BR112021014963A2

BR112021014963A2 - Molécula de ligação específica que se liga a cd3, molécula de ligação bifuncional, composição farmacêutica, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, método de preparação da molécula de ligação específica que se liga a cd3, e método de tratamento

Info

Publication number: BR112021014963A2
Application number: BR112021014963-5A
Authority: BR
Inventors: Martina Canestraro; Nele Dieckmann; Stephen Harper; Peter Benedict Kirk; Rachel Mulvaney; Ronan O'dwyer; Ian Butler Robertson
Original assignee: Immunocore Limited
Priority date: 2019-01-30
Filing date: 2020-01-30
Publication date: 2021-09-28
Also published as: JP2022523507A; EP3917959A1; US20220119527A1; IL284926A; MX2021009275A; GB201901305D0; CN113728005A; KR20210121141A; CA3127144A1; WO2020157210A1; AU2020215776A1

Abstract

molécula de ligação específica que se liga a cd3, molécula de ligação bifuncional, composição farmacêutica, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, método de preparação da molécula de ligação específica que se liga a cd3, e método de tratamento. trata-se de uma molécula de ligação específica que se liga a cd3 e compreende um polipeptídeo que tem um domínio de imunoglobulina vl e um domínio de imunoglobulina vh, nos quais o domínio vl compreende regiões determinantes de complementaridade (cdrs) vlcdr1, vlcdr2 e vlcdr3, e nos quais o domínio vh compreende regiões determinantes de complementaridade (cdrs) vhcdr1, vhcdr2, vhcdr3, cada um tendo uma respectiva sequência de aminoácidos conforme a seguir, nas quais vlcdr1 é vlcdr2 é vlcdr3 é vhcdr1 é vhcdr2 é vhcdr3 é ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica a isso.

Description

MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA QUE SE LIGA A CD3, MOLÉCULA DE LIGAÇÃO BIFUNCIONAL, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO

DE PREPARAÇÃO DA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA QUE SE LIGA A CD3, E MÉTODO DE TRATAMENTO

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a moléculas de ligação específicas que se ligam a CD3, particularmente, anticorpos e fragmentos dos mesmos, com propriedades aprimoradas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O CD3 (agrupamento de diferenciação 3) é um correceptor de células T que ajuda a ativar tanto a célula T citotóxica (células T CD8+) quanto também células ajudantes T (células T CD4+). O CD3 se associa com o receptor de células T (TCR) e a cadeia ζ (cadeia zeta; CD247) para gerar um sinal de ativação em linfócitos T. O TCR, a cadeia ζ e as moléculas CD3, em conjunto, constituem o complexo de TCR.

[003] Anticorpos que se ligam a CD3 são conhecidos e têm utilidade como fármacos imunossupressores. Exemplos incluem muromonabe-CD3 (Janssen-Cilag), otelixizumabe (também conhecido como TRX4), teplizumabe (também conhecido como PRV-031) e visilizumabe.

[004] Anticorpos anti-CD3 também têm utilidade como agentes de recrutamento de célula T em uma classe de produtos terapêuticos à base de proteína amplamente conhecidos, como produtos biespecíficos de acionamento de célula T (Baeuerle et al., Cancer Res. 15 de junho de 2009;69(12):4941-4). Tais produtos terapêuticos combinam um domínio de reconhecimento de célula-alvo com um domínio anti-

CD3. A ativação simultânea de células-alvo (por exemplo, uma célula cancerígena) e células T citotóxicas CD3+ causa a ativação de vias de sinalização de CD3, independentemente de especificidade de receptor de células T, e resulta definitivamente em morte de célula-alvo. O anticorpo biespecífico blinatumomabe (Amgen) é um exemplo de produto terapêutico de ativação de célula T comercializado para o tratamento de leucemia linfoide aguda (LLA). Vários produtos biespecíficos de acionamento de célula T adicionais estão sendo investigados em testes clínicos para o tratamento de vários cânceres e doenças infeciosas (por exemplo, consultar as tabelas fornecidas em Yuraszeck et al., Clin Pharmacol Ther. Maio de 2017;101(5):634-645, e Husain et al., BioDrugs. Out de 2018;32(5):441-464). A maioria dos produtos biespecíficos de acionamento de célula T reconhece antígenos de superfície celular na célula-alvo. Adicionalmente, produtos biespecíficos de acionamento de célula T também são conhecidos por reconhecer peptídeos curtos derivados de antígenos intracelulares e apresentados na superfície celular em complexo com MHC (pMHC) (Liddy et al., Nat Med. Jun de 2012;18(6):980-7).

[005] O anticorpo UCHT1 é um anticorpo anti-CD3 clinicamente relevante, que é conhecido na técnica (Shalaby et al., J Exp Med. Jan de 1992 1;175(1):217 a 25, documento nº US5821337). Um fragmento scFv de um anticorpo UCHT1 humanizado foi fundido a um receptor de células T solúvel para construir um produto biespecífico de ativação de célula T que se liga a pMHC em uma célula-alvo (por exemplo, consultar documento nº WO2011001152).

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[006] Surpreendentemente, os presentes inventores constataram que a introdução de determinadas mutações na sequência de aminoácidos de UCHT1 causa a geração de moléculas biespecíficas de ativação de célula T com propriedades inesperadas, que são particularmente benéficas para uso clínico.

[007] Em um primeiro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação específica que se liga a CD3 e compreende um polipeptídeo que tem um domínio de imunoglobulina VL e um domínio de imunoglobulina VH, nos quais o domínio VL compreende Regiões Determinantes de Complementaridade (CDRs) VLCDR1, VLCDR2 e VLCDR3, e nos quais o domínio VH compreende Regiões Determinantes de Complementaridade (CDRs) VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, cada um tendo uma respectiva sequência de aminoácidos conforme a seguir, nas quais VLCDR1 é VLCDR2 é VLCDR3 é VHCDR1 é VHCDR2 é VHCDR3 é

[008] ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica a isso.

[009] As CDRs são definidas de acordo com o sistema de informações ImMunoGeneTics internacional (IMGT®) (LeFranc et al., Nucleic Acids Res. 2009 Jan;37(edição de banco de dados):D1006-12)

[010] Em particular, as moléculas de ligação específicas da invenção compreendem uma alanina na extremidade C-terminal de VHCDR1, correspondente à posição 38 em numeração IMGT®, (que é posição designada 165 no presente documento, e é exemplificada e mostrada em negrito na sequência de cadeia pesada v1 da Figura 1). Foi constatado que as moléculas que incluem essa mutação têm propriedades aprimoradas, incluindo uma janela de especificidade aprimorada em comparação às moléculas sem essa mutação.

[011] As CDRs podem ser fornecidas em uma sequência de estruturas de domínio variável de anticorpo. A sequência de estruturas pode ser uma sequência de estruturas de camundongo ou uma sequência de estruturas de ser humano ou uma sequência de estruturas humanizadas ou qualquer outra estrutura adequada. A estrutura preferencial é uma sequência de estruturas de ser humano ou humanizadas. As estruturas de ser humano ou humanizadas têm substancialmente a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana. Em determinados casos, as estruturas de camundongo, estruturas de ser humano e estruturas humanizadas podem ser misturadas em qualquer combinação.

[012] Preferencialmente, a imunoglobulina VL compreende uma sequência geral VLFW1-VLCDR1-VLFW2-VLCDR2- VLFW3-VLCDR3-VLFW4, em que VLFW1, VLFW2, VLFW3 e VLFW4 são sequências de estruturas de VL (VLFW) 1 a 4, respectivamente, a imunoglobulina VH compreende uma sequência geral VHFW1- VHCDR1-VHFW2-VHCDR2-VHFW3-VHCDR3-VHFW4, em que VHFW1, VHFW2, VHFW3 e VHFW4 são sequências de estruturas de VH (VHFW) 1 a 4 respectivamente, opcionalmente em que as sequências de VLFW e VHFW são sequências de estrutura de camundongo, ser humano ou humanizada.

[013] Preferencialmente, a imunoglobulina VL compreende uma sequência geral conforme a seguir: VLFW1- VLCDR1-VLFW2-VLCDR2-VLFW3-VLCDR3-VLFW4, em que VLFW1, VLFW2,

VLFW3 e VLFW4 são sequências de estruturas (FW) 1 a 4 respectivamente, VLFW1, VLFW2, VLFW3 e VLFW4 cada um tendo uma respectiva sequência de aminoácidos conforme a seguir, nas quais: VLFW1 é ou VLFW2 é VLFW3 é VLFW4 é

[014] ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica a isso.

[015] Preferencialmente, a imunoglobulina VH compreende uma sequência geral conforme a seguir: VHFW1- VHCDR1-VHFW2-VHCDR2-VHFW3-VHCDR3-VHFW4, em que VHFW1, VHFW2, VHFW3 e VHFW4 são sequências de estruturas (FW) 1 a 4 respectivamente, VHFW1, VHFW2, VLFW3 e VLFW4 cada um tendo uma respectiva sequência de aminoácidos conforme a seguir, nas quais: VHFW1 é VHFW2 é VHFW3 é ou VHFW4 é

[016] ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica a isso.

[017] In particular, as moléculas de ligação específicas da invenção compreendem fenilalanina em VHFW3 na posição correspondente à posição 78 em numeração IMGT®, (que é a posição designada 202 no presente documento, e é exemplificada e mostrada em negrito na sequência de cadeia pesada v2 da Figura 1). Foi constatado que moléculas que incluem essa mutação adicionalmente à alanina na posição 38 têm eficiência aumentada de ativação de célula T em comparação a moléculas sem essas mutações.

[018] Preferencialmente, a imunoglobina VL compreende a sequência: ; ou

[019] ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica a isso.

[020] Preferencialmente, a imunoglobina VH compreende a sequência: ; ou

[021] ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica a isso.

[022] Preferencialmente, a molécula de ligação específica está na forma de um fragmento scFv.

[023] Preferencialmente, os domínios de imunoglobina VL e VH são conectados por meio de ligante. O ligante pode ser qualquer sequência de aminoácidos, preferencialmente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 aminoácidos de comprimento. Um ligante preferencial inclui uma sequência com a fórmula (GGGGS)n, opcionalmente adicionalmente a outros aminoácidos. Consequentemente, é fornecida uma molécula de ligação específica de cadeia única que tem a sequência: ; ou

[024] ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica a isso.

[025] A molécula de ligação específica também pode ser parte de uma proteína de fusão que compreende domínios adicionais. Proteínas de fusão podem ser construídas por meio de fusão de N-terminal e C-terminal tanto aos domínios de imunoglobulina VL como aos domínios de imunoglobulina VH. Domínios adicionais podem ser fundidos por meio de ligantes. As sequências ligantes geralmente são flexíveis, pois são compostas principalmente de aminoácidos, tais como glicina, alanina e serina, que não têm cadeias laterais volumosas que provavelmente restringem a flexibilidade. Alternativamente, ligantes com maior rigidez podem ser desejáveis. Comprimentos utilizáveis ou ótimos de sequências de ligação podem ser determinados facilmente. Frequentemente, a sequência ligante terá menos do que cerca de 12, tal como menos do que 10 ou de 2-10 aminoácidos de comprimento. O ligante pode ser qualquer sequência de aminoácidos, preferencialmente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 aminoácidos de comprimento.

Exemplos de ligantes adequados incluem, porém, sem limitação: , e (conforme descrito no documento nº WO2010/133828). Um ligante preferencial inclui uma sequência com a fórmula (GGGGS)n, opcionalmente adicionalmente a outros aminoácidos.

[026] Preferencialmente, a molécula de ligação específica mostra uma ou mais propriedades terapêuticas aprimoradas relativas à molécula não mutada quando usada como parte de uma molécula biespecífica, preferencialmente um produto biespecífico de ativação de célula T conforme descrito no presente documento. Preferencialmente, as propriedades terapêuticas aprimoradas são selecionadas dentre uma janela terapêutica aprimorada e/ ou um aumento na ativação de célula T máxima em uma dada concentração. Uma janela terapêutica aprimorada pode possibilitar maior dosagem enquanto minimiza a toxidade resultante da ativação sem alvo. Um aumento na ativação de célula T máxima em uma dada concentração de molécula biespecífica pode possibilitar mais eliminação eficiente de células-alvo em uma dada dose de fármaco. Métodos para determinar a ativação de célula T são conhecidos na técnica e incluem liberação de citocinas de ativação imunes e morte celular mediada por célula T. A janela terapêutica para um produto biespecífico de ativação de célula T pode ser determinada medindo-se a ativação de célula T na presença de células positivas de antígeno e células negativas de antígeno e calculando-se a diferença entre as duas medições. Detalhes adicionais de métodos preferenciais são descritos no Exemplo

2.

[027] Preferencialmente, o anticorpo anti-CD3 da invenção se liga à subunidade épsilon CD3 de CD3

[028] Moléculas de ligação específicas de acordo com a invenção podem ser usadas em um método de tratamento ou diagnóstico do corpo humano ou animal, tais como um método de tratamento de uma condição em um paciente (preferencialmente humano) que compreende administrar ao dito paciente uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação específica da invenção. A invenção também fornece uma molécula de ligação específica da presente invenção para uso na medicina, assim como o uso de uma molécula de ligação específica da presente invenção na fabricação de um medicamento para o diagnóstico ou tratamento de um tumor.

[029] Esses e outros aspectos da invenção são descritos em mais detalhes abaixo.

[030] Conforme usado no presente documento, “tratamento” inclui qualquer regime que pode beneficiar um animal humano ou não humano, preferencialmente mamífero. O tratamento pode ser em relação de uma condição existente ou pode ser profiláctica (tratamento preventivo).

[031] O termo “anticorpo” conforme usado no presente documento se refere a moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação de antígeno que se liga especificamente a um antígeno, seja natural ou parcialmente ou totalmente produzido sinteticamente. O termo também cobre qualquer polipeptídeo ou proteína que tem um domínio de ligação que é, ou é homóloga a um domínio de ligação de anticorpo. Os mesmos podem ser derivados de fontes naturais, ou os mesmos podem ser parcialmente ou totalmente produzidos sinteticamente. Exemplos de anticorpos são os isótipos de imunoglobulina (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) e suas subclasses isotípicas; fragmentos que compreendem um domínio de ligação de antígeno tal como Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; e diacorpos. Anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais. Um anticorpo monoclonal pode ser denominado no presente documento como “mab”.

[032] É possível tomar anticorpos monoclonais e outros anticorpos e usar técnicas de tecnologia de DNA recombinante para produzir outros anticorpos ou moléculas quiméricas que retêm a especificidade do anticorpo original. Tais técnicas podem envolver introduzir DNA que codifica a região variável de imunoglobulina, ou as regiões de determinação complementares (CDRs), de um anticorpo às regiões constantes, ou regiões constantes mais regiões de estrutura, de uma imunoglobulina diferente. Consultar, por exemplo, os documentos nº EP-A-184187, nº GB 2188638A ou nº EP-A-239400. Um hibridoma ou outra célula que produz um anticorpo pode ser sujeita a mutação genética ou outras mudanças, que podem ou não alterar a especificidade de ligação de anticorpos produzidos.

[033] Os anticorpos podem ser modificados de várias maneiras, o termo “anticorpo” deve ser interpretado como cobrindo qualquer molécula de ligação específica ou substância que têm um domínio de ligação com a especificidade necessária. Desse modo, esse termo cobre fragmentos de anticorpo, derivados, equivalentes funcionais e homólogos de anticorpos, anticorpos humanizados, incluindo qualquer polipeptídeo que compreende um domínio de ligação de imunoglobulina, seja natural ou total ou parcialmente sintético. Moléculas quiméricas que compreendem um domínio de ligação de imunoglobulina, ou equivalente, fundido a outro polipeptídeo são, portanto, incluídos. Clonagem e expressão de anticorpos quiméricos são descritos em EP-A-0120694 e EP-A-

0125023. Um anticorpo humanizado pode ser um anticorpo modificado que tem as regiões variáveis de um não humano, por exemplo, murina, anticorpo e a região constante de um anticorpo de humano. Métodos para produzir anticorpos humanizados são descritos, por exemplo, no documento de patente nº 5225539

[034] Foi mostrado que fragmentos de um anticorpo total pode realizar a função de antígenos de ligação. Exemplos de fragmentos de ligação são (i) o fragmento Fab que consiste em domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) o fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1 (iii) o fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um anticorpo único; (iv) o fragmento dAb (Ward, E.S. et al., Nature 341:544-546 (1989)) que consiste em um domínio VH; (v) regiões CDR isoladas; (vi) fragmentos F(ab’)2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados (vii) moléculas de cadeia Fv única (scFv), em que um domínio VH e um domínio VL são ligados por um ligante de peptídeo que permite que os dois domínios se associem para formar um sítio de ligação de antígeno (Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., PNAS USA 85:5879-5883 (1988)); (viii) dímeros de Fv de cadeia única biespecífica (PCT/US92/09965) e (ix) “diacorpos”, multivalentes ou fragmentos multiespecíficos construídos por fusão de gene (WO94/13804; P. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)).

[035] diacorpos são multímeros de polipeptídeos, sendo que cada polipeptídeo compreende um primeiro domínio que compreende uma região de ligação de uma cadeia leve de imunoglobulina e um segundo domínio que compreende uma região de ligação de uma cadeia pesada de imunoglobulina, os dois domínios sendo ligados (por exemplo, por um ligante de peptídeo), mas sem capacidade de se associar um ao outro para formar um sítio de ligação de antígeno: sítios de ligação de antígeno são formados pela associação do primeiro domínio de um polipeptídeo dentro do multímero com o segundo domínio de outro polipeptídeo dentro do multímero (WO94/13804).

[036] Onde anticorpos biespecíficos tiverem de ser usados, esses podem ser anticorpos convencionais biespecíficos, que podem ser fabricados em uma variedade de maneiras (Hollinger & Winter, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449 (1993)), por exemplo, preparados quimicamente ou a partir de hibridomas híbridos, ou pode ser qualquer um dos fragmentos de anticorpo biespecífico mencionados acima. Pode ser preferencial usar dímeros de scFv ou diacorpos em vez de anticorpos totais. diacorpos e scFv podem ser construídos sem uma região de Fc, com uso de somente domínios variáveis, reduzindo potencialmente os efeitos de reação anti-idiotípica. Outras formas de anticorpos biespecíficos incluem a “Janusinas” de cadeia única descritas em Traunecker et al., EMBO Journal 10:3655-3659 (1991).

[037] diacorpos biespecíficos, em oposição a anticorpos totais biespecíficos, também podem ser úteis devido ao fato de que os mesmos podem ser prontamente construídos e expressos em E. coli. diacorpos (e muitos outros polipeptídeos, tal como fragmentos de anticorpo) de especificidades de ligação apropriadas podem ser prontamente selecionadas com uso de exibição de fago (WO94/13804) de bibliotecas. Se um braço do diacorpo tiver de ser mantido constante, por exemplo, com uma especificidade direcionada contra antígeno X, então uma biblioteca pode ser criada em que o outro braço é variado e um anticorpo de especificidade apropriada selecionado.

[038] Um “domínio de ligação de antígeno” é a parte de um anticorpo que compreende a área que se liga especificamente a e é complementar a parte ou todo um antígeno. Onde um antígeno for grande, um anticorpo pode somente se ligar a uma parte particular do antígeno, cuja parte é denominada como um epítopo. Um domínio de ligação de antígeno pode ser fornecido por um ou mais domínios variáveis de anticorpo. Um domínio de ligação de antígeno pode compreender uma região variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e uma região variável de cadeia pesada de anticorpo (VH).

[039] “Específico” é geralmente usado para se referir à situação na qual um membro de um par de ligação específico não mostrará qualquer ligação significativa a moléculas diferente de seu(s) parceiro (ou parceiros) de ligação específico, e, por exemplo, tem menos do que cerca de 30%, preferencialmente 20%, 10%, ou 1% de reatividade cruzada com qualquer outra molécula. O termo é também aplicável em que, por exemplo, um domínio de ligação de antígeno é específico para um particular epítopo que é transportado por vários antígenos, em cujo caso, a molécula de ligação específica que transporta o domínio de ligação de antígeno poderá se ligar aos vários antígenos que transportam o epítopo.

[040] “Isolado(a)(s)” se refere ao estado no qual as moléculas de ligação específicas da invenção ou ácido nucleico que codifica tais moléculas de ligação estarão preferencialmente, de acordo com a presente invenção. Moléculas e ácido nucleico serão geralmente livres ou substancialmente livres de material com que os mesmos são naturalmente associados tais como outros polipeptídeos ou ácidos nucleicos com que os mesmos são encontrados em seu ambiente natural, ou o ambiente no qual os mesmos são preparados (por exemplo, cultura celular) quando tal preparação se dá por tecnologia de DNA recombinante praticada in vitro ou in vivo. Moléculas de ligação específicas e ácido nucleico podem ser formuladas com diluentes ou adjuvantes e ainda para propósitos práticos, ser isolados, por exemplo, as moléculas serão normalmente misturadas com gelatina ou outros carreadores se usados para revestir placas de microtitulação para uso em imunoensaios, ou serão misturados com carreadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis quando usados em diagnóstico ou terapia. Moléculas de ligação específicas podem ser glicosiladas, tanto naturalmente ou por sistemas de células encariotóticas heterólogas, ou os mesmos podem ser (por exemplo, se produzidos por expressão em uma célula procariótica) não glicosiladas.

[041] Por “substancialmente conforme apresentado” é dito que as regiões CDR da invenção serão tanto idênticas como altamente homólogas às regiões especificadas das Figuras 1a e 1cb. Por “altamente homólogo(a)(s)” é contemplado que, de 1 a 5, de 1 a 4, de 1 a 3, 2 ou 1 substituições podem ser realizadas nas CDRs.

[042] A invenção também inclui dentro de seu escopo polipeptídeos que têm a sequência de aminoácidos conforme apresentado nas Figuras 1 e 2 e sequências que têm identidade substancial às mesmas, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 99% de identidade à mesma.

[043] Os domínios variáveis podem ser derivados de qualquer linha genética ou domínio variável humano redisposto, ou pode ser um domínio variável sintético com base em sequências de consenso de domínios variáveis humanos conhecidas. As sequências da invenção podem ser introduzidas em um repertório de domínios variáveis que carecem de regiões CDR3, com uso de tecnologia de DNA recombinante, tal como o embaralhamento ou técnicas combinatoriais reveladas por Stemmer (Nature 370:389-391 (1994)) que descreve a técnica em relação a um gene de beta-lactamase, mas observa que a abordagem pode ser usada para a geração de anticorpos.

[044] Uma alternativa adicional é gerar regiões VH ou VL inovadoras que portam as sequências da invenção com uso de mutagênese aleatória, por exemplo, dos genes de VH ou VL SC104 para gerar mutações dentro do domínio variável inteiro. Tal técnica é descrita por Gram et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580 (1992)), que usou PCR propenso a erros.

[045] Outro método que pode ser usado é direcionar mutagênese a regiões CDR de genes de VH ou VL. Tais técnicas são reveladas por Barbas et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)) e Schier et al (J. Mol. Biol. 263:551-567 (1996)).

[046] Uma porção substancial de um domínio variável de imunoglobulina geralmente compreenderá pelo menos as três regiões CDR, em conjunto com suas regiões de estrutura de intervenção. A porção também pode incluir pelo menos cerca de 50% qualquer um ou tanto a primeira quanto a segunda regiões de estrutura, sendo 50% o C-terminal 50% da primeira região de estrutura e o N-terminal 50% da quarta região de estrutura.

Resíduos adicionais na extremidade de N-terminal ou C-terminal da parte substancial do domínio variável pode ser aquelas não normalmente associada com regiões de domínio variável naturalmente ocorrentes. Por exemplo, a construção de moléculas de ligação específicas da presente invenção realizada por técnicas de DNA recombinantes pode resultar na introdução de resíduos de N ou C-terminal codificados por ligantes introduzidos para facilitar a clonagem ou outras etapas de manipulação, incluindo a introdução de ligantes para unir domínios variáveis da invenção a sequências de proteínas adicionais incluindo cadeias pesadas de imunoglobulina, outros domínios variáveis (por exemplo, na produção de diacorpos) ou identificações de proteína conforme discutido em mais detalhes abaixo.

[047] Preferencialmente, a molécula de ligação específica compreende um par de domínios de ligação com base nas sequências de aminoácidos para as regiões de VL e VH substancialmente conforme apresentado na Figura 1. Domínios de ligação únicos baseados tanto nessas sequências formam aspectos adicionais da invenção. No caso dos domínios de ligação com base na sequência de aminoácidos para a região de VH substancialmente apresentada na Figura 1, tais domínios de ligação podem ser usados como agentes de alvejamento visto que sabe-se que o domínio VH de immunoglobulinas têm capacidade de ligar antígenos alvo de maneira específica.

[048] Moléculas de ligação específicas da presente invenção podem compreender adicionalmente regiões constantes de anticorpo ou partes dos mesmos. Por exemplo, moléculas de ligação específicas com base na região de VL mostradas na Figura 1 podem ser fixadas em sua extremidade de

C-terminal aos domínios constantes de cadeia leve de anticorpo incluindo cadeias de Cκ ou Cλ humano. De modo similar, moléculas de ligação específicas baseadas em região de VH mostrada na Figura 1 podem ser fixadas em sua extremidade de C-terminal a toda ou parte de uma cadeia pesada de imunoglobulina derivada de qualquer isotipo de anticorpo, por exemplo, IgG, IgA, IgE e IgM e qualquer uma das subclasses de isotipo, particularmente, IgG1 e IgG4.

[049] Moléculas de ligação específicas da invenção podem ser adicionalmente identificadas com uma identificação natural. Tais identificações funcionais incluem toxinas tais como ricina e enzimas tais como carboxipeptidase ou nitroreductase bacteriana, que têm capacidade de converter pró-fármacos em fármacos ativos. Adicionalmente, as moléculas de ligação específicas podem ser fixadas ou de outro modo associadas a agentes quimioterapêutico ou citotóxicos, tais como caliquiamicina, ou radio-identificações, tais como 90Y ou 131I.

[050] Além disso, moléculas de ligação específicas da invenção podem ser associadas com agente terapêutico adicional ou porção química de alvejamento. Agentes terapêuticos que podem ser associados com as moléculas de ligação específicas incluem imunomoduladores e efetores, compostos radioativos, enzimas (perforina, por exemplo) ou agentes quimioterapêuticos (cis-platina, por exemplo). Para garantir que efeitos tóxicos sejam exercidos na localização desejada, a toxina poderia estar dentro de um lipossoma ligado às moléculas de ligação específicas de modo que o composto seja liberado lentamente. Isso evitará efeitos nocivos durante o transporte no corpo e garantir que a toxina tenha efeito máximo após a ligação das moléculas de ligação específicas ao antígeno relevante que apresenta células.

[051] Exemplos de agentes terapêuticos adequados incluem, porém, sem limitação: • agentes citotóxicos de molécula pequena, isto é, compostos com a capacidade de eliminar células de mamíferos que têm um peso molecular de menos do que 700 Daltons. Tais compostos também poderia conter metais tóxicos com capacidade de ter um efeito citotóxico. Além disso, deve-se entender que esses agentes citotóxicos de molécula pequena também incluem pró-fármacos, isto é, compostos que decaem ou são convertidos sob condições fisiológicas para liberar agentes citotóxicos. Exemplos de tais agentes incluem cis-platina, derivados de maitansina, rachelmicina, caliquiamicina, docetaxel, etoposida, gemcitabina, ifosfamida, irinotecano, melfalano, mitoxantrona, sodiumfotofrina de sorfímero II, temozolomida, topotecano, arbourato de trimetreato, vincristina de auristatina E e doxorubicina; • citotoxinas de peptídeo, isto é, proteínas ou fragmentos dos mesmos com a capacidade de eliminar células de mamíferos. Por exemplo, ricina, toxina de difiteria, exotoxina bacteriana de pseudômonas A, Dnase e Rnase; • rádio-nucleotídeos, isto é, isótopos instáveis de elementos que decaem com a emissão concorrente de um ou mais de partículas α ou β, ou raios γ. Por exemplo, iodina 131, rênio 186, índio 111, itrio 90, bismute 210 e 213, actínio 225 e astatina 213; agentes quelantes podem ser usados para facilitar a associação desses rádio-nucleotídeos aos TCRs de alta afinidade, ou multímeros dos mesmos;

• Imunoestimulantes, isto é, moléculas imunoefetoras que estimulam resposta imune. Por exemplo, citotoxinas, tais como IL-2 e IFN-γ, • superantígenos e mutantes dos mesmos; • Fusões de TCR-HLA, por exemplo, fusão a um complexo de peptídeo-HLA, em que o dito peptídeo é derivado de um patógeno de humano comum, tal como Vírus Epstein Barr (EBV); • quimiocinas, tais como IL-8, fator de plaqueta 4, proteína estimulatória de crescimento de melanoma, etc; • anticorpos ou fragmentos dos mesmos, incluindo célula anti-T ou anticorpos determinantes de célula NK (por exemplo, anti-CD3, anti-CD28 ou anti-CD16); • cadeias principais de proteína alternativas com anticorpo como características de ligação • ativadores de complemento; • domínios de proteína xenogênica, domínios de proteína alogênica, domínios de proteína viral/bacteriana, peptídeos virais/bacterianos.

[052] Porções químicas de alvejamento que podem ser associadas com as moléculas de ligação específicas incluem • TCRs (incluindo TCRs alfa/beta e gama/delta) • anticorpos ou fragmentos dos mesmos, que reconhecem e se ligam a antígenos apresentados em células-alvo, incluindo antígenos de superfície celular e peptídeos derivados de antígenos intracelulares que são apresentados na superfície celular em complexo com MHC/HLA; • estruturas de suporte de proteína alternativas com anticorpo como características de ligação.

[053] Além disso, as moléculas de ligação específicas da presente invenção podem ser administradas por si só ou em combinação com outros tratamentos, tanto simultânea como sequencialmente, dependendo da afecção a ser tratada. Desse modo, a presente invenção fornece adicionalmente produtos que contêm uma molécula de ligação específica da presente invenção e um agente ativo como uma preparação combinada para uso simultâneo, separado ou sequencial no tratamento de um tumor. Agentes ativos podem incluir agentes quimioterapêutico ou citotóxicos que incluem, 5-Fluorouracil, cisplatina, Mitomicina C, oxaliplatina e tamoxifeno, que pode operar de modo sinérgico com as moléculas de ligação da presente invenção. Outros agentes ativos podem incluir doses adequadas de fármacos de alívio de dor, tais como fármacos não esteroidais anti-inflamatórios (por exemplo, aspirina, paracetamol, ibuprofeno ou cetoprofeno) ou opitatos, tais como morfina, ou antiemética.

[054] Moléculas de ligação específicas da presente invenção serão geralmente administradas na forma de uma composição farmacêutica, que pode compreender pelo menos um componente adicionalmente à molécula de ligação específica. A composição farmacêutica pode compreender, adicionalmente um ingrediente ativo, um excipiente farmaceuticamente aceitável, diluente, carreador, tampão, estabilizador ou outros materiais conhecidos aos elementos versados na técnica. Tais materiais devem ser não tóxicos e não devem interferir com a eficácia do ingrediente ativo. Tal natureza precisa do carreador ou outro material dependerá da rota de administração, que pode ser oral, ou por injeção, por exemplo, intravenosa.

[055] É previsto que injeções serão a rota primária para administração terapêutica das composições embora a entrega através de um cateter ou outra tubagem cirúrgica seja também usada. Algumas rotas adequadas de administração incluem administração intravenosa, subcutânea e intramuscular. Formulações líquidas podem ser utilizadas após a reconstituição das formulações em pó.

[056] Para injeção intravenosa, ou injeção no sítio de inflição, o ingrediente ativo estará na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável que é livre de pirogênio e tem pH, isotonicidade e estabilidades adequados. Os elementos de técnica relevante na técnica têm capacidade de preparar soluções adequadas com uso de, por exemplo, veículos isotônicos tais como Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Ringer lactada. Conservantes, estabilizadores, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos podem ser incluídos, conforme necessário.

[057] Composições farmacêuticas para administração oral podem estar em forma de tablete, cápsula, pó ou líquida. Um tablete pode compreender um carreador sólido tal como gelatina ou um adjuvante. Composições farmacêuticas líquidas geralmente compreendem um carreador líquido, tal como água, petróleo, animal ou óleos vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. Solução salina fisiológica, dextrose ou outra solução de sacarídeo ou glicóis, tais como etileno glicol, propileno glicol ou polietileno glicol podem ser incluídos. Onde a formulação for um líquido, o mesmo pode ser, por exemplo, uma solução de sal fisiológico que contêm tampão sem fosfato em pH 6,8-7,6, ou um pó liofilizado.

[058] A composição também pode ser administrada por meio de microesferas, lipossomas, outros sistemas de entrega de microparticulado ou formulações de liberação prolongada colocados em determinados tecidos que incluem sangue. Exemplos adequados de carreadores de liberação prolongada incluem matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de artigos compartilhados, por exemplo, supositórios ou microcápsulas. Matrizes de liberação prolongada implantáveis ou microcapsulares incluem polilactídeos (documento de patente nº 3, 773, 919; EP-A-0058481) copolímeros de ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamati (Sidman et al, Biopolymers 22(1): 547- 556, 1985), poli (2-hidroxietil-metacrilato) ou acetado de vinila de etileno (Langer et al, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277, 1981, e Langer, Chem. Tech. 12:98-105, 1982). Lipossomas que contêm os polipeptídeos são preparados por métodos conhecidos: DE 3,218, 121A; Epstein et al, PNAS USA, 82: 3688-3692, 1985; Hwang et al, PNAS USA, 77: 4030-4034, 1980; EP-A-0052522; E-A-0036676; EP-A-0088046; EP-A-0143949; EP-A-0142541; JP-A-83-11808; documentos de patente nº

4.485.045 e nº4.544.545. De modo comum, os lipossomas são de pequeno (cerca de 200-800 Angstroms) tipo unilamelar no qual o teor de lipídio é maior do que cerca de 30 mol. % colesterol, a proporção selecionada é ajustada para a taxa ideal do vazamento de polipeptídeo.

[059] A composição pode ser administrada de maneira localizada a um sítio desejado ou pode ser entregue em uma maneira na qual o mesmo alveja as células relevantes.

[060] As composições são preferencialmente administradas a um indivíduo em uma quantidade terapeuticamente eficaz”, sendo essa suficiente para mostrar benefício ao indivíduo. A quantidade real administrada, e taxa e curso de tempo de administração, dependerá da natureza e severidade do que está sendo tratado. A prescrição de tratamento, por exemplo, decisões sobre dosagem etc, está dentro da responsabilidade de profissionais gerais e outros médicos, e tipicamente leva em consideração o distúrbio a ser tratado, a afecção do paciente individual, o sítio de entrega, o método de administração e outros fatores conhecidos pelos profissionais.

[061] A dose ideal pode ser determinada por médicos com base em vários parâmetros incluindo, por exemplo, idade, sexo, peso, severidade da afecção a ser tratada, o ingrediente ativo a ser administrado e a rota de administração. Em geral, uma concentração de soro de polipeptídeos e anticorpos que permite a saturação de receptores é desejável. Uma concentração em excesso de aproximadamente 0,1nM é normalmente suficiente. Por exemplo, uma dose de 100mg/m2 de anticorpo fornece uma concentração de soro de aproximadamente 20nM por aproximadamente oito dias.

[062] Como uma diretriz aproximada, doses de anticorpos podem ser dadas semanalmente em quantidades de 10- 300mg/m2. Doses equivalentes de fragmentos de anticorpo devem ser usadas em intervalos mais frequentes de modo a manter um nível de soro em excesso da concentração que permite saturação da carbohidrateceramida de sialiltetraosila.

[063] A dose da composição será dependente das propriedades da molécula de ligação, por exemplo, sua atividade de ligação e meia-vida de plasma in vivo, a concentração do polipeptídeo na formulação, a rota de administração, o sítio e taxa de dosagem, a tolerância clínica do paciente envolvida, a afecção patológica que aflige o paciente e similares, conforme está dentro da habilidade do médico. Por exemplo,

doses de 300 µg de anticorpo por paciente por administração são preferenciais, embora dosagens possam variar de cerca de 10µg a 6 mg por dose. Diferentes dosagens são utilizadas durante uma série de inoculações sequenciais; o profissional pode administrar uma inoculação inicial e então intensificar com doses relativamente menores de anticorpo.

[064] As moléculas de ligação da presente invenção podem ser geradas total ou parcialmente por síntese química. As moléculas de ligação podem ser prontamente preparadas de acordo com métodos estabelecidos, líquido padrão ou, preferencialmente, métodos de síntese de peptídeo de fase sólida, cujas descrições gerais são amplamente disponíveis (consultar, por exemplo, in J.M. Stewart e J.D. Young, Solid Pteme Peptide Synthesis, 2a edição, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984), in M. Bodanzsky e A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Nova Iorque (1984); e Applied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc., Foster City, Califórnia), ou os mesmos podem ser preparados em solução, pelo método de fase líquida ou por qualquer combinação de fase sólida, fase líquida e química de solução, por exemplo, completando-se primeiro a respectiva porção de peptídeo e então, se for desejado e apropriado, após a remoção de quaisquer grupos de proteção que estão presentes, pela introdução do resíduo X pela reação do respectivo ácido carbônico ou sulfônico ou um derivado reativo do mesmo.

[065] Outro modo conveniente de produzir uma molécula de ligação de acordo com a presente invenção é expressar o ácido nucleico que codifica o mesmo, pelo uso de ácido nucleico em um sistema de expressão.

[066] A presente invenção fornece adicionalmente um ácido nucleico isolado que codifica uma molécula de ligação específica da presente invenção. Ácido nucleico inclui DNA e RNA. Em um aspecto preferencial, a presente invenção fornece um ácido nucleico que codifica uma molécula de ligação específica da invenção conforme definido acima. O elemento versado terá capacidade de determinar substituições, deleções e/ou adições a tais ácidos nucleicos que ainda fornecerá uma molécula de ligação específica da presente invenção.

[067] A presente invenção também fornece construtos na forma de plasmídeos, vetores, transcrição ou cassetes de expressão que compreendem pelo menos um ácido nucleico conforme descrito acima. A presente invenção também fornece uma célula hospedeira recombinante que compreende um ou mais construtos conforme acima. Conforme mencionado, um ácido nucleico que codifica uma molécula de ligação específica da invenção forma um aspecto da presente invenção, como um método de produção da molécula de ligação específica que método compreende expressão de codificação de ácido nucleico para o mesmo. A expressão pode ser convenientemente obtida por cultivo sob células hospedeiras recombinantes de condições apropriadas que contêm o ácido nucleico. Seguindo a produção por expressão, uma molécula de ligação específica pode ser isolada e/ou purificada com uso de qualquer técnica adequada, então usada conforme apropriado.

[068] Sistemas para clonar e expressão de um polipeptídeo em uma variedade de diferentes células hospedeiras são conhecidos. Células hospedeiras adequadas incluem bactérias, células de mamíferos, levedura e sistemas de baculovírus. Linhagens celulares de mamíferos disponíveis na técnica para expressão de um polipeptídeo heterólogo incluem células de ovário de hamster Chinês, células de HeLa, células de rins de hamster filhote, células de melanoma de camundongo de NSO e muitos outros. Um hospedeiro bacteriano preferencial comum é E. coli. A expressão de anticorpos e fragmentos de anticorpo em células procarióticas, tais como E. coli é estabelecida na técnica. Para uma revisão, consultar, por exemplo Plückthun, Bio/Technology 9:545-551 (1991). A expressão em células eucarióticas na cultura é também disponível aos elementos versados na técnica como uma opção para produção de uma molécula de ligação específica, consultar por revisão recente, por exemplo Reff, Curr. Opinion Biotech. 4:573-576 (1993); Trill et al., Curr. Opinion Biotech. 6:553- 560 (1995).

[069] Vetores adequados podem ser escolhidos ou construídos, contendo sequências regulatórias apropriadas, incluindo sequências promotoras, sequências terminadoras, sequências de poliadenilação, sequências intensificadoras, genes de marcador e outras sequências conforme apropriado. Vetores pode ser plasmídeos, virais, por exemplo, ‘fago, ou fagomídeo, conforme apropriado. Para detalhes adicionais, consultar, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Muitas técnicas e protocolos conhecidos para a manipulação de ácido nucleico, por exemplo, em preparação de construtos de ácido nucleico, mutagênese, sequenciamento, introdução de DNA em células e expressão de gene, e análise de proteínas, são descritos em detalhes em Ausubel et al. eds., Short Protocols in Molecular Biology, 2a Edição, John Wiley & Sons (1992).

[070] Desse modo, um aspecto adicional da presente invenção fornece uma célula hospedeira que contém ácido nucleico conforme revelado no presente documento. Ainda outro aspecto adicional fornece um método que compreende introduzir tal ácido nucleico em uma célula hospedeira. A introdução pode empregar qualquer técnica disponível. Para células eucarióticas, técnicas adequadas podem incluir transfecção de fosfato de cálcio, DEAE-Dextran, eletroporação, transfecção mediada por lipossoma e transdução com uso de retrovírus ou outros vírus, por exemplo, vaccinia ou, para células de inseto, baculovírus. Para células bacterianas, técnicas adequadas podem incluir transformação de cloreto de cálcio, eletroporação e transfecção com uso de bacteriofago. A introdução pode ser seguida causando-se ou permitindo-se expressão do ácido nucleico, por exemplo, cultivando-se células hospedeiras sob condições para expressão do gene.

[071] O ácido nucleico da invenção pode ser integrado no genoma (por exemplo, cromossomo) da célula hospedeira. A integração pode ser promovida pela inclusão de sequências que promovem a recombinação com o genoma, de acordo com técnicas padrão.

[072] A presente invenção também fornece um método que compreende com uso de um construto conforme afirmado acima em um sistema de expressão de modo a expressar uma molécula de ligação específica ou polipeptídeo conforme acima.

[073] Em um aspecto adicional, é fornecida uma molécula de ligação bifuncional que compreende:

[074] i) receptor de células T (TCR) ou anticorpo; e

[075] ii) uma molécula de ligação específica que se liga a CD3 de acordo com o primeiro aspecto.

[076] Será entendido que qualquer e todas as características descritas acima em relação ao primeiro aspecto são igualmente aplicáveis a esse aspecto adicional.

[077] A porção química de alvejamento pode ser um receptor de células T (TCR), um anticorpo ou um fragmento de anticorpo.

[078] A disposição de anti-CD3 e porção química de alvejamento pode ser estar em qualquer formato conhecido (tal como descrito em Brinkman et al., MAbs. 2017 Fev-Mar; 9(2): 182–212, Figura 2).

[079] O receptor de células T (TCR) pode ser um par de polipeptídeos de TCR alfa/beta ou gama/delta heterodinâmicos. O receptor de células T (TCR) pode ser um polipeptídeo de TCR de cadeia única.

[080] A molécula de ligação específica que se liga a CD3 pode ser fundida ao C ou N-terminal da cadeia alfa ou beta do receptor de células T (TCR). Preferencialmente, o efetor de CD3 é fundido ao N-terminal da cadeia beta do TCR. A molécula de ligação bifuncional pode estar na forma de um diacorpo, no qual o TCR-Va é fixado ao antiCD3-VL e o TCR-Vb é fixado ao antiCD3 –VH e vice-versa.

[081] Em alguns casos, a molécula de ligação específica que se liga a CD3 pode ser fundida ao C ou N- terminal da porção química de alvejamento. Em outros casos, a molécula de ligação específica que se liga a CD3 é fundida ao C ou N-terminal da porção química de alvejamento por meio de um ligante

[082] A molécula de ligação específica que se liga a CD3 pode ser fundida ao receptor de células T (TCR) ou um anticorpo similar a TCR por meio de um ligante, que pode ser um polipeptídeo ligante. As sequências ligantes de polipeptídeo geralmente são flexíveis, pois são compostas por aminoácidos, tais como glicina, alanina e serina que não têm cadeias laterais volumosas que provavelmente restringem a flexibilidade. Comprimentos utilizáveis ou ótimos de sequências de ligação são facilmente determinados. Frequentemente, a sequência ligante será menor que cerca de 12, tal como menor que 10, ou de 5 a 10 aminoácidos de comprimento. O ligante pode ter comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 aminoácidos. Um ligante preferencial inclui uma sequência com a fórmula ( )n, de maneira opcionalmente adicional a outros aminoácidos.

[083] O TCR pode compreender uma ligação de bissulfeto não nativo entre a região constante da cadeia alfa e a região constante da cadeia beta.

[084] A TCR pode se ligar a MHC em complexo com um antígeno de peptídeo. Preferencialmente, o antígeno de peptídeo é qualquer antígeno associado a doença. Preferencialmente, o antígeno de peptídeo é qualquer antígeno associado a tumor. Preferencialmente, o antígeno de peptídeo é um peptídeo derivado de GP100, NYESO, MAGEA4, ou PRAME conforme descrito nos documentos nº WO2011001152, nº WO2017109496, nº WO2017175006 e nº WO2018234319.

[085] Uma TCR adequada pode ter uma sequência de aminoácidos conforme definido nos documentos nº WO2011001152, nº WO2017109496, nº WO2017175006 e nº WO2018234319.

[086] A TCR pode ter uma sequência de aminoácidos conforme a seguir:

[087] ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica a isso.

[088] A molécula de ligação bifuncional pode ter uma sequência de aminoácidos conforme a seguir:

[089] ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica a isso.

[090] Ou, a molécula de ligação bifuncional pode ter uma sequência de aminoácidos conforme a seguir:

[091] ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica a isso.

[092] Variantes fenotipicamente silenciosas de moléculas de ligação específicas ou moléculas de ligação bifuncionais são também reveladas no presente documento. Conforme usado no presente documento, entende-se que o termo

“variantes fenotipicamente silenciosas” para se referir a uma molécula de ligação específica ou molécula de ligação bifuncional domínio variável que incorpora uma ou mais mudanças de aminoácidos adicionais, incluindo substituições, inserções e deleções, que molécula ou molécula tem um fenótipo similar à molécula ou polipeptídeo correspondente sem a dita mudança (ou mudanças).

[093] Variantes fenotipicamente silenciosas podem conter uma ou mais substituições conservativas e/ou uma ou mais substituições toleradas. Por substituições toleradas, são ditas aquelas substituições que não estão sob a definição de conservativo conforme determinado abaixo, mas, são, todavia fenotipicamente silenciosos. O elemento versado está ciente de que vários aminoácidos têm propriedades similar e, desse modo são ‘conservativos’. Um ou mais tais aminoácidos de uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo pode ser frequentemente substituídos por um ou mais outros tais aminoácidos sem eliminar uma atividade desejada dessa proteína, polipeptídeo ou peptídeo.

[094] Desse modo, os aminoácidos glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina podem ser frequentemente substituídos uns pelos outros (aminoácidos que têm cadeias laterais alifáticas). Dessas possíveis substituições, é preferencial que a glicina e alanina sejam usadas para substituir umas pelas outras (visto que as mesmas têm cadeias laterais relativamente curtas) e que a valina, leucina e isoleucina são usadas para substituir umas pelas outras (visto que as mesmas têm maiores cadeias laterais alifáticas que são hidrofóbicas). Outros aminoácidos que podem ser frequentemente substituídos uns pelos outros incluem: fenilalanina, tirosina e triptofano (aminoácidos que têm cadeias laterais aromáticas); lisina, arginina e histidina (aminoácidos que têm cadeias laterais básicas); aspartato e glutamato (aminoácidos que têm cadeias laterais ácidas); asparagina e glutamina (aminoácidos que têm cadeias laterais de amida); e cisteína e metionina (aminoácidos que têm cadeias laterais que contêm enxofre). Deve-se verificar que as substituições de aminoácido dentro do escopo da presente invenção podem ser realizadas com uso de aminoácidos naturalmente ocorrentes ou não naturalmente ocorrentes. Por exemplo, é contemplado no presente documento que o grupo metila em uma alanina pode ser substituído por um grupo etila, e/ou que mudanças menores podem ser realizadas à cadeia principal de peptídeo. Sejam aminoácidos naturais ou sintéticos usados ou não, é preferencial que somente L- aminoácidos estejam presentes.

[095] Substituições dessa natureza são frequentemente denominadas como substituições de aminoácido “conservativas” ou “semiconservativas”. A presente invenção, portanto, se estende para uso de uma molécula de ligação específica ou molécula de ligação bifuncional que compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos descritas acima, mas com uma ou mais substituições conservativas e ou uma ou mais substituições toleradas na sequência, de modo que a sequência de aminoácidos da molécula de ligação específica ou molécula de ligação bifuncional tenha pelo menos 80% de identidade, ou pelo menos 90% de identidade, tal como pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade, à molécula de ligação específica ou molécula de ligação bifuncional descrita acima.

[096] “Identidade” conforme conhecido na técnica é a relação entre duas ou mais sequências polipeptídicas ou duas ou mais sequências polinucleotídicas, como determinado por comparação das sequências. Na técnica, identidade também significa o grau de afinidade entre sequências polipeptídicas ou polinucleotídicas, de acordo com o caso, como determinado pela correspondência entre cadeias dessas sequências. Embora existam diversos métodos para medir a identidade entre dois polipeptídeos ou duas sequências polinucleotídicas, os métodos comumente empregados para determinar a identidade são codificados em programas de computador. Os programas de computador preferenciais para determinar a identidade entre duas sequências incluem, porém, sem limitação, o pacote de programas GCG (Devereux, et al., Nucleic Acids Research, 12, 387 (1984), BLASTP, BLASTN e FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol. 215, 403 (1990)).

[097] Pode-se usar um programa tal como o programa CLUSTAL para comparar sequências de aminoácidos. Esse programa compara sequências de aminoácidos e encontra o alinhamento ideal inserindo-se espaços em qualquer sequência conforme apropriado. É possível calcular identidade ou similaridade de aminoácido (identidade mais conservação de tipo de aminoácido) para um alinhamento ideal. Um programa como BLASTx alinhará o maior estiramento de sequências similares e designará um valor à adaptação. Desse modo, é possível obter uma comparação em que várias regiões de similaridade são encontradas, cada uma tendo uma pontuação diferente. Ambos os tipos de análise de identidade são contemplados na presente invenção.

[098] A identidade percentual de duas sequências de aminoácidos ou de duas sequências de ácidos nucleicos é determinada pelo alinhamento das sequências para fins de comparação ideal (por exemplo, podem ser introduzidos intervalos na primeira sequência para melhor alinhamento com a sequência) e comparação dos resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos nas posições correspondentes. O “melhor alinhamento” é um alinhamento de duas sequências que resulta na identidade percentual superior. A identidade percentual é determinada pelo número de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos idênticos nas sequências que são comparadas (ou seja, % de identidade = número de posições idênticas/número total de posições x 100).

[099] A determinação de percentual de identidade entre duas sequências pode ser concluída com uso de um algoritmo matemático conhecido pelos elementos versados na técnica. Um exemplo de um algoritmo matemático para comparar duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Os programas BLASTn e BLASTp de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 incorporou tal algoritmo. A determinação de percentual de identidade entre duas sequências de nucleotídeos pode ser realizada com o programa BLASTn. A determinação de percentual de identidade entre duas sequências de proteínas pode ser realizada com o programa BLASTp. Para obter alinhamentos com lacunas para fins de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado conforme descrito e, Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativamente, PSI-Blast pode ser usado para realizar uma pesquisa iterada que detecta relações distantes entre moléculas (Id.). Ao utilizar BLAST, programas Gapped BLAST, e PSI-Blast, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, BLASTp e BLASTp) podem ser usados. Consultar http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Os parâmetros gerais padrão podem incluir, por exemplo, Tamanho de Palavra = 3, Limiar Esperado = 10. Parâmetros podem ser selecionados para ajustar automaticamente para sequências de entrada curta. Outro exemplo de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller, CABIOS (1989). O programa ALIGN (versão 2.0) que é parte do pacote de software de alinhamento de sequência CGC incorporou tal algoritmo. Outros algoritmos para análise de sequência conhecidos na técnica incluem ADVANCE e ADAM conforme descrito em Torellis e Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10:3-5; e FASTA descrito em Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8. Dentro de FASTA, incluem, porém é uma opção de controle que ajusta a sensitividade e velocidade da busca. Para os propósitos de avaliar o percentual de identidade na presente revelação, BLASTp com os parâmetros padrão é usado como a metodologia de comparação. Adicionalmente, quando o percentual de identidade citado fornece um valor numérico não inteiro para aminoácidos (isto é, uma sequência de 25 aminoácidos que têm 90% de identidade de sequência fornece um valor de “22,5”, o valor obtido é arredondado para baixo ao próximo número inteiro, desse modo “22”). Consequentemente, no exemplo fornecido, uma sequência que tem 22 correspondências de 25 aminoácidos está dentro de 90% da identidade de sequência.

[100] Será óbvio àqueles versados na técnica que pode ser possível truncar ou estender as sequências fornecidas no C-terminal e/ou N-terminal do mesmo, por 1, 2, 3, 4, 5 ou mais resíduos, sem afetar substancialmente as características funcionais da molécula de ligação específica. As sequências fornecidas no C-terminal e/ou N-terminal do mesmo podem ser truncadas ou estendidas por 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos. Todas as tais variantes são abrangidas pela presente invenção.

[101] Mutações, incluindo substituições conservativas e toleradas, inserções e deleções, podem ser introduzidas nas sequências fornecidas com uso de qualquer método apropriado, incluindo, porém, sem limitação, aqueles baseados em reação em cadeia de polimerase (PCR), clonagem baseada em enzima de restrição, ou procedimentos de clonagem independente de ligação (LIC). Esses métodos são detalhados em muitos dos textos de biologia molecular padrão. Para detalhes adicionais relacionados a reação em cadeia de polimerase (PCR) e clonagem baseada em enzima de restrição, consultar Sambrook & Russell, (2001) Molecular Cloning – A Laboratory Manual (3a Ed.) CSHL Press. Informações adicionais sobre procedimentos de clonagem independente de ligação (LIC) podem ser encontradas em Rashtchian, (1995) Curr Opin Biotechnol 6(1): 30-6. As sequências fornecidas pela invenção podem ser obtidas a partir de síntese de estado sólido, ou qualquer outro método apropriado conhecido na técnica.

[102] A porção química de alvejamento pode ser um anticorpo ou fragmento do mesmo. Preferencialmente, os anticorpos, incluindo fragmentos, derivados e variantes dos mesmos, se ligam a antígenos apresentados em células doentes ou cancerosas.

[103] Moléculas de ligação específicas ou moléculas de ligação bifuncionais da presente invenção podem ser usadas em métodos de diagnóstico e tratamento de cânceres ou doenças infeciosas em cobaias humanas ou animais. Exemplos de cânceres incluem, porém, sem limitação, tumores líquidos, tais como Leucemias, linfomas e mieloma e tumores sólidos incluindo de bexiga, mama, cólo de útero, colorretal, gástrico endométrico esofagal, glioblastoma, fígado, melanoma, pulmonar, ovariano, pancreático, próstata, sarcoma, tireoide. Exemplos de doenças infeciosas incluem, porém, sem limitação, HIV, HBV, TB, HCV,

[104] Quando usadas em diagnóstico, moléculas de ligação específicas ou moléculas de ligação bifuncionais da invenção podem ser identificadas com uma identificação detectável, por exemplo uma rádioidentificação, tal como 131I ou 99Tc, que pode ser fixada a moléculas de ligação específicas da invenção com uso de química convencional conhecida na técnica de imageamento de anticorpo. Identificações também incluem identificações de enzima, tais como rábano peroxidase. Identificações incluem adicionalmente porções químicas, tais como biotina que pode ser detectada por meio de ligação a uma porção química detectável cognata específica, por exemplo, avidina identificada.

[105] Moléculas de ligação específicas ou molécula de ligação bifuncional da invenção podem ser suscetíveis a purificação de alto rendimento, particularmente, moléculas de ligação específicas em formato solúvel. O rendimento pode ser determinado com base na quantidade de material retido durante o processo de purificação (ou seja, a quantidade de material dobrado corretamente obtido no final do processo de purificação em relação à quantidade de material solubilizado obtido antes do redobramento), e/ou o rendimento pode ser baseado na quantidade de material dobrado corretamente obtido ao final do processo de purificação, em relação ao volume da cultura original. Alto rendimento significa rendimento maior do que 1%, ou mais preferencialmente maior do que 5% ou maior. Alto rendimento significa rendimento maior do que 1 mg/ml, ou mais preferencialmente maior do que 3 mg/ml, ou maior do que 5 mg/ml ou maior.

[106] Os métodos para determinar a afinidade de ligação (inversamente proporcional à constante de equilíbrio KD) e a meia vida de ligação (expressa como T½) são conhecidos pelos elementos versados na técnica. Preferencialmente, a afinidade de ligação e meia vida de ligação são determinados com uso de Ressonância de Plásmon de superfície (SPR) ou Interferometria de Bio-camada (BLI), por exemplo, com uso de um instrumento BIAcore ou instrumento Octet, respectivamente. Será verificado que duplicar a afinidade resulta em reduzir pela metade o KD. T½ é calculada como ln2 dividido pela taxa de desaceleração (koff). Portanto, a duplicação de T½ resulta em uma redução à metade em koff. Valores KD e koff. Para levar em conta a variação entre as medições independentes e, particularmente, para as interações com tempos de dissociação superiores a 20 horas, a afinidade de ligação e/ou meia-vida de ligação de uma dada molécula pode ser medida várias vezes, por exemplo, 3 ou mais vezes, com o uso do mesmo protocolo de ensaio e tomada uma média dos resultados. Para comparar dados de ligação entre duas amostras (isto é, duas moléculas diferentes e/ou duas preparações da mesma molécula), é preferencial que medições sejam realizadas com uso das mesmas condições de ensaio (por exemplo, temperatura), tal como aqueças descritas no documento nº WO2018234319.

[107] TCRs descritos no presente documento podem ser heterodímeros αβ. TCRs heterodiméricos alfa-beta geralmente compreendem uma sequência de domínio constante de TRAC de cadeia alfa e/ou uma sequência de domínio constante de TRBC1 ou TRBC2 de cadeia beta. Os domínios constantes podem ser de comprimento total pelo qual é dito que os domínios extracelular, transmembrana e citoplásmicos domínios estão presentes, ou os mesmos podem estar em formato solúvel (isto é, não tendo domínios de transmembrana ou citoplásmicos). Um ou ambos os domínios constantes podem conter mutações, substituições ou exclusões em relação às sequências TRAC e/ou TRBC1/2 nativas. O termo TRAC e TRBC1/2 também abrange variantes polimórficas naturais, por exemplo N a K na posição 4 de TRAC (Bragado et al International immunology. Fevereiro de 1994; 6 (2):223-30).

[108] Para TCRs solúveis, as sequências de domínio constante de cadeia alfa e beta podem ser modificadas por truncação ou substituição para deletar a ligação de dissulfeto nativo entre Cys4 de exão 2 de TRAC e Cys2 de exão 2 de TRBC1 ou TRBC2. A sequência (ou sequências) de domínio constante de cadeia alfa e/ou beta pode ter uma ligação dissulfeto introduzida entre resíduos dos respectivos domínios constantes, conforme descrito, por exemplo, no documento nº WO 03/020763. Os domínios constantes alfa e beta podem ser modificados por substituição de resíduos de cisteína na posição Thr 48 de TRAC e na posição Ser 57 de TRBC1 ou TRBC2, sendo que as ditas cisteínas formam uma ligação dissulfeto entre os domínios constantes alfa e beta do TCR. TRBC1 ou TRBC2 podem incluir adicionalmente uma mutação de cisteína para alanina na posição 75 do domínio constante e uma mutação de asparagina para ácido aspártico na posição 89 do domínio constante. Um ou ambos os domínios constantes extracelulares presentes em um heterodímero αβ podem ser truncados no C-terminal ou C- terminais, por exemplo, por até 15, ou até 10, ou até 8 ou menos aminoácidos. Um ou ambos os domínios constantes extracelulares presentes em um heterodímero αβ podem ser truncados no C-terminal ou C-terminais, por exemplo, por até 15, ou até 10, ou até 8 aminoácidos. O C-terminal do domínio constante extracelular da cadeia alfa pode ser truncado por 8 aminoácidos. TCRs solúveis são preferencialmente associados a agentes terapêuticos e/ou identificações detectáveis.

[109] Os domínios constantes de um TCR heterodimérico αβ pode ser de comprimento total, tendo tanto transmembrana quanto domínios citoplásmicos. Tais TCRs podem conter uma ligação de dissulfeto correspondente à encontrada na natureza entre os respectivos domínios constantes alfa e beta. Adicional ou alternativamente, uma ligação de dissulfeto não nativo pode estar presente entre os domínios constantes extracelulares. As ditas ligações dissulfeto não nativas são descritas adicionalmente nos documentos WO03020763 e WO06000830. A ligação dissulfeto não nativa pode estar entre a posição Thr 48 de TRAC e a posição Ser 57 de TRBC1 ou TRBC2. Um ou ambos os domínios constantes podem conter uma ou mais mutações, substituições ou exclusões em relação às sequências TRAC e/ou TRBC1/2 nativas. TCRs com domínios constantes de comprimento total são preferenciais para uso em terapia adotiva.

[110] TCRs descritos no presente documento pode estar em formato de cadeia única. Os formatos de cadeia única incluem, porém, sem limitação, polipeptídeos TCR αβ dos tipos

Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ, Vα-L-Vβ-Cβ ou Vα- Cα-L-Vβ-Cβ, em que Vα e Vβ são regiões variáveis de TCR α e β, respectivamente, Cα e Cβ são regiões constantes de TCR α e β, respectivamente, e L é uma sequência ligante (Weidanz et al., (1998) J Immunol Methods. Dez 1;221(1 a 2):59 a 76; Epel et al., (2002), Cancer Immunol Immunother. Nov;51(10):565 a 73; WO 2004/033685; WO9918129). Onde presentes, um ou ambos os domínios constantes podem ser de comprimento total ou podem ser truncados e/ou conter mutações conforme descrito acima. Preferencialmente, TCRs de cadeia única são solúveis. TCRs de cadeia única podem ter uma ligação de dissulfeto introduzida entre resíduos dos respectivos domínios constantes, conforme descrito no documento nº WO 2004/033685. Os TCRs de cadeia única são descritos adicionalmente nos documentos WO2004/033685; WO98/39482; WO01/62908; Weidanz et al. (1998) J Immunol Methods 221(1 a 2): 59 a 76; Hoo et al. (1992) Proc Natl Acad Sci EUA 89(10): 4.759 a 4.763; Schodin (1996) Mol Immunol 33(9): 819 a 829)

[111] Moléculas de ligação específicas ou moléculas de ligação bifuncionais podem ser associados (de modo covalente ou de outro modo) a uma porção química modificadora de PK. Exemplos de porções químicas modificadoras de PK incluem, porém, sem limitação, PEG (Dozier et al., (2015) Int J Mol Sci. Oct 28;16(10):25831-64 e Jevsevar et al., (2010) Biotechnol J.Jan;5(1):113-28), PASilação (Schlapschy et al., (2013) Protein Eng Des Sel. Ago;26(8):489-501), albumina, e domínios de ligação de albumina, (Dennis et al., (2002) J Biol Chem. Set 20;277(38):35035-43), e/ou polipeptídeos não estruturados (Schellenberger et al., (2009) Nat Biotechnol. Dez;27(12):1186-90). Porções químicas modificadoras de PK adicionais incluem fragmentos de anticorpos Fc.

[112] Conforme usado no presente documento, o termo “anticorpo” abrange tais fragmentos e variantes. Fragmentos de anticorpos e variantes/análogos que são adequados para uso nas composições e métodos descritos no presente documento incluem minibodies, fragmentos Fab, fragmentos F(ab’)2, fragmentos dsFv e scFv, diacorpos, Nanobodies™ (esses construtos, comercializados por Ablynx (Bélgica), compreendem domínio pesado variável de imunoglobulina única sintética derivado de um anticorpo camélido (por exemplo, camel ou llama)) e Anticorpos de Domínio (Domantis (Bélgica), que compreende um domínio pesado variável de imunoglobulina única maturada de afinidade ou domínio leve variável de imunoglobulina) ou estruturas de suporte de proteína alternativas que exibem características de ligação similares a anticorpo tais como Affibodies (Affibody (Suiça), que compreende estrutura de suporte A de proteína manipulada) ou Anticalinas (Pieris (Alemanha)), que compreende anticalinas manipuladas) para citar alguns.

[113] O anticorpo também inclui anticorpos similares a TCR (Chang et al., Expert Opin Biol Ther. 2016 Ago;16(8):979-87 e Dahan et al., Expert Rev Mol Med. 2012 Fev 24;14:e6).

[114] A ligação da porção química de alvejamento e molécula de ligação específica do primeiro aspecto pode ser por meio de fixação covalente ou não covalente. A fixação covalente pode ser direta, ou indireta por meio de uma sequência ligante. As sequências ligantes geralmente são flexíveis, pois são compostas principalmente de aminoácidos, tais como glicina, alanina e serina, que não têm cadeias laterais volumosas que provavelmente restringem a flexibilidade. Alternativamente, ligantes com maior rigidez podem ser desejáveis. Comprimentos utilizáveis ou ótimos de sequências de ligação podem ser determinados facilmente. Frequentemente, a sequência ligante será menor que cerca de 12, tal como menor que 10, ou de 2-10 aminoácidos de comprimento, preferencialmente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 aminoácidos de comprimento. Exemplos de ligantes adequados que podem ser usados em TCRs da invenção incluem, porém, sem limitação: , e (conforme descrito no documento nº WO2010/133828).

[115] Conforme é conhecido na técnica, moléculas de ligação específicas ou moléculas de ligação bifuncionais podem estar sujeitas a modificações pós-translacionais. A glicosilação é uma tal modificação, que compreende a fixação covalente de porções químicas de doligossacarídeo aos aminoácidos definidos na cadeia de aminoácidos. Por exemplo, resíduos de asparagina ou resíduos de serina/treonina são locais bem conhecidos para ligação de oligossacarídeos. O estado de glicosilação de uma determinada proteína depende de vários fatores, incluindo a sequência da proteína, a conformação da proteína e a disponibilidade de determinadas enzimas. Além disso, o estado de glicosilação (ou seja, tipo de oligossacarídeo, ligação covalente e número total de ligações) pode influenciar a função da proteína. Portanto, ao produzir proteínas recombinantes, frequentemente é desejável controlar a glicosilação. A glicosilação controlada tem sido usada para melhorar a terapêutica baseada em anticorpos. (Jefferis et al., (2009) Nat Rev Drug Discov Mar;8(3):226 a

34.). Para TCRs solúveis, a glicosilação pode ser controlada, com o uso de linhagens celulares específicas, por exemplo (incluindo, porém, sem limitação, linhagens celulares de mamíferos, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de rim embrionário humano (HEK)), ou por modificação química. Essas modificações podem ser desejáveis, uma vez que a glicosilação pode melhorar a farmacocinética, reduzir a imunogenicidade e simular mais de perto uma proteína humana nativa (Sinclair e Elliott, (2005) Pharm Sci.Aug; 94 (8): 1.626 a 1.635).

[116] Para administração a pacientes, as moléculas de ligação específicas, moléculas de ligação bifuncionais, ácidos nucleicos, vetores de expressão ou células da invenção podem ser fornecidos como parte de uma composição farmacêutica estéril em conjunto com um ou mais carreadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Essa composição farmacêutica pode estar em qualquer forma adequada (dependendo do método desejado de administração a um paciente). A mesma pode ser fornecida na forma de dosagem unitária, geralmente será fornecida em um recipiente vedado e pode ser fornecida como parte de um kit. Esse kit normalmente (embora não necessariamente) incluiria instruções de uso. O mesmo pode incluir uma pluralidade das ditas formas de dosagem unitária.

[117] A composição farmacêutica pode ser adaptada para administração por qualquer via apropriada, tal como parenteral (incluindo subcutânea, intramuscular, biespecificas ou intravenosa), enteral (incluindo oral ou retal), inalação ou vias intranasais. Tais composições podem ser preparadas por qualquer método conhecido na técnica de farmácia, por exemplo, misturando-se o ingrediente ativo com o veículo (ou veículos) ou excipiente (ou excipientes) em condições estéreis.

[118] As dosagens das substâncias da presente invenção podem variar entre limites amplos, dependendo da doença ou distúrbio a ser tratado, da idade e condição do indivíduo a ser tratado, etc. uma faixa de dose adequada para molécula da invenção pode estar na faixa de 25 ng/kg a 50 µg/kg ou 1 µg a 1 g. Em última análise, um médico determinará as dosagens apropriadas a serem usadas.

[119] Moléculas de ligação específica, moléculas de ligação bifuncionais, composições farmacêuticas, vetores, ácidos nucleicos e células da invenção podem ser fornecidos na forma substancialmente pura, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% pura.

[120] O método de tratamento pode incluir adicionalmente administrar separadamente, em combinação, ou sequencialmente, um agente anti-neoplástico adicional. Exemplos de tais agentes são conhecidos na técnica e podem incluir agentes de ativação imune e / ou agentes de modulação de célula T.

[121] Ácidos nucleicos, vetores de expressão, células hospedeiras e métodos de produção conforme descrito acima em relação ao primeiro aspecto são também contemplados em relação aos outros aspectos descritos no presente documento.

[122] As características preferenciais de cada aspecto da invenção são como para cada um dos outros aspectos mutatis mutandis. Os documentos de técnica anterior mencionados no presente documento são incorporados por referência à extensão total permitida pela lei.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[123] Figura 1 – fornece sequências de aminoácidos VH e VL de variantes de UCHT1 aprimoradas. CDRs são sublinhadas. Mutações são mostradas em negrito

[124] Figura 2 – fornece sequências de aminoácidos exemplificadoras uma proteína de fusão TCR-anti- CD3, incorporando variantes de scFv anti CD3 aprimoradas

[125] Figura 3 – demonstra que uma fusão TCR-CD3 que incorpora variante de scFv anti-CD3 aprimorada 1 tem uma janela terapêutica melhor em relação a anti-CD3 não mutado (A) e uma fusão TCR-CD3 que incorpora a variante de scFv anti-CD3 aprimorada 2 tem um maior Emax em relação a anti-CD3 não mutado (B)

[126] Figura 4 – demonstra propriedades de eliminação de célula T aprimoradas mediadas por uma fusão TCR- CD3 que incorpora a variantes 1 e variante 2 de UCHT1.

[127] A invenção é adicionalmente descrita nos exemplos não limitadores a seguir.

EXEMPLOS

[128] Os exemplos a seguir descrevem moléculas de ligação bifuncionais da invenção, que podem ser denominadas como proteínas biespecificas TCR-anti-CD3. 1) A PREPARAÇÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO BIESPECÍFICAS TCR-ANTI-CD3 FUSÃO COM ANTI-CD3 APRIMORADA

[129] Proteínas de fusão que compreendem um TCR e um scFv anti-CD3 são conhecidos na técnica (por exemplo,

consultar os documentos nº WO2011001152, nº WO2017109496, nº WO2017175006 e nº WO2018234319). Essas moléculas compreendem um fragmento scFv de UCHT1 humanizado.

[130] Nesse exemplo, variantes de uma proteína de fusão TCR-anti-CD3 descrita no documento nº WO2018234319 foram produzidas que incorporam tanto a variante anti-CD3 1 (T165A) como a variante anti-CD3 2 (T165A+I202F). Mutações foram introduzidas com uso de métodos de mutagênese e clonagem padrão (tal como descrito em Sambrook, Joseph. (2001). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y.:Cold Spring Harbor Laboratory Press). Sequências de aminoácidos de VL e VH para T165A e T165A+I202F são fornecidas na Figura 1. Sequências de aminoácidos de um TCR-anti-CD3 que incorpora as sequências fornecidas na Figura 1 são fornecidas na Figura 2.

[131] As proteínas de fusão TCR-anti-CD3 que compreendem T165A, T165A+I202F ou (WT) scFv de UCHT1 não mutada foram expressas em E. coli como corpos de inclusão e subsequentemente colocadas novamente em fold e purificadas com uso dos métodos descritos no documento nº WO2018234319, exemplo 2) 2) JANELA TERAPÊUTICA AUMENTADA E ATIVAÇÃO DE CÉLULA T MÁXIMA MEDIADA POR TCR-ANTI-CD3 COM VARIANTES T165A E T165A+I202F A) LIBERAÇÃO DE IFN-Γ

[132] As proteínas de fusão TCR-anti-CD3 descritas acima foram analisadas por sua capacidade de mediar a ativação de células T CD3+ na presença de células positivas de antígeno e negativas de antígeno. A liberação de Interferon- γ (IFN-γ) foi usada como uma leitura para a ativação de célula

T.

[133] Ensaios foram realizados com uso de um kit IFN-γ ELISPOT humano (BD Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante. Brevemente, células de melanoma Mel624 foram usadas como células-alvo positivas de antígeno. Células de linfoma de célula B de Granta-519 foram usadas como células-alvo negativas de antígeno. células-alvo foram preparadas em uma densidade de 1x106/ml em meio de ensaio (RPMI 1640 contendo FBS inativado por calor a 10% e penicilina- estreptomicina-L-glutamina a 1%) e plaqueadas em 50.000 células por poço em um volume de 50 μl. Células mononucleares de sangue periféricas (PBMC), isoladas do sangue fresco de doador, foram usadas como células efetoras CD3+ e plaqueadas em 35.000 células por poço em um volume de 50 μl. TCR-anti-CD3 proteínas foram tituladas às concentrações finais entre 10 nM e 0,0001 nM, e adicionadas ao poço em um volume de 50 μl.

[134] Placas foram preparadas e desenvolvidas de acordo com as instruções do fabricante. Poços que contêm células-alvo, células efetoras e proteínas de fusão foram compostas a um volume final de 200 μl com meio de ensaio. Todas as reações foram realizadas em triplicata. Poços de controle foram também preparados com a omissão tanto da proteína de fusão, células efetoras, como das células-alvo. As placas foram incubadas de um dia para o outro (37º C/5% CO2). No dia seguinte, as placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem (sachê de 1xPBS, contendo Tween-20 a 0,05%, composto em água deionizada). O anticorpo de detecção primário foi então adicionado a cada poço em um volume de 50 μl. Placas foram incubadas em temperatura ambiente por 2 horas antes de serem lavadas novamente três vezes. A detecção secundária foi realizada adicionando-se 50 μl de estreptavidina-HRP diluída a cada poço e incubando em temperatura ambiente por 1 hora e a etapa de lavagem repetida. Não mais do que 15 mins. antes do uso, uma queda de (20 μl) de cromogêneo de AEC foi adicionado a cada 1 ml de substrato de AEC e misturado e 50 μl adicionado a cada poço. O desenvolvimento por ponto foi monitorado regularmente e placas foram lavadas em água corrente para terminar a reação de desenvolvimento. Foi então permitido que as placas secassem em temperatura ambiente por pelo menos 2 horas antes de contar os pontos com uso de um analisador CTL com software Immunospot (Cellular Technology Limited). Dados foram preparados e analisados com uso de software PRISM.

[135] A janela terapêutica foi calculada determinando-se a potência relativa de ativação de célula T mediada por variante TCR-antiCD3 e WT, contra células positivas de antígeno, e comparando-se valores de Ec50 após adaptação de curva em Prism. Para células negativas de antígeno, valores de Ec50 robustos não puderam ser obtidos, então uma ‘concentração reativa de cruzamento mínimo’ foi determinada ajustando-se um número limítrofe de pontos (por exemplo, 25 pontos por poço), e identificando-se por interpolação a concentração que excederia primeiro esse número.

RESULTADOS T165A

[136] Para obter uma determinação robusta da janela terapêutica, dados foram medidos a partir de 4 placas Ag+ e 4 placas Ag-, das quais cada uma teve não mutada e T165A lado a lado. A Figura 3A mostra as curvas obtidas a partir de uma placa. Os dados para cada uma das placas individuais são mostrados nas tabelas abaixo.

Placa 1 Placa 2 Placa 5 Placa 6 Mel 624 Mel 624 Mel 624 Mel 624 Células-alvo (Ag+) (Ag+) (Ag+) (Ag+) Células Doador 1 Doador 1 Doador 2 Doador 2 efetoras T165A EC50 116pM 137pM 160pM 446pM Wt EC50 62,2pM 60,9pM 79,3pM 72,1pM Potência relativa de 0,54 0,44 0,50 0,16 T165A Placa 3 Placa 4 Placa 7 Placa 8 Células- Granta 519 Granta 519 Granta 519 Granta 519 alvo (Ag-) (Ag-) (Ag-) (Ag-) Células Doador 1 Doador 1 Doador 2 Doador 2 efetoras Concentraçã o reativa de 1,56nM 7,16nM 0,698nM 0,615nM cruzamento T165A Concentraçã o reativa de 0,165nM 0,811nM 0,206nM 0,152nM cruzamento Wt Reatividade cruzada 0,11 0,11 0,29 0,25 relativa a T165A

[137] A potência relativa contra células positivas de antígeno (isto é, Ec50 de WT dividido por Ec50 de T165A) gerou uma média de 0,41. A reatividade cruzada relativa contra células negativas de antígeno (isto é, conc. de WT gerando 25 pontos / concentração de T165A gerando 25 pontos)

gerou uma média de 0,19. Esses dados demonstram que a janela terapêutica de T165A é aproximadamente 2x maior do que a janela para o WT. T165A+I202F

[138] A Figura 3B mostra que a variante T165A+I202F resulta em uma maior ativação de célula T máxima (Emax) relativa a WT. Nesse caso, a janela terapêutica é similar a WT. Esses dados demonstram que T165A+I202F é mais eficiente em ativar células T. B) ELIMINAÇÃO MEDIADA POR CÉLULAS T

[139] A capacidade das proteínas de fusão TCR- anti-CD3 de mediar eliminação por célula T redirecionada de tumor positivo de antígeno e negativo de antígeno células foi investigada com uso da plataforma IncuCyte (Essen BioScience). Esse ensaio permite detecção em tempo real por microscópio da liberação de Caspase-3/7, um marcador para apoptose.

MÉTODO

[140] Ensaios foram executados com uso do kit de ensaio de apoptoseCaspase-3/7 de 96 poços CellPlayer (Essen BioScience, Cat. No.4440) e realizados de acordo com o protocolo do fabricante. Brevemente, células-alvo (Mel624 (positivas de antígeno) ou células MDA MB 231 (negativas de antígeno) células foram plaqueadas em 10000 células por poço e incubadas de um dia para o outro para permitir que as mesmas se aderissem. Proteínas de fusão TCR-anti-CD3 foram adicionadas em concentrações entre 0,05 nM e 0,0125 nM (para células positivas de antígeno) e entre 20 nM e 0,125 nM (para células negativas de antígeno). Células efetoras CD3+ (PBMC) foram usadas em uma razão de célula efetora alvo de 10:1 (100.000 células por poço). O reagente de ensaio NucView foi composto em 30 µM e 25 µl adicionado a cada poço e o volume final trazido a 150 µl (gerando conc. Final de 5 µM). A placa foi colocada no instrumento IncuCyte e imagens em intervalos regulares por 3 a 5 dias. O número de células apoptóticas em cada imagem foi determinada e registrada como contagem de objeto por mm2. Ensaios foram realizados em triplicata. Gráficos foram preparados com uso de software PRISM.

RESULTADOS

[141] As curvas de eliminação resultantes para WT, T165A e T165A+I202F contra células positivas de antígeno e células negativas de antígeno são mostradas na Figura 4. Observe que, por clareza, somente as curvas para as concentrações indicadas são mostradas. T165A

[142] T165A mostra uma pequena redução de eliminação de célula T de células positivas de antígeno relativas a WT em uma concentração de 0,005 nM. A eliminação de células negativas de antígeno não é observada até 20 nM, enquanto para WT, a eliminação é observada em uma concentração de 1 nM. Esses dados confirmam as constatações acima de que T165A tem uma janela terapêutica aprimorada. T165A+I202F

[143] T165A+I202F mostra aumento em eliminação mediada por célula T em uma dada concentração (por exemplo, 0,005nM) contra células positivas de antígeno. A eliminação de células negativas de antígeno é comparável a WT. Esses dados confirmam as constatações acima e demonstram que T165A+I202F é mais eficiente em ativar células T.

[144] Os dados apresentados no exemplo demonstram que proteínas de fusão TCR-antiCD3 que incorpora variantes de UCHT1 T165A ou T165A+I202F têm propriedades terapêuticas aprimoradas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA QUE SE LIGA A CD3, caracterizada por compreender um polipeptídeo que tem um domínio de imunoglobulina VL e um domínio de imunoglobulina VH, em que o domínio VL compreende Regiões Determinantes de Complementaridade (CDRs) VLCDR1, VLCDR2 e VLCDR3, e em que o domínio VH compreende Regiões Determinantes de Complementaridade (CDRs) VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, cada um tendo uma respectiva sequência de aminoácidos conforme a seguir, em que VLCDR1 é VLCDR2 é VLCDR3 é VHCDR1 é VHCDR2 é VHCDR3 é ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica a isso.

2. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela imunoglobulina VL compreender uma sequência geral VLFW1-VLCDR1-VLFW2-VLCDR2- VLFW3-VLCDR3-VLFW4, em que VLFW1, VLFW2, VLFW3 e VLFW4 são sequências de estruturas de VL (VLFW) 1 a 4, respectivamente, a imunoglobulina VH compreender uma sequência geral VHFW1- VHCDR1-VHFW2-VHCDR2-VHFW3-VHCDR3-VHFW4, em que VHFW1, VHFW2, VHFW3 e VHFW4 são sequências de estruturas de VH (VHFW) 1 a 4, respectivamente, opcionalmente em que as sequências de VLFW e VHFW são sequências de estrutura de camundongo, ser humano ou humanizada.

3. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pela imunoglobulina VL compreender uma sequência geral VLFW1- VLCDR1-VLFW2-VLCDR2-VLFW3-VLCDR3-VLFW4, em que VLFW1, VLFW2, VLFW3 e VLFW4 são sequências de estruturas (FW) 1 a 4, respectivamente, sendo que VLFW1, VLFW2, VLFW3 e VLFW4 têm, cada uma, uma respectiva sequência de aminoácidos conforme a seguir, em que: VLFW1 é ou VLFW2 é VLFW3 é VLFW4 é ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica a isso.

4. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pela imunoglobulina VH compreender uma sequência geral VHFW1- VHCDR1-VHFW2-VHCDR2-VHFW3-VHCDR3-VHFW4, em que VHFW1, VHFW2, VHFW3 e VHFW4 são sequências de estruturas (FW) 1 a 4, respectivamente, sendo que VHFW1, VHFW2, VHFW3 e VHFW4 têm, cada uma, uma respectiva sequência de aminoácidos conforme a seguir, em que: VHFW1 é VHFW2 é VHFW3 é ou VHFW4 é ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica a isso.

5. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pela imunoglobina VL compreender a sequência: ; ou ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica a isso.

6. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pela imunoglobina VH compreender a sequência: ; ou ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica a isso.

7. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pela molécula estar na forma de um fragmento scFv.

8. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelos domínios de imunoglobina VL e VH serem conectados por meio de ligante.

9. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO BIFUNCIONAL, caracterizada por compreender: i) uma porção química de alvejamento; e ii) uma molécula de ligação específica que se liga a CD3, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

10. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO BIFUNCIONAL, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pela porção química de alvejamento ser um receptor de células T (TCR), um anticorpo ou um fragmento de anticorpo.

11. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO BIFUNCIONAL, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo receptor de células T (TCR) ser um par de polipeptídeos TCR alfa/beta heterodinâmicos.

12. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO BIFUNCIONAL, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo receptor de células T (TCR) ser um polipeptídeo TCR alfa/beta de cadeia única.

13. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO BIFUNCIONAL, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo TCR compreender uma ligação de bissulfeto não nativo entre a região constante da cadeia alfa e a região constante da cadeia beta.

14. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO BIFUNCIONAL, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo TCR se ligar ao MHC em complexo com um antígeno de peptídeo.

15. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO BIFUNCIONAL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, caracterizada pela molécula de ligação específica que se liga a CD3, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ser fundida ao C ou N-terminal da porção química de alvejamento.

16. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO BIFUNCIONAL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 15, caracterizada pela molécula de ligação específica que se liga a CD3, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ser fundida ao C ou N-terminal da porção química de alvejamento por meio de um ligante.

17. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender uma molécula de ligação específica que se liga a

CD3, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou a uma molécula de ligação bifuncional, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 9 a 16.

18. ÁCIDO NUCLEICO, caracterizado por codificar uma molécula de ligação específica que se liga a CD3 conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou a uma molécula de ligação bifuncional conforme definida em qualquer uma das reivindicações 9 a 16.

19. VETOR DE EXPRESSÃO, caracterizado por compreender ácido nucleico conforme definido na reivindicação

18.

20. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizada por compreender ácido nucleico conforme definido na reivindicação 18, ou o vetor conforme definido na reivindicação 19, em que o ácido nucleico que codifica a molécula de ligação específica que se liga a CD3 conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou a molécula de ligação bifuncional conforme definida em qualquer uma das reivindicações 9 a 16, está presente como um quadro de leitura aberto único ou dois quadros de leitura abertos distintos que codificam a cadeia alfa e a cadeia beta, respectivamente.

21. MÉTODO DE PREPARAÇÃO DA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA QUE SE LIGA A CD3 conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou da molécula de ligação bifuncional conforme definida em qualquer uma das reivindicações 9 a 16, caracterizado por compreender a manutenção da célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 20, sob condições opcionais para expressão do ácido nucleico e isolar a molécula de ligação específica que se liga a CD3 e à molécula de ligação bifuncional.

22. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA QUE SE LIGA A CD3, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou molécula de ligação bifuncional, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 16, caracterizada por ser para uso como um medicamento.

23. MÉTODO DE TRATAMENTO, caracterizado por compreender administrar uma molécula de ligação específica que se liga a CD3 conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou uma molécula de ligação bifuncional conforme definida em qualquer uma das reivindicações 9 a 16, a um paciente em necessidade do mesmo.