BRPI0309796B1 - processo para utilização de zymomonas mobilis geneticamente modificada, e zymomonas modificada - Google Patents
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Abstract
"linhagens de zymomonas de fermentação de açúcar pentose e usos das mesmas, processo, método, integrante de zymomonas e biocatalisador". um integrante de zymomonas tem a capacidade de fermentar a pentose em etanol. o operon que codifica as enzimas de fermentação da pentose são integradas no genoma de zymomonas em um evento de duas integrações de recombinação homóloga e transposição. cada operon pode incluir mais que uma seqüência de codificação de enzima redutora da pentose. em algumas configurações, o integrante inclui seqüências enzimáticas que codificam a xilose isomerase, xiluloquinase, transquetolase e transaldolase. os integrantes de zymomonas são altamente estáveis e mantêm atividade para a produção da enzima de fermentação da pentose entre 80 a 160 gerações. os integrantes também são resistentes à inibição do acetato, uma vez que os integrantes demonstram uma eficiente produção de etanol mesmo na presença de 8 até 16 gramas de acetato por litro de meio.
Description
"PROCESSO PARA UTILIZAÇÃO DE ZYMOMONAS MOBILIS GENETICAMENTE MODIFICADA, E ZYMOMONAS MODIFICADA" Histórico da Invenção O presente pedido é uma continuação parcial do pedido de patente norte-americana número de série 09/565.233 depositado em 1 de maio de 2000. O presente pedido está relacionado ao pedido PCT/US01/11334, depositado em 6 de abril de 2001, reivindicando prioridade do pedido norte-americano número de série 09/565.233.
Origem Contratual da Invenção O governo norte-americano detém direitos sobre esta invenção de acordo com o contrato N° DE-AC36-99G010337 entre o Departamento Norte-Americano de Energia [United States -Department of Energy] e o Laboratório Nacional de Energia Renovável [National Renewable Energy Laboratory], uma divisão do Midwest Research Institute.
Campo Técnico A presente invenção refere-se à conversão biológica de substratos celulósicos em combustíveis e produtos químicos e, em particular, às linhagens de Zymomonas mok>± 1 ±s recombinantes que fermentam a xilose, arabinose e manose ou todas elas em etanol. Técnica Anterior A tecnologia de fermentação é útil na conversão de substratos de celulose de biomassa renovável em combustíveis e produtos químicos, por exemplo, o etanol. Um típico substrato é composto de 35 a 45% de celulose, 30 a 40% de hemicelulose e 15% de lignina. A fração de hidrólise contém polímeros de glicose e a fração de hemicelulose contém, predominantemente, xilose. A arabinose é também um substrato fermentável importante encontrado em materiais de biomassa, por exemplo, grama do tipo switchgrass e fibra de milho. Assim, é fundamental atingir uma alta taxa de formação de produto específico e eficiência de conversão na fermentação dos açúcares pentose para a produção comercial de combustíveis e produtos químico a partir de substratos renováveis. Z. mobilis é amplamente relatado pela sua capacidade de rapidamente e eficientemente converter substratos de glicose em etanol, em baixo pH, em uma cultura anaeróbia e em um meio que contém os compostos inibidores tipicamente associados a um hidrolisado de lignocelulose. Uma desvantagem quanto ao uso de Z. mobilis é, no entanto, o fato deste não fermentar os açúcares pentose. Para superar essa desvantagem, a técnica anterior enfatizou as linhagens de Z. mobilis recombinantes que fermentam uma mistura de glicose e xilose ou arabinose, ou ambas, utilizando genes exógenos que catalisam o metabolismo da xilose e da arabinose. Essas linhagens e os vetores de clonagem são baseados no uso de plasmídeos de múltiplas cópias tendo marcadores de resistência a antibióticos. A patente norte-americana 5.514.583 refere-se a uma linhagem de Z. mobilis transformada de fermentação da xilose (CP4/pZB4 e pZB5) tendo genes exógenos e vetores de plasmídeo (pBZ4 e pZB5) que codificam a xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transquetolase, compreendendo, ainda, pelo menos um promotor (Pgap e Peno) reconhecido pela Zymomonas que regula a expressão de pelo menos os referidos genes. O microorganismo é capaz de crescer tendo a xilose como única fonte de carbono e fermentar a xilose em etanol em aproximadamente 88% do rendimento teórico máximo. As patentes norte-americanas N— 5.712.133 e 5.726.053 se referem, entre outras coisas, aos transformantes de fermentação de arabinose de Z. mobilis (39676/pZB 206) , contendo genes exógenos que codificam a L-arabinose isomerase, L-ribuloquinase e L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase, transaldolase e transquetolase que conferem a capacidade de fermentação de arabinose em etanol. São também descritos o vetor de plasmídeo (pZB 206) e um processo que utiliza os transf ormantes da fermentação de um substrato contendo glicose e arabinose. A patente norte-americana N- 5.843.760 revela um transformante de fermentação de xilose e arabinose de Z. mobilis (206C/pZB301) contendo genes exógenos que codificam a xilose isomerase, xiluloquinase, L-arabinose isomerase, L-ribuloquinase, L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase, transaldolase e transquetolase, compreendendo, ainda, pelo menos um promotor reconhecido pela Zymomonas que regula a expressão de pelo menos um dos referidos genes, onde o referido microorganismo é capaz de crescer em arabinose e/ou xilose, isoladamente ou em combinação, como a fonte de carbono e fermentar as referidas arabinose e xilose em etanol. É também descrito o processo de utilização de transformantes com os vetores de plasmídeo (pZB301, pZB401, pZB402 e pZB 403). Embora possam ser facilmente mantidos em Z. mobilis quando cultivados em uma monocultura sob condições controladas, os plasmídeos híbridos ficam freqüentemente instáveis quando o organismo hospedeiro cresce na ausência de pressão de seleção para manutenção do plasmídeo, ou seja, na presença de antibióticos. Por exemplo, os genes exógenos nas linhagens acima mencionadas são capazes de expressão estável por aproximadamente quarenta gerações. A instabilidade pode ser exacerbada quando Z. mobilis precisa competir com outros organismos em uma cultura mista, por exemplo, um processo de sacarificação e fermentação simultânea da celulose. Além disso, marcadores de resistência a antibióticos são geralmente indesejáveis para aplicação industrial, por exemplo, na produção de etanol em larga escala. Assim, é preferível inserir os genes clonados no genoma de Z. mobilis onde são mantidos em um baixo número natural de cópia e, consequentemente, não sofrem superexpressão e onde devem ser tão estáveis quanto o DNA genômico.
Em Escherichia coli, o método clássico de geração de insertos genômicos de genes estranhos envolve o uso de vetores de clonagem de fago 1 especializados que podem existir de forma estável no estado lisogênico. Alternativamente, os genes podem ser inseridos através da recombinação homóloga, quando ligados a sequências cromossômicas de E. coli, ou por transposição caso os genes possam ser clonados nos sítios permitidos de um transpõson. Embora tenha sido demonstrada em Z. mobilis, (Pappas, K. M. , et al. , (1997) Journal of Applied Microbiology, 82: 379-388), a transposição foi limitada à transposição múltipla mini Mm ou Tn5 de auxotrofia aleatória ou fenótipos de resistência antibiótica para análise genética. No caso dos derivados de Tn5, a inserção é, conforme relatado, estável por somente 5-15 gerações (Pappas, K. M. , et seq. P. 383, FIG. 1.) Além disso, uma inserção específica do sítio através da recombinação homóloga em Z. mobllls não foi demonstrada e nenhum bacteriófago foi isolado a partir da Zymomonas.
Os transpósons Tn5 e TnlO são bem conhecidos e têm sido amplamente utilizados para mutagênese e inserção de DNA clonado em uma variedade de bactérias gram-negativas. Em Herrero, M. , et al . , (1990) (J. Bacteriol. 172:6557-6567), é descrito um procedimento de clonagem e inserção estável de genes estranhos no cromossomo da eubactéria gram-negativa combinando dois grupos de plasmídeos, (i) nas características de transposição de TnlO e Tn5, (ii) a resistência a determinados compostos, e (iii) as propriedades de distribuição do plasmídeo suicida pGP704 baseado em R6K. As construções resultantes contêm sítios Notl ou Sfil internos exclusivos para as repetições TnlO ou Tn5 invertidas. Esses sítios são utilizados para a clonagem de fragmentos de DNA com a ajuda de dois plasmídeos de clonagem adicionais especializados, pUC18Not e pUC18Sfi. As construções recentemente derivadas são mantidas somente nas linhagens de hospedeiro doador que produzem a proteína p especificada por R6K, uma proteína de replicação essencial para R6K e plasmídeos derivados desta. Os plasmídeos doadores contendo transpósons híbridos são transformados em uma linhagem de E. coli especializada lisogênica lpri, por exemplo, E. coli SmlO(lpir), com um RP4 cromossomicamente integrado que permitiu funções de transferência conjugal em ampla faixa de hospedeiro. A distribuição dos plasmídeos doadores nas bactérias hospedeiras selecionadas é realizada através da conjugação com a linhagem-alvo. A transposição do transpóson híbrido a partir do plasmídeo suicida distribuído para um replicon no alvo é mediada pela transposase cognata codificada no plasmídeo em um sítio externo ao transpóson. Uma vez que a função da transposase não é mantida nas células -alvo, essas células são/estão imunes a outros ciclos de transposição. Portanto, múltiplas inserções na mesma linhagem são limitadas somente pela disponibilidade de marcadores de seleção distintos.
Herrero, M. et al., (1990), (Journal of Bacteriol. 172(11) : 6568-6572), se refere à construção de uma coleção de minitranspósons derivados de Tn5, por exemplo, Tn5Tc. É possível empregar os minitranspósons derivados de Tn5, por exemplo, Tn5Tc, para incorporar fragmentos estranhos de DNA no genoma de uma variedade de bactérias gram-negativas. Os minitranspósons consistem em genes que especificam a resistência à canamicina e tetraciclina como marcadores de seleção e um único sítio de clonagem de Notl flanqueado por seqüências de repetição terminal de 19 pares de base de Tn5. Os transpósons estão localizados em um plasmídeo suicida de distribuição baseado em R6K que fornece o gene IS50R transposase tnp em cis, porém externo ao elemento móvel e cuja transferência conjugal a receptores é mediada por funções de mobilização de RP4 no doador. Portanto, as inserções produzidas por esses elementos são geralmente mais estáveis devido a ausência das transposições secundárias mediadas pela transposase, deleções e inversões. Vide também Berg et al . , (1989) Transposable elements and the genetic engineering of bactéria, p.p. 879-926, em D.E. Berg, Mobile DNA, American Society of Microbiology, Washington, DC. Dessa forma, inserções estáveis podem ser obtidas com elementos também derivados de, por exemplo, TnlO. Way, J.C. et al., (1984) (Gene 32: 369-379). A estrutura de mim-Tn5Tc, Herrero, et seq., p. 6569, é descrita para uso na mutagênese de inserção ou com um vetor de transpóson para a clonagem de fragmentos de DNA flanqueados por sítios Notl (isolados pela clonagem de fragmentos de DNA primeiramente nos derivados pUC18Not e pUC18Not de pUC18). O elemento Mini-Tn5Tc é construído, in vitro, utilizando as técnicas padrão de DNA recombinante. Maniatis, T., et al., (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. O determinante para resistência à tetraciclina (Tc) é obtido como um fragmento EcoRI de plasmídeos contendo-os em um interpóson. Fellay, R., et al . (1987) Interposon mutagenesis of soil and water bactéria.· a family of DNA fragments designed for in vitro insertion mutagenesis of Gram-negative bactéria. Gene 52: 147-154. o fragmento é subseqüentemente clonado em um único sítio EcoRI de pUC18Sfi, excisado como um fragmento de Sfil e inserido entre os terminais de 19 pares de base de Tn5 em pUT, de maneira que a unidade móvel esteja presente em todos os casos como uma porção Xbal-EcoRI (parcial) do plasmídeo de distribuição. O elemento resultante é mini-Tn5Tc.
Os sistemas de distribuição de vetor de transpóson baseados em TnlO são geralmente descritos em Herrero, M. et seq. 172:6557-6567. O fago 1, um 1RP167 derivado, possui um inserto EcoRI de 5,1-kb contendo o elemento mini-TnlOKm e o gene transposase de IS10R está localizado fora das repetições invertidas do elemento móvel e abaixo do promotor de PTac. Para obter um plasmídeo de distribuição de transpóson com uma regulação de sua transposição independente do hospedeiro, o fragmento de inserto EcoRI é ligado a pBOR8, um derivado de pGP704 contendo o gene laclq do plasmídeo pMJR1560. Esse plasmídeo é incapaz de se replicar em linhagens de hospedeiro desprovidas do produto da proteína p especificada por R6K do gene pir. pGP704 contém a origem de transferência conjugal (seqüência oriT) do plasmídeo RP4 e pode, portanto, ser transferida para bactérias gram-negativa quando provido em trans com funções de mobilização (Mob). O fragmento interno MluI das repetições invertidas, contendo o produto da proteína p original especificada do gene original de resistência à canamicina do mini-TnlO, é substituído por um fragmento contendo um cassete Sfil-Ptt, adequadamente modificado pela adição do sítio Notl e dos adaptadores MluI que produziram o pLODPtt. Essa construção possui sítios de clonagem Sfil, Notl e Xbal exclusivos entre as repetições invertidas mini-TnlO. O marcador de resistência Ptt (Ptt') de pLOFPtt é trocado pela resistência à canamicina para produzir o plasmídeo pLOFKrn. A dificuldade continua a existir na área da manipulação genética de Zymomonas mobilis para produzir linhagens geneticamente estáveis que contêm os componentes genéticos necessários para fermentação de açúcar pentose na produção de etanol. Os componentes genéticos necessários para permitir que a Zymomonas utilize açúcares pentose codificariam a xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transquetolase.
Com base no que foi acima exposto, existe a necessidade de construir linhagens estáveis de Z. mobilis recombinante que possam fermentar açúcares pentose, por exemplo, xilose e arabinose, ou ambas, em etanol. Portanto, existe a necessidade da geração de insertos genômicos estáveis que codifiquem as enzimas necessárias para o catabolismo do açúcar pentose. Existe ainda a necessidade de linhagens comercialmente adequadas dessas Zymomonas, o que significa que essas linhagens também devem estar livres da resistência antibiótica e permanecer estáveis por pelo menos 40 gerações ou mais em meios não seletivos. As linhagens comercialmente valiosas também devem preferencialmente demonstrar alta taxa específica de formação de produto próxima ao rendimento teórico máximo de produto. Essas e outras deficiências na técnica de produção microbiana de etanol são abordadas na presente invenção.
Revelação da Invenção É um objetivo da presente invenção prover um método de preparação de um integrante de Zymomonas estável que inclua genes estruturais estranhos que codifiquem enzimas necessárias para utilizar e fermentar um açúcar pentose. Em algumas configurações, essas enzimas são selecionadas a partir do grupo consistindo em xylAB, tal/tkt e araBAD. Pelo menos um gene regulador para indução dos genes estruturais no genoma da Z. mobilis deve ser incluído em outras configurações da construção. É um outro objetivo da invenção prover linhagens aperfeiçoadas de Z. mobilis capazes de expressão estável de genes estruturais que codifiquem enzimas necessárias para utilização de açúcar pentose em um meio não seletivo (por exemplo, na ausência de antibiótico ou marcadores de resistência antibiótica). É outro objetivo da invenção prover linhagens aperfeiçoadas de Z. mobilis cromossomicamente modificadas ou de plasmídeo nativo, tendo expressão estável dos genes estruturais e que proporcionem uma alta taxa de formação de produto específico e eficiência de conversão. Os integrantes estáveis de Zymomonas da presente invenção demonstraram estabilidade após 80 a 160 gerações. Ainda em outra configuração, a invenção provê um biocatalisador aperfeiçoado para uso em uma mistura de reação de hidrolisado de celulose. Esses biocatalisadores são as Zymomonas recombinantes descritas como parte da presente invenção. A presente invenção também provê um transpóson útil para a inserção estável de genes estranhos em um genoma bacteriano. Em uma configuração, o transpóson compreende: pelo menos um operon tendo genes estruturais que codificam enzimas selecionadas a partir do grupo consistindo em xylAxylB, araBAD e tal/tkt, e pelo menos um promotor para expressão dos genes estruturais na bactéria, um par de seqüências de inserção invertidas, os operons contidos nas seqüências de inserção e um gene transposase localizado fora das seqüências de inserção. Em outro aspecto, a invenção provê um vetor de transferência de plasmídeo capaz de transformar um genoma bacteriano de Zymomonas com a enzima de fermentação da pentose que codifica os genes. Em algumas configurações, o vetor de transferência de plasmídeo compreende pelo menos um operon tendo genes estruturais que codificam enzimas selecionadas a partir do grupo consistindo em xylAxylB, araBAD e tal/tkt, pelo menos um promotor para expressão dos genes estruturais na bactéria e pelo menos dois fragmentos de DNA tendo homologia com um gene no genoma bacteriano a ser transformado. Ainda em outra configuração, a presente invenção provê métodos para integrar pelo menos dois operons contendo enzima de fermentação de açúcar pentose que codifica genes. Através de exemplo, esses dois operons são PgapxylAB e Penotaltkt ou Pgaptaltkt. O complexo sistema de restrição da linhagem ATCC31821 de Zymomonas mobilis pode ser utilizado para criar uma linhagem estável de fermentação da pentose em outra configuração da presente invenção. Em outra configuração, o transpóson e os vetores de transferência são utilizados na construção de linhagens aperfeiçoadas e estáveis de Zymomonas mobilis que fermentam o substrato contendo açúcar pentose em etanol. Um método de conversão de açúcares pentose derivados de celulose em combustíveis e químicos é também provido utilizando as Zymomonas geneticamente modificadas que são estáveis para expressão em um meio não seletivo.
Em um aspecto particular, a invenção provê um processo para utilização de Zymomonas geneticamente modificadas que produzem etanol a partir de um açúcar pentose.
Em uma configuração particular, o processo compreende: preparação de uma linhagem integrante de Zymomonas compreendendo genes estavelmente incorporados que codificam pelo menos quatro enzimas de fermentação de açúcar pentose, xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transquetolase, onde a referida integração compreende pelo menos dois eventos de integração compreendendo uma primeira etapa de recombinação homóloga com um primeiro operon para incorporar genes que codificam uma primeira e segunda enzimas de fermentação de açúcar pentose e uma segunda etapa de transposição com um segundo operon para incorporar genes que codificam uma terceira e quarta enzimas de fermentação de açúcar pentose, adição da linhagem integrante de Zymomonas a uma matéria-prima compreendendo um açúcar pentose e fermentação do açúcar pentose para prover uma composição compreendendo etanol.
Em algumas configurações, o açúcar pentose compreende xilose, arabinose ou uma combinação. A seguir, o açúcar pentose em algumas configurações pode ser ainda descrito como sendo derivado de uma biomassa. Aspectos particulares do processo são ainda definidos pelo emprego de uma linhagem ATCC31821 de Zymomonas mobilis. A linhagem integrante de Zymomonas mobilis da invenção pode ser definida como um integrante Penotaltkt/PgapxylAB ATCC31821 de Z. mobilis. Através de exemplo, integrantes específicos são designados como int2/321, int2/1821, x9t(enott)Pi#4, x9t(enott)Pi#8, 321(5), 481, 2032, 2122, 8b e 321-a.
Em algumas configurações, a invenção provê integrantes de Zymomonas e derivados desses capazes de fermentar açúcares pentose (xilose, arabinose) em etanol na presença de uma concentração relativamente alta de acetato ou ácido acético. Por meio de exemplo, a invenção provê integrantes que produzem etanol com sucesso na presença de acetato ou ácido acético em uma concentração de 2,4, 8, 10, 12 e até mesmo 16 g/L.
Em outra configuração, a invenção provê um integrante de Zymomonas capaz de fermentar uma matéria-prima de pentose em etanol. Exemplos particulares do integrante incluem: int2/321, int2/l821, x9t(enott)Pi#4 , x9t(enott)Pi#8, 321(5), 481, 2032, 2122, 8b e 321-a.
Em outra configuração, um gene que utiliza manose (manA) é provido em um plasmídeo e o plasmídeo é utilizado para transformar a Zymomonas mobilis ATCC31821 e 39676, gerando linhagens de Zymomonas de fermentação de manose. 0 mesmo método de transformação método é aplicado aos integrantes mencionados na presente invenção para gerar linhagens de Zymomonas capazes de fermentar xilose e manose ou xilose, arabinose e manose em uma biomassa.
Ainda em outra configuração, o gene de utilização de manose (manA) e quaisquer outros genes necessários para utilização da manose são integrados no genoma da Z. mobilis ATCC31821, 39676, derivativos desses e integrantes aqui mencionados, gerando linhagens integrantes de Z. mobilis capazes de fermentar xilose e manose, ou xilose, arabinose e manose em uma biomassa.
Outras vantagens da presente invenção serão definidas em parte na descrição a seguir e, em parte, ficará evidente pela descrição ou poderá ser aprendida pela prática da invenção. As vantagens da invenção podem ser compreendidas e obtidas pelo método particularmente mencionado nas reivindicações em anexo.
Breve Descrição dos Desenhos Os desenhos que acompanham, sendo aqui incorporados e fazendo parte da especificação, ilustram pelo menos uma configuração da invenção e, com a descrição, explicam os princípios da invenção. A Figura 1 é um mapa de plasmídeo de Mini-Tn5 Tc em pGP704 contendo o operon de assimilação da xilose de acordo com a presente invenção. A Figura 2 é uma série de mapas de plasmídeo ilustrando as construções da série mini-Tn5 de acordo com a presente invenção. A Figura 3 é uma ilustração da série de construções que resulta no mapa de plasmídeo de pUCtaltktSfi. A Figura 4 representa os resultados da análise Southern de transconjugados de tal/tkt-xylAxylB Z. mobilis cora a sonda Tal. C é o controle plasmídeo e Tn5 tal/tkt-xylAxylB. AH é o marcador de tamanho do DNA. A Figura 5 representa os resultados da análise Southern de transconjugados de tal/tkt-xylAxylB Z. mobilis com a sonda Tnp. C é o controle plasmídeo e míni-Tn5 tal/tkt-xylAxylB. λ/Η é o marcador de tamanho do DNA. A Figura 6 é um gráfico das atividades enzimáticas dos diversos isolados da linhagem estável de Z. mobilis de fermentação da xilose de acordo com a presente invenção. A Figura 7 ilustra gráficos dos perfis de fermentação para quatro dos isolados (N— 21, 22, 5 e 11) da Figura 6 e seu desempenho em relação ao plasmídeo contendo as linhagens 39673/pZB4 e BCl/pZB4L. A Figura 8 é uma representação gráfica que ilustra a estabilidade das linhagens estáveis C25 e D92 de Z. mobilis de fermentação da xilose de acordo com a presente invenção. O gráfico mostra a estabilidade das linhagens contendo plasmídeo e das linhagens genômicas integradas de fermentação da xilose, utilizando o rendimento do processo de produção de etanol e os parâmetros de utilização da xilose como indicadores. As linhagens C25 e D92 da presente invenção permaneceram estáveis por mais que 90 gerações. O meio de fermentação compreendia RM com glicose a 1% e xilose a 5% e a temperatura era constante a 30°C. A Figura 9 ilustra a concentração de biomassa (a) , a concentração de etanol (b) , a utilização de xilose (c) e o rendimento do processo em comparação aos resultados percentuais de utilização da xilose para fermentação em lote das linhagens genômicas integradas de fermentação da xilose, C25 e D92, em um meio RM contendo glicose a 4,5% e xilose % em pH 5,0 e pH 5,5 a 30°C de acordo com a presente invenção. A Figura 10 é um mapa do plasmídeo de integração pZB 1862 - ldhL-ara. A araBAD é inserida no sítio Notl do ldhL rompendo ldh. A construção é baseada no plasmídeo de replicação pZB 1862 de Z. mobilis. A Figura 11 é o mapa de plasmídeo de TnlOG. ISIO* é o gene transposase. IR é a seqüência de repetição invertida do transpóson. AraBAD foi inserido entre as duas repetições invertidas nos sítios Notl. A Figura 12 mostra a análise Southern das linhagens genômicas integradas de Z. mobilis de fermentação de xilose/arabinose a partir da recombinação homóloga utilizando sondas DIG-ara e DIG-ldh. AX1, 13, 23, 101, 104 e 107 são integrantes araBAD. C25 é o controle de hospedeiro. PZB1862-IdhL-ara ê o controle de plasmídeo isolado a partir de DH5a. λ/Η é um marcador de peso molecular: 23, 9,4, 6,6, 4,3, 2,3 e 2,0 kb. A Figura 13 representa uma análise Southern das linhagens genômicas integradas de Zymomonas de fermentação de xilose/arabinose a partir da integração do transpóson utilizando sondas DIG-tnp e DIG-ara. G5, 6, 11, 15, 17,14 e 19 são integrantes araBAD. C25 é o controle de hospedeiro. TnlOG é o controle de plasmídeo. λ/Η é um marcador de peso molecular: 23, 9,4, 6,6, 4,3, 2,3 e 2,0 kb. A Figura 13 (a) é a sonda tnp e a digestão PstI e a Figura 13(b) é a sonda ara e a digestão PstI. A Figura 14 representa um gráfico de barras das atividades enzimáticas da transquetolase, transaldolase, xilose isomerase e xiluloquinase das linhagens genômicas integradas. 206C/pZB301 é um controle de plasmídeo. 206C é um controle de hospedeiro. C25 é o integrante de fermentação da xilose. G8 é o integrante de fermentação de xilose/arabinose da transposição ΤηΙΟ. AX1 e AX101 estão os integrantes de fermentação da xilose/arabinose da recombinação homóloga. A Figura 15 representa os resultados do gráfico de barras das atividades enzimáticas da L-arabinose isomerase, L-ribuloquinase e L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase das linhagens genômicas integradas. 206C/pZB301 é um controle de plasmídeo. 206C é um controle de hospedeiro. C25 é o integrante de fermentação da xilose. G8 é o integrante de fermentação da xilose/arabinose da transposição de ΤηΙΟ. AX1 e AX101 são os integrantes de fermentação da xilose/arabinose da recombinação homóloga. A Figura 16 representa o resultado de um gráfico de barras dos rendimentos do processo de produção de etanol das linhagens genômicas integradas de Zymomonas de fermentação de xilose e arabinoses em RMGXA (1:2:2%) em T=30°C, sem controle do pH. Essas linhagens foram inoculadas a partir de culturas em várias gerações em meios não-seletivos. A Figura 17 representa os resultados de um gráfico de barras da utilização de xilose e arabinose das linhagens genômicas integradas de Zymomonas de fermentação de xilose e arabinose em RM contendo glicose a 1%, xilose a 2% e arabinose a 2% a 30°C com controle do pH. Essas linhagens foram inoculadas a partir de culturas em várias gerações de meios não seletivos.
A Figura 18 é uma representação em gráfico de linhas do desempenho de fermentação das linhagens genômicas integradas de Zymomonas de fermentação de xilose e arabinose em RM contendo glicose a 4%, xilose a 4% e arabinose a 2% em pH 5,5 e 3 0 ° C . A Figura 19 apresenta os mapas de plasmídeo para pZB510XTc (19A) e pZB512XTc (19B) para recombinação homóloga na linhagem Z. mobills 31821. A Figura 2 0 representa o mapa de plasmídeo para pMODPenotal tktCm para transposição de integração em Z. mobilis 31821.
As Figuras 21 A e B representam manchas de hibridização Southern para integrantes de Z. mobilis 31821. As sondas xylB (21A) e tkt (21B) foram utilizadas no experimento. Os controles de plasmídeo incluíram pM0DPenotaItktCmPZB510XTc e pZB512XTc; observar que PgapxylAB em int2/321 era proveniente de pZB512XTc. PgapxylAB em int2/1821 era proveniente de pZB510XTc. λ/Η foi utilizado como marcador de peso molecular. A Figura 22 representa um gráfico de barras mostrando as atividades enzimáticas de x9t(enott)Pi#4, x9t(enott)Pi#8, int2/321 e int2/1821 e linhagens de controle. A Figura 23 é uma representação gráfica da adaptação de crescimento de x9t(enott)Pi#4, x9t(enott)Pi#8, int2/321 e int2/l 821 em meios RMX. A Figura 24 é o mapa de plasmídeo para pMODP?aptal tJctCm para transposição de integração em Z. mobilis 31821. A Figura 25 é uma representação gráfica da adaptação de crescimento de #20 e #21, em meios RMX.
As Figuras 26 A e B representam manchas de hibridização Southern para integrantes de Z. mobilis 51821. As sondas xylB (26A) e tkt (26B) foram utilizadas no experimento. Os controles de plasmídeo incluíram pMODPenotaltfetCm, pMODP?aptal tJctCm e pZB512XTc; observar que PgapxylAB em 321(5) foi derivado de pZB512XTc. λ/Η foi utilizado como um marcador de peso molecular.
As Figuras 27 A até C são demonstrações da utilização de xilose (27A) e glicose (27B) e produção de etanol (27C) em RMGX para integrantes de Zymomonas.
As Figuras 28 A e B são demonstrações da utilização de xilose (28A) e produção de etanol (28B) em RMX para integrantes de Zymomonas.
As Figuras 2 9 A até C são demonstrações da utilização de glicose (29A) e xilose (29B) e produção de etanol (29C) em RMGX (1%:6%) para integrantes de Zymomonas em fermentação com pH controlado.
As Figuras 3 0 A até C são demonstrações de utilização da glicose (30A) e xilose (30B) e produção de etanol (30C) em RMGX (3,5%: 3,5%) para integrantes de Zymomonas em fermentação com pH controlado. A Figura 31 é uma ilustração do teste de estabilidade.
As Figuras 32 A e B são representações gráficas que ilustram a estabilidade das linhagens estáveis de Z. mobilis de fermentação da xilose, 2032, 8b, 481 e 2/321-2, de acordo com a presente invenção. O gráfico mostra a estabilidade de linhagens genômicas integradas de fermentação da xilose, com o emprego da xilose (32A) e o rendimento do processo de produção de etanol (32B) . As linhagens 2032, 8b, 481 e 2/321-2 da presente invenção permaneceram estáveis por mais que 80 gerações. O meio de fermentação compreendeu RM com glicose a 2% e xilose a 2% e a temperatura foi constante em 30°C.
As Figuras 33 A e B são representações gráficas que ilustram a estabilidade das linhagens estáveis de Z. mobilis de fermentação da xilose, 8b, 2032, 481 e da linhagem contendo plasmídeo (3182l/pZB5) de acordo com a presente invenção. O gráfico mostra a estabilidade de linhagens genômicas integradas de fermentação da xilose, com o emprego da xilose (33A) e rendimento do processo de produção de etanol (33B). As linhagens 2032, 8b e 481 da presente invenção permaneceram estáveis por mais que 30 gerações. O meio de fermentação compreendeu RM com glicose a 2% e xilose a 2% e a temperatura foi constante em 37°C.
As Figuras 34 A até F são representações gráficas que ilustram os perfis de utilização de glicose (34A), utilização de xilose (34B), utilização de arabinose (34C), crescimento (34D), produção de etanol (34E) e rendimento do processo de produção de etanol (34F) na presença de acetato em pH 5,0 5,5 e 6,0.
As Figuras 35 A e B são representações gráficas que ilustram a produção contínua e constante de etanol a partir da glicose e xilose (35A) e a formação de subproduto (35B) com crescente concentração de acetato.
As Figuras 36 A e B são representações gráficas que ilustram a utilização de xilose (36A) e o rendimento de etanol (36B) na presença de acetato na concentração de 0, 2, 4 e 6 g/L.
As Figuras 37 A e B são representações gráficas que ilustram a utilização de xilose (37A) e o rendimento de etanol (37B) na presença de acetato na concentração de 0, 8, 12 e 16 g/L. A Figura 38 é o mapa de plasmídeo para pZB7 01 contendo o gene de utilização da manose.
As Figuras 39 A e B são representações gráfica da adaptação de crescimento de #2, 4, 6, 13 e 19 em meio RMM.
Melhor Forma de Realizar a Invenção A menos que especificamente definido de outra forma, todos os termos técnicos ou científicos aqui utilizados têm o mesmo significado conforme comumente compreendidos pelos técnicos no assunto ao qual a presente invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser utilizados na prática ou no teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos serão agora descritos. Todas as Patentes Norte-Americanas são incorporadas por referência conforme aqui definido.
Com relação ã construção de uma linhagem geneticamente estável de Z. mobilis ATCC31821 para utilização da pentose, dois métodos de integração foram desenvolvidos e incluem recombinação homóloga e transposição. Dois operons, PgapxylAB e Penotaltkt (ou Pgaptaltkt), foram construídos de modo que cada um pudesse ser integrado como um único cassete. Preferencialmente, cada operon inclui um gene de resistência antibiótica para a seleção dos integrantes.
Com relação à recombinação homóloga, integração do operon P qapxylAB em ldh da linhagem 31821 utilizada em um fragmento de DNA de 4 kb como alvo de homologia tendo uma região de ldh de 1 kb flanqueada por pgm e genes adhl. Esse fragmento homólogo de DNA é designado como ldhL4 O fragmento ldhL4 foi amplificado como dois fragmentos de DNA (5'ldhLR e 3'idhL4) utilizando Pfu polimerase usando DNA 31821 como temperado e remontado através da clonagem no vetor pZB1861. Os sítios Notl e Sfil foram introduzidos durante a PCR para a clonagem subseqüente de PgapXylAB e Tcr (vide Exemplos abaixo) . Os primers foram designados com base na sequência de DNA de Z. mobilis CP4 (Yamano et al (1993) J. Bact. 175:3926-3933).
Com relação à transposição, descobriu-se que a linhagem 31821 possui sistema(s) de restrição que degradam o DNA metilado introduzido nas células hospedeiras. A transposição utilizando MiniTnSTc via E. coli SmlO(Apir) como hospedeiro doador não foi bem sucedida. Assim, a integração do operon Penotaltkt ou Pgaptaltkt foi realizada utilizando o Kit de Inserção EZ::TN™ (Epicentre, Wisconsin), no qual foram providos um transposase eficiente (baseado em Tn5) e um vetor (pMOD) contendo seqüências de inserção geneticamente aperfeiçoadas (terminações Mosaic). Utilizando o kit, as células hospedeiras foram transformadas utilizando transpossomos (Penotaltkt ou Pgaptaltkt ligados a transposase) , onde o DNA foi preparado a partir de um hospedeiro deficiente em metilação ou plasmídeos nativos de Z. mobilis 31821 integrados com Penotaltkt.
Embora a descrição e os Exemplos abaixo sejam específicos para integração de dois operons no genoma de Z. mobilis, os métodos da presente invenção podem ser modificados para independentemente integrar cada um dos quatro genes de utilização da pentose, onde cada gene está sob o controle de seu próprio promotor. Além disso, qualquer número de promotores pode ser utilizado no contexto da presente invenção para expressão dos genes-alvo, contanto que o promotor direcione a expressão dos genes de utilização da xilose em Z. mobilis.
As configurações atualmente preferidas da invenção serão mencionadas em detalhes, cujos exemplos são ilustrados nos desenhos anexos. Para os exemplos descritos abaixo, o termo "linhagens contendo plasmídeo" se refere ou está relacionado às linhagens e vetores descritos nas Patentes Norte-Americanas identificadas na Descrição da Técnica Anterior. O termo "genoma do Z. mobilis ou genômico" significa os genes que, ín toto, especificam todos os expressos e potencialmente expressíveis com o determinado Z. mobilis.
Exemplos Linhagens, Plasmídeos e Meios As linhagens bacterianas de E. coli C118X(pri), CC118 (pir) (mini-Tn5Tc) , SM/λΟ(pir) e os plasmídeos pUC19, pLOF/Km, pUC18sfi, pUT/Tc contendo o minitranspóson Tn5, TnlO epUC18 foram obtidos de Dr. K. Timmis, GBF - Gesellschaft Fur Bíotechnololgische Forschung mbH, Mascheroder weg 1 D - 38124 Braunschweig, República Federal da Alemanha. E. coli DH5a (Life Technologies) foi utilizado como hospedeiro para a construção dos plasmídeos. E. coli SMIOXpir foi utilizado como linhagem doadora em experimentos de conjugação. As linhagens de Z. mobilis ATCC 39676 e seu derivado, 206C (Patente Norte-Americana N- 5.843.760) foram utilizadas como receptores de acordo com a invenção. Os plasmídeos baseados em TnlO foram construídos e mantidos em E. coli CC118. Plasmídeos de integração foram utilizados para transformar os hospedeiros de E. coli deficientes em metilação, por exemplo, JM110 e DM1 antes da transformação em hospedeiro de Z. mobilis ATCC31821 ou seus derivado 5C que foi obtido pela cura do plasmídeo a partir de 31821/pZB5. As linhagens de E. coli foram cultivadas em meio LB a 37°C com agitação (200 rpm) . As linhagens de Z. mobilis foram mantidas de forma anaeróbia em RM (10 g/L de extrato de levedura, 2 g/L de KH2P04) suplementado com 20 g/L de glicose, D-xilose ou L-arabinose, a menos que de outra forma especificado. Todas as linhagens contendo plasmídeos foram cultivadas na presença do antibiótico adequado, tetraciclina (Tc), 10 pg/ml em líquido para Z. mobilis e E. coli, 20 pg/ml em ágar para Z. mobilis e 15 pg/ml em ágar para E. coli; ampicilina (Ap) , 100 pg/ml para E. coli; cloranf enicol (Cm), 120 pg/ml para Z. mobilis e 100 pg/ml para E. coli. Para a regeneração e seleção de Z. mobilis transformantes ou transconjugados, foram utilizadas placas de conjugação ( (MMG ou MMX; 10 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de triptona, 2,5 g/L de (NH4)2S04, 0,2 g/L de K2HP04 e 50 g/L de açúcar)) suplementadas com tetraciclina ou ácido nalidixico (20 pg/ml). Todas as placas de ágar foram feitas com 15 g/L de ágar.
Em alguns casos, os integrantes contendo os quatro genes (xylA, xylB, tal e tkt) foram cultivados em meio de xilose. Os integrantes foram transferidos de RMGTcCm para RMX (1:50) e cultivados a 30°C. Para adaptação em RMX, as culturas desenvolvidas em xilose foram transferidas em RXM fresco sempre que o estágio exponencial estimado era atingido. O crescimento foi rotineiramente monitorado pela medição de OD6 0 0 em um Spectronic 601 (Milton Roy). O plasmídeo pZB701 foi construído por clonagem de um fragmento de DNA contendo PpdcmanA em um vetor de transferência pZB188 . O Ppdc e o gene estrutural de ManA foram amplificados utilizando PCR individualmente e combinada com uma terceira PCR (PCR de extensão de sobreposição) para fundir precisamente a região de transcrição 5' e de regulação translacional incluindo o RBS promotor e o códon inicial do gene PDC no gene estrutural manA. Técnicas de DNA recombinante Isolamento do DNA do plasmídeo, digestão da endonuclease de restrição, ligação e transformação, eletroforese em agarose e outras técnicas de DNA recombinante foram aplicadas de acordo com os protocolos publicados, Sambrook et ai. , (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory press, Cold Spring Harbor, NY, ou as respectivas instruções do fabricante do reagente, quando especificadas, e são bem conhecidas na técnica. O DNA genômico de Z. mobilis foi extraído utilizando três mililitros de células ressuspensas de um dia para o outro em 250 ml de tampão de Tris-50 mM EDTA 50 mM. As células foram tratadas com lisossomo a 37°C por 30 minutos e 100 ml de solução de SDS a 5% e RNAase (concentração final igual a 20 ng/ml) foram então adicionados e incubados por mais 30 minutos. Uma extração de fenol-clorofórmio foi realizada duas vezes para remover as proteínas. O DNA genômico foi recuperado pela precipitação do etanol. Alternativamente, o DNA genômico total de Z. mobilis foi extraído utilizando kits Puregen (Gentra System, MN) . A extração do DNA do plasmídeo foi realizada utilizando kits Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen, CA) .
Conjugação, Transposição e Transformação Os plasmídeos foram transferidos das linhagens doadoras E. coli SMIOlpir ou S17-1 em linhagens Z. mobilis por conjugação com uma técnica de conjugação em filtro (Conway et al., 1987) .
Em alguns casos, um kit comercialmente disponível. Kit de Inserção EZ::TN™, foi utilizado para gerar transpossomos para a transposição. O plasmídeo pM0DPenotal tJctCm foi tratado com transposase de acordo com os protocolos do fabricante com pequenas modificações. Para a transposição in vitro, os plasmídeos de integração foram tratados com transposase a 37°C por 2 horas na presença de plasmídeos nativos (DNA alvo) de Z. mobilis 31821. A reação foi então aquecida a 70 °C por 10 minutos na presença de SDS a 0,1% e dialisada contra glicerol a 5% e Tris 5 mM (pH 7,6) antes da transformação em Z. mobilis 31821. Para a transposição in vivo, os plasmídeos de integração foram tratados com transposase em temperatura ambiente por uma hora seguido de eletroporação (Bio-Rad Gene Pulser, cubetas com espaço de 0,1 cm, 1,6 kV, 200 ohms, 25 pFD) . Células eletrocompetente de Z. mobilis ou E. coli foram preparadas pela coleta de células com OD600 = 0,4 a 0,6. As células foram lavadas uma vez em água gelada estéril seguida de glicerol a 10% e concentradas em aproximadamente 1000 vezes. As células competentes foram dividias em alíquotas e armazenadas a -80°C.
Os DNAs do plasmxdeo também foram transformados em células de Z. mobilis 39676 ou E. coli por eletroporação conforme descrito em Zhang et al. , (1995) Science 267:240-243.
Análise Southern Blot O DNA foi transferido para uma membrana de nylon utilizando um blotter de pressão Stratagene Posi Blot. As sondas de DNA Tc, xylB, Tnp e Tal foram marcadas com digoxigenina-UTP por Reações de Cadeia de Polimerase (PCR) . Os primers a seguir foram utilizados para marcação do DNA: Tc: 5'-TTGCTAACGCAGTCAGGC-3' (ID SEQ No.: 1) 5 ' -GAATCCGTTAGCGAGGTG-3 ' (ID SEQ No.: 2) XylB 5' -TATGGGTTCAGCGGCATGAG-3 ' (ID SEQ No.: 3) 5' -ATGGGCATGAGATCCATAGCC-3 7 (ID SEQ No . : 4) Tnp 5' -TCCTAACATGGTAACGTTC-3 ' (ID SEQ No.: 5) 5' -CCAACCTTACCAGAGGGC-3' (ID SEQ No.: 6) Tal:5'-CGTCTAAAAGATTTTAAGAAAGGTTTCGATATGACGGACAA ATTGACC-3' (ID SEQ No.: 7) 5 ' -CATTTTGACTCCAGATCTAGATTACAGCAGATCGCCGATC ATTTTTTCC-3' (ID SEQ No.: 8) A pré hibridização e hibridização foram realizadas de acordo com os protocolos estabelecidos descritos no kit de hibridização da Boehringer Mannheim.
Amplificação utilizando A Reação de Cadeia de Polimerase (PCR) Para a construção de vários plasmídeos de integração para integração de genes, os seguintes fragmentos foram amplificados por PCR utilizando polimerase Pfu (Stratagene, La Jolla, CA) e seus pares de primer apropriados: 1. 5'IdhL4 (1,9 kb) Template·. Z. mobilis 31821 DNA Primers: PI6 (F)5'CCATCGATTCTAGAATCTCGCGTAATAAAACTATCAGGCGC AATCG3' (ID SEQ No.: 9) PI7 (R)5'CGCGGATCCAGATCTGGCCTAGGCGGCCTCATAATATGGG CAAAGACACTCCCG3'(ID SEQ No.:10) 2. 3'IdhL4 (2,4 kb) Template: Z. mobilis 31821 DNA Primers: P18(F) 5' GAAGATCTGCGGCCGCGTTTTGGTGCCAATGTTATCGCC3' (ID SEQ No.: 11) P19(R) 5' GAAGATCTAAGCTTGGATAGCGGCTTATAGCAACGAGTGC3 ' (ID SEQ No.: 12) 3. Tcr (1,5 kb) Template: pBR322 Primers: Tc (F) 5'AAAGGCCGCCTAGGCC3' (ID SEQ No.; 13) Tc (R) 5'AAAGGCCTAGGCGGCC3' (ID SEQ No.: 14) 4 . Cmr (1 kb) Template: pZB185 Primers: Cm (F, Eag) 5'CCGAATAAATACGGCCGCCTGTGACGGAAGATCAC TTC3'(ID SEQ No.:15) Cm (R, Eag) 5'TAACGACCCTGCCGGCCGCCTGAACCGACGACCGG GTCG3' (ID SEQ No.: 16) Construção de pZB512XTc e pZB510XTc para Recombinação Homóloga O plasmídeo de integração pZB510XTc (vide Figura 19 (A) ) foi então construído pela inserção de Pgapxy2AB (a partir de pZB4) e Tcr (produto da PCR) nos sítios Notl e Sfil entre fragmentos de 5'IdhL4 (1,9 kb) e 3'IdhL4 (2,4 kb) . 0 plasmídeo pZB512XTc (vide Figura 19(B)) foi construído de forma semelhante similar, com exceção da orientação do PgapxylAB que era oposta ã orientação do pZB510XTc.
Construção de pMODPenotaItkfcCm para Transposição Um fragmento de Cmr gerado por PCR foi clonado no sítio Smal do vetor pMOD (Epicentre, WI) resultando em pMODCm. Um fragmento BglII de pUCfcaltk (Zhang et al (1995) Science 267:240-243) foi então clonado em pMODCm no sítio BamHI para formar pMODPeilotal tkfcCm (vide Figura 20) . Os fragmentos clonados em pMOD são flanqueados por duas terminações Mosaic de 19 bp (IS), que podem ser reconhecidas por transposase para transposição.
Cura do Plasmídeo para Obtenção de Integrantes xylAB a partir da Recombinação Homóloga Culturas de Z. mobilis 5C/pZB512XTc desenvolvidas de um dia para o outro em RMGTcCm (30°C) foram subcultivadas (1 : 10 0) diariamente em tubos RMG de 5 ml a 3 7°C por até 10 transferências. Em cada transferência, as culturas foram separadas em placa e monitoradas quanto à perda de plasmídeo pela comparação dos números de colônia em placas RMG e RMGCm. Quando a população de células contendo plasmídeo for inferior a 10% do total, as culturas foram inoculadas (1:100) em RMGTc para enriquecer o crescimento de integrantes PgrapxylABTc em potencial . As culturas enriquecidas com RMGTc foram separadas em placas RMGTc e replicadas em placas RMGTc e RMGCm. As colônias com fenótipo TcrCms seriam ainda analisadas para confirmar a integração.
Ensaios Enzimãticos A xilose isomerase (XI) , xiluloquinase (XK) , transquetolase (TKT) e transaldolase (TAL) foram ensaiadas, em alguns casos, utilizando extratos sem células de integrantes de Z. mobilis e linhagens de controle de acordo com Zhang et al . , (1995) Science 267:240-243 com modificação. Os extratos de Z. mobilis sem células foram preparados pela coleta das culturas na fase log tardia (30 °C, OD600 de aproximadamente 1,2) e lavados uma vez com tampão de sonificação (Tris-Cl 10 mM, pH 7,6, MgCl2 10 mM) seguido de sonificação. Os resíduos celulares foram removidos por centrifugação (14.000 rpm, 45 minutos, 4°C). EXEMPLO 1 O exemplo a seguir ilustra a construção de Mini-Tn5Tc contendo genes que codificam as enzimas de assimilação de xilose e a transferência conjugal dessa construção em Z. mobilis 206C e ATCC 39676. O Mini-Tn5Tc contendo genes que codificam as enzimas de assimilação de xilose foi construído pela inserção de um operon Pgap-xylAxylB no sítio Notl exclusivo de Mini-Tn5Tc contidos no plasmídeo pGP704. Vide a Figura 1. Os operons Pgap-xylAxylB foram retirados do plasmídeo pZB4 ou pZB5, Patentes Norte-Americanas N— 5.712.133 e 5.726.053. Os plasmídeos resultantes, designados como Mini-Tn5Tc xylA/xylB(X4) e Mini-Tn5Tc xylAxylB (X5) foram transformados na linhagem doadora de E. coli SMIOÀpir por eletroporação e conjugados com as linhagens ATCC 39676 ou 206C de Z. mobilis. Z. mobilis 206C é revelado na Patente Norte-Americana 5.843.760 que é aqui incorporada por referência. Nove transconjugados de Zymomonas Tcr foram obtidos de doadores SMIOÀpir contendo Mini-Tn5Tc xylAxylB (X4) e Mini-Tn5 Tc xylAxylB (X5) por seleção em meios contendo Tc e ácido nalidixico. Vide a Figura 2 (b) . O DNA genômico e de plasmídeo dos nove transconjugados Z. mobilis Tcr foi então submetido às análises Southern blot. O DNA genômico e de plasmídeo dos transconjugados foi digerido com Sphl que é interrompido no híbrido do transpóson e no operon da xilose, e as manchas foram então hibridizadas em uma sonda Tc ou uma sonda XylB ou uma sonda Tnp transposase. A partir da auto-radiografia, determinou-se que (1) o operon Pgap-xylAxylB da xilose foi inserido no genoma da Zymomonas com o gene Tcr; (2) somente uma única inserção ocorreu para cada um dos transconj ugados; (3) cada uma das inserções foi inserida em um local distinto no genoma; (4) o gene Tcr e o XylB não estavam presentes na fração do plasmídeo; e (5) o gene tnp transposase não estava presente nos transconjugados. A análise enzimática dos transconjugados Tcr Pgap-xylAxylB da Zymomonas foi realizada para confirmar a expressão da xilose isomerase (XI) e da xiluloquinase (XK) nos transconjugados Tc Pgap-xylAxylB da Zymomonas. Essa análise revelou que os níveis enzimáticos de xilose isomerase de todos os transconjugados foram de aproximadamente 50% dos níveis de suas contrapartes de plasmídeo. Similarmente, cerca de 50% das atividades da xiluloquinase das linhagens contendo plasmídeo foi observada nos integrantes. As atividades da XI e da XK, expressas a partir de uma única cópia dos genes, no genoma da Zymomonas, foram consideravelmente maiores do que o esperado, quando comparadas às atividades das 10 cópias por célula encontradas nas linhagens contendo plasmídeo. EXEMPLO 2 (C25) Esse exemplo demonstra a utilidade de um método de evento de integração para criar um integrante de Zymomonas que expressa quatro genes de fermentação da pentose. Um integrante de Zymomonas com estabilidade genética aperfeiçoada na ausência de seleção de antibiótico é criado por esse processo. Os genes xylA e xylB de assimilação da xilose, que codificam a xilose isomerase e a xiluloquinase, os genes da via da pentose fosfato, talB e tktA, que codificam a transaldolase e a transquetolase, precisam ser introduzidos no genoma da Z. mobilis utilizando mini-Tn5 para criar as linhagens de fermentação da pentose. Dois operons contendo Pgap-xylA/xylB e Peno-talB/tktA foram montados em mini-Tn5 e o plasmídeo resultante foi conjugado em Z. mobilis. Com a ajuda da transposase localizada fora do cassete mini-Tn5, cópias únicas de Pgap-xylAxylB e Peno-talB/tktA foram inseridas no genoma da Z. mobilis, conforme mostrado pela hibridização Southern. A análise enzimática da xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transaldolase indicou que todos os genes foram expressos de forma coordenada e que as linhagens integradas produziram cerca de 30-70% das atividades enzimáticas das linhagens contendo plasmídeo. Esses níveis enzimáticos foram suficientes para que o organismo pudesse crescer e fermentar uma pentose, xilose em particular em etanol.
Para facilitar o processo de clonagem, o fragmento Bg/Il contendo o operon Peno-talB/tktA foi inserido no sítio BamHI de um plasmídeo auxiliar recém-construído, pUSCfiMCS conforme mostrado na Figura 3. O plasmídeo auxiliar, pUSCfiMCS, foi construído pela inserção de um fragmento EcoR I-Hind III contendo os sítios de mui ti clonagem de pUC19 em pUCSf i . PUCtaltkt foi então construído a partir de pUCpfiMCS e puctaltktsfi conforme mostrado na Figura 3.
Com referência agora à Figura 2, Peno-talB/tktA foi então excisado, a partir de pUCtaltktSfi, com um fragmento Sfi I e utilizado para clonar em mini-tn5-Tc-xylAxylB. Conforme mostrado na Figura, o gene Tcr é flanqueado pelos sítios SfiI no cassete Tn5-Tc-xylAxylB. Mini-tn5-Tc-xylAxylB foi parcialmente e completamente digerido com Sfi I e ligado ao fragmento Peno-talB/tktASfi, conforme mostrado na Figura 2(c). A digestão parcial resultou era um plasmídeo contendo o gene Tcr, designado como mini-tn5- Tc tal/tkt-xylAxylB ( (Figura 2 (c) ) , ao passo que a digestão completa resultou em um plasmídeo, de acordo com a presente invenção, sem o gene Tcr, designado como miniTnS-tal/tkt-xylAxylB. Vide a Figura 2(d).
Ambos os plasmídeos foram transformados na linhagem doadora E. coli, S17-1 e conjugados com Z. mobilis 206C. Os transconjugados resultantes foram selecionados em meios de conjugação contendo glicose, Tc e ácido nalidixico para miniTn5-tal/tkt-xylAxylB-Tc. Para mini-tn5-tal/tkt-xylAxylB, os transconjugados foram diretamente selecionados em meios de conjugação contendo xilose e ácido nalidixico. Diversos transconjugados Tcr (cultivados com glicose) foram obtidos para mini-tn5 tal/tkt-xylAxylB-Tc. Diversos transconjugados cultivados em xilose foram obtidos para mini-tn5-tal/tkt-xylAxylB.
As culturas de lote preliminar foram testadas estaticamente a 30°C sem controle do pH em recipientes com 80 ml de RM contendo xilose a 2% para a dinâmica da fermentação. As colônias, retiradas de placas de RM + xilose a 2%, foram cultivadas em um meio RM com xilose a 2% de um dia para o outro a 3 0 ° C até que a cultura atingisse a fase estacionária de crescimento (densidade óptica600 = 0,1 a 50 0 nm) . Essas colônias foram utilizadas como inóculo. A xilose e o etanol foram analisados utilizando um equipamento de HPLC Hewlett-Packard 1090L dotado de um P 1047. Um detector de índice de refração e uma coluna de análise de ácido orgânico Biorad HPX-87H operando a 65°C com uma vazão de fase móvel de ácido sulfúrico 0,01 N de 0,6 ml/min. O rendimento de etanol foi calculado utilizando o peso do açúcar fermentado ou o açúcar total disponível no meio. O rendimento teórico máximo foi baseado em 0,51 g de etanol/g de xilose. A análise de hibridização Southern de amostras de DNA genômico e de plasmídeo de transconjugados de Z. mobilis foi realizada para determinar se ocorreu a transposição do cassete mini-tn5 tal/tkt-xylAxylB cassete. O DNA genômico e de plasmídeo, preparado a partir dos quatro transconjugados de mini-tn5 tal/tkt-xylAxylB, foram digeridos com Sphl . Sphl se divide duas vezes dentro do cassete, dando origem a um fragmento com homologia da sonda Tal. As manchas foram então hibridizadas em sonda Tal ou sonda Tnp. A auto-radiograf ia na Figura 4 mostra que uma única banda maior que 4 kb (o tamanho de Peno-talB/tktA) , que é adjacente ao DNA de Z. mobilis, foi detectada a partir de todas as preparações de DNA genômico quando hibridizado com a sonda Tal . Três das amostras (N— 22, 23 e 24 possivelmente 'irmãs') também apresentaram uma banda na fração de plasmídeo, sugerindo que a integração ocorreu no plasmídeo nativo. A integração ocorreu no genoma do Z. mobilis da amostra N9 21 e somente uma cópia foi inserida. A hibridização das amostras de DNA genômico e de plasmídeo desses transconjugados com uma sonda Tnp (Figura 5) revelou a ausência de homologia entre os mesmos DNAs e a sonda Tnp. Esses resultados sugeriram que a assimilação de xilose e dos genes da via da pentose fosfato, bem como o gene Tcr, sofreram transposição no genoma de Z. mobilis, que somente uma inserção ocorreu em cada um dos transconjugados e que as inserções ocorreram em locais distintos no genoma.
As atividades da xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transquetolase foram medidas conforme anteriormente descrito em (Zhang et al., 1995) para os transconjugados de Z. mobilis. Conforme acima definido, observou-se que a expressão de uma única cópia de Pgap-xylAxylB no genoma foi de aproximadamente metade do rendimento enzimático de XI e XK para as linhagens contendo plasmídeo. No entanto, quando a análise enzimãtica foi realizada para confirmar se a transaldolase (TAL) e a transquetolase (TKT) foram expressas nos transconjugados tal/tkt-xylAxylB-Tc e tal/tkt-xylAxylB de Zymomonas, conforme mostrado na Figura 6, foi revelado que os níveis enzimáticos de TAL, para todos os transconjugados (N9S 4, 5, 17, 18, 21, 23 e 24), foi de aproximadamente 50-70% dos níveis de suas contrapartes de plasmídeo. Cerca de 30-70% da atividade de TKT das linhagens contendo plasmídeo foi observada nos integrantes. Embora os integrantes de plasmídeo tenham atividades de TAL e TKT discretamente elevadas, essas atividades expressas a partir de uma única cópia dos genes no genoma de Zymomonas foram consideravelmente maiores do que o esperado quando comparadas às atividades das 10 cópias por célula encontrada em uma linhagem contendo plasmídeo.
Os quatro integrantes de Zymomonas tal/tkt-xylAxylB (N25 21, 22, 5 e 11) foram capazes de crescer em xilose. Estudos preliminares sobre fermentação desse integrantes foram realizados utilizando um substrato de xilose a 2% a 30°C. Os perfis de fermentação desses integrantes são mostrados na Figura 7. Na Figura, o crescimento e as taxas de utilização de açúcar do integrante de Z. mobilis N- 21 foram menores que na linhagem 39676/pZB4 contendo plasmídeo. No entanto, a maioria dos integrantes de Z. mobilis (N— 22, 5 e 11) foram comparáveis às linhagens contendo plasmídeo. Todos os integrantes produziram etanol a partir da xilose, em 92% do rendimento teórico máximo do produto. A estabilidade dessas linhagens genômicas integradas e de três linhagens contendo plasmídeo foi medida em um meio não seletivo. Todas as linhagens foram cultivadas em um meio RMG e transferidas em série aproximadamente a cada 10 gerações diariamente. A cada 40 gerações, as células eram utilizadas para inocular um balão de meios RM contendo glicose a 1% e xilose a 5% para medir sua capacidade de fermentar xilose em etanol. Os rendimento do processo de produção de etanol processo e as taxas de utilização da xilose foram utilizadas no base da estabilidade. Duas das linhagens genômicas integradas demonstraram estabilidade por mais de 90 gerações (C25 e D92), ao passo que as linhagens contendo plasmídeo (206/pZB4, 206/pZB4L e BclpZB4L) permaneceram estáveis por aproximadamente 40 gerações. Vide a Figura 8. 0 desempenho de fermentação das linhagens C25 e D95 analisadas em um meio RM apresentava uma concentração diferente de glicose total e xilose (glicose a 1% e xilose a 5%; glicose a 3% e xilose a 3%; e glicose a 4,5% e xilose a 4,5%) sob condições de pH controlado. Conforme mostrado na Figura 9, a linhagem C25 demonstrou maior utilização de xilose e, em valores de pH 5 e 5,5 em RM contendo glicose a 4,5% e xilose a 4,5%, apresentou rendimentos do processo de produção de etanol melhores que a linhagem D92 . Nos exemplos a seguir, os três genes de assimilação de arabinose (araBAD) foram integrados no genoma da C2 5 . EXEMPLO III (AX) O exemplo a seguir demonstra a introdução das enzimas de assimilação de arabinose no genoma de C25 através da recombinaçao homóloga via ldh e transposição utilizando o minitranspóson TnlO. O plasmídeo pZB1862-ldhL-ara, descrito abaixo, foi utilizado para transformar Z. mobilis ou E. coli por eletroporação. Os transformantes foram selecionados em placas de conjugação suplementadas com glicose e tetraciclina. Colônias de Tcr foram ainda confirmadas como Ara+Xyl+ pelo crescimento em RM suplementado com xilose ou arabinose (RMX e RMA) . O plasmídeo TnlOG, também descrito abaixo, foi transferidos de um doador de E. coli SM10 Xpir para C25 de Z. mobilis por conjugação com uma técnica de conjugação em filtro (Conway et al., 1987). Os transconjugados resultantes foram selecionados em placas de conjugação contendo arabinose. A. Construção de pZB1862-IdhL-ara e integração em C25 utilizando a recombinação homóloga. Não foram bem sucedidas as tentativas anteriores de integrar araBAD no genoma de Zymomonas utilizando um fragmento de ldh de 1 kb como a região homóloga. Para aumentar a freqüência de recombinação, uma maior região de homologia foi utilizada. Um fragmento de DNA de 2,5 kb que inclui ldh e a região de f lanqueamento foi amplificado utilizando Pfu PCR. Os primers foram designados com base na seqüência de DNA de Z. mobilis CP4, publicada em Yamano I., (1993) Journal of Bacteriology, Vol. 175, 3926-3933. Em vez de um fragmento de 2,5 kb conforme esperado da PCR, obteve-se um fragmento de 3,4 kb. Após a digestão do fragmento de 3,4 kb com BamHI, obteve-se dois fragmentos (2,5 e 0,9 kb) . Ambos os fragmentos foram testados por PCR utilizando primers designados para reforçar somente o ldh. O fragmento de 2,5 kb gerou um produto de PCR do tamanho correto, ao passo que o fragmento de 0,9 kb não se comportou dessa maneira, indicando que o anterior continha a seqüência ldh. Portanto, o fragmento BamHI de 2,5 kb (designado como ldhL) foi clonado e utilizado como a região homóloga para a integração do gene em C25 O fragmento Idhh foi amplificado por PCR utilizando Pfu (Stratagene, La Jolla, CA) DNA polimerase (Qiagen, Valência, CA). O produto da PCR para ldhL tem 2,5 kb. As seguintes sequências de primer foram utilizadas: ldhL: 5'- TCGCGGATCCTCTATCCCTTTATTTTTCTATCCCCATCACCTCGG-3' (ID SEQ No.:17) 5 ' - TCGCGGATCCGCGGCTGACATACATCTTGCGAATATAGGG- 3 ' (ID SEQ N-: 18) Para fins de clonagem, um sítio Notl foi introduzido em ldhL por inserção de um oligonucleotídeo 5'-CATGCGCGGCCGCC- 3' (SEQ DO No.: 19) no sítio Ncol, que está localizado no meio do gene Idh. O novo sítio Notl tinha aproximadamente 1,4 e 1,1 kb de qualquer terminal do ldhL. Um fragmento BamHI de ldhL (2,5 kb) contendo o sítio Notl foi ligado em pZB1862 em um sítio Bell. Por fim, um Pgap-araBAD de 4,4 kb, isolado a partir de pZB206 (Patentes Norte-Americanas N— 5.712.133 e 5.726.053) , foi clonado no sítio Notl de ldhL para formar o plasmídeo de integração pZB1862-ldhL-ara. Vide a Figura 10. O operon Vgap-araBAD, contendo os três genes de assimilação da arabinose, foi integrado no sítio Idh no genoma C25 através de recombinação homóloga. Para integrar os genes araBAD no genoma de C25, pZB1862-IdhL-ara foi construído em E. coli DH5a. 0 plasmídeo pZB1862-ldhL-ara foi transferido para C25 por eletroporação. Os transformantes resistentes a Tc foram selecionados e testados para crescimento em arabinose. Durante a propagação dos transformantes, Pgap-ara-BAD pôde ser integrado no genoma de C25 pela substituição de ldhL com o cassete ldhL'-araBAD-ldhL' (a partir do plasmídeo) por recombinação homóloga.
Para enriquecer e isolar os integrantes, a cura do plasmídeo foi realizada para os transformantes. 0 plasmídeo pZB1862-IdhL-ara se replicará em Z. mobilis. No entanto, Z. mobilis tende a perder os plasmídeos estranhos sob condições de crescimento sub-ideais (por exemplo, 37°C). Utilizando essa característica, a cura do pZB1862 -IdhL-ara foi realizada pela subcultura dos transformantes de C25 a 37°C na ausência de Tc para várias transferências. As culturas de cada transferência foram constantemente monitoradas quanto à perda do plasmídeo. Na terceira transferência, 100% das células se tornaram Tc5, indicando uma perda do plasmídeo. As culturas da 3-, 4-, 5a e 6- transferências foram inoculadas em RM contendo arabinose (RMA) a 3 0 °C, para enriquecer o crescimento de integrantes de Pgap-araBAD em potencial. As células enriquecidas foram transferidas para placas RMG e separadas para replicação em placas RMA, RMX e RMGTc. Vários integrantes (AX) com o fenótipo de Xyl+Ara+Tc5 foram submetidos a outra análise, conforme descrito abaixo. Esses integrantes eram capazes de utilizar a xilose e a arabinose como a única fonte de carbono. B. Construção de TnlOG e Conjugação em C25.
Mini-Tn5 foi utilizado para construir C25 com os operons Peno-tal/tkt e Pgap-xylAB. Embora o gene transposase não existia em C25, mini TnlO foi utilizado para a integração subsequente de Pgap-araBAD para evitar qualquer possível incompatibilidade entre os mesmos transpósons. O plasmídeo TnlOG (Figura 11) foi construído com base no plasmídeo de distribuição baseado em TnlO, pLOFKm. O gene Kmr foi substituído por um fragmento No tl de Pgap-araBAD, isolado a partir de pZB206. TnlOG foi construído e mantido em E. coli C118 . O plasmídeo foi então transferido para o doador de conjugação, E. coli SM10 Xpir para conjugação com Z. mobilis. Uma vez que TnlOG é um plasmídeo suicida em Z. mobilis, somente transconjugados com integração araBAD puderam crescer nas placas de conjugação suplementadas com arabinose. O doador de E. coli SM10 kpir foi inibido nas placas pela presença de ácido nalidixico. Os transconjugados apareceram nas placas de conjugação/ara em 7 dias. As colônias foram separadas para replicação em RMA e RMX para confirmar seus fenótipos. Oitenta e seis por cento das colônias separadas eram Xyl+Ara+. Vinte colônias das placas separadas foram transferidas de forma cruzada para diferentes placas (de placas de xilose para placas de arabinose ou vice-versa). Sessenta por cento das colônias permaneceram Xyl+Ara+. Vinte colônias foram analisadas em uma hibndização Southern preliminar. Utilizando a sonda tnp, aproximadamente 50% das linhagens continham o gene transposase no genoma. Oito integrantes foram então submetidos à análise detalhada por hibridização Southern. A integração de Pgap-araBAD em Idh de C25 foi confirmada por hibridização Southern, para os integrantes pZB1862-IdhL-ara DNA utilizando as sondas ara e Idh marcadas com DIG. Vide a Figura 12(a) e (b). As sondas Idh, ara e tnp marcadas com digoxigenina (DIG) foram amplificadas por PCR utilizando Taq DNA polimerase (Qiagen, Valência, CA) . DIG-UTP foi adquirido da Boehringer Mannheim, Indianapolis, TN. Uma sonda tnp foi utilizada como sonda para IS10R, o gene transposase de TnlO. Os produtos de PCR para Idh, ara e tnp têm 1, 1,4 e 0,8 kb, respectivamente. As seguintes seqüências de primer foram utilizadas: DIG-Idh:5 ' - CGCGGATCCGTCTATGCGCGCGTCGCAATATTCAGTTCC - 3 ' (ID SEQ No.: 20)5'- TCGCGGATC CGTCGCTTGT CTATTAAACAAGCGCATC CGGC - 3 ' (ID SEQ No.: 21) DIG-ara: 5' - CTAACATGTTGACTCCTTCTCTAGACTTAGCG-3 ' (ID SEQ No.: 22) 5'-GTTGAAACCGCTGGGCACCACGC-3' (ID SEQ
No.: 23) DIG-tnp: 5'-CGCACTACACGGTCGTTCTGTTAC-3' (ID SEQ No.: 24) 5'-GGTTGCAGCCACGAGTAAGTCTTC-3' (ID SEQ No.: 25) Nas manchas, há somente um sítio PstI em pZB1862-IdhL-ara está localizado em Pgap-araBAD. Portanto, uma banda de hibridização (12,9 kb) do plasmídeo digerido por PstI era esperada utilizando a sonda ara. Com Pgap-araBAD integrado no genoma, duas bandas geradas pelo sítio PstI em Pgap-araBAD e os sítios PstI adjuntos no genoma localizado fora de Pgap-araBAD eram esperados. Os resultados da Figura 13(a) mostraram claramente que duas bandas formam a preparação de DNA total hibridizada com a sonda ara e demonstraram a integração de Pgap-araBAD. A ausência de bandas de hibridização do DNA de plasmídeo dos integrantes de Zymomonas indicou que a integração ocorreu no genoma em vez de nos plasmídeos nativos. Para demonstrar que ldh foi rompido pela integração de Pgap-araBAD, o mesmo DNA foi transferido e hibridizado com a sonda ldh. Conforme esperado, os padrões de hibridização para os integrantes foram os mesmos em ambas as manchas, exceto para C25, conforme mostrado na Figura 12(b). O DNA total da linhagem de hospedeira, C25, utilizado para a integração Pgap-araBAD, que possui um ldh intacto, apresentou somente uma banda. Os resultados confirmaram que araBAD foi integrada em ldh de C25 .
As Figuras 13(a) e (b) mostram os resultados da hibridização Southern utilizando as sondas Tnp e ara marcadas com DIG, respectivamente, para os oito integrantes de transpóson de Pgap-araBAD gerados por transposição de TnlO. O DNA foi digerido com uma enzima de restrição de PstI. PstI divide TnlOG em dois fragmentos que são hibridizados com uma sonda ara. De acordo com as manchas, somente G8, Gll, G15 e GH17 eram ara-positivos e tnp-negativos. Diferentes padrões de banda indicaram que Pgap-araBAD foi integrado em diferentes locais no genoma. Embora não se esperasse que o gene permanecesse no genoma dos integrantes, quatro linhagens das oito linhagens (G5, G6, G14 e G19) continham o gene transposase. Além disso, G14 e G19 continham o gene transposase no plasmídeo. Com uma sonda ara, duas bandas dos integrantes eram esperadas. No entanto, somente bandas únicas foram observadas. Para resolver essa ambigüidade, foi realizado um procedimento de PCR, para os integrantes utilizando primers de ara e confirmou-se que os oito integrantes continham Pgap-araBAD no genoma. A xilose isomerase (XI), xiluloquinase (XK) , L-arabinose isomerase (L-AI), L-ribuloquinase (L-RK) , L-ribulose-5 -P-4-epimerase (L-Repi), transquetolase (TKT) e transaldolase (TAL) foram ensaiadas utilizando extratos sem células de integrantes de Z. mobilis e linhagens de controle de acordo com Zhang, et al. , 1995; e Deanda et al. , 1996, com pequenas modificações. Os extratos sem células foram preparados pela coleta das culturas na fase log tardia (30°, ODS00 de aproximadamente 1,2) e lavados uma vez com tampão de sonificação (Tris-Cl 10 mM, pH 7,6, MgCl2 10 mM) seguido de sonificação. Os resíduos celulares foram removidos por centrifugação (14.000 rpm, 45 minutos, 4°C) . No ensaio L-AI, os volumes de amostras medidas foram classificados na ordem decrescente pela metade (50 μΐ) , H2S04 70% (1,5 ml) e carbazol (50 μΐ) 0,12%. Todos os tubos foram mantidos em banho-maria a 25°C tanto antes como depois da adição de H2S04 a 70%, até a leitura da absorbância. As amostras foram coletadas em 0, 5, 10, e 20 minutos durante a reação. Os integrantes, tanto da recombinação homóloga como da integração de transpóson, puderam crescer em D-xilose e L-arabinose. O nível de expressão dos genes integrados foi determinado medindo-se a atividade enzimática. Os isolados de C25/AX1, C25/AX101 e C25/G8 foram escolhidos para os ensaios enzimáticos por serem os integrantes mais estáveis, conforme determinado nos estudos de estabilidade descritos abaixo. Os resultados dos ensaios enzimáticos estão resumidos nas Figuras 14 e 15. Para todos os ensaios (com exceção da xiluloquinase) , os integrantes demonstraram atividades positivas em comparação aos controles (C25 e/ou 206C) . Na maioria dos ensaios, (exceto L-ribuloquinase e xilose isomerase), os integrantes demonstraram menores atividades que a linhagem contendo plasmídeo (206C/pZB301) . Isto está presumidamente relacionado ao número de cópia dos genes.
Para estudos de estabilidade, as culturas foram inoculadas em tubos de ensaio contendo RMG, incubadas de um dia para o outro a 3 0°C e transferidas diariamente para tubos RMG. O inóculo foi controlado para permitir a transferência a cada 10 gerações. A cada 40 gerações, as células eram utilizadas para inocular balões contendo uma mistura de açúcares para testar as capacidades de fermentação dos açúcares sem controle do pH a 30°C. Estudos de fermentação de lote foram realizados a 30°C com controle do pH em quimiostatos Bio-StatQR utilizando 500 ml como o volume de trabalho. O pH foi automaticamente controlado com KOH 2N. A concentração inicial de açúcar concentração e o pH variaram de lote para lote, dependendo das condições da cultura. Todos os açúcares utilizados eram de grau reagente. As amostras foram periodicamente coletadas durante toda a fermentação e analisadas por HPLC quanto ao teor de açúcares, etanol e subprodutos. conforme descrito anteriormente (Zhang 1995) . A densidade óptica a 600 nm (OD6oo) foi medida para monitorar o crescimento celular. O rendimento de etanol foi baseado na quantidade de açúcar total disponível.
Diversas linhagens genômicas integradas de Z. mobilis de fermentação de xilose e arabinose, desenvolvidas através de recombinação homóloga e transposição, foram estudadas quanto à estabilidade em um meio não seletivo (RMG) . Essas linhagens foram cultivadas em meio RMG e transferidas em série, diariamente, após aproximadamente 10 gerações. Após cada 40 gerações, as células foram utilizadas para inocular um balão contendo glicose a 1% e xilose a 2% e arabinose a 2% para análise de sua capacidade de fermentar a xilose e a arabinose em etanol. Os rendimentos do processo de produção de etanol e as taxas de utilização de xilose e arabinose foram utilizados como a característica de estabilidade. Dois dos isolados permaneceram estáveis por 160 gerações. Vide as Figuras 16 e 17. Três linhagens integradas e uma linhagem contendo plasmídeo foram ainda testadas quanto ao desempenho de fermentação em um meio contendo uma mistura de glicose a 4%, xilose a 4% e arabinose a 2% em pH 5,5 e a 30°C. Conforme mostrado na Figura 18, as três linhagens utilizaram glicose, xilose e arabinose em 72 horas, ao passo que as linhagens contendo plasmídeo ainda tinham 6 g/L de arabinose residual. No entanto, as linhagens integradas produziram mais xilitol (4 g/L) que a linhagem contendo plasmídeo (1 g/L). As duas linhagens AXl e AX101 de recombinação homóloga não produziram lactato, pois o gene lactato desidrogenase foi inativado através de integração genética. Os rendimentos do processo (cerca de 83% do valor teórico) das linhagens integradas eram muito semelhantes aos da linhagem contendo plasmídeo. Além disso, as linhagens integradas cresceram e atingiram maiores densidades celulares, o que reflete uma menor carga metabólica associada ao fato de ter somente uma única cópia dos sete genes.
EXEMPLO IV O exemplo a seguir ilustra a integração de PgapxylAB em ldh de Z. mobilis 31821-5C através da recombinação homóloga. Z. mobilis 31821 já demonstrou ter aumentado a tolerância aos altos fluxos de fornecimento de açúcar, altas temperaturas e ácido acético. Assim, Z. mobilis 31821 é um excelente alvo para integração dos quatro genes para utilização da xilose (tal, tkt, xylA e xylB) . No entanto, considerou-se que a linhagem 31821 é de dificílima transformação utilizando o DNA de um hospedeiro normal de E. coli. Descobriu-se que a linhagem parece ter um único histórico genético que restringe o DNA de um hospedeiro de metilação. O atual método utilizando minTn5Tc via transconjugação usando E. coli SmlO(Xpir) como hospedeiro doador não funcionou em 31821-5C. Tentou-se aplicar diferentes técnicas de integração. Os sistemas mini-Tn5 e mini-TnlO sistemas não são aplicáveis devido à ausência de um hospedeiro doador de E. coli deficiente em metilação q pode ser necessário para conjugação na linhagem 31821 para o plasmídeo do transpóson. Dois estudos foram conduzidos para conjugar um miniTn5 (que contém um gene Tcr entre as seqüências de inserção) em 31821-5C e nenhum transconjugado foi obtido. Considerando que um pequeno fragmento, por exemplo, Tcr (1,5 kb) não pode ser conjugado e integrado no genoma de 31821-5C pela transposição de mini-Tn5, a integração de qualquer fragmento maior, por exemplo, PgapxylABTc ou PenotaltktCm não é possível. Um método de transposição baseado na transformação em vez da conjugação no hospedeiro foi desenvolvido (utilizando o kit de inserção EZ: :TN, vide abaixo) e uma região de homologia ampliada para recombinação homóloga foi desenvolvida devido à baixa eficiência de recombinação da linhagem 31821.
As diversas tentativas de integrar os quatro genes (dispostos em dois operons - PgapxylAB e Penotaltkt) no genoma de 31821-5C utilizando o kit de inserção EZ: :TN não foram bem sucedidas. Isso pode ser atribuído a dois problemas em potencial. Primeiro, o tamanho do inserto deve ser muito grande para que a integração ocorra no genoma. Em segundo lugar, a seleção direta em meio de xilose pode não permitir que os genes sejam expressos a tempo para que os integrantes cresçam. Para superar esses problemas em potencial, foi necessário desenvolver uma abordar diferente para a integração do gene em 31821. Em vez da integração dos quatro genes, dois genes (um operon-PgapxylAB ou Penotaltkt) seriam integrados de uma só vez. Dois operons seriam integrados seqüencialmente no mesmo hospedeiro. Cada operon seria conectado a um marcador antibiótico (Tcr ou Cmr) para a seleção inicial de integrantes. Dessa forma, os integrantes podem ser selecionados pela resistência antibiótica. Dois métodos de integração foram aplicados para os genes de utilização da xilose em 31821-5C (recombinação homóloga e transposição). Um gene Tcr foi integrado no ldh de 31821-5C utilizando uma região de homologia de 2 kb incluindo ldh (a saber, ldhL) . Em duas das várias tentativas de integrar um fragmento PenotaltktTc em um local ldh de 2 kb, foi necessário um tempo muito longo para obter-se os integrantes devido ao prolongado processo de cura e enriquecimento (pelo menos 14 dias). No entanto, os integrantes não puderam crescer em xilose quando um plasmídeo contendo PgapxylAB foi transformado nos integrantes. Um fragmento de PCR utilizando primers específicos de ldh e o DNA genômico integrante como template foi produzido e analisado por seqüênciamento de DNA. O resultado indicou que nenhum mutação foi introduzida no operon Penotaltkt. Dois problemas em potencial foram analisados. Primeiro, a orientação dos genes taltkt foi oposta à de um gene, pgm, que está imediatamente acima de ldh no genoraa. Há fortes promotores no gene pgm que podem atuar contra a expressão de taltkt. Em segundo lugar, o Peno é um promotor relativamente fraco em Zymomonas. Uma única cópia de Penotaltkt no integrante pode não ser suficiente para a expressão do gene. Tentou-se então integrar Penotaltkt por transposição (uma vez que o sítio ldh pode apresentar um problema de forte promotor upstream) e PgapxylAB por recombinação homóloga. De modo mais importante, a região de homologia para integração precisa ser expandida além da região ldhL de 2 kb a fim de aumentar a eficiência da recombinação. A nova região de homologia foi ampliada e incluída nas regiões de flanqueamento de ldh (genes pgm e adhl) . O tamanho total da homologia foi de aproximadamente 4 kb (ldhL4 designado).
Uma estratégia foi desenvolvida para integração do operon PgapxylAB no genoma de 31821 pela construção de pZB510XTc e pZB512XTc (vide as Figuras 19A e 19B) e dois plasmídeos mais semelhante (pZB511XTc e pZB513XTc) com organização diferente dos genes no cassete baseado no plasmídeo de replicação, ρΖΒ1861. A fragmento de homologia ldhL4 foi gerado por duas reações PCR, resultando em fragmentos 5'- e 3'-. Os fragmentos 5'ldhL4 (1,9 kb) e 3' ldhL4 (2,4 kb) gerados pela PCR foram seqüencialmente inseridos no sítio BamHI-Xbal e no sítio BamHI do vetor de transferência, pZB1861. Os sítios e restrição de Notl e Sfil foram introduzidos entre 5'ldhL4 e 3'ldhL4 durante a PCR. O plasmídeo de integração pZB510XTc foi então construído pela inserção de PgapxylAB (de pZB4) e Tcr (produto da PCR) nos sítios Notl e Sfil . O plasmídeo pZB512XTc foi construído de forma semelhante, exceto pelo fato de que a orientação do PgapxylAB foi oposta à do pZB510XTc.
Os plasmídeos foram introduzidos na linhagem 31821-5C por eletroporação. Os plasmídeos pZB510XTc, pZB512XTc, pZB51lXTc e pZB513XTc foram utilizados para transformar 31821-5C. Após várias tentativas, os transformantes com pZB510XTc e pZB512XTc foram obtidos. Nenhum transformante com pZB511XTc e pZB513XTc foi obtido. O marcador Tcr foi incluído no cassete de integração e utilizado para a seleção de integrantes. O marcador Cmr, no entanto, foi localizado fora do cassete na base do vetor. Os transformantes TcrCmr foram selecionado e cultivados na presença de Tc para 2 a 4 transferências diárias. Durante a propagação dos transformantes, PgapxylABTc foi integrado em ldh do hospedeiro através de recombinação homóloga. Para enriquecer e isolar os integrantes, o plasmídeo passou por um processo de cura. A cura dos plasmídeos pode ser realizada pela subcultura dos transformantes a 37°C na ausência de antibióticos para várias transferências diárias por aproximadamente 7 a 14 dias. O monitoramento constante da perda de plasmídeos foi realizado para as culturas de cada transferência. Na terceira transferência, >99% das células se tornaram Cm® indicando a perda de plasmídeos. As culturas da 3-, 4â, 5® e 6- transferências foram inoculadas em RM a 3 0 °C para enriquecer o crescimento de integrantes de PgapxylAB em potencial. As culturas enriquecidas foram transferidas para placas RMGTc e separadas para replicação em placas RMGCm e RMGTc. Os integrantes (TcrCms) foram diferenciados das células do tipo selvagem (TcsCms) e das células contendo plasmídeo (TcrCmr) pelos fenótipos de resistência antibiótica. Vários integrantes de PgapxylAB em potencial foram isolados e submetidos para futura análise. A retrotransformação em E. coli DH5a com o plasmídeo D NA extraído dos integrantes foi realizada para excluir as linhagens contendo plasmídeo. A análise por PCR das colônias foi realizada para avaliar o genótipo dos integrantes utilizando pares de primer de Tc, xylAB e Cmr individualmente. Quatro isolados, x4i, x6i, x9i e xlOi foram indicados como integrantes uma vez que nenhum transformante foi obtido na retrotransformação e os resultados da PCR demonstraram bandas de xylAB e Tcr, porém nenhuma banda de Cmr. Os integrantes PgapxylAB (x4i, x6i, x91 e xlOi) foram transformados com um plasmídeo de replicação de Zymomonas, pZB192, que contém Penotaltkt, mas não PgapxylAB. Os transformantes puderam crescer em RMX, indicando que uma única cópia de PgapxylAB integrado forneceu atividades suficientes da xilose isomerase e xiluloquinase para utilização da xilose quando os genes tal e tkt foram fornecidos em um plasmídeo (múltiplas cópias). Os resultados também garantiram que podemos ainda integrar Penotaltkt nos integrantes PgapxylAB para construir uma linhagem 31821 de fermentação da xilose totalmente integrada (vide o Exemplo VI).
EXEMPLO V O exemplo a seguir ilustra a integração de Penotaltkt no genoma de Z. mobilis 31821-5C através de transposição. A transposição de mini-Tn5 ou mini-TnlO não foi aplicável para 31821 devido â ausência de um hospedeiro doador deficiente em metilação para conjugação. Um novo método de transposição (kit de inserção EZ: :TN) foi adotado. A natureza do método requer que as transposases se liguem às terminações Mosaic que flanqueiam PenotaltktCm e clivam o fragmento enquanto mantém a ligação às terminações quando submetido à eletroporação nas células. Dentro das células, as transposases desencadeiam a transposição do fragmento de DNA no genoma do hospedeiro. O plasmídeo de integração pMODPenotaltktCm (vide a Figura 20) é um plasmídeo de não-replicação em Zymomonas preparado a partir de um hospedeiro de E. coli deficiente em metilação. As células submetidas a eletroporação foram colocadas em placas MMGCm. Os transformantes Cmr devem ser integrantes. Três integrantes Cmr foram obtidos utilizando esse método de transposição, aqui denominados intl, int2 e int3. Os integrantes foram confirmados por triagem com PCR utilizando primers para tal ou Cm. Também, foi necessária a confirmação por retrotransformação do plasmídeo a partir dos integrantes em E. coli para garantir que Penotal tJctCmr não foi mantido no plasmídeo pMOD. Os integrantes foram transformados com um plasmídeo pZB188-xyl, que contém PgapxylAB (mas não Penotaltkt). As células submetidas a eletroporação foram colocadas diretamente em placas MMX. Nenhum transformante foi obtido nesse experimento de complementação. Uma única cópia de Penotaltkt não pode fornecer atividade suficiente de transaldolase e transquetolase para o crescimento inicial em placas de xilose. Um promotor de Zymomonas mais forte, por exemplo, Ppdc (do gene piruvato descarboxilase) e Pgap (do gene gliceraldeído fosfato desidrogenase) pode compensar o efeito de baixo número de cópias da expressão de taltkt.
EXEMPLO VI O exemplo a seguir - ilustra a construção de integrantes de Penotaltkt /PgapxylAB. As tentativas de integrar os quatro genes de utilização da xilose genes não foram bem sucedidas utilizando a transposição ou a recombinação homóloga, uma vez que a cópia única de Penotaltkt no genoma de 31821-5C não sustentou o crescimento da linhagem em xilose ao fornecer os genes de assimilação da xilose em um plasmídeo. Os requerentes tentaram aumentar o número de cópias de Penotaltkt integrado pela transposição ín vitro de pMODPenotaltktCm em plasmídeos nativos da linhagem 31821. Os plasmídeos nativos submetidos à transposição foram então submetidos à eletroporação em um integrante PgapxylAB, x9i. Os integrantes finais selecionados por TcrCmr foram designados como x9t(enott)Pi. Os plasmídeos isolados a partir de integrantes foram utilizados para a retrotransformação de Z. mobilis 31821-5C e E. coli DH5a. Os retrotransformantes foram obtidos para Z. mobilis, porém não para E. coli, indicando que os genes foram integrados nos plasmídeos nativos de x9i . Em outra abordagem, os plasmídeos de integração, pZB510XTc e pZB512XTc contendo PgapxylABTcr foram preparados a partir de E. coli DM1 e transformados em int2. Os transformantes TcrCmr foram obtidos após várias tentativas de eletroporação. Os transformantes foram então utilizados para um processo prolongado de cura e enriquecimento conforme descrito acima. Os integrantes obtidos por ambas as abordagens foram testados em meio de crescimento contendo xilose (RMX). Observou-se o crescimento em RMX de alguns dos integrantes; no entanto, esse crescimento foi mínimo. Após uma série de adaptação em RMX (vide os exemplos abaixo), dois integrantes de cada integração (x9t(enott)Pi#4 e #8; int2/321 e int2/l821) tiveram um desempenho relativamente melhor em RMX e foram novamente analisados.
Os integrantes Penotal tkt/PgapxylAB resultantes em potencial foram submetidos à análise de hibridização Southern análise para confirmar a presença do DNA-alvo. A hibridização foi realizada utilizando uma sonda xylB digerida com Sphl (Figura 21 A) utilizando DNA total e DNA de plasmídeo preparados a partir desses integrantes. Esperava-se que o plasmídeo pZB512XTc (como controle) tivesse duas bandas, 5,4 e 2,5 kb, sendo que a banda de 2,5 kb é comum aos DNA total dos integrantes x9t(enott)Pi#4, #8 e int2/321. No entanto, esperava-se que o plasmídeo pZB510XTc tivesse duas bandas, 4,2 e 3,7 kb, sendo que a banda de 3,7 kb é comum ao DNA total do integrante int2/l821. Todos os integrantes eram baseados em x9i, no qual PgapxylAB era integrado no local de LDH no genoma. Todos os integrantes possuem uma banda comum a seus respectivos plasmídeos de integração, bem como uma segunda banda que é diferente das bandas geradas a partir dos plasmídeos conforme esperado. Todos os integrantes continham bandas nas preparações de DNA total, porém não nas preparações de DNA de plasmídeo, indicando que PgapxylAB foi integrado no cromossomo em vez de nos plasmídeos nativos de ATCC31821. Na hibridização com a sonda tkt, o DNA total e o DNA de plasmídeo preparados a partir desses integrantes foram digeridos com BssHII (Figura 21B). Esperava-se que o plasmídeo pMODPenotal t/ctCm (como controle) tivesse 4 bandas incluindo 4,2, 1,5, 0,9 e 0,1 k, sendo que as bandas de 1,5 e 0,9 kb são comuns ao DNA total de todos os integrantes. A banda de 0,1 kb era muito pequena para ser retida no gel. Conforme mostrado na Figura 21 B, x9t(enott)Pi#4, #8 continha bandas de 1,5 e 0,9 kb tanto nas preparações de DNA total como de DNA de plasmídeo, confirmando que Penotaltkt foi integrado no plasmídeo nativo. A terceira banda, não presente em #4 e #8 na mancha, deve ser muito pequena para permanecer no gel. De acordo com o mapa (vide a Figura 20) , essa banda podería ser menor que 0,4 kb. Além das duas bandas comuns, int2/321 e int2/1821 possuíam uma banda de 6,4 kb que é diferente da banda do plasmídeo, indicando que Penotaltkt foi integrado no cromossomo desses dois integrantes.
EXEMPLO VII O exemplo a seguir ilustra a atividade enzimática do integrante de Zymomonas. As culturas foram inoculadas a partir da 5- (para x9 (enott) Pi#4 e #8) e 4- (para int2/321 e int2/1821) transferências de RMX em RMG e cultivadas por 16 horas antes da inoculação em RMG fresco. As células com OD600=1,0 foram coletadas e cultivas em RMG para ensaios. Os resultados são mostrados na Figura 22 . A linhagem int2 baseada em 31821-5C, uma linhagem Penotaltkt cromossomic amente integrada, e 31821-5 C/pZB112, a linhagem de plasmídeo contendo Penotaltkt em um plasmídeo de transferência (derivado de pZB1861), bem como a linhagem de hospedeiro 31821-5C, foram incluídas em ensaios de TAL e TKT como controles. Ensaios enzimãticos em xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transquetolase foram realizados em todos os integrantes e linhagens de controle. A linhagem 31821-5C/pZB112 apresentou altas atividades para transaldolase e transquetolase conforme esperado. Diferentes níveis enzimãticos foram observados a partir dos integrantes. Além disso, diferentes níveis enzimãticos foram observados mesmo entre os integrantes obtidos utilizando um método de integração similar. As linhagens x9t(enott)Pi#4 e int2/321 geraram, respectivamente, a primeira e segunda maior atividade em todos os ensaios. Essas linhagens também cresceram mais em RMX (vide a Figura 23) . Deve ser observado que as linhagens integradas por plasmídeo nativo (x9t(enott)Pi#4 e #8) não tinham necessariamente maiores atividades de TAL e TKT.
EXEMPLO VIII O exemplo a seguir ilustra que os integrantes Penotaltkt/PgapxylAB de Z. mobilis 38121-5C são capazes de fermentar D-xilose em etanol após uma série de adaptações em RMX. Os integrantes foram inoculados em tubos RMX vedados (contendo 2% de xilose) com parafilme para impedir a evaporação. 0 crescimento foi rotineiramente monitorado por medições de OD600. As culturas do estágio exponencial foram transferidas para RMX fresco. Conforme mostrado na Figura 23, comparou-se as curvas de crescimento entre a Ia e a 4â transferências. A taxa de crescimento e a leitura final da OD600 foram aperfeiçoadas durante o período de adaptação. O valor final de OD aumentou de 0,08 (primeira transferência) para 0,6 (quarta transferência). As taxas de crescimento e as leituras máximas de OD600 se estabilizaram após a quinta transferência. Acredita-se que a mutação das culturas ocorreu durante o processo de adaptação. O meio RMX permitiu a seleção natural de mutantes com utilização mais eficaz. Entre os quatro integrantes analisados, dois apresentaram as maiores taxas de crescimento e valores de OD, a saber, x9t(enott)Pi#4 e int2/321. As amostras das culturas da quarta/terceira transferências foram retiradas no tempo de 140 horas para análise por HPLC. Conforme mostrado na Tabela 1, a xilose foi consumida a partir de 20g/L desde a concentração inicial até 4-14 g/L e níveis significativos de etanol foram gerados, indicando que os integrantes PenotaI tJct/PgapxylAB de Z. mobilis 31821-5C foram capazes de fermentar a D-xilose em etanol.
Tabela 1: Análise por HPLC dos integrantes PenotaItJct/PffapxylAB de Z. mobilis 31821 em RMX em 140 horas EXEMPLO IX O exemplo a seguir ilustra a construção de pMODPgaptaltktCm para transposição em z. mobilis. Uma abordagem semelhante para construir pMODPenotaltktCm foi utilizada, como exceção de dois sítios loxP sítios que foram introduzidos. Um fragmento tkt de 2,2 kb foi isolado a partir de pUCtaltkt por digestão de BglII/Xbal e clonado em vetor pMOD digerido com BamHI/Xbal, resultando em pMODtkt. Um fragmento de PCR, Pgaptal, foi gerado pela fusão de uma região de promotor de Zymomonas de GAP (gene gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase) para o gene estrutural de tal. Esse fragmento foi digerido com Xbal e clonado no plasmídeo pMODtkt . Por fim, o fragmento de PCR contendo duas seqüências de loxP (Palmeros et al . , 2000, Gene 247:255-264) flanqueando Cmr (CmloxP) foi inserido no sítio Sfil do plasmídeo para formar o plasmídeo de integração pMODPgaptaltktCm (Figura 24) . As seqüências de loxP que flanqueia Cmr podem ser utilizadas como o alvo de ligação de um fago Cre recombinase, que então removerá Cmr do genoma do integrante se necessário. Similarmente, essa abordagem também pode ser utilizada para o loop do gene de resistência Tc. É vantajoso ter a capacidade de remover os genes de resistência antibiótica. Os requerentes introduziram um sistema loxP/cre para essa finalidade. As seqüências oligo da PCR para a construção acima são as seguintes: 1. Pgap (0,3 kb) Template: pZB4 Primers: PgapXbSfí(F) 5' CAGTCTAGAGGCCGCCTAGGCCGTTCGATCAACAACCCGAATCC3' (ID SEQ No.: 26) 3'Pgap5'tal(R) 5'CAATTTGTCCGTCATGTTTATTCTCCTAAC3' (ID SEQ No.: 27) 2 . tal (1 kb) Template: pZB4 Primers: 3'Pgap5'tal(F) 5'GTTAGGAGAATAAACATGACGGACAAATTG3' (ID SEQ NO.: 28) talXb (R) 5 ' CCAGATCGTCTAGATTACAGCAGATCGCC3 ' (ID SEQ No.: 29) 3. Pgaptal (1,3 kb) Template: Pgap e tal Primers: PgapXbSf i(F) 5 ' CAGTCTAGAGGC CGC CTAGGC CGTTCGATCAACAACCCGAATC C3 ' (ID SEQ No.: 30) talXb (R) 5 ' CCAGATCGTCTAGATTACAGCAGATCGCC3 ' (ID SEQ No.: 31) 4. CmloxP (1,1 kb) Template: pZB186 Cmlox(F,sfi) 5 ' CAGGGCCGCCTAGGCCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGT
TATCCTG TGACGGAAGATCACTTCGC3' (ID SEQ No.: 32) Cmlox(R,sfí) 5' CAGGGCCTAGGCGGCCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGT
TATCCTG AACCGACGACCGGGTCG3' (ID SEQ No.: 33) EXEMPLO X O exemplo a seguir ilustra a construção de integrantes Pgaptaltkt/PgapxylAB baseados em Z. mobilis 31821-5C. O plasmídeo pMODPgaptaltktCm preparado a partir de E. coli DM1 ou JM110 foi tratado com EZ::TN transposase para produzir transpossomo. A mistura de transpossomo foi submetida a eletroporação em um integrante PgapxylAB, a saber, x9i. Os integrantes Pgaptaltkt/PgapxylAB foram obtidos pela seleção em RMGTcCm (o gene de resistência Tc já foi integrado no genoma de x9i). A análise inicial, por exemplo, retrotransformação em E. coli utilizando o DNA de plasmídeo dos integrantes, foi realizada para identificar os reais integrantes vs. linhagens contendo plasmídeo. Vários integrantes de DNA de plasmídeo resultaram em retrotransformantes de E. coli e esses falsos integrantes foram eliminados. Os integrantes TcrCmr em potencial foram inoculados em RM contendo xilose como a única fonte de carbono e incubados a 30°C. O crescimento foi monitorado pela medição da OD600. Todas as linhagens puderam crescer em RMX inicialmente até OD = 0,3 em baixas taxas. No entanto, as taxas de crescimento e os valores finais de OD se aperfeiçoaram após a 6- transferência em RMX. As curvas de crescimento das linhagens com melhor crescimento (#20, #21) são mostradas na Figura 25.
EXEMPLO XI O exemplo a seguir ilustra o processo de isolamento dos integrantes Penotaltkt/PgapxylAB e Pgaptaltkt/PgapxylAB de Zymomonas. Para isolar as linhagens com melhor crescimento na população mista, as células foram inoculadas em placas RMX. As linhagens x9t(enott)Pi#4 e x9t(enott)Pi#8 foram inoculadas após a 4a transferência, int2/xyl321 e int2/xyll821 foram inoculadas após a 3â transferência e #20 e #21 foram inoculadas após a 6- transferência. Esse ciclo de isolamento foi denominado 1- isolamento. Diferentes tamanhos de colônias foram observados em placas RMX. As colônias grandes foram separadas e novamente inoculadas em placas RMX (2- isolamento). Várias colônias distintamente grandes foram separadas e inoculadas em meio líquido RMX para análise do crescimento. Quatro linhagens, que demonstraram promissor crescimento em RMX, foram escolhidas para outras análises incluindo a hibridização Southern, fermentação e ensaios enzimáticos. As quatro linhagens são designadas como 321(5) (derivada de int2/xyl321), 481 (derivada de x9tPenott) Pi#4) , 2032 (derivada de #20) e 2122 (derivada de #21). A hibridização Southern foi realizada utilizando o mesmo método discutido no Exemplo VI. Conforme mostrado na Figura 26A (utilizando xylB como sonda) e 26B (utilizando tkt como sonda) , a integração foi confirmada pela ausência de bandas de hibridização nas preparações de plasmídeo, exceto para a linhagem 481 (derivada de x9t(enott)Pi#4) na Figura 26B, conhecídamente construída pela integração de Penotaltkt no plasmídeo nativo de Z. mobilis 31821. A diferença no padrão de banda entre 481 e pMODPenotaltktCm de controle indicou que as bandas não foram derivadas do plasmídeo de integração. Em vez disso, foram derivadas da integração de PentaltktCm no plasmídeo nativo. Na Figura 26A, uma banda comum esperada de 2,5 kb foi observada em pZB512xTc e nos quatro integrantes. A segunda banda, no entanto, foi diferente entre pZB512xTc e os integrantes, indicando a integração de xylAB no cromossomo (supostamente o gene ldh) . A banda de maior peso em 2032 ocorreu possivelmente devido a uma mudança espontânea no sítio Sphl no genoma onde está próximo da região ldhL4. Na Figura 2 6B, as bandas comuns de 1,5, 0,9 e 0,1 kb eram esperadas entre pMODPenotaltktCm ou pMODPgaptaltkt e todos os integrantes. A banda diferente confirmou a integração de PenotaltktCm ou PgaptaltktCm no genoma de 31821-5C. A fermentação preliminar foi realizada para os quatro integrantes, 321(5), 481, 2032 e 2122, bem como as linhagens de controle, 31821/pZB5 (linhagem contendo plasmídeo), C25 (integrante de fermentação da xilose baseado em 39676) e 31821-5C (hospedeiro). A condição de fermentação foi: 80 ml de RMX (xilose a 2%) ou RMGX (glicose a 1% e xilose a 2%) em recipientes, sem controle do pH, 30°C, estático. A fermentação foi monitorada por análise por HPLC dos sobrenadantes dos caldos de fermentação. Todos os integrantes puderam crescer em RMGX e fermentar tanto a xilose como a glicose em etanol em máximos rendimentos (Figuras 27A, B e C) . Todos os integrantes puderam crescer em RMX e fermentar a xilose em etanol nos máximos rendimentos (Figuras 28A e B) . O perfil de produção de etanol é semelhante entre os integrantes e a linhagem de controle contendo plasmídeo (31821/pZB5) e integrante C25 (integrante de xilose baseado em 39676) em ambos os meios (Figuras 27C e 28B). Conforme esperado, a linhagem de hospedeiro somente fermentou a glicose em etanol (Figura 27B) em meio RMGX.
Os ensaios enzimáticos também foram realizados para os quatro integrantes e as linhagens de controle, 1821/pZB5 (linhagem contendo plasmídeo), C25 (integrante de fermentação da xilose baseado em 39676) e 1821-5C (hospedeiro). Os dados são apresentados na Tabela 2 abaixo. Todos os integrantes demonstraram atividades menores que 31821/pZB5 e C25.
Tabela 2. Atividades enzimãticas dos integrantes.
Atividade Específica (μπιοΐ/πύη-πκ? proteína) ND: não detectado.
XI XK TAL TKT 321(5) 0,06 0,17 2,10 0,91 481 0,04 0,23 2,27 0,74 2032 0,15 0,23 1,76 1,05 2122 0,04 0,19 1,56 0,51 int2 0,02 0,02 1,19 0,31 X9i 0,04 0,06 ND 0,03 3182l/pZB5 0,06 0,55 2,52 1,78 C25 0,20 0,81 3,78 1,99 31821-5C 0,08 0,07 0,01 0,01 EXEMPLO XII O exemplo a seguir ilustra o processo de mutagênese dos integrantes de Zymomonas na tentativa de melhorar o crescimento em meio de xilose. Colônias únicas de integrantes int2/xyl321 e x9t(Penott)Pi#8 foram inoculadas em RMG e incubadas a 30°C de um dia para o outro. As culturas desenvolvidas foram utilizadas para inocular o meio de conjugação suplementado com glicose a 5% (OD=0, 15~ 0,2) e incubado a 30°C até OD=0,5~0,6. As células foram coletadas e tratadas como um mutãgeno químico 1-metil-3-nitro-1-nitrosoguanidina (MNNG ou NTG) na concentração de 25 ng/ml. As células tratadas com NTG foram coletadas, lavadas em RMG duas vezes e ressuspensas em RMGX (glicose a 0,5% e xilose a 1,5%) para crescimento. As culturas desenvolvidas foram subcultivadas duas vezes no mesmo meio seguido de inoculação em placas RMX. As maiores colônias foram novamente inoculadas em placas RMX. As maiores colônias foram separadas e inoculadas em meio líquido RMX. As culturas desenvolvidas foram novamente inoculadas em placas RMX. Por fim, as maiores colônias foram separadas e cultivadas em RMX. Duas das colônias com o melhor desenvolvimento foram designadas como 8b e 2/321-2 . Uma das linhagens, 8b, foi novamente avaliada. De modo geral, o mutante aprimorou a utilização de xilose na mistura de glicose e xilose. bem como na presença de acetato conforme descrito nos exemplos a seguir.
EXEMPLO XIII O exemplo a seguir ilustra a avaliação da fermentação dos vários integrantes construídos com base no hospedeiro de Z. mobilis ATCC31821-5C. A linhagem C25 e a linhagem 31821/pZB5 contendo plasmídeo foram utilizadas como controle para avaliação da fermentação. A fermentação foi avaliada em fermentadores BioStat-Q com 500 mL de volume de trabalho sob condições controladas de pH e temperatura. O pH foi controlado em 5,5 utilizando KOH (2N) para titulação e a temperatura foi controlada em 3 0 °C. Os meios de fermentação RM continham uma mistura de glicose e xilose (RMGX(1%:6%) e RMGX{3,5%:3,5%)) . Todos os componentes dos meios de crescimento foram preparados separadamente como soluções estoque esterilizadas em filtro como RM (10X), glicose (50%) e xilose (50%). Os fermentadores passaram por uma autoclave e os meios de crescimento foram adicionados sob condições estéreis em fermentadores. 0 inóculo foi preparado em balão de 250 mL contendo 200 mL de meios RMGX (2%: 2%) . Após o crescimento de um dia para o outro crescimento, a cultura foi centrifugada e concentrada em 10 mL de meios similares aos meios de fermentação. O volume de inóculo necessário para iniciar a fermentação com OD = 0,1 a SOOnm foi calculado e utilizado para inocular os fermentadores. Os fermentadores foram freqüentemente amostrados conforme necessário. As amostras foram analisadas por HPLC quanto ao teor de açúcares, etanol e subprodutos.
Todas as linhagens fermentaram glicose e xilose em etanol, sendo que as linhagens 8b e 2 032 demonstraram o melhor desempenho em fermentações com pH controlado (Figuras 29 e 30). As linhagens integradas 8b e 2032 apresentaram desempenho similar ao da linhagem contendo plasmídeo 3182 l/pZB5 e o integrante C25 que é baseado no hospedeiro de 39676.
EXEMPLO XIV O exemplo a seguir ilustra a estabilidade dos integrantes de Zymomonas. O teste foi realizado por uma transferência em série da cultura em um meio não seletivo (RMG) utilizando tubos estéreis Falcon de 15 mL contendo 10 mL de meio (vide a Figura 31). Essas linhagens foram cultivadas em meio RMG e transferidas em série diariamente após aproximadamente 10 gerações. A cada 40 gerações, as células eram utilizadas para inocular um balão contendo glicose a 2% e xilose a 2% para análise de sua capacidade de fermentar glicose e xilose em etanol. Os rendimentos do processo de produção de etanol e as taxas de utilização da xilose foram utilizados como indicação da característica de estabilidade. Todos os integrantes demonstraram ser estáveis por pelo menos 140 a 160 gerações sem seleção das temperaturas de 30° e 37°C (Figuras 32 e 33) . A linhagem 3182l/pZB5 contendo plasmídeo perdeu as capacidades de utilização da xilose em 40 gerações tanto a 30°C como 37°C (a Figura 33 apresenta dados a 37°C).
EXEMPLO XV O exemplo a seguir ilustra o efeito da concentração de ácido acético sobre o crescimento e fermentação da xilose de linhagem AX101, bem como o efeito do pH. O ácido acético está normalmente presente nos hidrolisados das matérias-primas de biomassa pré-tratadas e inibe o microorganismo de fermentação. A fermentação ocorreu em pH 5, pH 5,5 e pH 6,0 com e sem (pH 5,5) suplementação com 2 g/L de acetato para avaliar o desempenho da linhagem AX101. O meio de cultura utilizado foi RMGXA (4%:4%:2%) suplementado com a concentração desejada de acetato. O resultado (Figura 34) demonstrou que 2 g/L de acetato apresentaram efeito inibitório sobre o crescimento, utilização da xilose e produção de etanol pela linhagem. A inibição foi muito mais forte em menor pH (pH 5,0) em comparação ao pH mais elevado (pH 6,0) .
EXEMPLO XVI O exemplo a seguir ilustra o processo de introdução e retirada da fermentação de AX101. Um estudo foi desenhado para verificar se a adaptação gradual da linhagem AX101 ao acetato melhoraria o desempenho dessa linhagem em meios de cultura com maiores concentrações de ácido acético. Primeiramente, foi comparado um grupo de fermentação em lote em meio RMGXA (4 %: 4 %: 2 %) , pH 5,5, T = 30°C sem acetato e 2 g/L de acetato. Uma vez que o acetato realizou a utilização do açúcar em um baixo nível de 2 g/L de acetato, outro estudo foi desenhado no qual 2 fermentadores com meio RMGXA (4%:4%:2%) suplementado com 2 g/L de acetato foram inoculados a partir de outro fermentador a uma concentração similar de açúcar, exceto com a menor concentração de acetato de 0,5 g/L e 1 g/L, respectivamente. Os resultados não demonstraram melhoria da utilização do açúcar pela linhagem AX101 na presença de 2 g/L de acetato.
EXEMPLO XVII
O exemplo a seguir ilustra a fermentação contínua de AX101. As fermentações contínuas foram realizadas em fermentadores MultiGen (New Bruswick Scientific, NJ, EUA) com um volume de trabalho de 3 00 mL e agitação a 300 rpm. Os valores de pH estudados foram de 4,5, 5 e 5,5, controlados com KOH (2N) . A temperatura foi mantida a 30°C em todos os estudos. A fermentação em lote foi iniciada como uma OD inicial de 0,1 a 600 nm. Amostras foram periodicamente coletadas durante toda a fermentação e analisadas por HPLC quanto ao teor de açúcares, etanol e subprodutos. Após a total utilização da glicose e quando restava aproximadamente 10 g/L de xilose no fermentador, a fermentação contínua foi iniciada pela alimentação de um meio de cultura com a composição desejada de açúcar a uma baixa taxa de diluição (D) de 0,02 (1/h) . Após 4 a 5 ciclos no estado estável, onde se observou total utilização da glicose e consumo de 80% de xilose, a taxa de diluição aumentou (Figura 35) . Esse processo continuou até o estágio de adaptação que foi indicado por uma maior concentração de xilose remanescente e reduzida concentração de etanol. O rendimento do processo de produção de etanol (Yp) foi calculado com base na concentração final de etanol produzido por massa do açúcar inicial total adicionado ao meio. A linhagem AX101 foi capaz de fermentar uma mistura de açúcar de 80 g/L de glicose, 40 g/L de xilose e 15 g/L de arabinose em meios de líquor de milho suplementados somente até 6 g/L de acetato, observando-se a seguir um período de adaptação.
EXEMPLO XVIII O exemplo a seguir ilustra que os integrantes são capazes de fermentar glicose e xilose em etanol na presença de alta concentração de acetato. O acetato é um composto inibitório normalmente encontrado nos hidrolisados das matérias-primas de biomassa previamente tratadas. A avaliação foi realizada em balões de agitação de 50 mL com controle de fluxo utilizando 35 mL de meio contendo RMGX (2%:2%) suplementado com diferentes concentrações de acetato. O acetato foi adicionado como ácido acético a meios RMGX e o pH foi ajustado em 5,8 com grânulos de KOH. O inóculo foi preparado em balão de 125 mL contendo 100 mL de meios RMGX (2%: 2%) , pH inicial de 5,8 em temperatura desejada de 30°C ou 37°C.
Após o crescimento de um dia para o outro, a OD em 600 nm foi medida e cada balão foi inoculado com OD de 0,1 em 600 nm e incubado em um agitador nas temperaturas desejadas. Amostras foram coletadas em diferentes tempos e analisadas por HPLC quanto ã presença de açúcares, etanol e subprodutos. Conforme mostrado na Figura 36, os integrantes 8b e 2032 podem cultivar e fermentar a xilose em etanol na concentração de acetato de 2g/L a 6g/L em um meio sem controle do pH. A inibição da utilização da xilose pelo acetato nessas concentrações é mínima.
Conforme mostrado na Figura 37, todos os integrantes puderam fermentar a glicose e a M-xilose em etanol mesmo na presença de 16 g/L de acetato e mesmo em um meio sem controle do pH. Os valores finais de pH dos meios de crescimento foram medidos e ficaram entre 3,5 e 4,5. As linhagens anteriormente construídas com base em um hospedeiro 39676, por exemplo, AX101 e C25, demonstraram ser inibidas de forma significativamente relevante por até 2 g/L de ácido acético.
EXEMPLO XIV O exemplo a seguir ilustra que as linhagens 39676 e 31821 de Z. mobilis podem ser transformadas com plasmídeo pZB701 (Figura 38) contendo um gene fosfomanose isomerase de E. coli, ManA, sob o controle do promotor piruvato descarboxilase decarboxylase (PDC) de Zymomonas, Ppdc.
Conforme mostrado na Figura 39, os transformantes para ambas as linhagens foram capazes de utilizar a D-manose como a única fonte de carbono. Para confirmar a expressão de ManA, todas as construções intermediárias e finais (incluindo pZB801) geradas foram utilizadas para transformar um hospedeiro manA(-), E. coli GMS407. Os transformantes foram colocados em placa em ágar McConkey contendo manose como a fonte de carbono. Colônias de cor rosa escuro indicaram utilização de manose pelos clones. O plasmídeo pZB701 extraído da colônia rosa escuro foi utilizado para a futura transformação em Z. mobilis 206C ou 31821. Os transformantes de Z. mobilis foram selecionados em meio de conjugação (MMG) contendo tetraciclina (Tcr) seguido pelo teste em meio contendo manose (RMM). Conforme mostrado na Figura 39, todos os transformantes puderam crescer em RMM inicialmente e, após várias transferências em série em RMM, demonstraram taxas de crescimento aperfeiçoadas.
Para a transformação de Z. mobilis 31821, pZB701 foi preparado a partir de E. coli JM110. Esses transformantes Tcr também foram capazes de crescer em RMM. A análise dos sobrenadantes de culturas desenvolvidas em RMM indicou que o etanol foi produzido por transformantes 39676 e 31821. O plasmídeo pZB701 contendo o gene de utilização da manose pode ser ainda transformado nas linhagens genômicas integradas de fermentação da xilose e arabinose que os requerentes construíram, por exemplo, C25, AX101, AX1, 321(5), 481, 8b, 2032, 2122, baseadas nas linhagens de hospedeiro 39676 e 31821. Foi demonstrado o sucesso da transformação em Z. mobilis 39676 e 31821 com pZB701 (contendo o gene ManA) e da fermentação da manose em etanol pelos transformantes. Os integrantes de Zymomonas acima mencionados também podem ser transformados com o plasmídeo pZB701 para obtenção de linhagens de Z. mobilis capazes de fermentar a xilose, arabinose, manose e glicose em etanol. Espera-se que as linhagens transformadas de Zymomonas sejam capazes de utilizar a xilose, arabinose, manose e glicose na matéria-prima de biomassa e fermentar todos os açúcares em etanol.Embora a presente invenção tenha sido descrita com relação âs configurações ilustradas, será apreciado e compreendido que modificações podem ser realizadas sem sair do real espírito e escopo da invenção.
REIVINDICAÇÕES
Claims (6)
1 . Processo para utilização de Zymomonas mobllls geneticamente modificada para produzir etanol a partir de um açúcar pentose, caracterizado pelo fato de que o referido processo compreende: fornecer uma Zymomonas mobills modificada compreendendo uma sequência que codifica mais que uma enzima de fermentação de açúcar pentose, em que as referidas enzimas de fermentação da pentose compreendem xilose isomerase, xiluloquinase, transquetolase e transaldolase, em que a referida Zymomonas mobilis modificada é ATCC31821-5C Penotaltkt/PgapxylAB ou ATCC31821-5C Pgaptaltkt/PgapxylAB; adicionar a Zymomonas mobilis modificada a uma matéria-prima compreendendo pentose sob condições apropriadas de fermentação; e fermentar o açúcar pentose para prover uma composição compreendendo etanol.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a Zymomonas mobilis modificada é ATCC31821-5C Penotaltkt/PgapxylAB.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a Zymomonas mobilis modificada é ATCC31821-5C Pgaptaltkt/PgapxylAB.
4. Zymomonas modificada, caracterizada pelo fato de que é ATCC31821-5C Penotaltkt/PgapxylAB ou ATCC31821-5C Pgaptaltkt/PgapxylAB.
5. Zymomonas modificada de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que é ATCC31821-5C Penotaltkt/PgapxylAB.
6. Zymomonas modificada de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é ATCC31821-5C Pgaptaltkt/PgapxylAB.
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