BR112021003055A2

BR112021003055A2 - métodos para liberar fósforo de matéria orgânica

Info

Publication number: BR112021003055A2
Application number: BR112021003055-7A
Authority: BR
Inventors: Sean Farmer; Ken Alibek; Paul S. Zorner; Alibek MOLDAKOZHAYEV
Original assignee: Locus Ip Company, Llc
Priority date: 2018-08-20
Filing date: 2019-08-20
Publication date: 2021-05-11
Also published as: US20210161981A1; AU2019325466A1; CA3107460A1; WO2020041265A1; SG11202100392WA; CL2021000423A1; MX2021001919A; JP2023179490A; KR20210035824A; EP3810783A4; PE20211741A1; EP3810783A1; IL280136A; CR20210147A; AR115986A1; CN112567043A; PH12021550210A1; JP2021534749A

Abstract

MÉTODOS PARA LIBERAR FÓSFORO DE MATÉRIA ORGÂNICA. A presente invenção fornece composições baseadas em micróbios compreendendo leveduras biologicamente puras e/ou um ou mais subprodutos de crescimento microbiano, tais como enzimas. Em certas modalidades, as enzimas são fitases. Métodos de uso dessas composições para liberar fosfatos de matéria orgânica contendo ácido fítico também são fornecidos.

Description

MÉTODOS PARA LIBERAR FÓSFORO DE MATÉRIA ORGÂNICA REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO RELACIONADO

[0001]Este pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente Provisório No. US 62/719.760, depositado em 20 de agosto de 2018, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002]Nos setores de agricultura, horticultura, silvicultura, pecuária e aquicultura, certos problemas comuns impedem a capacidade de maximizar o crescimento e a produção, mantendo os custos baixos. Isso inclui, mas não está limitado a, infecções e infestações causadas por bactérias, fungos e outras pragas e patógenos; os altos custos da alimentação; o alto custo dos fertilizantes químicos, bem como seus impactos ambientais e à saúde; e a dificuldade de fornecer às plantações e ao gado nutrientes essenciais, como fósforo, em formas utilizáveis. Além disso, existem preocupações crescentes em relação ao esgotamento de recursos não renováveis e os efeitos das emissões de gases de efeito estufa (GEE) na saúde do meio ambiente e nos ecossistemas mundiais.

[0003]O fósforo (P) é um macronutriente essencial para todos os organismos vivos. Nas plantas, o P é retirado da rizosfera pelas raízes, principalmente como fosfato inorgânico (Pi). O Pi é necessário em grandes quantidades para maximizar o rendimento das colheitas. No solo, entretanto, a maior porcentagem de fósforo existe na forma da molécula de armazenamento de fósforo, ácido fítico ou fitato na forma de sal. A hidrólise do ácido fítico pode ser realizada por hidrólise ácida ou básica parcial, ou por hidrólise usando enzimas fosfatase, com subprodutos incluindo fosfato, inositol e vários intermediários de fosfato de inositol.

[0004]As enzimas que catalisam a conversão do ácido fítico são conhecidas como fitases. As fitases são produzidas por certos micro-organismos, como, por exemplo, bactérias incluindo Bacillus subtilis e Pseudomonas spp.; leveduras incluindo Saccharomyces cerevisiae; e fungos incluindo Aspergillus terreus e Aspergillus ficuum. As fitases também estão presentes endogenamente em pequenas quantidades em algumas espécies de plantas.

[0005]O ácido fítico no solo pode não ser absorvido pela maioria das plantas, fazendo com que se acumule no solo sem uso, bem como nos detritos da planta e outra matéria orgânica do solo. Isso pode ser devido aos baixos níveis de enzimas na rizosfera e/ou devido à forte ligação do fitato à fase sólida do solo. Uma estratégia para superar esse obstáculo envolve a engenharia genética de safras de plantas para melhorar a capacidade das plantas de produzir exsudatos e/ou enzimas para solubilizar o ácido fítico ligado ao solo. No entanto, esse processo pode ser caro e complexo, e muitos consumidores se opõem à venda e/ou consumo de produtos geneticamente modificados.

[0006]A deficiência de fósforo também é um problema na criação de gado e pode levar a, por exemplo, infertilidade, diminuição da produção de leite em mamíferos e mineralização óssea inadequada. O ácido fítico é encontrado em muitos cereais, grãos e leguminosas, mas é considerado um fator anti-nutricional para muitos animais não ruminantes, que não podem metabolizar o composto ou o fazem mal.

[0007]Humanos e outros animais monogástricos (por exemplo, porcos, aves e peixes) produzem quantidades inadequadas, se houver, das enzimas necessárias para metabolizar o ácido fítico. Embora alguma hidrólise do ácido fítico ocorra no cólon, o fósforo inorgânico não tem valor nutricional, pois o fósforo inorgânico é absorvido apenas no intestino delgado. Como consequência, uma quantidade significativa de fósforo nutricionalmente importante não é usada por humanos e/ou outros animais monogástricos.

[0008]Além disso, o ácido fítico forma complexos com proteínas e cátions divalentes, como cálcio, ferro, zinco, magnésio, manganês, cobre e molibdênio, diminuindo assim a biodisponibilidade para o sistema digestivo de um animal. Por exemplo, a ingestão de grandes quantidades de alimentos contendo ácido fítico pode levar a deficiências de minerais em humanos, como deficiências de cálcio, ferro e/ou zinco. O ácido fítico também se liga ao amido e influencia sua digestibilidade e solubilidade. Assim, os animais monogástricos frequentemente devem receber suplementos dietéticos contendo fósforo inorgânico para garantir o crescimento e a saúde adequados.

[0009]A modificação genética de animais e micro- organismos também tem sido tentada para melhorar a digestão de compostos orgânicos de fósforo. Por exemplo, tanto porcos quanto E. coli foram projetados para possuir genes que codificam a produção e/ou o aumento da produção de fitase.

[00010]Animais ruminantes, por outro lado, podem possuir no rúmen micro-organismos que produzem enzimas capazes de converter o ácido fítico em fósforo digestível. No entanto, para animais ruminantes caipiras e/ou pastando em áreas onde os solos são pobres em fósforo biodisponível pelas plantas, a suplementação alimentar ainda pode ser necessária para combater a deficiência de fósforo. Além disso, quando os animais são alimentados com dietas altamente digestíveis (por exemplo, silagem de milho), pode ocorrer um aumento da taxa de passagem do fluido ruminal, resultando na digestão incompleta de compostos orgânicos de fósforo.

[00011]A atividade humana no século passado levou a certas preocupações ambientais relacionadas ao esgotamento e à poluição do fósforo. Práticas agrícolas não sustentáveis, como o uso excessivo de fertilizantes, têm esgotado continuamente a rocha fosfática recuperável do mundo, causando o acúmulo de estoques de fósforo não utilizados no solo e produzindo escoamento de fósforo para os aquíferos. Além disso, o escoamento de estoques de fósforo não digerido em esterco de gado lixiviado em águas subterrâneas também pode ser transportado para rios e lagos, levando à eutrofização.

[00012]Os custos econômicos da produção de commodities alimentares em grande escala e o esgotamento dos recursos de fósforo utilizáveis continuam a prejudicar globalmente a saúde humana e animal e a sustentabilidade da agricultura e da pecuária. A modificação genética de plantas, porcos e micróbios e suplementos dietéticos para animais e humanos são alguns dos métodos atuais de combate a esse problema, mas mais esforços devem ser feitos se um esgotamento total do fósforo for evitado. Assim, existe a necessidade de métodos de gestão sustentável do fósforo, em que o fósforo utilizável possa ser recuperado da matéria orgânica, como resíduos de colheitas, a fim de reciclar e conservar recursos de fósforo não renováveis.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00013]A presente invenção fornece micróbios, bem como subprodutos de seu crescimento, tais como biotensoativos, metabólitos e/ou enzimas. A presente invenção também fornece métodos de produção e uso desses micróbios e seus subprodutos. Vantajosamente, os produtos e métodos à base de micróbio da invenção em questão são ecologicamente corretos, operacionais e econômicos.

[00014]Em modalidades preferidas, a presente invenção fornece composições à base de micróbio compreendendo micro- organismos cultivados e/ou subprodutos de crescimento dos mesmos, métodos para a produção dessas composições e métodos de seu uso em, por exemplo, saúde humana, agricultura, silvicultura e pecuária. Geralmente, as composições baseadas em micróbios são capazes de liberar fósforo a partir de matéria orgânica contendo ácido fítico, como, por exemplo, solo, matéria vegetal, resíduo de colheita e esterco. Além disso, as composições à base de micróbio podem ser usadas para aumentar o reflorestamento e o crescimento e a produtividade da colheita. Além disso, as composições podem ser utilizadas como um suplemento dietético para animais e humanos, bem como um suplemento de meio de crescimento para cultivo de micro-organismos.

[00015]Os micro-organismos da composição à base de micróbio em questão são, de preferência, leveduras biologicamente puras, capazes de produzir um ou mais subprodutos de crescimento úteis, tais como, por exemplo, uma enzima. De preferência, a enzima é a fitase. Em modalidades específicas, a levedura é Wickerhamomyces anomalus (Pichia anomala) e/ou uma espécie intimamente relacionada (por exemplo, pertencente à mesma família e/ou gênero).

[00016]As composições à base de micróbio da presente invenção podem ser obtidas através de processos de cultivo que variam de pequena a grande escala. Estes processos de cultivo incluem, mas não estão limitados a, cultivo submerso, fermentação em estado sólido (SSF) e híbridos, modificações e/ou combinações dos mesmos.

[00017]As leveduras na composição podem estar em uma forma ativa ou inativa. Além disso, a composição também pode compreender caldo de fermentação líquido resultante do cultivo das leveduras, que pode incluir, entre outros, componentes celulares e subprodutos de crescimento microbiano, tais como biotensoativos, metabólitos e/ou enzimas. Em algumas modalidades, a composição compreende o caldo de fermentação sem as células de levedura.

[00018]Vantajosamente, o uso direto da composição, ou seja, sem mais estabilização, preservação e armazenamento, preserva uma alta viabilidade dos micro-organismos, reduz a possibilidade de contaminação por agentes estranhos e micro-organismos indesejáveis e/ou mantém a atividade dos subprodutos de crescimento microbiano.

[00019]Em certas modalidades, a composição compreende ainda um ou mais biotensoativos. Os biotensoativos podem ser adicionados na forma purificada ou na forma bruta, em que a forma bruta significa que eles estão presentes em um sobrenadante resultante do cultivo de um micro-organismo produtor de biotensoativo. A forma bruta pode opcionalmente compreender nutrientes residuais, outros subprodutos do crescimento microbiano, micro-organismos e/ou componentes celulares. Em algumas modalidades, os biotensoativos são produzidos pelo(s) micro-organismo(s) da composição à base de micróbio.

[00020]Em algumas modalidades, os biotensoativos são selecionados a partir de, por exemplo, glicolipídios (por exemplo, soforolipídios, ramnolipídios, lipídios de celobiose, lipídios de manosileritritol e lipídios de trealose), lipopeptídeos (por exemplo, surfactina, iturina, fengicina, artrofactina e liquenisina), por exemplo, cardiolipinas), compostos de éster de ácido graxo e polímeros de alto peso molecular, tais como lipoproteínas, complexos lipopolissacarídeo-proteína e complexos polissacarídeo-proteína-ácido graxo.

[00021]Em certas modalidades, a composição compreende ainda um veículo. O veículo pode ser qualquer veículo adequado conhecido na técnica que permite que as leveduras ou subprodutos de levedura sejam entregues aos locais alvo de uma maneira tal que o produto permaneça viável, ou, no caso de levedura inativa, retenha a atividade dos componentes necessários para ser eficaz.

[00022]Em algumas modalidades, a composição compreende ainda uma fonte de fósforo orgânico e/ou inorgânico. Por exemplo, sementes de linho e amêndoas são fontes comuns de ácido fítico.

[00023]A composição à base de micróbio pode ser formulada como, por exemplo, uma suspensão líquida, uma emulsão, um pó liofilizado ou seco por pulverização, pellets, grânulos, géis, comprimidos, cápsulas e/ou outras formas, dependendo do modo de aplicação e do local de destino. Em certas modalidades, a composição é utilizada na forma líquida com pouco ou nenhum processamento após a coleta do recipiente em que foi cultivada.

[00024]Em certas modalidades, as composições da presente invenção têm vantagens sobre, por exemplo, metabólitos microbianos purificados sozinhos, devido, por exemplo, ao uso de toda a cultura microbiana. Essas vantagens incluem um ou mais dos seguintes: altas concentrações de manoproteína como parte da superfície externa de uma parede celular de levedura; a presença de beta-glucano nas paredes celulares da levedura; a presença de biotensoativos na cultura; e a presença de solventes e outros metabólitos (por exemplo, vitaminas, minerais, carboidratos e fontes de proteína) na cultura. Essas vantagens estão presentes quando se usa levedura ativa ou inativa.

[00025]Em certas modalidades, os micróbios, bem como os metabólitos e outros subprodutos dos micróbios, trabalham sinergicamente uns com os outros.

[00026]Em uma modalidade, a presente invenção fornece métodos de produção de um subproduto do crescimento de um micro-organismo, em que um micro-organismo é cultivado sob condições apropriadas para o crescimento e produção dos subprodutos do crescimento; e, opcionalmente, purificação dos subprodutos. Em algumas modalidades, uma fonte de ácido fítico é incluída no meio de crescimento, como detritos de plantas.

[00027]Em algumas modalidades, o subproduto de crescimento produzido não é purificado, mas, em vez disso, utilizado em uma forma bruta, por exemplo, compreendendo o meio de fermentação no qual foi produzido. Exemplos de subprodutos de crescimento de acordo com a presente invenção incluem enzimas, ácidos, solventes, etanol, proteínas, aminoácidos, biotensoativos e outros. Em modalidades específicas, métodos são fornecidos para a produção de uma composição à base de micróbio compreendendo a enzima fitase.

[00028]A presente invenção fornece ainda métodos de liberação de fósforo, por exemplo, na forma de fosfatos inorgânicos, a partir do ácido fítico presente na matéria orgânica, em que os métodos compreendem aplicar uma quantidade eficaz de uma composição à base de micróbio da presente invenção à matéria orgânica. Os micróbios podem estar vivos (viáveis) ou inativos no momento da aplicação.

[00029]No caso de micro-organismos vivos, os micro- organismos podem crescer in situ no local de aplicação e produzir compostos ativos ou subprodutos de crescimento no local. Consequentemente, uma alta concentração de micro- organismos e subprodutos benéficos do crescimento podem ser alcançados facilmente e continuamente em um local de tratamento.

[00030]Para este fim, os métodos podem compreender adicionar materiais para aumentar o crescimento microbiano durante a aplicação (por exemplo, adicionar nutrientes e/ou prebióticos para promover o crescimento microbiano).

[00031]Em uma modalidade, os métodos compreendem ainda uma etapa de cultivar a composição à base de micróbio antes da aplicação. De preferência, toda ou parte da composição à base de micróbio é cultivada no local de aplicação ou próximo a ele, por exemplo, a menos de 300 milhas do local.

[00032]Vantajosamente, quando a composição é contatada com a matéria orgânica de acordo com os métodos em questão, a fitase produzida por micro-organismos na composição pode reagir com o ácido fítico na matéria orgânica, catalisando a hidrólise do ácido fítico e causando uma liberação de subprodutos de fósforo utilizáveis, por exemplo, na forma de fosfatos inorgânicos, ao longo do tempo.

[00033]Em certas modalidades, a matéria orgânica é matéria residual orgânica, como resíduo de colheita pós- colheita, que pode incluir, por exemplo, sobras de talos de milho, palha de milho, espigas de milho, palha de trigo, palha de soja, casca de arroz e outros caules, folhas, raízes e partes de plantas.

[00034]Outros tipos de matéria orgânica também são previstos, incluindo, por exemplo, matéria vegetal, como nozes, sementes e leguminosas, composto à base de plantas, estrume, sobras de milho, produção de etanol celulósico ou de biomassa (por exemplo, grãos de destilaria, lignina e grãos gastos de cervejeiras), serragem, borra de café usada e resíduos de jardim (por exemplo, árvores, sebes e aparas de grama).

[00035]Em algumas modalidades, a velocidade na qual ocorre a liberação de fosfato pode ser aumentada cortando, esmagando ou de outra forma reduzindo o tamanho de quaisquer pedaços individuais da matéria orgânica antes de aplicar a composição à base de micróbio.

[00036]Em uma modalidade, a composição é derramada, pulverizada ou polvilhada sobre a matéria orgânica e, em seguida, opcionalmente, misturada usando qualquer dispositivo de mistura padrão ou técnica conhecida na arte. Outros componentes também podem ser aplicados, como, por exemplo, água ou nutrientes (por exemplo, nutrientes para o crescimento microbiano e/ou para o crescimento da planta).

[00037]Em uma modalidade, o resíduo orgânico é resíduo de colheita que sobra em um campo de colheita pós-colheita. Conforme os resíduos da colheita se decompõem, os nutrientes necessários para o crescimento das plantas são liberados no solo. A presente invenção pode ser usada para converter formas indisponíveis de fósforo que são liberadas por este processo de decomposição em formas absorvíveis por plantas. Por exemplo, a composição pode ser aplicada diretamente nos resíduos da cultura que são deixados para trás em um campo. Os resíduos e a composição da cultura podem ser deixados na superfície do solo ou podem ser cultivados no solo.

[00038]Em uma modalidade, a composição é adicionada ao composto antes de aplicar o composto a um campo, permitindo que a fitase na composição catalise a hidrólise do ácido fítico e, em seguida, aplique o composto a um campo ou floresta como fertilizante.

[00039]A composição também pode ser aplicada à matéria orgânica que foi coletada de sua fonte e misturada em outro local. A matéria orgânica tratada pode então ser transportada para um local de aplicação desejado, como, por exemplo, um campo de cultivo e usado como, por exemplo, um biofertilizante.

[00040]Em uma modalidade dos métodos em questão, a matéria orgânica é o solo. Aplicando a composição em questão diretamente no solo e misturando a composição no solo ou permitindo que ela se infiltre no solo, o método pode ser usado para enriquecer o solo, reabastecendo-o com estoques de fósforo absorvível pelas plantas. Vantajosamente, os métodos podem aumentar os rendimentos e melhorar a qualidade das colheitas e produtos devido à liberação de fosfatos de fitato ou ácido fítico no solo.

[00041]Em uma modalidade, métodos de aumentar a produção na criação de animais (por exemplo, pecuária ou aquicultura) são fornecidos, em que a composição à base de micróbio é aplicada à água e/ou ração de um animal como um suplemento dietético e/ou auxiliar digestivo. Em uma modalidade, métodos de melhorar a saúde humana são fornecidos, em que a composição à base de micróbio é administrada a um ser humano como um suplemento dietético e/ou auxiliar digestivo. Vantajosamente, a presença de fitase na composição permite o aumento da absorção de fósforo de fontes alimentares que podem conter naturalmente ácido fítico e/ou fosfatos, reduz a quantidade de fosfato inorgânico necessária para complementar a alimentação de um animal e ajuda a prevenir a deficiência de fósforo.

[00042]Em certas modalidades, devido à presença de micro-organismos produtores de bioquímicos vantajosos nas composições à base de micróbio em questão, os métodos em questão também podem ajudar a prevenir que organismos prejudiciais se abriguem em resíduos orgânicos. Por exemplo, esterco e resíduos de colheita em decomposição podem ser atrativos para certas pragas, fungos e bactérias que podem ser prejudiciais às plantas que são cultivadas com o esterco ou resíduo. Leveduras exterminadoras, como Wickerhamomyces anomalus, são capazes de produzir metabólitos que são úteis para controlar muitas dessas pragas indesejadas.

[00043]Os métodos da presente invenção permitem a reciclagem de material orgânico residual, bem como a liberação de vitaminas, minerais e, principalmente, fósforo, que permanecem em determinada matéria orgânica. Além disso, as composições e métodos utilizam componentes que são biodegradáveis e toxicologicamente seguros. Assim, a presente invenção pode ser usada para aumentar a produção na agricultura, silvicultura e criação de animais, bem como melhorar a saúde humana, como um tratamento “verde”.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00044]Em modalidades preferidas, a presente invenção fornece composições à base de micróbio compreendendo micro- organismos cultivados e/ou subprodutos de crescimento microbiano, métodos para a produção dessas composições e métodos de seu uso, por exemplo, na saúde humana, agricultura, silvicultura e pecuária. Geralmente, as composições baseadas em micróbios são capazes de liberar fósforo a partir de matéria orgânica contendo ácido fítico, como, por exemplo, solo, matéria vegetal, resíduo de colheita e esterco. Além disso, as composições à base de micróbio podem ser usadas para aumentar o reflorestamento e o crescimento e a produtividade da colheita. Além disso, as composições podem ser utilizadas como um suplemento dietético para animais e humanos, para, por exemplo, prevenir a deficiência de fósforo, bem como um suplemento de meio de crescimento para cultivo de micro-organismos.

[00045]O micro-organismo da composição à base de micróbio em questão é de preferência uma levedura biologicamente pura capaz de produzir um ou mais subprodutos de crescimento úteis, tais como, por exemplo, uma enzima. De preferência, a enzima é a fitase. Em uma modalidade específica, a levedura é Wickerhamomyces anomalus (Pichia anomala), ou uma levedura intimamente relacionada a ela (por exemplo, pertencente ao mesmo gênero e/ou família).

[00046]A presente invenção fornece ainda métodos de liberação de fosfatos de ácido fítico presente na matéria orgânica, em que os métodos compreendem aplicar uma quantidade eficaz de uma composição à base de micróbio da presente invenção à matéria orgânica. Os micróbios podem estar vivos (viáveis) ou inativos no momento da aplicação. Vantajosamente, quando a composição é contatada com a matéria orgânica de acordo com os métodos em questão, a fitase produzida por micro-organismos na composição pode catalisar a hidrólise do ácido fítico na matéria orgânica, causando uma liberação de subprodutos de fósforo utilizáveis, por exemplo, na forma de fosfatos inorgânicos, ao longo do tempo. Definições Selecionadas

[00047]Conforme usado neste documento, a referência a uma "composição à base de micróbio" significa uma composição que compreende componentes que foram produzidos como resultado do crescimento de micro-organismos ou outras culturas de células. Assim, a composição à base de micróbio pode compreender os próprios micróbios e/ou subprodutos do crescimento microbiano. Os micróbios podem ser planctônicos ou na forma de biofilme, ou uma mistura de ambos. Os subprodutos do crescimento podem ser, por exemplo, metabólitos (por exemplo, biotensoativos, enzimas), componentes da membrana celular, proteínas e/ou outros componentes celulares. Os micróbios podem estar intactos ou lisados. As células podem estar ausentes da composição ou presentes a uma concentração de, por exemplo, pelo menos 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011, 1 x 1012 ou mais CFU por mililitro da composição.

[00048]A presente invenção fornece ainda "produtos à base de micróbio", que são produtos que devem ser aplicados na prática para atingir um resultado desejado. O produto à base de micróbio pode ser simplesmente a composição à base de micróbio colhida do processo de cultivo de micróbio. Alternativamente, o produto à base de micróbio pode compreender outros ingredientes que foram adicionados. Estes ingredientes adicionais podem incluir, por exemplo, estabilizadores, tampões, veículos (por exemplo, soluções de água ou sal), nutrientes adicionados para apoiar o crescimento microbiano, potencializadores de crescimento não nutritivos e/ou agentes que facilitam o rastreamento dos micróbios e/ou a composição no ambiente ao qual é aplicado. O produto à base de micróbio também pode compreender misturas de composições à base de micróbio. O produto à base de micróbio também pode compreender um ou mais componentes de uma composição à base de micróbio que foram processados de alguma forma, tais como, mas não se limitando a, filtragem, centrifugação, lise, secagem, purificação e semelhantes.

[00049]Conforme usado neste documento, "colhido" no contexto de cultivo de um micro-organismo se refere à remoção de parte ou toda a composição à base de micróbio de um vaso de crescimento.

[00050]Conforme usado neste documento, uma molécula ou composto "isolado" ou "purificado" é substancialmente livre de outros compostos, como material celular, com o qual está associado na natureza. Um polinucleotídeo purificado ou isolado (ácido ribonucleico (RNA) ou ácido desoxirribonucleico (DNA)) está livre dos genes ou sequências que o flanqueiam em seu estado de ocorrência natural. Um polipeptídeo purificado ou isolado está livre dos aminoácidos ou sequências que o flanqueiam em seu estado de ocorrência natural.

[00051]Conforme usado aqui, uma “cultura biologicamente pura” é aquela que foi isolada dos materiais com os quais está associada na natureza. Em uma modalidade preferida, a cultura foi isolada de todas as outras células vivas. Em outras modalidades preferidas, a cultura biologicamente pura tem características vantajosas em comparação com uma cultura do mesmo micróbio que existe na natureza. As características vantajosas podem ser, por exemplo, produção melhorada de um ou mais subprodutos de crescimento desejáveis.

[00052]Em certas modalidades, os compostos purificados são pelo menos 60% em peso do composto de interesse. Preferencialmente, a preparação é pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 90%, e mais preferencialmente pelo menos 99%, em peso do composto de interesse. Por exemplo, um composto purificado é aquele que é pelo menos

90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 98%, 99% ou 100% (p/p) do composto desejado em peso. A pureza é medida por qualquer método padrão apropriado, por exemplo, por cromatografia em coluna, cromatografia em camada fina ou análise de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).

[00053]Um "metabólito" se refere a qualquer substância produzida pelo metabolismo (ou seja, um subproduto do crescimento) ou uma substância necessária para participar de um processo metabólico específico. Um metabólito pode ser um composto orgânico que é um material de partida, um intermediário ou um produto final do metabolismo. Exemplos de metabólitos incluem, mas não estão limitados a, biopolímeros, enzimas, ácidos, solventes, álcoois, proteínas, vitaminas, minerais, microelementos, aminoácidos e biotensoativos.

[00054]Conforme usado neste documento, "modular" é intercambiável com alterar (por exemplo, aumentar ou diminuir). Tais alterações são detectadas por métodos conhecidos da técnica padrão, tais como aqueles aqui descritos.

[00055]Faixas fornecidas neste documento são entendidas como uma abreviação para todos os valores dentro da faixa. Por exemplo, uma faixa de 1 a 20 é entendida como incluindo qualquer número, combinação de números ou subfaixa do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, bem como todos os valores decimais intermediários entre os números inteiros acima mencionados, como, por exemplo, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 e 1,9. Com relação a subfaixas, "subfaixas agrupadas" que se estendem de qualquer ponto final da faixa são especificamente contempladas. Por exemplo, uma subfaixa agrupada de uma faixa exemplar de 1 a 50 pode compreender 1 a 10, 1 a 20, 1 a 30 e 1 a 40 em uma direção, ou 50 a 40, 50 a 30, 50 a 20 e 50 a 10 na outra direção.

[00056]Tal como aqui utilizado, "reduz" se refere a uma alteração negativa de pelo menos 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% ou 100% e "aumenta" se refere a uma alteração positiva de pelo menos 1 %, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% ou 100%.

[00057]Conforme usado neste documento, "referência" se refere a um padrão ou condição de controle.

[00058]Conforme usado neste documento, "tensoativo" se refere a um agente tensoativo que reduz a tensão superficial (ou tensão interfacial) entre um líquido e um gás, entre dois líquidos ou entre um líquido e um sólido. Os tensoativos atuam como, por exemplo, detergentes, agentes umectantes, emulsificantes, agentes espumantes e dispersantes. Um “biotensoativo” é um tensoativo produzido por um organismo vivo.

[00059]Tal como aqui utilizado, a referência a "ácido fítico" inclui os termos hexaquisfosfato de inositol, IP6, polifosfato de inositol, fitato e fitina, e quaisquer outros sais e/ou formas da molécula de ácido fítico.

[00060]Conforme usado neste documento, "agricultura" significa o cultivo e reprodução de plantas e/ou fungos para alimentos, fibras, biocombustíveis, medicamentos, cosméticos, suplementos, fins ornamentais e outros usos. De acordo com a invenção em questão, a agricultura também pode incluir horticultura, paisagismo, jardinagem, conservação de plantas, pomar e arboricultura. Ainda incluída na agricultura aqui está a ciência do solo (por exemplo,

pedologia e edafologia), bem como agronomia, ou o cuidado, monitoramento e gerenciamento do solo e da produção de safras.

[00061]Conforme usado neste documento, "gado" se refere a qualquer animal domesticado criado em um ambiente agrícola ou industrial para produzir commodities, como alimentos, fibras e trabalho. A “pecuária” é considerada uma forma de criação de animais, e inclui a reprodução, criação, manutenção e/ou abate desses animais. O gado pode ser produzido ao ar livre, como em campos abertos, fazendas ou em operações de alimentação de animais. Os tipos de animais incluídos no termo gado podem incluir, mas não estão limitados a, alpacas, gado de corte e leite, bisões, porcos, ovelhas, cabras, cavalos, mulas, asnos, cães, camelos, galinhas, perus, patos, gansos, galinha-d'angola e pombinhos.

[00062]Conforme usado neste documento, "aquacultura", "aquicultura", "agricultura aquática", "criação aquática" ou "criação de peixes" é uma forma de criação de animais e inclui a reprodução, criação e coleta de animais aquáticos em uma fazenda de peixes. A aquicultura pode ser intensiva (contando com tecnologia para criar peixes em recintos artificiais em altas densidades) ou extensiva (realizada no oceano, ou em lagos naturais e artificiais, baías, rios, fiordes ou outros corpos d'água). A aquicultura inclui a produção de frutos do mar a partir de peixes de incubação e crustáceos que são cultivados até o tamanho do mercado em recintos, lagoas, tanques, aquários, gaiolas ou canais. Além disso, a aquicultura inclui a maricultura, que envolve o cultivo de organismos marinhos em águas do mar abertas ou seções fechadas de água do mar. Além disso, a aquicultura inclui a restauração ou melhoria de estoque, em que peixes de incubação e crustáceos são soltos na natureza em um esforço para reconstruir populações selvagens ou habitats costeiros. Além disso, a aquicultura inclui a produção de peixes ornamentais para o comércio de aquários, bem como a criação de peixes ornamentais alojados em aquários. As espécies que podem ser cultivadas incluem peixes e crustáceos de água doce ou salgada e podem incluir peixes ornamentais, peixes alimentares, peixes esportivos, peixes isca, crustáceos, moluscos, algas, vegetais marinhos ou ovas de peixe.

[00063]Conforme usado neste documento, uma "piscicultura" é qualquer ambiente aquático em que a aquicultura ocorre ou pode ocorrer. As fazendas de peixes de acordo com esta divulgação podem incluir todos os tipos de ambientes aquáticos ou seções de ambientes aquáticos, sejam artificiais ou de ocorrência natural, incluindo lagoas, valas de irrigação, rios, lagos, oceanos, fiordes, tanques, aquários, gaiolas ou canais adutores.

[00064]Tal como aqui utilizado, uma "praga" é qualquer organismo, diferente de um ser humano, que seja destrutivo, nocivo e/ou prejudicial aos seres humanos ou às preocupações humanas (por exemplo, agricultura, horticultura, pecuária). As pragas podem causar infecções, infestações e/ou doenças. As pragas podem ser organismos únicos ou multicelulares, incluindo, mas não se limitando a, artrópodes, vírus, fungos, bactérias, parasitas, protozoários e/ou nematoides.

[00065]Tal como aqui utilizado, "tratar" se refere a erradicar, reduzir, melhorar, reverter ou prevenir um grau, sinal ou sintoma de uma condição ou um distúrbio e inclui, mas não requer, uma cura completa da condição ou do distúrbio. O tratamento pode curar, melhorar ou melhorar parcialmente um distúrbio.

[00066]Tal como aqui utilizado, "prevenir" uma situação ou ocorrência significa atrasar o início ou a progressão da mesma. Em alguns casos, a prevenção pode não ser absoluta, o que significa que a situação ou ocorrência ainda pode ocorrer, mas com atraso. Composições à base de micróbio

[00067]A presente invenção fornece composições à base de micróbio compreendendo micro-organismos benéficos, bem como um ou mais subprodutos de crescimento microbiano, tais como biotensoativos, metabólitos, ácidos, solventes e/ou enzimas. Além disso, a presente invenção fornece materiais e métodos para a produção de composições à base de micróbio.

[00068]Vantajosamente, as composições à base de micróbio de acordo com a presente invenção são não tóxicas (por exemplo, a toxicidade por ingestão é maior que 5g/kg de peso corporal) e podem ser aplicadas em altas concentrações sem causar irritação e/ou toxicidade para, por exemplo, pele ou aparelho digestivo de um ser humano ou animal.

[00069]Em certas modalidades, os micróbios da presente invenção são leveduras exterminadoras biologicamente puras. Em particular, a presente invenção utiliza leveduras exterminadoras pertencentes ao gênero Pichia. Ainda mais especificamente, em uma modalidade, os micróbios são

Wickerhamomyces anomalus (Pichia anomala). Outras leveduras produtoras de fitase, como Pichia kudriavzevii, P. guilliermondii e P. occidentalis também podem ser utilizadas.

[00070]Em uma modalidade, a composição compreende cerca de 1 x 106 a 1 x 1012, 1 x 107 a 1 x 1011, 1 x 108 a 1 x 1010, ou 1 x 109 CFU/ml do(s) micro-organismo(s).

[00071]Em certas modalidades, a composição à base de micróbio da presente invenção pode compreender caldo de fermentação contendo uma cultura viva e/ou inativa e/ou os metabólitos microbianos produzidos pelo micro-organismo e/ou quaisquer nutrientes residuais. A composição pode ser, por exemplo, pelo menos, em peso, 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% ou 100% de caldo. A quantidade de biomassa na composição, em peso, pode ser, por exemplo, de 0% a 100%, inclusive de todas as porcentagens entre elas, ou, por exemplo, de 5 g/l a 180 g/l ou mais, ou de 10 g/l a 150 g/l.

[00072]O produto da fermentação pode ser usado diretamente sem extração ou purificação. Se desejado, a extração e a purificação podem ser facilmente alcançadas usando métodos ou técnicas de extração e/ou purificação padrão descritos na literatura.

[00073]Em algumas modalidades, a composição compreende ainda a forma bruta adicional ou produtos de crescimento microbiano purificados, como enzimas, biotensoativos, solventes, ácidos, proteínas, minerais e/ou vitaminas. Os metabólitos da forma bruta podem assumir a forma de, por exemplo, uma mistura líquida compreendendo sedimento de metabólito em caldo de fermentação resultante do cultivo de um micróbio. Esta solução de forma bruta pode compreender de cerca de 25% a cerca de 75%, de cerca de 30% a cerca de 70%, de cerca de 35% a cerca de 65%, de cerca de 40% a cerca de 60%, de cerca de 45% a cerca de 55%, ou cerca de 50% de metabólito puro.

[00074]Em modalidades preferidas, a composição compreende uma enzima fosfatase, como a fitase. A fitase catalisa a hidrólise do ácido fítico ou fitato, que é uma forma orgânica de fósforo que libera uma forma de fósforo inorgânico durante a hidrólise. A fitase pode estar presente na composição como resultado do crescimento dos micróbios presentes na composição, ou a fitase pode ser produzida separadamente por outros micro-organismos produtores de fitase e adicionada à composição na forma bruta e/ou na forma purificada.

[00075]Em certas modalidades, a concentração de fitase (ou outra enzima) na composição é de 1 a 10.000 u/ml, de 100 a 9.000 u/ml ou de 200 a 8.000 u/ml.

[00076]Além disso, em uma modalidade, a composição compreende biotensoativos. Os biotensoativos podem estar presentes na composição como resultado do crescimento dos micróbios presentes na composição, ou os biotensoativos podem ser produzidos separadamente por outros micro- organismos e adicionados à composição na forma bruta e/ou na forma purificada.

[00077]Os biotensoativos inibem a adesão microbiana a uma variedade de superfícies, evitam a formação de biofilmes e podem ter propriedades emulsificantes e demulsificantes poderosas. Além disso, os biotensoativos são capazes de reduzir a tensão superficial e interfacial da água, por exemplo, em fazendas de peixes e aquários.

[00078]Em algumas modalidades, os biotensoativos são selecionados a partir de, por exemplo, glicolipídios (por exemplo, soforolipídios, ramnolipídios, lipídios de celobiose, lipídios de manosileritritol e lipídios de trealose), lipopeptídeos (por exemplo, surfactina, iturina, fengicina, artrofactina e liquenisina), por exemplo, cardiolipinas), compostos de éster de ácido graxo e polímeros de alto peso molecular, tais como lipoproteínas, complexos lipopolissacarídeo-proteína e complexos polissacarídeo-proteína-ácido graxo.

[00079]Em certas modalidades, a concentração de um ou mais biotensoativos na composição é de 0,001 a 90% em peso (% em peso), de preferência 0,01 a 50% em peso, e mais preferencialmente 0,1 a 20% em peso. Os biotensoativos podem ainda estar presentes em cerca de 0,01 g/L a cerca de 500 g/L, cerca de 0,5 g/L a cerca de 50,0 g/L, de cerca de 1,0 a cerca de 10,0 g/L ou de cerca de 2,0 a cerca de 5,0 g/L. Formulação de Enriquecimento do Solo

[00080]Em uma modalidade, a composição é preferencialmente formulada para aplicação ao solo, sementes, plantas inteiras ou partes de plantas (incluindo, mas não se limitando a, raízes, tubérculos, caules, flores e folhas). Em certas modalidades, a composição é formulada como, por exemplo, líquido, pó, grânulos, microgrânulos, pellets, pó molhável, pó escoável, emulsões, microcápsulas, óleos ou aerossóis.

[00081]Para melhorar ou estabilizar os efeitos da composição, ela pode ser misturada com adjuvantes adequados e, em seguida, usada como tal ou após diluição, se necessário. Em modalidades preferidas, a composição é formulada como um líquido, um líquido concentrado ou como pó seco ou grânulos que podem ser misturados com água e outros componentes para formar um produto líquido.

[00082]Em uma modalidade, a composição pode compreender glicose (por exemplo, na forma de melaço), glicerol e/ou glicerina, como, ou além de, uma substância osmótica, para promover a pressão osmótica durante o armazenamento e o transporte do produto seco.

[00083]As composições podem ser utilizadas isoladamente ou em combinação com outros compostos e/ou métodos para aumentar de forma eficiente a saúde, o crescimento e/ou os rendimentos das plantas e/ou para complementar o crescimento do primeiro e do segundo micróbios. Por exemplo, em uma modalidade, a composição pode incluir e/ou pode ser aplicada concomitantemente com nutrientes e/ou micronutrientes para aumentar o crescimento da planta e/ou micróbio, como magnésio, fosfato, nitrogênio, potássio, selênio, cálcio, enxofre, ferro, cobre e zinco; e/ou um ou mais prebióticos, tais como extrato de alga marinha, ácido fúlvico, quitina, humato e/ou ácido húmico. Os materiais exatos e as quantidades dos mesmos podem ser determinados por um agricultor ou um cientista agrícola tendo o benefício da divulgação da matéria.

[00084]As composições também podem ser utilizadas em combinação com outros compostos agrícolas e/ou sistemas de gestão de culturas. Em uma modalidade, a composição pode opcionalmente compreender ou ser aplicada com, por exemplo, pesticidas naturais e/ou químicos, repelentes, herbicidas,

fertilizantes, tratamentos de água, tensoativos não iônicos e/ou corretivos de solo. De preferência, no entanto, a composição não compreende e/ou não é usada com benomila, cloreto de dodecil dimetil amônio, dióxido de hidrogênio/ácido peroxiacético, imazilila, propiconazol, tebuconazol ou triflumizol.

[00085]Se a composição for misturada com aditivos químicos compatíveis, os produtos químicos são preferencialmente diluídos com água antes da adição da composição em questão.

[00086]Outros componentes podem ser adicionados à composição, por exemplo, agentes tamponantes, veículos, outras composições à base de micróbio produzidas na mesma instalação ou em instalações diferentes, modificadores de viscosidade, conservantes, nutrientes para o crescimento de micróbios, agentes de rastreamento, biocidas, outros micróbios, tensoativos, agentes emulsionantes, lubrificantes, agentes de controle de solubilidade, agentes de ajuste de pH, conservantes, estabilizantes e agentes resistentes à luz ultravioleta. Formulação de suplemento dietético humano ou animal

[00087]Em certas modalidades, a composição é formulada como um suplemento dietético humano e/ou animal ou auxiliar digestivo.

[00088]Em certas modalidades, o uso da levedura na alimentação fornece fontes ricas em proteínas e/ou polissacarídeos. Em uma modalidade, a composição em questão pode compreender nutrientes adicionais para suplementar uma dieta humana e/ou animal e/ou promover a saúde e/ou bem- estar, como, por exemplo, fontes de aminoácidos (incluindo aminoácidos essenciais), peptídeos, proteínas, vitaminas, microelementos, gorduras, ácidos graxos, lipídios, carboidratos, esteróis, enzimas, prebióticos e minerais.

[00089]As composições preferidas compreendem vitaminas e/ou minerais em qualquer combinação. Vitaminas para uso em uma composição desta invenção podem incluir, por exemplo, vitaminas A, E, K3, D3, B1, B3, B6, B12, C, biotina, ácido fólico, ácido pantotênico, ácido nicotínico, cloreto de colina, inositol e ácido para-amino-benzóico. Os minerais podem incluir, por exemplo, sais de cálcio, cobalto, cobre, ferro, magnésio, potássio, selênio e zinco. Outros componentes podem incluir, mas não estão limitados a, antioxidantes, beta-glucanos, sal biliar, colesterol, enzimas, carotenoides e muitos outros. Vitaminas e minerais típicos são aqueles, por exemplo, recomendados para consumo diário e na quantidade diária recomendada (RDA), embora as quantidades precisas possam variar. A composição incluiria preferencialmente um complexo de vitaminas RDA, minerais e oligoelementos, bem como aqueles nutrientes que não têm RDA estabelecido, mas têm um papel benéfico na fisiologia de mamíferos saudáveis.

[00090]Em algumas modalidades, as fontes de fitato e/ou ácido fítico são pré-misturadas com a composição, de modo que, quando em contato com a fitase na composição, a composição pode fornecer fósforo inorgânico prontamente disponível mediante administração a um indivíduo humano ou animal. As fontes de fitato e/ou ácido fítico podem ser, por exemplo, amêndoas, nozes, sementes de linho, legumes, aveia e grãos inteiros.

[00091]Em uma modalidade, a composição pode compreender ainda ração animal pré-fabricada úmida ou seca, em que o alimento pré-fabricado foi cozido e/ou processado para estar pronto para consumo animal. Por exemplo, o micro- organismo e/ou subprodutos de crescimento podem ser derramados sobre e/ou misturados com o alimento pré- fabricado, ou o micro-organismo e/ou subprodutos de crescimento podem servir como um revestimento do lado de fora de peças de ração animal secas, por exemplo, pedaços, croquetes ou pellets.

[00092]Em uma modalidade, a composição pode compreender ainda ingredientes crus para fazer ração animal, em que os ingredientes crus, juntamente com o micro-organismo e/ou subprodutos de crescimento, são então cozidos e/ou processados para fazer um produto alimentar seco ou úmido aprimorado.

[00093]Em algumas modalidades, a composição compreende ainda prebióticos para apoiar o crescimento de micróbios benéficos no intestino. Os prebióticos podem incluir, por exemplo, fibras fermentáveis derivadas de frutanos e xilanos, inulina, fruto-oligossacarídeos, xilo- oligossacarídeos e galacto-oligossacarídeos. Os alimentos conhecidos por conterem prebióticos incluem, por exemplo, raiz de chicória, cebola, alho, alho-poró, aveia, farelo de trigo, aspargos, folhas de dente-de-leão, alcachofra de Jerusalém e banana.

[00094]Em uma modalidade, a composição pode ser formulada como um produto de consumo oral e administrada por via oral a um animal ou indivíduo humano.

[00095]Produtos de consumo oral de acordo com a invenção são quaisquer preparações ou composições adequadas para consumo, para nutrição, higiene oral ou para prazer, e são produtos destinados a serem introduzidos na cavidade oral humana ou animal, para permanecer lá por um determinado período de vez por outra, para serem engolidos (por exemplo, suplementos, alimentos prontos para consumo) ou para serem removidos da cavidade oral novamente (por exemplo, gomas de mascar ou produtos de higiene oral ou de enxagues bucais). Esses produtos incluem todas as substâncias ou produtos destinados a serem ingeridos por humanos ou animais em um estado processado, semiprocessado ou não processado. Isso também inclui substâncias que são adicionadas a produtos de consumo oral (particularmente produtos alimentícios e farmacêuticos) durante sua produção, tratamento ou processamento e destinadas a serem introduzidas na cavidade oral humana ou animal.

[00096]Os produtos de consumo oral também podem incluir substâncias destinadas a serem engolidas por humanos ou animais e depois digeridas em um estado não modificado, preparado ou processado; os produtos de consumo oral de acordo com a invenção, portanto, também incluem invólucros, revestimentos ou outros encapsulamentos que também se destinam a ser engolidos juntamente com o produto ou para os quais a deglutição é previsível.

[00097]Em certas modalidades, a composição pode compreender ainda componentes que são, por exemplo, fontes de energia, nutrientes e/ou outros suplementos promotores da saúde, aromatizantes, conservantes, ajustadores de pH, adoçantes e/ou corantes.

[00098]Em uma modalidade, a composição é formulada como um pó desidratado ou concentrado que pode ser reconstituído em um fluido potável pela adição de água. Em uma modalidade, a composição é formulada como um smoothie ou milkshake misturado.

[00099]Em uma modalidade, a composição pode ser formulada para administração direta no trato GI. Por exemplo, a composição pode ser formulada para administração ao trato GI inferior proximal via colonoscopia, trato GI inferior distal via enema ou tubos retais e trato GI superior via tubos nasogástricos, tubos duodenais e endoscopia/gastroscopia.

[000100]Em certas modalidades, a presente invenção pode ser usada para melhorar a saúde geral e o bem-estar de um ser humano ou animal, aumentando a absorção de fósforo no trato digestivo humano ou animal. Fermentação de Micro-organismos

[000101]A presente invenção utiliza métodos para cultivar micro-organismos e produzir metabólitos microbianos e/ou subprodutos de crescimento. Mais especificamente, a presente invenção fornece materiais e métodos para a produção de biomassa, metabólitos extracelulares, nutrientes residuais e/ou componentes intracelulares.

[000102]A presente invenção utiliza processos de cultivo que são adequados para cultivo de micro-organismos e produção de metabólitos microbianos em qualquer escala desejada, desde pequena (por exemplo, ambiente de laboratório) a grande (por exemplo, ambiente industrial). Estes processos de cultivo incluem, mas não estão limitados a, cultivo/fermentação submersa, fermentação em estado sólido (SSF) e combinações, híbridos e/ou modificações dos mesmos.

[000103]Tal como aqui utilizado, "fermentação" ou "cultivo" se referem ao crescimento de células sob condições controladas. O crescimento pode ser aeróbio ou anaeróbico.

[000104]O vaso de crescimento de micróbio usado de acordo com a presente invenção pode ser qualquer fermentador ou reator de cultivo para uso industrial. Em uma modalidade, o vaso pode ter controles/sensores funcionais ou pode ser conectado a controles/sensores funcionais para medir fatores importantes no processo de cultivo, como pH, oxigênio, pressão, temperatura, potência do eixo do agitador, umidade, viscosidade e/ou densidade microbiana e/ou concentração de metabólitos.

[000105]O vaso também pode ser capaz de monitorar o crescimento de micro-organismos dentro do vaso (por exemplo, medição do número de células e fases de crescimento). Alternativamente, uma amostra diária pode ser retirada do recipiente e sujeita a enumeração por técnicas conhecidas na arte, como a técnica de diluição em placas.

[000106]Em modalidades preferidas, uma instalação de crescimento de micróbio compreendendo vários vasos de crescimento de micróbio produz micro-organismos frescos de alta densidade e/ou subprodutos de crescimento microbiano de interesse em uma escala desejada. A instalação de crescimento de micróbio pode estar localizada no local de aplicação ou próximo a ela. A instalação produz composições à base de micróbio de alta densidade em cultivo em batelada, quase contínuo ou contínuo.

[000107]As instalações de crescimento de micróbio distribuídas podem estar localizadas no local onde o produto à base de micróbio será usado (por exemplo, um campo ou piscicultura). Por exemplo, a instalação de crescimento de micróbio pode estar a menos de 300, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 15, 10, 5, 3 ou 1 milha do local de uso, ou pode estar localizada diretamente no local de uso.

[000108]Em certas modalidades, a produção pode ou não ser alcançada usando métodos de fermentação local e/ou distribuída, o que significa que métodos convencionais também podem ser utilizados de acordo com a presente invenção. No entanto, instalações de crescimento de micróbios locais e/ou distribuídas, conforme descrito neste documento, fornecem vantajosamente uma solução para o problema atual de depender de produtores de tamanho industrial distantes, cuja qualidade do produto sofre devido a atrasos de processamento a montante, gargalos da cadeia de abastecimento, armazenamento impróprio e outras contingências que inibem a entrega e aplicação oportuna de um produto útil.

[000109]As instalações de crescimento de micróbios produzem composições novas com base em micróbios, compreendendo os próprios micróbios, metabólitos microbianos e/ou outros componentes do caldo em que os micróbios são cultivados. Se desejado, as composições podem ter uma alta densidade de células vegetativas, células inativas, propágulos ou uma mistura de células vegetativas, células inativas e/ou propágulos.

[000110]Vantajosamente, as composições podem ser adaptadas para uso em um local especificado. Em uma modalidade, a instalação de crescimento de micróbio está localizada em, ou perto de, um local onde os produtos à base de micróbio serão usados. As instalações de crescimento de micróbios podem operar fora da rede, utilizando, por exemplo, energia solar, eólica e/ou hidrelétrica.

[000111]As instalações de crescimento de micróbios fornecem versatilidade de fabricação pela capacidade de adaptar os produtos baseados em micróbios para melhorar as sinergias com as geografias de destino. Por exemplo, os sistemas da presente invenção são capazes de aproveitar o poder de micro-organismos locais de ocorrência natural e seus subprodutos metabólicos. Os micróbios locais podem ser identificados com base, por exemplo, na tolerância ao sal, na capacidade de crescer em altas temperaturas e/ou na capacidade de produzir certos metabólitos.

[000112]Como o produto à base de micróbio é gerado no local ou próximo ao local de aplicação, sem a necessidade de estabilização, preservação, armazenamento prolongado e processos de transporte extensivos de produção convencional, uma densidade muito maior de micro-organismos vivos (ou inativos) e/ou seus propágulos podem ser gerados, exigindo assim um volume muito menor do produto à base de micróbio para uso em uma aplicação no local ou permitindo uma densidade muito maior de aplicações microbianas quando necessário. Isso reduz a possibilidade de contaminação por agentes estranhos e micro-organismos indesejáveis, mantém a atividade dos subprodutos do crescimento microbiano e permite um biorreator em escala reduzida eficiente (por exemplo, tanque de fermentação menor e volume menor de materiais iniciais, nutrientes, controle de pH e agente anti-espumante, etc.), sem razão para estabilizar as células. Culturas de micróbios de alta densidade e produzidas localmente são mais eficazes no campo do que aquelas que passaram por estabilização de células vegetativas ou permaneceram na cadeia de abastecimento por algum tempo.

[000113]A geração local do produto à base de micróbio também facilita a inclusão do caldo de fermentação no produto. O caldo pode conter agentes produzidos durante a fermentação que são particularmente adequados para uso local. Isso facilita ainda mais a portabilidade do produto.

[000114]Os tempos de transporte reduzidos permitem a produção e entrega de novos lotes de micróbios e/ou seus metabólitos no tempo e volume exigidos pela demanda local. A produção local e entrega dentro de, por exemplo, 24 horas de fermentação resultam em composições puras de alta densidade celular e custos de transporte substancialmente mais baixos. Dadas as perspectivas de um rápido avanço no desenvolvimento de inoculantes microbianos mais eficazes e poderosos, os consumidores se beneficiarão muito com essa capacidade de fornecer rapidamente produtos à base de micróbio.

[000115]Em uma modalidade, o método de cultivo, seja realizado usando métodos convencionais ou usando sistemas locais ou distribuídos, utiliza um meio de cultura compreendendo melaço, ureia e peptona.

[000116]Em uma modalidade, a concentração de melaço é de 2 a 6%, de preferência 4%. Em uma modalidade, a concentração de ureia é de 0,01 a 1,0%, de preferência

0,2%. Em uma modalidade, a concentração de peptona é de 1,0 a 5%, de preferência 2,5%.

[000117]Em uma modalidade, o método inclui suplementar o cultivo com uma fonte de nitrogênio. A fonte de nitrogênio pode ser, por exemplo, nitrato de potássio, nitrato de amônio, sulfato de amônio, fosfato de amônio, amônia, ureia e/ou cloreto de amônio. Essas fontes de nitrogênio podem ser usadas independentemente ou em uma combinação de duas ou mais.

[000118]O método de cultivo pode fornecer oxigenação à cultura em crescimento. Uma modalidade utiliza o movimento lento do ar para remover o ar contendo pouco oxigênio e introduzir ar oxigenado. O ar oxigenado pode ser ar ambiente suplementado diariamente por meio de mecanismos que incluem impulsores para agitação mecânica do líquido e pulverizadores de ar para fornecer bolhas de gás ao líquido para dissolução do oxigênio no líquido.

[000119]O método pode ainda compreender suplementar o cultivo com uma fonte de carbono. A fonte de carbono é tipicamente um carboidrato, como glicose, sacarose, lactose, frutose, trealose, manose, manitol e/ou maltose; ácidos orgânicos, tais como ácido acético, ácido fumárico, ácido cítrico, ácido propiônico, ácido málico, ácido malônico e/ou ácido pirúvico; álcoois, tais como etanol, propanol, butanol, pentanol, hexanol, isobutanol e/ou glicerol; gorduras e óleos, como óleo de soja, óleo de farelo de arroz, óleo de canola, óleo de girassol, azeite, óleo de milho, óleo de gergelim e/ou óleo de linhaça. Essas fontes de carbono podem ser usadas independentemente ou em uma combinação de duas ou mais.

[000120]Em uma modalidade, fatores de crescimento e nutrientes residuais para micro-organismos são incluídos no meio. Isto é particularmente preferido ao cultivar micróbios que são incapazes de produzir todas as vitaminas de que necessitam. Nutrientes inorgânicos, incluindo oligoelementos, como ferro, zinco, cobre, manganês, molibdênio e/ou cobalto também podem ser incluídos no meio. Além disso, fontes de vitaminas, aminoácidos essenciais e microelementos podem ser incluídos, por exemplo, na forma de farinhas ou refeições, como farinha de milho, ou na forma de extratos, como extrato de levedura, extrato de batata, extrato de carne, extrato de soja, extrato de casca de banana e semelhantes, ou em formas purificadas. Aminoácidos, tais como, por exemplo, aqueles úteis para a biossíntese de proteínas, também podem ser incluídos, por exemplo, L-Alanina.

[000121]Em uma modalidade, sais inorgânicos também podem ser incluídos. Os sais inorgânicos utilizáveis podem ser di-hidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato dipotássico, hidrogenofosfato dissódico, sulfato de magnésio, cloreto de magnésio, sulfato de ferro, cloreto de ferro, sulfato de manganês, cloreto de manganês, sulfato de zinco, cloreto de chumbo, sulfato de cobre, cloreto de cálcio, carbonato de cálcio, e/ou carbonato de sódio. Estes sais inorgânicos podem ser usados independentemente ou em combinação de dois ou mais.

[000122]Em algumas modalidades, o método de cultivo pode compreender ainda a adição de ácidos e/ou agentes antimicrobianos adicionais no meio líquido antes e/ou durante o processo de cultivo. Agentes antimicrobianos ou antibióticos podem ser usados para proteger a cultura contra contaminação. Por exemplo, Streptomyces eritromicina, lúpulo ou ácido de lúpulo e/ou pequenas quantidades, por exemplo, 50 a 100 ppm, de soforolípidos ou outros biotensoativos podem ser adicionados ao meio nutriente como agentes antibacterianos. Além disso, agentes anti-espuma também podem ser adicionados para prevenir a formação e/ou o acúmulo de espuma durante o cultivo.

[000123]O pH da mistura deve ser adequado para o micro- organismo de interesse. Tampões e reguladores de pH, como carbonatos e fosfatos, podem ser usados para estabilizar o pH próximo a um valor preferido. O controle de pH também pode ser usado para prevenir a contaminação da cultura. Por exemplo, o cultivo pode ser iniciado em pH baixo que é adequado para o crescimento da levedura (por exemplo, 3,0 a 3,5) e, em seguida, aumentado após o acúmulo de levedura (por exemplo, para 4,5 a 5,0) e estabilizado para o restante da fermentação. Quando os íons metálicos estão presentes em altas concentrações, pode ser necessário o uso de um agente quelante no meio líquido.

[000124]Os micróbios podem ser cultivados na forma planctônica ou como biofilme. No caso do biofilme, o vaso pode ter dentro dele um substrato sobre o qual os micróbios podem crescer em um estado de biofilme. O sistema também pode ter, por exemplo, a capacidade de aplicar estímulos (como tensão de cisalhamento) que estimula e/ou melhora as características de crescimento do biofilme.

[000125]Em uma modalidade, o método para cultivo de micro-organismos é realizado em cerca de 5 a cerca de 100°C, de preferência, 15 a 60°C, mais preferencialmente,

25 a 50°C. Em uma outra modalidade, o cultivo pode ser realizado continuamente a uma temperatura constante. Em outra modalidade, o cultivo pode estar sujeito a mudanças de temperatura.

[000126]Em uma modalidade, o equipamento usado no método e processo de cultivo é estéril. O equipamento de cultivo, como o reator/recipiente, pode ser separado, mas conectado a, uma unidade de esterilização, por exemplo, um autoclave. O equipamento de cultivo também pode ter uma unidade de esterilização que esteriliza in situ antes de iniciar a inoculação. O ar pode ser esterilizado por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o ar ambiente pode passar por pelo menos um filtro antes de ser introduzido no vaso. Em outras modalidades, o meio pode ser pasteurizado ou, opcionalmente, nenhum calor adicionado, onde o uso de baixa atividade de água e baixo pH pode ser explorado para controlar o crescimento bacteriano.

[000127]Em outras modalidades, o sistema de cultivo pode ser autoesterilizante, o que significa que o organismo sendo cultivado é capaz de prevenir a contaminação de outros organismos devido à produção de subprodutos de crescimento antimicrobianos ou metabólitos.

[000128]Em uma modalidade, tensoativos, enzimas, metabólitos e/ou outras proteínas são produzidos pelo cultivo de uma cepa de micróbio da presente invenção sob condições apropriadas para o crescimento e produção dos mesmos; e, opcionalmente, concentrar e purificar o subproduto do crescimento microbiano de interesse. Em modalidades preferidas, o subproduto do crescimento é uma enzima, ainda mais preferencialmente, fitase.

[000129]O subproduto do crescimento microbiano produzido pelos micro-organismos de interesse pode ser retido nos micro-organismos ou segregado no meio de crescimento. Opcionalmente, o meio de crescimento pode conter compostos que estabilizam a atividade do subproduto de crescimento microbiano.

[000130]O teor de biomassa do caldo de fermentação pode ser, por exemplo, de 5 g/l a 180 g/l ou mais, ou de 10 g/l a 150 g/l.

[000131]Quando é hora de colher o produto à base de micróbio do vaso ou vasos de crescimento, os micróbios e/ou caldo resultante do crescimento microbiano podem ser removidos do vaso de crescimento e transferidos por meio de, por exemplo, tubulação para uso imediato. Os micro- organismos podem estar em uma forma ativa ou inativa, ou podem conter uma combinação de micro-organismos ativos e inativos.

[000132]A composição (micróbios, caldo ou micróbios e caldo) também pode ser colocada em recipientes de tamanho apropriado, levando em consideração, por exemplo, o uso pretendido, o método de aplicação contemplado, o tamanho do tanque de fermentação e qualquer modo de transporte da instalação de crescimento de micróbios até o local de uso. Assim, os recipientes nos quais a composição à base de micróbio é colocada podem ser, por exemplo, de 1 galão a

1.000 galões ou mais. Em certas modalidades, os recipientes são de 2 galões, 5 galões, 25 galões ou maiores.

[000133]Outros componentes podem ser adicionados conforme o produto colhido é colocado em recipientes e/ou encanado (ou de outra forma transportado para uso). Os aditivos podem ser, por exemplo, tampões, veículos, outras composições à base de micróbio produzidas na mesma ou em instalações diferentes, modificadores de viscosidade, conservantes, nutrientes para o crescimento de micróbios, agentes de rastreamento, pesticidas e outros ingredientes específicos para um uso pretendido.

[000134]Em uma modalidade, toda a composição de cultivo microbiana é removida após a conclusão do cultivo (por exemplo, após, por exemplo, atingir uma densidade celular desejada, ou densidade de um metabólito especificado no caldo). Neste procedimento em batelada, uma batelada inteiramente nova é iniciada após a colheita da primeira batelada.

[000135]Em outra modalidade, apenas uma parte do produto de fermentação é removida a qualquer momento. Nesta modalidade, a biomassa com células viáveis permanece no vaso como um inoculante para um novo lote de cultivo. A composição que é removida pode ser um caldo livre de células ou pode conter células. Desta forma, um sistema quase contínuo é criado. Preparação de produtos à base de micróbio

[000136]Um produto à base de micróbio da presente invenção é simplesmente o caldo de fermentação contendo o micro-organismo e/ou os metabólitos microbianos produzidos pelo micro-organismo e/ou quaisquer nutrientes residuais. O produto da fermentação pode ser usado diretamente sem extração ou purificação. Se desejado, a extração e purificação podem ser facilmente alcançadas usando métodos ou técnicas de extração e/ou purificação padrão descritos na literatura.

[000137]Os micro-organismos no produto à base de micróbio podem estar em uma forma ativa ou inativa. Os produtos à base de micróbio podem conter combinações de micro-organismos ativos e inativos.

[000138]Os produtos à base de micróbio podem ser usados sem estabilização, preservação e armazenamento adicionais. Vantajosamente, o uso direto desses produtos à base de micróbio preserva uma alta viabilidade dos micro- organismos, reduz a possibilidade de contaminação por agentes estranhos e micro-organismos indesejáveis e mantém a atividade dos subprodutos do crescimento microbiano.

[000139]Os micróbios e/ou caldo resultantes do crescimento microbiano podem ser removidos do vaso de crescimento e transferidos por meio de, por exemplo, tubulação para uso imediato. Em outras modalidades, conforme descrito anteriormente, a composição (micróbios, caldo ou micróbios e caldo) pode ser colocada em recipientes de tamanho apropriado.

[000140]Após a colheita da composição à base de micróbio dos vasos de crescimento, outros componentes podem ser adicionados conforme o produto colhido é colocado em recipientes e/ou encanado (ou de outra forma transportado para uso). Os aditivos podem ser, por exemplo, agentes tamponantes, veículos, adjuvantes, outras composições à base de micróbio produzidas na mesma ou em instalações diferentes, modificadores de viscosidade, conservantes, nutrientes para o crescimento de micróbios, agentes de rastreamento, biocidas, outros micróbios, tensoativos não biológicos, agentes emulsionantes, lubrificantes, agentes tamponantes, agentes de controle de solubilidade, agentes de ajuste de pH, estabilizadores, agentes resistentes à luz ultravioleta e outros ingredientes específicos para um uso pretendido.

[000141]Em uma modalidade, a composição pode ainda compreender agentes tamponantes incluindo compostos orgânicos e aminoácidos ou seus sais, para estabilizar o pH próximo a um valor preferido. O pH da composição à base de micróbio deve ser adequado para o micro-organismo de interesse.

[000142]Os tampões adequados incluem, mas não estão limitados a, citrato, gluconato, tartarato, malato, acetato, lactato, oxalato, aspartato, malonato, glucoheptonato, piruvato, galactarato, glucarato, tartronato, glutamato, glicina, lisina, glutamina, metionina, cisteína, arginina e misturas dos mesmos. Ácidos fosfóricos e de fósforo ou sais dos mesmos também podem ser usados. Tampões sintéticos são adequados para serem usados, mas é preferível usar tampões naturais, tais como compostos orgânicos e aminoácidos ou sais dos mesmos.

[000143]Em outra modalidade, os agentes de ajuste de pH incluem hidróxido de potássio, hidróxido de amônio, carbonato ou bicarbonato de potássio, ácido clorídrico, ácido nítrico, ácido sulfúrico e misturas dos mesmos.

[000144]Em uma modalidade, componentes adicionais, como uma preparação aquosa de um sal, como bicarbonato ou carbonato de sódio, sulfato de sódio, fosfato de sódio ou bifosfato de sódio, podem ser incluídos na composição à base de micróbio.

[000145]Vantajosamente, o produto à base de micróbio pode compreender caldo no qual os micróbios cresceram. O produto pode ser, por exemplo, pelo menos, 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% ou 100% em peso de caldo. A quantidade de biomassa no produto, pode ser, por exemplo, de 0% a 100% em peso, inclusive de todas as porcentagens entre eles.

[000146]Em certas modalidades, a composição à base de micróbio da presente invenção compreende ainda um veículo. O veículo pode ser qualquer veículo adequado conhecido na técnica que permite que as leveduras ou subprodutos de crescimento de leveduras sejam entregues a plantas, solo, animais, peixes, etc., de modo que o produto permaneça viável, ou, no caso de levedura inativa, retém os componentes necessários para ser eficaz.

[000147]Os veículos podem ser constituídos por materiais secos de base sólida para formulação em comprimidos, cápsulas, grânulos ou em pó; ou o veículo pode ser constituído por materiais líquidos ou à base de gel para formulações em formas líquidas ou de gel. Por exemplo, os veículos podem compreender água, solução salina, biopolímeros, fibras vegetais naturais, materiais como argila, silagem, vermiculita, pedra-pomes ou lama de papel.

[000148]Em certas modalidades, particularmente no contexto da agricultura, a composição à base de micróbio pode compreender ainda um adjuvante para aumentar a eficácia da composição. Em uma modalidade, o adjuvante é selecionado a partir de um ou mais de extrato de alga marinha, quitina, ácido fúlvico, ácido húmico e humato.

[000149]Opcionalmente, a composição pode ser armazenada antes do uso. O tempo de armazenamento é preferencialmente curto. Assim, o tempo de armazenamento pode ser inferior a 60 dias, 45 dias, 30 dias, 20 dias, 15 dias, 10 dias, 7 dias, 5 dias, 3 dias, 2 dias, 1 dia ou 12 horas. Em uma modalidade preferida, se células vivas estiverem presentes no produto, o produto é armazenado a uma temperatura fria, como, por exemplo, menos de 20 °C, 15 °C, 10 °C ou 5 °C. Por outro lado, uma composição de biotensoativo pode ser tipicamente armazenada à temperatura ambiente.

[000150]Em certas modalidades, os produtos à base de micróbio da presente invenção têm vantagens sobre, por exemplo, metabólitos microbianos purificados sozinhos, devido, por exemplo, ao uso de toda a cultura microbiana. Essas vantagens incluem um ou mais dos seguintes: altas concentrações de manoproteína como parte da superfície externa de uma parede celular de levedura; a presença de beta-glucano nas paredes celulares da levedura; a presença de biotensoativos na cultura; e a presença de solventes e outros metabólitos na cultura. Essas vantagens estão presentes quando se usa levedura ativa ou inativa.

[000151]A composição à base de micróbio pode ser formulada como um produto à base de micróbio na forma de, por exemplo, uma suspensão líquida, emulsão, pó liofilizado ou seco por pulverização, grânulos, pellets ou um gel. De preferência, a composição é utilizada na forma líquida, embora outras formulações sejam consideradas como apropriadas para uma aplicação particular.

[000152]Em uma modalidade, particularmente para uso em aplicações de gado ou aquicultura, o produto à base de micróbio pode ser formulado como um grânulo de alimentação compreendendo concentrações uniformes da composição à base de micróbio por grânulo. Os métodos conhecidos na técnica para a produção de pellets de ração podem ser usados para produzi-los, incluindo moagem pressurizada. De preferência, o processo de peletização é peletização "fria" ou um processo que não usa alto calor ou vapor.

[000153]Em uma modalidade, particularmente para uso em aplicações aquáticas, cepas de micróbio são cultivadas com o propósito de produzir uma composição à base de micróbio inativa. A composição é preparada cultivando o micro- organismo desejado, inativando o micróbio por microfluidização (ou por qualquer outro método conhecido na técnica para não causar desnaturação da proteína), pasteurizando e adicionando-a ao alimento na forma concentrada. Em uma modalidade, a inativação ocorre na temperatura de pasteurização (até 65 a 70°C por um período de tempo suficiente para inativar 100% das células de levedura) e aumentar o valor do pH até cerca de 10,0. Isso induz a hidrólise parcial das células e permite a liberação de alguns componentes nutricionais das mesmas. Em seguida, a composição é neutralizada a um pH de cerca de 7,0 a 7,5 e os vários componentes da hidrólise são misturados. O produto à base de micróbio resultante pode então ser usado, por exemplo, para alimentação de peixes e tratamento de água de piscicultura.

[000154]Os produtos à base de micróbio da presente invenção são particularmente vantajosos em comparação com produtos tradicionais em que as células foram separadas de metabólitos e nutrientes presentes no meio de crescimento de fermentação. Cepas microbianas cultivadas de acordo com a presente invenção

[000155]Os micro-organismos cultivados de acordo com os sistemas e métodos da presente invenção podem ser, por exemplo, bactérias, leveduras e/ou fungos. Esses micro- organismos podem ser micro-organismos naturais ou geneticamente modificados. Por exemplo, os micro-organismos podem ser transformados com genes específicos para exibir características específicas. Os micro-organismos também podem ser mutantes de uma cepa desejada. Tal como aqui utilizado, "mutante" significa uma cepa, variante genética ou subtipo de um micro-organismo de referência, em que o mutante tem uma ou mais variações genéticas (por exemplo, uma mutação pontual, mutação missense, mutação nonsense, deleção, duplicação, mutação frameshift ou expansão de repetição) em comparação com o micro-organismo de referência. Os procedimentos para fazer mutantes são bem conhecidos na técnica microbiológica. Por exemplo, mutagênese UV e nitrosoguanidina são amplamente utilizadas para esse fim.

[000156]Em modalidades preferidas, o micro-organismo não é geneticamente modificado.

[000157]Em certas modalidades preferidas, o micro- organismo é qualquer levedura conhecida como "levedura exterminadora". Tal como aqui utilizado, "levedura exterminadora" significa uma cepa de levedura caracterizada por sua secreção de proteínas ou glicoproteínas tóxicas, às quais a própria cepa é imune. Essas leveduras podem incluir, mas não estão limitadas a, Wickerhamomyces (por exemplo, W. anomalus), Pichia (por exemplo, P. anomala, P. guilliermondii, P. occidentalis, P. kudriavzevii), Hansenula, Saccharomyces, Hanseniaspora, (por exemplo, H. uvarum), Debaryomyces (por exemplo, D. hansenii), Candida,

Cryptococcus, Kluyveromyces, Torulopsis, Ustilago (por exemplo, U. maydis), Williopsis, Zygosaccharomyces (por exemplo, Z. bailii) e outros.

[000158]Em uma modalidade específica, a presente invenção utiliza leveduras exterminadoras produtoras de fitase. Ainda mais especificamente, os micróbios da presente invenção incluem Wickerhamomyces anomalus (Pichia anomala).

[000159]Estas leveduras têm várias características benéficas úteis para a presente invenção, incluindo a sua capacidade para produzir metabolitos vantajosos. Por exemplo, W. anomalus é capaz de atividade de exo-β-1,3- glucanase, tornando-a capaz de controlar ou inibir o crescimento de um amplo espectro de fungos patogênicos. Além disso, se cultivado por 5 a 7 dias, W. anomalus produz biotensoativos glicolipídicos que são capazes de reduzir a tensão superficial/interfacial da água, além de exibir propriedades antimicrobianas e antifúngicas.

[000160]Além de vários subprodutos, essas leveduras são capazes de produzir fitase e fornecer uma série de proteínas (contendo até 50% da biomassa celular seca), lipídios e fontes de carbono, bem como um espectro completo de minerais e vitaminas (B1; B2; B3 (PP); B5; B7 (H); B6; E).

[000161]Outras cepas microbianas incluindo, por exemplo, outras cepas microbianas capazes de acumular quantidades significativas de, por exemplo, enzimas (particularmente fitase), ácidos, proteínas, biotensoativos, minerais ou vitaminas que são úteis no aumento da produção na saúde humana, agricultura,

horticultura, paisagismo, silvicultura, pecuária e aquicultura, também podem ser usados de acordo com a presente invenção. Em algumas modalidades, outros membros dos clados Pichia e/ou Wickerhamomyces são utilizados, por exemplo, P. anomala, P. guilliermondii, P. occidentalis e/ou P. kudriavzevii. Métodos de liberação de fosfatos de matéria orgânica

[000162]Em certas modalidades, a invenção em questão fornece materiais e métodos ecológicos e econômicos para a liberação de fosfatos de matéria orgânica contendo ácido fítico. Em uma modalidade, métodos também são fornecidos para enriquecer o solo para aumentar o crescimento da colheita e os rendimentos utilizando as composições da presente invenção. Em outra modalidade, métodos são fornecidos para alimentar gado e/ou peixes de criação utilizando composições da presente invenção. Em ainda outra modalidade, métodos são fornecidos para melhorar a saúde de um indivíduo humano utilizando composições da presente invenção.

[000163]Os métodos permitem a reciclagem de resíduos orgânicos, bem como a liberação de vitaminas, minerais e, principalmente, fósforo, que ali permanecem. Além disso, as composições e métodos utilizam componentes que são biodegradáveis e toxicologicamente seguros. Assim, a presente invenção pode ser usada para aumentar a produção na agricultura, silvicultura e pecuária, bem como para melhorar a saúde humana, como um tratamento “verde”.

[000164]Em certas modalidades, os métodos em questão são usados para a liberação de fosfatos de ácido fítico presente na matéria orgânica, em que os métodos compreendem a aplicação de uma quantidade eficaz de uma composição à base de micróbio da invenção em questão à matéria orgânica. Outros componentes também podem ser aplicados, como, por exemplo, água ou outros nutrientes (por exemplo, nutrientes e/ou prebióticos). Os micróbios podem estar vivos (viáveis) ou inativos no momento da aplicação.

[000165]No caso de micro-organismos vivos, os micro- organismos podem crescer in situ no local de aplicação e produzir quaisquer compostos ativos ou subprodutos de crescimento no local. Consequentemente, uma alta concentração de micro-organismos e subprodutos benéficos do crescimento podem ser alcançados facilmente e continuamente em um local de tratamento.

[000166]Para este fim, os métodos podem compreender adicionar materiais para aumentar o crescimento microbiano durante a aplicação (por exemplo, adicionar nutrientes para promover o crescimento microbiano).

[000167]Em uma modalidade, os métodos compreendem ainda uma etapa de cultivar a composição à base de micróbio antes da aplicação. De preferência, toda ou parte da composição à base de micróbio é cultivada no local de aplicação ou próximo a ele, por exemplo, a menos de 300 milhas do local.

[000168]Tal como aqui utilizado, "aplicar" uma composição ou produto a um alvo ou local, ou "tratar" um alvo ou local se refere ao contato de uma composição ou produto com um alvo ou local de modo que a composição ou produto possa ter um efeito sobre o mesmo. O efeito pode ser devido, por exemplo, ao crescimento microbiano e/ou à ação de um metabólito, enzima, biotensoativo ou outro subproduto do crescimento. Vantajosamente, quando a composição da presente invenção é contatada com matéria orgânica de acordo com os métodos em questão, a fitase na composição pode catalisar a hidrólise do fitato ou ácido fítico na matéria orgânica, causando uma liberação de subprodutos de fósforo que são absorvíveis por plantas, humanos e animais, por exemplo, na forma de fosfatos inorgânicos.

[000169]Em uma modalidade, a aplicação da composição à base de micróbio em questão compreende derramar, pulverizar ou borrifar a composição sobre a matéria orgânica e, em seguida, opcionalmente, misturar a composição com a matéria orgânica usando qualquer dispositivo de mistura padrão ou técnica conhecida na arte.

[000170]Em uma modalidade, a composição à base de micróbio em questão pode ser aplicada à matéria orgânica que foi coletada de sua fonte e misturada em outro local. A matéria orgânica tratada pode então ser transportada para um local de aplicação desejado, como, por exemplo, um campo de cultivo e usado como, por exemplo, um biofertilizante.

[000171]Em certas modalidades, a matéria orgânica que é tratada de acordo com os métodos em questão é matéria residual orgânica, como resíduo de colheita pós-colheita, que pode incluir, por exemplo, sobras de talos de milho, palha de milho, espigas de milho, palha de trigo, palha de soja, cascas de arroz e outros caules, folhas, raízes e partes de plantas. Outros tipos de resíduos orgânicos também são previstos, incluindo, por exemplo, composto de base vegetal, estrume, sobras de milho, produção de etanol celulósico ou de biomassa (por exemplo, grãos de destilaria, lignina e grãos gastos de cervejeiras),

serragem, borra de café e resíduos de jardim (por exemplo, árvores, sebes e aparas de grama).

[000172]Em certas modalidades, a matéria orgânica que é tratada de acordo com os métodos em questão é matéria vegetal contendo fitato ou ácido fítico. Por exemplo, a matéria orgânica da planta pode ser sementes (por exemplo, linhaça, semente de linho, semente de colza, soja e sementes de girassol), batatas, grãos (por exemplo, trigo, arroz, farelo, cevada, milho, centeio e aveia), leguminosas (por exemplo, feijão carioca, feijão roxo, feijão branco e amendoim) ou nozes (por exemplo, amêndoas, castanhas-do- pará, avelãs e nozes).

[000173]Em algumas modalidades, a velocidade na qual ocorre a liberação de fosfato pode ser aumentada cortando, esmagando ou de outra forma reduzindo o tamanho de quaisquer pedaços individuais da matéria orgânica antes de aplicar a composição à base de micróbio.

[000174]Em uma modalidade, a matéria orgânica é resíduo de colheita que sobra em um campo de colheita pós-colheita. Conforme os resíduos da colheita se decompõem, os nutrientes necessários para o crescimento das plantas são liberados no solo. A presente invenção pode ser usada para converter formas indisponíveis de fósforo que são liberadas por este processo de decomposição em formas absorvíveis por plantas. Por exemplo, a composição pode ser aplicada diretamente nos resíduos da cultura que são deixados para trás em um campo. Os resíduos e a composição da cultura podem ser deixados na superfície do solo ou podem ser cultivados no solo.

[000175]Em uma modalidade dos métodos em questão, a matéria orgânica é o solo. A composição à base de micróbio da presente invenção pode ser aplicada diretamente ao solo, ou a matéria orgânica que foi pré-tratada com a composição à base de micróbio pode ser aplicada ao solo. Opcionalmente, a composição e/ou a matéria orgânica pré- tratada pode ser misturada ao solo, por exemplo, por cultivo, ou a composição pode ser deixada percolar no solo sem mistura.

[000176]Em certas modalidades, a composição é aplicada à superfície do solo sem incorporação mecânica. O efeito benéfico da aplicação no solo pode ser ativado por chuva, aspersão, inundação ou irrigação por gotejamento e, posteriormente, entregue, por exemplo, às raízes das plantas.

[000177]Em uma modalidade, o método pode melhorar a saúde, o crescimento e/ou os rendimentos da planta, melhorando a saúde e o crescimento da raiz. Mais especificamente, em uma modalidade, os métodos podem ser usados para melhorar as propriedades da rizosfera na qual as raízes de uma planta estão crescendo, por exemplo, as propriedades de retenção de nutrientes e/ou umidade.

[000178]Além disso, em uma modalidade, o método pode ser usado para inocular uma rizosfera com um ou mais micro- organismos benéficos. Por exemplo, em modalidades preferidas, os micróbios da composição em questão podem colonizar a rizosfera e fornecer vários benefícios para a planta cujas raízes estão crescendo nela, incluindo proteção e nutrição.

[000179]As plantas e/ou seus ambientes podem ser tratados em qualquer ponto durante o processo de cultivo da planta. Por exemplo, a composição pode ser aplicada ao solo antes, simultaneamente ou após o momento em que as sementes são plantadas nele. Também pode ser aplicado em qualquer ponto posterior durante o desenvolvimento e crescimento da planta, incluindo quando a planta está em floração, frutificação e durante e/ou após a abscisão das folhas.

[000180]Em uma modalidade, o método pode ser usado em uma silvicultura em grande escala e/ou ambiente agrícola. O método pode compreender a administração da composição em um tanque conectado a um sistema de irrigação usado para fornecer água, fertilizantes ou outras composições líquidas a uma cultura, floresta, pasto, pomar ou campo. Assim, a planta e/ou o solo ao redor da planta podem ser tratados com a composição de tratamento do solo via, por exemplo, injeção de solo, encharcamento do solo ou usando um sistema de irrigação de pivô central, ou com um spray sobre o sulco de semente, ou com aspersores ou irrigadores por gotejamento. Vantajosamente, o método é adequado para tratar centenas de acres de plantações, florestas, pastagens, pomares ou campos de uma só vez.

[000181]Em uma modalidade, o método pode ser usado em uma configuração de escala menor, como em um jardim doméstico, em paisagismo municipal ou em uma estufa. Em tais casos, o método pode compreender a aplicação usando sistemas de irrigação, um gramado portátil e um pulverizador de jardim e/ou um regador portátil padrão.

[000182]Vantajosamente, os métodos em questão podem: promover a germinação de sementes; aumentar a sobrevivência de mudas e árvores jovens em reflorestamento e paisagismo; aumentar o rendimento das colheitas; e melhorar a qualidade dos produtos e vegetais cultivados neste solo enriquecido devido, por exemplo, à presença de metabólitos microbianos benéficos, como fitase, aminoácidos, proteínas, vitaminas e microelementos. Além disso, o aumento do crescimento e da saúde das plantas é um meio importante de reduzir os níveis de carbono atmosférico, uma vez que o aumento da biomassa vegetal (bem como da biomassa microbiana do solo associada) sequestra níveis elevados de carbono. Além disso, a presença de fitase no ambiente de cultivo de uma planta (por exemplo, solo) permite o tratamento e/ou prevenção da deficiência de fósforo nas plantas.

[000183]Em certas modalidades, devido à presença de micro-organismos produtores de agentes bioquímicos vantajosos nas composições à base de micróbio em questão, os métodos em questão também podem ajudar a prevenir que organismos prejudiciais se abriguem em resíduos orgânicos. Por exemplo, esterco e resíduos de colheita em decomposição podem ser atrativos para certas pragas, fungos e bactérias que podem ser prejudiciais às plantas que são cultivadas com o esterco ou o resíduo. Leveduras exterminadoras, como Wickerhamomyces anomalus, são capazes de produzir metabólitos que são úteis para controlar muitas dessas pragas indesejadas.

[000184]Em uma modalidade, métodos de aumentar a produção na criação de animais (por exemplo, pecuária ou aquicultura) são fornecidos, em que a composição à base de micróbio é formulada com, ou aplicada a, ração animal ou água potável como suplemento dietético e/ou um auxiliar digestivo. Como suplemento alimentar e/ou auxiliar digestivo, os produtos à base de micróbio podem fornecer,

entre outros benefícios, fontes de aminoácidos, proteínas, vitaminas e microelementos, além de auxiliar na absorção de fósforo no trato digestivo de um animal devido à presença de fitase.

[000185]No caso do gado, a composição à base de micróbio pode ser introduzida em comedouros juntamente com a ração tradicional para gado, e os animais podem então ingerir a composição. Em uma modalidade, a composição pode ser misturada com os componentes da alimentação e formulada em pellets uniformes e homogeneizados.

[000186]No caso de peixes de viveiro, a composição pode ser aplicada ao ambiente de um peixe, como a água da piscicultura, na forma de, por exemplo, uma solução líquida ou como pó seco, farinha ou flocos ou pellets de ração.

[000187]Em uma modalidade, são fornecidos métodos para melhorar a saúde humana, em que a composição à base de micróbio é administrada a um indivíduo humano como um suplemento dietético e/ou um auxiliar digestivo. Em modalidades preferidas, a composição é administrada por via oral.

[000188]Como suplemento dietético e/ou auxiliar digestivo, as composições e métodos podem fornecer, entre outros benefícios, fontes de aminoácidos, proteínas, vitaminas e microelementos, além de auxiliar na absorção de fósforo no trato digestivo do indivíduo devido à presença de fitase. Além disso, as composições podem ajudar a prevenir que o ácido fítico prejudique a absorção de minerais, como, por exemplo, magnésio, cálcio, zinco, ferro, manganês, cobre e/ou molibdênio, pelo trato digestivo do indivíduo, evitando assim as deficiências desses minerais.

[000189]Vantajosamente, quando um ser humano ou animal ingere a composição, a presença de fitase na composição permite um maior crescimento e saúde, por exemplo, aumentando a absorção de fósforo de fontes alimentares que podem conter naturalmente fosfatos e/ou ácido fítico; reduzindo a quantidade de fosfato inorgânico necessária para complementar a alimentação; e ajudando a tratar e/ou prevenir a deficiência de fósforo e/ou outras deficiências minerais relacionadas à ingestão de ácido fítico.

EXEMPLOS

[000190]Uma melhor compreensão da presente invenção e das suas muitas vantagens pode ser obtida a partir dos seguintes exemplos, dados a título de ilustração. Os exemplos a seguir são ilustrativos de alguns dos métodos, aplicações, modalidades e variantes da presente invenção. Eles não devem ser considerados como limitativos da invenção. Numerosas mudanças e modificações podem ser feitas em relação à invenção. EXEMPLO 1 - FERMENTAÇÃO DE LEVEDURA PARA PRODUÇÃO DE FITASE

[000191]Um produto de fermentação de levedura resultante do cultivo de leveduras, por exemplo, Wickerhamomyces anomalus (Pichia anomala), pode ser útil para liberar fósforo de matéria orgânica contendo ácido fítico ou fitato.

[000192]O caldo de fermentação após 48 a 72 horas de cultivo de W. anomalus a 25 a 30°C pode conter a suspensão de células de levedura e até, por exemplo, 9.000 u/mL de fitase, bem como outros subprodutos de crescimento de levedura e componentes de células. As células podem ser separadas do meio líquido ou nele mantidas.

[000193]O produto da fermentação de levedura (meio líquido com fitase e, opcionalmente, células de levedura vivas ou inativas) pode ser aplicado diretamente à matéria orgânica, solo, raízes de plantas, água, ração animal e/ou suplementos dietéticos. Ele pode ser usado diretamente na colheita ou armazenado e transportado para um local de tratamento desejado. Vantajosamente, os métodos em questão podem ser úteis para, por exemplo, conservação de fósforo e para resolver o esgotamento de fósforo no meio ambiente. EXEMPLO 2 - CÁLCULO DA PRODUÇÃO DE FITASE USANDO

WICKERHAMOMYCES ANOMALUS

[000194]Wickerhamomyces anomalus foi cultivada em um reator de fermentação a um pH ajustado para 5,0 por 72 horas com o seguinte meio de crescimento: melaço (2,0 a 5,0%, ou 3,0 a 4,0%), ureia (0,1 a 1,3%, ou 0,15 a 0,2%), peptona (2,0 a 3,0% ou 2,2 a 2,5%). A produção microbiana típica de fitase usando outros micro-organismos e/ou usando outras formulações de meio de crescimento resulta em concentrações mais baixas de fitase, cerca de 300 a 500 u/ml.

[000195]O ácido fítico foi retirado das sementes de gergelim quebrando/esmagando as sementes. As partes da semente (5g) foram então adicionadas a 10 mL de água e misturadas. O meio e as células foram testados quanto à presença de fitase. Tampão de glicina 0,2 M foi usado para ajustar o pH a 4 e o pH do ácido fítico também foi ajustado a 4.

[000196]Após 3 dias, a atividade da fitase foi medida preparando 6 padrões diferentes:

0) 550 microlitros de água 1) 10 microlitros de fosfato de potássio 50 mM e 540 microlitros de água 2) 20 microlitros de fosfato de potássio 50 mM e 530 microlitros de água 3) 30 microlitros de fosfato de potássio 50 mM e 520 microlitros de água 4) 40 microlitros de fosfato de potássio 50 mM e 510 microlitros de água 5) 50 microlitros de fosfato de potássio 50 mM e 500 microlitros de água.

[000197]Quinze brancos de ácido fítico foram preparados usando 500 µL de ácido fítico, 25 µL de tampão de glicina 0,2 M e 25 µL de água.

[000198]Quinze brancos de amostra de fitase foram preparados usando 25 µl de fitase, 25 µl de tampão de glicina 0,2 M e 500 µl de água.

[000199]Quinze amostras de fitase foram preparadas usando 500 µL de ácido fítico, 25 µL de tampão de glicina 0,2 M e 25 µL de fitase.

[000200]Uma solução de 4 ml de acetona-molibdato de amônio-H2SO4 (50ml-25ml-25ml) foi adicionada a cada um dos 6 padrões.

[000201]Cada uma das amostras e brancos foram transferidos para um banho-maria por 30 minutos a 37°C. Após 30 minutos, 4 ml da solução de acetona-molibdato de amônio-H2SO4 foram adicionados rapidamente a cada uma das amostras e brancos para precipitar o fosfato. Em seguida, foram centrifugados e 300 µl do sobrenadante foram dissolvidos em 600 µl de água.

[000202]Em seguida, 500 µl de todas as amostras, brancos e padrões foram carregados em placas de poços de equipamentos Varioscan e a absorbância foi medida a 400 nm.

[000203]Os valores padrão foram medidos 3 vezes e suas médias foram tiradas. O valor do padrão 0 foi subtraído de cada um dos valores dos padrões 1 a 5 para atingir um número correlacionado com a absorbância de uma concentração particular de fosfato. A absorbância média para cada um dos padrões é relatada na Tabela 1. A absorbância média de amostras e brancos é relatada na Tabela 2. Tabela 1. Absorbância média (OD) e níveis de fosfato (mM) medidos para os padrões 0 a 5. Padrão Absorbância (OD) Fosfato (mM) 0 0 0 1 0,0456 0,9091 2 0,1426 1,8182 3 0,1696 2,7273 4 0,2566 3,6364 5 0,2726 4,5455 Tabela 2. Absorbância média (OD) das amostras e brancos. Amostra/branco Absorbância (OD) Branco de ácido fítico 0,26 Branco de amostra de fitase 0,047 Amostra de fitase 0,319

[000204]Para determinar os milimoles (mM) de fosfato liberado, a absorbância média dos brancos da amostra de fitase foi adicionada à absorbância média dos brancos de ácido fítico e subtraída da absorbância média da amostra de fitase. O número resultante foi 0,012 OD. O valor do fosfato liberado foi de 0,198 mM. (1) unidades/ml de atividade enzimática = ((mM de fosfato) x (fator de diluição))/((tempo) x (quantidade de enzima adicionada))

[000205]Finalmente, de acordo com a Equação 1 acima, a concentração de fitase no reator foi calculada sendo 792 unidades/ml.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição para liberação de fosfatos de ácido fítico presente na matéria orgânica, a composição caracterizada pelo fato de compreender leveduras Wickerhamomyces anomalus e/ou um ou mais subprodutos de crescimento microbiano, e um veículo.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o subproduto do crescimento é a fitase.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender o caldo de fermentação resultante do cultivo das leveduras.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as leveduras são cultivadas em um meio de cultura que compreende: melaço, 2 a 5% ureia, 0,1 a 0,3% e peptona, 2,0 a 3,0%.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente um ou mais biotensoativos.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que um ou mais biotensoativos são glicolipídios, lipopeptídeos, flavolipídios, fosfolipídios, compostos de éster de ácido graxo, lipoproteínas, complexos de lipopolissacarídeo-proteína e/ou complexos de polissacarídeo-proteína-ácido graxo.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente uma ou mais fontes de fitato e/ou ácido fítico.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente um ou mais nutrientes e/ou prebióticos.

9. Método para a liberação de fósforo do ácido fítico na matéria orgânica, o método caracterizado pelo fato de compreender aplicar uma composição compreendendo leveduras Wickerhamomyces anomalus e/ou um ou mais subprodutos de crescimento microbiano, e um veículo, à matéria orgânica.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente misturar a composição e a matéria orgânica.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a matéria orgânica é matéria residual orgânica selecionada a partir de resíduo de colheita, estrume, composto, resíduos de jardim, borra de café, serragem, grãos de destilador, lignina e grãos gastos de cervejeiros.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o resíduo orgânico é resíduo de colheita que é espalhado sobre a superfície de um campo de cultivo.

13. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a matéria orgânica é composta.

14. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a matéria orgânica é matéria vegetal selecionada a partir de uma noz, uma semente, uma leguminosa, uma batata e um feijão.

15. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a matéria orgânica é solo.

16. Método para enriquecimento do solo caracterizado pelo fato de que uma composição compreendendo leveduras Wickerhamomyces anomalus e/ou um ou mais subprodutos de crescimento microbiano, e um veículo, é aplicada ao solo a fim de liberar fosfatos de ácido fítico presentes no solo.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que os resíduos orgânicos que foram pré-tratados com a composição são aplicados ao solo.

18. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de ser ainda utilizado para aumentar a produção na agricultura ou silvicultura, em que uma planta é cultivada ou será cultivada no solo enriquecido.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de ser utilizado para aumentar o crescimento e/ou o rendimento da planta.

20. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de ser usado para tratar e/ou prevenir a deficiência de fósforo na planta.

21. Método para aumentar a produção na criação de animais caracterizado pelo fato de que o método compreende aplicar uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo leveduras Wickerhamomyces anomalus e/ou um ou mais subprodutos de crescimento microbiano e, opcionalmente, um veículo, ou formular a composição com água potável e/ou ração de um animal como suplemento dietético e/ou auxiliar digestivo.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a criação de animais é a criação de gado.

23. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a criação de animais é a aquicultura.

24. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de ser usado para tratar e/ou prevenir a deficiência de fósforo no animal.

25. Método para melhorar a saúde humana caracterizado pelo fato de compreender administrar uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo leveduras Wickerhamomyces anomalus e/ou um ou mais subprodutos de crescimento microbiano, e um veículo, a um indivíduo humano como um suplemento dietético e/ou auxiliar digestivo.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada ao indivíduo humano por via oral.

27. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de ser usado para tratar e/ou prevenir a deficiência de fósforo no indivíduo.

28. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de ser usado para evitar que o ácido fítico prejudique a absorção de minerais pelo trato digestivo do indivíduo.