BRPI0315900B1 - método de neutralização, remoção e/ou impedimento do crescimento de células hiperproliferativas, não diferenciadas ou viralmente infectadas suspensas em fluido fisiológico - Google Patents

Abstract

"dispositivo para tratamento de suspensão de células e método de neutralização, remoção e/ou impedimento do crescimento de células hiperproliferativas, não diferenciadas ou viralmente infectadas suspensas num fluido fisiológico". dispositivos e métodos para tratamento, prevenção de crêscimento e neutralização de células hiperproliferativas, não diferenciadas ou viralmente infectadas num meio líquido usando ultra-som de alta freqüência, baixa energia.

Description

“Método de Neutralização, Remoção e/ou Impedimento do Crescimento de Células Hiperproliferativas, Não Diferenciadas ou viral-Mente Infectadas Suspensas em Fluido Fisiológico” Relatório Descritivo Campo A presente invenção é direcionada para o uso de ultra-som de alta frequência, de baixa energia, para o tratamento de meios líquidos. Em modalidades específicas, os dispositivos e métodos aqui utilizados podem induzir apoptose significativa em células suspensas num fluido fisiológico.

An tece dentes As células podem ser danificadas por exposição a ultra-som. Por exemplo, o ultra-som pode causar dano irreversível nas células e induzir modificações destrutivas da membrana da célula. Vários relatórios têm sugerido que a cavitação resultante do colapso de bolhas de gás geradas por campos de pressão acústica pode ser a causa dos danos celulares a seguir à irradiação ultra-sônica. Também tem sido sugerido que a cavitação induz rupturas de filamentos únicos no DNA pela ação do peróxido de hidrogênio residual. O uso de ultra-som na terapia do câncer tem-se tomado um tema importante. O ultra-som foi usado junto com hipertermia e foto, radio e quimioterapia. É sabido que as células malignas são mais suscetíveis a estes métodos combinados do que as suas contrapartes normais. O efeito da irradiação direta (por exemplo, ultra-som, laser, luz) sobre certas moléculas (por exemplo, fotossensibilizantes clássicos e sonossen-sibilizantes) é a geração de espécies de oxigênio altamente ativas como oxigênio singlete, radicais de superóxido, hidroperóxidos ou radicais de ácidos graxos, que podem desempenhar um papel importante no tratamento do câncer, agindo seletivamente sobre as células malignas.

De acordo com a origem da radiação, a terapia acima descrita é designada PDT (fotodinâmica terapia) ou, se por ultra-som ou sono- luminescência, SDT (terapia sonodinâmica). A adição de fotossensibili-zante é um pré-requisito para ambas as terapias. Embora os efeitos gerais induzidos por SDT e PDT sejam diferentes em termos de viabilidade celular, tanto o SDT (especificamente relacionados à atividade ultra-sônica cavitacional) como o PDT geram espécies oxigenadas ativas e conduzem a uma diminuição dos níveis intracelulares de tiol. No caso do PDT por ultravioleta-A (UVA), a apoptose das células T auxiliares pode ser induzida pela geração de oxigênio singlete, mas, este efeito depende essencialmente da concentração inicial de fotossensibilizantes (PS) e da concentração de oxigênio local. Para SDT, como resultado das altas energias envolvidas, a lise celular é o fenômeno principal, mascarando provavelmente outros efeitos nas células sobreviventes. A Patente US 4.971.991 concedida a Umemura e colaboradores revela o uso de ultra-som para tratamento de tumores celulares, mas, apóia-se em elevados níveis de potência de ultra-som e não descreve o uso de microbolhas. Outras patentes que descrevem ultra-som e microbolhas, como a Patente Norte-Americana 5.215.680 concedida a D Arrigo, apóiam-se no uso de efeitos cavitacionais e térmicos de ultra-som para o tratamento de tumores, ao invés de células cancerosas individuais, cuja medida é determinada pela duração e número de tratamentos. Este tipo de tratamento usa elevadas potências e tempos longos de irradiação, produzindo predominantemente a lise e necrose celular. Ver Kondo, Câncer Letters 178 (1), 63-70, (2002).

Breve Descrição Dos Desenhos A Figura 1 é um desenho que mostra uma modalidade de um dispositivo de tratamento ultra-sônico aqui descrito. A Figura 2 é um desenho que mostra três vistas de um aparelho para tratamento de células hiperproliferativas numa suspensão com ultra-som e microbolhas. A vista mais à esquerda é uma vista superior do aparelho, a visão mediana é uma vista dianteira e a vista mais ã direita é uma vista lateral do aparelho. A Figura 3 é um gráfico de barras que mostra os efeitos do tratamento ultra-sônico sobre os níveis celulares da glutationa. Os dados são expressos em porcentagem de células exibindo nível de glutationa comparável para células sem tratamento. Os valores são média±SEM de 3 experiências independentes. A Figura 4 é um gráfico de barras que representa os efeitos do ultra-som de alta freqüência sobre a atividade celular da caspase-3. A Figura 5 é um gráfico de barras que mostra o efeito da irradiação sobre a eficiência de clonagem de células K562. Os resultados são expressos em média±SEM de 3 experiências independentes. A Figura 6 é um gráfico de barras que mostra a porcentagem de células apoptóticas K562 5 horas depois de 1 ou 3 tratamentos ultra-sônicos. A taxa de apoptose é determinada por citometria de fluxo após coloração com Annexin-V e os resultados são expressos em média +SEM de 7 experiências independentes. A Figura 7 é um gráfico de pontos que mostra as mudanças da distribuição de fosfatidilserina de acordo com o tempo e tratamentos ultra-sônicos sucessivos. Os resultados de uma experiência representativa são expressos em porcentagem de células coradas com Annexin-V-FITC. A Figura 8 é um gráfico de barras que mostra o efeito do tratamento ultra-sônico na apoptose de células mononucleares normais (MNC) e células leucêmicas (Nalm-6, KGla, HL-6Q e células leucêmicas primárias obtidas de 5 pacientes). Os resultados são média±SEM de 5 experiências independentes.

Descrição Detalhada A apoptose ou morte programada da célula é um componente normal do desenvolvimento e da saúde de organismos multicelulares. A apoptose assegura a homeostasia de tecidos durante o desenvolvimento, defende contra a hospedagem, envelhecimento e ocorre em resposta a uma grande variedade de sinais incluindo irradiação γ e exposição a ultravioleta. As células morrem em resposta a uma variedade de estímulos, tipicamente durante a apoptose elas fazem-no de um modo controlado. Isso torna a apoptose distinta de outra forma de morte celular chamada necrose em que a morte descontrolada da célula leva à lise das células, respostas inflamatórias e, potencialmente, a problemas de saúde sérios. A apoptose, em contraste, é um processo em que as células desempenham um papel ativo na sua própria morte, razão pela qual a apoptose é freqüentemente chamada de suicídio celular.

Após o recebimento de sinais específicos instruindo as células a sofrerem apoptose, ocorre tipicamente na célula um certo número de mudanças distintivas bioquímicas e morfológicas. Por exemplo, uma família de proteínas conhecidas como caspases são tipicamente ativadas nos estágios iniciais da apoptose. Estas proteínas rompem ou clivam substratos celulares chave que são exigidos para a função celular normal, incluindo proteínas estruturais no citoesqueleto e proteínas nucleares, tais como enzimas de reparação de DNA. As caspases também podem ativar outras enzimas degradativas como DNases, que clivam o DNA no núcleo. Em geral, a morte célular apoptótica é caracterizada por mudanças iniciais na membrana nuclear, condensação da cromatina e fragmentação do DNA. Estas mudanças bioquímicas resultam em um-danças morfológicas na célula.

Os ensinamentos aqui utilizados são direcionados para dispositivos e métodos que podem neutralizar, impedir o crescimento e remover células hiperproliferativas (por exemplo, células de tumor) presentes num meio líquido. Em modalidades mais específicas, os métodos e dispositivos aqui providos utilizados induzem a apoptose em células hiperproliferativas presentes numa suspensão, tal como fluido fisiológico. Os fluidos fisiológicos tratáveis incluem sangue, plasma, soro e fluido cerebrospinal que podem ser extraídos e/ou administrados a animais, incluindo mamíferos, pessoas e semelhantes. O tratamento ultra-sônico de baixa energia, alta freqüência, de acordo com estes ensinamentos pode induzir efeitos apoptóticos em células hiperproliferativas. Estes efeitos incluem, por exemplo, ter um efeito em membranas mitocondriais (queda do potencial mitocondrial), perda da assimetria da fosfatidilserina, provocando uma oxidação lipídi-ca da membrana (diminuição do nível celular de GSH), variações morfo-lógicas, fragmentação do DNA, perda de membrana do plasma e semelhantes. Além disso, a apoptose induzida por ultra-som de baixa energia pode envolver a ativação de caspase-3, a degradação proteolítica do substrato caspase PARP e a modulação nas células da proporção bcl-2 / bax.

Testes específicos (ver Exemplos) confirmaram a indução muito rápida de apoptose com quantidades limitadas de necrose.

Dispositivos e Métodos As modalidades dos dispositivos que podem ser usados para implementar os métodos inventivos podem ser encontradas no Pedido Provisório Norte-Americano 60/423.368, Pedido de Patente Norte-Americana 10/358445 e Patente US 6.540.922 concedida a Cordemans e colaboradores, cada um dos quais é aqui expressamente incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos de tratamento de células hiperproliferativas podem ser realizados com os dispositivos aqui descritos. Uma modalidade particular de um dispositivo que pode ser usado para tratamento de um meio líquido tal como um meio aquoso (por exemplo, fluidos fisiológicos) está ilustrada na Figura 1. Em certas modalidades, os fluidos a serem tratados contêm células hiperproliferativas. Noutras modalidades, os fluidos a serem tratados podem ser um líquido fisiológico suspeito de conter células hiperproliferativas, tal como, depois do diagnóstico, por exemplo. As células que não estão completamente diferenciadas como células tronco, assim como também soluções contendo vírus e/ou células de vírus infetadas podem também ser tratadas. Os exemplos de vírus tratáveis podem incluir HIV, HCV, HBV, vírus de herpes, hantavírus, gripe e Ebola, por exemplo.

De acordo com a Figura 1, os dispositivos aqui descritos utilizados incluem um compartimento 2, de preferência na forma de um cilindro ou de seção reta retangular. Em certas modalidades, o compartimento 2 pode estar em comunicação com um reservatório (não mostrado) que mantém o meio líquido a ser tratado. Em outras modalidades (por exemplo, quando é tratado o fluido fisiológico de uma pessoa ou animal), os dispositivos aqui providos não contêm um reservatório que esteja diretamente conectado ao corpo da pessoa ou animal. Essas modalidades incluem aquelas em que o fluido fisiológico é extraído e/ou administrado (por exemplo, re-injeção) durante o tratamento extracorpó-reo da pessoa ou corpo de outro animal. Conseqüentemente, um animal tal como uma pessoa pode ser substituído por qualquer referência aqui a um “reservatório”.

Noutras modalidades, uma suspensão de células hiperproli-ferativas pode ser tratada num dispositivo, conforme mostrado na Figura 2. Nesta modalidade, um tubo de entrada de ar 3 é usado como emissor de microbolhas 3 para emitir microbolhas 5 na suspensão celular hiper-proliferativa 22 contida num compartimento (ou poach) 20. O compartimento (ou poach) 20 contendo a suspensão de célula 22 pode ser imerso num banho de água 24, tal como uma incubadora, por exemplo.

Em modalidades adicionais, o compartimento 2 contém (por exemplo, ao longo de sua parede ou adjacente à parte inferior) um ou mais emissores de ultra-som de alta freqüência 1 que emitem ultra-som 4 no compartimento 2 (vantajosamente em direção ao centro deste compartimento 2). Noutras modalidades, o recipiente também pode ter um ou mais emissores de microbolhas 3 para emitir microbolhas de gás 5, que são dispostas de modo a emitir microbolhas de gás 5 no campo do ultra-som 4 emitido no compartimento 2. O termo “microbolhas”, como aqui utilizado, visa referir-se a bolhas de gás com um diâmetro médio menor do que 1 mm. Nalgumas modalidades, o diâmetro é menor ou se equipara a 50 pm. Ainda noutras modalidades, as microbolhas têm um diâmetro menor do que 30 μπα. Em certas modalidades as microbolhas são selecionadas de ar, oxigênio e microbolhas de ozônio ou uma mistura dos mesmos. Para diminuir os custos operacionais, pode ser vantajoso usar microbolhas que não sejam microbolhas de ozônio, como microbolhas de ar. As modalidades vantajosas da invenção não levam em conta a geração de um efeito térmico para tratar células. Se bem que, em certas modalidades, o uso de microbolhas estabilizadas possa ser efetivo para o tratamento de células, nas modalidades preferidas, é desnecessário o uso de microbolhas estabilizadas. Microbolhas de lipídios limítrofes são um exemplo de uma microbolha estabilizada. O termo “células hiperproliferativas” pretende referir-se a células que dividem, reproduzem ou, de outra maneira, proliferam a uma taxa relativamente alta e pode incluir células de câncer (por exemplo, células leucêmicas), células pré-cancerígenas, células de tumor, células de medula ósse e células totipotentes.

Em certas modalidades, o termo “meio líquido” relaciona-se a líquidos fisiológicos que podem ser administrados ao homem ou a animais e/ou extraídos do homem ou animais. Em modalidades específicas, os fluidos fisiológicos são re-injetados depois do tratamento (por exemplo, um tratamento ex vivo). Em certas modalidades, o termo “líquidos fisiológicos” pode incluir, sem limitação, sangue, soro, fluido cefaloraquidiano, fluido cerebrospinal, plasma e semelhantes. A Patente Norte-Americana 5.401.237, concedida a Tachibana e colaboradores, descreve um processo de extração e readministração de fluido fisiológico e fica por este meio expressamente incorporado por referência na sua totalidade.

Em modalidades específicas, os métodos e dispositivos aqui utilizados incluem ultra-som de baixa energia, alta freqüência, para o tratamento de células hiperproliferativas. O termo “alta freqüência” pretende referir-se a freqüências maiores do que 100 kHz e até vários MHz. Em certas modalidades, as altas freqüências usadas estão entre 200 kHz e 20 MHz. Em várias modalidades, a freqüência de ultra-som pode ser selecionada desde 200 kHz até 10 MHz. Numa modalidade preferida, a freqüência fica entre 200 kHz e 1,8 MHz.

Em várias modalidades dos dispositivos aqui descritos, o emissor de microbolhas 3 para emissão de microbolhas de gás 5 fica disposto na base 11 do compartimento 2, (isto é, na parte inferior do compartimento 2), de tal forma que as microbolhas se movam subindo naturalmente ou por arrastamento do gás no fluxo de líquido.

Em modalidades adicionais, os dispositivos e métodos aqui descritos induzem a apoptose em células hiperproliferativas. Foi desço-berto que as células saudáveis são muito menos sensíveis à alta freqüência de ultra-som do que as células leucêmicas. Esta diferença de comportamento entre as células saudáveis e leucêmicas não pode ser relacionada a uma diferença na localização dos fotossensibilizantes endógenos, mas, é provavelmente devida a uma modificação dos mecanismos celulares fundamentais como status p53, trajetos de sinalização e resistência ao esforço oxidativo, por exemplo. Especificamente, a apoptose pode ser induzida em células cancerígenas (por exemplo, leucêmicas), células pré-cancerígenas, células de tumor, células de medula óssea, células totipotentes e semelhantes.

Embora os ensinamentos presentes não fiquem, de modo nenhum, limitados pelo seu mecanismo preciso de ação, em modalidades mais específicas, os dispositivos e métodos providos aqui utilizados podem produzir radicais como ROS (espécies reativas a oxigênio), H', ΌΗ e HOO' que podem também formar H2O2, sendo esta molécula e/ou estes radicais tóxicos para células hiperproliferativa e, deste modo, provocam a sua inativação e/ou destruição. Os produtos de peroxidação de lipídios, resultantes da tensão de oxidação criada sob as condições ultra-sônicas também são participantes potenciais deste biomecanismo.

Se bem que tenha sido apresentada evidência contra a formação de oxigênio singlete durante a terapia sonodinâmica, estes dados são apenas consistentes com uma longa exposição de ultra-som de “alta energia”, levando a uma acumulação de radicais livres derivados de sensibilizantes por pirólise direta ou devido a reações com radicais de H'ou ΌΗ formados por pirólise do solvente de água.

Acredita-se que as espécies criadas usando os métodos e dispositivos descritos sejam derivadas da reação do ultra-som de alta freqüência numa molécula da água, gerando mais provavelmente (em particular, na presença de oxigênio) as reações seguintes: Vantajosamente, a energia exigida para produzir estas espécies tóxicas é reduzida, se o processo for realizado na presença de microbolhas, como aqui descrito. Em certas modalidades, é configurado um gerador para fornecer energia para o emissor de ultra-som a menos do que 1 W/cm2. Em modalidades preferidas, a energia é fornecida a aproximadamente 0,5 W/cm2 ou mais baixo ou em muitas modalidades vantajosas em torno de 25 W/cm2 ou mais baixo. Em modalidades vantajosas, a energia dissipada no volume do fluido fisiológico a partir deste nível de energia aplicada ao emissor é menor do que 30 mW/cm3. Em algumas modalidades, a energia é dissipada a aproximadamente 7mW/cm3.

Embora, em certas modalidades, o ultra-som possa ser administrado continuamente, noutras modalidades, o ultra-som pode ser administrado com intermitência, usando ciclos de LIGA/DESLIGA. Os especialistas na técnica podem determinar tempos efetivos de ciclos de LIGA/DESLIGA dependendo do volume de células, tipo de células e outras variáveis relevantes.

Em modalidades adicionais, os ensinamentos aqui utilizados relacionam-se com o tratamento de células hiperproliferativas em suspensão, em oposição a um tumor ou massa neoplástica. Nestas modali- dades, os ensinamentos aqui utilizados não contam com microbolhas para se concentrar ou acumular-se num local de tumor particular. Isso permite o tratamento de células hiperproliferativas não desejadas, o que não acontece ao serem agrupadas.

Outra vantagem dos métodos e dispositivos aqui providos é que as células hiperproliferativas podem ser eficazmente tratadas em períodos curtos de tempo. Em modalidades específicas, as células hiperproliferativas podem ser tratadas abaixo de 1 minuto. Em modalidades ainda mais específicas, as células podem ser tratadas abaixo de 30 segundos, incluindo entre 5-20 segundos, por exemplo.

Como é cediço na técnica, os modos biofísicos de ação ultra-sônica são classificados como tendo efeitos térmicos, cavitacionais ou não térmicos e de não cavitação. É importante notar que, usando as faixas de potência acima descritas e os tempos curtos de tratamento, é evitado o fluido significativo e/ou o aquecimento de células de forma tal que ocorre pouca ou nenhuma morte célular gerada por calor. Como exemplo, os tratamentos que resultam num efeito não térmico incluem tratamentos conduzidos a temperaturas abaixo de 40°C, 35°C e 30°C. Os níveis de energia também são tais que a cavitação não ocorre numa extensão significativa, de tal forma que é substancialmente evitado o dano atribuível à membrana celular devido ao ultra-som.

Sob energias ultra-sônicas mais elevadas, foi recentemente averiguado que a injeção de microbolhas no campo do ultra-som ocasiona um aumento no fenômeno da sonoluminescência, pela sobreposição das microbolhas sobre as borbulhas de cavitação induzidas pelo ultra-som, o número de espécies excitadas e tóxicas pode ser multiplicado. Esse fenômeno é observado num nível macroscópico, quando o tratamento de ultra-som é sinergicamente combinado com a presença de microbolhas de tamanho apropriado.

Em modalidades adicionais, os dispositivos e métodos aqui providos têm a vantagem de que não há necessidade de dedicar o ultra- som a zonas específicas, visto que é observado que o sistema de tratamento funciona pela difusão dos produtos formados in situ (por exemplo, radicais e H2O2 formados) para o reservatório 6 do meio aquoso a ser tratado.

Em modalidades adicionais, um ou mais emissores 1 de ultra-som 4 nos dispositivos aqui descritos são orientados de forma a não causar nenhum fenômeno de onda permanente. Por exemplo, em certas modalidades, um ou mais emissores de ultra-som podem ser orientados obliquamente em relação ao eixo 9 do compartimento 2 (ângulo agudo não perpendicular a este eixo 9) e em relação ao fluxo de líquido e ao fluxo de microbolhas 5 (ver Figura 1) Esta característica torna possível que todas as microbolhas 5 no compartimento 2 sejam tratadas de uma maneira estatisticamente idêntica, sem criar zonas estacionárias no compartimento 2.

Os dispositivos e métodos aqui utilizados podem incluir emissão de microbolhas de gás com um diâmetro médio de menos do que 1 mm num campo de ultra-som de alta freqüência no meio líquido tratado. Em algumas modalidades, o diâmetro das microbolhas é menor ou equiparado a 50 pm. Ainda em outras modalidades, as microbolhas têm um diâmetro menor do que 30 pm. Em certas modalidades, as microbolhas são selecionadas do ar, oxigênio e microbolhas de ozônio. Em outras modalidades, as microbolhas não são microbolhas de ozônio.

De acordo com outras modalidades, os dispositivos e métodos aqui descritos podem incluir um emissor leve 12 (isto é, um emissor de radiação eletromagnética) que emite para o compartimento 2 no campo de ultra-som 4, radiação com uma freqüência que está principalmente na faixa visível. Todavia, para certas aplicações, a fim de remover certas células hiperproliferativas específicas, é vantajoso emitir radiação eletromagnética com uma freqüência que seja principalmente não visível, tal como radiação ultravioleta (por exemplo, do tipo UVA, UVB ou UVC), infra-vermelha, laser, microondas e semelhantes.

Foi recentemente descoberto, de modo inesperado, que um tratamento que inclua a emissão de microbolhas para os campos combinada com ultra-som e opcionalmente radiação de luz é particularmente efetiva na desativação e remoção de células hiperproliferativas num meio líquido, como fluido fisiológico. O fenômeno da luminescência pode promover a produção de espécies oxigenadas extremamente ativas como o radical de superóxido ou oxigênio singlete, o que pode resultar numa série de reações bioquímicas que são extremamente tóxicas para as células hiperproliferativas. Em modalidades vantajosas, a radiação é emitida com intermitência em ciclos de LIGA/DESLIGA. Em modalidades mais específicas, o ciclo de LIGA/DESLIGA pode ser de cerca de 5,5ms/3 ms. É cediço que a luminescência pode ocorrer na presença das assim chamadas moléculas sensibilizantes (por exemplo, fotossensibili-zantes e sonossensibilizantes), de forma a ocasionar uma ação antitumo-rígena em certo células de câncer. Essas moléculas podem incluir: porfirinas, cloretos, tetraciclinas, azul de metileno, fluoresceína, acridina, ródamina e semelhantes. Estes agentes ativos podem ser injetados no organismo ou administrados oralmente e subseqüentemente ativados por sonoluminescência. Depois da ativação, esses agentes podem produzir oxigênios singlete que, por sua vez, desempenha um papel fundamental, em particular, em processos bioquímicos resultantes da tensão de oxidação. Especificamente, um oxigênio singlete consegue oxidar os vários componentes da célula, como as proteínas, lipídios, aminoácidos e nucleotidios, por exemplo.

Noutras modalidades, as partículas sólidas ou superfícies sólidas podem ser usadas para sinergizar a luminescência e/ou emissão de radiação. Estes sólidos podem incluir TIO2, argila branca e cerâmica, por exemplo. Várias modalidades são direcionadas para os dispositivos e métodos que não exigem produtos químicos adicionais como fotossensi-bilizantes e/ou sonossensibilizantes para neutralizar, prevenir o crescimento e/ou remover células hiperproliferativas de um meio fisiológico. Nem sempre é necessário adicionar um agente fotossensibilizante ou sonossensibilizante ao meio líquido a ser tratado, desde que tenha sido inesperadamente observado que a luminescência pode ser produzida in situ em certas células hiperproliferativas (por exemplo, células leucêmicas) presentes em fluidos fisiológicos (por exemplo, sangue) já contendo essas moléculas fotossensibilizantes.

Se bem que os dispositivos e métodos aqui providos possam ser usados junto com outras drogas como fotossensibilizantes, sonossen-sibilizantes, agentes quimioterapêuticos, antibióticos, drogas antivirais, é importante notar que a efetividade dos métodos e dispositivos providos no tratamento de células hiperproliferativas não é dependente do uso de outras substâncias químicas, reativos ou drogas. Conseqüentemente, os métodos e dispositivos aqui descritos utilizados podem ser usados sem substâncias adicionais, incluindo substâncias químicas, reativos, hormônios, peptídios, proteínas, ácidos nucléicos, carboidratos, vacinas de DNA, estimuladores ou drogas de angiogênese. Em modalidades ainda mais específicas, os ensinamentos aqui utilizados não contam com a absorção celular destas substâncias.

Especificamente, os efeitos obtidos com os ensinamentos aqui utilizados podem ser alcançados sem a necessidade de fotossensibilizantes clássicos e sonossensibilizantes. Os efeitos fisiológicos obtidos com técnicas como PDT dependem, ao mesmo tempo, da dose de radiação, da natureza do fotossensibilizante usado, da sua concentração e da sua localização. Embora sendo requisitos para tratamentos tradicionais, os sensibilizantes não são necessários para os ensinamentos aqui providos, simplificando, assim, consideravelmente os métodos e dispositivos.

Em certas modalidades, os efeitos finais da ação ultra-sônica implicam fotossensibilizantes endógenos na estrutura onde sua concentração local é alta. Por exemplo, fotossensibilizantes endógenos são principalmente localizados nas estruturas de membrana como lisos-somos, mitocôndria, membranas nucleares, aparelho de Golgi e o mi- crossomos da retícula endoplásmica, cuja superfície relativa representa quase 50% da superfície da membrana da célula.

Em algumas modalidades, os dispositivos e métodos aqui descritos utilizados podem incluir uma bomba para circular o meio líquido, assim como um ou mais aparelhos para recuperar, de preferência por filtração, centrifugação ou precipitação (como ciclones, etc.), células hiperproliferativas presentes no meio líquido. Em certas modalidades, a bomba e/ou aparelho para recuperação são dispostos entre o reservatório (ou animal) contendo o meio líquido a ser tratado e o compartimento 2.

Em certas modalidades, os dispositivos e métodos aqui utilizados podem ser usados para extrair fluido fisiológico (por exemplo, sangue) de um sujeito, suspeito de (por exemplo, diagnosticado) tendo câncer (por exemplo, leucemia). Depois da extração, o fluido fisiológico pode ser tratado com ultra-som de baixa energia de alta freqüência e microbolhas de gás com diâmetro menor do que 1 mm. Em certas modalidades, os métodos induzem a apoptose das células cancerosas (por exemplo, leucemia). Após o tratamento do fluido fisiológico, de tal forma que as células hiperproliferativas tenham sido suficientemente neutralizadas, impedidas de crescer ou removidas, o fluido pode, então, ser administrado de volta ao sujeito. Estes métodos podem ser realizados semelhantemente a outros métodos ex vivo, como hemodiálise, por exemplo.

Um sujeito para tratamento de sangue pode ser ligado a um dos dispositivos aqui descritos. De acordo com certas modalidades, a circulação sangüínea do sujeito pode ser conectada a um dispositivo de ultra-som aqui descrito, através de uma fistula interna no braço. Isto envolve ter uma artéria e uma veia ligadas cirurgicamente. Quando são juntas, o fluxo de sangue mais forte da artéria faz que a veia se torne maior. As agulhas podem ser inseridas na veia aumentada para ligar o sujeito ao dispositivo de ultra-som.

Outro caminho para proporcionar acesso à circulação san-güínea é inserir um enxerto interno. Neste procedimento, uma artéria é cirurgicamente conectada a uma veia com um pedaço pequeno de tubulação especial colocada debaixo da pele, em que pode ser inserida uma agulha.

Noutras modalidades, quando é necessário obter rapidamente acesso à circulação sangüínea ou quando as veias no braço são muito pequenas, para proporcionar sangue suficiente para o tratamento ultra-sônico, por exemplo, pode ser usado um catéter venoso central. Neste procedimento, um tubo flexível é inserido cirurgicamente numa veia grande no pescoço ou próximo da clavícula. Em algumas modalidades, este método pode ser temporário até que um local de acesso permanente esteja pronto.

Os sujeitos que podem ser tratados de acordo com os métodos descritos podem incluir qualquer animal, como mamífero, incluindo pessoas, ratos, macacos, cachorros, porcos e semelhantes.

Em modalidades adicionais, os dispositivos e métodos aqui descritos utilizam ondas ultra-sônicas de baixa energia, alta frequência para impedir, tratar ou neutralizar células hiperproliferativas induzindo a apoptose nas células (por exemplo, células leucêmicas). A indução da apoptose em células hiperproliferativas pode levar a uma seqüência de eventos característicos incluindo uma queda no potencial mitocondrial, uma perda de assimetria de fosfatidilserina, variações morfológicas, uma fragmentação do DNA, uma perda da membrana do plasma e semelhantes. Além disso, a apoptose induzida por ultra-som de baixa energia pode envolver a ativação da caspase-3, a degradação proteolítica do substrato de caspase PARP e a modulação da taxa de bcl-2 / bax nas células.

Os métodos adicionais envolvem iniciação da apoptose usando luminescência sonoquímica induzida por ultra-som para ativar a produção fotosensibilizada do oxigênio singlete a partir da fotoirradiação direta. Em condições de irradiação ultra-sônica clássica, os efeitos destrutivos diretos da cavitação dominam a sonoluminescência, que é bastante fraca na ausência de uma interface de ar/líquido injetada no meio. Conseqüentemente, pode ser vantajoso utilizar microbolhas junto com o ultra-som, a fim de realçar a luminescência acima dos efeitos cavi-tacionais.

Os exemplos seguintes descrevem o tratamento de células com ultra-som de baixa energia, alta freqüência, e vários ensaios para indicar a presença de apoptose nas células mencionadas.

Exemplo 1 Preparação De Célula E

Tratamento Com Ultra-Som De Alta Freqüência Foram cultivadas linhas de células humanas leucêmicas (K562, Nalm-6, KGla e HL-60) obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, E.U.A.) em RPMI-1640 (BioWhittaker, Walkersville, MD, EUA) suplementado com soro de bezerro fetal a 10% (Gibco Grand island, NY, EUA.) e L-glutamina a 1% (Gibco). As células leucêmicas foram colhidas, ressuspensas em fosfato-solução salina tamponada (PBS salino, pH=7,2, Gibco) e imediatamente usadas no experimento. Foi obtido sangue venoso heparinizado a partir de voluntários saudáveis e pacientes leucêmicos. As células mononucleares foram separadas por centrifugação de densidade de gradiente de Ficoll-Hypaque {International Medicai Products, Bruxelas, Bélgica). O seguinte descreve o tratamento ultra-sônico sobre as células. Linhas de células leucêmicas humanas (K562, HL-60, KGla e Nalm-6), células leucêmicas primárias e células normais mononucleares foram tratadas por ultra-som a uma freqüência de 1,8 MHz durante os vários tempos de exposição a potência acústico de 7 mW/mL e ciclos de irradiação (LIGA/DESLIGA) 5,5ms/3 ms.

Depois de 18 horas de cultura na incubadora (37°C e 5% de CO2) as células foram testadas, com sucesso, quanto à viabilidade celu- lar por um ensaio de exclusão azul tripano. Os testes adicionais foram realizados nas células tratadas e são descritos com maior detalhe nos exemplos seguintes. A apoptose foi avaliada por morfologia celular, exposição a fosfatidilserina e fragmentação de DNA. O potencial mito-condrial, o conteúdo de glutationa, a ativação da caspase-3, a divagem PARP e a taxa bcl-2/bax foram testados por citometria de fluxo. A eficiência de clonagem foi avaliada por ensaios em metilcelulose.

Exemplo 2 Efeito De Ultra-Som De Alta Freqüência Na Fragmentação Do DNA A fragmentação do DNA foi associada com a apoptose. Foi realizada a quantificação de células com DNA degradado usando um método descrito por Nicoletti, I. e colaboradores J Immunol Methods 139(2): 271 (1991) e um kit de detecção Apotarget Quick DNA Ladder (Biosource). Foram ressuspensas esferas de células (106 células) em 20 L de tampão de lise e o DNA foi extraído de acordo com as instruções do fabricante. O DNA foi analisado depois de separação por electroforesis em gel (agarosel%). Como controle positivo, as células foram irradiadas com luz UV colocando uma placa diretamente sob um transiluminador UV durante 10 minutos (intensidade de 5 mW/cm2). As células foram, então, incubadas a 37°C durante 5 e 18 horas antes da apoptose ser avaliada.

Depois da permeabilização, as células foram incubadas com solução contendo PI e RNAse (Reagente Coulter DNA-prep). Os tubos foram colocados a 4°C no escuro durante a noite, antes da análise por fluxo citometria, para identificar o pico sub-GO correspondente à apoptose.

Foram observados os padrões de graduação clássicos de DNA nucleosomal em amostras de DNA a partir de células tratadas por ultravioleta (controle positivo) e por ultra-som. A divagem internucleos-sômica de DNA era dificilmente observável apenas 5 horas depois do tratamento ultra-sônico, mas, tornou-se claramente evidente 18 horas depois (resultados não mostrados). Além disso, foi observado um aumento no número de núcleos com DNA fragmentado com coloração PI, 5 horas depois do tratamento. Especificamente, 15% das células tratadas tiveram DNA fragmentado e 2% das células sem tratamento tiveram DNA fragmentado (dados não mostrados).

Exemplo 3 Efeito De Ultra-Som De Alta Freqüência No Potencial De Transmembrana Mitocondrial O rompimento antecipado do potencial de transmembrana mitocondrial (AYm), precedendo a fragmentação de DNA avançada, tem sido observado em vários modelos de apoptose de célula. O ensaio seguinte foi realizado para determinar o efeito de tratamento ultra-sônico de alta freqüência em ΔΥm. O potencial mitocondrial foi estimado por incorporação do fluorcromo catiônico DiOC6 logo depois do tratamento de célula de acordo com o protocolo publicado encontrado em A. Macho e colaboradores, Blood 86(7): 2481 (1995).

Em resumo, as células K562 (106/mL) foram incubadas com 2,5 nmol/L 3,3-dihexiloxacarbocianina (DiOC6; Molecular Probes, Eugene, OR) por 15 minutos a 37°C, seguidas de análise citométrica de fluxo. O tratamento ultra-sônico foi acompanhado por um aumento das populações de células exibindo um AYm baixo (resultados não fornecidos). Uma população de células exibindo uma reduzida incorporação de DÍOC6 foi evidenciada 30 minutos depois do tratamento e a queda de potencial mitocondrial foi muito clara 5 horas depois do tratamento ultra-sônico com mais de 50% das células tendo um baixo AYm. Estes resultados proporcionam evidência da apoptose celular.

Exemplo 4 Efeito De Ultra-Som De Alta freqüência Nos Níveis Da Glutationa Celular Foi mostrado que existe um esgotamento de glutationa durante a apoptose. Foi realizado um ensaio para determinar o conteúdo de glutationa celular depois do tratamento ultra-sônico. Foi usado o rastreador de células CMFDA verde (5-clorometil fluoresceína diacetato; Molecular Probes) para determinar níveis da glutationa de intracelular, conforme previamente descrito em D. W. Hedley e colaboradores Cito-metry 15: 349 (1994).

Diretamente depois do tratamento ultra-sônico, surgiu uma subpopulação com níveis mais baixos de GSH do que o observado em células sem tratamento (>50% de células exibindo um nível baixo de GSH), como mostrado na Figura 3. Os resultados de tratamentos sucessivos indicaram um esgotamento de GSH maior depois de 5 horas. Os resultados, expressos como porcentagem de células exibindo um nível GSH comparável a células sem tratamento, demonstra claramente que a alta freqüência de tratamento ultra-sônico está associada com o esgotamento de GSH.

Exemplo 5 Efeito de Ultra-Som De Alta Freqüência Na Atividade Celular Da Caspase-3 Tem sido mostrado que a caspase-3 desempenha um papel importante na apoptose quimioterapicamente induzida. Especificamente, a ativação de caspases leva ao falecimento da célula via divisão de substratos celulares como actina, gelsolina ou PARP. Para encontrar diretamente o envolvimento da caspase-3 na apoptose induzida por ultra-som, foi determinada a atividade da caspase usando citometria de fluxo e ensaio colorimétrico.

Especificamente, foi detectada a caspase-3 por análise citométrica de fluxo usando o anticorpo monoclonal da caspase-3 anti-ativo de anticorpo de coelho policlonal Pe)-conjugado ficoeritrina (BD- Pharmingen, San Diego, CA, E.U.A.). As células foram fixadas e per-meabilizadas usando kit Fix and Perm (Caltag, Burlingame, CA) durante 15 minutos à temperatura ambiente. As células foram, então, coradas com anti-caspase-3 Ab e incubadas por 15 minutos. As células foram lavadas e analisadas por citometria de fluxo. A atividade enzimática da caspase-3 foi determinada usando o kit de ensaio colorimétrico da protease/cpp32/Apotarget caspase-3 (Biosource), conforme sugerido pelo fabricante. A ativação da caspase-3 também foi indiretamente avaliada por divagem de PARP usando um local de divagem anti-PARP de coelho AB, conjugado FITC (Biosource).

Conforme mostrado na Figura 4, o tratamento ultra-sônico de alta freqüência levou à ativação da caspase-3. Além disso, esta atividade de protease era máxima 1 h pós-tratamento. Além disso, a divagem de PARP era evidente 2 horas depois do tratamento, com 40% das células coradas pelo FITC anti-PARP coelho vs 5% para células sem tratamento (resultados não mostrados).

Exemplo 6 Efeito do Ultra-Som De Alta Freqüência Sobre A Taxa Celular bcl-2/bax Proteínas diferentes da família bcl-2 têm sido implicadas na ativação ou prevenção da apoptose. Foi realizado o seguinte ensaio para determinar se bcl-2 e bax, os dois membros importantes da família bcl-2, estavam envolvidos na indução da apoptose por ultra-som. Depois da permeabilização, as células foram incubadas com controle negativo combinado com isotipo, bcl-2 anti-humano FITC camundongo-marcado (Dako, Glostrup, Dinamarca) e anticorpos policlonais do coelho para bax.

Subseqüentemente, foi adicionado um anticorpo secundário FITC-marcado (Dako) a bax. Para quantificar a expressão bcl-2 e bax, o cito-metro foi calibrado usando uma mistura de contas marcadas com quantidades conhecidas de fluorcromo (Dako). Os valores da intensidade fluorescente média (MFI) foram, então, convertidos em moléculas de íluorcromo solúvel equivalente (MESF) usando uma curva de calibra-ção.

Os resultados (dados não fornecidos) demonstraram que as células sem tratamento expressaram níveis altos da proteína anti-apoptótica bcl-2-proteína (47±4xl03 MESF) e esta expressão aparece como um pico unimodal de fluorescência. Uma hora depois do tratamento ultra-sônico, a expressão da proteína bcl-2 já estava subregulada (respectivamente 40±0,9 e 32+0,9x103 MESF em células de K562 tratadas por 1 ou 3 tratamentos ultras-sônicos). Duas horas depois do tratamento, a expressão bcl-2 surgiu claramente bimodal, exibindo as células um fenótipo bcl-2elevado (comparável a células sem tratamento) ou bcl-2baixo (11±2 xlO3 MESF).

Em contraste com bcl-2, os níveis da proteína pró-apoptó-tica, bax, eram mais altos em células tratadas com ultra-som em comparação com células sem tratamento (respectivamente, 85±0,5 e 48±5xl03 MESF para K562 tratado e sem tratamento). A taxa de bcl-2/ bax foi, deste modo, significativamente reduzida durante o tratamento ultra-sônico de alta freqüência, fornecendo evidência da apoptose celular (0,98 para controle células vs 0,38 para células tratadas por ultra-som).

Exemplo 7 Efeito do Ultra-Som De Alta Freqüência Nos Níveis Da Fosfatidilserina Celular Durante a apoptose, os resíduos de fosfatidilserina movem-se rapidamente de dentro para fora da membrana de plasma e esta mudança pode ser detectada usando Annexin-FITC, que se liga aos resíduos PS. O seguinte descreve um ensaio de ligação Annexin V que foi realizado. Foi executada a análise citométrica de fluxo de células (PI) coradas de Annexin-V-fluorescência isotiocianato (FITC) e iodeto de propídio usando o kit comprado de Biosource International (Camarillo, CA, EUA), conforme recomendado pelo fabricante. Os dados foram apresentados como gráficos de pontos mostrando a mudança na intensidade da fluorescência média de Annexin-V-FITC/ iodeto de propídio (não mostrado) .

Os resultados indicaram que as mudanças de distribuição de fosfatidilserina variaram de acordo com o tempo. Especificamente, os resultados mostraram que o tratamento ultra-sônico provocou dano à membrana do plasma numa porcentagem baixa de células, demonstrando que a ação necrótica do tratamento de ultra-som testado é muito fraca. De forma interessante, foi observado um aumento nas células apoptóticas duas horas depois do tratamento. Cinco horas depois do tratamento, 35% das células eram Annexin-V-positivas, demonstrando a indução ultra-sônica da apoptose em células K562.

Exemplo 8 Efeito Do Ultra-Som De Alta Freqüência Na Formação De Colônia Uma prova importante para um efeito sobre a viabilidade das célula é a inabilidade de uma célula em multiplicar-se e formar uma colônia. O seguinte descreve um ensaio clonogênico que foi realizado numa linha de células K562 para determinar o efeito da irradiação ultra-sônica de alta freqüência sobre a eficiência da clonagem. Em resumo, o meio de cultura consistia em IMDM suplementado com FCS a 20% e metilcelulose numa concentração final de 4%. As culturas foram incubadas a 37°C em ar a 5% de CO2 e as colônias (>20 células) foram contadas depois de 5 dias. A eficiência clonogênica da linha de célula K562 era de 16%. Como mostrado na Figura 5, é observada uma redução significativa na eficiência da clonagem de células K562 depois de 1 a 3 tratamentos (respectivamente, 25% e 42% de inibição), confirmando a sensibilidade das células leucêmicas ao ultra-som de alta freqüência.

Exemplo 9 Efeito de captores de oxigênio na apoptose Foi realizado o procedimento seguinte para determinar o efeito de captores de oxigênio ativos na indução de apoptose por ultra- som de alta freqüência. As células K562 foram incubadas com L-histidi-na (10 mM) e/ou manitol (100 mM). Algumas células foram tratadas por ultra-som de alta freqüência e outras não foram. A apoptose das células foi detectada por um ensaio de Annexin-V/PI. Os resultados, como mostrados na Tabela 1, demonstram que o dano celular induzido ultra-sonicamente é significativamente reduzido na presença de histidina e manitol (respectivamente, 43% e 47% de inibição da apoptose induzida por 3 tratamentos sucessivos).

Tabela 1 Efeitos de captores de oxigênio ativos sobre a apoptose celular induzida ultrasonicamente Os resultados são expressos em porcentagem de células que mostram a extemalização de fosfatidilserina 5 horas pós-tratamento (média ± SEM de 4 experiências independentes). A associação de manitol e histidina conduz a mais de 60% da inibição de apoptose. A efetividade desses agentes na redução da apoptose celular induzida por tratamento ultra-sônico proporciona prova de que o oxigênio singlete e radicais hydroxil induzidos ultrasonicamente são mediadores importantes para induzir a apoptose.

Exemplo 10 Efeito De Sucessivos Tratamentos De Ultra-Som De Alta Freqüência Sobre as Células Foi realizado um acompanhamento da citometria de fluxo em células de K562 cultivadas 0,5, 2 e 5 horas depois do tratamento ultra-sônico. Depois de um tratamento, o nível observado das células apoptóticas era de três vezes o do controle (respectivamente, 26% e 8% depois de 5 horas de cultura para células tratadas e não tratadas). Também foi observado um efeito necrótico de 5 a 10%, que está bem abaixo do encontrado no uso de drogas ou tratamento fotodinâmico (PDT). Com sucessivas irradiações, sob as mesmas condições (7 mW/mL, 20 segundos) e em intervalos diferentes, a apoptose das células K562 aumentou para 37±3% (p<0,02) e 49±5% (p<0,02) depois de, respectivamente, 1 e 3 tratamentos sucessivos (Figura 6). Também foram observadas variações morfológicas (por exemplo, contração celular, empolamento de membrana, condensação da cromatina) depois de sucessivos tratamentos (resultados não mostrados). A Figura 7 demonstra que a quantidade de fosfa-tidilserina celular aumenta, depois de sucessivos tratamentos de ultra-som de alta-freqüência, como detectado por um ensaio de Annexin-V.

Exemplo 11 Efeito Do Ultra-Som De Alta Freqüência Em Várias Linhas De Células Além de K562, o efeito do tratamento ultra-sônico foi testado em outras linhas de células normais e malignas, inclusive KGla (células de leucemia mielóide aguda imaturas minimamente diferenciadas), HL-60 (leucemia promielocítica) e Nalm-6 (linha celular ALL). Os resultados apresentados na Figura 8 demonstram que a sensibilidade ao ultra-som depende do tipo da célula, mas, tratamentos sucessivos levaram a um aumento significativo no número de células apoptóticas para todas as linhas celulares avaliadas. Células mononucleares de 5 pacientes (1 anemia refratária com excesso de células blast [RAEB], 1 leucemia mielógena aguda secundária [AML] e 3 casos de classificação AML French-American-British [FAB] M3, M4 e M4Eo) também foram tratadas por ultra-som e as células blast foram discriminadas das células normais contaminantes na base da sua expressão CD45, conforme previamente descrito em F. Lacombe, F. e colaboradores Leukemia 11:1878 (1997). Estas células também tinham sido marcadas pela sua exposição à fosfatidilserina por FITC-anexina. Este método torna possível comparar o respectivo comportamento apop-tótico das células blast leucêmicas e células normais tratadas por ultra-som. Os resultados apresentados na Figura 8 demonstram que as células leucêmicas primárias são sensíveis ao tratamento ultra-sônico com mais de 37±18% de células apoptóticas observadas 5 horas depois de 3 tratamentos. A descrição precedente detalha certas modalidades dos ensinamentos aqui utilizados. Será observado, porém, que não importa quão detalhado o precedente apareça no texto, os dispositivos e métodos aqui utilizados podem ser praticados de muitas formas. Como é também afirmado acima, deve ser notado que o uso de terminologia particular, quando descreve certas características ou aspectos dos ensinamentos aqui utilizados, não deve ser considerado implicar que a terminologia esteja sendo redefinida aqui de modo a ficar restringida a incluir quaisquer características específicas das características ou aspectos dos ensinamentos aqui utilizados com os quais essa terminologia esteja associada. O escopo dos ensinamentos aqui utilizados deve, portanto, ser interpretado de acordo com as reivindicações anexas e quaisquer equivalentes seus.

Reividicações

Claims (12)

1 - Método de Neutralização, Remoção e/ou Impedimento do Crescimento de Células Hiperproliferativas, Não Diferenciadas ou Viral-Mente Infectadas Suspensas em Fluido Fisiológico, caracterizado por que compreende: emitir ultra-som tendo uma frequência mais alta do que 100 kHz num compartimento que contém o fluido fisiológico a ser tratadoa um nível de potência que é menor do que 30mW/cm3; e emitir microbolhas de gás tendo um diâmetro médio de menos do que 1 mm para o campo ultra-sônico no compartimento que contém o fluido fisiológico, de tal forma que a emissão de ultra-som e microbolhas induza a morte celular programada significativa nas células hiperproliferativas, não diferenciadas ou viralmente infectadas, sem causar cavitação significative ou aquecer significativamente o fluido.

2 - Método de Neutralização, Remoção e/ou Impedimento do Crescimento de Células Hiperproliferativas, Não Diferenciadas ou Viral-Mente Infectadas Suspensas em Fluido Fisiológico, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que as microbolhas de gás não são microbolhas de ozônio.

3 - Método de Neutralização, Remoção e/ou Impedimento do Crescimento de Células Hiperproliferativas, Não Diferenciadas ou Viral-Mente Infectadas Suspensas em Fluido Fisiológico, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que as microbolhas de gás são selecionadas do grupo que consiste em microbolhas de ar e oxigênio.

4 - Método de Neutralização, Remoção e/ou Impedimento do Crescimento de Células Hiperproliferativas, Não Diferenciadas ou Viral-Mente Infectadas Suspensas em Fluido Fisiológico, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o fluido fisiológico é administrado a um mamífero e/ou extraído de um mamífero.

5 - Método de Neutralização, Remoção e/ou Impedimento do Crescimento de Células Hiperproliferativas, Não Diferenciadas ou Viral- Mente Infectadas Suspensas em Fluido Fisiológico, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o fluido fisiológico é selecionado do grupo que consiste em sangue, plasma, soro e fluido cerebrospinal.

6 - Método de Neutralização, Remoção e/ou Impedimento do Crescimento de Células Hiperproliferativas, Não Diferenciadas ou Viral-Mente Infectadas Suspensas em Fluido Fisiológico, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o diâmetro médio das microbo-lhas de gás é menor do que 50 μπι.

7 - Método de Neutralização, Remoção e/ou Impedimento do Crescimento de Células Hiperproliferativas, Não Diferenciadas ou Viral-Mente Infectadas Suspensas em Fluido Fisiológico, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o diâmetro médio das microbo-lhas de gás é menor do que 30 μπι.

8 - Método de Neutralização, Remoção e/ou Impedimento do Crescimento de Células Hiperproliferativas, Não Diferenciadas ou Viral-Mente Infectadas Suspensas em Fluido Fisiológico, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o ultra-som emitido para o compartimento não gera um fenômeno de campo estacionário.

9 - Método de Neutralização, Remoção e/ou Impedimento do Crescimento de Células Hiperproliferativas, Não Diferenciadas ou Viral-Mente Infectadas Suspensas em Fluido Fisiológico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por que ainda compreende emitir luz tendo uma radiação eletromagnética principalmente na faixa visível para o campo ultra-sônico.

10 - Método de Neutralização, Remoção e/ou Impedimento do Cresci-mento de Células Hiperproliferativas, Não Diferenciadas ou viral-Mente Infectadas Suspensas em Fluido Fisiológico, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que as células hiperproliferativas são selecionadas do grupo que consiste em células de tumor, células de medula óssea, células tronco cancerígenas e células pré-cancerígenas.

11 - Método de Neutralização, Remoção e/ou Impedimento do Cresci-mento de Células Hiperproliferativas, Não Diferenciadas ou viral-Mente Infectadas Suspensas em Fluido Fisiológico, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que as células hiperproliferativas são células leucêmicas.

12 - Método de Neutralização, Remoção e/ou Impedimento do Cresci-mento de Células Hiperproliferativas, Não Diferenciadas ou viral-Mente Infectadas Suspensas em Fluido Fisiológico, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que compreende ainda suprir energia para o emissor de ultra-som a menos do que 1 W/cm2.