KR20210035824A - 유기 물질로부터 인을 분리시키는 방법 - Google Patents

유기 물질로부터 인을 분리시키는 방법 Download PDF

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Abstract

상기 본 발명은 생물학적으로 순수한 이스트, 및/또는 하나 이상의 미생물 성장 부산물, 예를 들어 효소를 포함하는 미생물-기반 조성물을 제공한다. 특정 실시예에서, 상기 효소는 피타아제이다. 상기 조성물을 사용하여 피트산-함유 유기 물질로부터 포스페이트를 분리시키는 방법이 또한 제공된다.

Description

유기 물질로부터 인을 분리시키는 방법
본 출원은 2018년 8월 20일에 출원된 U.S. 임시 특허출원 제62/719,760호의 우선권을 주장하며 여기 참조로서 통합되어 있다.
농업, 원예, 삼림학, 가축 사육 및 수경재배 산업에서, 특정의 공통된 문제는 단가를 낮게 유지하면서도 성장과 수확을 최대화할 수 있는 능력을 방해하는 것이다. 이러한 것들로는, 이에 한정되지는 않지만, 박테리아, 곰팡이 및 다른 해충이나 병원균에 의해 야기된 감염 및 침입; 사료의 높은 단가; 화학 비료의 높은 단가뿐만 아니라 이들의 환경적 및 건강상 충격; 및 작물 및 가축에 필수 영양소, 예를 들어 인을 유용한 형태로 공급하는데 어려움;을 포함한다. 추가적으로 환경의 건강 및 세계 생태계에 대한 온실가스(GHG) 방출의 효과 및 재생불가능한 자원의 고갈과 관련한 문제들이 늘어나고 있다.
인(P)은 모든 살아있는 유기체에서 필수적인 대량영양소이다. 식물에서 P는 무기 인산염(Pi)으로서 주로 뿌리에 의해 근권(rhizophere)으로부터 취해진다. Pi는 작물 수확량을 최대화하는데 다량 필요하다. 그러나 토양에서, 가장 큰 퍼센트의 인은 인 저장 분자의 형태, 피트산, 또는 염의 형태 피트산염의 형태로 존재한다. 피트산의 가수분해는 부분적인 산성 가수분해 또는 염기성 가수분해, 또는 포스파타아제 효소를 사용한 가수분해로 수행될 수 있으며, 포스페이트, 이노시톨 및 다양한 이노시톨 포스페이트 중간체를 포함하는 부산물이 생긴다.
피트산의 전환을 촉매하는 효소는 피타아제로 알려져있다. 피타아제는 특정 미생물, 예를 들어 Bacillus subtilis 및 Pseudomonas spp.을 포함하는 박테리아; Saccharomyces cerevisiae를 포함하는 이스트; 및 Aspergillus terreus 및 Aspergillus ficuum을 포함하는 곰팡이에 의해 제조된다. 피타아제는 또한 일부 식물 종에서 소량으로 내생적으로 존재한다.
토양에서 피트산은 대부분의 식물에 의해 취해질 수 없어 사용되지 않는 토지뿐만 아니라 토양내 식물 쓰레기 및 다른 유기 물질내에 퇴적하게 된다. 이는 근권 내 낮은 효소 준위, 및/또는 토양 고체상에 대한 피트산염의 강한 결합으로 인한 것일 수 있다. 이러한 장애를 극복하기 위한 하나의 전략은 유전적으로 식물 작물을 가공하여 토양-결합된 피트산을 가용화하는 효소 및/또는 심출물을 생산하는 식물의 능력을 개선하는 것과 관계가 있다. 그러나, 이 공정은 비용이 높아지고 복잡해질 수 있으며 많은 소비자들은 유전적으로 변형된 작물의 판매 및/또는 소모에 반대하고 있다.
인 결핍은 가축 사육에서 또한 문제이며, 예를 들어 불임, 포유류의 우유 생산 감소, 및 불충분한 뼈 미네랄화를 유도할 수 있다. 피트산은 많은 시리얼, 곡류 및 콩과식물 내에 발견되지만, 화합물을 대사 작용을 할 수 없거나 잘하지 못할 수 있는 많은 비반추(non-ruminant) 동물에 대해 항-영향 인자로 여겨진다.
인간 및 다른 단위 동물(monogastric animal)(e.g., 돼지, 가금류 및 물고기)은 만약 있다면 피트산을 대사작용하는데 필요한 효소를 부적당한 양으로 생산한다. 피트산의 일부 가수분해가 결장(colon) 내에서 일어남에도 불구하고, 무기 인은 단지 소장에서만 흡수되기 때문에 무기인은 영양적 가치가 없다. 결과적으로, 영양적으로 중요한 인이 인간 및/또는 다른 단위 동물에서 대량으로 사용되지 않는다.
게다가, 피트산은 단백질 및 2가 양이온, 예를 들어 칼슘, 철, 아연, 마그네슘, 망간, 구리 및 몰리브덴과 복합체를 형성하여, 동물의 소화계에 대한 생체이용성을 줄인다. 예를 들어, 대량의 피트산을 포함하는 음식의 섭취는 인간에게 미네랄 결핍성, 예를 들어 칼슘, 철 및/또는 아연 결핍성을 일으킬 수 있다. 피트산은 또한 전분에 결합하고 이의 소화흡수율 및 용해성에 영향을 미친다. 그러므로, 단위 동물에는 때때로 적당한 성장 및 건강을 확보하기 위하여 무기인을 포함하는 식이 보충제를 주어야만 한다.
유기 인 화합물의 소화를 개선하고자 동물 및 미생물의 유전적 변형이 시도되어 왔다. 예를 들어, 피타아제를 생산 및/또는 생산의 증가를 위한 코드를 하는 유전자들을 갖도록 돼지 및 E. coli 둘 다를 가공하였다.
다른 한편, 반추 동물들은 피트산을 소화가능한 인으로 전환시킬 수 있는 효소를 생산하는 반추 내 미생물을 가질 수 있다. 그러나, 식물-생체 이용가능한 인의 함량이 낮은 토양의 지역에 놓아 기르거나 방목한 반추 동물에는, 인 결핍에 대항하기 위하여 식이 보충이 여전히 필요할 것이다. 게다가, 동물에게 매우 소화력이 큰 사료(e.g., 옥수수 사일러지)를 공급할 때, 소화기 유체 경로의 속도가 증가하게 되어 그 결과 유기 인 화합물을 불완전하게 소화하게 된다.
과거 수십세기 동안 인간 활동은 인 고갈 및 인 오염 두 가지와 관련된 환경 문제에 직면해왔다. 비료의 과사용과 같은 지속불가능한 농장일은 계속적으로 세계 회수가능한 포스페이트 바위를 고갈시켜, 토양에 사용되지 않은 인 저장을 축적시키게 되고 대수층(aquifer) 내로 인 빗물을 생산하게 되었다. 게다가, 가축 거름에서 소화되지 않은 인 저장으로부터의 빗물이 지하수로 침투하여 강 및 호수로 흘러갈 수 있어 부영양화를 일으킬 수 있다.
대량으로 식료품을 제조하는 경제적 단가, 및 사용불가능한 인 원료의 고갈은 세계적으로 인간 및 동물 건강, 농업 및 동물 농사의 지속성에 부담이 되고 있다. 동물 및 인간을 위한 식물, 돼지 및 미생물, 및 식이 보충제의 유전적 변형은 이러한 문제들에 대항하는 현재 방법들 중 일부이나 인의 총 고갈을 피하려면 추가적인 노력이 있어야만 한다. 그러므로, 사용가능한 인을 유기 물질, 예를 들어 작물 쓰레기에서 회수하여 재활용하고 재생산불가능한 인 원료를 보존할 수 있는 지속가능한 인 관리 방법의 필요성이 있다.
본 발명은 미생물뿐만 아니라 이들의 성장 부산물, 예를 들어 바이오계면활성제, 대사산물 및/또는 효소를 제공한다. 본 발명은 또한 이들 미생물 및 이들의 부산물을 제조 및 사용하는 방법을 제공한다. 유리하게 본 발명의 상기 미생물 기반 생성물 및 방법은 환경 친화적이고, 작동이 용이하며 비용이 경제적이다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 배양된 미생물 및/또는 이들의 성장 부산물을 포함하는 미생물 기반 조성물, 이들 조성물을 제조하는 방법, 및 이들의 사용 방법, 예를 들어 인간 건강, 농업, 삼림학 및 동물 농장에서의 사용 방법을 제공한다. 일반적으로, 미생물 기반 조성물은 피트산-함유 유기 물질, 예를 들어 토양, 식물 물질, 작물 잔류물 및 거름으로부터 인을 분리할 수 있다. 추가적으로, 미생물-기반 조성물은 재식림 및 작물 성장 및 수확량을 증가시키는데 사용될 수 있다.게다가, 상기 조성물은 동물 및 인간의 식이 보충제뿐만 아니라 미생물 배양의 성장 배지 보충제로서 사용될 수 있다.
본 미생물-기반 조성물의 미생물은 하나 이상의 유용한 성장 부산물, 예를 들어 효소를 생산할 수 있는 생물학적으로 순수한 이스트가 바람직하다. 바람직하게는, 효소는 피타아제이다. 구체적인 실시예에서, 이스트는 Wickerhamomyces anomalus (Pichia anomala) 및/또는 밀접하게 관련된 종(e.g., 동일한 패밀리 및/또는 속에 속함).
본 발명의 미생물-기반 조성물은 소규모에서 대규모로 배양 공정을 통해 얻어질 수 있다. 이들 배양 공정은, 이에 한정되지는 않지만, 수중 배양(submerged cultivation), 고체상발효(solid state fermentation, SSF), 및 하이브리드, 변형 및/또는 이들의 조합을 포함한다.
조성물 내 이스트는 활성 또는 불활성 형태일 수 있다. 게다가, 상기 조성물은 또한 이스트 배양의 결과로부터 나온 액체 발효 브로스를 포함하며, 이는 이중에서도 세포성 성분 및 미생물 성장 부산물, 예를 들어 바이오계면활성제, 대사산물 및/또는 효소를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서 상기 조성물은 이스트 세포가 없는 발효 브로스를 포함한다.
유리하게, 조성물의 직접적인 사용, 즉 추가 안정화, 보존 및 저장이 없이 바로 사용하는 것은 미생물의 높은 생존력을 보존하고, 이물질 및 원하지 않는 미생물로부터 오염 가능성을 줄이고, 및/또는 미생물 성장의 부산물의 활성을 유지한다.
특정 실시예에서, 상기 조성물은 하나 이상의 바이오계면활성제를 더 포함한다. 바이오계면활성제는 정제된 형태 또는 조 형태(crude form)로 첨가될 수 있으며, 여기서 조 형태는 이들이 바이오계면활성제-생산 미생물의 배양 결과의 상청액에 존재한다는 것을 의미한다. 조 형태는 선택적으로 잔류 영양소, 다른 미생물 성장 부산물, 및/또는 세포성 성분을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 바이오계면활성제는 미생물-기반 조성물의 미생물에 의해 생산된다.
일부 실시예에서, 바이오계면활성제는 예를 들어 당지질(e.g., 소포로리피드, 람노리피드, 셀로바이오스 리피드(cellobiose lipid), 만노실에리트리톨 리피드 및 트레할로스 리피드), 지질펩티드(e.g., 수르팩틴(surfactin), 이투린, 펜기신, 아르트로팩틴(arthrofactin) 및 리체니신(lichenysin)), 팔라보리피드, 포스포리피드 (e.g., 카르디오리핀), 지방산 에스테르 화합물, 및 고분자량 폴리머, 예를 들어 리포단백질, 지질다당류-단백질 복합체, 및 다당류-단백질-지방산 복합체로부터 선택된다.
특정 실시예에서, 상기 조성물은 담체를 더 포함한다. 담체는 생성물이 활력을 유지하도록 하거나, 또는 불활성 이스트의 경우 효과적이게 하는데 필요한 성분의 활성을 포함하게 하는 방법으로 이스트 또는 이스트 부산물이 표적 사이트까지 전달되게 하는 당해 기술 분야에 알려진 적당한 임의 담체일 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 조성물은 유기 및/무기 인의 원료를 더 포함한다. 예를 들어, 아마씨 및 아몬드가 피트산의 일반적인 원료이다.
미생물-기반 조성물은 예를 들어 사용의 모드 및 표적 부위에 따라서, 예를 들어, 액체 현탁액, 에멀젼, 동결- 또는 스프레이-건조 분말, 펠렛, 과립, 겔, 정제, 캡슐, 및/또는 다른 형태로 제형화될 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 조성물은 배양된 용기로부터 수확한 후 추가 공정이 거의 없이 액체 형태로 이용된다.
특정 실시예에서, 본 발명의 조성물은, 예를 들어 전체 미생물 배양액을 사용하므로 예를 들어, 정제된 미생물 대사산물 단독 보다 유리하다. 이들 장점은 하나 이상의 다음 장점들을 포함한다: 이스트 세포 벽 외표면의 일부로서 고농도의 마노단백질; 이스트 세포 벽 내 베타-글루칸의 존재; 배양액 내 바이오계면활성제의 존재; 및 배양액 내 용매 및 다른 대사산물(e.g., 비타민, 미네랄, 탄수화물 및 단백질 원료). 이들 장점은 활성 또는 불활성 이스트를 사용할 때 존재한다.
특정 실시예에서, 상기 미생물뿐만 아니라 미생물의 대사산물 및 다른 부산물은 서로 상승적으로 작동한다.
일 실시예에서, 본 발명은 미생물의 성장 부산물을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 미생물은 성장 및 성장 부산물의 생성; 및 선택적으로 상기 부산물의 정제에 적당한 조건하에서 배양된다. 일부 실시예에서, 피트산의 원료는 성장 배지, 예를 들어 식물 쓰레기 내에 포함된다.
일부 실시예에서, 생산된 성장 부산물은 정제되지 않고 대신에 조 형태, e.g., 이것이 생산되었던 발효 배지를 포함하는 형태로 사용된다. 본 발명에 따른 성장 부산물의 예는 효소, 산, 용매, 에탄올, 단백질, 아미노산, 바이오계면활성제, 및 다른 것들을 포함한다. 구체적인 실시예에서, 효소 피타아제를 포함하는 미생물-기반 조성물을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명은 유기 물질 내 존재하는 피트산으로부터 인을, 예를 들어 무기 포스페이트 형태로 분리하는 방법을 더 제공하며, 여기서 상기 방법은 효과적인 함량의 본 발명의 미생물-기반 조성물을 상기 유기 물질에 사용하는 단계를 포함한다. 상기 미생물은 사용시 살아있거나(생존가능하거나) 또는 불활성일 수 있다.
살아있는 미생물의 경우에, 상기 미생물은 사용 부위 그 자리에서 성장하고 현지에서 활성 화합물 또는 성장 부산물을 생산할 수 있다. 결과적으로 고농도의 미생물 및 유리한 성장 부산물이 처리 사이트에서 용이하고 연속적으로 얻어질 수 있다.
이 목적을 위하여, 본 발명은 사용 동안 미생물 성장을 증가시키기 위하여 물질들을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다(e.g., 미생물 성장을 촉진시키기 위하여 영양소 및/또는 프리바이오틱스를 첨가하는 단계).
일 실시예에서, 상기 방법은 사용 전에 미생물-기반 조성물을 제조하는 단계를 더 포함한다. 바람직하게는, 미생물-기반 조성물 모두 또는 일부를 사용 사이트에 또는 근처, 예를 들어 상기 사이트로부터 300mile 미만에서 배양된다.
유리하게, 조성물을 본 발명에 따른 유기 물질과 접촉시킬 때, 상기 조성물 내 미생물-생산 피타아제를 유기 물질 내 피트산과 반응시킬 수 있어, 피트산의 가수분해를 촉매화하여 사용가능한 인 부산물을, e.g., 무기 포스페이트의 형태로 시간에 따른 방출을 야기시킨다.
특정 실시예에서, 유기 물질은 유기 폐기물, 예를 들어 수확후 작물 잔류물이며, 이는 예를 들어, 남은 곡식 줄기, 곡식 여물, 곡식 알, 밀 짚, 콩 짚, 쌀 겨, 및 다른 식물 줄기, 잎, 뿌리 및 부분들을 포함할 수 있다.
예를 들어, 식물-기반 물질, 예를 들어 너트, 종자 및 콩과 식물, 식물-기반 퇴비, 거름, 곡식에서 남은 것, 셀룰로오스 또는 바이오매스 에탄올 생산(e.g., 주모(distiller's grain), 리그닌 및 맥주박(brewers' spent grain)), 톱밥, 사용된 커피 가루, 및 낙엽 쓰레기(yard waste)(e.g., 나무, 헤지 및 잔디 깍기)를 포함하는 다른 타입의 유기 물질이 또한 가사화된다.
일부 실시예에서, 포스페이트 방출이 일어나는 속도는 미생물-기반 조성물을 사용하기 전에 개별 조각의 유기 물질을 다지거나, 부수거나 또는 다른 크기 줄이는 방법으로 증가될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 조성물은 유기 물질 위로 붓거나, 스프레이 또는 스프링클되고, 선택적으로 임의 표준 혼합 장치 또는 당해 기술 분야에서 알려진 기술을 사용하여 혼합된다. 추가 성분들, 예를 들어 물 또는 영양소(e.g., 미생물 성장 및/또는 식물 성장을 위한 영양소)가 또한 사용될 수 있다.
일 실시예에서, 유기 폐기물 물질은 수확후 작물 밭에 남은 작물 잔류물이다. 작물 잔류물이 분해하기 때문에, 식물 성장에 필요한 영양소가 토양 내로 방출된다. 본 발명은 이 분해 공정에 의해 방출된 이용불가능한 인의 형태를 식물-흡수가능한 형태로 전환하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물은 밭에 남겨진 작물 잔류물에 직접 사용될 수 있다. 작물 잔류물 및 조성물은 토양의 표면에 남겨지거나 또는 이들은 토양 내로 밭갈이 될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 조성물은 상기 조성물 내 피타아제가 피트산의 가수분해를 촉매하게 하도록 퇴비를 밭에 사용하기 전에 퇴비에 첨가되어, 이후 퇴비는 밭 또는 숲에 비료로 사용된다.
조성물을 그의 원료로부터 수집되어 서로 다른 위치에서 함께 혼합된 유기 물질에 또한 사용될 수 있다. 처리된 유기 물질은 이후 원하는 사용 사이트, 예를 들어 작물 밭에 이송되고 예를 들어 바이오비료로서 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 유기 물질이 토양이다. 본 조성물을 토양에 직접 사용하고 상기 조성물을 토양에 혼합시키거나 또는 토양에 스며들게 하는 것으로, 상기 방법은 식물-흡수가능한 인 저장으로 보충하여 토양을 비옥하게 하는데 사용될 수 있다. 유리하게, 상기 방법은 작물의 수확량을 증가시키고 품질을 높일 수 있으며 이는 토양 내 피트산염 또는 피트산으로부터 포스페이트를 분리시키는 것에 의한 것이다.
일 실시예에서, 동물 농장(e.g., 가축 사육 또는 수경재배)에서 생산을 증가시키는 방법이 제공되며, 여기서 상기 미생물-기반 조성물은 동물의 식수 및/또는 사료에 식이 보중제 및/또는 소화 보조제로서 사용된다. 일 실시예에서, 인간 건강을 증진시키는 방법이 제공되며, 여기서 미생물-기반 조성물이 식이 보조제 및/또는 소화 보조제로 인간에 투여된다. 유리하게, 상기 조성물 내 피타아제 존재는 자연적으로 피트산 및/또는 포스페이트를 포함할 수 있는 음식 원료로부터 인의 흡수를 증가시키고, 동물 사료를 보충에 보충할 필요가 있는 무기 포스페이트의 함량을 줄이고, 인 결핍 방지를 돕는다.
특정 실시예에서, 본 미생물-기반 조성물에서 유리한 생화학-생산 미생물의 존재로 인하여, 본 방법은 해로운 유기물이 유기 폐기물에 고정되는 것을 방지하는데 도움을 줄 수 있다. 예를 들어, 거름 및 분해 작물 잔류물은 거름 또는 잔류물로 성장하는 식물에 해로울 수 있는 특정 해충, 곰팡이 및 박테리아에 매력적일 수 있다. 킬러 이스트, 예를 들어 Wickerhamomyces anomalus는 이들 원하지 않는 많은 해충들을 제어하는데 유용한 대사산물을 제조할 수 있다.
본 발명의 방법은 유기 폐기물의 재활용을 가능하게 할뿐만 아니라 비타민, 미네랄 및 중요하게는 특정 유기 물질에 남은 인의 방출이 가능하게 한다. 게다가, 상기 조성물 및 방법은 생분해가능하고 독성적으로 안전한 성분들을 이용한다. 그러므로 본 발명은, "녹색" 치료로서, 농업, 삼림학, 및 동물 농장에서 생산을 증가시킬뿐만 아니라 인간 건강을 증진시키는데 사용될 수 있다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 배양된 미생물 및/또는 미생물 성장 부산물을 포함하는 미생물-기반 조성물, 이들 조성물을 제조하는 방법 및 이들의 사용하는 방법, 예를 들어 인간 건강, 농업, 삼림학, 및 동물 농장에서의 이들의 사용방법을 제공한다. 일반적으로, 미생물-기반 조성물은 피트산-함유 유기 물질, 예를 들어, 예를 들어, 토양, 식물 물질, 작물 잔류물 및 거름으로부터 인을 분리할 수 있다. 추가적으로, 미생물-기반 조성물은 재식림 및 작물 성장 및 수확량을 증가시키기 위하여 사용될 수 있다. 게다가, 조성물은, 예를 들어 인 결핍을 방지하기 위하여 동물 및 인간에 대한 식이 보충제로서 뿐만 아니라 미생물의 배양을 위한 성장 배지 보충제로서 사용될 수 있다.
본 미생물-기반 조성물의 미생물은, 하나 이상의 유용한 성장 부산물, 예를 들어, 효소를 제조할 수 있는 바람직하게는 생물학적으로 순수한 이스트이다. 바람직하게는, 상기 효소는 피타아제이다. 구체적인 실시예에서, 상기 이스트는, Wickerhamomyces anomalus (Pichia anomala), 또는 이에 밀접하게 관련된 이스트(e.g., 동일한 종 및/또는 패밀리에 속하는 것)이다.
본 발명은 유기 물질에 존재하는 피트산으로부터 포스페이트를 분리하는 방법을 더 제공하며, 여기서 상기 방법은 효과적인 함량의 본 발명의 미생물 기반 조성물을 유기 물질에 적용하는 단계를 포함한다. 상기 미생물은 사용시에 살아있는(활력있는) 또는 불활성일 수 있다. 유리하게, 조성물이 본 방법에 따라 유기 물질과 접촉될 때, 상기 조성물 내 미생물-생산 피타아제는 유기 물질 내 피트산의 가수분해를 촉매화하여, 유용한 인 부산물을 시간에 따라, e.g., 무기 포스페이트 형태로 방출시킬 수 있다.
선택된 정의
여기 사용된, “미생물-기반 조성물”은 미생물의 성장의 결과로서 생산된 성분들 또는 다른 세포 배양액을 포함하는 조성물을 의미한다. 그러므로, 미생물-기반 조성물은 미생물 자체 및/또는 미생물 성장의 부산물을 포함할 수 있다. 상기 미생물은 플랑크톤이거나 또는 바이오필름 형태, 또는 둘 다의 혼합물일 수 있다. 성장의 부산물은, 예를 들어, 대사산물(e.g., 바이오계면활성제, 효소), 세포 막 성분, 단백질, 및/또는 다른 세포성 성분일 수 있다. 미생물은 온전하거나 또는 용해될 수 있다. 세포는 조성물에 없거나 또는 예를 들어 적어도 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011, 1 x 1012 또는 그 이상의 CFU/ml(조성물)의 농도로 존재할 수 있다.
본 발명은 “미생물-기반 생성물”을 더 제공하며, 이는 원하는 결과를 얻기 위하여 실제로 사용될 수 있는 생성물이다. 미생물-기반 생성물은 미생물 배양 공정으로부터 수확된 단순한 미생물-기반 조성물일 수 있다. 대안적으로, 미생물-기반 생성물은 추가된 성분들을 더 포함할 수 있다. 이들 추가된 성분들은, 예를 들어, 안정화제, 완충제, 담체 (e.g., 물 또는 염 용액), 미생물 성장을 더 지지하기 위하여 첨가된 영양소, 비-영양소 성장 증가제 및/또는 미생물 및/또는 조성물이 사용되는 환경에서 이들 흔적의 추적을 용이하게 하는 약제를 포함할 수 있다. 미생물-기반 생성물은 미생물-기반 조성물의 혼합물을 또한 포함한다. 미생물-기반 생성물은 일부 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않지만, 여과, 원심분리, 용해, 건조, 정제 및 이와 유사한 방법으로 가공된 미생물-기반 조성물의 하나 이상의 성분들을 포함할 수 있다.
미생물 배양의 맥락에서 여기 사용된 “수확”은 성장 용기로부터 미생물-기반 조성물의 일부 또는 전부를 제거하는 것을 의미한다.
여기 사용된, "분리" 또는 "정제" 분자 또는 화합물은 실질적으로 다른 화합물, 예를 들어 자연과 관련된 세포성 물질이 없는 것이다. 정제 또는 분리된 폴리뉴클레오티드(리보뉴클레익 산 (RNA) 또는 데옥시리보뉴클레익 산 (DNA))은 자연발생한 상태로 측면에 있는 유전자 또는 시퀀스가 없는 것이다. 정제된 또는 분리된 폴리펩티드는 자연 발생한 상태로 옆구리에 아미노산 또는 시퀀스가 없는 것이다.
여기 사용된 "생물학적으로 순수한 배양액"은 자연적으로 관련된 물질로부터 분리된 것이다. 바람직한 실시예에서, 배양액은 모든 다른 살아있는 세포로부터 분리되었다. 추가 바람직한 실시예에서, 생물학적으로 순수한 배양액은 자연에 존재하는 것과 동일한 미생물의 배양액에 비하여 유리한 특성들을 갖는다. 상기 유리한 특성들은, 예를 들어 하나 이상의 원하는 성장 부산물의 생성을 증가시킬 수 있다.
특정 실시예에서, 정제된 화합물은 관심있는 화합물의 적어도 60중량%이다. 바람직하게는, 제제는 관심있는 화합물의 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 99중량% 이다. 예를 들어, 정제된 화합물은 원하는 화합물의 중량의 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% (w/w) 중 하나이다. 순도는 임의 적당한 표준 방법, 예를 들어 컬럼 그래피, 박막 그래피, 또는 고성능 액체 그래피 (HPLC) 분석으로 측정된다.
"대사산물"은 특정 신진대사 과정에 참여하는데 필요한 신진대사 (i.e., 성장 부산물) 또는 물질에 의해 제조된 임의 물질을 의미한다. 대사산물은 출발 물질, 중간체, 또는 신진대사의 최종 생성물인 유기 화합물일 수 있다. 대사산물의 예는, 이에 한정되지는 않지만, 바이오폴리머, 효소, 산, 용매, 알코올, 단백질, 비타민, 미네랄, 미량원소, 아미노산, 및 바이오계면활성제를 포함한다.
여기 사용된 "조절하다"는 변경하다(e.g., 증가하거나 또는 감소하다)와 교환가능하다. 그러한 변경은, 표준 기술로 알려진 방법, 예를 들어 여기 설명된 것들에 의해 검출된다.
여기 제시된 범위는 그 범위 내 값들 모두에 대하여 짧게 표시한 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 20의 값은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20로 이루어진 군 임의 수, 수들의 조합, 또는 하부의 범위뿐만 아니라 상기 언급된 정수들 사이의 모든 소수 , 예를 들어, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 및 1.9를 포함하는 것으로 이해된다. 하부 범위와 관련해서, 범위의 양 끝점으로부터 연장하는 "중첩 하부 범위(nested sub-ranges)"는 구체적으로 고려된다. 예를 들어, 예시적 범위인 1 내지 50의 중첩 하부 범위는 한 방향으로 1 내지 10, 1 내지 20, 1내지 30 및 1 내지 40, 또는 다른 방향으로 50 내지 40, 50 내지 30, 50 내지 20, 및 50 내지 10을 포함할 수 있다.
여기 설명된, "줄이다"는 적어도 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 100%의 음성적 변형을 의미하고, "증가하다"는 적어도 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 100%의 양성적 변형을 의미한다.
여기 사용된 "참조는" 표준 또는 대조군 조건을 의미한다.
여기 사용된 "계면활성제"는 액체 및 기체 사이, 2개의 액체 사이, 또는 액체 및 고체 사이의 표면장력(또는 계면 장력)을 낮추는 표면활성제를 의미한다. 계면활성제는 e.g., 세제, 습윤제, 에멀화제, 기포제, 및 분산제로서 작용한다. "바이오계면활성제"는 살아있는 유기체에 의해 생산된 계면활성제이다.
여기 사용된 "피트산"은, 용어들 이노시톨 헥사키스포스페이트, IP6, 이노시톨 폴리포스페이트, 피트산염 및 피틴, 및 피트산 분자의 임의 다른 염 및/또는 형태를 포함한다.
여기 사용된, "농업"은 식품, 섬유, 바이오연료, 의약, 화장품, 보충제, 장식 목적 및 다른 용도를 위하여 식물 및/또는 곰팡이를 경작 및 번식시키 것을 의미한다. 본 발명에 따라, 농업은 원예, 조경, 가드닝, 식물 보존, 과수재배 및 수목재배를 또한 포함할 수 있다. 추가로, 여기 농업에는 토양 과학(e.g., 토양학 및 응용토양학)뿐만 아니라 작물학(agronomy), 또는 토양 및 작물 생성물의 돌봄, 모니터링 및 관리가 포함된다.
여기 사용된, "가축"은 상품, 예를 들어 식품, 섬유 및 노동력을 생산하기 위하여 농업 또는 산업적 세팅에서 키워진 임의 동물을 의미한다. "가축 사육"은 동물 농장 형태로 여겨지며, 이들 동물의 번식, 보육, 사육, 유지 및/또는 도축을 포함한다. 가축은 가두지 않고, 예를 들어 개방 필드, 농장, 또는 동물 먹이공급 작동으로 생산될 수 있다. 가축의 용어에 포함되는 동물 종류는, 이에 한정되지 않지만, 알파카, 소고기 및 젖소, 들소, 돼지, 양, 염소, 말, 노새, 당나귀, 개, 낙타, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 뿔닭(guinea fowl), 및 새끼 비둘기를 포함할 수 있다.
여기 사용된, "수경재배," "아쿠아 파밍", "수경 농장," "아쿠아 농장" 또는 "물고기 농장"은 동물 농장의 형태이고, 물고기 농장에서 수중 동물의 번식, 사육 및 수확을 포함한다. 수경재배는 집중적(고밀도로 인공적인 울타리 내에서 물고기를 키우는 기술을 기반으로 함)이거나 또는 확장적(바다, 또는 자연 및 인공 호수, 베이, 강, 피오르, 또는 물의 다른 몸체 내에서 수행됨)이다. 수경재배는 울타리, 연못, 탱크, 아쿠아리움, 케이지 또는 레이스웨이(raceway)에서 시장 크기로까지 키워진 부화 물고기 또는 조개의 바다 식뭄을 생산하는 것을 포함한다. 추가적으로, 수경재배는 개방 바닷물 또는 바닷물의 가둔 부분에서 바다 유기체의 배양을 수반하는 해수 양식을 포함한다. 게다가, 수경재배는 재고품 복원 또는 증대를 포함하고, 여기서 부화 물고기 또는 조개는 야생 집단 또는 연안 서식지를 재건하기 위한 노력으로 야생으로 방출된다. 추가로, 수경재배는 아쿠아리움 무역을 위한 장식 고기의 생산뿐만 아니라 아쿠아리움 내 가두어진 장식 물고기의 농장을 포함한다. 양식될 수 있는 종들은 담수 또는 염수 물고기 및 조개를 포함하며, 장식 물고기, 식품 물고기, 스포츠 물고기, 미끼 물고기, 갑각류, 연체동물, 조류(mollusk), 바다 식물, 또는 물고기알을 포함할 수 있다.
여기 사용된 "물고기 농장"은 수경 재배가 일어나거나 일어날 수 있는 임의 물환경이다. 본 개시에 따른 물고기 농장은, 인공이거나 또는 자연발생한 것이나 물 환경의 모든 타입 또는 물 환경의 섹션을 포함할 수 있고, 연못, 용수로, 강, 호수, 대양, 피오르, 탱크, 아쿠아리움, 케이지, 또는 레이스웨이을 포함한다.
여기 사용된, "해충"은 인간 또는 인간 관련된 것(e.g., 농업, 원예, 동물 농장)에 파괴적이고, 해롭고 및/또는 유해한, 인간이외 임의 유기체이다. 해충은 감염, 침입 및/또는 질병을 야기할 수 있다. 해충은 단일- 또는 다중-세포성 유기체이며, 이에 한정되지는 않지만, 절지 동물, 바이러스, 곰팡이, 박테리아, 기생충, 원생동물, 및/또는 선충을 포함한다.
여기 사용된, "치료하는" 은 상태 또는 질병의 정도, 표시 또는 증세를 박멸하거나, 줄이거나, 완화하거나, 역전시키거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 상태 또는 질병의 완전한 치유를 포함하나, 반드시 필요한 것은 아니다. 치료는 질병을 치유, 개선 또는 부분적으로 완화할 수 있다.
여기 사용된, 상황 또는 발생을 "예방하는"은, 이들의 발생 또는 진행을 지연시키는 것을 의미한다. 일부 예에서, 예방은 절대적이지 않으며, 상황 또는 발생이 여전히 일어나지만, 지연될 수 있다는 것을 의미한다.
미생물-기반 조성물
본 발명은 유리한 미생물을 포함하는 미생물-기반 조성물뿐만 아니라 하나 이상의 미생물 성장 부산물, 예를 들어 바이오계면활성제, 대사산물, 산, 용매 및/또는 효소를 제공한다. 게다가, 본 발명은 미생물 기반 조성물을 제조하기 위한 물질 및 방법을 제공한다.
유리하게, 본 발명에 따른 미생물-기반 조성물은 무독성(e.g., 섭식 독성이 체중의 5g/kg보다 큼)이고 예를 들어 인간 또는 동물의 피부 또는 소화관에 자극 및/또는 독성을 야기하지 않고 고농도로 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명의 미생물은 생물학적으로 순수한 킬러 이스트이다. 특히 본 발명은 Pichia속에 속하는 킬러 이스트를 이용한다. 보다 특히 일 실시예에서 상기 미생물은 Wickerhamomyces anomalus (Pichia anomala)이다. 다른 피타아제-생산 이스트는, 예를 들어 Pichia kudriavzevii, P. guilliermondii, 및 P. occidentalis가 또한 사용될 수 있다.
일 실시예에서, 조성물은 약1 x 106 내지 1 x 1012, 1 x 107 내지 1 x 1011, 1 x 108 내지 1 x 1010, 또는 1 x 109 CFU/ml(미생물)을 포함한다.
특정 실시예에서, 본 발명의 미생물-기반 조성물은 살아있거나 및/또는 불활성의 배양액 및/또는 상기 미생물 및/또는 임의 잔류 영양소에 의해 생산된 미생물 대사산물을 포함하는 발효 브로스를 포함할 수 있다. 조성물은 예를 들어, 적어도 중량으로 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 100% 브로스이다. 조성물 내 바이오매스의 함량은 중량으로 예를 들어 0% 내지 100% 사이 모든 퍼센트, 또는 예를 들어 5 g/l 내지 180 g/l 또는 그 이상, 또는 10 g/l 내지 150 g/l일 수 있다.
발효 생성물은 추출 또는 정제없이 바로 사용될 수 있다. 원한다면, 추출 및 정제는 문헌에 설명된 표준 추출 및/또는 정제 방법 또는 기술을 사용하여 용이하게 얻을 수 있다.
일부 실시예에서, 조성물은 추가적인 조 형태 또는 정제된 미생물 성장-생성물, 예를 들어 효소, 바이오계면활성제, 용매, 산, 단백질, 미네랄 및/또는 비타민을 더 포함한다. 조 형태 대사산물은, 예를 들어 미생물 배양의 결과 발효 브로스 내 대사산물 침전물을 포함하는 액체 혼합물의 형태를 취할 수 있다. 조 형태 용액은 약 25% 내지 약 75%, 약 30% 내지 약 70%, 약 35% 내지 약 65%, 약 40% 내지 약 60%, 약 45% 내지 약 55%, 또는 약 50% 순수한 대사산물을 포함할 수 있다.
바람직한 실시예에서, 상기 조성물은 포스파타아제 효소, 예를 들어 피타아제를 포함한다. 피타아제는 피트산 또는 피트산염의 가수분해를 촉매하고, 이는 가수 분해시 무기 임의 형태를 방출하는 인의 유기 형태이다. 피타아제는 조성물 내 존재하는 미생물의 성장 결과로서 조성물 내에 존재할 수 있거나, 또는 피타아제는 다른 피타아제-생산 미생물에 의해 별도로 생산되어 조 형태 및/또는 정제된 형태로 조성물에 첨가될 수 있다.
특정 실시예에서, 조성물 내 피타아제(또는 다른 효소)의 농도는 1 내지 10,000 u/ml, 100 내지 9,000 u/ml, 또는 200 내지 8,000 u/ml이다.
추가적으로, 일 실시예에서, 상기 조성물은 바이오계면활성제을 포함한다. 바이오계면활성제는 조성물 내 존재하는 미생물 성장의 결과로서 조성물 내에 포함될 수 있고, 또는 바이오계면활성제는 다른 미생물에 의해 별도로 생산되고 상기 조성물에 조 형태 및/또는 정제된 형태로 첨가될 수 있다.
바이오계면활성제는 다양한 표면에 미생물 부착을 방지하고, 바이오필름의 형성을 방지하고, 강력한 에멀젼화 및 디멀젼화 성질을 가질 수 있다. 추가적으로, 바이오계면활성제는 예를 들어 물고기 농장 및 아쿠아리움에서 물의 표면 및 계면 장력을 줄일 수 있다.
일부 실시예에서, 바이오계면활성제는 예를 들어, 당지질(e.g., 소포로리피드, 람노리피드, 셀로바이오스 리피드, 만노실에리트리톨 리피드 및 트레할로스 리피드), 지질펩티드(e.g., 수르팩틴, 이투린, 펜기신, 아르트로팩틴 및 리체니신), 팔라보리피드, 포스포리피드(e.g., 카르디오리핀), 지방산 에스테르 화합물, 및 고분자량 폴리머 예를 들어 리포단백질, 지질다당류-단백질 복합체, 및 다당류-단백질-지방산 복합체로부터 선택된다.
특정 실시예에서, 조성물내 하나 이상의 바이오계면활성제의 농도는 0.001 내지 90 중량%(wt %), 바람직하게는 0.01 내지 50 wt %, 및 보다 바람직하게는 0.1 내지 20 wt %이다. 바이오계면활성제는 약 0.01 g/L 내지 약 500 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 50.0 g/L, 약 1.0 내지 약 10.0 g/L 또는 약 2.0 내지 약 5.0 g/L로 존재할 수 있다.
토양 비용한 제형
일 실시예에서, 조성물은 토양, 종자, 전체 식물, 또는 식물 부분(이에 한정되지는 않지만, 뿌리, 덩이줄기, 꽃 및 잎을 포함)에 사용하기 위한 바람직한 제형이다. 특정 실시예에서, 상기 조성물은 예를 들어, 액체, 먼지, 과립, 마이크로과립, 펠렛, 습식성 분말, 가루성 분말, 에멀젼, 마이크로캡슐, 오일, 또는 에어로졸로서 제형화된다.
상기 조성물의 효과를 개선하거나 또는 안정화하기 위하여, 적당한 부형제와 혼합되고 이후 그대로 또는 필요에 따라 희석하여 사용될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 조성물은 액체, 농축 액체 또는 물 또는 다른 성분과 혼합되어 액체 생성물을 형성할 수 있는 건조 분말 또는 과립으로 제형화된다.
일 실시예에서, 상기 조성물은 글루코스(e.g., 당밀의 형태), 글리세롤 및/또는 글리세린를 포함하거나, 또는 추가로 건조 생성물의 저장 및 운송 동안 삼투압을 촉진시킬 수 있도록 삼투압 조절(osmoticum) 물질를 포함한다.
상기 조성물은 단독 또는 다른 화합물과 조합하여 사용될 수 있거나, 식물 건강, 성장 및/또는 수확량을 효율적으로 증가시키거나, 및/또는 제1 및 제2 미생물의 성장을 보충하기 위한 방법과 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 일 실시예에서, 상기 조성물은 식물 및/또는 미생물 성장을 증진시키는 영양소 및/또는 마이크로영양소, 예를 들어 마그네슘, 포스페이트, 질소, 포타슘, 셀레늄, 칼슘, 황, 철, 구리, 및 아연; 및/또는 하나 이상의 프리바이오틱스, 예를 들어 켈프 추출물, 풀브산, 키틴, 휴메이트 및/또는 휴민산을 포함하거나 및/또는 함께 사용될 수 있다. 정확한 물질 및 이의 정량은 본 개시 내용의 혜택을 받는 재배업자 또는 농업 과학자에 의해 결정될 수 있다.
조성물은 또한 다른 농업 화합물 및/또는 작물 관리 시스템과 함께 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 조성물은 선택적으로, 예를 들어 자연 및/또는 화학적 살충제, 퇴치제, 제초제, 비료, 수처리, 비이온성 계면활성제 및/또는 토양 개량제를 포함하거나 함께 사용될 수 있다. 그러나 바람직하게는, 상기 조성물은 베노밀, 도데실 디메틸 암모늄 클로라이드, 이산화수소/퍼옥시아세트산, 이마질릴(imazilil), 프로피코나졸, 터부코나졸, 또는 트리플루미졸을 포함하지 않거나 및/또는 함께 사용되지 않는다.
조성물이 호환가능한 화학적 첨가제와 혼합된다면, 화학제들은 상기 조성물의 첨가 전에 물과 함께 희석되는 것이 바람직하다.
상기 조성물에 추가 성분, 예를 들어, 완충제, 담체, 동일하거나 다른 설비에서 생산된 다른 미생물-기반 조성물, 점도 조절제, 방부제, 미생물 성장을 위한 영양제, 추적제, 살생제, 다른 미생물, 계면활성제, 에멀화제, 윤활제, 용해성 제어제, pH 조절제, 방부제, 안정화제 및 UV 광 억제제이 추가될 수 있다.
인간 또는 동물 식이 보충 제형
특정 실시예에서, 조성물은 인간 및/또는 동물 식이 보충 또는 소화 보조제로서 제형화된다.
특정 실시예에서, 사료 내 이스트의 사용은 단백질 및/또는 다당류가 풍부한 원료를 제공한다. 일 실시예에서, 본 조성물은 인간 및/또는 동물의 식이를 보충하거나 및/또는 건강 및/또는 웰빙을 촉진하기 위한 추가 영양소, 예를 들어 아미노산 (필수 아미노산을 포함), 펩티드, 단백질, 비타민, 미량원소, 지방, 지방산, 지질, 탄수화물, 스테롤, 효소, 프리바이오틱스, 및 미량 미네랄의 원료를 포함할 수 있다.
바람직한 조성물은 임의 조합으로 비타민 및/또는 미네랄을 포함한다. 본 발명의 조성물에 사용되는 비타민은 예를 들어, 비타민 A, E, K3, D3, B1, B3, B6, B12, C, 비오틴, 엽산, 판토텐산, 니코틴산, 콜린 클로라이드, 이노시톨 및 파라-아미노-벤조산 산을 포함할 수 있다. 미네랄은 예를 들어, 칼슘, 코발트, 구리, 철, 마그네슘, 포타슘, 셀레늄 및 아연의 염을 포함할 수 있다. 다른 성분들은, 이에 한정되지는 않지만, 항산화제, 베타-글루칸, 담즙 염, 콜레스테롤, 효소, 카로테노이드, 및 많은 다른 것들을 포함할 수 있다.전형적인 비타민 및 미네랄은, 정확한 함량은 변화할 수 있지만, 예를 들어 매일 권장량(RDA) 및 매일 권장 소비량으로 추천된 것들이다. 상기 조성물은 바람직하게는 RDA 비타민, 미네랄 및 미량 미네랄의 복합체뿐만 아니라 RDA를 성립하지 않은 영양소를 포함하나 건강한 포유류 생리학에서 유리한 역할을 하는 영양소들을 포함한다.
일부 실시예에서, 피트산염 및/또는 피트산의 원료는 조성물과 사전 혼합되어, 조성물 내 피타아제와 접촉할 때, 조성물이 인간 또는 동물 대상에 투여시 이용가능한 무기 인을 용이하게 제공할 수 있다. 피트산염 및/또는 피트산의 원료는 예를 들어, 아몬드, 호두, 아마씨, 콩과 식물, 귀리, 및 전곡일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 조성물은 사전에 만들어진 습식 또는 건식 동물 사료를 더 포함할 수 있고, 상기 사전제작된 식품은 동물 소비에 용이하도록 조리 및/또는 가공되어 있다. 예를 들어, 미생물 및/또는 성장 부산물은 사전 제작된 식품에 부어지거나 및/또는 혼합될 수 있거나, 또는 미생물 및/또는 성장 부산물은 건조 동물 사료 조각의 외부에 코팅으로서, e.g., 작은 조각(morsel), 알갱이(kibbles) 또는 펠렛으로 사용된다.
일 실시예에서, 상기 조성물은 동물 사료를 제조하기 위한 원료 성분을 더 포함할 수 있고, 상기 원료 성분은, 미생물 및/또는 성장 부산물과 함께 조리 및/또는 가공되어 개선된 건식 또는 습식 사료 생성물을 만든다.
일부 실시예에서, 상기 조성물은 내장 내 유리한 미생물의 성장을 뒷받침하는 프리바이오틱스를 더 포함한다. 프리바이오틱스는 예를 들어 프룩탄 및 크실란으로부터 유래한 발효성 섬유, 인눌린, 프락토올리고당, 자일로올리고당 및 갈락토올리고당을 포함할 수 있다. 프리바이오틱스를 포함하는 것으로 알려진 식품은, 예를 들어, 치커리 뿌리, 양파, 마늘, 리크(leek), 귀리밀, 밀 겨, 아스파라거스, 민들레 잎, 예루살렘 아티초크, 및 바나나를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 조성물은 경구-소모성 생성물로 제형되고 동물 또는 인간 대상에 경구적으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 경구-소모성 생성물은 소비, 영양, 구강 위생 또는 즐거움에 적당한 임의 제제 또는 조성물이며, 인간 또는 동물 구강 구멍 내로 투여하여 특정의 기간 동안 구강 내에 남게 하고 삼켜지거나(e.g., 소비에 용이한 보조제, 식품), 또는 구강으로부터 다시 제거되는(e.g., 구강 위생 또는 의학적 입 세척을 위하한 씹는 껌 또는 생성물) 것으로 의도된 생성물들이다. 이들 생성물은 가공, 반가공 또는 미가공 상태로 인간 또는 동물에 의해 삼켜지도록 의도된 모든 물질 또는 생성물을 포함한다. 이는 또한 이들 제조, 치료 또는 가공 동안 구강 소비가능한 생성물(특히 식품 및 약제학적 식품)에 투여되는 물질 또는 인간 또는 동물 구강 내로 도입되도록 의도된 물질을 포함한다.
경구 소모가능한 생성물은 또한 인간 또는 동물에 의해 삼켜진 후 변형없이, 제조되거나 또는 가공된 상태로 소화되도록 의도된 물질을 포함할 수 있으며; 본 발명에 따른 경구 소모가능한 생성물은 그러므로 생성물과 함께 삼켜지거나 또는 삼킴이 예상되는 케이싱, 코팅 또는 다른 캡슐포장을 포함한다.
특정 실시예에서, 조성물은 예를 들어 에너지원, 영양소 및/또는 다른 건강-촉진 보충제, 향료, 방부제, pH 조절제, 감미제 및/또는 염료인 성분들을 더 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 조성물은 물의 첨가로 마실 수 있는 유체로 재구성될 수 있는 탈수화된 분말 또는 농축물로서 제형된다. 일 실시예에서, 조성물은 혼합된 스무디 또는 밀크쉐이크로서 제형된다.
일 실시예에서, 상기 조성물은 GI 관 내로 직접 투여하도록 제형될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 대장내시경을 통해 하부 근위(proximal lower) GI, 관장 또는 직장 튜브를 통해 하부 말단(distal lower) GI, 코위관(nasogastric tube), 십이지장 튜브, 및 내시경검사/위내시경검사을 통해 상부 GI 관에 투여하도록 제형될 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명은 인간 또는 동물의 소화관 내 인 흡수를 증가시켜 인간 또는 동물의 전체 건강 및 웰빙을 증가시키는데 사용될 수 있다.
미생물의 발효
본 발명은 미생물을 배양하고 미생물 대사산물 및/또는 성장 부산물을 제조하는 방법을 이용한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 바이오매스, 세포외(extracellular) 대사산물, 잔류 영양소 및/또는 세포 내 성분의 제조를 위한 물질 및 방법을 제공한다.
본 발명은 임의 원하는 규모, 소규모(e.g., 실험실 세팅)로부터 대규모(e.g., 산업적 세팅)로 미생물 배양 및 미생물 대사산물의 제조에 적당한 배양 공정을 이용한다. 이들 배양 공정은, 이에 한정되지는 않지만, 수중 배양/발효, 고체상발효 (SSF), 및 이들의 조합, 하이브리드 및/또는 변형을 포함한다.
여기 사용된 "발효" 또는 "배양"은 제어된 조건하에서 세포의 성장을 의미한다. 성장은 혐기성 또는 호기성일 수 있다.
본 발명에 따라 사용된 미생물 성장 용기는 산업적 용도를 위한 임의 발효기 또는 배양 반응기일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 용기는 기능성 컨트롤/센서를 가지거나 또는 기능성 컨트롤/센서에 연결되어 배양 공정에서 중요한 인자들, 예를 들어 pH, 산소, 압력, 온도, 교반기 샤프트 파워, 습도, 점도 및/또는 미생물 밀도 및/또는 대사산물 농도를 측정할 수 있다.
용기는 또한 용기 내 미생물의 성장을 모니터링 할 수 있다(e.g., 세포 수 및 성장 단계의 측정). 대안적으로, 매일 샘플은 용기로부터 취하여 당해 기술 분야에서 알려진 기술들, 예를 들어 희석액 플레이팅 기술에 의해 계산될 수 있다.
바람직한 실시예에서, 다중 미생물 성장 용기를 포함하는 미생물 성장 설비는 신선하고, 고밀도의 원하는 미생물 및/또는 미생물 성장 부산물을 원하는 규모로 생산한다. 미생물 성장 설비는 사용 사이트에 또는 근처에 위치될 수 있다. 설비는 배치, 반-연속적 또는 연속적 배양으로 고밀도 미생물-기반 조성물을 생산한다.
분포된 미생물 성장 설비는 미생물-기반 생성물이 사용될 위치(e.g., 밭 또는 물고기 농장)에 위치될 수 있다. 예를 들어, 미생물 성장 설비는 사용 위치로부터 300, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 15, 10, 5, 3, 또는 1 mile 이하일 수 있거나 또는 사용 위치에 직접 위치될 수 있다.
특정 실시예에서, 제조는 지역적 및 또는 분포된 발효 방법을 사용하여 얻어질 수도 있고 얻어지지 않을 수도 있으며, 이는 종래 방법이 본 발명에 따라 또한 사용될 수 있다는 것을 의미한다. 그러나, 여기 설명된 지역적 및/또는 분포된 미생물 성장 설비는 업스트림 공정 지연, 공급 사슬 병목(supply chain bottleneck), 부적절한 저장, 및 유용한 생성물의 시간내 배송 및 사용을 방해하는 다른 사태들로 인하여 생성물 품질이 나빠지는 먼거리 산업적 규모의 제조업자들에게 주어지는 현재 문제들에 대해 해결책을 제공한다.
미생물 성장 설비는 미생물 자체, 미생물 대사산물, 및/또는 미생물이 성장하는 브로스의 다른 성분들을 포함하는 신선한, 미생물-기반 조성물을 제조한다. 원한다면, 조성물은 높은 밀도의 영양 세포, 불활성 세포, 번식체, 또는 영양 세포, 불활성 세포 및/또는 번식체의 혼합물을 가질 수 있다.
유리하게, 상기 조성물은 특정 위치에 사용하기 위하여 맞춤형 제작될 수 있다. 일 실시예에서, 미생물 성장 설비는 미생물-기반 생성물이 사용될 사이트에, 또는 근처에 위치된다. 상기 미생물 설비는 예를 들어 태양, 바람, 및/또는 수력발전을 이용하여 공공 설비를 사용하지 않을 수 있다.
미생물 성장 설비는 목적지 지형과의 시너지를 개선하기 위하여 미생물-기반 생성물을 재단하는 능력으로 제조 다양성을 제공한다. 예를 들어 본 발명의 시스템은 자연-발생하는 지역 미생물 및 이들의 대사적 부산물의 힘을 이용할 수 있다. 지역 미생물은 예를 들어 내염성(salt tolerance), 고온에서의 성장 능력, 및/또는 특정 대사산물 제조 능력을 기반으로 확인될 수 있다.
미생물-기반 생성물은 사용 사이트에 또는 근처에서 제조되기 때문에, 종래 제조의 안정화, 보존, 장기 저장 및 확장된 운송 공정의 요구사항없이, 매우 높은 밀도의 살아있는(또는 불활성) 미생물 및/또는 이들의 번식체를 생산할 수 있으므로, 현장 사용에서 미생물-기반 생성물을 매우 작은 부피로 만들거나 또는 필요한 경우 매우 높은 밀도의 미생물 사용이 가능하게 한다. 이것은 세포 안정화를 할 필요없이, 외래 약제 및 원하지 않는 미생물로부터의 오염 가능성을 줄이고, 미생물 성장의 부산물의 활성을 유지하고, 효율적인 규모가 작은 바이오반응기(e.g. 보다 작은 발효 탱크 및 보다 작은 부피의 출발 물질, 영양소, pH 제어제, 및 소포제, etc.)를 가능하게 한다. 지역적으로-생산된 고밀도의 건전한 미생물 배양액은 영양 세포 안정화가 되거나 또는 한동안 공급 사슬에 안착되는 것들보다 밭에서 더 효과적이다.
미생물-기반 생성물의 지역적 생산은 또한 생성물 내 발효 브로스를 포함시키는 것을 용이하게 한다. 브로스는 지역적 사용에 특히 적당한 발효 동안 생산된 약제들을 포함할 수 있다. 이것으로 생성물의 호환성을 더 용이하게 한다.
줄어든 이송 시간들은 미생물 및/또는 이들의 대사산물을 지역적 요구에 따른 시간 및 부피로 미생물 및/또는 이들의 대사산물의 신선한 배치를 제조 및 이송할 수 있게 한다. 예를 들어 발효 24시간 내 지역적 생산 및 배송은 순수하고, 높은 세포 밀도 조성물을 결과적으로 가져오고 실질적으로 운송 단가를 낮춘다. 보다 효과적이고 강력한 미생물 접종원 개발을 빠르게 발전시킬 가능성이 주어진다면, 소비자들은 미생물-기반 생성물을 빠르게 배송하는 이 능력으로부터 큰 이익을 얻을 것이다.
일 실시예에서, 종래 방법을 사용하거나 또는 지역적 또는 분포된 시스템을 사용하여 수행되거나 하는 배양 방법은, 당밀, 우레아 및 펩톤을 포함하는 배양 배지를 이용한다.
일 실시예에서, 당밀의 농도는 2 내지 6%, 바람직하게는 4%이다. 일 실시예에서, 우레아 농도는 0.01 내지 1.0%, 바람직하게는 0.2%이다. 일 실시예에서, 펩톤의 농도는1.0 내지 5%, 바람직하게는 2.5%이다.
일 실시예에서, 상기 방법은 질소 원료로 배양을 보충하는 단계를 포함한다. 질소 원료는, 예를 들어, 포타슘 니트레이트, 암모늄 니트레이트, 암모늄 설페이트, 암모늄 포스페이트, 암모니아, 우레아, 및/또는 암모늄 클로라이드일 수 있다. 이들 질소 원료는 독립적으로 또는 2이상 조합해서 사용될 수 있다.
배양 방법은 성장하는 배양액에 산소화를 시킬 수 있다. 하나의 예는 공기의 움직임을 느리게 하여 저-산소 함량 공기를 제거하고 산호화된 공기를 도입한다. 산소화된 공기는 액체의 기계적 교반을 위한 임펠러, 및 액체 내 산소 용해를 위해 액체에 공기 방울을 공급하는 공기 스파저를 포함하는 장치를 통해 매일 공급되는 대기 공기일 수 있다.
상기 방법은 배양에 탄소 원료를 보충하는 단계를 더 포함할 수 있다. 탄소 원료는 전형적으로, 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 수크로오스, 락토오스, 프룩토오스, 트레할로오스, 만노오스, 만니톨, 및/또는 말토오스; 유기산, 예를 들어 아세트산, 푸마르산, 시트르산, 프로피온산, 말산, 말론산, 및/또는 피루브산; 알코올, 예를 들어 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 헥산올, 이소부탄올, 및/또는 글리세롤; 지방 및 오일, 예를 들어 콩 오일, 쌀 겨 오일, 카놀라 오일, 해바라기 오일, 올리브 오일, 곡식 오일, 참기름, 및/또는 아마인 오일이다. 이들 탄소 원료는 독립적으로 또는 2이상 조합하여 사용될 수 있다.
일 실시예에서, 미생물을 위한 성장 인자 및 미량 영양소는 배지 내에 포함된다. 이는 특히 이들이 필요로 하는 모든 비타민을 생산할 수 없는 미생물 성장시에 특히 바람직하다. 미량 원소들, 예를 들어 철, 아연, 구리, 망간, 몰리브덴 및/또는 코발트을 포함하는 무기 영양소는 또한 배지에 포함될 수 있다. 게다가, 비타민, 필수 아미노산 및 미량 원소의 원료는, 예를 들어 가루 또는 으깬 곡물(meal) 형태, 예를 곡식 분말, 또는 추출물 형태, 예를 들어 이스트 추출물, 감자 추출물, 소고기 추출물, 콩 추출물, 바나나 껍질 추출물, 및 이와 유사한 것, 또는 정제된 형태로 포함될 수 있다. 아미노산, 예를 들어, 단백질 생합성에 유용한 것들 e.g., L-알라닌이 또한 포함될 수 있다.
일 실시예에서, 무기 염이 또한 포함될 수 있다. 사용가능한 무기 염은 포타슘 디히드로겐 포스페이트, 디포타슘 히드로겐 포스페이트, 디소듐 히드로겐 포스페이트, 마그네슘 설페이트, 마그네슘 클로라이드, 철 설페이트, 철 클로라이드, 망간 설페이트, 망간 클로라이드, 아연 설페이트, 납 클로라이드, 구리 설페이트, 칼슘 클로라이드, 칼슘 카보네이트, 및/또는 소듐 카보네이트일 수 있다. 이들 무기 염은 독립적으로 또는 2이상 조합하여 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 배양 방법은 배양 공정 전, 및/또는 동안 액체 배지 내에 추가 산 및/또는 항미생물을 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 항미생물제 또는 항생제는 오염에 대하여 배양액을 보호하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, Streptomyces erythromycin, 홉(hop) 또는 홉산(hop acid), 및/또는 소량, e.g., 50-100 ppm의 소포로리피드 또는 다른 바이오계면활성제를 항박테리아제로서 영양 배지에 첨가할 수 있다. 추가적으로, 소포제는 배양 동안 기포의 형성 및/또는 축적을 방지하기 위하여 첨가될 수 있다.
상기 혼합물의 pH는 관심있는 미생물에 적당해야 한다. 완충제, 및 pH 조정제, 예를 들어 카보네이트 및 포스페이트는 바람직한 값 근처 pH를 안정화하기 위하여 사용될 수 있다. pH 대조는 배양액의 오염을 방지하기 위하여 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 배양은 이스트 성장(e.g., 3.0-3.5)에 적당한 낮은 pH에서 시작될 수 있고, 이스트 축적(e.g., 4.5-5.0까지) 후 증가되고, 발효 잔여물을 위해 안정화된다. 금속 이온이 고농도로 존재할 때, 액체 배지 내에 킬레이트제를 사용할 필요가 있을 수 있다.
미생물은 플랑크톤 형태 또는 바이오필름으로 성장될 수 있다. 바이오필름의 경우에, 용기는 미생물이 바이오필름 상태로 성장될 수 있는 기판을 그 안에 가질 수 있다. 이 시스템은 또한, 예를 들어 바이오필름 성장 특성을 키우게 하거나 및/또는 개선하는 자극(예를 들어, 전단 응력)을 사용하는 능력을 가질 수 있다.
일 실시예에서, 미생물의 배양 방법은 약 5℃ 내지 약 100℃, 바람직하게는, 15℃ 내지 60℃, 보다 바람직하게는, 25℃ 내지 50℃에서 수행된다. 추가 실시예에서, 배양은 고정된 온도에서 계속적으로 수행될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 배양은 온도를 변화시켜 수행될 수 있다.
일 실시예에서, 본 방법 및 배양 공정에서 사용된 도구는 멸균된다. 배양 도구, 예를 들어 반응기/용기는 멸균 장치, e.g., 오토클레이브로부터 떨어져 있으나, 연결되어 있다. 배양 도구는 또한 접종 시작 전에 스스로 멸균을 하는 멸균 장치를 가질 수 있다. 공기는 당해 기술 분야에 알려진 방법들로 멸균될 수 있다. 예를 들어, 대기 공기는 용기 내로 도입되기 전에 적어도 하나의 필터를 통과할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 배지는 저온살균되거나, 선택적으로 낮은 수분 활성도 및 낮은 pH를 사용하여 박테리아 성장을 제어하는 경우에 전혀 가열되지 않을 수 있다.
또 다른 실시예에서, 배양 시스템은 자체 멸균될 수 있으며, 이는 배양된 유기체가 항미생물 성장 부산물 또는 대사산물을 생산하므로 다른 유기체로 인한 오염을 방지할 수 있다는 것을 의미한다.
일 실시예에서, 계면활성제, 효소, 대사산물, 및/또는 다른 단백질은 본 발명의 미생물 균주를 그의 성장과 생성에 적당한 조건하에서 배양; 및 선택적으로 관심 있는 미생물 성장 부산물을 농축 및 정제하는 것으로 생성된다. 바람직한 실시예에서, 성장 부산물은 효소, 보다 바람직하게는 피타아제이다.
원하는 미생물로 생성된 미생물 성장 부산물은 미생물 내에 함유되어 있거나 또는 성장 배지 내로 분비될 수 있다. 선택적으로, 성장 배지는 미생물 성장 부산물의 활성을 안정화시키는 화합물을 포함할 수 있다.
발효 브로스의 바이오매스 함량은, 예를 들어 5 g/l 내지 180 g/l 또는 그 이상, 또는 10 g/l 내지 150 g/l이다.
성장 용기 또는 용기들로부터 미생물-기반 생성물을 수확하는 시간일 때, 미생물 성장 결과 얻어진 미생물 및/또는 브로스는 성장 용기로부터 제거되거나, 및 예를 들어 중간 사용을 위하여 파이프를 통해 이송될 수 있다. 미생물은 활성 또는 불활성 형태이거나, 또는 활성 및 불활성 미생물들의 조합을 포함할 수 있다.
조성물(미생물, 브로스, 또는 미생물 및 브로스)는, 예를 들어 의도한 용도, 사용에 고려된 방법, 발효 탱크의 크기 및 미생물 성장 설비로부터 사용할 위치까지의 운송 모드를 고려하여, 적당한 크기의 용기 내에 놓여질 수 있다. 그러므로, 미생물 기반 조성물이 놓여지는 컨테이너는, 예를 들어 1갤론 내지 1,000 갤론 또는 그 이상일 수 있다. 특정 실시예에서 상기 컨테이너는 2 갤런, 5 갤런, 25 갤런, 또는 그 보다 클 수 있다.
수확된 생성물들이 컨테이너 및/또는 파이프(또는 사용을 위한 다른 운송 수단)에 놓여짐에 따라 추가 성분들이 첨가될 수 있다. 첨가제들은, 예를 들어, 완충제, 담체, 동일하거나 다른 설비에서 생산된 다른 미생물-기반 조성물, 점도 조절제, 방부제, 미생물 성장용 영양소, 추적제, 살충제, 및 의도한 용도에 특화된 다른 성분들일 수 있다.
일 실시예에서, 미생물 배양 조성물의 모든 것들은 배양 완료 시(예를 들어, 원하는 세포 밀도에 도달, 브로스 내 특정 대사산물의 원하는 밀도에 도달) 제거된다. 배치 절차에서, 전체적으로 새로운 배치는 제1 배치 수확 시 시작된다.
또 다른 실시예에서, 발효 생성물의 단지 일부만이 아무 때나 제거된다. 일 실시예에서, 활력있는 세포를 갖는 바이오매스는 새로운 배양 배치를 위한 접종원으로 용기 내에 남는다. 제거된 조성물은 세포가 없는 브로스 또는 세포를 포함할 수 있다. 이 방법으로, 반-연속적 시스템이 만들어진다.
미생물-기반 생성물의 제조
본 발명의 하나의 미생물-기반 생성물은 단순히 미생물 및/또는 상기 미생물에 의해 제조된 미생물 대사산물 및/또는 임의 잔류 영양소를 포함하는 발효 브로스이다. 발효의 생성물은 추출 또는 정제 없이 바로 사용될 수 있다. 원한다면, 추출 및 정제는 문헌에 설명된 표준 추출 및/또는 정제 방법 또는 기술을 사용하여 용이하게 얻어질 수 있다.
미생물-기반 생성물 내 미생물은 활성 또는 불활성 형태일 수 있다. 상기 미생물-기반 생성물은 활성 및 불활성 미생물의 조합을 포함할 수 있다.
미생물-기반 생성물은 추가적인 안정화, 보존 및 저장 없이 사용될 수 있다. 유리하게, 이들 미생물 기반 생성물의 즉각적인 사용은 미생물의 높은 생존력을 보존하고, 외래 약제 및 원하지 않은 미생물로부터 오염 가능성을 줄이고, 미생물 성장의 부산물의 활성을 유지한다.
미생물 및/또는 미생물 성장 결과의 브로스는 상기 성장 용기로부터 제거되고, 예를 들어 중간 사용을 위하여 파이핑을 통해 운송된다. 다른 실시예에서, 상술한 것처럼, 조성물(미생물, 브로스, 또는 미생물 및 브로스)는 적당한 크기의 컨테이너 내에 놓여질 수 있다.
성장 용기로부터 미생물-기반 조성물을 수확할 때, 수확된 생성물이 컨테이너 및/또는 파이프(또는 사용을 위한 다른 운송 수단) 내에 놓여지기 때문에 추가 성분이 첨가될 수 있다. 첨가제는 예를 들어, 완충제, 담체, 아주반트, 동일하거나 다른 설비에서 생산된 다른 미생물-기반 조성물, 점도 조절제, 방부제, 미생물 성장용 영양소, 추적제, 살생제, 다른 미생물, 비생물학적 계면활성제, 에멀화제, 윤활제, 완충제, 용해성 제어제, pH 조절제, 안정화제, UV 광 억제제 및 의도한 용도에 특화된 성분들일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 조성물은 바람직한 값 근처로 pH를 안정화시키기 위하여 유기산 및 또는 아미노산 또는 이들의 염을 포함하는 완충제를 더 포함할 수 있다. 미생물-기반 조성물의 pH는 관심있는 미생물에 적당해야만 한다.
적당한 완충제는, 이에 한정되지는 않지만, 시트레이트, 글루코네이트, 타르타레이트, 말레이트, 아세테이트, 락테이트, 옥살레이트, 아스파르테이트, 말로네이트, 글루코헵토네이트, 피루베이트, 갈락타레이트, 글루카레이트, 타르트로네이트, 글루타메이트, 글리신, 리신, 글루타민, 메티오닌, 시스테인, 아르기닌 및 이들의 혼합물을 포함한다. 인산(Phosphoric acid)및 인 산(phosphorus acid) 또는 이들의 염이 또한 사용된다. 합성 완충제가 사용되기에 적당할 수 있으나, 천연 완충제, 예를 들어 유기산 및 아미노산 또는 이들의 염을 사용하는 것이 바람직하다.
추가 실시예에서, pH 조절제는 포타슘 히드록시드, 암모늄 히드록시드, 포타슘 카보네이트 또는 바이카보네이트, 염산, 질산, 황산 및 이들의 혼합물을 포함한다.
일 실시예에서, 추가 성분, 예를 들어 염, 예를 들어 소듐 바이카보네이트 또는 카보네이트, 소듐 설페이트, 소듐 포스페이트, 또는 소듐 바이포스페이트의 수성 제조는, 미생물-기반 조성물 내에 포함될 수 있다.
유리하게, 미생물-기반 생성물은 미생물이 성장한 브로스를 포함할 수 있다. 상기 생성물은, 예를 들어 적어도 중량으로, 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 100% 브로스일 수 있다. 생성물 내 바이오매스의 함량은 중량으로, 예를 들어 0% 내지 100%의 범위에서 이들 사이의 모든 퍼센트가 포함될 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명의 미생물-기반 조성물은 담체를 더 포함한다. 담체는 생성물이 생존가능하게 남아있도록하거나, 또는 불활성 이스트의 경우 효과적이 되게 하는데 필요한 성분을 유지하도록 하는 방법으로 이스트 또는 이스트 성장 부산물을 목적 식물, 토양, 동물, 물고기 등에 배송될 수 있게 하는 당해 기술 분야에 잘 알려진 임의 적당한 담체일 수 있다.
담체는 정제, 캡슐, 과립 또는 분말화된 형태로 제형화 시키기 위한 고체-기반, 건조 물질을 포함하거나; 또는 담체는 액체 또는 겔 형태로 제형하기 위한 액체 또는 겔-기반 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 담체는 물, 염분, 바이오폴리머, 천연 식물 섬유, 물질들 예를 들어 점토, 사일러지, 질석, 부석, 또는 종이 슬러지를 포함할 수 있다.
특정 실시예에서, 특히 농업 측면에서, 미생물-기반 조성물은 조성물의 효능을 증가시키기 위하여 아주반트를 더 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 아주반트는 하나 이상의 켈프 추출물, 키틴, 풀브산, 휴민산 및 휴메이트로부터 선택된다.
선택적으로 상기 조성물은 사용 전에 저장될 수 있다. 상기 저장 시간은 짧은 것이 바람직하다. 그러므로 저장 시간은 60일, 45일, 30일, 20일, 15일, 10일, 7일, 5일, 3일, 2일, 1일, 또는 12 시간 미만일 수 있다. 바람직한 실시예에서, 만약 살아있는 세포가 생성물 내에 존재한다면, 생성물은 차가운 온도, 예를 들어, 20℃, 15℃, 10℃, 또는 5℃ 미만에서 저장된다. 다른 한편, 바이오계면활성제 조성물은 대기 온도에서 전형적으로 저장될 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명의 미생물-기반 생성물은 예를 들어 전체 미생물 배양액의 사용으로 인하여 정제된 미생물 대사산물 단독 보다 유리하다. 이들 장점은 다음 중 하나 이상을 포함한다: 이스트 세포벽 외부 표면의 일부로서 고농도 마노단백질; 이스트 세포벽 내 베타-글루칸의 존재; 배양액 내 바이오계면활성제의 존재; 및 배양액 내 용매 및 다른 대사산물의 존재. 이들 장점은 활성 또는 불활성 이스트를 사용할 때 존재한다.
미생물-기반 조성물은 예를 들어, 액체 현탁액, 에멀젼, 동결- 또는 스프레이-건조 분말, 과립, 펠렛, 또는 겔의 형태로 미생물-기반 생성물으로 제형화될 수 있다. 바람직하게는, 특정 사용을 위해서 다른 제형이 적당하기 때문에 다른 제형이 가시화될 수 있음에도 불구하고 액체 형태로 조성물이 이용된다.
일 실시예에서, 특히 가축 또는 수경 재배 분야에 사용하기 위하여, 미생물-기반 생성물은 펠렛당 미생물-기반 조성물을 균일한 농도로 포함하는 사료 펠렛으로 제형화될 수 있다. 사료 펠렛을 제조하기 위한 기존 방법이 가압화된 밀링 단계를 포함하여 이들을 제조하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 펠렛화 공정은 "차가운" 펠렛화 또는 높은 열 또는 스팀을 사용하지 않은 공정이다.
일 실시예에서, 특히 수성 분야에 사용하기 위하여, 미생물 균주는 불활성 미생물-기반 조성물을 제조할 목적으로 배양된다. 상기 조성물은 원하는 미생물을 배양하고, 마이크로-유체화(또는 단백질 변성을 야기하지 않도록 당해 기술 분야에 알려진 임의 다른 방법)에 의해 미생물을 불활성하고, 저온살균하고 이를 농축된 형태로 식품 품목들에 첨가되는 것으로 제조된다. 일 실시예에서, 불활성화는 저온살균 온도(100%의 이스트 세포를 불활성화시키기에 충분한 시간 동안 65℃~70℃까지)에서 일어나고 pH 값을 약 10.0까지 증가시킨다. 이는 세포의 부분적 가수분해를 유도하고 그 안의 일부 영양 성분들이 나올 수 있게 한다. 그 후 조성물은 pH 약 7.0~7.5로 중성화하고 가수분해의 다양한 성분들이 혼합된다. 얻어진 미생물-기반 생성물은 이후 예를 들어 물고기 사료 및 물고기 농장 물의 처리에 사용될 수 있다.
본 발명의 미생물-기반 생성물은 세포들이 발효 성장 배지 내에 존재하는 대사산물 및 영양소로부터 분리되는 전통 생성물에 비하여 특히 유리하다.
본 발명에 따라 성장된 미생물 균주
본 발명의 시스템 및 방법에 따라 성장한 미생물은, 예를 들어, 박테리아, 이스트 및/또는 곰팡이일 수 있다. 이들 미생물은 천연, 또는 유전적으로 변형된 미생물일 수 있다. 예를 들어, 미생물은 특정 특성을 나타내는 특정 유전자로 변형될 수 있다. 미생물은 원하는 균주의 돌연변이일 수 있다. 여기 사용된, "돌연변이" 는 참조 미생물의 균주, 유전적 변이체 또는 서브타입을 의미하며, 상기 돌연변이는 표준 미생물에 비하여 하나 이상의 유전적 변이(e.g., 점 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 결실, 중복, 틀이동 돌연변이 또는 반복 서열 증가(repeat expansion))를 갖는다. 돌연변이를 제조하는 절차는 미생물학적 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, UV 돌연변이 유발 및 니트로소구아니딘이 본 목적으로 널리 사용된다.
바람직한 실시예에서, 미생물은 유전적으로 변형되지 않는다.
특정 실시예에서, 상기 미생물은 "킬러 이스트"로 알려진 임의 이스트이다. 여기 사용된, "킬러 이스트" 는 독성 단백질 또는 글리코단백질의 분비로 특성화되는 이스트 균주로서, 이에 대해 균주 자체는 면역성이 있는 이스트 균주를 의미한다. 그러한 이스트는 이에 한정되지는 않지만, Wickerhamomyces (e.g., W. anomalus), Pichia (e.g., P. anomala, P. guilliermondii, P. occidentalis, P. kudriavzevii), Hansenula, Saccharomyces, Hanseniaspora, (e.g., H. uvarum), Debaryomyces (e.g., D. hansenii), C및ida, Cryptococcus, Kluyveromyces, Torulopsis, Ustilago (e.g., U. maydis), Williopsis, Zygosaccharomyces (e.g., Z. bailii), 및 다른 것들을 포함할 수 있다.
구체적인 실시예에서, 본 발명은 피타아제-생산 킬러 이스트를 사용한다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 미생물은 Wickerhamomyces anomalus (Pichia anomala)을 포함한다.
이들 이스트는 유리한 대사산물을 제조하는 이들의 능력을 포함하여, 본 발명에 사용되는 유리한 수 많은 특성들을 갖는다. 예를 들어, W. anomalus는 엑소-β-1,3-글루카나아제 활성이 광범위한 스펙트럼의 병원성 곰팡이의 성장을 억제하거나 제어할 수 있게 할 수 있다. 추가적으로, 5~7일 동안 배양한다면 W. anomalus는 물의 표면/계면 장력을 줄일뿐만 아니라 항미생물 및 항곰팡이 성질을 나타내는 당지질 바이오계면활성제를 생산한다.
다양한 부산물외에, 이들 이스트는 피타아제를 생성하고 수 많은 단백질(건조 세포 바이오매스 50%까지 포함), 지질 및 탄소 원료를 생산할 뿐만 아니라 완전한 스펙트럼의 미네랄 및 비타민(B1; B2; B3 (PP); B5; B7 (H); B6; E)을 제공할 수 있다.
다른 미생물 균주, 예를 들어 대량 함량의 예를 들어, 효소(특히 피타아제), 산, 단백질, 바이오계면활성제, 미네랄 또는 비타민으로서 인간 건강, 농업, 원예, 조경, 삼림학, 가축 사육 및 수경재배에서 생산을 증가시키는 데 유용한 것들을 축적할 수 있는 다른 미생물 균주가 본 발명에 따라 또한 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, Pichia 및/또는 Wickerhamomyces 계통군의 다른 구성원들이 또한 사용되며, e.g., P. anomala, P. guilliermondii, P. occidentalis, 및/또는 P. kudriavzevii가 있다.
유기 물질로부터 포스페이트 분리 방법
특정 실시예에서, 본 발명은 피트산 함유 유기 물질로부터 포스페이트를 분리하는 환경 친화적이고, 가격 효율적인 물질 및 방법을 제공한다. 일 실시예에서, 본 발명의 조성물을 사용하는 작물 성장 및 수확량을 증가시키기 위하여 토양을 비옥하게 하는 방법이 또한 사용된다. 다른 실시예에서, 본 발명의 조성물을 이용하는 가축 사용 및/또는 농장 물고기 사용을 위한 방법이 제공된다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 조성물을 이용하는 인간 대상의 건강을 증진시키는 방법이 제공된다.
본 발명은 유기 폐기물의 재활용뿐만 아니라 비타민, 미네랄 및 중요하게는 그 안에 남아있는 인의 방출을 가능하게 한다. 게다가, 본 조성물 및 방법은 생분해가능하고 독성적으로 안전한 성분들을 사용한다. 그러므로, 본 발명은 농업, 삼림학 및 동물 농장의 생산을 증가시킬 뿐만 아니라 인간 건강을 "녹색" 치료로서 증가시키는데 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 본 방법은 유기 물질 내에 존재하는 피트산으로부터 포스페이트를 분리하는 데 사용되며, 본 방법은 유기 물질에 효과적인 함량의 본 발명의 미생물-기반 조성물을 적용시키는 단계를 포함한다. 예를 들어 물 또는 다른 영양소(e.g., 영양소 및/또는 프리바이오틱스)과 같은 추가 성분들이 또한 사용될 수 있다. 미생물은 사용할 때 살아있거나(생존가능) 또는 불활성일 수 있다.
살아있는 미생물의 경우에, 상기 미생물은 사용하는 사이트 그 자리에서 성장하고 현장에서 임의 활성 화합물 또는 성장 부산물을 생산할 수 있다. 결과적으로, 고농도의 미생물 및 유리한 성장 부산물은 처리 사이트에서 연속적으로 용이하게 얻을 수 있다.
이 목적을 위하여, 사용 동안 미생물 성증을 증진시키는 물질들을 첨가하는 단계(e.g., 미생물 성장을 촉진시키는 영양소 첨가)를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 방법은 사용 전에 미생물-기반 조성물을 배양하는 단계를 더 포함한다. 바람직하게는, 미생물-기반 조성물 모두 또는 부분을 사용 사이트 또는 근처, 예를 들어 사용 사이트로부터 300miles 내에서 배양한다.
여기 사용된, 표적 또는 사이트에 조성물 또는 생성물을 "사용 또는 적용", 또는 표적 또는 사이트를 "처리"한다는 것은 조성물 또는 생성물이 그 위에서 효과를 나타내도록 표적 또는 사이트와 조성물 또는 생성물을 접촉시킨다는 것을 의미한다. 예를 들어, 미생물 성장 및/또는 대사산물, 효소, 바이오계면활성제 또는 다른 성장 부산물의 작용으로 인하여 효과가 나타날 수 있다. 유리하게, 본 발명의 조성물이 본 방법에 따라 유기 물질과 접촉될 때, 조성물 내 피타아제는 유기 물질 내 피트산염 또는 피트산의 가수분해를 촉매화할 수 있어, 식물, 인간, 및 동물에 의해 흡수가능한 인 부산물을, 예를 들어 무기 포스페이트 형태로 방출시킬 수 있다.
일 실시예에서, 본 미생물-기반 조성물의 사용은 유기 물질 위로 조성물을 붓거나, 스프레이 하거나 또는 스프링클하는 단계를 포함하고, 이후 선택적으로 당해 기술 분야에 알려진 임의 표준 혼합 장치 또는 기술을 사용하여 상기 조성물과 유기 물질을 혼합하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 본원 미생물-기반 조성물은 그의 원료로부터 수집되어 다른 위치에서 혼합된 유기 물질에 사용될 수 있다. 처리된 유기 물질은 이후 원하는 사용 사이트, 예를 들어 작물 밭으로 이송되고, 예를 들어 바이오 비료로서 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 본 방법에 따라 처리되는 상기 유기 물질은 유기 폐기물, 예를 들어 수확후 작물 잔류물, 예를 들어, 남은 곡식 줄기, 곡식 여물, 곡식 옥수수대 옥수수, 밀 짚, 콩 짚, 쌀 겨, 및 다른 식물 줄기, 잎, 뿌리 및 부분들을 포함할 수 있는 수확 후 작물 잔류물이다. 예를 들어, 식물-기반 퇴비, 거름, 곡식 잔류물, 셀룰로오스 또는 바이오매스 에탄올 생산(e.g., 주모, 리그닌 및 맥주박), 톱밥, 사용된 커피 가루, 및 낙엽 쓰레기(e.g., 나무, 헤지 및 잔디 깍아낸조각)를 포함하는 다른 타입의 유기 폐기물이 또한 가시화된다.
특정 실시예에서, 본 방법에 따라 처리된 유기 물질은 피트산염 또는 피트산을 포함하는 식물 물질이다. 예를 들어, 유기 식물 물질은 종자(e.g., 아마인, 아마씨, 유채씨, 콩, 및 해바라기 종자), 감자, 낟알(e.g., 밀, 쌀, 겨, 보리, 곡식, 호밀, 및 귀리), 콩과 식물 (e.g., 핀토빈, 덩굴강남콩, 흰강남콩 및 땅콩) 또는 너트 (e.g., 아몬드, 브라질 너트, 헤이즐넛 및 호두)일 수 있다.
일부 실시예에서, 포스페이트 방출이 일어나는 속도는 미생물-기반 조성물을 사용하기 전에 다지거나, 부시거나 또는 유기 물질의 개별 조각의 크기를 줄이는 것으로 증가될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 유기 물질은 수확 후 작물 밭에 남은 작물 잔류물이다. 작물 잔류물을 분해시킴에 따라, 식물 성장에 필요한 영양소가 토양 내로 방출된다. 본 발명은 이 분해 공정에 의해 방출된 이용불가능한 형태의 인을 식물-흡수가능한 형태로 전환시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 밭에 남겨진 작물 잔류물 위로 직접적으로 사용될 수 있다. 작물 잔류물 및 조성물은 토양의 표면에 남겨지거나, 또는 이들은 토양 내로 밭갈이 될 수 있다.
본 방법의 일 실시예에서, 상기 유기 물질은 토양이다. 본 발명의 미생물-기반 조성물은 토양에 직접 사용될 수 있거나, 또는 미생물-기반 조성물과 함께 사전 처리된 유기 물질은 토양에 사용될 수 있다. 선택적으로 조성물 및/또는 사전 처리된 유기 물질은 예를 들어 밭갈이에 의해 토양 내로 혼합되거나, 또는 상기 조성물은 혼합 없이 토양 내로 스며들게 할 수 있다.
특정 실시예에서, 조성물은 기계적 혼합 없이 토양 표면에 사용된다. 토양 사용의 유리한 효과는 강우, 스프링클러, 홍수 또는 점적관개(drip irrigation)로 활성화되고, 및 연속해서 예를 들어 식물의 뿌리로 전달될 수 있다.
일 실시예에서, 본 방법은 뿌리 건강 및 성장을 증가시키는 것으로 식물 건강, 성장 및/또는 수확량을 증가시킬 수 있다. 보다 구체적으로, 일 실시에에서, 본 방법은 식물 뿌리가 성장하는 근권의 성질, 예를 들어 영양 및/또는 습기 보존 성질을 개선하는 데 사용될 수 있다.
추가적으로, 일 실시예에서, 본 방법은 하나 이상의 유리한 미생물로 근권을 접종하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시예에서, 본 조성물의 미생물은 근권에 대량 서식하여 보호 및 영양 공급을 포함하여, 이들이 자라는 식물 뿌리에 다중 이익을 제공한다.
식물 및/또는 이들의 환경은, 식물을 배양하는 공정 동안 임의 시점에서 처리될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 종자가 그 안에 이식되기 전, 그와 동시에 또는 그 후에 사용될 수 있다. 식물이 개화하고, 과일을 맺고, 잎이 떨어지는 동안 및/또는 그 후를 포함하여 식물의 성장 및 발달 동안 임의 시점에서 사용될 수 있다.
일 실시예에서, 본 방법은 대규모 삼림 및/또는 농업 세팅에 사용될 수 있다. 본 방법은 물, 비료 또는 다른 액체 조성물을 작물, 숲, 목초지, 과수원 또는 밭에 공급하기 위해 사용된 관개 시스템에 연결된 탱크 내로 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 그러므로, 식물 주변 식물 및/또는 토양은 예를 들어, 토양 주입, 토양 적심, 또는 회전 살수(center pivot irrigation) 시스템을 통해, 또는 종자 고랑에 스프레이하거나, 또는 스프링쿨러 또는 점적 관개로 토양 처리 조성물로 처리될 수 있다. 유리하게, 상기 방법은 작물, 숲, 목초지, 과수원 또는 밭의 수백 에이커를 아무 때나 처리하는데 적당하다.
일 실시예에서, 상기 방법은 집 정원, 지방자치 조경 또는 온실에서 보다 소규모 세팅에 사용될 수 있다. 그러한 경우에, 본 방법은 관개 시스템, 소형 잔디 및 정원 스프레이어, 및/또는 표준 소형 급수 캔을 사용하여 사용하는 것을 포함한다.
유리하게 본 방법은 예를 들어, 유리한 미생물 대사산물, 예를 들어 피타아제, 아미노산, 단백질, 비타민 및 미량원소로 인하여, 다음을 할 수 있다: 종자의 발아를 촉진시키고; 재식림 및 조경에서 묘목 및 어린 나무의 생존을 증가시키고; 작물 수확량을 증가시키고; 및 비옥한 토지 내에서 성장한 생성물 및 식물 생성물의 품질을 증가시킬 수 있다. 추가적으로, 식물의 증가된 성장 및 건강은 대기 탄소 준위를 줄이는 중요한 수단이며, 이는 식물 바이오매스(뿐만 아니라 관련된 토양 미생물 바이오매스)의 증가가 탄소 준위의 증가와 분리되기 때문이다. 게다가, 식물 성장 환경(e.g., 토양)에서 피타아제의 존재는 식물 내 인 결핍의 처리 및/또는 예방을 가능하게 한다.
특정 실시예에서, 본 미생물-기반 조성물의 유리한 생화학적-생산 미생물의 존재로 인하여, 본 방법은 유기 폐기물 물질에 해로운 유기물이 들어가는 것을 방지할 수 있다. 예를 들어, 거름 및 분해하는 작물 잔류물은 거름 또는 잔류물로 성장하는 식물에 해로울 수 있는 특정 해충, 곰팡이 및 박테리아에 매력적이다. 킬러 이스트, 예를 들어 Wickerhamomyces anomalus는, 이들 원하지 않는 많은 해충을 제어하는데 유용한 대사산물을 생산할 수 있다.
일 실시예에서, 동물 농장(e.g., 가축 사육 또는 수경재배)에서 생산을 증가시키는 방법이 제공되며, 여기서 미생물-기반 조성물은 식이 보충제 및/또는 소화 보조제로서 동물 사료 또는 마시는 물과 함께 제형되거나 또는 여기에 사용된다. 식품 보충제 및/또는 소화 보조제로서, 상기 미생물-기반 생성물은 피타아제의 존재로 인하여, 다른 장점들 중에서도 아미노산, 단백질, 비타민 및 미량원소의 원료를 제공할 뿐만 아니라 동물 소화관 내에 인 흡수를 보조할 수 있다.
가축의 경우에, 미생물-기반 조성물은 전통 가축 사료와 함께 먹이 주기로 도입되고, 상기 동물은 이후 조성물을 삼킬 수 있게 된다. 일 실시예에서, 상기 조성물은 사료 성분과 함께 혼합되고 균일하고, 균질화된 펠렛으로 제형화될 수 있다.
농장 물고기의 경우, 상기 조성물은 물고기 환경, 예를 들어 물고기 농장의 물, 예를 들어 액체 용액, 또는 건조 분말, 밀(meal) 또는 사료 플레이크 또는 펠렛의 형태로 사용될 수 있다.
일 실시예에서, 인간 건강을 증가시키는 방법이 제공되며, 여기서 상기 미생물-기반 조성물을 식이 보충제 및/또는 소화 보조제로서 인간 대상에 투여된다. 바람직한 실시예에서, 상기 조성물이 경구적으로 투여된다.
식이 보충제 및/또는 소화 보조제로서, 상기 조성물 및 방법은 피타아제의 존재로 인하여 다른 유리한 점들 중에서도, 아미노산, 단백질, 비타민 및 미량원소의 원료를 제공할 뿐만 아니라 대상의 소화관내에서 인 흡수를 도울 수 있다. 추가적으로, 상기 조성물은 대상의 소화관이 미네랄, 예를 들어, 마그네슘, 칼슘, 아연, 철, 망간, 구리 및/또는 몰리브덴의 흡수하는 것을, 피트산이 손상시키는 것을 방지하여 이들 미네랄의 결핍성을 예방하는 것을 도울 수 있다.
유리하게, 인간 또는 동물이 상기 조성물을 삼킬 때, 상기 조성물 내 피타아제의 존재는 자연적으로 포스페이트 및/또는 피트산을 포함할 수 있는 식품 원료로부터 인의 흡수를 증가시키고; 보충 식품에 필요한 무기 포스페이트의 양을 줄이고; 및 피트산 섭취와 관련된 인 결핍 및/또는 다른 미네랄 결핍성을 처리 및/또는 방지하는 것을 돕는 것으로 성장 및 건강을 증진시킬 수 있게 한다.
실시예
본 발명 및 이의 많은 장점들은 설명의 방법으로 주어진 다음 실시예에 의해 보다 잘 이해될 수 있다. 다음 실시예들은 본 발명의 일부 방법, 사용, 구현예 및 변형을 설명한다. 이들은 본 발명을 제한하는 것으로 고려되지 않는다. 수 많은 변화 및 변형이 본 발명에 따라 만들어질 수 있다.
실시예 1 - 피타아제 생산을 위한 이스트 발효
이스트, 예를 들어, Wickerhamomyces anomalus (Pichia anomala)의 배양으로 얻어진 이스트 발효 생성물은, 피트산-또는 피트산염-함유 유기 물질로부터 인을 분리하는데 유용할 수 있다.
25~30℃에서 W. anomalus를 배양하는 48~72 시간 후에 발효 브로스는 이스트 세포 현탁액을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 9,000 u/mL의 피타아제뿐만 아니라 다른 이스트 성장 부산물 및 세포성 성분을 포함할 수 있다. 세포는 액체 배지로부터 분리되거나 또는 그 안에 유지될 수 있다.
이스트 발효 생성물(피타아제 및 선택적으로 살아있거나 또는 불활성 이스트 세포를 갖는 액체 배지)은 유기 물질, 토양, 식물 뿌리, 물, 동물 사료 및/또는 식이 보충제에 직접 사용될 수 있다. 수확시 바로 사용되거나, 또는 원하는 처리 위치까지 저장 및 운송될 수 있다. 유리하게, 본 방법은 상기 환경에서 e.g., 인 보존 및 인 소멸을 해결하는데 유용할 수 있다.
실시예 2 - WICKERHAMOMYCES ANOMALUS 를 사용하여 피타아제 생산을 계산
Wickerhamomyces anomalus 를 다음 성장 배지를 사용하여 72 시간 동안 pH 5.0으로 조절된 발효 반응기 내에서 성장시켰다: 당밀(2.0-5.0%, 또는 3.0-4.0%), 우레아(0.1-1.3%, 또는 0.15-0.2%), 펩톤(2.0-3.0%, 또는 2.2-2.5%). 다른 미생물 및/또는 다른 성장 배지 제형을 사용한 피타아제의 전형적인 미생물 생산 결과 피타아제의 농도를 약 300 내지 500 u/ml로 보다 낮추게 한다.
종자를 깨고/부시는 것으로 참깨 씨로부터 피트산을 얻었다. 종자 5g을 물 10mL에 첨가하고 혼합하였다. 배지 및 세포를 피타아제 존재에 대하여 시험하였다. 0.2M 글리신 완충제를 사용하여 pH를 4로 조절하고 피트산의 pH를 또한 4로 조절하였다.
3일 후, 피타아제 활성을 6개 다른 기준으로 제조하여 측정하였다.
0) 550㎕의 물
1) 10㎕의 50 mM 포타슘 포스페이트 및 540㎕의 물
2) 20㎕의 50 mM 포타슘 포스페이트 및 530㎕의 물
3) 30㎕의 50 mM 포타슘 포스페이트 및 520㎕의 물
4) 40㎕의 50 mM 포타슘 포스페이트 및 510㎕의 물
5) 50㎕의 50 mM 포타슘 포스페이트 및 500㎕의 물
15 피트산 블랭크(블랭크)는 500 μL 피트산, 25 μl 0.2 M 글리신 완충제 및 25 μl 물을 사용하여 제조되었다.
15 피타아제 샘플 블랭크를 25 μl 피타아제, 25 μl 0.2 M 글리신 완충제 및 500 μl 물을 사용하여 제조하였다.
15 피타아제 샘플을 500 μL 피트산, 25 μl 0.2 M 글리신 완충제 및 25 μl 피타아제을 사용하여 제조하였다.
용액의 4 ml의 아세톤-암모늄 몰리브데이트-H2SO4 (50ml-25ml-25ml)를 6개의 표준 샘플 각각에 첨가하였다.
샘플 및 블랭크 각각을 37℃에서 30분 동안 물 욕조에 넣었다. 30분 후, 4 ml의 아세톤-암모늄 몰리브데이트- H2SO4 용액을 샘플 및 블랭크 각각에 빠르게 첨가하여 포스페이트를 침전시켰다. 이후 이들을 원심분리하고 300 μl의 상청액을 600 μl의 물에 용해시켰다.
다음으로, 500μl의 모든 샘플, 블랭크 및 표준 샘플을 Varioscan equipment 웰 플레이트에 놓고, 400nm에서 흡광도를 측정하였다.
표준 값을 3번 측정하고 이들의 평균을 취하였다. 표준 0값은 표준 1-5의 값들 각각으로부터 빼어서 포스페이트의 특정 농도의 흡광과 관련된 수를 얻었다. 표준 각각의 평균 흡광도는 표 1에 보고된다. 샘플 및 블랭크의 평균 흡광도는 표 2에 보고된다.
표준 0-5에 대해 측정된 평균 흡광도(OD) 및 포스페이트(mM) 준위
표준 흡광도(OD) 포스페이트(mM)
0
1
2
3
4
5		 0
0.0456
0.1426
0.1696
0.2566
0.2726		 0
0.9091
1.8182
2.7273
3.6364
4.5455
샘플 및 블랭크의 평균 흡광도(OD)
샘플/블랭크 흡광도(OD)
피트산 블랭크 0.26
피타아제 샘플 블랭크 0.047
피타아제 샘플 0.319
밀리몰(mM)의 방출된 포스페이트를 결정하기 위하여, 피타아제 샘플 블랭크의 평균 흡광도는 피트산 블랭크의 평균 흡광도에 첨가되고 피타아제 샘플의 평균 흡광도로부터 뺐다. 얻어진 수는 0.012 OD이었다. 방출된 포스페이트의 값은0.198 mM이었다.
(1)
Figure pct00001
마지막으로, 상기 공식(1)에 따라 반응기 내 피타아제 농도를 792단위/ml로 계산되었다.

Claims (28)

  1. 유기 물질 내 존재하는 피트산으로부터 포스페이트를 분리하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 Wickerhamomyces anomalus 이스트 및/또는 하나 이상의 미생물 성장 부산물, 및 담체를 포함하는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 성장 부산물이 피타아제인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 이스트의 배양 결과 얻어진 발효 브로스를 포함하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 이스트가 다음을 포함하는 배양 배지 내에서 배양되는, 조성물:
    당밀, 2-5%
    우레아, 0.1-0.3% 및
    펩톤, 2.0-3.0%.
  5. 제1항에 있어서, 하나 이상의 바이오계면활성제를 더 포함하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오계면활성제는 당지질 지질펩티드, 플라보리피드, 포스포리피드, 지방산 에스테르 화합물, 리포단백질, 지질다당류-단백질 복합체, 및/또는 다당류-단백질-지방산 복합체인, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 피트산염 및/또는 피트산의 하나 이상의 원료를 더 포함하는 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 하나 이상의 영양소 및/또는 프리바이오틱스를 더 포함하는 조성물.
  9. 유기 물질 내 피트산으로부터 인을 분리하는 방법으로, 상기 방법은, Wickerhamomyces anomalus 이스트 및/또는 하나 이상의 미생물 성장 부산물, 및 담체를 포함하는 조성물을 상기 유기 물질에 사용하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 조성물 및 상기 유기 물질을 혼합하는 단계를 더 포함하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 유기 물질이 작물 잔류물, 거름, 퇴비, 낙엽 쓰레기, 커피 가루, 톱밥, 주모, 리그닌 및 맥주박으로부터 선택된 유기 폐기 물질인, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 유기 폐기물 물질이 작물 밭의 표면에 퍼져있는 작물 잔류물인, 방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 상기 유기 물질이 퇴비인 방법.
  14. 제9항에 있어서, 상기 유기 물질이 너트, 종자, 콩과 식물, 감자 및 콩으로부터 선택된 식물 물질인 방법.
  15. 제9항에 있어서, 여기서 상기 유기 물질이 토양인 방법.
  16. 토양을 비옥하게 하는 방법으로서, Wickerhamomyces anomalus 이스트 및/또는 하나 이상의 미생물 성장 부산물, 및 담체를 포함하는 조성물을 상기 토양에 사용하여 상기 토양 내에 존재하는 피트산으로부터 포스페이트를 분리시키는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 조성물로 사전 처리된 유기 폐기물을 상기 토양에 사용하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 농업 또는 삼림학에서 생산을 증가시키기 위하여 더 사용되며, 여기서 식물은 상기 비옥한 토양에서 성장하거나 성장할 것인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 식물의 성장 및/또는 수확량을 증가시키기 위해 사용된 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 식물 내 인 결핍을 처리 및/또는 방지하기 위하여 사용된, 방법.
  21. 동물 농장에서 생산을 증가시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은 Wickerhamomyces anomalus 이스트 및/또는 하나 이상의 미생물 성장 부산물, 및, 선택적으로 담체를 포함하는 조성물을 효과적인 함량으로 동물의 식수 및/또는 사료에 식이 보충제 및/또는 소화 보조제로서 사용하거나, 또는 상기 조성anf을 식이 보충제 및/또는 소화 보조제로서 동물의 식수 및/또는 사료와 함께 제형화하는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 동물 농장이 가축 사육인, 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 동물 농장이 수경재배인 방법.
  24. 제21항에 있어서, 상기 동물 농장 내 인 결핍을 처리 및/또는 방지하는 데 사용된 방법.
  25. 인간 건강을 증진시키는 방법으로서, 상기 방법이 Wickerhamomyces anomalus 이스트 및/또는 하나 이상의 미생물 성장 부산물, 및 담체을 포함하는 조성물을 효과적인 함량으로 인간 대상에게 식이 보충제 및/또는 소화 보조제로서 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 조성물이 인간 대상에게 경구적으로 투여되는 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 대상 내 인 결핍을 치료 및/또는 예방하는 데 사용된 방법.
  28. 제25항에 있어서, 피트산이 상기 대상의 소화 보조제에 의한 미네랄 흡수를 손상시키는 것을 예방하는데 사용된 방법.
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