PT1562642E - Dispositivo e processo para tratamento de um meio líquido utilizando ultra-sons para prevenção do crescimento de células hiperproliferativas ou infectadas - Google Patents

Description

ΕΡ 1 562 642 /PT DESCRIÇÃO "Dispositivo e processo para tratamento de um meio liquido utilizando ultra-sons para prevenção do crescimento de células hiperproliferativas ou infectadas"

CAMPO 0 presente invento refere-se à utilização de ultra-sons de alta frequência, de baixa energia, para tratar meios líquidos. Em concretizações específicas, os dispositivos e métodos podem aqui induzir apoptose significativa em células suspensas num fluido fisiológico.

ANTECEDENTES

As células podem ser danificadas por exposição a ultra-sons. Por exemplo, os ultra-sons podem causar danos irreversíveis nas células e induzir modificações destrutivas na membrana celular. Vários relatos têm sugerido que a cavitação resultante do colapso de bolhas de gás gerado por campos de pressão acústica pode ser a causa de danos nas células após irradiação ultra-sónica. Tem sido também sugerido que a cavitação induz quebras na cadeia simples em ADN pela acção de peróxido de hidrogénio residual. A utilização de ultra-sons em terapia do cancro tem-se tornado um tema importante. Os ultra-sons têm sido utilizados conjuntamente com hipertermia e com foto-, radio- e quimioterapia. As células malignas são conhecidas por serem mais susceptíveis a estes métodos combinados do que os seus correspondentes normais. 0 efeito de irradiação directa (e.g., ultra-sons, laser, luz) sobre certas moléculas (e.g., fotossensibilizadores e sonossensibilizadores clássicos) é a geração de espécies de oxigénio altamente activas tais como oxigénio singuleto, radicais superóxido, hidroperóxidos ou radicais de ácido gordo, que podem desempenhar um papel importante no tratamento do cancro, actuando selectivamente sobre células malignas.

De acordo com a origem da radiação, a terapia anteriormente descrita é denominada PDT (terapia fotodinâmica) ou, se por ultra-sons ou sonoluminescência, SDT (terapia sonodinâmica). A adição de um fotossensibilizador é um pré- 2

ΕΡ 1 562 642 /PT requisito para ambas as terapias. Embora os efeitos gerais induzidos SDT e PDT sejam diferentes, em termos de viabilidade celular, tanto a SDT (especificamente relacionada com a actividade de cavitação ultra-sónica) como a PDT geram espécies oxigenadas activas e conduzem a uma diminuição dos níveis de tiol intracelular. No caso de PDT por ultravioletas A (UVA), a apoptose de células T auxiliares pode ser induzida pela geração de oxigénio singuleto, mas este efeito depende essencialmente da concentração inicial em fotossensibilizadores (PS) e da concentração de oxigénio local. Para a SDT, como resultado das elevadas energias envolvidas, a lise celular é o principal fenómeno, provavelmente mascarando outros efeitos nas células sobreviventes. A Patente dos e.u.a. n.° 4 971 991 de Umemura et al. revela a utilização de ultra-sons para tratar células de tumor, mas baseia-se em elevados níveis de potência de ultra-sons, e não descreve a utilização de microbolhas. Outras patentes que descrevem ultra-sons e microbolhas, tal como a

Patente dos E.U.A. N.° 5 215 680 de D'Arrigo, baseiam-se na utilização dos efeitos de cavitação e térmicos de ultra-sons para tratar tumores, em oposição a células de cancro individuais, cuja extensão é determinada pela duração e pelo número de tratamentos. Este tipo de tratamento utiliza potência elevada e tempos de irradiação longos, produzindo predominantemente lise e necrose celular. Ver Kondo, Câncer Letters 178(1), 63-70, (2002).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um desenho mostrando uma concretização de um dispositivo de tratamento ultra-sónico aqui descrito. A Figura 2 é um desenho mostrando três vistas de um aparelho para tratamento de células hiperproliferativas numa suspensão com ultra-sons e microbolhas. A vista mais à esquerda é uma vista superior do aparelho, a vista do meio é uma vista frontal, e a vista mais à direita é uma vista lateral do aparelho. A Figura 3 é um gráfico de barras mostrando os efeitos do tratamento ultra-sónico nos níveis de glutationa celular. Os dados estão expressos em percentagem de células exibindo um 3

ΕΡ 1 562 642 /PT nível de glutationa comparável ao de células não tratadas. Os valores são a média ± SEM de 3 experiências independentes. A Figura 4 é um gráfico de barras representando os efeitos de ultra-sons de alta frequência na actividade de caspase-3 celular. A Figura 5 é um gráfico de barras mostrando o efeito de irradiação na eficiência de clonagem de células K562. Os resultados estão expressos como a média ± SEM de 3 experiências independentes. A Figura 6 é um gráfico de barras mostrando a percentagem de células K562 apoptóticas, 5 horas após 1 ou 3 tratamentos ultra-sónicos. A taxa de apoptose é determinada por citometria de fluxo após coloração com Anexina-V e os resultados estão expressos como a média ± SEM de 7 experiências independentes. A Figura 7 é um gráfico de pontos mostrando as alterações da distribuição de fosfatidilserina de acordo com o tempo e tratamentos ultra-sónicos sucessivos. Os resultados de uma experiência representativa estão expressos como percentagem de células coradas com Anexina-V-FITC. A Figura 8 é um gráfico de barras mostrando o efeito do tratamento ultra-sónico sobre a apoptose de células mononucleares normais (MNC) e de células leucémicas (Nalm-6, KGla, HL-60, e células leucémicas primárias obtidas a partir de 5 pacientes). Os resultados são a média ± SEM de 5 experiências independentes.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A apoptose, ou morte celular programada, é um componente normal do desenvolvimento e da saúde de organismos multicelulares. A apoptose assegura a homeostasia de tecidos durante o desenvolvimento, defesa do hospedeiro, envelhecimento e ocorre em resposta a uma grande variedade de sinais incluindo irradiação γ e exposição a ultravioletas. As células morrem em resposta a uma variedade de estímulos, tipicamente, durante a apoptose, elas fazem-no de um modo controlado. Isto torna a apoptose distinta doutra forma de morte celular denominada necrose na qual a morte celular não controlada conduz a lise de células, a respostas inflamatórias e, potencialmente, a graves problemas para a saúde. A 4 ΕΡ 1 562 642 /PT apoptose, por contraste, é um processo no qual as células desempenham um papel activo na sua própria morte, motivo pelo qual a apoptose é frequentemente designada por suicídio celular.

Ao receber sinais específicos instruindo as células para sofrerem apoptose, ocorrem tipicamente na célula várias modificações bioquímicas e morfológicas características. Por exemplo, uma família de proteínas conhecidas como caspases é tipicamente activada nas etapas precoces da apoptose. Estas proteínas quebram ou clivam substratos celulares chave que são requeridos para a função celular normal, incluindo proteínas estruturais no citoesqueleto e proteínas nucleares, tais como enzimas de reparação de ADN. As caspases podem também activar outras enzimas de degradação tais como ADNases, que clivam o ADN no núcleo. Em geral, a morte celular apoptótica é caracterizada por alterações precoces na membrana nuclear, condensação de cromatina e fragmentação de ADN. Estas alterações bioquímicas resultam em alterações morfológicas na célula.

Os ensinamentos aqui apresentados são dirigidos a dispositivos e métodos que podem neutralizar, prevenir crescimento de, e remover células hiperproliferativas (e.g., células de tumor) presentes num meio líquido. Em concretizações mais específicas, os métodos e dispositivos aqui proporcionados induzem apoptose em células hiperproliferativas presentes numa suspensão, tal como um fluido fisiológico. Fluidos fisiológicos tratáveis incluem sangue, plasma, soro e fluido cerebrospinal, que podem ser extraídos a partir de e/ou administrados a animais, incluindo mamíferos, humanos e outros. 0 tratamento ultra-sónico de alta frequência, de baixa energia, de acordo com os presentes ensinamentos, pode induzir efeitos apoptóticos em células hiperproliferativas. Estes efeitos incluem, por exemplo, ter um efeito nas membranas mitocondriais (perda de potencial mitocondrial), perda de assimetria de fosfatidilserina, provocando uma oxidação de lípido da membrana (diminuição do nível de GSH celular), variações morfológicas, fragmentação de ADN, perda de membrana plasmática, e outros. Adicionalmente, a apoptose induzida por ultra-sons de baixa energia pode envolver a activação de caspase-3, a degradação proteolítica do substrato de caspase PARP, e a modulação da razão bcl-2/bax nas células. 5

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Testes específicos (ver Exemplos) têm confirmado a indução muito rápida de apoptose com quantidades limitadas de necrose.

Dispositivos e métodos

Concretizações dos dispositivos que podem ser utilizados para implementar os métodos inventivos podem ser encontrados no Pedido de Patente Provisório dos E.U.A. 60/423 368, Pedido de Patente dos E.U.A. 10/358445 e Patente dos E.U.A. N.° 6 540 922 de Cordemans et al. Métodos para tratamento de células hiperproliferativas podem ser realizados com os dispositivos aqui revelados. Na FIGURA 1 ilustra-se uma concretização particular de um dispositivo que pode ser utilizado para tratamento de um meio liquido tal como um meio aquoso (e.g., fluidos fisiológicos). Em certas concretizações, os fluidos a serem tratados contêm células hiperproliferativas. Noutras concretizações, os fluidos a serem tratados podem ser um liquido fisiológico suspeito de conter células hiperproliferativas, tal como após diagnóstico, por exemplo. Podem também ser tratadas células que não estão completamente diferenciadas, tais como células estaminais, bem como soluções contendo vírus e/ou células infectadas por virus. Exemplos de vírus tratáveis podem incluir HIV, HCV, HBV, Herpes virus, hantavírus, influenza e Ebola, por exemplo.

Por referência à FIGURA 1, os dispositivos aqui descritos incluem um compartimento 2, preferivelmente na forma de um cilindro ou com uma secção transversal rectangular. Em certas concretizações, o compartimento 2 pode estar em comunicação com um reservatório (não mostrado) que contém o meio líquido a tratar. Noutras concretizações (e.g., quando se trata um fluido fisiológico humano ou animal), os dispositivos aqui proporcionados não contêm um reservatório e estão directamente conectados ao corpo humano ou animal. Estas concretizações incluem aquelas onde o fluido fisiológico é extraído e/ou administrado (e.g., reinjecção) durante o tratamento extracorporal do corpo humano ou outro corpo animal. Deste modo, um animal tal como um humano pode ser aqui utilizado, numa qualquer referência, em substituição de "reservatório."

Noutras concretizações, uma suspensão de células hiperproliferativas pode ser tratada num dispositivo como se mostra na FIGURA 2. Nesta concretização, utiliza-se um tubo de entrada de ar 3 como um emissor de microbolhas 3 para emitir 6 ΕΡ 1 562 642 /PT microbolhas 5 para o interior da suspensão de células hiperproliferativas 22 contida num compartimento (ou bolsa) 20. O compartimento (ou bolsa) 20, contendo a suspensão de células 22, pode estar imerso num banho de água 24, tal como uma incubadora, por exemplo.

Em concretizações adicionais, o compartimento 2 contém (e.g., ao longo da sua parede ou adjacente ao fundo) um ou mais emissores de ultra-sons de alta frequência 1 que emitem ultra-sons 4 para o interior do compartimento 2 (vantajosamente no sentido do centro deste compartimento 2) . Noutras concretizações, o contentor pode também ter um ou mais emissores de microbolhas 3 para emissão de microbolhas de gás 5, que estão dispostos de modo a emitirem as microbolhas de gás 5 para o interior do campo de ultra-sons 4 emitido no compartimento 2. O termo "microbolhas," conforme aqui utilizado, pretende referir-se a bolhas de gás com um diâmetro médio inferior a 1 mm. Nalgumas concretizações, o diâmetro é menor ou igual a 50 pm. Ainda noutras concretizações, as microbolhas têm um diâmetro inferior a 30 pm. Em certas concretizações, as microbolhas são seleccionadas de entre microbolhas de ar, de oxigénio e de ozono, ou uma sua mistura. Para reduzir os custos de operação, pode ser vantajoso utilizar microbolhas que não sejam microbolhas de ozono, tais como microbolhas de ar. Concretizações vantajosas do invento não se baseiam na geração de um efeito térmico para tratar as células. Embora em certas concretizações a utilização de microbolhas estabilizadas possa ser eficaz no tratamento de células, em concretizações preferidas, é desnecessária a utilização de microbolhas estabilizadas. As microbolhas de fronteira lipidica são um exemplo de uma microbolha estabilizada. O termo "células hiperproliferativas" pretende designar células que se dividem, reproduzem ou de outro modo proliferam a uma velocidade relativamente elevada, e pode incluir células de cancro (e.g., células leucémicas), células pré-cancerosas, células de tumor, células de medula óssea e células totipotentes.

Em certas concretizações, o termo "meio líquido" refere-se a líquidos fisiológicos que podem ser administrados ao ser humano ou a animais, e/ou extraídos a partir do ser humano ou de animais. Em concretizações específicas, os 7

ΕΡ 1 562 642 /PT fluidos fisiológicos são reinjectados após tratamento (e.g., um tratamento ex vivo) . Em certas concretizações, o termo "líquidos fisiológicos" pode incluir, sangue, soro, fluido cefalorraquidiano, fluido cerebrospinal, plasma e outros. A Patente dos E.U.A. N.° 5 401 237, publicada de Tachibana et al.r descreve um processo de extracção e de readministração de fluido fisiológico.

Em concretizações especificas, os presentes métodos e dispositivos incluem ultra-sons de alta frequência, de baixa energia, para tratar células hiperproliferativas. O termo "alta frequência" pretende referir-se a frequências superiores a 100 kHz e até vários MHz. Em certas concretizações, as elevadas frequências utilizadas estão entre 200 kHz e 20 MHz. Em várias concretizações, a frequência de ultra-sons pode ser seleccionada entre 200 kHz até 10 MHz. Numa concretização preferida, a frequência utilizada está entre 200 kHz e 1,8 MHz.

Em várias concretizações dos dispositivos aqui descritos, o emissor de microbolhas 3 para emissão de microbolhas de gás 5 está disposto na base 11 do compartimento 2, (i.e., no fundo do compartimento 2), tal que as microbolhas se movem elevando-se naturalmente ou por aprisionamento do gás no fluxo de liquido.

Em concretizações adicionais, os dispositivos e métodos aqui descritos induzem a apoptose em células hiperproliferativas. Descobriu-se que as células saudáveis são muito menos sensíveis a ultra-sons de alta frequência do que as células leucémicas. Esta diferença de comportamento entre as células saudáveis e leucémicas não pode estar relacionada com uma diferença na localização dos fotossensibilizadores endógenos mas é provavelmente devida a uma modificação dos mecanismos fundamentais da célula, tais como o estado de p53, percursos de sinalização e resistência stress oxidativo, por exemplo. Especificamente, a apoptose pode ser induzida em células cancerosas (e.g., leucémicas), células pré-cancerosas, células de tumor, células medula óssea, células totipotentes e outras.

Em concretizações mais específicas, os dispositivos e métodos aqui proporcionados podem produzir radicais tais como ROS (espécies de oxigénio reactivo), H‘, 'OH e HOO' que podem também formar H2O2, esta molécula e/ou estes radicais sendo 8 ΕΡ 1 562 642 /PT tóxicos para células hiperproliferativas e assim efectuando a sua inactivação e/ou destruição. Produtos de peroxidação de lípido, resultantes do stress oxidativo criado sob as condições ultra-sónicas são também participantes potenciais neste biomecanismo.

Embora tenha sido apresentada evidência contra a formação de oxigénio singuleto durante a terapia sonodinâmica, estes dados são apenas consistentes com uma exposição a ultra-sons de "alta energia" e prolongada, conduzindo a uma acumulação de radicais livres derivados de sensibilizador, quer por pirólise directa quer devido a reacções com radicais H* ou 'OH formados por pirólise do solvente aquoso.

Pensa-se que as espécies criadas, utilizando os métodos e dispositivos revelados, são obtidas a partir da reacção de ultra-sons de alta frequência sobre uma molécula de água, muito provavelmente dando origem (em particular na presença de oxigénio) às reacções seguintes:

H20 -> H' + ‘OH H‘ + 02 -> H00‘ H00' + H00' -» H202 + 02, ‘OH + ‘OH -> H202

Vantajosamente, a energia requerida para produzir estas espécies tóxicas é reduzida se o processo for realizado na presença de microbolhas, conforme aqui descrito. Em certas concretizações, um gerador está configurado para fornecer potência ao emissor a menos do que 1 W/cm2. Em concretizações preferidas, a potência é fornecida a cerca de 0,5 W/cm2 ou inferior, ou em muitas concretizações mais vantajosas a cerca de 0,25 W/cm2 ou inferior. Em concretizações vantajosas, a potência dissipada no volume de fluido fisiológico a partir deste nível de potência aplicado ao emissor é inferior a 30 mW/cm3. Nalgumas concretizações, a potência é dissipada a cerca de 7 mW/cm3.

Embora em certas concretizações, os ultra-sons possam ser administrados continuamente, noutras concretizações, os ultra-sons podem ser administrados intermitentemente, utilizando ciclos de LIGADO/DESLIGADO ("ON/OFF"). Os peritos na 9 ΕΡ 1 562 642 /PT especialidade podem determinar tempos de ciclo LIGADO/DESLIGADO eficazes dependendo do volume de células, do tipo de células e doutras variáveis relevantes.

Em concretizações adicionais, os presentes ensinamentos referem-se ao tratamento de células hiperproliferativas em suspensão, em oposição a um tumor ou massa neoplásica. Nestas concretizações, os presentes ensinamentos não confiam nas microbolhas para se concentrarem ou agruparem num local de tumor particular. Isto permite o tratamento de células hiperproliferativas indesejadas que não se agrupam em conjunto.

Outra vantagem dos métodos e dispositivos aqui proporcionados é que as células hiperproliferativas podem ser tratadas eficazmente em curtos períodos de tempo. Em concretizações específicas, as células hiperproliferativas podem ser tratadas em menos de 1 minuto. Em concretizações ainda mais específicas, as células podem ser tratadas em menos de 30 segundos, incluindo entre 5-20 segundos, por exemplo.

Como é conhecido na especialidade, os modos biofísicos de acção ultra-sónica são classificados como possuindo quer efeitos térmicos, de cavitação, quer efeitos não térmicos e de não cavitação. É importante notar que, utilizando as gamas de potência anteriormente descritas e os tempos de tratamento curtos, se evita o aquecimento significativo do fluido e/ou das células tal que ocorrem poucas ou nenhumas mortes celulares geradas por calor. Como exemplo, tratamentos resultando num efeito não térmico incluem tratamentos conduzidos a temperaturas inferiores a 40°C, 35°C e 30°C. Os níveis de potência são também tais que não ocorre cavitação numa extensão significativa, pelo que se evita substancialmente a danificação da membrana celular devida aos ultra-sons.

Sob potências de ultra-sons mais elevadas, constatou-se recentemente que a injecção de microbolhas para o interior do campo de ultra-sons dá origem a um aumento no fenómeno de sonoluminescência, por sobreposição das microbolhas sobre as bolhas de cavitação induzidas pelos ultra-sons, o número de espécies excitadas e tóxicas pode ser multiplicado. Este fenómeno é observado a um nível macroscópico quando o tratamento de ultra-sons é combinado sinergicamente com a presença de microbolhas de tamanho adequado. 10

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Em concretizações adicionais, os dispositivos e métodos aqui proporcionados têm a vantagem de não haver qualquer necessidade de dedicar os ultra-sons a zonas especificas, dado que se observa que o sistema de tratamento funciona por difusão dos produtos formados in situ (por exemplo radicais e H202 formados) no sentido do reservatório 6 do meio aquoso a tratar.

Ainda noutras concretizações, os um ou mais emissores 1 de ultra-sons 4 nos dispositivos aqui descritos estão orientados de modo a não darem origem a quaisquer fenómenos de ondas permanentes. Por exemplo, em certas concretizações, um ou mais emissores de ultra-sons podem estar orientados obliquamente em relação ao eixo 9 do compartimento 2 (ângulo agudo não perpendicular a este eixo 9) e em relação ao fluxo de liquido e ao fluxo de microbolhas 5 (ver FIGURA 1) . Esta caracteristica torna possível que todas as microbolhas 5 no compartimento 2 sejam tratadas de um modo estatisticamente idêntico, sem a criação de zonas estacionárias no compartimento 2.

Os dispositivos e métodos podem aqui incluir a emissão de microbolhas de gás com um diâmetro médio inferior a 1 mm num campo de ultra-sons de alta frequência no meio líquido tratado. Nalgumas concretizações, o diâmetro das microbolhas é menor ou igual a 50 pm. Ainda noutras concretizações, as microbolhas têm um diâmetro inferior a 30 pm. Em certas concretizações, as microbolhas são seleccionadas entre microbolhas de ar, oxigénio e ozono. Noutras concretizações, as microbolhas não são microbolhas de ozono.

De acordo com outras concretizações, os dispositivos e métodos aqui descritos podem incluir um emissor de luz 12 (i.e. um emissor de radiação electromagnética) que emite para o interior do compartimento 2 no campo de ultra-sons 4, radiação com uma frequência que está essencialmente na gama visível. Contudo, para certas aplicações, de modo a remover certas células hiperproliferativas específicas, é vantajoso emitir radiação electromagnética com uma frequência que é essencialmente não visível, tal como radiação ultravioleta (e.g.f do tipo UVA, UVB ou UVC), infravermelhos, laser ou microondas.

Inesperadamente, verificou-se recentemente que um tratamento compreendendo a emissão de microbolhas para o 11

ΕΡ 1 562 642 /PT interior dos campos combinada com ultra-sons e opcionalmente radiação luminosa é particularmente eficaz na inactivação e remoção de células hiperproliferativas presentes num meio líquido,· tal como um fluido fisiológico. 0 fenómeno de luminescência pode promover a produção de espécies oxigenadas extremamente activas tais como o radical superóxido ou oxigénio singuleto, o que pode resultar numa série de reacções bioquímicas que são extremamente tóxicas para certas células hiperproliferativas. Em concretizações vantajosas, a radiação é emitida intermitentemente em ciclos LIGADO/DESLIGADO. Em concretizações mais específicas, o ciclo LIGADO/DESLIGADO pode ser cerca de 5,5 ms/3 ms. É conhecido que a luminescência pode ocorrer na presença de assim denominadas moléculas de sensibilização (e.g., fotossensibilizadores e sonossensibilizadores), de modo a dar origem a uma acção antitumoral sobre certas células de cancro. Estas moléculas podem incluir: porfirinas, clorinas, tetraciclinas, azul de metileno, fluoresceína, acridina, rodamina, e outras. Estes agentes activos podem ser injectados no interior do organismo ou administrados oralmente e subsequentemente activados por sonoluminescência. Após activação, estes agentes podem produzir oxigénios singuletos que, por sua vez, desempenham um papel fundamental, em particular, em processos bioquímicos resultantes de stress oxidativo. Especificamente, um oxigénio singuleto pode oxidar os vários componentes da célula, tais como proteínas, lípidos, aminoácidos e nucleótidos, por exemplo.

Noutras concretizações, podem-se utilizar partículas sólidas ou superfícies sólidas para potenciar sinergias da luminescência e/ou emissão de radiação. Estes sólidos podem incluir Ti02, argilas e cerâmicos, por exemplo. Várias concretizações são dirigidas a dispositivos e métodos que não requerem produtos químicos adicionais, tais como fotossensibilizadores e/ou sonossensibilizadores, para neutralizar, prevenir o crescimento de, e/ou remover células hiperproliferativas de um meio fisiológico. Nem sempre é necessário adicionar um agente de fotossensibilização ou sonossensibilização ao meio líquido a tratar, uma vez que se observou inesperadamente que a luminescência pode ser produzida in situ sobre certas células hiperproliferativas (e.g., certas células leucémicas) presentes em fluidos 12

ΕΡ 1 562 642 /PT fisiológicos (e.g., sangue) já contendo estas moléculas de fotossensibilização.

Embora os dispositivos e métodos aqui proporcionados possam ser utilizados conjuntamente com outras drogas, tais como fotossensibilizadores, sonossensibilizadores, agentes quimioterapêuticos, antibióticos, drogas antivirais, é importante notar que a eficácia dos métodos e dispositivos proporcionados, no tratamento de células hiperproliferativas, não está dependente da utilização doutros produtos químicos, reagentes ou drogas. Por conseguinte, os métodos e dispositivos aqui descritos podem ser utilizados sem substâncias adicionais, incluindo produtos químicos, reagentes, hormonas, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, vacinas de ADN, estimulantes de angiogénese ou drogas. Em concretizações ainda mais específicas, os presentes ensinamentos não se baseiam na absorção celular destas substâncias.

Especificamente, os efeitos obtidos com os presentes ensinamentos podem ser conseguidos sem a necessidade fotossensibilizadores e sonossensibilizadores clássicos. Os efeitos fisiológicos obtidos com técnicas tais como PDT dependem ao mesmo tempo da dose de radiação, da natureza do fotossensibilizador utilizado, da sua concentração e da sua localização. Embora sejam requisitos para tratamentos tradicionais, os sensibilizadores não são necessários para os ensinamentos aqui proporcionados, simplificando-se deste modo consideravelmente os métodos e dispositivos.

Em certas concretizações, os efeitos resultantes da acção ultra-sónica implicam fotossensibilizadores endógenos na estrutura onde a sua concentração local é elevada. Por exemplo, fotossensibilizadores endógenos estão localizados principalmente nas estruturas de membrana, tais como lisossomas, mitocôndrias, membranas nucleares, complexo de Golgi e os microssomas do retículo endoplasmático, cuja superfície relativa representa aproximadamente 50% da superfície da membrana celular.

Nalgumas concretizações, os dispositivos e métodos aqui descritos podem incluir uma bomba para circulação do meio líquido, bem como um ou mais aparelhos para recuperação, preferivelmente por filtração, centrifugação ou precipitação (tais como ciclones, etc.), de células hiperproliferativas 13

ΕΡ 1 562 642 /PT presentes no meio líquido. Em certas concretizações, a bomba e/ou aparelhos para recuperação estão dispostos entre o reservatório (ou animal) contendo o meio líquido a tratar e o compartimento 2.

Em certas concretizações, os dispositivos e métodos podem ser aqui utilizados para extrair fluido fisiológico (e.g., sangue) a partir de um sujeito, suspeito de (e.g., diagnosticados) de ter cancro (e.g., leucemia). Após extracção, o fluido fisiológico pode ser tratado com ultra-sons de alta frequência, de baixa energia, e com microbolhas de gás com diâmetros inferiores a 1 mm. Em certas concretizações, os métodos induzem apoptose de células cancerosas (e.g., leucemia). Após tratamento do fluido fisiológico, tal que as células hiperproliferativas foram suficientemente neutralizadas, impedidas de crescerem ou removidas, o fluido pode depois ser administrado de retorno ao sujeito. Estes métodos podem ser realizados de modo similar a outros métodos ex vivo, tais como hemodiálise, por exemplo.

Um sujeito cujo sangue se pretende tratar pode ser ligado a um dos dispositivos aqui descritos. De acordo com certas concretizações, a corrente sanguínea do sujeito pode ser ligada a um dispositivo de ultra-sons aqui descrito, através de uma fístula interna no seu braço. Isto envolve ter uma artéria e uma veia ligadas cirurgicamente. Quando estas são juntas, o fluxo de sangue mais forte a partir da artéria faz com que a veia se torne mais larga. Podem ser inseridas agulhas na veia alargada para ligar o sujeito ao dispositivo de ultra-sons.

Outra via para proporcionar o acesso à corrente sanguínea é inserir um enxerto interno. Neste procedimento, uma artéria é ligada cirurgicamente a uma veia com uma pequena peça de tubagem especial colocada sob a pele, no interior da qual se pode inserir uma agulha.

Noutras concretizações, quando é necessário ter rapidamente acesso à corrente sanguínea, ou quando as veias nos braços são demasiado pequenas para proporcionar sangue suficiente para tratamento ultra-sónico, por exemplo, pode-se utilizar um cateter venoso central. Neste procedimento, um tubo mole é inserido cirurgicamente numa veia larga no pescoço ou próxima da clavícula. Nalgumas concretizações, este método 14

ΕΡ 1 562 642 /PT pode ser temporário até estar pronto um local de acesso permanente.

Sujeitos que podem ser tratados de acordo com os métodos aqui descritos podem incluir qualquer animal, tal como um mamífero, incluindo humanos, ratinhos, macacos, cães ou porcos.

Em concretizações adicionais, os presentes dispositivos e métodos utilizam ondas ultra-sónicas de alta frequência, de baixa energia, para prevenir, tratar ou neutralizar células hiperproliferativas por indução de apoptose nas células (e.g. células leucémicas). A indução de apoptose em células hiperproliferativas pode conduzir a uma sequência de eventos característicos incluindo uma queda no potencial mitocondrial, perda de assimetria de fosfatidilserina, variações morfológicas, fragmentação de ADN, perda de membrana plasmática, e outros. Para além disso, a apoptose induzida por ultra-sons de baixa energia podem envolver a activação de caspase-3, a degradação proteolítica do substrato de caspase PARP, e a modulação da razão bcl-2/bax nas células. Métodos adicionais envolvem a iniciação da apoptose utilizando luminescência sonoquímica induzida por ultra-sons para despoletar a produção de oxigénio singuleto fotossenssibilizada a partir de foto-irradiação directa. Em condições de irradiação ultra-sónica clássica, os efeitos de cavitação destrutiva directa dominam a sonoluminescência, que é razoavelmente fraca na ausência de uma interface ar/líquido injectada no interior do meio. Deste modo, pode ser vantajoso utilizar microbolhas conjuntamente com ultra-sons, de modo a intensificar a luminescência em relação aos efeitos de cavitação.

Os exemplos seguintes descrevem o tratamento de células com ultra-sons de alta frequência, de baixa energia, e vários ensaios para indicar a presença de apoptose nas referidas células. EXEMPLO 1

Preparação de células e tratamento com ultra-sons de alta

Cultivaram-se linhas de células de leucemia de humano (K562, Nalm-6, KGla e HL-60), obtidas na American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, E.U.A.), em RPMI-1640 15 ΕΡ 1 562 642 /PT (BioWhittaker, Walkersville, MD, E.U.A.) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (Gibco, Grand Island, NY, E.U.A.) e 1% de L-glutamina (Gibco). Colheram-se as células leucémicas, ressuspenderam-se em solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH = 7,2, Gibco), e utilizaram-se imediatamente para a experiência. Obteve-se sangue venoso heparinizado a partir de voluntários saudáveis e de pacientes leucémicos. As células mononucleares foram separadas por centrifugação em gradiente de densidade Ficoll-Hypaque (International Medicai Products, Bruxelas, Bélgica).

Descreve-se a seguir o tratamento ultra-sónico das células. Trataram-se linhas de células de leucemia de humano (K562, HL-60, KGla e Nalm-6), células leucémicas primárias e células mononucleares normais, por ultra-sons a uma frequência de 1,8 MHz durante vários tempos de exposição, a uma potência acústica de 7 mW/ml e ciclos de irradiação (LIGADO/DESLIGADO) de 5,5 ms/3 ms.

Após 18 horas de cultura na incubadora (37°C e 5% de CO2), testaram-se sucessivamente as células quanto à viabilidade celular por um ensaio de exclusão de azul de tripano. Realizaram-se testes adicionais sobre as células tratadas e descrevem-se em maior detalhe nos exemplos seguintes. A apoptose foi avaliada por morfologia celular, exposição a fosfatidilserina e fragmentação de ADN. O potencial mitocondrial, o teor de glutationa, a activação de caspase-3, a clivagem de PARP e a razão bcl-2/bax foram testados por citometria de fluxo. A eficiência de clonagem foi avaliada por ensaios de metilcelulose. EXEMPLO 2

Efeito de ultra-sons de alta frequência na fragmentação de ADN

A fragmentação de ADN tem sido associada a apoptose. A quantificação de células com ADN degradado foi realizada utilizando um método descrito por Nicoletti, I. et al. J. Immunol. Methods 139(2):271 (1991) e um Apotarget Quick DNA

Ladder Detection Kit (Biosource). Ressuspenderam-se os sedimentos de células (106 células) em 20 1 de tampão de lise e extraiu-se o ADN de acordo com as instruções do fabricante. O ADN foi analisado após separação por electroforese em gel (1% de agarose) . Como controlo positivo, as células foram irradiadas com luz UV colocando uma placa directamente sob um 16 ΕΡ 1 562 642 /PT transiluminador UV durante 10 minutos (intensidade de 5 mW/cm2) . As células foram depois incubadas a 37°C durante 5 e 18 horas antes de se avaliar a apoptose.

Após permeabilização, as células foram incubadas com uma solução contendo PI e ARNase (Reagente Coulter DNA-prep). Os tubos foram colocados a 4°C no escuro de um dia para o outro antes da análise por citometria de fluxo para identificar o pico sub-GO correspondendo a apoptose.

Observaram-se padrões em escada de ADN nucleossómico clássicos em amostras de ADN a partir de células tratadas por ultravioletas (controlo positivos) e por ultra-sons. A clivagem de ADN internucleossómico apenas foi notada 5 horas após o tratamento ultra-sónico mas tornou-se claramente evidente 18 horas depois (resultados não mostrados). Para além disso, com coloração de PI observou-se um aumento no número de núcleos com ADN fragmentado, 5 horas após tratamento. Especificamente, 15% das células tratadas tinham ADN fragmentado e 2% das células não tratadas tinham ADN fragmentado (dados não mostrados). EXEMPLO 3

Efeito de ultra-sons de alta frequência no potencial de transmembrana mitocondrial A ruptura precoce do potencial transmembranar mitocondrial (ΔΥm), que precede a fragmentação avançada de ADN, tem sido observada em vários modelos de apoptose celular. Realizou-se o ensaio seguinte para determinar o efeito do tratamento ultra-sónico de alta frequência no ΔΥm. O potencial mitocondrial foi estimado por incorporação do fluorócromo catiónico DÍOC6 imediatamente após o tratamento da célula de acordo com o protocolo publicado encontrado em A. Macho, et al.r Blood 86(7): 2481 (1995).

Resumidamente, incubaram-se células K562 (106/ml) com 2,5 nmol/1 de 3,3'-di-hexiloxacarbocianina (DiOC6; Molecular Probes, Eugene, OR) durante 15 minutos a 37°C, seguindo-se análise citométrica de fluxo. O tratamento ultra-sónico foi acompanhado por um aumento de populações celulares exibindo um ΔΥm baixo (resultados não apresentados). Uma população de células exibindo uma 17 ΕΡ 1 562 642 /PT incorporação de DiOC6 reduzida foi evidenciada 30 minutos após tratamento, e a queda de potencial mitocondrial foi muito evidente 5 horas após o tratamento ultra-sónico, com mais do que 50% das células possuindo um ΔΥm baixo. Estes resultados proporcionam evidência de apoptose celular. EXEMPLO 4

Efeito de ultra-sons de alta frequência nos níveis de glutationa celular

Tem sido mostrado que existe uma depleção de glutationa durante a apoptose. Foi realizado um ensaio para determinar o teor em glutationa celular após tratamento ultra-sónico. Utilizou-se rastreador de células ("Cell Tracker") verde CMFDA (diacetato de 5-clorometilfluoresceína; Molecular Probes) para determinação dos níveis de glutationa intracelular, conforme anteriormente descrito em D.W. Hedley et al. Cytometry 15: 349 (1994) .

Directamente após tratamento ultra-sónico, surgiu uma subpopulação com níveis inferiores de GSH do que os observados em células não tratadas (>50% de células exibindo um nível baixo de GSH) como se mostra na FIGURA 3. Os resultados de tratamentos sucessivos mostraram uma depleção de GSH maior após 5 horas. Os resultados, expressos como uma percentagem de células exibindo um nível de GSH comparável ao de células não tratadas, demonstram claramente que o tratamento ultra-sónico de alta frequência está associado com a depleção de GSH. EXEMPLO 5

Efeito de ultra-sons de alta frequência na actividade de caspase-3 celular

Tem sido mostrado que a caspase-3 desempenha um papel importante na apoptose induzida por quimioterapia. Especificamente, a activação de caspases conduz à morte da célula via clivagem de substratos celulares tais como actina, gelsolina ou PARP. Para abordar directamente o envolvimento da caspase-3 na apoptose induzida por ultra-sons, determinou-se a actividade de caspase utilizando citometria de fluxo e um ensaio colorimétrico.

Especificamente, a caspase-3 foi detectada por análise de citometria de fluxo utilizando o anticorpo policlonal de 18

ΕΡ 1 562 642 /PT coelho conjugado com ficoeritrina (PE) anti-anticorpo monoclonal de caspase-3 activa (BD-Pharmingen, San Diego, CA, USA) . Fixaram-se as células e permeabilizaram-se utilizando o "kit" Fix and Perm (Caltag, Burlingame, CA) durante 15 minutos à temperatura ambiente. Depois, coraram-se as células com Ab anti-caspase-3 e incubaram-se durante 15 minutos. Lavaram-se as células e analisaram-se por citometria de fluxo. Determinou-se a actividade enzimática de caspase-3 utilizando o "kit" de ensaio de protease Apotarget caspase-3/cpp32/colorimétrico (Biosource), conforme sugerido pelo fabricante. A activação de caspase-3 foi também avaliada indirectamente por clivagem de PARP, utilizando um Ab de coelho anti-local de clivagem de PARP, conjugado com FITC (Biosource).

Como se mostra na FIGURA 4, o tratamento ultra-sónico de alta frequência conduziu à activação de caspase-3. Além do mais, esta actividade de protease foi máxima 1 hora pós-tratamento. Adicionalmente, a clivagem de PARP era evidente 2 horas após tratamento, com 40% de células coradas pelo anti-PARP-FITC de coelho vs. 5% para células não tratadas (resultados não mostrados). EXEMPLO 6

Efeito de ultra-sons de alta frequência na razão celular BCL-2/BAX

Diferentes proteínas da família bcl-2 têm sido implicadas no desencadeamento ou na prevenção da apoptose. O ensaio seguinte foi realizado para determinar se bcl-2 e bax, os dois membros principais da família bcl-2, estavam ou não envolvidos na indução de apoptose por ultra-sons. Após permeabilização, incubaram-se as células com controlo negativo do mesmo isotipo, anticorpo de ratinho marcado com FITC anti-bcl-2 de humano (Dako, Glostrup, Dinamarca), e anticorpos policlonais de coelho para bax. Subsequentemente, adicionou-se à bax anticorpo secundário marcado com FITC (Dako). Para quantificar a expressão de bcl-2 e de bax, o citómetro foi calibrado utilizando uma mistura de pérolas marcadas com quantidades conhecidas de fluorócromo (Dako). Os valores de intensidade fluorescente média (mfi) foram depois convertidos para moléculas de fluorócromo solúvel equivalente (MESF) utilizando uma curva de calibração. 19

ΕΡ 1 562 642 /PT

Os resultados (dados não fornecidos) demonstraram que as células não tratadas exprimiram niveis elevados da proteina anti-apoptótica, proteina bcl-2 (47 ± 4 χ 103 MESF), e esta expressão aparece como um pico de fluorescência unimodal. Uma hora após tratamento ultra-sónico, a expressão de proteina bcl-2 já estava sub-regulada (respectivamente 40 ± 0,9 e 32 ± 0,9 χ 103 MESF em células K562 tratadas por 1 ou 3 tratamentos ultra-sónicos) . Duas horas após tratamento, a expressão de bcl-2 surgiu claramente bimodal, as células exibindo quer um fenótipo bcl-2alto (comparável ao de células não tratadas) quer um fenótipo bcl-2baixo (11 ± 2 χ 103 MESF).

Em contraste com a bcl-2, os níveis da proteína pró-apoptótica, bax, eram mais elevados em células tratadas com ultra-sons em comparação com as células não tratados (respectivamente 85 ± 0,5 e 48 ± 5 χ 103 MESF para K562 tratadas e não tratadas). A proporção de bcl-2/bax foi assim significativamente reduzida durante o tratamento ultra-sónico de alta frequência, proporcionando evidência de apoptose celular (0,98 para células de controlo vs. 0,38 para células tratadas com ultra-sons). EXEMPLO 7

Efeito de ultra-sons de alta frequência nos níveis de fosfatidilserina celular

Durante a apoptose, os resíduos de fosfatidilserina saltam do interior para o exterior da membrana plasmática e esta alteração pode ser detectada utilizando Anexina-FITC, que se liga aos resíduos de PS. Descreve-se a seguir um ensaio de Anexina-V que foi realizado. A análise citométrica de fluxo de células coradas com Anexina-V-isotiocianato de fluoresceína (FITC) e iodeto de propídio (PI) foi realizada utilizando o kit comprado na Biosource International (Camarillo, CA, E.U.A.) conforme recomendado pelo fabricante. Os resultados foram apresentados como representações gráficas de pontos mostrando a alteração em intensidade de fluorescência média de Anexina-V-FlTC/iodeto de propídio (não apresentadas).

Os resultados mostraram que as alterações da distribuição de fosfatidilserina variaram de acordo com o tempo. Especificamente, os resultados mostraram que o tratamento ultra-sónico provocou a danificação da membrana plasmática numa baixa percentagem de células, demonstrando que a acção 20

ΕΡ 1 562 642 /PT necrótica do tratamento com ultra-sons testado é muito fraca. De um modo interessante, observou-se um aumento em células apoptóticas duas horas após tratamento. Cinco horas após o tratamento, 35% das células eram positivas em relação à Anexina-v, demonstrando a indução ultra-sónica de apoptose em células K562. EXEMPLO 8

Efeito de ultra-sons de alta frequência na formação de colónias

Uma prova importante de um efeito na viabilidade celular é a incapacidade de uma célula para se multiplicar e formar uma colónia. Descreve-se a seguir um ensaio clonogénico que foi realizado numa linha de células K562 para determinar o efeito da irradiação ultra-sónica de alta frequência na eficiência de clonagem. Resumidamente, o meio de cultura consistiu de IMDM suplementado com 20% de FCS e metilcelulose numa concentração final de 4%. Incubaram-se as culturas a 37°C em ar com 5% de C02, e contaram-se as colónias (> 20 células) após 5 dias. A eficiência clonogénica da linha de células K562 foi de 16%. Como se mostra na FIGURA 5, observa-se um redução significativa em eficiência de clonagem de células K562 após 1 e 3 tratamentos (respectivamente 25% e 42% de inibição), confirmando a sensibilidade de células leucémicas a ultra-sons de alta frequência. EXEMPLO 9

Efeito de sequestrantes de oxigénio na apoptose 0 procedimento seguinte foi realizado para determinar o efeito de sequestrantes ("scavengers") de oxigénio activo na indução de apoptose por ultra-sons de alta frequência. Incubaram-se células K562 com L-histidina (10 mM) e/ou manitol (100 mM) . Algumas células foram tratadas com ultra-sons de alta frequência e outras não. A apoptose das células foi detectada por um ensaio de Anexina-V/PI. Os resultados, conforme apresentados na Tabela 1, demonstram que a danificação na célula induzida por ultra-sons é reduzida significativamente na presença de histidina e manitol (respectivamente 43% e 47% de inibição de apoptose induzida por 3 tratamentos sucessivos). 21

ΕΡ 1 562 642 /PT

Tabela 1

Efeitos de sequestrantes de oxigénio activo na apoptose de células induzida por ultra-sons

Nenhum 1 3 tratamento tratamento tratamentos com US com US com US Nenhum agente 18 ± 6 42 ± 8 63 ± 5 Histidina 15 ± 5 24 ± 8 36 ± 11 Manitol 11 ± 4 21 ± 5 30 ± 3 Histidina + manitol 11 ± 2 16 ± 3 25 ± 5 Os resultados estão expressos como percentagem de células exibindo externalização de fosfatidilserina 5 horas pós- tratamento (média ± SEM de 4 experiências independentes). A associação de manitol e histidina conduziu a mais do que 60% de inibição de apoptose. A eficácia destes agentes na redução da apoptose celular induzida por tratamento ultra-sónico proporciona evidência de que radicais oxigénio singuleto e hidroxilo induzidos por ultra-sons são mediadores importantes para induzir apoptose. EXEMPLO 10

Efeito de tratamentos sucessivos de ultra-sons de alta frequência sobre as células

Realizou-se um seguimento de citometria de fluxo nas células K562 cultivadas 0,5, 2 e 5 horas após tratamento ultra-sónico. Após um tratamento, o nivel observado de células apoptóticas era três vezes o do controlo (respectivamente 26% e 8% após 5 horas de cultura, para células tratadas e não tratadas). Observou-se também um efeito necrótico de 5 a 10%, que é bem inferior ao encontrado quando se utilizam tratamento com drogas ou tratamento fotodinâmico (PDT). Com irradiações sucessivas, sob as mesmas condições (7 mW/ml, 20 segundos) e para diferentes intervalos, a apoptose de células K562 aumentou até 37 ± 3% (p< 0,02) e 49 ± 5% (p< 0,02), respectivamente, após 1 e 3 tratamentos sucessivos (FIGURA 6). Observaram-se também variações morfológicas (e.g., contracção celular, bolhas na membrana, condensação de cromatina) após tratamentos sucessivos (resultados não apresentados). A FIGURA 7 demonstra que a quantidade de fosfatidilserina celular aumenta após tratamentos sucessivos de ultra-sons de 22

ΕΡ 1 562 642 /PT alta frequência, conforme detectado por um ensaio de Anexina-V. EXEMPLO 11

Efeito de ultra-sons de alta frequência em várias linhas de células

Para além de K562, o efeito do tratamento ultra-sónico foi testado noutras linhas de células normais e malignas, incluindo KGla (blastos imaturos minimamente diferenciados de leucemia mielóide aguda), HL-60 (leucemia promielocítica) e Nalm-β (linha de células ALL). Os resultados apresentados na FIGURA 8 demonstram que a sensibilidade a ultra-sons depende do tipo de célula, mas tratamentos sucessivos conduziram a um aumento significativo no número de células apoptóticas para todas as linhas de células avaliadas. Células mononucleares de 5 pacientes (1 com anemia refractária, com excesso de células blásticas [RAEB], 1 com leucemia mielógena aguda [AML] secundária, e 3 casos de aml classificação Francesa-Americana-Britânica [FAB] M3, M4 e M4Eo) foram também tratadas por ultra-sons, e as células blásticas foram discriminadas de células normais contaminantes com base na sua expressão de CD45, conforme anteriormente descrito em F. Lacombe, F. et al. Leukemia 11:1878 (1997). Estas células foram também marcadas quanto à sua exposição de fosfatidilserina por FlTC-anexina. Este método torna possivel comparar o comportamento apoptótico respectivo de células blásticas leucémicas e de células normais tratadas por ultra-sons. Os resultados apresentados na FIGURA 8 demonstram que as células leucémicas primárias são sensíveis a tratamento ultra-sónico, observando-se mais 37 ± 18% de células apoptóticas 5 horas após 3 tratamentos.

Lisboa

Claims (10)

1. ΕΡ 1 562 642 /PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Método in vítro de neutralização, remoção e/ou prevenção do crescimento de células isoladas hiperproliferativas não diferenciadas, ou infectadas viralmente, suspensas num fluido fisiológico compreendendo: - emissão de ultra-sons possuindo uma frequência superior a 100 kHz para o interior de um compartimento contendo o fluido fisiológico a tratar, a um nível de potência que é inferior a 30 mW/cm3; e - emissão de microbolhas de gás possuindo um diâmetro médio inferior a 1 mm para o interior do campo de ultra-sons no compartimento contendo o fluido fisiológico, tal que a emissão de ultra-sons e de microbolhas induz morte celular programada significativa nas células hiperproliferativas, não diferenciadas, ou infectadas viralmente, sem causar cavitação significativa ou sem aquecer significativamente o fluido.
2. 2. Método de acordo com a Reivindicação 1, onde as microbolhas de gás não são microbolhas de ozono.
3. 3. Método de acordo com a Reivindicação 1, onde as microbolhas de gás são seleccionadas de entre o grupo consistindo em microbolhas de ar e de oxigénio.
4. 4. Método de acordo com a Reivindicação 1, onde o fluido fisiológico é seleccionado de entre o grupo consistindo em sangue, plasma, soro e fluido cerebrospinal.
5. 5. Método de acordo com a Reivindicação 1, onde o diâmetro médio das microbolhas de gás é inferior a 50 pm.
6. 6. Método de acordo com a Reivindicação 1, onde o diâmetro médio das microbolhas de gás é inferior a 30 pm.
7. 7. Método de acordo com a Reivindicação 1, onde os ultra-sons emitidos para o interior do compartimento não geram um fenómeno de campo estacionário.
8. 8. Método de acordo com a Reivindicação 1, compreendendo adicionalmente a emissão de luz possuindo uma radiação electromagnética principalmente na gama do visível para o interior do campo de ultra-sons. ΕΡ 1 562 642 /PT 2/2
9. 9. Método de acordo com a Reivindicação 1, onde as células hiperproliferativas são seleccionadas de entre o grupo consistindo em células de tumor, células de medula óssea, células estaminais de cancro, células pré-cancerosas e células leucémicas.
10. 10. Método de acordo com a Reivindicação 1, compreendendo adicionalmente o fornecimento ao emissor de ultra-sons de uma potência inferior a 1 W/cm2. Lisboa,