BR112020020174A2 - Composições de aav, métodos de fabricação e métodos de uso - Google Patents

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Abstract

composições de aav, métodos de fabricação e métodos de uso. são divulgados métodos para a purificação de uma partícula aav recombinante (raav) de uma cultura de células hospedeiras de mamífero. a descrição refere-se a ainda uma composição farmacêutica produzida pelos métodos da descrição, composições farmacêuticas e método de uso das composições farmacêuticas descritas neste documento para o tratamento de doenças.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕES DE AAV, MÉTODOS DE FABRICAÇÃO E MÉTODOS DE USO".
PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório USSN 62/653.139, depositado em 5 de abril de 2018, USSN 62/746.980, depositado em 17 de outubro de 2018 e USSN 62/773.975, depositado em 30 de novembro de 2018, cujo conteúdo é incorporado a este documento por referência em sua totalidade.
INCORPORAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[002] O conteúdo do arquivo de texto denominado "NIGH- 013/001WO_SeqList.txt", que foi criado em 4 de abril de 2019 e tem 60 KB de tamanho, é incorporado a este documento por referência em sua totalidade.
CAMPO DA DESCRIÇÃO
[003] A descrição refere-se aos campos da terapêutica humana, produtos biológicos de droga, distribuição viral de sequências de DNA humano e métodos de fabricação dos mesmos.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[004] Há uma necessidade sentida e não atendida de vetores de distribuição baseados em AAV e métodos melhorados de fabricação desses vetores de distribuição baseados em AAV.
SUMÁRIO
[005] A descrição fornece um método para a purificação de uma partícula de AAV (AAV) a partir de uma cultura de células hospedeiras de mamífero, compreendendo as etapas de: (a) cultivar uma pluralidade de células hospedeiras de mamífero em um meio de cultura sob condições adequadas para a formação de uma pluralidade de partículas de AAV, em que a pluralidade de células hospedeiras de mamífero foi transfectada com um vetor de plasmídeo compreendendo uma sequência exógena, um vetor de plasmídeo auxiliar e um vetor de plasmídeo compreendendo uma sequência que codifica uma proteína Rep viral e uma proteína Cap viral para produzir uma pluralidade de células hospedeiras de mamífero transfectadas; (b) colher o meio de cultura que compreende a pluralidade de células hospedeiras de mamífero transfectadas; (c) colher uma pluralidade de partículas de AAV da pluralidade de células hospedeiras de mamífero transfectadas; (d) concentrar a pluralidade de partículas de AAV por filtração de fluxo tangencial (TFF) para produzir uma pluralidade concentrada de partículas de AAV; (e) enriquecer a pluralidade concentrada de partículas de AAV para partículas de AAV completas por ultracentrifugação de gradiente de densidade para produzir uma pluralidade enriquecida de partículas de AAV completas; (f) purificar a pluralidade enriquecida de partículas de AAV completas por cromatografia de troca aniônica (AEX) ou cromatografia de afinidade para produzir um eluato compreendendo uma pluralidade purificada e enriquecida de partículas de AAV completas; e (g) diafiltrar e concentrar o eluato de (f) em um tampão de formulação por filtração de fluxo tangencial (TFF) para produzir uma composição final compreendendo a pluralidade purificada e enriquecida de partículas de AAV completas e o tampão de formulação. Em algumas modalidades, um AAV completo compreende uma sequência exógena sob o controle de um promotor capaz de expressar a sequência exógena em uma célula de mamífero ou humana.
[006] A descrição fornece um método para a purificação de uma partícula de AAV recombinante (rAAV) a partir de uma cultura de células hospedeiras de mamífero, compreendendo as etapas de: (a) cultivar uma pluralidade de células hospedeiras de mamífero em um meio de cultura sob condições adequadas para a formação de uma pluralidade de partículas de rAAV, em que a pluralidade de células hospedeiras de mamífero foi transfectada com um vetor de plasmídeo compreendendo uma sequência exógena, um vetor de plasmídeo auxiliar e um vetor de plasmídeo compreendendo uma sequência que codifica uma proteína Rep viral e uma proteína Cap viral para produzir uma pluralidade de células hospedeiras de mamífero transfectadas; (b) colher o meio de cultura que compreende a pluralidade de células hospedeiras de mamífero transfectadas; (c) colher uma pluralidade de partículas de rAAV da pluralidade de células hospedeiras de mamífero transfectadas; (d) concentrar a pluralidade de partículas de rAAV por filtração de fluxo tangencial (TFF) para produzir uma pluralidade concentrada de partículas de rAAV; (e) enriquecer a pluralidade concentrada de partículas de rAAV para partículas de rAAV completas por ultracentrifugação de gradiente de densidade para produzir uma pluralidade enriquecida de partículas de rAAV completas; (f) purificar a pluralidade enriquecida de partículas de rAAV completas por cromatografia de troca aniônica (AEX) ou cromatografia de afinidade para produzir um eluato compreendendo uma pluralidade purificada e enriquecida de partículas de rAAV completas; e (g) diafiltrar e concentrar o eluato de (f) em um tampão de formulação por filtração de fluxo tangencial (TFF) para produzir uma composição final compreendendo a pluralidade purificada e enriquecida de partículas de rAAV completas e o tampão de formulação. Em algumas modalidades, um rAAV completo compreende uma sequência exógena sob o controle de um promotor capaz de expressar a sequência exógena em uma célula de mamífero ou humana.
[007] A descrição fornece um método para a purificação de uma partícula de AAV recombinante (rAAV) a partir de uma cultura de células hospedeiras de mamífero, compreendendo as etapas de: (a) cultivar uma pluralidade de células hospedeiras de mamífero em um meio de cultura sob condições adequadas para a formação de uma pluralidade de partículas de rAAV-REP1, em que a pluralidade de células hospedeiras de mamífero foi transfectada com um vetor de plasmídeo compreendendo uma sequência exógena em que a sequência exógena compreende uma sequência que codifica uma proteína 1 de escolta Rab humana (REP1), um vetor de plasmídeo auxiliar e um vetor de plasmídeo compreendendo uma sequência que codifica uma proteína Rep viral e uma proteína Cap viral para produzir uma pluralidade de células hospedeiras de mamífero transfectadas; (b) colher o meio de cultura que compreende a pluralidade de células hospedeiras de mamífero transfectadas; (c) colher uma pluralidade de partículas de rAAV da pluralidade de células hospedeiras de mamífero transfectadas; (d) concentrar a pluralidade de partículas de rAAV por filtração de fluxo tangencial (TFF) para produzir uma pluralidade concentrada de partículas de rAAV; (e) enriquecer a pluralidade concentrada de partículas de rAAV para partículas de rAAV completas por ultracentrifugação de gradiente de densidade para produzir uma pluralidade enriquecida de partículas de rAAV completas; (f) purificar a pluralidade enriquecida de partículas de rAAV completas por cromatografia de troca aniônica (AEX) ou cromatografia de afinidade para produzir um eluato compreendendo uma pluralidade purificada e enriquecida de partículas de rAAV completas; e (g) diafiltrar e concentrar o eluato de (f) em um tampão de formulação por filtração de fluxo tangencial (TFF) para produzir uma composição final compreendendo a pluralidade purificada e enriquecida de partículas de rAAV completas e o tampão de formulação.
[008] Em algumas modalidades dos métodos da descrição, a sequência que codifica a proteína REP1 humana compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico de:
1 gatatcgaat tcctgcagcc cggcggcacc atggcggata ctctcccttc ggagtttgat 61 gtgatcgtaa tagggacggg tttgcctgaa tccatcattg cagctgcatg ttcaagaagt 121 ggccggagag ttctgcatgt tgattcaaga agctactatg gaggaaactg ggccagtttt 181 agcttttcag gactattgtc ctggctaaag gaataccagg aaaacagtga cattgtaagt 241 gacagtccag tgtggcaaga ccagatcctt gaaaatgaag aagccattgc tcttagcagg 301 aaggacaaaa ctattcaaca tgtggaagta ttttgttatg ccagtcagga tttgcatgaa 361 gatgtcgaag aagctggtgc actgcagaaa aatcatgctc ttgtgacatc tgcaaactcc 421 acagaagctg cagattctgc cttcctgcct acggaggatg agtcattaag cactatgagc 481 tgtgaaatgc tcacagaaca aactccaagc agcgatccag agaatgcgct agaagtaaat 541 ggtgctgaag tgacagggga aaaagaaaac cattgtgatg ataaaacttg tgtgccatca 601 acttcagcag aagacatgag tgaaaatgtg cctatagcag aagataccac agagcaacca 661 aagaaaaaca gaattactta ctcacaaatt attaaagaag gcaggagatt taatattgat 721 ttagtatcaa agctgctgta ttctcgagga ttactaattg atcttctaat caaatctaat 781 gttagtcgat atgcagagtt taaaaatatt accaggattc ttgcatttcg agaaggacga 841 gtggaacagg ttccgtgttc cagagcagat gtctttaata gcaaacaact tactatggta 901 gaaaagcgaa tgctaatgaa atttcttaca ttttgtatgg aatatgagaa atatcctgat 961 gaatataaag gatatgaaga gatcacattt tatgaatatt taaagactca aaaattaacc 1021 cccaacctcc aatatattgt catgcattca attgcaatga catcagagac agccagcagc 1081 accatagatg gtctcaaagc taccaaaaac tttcttcact gtcttgggcg gtatggcaac 1141 actccatttt tgtttccttt atatggccaa ggagaactcc cccagtgttt ctgcaggatg 1201 tgtgctgtgt ttggtggaat ttattgtctt cgccattcag tacagtgcct tgtagtggac 1261 aaagaatcca gaaaatgtaa agcaattata gatcagtttg gtcagagaat aatctctgag 1321 catttcctcg tggaggacag ttactttcct gagaacatgt gctcacgtgt gcaatacagg 1381 cagatctcca gggcagtgct gattacagat agatctgtcc taaaaacaga ttcagatcaa 1441 cagatttcca ttttgacagt gccagcagag gaaccaggaa cttttgctgt tcgggtcatt 1501 gagttatgtt cttcaacgat gacatgcatg aaaggcacct atttggttca tttgacttgc 1561 acatcttcta aaacagcaag agaagattta gaatcagttg tgcagaaatt gtttgttcca 1621 tatactgaaa tggagataga aaatgaacaa gtagaaaagc caagaattct gtgggctctt 1681 tacttcaata tgagagattc gtcagacatc agcaggagct gttataatga tttaccatcc 1741 aacgtttatg tctgctctgg cccagattgt ggtttaggaa atgataatgc agtcaaacag 1801 gctgaaacac ttttccagga aatctgcccc aatgaagatt tctgtccccc tccaccaaat 1861 cctgaagaca ttatccttga tggagacagt ttacagccag aggcttcaga atccagtgcc 1921 ataccagagg ctaactcgga gactttcaag gaaagcacaa accttggaaa cctagaggag
1981 tcctctgaat aa (SEQ ID Nº: 1), em que a sequência consenso de Kozak é indicada por sublinhado e o códon de iniciação é indicado por negrito.
[009] Em algumas modalidades dos métodos da descrição, a proteína REP1 humana compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de 1 MADTLPSEFD VIVIGTGLPE SIIAAACSRS GRRVLHVDSR
SYYGGNWASF SFSGLLSWLK 61 EYQENSDIVS DSPVWQDQIL ENEEAIALSR KDKTIQHVEV
FCYASQDLHE DVEEAGALQK 121 NHALVTSANS TEAADSAFLP TEDESLSTMS CEMLTEQTPS
SDPENALEVN GAEVTGEKEN 181 HCDDKTCVPS TSAEDMSENV PIAEDTTEQP KKNRITYSQI
IKEGRRFNID LVSKLLYSRG 241 LLIDLLIKSN VSRYAEFKNI TRILAFREGR VEQVPCSRAD
VFNSKQLTMV EKRMLMKFLT 301 FCMEYEKYPD EYKGYEEITF YEYLKTQKLT PNLQYIVMHS
IAMTSETASS TIDGLKATKN 361 FLHCLGRYGN TPFLFPLYGQ GELPQCFCRM CAVFGGIYCL
RHSVQCLVVD KESRKCKAII 421 DQFGQRIISE HFLVEDSYFP ENMCSRVQYR QISRAVLITD
RSVLKTDSDQ QISILTVPAE 481 EPGTFAVRVI ELCSSTMTCM KGTYLVHLTC TSSKTAREDL
ESVVQKLFVP YTEMEIENEQ 541 VEKPRILWAL YFNMRDSSDI SRSCYNDLPS NVYVCSGPDC
GLGNDNAVKQ AETLFQEICP 601 NEDFCPPPPN PEDIILDGDS LQPEASESSA IPEANSETFK ESTNLGNLEE SSE (SEQ ID Nº: 2)
[0010] Em algumas modalidades do método da descrição, o meio de cultura compreende soro fetal bovino reduzido. Em algumas modalidades, o meio de cultura não compreende soro fetal bovino reduzido.
[0011] Em algumas modalidades dos métodos da descrição, o meio de cultura compreende meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM).
[0012] Em algumas modalidades dos métodos da descrição, o meio de cultura compreende glicina, cloridrato de L-Arginina, dicloridrato de L-Cistina, L-Glutamina, cloridrato de L-Histidina-H2O, L-isoleucina, L- Leucina, cloridrato de L-Lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-serina, L- treonina, L-triptofano, sal dissódico de L-tirosina desidratado, L-valina, cloreto de colina, pantotenato de D-cálcio, ácido fólico, niacinamida, cloridrato de piridoxina, riboflavina, cloridrato de tiamina, i-Inositol, Cloreto de Cálcio (CaCl2) (anidro), Nitrato Férrico (Fe(NO3)3"9H2O), Sulfato de Magnésio (MgSO4) (anidro), Cloreto de Potássio (KCl), Bicarbonato de Sódio (NaHCO3), Cloreto de sódio (NaCl), Fosfato de Sódio monobásico (NaH2PO4-H2O) e D-Glicose (Dextrose).
[0013] Em algumas modalidades dos métodos da descrição, o meio de cultura compreende um meio sem soro. Em algumas modalidades, o meio de cultura consiste em um meio sem soro.
[0014] Em algumas modalidades dos métodos da descrição, o meio de cultura compreende um meio clarificado. Em algumas modalidades, o meio de cultura consiste em um meio clarificado. Em algumas modalidades dos métodos da descrição, o meio de colheita compreende um meio sem proteína. Em algumas modalidades dos métodos da descrição, o meio de colheita consiste em um meio sem proteína.
[0015] Em algumas modalidades do método da descrição, as células de mamífero foram transfectadas com uma composição que compreende um reagente de transdução PEI.
[0016] Em algumas modalidades do método da descrição, o vetor de plasmídeo compreendendo uma sequência exógena compreende ainda uma sequência que codifica uma repetição terminal invertida 5' (ITR) e uma sequência que codifica uma ITR 3'. Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma ITR 5' é derivada de uma sequência que codifica uma ITR 5' de um AAV do sorotipo 2 (AAV2). Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma ITR 5' compreende uma sequência que é idêntica a uma sequência que codifica uma ITR 5' de um AAV do sorotipo 2 (AAV2). Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma ITR 5' compreende uma sequência que não é idêntica a uma sequência que codifica uma ITR 5' de um AAV do sorotipo 2 (AAV2). Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma ITR 3' é derivada de uma sequência que codifica uma ITR 3' de um AAV do sorotipo 2 (AAV2). Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma ITR 3' compreende uma sequência que é idêntica a uma sequência que codifica uma ITR 3' de um AAV do sorotipo 2 (AAV2). Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma ITR 3' compreende uma sequência que não é idêntica a uma sequência que codifica uma ITR 3' de um AAV do sorotipo 2 (AAV2). Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma ITR 5' ou a sequência que codifica uma ITR 3' compreende 145 pares de bases (bp).
[0017] Em algumas modalidades do método da descrição, o vetor plasmídico compreendendo uma sequência exógena, o vetor plasmídeo auxiliar ou o vetor plasmídeo compreendendo uma sequência que codifica uma proteína Rep viral e uma proteína Cap viral, compreende ainda uma sequência que codifica um marcador de seleção. Em algumas modalidades, o vetor de plasmídeo compreendendo uma sequência exógena compreende ainda uma sequência que codifica um marcador de seleção. Em algumas modalidades, o vetor de plasmídeo auxiliar compreende ainda uma sequência que codifica um marcador de seleção. Em algumas modalidades, o vetor plasmídico compreendendo uma sequência que codifica uma proteína Rep viral e uma proteína Cap viral compreende ainda uma sequência que codifica um marcador de seleção. Em algumas modalidades, a sequência que codifica um marcador de seleção transmite resistência à canamicina.
[0018] Em algumas modalidades do método da descrição, a etapa de colheita (c) compreende uma interrupção mecânica da pluralidade de células de mamífero transfectadas para liberar partículas de AAV recombinante (rAAV) produzidas pela pluralidade de células de mamífero transfectadas. Em algumas modalidades, a interrupção mecânica compreende uma microfluidização.
[0019] Em algumas modalidades do método da descrição, a etapa de concentração compreende ainda (1) clarificar a pluralidade concentrada de partículas de rAAV por uma filtração de profundidade para produzir uma pluralidade concentrada e clarificada de partículas de rAAV.
[0020] Em algumas modalidades do método da descrição, a etapa de concentração compreende ainda (2) congelar a pluralidade concentrada e clarificada de partículas de rAAV a -80°C para produzir um intermediário de processo.
[0021] Em algumas modalidades do método da descrição, a etapa de enriquecimento (e) compreende uma ultracentrifugação de gradiente de densidade de iodixanol para produzir uma pluralidade enriquecida de partículas de rAAV. Em algumas modalidades, o gradiente de densidade é um gradiente de densidade descontínuo. Em algumas modalidades, o gradiente de densidade de iodixanol compreende uma ou mais de uma composição de iodixanol com uma concentração de 15%, 25%, 40% e 57%, respectivamente. Em algumas modalidades, a pluralidade enriquecida de partículas de rAAV é isolada de um gradiente de densidade de iodixanol. Em algumas modalidades, a pluralidade enriquecida de partículas de rAAV é isolada da interface de uma composição de iodixanol com uma concentração de 40% e uma composição de iodixanol com uma concentração de 57%. Em algumas modalidades, a pluralidade concentrada e clarificada de partículas de rAAV é aplicada a um gradiente de densidade da descrição e, subsequentemente, submetida a uma etapa de ultracentrifugação. Em algumas modalidades, após a etapa de ultracentrifugação, uma pluralidade enriquecida de partículas de rAAV ou rAAV completas é isolada do gradiente de densidade.
[0022] Em algumas modalidades do método da descrição, a cromatografia de afinidade da etapa de purificação (f) compreende uma matriz AVB Sepharose.
[0023] Em algumas modalidades do método da descrição, o tampão de formulação compreende Tris, MgCl2 e NaCl. Em algumas modalidades, o tampão de formulação compreende Tris 20 mM, MgCl 2 1 mM e NaCl 200 mM a pH 8. Em algumas modalidades, o tampão de formulação compreende Tris 20 mM, MgCl2 1 mM e NaCl 200 mM a pH 8 com poloxâmero 188 a 0,001%.
[0024] Em algumas modalidades dos métodos da descrição, a Cromatografia AEX compreende o uso de cromatografia UnoSphere Q ou Poros AEX. Em algumas modalidades, a Cromatografia AEX compreende ainda as etapas de gerar um Cromatograma AEX e selecionar um pico no Cromatograma AEX contendo partículas de rAAV completas.
[0025] Em algumas modalidades dos métodos para a purificação de uma partícula de AAV recombinante (rAAV) da descrição, o método compreende ainda uma etapa de diluição antes da etapa (g), em que a etapa de diluição compreende (1) diluir a primeira pluralidade purificada de partículas de rAAV da etapa (d) em 20x antes da etapa (e), quando a cromatografia compreende o contato da primeira pluralidade de partículas de rAAV purificada com UnoQ ou (2) diluir a primeira pluralidade de partículas de rAAV purificada da etapa (d) em 6x antes da etapa (e) quando a cromatografia compreende o contato da primeira pluralidade purificada de partículas de rAAV com AVB. Em algumas modalidades, a etapa de diluição compreende adicionar um tampão de diluição à primeira pluralidade purificada de partículas de rAAV, em que a cromatografia compreende o contato da primeira pluralidade purificada de partículas de rAAV com UnoQ e em que o tampão de diluição compreende Tris 10 mM a pH 9. Em algumas modalidades, a etapa de diluição compreende adicionar um tampão de diluição à primeira pluralidade purificada de partículas de rAAV, em que a cromatografia compreende o contato da primeira pluralidade de partículas de rAAV purificada com AVB e em que o tampão de diluição compreende Tris 20 mM, MgCl2 1 mM e NaCl 200 mM a pH 8. Em algumas modalidades, a etapa (e) produz uma composição compreendendo uma segunda pluralidade purificada de partículas de rAAV e um tampão de eluição. Em algumas modalidades, a cromatografia compreende UnoQ e em que o tampão de eluição compreende Tris 10 mM, NaCl 650 mM a pH 9. Em algumas modalidades, a cromatografia compreende AVB e em que o tampão de eluição compreende NaHPO4 10,8 mM, ácido cítrico 44,6 mM, NaCl 400 mM a pH 2,6. Em algumas modalidades, o tampão de eluição é eluído em um tampão de neutralização. Em algumas modalidades, o tampão de neutralização compreende Tris 1M a pH 8,8.
[0026] Em algumas modalidades dos métodos da descrição, o TFF da etapa (d) ou etapa (g) é realizado usando um filtro de fibra oca de 100 kDa (HFF). Em algumas modalidades, o TFF da etapa (d) ou etapa (g) é realizado usando um HFF de 70 kDa. Em algumas modalidades, o TFF da etapa (d) ou etapa (g) é realizado usando um HFF de 50 kDa. Em algumas modalidades, na etapa (g) o método compreende ainda um segundo TFF, o TFF da etapa (d) e o primeiro TFF da etapa (g) são realizados usando um HFF de 100 kDa e o segundo TFF da etapa (g) é realizado usando um HFF de 50 kDa ou 70 kDa.
[0027] Em algumas modalidades dos métodos da descrição, a célula hospedeira é isolada ou derivada de uma linhagem celular cultivada. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula HEK293.
[0028] Em algumas modalidades dos métodos da descrição, a célula hospedeira é isolada ou derivada de uma linhagem celular primária. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula imortalizada ou uma célula tronco.
[0029] A descrição fornece uma composição farmacêutica que compreende uma pluralidade de partículas de rAAV produzida por um método da descrição.
[0030] Em algumas modalidades das composições farmacêuticas da descrição, a composição farmacêutica compreende (a) entre 0,5 e 2,5 x 1012 genomas de vetor (vg)/mL de vírus adenoassociado com replicação deficiente e recombinante (rAAV); (b) menos de 50% de capsídeos vazios; (c) menos de 4 ng/mL de proteína da célula hospedeira residual por 1,0 x 1012 vg/mL; e (d) menos de 7 x 10-3 pg/ml de DNA da célula hospedeira residual por 1,0 x 1012 vg/ml.
[0031] Em algumas modalidades das composições farmacêuticas da descrição, a composição farmacêutica compreende ainda (e) uma pluralidade de vg/mL funcional, em que cada um dos genomas de vetor funcional é capaz de expressar uma sequência exógena em uma célula após a transdução.
[0032] Em algumas modalidades das composições farmacêuticas da descrição, após a transdução de uma célula com a composição farmacêutica, a pluralidade de vg/mL funcional expressa a sequência exógena em um aumento de 2 vezes quando comparado a um nível de expressão de uma sequência endógena correspondente em um célula não transduzida. Em algumas modalidades, após a transdução de uma célula com a composição farmacêutica, a pluralidade de vg/mL funcional expressa a sequência exógena em 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes,
7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes, 18 vezes, 19 vezes, 20 vezes, ou qualquer outro incremento de aumento dentro desses valores, quando comparado a um nível de expressão de uma sequência endógena correspondente em uma célula não transduzida. Em algumas modalidades, a sequência exógena e a sequência endógena correspondente são idênticas. Em algumas modalidades, a sequência exógena e a sequência endógena correspondente não são idênticas. Em algumas modalidades, a sequência exógena e a sequência endógena correspondente não são idênticas, mas o polipeptídeo correspondente é idêntico. Em algumas modalidades, a sequência exógena e a sequência endógena correspondente têm pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou qualquer porcentagem intermediária de identidade. Em algumas modalidades, a sequência exógena é otimizada por códons para expressão em um mamífero ou humano quando comparada com a sequência endógena correspondente. Em algumas modalidades, incluindo aquelas em que a sequência exógena é otimizada por códons para expressão em um mamífero ou humano quando comparada com a sequência endógena correspondente, a sequência exógena e a sequência endógena correspondente têm pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou qualquer porcentagem intermediária de homologia.
[0033] Em algumas modalidades das composições farmacêuticas da descrição, após a transdução de uma célula com uma composição farmacêutica da descrição, a sequência exógena codifica uma proteína. Em algumas modalidades, a proteína codificada pela sequência exógena tem um nível de atividade igual ou maior que um nível de atividade de uma proteína codificada por uma sequência correspondente de uma célula não transduzida. Em algumas modalidades, a sequência exógena e a sequência endógena correspondente são idênticas. Em algumas modalidades, a sequência exógena e a sequência endógena correspondente não são idênticas. Em algumas modalidades, a sequência exógena e a sequência endógena correspondente não são idênticas, mas o polipeptídeo correspondente é idêntico. Em algumas modalidades, a sequência exógena e a sequência endógena correspondente têm pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou qualquer porcentagem intermediária de identidade. Em algumas modalidades, incluindo aquelas em que a sequência exógena é otimizada por códons para expressão em um mamífero ou humano quando comparada com a sequência endógena correspondente, a sequência exógena e a sequência endógena correspondente têm pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou qualquer porcentagem intermediária de homologia. Em algumas modalidades, a atividade compreende a ligação, ativação e/ou transferência de um ou mais grupos funcionais para um ligante ou substrato. Em algumas modalidades, a proteína compreende uma proteína REP-1 e a atividade compreende uma prenilação do substrato REP-1.
[0034] Em algumas modalidades das composições farmacêuticas da descrição, a composição farmacêutica compreende (a) entre 1,0 e 2,0 x 1012 genomas de vetor (vg)/mL de vírus adenoassociado com replicação deficiente e recombinante (AAV). Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende (a) cerca de 1,0 x 1012 genomas de vetor (vg)/mL de vírus adenoassociado com replicação deficiente e recombinante (AAV). Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende (a) 1,0 x 1012 genomas de vetor (vg)/mL de vírus adenoassociado com replicação deficiente e recombinante (AAV).
[0035] Em algumas modalidades das composições farmacêuticas da descrição, a composição farmacêutica compreende (b) menos de 50% dos capsídeos vazios. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas da descrição, a composição farmacêutica compreende (b) menos de 30% dos capsídeos vazios.
[0036] Em algumas modalidades das composições farmacêuticas da descrição, o vírus adenoassociado com replicação deficiente e recombinante (rAAV) contém uma sequência isolada ou derivada de um AAV do sorotipo 2 (AAV2). Em algumas modalidades, a sequência isolada ou derivada de um AAV2 compreende uma sequência que codifica uma repetição terminal invertida (ITR). Em algumas modalidades, o vírus adenoassociado com replicação deficiente e recombinante (rAAV) contém uma sequência que codifica uma ITR 5' e uma sequência que codifica uma ITR 3'. Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma ITR 5' e a sequência que codifica uma ITR 3' compreende uma sequência de tipo selvagem de uma ITR de AAV2.
[0037] Em algumas modalidades das composições farmacêuticas da descrição, a célula hospedeira é isolada ou derivada de uma linhagem celular cultivada. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula HEK293.
[0038] Em algumas modalidades das composições farmacêuticas da descrição, a célula hospedeira é isolada ou derivada de uma linhagem celular primária. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula imortalizada ou uma célula tronco.
[0039] Em algumas modalidades das composições farmacêuticas da descrição, cada rAAV completo da pluralidade de rAAVs completos da composição final compreende ainda: uma sequência de ácido nucleico compreendendo, de 5' a 3': (a) uma sequência que codifica um ITR 5' de AAV2, (b) uma sequência que codifica um elemento intensificador inicial, (c) uma sequência que codifica um promotor, (d) uma sequência que codifica um éxon e um íntron, (e) uma sequência que codifica um sítio aceptor de junção, (f) uma sequência que codifica uma proteína 1 de escolta Rab (REP1), (g) uma sequência que codifica um elemento regulador pós-transcricional (PRE), (h) uma sequência que codifica um sítio de poliadenilação (poliA) e (i) uma sequência que codifica um ITR 3' de AAV2. (ver também, Patente US Nº. 9.834.788, cujo conteúdo é incorporado a este documento na sua totalidade).
[0040] Em algumas modalidades das composições farmacêuticas da descrição, incluindo aquelas em que cada rAAV completo da pluralidade de rAAVs completos da composição final compreende ainda: uma sequência de ácido nucleico compreendendo de 5' a 3' elementos (a) a (i), o elemento intensificador inicial compreende uma sequência isolada ou derivada de Citomegalovírus (CMV). Em algumas modalidades, o elemento intensificador inicial compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico de 1 ATTGACGT CAATAATGAC GTATGTTCCC ATAGTAACGC
CAATAGGGAC TTTCCATTGA 61 CGTCAATGGG TGGAGTATTT ACGGTAAACT GCCCACTTGG
CAGTACATCA AGTGTATCAT 121 ATGCCAAGTA CGCCCCCTAT TGACGTCAAT GACGGTAAAT
GGCCCGCCTG GCATTATGCC 181 CAGTACATGA CCTTATGGGA CTTTCCTACT TGGCAGTACA
TCTACGTATT AGTCATCGCT 241 ATTACCATGG(SEQ ID Nº: 3).
[0041] Em algumas modalidades, o elemento intensificador inicial compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico de 1 CCATTGACGT CAATAATGAC GTATGTTCCC ATAGTAACGC
CAATAGGGAC TTTCCATTGA 61 CGTCAATGGG TGGAGTATTT ACGGTAAACT GCCCACTTGG
CAGTACATCA AGTGTATCAT 121 ATGCCAAGTA CGCCCCCTAT TGACGTCAAT GACGGTAAAT
GGCCCGCCTG GCATTATGCC
181 CAGTACATGA CCTTATGGGA CTTTCCTACT TGGCAGTACA
TCTACGTATT AGTCATCGCT 241 ATTACCATGG (SEQ ID Nº: 4).
[0042] Em algumas modalidades das composições farmacêuticas da descrição, incluindo aquelas em que cada rAAV completo da pluralidade de rAAVs completos da composição final compreende ainda: uma sequência de ácido nucleico compreendendo de 5' a 3' elementos (a) a (i), a sequência que codifica o promotor compreende ou consiste em uma sequência isolada ou derivada de uma sequência que codifica um gene de beta actina de galinha (CBA). Em algumas modalidades, a sequência que codifica o promotor compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico de 1 TCGAGGTGAG CCCCACGTTC TGCTTCACTC TCCCCATCTC
CCCCCCCTCC CCACCCCCAA 61 TTTTGTATTT ATTTATTTTT TAATTATTTT GTGCAGCGAT
GGGGGCGGGG GGGGGGGGGG 121 GGCGCGCGCC AGGCGGGGCG GGGCGGGGCG AGGGGCGGGG
CGGGGCGAGG CGGAGAGGTG 181 CGGCGGCAGC CAATCAGAGC GGCGCGCTCC GAAAGTTTCC
TTTTATGGCG AGGCGGCGGC 241 GGCGGCGGCC CTATAAAAAG CGAAGCGCGC GGCGGGCGGG
AGTCGCTGCG CGCTGCCTTC 301 GCCCCGTGCC CCGCTCCGCC GCCGCCTCGC GCCGCCCGCC
CCGGCTCTGA CTGACCGCGT 361 TACTCCCACA GGTGAGCGGG CGGGACGGCC CTTCTCCTCC
GGGCTGTAAT TAGCGCTTGG 421 TTTAATGACG GCTTGTTTCT TTTCTGTGGC TGCGTGAAAG
CCTTGAGGGG CTCCGGGAGG 481 GCCCTTTGTG CGGGGGGAGC GGCTCGGGG (SEQ ID Nº: 5).
[0043] Em algumas modalidades das composições farmacêuticas da descrição, incluindo aquelas em que cada rAAV completo da pluralidade de rAAVs completos da composição final compreende ainda: uma sequência de ácido nucleico compreendendo de 5' a 3' elementos (a) a (i), a sequência que codifica o éxon e íntron compreende ou consiste em uma sequência isolada ou derivada de uma sequência que codifica um gene de beta actina de galinha (CBA). Em algumas modalidades, a sequência que codifica o éxon e íntron compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico de 1 TCGAGGTGAG CCCCACGTTC TGCTTCACTC TCCCCATCTC
CCCCCCCTCC CCACCCCCAA 61 TTTTGTATTT ATTTATTTTT TAATTATTTT GTGCAGCGAT
GGGGGCGGGG GGGGGGGGGG 121 GGCGCGCGCC AGGCGGGGCG GGGCGGGGCG
AGGGGCGGGG CGGGGCGAGG CGGAGAGGTG 181 CGGCGGCAGC CAATCAGAGC GGCGCGCTCC GAAAGTTTCC
TTTTATGGCG AGGCGGCGGC 241 GGCGGCGGCC CTATAAAAAG CGAAGCGCGC
GGCGGGCGGG AGTCGCTGCG CGCTGCCTTC 301 GCCCCGTGCC CCGCTCCGCC GCCGCCTCGC
GCCGCCCGCC CCGGCTCTGA CTGACCGCGT 361 TACTCCCACA GGTGAGCGGG CGGGACGGCC CTTCTCCTCC
GGGCTGTAAT TAGCGCTTGG 421 TTTAATGACG GCTTGTTTCT TTTCTGTGGC TGCGTGAAAG
CCTTGAGGGG CTCCGGGAGG 481 GCCCTTTGTG CGGGGGGAGC GGCTCGGGG (SEQ ID Nº: 5).
[0044] Em algumas modalidades das composições farmacêuticas da descrição, incluindo aquelas em que cada rAAV completo da pluralidade de rAAVs completos da composição final compreende ainda: uma sequência de ácido nucleico compreendendo de 5' a 3' elementos (a) a (i), a sequência que codifica o sítio aceptor de junção compreende uma sequência isolada ou derivada de uma sequência que codifica um sítio aceptor de junção de beta globina de Oryctolagus cuniculus. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o sítio aceptor de junção de beta globina de Oryctolagus cuniculus compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico de 1 CTCTGCT AACCATGTTC ATGCCTTCTT CTTTTTCCTA CAGCTCCTGG
GCAACGTGCT 61 GGTTATTGTG CTGTCTCATC ATTTTGGCAA AGAATT(SEQ ID Nº: 6).
[0045] Em algumas modalidades das composições farmacêuticas da descrição, incluindo aquelas em que cada rAAV completo da pluralidade de rAAVs completos da composição final compreende ainda: uma sequência de ácido nucleico compreendendo de 5' a 3' elementos (a) a (i), a sequência que compreende o elemento intensificador inicial, a sequência que compreende o promotor, a sequência que compreende o íntron e éxon e a sequência que compreende o sítio aceptor de junção compreendem ou consistem na sequência de ácido nucleico de 1 TCGAGGTGAG CCCCACGTTC TGCTTCACTC TCCCCATCTC
CCCCCCCTCC CCACCCCCAA 61 TTTTGTATTT ATTTATTTTT TAATTATTTT GTGCAGCGAT
GGGGGCGGGG GGGGGGGGGG 121 GGCGCGCGCC AGGCGGGGCG GGGCGGGGCG AGGGGCGGGG
CGGGGCGAGG CGGAGAGGTG 181 CGGCGGCAGC CAATCAGAGC GGCGCGCTCC GAAAGTTTCC
TTTTATGGCG AGGCGGCGGC 241 GGCGGCGGCC CTATAAAAAG CGAAGCGCGC GGCGGGCGGG
AGTCGCTGCG CGCTGCCTTC 301 GCCCCGTGCC CCGCTCCGCC GCCGCCTCGC GCCGCCCGCC
CCGGCTCTGA CTGACCGCGT 361 TACTCCCACA GGTGAGCGGG CGGGACGGCC CTTCTCCTCC
GGGCTGTAAT TAGCGCTTGG 421 TTTAATGACG GCTTGTTTCT TTTCTGTGGC TGCGTGAAAG
CCTTGAGGGG CTCCGGGAGG 481 GCCCTTTGTG CGGGGGGAGC GGCTCGGGGC TGTCCGCGGG
GGGACGGCTG CCTTCGGGGG 541 GGACGGGGCA GGGCGGGGTT CGGCTTCTGG CGTGTGACCG
GCGGCTCTAG AGCCTCTGCT 601 AACCATGTTC ATGCCTTCTT CTTTTTCCTA CAGCTCCTGG
GCAACGTGCT GGTTATTGTG 661 CTGTCTCATC ATTTTGGCAA AGAATTGGAT C (SEQ ID Nº: 7).
[0046] Em algumas modalidades das composições farmacêuticas da descrição, incluindo aquelas em que cada rAAV completo da pluralidade de rAAVs completos da composição final compreende ainda: uma sequência de ácido nucleico compreendendo de 5' a 3' elementos (a) a (i), a sequência que compreende o elemento intensificador inicial, a sequência que compreende o promotor, a sequência que compreende o íntron e éxon e a sequência que compreende o sítio aceptor de junção compreendem ou consistem na sequência de ácido nucleico de 1 CCATTGACGT CAATAATGAC GTATGTTCCC ATAGTAACGC
CAATAGGGAC TTTCCATTGA 61 CGTCAATGGG TGGAGTATTT ACGGTAAACT GCCCACTTGG
CAGTACATCA AGTGTATCAT 121 ATGCCAAGTA CGCCCCCTAT TGACGTCAAT GACGGTAAAT
GGCCCGCCTG GCATTATGCC 181 CAGTACATGA CCTTATGGGA CTTTCCTACT TGGCAGTACA
TCTACGTATT AGTCATCGCT 241 ATTACCATGG TCGAGGTGAG CCCCACGTTC TGCTTCACTC
TCCCCATCTC CCCCCCCTCC 301 CCACCCCCAA TTTTGTATTT ATTTATTTTT TAATTATTTT
GTGCAGCGAT GGGGGCGGGG 361 GGGGGGGGGG GGCGCGCGCC AGGCGGGGCG GGGCGGGGCG
AGGGGCGGGG CGGGGCGAGG 421 CGGAGAGGTG CGGCGGCAGC CAATCAGAGC GGCGCGCTCC
GAAAGTTTCC TTTTATGGCG 481 AGGCGGCGGC GGCGGCGGCC CTATAAAAAG CGAAGCGCGC
GGCGGGCGGG AGTCGCTGCG 541 CGCTGCCTTC GCCCCGTGCC CCGCTCCGCC GCCGCCTCGC
GCCGCCCGCC CCGGCTCTGA 601 CTGACCGCGT TACTCCCACA GGTGAGCGGG CGGGACGGCC
CTTCTCCTCC GGGCTGTAAT 661 TAGCGCTTGG TTTAATGACG GCTTGTTTCT TTTCTGTGGC
TGCGTGAAAG CCTTGAGGGG 721 CTCCGGGAGG GCCCTTTGTG CGGGGGGAGC GGCTCGGGGC
TGTCCGCGGG GGGACGGCTG 781 CCTTCGGGGG GGACGGGGCA GGGCGGGGTT CGGCTTCTGG
CGTGTGACCG GCGGCTCTAG 841 AGCCTCTGCT AACCATGTTC ATGCCTTCTT CTTTTTCCTA
CAGCTCCTGG GCAACGTGCT 901 GGTTATTGTG CTGTCTCATC ATTTTGGCAA AGAATTGGAT C (SEQ ID Nº: 8).
[0047] Em algumas modalidades das composições farmacêuticas da descrição, incluindo aquelas em que cada rAAV completo da pluralidade de rAAVs completos da composição final compreende ainda: uma sequência de ácido nucleico compreendendo de 5' a 3' elementos (a) a (i), a sequência que codifica a proteína REP1 compreende uma sequência isolada ou derivada de uma sequência REP1 de mamífero. Em algumas modalidades, a sequência REP1 de mamífero é isolada ou derivada de um camundongo, um rato, um coelho, um primata não humano ou um humano. Em algumas modalidades, a sequência REP1 de mamífero é isolada ou derivada de um humano. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a proteína REP1 humana compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico de 1 gatatcgaat tcctgcagcc cggcggcacc atggcggata ctctcccttc ggagtttgat 61 gtgatcgtaa tagggacggg tttgcctgaa tccatcattg cagctgcatg ttcaagaagt 121 ggccggagag ttctgcatgt tgattcaaga agctactatg gaggaaactg ggccagtttt 181 agcttttcag gactattgtc ctggctaaag gaataccagg aaaacagtga cattgtaagt
241 gacagtccag tgtggcaaga ccagatcctt gaaaatgaag aagccattgc tcttagcagg 301 aaggacaaaa ctattcaaca tgtggaagta ttttgttatg ccagtcagga tttgcatgaa 361 gatgtcgaag aagctggtgc actgcagaaa aatcatgctc ttgtgacatc tgcaaactcc 421 acagaagctg cagattctgc cttcctgcct acggaggatg agtcattaag cactatgagc 481 tgtgaaatgc tcacagaaca aactccaagc agcgatccag agaatgcgct agaagtaaat 541 ggtgctgaag tgacagggga aaaagaaaac cattgtgatg ataaaacttg tgtgccatca 601 acttcagcag aagacatgag tgaaaatgtg cctatagcag aagataccac agagcaacca 661 aagaaaaaca gaattactta ctcacaaatt attaaagaag gcaggagatt taatattgat 721 ttagtatcaa agctgctgta ttctcgagga ttactaattg atcttctaat caaatctaat 781 gttagtcgat atgcagagtt taaaaatatt accaggattc ttgcatttcg agaaggacga 841 gtggaacagg ttccgtgttc cagagcagat gtctttaata gcaaacaact tactatggta 901 gaaaagcgaa tgctaatgaa atttcttaca ttttgtatgg aatatgagaa atatcctgat 961 gaatataaag gatatgaaga gatcacattt tatgaatatt taaagactca aaaattaacc 1021 cccaacctcc aatatattgt catgcattca attgcaatga catcagagac agccagcagc 1081 accatagatg gtctcaaagc taccaaaaac tttcttcact gtcttgggcg gtatggcaac 1141 actccatttt tgtttccttt atatggccaa ggagaactcc cccagtgttt ctgcaggatg 1201 tgtgctgtgt ttggtggaat ttattgtctt cgccattcag tacagtgcct tgtagtggac 1261 aaagaatcca gaaaatgtaa agcaattata gatcagtttg gtcagagaat aatctctgag 1321 catttcctcg tggaggacag ttactttcct gagaacatgt gctcacgtgt gcaatacagg 1381 cagatctcca gggcagtgct gattacagat agatctgtcc taaaaacaga ttcagatcaa 1441 cagatttcca ttttgacagt gccagcagag gaaccaggaa cttttgctgt tcgggtcatt 1501 gagttatgtt cttcaacgat gacatgcatg aaaggcacct atttggttca tttgacttgc 1561 acatcttcta aaacagcaag agaagattta gaatcagttg tgcagaaatt gtttgttcca
1621 tatactgaaa tggagataga aaatgaacaa gtagaaaagc caagaattct gtgggctctt 1681 tacttcaata tgagagattc gtcagacatc agcaggagct gttataatga tttaccatcc 1741 aacgtttatg tctgctctgg cccagattgt ggtttaggaa atgataatgc agtcaaacag 1801 gctgaaacac ttttccagga aatctgcccc aatgaagatt tctgtccccc tccaccaaat 1861 cctgaagaca ttatccttga tggagacagt ttacagccag aggcttcaga atccagtgcc 1921 ataccagagg ctaactcgga gactttcaag gaaagcacaa accttggaaa cctagaggag 1981 tcctctgaat aa (SEQ ID Nº: 9).
[0048] Em algumas modalidades, a proteína REP1 humana compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de 1 MADTLPSEFD VIVIGTGLPE SIIAAACSRS GRRVLHVDSR SYYGGNWASF
SFSGLLSWLK 61 EYQENSDIVS DSPVWQDQIL ENEEAIALSR KDKTIQHVEV FCYASQDLHE
DVEEAGALQK 121 NHALVTSANS TEAADSAFLP TEDESLSTMS CEMLTEQTPS SDPENALEVN
GAEVTGEKEN 181 HCDDKTCVPS TSAEDMSENV PIAEDTTEQP KKNRITYSQI IKEGRRFNID
LVSKLLYSRG 241 LLIDLLIKSN VSRYAEFKNI TRILAFREGR VEQVPCSRAD VFNSKQLTMV
EKRMLMKFLT 301 FCMEYEKYPD EYKGYEEITF YEYLKTQKLT PNLQYIVMHS IAMTSETASS
TIDGLKATKN 361 FLHCLGRYGN TPFLFPLYGQ GELPQCFCRM CAVFGGIYCL RHSVQCLVVD
KESRKCKAII 421 DQFGQRIISE HFLVEDSYFP ENMCSRVQYR QISRAVLITD RSVLKTDSDQ
QISILTVPAE 481 EPGTFAVRVI ELCSSTMTCM KGTYLVHLTC TSSKTAREDL ESVVQKLFVP
YTEMEIENEQ 541 VEKPRILWAL YFNMRDSSDI SRSCYNDLPS NVYVCSGPDC GLGNDNAVKQ
AETLFQEICP 601 NEDFCPPPPN PEDIILDGDS LQPEASESSA IPEANSETFK ESTNLGNLEE SSE (SEQ ID Nº: 10).
[0049] Em algumas modalidades das composições farmacêuticas da descrição, incluindo aquelas em que cada rAAV completo da pluralidade de rAAVs completos da composição final compreende ainda: uma sequência de ácido nucleico compreendendo de 5' a 3' elementos (a) a (i), a sequência que codifica o PRE compreende uma sequência isolada ou derivada de um Vírus da Hepatite da Marmota (WPRE). Em algumas modalidades, a sequência que codifica o WPRE compreende ou consiste em uma sequência de ácido nucleico de 1 atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc 61 cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta 121 tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt 181 ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg 241 gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta 301 ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt 361 tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg 421 cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca 481 atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc 541 gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgc (SEQ ID Nº: 11).
[0050] Em algumas modalidades das composições farmacêuticas da descrição, incluindo aquelas em que cada rAAV completo da pluralidade de rAAVs completos da composição final compreende ainda: uma sequência de ácido nucleico compreendendo de 5' a 3' elementos (a) a (i), a sequência que codifica um sítio de poliadenilação (poliA) compreende uma sequência isolada ou derivada de um gene de mamífero. Em algumas modalidades, a sequência que codifica um sítio de poliadenilação (poliA) compreende uma sequência isolada ou derivada de um gene do hormônio de crescimento bovino (BGH). Em algumas modalidades, a sequência que codifica o sítio poliA compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico de 1 tcgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc 61 cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga
121 aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga 181 cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat 241 ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg (SEQ ID Nº: 12).
[0051] Em algumas modalidades das composições farmacêuticas da descrição, incluindo aquelas em que cada rAAV completo da pluralidade de rAAVs completos da composição final compreende ainda: uma sequência de ácido nucleico compreendendo de 5' a 3' elementos (a) a (i), a sequência que codifica o ITR 5' de AAV2 compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico de 1 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 61 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 121 aggggttcct tgtagttaat gatt (SEQ ID Nº: 13).
[0052] Em algumas modalidades das composições farmacêuticas da descrição, incluindo aquelas em que cada rAAV completo da pluralidade de rAAVs completos da composição final compreende ainda: uma sequência de ácido nucleico compreendendo de 5' a 3' elementos (a) a (i), a sequência que codifica o ITR 3' de AAV2 compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico de 1 AGGAACCCCT AGTGATGGAG TTGGCCACTC CCTCTCTGCG
CGCTCGCTCG CTCACTGAGG 61 CCGGGCGACC AAAGGTCGCC CGACGCCCGG GCGGCCTCAG
TGAGCGAGCG AGCGCGCAGA 121 G (SEQ ID Nº: 14).
[0053] Em algumas modalidades das composições farmacêuticas da descrição, incluindo aquelas em que cada rAAV completo da pluralidade de rAAVs completos da composição final compreende ainda: uma sequência de ácido nucleico compreendendo de 5' a 3' elementos (a) a (i), o ácido nucleico compreendendo, de 5' a 3'
elementos (a) a (i), compreende ou consiste em uma sequência de DNA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreendendo, de 5' a 3', os elementos (a) a (i) compreendem ou consistem em uma sequência de DNA de fita simples.
[0054] Em algumas modalidades das composições farmacêuticas da descrição, incluindo aquelas em que cada rAAV completo da pluralidade de rAAVs completos da composição final compreende ainda: uma sequência de ácido nucleico compreendendo de 5' a 3' elementos (a) a (i), cada rAAV da pluralidade de rAAVs completos da composição final compreende uma proteína do capsídeo isolada ou derivada de um AAV2. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo de AAV2 compreende uma sequência com pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos 1 MAADGYLPDW LEDTLSEGIR QWWKLKPGPP PPKPAERHKD DSRGLVLPGY
KYLGPFNGLD 61 KGEPVNEADA AALEHDKAYD RQLDSGDNPY LKYNHADAEF QERLKEDTSF
GGNLGRAVFQ 121 AKKRVLEPLG LVEEPVKTAP GKKRPVEHSP VEPDSSSGTG KAGQQPARKR
LNFGQTGDAD 181 SVPDPQPLGQ PPAAPSGLGT NTMATGSGAP MADNNEGADG
VGNSSGNWHC DSTWMGDRVI 241 TTSTRTWALP TYNNHLYKQI SSQSGASNDN HYFGYSTPWG YFDFNRFHCH
FSPRDWQRLI 301 NNNWGFRPKR LNFKLFNIQV KEVTQNDGTT TIANNLTSTV QVFTDSEYQL
PYVLGSAHQG 361 CLPPFPADVF MVPQYGYLTL NNGSQAVGRS SFYCLEYFPS QMLRTGNNFT
FSYTFEDVPF 421 HSSYAHSQSL DRLMNPLIDQ YLYYLSRTNT PSGTTTQSRL QFSQAGASDI
RDQSRNWLPG 481 PCYRQQRVSK TSADNNNSEY SWTGATKYHL NGRDSLVNPG
PAMASHKDDE EKFFPQSGVL 541 IFGKQGSEKT NVDIEKVMIT DEEEIRTTNP VATEQYGSVS TNLQRGNRQA
ATADVNTQGV
601 LPGMVWQDRD VYLQGPIWAK IPHTDGHFHP SPLMGGFGLK HPPPQILIKN
TPVPANPSTT 661 FSAAKFASFI TQYSTGQVSV EIEWELQKEN SKRWNPEIQY TSNYNKSVNV
DFTVDTNGVY 721 SEPRPIGTRY LTRNL (SEQ ID Nº: 15).
[0055] Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo de AAV2 compreende a sequência de aminoácidos 1 MAADGYLPDW LEDTLSEGIR QWWKLKPGPP PPKPAERHKD
DSRGLVLPGY KYLGPFNGLD 61 KGEPVNEADA AALEHDKAYD RQLDSGDNPY LKYNHADAEF
QERLKEDTSF GGNLGRAVFQ 121 AKKRVLEPLG LVEEPVKTAP GKKRPVEHSP VEPDSSSGTG
KAGQQPARKR LNFGQTGDAD 181 SVPDPQPLGQ PPAAPSGLGT NTMATGSGAP MADNNEGADG
VGNSSGNWHC DSTWMGDRVI 241 TTSTRTWALP TYNNHLYKQI SSQSGASNDN HYFGYSTPWG
YFDFNRFHCH FSPRDWQRLI 301 NNNWGFRPKR LNFKLFNIQV KEVTQNDGTT TIANNLTSTV
QVFTDSEYQL PYVLGSAHQG 361 CLPPFPADVF MVPQYGYLTL NNGSQAVGRS SFYCLEYFPS
QMLRTGNNFT FSYTFEDVPF 421 HSSYAHSQSL DRLMNPLIDQ YLYYLSRTNT PSGTTTQSRL
QFSQAGASDI RDQSRNWLPG 481 PCYRQQRVSK TSADNNNSEY SWTGATKYHL NGRDSLVNPG
PAMASHKDDE EKFFPQSGVL 541 IFGKQGSEKT NVDIEKVMIT DEEEIRTTNP VATEQYGSVS
TNLQRGNRQA ATADVNTQGV 601 LPGMVWQDRD VYLQGPIWAK IPHTDGHFHP SPLMGGFGLK
HPPPQILIKN TPVPANPSTT 661 FSAAKFASFI TQYSTGQVSV EIEWELQKEN SKRWNPEIQY
TSNYNKSVNV DFTVDTNGVY 721 SEPRPIGTRY LTRNL (SEQ ID Nº: 15).
[0056] Em algumas modalidades das composições farmacêuticas da descrição, incluindo aquelas em que cada rAAV completo da pluralidade de rAAVs completos da composição final compreende ainda: uma sequência de ácido nucleico compreendendo de 5' a 3' elementos (a) a (i), a composição farmacêutica compreende ainda um tampão de formulação. Em algumas modalidades, o tampão de formulação compreende Tris, MgCl2 e NaCl. Em algumas modalidades, o tampão de formulação compreende Tris 20 mM, MgCl2 1 mM e NaCl 200 mM a pH 8. Em algumas modalidades, o tampão de formulação compreende Tris 20 mM, MgCl2 1 mM e NaCl 200 mM a pH 8 com poloxâmero 188 a 0,001%.
[0057] Em algumas modalidades das composições farmacêuticas da descrição, incluindo aquelas em que cada rAAV completo da pluralidade de rAAVs completos da composição final compreende ainda: uma sequência de ácido nucleico compreendendo, de 5' a 3' elementos (a) a (i), a pluralidade de rAAVs completos está a uma concentração de entre 1x108 partículas de genoma (gp)/mL e 1x1014 gp/mL, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, a pluralidade de rAAVs completos está em uma concentração de entre 0,5x1010 gp/mL e 2,5x1012 gp/mL, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, a pluralidade de rAAVs completos está a uma concentração de entre 1x1011 gp/mL e 5x1013 gp/mL, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, a pluralidade de rAAVs completos está em uma concentração de entre 1x1011 gp/mL e 2x1012 gp/mL, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, a pluralidade de rAAVs completos está a uma concentração de 1x10 12 gp/mL. Em algumas modalidades, a pluralidade de rAAVs completos está a uma concentração de 1x1011 gp/mL. Em algumas modalidades, a concentração da pluralidade de rAAVs completos é medida usando qPCR. Em algumas modalidades, o qPCR usa um vetor de plasmídeo superenrolado como padrão. Em algumas modalidades, o qPCR usa um vetor de plasmídeo linearizado como padrão.
[0058] A descrição fornece um dispositivo de distribuição que compreende a composição farmacêutica da descrição. Em algumas modalidades, o dispositivo de distribuição compreende um ou mais dentre uma seringa, um cateter e uma agulha. Em algumas modalidades, o dispositivo de distribuição é adequado para administrar a composição farmacêutica por injeção. Em algumas modalidades, o dispositivo de distribuição é adequado para administrar a composição farmacêutica por infusão. Em algumas modalidades, o dispositivo de distribuição é adequado para administrar a composição farmacêutica por uma via sub-retiniana. Em algumas modalidades, o dispositivo de distribuição é adequado para administrar a composição farmacêutica por uma via supracoroidal.
[0059] A descrição fornece um método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo em necessidade, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica da descrição.
[0060] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio da descrição, a doença ou distúrbio é uma doença ou distúrbio retiniano. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é Coroideremia.
[0061] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio da descrição, a quantidade terapeuticamente eficaz compreende uma quantidade entre uma quantidade minimamente eficaz e uma quantidade máxima tolerável da composição farmacêutica.
[0062] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio da descrição, a quantidade minimamente eficaz compreende uma quantidade da composição farmacêutica suficiente para transduzir pelo menos um neurônio de uma retina ou uma porção-alvo do mesmo. Em algumas modalidades, a quantidade minimamente eficaz compreende uma quantidade da composição farmacêutica suficiente para transduzir pelo menos 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou qualquer porcentagem entre os neurônios de uma retina ou uma porção-alvo deles. Em algumas modalidades, a quantidade minimamente eficaz compreende uma quantidade da composição farmacêutica suficiente para melhorar a acuidade visual do indivíduo. Em algumas modalidades, a quantidade minimamente eficaz compreende uma quantidade da composição farmacêutica suficiente para reduzir um sinal ou sintoma de uma doença retinal. Em algumas modalidades, a doença retinal é Coroideremia.
[0063] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio da descrição, a quantidade máxima tolerável compreende uma quantidade da composição farmacêutica suficiente para induzir um evento adverso. Em algumas modalidades, o efeito adverso compreende uma resposta imune à composição farmacêutica. Em algumas modalidades, a resposta imune compreende inflamação. Em algumas modalidades, a inflamação é sistêmica. Em algumas modalidades, a inflamação é local. Em algumas modalidades, o evento adverso é grave. Em algumas modalidades, o evento adverso não pode ser evitado, reduzido ou controlado pela administração de um tratamento médico secundário ao indivíduo. Em algumas modalidades, o tratamento médico secundário compreende um supressor do sistema imunológico. Em algumas modalidades, o supressor compreende um agente anti-inflamatório. Em algumas modalidades, o agente anti- inflamatório compreende um corticosteroide. Em algumas modalidades, o corticosteroide compreende prednisona ou prednisolona.
[0064] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio da descrição, a quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica compreende uma quantidade com uma multiplicidade de infecção (MOI) entre 104 e 107, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica compreende uma quantidade com uma multiplicidade de infecção (MOI) entre 1x106 e 9x106, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica compreende uma quantidade com uma multiplicidade de infecção (MOI) entre 104 e 105, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica compreende uma quantidade com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 105.
[0065] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio da descrição, a quantidade terapeuticamente eficaz compreende entre 1x108 gp e 1x1013 gp, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz compreende entre 6x109 gp e 1x1013 gp, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz compreende entre 6x109 gp e 7x1012 gp, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz compreende entre 6x109 gp e 5x1012 gp, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz compreende entre 1x1010 gp e 1x1012 gp, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz compreende ou consiste em 1x1010 gp. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz compreende ou consiste em 1x1011 gp. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz compreende ou consiste em 1x1012 gp.
[0066] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio da descrição, a quantidade terapeuticamente eficaz compreende ou consiste em um volume entre 10 µL e 200 µL,
incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz compreende ou consiste em um volume entre 10 µL e 50 µL, entre 50 µL e 100 µL, entre 100 µL e 150 µL ou entre 150 µL e 200 µL, incluindo os pontos finais, para cada intervalo. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz compreende ou consiste em um volume entre 70 µL e 120 µL, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz compreende ou consiste em um volume de 100 µL.
[0067] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio da descrição, a quantidade terapeuticamente eficaz compreende ou consiste em pelo menos uma injeção de um volume entre 10 µL e 200 µL, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz compreende ou consiste em pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 injeções de um volume entre 10 µL e 200 µL, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, duas ou mais injeções são feitas em um espaço sub- retiniano durante o mesmo procedimento médico no mesmo olho. Em algumas modalidades, duas ou mais injeções são feitas em dois ou mais espaços sub-retinianos distintos durante o mesmo procedimento médico no mesmo olho. Em algumas modalidades, a área do espaço sub-retiniano em contato com a quantidade terapeuticamente eficaz do vetor compreende ou consiste em entre 5 e 20 mm 2. Em algumas modalidades, a área do espaço sub-retiniano em contato com a quantidade terapeuticamente eficaz do vetor compreende ou consiste em 10 mm2. Em algumas modalidades, uma ou mais injeções são feitas em pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 áreas distintas da retina de um olho. Em algumas modalidades, uma ou mais injeções são feitas em pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 áreas distintas da retina de um olho durante um único procedimento. Em algumas modalidades, uma ou mais injeções são feitas em pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 áreas distintas da retina de um olho ao longo de dois ou mais procedimentos.
[0068] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio da descrição, a quantidade terapeuticamente eficaz compreende ou consiste em pelo menos uma injeção de um volume entre 10 µL e 200 µL, incluindo os pontos finais, administrada a partir do mesmo dispositivo. Em algumas modalidades dos métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio da descrição, a quantidade terapeuticamente eficaz é distribuída pelo mesmo dispositivo como uma dose dividida entre uma ou mais injeções. A dose dividida pode ser administrada ao mesmo espaço sub-retiniano ou a dois ou mais espaços sub-retinianos distintos dentro do mesmo olho.
[0069] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio da descrição, a etapa de administração compreende uma injeção ou uma infusão. Em algumas modalidades, a etapa de administração compreende uma via sub-retiniana, supracoroidal ou intravítrea. Em algumas modalidades, a etapa de administração compreende uma injeção ou infusão sub-retiniana. Em algumas modalidades, a injeção ou infusão sub-retiniana compreende uma injeção sub-retiniana de duas etapas. Em algumas modalidades, a etapa de administração compreende uma injeção ou infusão supracoroidal.
[0070] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio da descrição, o indivíduo é do sexo masculino. Em algumas modalidades, o indivíduo tem pelo menos 18 anos de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um diagnóstico confirmado geneticamente de coroideremia. Em algumas modalidades, o indivíduo foi identificado como tendo uma mutação no gene REP1. Em algumas modalidades, o indivíduo apresenta um sinal clínico de coroideremia em uma mácula de pelo menos um olho. Em algumas modalidades, o indivíduo tem uma pontuação de Melhor Acuidade Visual Corrigida (BCVA) de 34-73 letras em pelo menos um olho. Em algumas modalidades, o indivíduo tem coroideremia leve ou em estágio inicial. Em algumas modalidades, o indivíduo tem coroideremia avançada ou grave.
[0071] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio da descrição, o método compreende o tratamento de 10 mm2 de uma retina de pelo menos um olho. Em algumas modalidades, o método compreende o tratamento entre 5 mm2 e 10 mm2, inclusive dos pontos finais, de uma retina de pelo menos um olho. Em algumas modalidades, o método compreende o tratamento entre 2 mm2 e 15 mm2, inclusive dos pontos finais, de uma retina de pelo menos um olho.
[0072] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio da descrição, a composição farmacêutica é administrada a um olho do indivíduo. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada a ambos os olhos do indivíduo. Em algumas modalidades, os olhos do indivíduo são tratados simultaneamente. Em algumas modalidades, ambos os olhos do indivíduo são tratados sequencialmente. Em algumas modalidades, pelo menos um olho do indivíduo foi tratado para coroideremia antes da administração da composição farmacêutica ao indivíduo.
[0073] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio da descrição, o método compreende a administração entre 1 e 12 doses por olho, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, o método compreende a administração de pelo menos uma dose pelo menos uma vez por dia, uma vez por semana, uma vez por mês, uma vez a cada três meses, uma vez a cada 6 meses ou uma vez por ano. Em algumas modalidades, o método compreende a administração de doses múltiplas e em que cada dose compreende a mesma quantidade da composição farmacêutica. Em algumas modalidades, o método compreende a administração de doses múltiplas e em que cada dose não compreende a mesma quantidade da composição farmacêutica. Em algumas modalidades, o método compreende a administração de doses múltiplas e em que cada dose sucessiva compreende um número maior de rAAV completo do que a dose anterior. Em algumas modalidades, o método compreende a administração de doses múltiplas e em que cada dose sucessiva compreende um número menor de rAAV completo do que a dose anterior.
[0074] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio da descrição, o método compreende a administração entre 1 e 12 doses por olho, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, as doses são fornecidas após um período de recuperação. Em algumas modalidades, o período de recuperação é de pelo menos 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ou qualquer número de minutos entre eles. Em algumas modalidades, o período de recuperação é de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 horas. Em algumas modalidades, o período de recuperação é de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias. Em algumas modalidades, o período de recuperação é de pelo menos 1, 2, 3 ou 4 semanas. Em algumas modalidades, o período de recuperação é de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses. Em algumas modalidades, o período de recuperação é de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 anos.
[0075] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio da descrição, incluindo aqueles em que o método compreende a administração entre 1 e 12 doses por olho, incluindo os pontos finais, o indivíduo experimentou um evento adverso após uma dose terapeuticamente eficaz e a dose subsequente compreende um número menor de rAAV completo do que a dose anterior que induziu o evento adverso. Em uma modalidade, o indivíduo se recupera do evento adverso e uma dose subsequente da composição farmacêutica é administrada ao indivíduo. Em algumas modalidades, a dose terapeuticamente eficaz que induziu o evento adverso e a dose subsequente contêm um número igual de rAAV completo. Em algumas modalidades, a dose terapeuticamente eficaz que induziu o evento adverso e a dose subsequente não contém um número igual de rAAV completo.
[0076] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio da descrição, o método compreende ainda a administração de uma quantidade de uma pluralidade de rAAVs de placebo ao indivíduo antes da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica, em que cada rAAV de placebo é um rAAV vazio. Em algumas modalidades, o rAAV vazio não contém um promotor para expressar uma sequência exógena ou uma sequência exógena. Em algumas modalidades, a administração da quantidade de uma pluralidade de rAAVs de placebo é sistêmica. Em algumas modalidades, a administração da quantidade de uma pluralidade de rAAVs de placebo é local. Em algumas modalidades, o método compreende ainda (a) determinar se a pluralidade de rAAVs de placebo induziu uma resposta imune no indivíduo e/ou (b) determinar se o indivíduo desenvolveu uma tolerância imunológica à pluralidade de rAAVs de placebo, indicando assim que a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica não deve induzir um evento adverso mediado imunologicamente no indivíduo.
[0077] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio da descrição, o método compreende ainda a administração ao indivíduo de um supressor de uma resposta imune.
Em algumas modalidades, o supressor compreende um agente anti- inflamatório. Em algumas modalidades, o agente anti-inflamatório compreende um corticosteroide. Em algumas modalidades, o corticosteroide compreende prednisona ou prednisolona. Em algumas modalidades, a administração do supressor de uma resposta imune é sistêmica. Em algumas modalidades, o supressor de uma resposta imune é administrado por via oral. Em algumas modalidades, a administração do supressor de uma resposta imune é local. Em algumas modalidades, o supressor de uma resposta imune é administrado ao olho tratado com a composição farmacêutica. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica e o supressor de uma resposta imune são administrados simultaneamente. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica e o supressor de uma resposta imune são administrados no mesmo dia. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica e o supressor de uma resposta imune são administrados sequencialmente. Em algumas modalidades, a administração do supressor precede a administração da composição farmacêutica em pelo menos um dia. Em algumas modalidades, a administração da composição farmacêutica precede a administração do supressor em pelo menos um dia.
[0078] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio da descrição, o método compreende ainda determinar uma gravidade inicial de dano mediado por coroideremia em pelo menos um olho do indivíduo. Em algumas modalidades, o método compreende ainda determinar uma gravidade subsequente de dano mediado por coroideremia em pelo menos um olho do indivíduo após a administração da composição farmacêutica a pelo menos um olho. Em algumas modalidades, a gravidade inicial ou subsequente do dano mediado por coroideremia é determinada determinando uma pontuação de teste de Melhor Acuidade Visual Corrigida (BCVA), medindo uma área ou um volume de tecido retinal viável, medindo uma zona elipsoide preservada, medindo a sensibilidade retinal, medindo a sensibilidade ao contraste, medindo a visão de cores, medindo a acuidade visual de baixa luminância, medindo a velocidade de leitura ou qualquer combinação respectiva. Em algumas modalidades, o teste de BCVA utiliza um gráfico ETDRS (Estudo de Tratamento Precoce de Retinopatia Diabética, "Early Treatment of Diabetic Retinopathy Study"). Em algumas modalidades, o teste de BCVA compreende uma avaliação de um ou mais dentre contagem de dedos, movimento da mão, percepção de luz e uma combinação respectiva. Em algumas modalidades, o tecido retiniano viável compreende autofluorescência de fundo e em que a medição de tecido retiniano viável compreende a detecção de um nível ou padrão de autofluorescência de fundo de olho. Em algumas modalidades, a medição de uma zona de elipsoide preservada compreende Tomografia de Coerência Óptica de Domínio Espectral (SD-OCT). Em algumas modalidades, a medição da sensibilidade retinal compreende microperimetria.
[0079] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio da descrição, a administração da quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica inibe ou reduz a progressão de um sinal ou sintoma de coroideremia. Em algumas modalidades, a administração da quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica reduz um sinal ou sintoma de coroideremia. Em algumas modalidades, um sinal ou sintoma de coroideremia compreende uma perda de células fotorreceptoras, uma perda de células RPE, uma diminuição da acuidade visual, diminuição da acuidade visual de baixa luminescência, área total de autofluorescência preservada (AF), uma pontuação baixa em um teste de BCVA, uma área diminuída de zona elipsoide preservada, sensibilidade retiniana diminuída, sensibilidade ao contraste diminuída,
visão de cores diminuída ou desbotada, taxas diminuídas de leitura rápida ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, a gravidade do sinal ou sintoma de coroideremia é determinada em relação a uma retina saudável. Em algumas modalidades, a retina saudável pertence a um indivíduo controle de mesma idade.
[0080] A descrição fornece um método para determinar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica da descrição, o método compreendendo: (a) medir uma área de uma retina de um indivíduo a ser tratado, (b) determinar se a área de (a) está na área foveal central de 0,5 mm2 ou na mácula, (c) calcular o número de bastonetes, cones e células epiteliais pigmentares da retina (RPE) dentro da área de (a), e (d) multiplicar o número total de células por uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1x105 para calcular um número de partículas do genoma (gp) a serem incluídas na quantidade terapeuticamente eficaz, em que a área máxima da retina a ser tratada é de 10 mm2, em que a densidade de células RPE na retina é de 5.000 células por mm2, em que a densidade de bastonetes na retina é de
75.000 bastonetes por mm2 exclusivo da área foveal central de 0,5 mm2, em que a densidade de cones na retina é de 150.000 cones por mm2 na área foveal central de 0,5 mm2 e a densidade de cones na retina é de
25.000 por mm2 na mácula fora da área foveal central de 0,5 mm2.
[0081] A descrição fornece uma composição farmacêutica da descrição para uso no tratamento de uma doença ou um distúrbio em um indivíduo em necessidade.
[0082] A descrição fornece um vetor da descrição para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo em necessidade.
[0083] A descrição fornece um AAV ou um rAAV da descrição para uso no tratamento de uma doença ou um distúrbio em um indivíduo em necessidade.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0084] A Figura 1 é uma visão geral de um método de fabricação de Substância da Droga de Construto AAV2 exemplar (Processo 2)
[0085] A Figura 2 é um diagrama de fluxo correspondente à visão geral fornecida na Figura 1.
[0086] A Figura 3 é um diagrama que representa uma organização estrutural de um Construto AAV2 exemplar.
[0087] A Figura 4 é uma visão geral da produção de HEK293 MCB.
[0088] A Figura 5 é uma visão geral de um Método de Fabricação de Substância da Droga de Construto AAV2 (Processo Original).
[0089] A Figura 6 é um diagrama de fluxo correspondente à visão geral fornecida na Figura 5.
[0090] A Figura 7 é um diagrama de fluxo que descreve um Método de Fabricação de Produto da Droga de Construto AAV2 (Processo Original).
[0091] A Figura 8 é um par de diagramas de fluxo que representam uma comparação dos Métodos Originais e Melhorados -- Fases de Cultura Celular.
[0092] A Figura 9 é um gráfico que representa uma comparação dos Métodos Originais e Melhorados -- Fases de Cultura Celular.
[0093] A Figura 10 é um gráfico que representa uma comparação dos Métodos Originais e Melhorados -- Fases de Cultura Celular.
[0094] A Figura 11 é um diagrama de fluxo que descreve um método a jusante transferido do Processo Original para o Processo Melhorado.
[0095] A Figura 12 é um gráfico que representa uma comparação de Análise de Rendimento AVG DRP/cm² para Plasmídeos AmpR (barra esquerda) e KanR (barra direita).
[0096] A Figura 13 é um gráfico que representa uma Intensidade de Fluorescência Média de uma marcação detectável elucidando a expressão do Construto de cada célula após a transdução com o Construto AAV2.
[0097] A Figura 14 é um gráfico que representa uma porcentagem de células GFP-positivas, conforme determinado por citometria de fluxo, indicando uma porcentagem de células que expressam a proteína de Construto a partir da transdução seguinte com Construto AAV2.
[0098] A Figura 15 é um gráfico que representa os resultados de rendimento médio para Análise de Rendimento do Construto AAV2.
[0099] A Figura 16 é uma fotografia de uma eletroforese em gel que descreve os dados de pureza para uma composição de Construto AAV2 (não GMP) (do Processo Melhorado).
[00100] A Figura 17 é uma fotografia de uma eletroforese em gel que descreve a expressão e atividade do Construto após a transdução in vitro de células HEK293 com MOI equivalente do Vetor de Construto AAV2 a partir de composições (não GMP) produzidas por Processos Originais e Melhorados.
[00101] A Figura 18 é um mapa do Plasmídeo pAAV-REP1-Kan.
[00102] A Figura 19 é uma sequência completa do vetor pBC-hREP1 (SEQ ID Nº: 24).
[00103] A Figura 20 é um gráfico que representa a acuidade visual em olhos tratados e não tratados 2 anos após a terapia gênica (Exemplo 13). A acuidade visual medida com o gráfico de Estudo de Tratamento Precoce para Retinopatia Diabética (ETDRS) em 2 anos em 12 pacientes com coroideremia que receberam terapia genética sub- retiniana sem complicações (a linha horizontal representa a mediana, o gráfico de caixa representa o intervalo interquartil e as aparas representam os limites). Os olhos tratados são mostrados em azul com os olhos não tratados em verde (barra esquerda e barra direita, respectivamente, em cada ponto de tempo). Os dados provisórios de 1 ano também são mostrados. Houve melhora da acuidade visual nos olhos tratados 2 anos após a terapia gênica (p = 0,020). Os olhos tratados melhoraram em relação aos olhos não tratados nesse período (p = 0,003).
[00104] A Figura 21 é um gráfico que representa a função macular em olhos tratados e não tratados 2 anos após a terapia gênica. A sensibilidade retiniana medida com microperimetria inclui pontos em toda a mácula e aumenta com a melhora da função retiniana. Houve uma queda na sensibilidade da retina nos olhos não tratados da linha de base por 2 anos (p = 0,004), mas nenhuma mudança significativa nos olhos tratados nesse período. Os dados provisórios de 1 ano também são mostrados. Os olhos tratados são mostrados em azul e os olhos não tratados em verde (barra esquerda e barra direita, respectivamente, em cada ponto de tempo) – as barras de erro representam o erro padrão da média.
[00105] A Figura 22 é um desenho esquemático que descreve o projeto do ensaio GEMINI descrito no Exemplo 14.
[00106] A Figura 23A-B é um desenho esquemático que descreve uma vitrectomia (A) e uma Injeção sub-retinal (B) do Vetor AAV2. (A) Uma vitrectomia padrão através do sistema operacional BIOM para remover o gel vítreo é seguida por (B) procedimento de 2 etapas: 1) descolamento da retina por injeção de BSS; 2) injeção de um volume de 0,1 mL de suspensão de vetor através de uma cânula de calibre 41 no espaço sub-retinal.
[00107] A Figura 24 é um desenho esquemático que descreve o projeto do ensaio STAR descrito no Exemplo 15.
[00108] A Figura 25 é um gráfico que mostra o título de AAV conforme determinado por PCR. No eixo X estão as amostras com um título inicial de 1x1012 partículas resistentes à DNase (DRP)/mL, 1x1011 DRP/mL e 1x1011 DRP/mL em solução salina balanceada (BSS). No eixo Y, é mostrado o título medido depois que as amostras foram tratadas conforme descrito à direita do gráfico.
[00109] A Figura 26 é uma série de 3 fotografias de testes Western blot mostrando a atividade de prenilação de rAAV2.REP-1 em um estudo de compatibilidade usando o vetor AAV2.REP1.ENG1014-A em uma dose alta de 1x1012 DRP/mL e um MOI de 10.000. De cima para baixo são mostrados: hREP1 (83 KDa), Actina (42 KDa) e Rab6a biotinilado (24 KDa). Os tamanhos das proteínas são indicados à esquerda, de cima para baixo, como 180, 135, 100, 75, 63, 48, 35, 25, 20, 17 e 11 KDa. As amostras, da esquerda para a direita, em triplicado, são: controle não transduzido, células transduzidas com vetor de linha de base, com vetor mantido 6 horas a 4°C, com vetor mantido 6 horas a 4°C e injetado após 180 minutos, com vetor mantido 6 horas a 4°C e 180 minutos em uma seringa, e REP1 de peixe como controle positivo (amostra única).
[00110] A Figura 27 é uma série de 3 fotografias de testes Western blot mostrando a atividade de prenilação de rAAV2.REP-1 em um estudo de compatibilidade usando o vetor AAV2.REP1.ENG1014-A em uma dose baixa de 1x1011 DRP/mL e um MOI de 10.000. De cima para baixo são mostrados: hREP1 (83 KDa), Actina (42 KDa) e Rab6a biotinilado (24 KDa). Os tamanhos das proteínas são indicados à esquerda, de cima para baixo, como 180, 135, 100, 75, 63, 48, 35, 25, 20, 17 e 11 KDa. As amostras, da esquerda para a direita, em triplicado, são: controle não transduzido, células transduzidas com vetor de linha de base, com vetor mantido 6 horas a 4°C, com vetor mantido 6 horas a 4°C e injetado após 180 minutos, com vetor mantido 6 horas a 4°C e 180 minutos em uma seringa, e REP1 de peixe como controle positivo (amostra única).
[00111] A Figura 28A-B é um par de gráficos que mostram a semiquantificação de testes Western blot da atividade de prenilação de rAAV2.REP-1 em um estudo de compatibilidade usando o vetor
AAV2.REP1.ENG1014-A. (A) Mostra REP1 normalizado. Os valores de densidade de banda (a.u.) estão no eixo y e AAV2-REP1 em uma dose alta de 1x1012 DRP/mL e uma dose baixa de 1x1011 DRP/mL estão no eixo x. (B) Mostra Rab6a biotinilado normalizado. Os valores de densidade de banda (a.u.) estão no eixo y e AAV2-REP1 em uma dose alta de 1x1012 DRP/mL e uma dose baixa de 1x1011 DRP/mL estão no eixo x. Em (A) e (B), as barras para cada dose, da esquerda para a direita, indicam células não transduzidas, células transduzidas com vetor de linha de base, com vetor mantido 6 horas a 4°C, + 6 horas a 4°C e injetadas após 180 minutos a 20°C, com vetor 6 horas a 4°C e 180 minutos em uma seringa a 20°C.
[00112] A Figura 29 é um construto exemplar da descrição compreendendo ou consistindo em uma sequência de nucleotídeos compreendendo de 5' a 3', uma sequência que codifica uma repetição terminal invertida 5' (ITR), uma sequência que codifica um promotor CAG, uma sequência que codifica uma proteína REP1 humana, uma sequência que codifica um sinal WPRE mutado, uma sequência que codifica um sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino e uma sequência que codifica um ITR 3'.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00113] A descrição fornece métodos para a purificação de uma partícula de AAV recombinante (rAAV) da descrição. A descrição fornece composições farmacêuticas compreendendo partículas de rAAV produzidas pelos métodos da descrição. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendendo partículas de rAAV produzidas pelos métodos da descrição compreendem (a) entre 0,5 e 2,5 x 1012 genomas de vetor (vg)/mL de vírus adenoassociado com replicação deficiente e recombinante (rAAV); (b) menos de 50% de capsídeos vazios; (c) menos de 4 ng/mL de proteína da célula hospedeira residual por 1,0 x 1012 vg/mL; e (d) menos de 7 x 10-3 pg/ml de DNA da célula hospedeira residual por 1,0 x 1012 vg/ml.
[00114] A descrição fornece um método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo em necessidade, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica da descrição. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é uma doença ou distúrbio retiniano. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é Coroideremia.
[00115] A descrição fornece uma composição farmacêutica compreendendo: (a) entre 0,5 e 2,5 x 1012 genomas de vetor (vg)/mL de vírus adenoassociado com replicação deficiente e recombinante (rAAV); (b) menos de 50% de capsídeos vazios; (c) menos de 4 ng/mL de proteína da célula hospedeira residual por 1,0 x 1012 vg/mL; e (d) menos de 7 x 10-3 pg/ml de DNA da célula hospedeira residual por 1,0 x 1012 vg/ml.
[00116] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende (a) entre 0,5 e 2,5 x 1012 genomas de vetor (vg)/mL de vírus adenoassociado com replicação deficiente e recombinante (rAAV); (b) menos de 50% de capsídeos vazios; (c) menos de 4 ng/mL de proteína da célula hospedeira residual por 1,0 x 1012 vg/mL; (d) menos de 7 x 10-3 pg/ml de DNA da célula hospedeira residual por 1,0 x 1012 vg/mL; e (e) uma pluralidade de vg/mL funcional, em que cada um dos genomas de vetor funcional é capaz de expressar uma sequência exógena em uma célula após a transdução. Em algumas modalidades, após a transdução de uma célula com uma composição farmacêutica da descrição, a pluralidade de vg/mL funcional expressa a sequência exógena em um aumento de 2 vezes quando comparado a um nível de expressão de uma sequência endógena correspondente em uma célula não transduzida. Em algumas modalidades, após a transdução de uma célula com uma composição farmacêutica da descrição, a pluralidade de vg/mL funcional expressa a sequência exógena em 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes, 18 vezes, 19 vezes, 20 vezes, ou qualquer outro incremento de aumento dentro desses valores, quando comparado a um nível de expressão de uma sequência endógena correspondente em uma célula não transduzida. Em algumas modalidades, a sequência exógena e a sequência endógena correspondente são idênticas. Em algumas modalidades, a sequência exógena e a sequência endógena correspondente não são idênticas. Em algumas modalidades, a sequência exógena e a sequência endógena correspondente têm pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou qualquer porcentagem intermediária de identidade.
[00117] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende (a) entre 0,5 e 2,5 x 1012 genomas de vetor (vg)/mL de vírus adenoassociado com replicação deficiente e recombinante (rAAV); (b) menos de 50% de capsídeos vazios; (c) menos de 4 ng/mL de proteína da célula hospedeira residual por 1,0 x 1012 vg/mL; (d) menos de 7 x 10- 3 pg/ml de DNA da célula hospedeira residual por 1,0 x 1012 vg/mL; e (e) uma pluralidade de vg/mL funcional, em que cada um dos genomas de vetor funcional é capaz de expressar uma sequência exógena em uma célula após a transdução. Em algumas modalidades, após a transdução de uma célula com uma composição farmacêutica da descrição, a sequência exógena codifica uma proteína. Em algumas modalidades, a proteína codificada pela sequência exógena tem um nível de atividade igual ou maior que um nível de atividade de uma proteína codificada por uma sequência correspondente de uma célula não transduzida. Em algumas modalidades, a sequência exógena e a sequência endógena correspondente são idênticas. Em algumas modalidades, a sequência exógena e a sequência endógena correspondente não são idênticas.
Em algumas modalidades, a sequência exógena e a sequência endógena correspondente têm pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou qualquer porcentagem intermediária de identidade. Em algumas modalidades, a atividade compreende a ligação, ativação e/ou transferência de um ou mais grupos funcionais para um ligante ou substrato. Em algumas modalidades, a proteína compreende uma proteína REP-1 e a atividade compreende a prenilação do substrato REP-1. Composições de AAV
[00118] As composições da descrição compreendem um Construto terapêutico adequado para administração sistêmica ou local a um mamífero e, preferencialmente, a um humano. Construtos exemplares da descrição compreendem uma sequência que codifica um gene ou uma porção do mesmo. Preferencialmente, os Construtos da descrição compreendem uma sequência que codifica um gene humano ou uma porção do mesmo. Construtos exemplares da descrição podem compreender ainda uma ou mais sequências que codificam elementos reguladores para permitir ou intensificar a expressão do gene ou de uma porção do mesmo. Os elementos reguladores exemplares incluem, mas não estão limitados a, promotores, íntrons, elementos intensificadores, elementos de resposta (incluindo elementos de resposta pós- transcricional ou elementos reguladores pós-transcricionais), sequências de poliadenosina (poliA) e um fragmento de gene para facilitar a terminação eficiente de transcrição (incluindo um fragmento do gene da β-globina e um fragmento do gene da β-globina de coelho).
[00119] Em algumas modalidades das composições da descrição, o Construto compreende um gene humano ou uma porção do mesmo correspondente a uma Proteína de Escolta Rab humana tipo 1 (REP-1) ou uma porção da mesma. Em algumas modalidades das composições da descrição, o Construto compreende um gene humano ou uma porção do mesmo compreendendo uma sequência otimizada por códons. Em algumas modalidades, a sequência é otimizada por códons para expressão em mamíferos. Em algumas modalidades, a sequência é otimizada por códons para expressão em humanos.
[00120] Em algumas modalidades das composições da descrição, em que o Construto compreende uma proteína REP-1 humana ou uma porção da mesma, o Construto é referido como "AAV2-REP1 ou AAV2.REP1" e a Denominação Comum Internacional (DCI) é timrepigene emparvovec. Em algumas modalidades, o Construto compreende ou consiste na sequência de: 1 CTGCGCGCTC GCTCGCTCAC TGAGGCCGCC CGGGCAAAGC
CCGGGCGTCG GGCGACCTTT 61 GGTCGCCCGG CCTCAGTGAG CGAGCGAGCG CGCAGAGAGG
GAGTGGCCAA CTCCATCACT 121 AGGGGTTCCT TGTAGTTAAT GATTAACCCG CCATGCTACT
TATCTACGTA GCCATGCTCT 181 AGGTACCATT GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT
AACGCCAATA GGGACTTTCC 241 ATTGACGTCA ATGGGTGGAG TATTTACGGT AAACTGCCCA
CTTGGCAGTA CATCAAGTGT 301 ATCATATGCC AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG
TAAATGGCCC GCCTGGCATT 361 ATGCCCAGTA CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA
GTACATCTAC GTATTAGTCA 421 TCGCTATTAC CATGGTCGAG GTGAGCCCCA CGTTCTGCTT
CACTCTCCCC ATCTCCCCCC 481 CCTCCCCACC CCCAATTTTG TATTTATTTA TTTTTTAATT
ATTTTGTGCA GCGATGGGGG 541 CGGGGGGGGG GGGGGGGCGC GCGCCAGGCG GGGCGGGGCG
GGGCGAGGGG CGGGGCGGGG 601 CGAGGCGGAG AGGTGCGGCG GCAGCCAATC AGAGCGGCGC
GCTCCGAAAG TTTCCTTTTA
661 TGGCGAGGCG GCGGCGGCGG CGGCCCTATA AAAAGCGAAG
CGCGCGGCGG GCGGGAGTCG 721 CTGCGCGCTG CCTTCGCCCC GTGCCCCGCT CCGCCGCCGC
CTCGCGCCGC CCGCCCCGGC 781 TCTGACTGAC CGCGTTACTC CCACAGGTGA GCGGGCGGGA
CGGCCCTTCT CCTCCGGGCT 841 GTAATTAGCG CTTGGTTTAA TGACGGCTTG TTTCTTTTCT
GTGGCTGCGT GAAAGCCTTG 901 AGGGGCTCCG GGAGGGCCCT TTGTGCGGGG GGAGCGGCTC
GGGGCTGTCC GCGGGGGGAC 961 GGCTGCCTTC GGGGGGGACG GGGCAGGGCG GGGTTCGGCT
TCTGGCGTGT GACCGGCGGC 1021 TCTAGAGCCT CTGCTAACCA TGTTCATGCC TTCTTCTTTT
TCCTACAGCT CCTGGGCAAC 1081 GTGCTGGTTA TTGTGCTGTC TCATCATTTT GGCAAAGAAT
TGGATCCTAG CTTGATATCG 1141 AATTCCTGCA GCCCGGCGGC ACCATGGCGG ATACTCTCCC
TTCGGAGTTT GATGTGATCG 1201 TAATAGGGAC GGGTTTGCCT GAATCCATCA TTGCAGCTGC
ATGTTCAAGA AGTGGCCGGA 1261 GAGTTCTGCA TGTTGATTCA AGAAGCTACT ATGGAGGAAA
CTGGGCCAGT TTTAGCTTTT 1321 CAGGACTATT GTCCTGGCTA AAGGAATACC AGGAAAACAG
TGACATTGTA AGTGACAGTC 1381 CAGTGTGGCA AGACCAGATC CTTGAAAATG AAGAAGCCAT
TGCTCTTAGC AGGAAGGACA 1441 AAACTATTCA ACATGTGGAA GTATTTTGTT ATGCCAGTCA
GGATTTGCAT GAAGATGTCG 1501 AAGAAGCTGG TGCACTGCAG AAAAATCATG CTCTTGTGAC
ATCTGCAAAC TCCACAGAAG 1561 CTGCAGATTC TGCCTTCCTG CCTACGGAGG ATGAGTCATT
AAGCACTATG AGCTGTGAAA 1621 TGCTCACAGA ACAAACTCCA AGCAGCGATC CAGAGAATGC
GCTAGAAGTA AATGGTGCTG 1681 AAGTGACAGG GGAAAAAGAA AACCATTGTG ATGATAAAAC
TTGTGTGCCA TCAACTTCAG 1741 CAGAAGACAT GAGTGAAAAT GTGCCTATAG CAGAAGATAC
CACAGAGCAA CCAAAGAAAA 1801 ACAGAATTAC TTACTCACAA ATTATTAAAG AAGGCAGGAG
ATTTAATATT GATTTAGTAT 1861 CAAAGCTGCT GTATTCTCGA GGATTACTAA TTGATCTTCT
AATCAAATCT AATGTTAGTC 1921 GATATGCAGA GTTTAAAAAT ATTACCAGGA TTCTTGCATT
TCGAGAAGGA CGAGTGGAAC 1981 AGGTTCCGTG TTCCAGAGCA GATGTCTTTA ATAGCAAACA
ACTTACTATG GTAGAAAAGC 2041 GAATGCTAAT GAAATTTCTT ACATTTTGTA TGGAATATGA
GAAATATCCT GATGAATATA 2101 AAGGATATGA AGAGATCACA TTTTATGAAT ATTTAAAGAC
TCAAAAATTA ACCCCCAACC 2161 TCCAATATAT TGTCATGCAT TCAATTGCAA TGACATCAGA
GACAGCCAGC AGCACCATAG 2221 ATGGTCTCAA AGCTACCAAA AACTTTCTTC ACTGTCTTGG
GCGGTATGGC AACACTCCAT 2281 TTTTGTTTCC TTTATATGGC CAAGGAGAAC TCCCCCAGTG
TTTCTGCAGG ATGTGTGCTG 2341 TGTTTGGTGG AATTTATTGT CTTCGCCATT CAGTACAGTG
CCTTGTAGTG GACAAAGAAT 2401 CCAGAAAATG TAAAGCAATT ATAGATCAGT TTGGTCAGAG
AATAATCTCT GAGCATTTCC 2461 TCGTGGAGGA CAGTTACTTT CCTGAGAACA TGTGCTCACG
TGTGCAATAC AGGCAGATCT 2521 CCAGGGCAGT GCTGATTACA GATAGATCTG TCCTAAAAAC
AGATTCAGAT CAACAGATTT 2581 CCATTTTGAC AGTGCCAGCA GAGGAACCAG GAACTTTTGC
TGTTCGGGTC ATTGAGTTAT
2641 GTTCTTCAAC GATGACATGC ATGAAAGGCA CCTATTTGGT
TCATTTGACT TGCACATCTT 2701 CTAAAACAGC AAGAGAAGAT TTAGAATCAG TTGTGCAGAA
ATTGTTTGTT CCATATACTG 2761 AAATGGAGAT AGAAAATGAA CAAGTAGAAA AGCCAAGAAT
TCTGTGGGCT CTTTACTTCA 2821 ATATGAGAGA TTCGTCAGAC ATCAGCAGGA GCTGTTATAA
TGATTTACCA TCCAACGTTT 2881 ATGTCTGCTC TGGCCCAGAT TGTGGTTTAG GAAATGATAA
TGCAGTCAAA CAGGCTGAAA 2941 CACTTTTCCA GGAAATCTGC CCCAATGAAG ATTTCTGTCC
CCCTCCACCA AATCCTGAAG 3001 ACATTATCCT TGATGGAGAC AGTTTACAGC CAGAGGCTTC
AGAATCCAGT GCCATACCAG 3061 AGGCTAACTC GGAGACTTTC AAGGAAAGCA CAAACCTTGG
AAACCTAGAG GAGTCCTCTG 3121 AATAATCTAG TCGATTCGAA TTCGATATCA AGCTTATCGA
TAATCAACCT CTGGATTACA 3181 AAATTTGTGA AAGATTGACT GGTATTCTTA ACTATGTTGC
TCCTTTTACG CTATGTGGAT 3241 ACGCTGCTTT AATGCCTTTG TATCATGCTA TTGCTTCCCG
TATGGCTTTC ATTTTCTCCT 3301 CCTTGTATAA ATCCTGGTTG CTGTCTCTTT ATGAGGAGTT
GTGGCCCGTT GTCAGGCAAC 3361 GTGGCGTGGT GTGCACTGTG TTTGCTGACG CAACCCCCAC
TGGTTGGGGC ATTGCCACCA 3421 CCTGTCAGCT CCTTTCCGGG ACTTTCGCTT TCCCCCTCCC
TATTGCCACG GCGGAACTCA 3481 TCGCCGCCTG CCTTGCCCGC TGCTGGACAG GGGCTCGGCT
GTTGGGCACT GACAATTCCG 3541 TGGTGTTGTC GGGGAAATCA TCGTCCTTTC CTTGGCTGCT
CGCCTGTGTT GCCACCTGGA 3601 TTCTGCGCGG GACGTCCTTC TGCTACGTCC CTTCGGCCCT
CAATCCAGCG GACCTTCCTT 3661 CCCGCGGCCT GCTGCCGGCT CTGCGGCCTC TTCCGCGTCT
TCGCCTTCGC CCTCAGACGA 3721 GTCGGATCTC CCTTTGGGCC GCCTCCCCGC ATCGATACCG
TCGACTCGCT GATCAGCCTC 3781 GACTGTGCCT TCTAGTTGCC AGCCATCTGT TGTTTGCCCC
TCCCCCGTGC CTTCCTTGAC 3841 CCTGGAAGGT GCCACTCCCA CTGTCCTTTC CTAATAAAAT
GAGGAAATTG CATCGCATTG 3901 TCTGAGTAGG TGTCATTCTA TTCTGGGGGG TGGGGTGGGG
CAGGACAGCA AGGGGGAGGA 3961 TTGGGAAGAC AATAGCAGGC ATGCTGGGGA TGCGGTGGGC
TCTATGGCTT CTGAGGCGGA 4021 AAGAACCAGC TGGGGCTCGA CTAGAGCATG GCTACGTAGA
TAAGTAGCAT GGCGGGTTAA 4081 TCATTAACTA CAAGGAACCC CTAGTGATGG AGTTGGCCAC
TCCCTCTCTG CGCGCTCGCT 4141 CGCTCACTGA GGCCGGGCGA CCAAAGGTCG CCCGACGCCC
GGGCGGCCTC AGTGAGCGAG 4201 CGAGCGCGCA GAG (SEQ ID Nº: 16).
[00121] Em algumas modalidades, o Construto compreende ou consiste em uma sequência com pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou qualquer porcentagem intermediária de identidade para a sequência de: 1 CTGCGCGCTC GCTCGCTCAC TGAGGCCGCC CGGGCAAAGC
CCGGGCGTCG GGCGACCTTT 61 GGTCGCCCGG CCTCAGTGAG CGAGCGAGCG CGCAGAGAGG
GAGTGGCCAA CTCCATCACT 121 AGGGGTTCCT TGTAGTTAAT GATTAACCCG CCATGCTACT
TATCTACGTA GCCATGCTCT 181 AGGTACCATT GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT
AACGCCAATA GGGACTTTCC 241 ATTGACGTCA ATGGGTGGAG TATTTACGGT AAACTGCCCA
CTTGGCAGTA CATCAAGTGT 301 ATCATATGCC AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG
TAAATGGCCC GCCTGGCATT 361 ATGCCCAGTA CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA
GTACATCTAC GTATTAGTCA 421 TCGCTATTAC CATGGTCGAG GTGAGCCCCA CGTTCTGCTT
CACTCTCCCC ATCTCCCCCC 481 CCTCCCCACC CCCAATTTTG TATTTATTTA TTTTTTAATT
ATTTTGTGCA GCGATGGGGG 541 CGGGGGGGGG GGGGGGGCGC GCGCCAGGCG GGGCGGGGCG
GGGCGAGGGG CGGGGCGGGG 601 CGAGGCGGAG AGGTGCGGCG GCAGCCAATC AGAGCGGCGC
GCTCCGAAAG TTTCCTTTTA 661 TGGCGAGGCG GCGGCGGCGG CGGCCCTATA AAAAGCGAAG
CGCGCGGCGG GCGGGAGTCG 721 CTGCGCGCTG CCTTCGCCCC GTGCCCCGCT CCGCCGCCGC
CTCGCGCCGC CCGCCCCGGC 781 TCTGACTGAC CGCGTTACTC CCACAGGTGA GCGGGCGGGA
CGGCCCTTCT CCTCCGGGCT 841 GTAATTAGCG CTTGGTTTAA TGACGGCTTG TTTCTTTTCT
GTGGCTGCGT GAAAGCCTTG 901 AGGGGCTCCG GGAGGGCCCT TTGTGCGGGG GGAGCGGCTC
GGGGCTGTCC GCGGGGGGAC 961 GGCTGCCTTC GGGGGGGACG GGGCAGGGCG GGGTTCGGCT
TCTGGCGTGT GACCGGCGGC 1021 TCTAGAGCCT CTGCTAACCA TGTTCATGCC TTCTTCTTTT
TCCTACAGCT CCTGGGCAAC 1081 GTGCTGGTTA TTGTGCTGTC TCATCATTTT GGCAAAGAAT
TGGATCCTAG CTTGATATCG 1141 AATTCCTGCA GCCCGGCGGC ACCATGGCGG ATACTCTCCC
TTCGGAGTTT GATGTGATCG 1201 TAATAGGGAC GGGTTTGCCT GAATCCATCA TTGCAGCTGC
ATGTTCAAGA AGTGGCCGGA
1261 GAGTTCTGCA TGTTGATTCA AGAAGCTACT ATGGAGGAAA
CTGGGCCAGT TTTAGCTTTT 1321 CAGGACTATT GTCCTGGCTA AAGGAATACC AGGAAAACAG
TGACATTGTA AGTGACAGTC 1381 CAGTGTGGCA AGACCAGATC CTTGAAAATG AAGAAGCCAT
TGCTCTTAGC AGGAAGGACA 1441 AAACTATTCA ACATGTGGAA GTATTTTGTT ATGCCAGTCA
GGATTTGCAT GAAGATGTCG 1501 AAGAAGCTGG TGCACTGCAG AAAAATCATG CTCTTGTGAC
ATCTGCAAAC TCCACAGAAG 1561 CTGCAGATTC TGCCTTCCTG CCTACGGAGG ATGAGTCATT
AAGCACTATG AGCTGTGAAA 1621 TGCTCACAGA ACAAACTCCA AGCAGCGATC CAGAGAATGC
GCTAGAAGTA AATGGTGCTG 1681 AAGTGACAGG GGAAAAAGAA AACCATTGTG ATGATAAAAC
TTGTGTGCCA TCAACTTCAG 1741 CAGAAGACAT GAGTGAAAAT GTGCCTATAG CAGAAGATAC
CACAGAGCAA CCAAAGAAAA 1801 ACAGAATTAC TTACTCACAA ATTATTAAAG AAGGCAGGAG
ATTTAATATT GATTTAGTAT 1861 CAAAGCTGCT GTATTCTCGA GGATTACTAA TTGATCTTCT
AATCAAATCT AATGTTAGTC 1921 GATATGCAGA GTTTAAAAAT ATTACCAGGA TTCTTGCATT
TCGAGAAGGA CGAGTGGAAC 1981 AGGTTCCGTG TTCCAGAGCA GATGTCTTTA ATAGCAAACA
ACTTACTATG GTAGAAAAGC 2041 GAATGCTAAT GAAATTTCTT ACATTTTGTA TGGAATATGA
GAAATATCCT GATGAATATA 2101 AAGGATATGA AGAGATCACA TTTTATGAAT ATTTAAAGAC
TCAAAAATTA ACCCCCAACC 2161 TCCAATATAT TGTCATGCAT TCAATTGCAA TGACATCAGA
GACAGCCAGC AGCACCATAG 2221 ATGGTCTCAA AGCTACCAAA AACTTTCTTC ACTGTCTTGG
GCGGTATGGC AACACTCCAT 2281 TTTTGTTTCC TTTATATGGC CAAGGAGAAC TCCCCCAGTG
TTTCTGCAGG ATGTGTGCTG 2341 TGTTTGGTGG AATTTATTGT CTTCGCCATT CAGTACAGTG
CCTTGTAGTG GACAAAGAAT 2401 CCAGAAAATG TAAAGCAATT ATAGATCAGT TTGGTCAGAG
AATAATCTCT GAGCATTTCC 2461 TCGTGGAGGA CAGTTACTTT CCTGAGAACA TGTGCTCACG
TGTGCAATAC AGGCAGATCT 2521 CCAGGGCAGT GCTGATTACA GATAGATCTG TCCTAAAAAC
AGATTCAGAT CAACAGATTT 2581 CCATTTTGAC AGTGCCAGCA GAGGAACCAG GAACTTTTGC
TGTTCGGGTC ATTGAGTTAT 2641 GTTCTTCAAC GATGACATGC ATGAAAGGCA CCTATTTGGT
TCATTTGACT TGCACATCTT 2701 CTAAAACAGC AAGAGAAGAT TTAGAATCAG TTGTGCAGAA
ATTGTTTGTT CCATATACTG 2761 AAATGGAGAT AGAAAATGAA CAAGTAGAAA AGCCAAGAAT
TCTGTGGGCT CTTTACTTCA 2821 ATATGAGAGA TTCGTCAGAC ATCAGCAGGA GCTGTTATAA
TGATTTACCA TCCAACGTTT 2881 ATGTCTGCTC TGGCCCAGAT TGTGGTTTAG GAAATGATAA
TGCAGTCAAA CAGGCTGAAA 2941 CACTTTTCCA GGAAATCTGC CCCAATGAAG ATTTCTGTCC
CCCTCCACCA AATCCTGAAG 3001 ACATTATCCT TGATGGAGAC AGTTTACAGC CAGAGGCTTC
AGAATCCAGT GCCATACCAG 3061 AGGCTAACTC GGAGACTTTC AAGGAAAGCA CAAACCTTGG
AAACCTAGAG GAGTCCTCTG 3121 AATAATCTAG TCGATTCGAA TTCGATATCA AGCTTATCGA
TAATCAACCT CTGGATTACA 3181 AAATTTGTGA AAGATTGACT GGTATTCTTA ACTATGTTGC
TCCTTTTACG CTATGTGGAT
3241 ACGCTGCTTT AATGCCTTTG TATCATGCTA TTGCTTCCCG
TATGGCTTTC ATTTTCTCCT 3301 CCTTGTATAA ATCCTGGTTG CTGTCTCTTT ATGAGGAGTT
GTGGCCCGTT GTCAGGCAAC 3361 GTGGCGTGGT GTGCACTGTG TTTGCTGACG CAACCCCCAC
TGGTTGGGGC ATTGCCACCA 3421 CCTGTCAGCT CCTTTCCGGG ACTTTCGCTT TCCCCCTCCC
TATTGCCACG GCGGAACTCA 3481 TCGCCGCCTG CCTTGCCCGC TGCTGGACAG GGGCTCGGCT
GTTGGGCACT GACAATTCCG 3541 TGGTGTTGTC GGGGAAATCA TCGTCCTTTC CTTGGCTGCT
CGCCTGTGTT GCCACCTGGA 3601 TTCTGCGCGG GACGTCCTTC TGCTACGTCC CTTCGGCCCT
CAATCCAGCG GACCTTCCTT 3661 CCCGCGGCCT GCTGCCGGCT CTGCGGCCTC TTCCGCGTCT
TCGCCTTCGC CCTCAGACGA 3721 GTCGGATCTC CCTTTGGGCC GCCTCCCCGC ATCGATACCG
TCGACTCGCT GATCAGCCTC 3781 GACTGTGCCT TCTAGTTGCC AGCCATCTGT TGTTTGCCCC
TCCCCCGTGC CTTCCTTGAC 3841 CCTGGAAGGT GCCACTCCCA CTGTCCTTTC CTAATAAAAT
GAGGAAATTG CATCGCATTG 3901 TCTGAGTAGG TGTCATTCTA TTCTGGGGGG TGGGGTGGGG
CAGGACAGCA AGGGGGAGGA 3961 TTGGGAAGAC AATAGCAGGC ATGCTGGGGA TGCGGTGGGC
TCTATGGCTT CTGAGGCGGA 4021 AAGAACCAGC TGGGGCTCGA CTAGAGCATG GCTACGTAGA
TAAGTAGCAT GGCGGGTTAA 4081 TCATTAACTA CAAGGAACCC CTAGTGATGG AGTTGGCCAC
TCCCTCTCTG CGCGCTCGCT 4141 CGCTCACTGA GGCCGGGCGA CCAAAGGTCG CCCGACGCCC
GGGCGGCCTC AGTGAGCGAG 4201 CGAGCGCGCA GAG (SEQ ID Nº: 16).
[00122] Em algumas modalidades, o Construto compreende ou consiste em uma sequência que codifica uma sequência REP1 humana com a sequência de 1 ATGGCGGATA CTCTCCCTTC GGAGTTTGAT GTGATCGTAA
TAGGGACGGG TTTGCCTGAA 61 TCCATCATTG CAGCTGCATG TTCAAGAAGT GGCCGGAGAG
TTCTGCATGT TGATTCAAGA 121 AGCTACTATG GAGGAAACTG GGCCAGTTTT AGCTTTTCAG
GACTATTGTC CTGGCTAAAG 181 GAATACCAGG AAAACAGTGA CATTGTAAGT GACAGTCCAG
TGTGGCAAGA CCAGATCCTT 241 GAAAATGAAG AAGCCATTGC TCTTAGCAGG AAGGACAAAA
CTATTCAACA TGTGGAAGTA 301 TTTTGTTATG CCAGTCAGGA TTTGCATGAA GATGTCGAAG
AAGCTGGTGC ACTGCAGAAA 361 AATCATGCTC TTGTGACATC TGCAAACTCC ACAGAAGCTG
CAGATTCTGC CTTCCTGCCT 421 ACGGAGGATG AGTCATTAAG CACTATGAGC TGTGAAATGC
TCACAGAACA AACTCCAAGC 481 AGCGATCCAG AGAATGCGCT AGAAGTAAAT GGTGCTGAAG
TGACAGGGGA AAAAGAAAAC 541 CATTGTGATG ATAAAACTTG TGTGCCATCA ACTTCAGCAG
AAGACATGAG TGAAAATGTG 601 CCTATAGCAG AAGATACCAC AGAGCAACCA AAGAAAAACA
GAATTACTTA CTCACAAATT 661 ATTAAAGAAG GCAGGAGATT TAATATTGAT TTAGTATCAA
AGCTGCTGTA TTCTCGAGGA 721 TTACTAATTG ATCTTCTAAT CAAATCTAAT GTTAGTCGAT
ATGCAGAGTT TAAAAATATT 781 ACCAGGATTC TTGCATTTCG AGAAGGACGA GTGGAACAGG
TTCCGTGTTC CAGAGCAGAT 841 GTCTTTAATA GCAAACAACT TACTATGGTA GAAAAGCGAA
TGCTAATGAA ATTTCTTACA
901 TTTTGTATGG AATATGAGAA ATATCCTGAT GAATATAAAG
GATATGAAGA GATCACATTT 961 TATGAATATT TAAAGACTCA AAAATTAACC CCCAACCTCC
AATATATTGT CATGCATTCA 1021 ATTGCAATGA CATCAGAGAC AGCCAGCAGC ACCATAGATG
GTCTCAAAGC TACCAAAAAC 1081 TTTCTTCACT GTCTTGGGCG GTATGGCAAC ACTCCATTTT
TGTTTCCTTT ATATGGCCAA 1141 GGAGAACTCC CCCAGTGTTT CTGCAGGATG TGTGCTGTGT
TTGGTGGAAT TTATTGTCTT 1201 CGCCATTCAG TACAGTGCCT TGTAGTGGAC AAAGAATCCA
GAAAATGTAA AGCAATTATA 1261 GATCAGTTTG GTCAGAGAAT AATCTCTGAG CATTTCCTCG
TGGAGGACAG TTACTTTCCT 1321 GAGAACATGT GCTCACGTGT GCAATACAGG CAGATCTCCA
GGGCAGTGCT GATTACAGAT 1381 AGATCTGTCC TAAAAACAGA TTCAGATCAA CAGATTTCCA
TTTTGACAGT GCCAGCAGAG 1441 GAACCAGGAA CTTTTGCTGT TCGGGTCATT GAGTTATGTT
CTTCAACGAT GACATGCATG 1501 AAAGGCACCT ATTTGGTTCA TTTGACTTGC ACATCTTCTA
AAACAGCAAG AGAAGATTTA 1561 GAATCAGTTG TGCAGAAATT GTTTGTTCCA TATACTGAAA
TGGAGATAGA AAATGAACAA 1621 GTAGAAAAGC CAAGAATTCT GTGGGCTCTT TACTTCAATA
TGAGAGATTC GTCAGACATC 1681 AGCAGGAGCT GTTATAATGA TTTACCATCC AACGTTTATG
TCTGCTCTGG CCCAGATTGT 1741 GGTTTAGGAA ATGATAATGC AGTCAAACAG GCTGAAACAC
TTTTCCAGGA AATCTGCCCC 1801 AATGAAGATT TCTGTCCCCC TCCACCAAAT CCTGAAGACA
TTATCCTTGA TGGAGACAGT 1861 TTACAGCCAG AGGCTTCAGA ATCCAGTGCC ATACCAGAGG
CTAACTCGGA GACTTTCAAG
[00123] 1921 GAAAGCACAA ACCTTGGAAA CCTAGAGGAG TCCTCTGAAT AA (SEQ ID Nº: 17) ou uma sequência com pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, ou qualquer porcentagem intermediária de identidade para a sequência de 1 ATGGCGGATA CTCTCCCTTC GGAGTTTGAT GTGATCGTAA
TAGGGACGGG TTTGCCTGAA 61 TCCATCATTG CAGCTGCATG TTCAAGAAGT GGCCGGAGAG
TTCTGCATGT TGATTCAAGA 121 AGCTACTATG GAGGAAACTG GGCCAGTTTT AGCTTTTCAG
GACTATTGTC CTGGCTAAAG 181 GAATACCAGG AAAACAGTGA CATTGTAAGT GACAGTCCAG
TGTGGCAAGA CCAGATCCTT 241 GAAAATGAAG AAGCCATTGC TCTTAGCAGG AAGGACAAAA
CTATTCAACA TGTGGAAGTA 301 TTTTGTTATG CCAGTCAGGA TTTGCATGAA GATGTCGAAG
AAGCTGGTGC ACTGCAGAAA 361 AATCATGCTC TTGTGACATC TGCAAACTCC ACAGAAGCTG
CAGATTCTGC CTTCCTGCCT 421 ACGGAGGATG AGTCATTAAG CACTATGAGC TGTGAAATGC
TCACAGAACA AACTCCAAGC 481 AGCGATCCAG AGAATGCGCT AGAAGTAAAT GGTGCTGAAG
TGACAGGGGA AAAAGAAAAC 541 CATTGTGATG ATAAAACTTG TGTGCCATCA ACTTCAGCAG
AAGACATGAG TGAAAATGTG 601 CCTATAGCAG AAGATACCAC AGAGCAACCA AAGAAAAACA
GAATTACTTA CTCACAAATT 661 ATTAAAGAAG GCAGGAGATT TAATATTGAT TTAGTATCAA
AGCTGCTGTA TTCTCGAGGA 721 TTACTAATTG ATCTTCTAAT CAAATCTAAT GTTAGTCGAT
ATGCAGAGTT TAAAAATATT 781 ACCAGGATTC TTGCATTTCG AGAAGGACGA GTGGAACAGG
TTCCGTGTTC CAGAGCAGAT
841 GTCTTTAATA GCAAACAACT TACTATGGTA GAAAAGCGAA
TGCTAATGAA ATTTCTTACA 901 TTTTGTATGG AATATGAGAA ATATCCTGAT GAATATAAAG
GATATGAAGA GATCACATTT 961 TATGAATATT TAAAGACTCA AAAATTAACC CCCAACCTCC
AATATATTGT CATGCATTCA 1021 ATTGCAATGA CATCAGAGAC AGCCAGCAGC ACCATAGATG
GTCTCAAAGC TACCAAAAAC 1081 TTTCTTCACT GTCTTGGGCG GTATGGCAAC ACTCCATTTT
TGTTTCCTTT ATATGGCCAA 1141 GGAGAACTCC CCCAGTGTTT CTGCAGGATG TGTGCTGTGT
TTGGTGGAAT TTATTGTCTT 1201 CGCCATTCAG TACAGTGCCT TGTAGTGGAC AAAGAATCCA
GAAAATGTAA AGCAATTATA 1261 GATCAGTTTG GTCAGAGAAT AATCTCTGAG CATTTCCTCG
TGGAGGACAG TTACTTTCCT 1321 GAGAACATGT GCTCACGTGT GCAATACAGG CAGATCTCCA
GGGCAGTGCT GATTACAGAT 1381 AGATCTGTCC TAAAAACAGA TTCAGATCAA CAGATTTCCA
TTTTGACAGT GCCAGCAGAG 1441 GAACCAGGAA CTTTTGCTGT TCGGGTCATT GAGTTATGTT
CTTCAACGAT GACATGCATG 1501 AAAGGCACCT ATTTGGTTCA TTTGACTTGC ACATCTTCTA
AAACAGCAAG AGAAGATTTA 1561 GAATCAGTTG TGCAGAAATT GTTTGTTCCA TATACTGAAA
TGGAGATAGA AAATGAACAA 1621 GTAGAAAAGC CAAGAATTCT GTGGGCTCTT TACTTCAATA
TGAGAGATTC GTCAGACATC 1681 AGCAGGAGCT GTTATAATGA TTTACCATCC AACGTTTATG
TCTGCTCTGG CCCAGATTGT 1741 GGTTTAGGAA ATGATAATGC AGTCAAACAG GCTGAAACAC
TTTTCCAGGA AATCTGCCCC 1801 AATGAAGATT TCTGTCCCCC TCCACCAAAT CCTGAAGACA
TTATCCTTGA TGGAGACAGT 1861 TTACAGCCAG AGGCTTCAGA ATCCAGTGCC ATACCAGAGG
CTAACTCGGA GACTTTCAAG 1921 GAAAGCACAA ACCTTGGAAA CCTAGAGGAG TCCTCTGAAT AA (SEQ ID Nº: 17).
[00124] Em algumas modalidades, o Construto compreende ou consiste em uma sequência que codifica um promotor CAG com a sequência de 1 CCATTGACGT CAATAATGAC GTATGTTCCC ATAGTAACGC
CAATAGGGAC TTTCCATTGA 61 CGTCAATGGG TGGAGTATTT ACGGTAAACT GCCCACTTGG
CAGTACATCA AGTGTATCAT 121 ATGCCAAGTA CGCCCCCTAT TGACGTCAAT GACGGTAAAT
GGCCCGCCTG GCATTATGCC 181 CAGTACATGA CCTTATGGGA CTTTCCTACT TGGCAGTACA
TCTACGTATT AGTCATCGCT 241 ATTACCATGG TCGAGGTGAG CCCCACGTTC TGCTTCACTC
TCCCCATCTC CCCCCCCTCC 301 CCACCCCCAA TTTTGTATTT ATTTATTTTT TAATTATTTT
GTGCAGCGAT GGGGGCGGGG 361 GGGGGGGGGG GGCGCGCGCC AGGCGGGGCG GGGCGGGGCG
AGGGGCGGGG CGGGGCGAGG 421 CGGAGAGGTG CGGCGGCAGC CAATCAGAGC GGCGCGCTCC
GAAAGTTTCC TTTTATGGCG 481 AGGCGGCGGC GGCGGCGGCC CTATAAAAAG CGAAGCGCGC
GGCGGGCGGG AGTCGCTGCG 541 CGCTGCCTTC GCCCCGTGCC CCGCTCCGCC GCCGCCTCGC
GCCGCCCGCC CCGGCTCTGA 601 CTGACCGCGT TACTCCCACA GGTGAGCGGG CGGGACGGCC
CTTCTCCTCC GGGCTGTAAT 661 TAGCGCTTGG TTTAATGACG GCTTGTTTCT TTTCTGTGGC
TGCGTGAAAG CCTTGAGGGG 721 CTCCGGGAGG GCCCTTTGTG CGGGGGGAGC GGCTCGGGGC
TGTCCGCGGG GGGACGGCTG 781 CCTTCGGGGG GGACGGGGCA GGGCGGGGTT CGGCTTCTGG
CGTGTGACCG GCGGCTCTAG 841 AGCCTCTGCT AACCATGTTC ATGCCTTCTT CTTTTTCCTA
CAGCTCCTGG GCAACGTGCT
[00125] 901 GGTTATTGTG CTGTCTCATC ATTTTGGCAA AGAATTGGAT CC (SEQ ID Nº: 18) ou uma sequência com pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, ou qualquer porcentagem intermediária de identidade para a sequência de 1 CCATTGACGT CAATAATGAC GTATGTTCCC ATAGTAACGC
CAATAGGGAC TTTCCATTGA 61 CGTCAATGGG TGGAGTATTT ACGGTAAACT GCCCACTTGG
CAGTACATCA AGTGTATCAT 121 ATGCCAAGTA CGCCCCCTAT TGACGTCAAT GACGGTAAAT
GGCCCGCCTG GCATTATGCC 181 CAGTACATGA CCTTATGGGA CTTTCCTACT TGGCAGTACA
TCTACGTATT AGTCATCGCT 241 ATTACCATGG TCGAGGTGAG CCCCACGTTC TGCTTCACTC
TCCCCATCTC CCCCCCCTCC 301 CCACCCCCAA TTTTGTATTT ATTTATTTTT TAATTATTTT
GTGCAGCGAT GGGGGCGGGG 361 GGGGGGGGGG GGCGCGCGCC AGGCGGGGCG GGGCGGGGCG
AGGGGCGGGG CGGGGCGAGG 421 CGGAGAGGTG CGGCGGCAGC CAATCAGAGC GGCGCGCTCC
GAAAGTTTCC TTTTATGGCG 481 AGGCGGCGGC GGCGGCGGCC CTATAAAAAG CGAAGCGCGC
GGCGGGCGGG AGTCGCTGCG 541 CGCTGCCTTC GCCCCGTGCC CCGCTCCGCC GCCGCCTCGC
GCCGCCCGCC CCGGCTCTGA 601 CTGACCGCGT TACTCCCACA GGTGAGCGGG CGGGACGGCC
CTTCTCCTCC GGGCTGTAAT 661 TAGCGCTTGG TTTAATGACG GCTTGTTTCT TTTCTGTGGC
TGCGTGAAAG CCTTGAGGGG
721 CTCCGGGAGG GCCCTTTGTG CGGGGGGAGC GGCTCGGGGC
TGTCCGCGGG GGGACGGCTG 781 CCTTCGGGGG GGACGGGGCA GGGCGGGGTT CGGCTTCTGG
CGTGTGACCG GCGGCTCTAG 841 AGCCTCTGCT AACCATGTTC ATGCCTTCTT CTTTTTCCTA
CAGCTCCTGG GCAACGTGCT 901 GGTTATTGTG CTGTCTCATC ATTTTGGCAA AGAATTGGAT CC (SEQ ID Nº: 18).
[00126] Em algumas modalidades, o Construto compreende ou consiste em uma sequência que codifica um sinal WPRE mutado com a sequência de 1 ATCGATAATC AACCTCTGGA TTACAAAATT TGTGAAAGAT
TGACTGGTAT TCTTAACTAT 61 GTTGCTCCTT TTACGCTATG TGGATACGCT GCTTTAATGC
CTTTGTATCA TGCTATTGCT 121 TCCCGTATGG CTTTCATTTT CTCCTCCTTG TATAAATCCT
GGTTGCTGTC TCTTTATGAG 181 GAGTTGTGGC CCGTTGTCAG GCAACGTGGC GTGGTGTGCA
CTGTGTTTGC TGACGCAACC 241 CCCACTGGTT GGGGCATTGC CACCACCTGT CAGCTCCTTT
CCGGGACTTT CGCTTTCCCC 301 CTCCCTATTG CCACGGCGGA ACTCATCGCC GCCTGCCTTG
CCCGCTGCTG GACAGGGGCT 361 CGGCTGTTGG GCACTGACAA TTCCGTGGTG TTGTCGGGGA
AATCATCGTC CTTTCCTTGG 421 CTGCTCGCCT GTGTTGCCAC CTGGATTCTG CGCGGGACGT
CCTTCTGCTA CGTCCCTTCG 481 GCCCTCAATC CAGCGGACCT TCCTTCCCGC GGCCTGCTGC
CGGCTCTGCG GCCTCTTCCG
[00127] 541 CGTCTTCGCC TTCGCCCTCA GACGAGTCGG ATCTCCCTTT GGGCCGCCTC CCC (SEQ ID Nº: 19) ou uma sequência com pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%,
85%, 90%, 95%, 99%, ou qualquer porcentagem intermediária de identidade para a sequência de 1 ATCGATAATC AACCTCTGGA TTACAAAATT TGTGAAAGAT
TGACTGGTAT TCTTAACTAT 61 GTTGCTCCTT TTACGCTATG TGGATACGCT GCTTTAATGC
CTTTGTATCA TGCTATTGCT 121 TCCCGTATGG CTTTCATTTT CTCCTCCTTG TATAAATCCT
GGTTGCTGTC TCTTTATGAG 181 GAGTTGTGGC CCGTTGTCAG GCAACGTGGC GTGGTGTGCA
CTGTGTTTGC TGACGCAACC 241 CCCACTGGTT GGGGCATTGC CACCACCTGT CAGCTCCTTT
CCGGGACTTT CGCTTTCCCC 301 CTCCCTATTG CCACGGCGGA ACTCATCGCC GCCTGCCTTG
CCCGCTGCTG GACAGGGGCT 361 CGGCTGTTGG GCACTGACAA TTCCGTGGTG TTGTCGGGGA
AATCATCGTC CTTTCCTTGG 421 CTGCTCGCCT GTGTTGCCAC CTGGATTCTG CGCGGGACGT
CCTTCTGCTA CGTCCCTTCG 481 GCCCTCAATC CAGCGGACCT TCCTTCCCGC GGCCTGCTGC
CGGCTCTGCG GCCTCTTCCG 541 CGTCTTCGCC TTCGCCCTCA GACGAGTCGG ATCTCCCTTT GGGCCGCCTC CCC (SEQ ID Nº: 19)
[00128] Em algumas modalidades, o Construto compreende ou consiste em uma sequência que codifica um sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino com a sequência de 1 CGCTGATCAG CCTCGACTGT GCCTTCTAGT TGCCAGCCAT
CTGTTGTTTG CCCCTCCCCC 61 GTGCCTTCCT TGACCCTGGA AGGTGCCACT CCCACTGTCC
TTTCCTAATA AAATGAGGAA 121 ATTGCATCGC ATTGTCTGAG TAGGTGTCAT TCTATTCTGG
GGGGTGGGGT GGGGCAGGAC 181 AGCAAGGGGG AGGATTGGGA AGACAATAGC AGGCATGCTG
GGGATGCGGT GGGCTCTATG
[00129] 241 GCTTCTGAGG CGGAAAGAAC CAGCTGGGG (SEQ ID Nº: 20) ou uma sequência com pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, ou qualquer porcentagem intermediária de identidade para a sequência de 1 CGCTGATCAG CCTCGACTGT GCCTTCTAGT TGCCAGCCAT
CTGTTGTTTG CCCCTCCCCC 61 GTGCCTTCCT TGACCCTGGA AGGTGCCACT CCCACTGTCC
TTTCCTAATA AAATGAGGAA 121 ATTGCATCGC ATTGTCTGAG TAGGTGTCAT TCTATTCTGG
GGGGTGGGGT GGGGCAGGAC 181 AGCAAGGGGG AGGATTGGGA AGACAATAGC AGGCATGCTG
GGGATGCGGT GGGCTCTATG 241 GCTTCTGAGG CGGAAAGAAC CAGCTGGGG (SEQ ID Nº: 20).
[00130] Em algumas modalidades, o Construto compreende ou consiste em uma sequência que codifica um ITR 5' com a sequência de 1 CTGCGCGCTC GCTCGCTCAC TGAGGCCGCC CGGGCAAAGC
CCGGGCGTCG GGCGACCTTT 61 GGTCGCCCGG CCTCAGTGAG CGAGCGAGCG CGCAGAGAGG
GAGTGGCCAA CTCCATCACT
[00131] 121 AGGGGTTCCT (SEQ ID Nº: 21) ou uma sequência com pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, ou qualquer porcentagem intermediária de identidade para a sequência de 1 CTGCGCGCTC GCTCGCTCAC TGAGGCCGCC CGGGCAAAGC
CCGGGCGTCG GGCGACCTTT 61 GGTCGCCCGG CCTCAGTGAG CGAGCGAGCG CGCAGAGAGG
GAGTGGCCAA CTCCATCACT 121 AGGGGTTCCT (SEQ ID Nº: 21).
[00132] Em algumas modalidades, o Construto compreende ou consiste em uma sequência que codifica um ITR 3' com a sequência de 1 AGGAACCCCT AGTGATGGAG TTGGCCACTC CCTCTCTGCG
CGCTCGCTCG CTCACTGAGG 61 CCGGGCGACC AAAGGTCGCC CGACGCCCGG GCGGCCTCAG
TGAGCGAGCG AGCGCGCAGA
[00133] 121 G (SEQ ID Nº: 22) ou uma sequência com pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, ou qualquer porcentagem intermediária de identidade para a sequência de 1 AGGAACCCCT AGTGATGGAG TTGGCCACTC CCTCTCTGCG
CGCTCGCTCG CTCACTGAGG 61 CCGGGCGACC AAAGGTCGCC CGACGCCCGG GCGGCCTCAG
TGAGCGAGCG AGCGCGCAGA 121 G (SEQ ID Nº: 22).
[00134] Em algumas modalidades das composições da descrição, em que o Construto compreende uma proteína REP-1 humana ou uma porção da mesma, o Construto é referido como "AAV2-REP1 ou AAV2.REP1" e a Denominação Comum Internacional (DCI) é timrepigene emparvovec. Em algumas modalidades das composições da descrição, em que o Construto compreende uma proteína REP-1 humana ou uma porção da mesma, o produto AAV2-REP1 consiste em um vetor viral adenoassociado sorotipo 2 recombinante purificado (rAAV) que codifica o cDNA da proteína de escolta Rab humana tipo 1 (REP1). Em algumas modalidades, cada vírion AAV 20 nm contém uma sequência de inserção de DNA de fita simples de 4173 bp de comprimento (mais sítios de clonagem curtos flanqueando cada elemento) compreendendo: uma repetição terminal invertida 5' de 177 bp (ITR), um intensificador de Citomegalovírus/promotor híbrido de beta actina de galinha (CBA) de 934 bp, um cDNA de REP1 humano de 1962 bp, um elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite da marmota de 589 bp (WPRE), uma sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino de 242 bp (BGH-poliA) e um ITR 3' de 165 bp. Em algumas modalidades, um plasmídeo pAAV.REP-1-Kan usado para gerar o vetor AAV2-REP1 é mostrado na Figura 18. Em algumas modalidades, o cDNA de REP1 humano de 1962 bp compreende a sequência de ácido nucleico de: 1 atggcggata ctctcccttc ggagtttgat gtgatcgtaa tagggacggg tttgcctgaa 61 tccatcattg cagctgcatg ttcaagaagt ggccggagag ttctgcatgt tgattcaaga 121 agctactatg gaggaaactg ggccagtttt agcttttcag gactattgtc ctggctaaag 181 gaataccagg aaaacagtga cattgtaagt gacagtccag tgtggcaaga ccagatcctt 241 gaaaatgaag aagccattgc tcttagcagg aaggacaaaa ctattcaaca tgtggaagta 301 ttttgttatg ccagtcagga tttgcatgaa gatgtcgaag aagctggtgc actgcagaaa 361 aatcatgctc ttgtgacatc tgcaaactcc acagaagctg cagattctgc cttcctgcct 421 acggaggatg agtcattaag cactatgagc tgtgaaatgc tcacagaaca aactccaagc 481 agcgatccag agaatgcgct agaagtaaat ggtgctgaag tgacagggga aaaagaaaac 541 cattgtgatg ataaaacttg tgtgccatca acttcagcag aagacatgag tgaaaatgtg 601 cctatagcag aagataccac agagcaacca aagaaaaaca gaattactta ctcacaaatt 661 attaaagaag gcaggagatt taatattgat ttagtatcaa agctgctgta ttctcgagga 721 ttactaattg atcttctaat caaatctaat gttagtcgat atgcagagtt taaaaatatt 781 accaggattc ttgcatttcg agaaggacga gtggaacagg ttccgtgttc cagagcagat 841 gtctttaata gcaaacaact tactatggta gaaaagcgaa tgctaatgaa atttcttaca 901 ttttgtatgg aatatgagaa atatcctgat gaatataaag gatatgaaga gatcacattt 961 tatgaatatt taaagactca aaaattaacc cccaacctcc aatatattgt catgcattca 1021 attgcaatga catcagagac agccagcagc accatagatg gtctcaaagc taccaaaaac 1081 tttcttcact gtcttgggcg gtatggcaac actccatttt tgtttccttt atatggccaa 1141 ggagaactcc cccagtgttt ctgcaggatg tgtgctgtgt ttggtggaat ttattgtctt 1201 cgccattcag tacagtgcct tgtagtggac aaagaatcca gaaaatgtaa agcaattata 1261 gatcagtttg gtcagagaat aatctctgag catttcctcg tggaggacag ttactttcct 1321 gagaacatgt gctcacgtgt gcaatacagg cagatctcca gggcagtgct gattacagat 1381 agatctgtcc taaaaacaga ttcagatcaa cagatttcca ttttgacagt gccagcagag 1441 gaaccaggaa cttttgctgt tcgggtcatt gagttatgtt cttcaacgat gacatgcatg 1501 aaaggcacct atttggttca tttgacttgc acatcttcta aaacagcaag agaagattta 1561 gaatcagttg tgcagaaatt gtttgttcca tatactgaaa tggagataga aaatgaacaa 1621 gtagaaaagc caagaattct gtgggctctt tacttcaata tgagagattc gtcagacatc 1681 agcaggagct gttataatga tttaccatcc aacgtttatg tctgctctgg cccagattgt 1741 ggtttaggaa atgataatgc agtcaaacag gctgaaacac ttttccagga aatctgcccc 1801 aatgaagatt tctgtccccc tccaccaaat cctgaagaca ttatccttga tggagacagt
1861 ttacagccag aggcttcaga atccagtgcc ataccagagg ctaactcgga gactttcaag 1921 gaaagcacaa accttggaaa cctagaggag tcctctgaat aa (SEQ ID Nº: 23).
[00135] Em algumas modalidades das composições da descrição, o Construto compreende ainda uma sequência correspondente a uma repetição terminal invertida 5' (ITR) e uma sequência correspondente a uma repetição terminal invertida 3' (ITR). Em algumas modalidades, a sequência que codifica a ITR 5' e a sequência que codifica a ITR 3' são idênticas. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a ITR 5' e a sequência que codifica a ITR 3' não são idênticas. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a ITR 5' e a sequência que codifica a ITR 3' são isoladas ou derivadas de um vetor viral adenoassociado do sorotipo 2 (AAV2). Em algumas modalidades, a sequência que codifica a ITR 5' e a sequência que codifica a ITR 3' compreende uma sequência de tipo selvagem. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a ITR 5' e a sequência que codifica a ITR 3' compreende uma sequência truncada de AAV2 de tipo selvagem. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a ITR 5' e a sequência que codifica a ITR 3' compreende uma variação quando comparada a uma sequência de tipo selvagem do mesmo sorotipo de AAV. Em algumas modalidades, a variação compreende uma substituição, uma inserção, uma deleção, uma inversão ou uma transposição. Em algumas modalidades, a variação compreende um truncamento ou alongamento de uma sequência de tipo selvagem ou variante.
[00136] Em algumas modalidades das composições da descrição, um AAV compreende ainda uma sequência correspondente a uma repetição terminal invertida 5' (ITR) e uma sequência correspondente a uma repetição terminal invertida 3' (ITR). Em algumas modalidades, a sequência que codifica a ITR 5' e a sequência que codifica a ITR 3' são idênticas. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a ITR 5' e a sequência que codifica a ITR 3' não são idênticas. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a ITR 5' e a sequência que codifica a ITR 3' são isoladas ou derivadas de um vetor viral adenoassociado do sorotipo 2 (AAV2). Em algumas modalidades, a sequência que codifica a ITR 5' e a sequência que codifica a ITR 3' compreende uma sequência de tipo selvagem. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a ITR 5' e a sequência que codifica a ITR 3' compreende uma sequência truncada de AAV2 de tipo selvagem. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a ITR 5' e a sequência que codifica a ITR 3' compreende uma variação quando comparada a uma sequência de tipo selvagem do mesmo sorotipo de AAV. Em algumas modalidades, a variação compreende uma substituição, uma inserção, uma deleção, uma inversão ou uma transposição. Em algumas modalidades, a variação compreende um truncamento ou alongamento de uma sequência de tipo selvagem ou variante.
[00137] Em algumas modalidades das composições da descrição, um AAV compreende uma sequência viral essencial para a formação de um AAV de replicação deficiente. Em algumas modalidades, a sequência viral é isolada ou derivada de um AAV do mesmo sorotipo que um ou ambos dentre a sequência que codifica a ITR 5' ou a sequência que codifica a ITR 3'. Em algumas modalidades, a sequência viral, a sequência que codifica a ITR 5' ou a sequência que codifica a ITR 3' são isoladas ou derivadas de um AAV2. Em algumas modalidades, a sequência viral, a sequência que codifica a ITR 5' e a sequência que codifica a ITR 3' são isoladas ou derivadas de um AAV2.
[00138] Em algumas modalidades das composições da descrição, um AAV compreende uma sequência viral essencial para a formação de um AAV de replicação deficiente, uma sequência que codifica a ITR 5' e uma sequência que codifica a ITR 3', mas não compreende qualquer outra sequência isolada ou derivada de um AAV. Em algumas modalidades, o AAV é um AAV recombinante (rAAV), compreendendo uma sequência viral essencial para a formação de um AAV de replicação deficiente, uma sequência que codifica a ITR 5', uma sequência que codifica a ITR 3' e uma sequência que codifica um Construto da descrição.
[00139] Em algumas modalidades, um DNA de plasmídeo usado para criar o rAAV em uma célula hospedeira compreende um marcador de seleção. Os marcadores de seleção exemplares incluem, mas não estão limitados a, genes de resistência a antibióticos. Genes de resistência a antibióticos exemplares incluem, mas não estão limitados a, amplicilina e canamicina. Os marcadores de seleção exemplares incluem, mas não estão limitados a, genes de resistência a drogas ou moléculas pequenas. Marcadores de seleção exemplares incluem, mas não estão limitados a, dapD e um operador reprimível incluindo, mas não se limitando a, um construto lacO/P controlando ou suprimindo a expressão dapD, em que a seleção de plasmídeo é realizada pela administração ou contato de uma célula transformada com um plasmídeo capaz de titulação do repressor de operador (ORT). Os marcadores de seleção exemplares incluem, mas não estão limitados a, um gene de seleção de ccd. Em algumas modalidades, o gene de seleção de ccd compreende uma sequência que codifica um gene de seleção de ccdA que resgata uma linhagem de células hospedeiras projetada para expressar um gene ccdB tóxico. Marcadores de seleção exemplares incluem, mas não estão limitados a, sacB, em que um RNA é administrado ou colocado em contato com uma célula hospedeira para suprimir a expressão do gene sacB em meio de sacarose. Os marcadores de seleção exemplares incluem, mas não estão limitados a, um mecanismo de morte segregacional, como o locus parAB+ composto por Hok (um gene de morte do hospedeiro) e Sok (supressão de morte).
Estrutura de Construto AAV
[00140] O produto de Construto AAV2 consiste em um vetor viral adenoassociado do sorotipo 2 recombinante purificado (rAAV) que codifica o cDNA que codifica um construto terapêutico. Um diagrama exemplar é fornecido na Figura 3.
[00141] Em algumas modalidades, o Construto AAV2 compreende um ou mais de uma sequência que codifica uma ITR 5', uma sequência que codifica uma ITR 3' e uma sequência que codifica uma proteína do capsídeo que é isolada e/ou derivada de um vetor viral adenoassociado de sorotipo 2 (AAV2). Em algumas modalidades, o Construto AAV2 compreende uma sequência que codifica uma ITR 5', uma sequência que codifica uma ITR 3' e uma sequência que codifica uma proteína do capsídeo que é isolada e/ou derivada de um vetor viral adenoassociado de sorotipo 2 (AAV2). Em algumas modalidades, o Construto AAV2 compreende uma sequência truncada que codifica uma ITR 5' e uma sequência que codifica uma ITR 3' que é isolada e/ou derivada de um vetor viral adenoassociado de sorotipo 2 (AAV2). Em algumas modalidades, o Construto AAV2 compreende ITRs de AAV2 de tipo selvagem (uma ITR 5' de tipo selvagem e uma ITR 3' de tipo selvagem).
[00142] Em algumas modalidades, cada vírion AAV 20 nm contém uma sequência de inserção de DNA de fita simples (mais sítios de clonagem curtos flanqueando cada elemento) compreendendo: (a) uma repetição terminal invertida 5' (ITR), (b) um promotor adequado para expressão em células de mamíferos, (c) um cDNA que codifica um construto terapêutico, e (d) uma ITR 3'.
[00143] Em algumas modalidades, cada vírion AAV 20 nm contém uma sequência de inserção de DNA de fita simples (mais sítios de clonagem curtos flanqueando cada elemento) compreendendo: (a) uma repetição terminal invertida 5' (ITR) de 145 bp, (b) um promotor adequado para expressão em células de mamíferos, (c) um cDNA que codifica um construto terapêutico, e (d) uma ITR 3' de 145 bp. Em algumas modalidades, cada vírion AAV 20 nm contém uma sequência de inserção de DNA de fita simples (mais sítios de clonagem curtos flanqueando cada elemento) compreendendo: (a) uma repetição terminal invertida 5' (ITR), (b) um promotor adequado para expressão em células de mamíferos, (c) um cDNA que codifica um construto terapêutico, e (d) uma ITR 3', em que a ITR 5' ou a ITR 3' compreende ou consiste em 134, 135, 136 ou 137 bp.
[00144] Em algumas modalidades, cada vírion AAV 20 nm contém uma sequência de inserção de DNA de fita simples (mais sítios de clonagem curtos flanqueando cada elemento) compreendendo: (a) uma repetição terminal invertida 5' (ITR) de 145 bp, (b) um promotor adequado para expressão em células de mamíferos, (c) um cDNA que codifica um construto terapêutico, (e) uma sequência de poliadenilação (poliA) e (f) uma ITR 3' de 145 bp. Em algumas modalidades, cada vírion AAV 20 nm contém uma sequência de inserção de DNA de fita simples (mais sítios de clonagem curtos flanqueando cada elemento) compreendendo: (a) uma repetição terminal invertida 5' (ITR), (b) um promotor adequado para expressão em células de mamíferos, (c) um cDNA que codifica um construto terapêutico, (e) uma sequência de poliadenilação (poliA) e (f) uma ITR 3', em que a ITR 5' ou a ITR 3' compreende ou consiste em 134, 135, 136 ou 137 bp.
[00145] Em algumas modalidades, cada vírion AAV 20 nm contém uma sequência de inserção de DNA de fita simples (mais sítios de clonagem curtos flanqueando cada elemento) compreendendo: (a) uma repetição terminal invertida 5' (ITR) de 145 bp, (b) um promotor adequado para expressão em células de mamíferos, (c) um cDNA que codifica um construto terapêutico, (d) um elemento regulador pós- transcricional (PRE), (e) uma sequência de poliadenilação (poliA) e (f) uma ITR 3' de 145 bp. Em algumas modalidades, cada vírion AAV 20 nm contém uma sequência de inserção de DNA de fita simples (mais sítios de clonagem curtos flanqueando cada elemento) compreendendo: (a) uma repetição terminal invertida 5' (ITR), (b) um promotor adequado para expressão em células de mamíferos, (c) um cDNA que codifica um construto terapêutico, (d) um elemento regulador pós-transcricional (PRE), (e) uma sequência de poliadenilação (poliA) e (f) uma ITR 3', em que a ITR 5' ou a ITR 3' compreende ou consiste em 134, 135, 136 ou 137 bp.
[00146] Em algumas modalidades, cada vírion AAV 20 nm contém uma sequência de inserção de DNA de fita simples (mais sítios de clonagem curtos flanqueando cada elemento) compreendendo: (a) uma repetição terminal invertida 5' de 145 bp (ITR), (b) um promotor, opcionalmente, um intensificador de Citomegalovírus/promotor híbrido de beta actina de galinha (CBA) de 934 bp, (c) um cDNA que codifica um construto terapêutico, (d) um elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite da marmota de 589 bp (WPRE), (e) uma sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino de 242 bp (BGH- poliA) e (f) uma ITR 3' de 145 bp. Em algumas modalidades, cada vírion AAV 20 nm contém uma sequência de inserção de DNA de fita simples (mais sítios de clonagem curtos flanqueando cada elemento) compreendendo: (a) uma repetição terminal invertida 5' (ITR), (b) um promotor, opcionalmente, um intensificador de Citomegalovírus/promotor híbrido de beta actina de galinha (CBA) de 934 bp, (c) um cDNA que codifica um construto terapêutico, (d) um elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite da marmota de 589 bp (WPRE), (e) uma sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino de 242 bp (BGH-poliA) e (f) uma ITR 3', em que a ITR 5' ou a ITR 3' compreende ou consiste em 134, 135, 136 ou 137 bp.
[00147] Os AAVs ou Construtos da descrição podem compreender uma sequência que codifica um promotor capaz de expressão em uma célula de mamífero. Preferencialmente, os AAVs ou Construtos da descrição podem compreender uma sequência que codifica um promotor capaz de expressão em uma célula humana. Promotores exemplares da descrição incluem, mas não estão limitados a, promotores constitutivamente ativos, promotores específicos do tipo de célula, promotores virais, promotores de mamíferos e promotores híbridos ou recombinantes. Em algumas modalidades das composições da descrição, o Construto terapêutico de um Construto AAV2 está sob o controle de um promotor da beta-actina de galinha (CBA). Em algumas modalidades das composições da descrição, o promotor CBA compreende uma sequência que codifica um intensificador de citomegalovírus (CMV) e uma sequência que codifica um promotor de beta-actina de galinha (variadamente denominado CBA ou CAG).
[00148] Os AAVs ou Construtos da descrição podem compreender uma sequência que codifica um elemento regulador pós-transcricional (PRE). PREs exemplares da descrição incluem, mas não estão limitados a, um elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite da marmota (WPRE). Em algumas modalidades das composições da descrição, o AAV compreende um WPRE de 589 bp, com origem na região 3' do transcrito S viral, diretamente a jusante do cDNA que codifica um Construto terapêutico da descrição. Este WPRE é importante para a expressão de alto nível de transcritos de mRNA nativos, agindo para intensificar o processamento de mRNA e o transporte de genes sem íntron. Em algumas modalidades das composições da descrição, o WPRE foi modificado para evitar a expressão do antígeno viral X por ablação do sítio de início da tradução. Isto foi conseguido eliminando o promotor/intensificador We2 e mutando o promotor We1.
[00149] Os AAVs ou Construtos da descrição podem compreender uma sequência de poliadenosina (poliA). Sequências de poliA exemplares da descrição incluem, mas não estão limitadas a, uma sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (BGH- poliA). A sequência BGH-poliA é usada para aumentar a expressão gênica e mostrou produzir níveis de expressão três vezes maiores do que outras sequências poliA, como SV40 e poliA de colágeno humano. Esta expressão aumentada é amplamente independente do tipo de promotor ou transgene a montante. O aumento dos níveis de expressão usando as sequências BGH-poliA e WPRE permite que uma dose geral mais baixa de AAV ou vetor de plasmídeo seja injetada, o que é menos provável de gerar uma resposta imune do hospedeiro.
[00150] Em uma modalidade ilustrativa, o vetor pBC-hREP1 compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID Nº:24.
[00151] Em algumas modalidades das composições da descrição, a composição compreende uma Substância da Droga. Conforme usado neste documento, uma Substância da Droga compreende um rAAV da descrição compreendendo um Construto da descrição.
[00152] Em algumas modalidades das composições da descrição, a composição compreende um Produto de Droga. Conforme usado neste documento, um Produto de Droga compreende uma substância da droga, formulada para administração a um indivíduo para o tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio.
[00153] Os componentes de um Produto de Droga exemplar da descrição, suas funções e especificações estão listados na Tabela 1.
Tabela 1: Composição do Produto da Droga de Construto AAV2 Nome do Quantidade/Con- Função Grau Ingrediente centração 1,0 x 10^12 Construto AAV2 Ativo GMP DRP/mL Tris, pH 8,0 Tampão EP, BP, USP, JPC 20 mM Intensifica a MgCl2 EP, BP, USP, JPC, FCC 1 mM estabilidade do vetor Intensifica a estabilidade do vetor NaCl EP, BP, USP, JP 200 mM e evita a agregação do vetor Poloxâmero 188 EP, USP 0,001% Água para Injeções Diluente EP, USP QS para 125 mL Forma de Dosagem
[00154] As composições da descrição podem ser formuladas para administração sistêmica ou local.
[00155] As composições da descrição podem ser formuladas como uma Suspensão para Injeção ou Infusão.
[00156] As composições da descrição podem ser formuladas para injeção ou infusão por qualquer via, incluindo, mas não se limitando a, uma injeção ou infusão intravítrea, uma injeção ou infusão sub-retiniana ou uma injeção ou infusão supracoroidal.
[00157] As composições da descrição podem ser formuladas a uma concentração de entre 1,0 x 10^10 DRP/mL e 1,0 x 10^14 DRP/mL, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, as composições da descrição podem ser formuladas a uma concentração de cerca de 1,0 x 10^12 DRP/mL. Em algumas modalidades, as composições da descrição podem ser formuladas a uma concentração de 1,0 x 10^12 DRP/mL. Em algumas modalidades, as composições da descrição podem ser formuladas a uma concentração de entre 0,1 x 10^12 DRP/mL e 10,0 x 10^12 DRP/mL, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, as composições da descrição podem ser formuladas a uma concentração de entre 0,1 x 10^12 DRP/mL e 5,0 x 10^12 DRP/mL, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, as composições da descrição podem ser formuladas a uma concentração de entre 0,1 x 10^12 DRP/mL e 2,0 x 10^12 DRP/mL, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, as composições da descrição podem ser formuladas a uma concentração de entre 0,5 x 10^12 DRP/mL e 1,5 x 10^12 DRP/mL, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, as composições da descrição podem ser formuladas a uma concentração de entre 0,7 x 10^12 DRP/mL e 1,3 x 10^12 DRP/mL, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, as composições da descrição podem ser formuladas a uma concentração de entre 0,8 x 10^12 DRP/mL e 1,2 x 10^12 DRP/mL, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, as composições da descrição podem ser formuladas a uma concentração de entre 0,9 x 10^12 DRP/mL e 1,1 x 10^12 DRP/mL, incluindo os pontos finais.
[00158] As composições da descrição podem ser diluídas antes da administração usando um diluente da descrição. Em algumas modalidades, o diluente é idêntico a um tampão de formulação usado para a preparação do Produto da Droga de Construto AAV2. Em algumas modalidades, o diluente não é idêntico a um tampão de formulação usado para a preparação do Produto da Droga de Construto AAV2.
[00159] As composições da descrição, incluindo o Produto da Droga de Construto AAV2 descrito na Tabela 1, podem ser formuladas como uma suspensão para injeção contendo 1,0 x 10^12 DRP/mL. Se exigido pelo protocolo, o Produto da Droga de Construto AAV2 pode ser diluído na clínica (ou seja, por um profissional médico) antes da administração usando um diluente da descrição. Em algumas modalidades, este diluente é o mesmo tampão de formulação usado para a preparação do Produto da Droga de Construto AAV2. Formulações Farmacêuticas
[00160] As composições da descrição podem compreender uma Substância da Droga. Em algumas modalidades, a Substância da Droga compreende ou consiste em um Construto AAV2. Em algumas modalidades, a Substância da Droga compreende ou consiste em um Construto AAV2 e um tampão de formulação. Em algumas modalidades, o tampão de formulação compreende Tris 20 mM, MgCl2 1 mM e NaCl 200 mM a pH 8. Em algumas modalidades, o tampão de formulação compreende Tris 20 mM, MgCl2 1 mM e NaCl 200 mM a pH 8 com poloxâmero 188 a 0,001%. Excipientes
[00161] As composições da descrição podem compreender um Produto da Droga. Em algumas modalidades, o Produto da Droga compreende ou consiste em uma Substância da Droga e um tampão de formulação. Em algumas modalidades, o Produto da Droga compreende ou consiste em uma Substância da Droga diluída em um tampão de formulação. Em algumas modalidades, o Produto da Droga compreende ou consiste em uma Substância da Droga de Construto AAV2 diluída para uma concentração de genoma de vetor de Construto AAV2 de Produto da Droga final (vg) em um tampão de formulação. Formulações Oculares
[00162] As composições da descrição podem ser formuladas para compreender, consistir essencialmente em ou consistir em uma Substância da Droga de Construto AAV2 em uma concentração ideal para injeção ou infusão ocular.
[00163] As composições da descrição podem compreender um ou mais tampões que aumentam ou intensificam a estabilidade de um AAV da descrição. Em algumas modalidades, as composições da descrição podem compreender um ou mais tampões que garantem ou intensificam a estabilidade de um AAV2 da descrição. Alternativamente, ou além disso, as composições da descrição podem compreender um ou mais tampões que previnem, diminuem ou minimizam a agregação de partículas de AAV. Em algumas modalidades, as composições da descrição podem compreender um ou mais tampões que evitam, diminuem ou minimizam a agregação de partículas de AAV2.
[00164] As composições da descrição podem compreender um ou mais componentes que induzem ou mantêm um pH neutro ou ligeiramente básico. Em algumas modalidades, as composições da descrição compreendem um ou mais componentes que induzem ou mantêm um pH neutro ou ligeiramente básico entre 7 e 9, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, as composições da descrição compreendem um ou mais componentes que induzem ou mantêm um pH de cerca de 8. Em algumas modalidades, as composições da descrição compreendem um ou mais componentes que induzem ou mantêm um pH entre 7,5 e 8,5. Em algumas modalidades, as composições da descrição compreendem um ou mais componentes que induzem ou mantêm um pH entre 7,7 e 8,3. Em algumas modalidades, as composições da descrição compreendem um ou mais componentes que induzem ou mantêm um pH entre 7,9 e 8,1. Em algumas modalidades, as composições da descrição compreendem um ou mais componentes que induzem ou mantêm um pH de 8.
[00165] Após o contato de uma composição da descrição e uma célula, o Construto AAV2 expressa um gene ou uma porção do mesmo, resultando na produção de um produto codificado pelo gene ou uma porção do mesmo. Em algumas modalidades, a célula é uma célula alvo. Em algumas modalidades, a célula alvo é uma célula retinal. Em algumas modalidades, a célula retinal é um neurônio. Em algumas modalidades, o neurônio é um fotorreceptor. Em algumas modalidades, a célula está in vivo, in vitro, ex vivo ou in situ. Em algumas modalidades, incluindo aquelas em que a célula está in vivo, o contato ocorre após a administração da composição a um indivíduo. Em algumas modalidades, o Construto AAV2 expressa um gene ou uma porção do mesmo, resultando na produção de um produto codificado pelo gene ou uma porção do mesmo em um nível terapeuticamente eficaz de expressão do produto gênico. Em algumas modalidades, o produto gênico é uma proteína. Formulações de Lote
[00166] As composições da descrição podem ser fabricadas em uma escala de 1 a 1000 frascos por lote, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades das composições da descrição, uma composição, Substância da Droga ou Produto da Droga pode ser fabricada em uma escala de 50 a 500 frascos por lote, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades das composições da descrição, uma composição, Substância da Droga ou Produto da Droga pode ser fabricada em uma escala de 100 a 415 frascos por lote, incluindo os pontos finais.
[00167] Lotes exemplares da descrição podem compreender entre 0,01 mL e 5 mL, incluindo os pontos finais, de uma composição, Substância da Droga ou Produto da Droga da descrição. Em algumas modalidades, um lote da descrição pode compreender entre 0,01 mL e 1 mL, incluindo os pontos finais, de uma composição, Substância da Droga ou Produto da Droga da descrição. Em algumas modalidades, um lote da descrição pode compreender entre 0,1 mL e 1 mL, incluindo os pontos finais, de uma composição, Substância da Droga ou Produto da Droga da descrição. Em algumas modalidades, um lote da descrição pode compreender entre 0,1 mL e 5 mL, incluindo os pontos finais, de uma composição, Substância da Droga ou Produto da Droga da descrição. Em algumas modalidades, um lote da descrição pode compreender entre 0,25 mL e,35 mL, incluindo os pontos finais, de uma composição, Substância da Droga ou Produto da Droga da descrição. Em algumas modalidades, um lote da descrição pode compreender cerca de 0,3 mL de uma composição, Substância da Droga ou Produto da Droga da descrição. Em algumas modalidades, um lote da descrição pode compreender 0,3 mL de uma composição, Substância da Droga ou Produto da Droga da descrição. Tabela 2: Fórmula de Lote Exemplar para um frasco de Produto da Droga de Construto AAV2 Componente Quantidade Referência ao Padrão Construto AAV2 1,25 x 10^14 DRP Interna, GMP Tris, pH 8,0 20 mM EP, BP, USP, JPC MgCl2 (anidro) 1 mM EP, BP, USP, JPC, FCC NaCl 200 mM EP, BP, USP, JP Poloxâmero 188 0,001% EP, USP Água Para Injeções QS para 125 mL EP, USP
[00168] Em algumas modalidades dos métodos da descrição para a preparação do Produto da Droga, uma Substância da Droga é descongelada a +35 ± 2°C e diluída conforme necessário em tampão de formulação estéril para a concentração alvo (1,0 x 10^12 DRP/mL).
[00169] Em algumas modalidades das composições da descrição, o título de DRP final alvo do Produto da Droga do Construto AAV2 é 1 x 10^12 DRP/mL, o título mínimo e máximo aceitável é 0,8 x 10^12 DRP/mL e 1,5 x 10^12 DRP/mL, respectivamente. O Produto da Droga de Construto AAV2 é esterilizado por filtração e colocado em frascos de vidro 2R Tipo I de 3 mL com rolhas de borracha de bromobutil em volumes de 0,3 mL por frasco. Os frascos são então congelados e armazenados a ≤ -60°C. Para rotulagem e armazenamento antes da liberação do QP e distribuição no sítio, o Produto da Droga é transferido para o distribuidor clínico qualificado. O Produto da Droga é armazenado a ≤ -60°C em um freezer com temperatura monitorada até a liberação e distribuição do QP. Armazenamento de Composições
[00170] Em algumas modalidades das composições da descrição, incluindo aquelas em que a composição compreende um Produto da Droga e a composição é fornecida em um frasco estéril, a composição pode ser armazenada abaixo de zero (°C). Em algumas modalidades, as composições podem ser descongeladas e congeladas sem perda de eficácia do Produto da Droga ou integridade da embalagem estéril. Em algumas modalidades, as composições podem passar por várias rodadas de descongelamento e congelamento sem perda de eficácia do Produto da Droga ou integridade da embalagem estéril.
[00171] Em algumas modalidades das composições da descrição, incluindo aquelas em que a composição compreende um Produto da Droga e a composição é fornecida em um frasco estéril, a composição pode ser armazenada em temperatura ambiente. Materiais Orgânicos
[00172] Os materiais iniciais usados na preparação de tampões e meios da descrição são certificados como livres de material de origem animal. Materiais Compendiais: Consulte a Tabela 3.
Tabela 3:
Componente Fornecedor Exemplar/Número de Grau Catálogo
Ácido Clorídrico, Concentrado Merck/1370072500 NF
Cloreto de Magnésio, Merck/1058321000 USP Hexahidratado
Cloreto de Potássio Merck/1049355000 USP
Cloreto de Sódio Merck/1162245000 USP
Hidróxido de Sódio, Grânulos Merck/1064821000 NF
Tris Base Merck/1083861000 USP
Etanol, absoluto Merck/1009862500 USP
Água para Injeção EP, USP
Ácido cítrico, monohidratado Merck/137003 EP, USP
H3PO4 Merck/100563 EP, USP
Na2HPO4.2H2O Merck/106580 EP, USP
Poloxâmero 188 Merck/137065 EP, USP
NF = Formulário Nacional; USP = Farmacopeia US; EP = Farmacopeia Europeia
Materiais Não Compendiais: consulte a Tabela 4. Tabela 4. Componente Fornecedor Teste/Especificação de Exemplar/Número Fabricantes de Catálogo FBS IRR (30-45kGy) Hyclone/SH30406.03 Certificado e CEP
IR FBS IRR (30-45kGy) Hyclone/SH30406.02 Certificado e CEP
IR FBS, irradiado Life Certificado e CEP technologies/10101 TrypLE TM Select Gibco/12563-029 pH 7,0 - 7,4, Identidade: HPLC PBS sem Ca e Mg Gibco/10010-031 pH 7,3 - 7,5 HBSS sem Ca e Mg sem Gibco/14170-138 pH 6,7 - 7,8, Estéril
RP Benzonase Merck/1060950001 Pureza ≥99,0%, Endotoxina <0,25EU/1000U, Identidade: Aprovado DMEM glutamax BTL Gibco/61965-026 pH 6,8 - 7,2, Estéril DMEM glutamax PCH Gibco/10566-016 Estéril PEI pro PolyPlus/PPLU115- Estéril, Endotoxina < 0,5 EU/mL 375 DNA de plasmídeo personalizado Certificado de Análise pAAV.Construct-Kan DNA de plasmídeo personalizado Certificado de Análise pNLRep-Cap2-Kan DNA de plasmídeo pHELP- personalizado Certificado de Análise Kan Banco de Células Principal Cobra Biologics HEK293 Filtro de clarificação, 0,65 Sartorius/5551305P1 Esterilizado em Novasep antes do µm --SS uso Filtro de clarificação, 0,2 Sartorius/5445307H9 Estéril – autoclavado, Endotoxinas µm --FF—A < 0,18 EU/mL, Atende aos plásticos classe VI da USP
Filtro UFDF, 100 kDa Spectrum labs/N02- Sanitizado antes do uso, teste E100-05-N ou filtro LAL realizado após o equilíbrio de área de filtração efetiva inferior equivalente (EFA) Tubos de ultracentrífuga Beckman/342414 Está em conformidade com o Código de Regulamentos Federais da FDA, Título 21 §177.1520 (c) 3.1a e 3.2a e os critérios da Farmacopeia dos EUA para plásticos Classe VI Filtro de filtração estéril, Sartorius/5445307HS Endotoxinas < 0,18 EU/mL, 0,2 µm --FFou filtro EFA Atende aos plásticos classe VI da inferior equivalente USP Meio de troca iônica Biorad/156-0101 Sanitizado com NaOH 0,5M, teste LAL realizado após o equilíbrio Coluna Merck Sanitizado com NaOH 0,5M, Millipore/96100250 Endotoxina no enxágue final com WFI < 0,25 EU/mL). Coluna Coluna Merck Sanitizado com H3PO4 0,17M, Vantage-L VL22x250 NaCl 1M e condicionado antes do uso. pH e condutividade testados após equilíbrio Filtro UFDF/Diálise, 100 Spectrum labs/S02- Sanitizado antes do uso, teste kDa E100-05-N ou filtro LAL realizado após o equilíbrio de EFA inferior equivalente Resina UnoQ Bio-Rad Sanitizado com NaOH 0,5M, Endotoxina no enxágue final com WFI < 0,25 EU/mL) Resina AVB Sepharose GE Healthcare Sanitizado com H3PO4 0,17M, NaCl 1M e condicionado antes do uso. pH e condutividade testados após equilíbrio CEP = Certificado de Adequação
Matérias-primas de origem animal
[00173] Os soros fetais bovinos são de origem animal. A fonte, o fabricante e o uso dessas matérias-primas estão resumidos na Tabela
5. Tabela 5.
Componente Fonte Fabricante Uso CEP Documentação Fonte Soro Fetal Bovino HyClone Nova Cultura de células R1-CEP Certificado e Bovino, Zelândia HEK293, 2000-211- CEP, fornecidos irradiado fabricação de lote Rev 01 pela Nova clínico Zelândia Soro Fetal Bovino Life Produção de R1-CEP Certificado e Bovino, Technologies HEK293 MCB 2001-024- CEP, fornecidos irradiado Rev 02 pela Austrália Filtros e Matrizes Cromatográficas
[00174] Os filtros usados para a filtração da Substância da Droga e do Produto da Droga são os filtros Sartopore de 0,45 µm e 0,2 µm. Os filtros não são esterilizados quando adquiridos e são esterilizados internamente no fabricante contratado por autoclavagem. Eles são testados quanto a integridade por teste de ponto de bolha em 3,2 Bars.
[00175] Todos os materiais cromatográficos são liberados em um Certificado de Análise antes do uso. As colunas são adquiridas pré- embaladas e sanitizadas antes do uso. Métodos de Fabricação de Produto da Droga de Construto AAV2 "Processo Original" (Processo 1)
[00176] Uma visão geral de um processo de fabricação exemplar para a Substância da Droga de Construto AAV2 é ilustrada na Figura 8. Os diagramas de fluxo correspondentes a este processo são fornecidos nas Figuras 9 e 10. O processo de fabricação descrito nas Figuras 8, 9 e 10 pode ser referido neste documento como "Processo 1".
[00177] Mudanças exemplares para o Processo 1 são fornecidas na Tabela 6 abaixo. Algumas modalidades do Processo 2 podem incluir as mudanças descritas na Tabela 6. Tabela 6. Etapa/Materiais Processo 1 Processo 2 Observações do Processo Grau de Salas limpas Laboratórios Fabricação GMP não-GMP Banco de células de Para avaliar as Processo Células HEK293 desenvolvimento mudanças na fonte das Original 1 ATCC CRL- células 1573 Para avaliar as Plasmídeos Plasmídeos de alterações na estrutura Plasmídeos de ampicilina canamicina do plasmídeo (mudar do gene AmpR para KanR) Grau de Matérias-primas Grau GMP pesquisa A colheita de até 96 h Tempo de após a transdução não Realimentação afeta adversamente os (após transdução 22-24 h 72-73 h rendimentos de células de plasmídeo) + meio em comparação para Colheita com a colheita anterior Otimização do Processo 1 (Processo a Montante)
[00178] O material inicial para o Processo 1 foi iniciado a partir de um único frasco de células HEK293 de um banco de células de desenvolvimento (DCB). Este DCB foi produzido usando um único frasco de células ATCC HEK293. CS10 foi usado para cultivar as células HEK293, mas a escala desta cultura foi aumentada de 12 CS10 para 24 CS10 para gerar material adicional para o desenvolvimento do processo subsequente que estava sendo realizado simultaneamente. O procedimento prosseguiu com 2 x 12 CS10 até o ponto de transdução, momento em que, os 24 CS10 foram tratados dentro da mesma operação.
[00179] Recipientes de Cultura de Células e Matérias-primas: A Tabela 7 destaca as principais diferenças entre as matérias-primas usadas para dois processos de fabricação diferentes e fornece observações sobre qualquer significância da mudança. Tabela 7: Desenvolvimento de Novo Processo Processo Original Matéria-prima (incorporando mudanças (correspondendo ao Observações no Processo 1 e no Processo 1) Processo 2) O soro cosmic calf não é adequado para a fabricação da fase clínica tardia. A alteração no soro pode FBS Soro Cosmic Calf afetar o crescimento celular/perfil de Soro Hyclone – SH30406.03IR Hyclone – SH30087-04IR impurezas, mas precisa ser alterada para a fabricação de GMP. FBS usado rotineiramente no processo aprimorado. Reagente de HyQtase Lote clínico usou HyQtase (processo Dissociação Lonza – Trypzean Hyclone – ref: SV30030.01 original). Celular SG-200 Suplemento de L-glutamina 200mM Dipeptídeo estável de L- Fornecedor preferido para processo Meio Life technology – ref: 25030 Alanil L-Glutamina (200mM) aprimorado. Hyclone – ref:SH30590 Fornecedor preferido para processo Cloroquina Sigma Aldrich – ref:C6628 Espectro químico – C1448 aprimorado.. Fornecedor preferido para processo Dextrose Roquette –ref: 361409 Sigma Aldrich – ref: D9434 aprimorado. pAAV.Construct pAAV.Construct Todos os plasmídeos fabricados são pHELP (Kan) pHELP (Kan) sequenciados na sua totalidade para garantir a homologia. Embora o Plasmídeos número do lote possa mudar, as pNLRep-Cap2 (Kan) pNLRep-Cap2 (Kan) sequências permanecem idênticas entre o processo original e o processo aprimorado.
[00180] Cultura celular: A fonte de células usadas para o processo aprimorado era de um único frasco de células DCB HEK293. Como este era um banco diferente usado para produzir o lote do processo original, embora fosse a mesma fonte original de células ATCC, a escala de cultura foi aumentada (12 CS10 a 24 CS10) e uma fonte diferente de soro foi usada para apoiar o crescimento celular durante a amplificação celular, esta etapa foi adaptada em conformidade. O crescimento celular pré-cultura do processo melhorado incluiu 8 passagens em comparação com 10 passagens para o lote produzido pelo processo original. Além disso, as densidades celulares após a passagem eram variáveis de acordo com o processo original, mas fixas de acordo com o processo melhorado. A Figura 8 ilustra uma comparação entre os dois sítios para a fase de cultura celular do processo.
[00181] O crescimento celular foi avaliado entre os processos original e melhorado usando medições de densidade celular. Os resultados indicaram que as células produzidas pelos processos melhorados cresceram mais rápido. Isso pode ser potencialmente atribuído a uma fonte diferente de soro e/ou ao regime de passagem de células com base em densidades de semeadura fixas dos processos melhorados. Para ambos os processos, o tempo de duplicação da população mostrou ser de 20-30 horas, uma vez que o crescimento celular se estabilizou (Figura 10).
[00182] Em algumas modalidades do Processo 2, incluindo aquelas que utilizam as matérias-primas listadas na Tabela 7 (com exceção do soro), a cultura celular e/ou meio de crescimento celular compreende ou consiste em um meio sem soro.
[00183] Transdução: a transdução como parte do processo melhorado foi realizada usando o mesmo método do processo original.
[00184] Colheita Celular: De acordo com o processo melhorado, a colheita foi dividida em duas colheitas de 12 CS10 para ser representativa do processo original (1x12 CS10). Após a colheita, as células foram desreguladas usando um dispositivo PANDA e o título do vetor determinado. O dispositivo PANDA usado durante o processo aprimorado era de um fabricante diferente em comparação com o desregulador de células usado durante o processo original (ver Tabela 8 abaixo), mas tem a capacidade de realizar a lise de células na mesma pressão que o desregulador de células do processo original (80 bar).
[00185] Tabela 8: Comparação do Equipamento de Desregulação Celular Usado nos processos originais versus aprimorados.
Processo Equipamento de Desregulação Celular Usado Microfluidizador Microfluidics International HC- Processo Original 8000 com módulo de canal Z de cerâmica de 200 µm Processo Homogeneizador PANDA 2K GEA/NiroSoavi Melhorado
[00186] Título do Vetor Pós-processamento a Montante: O título do material do vetor do processo a montante de 1 x 12 CS10 (6,4 x 10 15 DRP/lote) (de acordo com o processo melhorado) foi comparável ao gerado na mesma escala do processo a montante (1,44 x 1015 DRP/lote) (de acordo com o processo original). Otimização do Processo 1 (Processo a Jusante)
[00187] O processo a jusante que foi transferido do processo original para o melhorado é ilustrado na Figura 11.
[00188] Matérias-primas e Experimentais: Sempre que possível, os mesmos equipamentos e matérias-primas e fornecedores foram selecionados para uso no processo "melhorado" posterior, como aqueles usados no processo original.
[00189] Desempenho a Jusante: As observações nos estágios individuais do processo estão resumidas abaixo.
Tabela 9: Desregulação/Lise Celular
Processo Processo Observações Original Melhorado
Aparência do Vermelho; Vermelho; Produto de Entrada partículas partículas Nenhuma Duração (min) 60 65 Mudança Significativa Aparência do Vermelho; Vermelho; Produto de Saída partículas partículas
Tabela 10: Etapa de Congelamento/Descongelamento Processo Processo Observações Original Melhorado Aparência do Vermelho e Vermelho e Produto de Entrada Partículas Partículas Incubação 37°C 37°C Duração 19 19 Nenhuma Congelamento -20°C -20°C Mudança Duração do Significativa 4h 4,5 h Descongelamento Aparência do Vermelho e Vermelho e Produto de Saída Partículas Partículas
Tabela 11: Esclarecimento Processo Processo Observações Original Melhorado Aparência do Produto Vermelho e Vermelho e Nenhuma Mudança de Entrada Partículas Partículas Significativa Taxa de Fluxo Nenhuma Mudança 750 750 (mL/min) Significativa Duração (min) 20 2 Pressão de Entrada O critério de aceitação foi 0,9 1,7 Máxima (psi) pressão abaixo de 10 psi.
Aparência do Produto Nenhuma Mudança Vermelho Vermelho de Saída Significativa
Tabela 12: Concentração e Diafiltração
Processo Processo Observações Original Melhorado
Aparência do Vermelho Vermelho Produto de Entrada
% (v/v) Volume de 10 10 Adição de SSS
Nenhuma Taxa de Fluxo de 2,76 2,76 Mudança Recirculação (L/min) Significativa
Duração 1 h 30 min 1 h 25 min
Taxa de Diafiltração 4 4
Um intervalo de 3 a 6 psi para TMP também foi usado no TMP (psi) 6-7 5,4 – 6,0 Processo 2 e pode ser usado em um processo de fabricação da descrição Nenhuma Aparência do Rosa Rosa Turvo Mudança Produto de Saída Significativa
Nenhuma Volume (mL) 230 220 Mudança Significativa
Tabela 13: Gradiente de Iodixanol Processo Processo Original Observações Melhorado Aparência do Nenhuma Produto de Rosa Rosa Turvo Mudança Entrada Significativa Nenhuma Aparência do Límpido, Incolor Límpido, Incolor Mudança Produto de Saída Significativa * 15% Esquema de 15% Gradiente de 25% 25% Iodixanol 40% 40% 57% % 57% *Durante o processo Original, bandas de impurezas puderam ser observadas a olho nu nas frações 15%, 25% e 40% (bandas múltiplas). No entanto, esse perfil não foi observado durante o processo melhorado e apenas uma banda foi vista na fração de 40%. As bandas extras podem estar associadas ao maior teor de impurezas.
[00190] Etapas de Diálise, Diafiltração e Filtração com Heparina: O produto era límpido e incolor desde a etapa de gradiente de Iodixanol até o produto final. Nenhuma observação inesperada foi evidente durante essas etapas. "Processo Melhorado" (Processo 2)
[00191] Um lote de produto é preparado a partir de uma única campanha de produção consistindo em 24 recipientes Corning de 10 pilhas contendo células HEK293 transfectadas com DNA de plasmídeo que produzem o produto biológico de Construto AAV2. A massa celular e o meio de cultura celular são colhidos e agrupados a partir dos 24 recipientes Corning de 10 pilhas e seguido por um único processo de purificação. Espera-se que um lote de produto preparado a partir de uma única campanha produza ≥ 5 x 1013 partículas virais (vp; também referidas neste documento como partículas de vetor) de Substância da Droga.
[00192] Uma visão geral de um processo de fabricação exemplar para a Substância da Droga de Construto AAV2 é ilustrada na Figura 1. O diagrama de fluxo correspondente a este processo é fornecido na Figura 2. O processo de fabricação descrito neste exemplo pode ser referido neste documento como "Processo 2".
[00193] Em algumas modalidades do Processo 2, o meio de cultura celular colhido e agrupado a partir dos 24 recipientes Corning de 10 pilhas compreende um meio sem soro. Em algumas modalidades do Processo 2, o meio de cultura celular colhido e agrupado a partir dos 24 recipientes Corning de 10 pilhas consiste em um meio sem soro. Expansão Celular e Semeadura de Pilha de Células Corning
[00194] Consulte a Figura 2 para um diagrama esquemático correspondente à descrição detalhada de um processo de fabricação exemplar fornecido abaixo.
[00195] Etapa 1: Descongelamento e semeadura de células usadas para produzir a Substância da Droga de Construto AAV2. As temperaturas, durações, velocidade de centrifugação e volumes abaixo podem ser ajustados para resultados ideais dependendo do tipo de célula usado. Para a modalidade exemplar descrita abaixo, as condições foram otimizadas para o uso de células HEK293.
[00196] Descongelamento de Células HEK293 e Semeadura em frasco 1 T75: Um frasco de HEK293 MCB é descongelado a 37±2°C. As células são transferidas para um tubo de 15 mL contendo 9 mL de meio de crescimento frio (meio DMEM com 5% de FBS). O frasco é enxaguado com 1 mL de meio de crescimento. A suspensão é centrifugada a 4°C por 5 minutos a 300g, o sobrenadante é descartado e as células são suspensas em 10 mL de meio de crescimento pré- aquecido. A densidade celular é determinada e a suspensão celular é transferida para um frasco T75cm2 contendo 10,5 mL de meio de crescimento para obter um volume final de 20 mL. O frasco T75cm2 é transferido para uma incubadora a 37±1°C sob atmosfera umidificada de 4-6% de CO2. 24±4 horas após o descongelamento, o meio de crescimento é substituído por 20mL de meio de crescimento pré- aquecido.
[00197] Em algumas modalidades das etapas de descongelamento de células HEK293 e semeadura em frasco 1 T75, as células são transferidas para um tubo de 15 mL contendo 9 mL de meio de crescimento frio. Em algumas modalidades, o meio de crescimento compreende ou consiste em glicina, cloridrato de L-Arginina, dicloridrato de L-Cistina, L-Glutamina, cloridrato de L-Histidina-H2O, L-isoleucina, L- Leucina, cloridrato de L-Lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-serina, L- treonina, L-triptofano, sal dissódico de L-tirosina desidratado, L-valina, cloreto de colina, pantotenato de D-cálcio, ácido fólico, niacinamida, cloridrato de piridoxina, riboflavina, cloridrato de tiamina, i-Inositol, Cloreto de Cálcio (CaCl2) (anidro), Nitrato Férrico (Fe(NO3)3"9H2O), Sulfato de Magnésio (MgSO4) (anidro), Cloreto de Potássio (KCl), Bicarbonato de Sódio (NaHCO3), Cloreto de sódio (NaCl), Fosfato de Sódio monobásico (NaH2PO4-H2O) e D-Glicose (Dextrose). Em algumas modalidades, o meio de crescimento compreende ou consiste em um meio sem soro. Em algumas modalidades, o meio de crescimento compreende ou consiste em um meio clarificado.
[00198] Etapa 2: Expansão das células usadas para produzir a
Substância da Droga de Construto AAV2. As temperaturas, durações e volumes abaixo podem ser ajustados para resultados ideais dependendo do tipo de célula usado. Para a modalidade exemplar descrita abaixo, as condições foram otimizadas para o uso de células HEK293.
[00199] Frasco de Expansão 1 T75 para 1 x T175CB ou Frascos 3 T75: o meio é descartado e as células são lavadas com PBS pré- aquecido. As células são soltas com o reagente de dissociação de células TrypLE. Os frascos T ou pilhas de células são incubados 5 a 10 minutos em uma incubadora ajustada a 37±1°C e as células são totalmente desalojadas batendo levemente no recipiente. O meio de crescimento é adicionado para inibir o TrypLE. Os volumes de meio de crescimento, PBS e TrypLE usados para diferentes suportes são apresentados na Tabela 14. Todas as suspensões de células são então agrupadas. Tabela 14: Volume de Meio e Soluções Volume Inibição de Suportes Superfície PBS TrypLE (Meio de Cultura Crescimento) de Trabalho T75 75 cm2 5 mL 2 mL 6 mL 20 mL T175CB 175 cm2 10 mL 4 mL 12 mL 50 mL CS2 CB 1260 cm2 100 mL 40 mL 120 mL 400 mL CS10 CB 6320 cm2 400 mL 140 mL 420 mL 2L
[00200] A contagem de células e a viabilidade celular são determinadas e as células são semeadas, incubadas e passadas de acordo com a Tabela 15.
Tabela 15: Parâmetros de Processo para Passagens Densidade/Proporção de Tempo de Pa Passagem Semeadura Incubação P1 1T75  xT175CB 20000 células/cm2 5 dias Ou 1T75  3T75 P2 xT1T75  4T175CB 20000 células/cm2 4 dias Ou 3T75  4T175CB P3 4T175CB  8T175CB 20000 células/cm2 4 dias P4 6T175CB  3CS2CB Proporção 1/4 3 dias P5 2CS2CB  3CS10CB Proporção 1/8 4 dias P6 2CS10CB  8CS10CB Proporção 1/4 3 dias P7 8CS10CB  20000 células/cm2 3 dias 24CS10CB
[00201] Controles em Processo (IPCs): Contagem de Células e Viabilidade Celular
[00202] Etapa 3: Expansão 1 T175CB para 4 T175CB ou Frascos 3 T75 para 4 T175CB: Consulte a Etapa 2.
[00203] IPCs: Contagem de Células e Viabilidade Celular.
[00204] Etapa 4: Expansão 4 T175CB para 8 T175CB: Consulte a Etapa 2.
[00205] IPCs: Contagem de Células e Viabilidade Celular.
[00206] Etapa 5: Expansão 6 T175CB para 3 CS2CB: Consulte a Etapa 2.
[00207] IPCs: Contagem de Células e Viabilidade Celular.
[00208] Etapa 6: Expansão 2 CS2CB para 3 CS10CB: Consulte a Etapa 2.
[00209] IPCs: Contagem de Células e Viabilidade Celular.
[00210] Etapa 7: Expansão 2 CS10CB para 8 CS10CB: Consulte a Etapa 2.
[00211] IPCs: Contagem de Células e Viabilidade Celular.
[00212] Etapa 8: Expansão 8 CS10CB para 24 CS10CB. Consulte a etapa 2.
[00213] IPCs: Contagem de Células e Viabilidade Celular Transfecção de DNA de Plasmídeo
[00214] Etapa 9: Transfecção das células usadas para produzir a Substância da Droga de Construto AAV2. As temperaturas, durações, velocidade de centrifugação e volumes abaixo podem ser ajustados para resultados ideais dependendo do tipo de célula usado. Para a modalidade exemplar descrita abaixo, as condições foram otimizadas para o uso de células HEK293.
[00215] As células HEK293 são transfectadas com três plasmídeos usando Polietilenimina (PEI).
[00216] Os três plasmídeos (pAAV.Construct-Kan, pHELP-Kan e pNLRep-Cap2-Kan) são adicionados de forma sequencial com uma proporção específica. Tabela 16: Condições de Transfecção Condições de Transdução Volume de Trabalho 2125 mL/CS10 CB DNA + Meio de Crescimento (Solução 1) 40 mL/CS10 CB Quantidade Total de DNA 1,02 mg/CS10 CB pAAV.Construct-Kan 1 Proporção de DNA pHELP-Kan 2 pNLRep-Cap2-Kan 1,5 PEI + Meio de Crescimento (Solução 2) 40 mL/CS10 CB PEI: Proporção de DNA 2:1
[00217] Os plasmídeos e o PEI são preparados com meio de crescimento.
[00218] A quantidade necessária de DNA de plasmídeo é apresentada na Tabela 17.
Tabela 17: Quantidades de DNA de Plasmídeo Quantidade (mg) Quantidade Total Plasmídeo Proporção para (mg) para 24CS10 1CB10 CB CB pAAV.Construct- 1 0,427 mg 10,248 mg Kan pHELP-Kan 2 0,854 mg 20,496 mg pNLRep-Cap-Kan 1,5 0,640 mg 15,360 mg
[00219] A quantidade necessária de mistura PEI é transferida na mistura de DNA para formar o complexo PEI-DNA, agitar por 10 segundos e incubar em temperatura ambiente. O complexo PEI-DNA é transferido para 8,2 L de meio de crescimento. A mistura do meio de crescimento e do complexo PEI-DNA é homogeneizada, o frasco do complexo PEI-DNA é enxaguado e a mistura do meio de crescimento e do complexo PEI-DNA é homogeneizada novamente. O meio é drenado do CS10CB e 2 L de mistura de meio de crescimento/complexo PEI- DNA são transferidos para o CS10CB. O CS10CB transfectado é transferido para uma incubadora definida a 37±1°C sob atmosfera humidificada de 4-6% de CO2.
[00220] A mistura de transfecção é deixada nas células por 24±1 horas e então o meio é substituído por DMEM Glutamax.
[00221] IPCs: Contagem de Células e Viabilidade Celular.
[00222] Etapa 10: Colheita das células usadas para produzir a Substância da Droga de Construto AAV2. As temperaturas, durações, velocidade de centrifugação e volumes abaixo podem ser ajustados para resultados ideais dependendo do tipo de célula usado. Para a modalidade exemplar descrita abaixo, as condições foram otimizadas para o uso de células HEK293.
[00223] A colheita é feita 60±13 horas após a transfecção.
[00224] O produto é colhido pelas seguintes etapas:
[00225] A primeira metade do meio é transferida para a bolsa de colheita.
[00226] O CS10CB é agitado e o meio restante e as células são colhidos.
[00227] 200 mL de HBSS-EDTA são transferidos para o CS10CB e incubados em temperatura ambiente por 10 minutos.
[00228] No final do tempo de incubação, o tampão é drenado para a bolsa de colheita.
[00229] Este processo de colheita é repetido com todos os recipientes.
[00230] Após a colheita, MgCl2 1M é adicionado para uma concentração final de 5 mM e benzonase é adicionada para uma concentração final de 90 U/mL.
[00231] IPC: Vírus Adventícios, Biocarga, Micoplasma, Título físico.
[00232] Etapa 11: Lise por Microfluidização.
[00233] O desregulador PANDA é equilibrado com um mínimo de 3 L de tampão Tris 20 mM, MgCl2 1 mM, NaCl 50 mM a pH 8. A bolsa contendo a colheita tratada com Benzonase é conectada ao conjunto de lise. O produto é carregado no sistema PANDA a uma pressão de 80±10 bar e coletado em uma nova bolsa. Após carregar o produto, o sistema é enxaguado com 2 x 200 mL de tampão Tris 20 mM, MgCl2 1 mM, NaCl 50 mM a pH 8. Ambos os enxágues são agrupados com o produto lisado.
[00234] IPC: Título Físico
[00235] Etapa 12: Incubação de Benzonase:
[00236] As células microfluidizadas são incubadas durante a noite em temperatura ambiente por um período máximo de 18 horas para a atividade da endonuclease de benzonase.
[00237] Etapa 13: Congelar/Descongelar:
[00238] A etapa final de lise é um congelamento a -15 a -25°C seguido por um descongelamento durante a noite em temperatura ambiente para promover a agregação de detritos celulares para facilitar a etapa de clarificação. Purificação
[00239] Etapa 14: Clarificação do Lisado Microfluidizado.
[00240] O processo de filtração utiliza um pré-filtro (Sartopure GF 0,65 µm 0,4 m2) seguido por um filtro para redução da carga biológica (Sartopore 2, 0,2 µm, 0,2 m2) e tampão Tris 20 mM, MgCl2 1 mM, NaCl 50 mM a pH 8 para lavagem.
[00241] IPCs: Picogreen, Título Físico
[00242] Etapa 15: Concentração de TFF em Grande Escala e Diafiltração.
[00243] Este processo atinge a redução de volume e uma purificação inicial usando o princípio de Filtração de Fluxo Tangencial (TFF). A redução do volume pode chegar a 100 vezes. Solução de sal e surfactante (SSS, 4,14 M NaCl + surfactante não iônico) é adicionada ao lisado clarificado com 1/10 do peso do lisado. A purificação é conseguida por diafiltração (100 kDa) do concentrado com Tris 20 mM a pH 8,0, MgCl2 1 mM, NaCl 500 mM, 0,1% de surfactante não iônico para "lavar" impurezas de menor peso molecular da amostra. Esta parte é necessária para atingir altos níveis de concentração sem precipitação de proteínas/partículas de AAV.
[00244] IPCs: Título Físico, Partículas Totais (ELISA), Proporção de Partículas Cheias/Vazias.
[00245] Etapa 16: Purificação de Iodixanol.
[00246] Este processo é projetado para purificar rAAV usando um gradiente de iodixanol descontínuo de quatro camadas (15%, 25%, 40%, 57%). Esta etapa de purificação ortogonal enriquece muito a preparação para DNA contendo partículas de rAAV, enquanto remove a maior parte das partículas de rAAV que são desprovidas de DNA
(partículas vazias) com base na densidade flutuante diferencial dessas partículas no meio de gradiente de iodixanol após a ultracentrifugação. A densidade do DNA contendo rAAV resulta na migração de rAAV para a camada de iodixanol de 40%, enquanto a maioria das proteínas celulares contaminantes migra para a interface de 25%/40%. A agregação de rAAV com proteínas e DNA pode alterar a densidade flutuante das partículas, de modo que a inclusão de NaCl 1M na camada de iodixanol de 15% minimize essa agregação.
[00247] A separação é obtida por um gradiente descontínuo de iodixanol (solução de Optiprep a 57%) que é submetido a altas forças g em uma ultracentrífuga. A fração de 40% é colhida até atingir a banda de impurezas (~3mL).
[00248] As frações coletadas são agrupadas e armazenadas a +2/+8°C até as etapas de purificação subsequentes.
[00249] Etapa 17: Diluição:
[00250] A fração obtida no final da etapa de purificação é diluída 20 vezes com tampão Tris 10 mM, pH 9,0 para purificação do lote GMP G214/REP1/FC001 por cromatografia de troca aniônica. Para purificação por afinidade de AVB, a fração agrupada no final da etapa de Purificação (gradiente de densidade) é diluída 6 vezes com tampão Tris 20 mM, MgCl2 1 mM e NaCl 200 mM a pH 8.
[00251] IPCs: Título Físico, Partículas Totais (ELISA), Proporção de Partículas Cheias/Vazias, Picogreen
[00252] Etapa 18: Cromatografia de Troca Aniônica.
[00253] A cromatografia de troca aniônica é realizada em temperatura ambiente com um meio Unosphere Q (UnoQ) (Biorad) empacotado a uma taxa de fluxo de 14 mL/min com Tris 10 mM, NaCl 200 mM a pH 9 em uma coluna Vantage VL 11 x 250 (volume empacotado ~9,5 mL). A coluna é condicionada primeiro com tampão Tris de 10 mM, 1 M de NaCl om pH 9 e segundo com tampão Tris de 10 mM, pH 9 para obter um pH igual a pH 9,0 ± 0,2 e uma condutividade igual a Tris de 10 mM, pH 9,0 de condutividade ± 10%.
[00254] O produto diluído é filtrado através de um filtro Sartoscale de 0,2µm 17 cm2.
[00255] É carregado na coluna e a coluna é enxaguada com tampão de equilíbrio. Após uma segunda lavagem com tampão Tris de 10 mM, NaCl de 45 mM e pH 9, o produto é eluído com um mínimo de 30 volumes de coluna de tampão Tris de 10 mM, NaCl de 650 mM e pH 9.
[00256] O produto eluído é armazenado a +2/+8°C até a próxima etapa.
[00257] IPCs: Picogreen, Título Físico
[00258] Etapa 18 com Cromatografia por Afinidade de AVB Sepharose.
[00259] A cromatografia por afinidade é realizada à temperatura ambiente com AVB Sepharose HP (GE Healthcare) empacotado em uma coluna Vantage-L VL22x250 (8±1cm de altura de leito) empacotada e lavada em tampão Tris 20 mM, MgCl 2 1 mM, NaCl 200 mM pH 8 e então é higienizada com H 3PO4 0,17M, NaCl 1 M durante 30 minutos. Após a higienização, a coluna é equilibrada em tampão Tris 20 mM, MgCl2 1 mM, NaCl 200 mM pH 8 antes de carregar o produto (frações agrupadas da etapa 16) diluído em Tris 20 mM, MgCl 2 1 mM, NaCl 200 mM pH 8. O produto diluído é filtrado através de um filtro Sartoscale 0,2 µm 17 cm2 antes do carregamento da coluna. Uma vez carregada, a coluna é lavada com aproximadamente 35 volumes de coluna de tampão Tris 20 mM, MgCl 2 1 mM, NaCl 200 mM pH 8 e, em seguida, eluída com aproximadamente com 20 volumes de coluna de Na2HPO4 10,8 mM, ácido cítrico 44,6 mM, NaCl 400 mM pH 2,6 amortecedor. Imediatamente após a eluição, o eluato é neutralizado com aproximadamente 4 volumes de coluna de tampão Tris 1 M pH8.
[00260] O produto eluído é armazenado a +2/+8°C até a próxima etapa.
[00261] IPCs: Picogreen, Título Físico
[00262] Etapa 19: Diálise e Formulação Final.
[00263] Este processo utiliza diálise para formular o produto AAV no tampão de Formulação Final desejado (Tris 20 mM, pH 8, MgCl 2 1mM, NaCl 200 mM, opcionalmente com poloxâmero a 0,001%).
[00264] A filtração de fluxo tangencial do produto de eluição é conduzida usando um cartucho de fibra oca com um peso molecular de corte de 100 kDa (Spectrum). O cartucho e o sistema são equilibrados com tampão Tris 20 mM, MgCl2 mM, NaCl 200 mM pH 8 para se obter um pH de 8,0 ± 0,2 no lado do permeado.
[00265] O produto é concentrado até o volume mínimo antes da diafiltração em modo contínuo contra um mínimo de 6 volumes de Tampão de Formulação. O retentado é coletado. O sistema é enxaguado com Tampão de Formulação. Este enxágue é coletado em um recipiente diferente.
[00266] IPCs: Título físico.
[00267] Etapa 20: Filtração Submicrônica da Substância Farmacológica a Granel Purificada.
[00268] Se necessário para armazenamento a longo prazo (> 60 dias), o produto é filtrado em um submicron usando um filtro de 0,2 µm. Uma vez que a Substância Farmacológica é completamente filtrada, o filtro é enxaguado com o tampão de formulação final.
[00269] Após a amostragem de QC, a Substância Farmacológica a granel purificada é armazenada a <-60°C. Método de Fabricação de um Produto Farmacêutico a partir de Uma Substância Farmacológica
[00270] A descrição fornece vários processos/métodos de fabricação exemplificativos de um Produto Farmacêutico a partir de uma
Substância Farmacológica (como material de partida). Dois desses métodos exemplificativos são o Processo 1 (o processo original) e o Processo 2 (o processo aprimorado). Conforme descrito neste documento, o Processo 2 inclui mudanças e/ou aprimoramentos feitos no Processo 1.
[00271] Tanto no Processo 1 quanto no Processo 2, a substância farmacológica é descongelada, diluída, esterilizada por filtração e colocada nos recipientes de empacotamento primários. No entanto, o processo aprimorado (Processo 2) introduziu as seguintes alterações no procedimento original (os controles em processo permanecem inalterados):
[00272] Mudança na temperatura de descongelamento da temperatura ambiente para +35 ± 2°C
[00273] Mudança no empacotamento primário de criotubos de polipropileno de 0,5 mL para frascos de vidro tipo I de 3 mL e rolhas de borracha de bromobutil Mudança no tamanho de preenchimento por frasco único de 0,1 mL/frasco para 0,3 mL/frasco
[00274] As composições da descrição podem ser fornecidas como líquidos. Em algumas modalidades das composições da descrição, incluindo aquelas em que a composição compreende um Produto Farmacêutico, o Produto Farmacêutico é fornecido em frascos de vidro estéreis. Em algumas modalidades, os frascos de vidro estéreis são frascos de vidro transparente estéreis. Em algumas modalidades, os frascos de vidro estéreis são tampados com rolhas. Em algumas modalidades, as rolhas são de plástico. Em algumas modalidades, os frascos de vidro estéreis são tampados e ainda fechados com selos. Otimização do Processo de Fabricação
[00275] Após a revisão do processo de fabricação original (Processo 1), as oportunidades para aprimorar a qualidade do futuro produto clínico e comercial e/ou para tornar um processo mais robusto foram identificadas e implementadas como Processo 2. As atividades de desenvolvimento de processo realizadas se enquadram em duas categorias: (1) Mudanças de Processo; (2) Otimização de Processo.
Um resumo da estratégia e justificativa de desenvolvimento do processo é fornecido na Tabela 18 e cada categoria é discutida em mais detalhes abaixo.
Tabela 18: Resumo das Mudanças no Processo 1 Mudança Tópico Fundamentos Pretendida Mudanças de Processo Rastreabilidade aprimorada de Fonte de células a Banco de células células para aumentar a partir da qual o MCB Principal HEK293 garantia de qualidade e é gerado segurança do produto
Substituição do gene Remoção do risco teórico de de resistência à transferência do gene de Plasmídeos Vetoriais ampicilina por gene resistência à de resistência à ampicilina/ampicilina para os canamicina pacientes
Substituição de Redução dos riscos de Cromatografia de matriz derivada de biossegurança associados a afinidade com heparina animal por matriz não materiais derivados de animais derivada de animal Mudança a partir de frascos de Recipiente do Produto polipropileno com Integridade final aprimorada da Final e Fecho do tampa de rosca para substância farmacológica Recipiente frascos de vidro com tampa Aumento em Escala das Aumento da escala Aumentar o rendimento do Etapas do Processo a da fase de cultura produto final Montante celular
Mudança Tópico Fundamentos Pretendida Robustez aprimorada, Mudança a partir de Transfecção de células remoção da necessidade de fosfato de cálcio para HEK293 cloroquina (reagente de
PEI escape endossomal) Otimização de Processo Otimização da densidade de Cultura e expansão de semeadura e células HEK293 desempenho da cultura celular. Estudos de Transfecção e Coleta desenvolvimento Tripla de Plasmídeo para otimizar a Controle de processo e transdução reprodutibilidade aprimorados Otimização das para garantir a consistência e condições robustez do processo Microfluidização para operacionais com Ruptura Celular equipamentos (processo aprimorado) Aumentar a robustez Ultracentrifugação de da etapa do processo Gradiente de Densidade de purificação Garantir a consistência e Otimização das robustez do processo e Ultrafiltração/Diafiltração etapas de troca de adequação dos materiais de tampão contato do produto MCB = Banco de Células Principal
[00276] Em resumo, para gerar o Processo 2, foram feitas mudanças na fonte de células a partir das quais o MCB é gerado, o gene de seleção de antibióticos dos três plasmídeos, a escala da etapa de processamento a montante, o reagente de transdução, a etapa de cromatografia por afinidade e o embalagem e fechamento do produto final.
Banco de células Principal HEK293
[00277] Processo 1: O MCB usado para produzir o primeiro lote clínico foi gerado a partir da produção de AAV2 otimizada de células. Há uma rastreabilidade limitada da história dessa linhagem celular, tanto em termos de como as células foram otimizadas quanto na exposição a materiais de origem animal.
[00278] Mudança para o Processo 1: Um frasco original de células HEK293 depositadas na ATCC (o banco de células precursoras a partir do qual o Processo 1 foi gerado) foi usado para iniciar a fabricação de um novo MCB GMP. Este MCB, agora caracterizado e testado, é usado para apoiar a fabricação de vetores de AAV clínicos e pode ser usado para a fabricação comercial. Rastreabilidade total do número de passagem da célula, materiais usados, métodos seguidos e estudos de caracterização do banco de células realizados fornecem maior garantia de qualidade do produto, rastreabilidade e segurança. Um banco de células de trabalho foi subsequentemente gerado a partir de um único frasco de GMP MCB sob condições de Bom Processo de Fabricação (GMP) para formar um GMP WCB. Este WCB, agora caracterizado e testado, pode ser usado para fabricação comercial. Rastreabilidade total do número de passagem da célula, materiais usados, métodos seguidos e estudos de caracterização do banco de células realizados fornecem maior garantia de qualidade do produto, rastreabilidade e segurança.
[00279] As células HEK293 fornecidas pela ATCC foram avaliadas quanto à comparabilidade seguindo um protocolo definido em que a produção do vetor, avaliada pelo título genômico, foi comparada diretamente com a das células Stratagene originais. O título do vetor foi avaliado em triplicado e simultaneamente a partir de células em limites de passagem comparáveis, incluindo passagem baixa e alta. As células também foram avaliadas quanto à cinética de crescimento e viabilidade.
Além disso, as células foram tratadas com um vetor de expressão de proteína fluorescente verde (GFP) para avaliar a eficácia da transdução.
[00280] As células originadas da ATCC também foram avaliadas como parte de uma execução de manipulação não GMP em escala real em combinação com as alterações de plasmídeo (ver abaixo) seguindo o mesmo protocolo de fabricação de lote do lote clínico original. Este lote foi testado em relação a todo o painel de testes de controle em processo, coleta em massa, testes de substâncias farmacológicas e produtos farmacêuticos (com exceção dos testes de biocarga, endotoxina, esterilidade e agentes adventícios) e comparados com os mesmos resultados de teste, que foram obtidos previamente do lote clínico (processo original).
[00281] Uma vez que a adequação das células HEK293 da ATCC foi estabelecida, um GMP MCB foi preparado e totalmente testado para agentes adventícios, identidade, pureza e segurança. O GMP MCB foi liberado no controle de qualidade para subsequente fabricação de GMP. Plasmídeos Vetoriais
[00282] Processo 1: Os três construtos de plasmídeo usados para produzir o vetor de Construto de AAV2 contendo um gene que codifica a resistência à ampicilina, usado para seleção durante a produção de plasmídeo. Embora a ampicilina, um antibiótico β-lactâmico, não seja usada no processo de fabricação do vetor de Construto de AAV2, a remoção do AmpR é preferencial para evitar o potencial de qualquer transporte de ampicilina residual do processo de produção de plasmídeo para o Construto de AAV2 e também remove o potencial para o gene que codifica a resistência à ampicilina estar presente no produto final empacotado.
[00283] Mudança para o Processo 1: Cada plasmídeo foi modificado para substituir o gene de resistência à ampicilina por um gene que codifica a resistência à canamicina. O restante da estrutura do plasmídeo não foi alterado. Durante a fabricação do plasmídeo, a ampicilina usada para a seleção do plasmídeo pode ser carreada para o processo de produção do Construto de AAV2 e representar um risco potencial para os pacientes com sensibilidade aos antibióticos β- lactâmicos. Além disso, a presença de um gene de resistência à ampicilina do material do plasmídeo pode acabar empacotado no produto final do vetor e, teoricamente, conferir ou transferir resistência antibiótica aos receptores. Embora a probabilidade de qualquer um dos riscos seja considerada baixa, entende-se que, sempre que possível, o uso de β-lactâmicos deve ser evitado. Portanto, o perfil de segurança do produto foi aprimorado com a substituição do AmpR por um KanR.
[00284] Os novos plasmídeos foram totalmente sequenciados e esse sequenciamento forneceu a confirmação de que apenas o gene de resistência havia mudado.
[00285] Um estudo de comparabilidade para avaliar a produção do Construto de AAV2 usando os novos plasmídeos foi conduzido seguindo um protocolo definido. Ambos os plasmídeos AmpR (antigo) e KanR (novo) foram usados para transfectar células HEK293 simultaneamente e a produção do vetor foi comparada avaliando o título genômico. O teste em triplicado foi realizado e a comparação do título do vetor relatada.
[00286] Após a demonstração do título aceitável, os plasmídeos modificados também foram avaliados como parte de uma execução de produção não-GMP em escala real em combinação com as mudanças celulares (detalhadas acima) seguindo o mesmo protocolo de fabricação de lote que o lote clínico original. Este lote foi testado em relação a todo o painel de testes de colheita a granel, testes de substâncias farmacológicas e produtos farmacêuticos (com exceção dos testes de biocarga, endotoxina, esterilidade e agentes adventícios) e comparados com os mesmos resultados de teste obtidos previamente do lote clínico (processo original). Uma vez que os dados desta corrida técnica foram gerados e considerados aceitáveis, a fabricação de plasmídeo adequado para uso na fabricação de produtos de GMP foi implementada. Cromatografia Heparina
[00287] Processo 1: Uma coluna de cromatografia de afinidade foi usada para purificar seletivamente o Construto de AAV2. A matriz de origem animal usada na coluna (por exemplo, heparina) pode ser fornecida como material de GMP adequado para uso na fabricação de produtos terapêuticos humanos. Embora a fonte, a fabricação e o fornecimento da matriz de origem animal sejam credenciados de uma perspectiva de uso humano e de GMP, um risco de segurança viral permanece com o uso de qualquer matéria-prima de origem animal.
[00288] Mudança para o Processo 1: Matrizes de cromatografia alternativas não derivadas de animais foram exploradas como uma substituição para a coluna de afinidade atual preenchida com uma matriz derivada de animais (por exemplo, heparina). Uma resina de cromatografia de troca iônica foi inicialmente usada para substituir a matriz derivada de animal para o primeiro lote de GMP de acordo com o processo aprimorado e, subsequentemente, uma resina de cromatografia por afinidade não derivada de animal foi introduzida. Essa mudança foi implementada para reduzir os riscos de biossegurança associados às matérias-primas de origem animal.
[00289] Diferentes matrizes de cromatografia foram avaliadas e a adequação foi baseada no perfil de pureza/impureza, título e potência do produto final. Recipiente do Produto Final e Fecho do Recipiente
[00290] Processo Original: O Produto Farmacêutico foi colocado em frascos de polipropileno estéreis de 0,5 mL com tampa de rosca e gaxeta em volumes de 0,1 mL por frasco.
[00291] Mudança para o Processo 1: Preenchimento de 0. 3 mL do
Produto Farmacêutico em frascos de injeção de vidro de borosilicato Tipo 1, com uma rolha de bromobutil e fecho de vedação do frasco cravado (inviolável). Esta mudança foi implementada para alcançar maior integridade do Produto Farmacêutico final, contenção aprimorada durante o uso, aceitabilidade farmacêutica aprimorada dos materiais de contato do produto do recipiente primário, facilidade de inspeção visual e segurança (segurança fornecida por selo inviolável).
[00292] A avaliação da compatibilidade do Produto Farmacêutico em frascos de vidro foi realizada pela recuperação e estabilidade do produto. Aumento em Escala das Etapas do Processo a Montante
[00293] Processo 1: Expansão e aumento de escala de um único frasco de HEK293 MCB, por meio de passagem em série, para 12 pilhas de células de dez camadas.
[00294] Mudar para o Processo 1: Expansão e aumento de escala de um único frasco de HEK293 MCB, por meio de passagem em série, para 24 pilhas de células de dez camadas. Esta mudança foi implementada para alcançar maior escala de processo a montante para permitir material adicional para testes e controles em processo, bem como aumento do volume de Substância Farmacológica para teste e acabamento de preenchimento. Além disso, essa mudança foi implementada para aumentar a disponibilidade do Produto Farmacêutico.
[00295] A análise de viabilidade celular, taxa de crescimento e rendimento celular foram avaliados para determinar o desempenho ideal e consistente. Otimização de Processo
[00296] Uma série de etapas do processo de fabricação original permaneceram inalteradas em termos de definição física e química; no entanto, eles foram avaliados posteriormente a fim de aprimorar a compreensão e caracterização do processo e para garantir o desempenho ideal do processo em termos de consistência e robustez do processo. Cultura e expansão de células HEK293
[00297] Processo 1: Expansão e aumento de escala de um único frasco de HEK293 MCB, por meio de passagem em série, para 12 fábricas de células de dez camadas.
[00298] Otimização de Processo: Simultaneamente à mudança na escala de cultura de células de 12 CS10 para 24 CS10, foram realizados estudos para otimizar a densidade de semeadura e avaliar a cinética de crescimento para o desempenho ideal da cultura de células. Mudanças operacionais (não de processo) foram otimizadas para aprimorar o controle e a reprodutibilidade das etapas do processo para garantir a consistência e robustez do processo. Especificamente, este aspecto do processo foi otimizado para aumentar de 12 CS10 para 24 CS10 para aprimorar o rendimento.
[00299] A análise de viabilidade celular, taxa de crescimento e rendimento celular foram realizados para determinar o desempenho ideal e consistente. Transfecção e Coleta Tripla de Plasmídeo
[00300] Processo 1: A transfecção de três plasmídeos de células HEK293 foi realizada por precipitação de DNA com fosfato de cálcio após o pré-tratamento das células com cloroquina.
[00301] Otimização de Processo: Otimize a transfecção, incluindo condições de semeadura celular, comparação de fosfato de cálcio e polietilenimina. Otimizar a razão da concentração de plasmídeo. Determinar o dia pós-transfecção ideal para troca de meio e coleta. Mudanças operacionais (não de processo) foram otimizadas para aprimorar o controle e a reprodutibilidade das etapas do processo para garantir a consistência e robustez do processo. A cloroquina foi removida do processo para aprimorar a segurança.
[00302] Outras otimizações foram realizadas em pequena escala, incluindo densidade de semeadura celular, meio para crescimento celular, concentração de FBS e razão de DNA:PEI. Uma vez que um processo de transfecção otimizado foi estabelecido, o processo foi realizado em escala real usando PEI e comparado ao mesmo processo usando fosfato de cálcio para demonstrar comparabilidade. Microfluidização para Ruptura Celular
[00303] Processo 1: Este processo usa lise mecânica de células para liberar vírus intracelular usando um microfluidizador.
[00304] Otimização de Processo: Nenhuma mudança nesta etapa do processo foi realizada. Estudos de desenvolvimento com foco na otimização e definição das condições de operação usando um microfludizador sanitário adequado para confecção e contenção de GMP. Mudanças operacionais (não de processo) foram implementadas para aprimorar o controle e reprodutividade das etapas do processo e para aprimorar a compreensão e caracterização do processo para garantir a consistência e robustez do processo. A consistência dos testes de controle em processo para pureza do produto e título do vetor foram determinados. Ultracentrifugação de Gradiente de Densidade
[00305] Processo 1: Purificação do gradiente de densidade para reduzir as impurezas do processo.
[00306] Otimização de Processo: Como o método de purificação do gradiente atual é manual, é possível que contribua para a variabilidade do processo. Embora os princípios do método de purificação permaneçam inalterados, oportunidades para tornar esta etapa do processo mais robusta e semiautomática foram avaliadas. Mudanças operacionais (não de processo) foram implementadas para aprimorar o controle e reprodutividade das etapas do processo e para aprimorar a compreensão e caracterização do processo para garantir a consistência e robustez do processo. A consistência dos testes para pureza do produto e título do vetor foram determinados. Ultrafiltração (UF)/Diafiltração (DF)
[00307] Processo 1: Troca de tampão por UF/DF e diálise.
[00308] Otimização de Processo: Cada etapa do processo envolvendo troca de tampão por UF/DF e diálise foi otimizada para estabelecer os parâmetros críticos do processo, bem como garantir a aceitabilidade dos materiais de contato para a qualidade do produto. Esta mudança foi implementada para garantir a consistência e robustez do processo, para aprimorar a compreensão e caracterização do processo e para garantir a adequação dos materiais de contato do produto. O rendimento do vírus e o perfil de impurezas foram avaliados. Mudança na Resistência a Antibióticos Codificados por Plasmídeo
[00309] O vetor clínico do Construto de AAV2 que expressa um construto terapêutico é produzido através de uma plataforma de transdução transiente utilizando três plasmídeos; um plasmídeo de vetor contendo o construto/transgene terapêutico e o promotor com sequências de repetição terminal invertida, um plasmídeo auxiliar de AAV que contém as sequências de AAV2-Rep e Cap e, finalmente, um plasmídeo auxiliar que codifica os genes essenciais de adenovírus E2A, E4 e VA. Todos os três plasmídeos usados para a produção do vetor clínico de Construto de AAV2 produzido de acordo com o processo original continham um marcador selecionável por ampicilina (Amp). Para evitar preocupações sobre a sensibilidade do paciente à ampicilina residual e uma transferência teórica do gene AmpR para o vetor final, os plasmídeos foram reprojetados para trocar a sequência do marcador selecionável por Amp por uma sequência de resistência à canamicina (Kan). A sequenciação completa foi realizada para confirmar que o restante da estrutura do plasmídeo permanece o mesmo para todos os três plasmídeos. Esses plasmídeos foram avaliados quanto ao seu desempenho de rendimento na produção de rAAVs em estudos in vitro de pequena escala para estabelecer sua adequação para uso na produção de cGMP. Esta análise experimental dos plasmídeos foi feita através de uma comparação direta de rendimento com um controle que consiste nos plasmídeos previamente usados para a produção do vetor clínico de Construto de AAV2 e é descrito abaixo. Uma vez que a adequação do plasmídeo foi determinada em estudos in vitro de pequena escala, os plasmídeos KanR foram avaliados em uma escala completa, processo não GMP. Mudança na Linhagem Celular do Banco de Células Principal
[00310] A produção do vetor clínico de Construto de AAV2 a partir do processo original utilizou uma linhagem celular HEK293 que foi derivada, testada e armazenada pela instalação GMP (processo original 1) de uma linhagem de células HEK293 que está comercialmente disponível através da Stratagene. Este banco de células foi totalmente testado e caracterizado, mas um histórico documentado completo do banco de células não estava disponível. Para garantir a rastreabilidade total das células HEK293, novas células foram obtidas da ATCC, avaliadas quanto à comparabilidade com as células do processo 1 original e usadas para a produção de MCB GMP. Três linhagens de células (duas linhagens de células HEK293 e uma linhagem celular 293T) foram rastreadas em uma comparação direta dos seguintes parâmetros para determinar a linhagem celular ideal para a produção do vetor de Construto de AAV2: 1) Eficiência de transdução genérica via fluorescência média de GFP Intensidade e porcentagem de GFP usando um plasmídeo eGFP baseado em AAV, 2) Eficiência de transdução específica para o produto de Construto de AAV2 avaliando o rendimento de Construto de AAV2 via análise de DRP (Partícula Resistente de DNase), 3) Cinética de crescimento por contagens de células e porcentagem de células viáveis, e 4) Passagem contínua e novo teste para rendimento e eficiência de transdução para comparar a eficiência de transdução com células em uma passagem posterior. Robustez Aprimorada da Cromatografia de Purificação de AAV2
[00311] A etapa da coluna de afinidade derivada de animais (por exemplo, heparina) no processo de fabricação da Fase 1/2 original foi substituída por uma coluna de troca iônica não derivada de animais (AEX), UnoQ, para aprimorar as preocupações de segurança potenciais (potencial de contaminantes adventícios de matriz derivada de animais). A Figura 2 mostra um diagrama de fluxo do processo destacando as etapas principais do processo e a etapa final de cromatografia em coluna (Etapa 18). CAntes da etapa final de purificação UnoQ, uma etapa de diluição com baixo teor de sal reduz a condutividade e suporta a ligação eficiente do Construto de AAV2 à coluna. O intervalo de concentração de sal aceitável (condutividade) para o desempenho bem- sucedido desse estágio foi demonstrada ser muito estreita. Se a condutividade for muito alta, o produto não se liga à coluna AEX e se perde no fluxo. Se a condutividade for muito baixa, pode ocorrer agregação do produto, resultando em perda do produto durante a purificação. O rendimento e a concentração do produto impactaram e, como resultado, o sucesso do lote - um lote de baixo rendimento não seria viável em termos de material necessário para apoiar os estudos clínicos. A etapa UnoQ, entretanto, não teve nenhum impacto negativo na eficácia ou segurança do produto, conforme demonstrado pela produção bem-sucedida de um lote de Construto de AAV2 não clínico e o lote GMP usando este processo aprimorado.
[00312] Para abordar o intervalo estreito de sal necessário antes de AEX, uma coluna alternativa de cromatografia de afinidade não derivada de animais, AVB Sepharose da GE Healthcare, foi avaliada. Após uma fase de desenvolvimento abrangente para garantir a manutenção da comparabilidade do produto, conforme descrito abaixo, a coluna de afinidade (com uma matriz de origem animal) foi substituída por AVB para a fabricação de lotes subsequentes de GMP.
[00313] AVB Sepharose é um meio de afinidade com afinidade para vírus adenoassociados usado na purificação de AAV2 para permitir alta pureza e produção de rendimento. O ligante de afinidade é um fragmento de 14 kDa de um anticorpo de cadeia simples, expresso em levedura. A coluna AVB permite uma boa ligação e eluição do Construto de AAV2 e pode ser realizada em sal superior (condutividade). Portanto, a coluna de AVB representa uma etapa de processo robusta que minimiza as perdas de produto O AVB não é derivado de animal, portanto seu uso não apresenta risco à segurança de contaminantes adventícios. Controle de Substâncias Farmacológicas da Descrição
[00314] Substâncias Farmacológicas exemplificativas são caracterizadas pelos testes listados na Tabela 19. Tabela 19: Critérios de Teste Método de Teste Aceitação Caracterização vetorial Ensaio de Partícula Resistente a Título Físico DNase (DRP) com Base em qPCR >0,7 x 10^12 Título de unidade infecciosa Infecção de células RC32 seguida > 1,24 x 10 ^ 8 (IU) pela detecção de AAV2 por qPCR IU/mL DRP: Razão IU - Cálculo n/a <5645: 1 ELISA comercial de partículas anti- > 0,49 x 10^12 Partículas Totais AAV2 partículas/mL Microscopia eletrônica de <55% de partículas Razão de Cheio:Vazio transmissão vazias Identidade Purificação do DNA viral com Corresponde à Identidade vetorial (DNA) Sequenciamento de DNA de sequência
Ambas as Fitas esperada com exceção das regiões ITR Pureza e Impurezas Quantificação de proteína Micro- Proteína total > 5 µg/mL
BCA Pureza> 90% sem nenhuma impureza> 2%. Ensaio SDS-PAGE com impurezas Três bandas Pureza estimadas por análise de correspondentes a intensidade AAV2 VP1, VP2 e VP3 devem ser evidentes. AAV Competente para Amplificação baseada em células <LOD do ensaio Replicação HEK293 e qPCR Proteína de célula Kit ELISA Comercial <80 ng/mL hospedeira HEK293 Relatório de DNA total Ensaio Picogreen resultado Ensaio de qPCR DNA da célula hospedeira < 2,66 x 10^7 Método de res de SEQ de DNA HEK293 pg/mL Humana (kit Life Technologies) BSA Residual Kit ELISA Comercial <126 ng/mL Benzonase Residual Kit ELISA Comercial <5 ng/mL Relatório de AVB Residual Kit ELISA Comercial resultado Critérios de Teste Método de Teste Aceitação Segurança Ensaio de Biocarga Filtração por membrana <1 CFU/1% PB Método cinético-cromogênico Ensaio de endotoxina <5 EU/mL quantitativo. n/a: Não aplicável
Procedimentos analíticos
[00315] Título físico: o título genômico é determinado usando qPCR. Este método permite a quantificação do número de cópias genômicas. Amostras do estoque de vetor são diluídas em tampão. As amostras são tratadas com DNase e os capsídeos virais lisados com proteinase K para liberar o DNA genômico. Uma série de diluições é então feita. As réplicas de cada amostra são submetidas a qPCR usando um conjunto de primer/sonda baseado em Taqman específico para a sequência CAG. Uma curva padrão é produzida tomando a média para cada ponto no intervalo linear da série de diluição do plasmídeo padrão e plotando o número de cópias logarítmicas contra o valor médio de CT para cada ponto. O título do vetor de rAAV pode ser calculado a partir da curva padrão e é expresso como Partículas Resistentes a DNase (DRP)/mL.
[00316] Título de unidade infecciosa (IU): Este ensaio quantifica o número de partículas infecciosas de AAV. A quantificação é realizada infectando células RC32 (HeLa expressando AAV2 Rep/Cap) com diluições em série da amostra do vetor e concentrações uniformes de adenovírus do tipo selvagem para fornecer função auxiliar. Vários dias após a infecção, as células são lisadas, diluídas para reduzir os inibidores de PCR e testadas por qPCR da mesma maneira conforme descrito no ensaio de título físico acima, exceto que a digestão com DNase e Proteinase K é omitida e apenas a porção qPCR é realizada. Os poços individuais são classificados como Positivos ou Negativos para a amplificação de AAV. Os poços pontuados são usados para determinar o TCID50 em IU/mL usando o Método de Karber.
[00317] Partículas Totais: O ensaio usa uma técnica ELISA (Título de AAV2 do KIT de ELISA). Um anticorpo monoclonal específico para um epítopo conformacional em capsídeos de AAV2 montados é revestido em tiras de microtitulação e é usado para capturar partículas de AAV2 da amostra. As partículas capturadas de AAV são detectadas em duas etapas. Primeiro, um anticorpo monoclonal conjugado com biotina para AAV2 é ligado ao complexo imune. Na segunda etapa, o conjugado de estreptavidina peroxidase reage com as moléculas de biotina. A adição de solução de substrato resulta em uma reação de cor que é proporcional à quantidade de partículas virais especificamente ligadas. A absorbância é medida fotometricamente a 450 nm.
[00318] Razão de Cheio:Vazio (Microscopia Eletrônica de Transmissão): A razão de cheio:vazio de partículas de AAV2 pode ser determinada usando microscopia eletrônica de transmissão de coloração negativa (TEM). As amostras são aplicadas a uma grade fixa. As amostras são visualizadas usando um microscópio eletrônico de transmissão e as contagens são realizadas das partículas de capsídeo de AAV2 completas (ou seja, contendo DNA) e vazias com base em sua morfologia. A razão de partículas cheias:vazias é calculada a partir das contagens de partículas.
[00319] Razão de cheio:vazio (Ultracentrifugação analítica): A razão de cheio: vazio das partículas de AAV2 pode ser determinada usando ultracentrifugação analítica (AUC). A AUC tem uma vantagem sobre outros métodos de não ser destrutiva, o que significa que as amostras podem ser recuperadas após a AUC para testes adicionais. Amostras compreendendo partículas de AAV2 vazias e cheias são aplicadas a uma composição líquida através da qual o AAV2 se move durante uma ultracentrifugação. Uma medição da velocidade de sedimentação de uma ou mais partículas de AAV2 fornece informações hidrodinâmicas sobre o tamanho e a forma das partículas de AAV. Uma medida de equilíbrio de sedimentação fornece informações termodinâmicas sobre as massas molares da solução, estequiometrias, constantes de associação e não idealidade da solução das partículas de AAV2. Medições exemplares adquiridas durante AUC são distribuições de concentração radial ou "varreduras". Em algumas modalidades, as varreduras são adquiridas em intervalos que variam de minutos (para sedimentação de velocidade) a horas (para sedimentação de equilíbrio). As varreduras dos métodos da descrição podem conter medições ópticas (por exemplo, absorbância de luz, interferência e/ou fluorescência). As velocidades de ultracentrifugação podem variar entre
10.000 rotações por minuto (rpm) e 75.000 rpm, incluindo os critérios de avaliação. Como as partículas de AAV2 cheias e as partículas de AAV2 vazias demonstram medições distintas por AUC, a razão de cheia/vazia de uma amostra pode ser determinada usando este método.
[00320] Identidade do vetor (DNA): Este ensaio fornece uma confirmação da sequência do DNA viral. O ensaio é realizado digerindo o capsídeo viral e purificando o DNA viral. O DNA é sequenciado com uma cobertura mínima de duas vezes tanto para frente quanto para trás, sempre que possível (algumas regiões, por exemplo, ITRs são problemáticas para sequenciar). O sequenciamento de DNA contíguo é comparado com as sequências esperadas para confirmar a identidade.
[00321] Proteína total: Este ensaio quantifica a quantidade total de proteína presente no artigo de teste usando um kit Micro-BCA. Para eliminar os efeitos da matriz da formulação, as amostras tampão são precipitadas com acetona e a proteína precipitada ressuspensa em igual volume de água antes da análise. A determinação da concentração de proteína é realizada pela mistura do artigo de teste ou artigo de teste diluído com um reagente Micro-BCA fornecido no kit. O mesmo é realizado usando diluições de um padrão de albumina de soro bovino (BSA). As misturas são incubadas a 60°C e a absorbância é medida a 562 nm. Uma curva padrão é gerada a partir da absorbância padrão e das concentrações conhecidas usando um ajuste de regressão linear. As amostras desconhecidas são quantificadas de acordo com a regressão linear.
[00322] Pureza: Este ensaio fornece uma determinação semiquantitativa da pureza de AAV. Com base nos resultados do ELISA de partícula de capsídeo de AAV2, as amostras são concentradas por SpeedVac e 4 x 10^10 ou 1 x 10^11 partículas são carregadas e as proteínas de capsídeo são separadas em um gel SDS-PAGE. A análise densitométrica dos géis pigmentados com laranja SYPRO permite o cálculo dos níveis aproximados de impurezas em relação às proteínas de capsídeo (Vp1, Vp2 e Vp3).
[00323] AAV Competente para Replicação: O artigo de teste é usado para transduzir células HEK293 na presença ou ausência de adenovírus do tipo selvagem. Três rodadas sucessivas de amplificação celular serão conduzidas e o DNA genômico total é extraído em cada etapa de amplificação.
[00324] Os rcAAV2 são detectados por PCR quantitativo em tempo real. Duas sequências são DNA genômico isolado; um específico para o gene Rep AAV2 e um específico para um gene endógeno das células HEK293 (albumina humana). O número relativo de cópias do gene Rep por célula é determinado. O controle positivo é o sorotipo 2 do vírus AAV do tipo selvagem testado sozinho ou na presença da preparação do vetor de rAAV.
[00325] O limite de detecção do ensaio é desafiado para cada lote testado. O limite de detecção é de 10 rcAAV por 1 x 10^8, ou 1 x 10^10, cópias do genoma da amostra de teste. Se uma amostra de teste for negativa para a sequência Rep, o resultado para esta amostra será relatado como: SEM REPLICAÇÃO, <10 rcAAV por 1 x 10^8 (ou 1 x 10^10) cópias do genoma da amostra de teste. Se uma amostra de teste for positiva para a sequência Rep, o resultado para esta amostra será relatado como: REPLICAÇÃO.
[00326] Proteína da célula hospedeira HEK293: O ensaio da proteína da célula hospedeira HEK293 (HCP) é um ensaio imunoenzimétrico.
Amostras de vírus purificados reagem em tiras de microtitulação revestidas com um anticorpo de captura purificado por afinidade. Uma enzima conjugada com peroxidase de rábano (HRP) secundária é feita reagir simultaneamente, resultando na formação de um complexo sanduíche de anticorpo de fase sólida-HCP-anticorpo marcado com enzima. As tiras de microtitulação são lavadas para remover quaisquer reagentes não ligados. A quantidade de HCPs de HEK293 é detectada pela adição de 3, 3', 5, 5' tetrametil benzidina peroxidase, um substrato de HRP, a cada poço. A quantidade de substrato hidrolisado é lida em um leitor de placas e é diretamente proporcional à concentração de HCPs de HEK293 presentes.
[00327] DNA total: o reagente Picogreen é uma pigmentação de ácido nucleico fluorescente ultrassensível que se liga ao DNA de fita dupla e forma um complexo altamente luminescente (excitação λ = 480 nm - emissão λ = 520 nm). Esta intensidade de emissão de fluorescência é proporcional à quantidade de dsDNA em solução. Usando uma curva padrão de DNA com concentrações conhecidas, o conteúdo de DNA nas amostras de teste é obtido pela conversão da fluorescência medida.
[00328] DNA da célula hospedeira HEK293: O processo original mediu o tamanho e a quantidade de 3 amplicons diferentes, enquanto o processo aprimorado mede o hcDNA total, incluindo alto peso molecular e DNA fragmentado. Os dados de qualificação do processo aprimorado demonstram que o ensaio é específico e suficientemente sensível para atender aos requisitos de avaliação de hcDNA por dose <10 ng/dose (Comitê de Especialistas da OMS em Padronização Biológica, 2013).
[00329] BSA residual: BSA residual é quantificado usando um kit de ELISA disponível comercialmente, fabricado e comercializado pela Bethyl. O princípio científico do kit de ELISA é muito semelhante ao especificado para o ELISA de proteínas da célula hospedeira.
[00330] Benzonase residual: Este ensaio usa anticorpos policlonais purificados específicos para a endonuclease da Benzonase para detectar a Benzonase residual na amostra de teste por ELISA sanduíche. A medição precisa é alcançada comparando o sinal da amostra com os padrões de endonuclease Benzonase testados ao mesmo tempo.
[00331] Ensaio de Biocarga: Este procedimento é usado para determinar quantitativamente (se detectável) a quantidade de Biocarga presente em uma amostra. O método usado envolve a filtração por membrana de metade da amostra em cada uma das duas membranas. As membranas são colocadas em placas de meio de ágar separadas que são incubadas em condições aeróbias e anaeróbias sequencialmente a 20-25°C e 30-35°C. No final da incubação; as contagens de aeróbios, anaeróbios e fúngicos são expressas como CFU/mL de amostra.
[00332] Ensaio de endotoxinas: Este ensaio é usado para determinar se endotoxinas bacterianas estão presentes no artigo de teste. Um procedimento quantitativo é realizado pelo método cinético- cromogênico. Quantidades conhecidas de endotoxina são testadas em paralelo com o artigo de teste para uma determinação precisa do nível de endotoxina bacteriana. O potencial de interferência pelo produto de teste é examinado adicionando o produto de teste mais o reagente LAL com níveis especificados de endotoxina. Após o teste de inibição/intensificação, o teor de endotoxina do produto de teste é determinado.
[00333] AVB residual: A análise de AVB residual é realizada usando um kit de ELISA comercial, ELISA de Vazamento de Ligante HP de AVB Sepharose CaptureSelectTM, fabricado pela Life Technologies. O princípio do ELISA sanduíche envolve o revestimento de placas de microtitulação com anticorpos policlonais de cabra antiligante de afinidade para capturar AVB presente na amostra. A detecção é feita por meio de anticorpos policlonais de cabra do ligante anti-AVB purificados por afinidade biotinilados e conjugado de estreptavidina com peroxidase de rábano. A concentração de AVB residual na amostra é determinada por medição em relação a uma curva padrão. Estabilidade de Composições de AAV
[00334] As composições da descrição mantêm estabilidade a longo prazo quando armazenadas a <-60°C. Por exemplo, as composições da descrição mantêm a estabilidade de longo prazo quando armazenadas em temperaturas entre -80°C e 40°C (aproximadamente a temperatura do corpo humano), incluindo os critérios de avaliação. Por exemplo, as composições da descrição mantêm a estabilidade de longo prazo quando armazenadas em temperaturas entre -80°C e 5°C, incluindo os critérios de avaliação. Por exemplo, as composições da descrição mantêm estabilidade de longo prazo quando armazenadas a -80°C, -20°C ou 5°C. Em algumas modalidades, as composições da descrição são formuladas como líquidos ou suspensões, divididas em alíquotas em um ou mais recipientes (por exemplo, frascos) e armazenadas a <- 60°C. Em algumas modalidades, as composições da descrição são formuladas como líquidos ou suspensões, alíquotas em um ou mais recipientes (por exemplo, frascos) e armazenadas a -80°C, -20°C ou 5°C.
[00335] As composições da descrição podem ser fornecidas em um recipiente com uma área de superfície ótima para a razão de volume para manter a estabilidade de longo prazo quando armazenadas a <- 60°C. As composições da descrição podem ser fornecidas em um recipiente com uma área de superfície ideal para a razão de volume para manter a estabilidade de longo prazo quando armazenadas a - 80°C, -20°C ou 5°C. Em algumas modalidades, as composições da descrição são formuladas como líquidos ou suspensões, aliquotadas em um ou mais recipientes (por exemplo, frascos) e armazenadas em um ou mais recipientes com uma razão de área de superfície para volume tão grande quanto possível quando todos os requisitos de armazenamento são considerados.
[00336] As composições da descrição mantêm estabilidade de longo prazo quando armazenadas em umidade relativa ambiente. Projeto de Dose Clínica
[00337] A coroideremia (CHM) é uma distrofia retinal hereditária ligada ao X, descrita pela primeira vez no século 19. Uma deleção ou mutação do gene CHM, que codifica REP1, leva à degeneração da coroide, RPE e retina. A coroideremia é caracterizada por degeneração coriorretiniana progressiva em machos afetados e sinais mais leves em fêmeas carreadoras. Os sintomas em machos afetados podem evoluir da cegueira noturna à perda do campo visual periférico, com a visão central preservada até o final da vida. Embora as fêmeas carreadoras sejam geralmente assintomáticas, sinais de degeneração coriorretiniana podem ser observados com exame cuidadoso de fundo de olho. Esses sinais tornam-se mais evidentes após a segunda década.
[00338] CHM é causado por mutações no gene CHM (Xq21), que codifica o componente A de Rab geranil-geranil-transferase, referido como REP1. O REP1 é necessário para o tráfego intracelular e, portanto, essencial para a função retiniana normal. Quando o REP1 é deficiente, como é o caso dos portadores de CHM, ocorre uma perda gradual da função e atrofia do epitélio pigmentar da retina, fotorreceptores e da coroide, o que acaba levando à cegueira. Antes do desenvolvimento das composições farmacêuticas da descrição, nenhum tratamento estava disponível para CHM.
[00339] A dosagem de terapia gênica retinal usando um vetor viral adenoassociado (AAV) envolve o cálculo de uma dose única que pode ter efeitos ao longo da vida. Na dosagem sistêmica tradicional do fármaco, a meia-vida do fármaco é medida no sangue e isso determina a frequência de doses repetidas administradas ao longo do dia, de modo que os níveis máximos não sejam tóxicos e os níveis mínimos sejam suficientes para manter a atividade farmacodinâmica. Com os regimes de dosagem tradicionais, é possível usar voluntários saudáveis para calcular a eliminação do fármaco e, portanto, calcular a meia-vida do fármaco e, assim, estimar os níveis plasmáticos necessários para calcular a dose e a frequência de administração. Ajustes podem ser feitos, por exemplo, a dosagem pode ser reduzida para fármacos metabolizados pelo fígado em casos de insuficiência hepática. Em casos pediátricos, a dosagem pode ser ajustada de acordo com o peso, que reconhece o menor volume de sangue e órgãos alvo. Estes métodos tradicionais de titulação ativa da dosagem apresentam desafios com a administração de terapia gênica oftálmica porque, em modalidades preferenciais dos métodos de tratamento e usos das composições farmacêuticas da descrição, o objetivo do tratamento é dar apenas uma dose que atingirá efeitos terapêuticos ao longo da vida.
[00340] Em algumas modalidades dos métodos da descrição, a composição farmacêutica é administrada ao olho por meio de uma injeção sub-retinal para alvejar RPE e camadas de células fotorreceptoras. Como parte do procedimento cirúrgico para uma injeção sub-retiniana, uma vitrectomia é realizada no olho a ser tratado antes da rejeição sub-retiniana. Esta vitrectomia é seguida por uma infusão sub-retinal de solução salina balanceada para formar uma bolha hemisférica. Em algumas modalidades da descrição, a bolha hemisférica tem aproximadamente 10 mm2 de área ou a bolha hemisférica tem 10 mm2 de área. Em algumas modalidades da descrição, uma composição farmacêutica da descrição é formulada em um volume final de 0,1 mL e injetada na bolha pré-formada, permitindo que a composição farmacêutica se distribua uniformemente pela superfície retinal (por exemplo, através da superfície retinal de 10mm2). Assim, nas modalidades em que uma bolha hemisférica é formada na qual a composição farmacêutica pode ser injetada, a bolha facilita uma distribuição uniforme de rAAVs completos da composição através da camada de células RPE da retina. Após a injeção da composição farmacêutica, a bolha resolve dentro de algumas horas após a cirurgia.
[00341] Uma complicação potencial da vitrectomia/cirurgia sub- retiniana é a redução da acuidade visual (VA) imediatamente após a cirurgia. Outra complicação potencial e de longo prazo é a formação de catarata. Ambos os fatores afetam a visão quando um teste de VA é realizado e, portanto, esses fatores são considerados ao determinar o resultado da variação da dose, especialmente quando VA é o único preditor da determinação da dose efetiva.
[00342] A escolha da dose apropriada em testes de terapia gênica é diferente das formas tradicionais de avaliar o intervalo de dosagem. O objetivo é administrar a dose mais eficaz possível que seja sabidamente segura. As razões para isso são motivadas principalmente pelo fato de que a multiplicidade de infecção (MOI) para fotorreceptores da retina é muito alta na ordem de 105 partículas do genoma (gp) por célula da retina. Dado que, em algumas modalidades, e dependendo da biologia do indivíduo individual a ser tratado, a área máxima da retina que pode ser tratada é de aproximadamente 10 mm2 e que a área da retina que pode ser trada está em volta da mácula, o número total de bastonetes, cones e células do epitélio pigmentar da retina (RPE) nesta área totalizam aproximadamente 1 x 106 células, o coorte de baixa dose (1010 gp) no estudo (descrito no Exemplo 13) fornece apenas um MOI de 1 x 104 gp, enquanto o braço de alta dose (1011 gp) no mesmo estudo fornece um MOI de 1 x 105 gp.
[00343] Os dados da Fase I/II são fornecidos no Exemplo 13. A alta dose deste estudo (1011 gp) demonstrou ser segura e eficaz. Em certas modalidades, um regime de terapia esteroide pode ser usado para abordar qualquer resposta imune do indivíduo ao AAV da composição farmacêutica. Conforme descrito no Exemplo 13, uma dose de 10 11 gp da composição farmacêutica da descrição resulta em um MOI em um intervalo preferencial de 105 gp. Avaliando a Dose Terapêutica na Coroideremia
[00344] Um parâmetro para medir é um aprimoramento na função visual. Isso pressupõe que o parâmetro de função visual é adversamente afetado pelo defeito genético e pode, portanto, ser reversível até certo ponto, de modo que o aprimoramento pode ser medido após a transferência bem-sucedida do gene. Em algumas modalidades de métodos de tratamento de CHM, os parâmetros de função visual são medidos, incluindo, mas não se limitando a acuidade visual (VA), sensibilidade retinal e medições de visão adaptada ao escuro. Para alguns assuntos, no entanto, dependendo da gravidade do defeito e do estágio da degeneração, alguns dos parâmetros de função visual acima podem ser considerados normais. Em algumas modalidades dos métodos de tratamento da descrição, o parâmetro de função visual de um indivíduo aprimora após o tratamento e o aprimoramento resulta em medições de parâmetros de função visual que são iguais às medições obtidas de um indivíduo saudável (que não tem CHM) e que não receberam o tratamento. Em algumas modalidades, o indivíduo saudável é um indivíduo da mesma idade, por exemplo, para contabilizar a deterioração natural da visão relacionada à idade que é independente de CHM. Além disso, como homens e mulheres podem diferir em sua acuidade de visão de cores, em algumas modalidades, o indivíduo saudável é um indivíduo com a mesma composição do cromossomo XY. Em algumas modalidades dos métodos de tratamento da descrição, incluindo aquelas modalidades nas quais o indivíduo já experimentou dano retinal significativo (perda neuronal) ou em que as áreas não afetadas da retina são pequenas e/ou descontínuas, uma recuperação completa do visual função pode não ser esperada. Nas modalidades em que apenas uma recuperação parcial é possível, um aprimoramento da função visual pode ser aparente quando o aprimoramento é comparado com a função de linha de base do indivíduo (a função avaliada neste indivíduo e no olho tratado antes da administração da composição farmacêutica). Mesmo nas modalidades em que apenas uma recuperação parcial é possível, o tratamento aumenta a função de linha de base do olho e a função de visão do indivíduo, de modo que CHM e/ou degeneração retinal relacionada à idade sejam adiadas ou reduzidas, prolongando assim a vida útil da visão para o indivíduo. Densidade Anatômica de Células Retinais na Zona Alvo
[00345] Para calcular o MOI para tratamentos clínicos in vivo, o número total de partículas de vetor e o número de células alvo na região a ser tratada são determinados. Esse número depende da área da retina exposta ao vetor e da densidade de cada um dos diferentes tipos de células naquela região.
[00346] As composições farmacêuticas da descrição são administradas em pacientes com CHM por meio de uma injeção sub- retinal após um descolamento retinal induzido. Por exemplo, se for assumido que o descolamento de retina tem dimensões lineares de aproximadamente 2-3 diâmetros de disco, esta área de descolamento de retina é equivalente a um círculo com um diâmetro de 3-4 mm, ou uma área de aproximadamente 10 mm².
[00347] A descrição fornece densidades celulares exemplificativas para cálculos de dose exemplificativas, no entanto, as doses das composições farmacêuticas da descrição não são limitadas por esses cálculos exemplificativas. Na mácula central, a densidade de células RPE em indivíduos humanos normais é de 5.000 células por mm2 (com base em estudos post-mortem em pacientes no grupo de 40-50 anos de idade). Na mácula central, a densidade de células bastonetes em indivíduos humanos normais é de 75.000 células por mm2, mas exclui a área foveal central de aproximadamente 0,5 mm2. Na mácula central, a densidade das células cone em indivíduos humanos normais é 150.000 por mm2 na fóvea central de 0,5 mm2 (75.000 total) + 25.000 por mm2 na mácula fora da área da fóvea. Portanto, em algumas modalidades da descrição que são baseadas nestas densidades celulares exemplificatvas, o número total de cada um dos três tipos de células expostas a rAAV das composições farmacêuticas da descrição em um destacamento padrão de 10 mm2 pode ser calculado a partir do acima conforme segue: (a) RPE: 5.000 células por mm2 - TOTAL = 5 x 104 em 10 mm2; (b) Bastonetes: 75.000 células por mm2, mas exclundo a fóvea central de 0,5 mm2 - TOTAL = 7,1 x 105 em 10 mm2; e (c) Cones:
150.000 células por mm2 na fóvea central de 0,5 mm2 (75.000), mas apenas 25.000 mm2 extrafoveal - TOTAL = 3,1 x 105 em 10 mm2. A densidade de EPR, bastonetes e cones difere nos 10 mm 2 centrais da mácula e varia em cerca de uma unidade logarítmica, com a densidade mais baixa (e, portanto, maior MOI) observada em relação ao EPR.
LISTA DE ABREVIATURAS AAV Vírus Adeno-Associado AmpR Resistência à Ampicilina ATCC Coleta de Cultura do Tipo Americano (American Type Culture Collection) MED Média BCA Ácido Bicinconínico BGH-poliA Sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino bp Pares de base BSA Albumina de Soro Bovino BSE Encefalopatia Espongiforme dos Bovinos BSS Solução Balanceada de Sal °C Graus Centígrados CBA Intensificador de Citomegalovírus/Beta-Actina de Galinha CEP Certificados de Adequação c.f.
Conferre (compare) CFU Unidades Formadoras de Colônias CI Intervalo de confiança cm Centímetro CT Limite de Ciclo CV Coeficiente de variação cGMP Boas Práticas de Fabricação Atuais CHM Coroideremia CMV Citomegalovírus CNS Sistema Nervoso Central DCB Banco de Células de Desenvolvimento DF Diafiltração DLS Dispersão Dinâmicã de Luz DMEM Meio de Eagle Modificado por Dulbecco DNA Acido Deoxirribonucleico DP Produto Farmacêutico DRP Ensaio de Partículas Resistentes a DNase dsDNA DNA de fita dupla EDTA ácido etilenodiaminotetracético EF fator de alongamento EFS Fator de alongamento 1 alfa curto ERA Área de Filtração Eficaz
EGFP Proteína fluorescente verde potencializada ELISA Ensaio de imunoabsorção enzimática EP Farmacopeia Europeia et al. et alii (e outros) EtBr Brometo de etídio FACS Classificação celular ativada por fluorescência FBS Soro fetal de bovino FC Recipiente Final FTM Meio de tioglicolato de fluido g x gravidade GAD Descarboxilase de ácido glutâmico GGPP Geranilgeranilpirofosfato GF Filtragem de Gel GFP Proteína fluorescente verde GLP Boas Práticas de Laboratório GMP Boas Práticas de Fabricação gp Partículas de Genoma gp/mL Partículas de genoma por mL h Hora HBSS Solução Balanceada de Sal de Hanks HCP Proteína da célula hospedeira HEK Rim embrionário humano HI-FBS FBS inativado por calor HPLC Cromatografia Líquida de Alta Eficiência HRP Peroxidase de rabano de cavalo HSA albumina de soro humano DCI Denominação comum internacional IPC Controle em processo IST Teste Patrocinado pelo Investigador ITR Repetição Terminal Invertida
IU Unidades Infecciosas KanR Resistência à canomicina kb Quilobase kDa Quilodaltons kg Quilograma kGy Kilogray L Litro LOQ Limite de Quantificação LAL Lisado de amebócito Limulus LOD Limite de Detecção µL Microlitros µm Micrometro m Metro M Molar mbars Milibares MCB Banco de Células Principal mDa Mega Daltons mg Miligramas MIA (IMP) Autorização do fabricante/importador min Minuto mL Mililitro mm Milímetro mM Milimolar mOsm Miliosmoles MSC Gabinete de segurança microbiológica N/A Não Aplicável ND Não Determinado NEAA Aminoácidos não essenciais ng Nanograma NF Formulário Nacional nm Nanômetro Nº Número OCT Temperatura ideal de corte OD Densidade Óptica OD600 Densidade Óptica Medida em 600 nm ONL Camada Nuclear Externa p Probabilidade Pa Pascals PAGE Eletroforese em Gel de Poliacrilamida PB Massa Purificada PBDS Substância Farmacológica Purificada a Granel PCR Reação em Cadeia da Polimerase PDA Detector de Arranjo de Fotodiodos PEI Polietilenimina PETG Polietileno Tereftalato Glicol pfu Unidades formadoras de Placa pg Picogramas ppm Partes por Milhão PSG Gerador de Vapor Puro psi Libras por Polegada Quadrada PTC Pontos a Considerar CQ Controle de Qualidade QP Pessoa qualificada QFPERT Transcriptase Reversa Aprimorada por Prroduto Fluorescente Quantitativo qPCR Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa qs Quantum Sufficit rAAV AAV Recombinante P&D Pesquisa e Desenvolvimento rcAAV AAV Competente para Replicação rDNA DNA Recombinante REP1 Proteína de Escolta Rab Tipo 1 RH Umidade Relativa RO Osmose Reversa RPE Epitélio Pigmentar da Retina RPE65 Proteína 65 do Epitélio Pigmentar da Retina rpm Rotações por Minuto s Segundo SCDM Meio Digestivo de Soja-Caseína SDA Agar Sabouraud Dextrose SDS Dodecil Sulfato de Sódio SLO Oftalmoscopia por varredura a laser SOP Procedimento Operacional Padrão SSS Solução de sal e surfactante Desv.
Padr.
Desvio Padrão TAMC Contagem Microbiana Aeróbia Total TBA A Ser Atribuído TCID50 Dose infecciosa de cultura de tecido 50 TFF Filtração por fluxo tangencial TSA Ágar de Tripticase de Soja TT Transferência de Tecnologia TYMC Contagem Total de Levedura/Bolor U Unidades UF Ultrafiltração USP Farmacopéia dos Estados Unidos UV Ultravioleta vg Genoma do Vetor vp Partículas Virais v/v Volume a Volume WFI Água para Injeção
WPRE Elemento Regulador Pós-Transcricional do Vírus da Hepatite da Marmota WT Tipo Selvagem µl Microlitro μm Micrômetro
EXEMPLOS Exemplo 1: Dados de Teste Analítico Comparativo de Processos Originais e Aprimorados
[00348] Amostras do processo original foram fornecidas para uso na análise de dados do processo aprimorado para que os dados pudessem ser gerados a partir de ambos os conjuntos de lotes usando os mesmos métodos (quando aplicável) para permitir uma comparação relativa direta dos dados gerados, a menos que indicado de outra forma. Para os dados fornecidos abaixo, as medições são feitas a partir de um ou mais lotes de Construto de AAV2, em que o Construto é idêntico em todos os lotes.
[00349] Os produtos intermediários gerados pelo processo aprimorado foram analisados quanto ao título físico (qPCR), proteína total (Micro-BCA), DNA total (Picogreen) e pureza (SDS- PAGE/coloração Sypro Orange).
[00350] Os dados do título genômico para amostras do processo original foram retirados da documentação de teste fornecida.
[00351] Os dados de proteína total e DNA total das amostras intermediárias em processo originais apresentadas neste documento foram gerados de acordo com o processo aprimorado do material inicial produzido a partir do processo original.
[00352] A análise de Microscopia Eletrônica (EM) usada para determinação da razão de partículas cheias e vazias não foi totalmente estabelecida no momento em que o processo foi transferido do original para o processo aprimorado. O processo original não envolveu nenhum teste no momento da fabricação para determinar a razão de partículas cheias e vazias dentro do lote clínico, seja para avaliar a etapa de purificação (gradiente de densidade) ou para medir o Produto Farmacêutico final, portanto, nenhum dado estava disponível para comparação da etapa do processo de purificação (gradiente de densidade) do processo aprimorado com aquela do processo original. Portanto, a razão de partículas cheias e vazias não foi usada como uma avaliação de comparabilidade. Em vez disso, a determinação do título físico (ou partículas do genoma) medida por qPCR foi considerada uma determinação adequada de transferência bem-sucedida de todo o processo e de transferência bem-sucedida de etapas individuais do processo, pois isso é específico para o produto do vetor e, portanto, representativo de capsídeos completos. No entanto, para o processo original, um método baseado em ultracentrifugação analítica (AUC) foi usado para avaliar a razão de cheio para vazio apenas para informação. O resultado deste teste foi apresentado na Tabela 33.
[00353] EM é o método preferencial e foi executado em todos os lotes fabricados até o momento. Além disso, a análise EM foi usada retrospectivamente para testar ambos os lotes do processo original para dar uma compreensão da razão de cheio para vazio. Este teste demonstrou que o processo aprimorado é capaz de gerar uma razão comparável de capsídeos cheios e vazios, conforme mostrado na Tabela 20. Tabela 20: Análise de Microscopia Eletrônica Capsídeos Vazios Lote Conforme Estimado por EM (Processo Original) Produto Farmacêutico* 11% (Processo Original) Substância Farmacológica 11% (Processo Aprimorado) Substância Farmacológica - lote 1 15% (Processo Aprimorado) Substância Farmacológica - lote 2 24% (Processo Aprimorado) Substância Farmacológica - lote 3 51%**
*Nenhum DS disponível para teste. Testes realizados em DP apenas para informação; no entanto, há processamento limitado entre a Substância Farmacológica e Produto Farmacêutico, portanto, acreditamos que isso seria representativo de um resultado da Substância Farmacológica.
[00354] **Observe que este valor é um pouco maior do que o esperado. De acordo com o processo aprimorado, a maior razão de partículas vazias observada neste lote parece ser devido a uma manipulação operacional onde um maior volume de material foi removido dos tubos de centrífuga durante a coleta/seleção da fração para capsídeos cheios. Uma ação corretiva foi implementada para resolver isso para lotes futuros, e o lote 2, que foi fabricado após esta investigação, teve o número menor esperado de capsídeos vazios.
[00355] Os resultados analíticos do material inicial e do material de referência (ambos do processo original) estão resumidos na Tabela 21. Tabela 21: Processo Original Processo Aprimorado - lote 2 Recupe- Total Recupe- Total Título DNA Título DNA ração Proteína ração Proteína (DRP/mL) (ng/mL) (DRP/mL) (ng/mL) % (ug/mL) % (ug/mL) Pós-Lise NA 2,1 x 10^9 ND 4655 NA 1,3 x 10^11 505 7624 Clarificação NA 8,4 x 10^10 ND ND 110% 1,3 x 10^11 ND 3226 Pós-TFF 118% 7,4 x 10^12 ND ND 104% 9,5 x 10^12 ND ND Pós-Purificação 53% 2,3 x 10^13 6 821 28% 1,6 x 10^13 7 1223 Cromatografia de Pós- Afinidade 88% 8,5 x 10^12 ND ND 105% 6,8 x 10^12 ND ND (matriz derivada de animais) Produto Final 82% 6,7 x 10^12 7 32 105% 7,1 x 10^12 9 36 % de Recuperação 45% 36% Global
[00356] O material de coleta produzido pelo processo aprimorado continha uma concentração de proteína total mais alta do que o material de coleta produzido pelo processo original. No entanto, os perfis de pureza da Substância Farmacológica final foram semelhantes entre os processos original e aprimorado, sem impurezas principais detectadas. A recuperação do título entre os processos original e aprimorado também foi semelhante.
[00357] Com relação aos critérios de aceitação definidos para uma transferência de tecnologia bem-sucedida do processo, o processo aprimorado foi controlado e o desempenho das etapas individuais do processo aprimorado foram semelhantes aos observados durante o processo original. A recuperação do processo (título do vetor) do processo melhorado ficou dentro de 20% do obtido pelo processo original. A pureza do produto final (conteúdo de DNA/proteína) do processo melhorado estava dentro de 20% daqueles obtidos pelo processo original, com perfil SDS-PAGE semelhante. Exemplo 2: Otimização do Processo de Fabricação
[00358] Para os dados fornecidos abaixo, as medições são feitas a partir de um ou mais lotes de Construto de AAV2, em que o Construto é idêntico em todos os lotes. Transfecção e Coleta Tripla de Plasmídeo
[00359] Processo 1: A transfecção de três plasmídeos de células HEK293 foi realizada por precipitação de DNA com fosfato de cálcio após o pré-tratamento das células com cloroquina.
[00360] Otimização de Processo: Otimize a transfecção, incluindo condições de semeadura celular, comparação de fosfato de cálcio e polietilenimina. Otimizar a razão da concentração de plasmídeo. Determinar o dia pós-transfecção ideal para troca de meio e coleta. Mudanças operacionais (não de processo) foram otimizadas para aprimorar o controle e a reprodutibilidade das etapas do processo para garantir a consistência e robustez do processo. A cloroquina foi removida do processo para aprimorar a segurança.
[00361] Foi realizada uma análise do rendimento do título do vetor. O reagente de transfecção de polietilenimina (PEI) foi comparado com o fosfato de cálcio (usado para o Processo 1) para determinar se o primeiro poderia ser usado para substituir o fosfato de cálcio como um agente de transfecção mais robusto. A necessidade de um pré- tratamento com cloroquina também foi avaliada. Todos os parâmetros foram avaliados pela determinação do título físico por qPCR usando um método não validado.
[00362] A Tabela 22 apresenta os resultados iniciais em que o título do vetor após a transfecção com PEI foi comparado diretamente com o título obtido com Fosfato de Cálcio, tanto na presença quanto na ausência de cloroquina. Todos os estudos foram realizados com meio DMEM contendo Glutamax, que é o meio usado para todas as etapas do processo a montante. Tabela 22: Comparação de Reagentes de Transfecção - Título Físico Reagente de Cloroquina Título Físico Medido Pós- Transfecção Pré-tratamento Transfecção Usando qPCR (DRP/mL) Fosfato de cálcio Sim 1,90 x 10^8 DRP/mL Fosfato de cálcio Nº 6,90 x 10^7 DRP/mL PEI Sim 1,70 x 10^6 DRP/mL PEI Nº 5,60 x 10^6 DRP/mL
[00363] Este trabalho demonstrou transdução bem-sucedida usando PEI, embora com resultados de títulos físicos inferiores quando comparados à transfecção usando fosfato de cálcio. Este trabalho também mostrou que quando o PEI era usado como um reagente de transfecção, o pré-tratamento com cloroquina não era necessário e poderia ser removido do processo.
[00364] Com base neste resultado, outras otimizações foram realizadas em pequena escala, incluindo densidade de semeadura celular, meio para crescimento celular, concentração de FBS e razão de DNA:PEI. Uma vez que um processo de transfecção otimizado foi estabelecido, o processo foi realizado em escala real usando PEI e comparado ao mesmo processo usando fosfato de cálcio para demonstrar comparabilidade.
[00365] A Tabela 23 mostra os dados obtidos na fabricação em grande escala, o que demonstra a adequação e comparabilidade do PEI como um reagente de transfecção. Com base nesses dados, o PEI foi selecionado como o reagente de transfecção de escolha para permitir uma etapa de processo mais robusta quando comparado ao fosfato de cálcio. Tabela 23: Comparação de Reagentes de Transfecção de Fabricação em Escala Real - Título Físico Reagente de Título Pós-Transfecção Transfecção PEI 11,9 x 10^14 DRP/frasco (5,41 x 10^11 DRP/mL) Fosfato de cálcio 6,644 x 10^14 DRP/frasco (3,02 x 10^11 DRP/mL)
[00366] Além disso, a produtividade geral e o rendimento do processo dos lotes produzidos pelo processo aprimorado são comparáveis aos produzidos pelo processo original (Tabela 24), demonstrando a adequação do PEI como um reagente de transfecção.
Tabela 24: Comparação da Produtividade Geral e Rendimento do Processo - Lotes de Processos Originais e Aprimorados Processo Processo Processo Fabricante e Lote Aprimorado -- Aprimorado -- Original--GMP não GMP GMP 3,4 x 10^13 6,7 x 10^13 4,7 x 10^13 Vírus Produzido DRP total DRP total DRP total 12 frascos de 24 frascos de 22 frascos de Escala de Fabricação fábrica celular fábrica celular fábrica celular Rendimento de 2,83 x 10^12 2,79 x 10^12 2,14 x 10^12 vírus/fábrica de células DRP/frasco DRP/navio DRP/frasco Exemplo 3: Mudança na Resistência a Antibióticos Codificada em Plasmídeo - de AmpR para KanR
[00367] Para os dados fornecidos abaixo, as medições são feitas a partir de um ou mais lotes de Construto de AAV2, em que o Construto é idêntico em todos os lotes. Materiais de Estudo e Procedimentos
[00368] Os plasmídeos contendo ampicilina usados para a produção do lote clínico produzido pelo processo original serviram como controle para a análise do rendimento do vetor de Construto de AAV2 em termos de partículas resistentes a DNase (DRP)/cm². Os experimentos foram realizados a partir do mesmo evento de descongelamento celular e todas as células receberam os mesmos tratamentos, meios, reagentes e condições de crescimento ao longo do experimento.
[00369] Plasmídeos testados: Construto de pAAV (KAN); pNLREP- CAP2 (KAN); pHELP (KAN); Construto de pAAV, CN1055CM (Processo Original; versão do Amp, usado como controle); pNLREP-CAP2, CN1054CM (Processo Original; versão do Amp, usado como controle), pHELP, CN2291CM (Processo Original; versão do Amp, usado como controle).
[00370] O teste em triplicado foi realizado para cada conjunto de plasmídeos. Três 1-pilhas foram transfectados com Construto de pAAV (KAN), pNLREP-CAP2 (KAN) e pHELP (KAN). Três 1-pilhas foram transfectados com os plasmídeos contendo AmpR equivalentes. As células foram realimentadas em 16 a 26 horas após a transdução, e a mídia e as células colhidas em 44 a 52 horas após a transdução, e o rendimento de DRP determinado para cada 1-pilha determinado. Resultados
[00371] O DRP/cm2 médio foi determinado entre as 3 réplicas testadas via qPCR. Os rendimentos do meio e do lisado celular foram analisados separadamente e depois adicionados para determinar o rendimento total do vetor por réplica, que foi então dividido pelo número de centímetros quadrados. Tabela 25: Análise de rendimento DRP/cm² para Plasmídeos AmpR e KanR Rendimento total Plasmídeo DRP/cm² AVG DRP/cm² Desv. Padr. (meios + lisado) Kan 1 3,04 x 10^13 4,79 x 10^10 Kan 2 2,88 x 10^13 4,52 x 10^10 4,61 x 10^10 1,57 x 10^9 Kan 3 2,87 x 10^13 4,51 x 10^10 Amp 1 2,50 x 10^13 3,93 x 10^10 Amp 2 2,64 x 10^13 4,15 x 10^10 3,78 x 10^10 4,68 x 10^9 Amp 3 2,07 x 10^13 3,25 x 10^10
[00372] Os critérios de aceitação para os plasmídeos reprojetados (Kan) usados para a fabricação da Substância Farmacológica e do Produto Farmacêutico foram definidos como sendo não menos do que quatro vezes o rendimento dos plasmídeos de controle. As versões Kan reclonadas dos plasmídeos cumpriram os critérios de aceitação. Com base no rendimento semelhante de DRP obtido e na confirmação da sequência, os plasmídeos contendo KanR são considerados adequados para a produção de lotes clínicos de Construto de AAV2. Exemplo 4: Mudança na Linhagem Celular do Banco de Células Principal para HEK-293 de ATCC
[00373] Para os dados fornecidos abaixo, as medições são feitas a partir de um ou mais lotes de Construto de AAV2, em que o Construto é idêntico em todos os lotes. Materiais e Procedimentos de Estudo
[00374] A linhagem celular do Processo Original 1 usada para a produção do lote de GMP pelo processo original serviu como o controle para a eficiência de transfecção e rendimento do vetor de Construto de AAV2. A passagem contínua e o novo teste para rendimento e eficiência de transfecção não foram avaliados anteriormente para as células usadas do Processo Original 1 e o teste é apenas para informação. Os experimentos para eficiência de transfecção, análise de rendimento e cinética de crescimento foram realizados a partir dos mesmos eventos de descongelamento de células e todas as células receberam os mesmos tratamentos, meios, reagentes e condições de crescimento ao longo do experimento de triagem.
[00375] Linhagens de células testadas: ATCC = [HEK-293] (ATCC® CRL-1573TM), Bioreliance = 293 células (G95001 2), linhagens de células do Processo 1 e 293T = 293T/17 [HEK 293T/17] (ATCC® CRL- l 1268TM). Digno de nota, a linhagem celular 293T foi incluída como fonte alternativa.
[00376] Para eficiência de transfecção e análise de rendimento, as monocamadas de cada linhagem de células foram transfectadas com os plasmídeos relevantes e realimentadas 16 a 26 horas após a transfecção. A coleta de células e meios para análise de GFP ou Construto de AAV2 DRP foi conduzida 44 a 52 horas após a transdução.
[00377] A cinética de crescimento foi avaliada semeando frascos
T175 com 10^7 ou 2,5 x 10^6 células/frasco e a saúde celular, confluência, contagem de células e viabilidade registradas nos dias 1, 2, 3, 4 e 7 após a semeadura. Isso foi repetido em uma passagem ≥15. Resultados
[00378] Intensidade de Fluorescência Média: A intensidade de fluorescência média foi analisada por meio de citometria de fluxo para medir os níveis de expressão da proteína GFP juntamente com o número de células transfectadas como um indicador da expressão geral do gene em correlação com o rendimento viral.
[00379] Tabela 26: Resultados para Intensidade de Fluorescência Média GFP Médio/Amostra Linhagem Celular GFP Médio Rep 1 Rep 2 Rep 3 Experimento 1 ATCC 40.935 39.347 35.525 38.602 Experimento 1 de
24.934 24.569 23.033 24.179 Bioreliance Experimento 1 de
34.217 33.151 37.010 34.793 Controle MCB 293T 30.508 29.768 33.665 31.314 Experimento 2 de ATCC 32.722 36.068 32.656 33.815 Experimento 2 de
24.224 23.060 22.072 23.119 Bioreliance Experimento 2 de
45.604 50.686 44.817 47.036 Controle de MCB
[00380] Porcentagem de GFP: A porcentagem de células positivas de GFP, conforme determinado por citometria de fluxo, é mostrada nas Figuras 13 e 14.
[00381] Análise de rendimento de Construto de AAV2: Os resultados do ensaio de título de DRP foram gerados para análise comparativa frente a frente do rendimento do Construto de AAV2 nas células colhidas + meios para cada tratamento (1-Stack) por análise qPCR.
[00382] O critério de aceitação para que uma linhagem celular fosse adequada para uso na fabricação clínica foi considerado uma diferença de não mais do que quatro vezes o controle (células do Processo Original 1) por tratamento. Experimento 1 (Exp1) foi realizado na passagem celular 7 e Experimento 2 (Exp2) na passagem 15. Tabela 27: Resultados da Análise de Rendimento do Construto de AAV2 DRPs de Rendimento Média Diferença em Linhagem Rendimento Intervalo Vezes a partir Celular Rep 1 Rep 2 Rep 3 Médio DRP/cm² do Controle ATCC Exp1 1,23 x 10^13 1,17 x 10^13 1,01 x 10^13 1,14 x 10^13 1,79 x 10^10 2,28 x 10^12 2,77 Bioreliance 1,70 x 10^12 1,33 x 10^12 1,21 x 10^12 1,41 x 10^12 2,22 x 10^09 4,85 x 10^11 22,27 Exp1 Exp1 de Controle de 2,84 x 10^13 2,60 x 10^13 4,01 x 10^13 3,15 x 10^13 4,95 x 10^10 1,41 x 10^13 N/A
MCB 293T 1,96 x 10^13 2,21 x 10^13 7,29 x 10^12 1,63 x 10^13 2,56 x 10^10 1,48 x 10^13 1,93 Exp2 de ATCC 1,50 x 10^13 1,46 x 10^13 1,40 x 10^13 1,45 x 10^13 2,29 x 10^10 9,70 x 10^11 2,16 Exp2 da 1,74 x 10^12 1,98 x 10^12 2,06 x 10^12 1,93 x 10^12 3,03 x 10^9 3,12 x 10^11 16,30 Bioreliance Experimento 2 de Controle de 3,99 x 10^13 1,94 x 10^13 3,49 x 10^13 3,14 x 10^13 4,94 x 10^10 2,05 x 10^13 N/A
MCB
[00383] Cinética de crescimento: a cinética de crescimento foi avaliada registrando contagens de células e viabilidade de frascos T175, semeados em duas densidades simultaneamente, nos dias 1, 2, 3, 4 e 7 após a semeadura. Cada experimento consistiu em duas repetições em passagens consecutivas. A experiência 1 foi realizada na passagem 7 e repetida na passagem 8 a partir do descongelamento. A experiência 2 foi realizada na passagem 15 e repetida na passagem 16 a partir do descongelamento. A quantidade e a porcentagem de células viáveis foram determinadas por coloração com azul de tripano.
Tabela 28: Resultados para a cinética de crescimento Experiência de Contagem de Células 1, Passagem 7 Dias Após a Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 7 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 7 Semeadura Densidade de 2,50 x 10^6 1,00 x 10^7 Semeadura 4,20 x 2,10 x 1,49 x 1,90 x 3,80 x 1,90 x 3,30 x 5,53 x 1,60 x 9,20 x
ATCC 10^5 10^5 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 2,70 x 2,70 x 2,47 x 3,08 x 4,00 x 3,10 x 4,80 x 4,35 x 3,35 x 8,70 x
MCB 10^5 10^5 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 1,40 x 1,10 x 1,16 x 2,68 x 3,70 x 1,30 x 1,40 x 5,40 x 2,05 x 6,70 x Bioreliance 10^5 10^5 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 5,00 x 2,90 x 3,52 x 5,20 x 6,10 x 1,80 x 3,60 x 6,40 x 9,70 x 9,30 x 293T 10^5 10^5 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 Experiência de Contagem de Células 1, Passagem 8 Dias Após a Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 7 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 7 Semeadura Densidade de 2,50 x 10^6 1,00 x 10^7 Semeadura 9,50 x 1,60 x 1,60 x 4,40 x 2,10 x 7,45 x 4,60 x 9,30 x 1,30 x 2,50 x
ATCC 10^4 10^5 10^5 10^5 10^6 10^5 10^5 10^5 10^6 10^6 3,70 x 9,30 x 2,70 x 4,60 x 4,10 x 1,90 x 2,70 x 5,10 x 4,10 x 4,70 x
MCB 10^5 10^5 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 1,40 x 1,20 x 5,90 x 2,20 x 5,30 x 7,60 x 1,50 x 3,40 x 4,90 x 6,00 x Bioreliance 10^5 10^5 10^5 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 3,60 x 1,10 x 3,00 x 6,00 x 7,30 x 1,80 x 3,40 x 7,80 x 1,10 x 7,10 x 293T 10^5 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10 ^6 10^7 10^6 Experiência de Contagem de Células 2, Passagem 15 Dias Após a Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 7 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 7 Semeadura Densidade de 2,50 x 10^6 1,00 x 10^7 Semeadura 2,90 x 3,10 x 2,10 x 1,50 x 4,30 x 1,20 x 2,80 x 3,10 x 6,50 x 7,80 x
ATCC 10^5 10 ^ 5 10^5 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10 ^6 5,10 x 7,00 x 3,20 x 4,40 x 4,20 x 1,70 x 5,60 x 3,60 x 4,40 x 5,40 x
MCB 10^5 10^5 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 3,80 x 3,50 x 1,50 x 2,10 x 5,70 x 1,30 x 2,90 x 5,50 x 6,20 x 8,20 x Bioreliance 10^5 10^5 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 Experiência de Contagem de Células 2, Passagem 16 Dias Após a Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 7 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 7 Semeadura Densidade de 2,50 x 10^6 1,00 x 10^7 Semeadura 1,50 x 1,20 x 2,20 x 4,00 x 7,00 x 1,10 x 2,50 x 5,60 x 5,40 x 6,80 x
ATCC 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 4,80 x 2,20 x 3,40 x 2,20 x 4,90 x 2,70 x 8,80 x 4,20 x 3,30 x 5,00 x
MCB 10 ^ 5 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 1,40 x 3,00 x 2,00 x 3,40 x 8,90 x 1,40 x 2,80 x 3,80 x 7,20 x 1,10 x Bioreliance 10^5 10^5 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^6 10^7
Porcentagem de Viabilidade do Experimento 1 Passagem 7 Dias Após a Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 7 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 7 Semeadura Densidade de 2,50 x 10^6 1,00 x 10^7 Semeadura ATCC 94% 100% 98% 100% 99% 87% 99% 98% 99% 99% CMF/MCB 96% 95% 99% 89% 99% 97% 100% 97% 86% 100% Bioreliance 93% 96% 100% 94% 100% 91% 99% 97% 89% 99% 293T 96% 98% 99% 97% 100% 91% 100% 98% 97% 100% Porcentagem de Viabilidade do Experimento 1 Passagem 8 Dias Após a Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 7 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 7 Semeadura Densidade de 2,50 x 10^6 1,00 x 10^7 Semeadura ATCC 95% 94% 100% 95% 94% 99% 97% 95% 93% 94% CMF/MCB 100% 98% 92% 96% 96% 100% 100% 96% 92% 94% Bioreliance 100% 100% 95% 96% 99% 100% 98% 99% 94% 99% 293T 100% 99% 95% 96% 99% 100% 100% 97% 98% 98% Porcentagem de Viabilidade do Experimento 2 Passagem 15 Dias Após a Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 7 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 7 Semeadura Densidade de 2,50 x 10^6 1,00 x 10^7 Semeadura ATCC 95% 98% 73% 91% 87% 98% 98% 67% 89% 85% CMF/MCB 96% 100% 90% 86% 82% 93% 96% 55% 83% 90% Bioreliance 100% 100% 95% 97% 84% 96% 99% 90% 92% 92% Porcentagem de Viabilidade do Experimento 2, Passagem 16 Dias Após a Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 7 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 7 Semeadura Densidade de 2,50 x 10^6 1,00 x 10^7 Semeadura ATCC 98% 81% 90% 96% 82% 89% 90% 97% 87% 76% CMF/MCB 96% 83% 93% 96% 85% 94% 83% 92% 78% 81% Bioreliance 94% 67% 95% 98% 93% 96% 91% 91% 97% 89%
[00384] Todas as quatro linhagens de células expressaram GFP em níveis consistentes com aqueles esperados para uma boa eficiência de transdução com base na experiência anterior em relação à análise de rendimento correlacionada. As duas linhagens de células de ATCC, HEK293 (CRL-1573) e 293T (CRL-11268) exibiram bom crescimento celular e expansão a partir do descongelamento. É notável que a linhagem celular Bioreliance teve um crescimento inicial mais lento e expansão com pior saúde celular geral em relação às outras linhagens de células e controle. A linhagem celular Bioreliance também falhou em atender aos critérios de aceitação de rendimento dentro de quatro vezes do controle para ambos os experimentos onde ambas as linhagens de células ATCC caíram dentro dos critérios de aceitação mínimos.
[00385] Para a produção adicional do vetor de Construto de AAV2, a linhagem celular ATCC HEK293 (CRL-1573) foi escolhida com base nos resultados apresentados acima para modalidades exemplificativas dos processos de fabricação da descrição. Exemplo 5: Desenvolvimento Analítico do Processos de Fabricação
[00386] Para os dados fornecidos abaixo, as medições são feitas a partir de um ou mais lotes de Construto de AAV2, em que o Construto é idêntico em todos os lotes.
[00387] Como parte da estratégia de transferência do processo de fabricação original para um aprimorado, uma estratégia analítica foi desenvolvida em paralelo. Sempre que possível, os métodos desenvolvidos para o processo original foram transferidos para o processo aprimorado ou para o processo de próxima geração. Tabela 29: Resumo dos Métodos Analíticos Resumo da Testes Realizados Processo Original Processo Aprimorado Comparabilidade dos Métodos Testes Gerais Cor, aparência e Cor, aparência e Métodos não Aparência clareza Método clareza Método significativamente diferentes compendial EP/USP compendial EP/USP Phmetro Método Phmetro Método Métodos não pH compendial EP/USP compendial EP/USP significativamente diferentes Depressão do ponto de Depressão do ponto de Métodos não Osmolalidade congelamento. Método congelamento. Método significativamente diferentes compendial EP/USP compendial EP/USP Conteúdo qPCR usando vetor de qPCR usando vetor de plasmídeo plasmídeo Métodos não Título Físico superenrolado usado superenrolado usado significativamente diferentes. como padrão. como padrão.
Resumo da Testes Realizados Processo Original Processo Aprimorado Comparabilidade dos Métodos Testes Gerais Cultura de células com Cultura de células com Métodos não Título Infeccioso critério de avaliação de critério de avaliação de significativamente diferentes. qPCR. qPCR. Razão de Título
NA NA NA Físico:Infeccioso NA - não determinado no Kit ELISA comercial - Partículas Totais NA material clínico do processo Progen, Cat# PRATV original NA - não determinado no Microscopia eletrônica Razão de Cheio:Vazio NA material clínico do processo de transmissão original Identidade Sequenciamento de Sequenciamento de DNA DNA Métodos não DNA de Identidade significativamente diferentes.
Potência Transdução celular com expressão de construto Expressão Proteica e NA - não determinado no e atividade de substrato Atividade do NA material clínico do processo medida por Western Construto original Blot. ELISAs para o construto e o substrato. Pureza e Impurezas Efeito de matriz observado no tampão em massa purificado e no tampão do produto final Ensaio Micro-BCA - Ensaio Micro-BCA - durante a validação do tudo quantificado em após a precipitação da Proteína total processo aprimorado. Etapa relação à calibração proteína para remover o de precipitação de proteína BSA em PBS. efeito da matriz. (acetona) introduzida no ensaio aprimorado para abordar o efeito de matriz Métodos não significativamente diferentes. Gel carregado por partículas SDS-PAGE SDS-PAGE totais medidas por um Pureza método ELISA validado em vez de partículas totais medidas por Micro-BCA não validado para aprimorar a quantificação. Métodos não rcAAV qPCR qPCR significativamente diferentes. Kit ELISA comercial - Kit ELISA comercial - Proteína da célula Métodos não Cygnus Número de Cygnus Número de hospedeira significativamente diferentes. Catálogo F650 Catálogo F650
Resumo da Testes Realizados Processo Original Processo Aprimorado Comparabilidade dos Métodos Testes Gerais NA - não determinado no DNA total N/A Ensaio Picogreen material clínico do processo original Tamanho e quantidade medidos de 3 amplicons diferentes, enquanto o processo aprimorado mede hcDNA total, incluindo alto peso molecular e DNA DNA da célula Kit de ensaio Life fragmentado. Os dados de Método Personalizado hospedeira Technologies qualificação do processo aprimorado demonstram que o ensaio é específico e suficientemente sensível para atender aos requisitos de avaliação de hcDNA por dose <10 ng/dose. Métodos não Kit ELISA comercial - Kit ELISA comercial - significativamente diferentes. Bethyl Laboratories, Alpha Diagnostic, Ambos os kits têm um nível BSA Residual Inc., Número de Número de Catálogo adequado de sensibilidade e Catálogo E10-113 8100 especificidade para atender às especificações do produto Kit ELISA comercial - Kit ELISA comercial - Métodos não Benzonase Residual EMD Millipore (Merck), Merck, Número de significativamente diferentes. Cat. # 1.01681.0001 Catálogo 1.01681.0001 Novo IPC adicionado. NA - Kit ELISA comercial, AVB Residual NA não determinado no material Life Technologies clínico do processo original Segurança Método compendial Método compendial Métodos não Esterilidade EP/USP EP/USP significativamente diferentes. Método compendial Método compendial Métodos não Biocarga EP/USP EP/USP significativamente diferentes. Método compendial Método compendial Métodos não Endotoxina EP/USP EP/USP significativamente diferentes. NA = Não aplicável
[00388] Os ensaios de rcAAV original e aprimorado utilizam células renais embrionárias humanas (HEK293) que são infectadas com diluições do Construto de AAV2 ou AAV do tipo selvagem (wt) como controle. As células são então co-infectadas com adenovírus serótipo 5 (Ad5) para fornecer funções auxiliares para rcAAV (se presente). No efeito citopático máximo (CPE), as células são lisadas. Isso constitui o fim da passagem 0 (P0) do vetor. Na passagem 1 (amplificação 1), uma porção dos lisados P0 é usada para inocular células HEK293 co- infectadas com e sem Ad5. As células sem Ad5 servem para determinar o nível de entrada de DNA nas células, enquanto as células com Ad5 permitem a amplificação do construto de rcAAV2, ou AAV wt no caso dos controles. No ensaio Original, quando as amostras positivas para Ad5 atingem o CPE máximo após a primeira amplificação, as células são analisadas por PCR. No ensaio melhorado, a etapa de lise/amplificação celular é realizada um total de 3 vezes antes da análise de PCR.
[00389] O ensaio foi validado como um teste limite do processo aprimorado. Nem o lote clínico original nem o lote de manipulação foram analisados como parte desta validação, portanto uma comparação direta dos resultados obtidos não é possível. O ensaio original não foi validado. Em conclusão, os dois métodos fornecem resultados que não são significativamente diferentes.
[00390] As medições de hcDNA do processo Original e Aprimorado usam qPCR no instrumento Taqman. O ensaio Original mediu três amplicons diferentes (102, 401 e 765 bp) com uma sensibilidade (LOD) de 20 pg/mL para cada amplicon. O ensaio usado pelo processo aprimorado tem um único amplicon e uma sensibilidade (LOQ) de 1,3156 ng/mL. Não foi realizada uma comparação direta dos métodos, no entanto, o método hcDNA foi posteriormente qualificado e demonstrou ser adequado para o propósito. Portanto, não há impacto adverso na avaliação da comparabilidade.
[00391] BSA residual foi medido pelo Processo Original usando um kit ELISA comercialmente disponível de Bethyl Laboratories, Número de Catálogo E10-113. A sensibilidade desse kit, usado no processo Original, foi de 12,6 ng/mL. Um kit ELISA disponível comercialmente, Alpha Diagnostics, Número de Catálogo 8100, é usado no processo aprimorado. Este kit não foi validado, mas a sensibilidade é definida como o padrão de calibração mais baixo, ou seja, 1 ng/mL. Os fabricantes dos anticorpos primários usados em ambos os kits afirmam que os anticorpos primários são específicos para a detecção de BSA humana. Não foi realizada uma comparação direta dos métodos; no entanto, todos os lotes testados com os dados demonstraram níveis muito baixos de BSA residual (abaixo da sensibilidade do método).
[00392] Portanto, concluiu-se que todos os lotes contêm níveis comparativamente baixos de BSA residual.
[00393] Além disso, como a BSA pode causar reações alérgicas em humanos, a Organização Mundial da Saúde (OMS) estabeleceu uma orientação de 50 ng ou menos de BSA residual por dose de vacina. Por exemplo, para uma dose de Construto de AAV2 de 100 µL, o limite de concentração de BSA seria 500 ng/mL. Ambos os testes do kit ELISA usados nos processos Original e Aprimorado têm níveis de sensibilidade abaixo desse limite exigido e, portanto, são considerados comparáveis na medição de BSA residual dentro de limites aceitáveis. Título Infeccioso
[00394] O teste de título infeccioso foi transferido do processo Original para o processo aprimorado. Tanto a parte da cultura de células do ensaio quanto a PCR foram realizadas como parte dessa transferência, seguindo o procedimento usado no Processo Original. O Construto de AAV2 (não GMP) (pelo processo Original) foi analisado em 3 ocasiões durante a transferência do ensaio e os resultados obtidos foram comparados com o título infeccioso, 2,90 x 1010 IU/mL. Os dados obtidos são fornecidos na Tabela 30.
Tabela 30: Ensaio de título infeccioso Resultado Amostra Aprovado/Reprovado (IU/mL) Ocasião 1 4,31 x 10^10 Aprovado Ocasião 2 9,28 x 10^10 Aprovado Ocasião 3 3,56 x 10^10 Aprovado Média 5,72 x 10^10 - Desvio padrão 3,11 x 10^10 - Precisão (% CV) 54,4 -
[00395] Os dados obtidos no estudo de transferência do ensaio não são significativamente diferentes, ou seja, dentro de um intervalo de 4 vezes o resultado obtido no processo Original.
[00396] O construto de AAV (não GMP) produzido pelo processo Original foi analisado em 3 ocasiões de acordo com o processo aprimorado e os resultados são fornecidos na Tabela 31 em relação ao título relatado (4,95 x 10^12 DRP/mL)(Processo Original). Os dados foram considerados aceitáveis se estivessem dentro de um intervalo de 3 vezes o resultado relatado de acordo com o processo Original. Tabela 31: Ensaio de Título Físico - Dados de Comparabilidade Amostra Resultado (IU/mL) Aprovado/Reprovado Ocasião 1 9,57 x 10^12 Aprovado Ocasião 2 7,99 x 10^12 Aprovado Ocasião 3 7,75 x 10^12 Aprovado Média 8,44 x 10^12 - Desvio padrão 9,888 x 10^11 - Precisão (% CV) 10,3 -
[00397] O ensaio foi subsequentemente validado e os valores adicionais na Tabela 32 foram obtidos para o material do Construto de AAV (não GMP) (do processo Original) (resultados de diluição 1000 e
10.000 apenas). Tabela 32: Resultados do título físico (validação pós-ensaio) para o Construto de AAV (não GMP) (Processo Original) Ensaio de Resultado Aprovado/Reprovado Validação (IU/mL) 2a 6,11 x 10^12 Aprovado 2b 1,50 x 10^13 Aprovado 7 1,72 x 10^12 Aprovado 6,93 x 10^12 10 4,60 x 10^12 Aprovado 4,98 x 10^12 3,57 x 10^12 11 3,47 x 10^12 Aprovado 3,15 x 10^12 7,99 x 10^12 12 8,55 x 10^12 Aprovado 8,66 x 10^12 Média 6,23 x 10^12 - Desvio padrão 3,574 x 10^12 - Precisão (% CV) 57,4 -
[00398] O material do Construto de AAV2 (não GMP) (a partir do Processo Original) é rotineiramente analisado na análise de amostra DS e DP como um controle de referência interno (referência primária) com critérios de aceitação de adequação do sistema definidos como uma diferença de 3 vezes do título nominal (4,95 x 10^12 DRP/mL) (determinado pelo processo Original) para garantir o desempenho comparável contínuo do método. Exemplo 6: Comparação de Composições Geradas por Processo Aprimorado
[00399] Para os dados fornecidos abaixo, as medições são feitas a partir de um ou mais lotes de Construto de AAV2, em que o Construto é idêntico em todos os lotes.
[00400] Para demonstrar que as alterações/otimizações do processo de mudança (para o Processo 1 para gerar o Processo 2) não afetaram os atributos críticos de qualidade do material vetorial produzido, foi realizada uma Avaliação de Comparabilidade.
[00401] Uma vez que as alterações do processo foram feitas nas células, plasmídeos, condições de transfecção, coluna de cromatografia de afinidade, escala e recipiente final, e o trabalho de otimização foi concluído com relação ao Processo 1, um novo processo para a fabricação do material da Fase Clínica 3 foi definido e um lote de 'manipulação' em escala real realizado para medir o desempenho do processo e a equivalência da Substância Farmacológica e do Produto Farmacêutico ao material produzido pelo processo Original.
[00402] As análises abaixo comparam os dados gerados a partir do lote de manipulação em escala real e os lotes de GMP do processo aprimorado ao lote de manipulação e material clínico gerado pelo processo Original.
[00403] Um lote de manipulação produzido pelo processo Original (Construto de AAV2 (não GMP)), para o qual testes adicionais foram realizados (consulte a Tabela 33 abaixo) para fornecer informações para comparação com o lote de manipulação produzido pelo processo Aprimorado.
Tabela 33: Comparação de lotes do Construto de AAV2 (não GMP) produzidos por processos Original e Aprimorado Processo Processo Processo Processo Processo Aprimorado: Aprimorado: Original: Lote Original: Testes Aprimorado: lote GMP G214/ lote GMP G214/ Clínico Construto de Realizados Construto de AAV2 (Construto de (Construto de (Construto de AAV2 (não (não-GMP) AAV2) lote 1 AAV2) lote 2 AAV2) GMP) 0 CFU/0,410 mL 0 CFU/0,552 mL TAMC <8,0 TAMC <2,01 TAMC 0 CFU/mL* (pré-filtração em (pré-filtração em CFU/mL* CFU/mL Biocarga TYMC 0 CFU/mL* massa massa TYMC <8,0 TYMC <2,01 formulada) formulada) CFU/mL* CFU/mL Endotoxina 0,79 EU/mL <1 EU/mL <1 EU/mL <0,054 EU/mL <0,050 EU/mL 1,86 x 10^11 1,06 x 10^12 9,57 x 10^11 8,71 x 10^11 4,95 x 10^12 Título físico*** DRP/mLⱡ DRP/mL DRP/mL DRP/mL DRP/mL 2,4 x 10^10 2,9 x 10^10 Título Infeccioso 2,00 x 10^9 IU/mL 4,3 x 10^9 IU/mL 5,2 x 10^9 IU/mL IU/mL IU/mL Razão de Título 93:1 247:1 184:1 36:1 171:1 Físico:Infeccioso 2,7 x 10^11 1,9 x 10^12* 1,9 x 10^12* Partículas Totais ND ND capssídeos/mL capsídeos/mL capsídeos/mL Razão de 5,7:1* 0,96:1* 8,1:1* 9:1** 25:1ⱡⱡ Cheio:Vazio Proteína total <LOQ 22 µg/mL* 16 µg/mL* 28,979 µg/mL 29,434 µg/mL Pureza = 93,238% Impureza 1: 52,33 kDa e Sem impurezas 1,656% detectáveis (a Pureza = 100% Impureza 2: amostra apresenta Pureza = 100% Pureza = 100% Sem 47,05 kDa e Pureza as bandas Sem impurezas Sem impurezas impurezas 1,805% específicas das detectáveis detectáveis detectáveis Impureza 3: proteínas VP1, VP2 45,01 kDa e e VP3) <1% Impureza 4: 35,14 kDa e 1,693% Nenhum rcAAV <10 IU de rcAAV <10 IU de <10 IU de rcAAV2 detectável em rcAAV <LOD do Ensaio em 1,0 x 10^10 rcAAV em 1,0 em 1 x 10^10 DRP**** 1 x 10^7 DRP DRP x 10^11 DRP com LOD de 3,3 IU
A sequência de A sequência de A sequência do DNA disponível DNA disponível construto que A sequência de corresponde à corresponde à codifica o cDNA Corresponde à DNA DNA de sequência sequência corresponde à sequência corresponde à Identidade correta correta sequência esperada esperada sequência (sequência (sequência (sequência completa correta completa não completa não não disponível) * obtida) obtida) Proteína da célula <LOD <LOD (10 <4 ng/mL <8 ng/mL <8 ng/mL hospedeira <4 ng/mL ng/mL*) 102bp: 1612pg/1 x 102 bp: 4,41 x 10^9 DRP 10^4 pg/mL 401 bp: 1204 DNA da célula <6,58 x 10^3 <6,58 x 10^3 401 bp: 3,79 x 0,53 ng/mL pg/1 x 10^9 hospedeira pg/mL* pg/mL* 10^4 pg/mL
DRP 765 bp: 2,74 x 765bp: 10^4 pg/mL 832pg/1 x 10^9
DRP 102 bp: 4,41 x 102 bp: 7,98 x DNA da célula 10^4 pg/mL 10^6 pg/mL hospedeira <LOQ <LOQ (6,58 x 401 bp: 3,79 x 401 bp: 5,96 x (unidades 530 pg/mL (<6,58 x 10^3 10^3 pg/mL)* 10^4 pg/mL 10^6 pg/mL normalizadas pg/mL)* 765 bp: 2,74 x 765 pb: 4,12 x para pg/mL) 10^4 pg/mL 10^6 pg/mL <LOD <LOD BSA Residual 4 ng/mL <12,6 ng/mL <12,6 ng/mL (<1 ng/m)L)* (<1 ng/mL)* Benzonase <LOD <0,2 ng/mL <0,4 ng/mL* <0,5 ng/mL <0,5 ng/mL residual (<4 ng/mL)* 402 mOsm/kg 408 mOsm/kg 400 mOsm/kg 408 mOsm/kg Osmolalidade 408 mOsm/kg H2Oⱡ H2O H2O H2O H2O pH 8,0 ⱡ pH 8,0 pH 7,9 pH 7,9 pH 8,0 Líquido incolor Líquido límpido Líquido límpido Líquido incolor claro Líquido límpido claro sem incolor, livre de incolor, livre de Aparência sem partículas incolor partículas partículas partículas visíveis visíveis visíveis visíveis Expressão Expressão Expressão Expressão Expressão Expressão proteica proteica de proteica de proteica de proteica de proteica de de construto construto construto construto construto construto detectadaⱡ ** detectada ** detectada ** detectada ** detectada ** Ligante AVB <0,088 ng/mL n/a n/a n/a n/a Residual (LOD)* ⱡ Teste Realizado no Produto Farmacêutico (recipiente final)
ⱡⱡ Testes realizados por ultracentrifugação analítica, não por microscopia eletrônica *Teste realizado em massa purificada (Substância Farmacológica) **Teste realizado usando análise não GMP ***Título físico relatado foi realizado de acordo com o processo original ****Analisado no estudo de validação de acordo com o processo aprimorado
[00404] Informações e dados analíticos adicionais
[00405] Título físico: O título físico alvo para o material clínico do Produto Farmacêutico preenchido (produto GMP) era 1 x 10^12 DRP/mL (produzido pelo processo Original). Para o lote de manipulação fabricado pelo processo Original (produto não GMP), não havia título alvo e Construto de AAV2 (não GMP) representava a Substância Farmacológica que seria diluída para a concentração de preenchimento alvo se este lote tivesse progredido para o Produto Farmacêutico. Para o Construto de AAV2 (não-GMP) produzido pelo processo aprimorado, a concentração alvo era de 1-2 x 10^12 DRP/mL. O título relatado de 1,87 x 10^11 DRP/mL para o Construto de AAV2 (não GMP) é menor do que o esperado, mas isso se deve ao volume mínimo de retenção na etapa final de ultrafiltração de fluxo tangencial (TFF2), limitando a extensão para qual a Substância Farmacológica final poderia ser concentrada. Especificamente, esta concentração incompleta resultou no lote sendo 6 vezes menos concentrado. Se o título físico e infeccioso for corrigido para esta diluição de 6 vezes, o título físico, o título infeccioso e as razões de título físico: infeccioso são semelhantes entre os lotes, conforme resumido na Tabela 34. O uso de um cartucho TFF de menor volume de retenção (menor) foi avaliado para atingir um fator de concentração mais alto.
Tabela 34: Comparação de Título Físico, Título Infeccioso e Razão de Título Físico:Infeccioso Processo Processo Processo Processo Aprimorado: Original: Original: Processo Aprimorado: Aprimorado: Testes Construto Lote Construto Construto de AAV2 (não lote GMP Realizados de AAV2 Clínico de AAV2 GMP) - lote 2 (Construto (não-GMP) - (Construto (não de AAV2) lote 1 de AAV2) GMP) Resultado Resultado corrigido para não diluição de 6 corrigido vezes 1,86 x 8,71 x 4,95 x 1,11 x 10^12 1,06 x 10^12 9,57 x 10^11 Título Físico 10^11 10^11 10^12 DRP/mL DRP/mL DRP/mL DRP/mL DRP/mL DRP/mL 2,00 x 2,4 x 2,9 x 1,2 x 10^10 4,3 x 10^9 5,2 x 10^9 Título Infeccioso 10^9 10^10 10^10 IU/mL IU/mL IU/mL IU/mL IU/mL IU/mL Razão de Título 93:1 93:1 247:1 184:1 36:1 171:1 Físico:Infeccioso
[00406] Pureza: A pureza é medida por análise com eletroforese em gel de SDS poliacrilamida reduzida corada com Sypro Orange. A Figura 16 mostra o perfil de pureza gerado para o lote de Construto de AAV2 (não GMP) produzido pelo processo aprimorado. Os dados mostram a presença das 3 proteínas do capsídeo viral (VP1, VP2 e VP3) sem impurezas adicionais detectadas.
[00407] Expressão Proteica do Construto: Antes da introdução de um ensaio quantitativo para a expressão proteica do construto (por meio de um método ELISA), a análise preliminar foi realizada usando um ensaio não GMP qualitativo. Este ensaio in vitro baseado em células, descrito abaixo, é capaz de medir tanto a expressão do Construto quanto a atividade biológica do Construto expresso em uma linhagem celular humana. O ensaio tem 3 componentes:  Cultura de células e transdução de vetor viral  Western blot para a detecção da expressão proteica do Construto
 Ensaio para a detecção da atividade proteica do construto
[00408] A cultura de células é realizada usando células HEK293 que são transduzidas com um título físico conhecido e comparável do vetor de Construto de AAV2. Estas células expressam a proteína do construto em um nível abaixo ou no limite daquele detectado neste ensaio, permitindo uma avaliação qualitativa comparativa da expressão aumentada da proteína de construto devido à transdução celular e expressão do vetor de Construto de AAV2. Após a transdução e incubação, os lisados celulares são coletados e a fração citosólica é usada em Western blot e em um ensaio in vitro para determinar a expressão e a atividade proteica do construto, respectivamente. A detecção de proteína é realizada usando um anticorpo monoclonal específico para a proteína de construto e os níveis de expressão são normalizados contra, por exemplo, a expressão intracelular de B-actina para fornecer uma análise semiquantitativa.
[00409] A Figura 17 mostra os dados que ilustram os resultados para a expressão do Construto e a atividade funcional após a transdução de células HEK293 em cultura com os lotes de manipulação dos processos original e aprimorado. A coloração para a proteína de construto é positiva para ambos os lotes e indica níveis aumentados de expressão proteica do construto em comparação com os níveis de expressão proteica do construto de linha de base observados em células 293 de controle não transduzidas. A detecção de um substrato da proteína de construto também é positiva para ambos os lotes e indica níveis aumentados de atividade com o substrato em comparação com os níveis basais observados em células 293 de controle não transduzidas. Além disso, os níveis de expressão do construto e atividade do substrato parecem comparáveis para ambas as execuções de manipulação original e aprimorada, demonstrando potência comparável para esses lotes. Os dados de lotes de GMP também mostram aumento na expressão e atividade do Construto.
[00410] Produto do Processo Otimizado:
[00411] Segurança: os dados de biocarga e endotoxina não indicaram problemas de segurança relacionados à introdução de novos contaminantes. Os lotes dos processos original e aprimorado não são significativamente diferentes nesse aspecto.
[00412] Impurezas: Os níveis de impurezas relacionadas ao processo (HCP, benzonase residual, BSA, Proteína Total) não foram significativamente diferentes para todos os lotes.
[00413] Algumas diferenças nos níveis de DNA da célula hospedeira (hcDNA) são observadas. A diferença entre o Construto de AAV2 (não- GMP) e Construto de AAV2 (GMP), ambos produzidos pelo processo original, pode ser devido ao fato de que o Construto de AAV2 (não- GMP) foi produzido em laboratórios não-GMP enquanto o Construto de AAV2 (GMP) foi produzido em salas limpas GMP onde há maior controle das etapas do processo, operações do processo, amostragem, testes e matérias-primas, permitindo a obtenção de resultados melhores e mais reprodutíveis. Além disso, um tempo de incubação mais longo após a transdução de plasmídeo de células foi usado para produzir o Construto de AAV2 (não-GMP); 72 horas da alimentação das células até a coleta em comparação com 23 horas para as células usadas para produzir o Construto de AAV2 (GMP). A incubação mais longa pode permitir que mais crescimento celular e mais hcDNA seja liberado por essas células.
[00414] Essas diferenças podem ser responsáveis pelas diferenças observadas nos níveis de hcDNA entre os 2 lotes de material produzidos pelo processo original.
[00415] Por outro lado, para o Construto de AAV2 (não-GMP) e os 2 lotes de GMP, todos produzidos pelo processo aprimorado, os níveis de hcDNA são muito mais baixos (530 pg/mL ou &lt;LOD respectivamente). No processo de produção dessas bateladas, existe uma etapa de purificação e polimento por cromatografia, que é capaz de remover DNA residual.
[00416] Características do produto: aparência, pH e osmolalidade não foram significativamente diferentes para todos as bateladas.
[00417] Características do vetor: as bateladas não-GMP e GMP produzidos pelo processo aperfeiçoado mostram a expressão do construto e atividade biológica comparáveis quando avaliadas em um ensaio não quantitativo. Essas bateladas também tinham pureza comparável as batelada geradas pelo processo original sem impurezas detectáveis.
[00418] Os dados sobre a razão de capsídeos vetoriais cheios e vazios são semelhantes, e os dados da expressão e atividade do construto apresentados acima confirmam que a razão de capsídeos vetoriais cheios e vazios na batelada (não-GMP) produzida pelo processo aperfeiçoado é equivalente a bateladas GMP produzidas pelo processo original e não impactam negativamente a capacidade do vetor de transduzir células humanas e demonstrar atividade biológica.
[00419] Os dados sobre a identidade (sequência de vetor) confirmam a homologia em toda a sequência para todos as bateladas sem mutações introduzidas. A identidade também é confirmada pela capacidade de detectar a expressão do construto in vitro e a atividade biológica, ambas as quais dependem de uma proteína do construto intacta e funcional flanqueada por AAV ITRs.
[00420] O AAV competente para replicação não foi detectado em nenhuma batelada. A presença de um rcAAV é improvável devido à natureza do plasmídeo e à genética do vetor, mas continuará a ser avaliada para qualquer batelada de GMP anterior à liberação para estudos clínicos para garantir a segurança do paciente.
[00421] Rendimento do processo:
[00422] A Tabela 35 resume o rendimento geral do processo do processo aperfeiçoado. Do dobro do número de 10 fábricas de celula de empilhamento (24 cf 12 para o processo Original), duas vezes o número de partículas de vírus (DRP) são feitas (6,7 x 10^13 cf 3,4 x 10^13 para o processo original). A recuperação geral do processo é menor, mas isso se deve em parte aos testes adicionais em processo e de controle de qualidade realizados durante o desenvolvimento do processo aperfeiçoado que não foi incluído durante a produção da batelada original. Tabela 35: Rendimentos Relativos ao Processo e Recuperação Processo Processo original: aperfeiçoado: Fabricante e Bateladas construto de construto de AAV2 AAV2 (Clínico) (não clínico) Vírus produzido (título 3,4 x 10^13 DRP 6,7 x 10^13 DRP físico total)* total total 12 fábricas de 24 fábricas de Escala de Fabricação celulares celulares Rendimento geral do Rendimento a Rendimento a 14%** processo 28% *O título físico relatado foi realizado usando o processo original **~10% é perdido nas amostras (IPC's, QC)
[00423] Com base nos dados apresentados acima, a batelada não clínica do Construto de AAV2 produzido a partir do novo processo otimizado é considerado comparável às bateladas não clínicas e clínicas geradas pelo processo original. Este processo foi usado para produzir a primeiro batelada de GMP, de acordo com o processo aperfeiçoado.
Exemplo 7: Robustez Aperfeiçoada da Cromatografia de Purificação AAV2
[00424] Todos os parâmetros de teste relacionados à qualidade e eficácia do produto foram avaliados após a introdução de AVB e não houve alteração detectável na qualidade ou no perfil de eficácia do produto derivado de cromatografia de AVB, conforme detalhado na Tabela 36 a Tabela 41.
[00425] Além disso, um novo método para a detecção de ligante AVB residual foi introduzido e não demonstrou nenhum ligante AVB detectável em qualquer material fabricado usando a coluna AVB Sepharose.
[00426] Sete execuções de manipulação AVB realizadas com material de colheita construto de AAV2 (Figura 2, Etapa 13) para avaliar a prevenção de agregação e o rendimento da etapa, 5 execuções em pequena escala (1,5 a 7L) e duas execuções em escala maior (16L). A etapa AVB teve um bom desempenho em todos os experimentos, com boa recuperação da etapa de 40-78% de rendimento (e com um rendimento médio de 64%). Nenhuma agregação significativa foi detectada em nenhum experimento. Após a cromatografia AVB, os níveis de impurezas potenciais ou contaminantes do processo foram todos baixos e em linha com os níveis demonstrados anteriormente e o produto final do vetor mostrou boa potência e títulos infecciosos. Em conclusão das execuções em escala reduzida com a etapa de purificação de AVB Sepharose, todos os resultados do ensaio (Tabela 36) mostram boa comparabilidade com o processo da Fase 1/2 Original (empregando a cromatografia de afinidade preenchida com matriz derivada de animal) e o processo inicial "aperfeiçoado" para o material clínico GMP do construto AAV2 (processo de troca aniônica UnoQ).
Tabela 36: Etapa de Purificação de Sepharose AVB - Resultados do Ensaio
Experiência AVB 10a 10b 11 12 13 14 15 Código de ID
0,7 x 0,8 x 1 x 10^12 10^12 10^12 Título Físico 1,4 x 1,6 x 1,87 x 2,2 x (2,0 x 10^12 10^12 10^12 (1,3 x (1,6 x 10^12 (DRP/mL) 10^12 em 10^12 em 10^12 em escala)* escala)* escala)*
Processo Global 12% 13% 11% 8% 6,5%** 9% 6% Recuperação (%)
Título de capsídeo 9,7 x 1,1 x 1,4 x 2,8 x 3,9 x 1,1 x 4,3 x 10^11 (cap/mL) 10^11 10^12 10^12 10^11 10^11 10^12
HCP residual (ng/mL) Todos os resultados abaixo do limite do ensaio de quantificação (<LOQ) Ligante AVB residual (ng/mL)
DLS*** (% volume) 98,1 99,2 96,1 99,2 99,2 98,6 99,4
*Título equivalente em escala completa **Rendimento corrigido para perda de um tubo de centrífuga***Método de R&D para avaliar a agregação Tabela 37: Etapa de Purificação de Sepharose AVB - Resultados do Ensaio
Título Potência (aumento de vezes vs Códio ID de células não transduzidas) Capsídeos Físico Título Experimento completos Infeccioso AVB (DRP/Ml) (%) Construto Substrato
Exp11 1,87 x 10^12 5,0 4,3 2,4 x 10^10 82% cheio
Exp12 1,0 x 10^12 4,8 16,9 Não testado 87% cheio
Exp13 0,7 x 10^12* 3,4 9,3 Não testado 78% cheio
Exp14 0,8 x 10^12 3,1 11,5 7,7 x 10^9 Sem dados
Exp15 2,2 x 10^12 4,7 15,4 8,4 x 10^9 70% cheio
Aumento >duas Aumento >duas <55% vazio vezes em vezes em Especi- (>45% >0,7 x 10^12 comparação comparação > 1,4 x 10^8 ficação capsídeos com o não com o não transduzido transduzido completos)
*volume da amostra não permitiu a concentração até o título final.
[00427] Após a demonstração da comparabilidade do produto e robustez do processo aperfeiçoado por execuções de desenvolvimento em pequena escala e lotes de produção em escala usando a etapa de cromatografia de afinidade AVB, GMP de construto AAV2 foi fabricado usando o processo AVB. Todos os resultados do teste analítico para este lote de GMP atenderam às especificações e expectativas.
[00428] Os resultados analíticos preliminares para a substância medicamentosa GMP de construto de AAV2 e o produto farmacêutico (produzidos pelo processo aperfeiçoado) estão resumidos abaixo na Tabela 38 e na Tabela 39. Todos os testes atendem às especificações e expectativas. Tabela 38: Resultados do Teste de Liberação Preliminar para GMP de Construto de AAV2 (do processo aperfeiçoado) Teste(s) Especificações Resultado Conclusão DNA HC <2,66 x10^7 pg/mL <6,58 x10^3 pg/mL Aprovado Segurança, <1 IU/mL endotoxinas < 5 IU/mL Aprovado (<0,05 IU/mL) bacterianas Título Físico > 0,7 x 10^12 DRP/mL 4,30 x 10^12 DRP/mL Aprovado Título Infeccioso > 1,24x 10^8 IU/mL 1,1x 10^10 IU/mL Aprovado DRP: Razão IU - <5645:1 391 Aprovado Cálculo Pureza > 90% sem nenhuma impureza > 2%. Pureza por As três bandas 100% Aprovado SDS-PAGE correspondentes a AAV2 VP1, VP2 e VP3 devem ser evidentes.
Corresponde à sequência Corresponde à sequência DNA de identidade de esperada com exceção esperada com exceção das Aprovado
AAV das regiões ITR regiões ITR < LOD do ensaio rcAAV < LOD do ensaio Aprovado (< 10 rcAAV por 1 x 10^10 vg)
Tabela 39: Resultados do Teste de Caracterização Preliminar para Substância Medicamentosa GMP do Construto de AAV2 do Processo Aperfeiçoado Teste de Caracterização Teste(s) Resultado Proteína total 16 µg/mL HCP < LOQ = <10 ng/mL BSA residual <1 ng/mL Benzonase residual <0,4 ng/mL Ligante AVB Residual <0,088 ng/mL (LOD) Razão de Partículas 89:11 Cheias/Vazias Partículas Totais 1,9 x 10^12 partículas/mL DNA total 328 ng/mL
[00429] O aperfeiçoamento do processo de purificação resultou na substância medicamentosa do construto de AAV2 comparável e robustez do processo aperfeiçoado em comparação com o processo e o produto do processo original.
[00430] Durante a fabricação pelo processo aperfeiçoado, a razão de partículas cheias e vazias é determinada como um teste de caracterização.
[00431] Potenciais impurezas relacionadas ao produto são fornecidas na Tabela 40.
Tabela 40: Potenciais impurezas Controle relacionadas ao produto Ensaio de AAV competente para AAV competente para replicação replicação* Maioria removida por purificação Partícula AAV vazia gradiente *Teste de liberação de substância medicamentosa.
[00432] Potenciais impurezas relacionadas ao processo e seu controle são dados na Tabela 41. Tabela 41: Potenciais impurezas Controle (Teste de Liberação de relacionadas ao processo Substância Medicamentosa) Benzonase ELISA de benzonase residual Endotoxina Ensaio de endotoxina - Cinética LAL Albumina de Soro Bovino BSA ELISA residual ELISA de proteína de célula hospedeira Proteína da célula hospedeira HEK293 DNA da célula hospedeira DNA da célula hospedeira HEK293 qPCR Análise de DNA de fita dupla residual de DNA total Picogreen Ligante AVB AVB ELISA residual Exemplo 8: Controle de substância medicamentosa
[00433] Para os dados fornecidos abaixo, as medições são feitas a partir de uma ou mais bateladas de Construto de AAV2, em que o construto é idêntico em todos as bateladas.
[00434] Validação de procedimentos analíticos: os resumos dos resultados da validação do método, quando disponíveis, são apresentados a seguir.
[00435] Título físico: Este ensaio foi validado para cumprir os seguintes critérios (ver Tabela 42). O "valor real" é um valor para um Construto de AAV2 exemplar da descrição. Tabela 42: Aprovado Parâmetro de Critérios de Aceitação Valor Real ou Teste Reprovado O % de CV usando valores de CT replicados de cada diluição da curva de calibração é ≤ 5% para a precisão inter e intraensaio (o valor de precisão inter-ensaio detalhado é baseado nos valores CT padrão de calibração. A Precisão <3,87% Aprovado precisão baseada na análise do controle de tendência do ensaio (GMP do construto de AAV2), usando a média de 1 em 1000 e 1 em 10.000 diluições, foi de 57,4% (n = 13 analisados em 7 execuções).
Nenhuma inibição O artigo de teste está dentro de observada no artigo Especificidade 3,3 (1 log) valores CT do padrão de teste na presença Aprovado e precisão apropriado de 1 µg de DNA humano r2 0,993 a 0,994 e um declive -3.21 a - r2 ≥ 0,98. O declive alvo da curva
3.48 para os ensaios de calibração para cada ensaio Linearidade e 1, 2b e 6 deve estar entre -3,0 a -3,8, Aprovado faixa r2 0,988 a 0,997 e indicando uma eficiência QPCR um declive de -3,17 de 83% a 115%. a -3,56 para os ensaios 7, 4 e 5 As eficiências de amplificação do Comparável na faixa Co-linearidade Aprovado vetor de plasmídeo super- de 5 x 10^5 enrolado e DNA viral são cópias/2,5 µL to 5 x comparáveis 10^2 cópias/2,5 µL, 100 cópias/2,5 µL e 50 cópias/2.5 µL Limite de Resultado do relatório 168,2 cópias/2,5 µL Aprovado Detecção Válido em faixas de 5 x 10^6 cópias/2, Limite de 5µL a 5 x 10^2 Resultado do relatório Aprovado Quantificação cópias/2,5 µL, 100 cópias/2,5 µL e 50 cópias/2,5 µL Reagentes: 0,24% a 2,78% com relação à % de CV usando valores de CT variação em Robustez replicados de cada diluição da Aprovado diferentes bateladas curva de calibração é ≤5%. de reagente.
Operadora: <3,06% % de CV usando valores de CT Preparação da replicados de cada diluição é ≤ mistura de <1,91% Aprovado 5% para as duas bateladas de reação mistura de reação preparados.
[00436] Razão DRP:IU - Cálculo: Nenhuma validação necessária. Valor determinado pelo cálculo do título físico e dados do ensaio de título de unidade infecciosa.
[00437] Partículas totais: o ensaio de partículas totais foi validado. Um resumo dos resultados da validação é apresentado na Tabela 43. O "valor real" é um valor para um Construto de AAV2 exemplar da descrição.
Tabela 43: Resumo da validação do ensaio de partículas totais Parâmetro de Critérios de Aprovado ou Valor Real Teste Aceitação Reprovado Precisão CV ≤ 20% CV ≤ 14% (n=4) Aprovado (Intra-Ensaio) Precisão CV ≤ 30% CV ≤ 28% (n=4) Aprovado (intermediária) Recuperação entre 106% e Recuperação 70 – 115% para resultados Precisão Aprovado 130% obtidos na diluição de duas a 16 vezes do padrão A amostra em branco A amostra em branco não não deve mostrar a Especificidade mostra a presença de Aprovado presença de partículas partículas (≤ 0,2 OD) (n = 20) (≤ 0,3 OD) De 1,88 x 10^8 Faixa Resultado do relatório capsídeos/mL a 14.5 x 10^8 Aprovado capsídeos/mL (n = 1) Linearidade r2 ≥ 0,98 r2 ≥ 0,99 (n = 1) Aprovado O LOD corresponde à placa Limite de Resultado do relatório baixa da curva de calibração Aprovado Detecção (n = 4) Limite de 0,7 x 10^8 capsídeo/mL (n = Resultado de relatório Aprovado Quantificação 4)
[00438] Razão Cheia:Vazia: Validação do ensaio específico do medicamento não realizada. Contagem de partículas de AAV2 cheias e vazias em imagens de microscópio de elétron de transmissão realizada em instalação compatível com GMP.
[00439] Identidade vetorial (DNA): validação do ensaio específico do medicamento não realizada. O sequenciamento de DNA é realizado usando métodos e equipamentos qualificados em uma instalação compatível com GMP.
[00440] Ensaio de proteína total: este ensaio foi validado para cumprir os seguintes critérios (ver Tabela 44). Tabela 44: Critérios de validação do ensaio de proteína total Parâmetro de Teste Critérios de Aceitação Precisão (Intra-Ensaio) CV ≤ 20% Precisão (intermediária) CV ≤ 30% Precisão Recuperação 70 – 130% Faixa Relatório do resultado Linearidade r2 ≥ 0,98 Limite de Detecção Resultado do relatório Limite de Quantificação Relatório de resultado
[00441] Ensaio de pureza (SDS-PAGE): o ensaio de pureza foi validado. Um resumo dos resultados da validação é apresentado (na Tabela 45). O "valor real" é um valor para um Construto de AAV2 exemplar da descrição. Tabela 45: Resumo de validação do ensaio de pureza Critérios de Aprovado ou Parâmetro de Teste Valor Real Aceitação Reprovado Precisão CV ≤ 10% ≤ 4% Aprovado (Intra-Ensaio) Precisão (intermediária) CV ≤ 15% ≤ 4% Aprovado Linearidade r2 ≥ 0,98 ≥ 0,99 Aprovado O limite de quantificação (por extrapolação) é de Limite de Quantificação e 1,4%. Resultado de relatório Aprovado Faixa Faixa de carregamento de 1 x 10^10 a 1 x 10^11 partículas/pista Nenhuma banda deve Nenhuma banda é ser detectada na pista Especificidade detectada no tampão de Aprovado onde a formulação de formulação tampão será carregada Uma variação na Sem efeito nos Robustez temperatura não afeta Aprovado resultados o resultado
[00442] AAVcompetente para replicação: o ensaio de AAV competente para replicação foi validado para cumprir os requisitos de validação relevantes, conforme especificado em ICH Q2(R1) para um teste de limite para impurezas (ver Tabela 46). Um resumo dos resultados da validação é apresentado abaixo. O "Valor real" é uma medição de um Construto de AAV2 exemplar da descrição. Tabela 46: Resumo de validação do ensaio AAV competente para replicação Parâmetro de Aprovado ou Critérios de Aceitação Valor Real Teste Reprovado Sinal positivo obtido Sinal positivo obtido apenas se adenovírus e o quando adenovírus e o Especificidade Aprovado AAV replicativo estiverem AAV replicativo estão presentes presentes Limite de ≤ 10 rcAAV2 em 1 x 10^10 ≤ 10 rcAAV2 em 1 x Aprovado detecção vetor DRP AAV 10^10 DRP
[00443] DNA total: o ensaio de DNA total foi validado. Um resumo dos resultados da validação é apresentado (ver Tabela 47). O "valor real" é fornecido é uma medição de um Construto de AAV2 exemplar da descrição. Tabela 47: Resumo de validação do ensaio de DNA total Aprovado ou Parâmetro de teste Critérios de Aceitação Valor Real Reprovado Precisão (Intra-Ensaio) CV ≤ 15% CV ≤ 9,0% (n = 6) Aprovado Precisão (intermediária) CV ≤ 20% CV ≤ 12,1% (n = 4) Aprovado Recuperação de pico Precisão (veracidade) 66 - 83% (n = 4) Aprovado dentro de 50 – 200% Faixa Resultado de relatório 0,1 a 1.0 ng/mL Aprovado Linearidade r2 ≥ 0,95 r2 ≥ 0,99 (n = 4) Aprovado Limite de Detecção Resultado de relatório 0,042 ng/mL (n = 4) Aprovado Limite de Quantificação Resultado de relatório 0,127 ng/mL (n = 4) Aprovado
[00444] DNA da célula hospedeira HEK293: o ensaio de DNA da célula hospedeira HEK293 foi qualificado (ver Tabela 48). Um resumo dos resultados da qualificação é apresentado a seguir. O "valor real" fornecido é uma medição de um Construto de AAV2 exemplar da descrição. Tabela 48: Resumo de qualificação de ensaio de DNA de célula hospedeira Critérios de Aprovado ou Parâmetro de Teste Valor Real Aceitação Reprovado Precisão Resultado de 24,81% Aprovado (Intra-Ensaio) relatório Precisão Resultado de 27,84% Aprovado (intermediária) relatório Faixa dentro de ± Recuperações Perfil de Precisão Aprovado 50% 77,87-107,6% Linearidade r2 ≥ 0,97 1,00 Aprovado Limite de Resultado de 0,6578-300,0 Aprovado Quantificação e Faixa relatório pg/µL Nenhuma amplificação detectada com E. Nenhuma coli ou se > amplificação Especificidade diferença de 5 vezes Aprovado detectada no valor de CT na com E. coli mesma concentração padrão de qualificação Resultado de 0,03-300 Veracidade Aprovado relatório pg/µL
[00445] Ensaio Biocarga: Este é um método compendial harmonizado para atender aos requisitos EP 2.6.12 e USP <61>. A qualificação/validação é conduzida de acordo com as monografias farmacopêicas relevantes.
[00446] Ensaio de endotoxina: este é um método compendial harmonizado para atender aos requisitos de EP 2.6.14 e USP <85>. A qualificação/validação é conduzida de acordo com as monografias relevantes da farmacopéia. Exemplo 9: Resultados da análise de batelada para composições fabricadas usando o processo 2
[00447] Para os dados fornecidos abaixo, as medições são feitas a partir de uma ou mais bateladas de construto de AAV2, em que o construto é idêntico em todos as bateladas.
[00448] Os dados de análise de batelada de 2 bateladas não-GMP e 2 GMP são apresentados abaixo na Tabela 50. Tabela 50: resultados do teste de controle de qualidade para a substância medicamentosa do construto de AAV2 fabricada de acordo com o processo 2 Construto de Construto de Construto de Construto de AAV2 (não- AAV2 (não- Número de lote AAV2 (GMP) AAV2 (GMP) GMP) – GMP) – – batelada 1 – batelada 2 batelada 1 batelada 2 Desenvolvimen- Uso Estabilidade Clínico Clínico to do processo Método de Critérios de Teste Resultados Teste Aceitação Caracterização vetorial Ensaio de Partícula Ensaio de Resistente a > 0,7 x 10^12 4,22 x 10^11 1,11 x 10^12 1,82 x 10^12 4,30 x 10^12 título físico DNase com DRP/mL DRP/mL*c DRP/mL DRP/mL DRP/mL (DRP) Base em qPCR (DRP) Ensaio de Infecção de título de células RC32 > 1,24 x 10^8 6,32 x 10^9 Sem 1,70 x 10^10 1,1 x 10^10 unidade seguida pela IU/mL IU/mL resultados***** IU/mL IU/mL infecciosa detecção de (IU) AAV2 por qPCR Razão DRP:IU – n/a < 5645:1 67:1 n/a 107:1 391:1 Cálculo
Construto de Construto de Construto de Construto de AAV2 (não- AAV2 (não- Número de lote AAV2 (GMP) AAV2 (GMP) GMP) – GMP) – – batelada 1 – batelada 2 batelada 1 batelada 2 Desenvolvimen- Uso Estabilidade Clínico Clínico to do processo Método de Critérios de Teste Resultados Teste Aceitação ELISA comercial Partículas > 0,49 x 10^12 2,7 x 10^11 1,2 x 10^12 3,2 x 10^12 1,9 x 10^12 de partículas Totais partículas/mL capsídeos/mL*** partículas/mL partículas/mL partículas/mL anti-AAV2 Microscopia Razão de <55% de eletrônica de 85:15 76:24 49:51 89:11 Cheia:Vazia partículas vazias transmissão Identidade Corresponde Corresponde Purificação do Corresponde à A sequência de à sequência à sequência Identidade DNA viral com sequência construto Não esperada esperada vetorial Sequenciamento esperada com corresponde à executada** com exceção com exceção (DNA) de DNA de exceção das sequência das regiões das regiões Ambas as Fitas regiões ITR esperada
ITR ITR Pureza e Impurezas Quantificação de Proteína proteína Micro- > 5µg/mL <LOQ*** 14 µg/mL 22 µg/mL 16 µg/mL total
BCA Pureza > 90% sem nenhuma Ensaio SDS- A amostra impureza > 2%. PAGE com apresenta as As três bandas impurezas bandas Pureza correspondentes 100% 100% 100% estimadas por específicas das a AAV2 VP1, análise de proteínas VP1, VP2 e VP3 intensidade VP2 e VP3 devem ser evidentes. AAV Amplificação Competente baseada em < LOD do < LOD de Não < LOD do < LOD do para células HEK293 ensaio ensaio**** executado** ensaio ensaio Replicação e qPCR Proteína de célula Kit ELISA <LOD (10 <80 ng/mL <4 ng/mL 10,5 ng/mL < 4 ng/mL hospedeira Comercial ng/mL) HEK293
Construto de Construto de Construto de Construto de AAV2 (não- AAV2 (não- Número de lote AAV2 (GMP) AAV2 (GMP) GMP) – GMP) – – batelada 1 – batelada 2 batelada 1 batelada 2 Desenvolvimen- Uso Estabilidade Clínico Clínico to do processo Método de Critérios de Teste Resultados Teste Aceitação Ensaio Resultado de DNA total 130 ng/mL 487 ng/mL 575 ng/mL 328 ng/mL Picogreen relatório DNA da célula Ensaio qPCR, hospedeira < 2,66 x 10^7 5,30 x 10^2 <6,58 x 10^3 < 6,58 x 10^3 < 6,58 x 10^3 Método res DNA HEK293 pg/mL pg/mL pg/mL pg/mL pg/mL SEQ Humana (quantidade e tamanho) BSA Kit ELISA < 126 ng/mL 4 ng/mL <1 ng/mL <1 ng/mL <1 ng/mL residual Comercial Benzonase Kit ELISA < 5 ng/mL <0,2 ng/mL <0,2 ng/mL <0,4 ng/mL <0,4 ng/mL residual Comercial Segurança 0 CFU/0,410 0 CFU TAMC: mL /0,552 mL Ensaio de Filtração por 0 CFU/mL Não < 1CFU/1% PB (pré-filtração (pré-filtração bioburden membrana TYMC: executado em massa em massa 0 CFU/mL formulada) formulada) Método cinético- Ensaio de Não cromogênico <5 EU/mL 0,79 EU/mL <1 EU/mL <1 EU/mL endotoxina executado quantitativo.
Notas de rodapé: (*) Análise realizada conforme Processo 1. (**) Não realizada para conservação de material para estudos de estabilidade. (***) Resultado não atende às especificações; especificação definida após a obtenção dos resultados. (****) Resultado obtido como parte da validação do ensaio. Título determinado pelo Processo 2 usando DNA de plasmídeo como padrão de ensaio (1,87 x 10^11 DRP/mL) usado em vez do valor físico do título relatado. (*****) O ensaio não atendeu aos critérios de validade. Amostra insuficiente para reanálise.
Exemplo 10: resultados da análise de batelada para composições fabricadas usando o processo 1
[00449] Para os dados fornecidos abaixo, as medições são feitas a partir de uma ou mais bateladas de construto de AAV2, em que o construto é idêntico em todos as bateladas.
[00450] Uma batelada clínica de GMP foi fabricado de acordo com o Processo 1. Os dados de análise de batelada a partir desta batelada de substância medicamentosa são fornecidos na Tabela 51. Tabela 51: resultados do teste de controle de qualidade Teste Critérios de Aceitação Resultados 1,46 x 10^12 DRP/mL (Dia 1) Ensaio de título físico (DRP) Resultado de relatório 1,92 x 10^12 DRP/mL (Dia 2) Quantificação de proteína Relatório de resultado 35,350 µg/mL Micro-BCA Determinação da pureza de Pureza > 90% sem Pureza = 100% sem impurezas AAV por eletroforese em gel nenhuma impureza> 2% detectáveis de SDS-poliacrilamida Ensaio in vitro para Nenhum detectado Nenhum detectado contaminantes virais 1 <8,0 CFU/mL Contagem total de < 1 CFU/1% de PBDS Ensaio de bioburden leveduras e Molde 8,0 CFU/mL (0,5% em cada mídia) Contagem microbiana aeróbia total Ensaio de endotoxina <5 EU/mL 0,234 EU/mL Ensaio de Micoplasma1 Nenhum detectado Negativo 1 Resultados do teste IPC. Exemplo 11: Estabilidade de Composições AAV
[00451] Alíquotas da substância medicamentosa do construto AAV2 são analisadas quanto à estabilidade de longo prazo para suportar a condição de armazenamento da substância medicamentosa do construto AAV2 de < -60°C. Este estudo aumenta os estudos de estabilidade acelerada e em tempo real do medicamento em andamento a -80°C, -20°C e 5°C.
[00452] A substância medicamentosa do construto AAV2 é dividida em alíquotas em pequenos recipientes (garrafas PETG com tampa de rosca de 5mL) representativos dos recipientes de substância medicamentosa do construto de AAV2 para garantir que recipientes suficientes estejam disponíveis para testes de estabilidade ao longo do tempo. Esses recipientes têm os mesmos materiais de contato com o produto e são escolhidos para melhor representar os recipientes finais da substância medicamentosa do construto de AAV2, com exceção da área de superfície para a razão de volume. Acredita-se que o menor volume e a maior razão entre a área de superfície e o volume nas alíquotas de pequenos recipientes representam o 'pior cenário' em relação à estabilidade de longo prazo da substância medicamentosa do construto de AAV2.
[00453] A substância medicamentosa do construto de AAV2 aliquotada é colocada a -80±10°C com umidade relativa ambiente.
[00454] Se alíquotas insuficientes de substância medicamentosa do construto de AAV2 estiverem disponíveis para completar o estudo de 36 meses completo, o estudo será truncado em um ponto de tempo anterior.
[00455] Um estudo de estabilidade de suporte reduzido foi iniciado usando material a partir de uma batelada de construto de AAV2 em pequena escala (não GMP). Este estudo usa alíquotas de 100 µl em criotubos de polipropileno de 2 mL armazenados a <-60°C. Acredita-se que o menor volume de preenchimento e a maior razão entre a área de superfície e o volume nas alíquotas do recipiente pequeno representam o "pior cenário" em relação à estabilidade a longo prazo da substância medicamentosa do construto de AAV2. O estudo avaliará a estabilidade da substância medicamentosa em pontos de tempo de 2, 6 e 12 meses. Detalhes adicionais deste estudo são apresentados a seguir. Exigências do Teste
[00456] Os ensaios foram selecionados para o protocolo de estabilidade primária com base na seguinte análise racional (ver Tabela 52)
Tabela 52: Testes usados para o protocolo de estabilidade de substância medicamentosa primária Teste Tipo de Teste Objetivo e análise racional/justificativa Para acumular dados sobre a aparência durante o Físico-Química programa de estabilidade. Mudanças na aparência Aparência (Visual) podem resultar a partir de uma mudança no produto, por exemplo, precipitação. Para acumular dados sobre o pH durante o Físico-Química programa de estabilidade. Mudanças no pH podem pH (medição com resultar de uma mudança no produto, por exemplo, eletrodo) degradação química. Para acumular dados sobre a pureza durante o Pureza por Pureza programa de estabilidade. Uma diminuição da SDS-PAGE pureza pode indicar degradação do produto. Para acumular dados sobre possível agregação Agregação por Integridade (perfil de tamanho de partículas) durante o programa
DLS de estabilidade. Título físico Para acumular dados sobre a quantidade de vetor (DRP) por Quantificação viral de rAAV durante o programa de estabilidade. qPCR Expressão do Para medir e acumular dados sobre a expressão do Construto e Atividade construto durante o programa de estabilidade. Atividade Vedação de Integridade do Verificar a integridade da vedação do contêiner no Recipiente recipiente final do programa de estabilidade.
[00457] Os ensaios foram selecionados para o protocolo de estabilidade de suporte para incluir título físico, pureza, partículas totais e potência conforme indicado na Tabela 53. Esses testes de estabilidade e pontos no tempo (Tabela 54 e Tabela 57) foram considerados os mais adequados para a quantidade de material disponível para a realização do estudo. Uma avaliação da agregação do vetor não foi incluída neste estudo, pois o método está atualmente em desenvolvimento para o material do vetor AAV2. A integridade do recipiente também foi excluída a partir do estudo por se tratar de um estudo de estabilidade de suporte reduzido.
Tabela 53: Testes usados para protocolo de estabilidade de substância medicamentosa de suporte Tipo de Objetivo e análise Teste Teste racional/justificativa Título físico Para acumular dados sobre a (DRP) por Quantificação quantidade de vetor viral de rAAV qPCR durante o programa de estabilidade.
Para acumular dados sobre a Partículas quantidade total de partículas do Quantificação Totais vetor viral durante o programa de estabilidade.
Para acumular dados sobre a pureza Pureza por durante o programa de estabilidade. Pureza SDS-PAGE Uma diminuição da pureza pode indicar degradação do produto.
Expressão do Para medir e acumular dados sobre Construto e Atividade a expressão do construto durante o Atividade programa de estabilidade.
Para medir e acumular dados sobre Atividade do Atividade a atividade do Construto expresso construto durante o programa de estabilidade.
Tabela 54: Protocolo de estabilidade e especificações de vida útil para estudo de estabilidade de substância medicamentosa primária de construto AAV2, armazenamento a -80ºC ± 10ºC Ponto de tempo (meses) Teste Especificação T0 T3 T6 T9 T12 T18 T24 T36 -80°C -80°C -80°C -80°C -80°C -80°C -80°C -80°C Aparência Resultado de relatório X - X - X X X X pH Resultado de relatório X - X - X X X X Pureza por Resultado de relatório X - X - X X X X SDS-PAGE Agregação Resultado de relatório X X X X X X X X por DLS Título físico (DRP) por Resultado de relatório X - X - X X X X qPCR Expressão do Construto e Resultado de relatório X X X X X X X X Atividade Vedação de Conforme - - - - - - - X Recipiente Tabela 55: protocolo de estabilidade e especificações de vida de prateleira para o estudo de estabilidade de substância medicamentosa de suporte do construto de AAV2, armazenamento a <-60°C Ponto de tempo (meses) Teste Especificação T0 T2 T6 T12 <-60°C <-60°C <-60°C <-60°C Título físico (DRP) por > 0,7 x 10^12 DRP/mL X X X X qPCR 90% sem impureza única> 2%. As três Partículas bandas correspondentes a VP1, VP2 e X X X X Totais VP3 devem ser evidentes Pureza por > 0,49 x 10^12 partículas/mL X X X X SDS-PAGE ≥ Aumento de duas vezes na densidade de Expressão banda da proteína de construto em células do Construto X X X X transduzidas em comparação com células e Atividade não transduzidas ≥ Aumento de duas vezes na densidade de Atividade do banda do substrato de construto em
X X X X construto células transduzidas em comparação com células não transduzidas
Tabela 56: dados de estabilidade para o estudo de estabilidade de substância medicamentosa primária de construto de AAV2, armazenamento a -80°C ± 10°C Ponto de tempo (meses) Teste Especificação T0 T3 T6 T9 T12 T18 T24 T36 -80°C -80°C -80°C -80°C -80°C -80°C -80°C -80°C Aparência Relatório de resultado X - X - X X X X pH Relatório de resultado X - X - X X X X Pureza por SDS- Resultado de relatório X - X - X X X X
PAGE Agregação por DLS Resultado de relatório X X X X X X X X Título físico (DRP) Resultado de relatório X - X - X X X X por qPCR Expressão do Resultado de relatório X X X X X X X X Construto e Atividade Vedação de Conforme - - - - - - - X Recipiente Tabela 57: Dados de estabilidade para estudo de estabilidade de substância medicamentosa de suporte do construto de AAV2, armazenamento a <-60°C Ponto de tempo (meses) Teste Especificação T0 <-60°C T2 <-60°C T6 <-60°C T12 <-60°C Título físico > 0,7 x 10^12 (DRP) por 1,8 x 10^12 DRP/mL 1,8 x 10^12 DRP/mL X X DRP/mL qPCR Partículas > 0,49 x 10^12 1,4 x 10^12 1,2 x 10^12
X X Totais partículas/mL capsídeos/mL capsídeos/mL > 90% sem impureza Pureza: 100% As três Pureza: 100% As três única > 2%. As três bandas bandas Pureza por bandas correspondentes a correspondentes a X X SDS-PAGE correspondentes a VP1, VP2 e VP3 VP1, VP2 e VP3 VP1, VP2 e VP3 devem ser evidentes devem ser evidentes devem ser evidentes ≥ Aumento de duas Aumento de 5,0 Aumento de 3,1 vezes na densidade vezes na densidade vezes na densidade de banda da proteína da banda da proteína de banda da proteína Expressão de construto em de construto em de construto em do Construto X X células transduzidas células transduzidas células transduzidas e Atividade em comparação com em comparação com em comparação com células não células não células não transduzidas transduzidas transduzidas ≥ Aumento de duas Aumento de 4,3 Aumento de 8,3 vezes na densidade vezes na densidade vezes na densidade de banda do de banda do de banda do Atividade do substrato em células substrato em células substrato em células
X X construto transduzidas em transduzidas em transduzidas em comparação com comparação com comparação com células não células não células não transduzidas transduzidas transduzidas X: denota o ponto de tempo de estabilidade futuro.
Exemplo 12: Análise do produto farmacêutico clínico
[00458] Para os dados fornecidos abaixo, as medições são feitas a partir de uma ou mais bateladas de construto de AAV2, em que o construto é idêntico em todos as bateladas.
[00459] Os procedimentos analíticos realizados para o teste de liberação do medicamento do construto de AAV2 estão detalhados na Tabela 58, além das respectivas especificações. Tabela 58: Especificações do produto farmacêutico Parâmetro de Teste Método de Teste Critérios de Aceitação Testes Gerais Solução transparente a Aparência Cor, partículas visíveis e clareza ligeiramente opaca, incolor a branco desbotado pH metro pH 8 ± 0,5 Osmolalidade Depressão do ponto de congelamento 388 – 426 mOsm/kg H2O Teor Ensaio de Partícula Resistente a Título Físico 0,8 x 10^12 – 1,5 x 10^12 DNase com Base em qPCR (DRP) Título de unidade Infecção de células RC32 seguida >1,4 x 10^8 IU/mL infecciosa (IU) pela detecção de AAV2 por qPCR Razão DRP:IU – Cálculo n/a <5645:1 Potência ≥ Aumento de duas vezes na densidade de banda da Medição da expressão da proteína do proteína de construto em Potência construto e substrato após transdução células transduzidas em in vitro de células HEK293 comparação com células não transduzidas Segurança Cultura aeróbia e anaeróbia para Esterilidade Ausência de crescimento bactérias e fungos por imersão Cromogênico cinético (ensaio Endotoxina <5 EU/mL USP/FDA I/E)
[00460] Procedimentos analíticos: os métodos usados para controlar o produto farmacêutico estão resumidos abaixo.
[00461] Aparência (EP 2.2.1, 2.2.2 e 2.9.20 e USP <631>): o produto será inspecionado visualmente quanto à transparência, cor e ausência/presença de partículas estranhas. O produto será inspecionado em fundos brancos e pretos.
[00462] pH (EP 2.2.3 e USP <791>): o pH do produto será determinado utilizando um microeletrodo de pH com compensação de temperatura.
[00463] Osmolalidade (EP 2.2.35 e USP <785>): A osmolalidade é determinada pelo método de Depressão do Ponto de Congelamento.
[00464] Titulação física: A titulação física do produto final será realizada conforme descrito neste documento.
[00465] Ensaio de título de unidade infecciosa: O ensaio de título de unidade infecciosa no produto final será realizado conforme descrito neste documento.
[00466] Potência: Este ensaio é usado para demonstrar que o construto de proteína é superproduzido e está ativo em células transduzidas com o artigo de teste. As células, HEK293, expressam o construto de proteína endógena em um nível muito baixo, permitindo uma avaliação comparativa da expressão aumentada da proteína de construto devido à transdução celular e a expressão do vetor do construto se AAV2 em comparação com células não transduzidas. Após a transdução, as células são lisadas e a concentração de construto nos lisados é medida por Western blotting ou ELISA. A atividade da proteína de construto expressa é medida nos lisados celulares usando uma reação que mede a incorporação de GPP marcada com biotina em um substrato usando transferência de Wester ou ELISA.
[00467] Teste de esterilidade (EP 2.6.1 e USP <71>): este procedimento é usado para determinar se o artigo de teste está livre de contaminação bacteriana e fúngica viável. O artigo de teste é transferido assepticamente para o meio digestivo de caseína de soja (SCDM) e meio de tioglicolato de fluido (FTM). Esses caldos são incubados por 14 dias e inspecionados quanto a evidências de crescimento de bactérias e fungos.
[00468] Endotoxina (EP 2.6.14 e USP <85>): este ensaio é usado para determinar se endotoxinas bacterianas estão presentes no artigo de teste. Um procedimento quantitativo é realizado pelo método cinético- cromogênico. Quantidades conhecidas de endotoxina são testadas em paralelo com o artigo de teste para uma determinação precisa do nível de endotoxina bacteriana. O potencial de interferência pelo artigo de teste é examinado adicionando o produto de teste mais o reagente LAL com níveis especificados de endotoxina. Após o teste de inibição/intensificação, o teor de endotoxina do artigo de teste é determinado.
[00469] Validação de procedimentos analíticos: os resumos dos resultados da validação do método, quando disponíveis, são apresentados a seguir.
[00470] Aparência: Este é um método compendial harmonizado para atender aos requisitos EP 2.2.1/2.2.2 e USP <631>. A qualificação/validação é conduzida de acordo com as monografias farmacopêicas relevantes.
[00471] pH: este é um método compendial harmonizado para atender aos requisitos EP 2.2.3 e USP <791>. A qualificação/validação é conduzida de acordo com as monografias farmacopêicas relevantes.
[00472] Osmolalidade: este é um método compendial harmonizado para atender aos requisitos EP 2.2.35 e USP <785>. A qualificação/validação é conduzida de acordo com as monografias farmacopêicas relevantes.
[00473] Esterilidade: este é um método compendial harmonizado para atender aos requisitos EP 2.6.1 e USP <71>. A qualificação/validação é conduzida de acordo com as monografias farmacopeicas relevantes.
Exemplo 13: Projeto de Dose Clínica
[00474] A coroideremia é uma degeneração retiniana recessiva ligada ao X rara, atualmente incurável, que se apresenta no final da infância e leva à cegueira. Este exemplo fornece o desfecho primário de um ensaio clínico não randomizado, de dois anos, de fase 1-2 de marcação aberta que avalia a terapia gênica da retina, usando um vetor viral adeno-associado tipo 2 (AAV2) que expressa o transgene de coroideremia (NCT01461213). Inicialmente, 12 pacientes foram recrutados, 5 dos quais receberam 1x1010 partículas do genoma (gp) of AAV.REP1 e 6 receberam 1x1011 gp. Uma complicação cirúrgica em um paciente levou ao afinamento retiniano e a uma dose reduzida do vetor de menos de 1010 gp. O resultado primário de segurança e eficácia foi a acuidade visual em dois anos. Sensibilidade retiniana e alterações anatômicas foram desfechos secundários. Em todo o grupo de 14 pacientes, em dois anos, a acuidade visual mediana melhorou em 4,5 letras nos olhos tratados, em comparação com uma perda de 1,5 letras nos olhos não tratados (p = 0,03). Para os 12 pacientes que receberam terapia genética sem complicações, os olhos tratados ganharam 5,5 letras acima da avaliação inicial em dois anos (p = 0,02). Em comparação com os olhos não tratados, isso representou um ganho médio de 4,5 letras em favor dos olhos que receberam terapia genética por dois anos (p = 0,003). Nesta altura, 6 dos 12 olhos tratados tinham ganhado mais do que uma linha de visão (>5 letras), em comparação com nenhum dos 12 olhos não tratados. No último acompanhamento (faixa de 2 a 5 anos), a acuidade visual foi mantida ou aumentada em todos os 12 olhos do estudo que receberam a terapia genética de acordo com o protocolo, em comparação com apenas 4 dos 12 olhos não tratados. Isso foi equivalente a uma diferença média de 15,9 letras (> 3 linhas) entre os olhos. Nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observada nos desfechos secundários, como microperimetria, espessura da retina ou perda da borda externa da retina entre olhos tratados e não tratados durante o acompanhamento de dois anos. A terapia gênica retiniana para coroideremia parece segura e pode beneficiar a acuidade visual.
[00475] Neste ensaio clínico não mascarado, não randomizado e prospectivo de terapia gênica de intervenção, 14 participantes foram recrutados com consentimento informado e foram submetidos a tratamento de terapia gênica em um olho usando o vetor AAV2.REP1. Geralmente, o olho selecionado para o tratamento tinha pior acuidade visual na avaliação inicial, mas em 3 casos o olho com melhor acuidade foi escolhido por causa de outros fatores, como constrição do campo visual. Todos os participantes eram do sexo masculino com idade variando de 25 a 73 anos com mutações nulas confirmadas no gene CHM. O objetivo principal do estudo foi avaliar a segurança em relação à manutenção da visão por dois anos após a cirurgia. Inicialmente, 12 pacientes deveriam ser recrutados em coortes de duas doses de seis pacientes, cada um dos quais seria monitorado por 24 meses. As complicações em dois pacientes, entretanto, levaram a um atraso de 24 meses no meio da triagem e a uma mudança no protocolo relacionado à técnica cirúrgica e ao regime de imunossupressão usado. O comitê de ética aprovou uma extensão da triagem juntamente com o recrutamento de mais dois pacientes, de modo que 12 pacientes no total receberam o tratamento de terapia gênica, de acordo com o protocolo, sem complicações.
[00476] Na primeira coorte de 6 pacientes, uma injeção sub-retiniana de até 1x1010 partículas de genoma (gp) testadas usando uma referência de vetor de plasmídeo super-enrolado foi injetada sob a retina em um procedimento de duas etapas. Isso compreendeu um descolamento inicial da retina com solução salina balanceada entregue através de uma cânula de Teflon calibre 41 (G) (DORC BV, Zuidland,
Holanda) e injeção secundária do vetor AAV.REP1 no interior do espaço sub-retiniano recém-criado. No paciente seis (C1), as dificuldades de descolamento da retina e de expansão do feixe papilomacular resultaram em uma dose de terapia gênica reduzida de <6×109 e o desbaste da retina subsequente, mas todos os outros pacientes receberam a dose baixa total de 1x1010 gp (L1-5) ou alta dose de 1x1011 gp (C2 e H1-7), conforme o protocolo. Prednisolona oral inicialmente foi administrada a 1 mg/kg por 3 dias antes e 7 dias após a terapia gênica, mas C2 desenvolveu vitrite e retinite em duas semanas de pós- operatório, o que afetou adversamente sua visão. O protocolo foi posteriormente alterado para que H1-7 recebesse uma extensão do regime de prednisolona: 0,5 mg/kg (dias 8-14), 0,25 mg/kg (dias 15-16), depois 0,125 mg/kg (dias 17-18). Uma bolha de ar no sistema de injeção se expandiu para o espaço sub-retiniano em H3 e a administração do vetor foi adiada porque se sentiu que o vetor seria deslocado pelo ar sub-retiniano. O sistema de injeção foi alterado para permitir uma infusão mais controlada do vetor no espaço sub-retiniano e reduzir a possibilidade de bolhas de ar aprisionadas. O protocolo permitiu a administração deferida do vetor se indicado por razões cirúrgicas e H3 foi trazido de volta para terapia genética retiniana em uma data posterior, quando a dose total do vetor foi administrada sem complicações.
[00477] Para auxiliar na visualização do descolamento da retina e monitorar o alongamento da retina, a imagem de tomografia de coerência ótica (OCT) intra-operatória foi introduzida em H3-7. Isso compreendeu um Heidelberg Spectralis alinhado verticalmente que foi movido para dentro e para fora do campo operatório em vários estágios para avaliar o plano de injeção sub-retiniana e o grau de expansão retiniano.
[00478] Na coroideremia, ao contrário de muitas outras degenerações retinais, a perda do RPE leva a uma reação cicatricial da coroide subjacente, que então se torna firmemente aderente à retina residual. A ilha central da retina funcional, entretanto, permanece intacta e um plano de tecido para administração de vetor entre RPE e fotorreceptores pode ser identificado dentro dela. Se, no entanto, o fluido for injetado neste plano muito rapidamente, a bolha de fluido em desenvolvimento formará uma bolha apertada e expandirá a retina central, porque o tecido da cicatriz periférica impedirá que o fluido sub- retiniano se propague para a periferia retiniana. Essa reação de expansão da retina tem duas consequências negativas. Primeiro, pode danificar diretamente a retina neurossensorial – em C1, o feixe papilomacular foi indivíduo a expandir como relatado anteriormente, porque a camada nuclear externa era deficiente nesta área, tornando-a mais fina do que a retina central e sujeita a mais expansão em uma determinada pressão, de acordo com Lei de Hooke. Em segundo lugar, uma pressão de fluido mais elevada na bolha resultará no refluxo da suspensão do vetor de volta através da retinotomia alargada no interior do vítreo, reduzindo assim a dose terapêutica administrada e aumentando o risco de inflamação. Portanto, após a complicação em C1, em que o vetor foi injetado manualmente de uma seringa de 1 ml, um novo dispositivo de administração de vetor foi projetado e testado, o que permitiu uma infusão lenta do vetor controlada por pedal preciso. Isso foi usado com sucesso em H3-7 em que a administração do vetor não foi complicada. Uma bolha de líquido pesado, perfluoro-n-octano (Bausch & Lomb, Rochester, New York, EUA) foi usada para estabilizar áreas focais de afinamento da retina em P10 e P11 durante a infusão do vetor.
[00479] A função visual foi avaliada com a melhor acuidade visual corrigida (BCVA), de acordo com o protocolo do Early Treatment for Diabetic Retinopathy Study (ETDRS). Além disso, o teste de sensibilidade ao contraste Pelli-Robson foi realizado na avaliação inicial, 1 ano e 2 anos. O teste de microperimetria usando o microperímetro MAIA (CenterVue SpA, Padova, Itália) seguiu o protocolo descrito anteriormente [MacLaren et al., 2014], exceto em H3-7, foram usadas grades centrais padrão não personalizadas de 20° (38 estímulos). Para participantes com profunda restrição de campo visual que conseguiam atingir sensibilidades de limiar quase imperceptíveis ou de 0 dB nas grades de 20° (H4-6), foi usada uma grade central de 10°. Após relatos subjetivos de visão de cores aperfeiçoadas em L3, a avaliação da visão de cores usando o teste Farnworth-Munsell 100 hue (FM100) foi adicionada à mudança de protocolo e incluída em H1-7. Embora outras descrições subjetivas de percepção de cor aperfeiçoada no olho tratado tenham sido relatadas por H2, H5, H6 e H7, o teste se mostrou difícil de ser executado em pacientes com perda avançada de campo visual. As avaliações anatômicas incluíram tomografia de coerência óptica de domínio espectral (OCT) usando o Spectralis (Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany) e imageamento de autofluorescência (AF) de fundo (BluePeak, Heidelberg Engineering). Os testes de imunologia para avaliar as respostas das células T ao AAV (ELISpot) seguiram a metodologia descrita anteriormente [MacLaren et al., 2014].
[00480] Devido aos efeitos de teto de incluir olhos com acuidade visual quase máxima no estudo, os resultados do ETDRS foram distorcidos (teste de normalidade Shapiro-Wilk em 0,05 alfa) e, portanto, são apresentados como valores medianos com faixas interquartílicas (IQR). As mudanças entre os olhos tratados e os de controle foram comparadas usando o teste de classificação sinalizada de Wilcoxon. Dados de microperimetria e avaliações anatômicas foram encontrados para distribuição normal e comparados usando o teste t pareado. Resultados
[00481] No total, 14 pacientes foram recrutados, 13 dos quais receberam 1 x 1010 gp (L1-5) or 1 x 1011 gp (C2 e H1-7) do vetor AAV.REP1 (Tabela 59). Houve eventos adversos (AEs) significativos relacionados à administração do vetor em dois pacientes: C1 e C2. Em C1, uma complicação cirúrgica resultou em afinamento da retina e a administração do vetor foi subdosada.
Em C2, houve inflamação retinana significativa em duas semanas de pós-operatório que provavelmente estava relacionada ao vetor.
Em H3, uma bolha de ar sub-retiniana impediu a administração do vetor na primeira tentativa, mas a distribuição do vetor secundário foi bem-sucedida sem complicações posteriormente.
A mudança de protocolo, principalmente no que diz respeito à cirurgia, foi projetada para reduzir a chance de esses eventos adversos ocorrerem no futuro.
O comitê de ética aprovou o recrutamento de mais dois pacientes, proporcionando 12 pacientes tratados, de acordo com o protocolo com acompanhamento de dois anos, incluindo 5 em dose perdida (L1-5) e 7 em dose alta (H1-7). Tabela 59: características demográficas dos participantes da triagem.
Idade Sequência de proteína Olho Dose de ID Mutação CHM (anos) prevista tratado vetor (vg) mutação de sítio doador de L1 63 c.940+2T>C esquerda 1x1010 junção - íntron 7 (+2) mutação de sítio doador de L2 47 c.189+1G>C esquerda 1x1010 junção - íntron 3 (+1) L3 36 c.492_493delGA N165Cfs*8 (exon 6) esquerda 1x1010 L4 55 c.535_538delGAAA E179Tfs*17 esquerda 1x1010 L5 41 c.529delG E177Kfs*20 direita 1x1010 mutação de sítio doador de C1 57 c.819+1G>T esquerda 6x109 junção - íntron 6 (+1) C2 44 c.130G>T G44* (exon 3) esquerda 1x1011 H1 38 c.799C>T R267* (exon 6) esquerda 1x1011 H2 43 c.877C>T R293* (exon 7) esquerda 1x1011 H3 41 c.1264C>T Q422* (exon 10) direita 1x1011 H4 59 c.1335_1336insA R446Tfs*16 direita 1x1011 H5 72 c.757C>T R253* (exon 6) direita 1x1011 H6 55 c.799C>T R267* (exon 6) esquerda* 1x1011 H7 24 c.525_526delAG E177Kfs*6 direita 1x1011
[00482] Todos os participantes são caucasianos do sexo masculino com coroideremia geneticamente confirmada e estão listados por ordem de cirurgia de terapia genética. L1-5 e H1-7 foram submetidos à terapia gênica não complicada na dose baixa e na dose alta, respectivamente. A cirurgia em C1 foi complicada por expansão da retina resultando em subdosagem. C2 desenvolveu inflamação intra-ocular pós-operatória acentuada, que levou a uma redução aguda na acuidade visual seguida por rebote lento, uma vez que a inflamação foi resolvida. Avaliações de Acuidade Visual
[00483] No total, 12 receberam o vetor AAV.REP1 por injeção sub- retiniana sem complicações e 2 foram tratados fora do protocolo como resultado de eventos adversos. No ponto final da triagem de 2 anos, a acuidade visual mediana nos 14 olhos tratados melhorou em 4,5 letras (IQR: -2,0 a 8,8) e nos 14 olhos não tratados diminuiu em -1,5 letras (IQR: -5,0 a 0,0) Assim, favorecendo os olhos tratados em geral, apesar das complicações significativas em 2 pacientes (Wilcoxon Signed rank test, W = 68, z = 2,12, p = 0,034). A seguir, com o propósito de avaliar a eficácia do produto farmacêutico investigacional (IMP), os 12 pacientes que recebem o tratamento de terapia gênica, de acordo com o protocolo (L1-5 e H1-7) são relatados separadamente para os 2 pacientes com complicações cirúrgicas ou médicas (C1 e C2).
[00484] Devido ao atraso no meio da triagem para otimizar a técnica cirúrgica, os primeiros 5 pacientes (L1-5) têm 5 anos de acompanhamento, enquanto os últimos 5 (H3-7) só recentemente alcançaram o acompanhamento de 2 anos, com períodos intermediários de acompanhamento entre eles. Os dados são, portanto, apresentados de duas maneiras: a primeira é em todos os 12 pacientes em 2 anos, de acordo com o ponto final original definido no protocolo e a segunda é o último ponto de acompanhamento, para o qual L1-5 e H1 -2 estender além de 2 anos.
[00485] Em 2 anos, a acuidade visual mediana melhorou em 5,5 letras (IQR: 2,5 a 9,0) nos 12 olhos tratados (teste de classificação sinalizada de Wilcoxon, W = 60, z = 2,33, p = 0,020). Em contraste, houve uma pequena perda de -1,0 letras (IQR: -5,0 a +1,0) nos olhos não tratados durante este período (Tabela 60 e Figura 20). Isso representou um ganho médio de 4,5 letras (IQR: 2,0 a 14,0) nos olhos tratados sobre os olhos do outro lado não tratados (teste de classificação sinalizada de Wilcoxon, W = 76, z = 2,96, p = 0,003). No último acompanhamento, os olhos tratados ganharam uma mediana de 6,5 letras (IQR: 3,8 a 10,3), enquanto os olhos não tratados perderam - 2,0 letras (IQR: -5,3 a 0,3). Isso representou um ganho médio de 8 letras (IQR: 4,0 a 18,5) no olho tratado sobre o olho não tratado (teste de classificação sinalizada de Wilcoxon, W = 78, z = 3,04, p = 0,002).
[00486] No último acompanhamento, a acuidade visual foi mantida ou aumentada em todos os 12 olhos tratados que receberam terapia gênica, mas 8 dos 12 olhos não tratados deterioraram-se em quantidades variáveis durante este período. A acuidade visual é uma leitura biológica variável, mas o teste foi realizado de maneira padrão e nenhum dos olhos não tratados ganhou mais de uma linha (> 5 letras) em 24 meses. Em contraste, 6 dos 12 olhos tratados (50%) ganharam mais de uma linha em 24 meses. Em comparação com o olho não tratado, ganhos de duas linhas ou mais foram observados em 4 de 12 pacientes em 24 meses (Tabela 60: Negrito). Isso aumentou ainda mais para 6 de 12 (50%) no último acompanhamento com 4 desses tendo um ganho de três linhas ou mais (≥15 letras) em favor dos olhos tratados (Tabela 60: Negrito). No último acompanhamento, a acuidade visual no olho tratado havia aperfeiçoado em relação ao olho não tratado em cada um dos 12 pacientes (mediana = 8,5 letras, IQR: 4,0 a 18,5), equivalente a um ganho médio de 15,9 letras (> 3 linhas) em favor dos olhos recebendo terapia genética
Tabela 60: resultados da acuidade visual (pontuação ETDRS melhor corrigida) em 2 anos e último acompanhamento para todos os 12 participantes. gp = partículas do genoma do vetor AAV2.REP1; Med = mediana; TE = olho tratado; CE = olho de controle; m = meses; y = anos; DIFF = diferença entre os olhos; FU = acompanhamento; mudanças de visão de 2 linhas (10 letras) ou mais entre os olhos são mostradas em negrito. Dose baixa (1 x 1010 gp) Dose alta (1 x 1011 gp) L1 L2 L3 L4 L5 H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 Med Avaliação TE 23 79 89 53 79 77 76 70 61 67 60 39 68,5 inicial CE 58 82 85 76 83 87 88 88 57 74 26 87 82,5 TE 41 73 94 61 76 78 80 79 70 73 63 53 73,0 24 m CE 62 77 85 70 78 86 88 87 62 78 6 84 78,0 Mudança TE 18 -6 5 8 -3 1 4 9 9 6 3 14 +5,5 (24 m) CE 4 -5 0 -6 -5 -1 0 -1 5 4 -20 -3 -1,0 Dif (24m) 14 -1 5 14 2 2 4 10 4 2 23 17 +4,5 TE 48 79 93 73 84 80 83 79 70 73 63 53 76,0 Último FU CE 0 77 86 73 77 86 88 87 62 78 6 84 77,5 Mudança TE 25 0 4 20 5 3 7 9 9 6 3 14 +6,5 (Último CE -58 -5 1 -3 -6 -1 0 -1 5 4 -20 -3 -2,0 FU) Diferença (Último 83 5 3 23 11 4 7 10 4 2 23 17 +8,5 FU) Último FU (ano) 5 5 5 5 5 4 4 2 2 2 2 2 4,0
[00487] A microperimetria avalia a sensibilidade retiniana média em uma área mais ampla da mácula do que a acuidade visual, mas leva mais tempo para ser realizada e requer concentração, especialmente para pacientes com fixação deficiente [Jolly et al., 2017]. A sensibilidade retiniana média nos olhos tratados foi de 4,0 ± 0,7 decibeis (dB) na avaliação inicial e 3,3 ± 0,6 em 2 anos, representando um pequeno declínio estatisticamente insignificante (p =0,07). Em contraste, os olhos não tratados caíram significativamente de 4,8 ± 0,8 dB na avaliação inicial para 3,3 ± 0,7 dB em 2 anos (p = 0,004). Embora tenha havido um ganho relativo favorecendo os olhos tratados em relação aos olhos não tratados de 0,8 ± 0,53 dB (IC 95%: -0,3 a 1,8 dB) no ponto final do estudo de 2 anos, não foi estatisticamente significativo (p = 0,17). Os dados e a análise provisória em 1 ano são mostrados na Figura 21. Nesta fase, a perda média de sensibilidade da retina nos olhos tratados foi menor do que nos olhos não tratados em 0,9 ± 0,5 dB (IC 95%: 0,0 a 1,8 dB), sugerindo que a melhora em relação ao olho não tratado observada em 2 anos pode ser duradoura.
[00488] A microperimetria também fornece informações úteis sobre a fixação, ou seja, o locus retiniano que tem sensibilidade máxima (geralmente a fóvea). Todos os pacientes, exceto L1, ainda retinham algum grau de fixação foveal ou parafoveal, consistente com a natureza centrípeta da perda de campo visual nesta doença. Foi observado anteriormente que L1 mudou sua fixação (ou locus retiniano preferido) para usar esta ilha tratada, enquanto contornava a ilha não tratada da retina. Isso foi mantido por até 5 anos neste paciente, consistente com a melhora sustentada na acuidade visual.
[00489] Preservação da estrutura da retina: avaliações anatômicas incluíram tomografia de coerência ótica (OCT), que fornece uma visão transversal para medir a espessura da retina e autofluorescência, o que gera um mapa que pode ser usado para estimar a área retiniana sobrevivente. Os olhos não foram randomizados, com o olho mais avançado em termos de acuidade visual selecionado para terapia gênica em 9 dos 12 pacientes do estudo (Tabela 59).
[00490] A OCT foi usada principalmente por segurança para avaliar o desbaste da retina que pode ocorrer, por exemplo, por trauma cirúrgico ou se houver um efeito tóxico de longo prazo da superexpressão da proteína REP1. A espessura média dos 12 olhos tratados com protocolo no ponto de fixação (conforme indicado pela microperimetria) na avaliação inicial foi de 224,8 μm em comparação com 251,9 μm nos olhos não tratados. Aos 24 meses, os olhos tratados reduziram para uma média de 207,7 μm e os não tratados para 245,6 μm, o que foi estatisticamente significativo (n = 12, p = 0,04). Uma análise de subgrupo adicional, no entanto, revelou que nos primeiros 7 olhos que receberam injeção manual de vetor no espaço sub-retiniano (L1-5 e H1-2), o desbaste da retina foi maior nos olhos tratados (média 23,1 μm) do que nos olhos não tratados (6,4 μm) (n = 7, p = 0,02). No entanto, em olhos que receberam injeção automática após melhoria no sistema de entrega de vetores (H3-7), nenhuma diferença significativa foi detectada (n = 5, p = 0,72).
[00491] Para medições de área, a área de autofluorescência é correlacionada à área de fotorreceptores sobreviventes calculada a partir de múltiplas fatias através da zona elipsoide. Em todo o grupo de 12 pacientes, 81,1 ± 3,2% da área de autofluorescência foi preservada nos olhos tratados, enquanto 80,8 ± 2,1% foi preservada nos olhos não tratados por 2 anos, o que foi semelhante. Deve-se notar, no entanto, que o encolhimento de AF ocorre apenas nas células mais externas da retina no limite da degeneração e 2 anos é tempo insuficiente para avaliar os efeitos de longo prazo da terapia gênica da retina nas zonas centrais mais saudáveis. Apenas um paciente (H5) não teve declínio mensurável (preservação de 100%) por 2 anos e foi observado apenas em seu olho tratado. O acompanhamento de longo prazo (5 anos) de 5 pacientes mostrou um padrão semelhante, com autofluorescência remanescente de 66,1 ± 5,0% nos olhos tratados em comparação com 64,9 ± 3,6% nos olhos não tratados (Tabela S2B). Deve-se notar, entretanto, que este era um quadro misto, com os pacientes com grandes ganhos de acuidade visual se saindo muito melhor do que outros. Além disso, durante este período de tempo, diferenças significativas entre pacientes na taxa de degeneração medida surgiram até mesmo nos olhos não operados, que variaram de 58% a 78%. Isso destaca a necessidade de não interpretar excessivamente um conjunto de dados não aleatório limitado.
Eventos Adversos
[00492] Todos os pacientes foram inscritos sem catarata visualmente significativa na avaliação inicial devido à necessidade de uma visão clara da retinotomia de calibre 41, mas a formação de catarata é um efeito colateral bem conhecido e quase inevitável da cirurgia de vitrectomia. Em 2 participantes (H5 e H6), a cirurgia de catarata foi realizada anteriormente. Um paciente desenvolveu catarata visualmente significativa, que foi removida 1 ano após a terapia gênica (H3), mas quatro outros pacientes (L2, L4, L5, H2) foram submetidos à cirurgia de catarata após a conclusão do acompanhamento de 2 anos. A cirurgia de catarata ainda não foi realizada nos cinco pacientes restantes (L1, L3, H1, H4 e H7), embora todos tenham sinais de progressão de catarata na graduação de catarata LOCS III. Em todo o grupo de 14 pacientes e mesmo incluindo os dois pacientes com complicações, a acuidade visual nos olhos tratados melhorou em relação aos olhos não tratados durante este período. Considerando apenas os 12 pacientes submetidos à terapia gênica retiniana sem complicações, sem desvios de protocolo, ao final de 2 anos, a acuidade visual havia melhorado nos olhos tratados em comparação com sua avaliação inicial. No último ponto analisado, que é de até 5 anos, todos os 12 olhos tratados mantiveram ou ganharam acuidade visual acima dos níveis basais, apesar das perdas variáveis na acuidade visual em 8 dos 12 olhos não tratados durante este período. Os efeitos benéficos na acuidade visual combinados com um bom perfil de segurança garantem uma avaliação adicional da terapia gênica de coroideremia como um tratamento potencial em uma triagem clínica prospectiva de Fase III totalmente randomizada (ver Exemplo 14).
[00493] Embora não tenha havido diferença significativa nos ganhos de acuidade visual entre as coortes de dose baixa ou alta, deve-se notar que este foi um grupo de estudo muito pequeno com apenas 5 pacientes tratados com a dose mais baixa (1 x 1010). Dada a natureza heterogênea do sistema imunológico antiviral inato humano, é provável que uma dose limite possa ser terapêutica em alguns, mas não em todos os pacientes. Portanto, pode ser vantajoso tratar com uma dose máxima tolerada, desde que nenhum efeito tóxico seja observado. A excelente preservação da função visual em pacientes com altas doses ao longo do tempo apoia essa abordagem. Também vale a pena ter em mente que os pacientes selecionados para este estudo geralmente estavam em estágio final com ilhas muito pequenas de retina residual e, portanto, não havia muitas células retinais restantes para tratar. A dose baixa pode ser insuficiente para pacientes em estágio inicial nos quais uma área-alvo muito maior seria exposta ao vetor. Ressalta-se também que a formulação farmacêutica utilizada para este estudo não contém elemento PRE ou WPRE, o que pode melhorar a eficácia terapêutica.
[00494] Com exceção de H5, a constrição adicional da área de autofluorescência nos pacientes restantes não foi consistente com outros modelos pré-clínicos nos quais as melhorias na função visual resultantes da substituição de um único gene estão invariavelmente associadas à desaceleração da degeneração retiniana. Aqui, no entanto, é importante ter em mente que o avanço da degeneração medido ao longo do período de 2 anos ocorre apenas nas bordas extremas da degeneração retiniana e esta parte pode estar muito avançada para resgate. Os ganhos de acuidade visual em contraste surgiram principalmente da retina central. Além disso, a retina na coroideremia é difícil de destacar além das bordas da retina sobrevivente, resultando na expansão da bolha sobreposta. A forma côncava do espaço sub-retiniano aumentará a altura da bolha centralmente, que será, portanto, a última parte da retina a se reconectar conforme o fluido é reabsorvida. Isso poderia potencialmente fornecer à retina central várias horas adicionais de exposição ao vetor em comparação com a periferia extrema. Finalmente, deve-se notar que os olhos não foram randomizados e as diferenças intra-oculares na área de retina sobrevivente observada em alguns pacientes na avaliação inicial é indicativo de taxas assimétricas de degeneração. Ao tratar o pior olho, haverá, por definição, uma tendência a tratar o olho com degeneração mais rápida.
[00495] Enquanto a acuidade visual foi mantida ou aumentada em todos os olhos tratados ao longo da duração do estudo, a sensibilidade da retina medida com microperimetria mostrou uma tendência de declínio e, embora numericamente melhor do que os olhos não tratados, não houve diferença estatisticamente significativa entre os dois. Provavelmente, isso se deve à maior variabilidade na realização da microperimetria em comparação com a leitura de letras únicas em um gráfico de alto contraste. No entanto, os testes apresentam diferenças sutis nas suas medições. A microperimetria avalia a função retiniana de muitos pontos calculados em uma média de 10-30 graus da retina central, enquanto a acuidade visual é uma medida feita a partir de um único ponto que geralmente tem sensibilidade máxima e está localizado centralmente. A manutenção da sensibilidade retiniana, portanto, é aperfeiçoada com uma transdução bem-sucedida de toda a área medida até as bordas da retina sobrevivente. Por exemplo, se apenas 20% das células epiteliais do pigmento da retina são transduzidas com sucesso pelo vetor, então isso pode ser suficiente para ver um ganho de acuidade visual se essas células estiverem abaixo da fóvea. Os 80% restantes das células não transduzidas, entretanto, continuariam a degenerar e esse declínio seria refletido em um declínio gradual na microperimetria ao longo do tempo, mas a acuidade visual permaneceria estável. Se, no entanto, a terapia gênica for bem- sucedida em interromper a degeneração nas áreas transduzidas com sucesso, então, eventualmente, apenas as células transduzidas permaneceriam e as leituras de microperimetria se estabilizariam para permanecer constantes ao longo do tempo. Este efeito de 'platô' está surgindo agora em L1, que também manteve seu ganho de acuidade visual e que tem o acompanhamento mais longo. Alternativamente, pode ser um fator simples que a sensibilidade retiniana medida por microperimetria seja mais sensível à formação de catarata do que a acuidade visual de alto contraste. No ponto de tempo de 2 anos após a vitrectomia, apenas um dos 10 pacientes tratados com protocolo fácico foi submetido a cirurgia de catarata.
[00496] O sucesso da cirurgia é um fator crítico ao interpretar os resultados neste e em qualquer outro estudo de terapia gênica que envolva a entrega do vetor sob a retina. Um evento potencialmente adverso de expansão da retina foi relacionado à cirurgia. O outro evento adverso significativo de inflamação pode igualmente estar relacionado à cirurgia se durante a injeção houver refluxo do vetor para o interior vítreo, que é conhecido por desencadear a inflamação. Seguindo a mudança de protocolo no meio da triagem, um sistema automatizado de injeção sub-retiniana foi adotado que permitiu a entrega precisa e controlada do vetor no espaço sub-retiniano. Isso foi facilitado adicionalmente mais pela varredura intra-operatória da retina (OCT), que forneceu uma imagem de seção transversal em tempo real da retina sendo descolada e ajudou a identificar o espaço sub-retiniano em alguns dos pacientes mais avançados. Esses refinamentos cirúrgicos adicionais irão melhorar a segurança em estudos futuros de terapia gênica. No entanto, os resultados deste ensaio clínico de Fase I/II mostram que a terapia gênica para coroideremia é geralmente segura. Exemplo 14: Estudo Gemini
[00497] Este é um estudo multicêntrico, aberto, prospectivo e intervencionista bilateral de segurança de AAV2-REP1 em indivíduos adultos do sexo masculino com CHM geneticamente confirmado.
[00498] O estudo consistirá em uma visita de triagem seguida por 2 períodos de tratamento (período 1 e período 2) com até 9 visitas por período (Figura 22). Na visita de triagem, os indivíduos são avaliados quanto à elegibilidade de ambos os olhos. O investigador atribui a ordem em que os olhos são tratados (ou seja, olho do estudo 1 [SE1] e olho do estudo 2 [SE2], respectivamente) com um número atribuído a cada olho. Esta tarefa é realizada em colaboração com o indivíduo; entretanto, o pior olho geralmente é selecionado para tratamento primeiro. O intervalo alvo entre o procedimento cirúrgico em SE1 e SE2 é determinado na visita de triagem. Cada olho do estudo é seguido por pelo menos 12 meses após o tratamento, por até 9 visitas por período de tratamento: Visita 1 (Dia 0, Visita do Dia da Injeção); Visita 2 (Dia 1, visita de acompanhamento pós-operatório); Visita 3 (Dia 3); Visita 4 (Dia 7); Visita 5 (Dia 14); Visita 6 (mês 1); Visita 7 (mês 3); Visita 8 (mês 6) e visita 9 (mês 12).
[00499] No Período 1, Visita 1 (Dia 0, Visita do Dia de Injeção para SE1), os indivíduos são submetidos a uma vitrectomia com descolamento de retina e recebem uma injeção sub-retinal de AAV2- REP1 em SE1. As visitas 2 a 9 são realizadas de acordo com o Programa de Procedimentos de Estudo, a menos que o Período 2 comece durante este período. As avaliações oftálmicas durante o período 1, visitas 2 a 9, são realizadas em ambos os olhos.
[00500] No Período 2, Visita 1 (Dia 0, Visita do Dia de Injeção para SE2) os indivíduos são submetidos a uma vitrectomia com descolamento da retina e injeção sub-retiniana de AAV2-REP1 no olho contralateral não tratado (SE2). Os indivíduos não seguem mais o cronograma de visitas do Período 1, mas, em vez disso, frequentam o Período 2, Visitas 2-9, de acordo com o Programa de Procedimentos de Estudo. As avaliações oftálmicas agendadas para o período 2, visitas 2 a 9, serão realizadas em ambos os olhos.
[00501] Os indivíduos são avaliados quanto à segurança e eficácia ao longo do estudo; as avaliações são descritas no Programa de Procedimentos de Estudo. Os indivíduos que desenvolvem catarata podem ser submetidos à cirurgia de catarata, se considerada clinicamente necessária. Se a cirurgia de catarata for realizada, ela será realizada pelo menos 4 semanas antes do mês 12 (visita 9) para o respectivo olho.
[00502] O desfecho primário é a avaliação da segurança após a administração bilateral de AAV2-REP1. Os desfechos secundários do estudo incluem uma mudança a partir da avaliação inicial na melhor acuidade visual corrigida (BCVA), conforme medido pelo gráfico do estudo de tratamento precoce da retinopatia diabética (ETDRS), uma mudança da avaliação inicial na autofluorescência (AF), uma alteração da avaliação inicial na tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) e uma alteração da avaliação inicial na microperimetria.
[00503] Critérios de Inclusão:
[00504] Na visita de triagem, os indivíduos são elegíveis para participação no estudo se atenderem a todos os critérios de inclusão a seguir. Critérios de inclusão: (1) _estão dispostos e são capazes de produzir consentimento informado para a participação no estudo para tratamento de ambos os olhos, (2) são do sexo masculino e ≥18 anos de idade, (3) têm um diagnóstico geneticamente confirmado de CHM, (4) ter doença ativa clinicamente visível na região macular de ambos os olhos, (5) ter um BCVA de: ≥74 letras ETDRS (equivalente a melhor ou igual a 6/9 ou 20/32 de Snellen, decimal 0,63, LogMar 0,2) em ambos os olhos, se nenhum tratamento anterior com AAV2-REP1≥74 letras ETDRS (equivalente a melhor ou igual a 6/9 ou 20/32 Snellen, decimal 0,63, LogMar 0,2) no olho não tratado, se tratamento anterior com AAV2- REP1 foi recebido em um estudo alternativo. Se tratados anteriormente com AAV2-REP1 em um estudo alternativo, os indivíduos podem ser elegíveis para participação após a aprovação do patrocinador.
[00505] Critérios de Exclusão:
[00506] Na visita de triagem, os indivíduos não são elegíveis para participação no estudo se atenderem a qualquer um dos seguintes critérios de exclusão. Critérios de exclusão: (1) ter um histórico de ambliopia ou distúrbio inflamatório em um dos olhos, (2) não querer usar métodos de contracepção de barreira por um período de 3 meses após o tratamento com AAV2-REP1 em qualquer um dos olhos, (3) ter tido cirurgia intraocular anterior realizada dentro de 3 meses da visita de triagem em qualquer um dos olhos, (4) ter qualquer outra doença/distúrbio ocular ou não ocular significativo que, na opinião do investigador, pode colocar os indivíduos em risco devido à participação no estudo, ou pode influenciar os resultados do estudo, ou a capacidade do indivíduo de participar do estudo, e (5) ter participado de outro estudo de pesquisa envolvendo um produto investigacional nas últimas 12 semanas ou recebido uma terapia baseada em genes/células a qualquer momento anteriormente, exceto se tratado em outro estudo com AAV2-REP1. Esta doença/distúrbio ocular ou não ocular significativo que, na opinião do investigador, pode colocar os indivíduos em risco devido à participação no estudo, ou pode influenciar os resultados do estudo, ou a capacidade do indivíduo de participar do estudo inclui, mas não está limitado a um indivíduo potencial: a) com uma contra-indicação ao corticosteroide oral (por exemplo, prednisolona/prednisona), b) com catarata clinicamente significativa em qualquer um dos olhos, c) que, na opinião clínica do investigador, não é um candidato apropriado para cirurgia sub-retiniana.
[00507] Produto de teste, dosagem e modo de administração: para cada olho, os indivíduos serão submetidos à vitrectomia e descolamento da retina e receberão um volume de 0,1 mL de injeção sub-retiniana do medicamento do estudo contendo 1 × 1011 partículas do genoma AAV2- REP1.
[00508] Critérios para avaliação: a avaliação de segurança é baseada em exame oftálmico completo (incluindo pressão intraocular [IOP], exame de lâmpada de fenda, graduação de opacidade de lente e oftalmoscopia dilatada); retinografia; notificação de eventos adversos (EA); excreção vetorial e amostragem de imunogenicidade; e sinais vitais.
[00509] Eficácia: a avaliação da eficácia é baseada em BCVA (conforme medido pelo gráfico ETDRS), autofluorescência de fundo, SD-OCT e microperimetria.
[00510] Metodologia estatística: nenhum cálculo formal do tamanho da amostra foi realizado. Variáveis contínuas são resumidas ao longo do tempo usando estatísticas descritivas (isto é, média, desvio padrão, intervalo de confiança de 95% [IC], mediana, Q1, Q3, P05, P95, mínimo e máximo). Variáveis categóricas são descritas ao longo do tempo usando contagens, porcentagens e ICs a 95%. Os resumos são tabulados por visita e olho. Nenhum teste estatístico formal é realizado. Os AEs são resumidos por classe de sistema de órgãos, termo preferido e olho. O número de indivíduos e o número de olhos que experimentam um EA, bem como o número de eventos, são resumidos. Resumos semelhantes serão produzidos para AEs relacionados ao medicamento/procedimento do estudo, AEs que levam à descontinuação e AEs graves. Os AEs também são resumidos por gravidade máxima, relação com o medicamento/procedimento do estudo e tempo para início e resolução. Os perfis de liberação de vetores e de resposta imune serão descritos. As demais avaliações de segurança são analisadas por meio de estatística descritiva.
[00511] CHM é incurável e, antes do desenvolvimento das composições farmacêuticas da descrição, o tratamento era de suporte, na melhor das hipóteses. A composição farmacêutica administrada a indivíduos desta triagem, AAV2-REP1, é uma partícula AAV2 que encapsula ácido desoxirribonucleico complementar (cDNA) de 1,962kB do gene REP1 humano de tipo selvagem. AAV2-REP1 expressa altos níveis de proteína REP1 humana, restaura REP1 para fibroblastos CHM humanos, fornece resgate funcional de células CHM humanas, expressa proteína na retina de camundongos CHM in vivoe não é tóxico quando superexpresso por uma unidade logarítmica. Além disso, a superexpressão da proteína REP1 humana não afeta significativamente a função retiniana de forma negativa.
[00512] Considerando que a CHM afeta ambos os olhos, este estudo demonstra a administração bilateral de AAV2-REP1. Dados emergentes de estudos clínicos e não clínicos com vetores AAV2 demonstram que os vetores AAV2 ilicitam uma resposta imune mínima, incluindo após administração bilateral. O objetivo deste estudo é fornecer informações importantes sobre a segurança e tolerabilidade do tratamento bilateral sequencial com AAV2-REP1. Tratamentos Administrados
[00513] Os indivíduos elegíveis são submetidos a vitrectomia e descolamento de retina em cada olho. No Período 1, Visita 1 (Dia 0, a Visita do Dia da Injeção para SE1), os indivíduos recebem um volume de 0,1 mL de injeção sub-retiniana do medicamento do estudo contendo 1 × 1011 AAV2-REP1 gp em SE1. No Período 2, Visita 1 (Dia 0, a Visita do Dia da Injeção para SE2), os indivíduos recebem a mesma injeção sub-retiniana de AAV2-REP1 em SE2. Descrição da composição farmacêutica
[00514] O vetor AAV2 contém cDNA humano recombinante que codifica REP1 (AAV2-REP1). O genoma do vetor (AAV2-CBA-hREP1- WPRE-BGH) é composto por um cassete de expressão constitutivo forte, um promotor CBA híbrido, o cDNA humano que codifica REP1, uma sequência do elemento regulador pós-transcricional (WPRE) modificado do vírus da hepatite da marmota, e uma sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (BGH-poliA) flanqueada por repetições terminais invertidas de AAV2. O fragmento de cDNA foi originalmente isolado de uma biblioteca de cDNA retiniana humana de indivíduos não afetados.
[00515] O produto farmacêutico AAV2-REP1 é formulado em uma solução tamponada com Tris 20 mM estéril, pH 8,0, e contém MgCl2 de 1 mM, NaCl de 200 mM e PF68 a 0,001%. O medicamento é uma suspensão límpida a ligeiramente opalescente, incolor e filtrada por esterilização com uma concentração alvo de 1 × 1012 gp/mL.
[00516] AAV2-REP1 é fornecido em frascos estéreis, rolhados e tampados. Um total de 0,3 mL de suspensão de vetor é fornecido para cada olho a ser tratado. Antes do envio, cada frasco é colocado em um recipiente secundário rotulado. O produto farmacêutico deve ser armazenado a <−60°C (−76°F) em um acesso controlado, freezer com temperatura monitorada. Procedimento de vitrectomia e injeção de AAV2-REP1
[00517] A injeção de AAV2-REP1 é realizada por um cirurgião de retina devidamente qualificado e experiente. Devido à complexidade e imprevisibilidade do descolamento da retina no CHM, no qual a retina e a coroide podem ser extremamente finas e fundidas em alguns lugares, foi desenvolvida uma modificação na técnica de terapia gênica sub- retiniana. Isso envolve a realização da entrega do vetor em duas etapas após a vitrectomia. Uma vantagem de um procedimento de duas etapas é que quaisquer complicações inesperadas do descolamento da retina podem ser gerenciadas de forma conservadora, minimizando as preocupações com o escape do vetor para o interior vítreo. Além disso, a injeção poderia ser adiada para uma data posterior se, por exemplo,
um buraco macular fosse criado que exigisse tratamento com gás. Além disso, uma vez que o volume de fluido necessário para destacar a fóvea é variável, removendo o vetor da primeira etapa, uma dose consistente precisa em termos de partículas do genoma ainda pode ser aplicada no espaço sub-retiniano.
[00518] Inicialmente, os indivíduos são submetidos a uma vitrectomia padrão e descolamento do hialoide posterior no respectivo olho do estudo (Figura 23). Todas as cirurgias serão realizadas usando o sistema de vitrectomia padrão BIOM. Uma abordagem suturada de calibre 23 é geralmente preferida para evitar quaisquer riscos potenciais de vazamento da ferida. A retina será descolada com 0,1-0,5 mL de solução salina balanceada (BSS) injetada através de uma cânula sub- retiniana calibre 41 conectada a um conjunto de injeção de vítreo. Uma única dose de AAV2-REP1 será injetada no fluido sub-retiniano através do mesmo sítio de entrada.
[00519] Na segunda etapa do procedimento, a cânula BSS é removida do olho e AAV2-REP1 é preparada para injeção. Uma dose de 1,0×1011 AAV2-REP1 gp é injetada no espaço sub-retiniano através do mesmo sítio de entrada. O vetor precisa ser preparado na seringa de 1 mL para evitar a formação de bolhas de ar e um conector é usado para que a seringa de 1 mL possa ser conectada à linha de pressão constante da máquina de vitrectomia. A injeção sub-retiniana terá como alvo qualquer área da mácula, mas também incluirá a fóvea, se possível. Em cada caso, o vetor é injetado de modo que o fluido sub-retiniano se sobreponha a todos os limites da borda da região central que ainda não sofreu degeneração coriorretiniana, conforme identificado pela autofluorescência do fundo. Após o fechamento da ferida, deve-se ter o cuidado de descartar todos os fluidos de irrigação que possam ter passado pelo olho para limitar a disseminação potencial do vetor.
[00520] Terapia Concomitante:
[00521] Os indivíduos não podem ter participado de outro estudo de pesquisa envolvendo um produto experimental nas últimas 12 semanas ou recebido uma terapia baseada em genes/células em qualquer momento anterior, exceto se tratados em outro estudo com AAV2- REP1. Ao longo do estudo, os investigadores podem prescrever quaisquer medicamentos ou tratamentos concomitantes considerados necessários para fornecer cuidados de suporte adequados. Os detalhes dos medicamentos concomitantes são coletados na visita de triagem e atualizados em cada visita do estudo (incluindo a Visita ET, se aplicável). Os medicamentos concomitantes (incluindo corticosteroide oral) tomados durante o estudo devem ser registrados nos prontuários médicos do participante e na eCRF; uma exceção a isso é qualquer medicamento usado durante a realização de um procedimento de estudo (por exemplo, anestesia, colírio dilatador).
[00522] Para minimizar a inflamação resultante da cirurgia e respostas imunes potenciais ou inesperadas ao vetor/transgene, todos os indivíduos receberão um curso de prednisona/prednisolona oral de 21 dias antes de cada cirurgia. Assim, para cada cirurgia, seria de 1 mg/kg/dia de prednisona/prednisolona por um total de 10 dias (começando 2 dias antes da injeção do vetor, no dia da injeção e depois por 7 dias); seguido de 0,5 mg/kg/dia por 7 dias; 0,25 mg/kg/dia por 2 dias; e 0,125 mg/kg/dia por 2 dias (21 dias no total). Os detalhes do uso de corticosteroides são capturados por cada indivíduo em um cartão de diário. Procedimentos do Estudo
[00523] Em cada visita do estudo, deve-se tentar realizar todos os procedimentos em ambos os olhos. Visita de Triagem
[00524] O investigador explica o propósito do estudo, procedimentos e responsabilidades do indivíduo para cada indivíduo de estudo potencial. Os procedimentos de triagem consistirão no seguinte (todas as avaliações oftálmicas serão realizadas em ambos os olhos): demografia, história médica e ocular, sinais vitais, peso, amostra de excreção vetorial – sangue, lágrimas (ambos os olhos), urina, saliva, amostra de imunogenicidade (ensaio de imunoabsorção enzimática [ELISA] e immunospot ligado a enzima [ELISPOT]), BCVA, exame oftálmico completo (incluindo IOP, exame com lâmpada de fenda, opacidade de lente e exame de fundo dilatado), SD-OCT, autofluorescência, microperimetria, retinografia colorida de 7 campos (incluindo estéreo fotografias para os campos 1, 2 e 3), monitoramento de EA graves (SAE), Revisão de medicação.
[00525] Os indivíduos que atendem a todos os critérios de inclusão e nenhum dos critérios de exclusão receberão um número de indivíduo e serão incluídos no estudo. O investigador atribui a ordem em que os olhos são tratados (isto é, SE1 e SE2, respectivamente). Isso será feito em colaboração com o indivíduo; entretanto, o pior olho geralmente é selecionado para tratamento primeiro. O intervalo alvo entre o procedimento cirúrgico em SE1 e SE2 é determinado nesta visita.
[00526] Para cada indivíduo, o intervalo entre o tratamento SE1 e SE2 deve variar de algumas semanas a meses. Embora esse intervalo seja decidido caso por caso, deve-se fazer um esforço para programar intervalos de tratamento variados (por exemplo, 1, 3 ou 6+ meses de intervalo) a fim de melhor caracterizar o perfil imunológico e de segurança da administração sequencial do tratamento.
[00527] A próxima visita de estudo (Período 1, Visita 1) deve ser agendada dentro de 10 semanas da Visita de triagem. Os indivíduos comparecerão às visitas 2 a 9 do Período 1, a menos que a segunda visita de cirurgia (Período 2, Visita 1) comece, que marcará o início do Período 2. Visto que o momento da segunda visita de cirurgia (Período 2, Visita 1) irá variar entre os assuntos, a duração do período de estudo 1 também será variável.
[00528] Os indivíduos recebem dois cursos de corticosteroide oral de 21 dias (por exemplo, prednisolona/prednisona) e são instruídos a começar a tomar o medicamento 2 dias antes da próxima cirurgia, no Período 1, Visita 1 para SE1 e Período 2, Visita 1 para SE2. Os participantes receberão um cartão diário para registrar a conformidade com os corticosteroides ao longo de cada período de 21 dias. Os indivíduos são instruídos a usar contracepção de barreira por um período de 3 meses a partir do momento em que são tratados.
[00529] O cronograma de procedimentos é idêntico para os períodos 1 e 2; durante cada período, os procedimentos devem ser realizados em SE1 e SE2.
[00530] Se um indivíduo já participou de uma triagem clínica de AAV2-REP1 para o tratamento de CHM e recebeu AAV2-REP1 em um olho, o olho não tratado será designado SE2 na visita de triagem e o indivíduo entrará imediatamente no Período 2. Período 1 e 2, Visita 1 (Dia 0, Visita do Dia de Injeção)
[00531] Na Visita 1 (Dia 0, Visita do Dia da Injeção), as seguintes avaliações são realizadas: exame oftálmico completo (incluindo PIO, exame de lâmpada de fenda, opacidade de lente e exame de fundo dilatado), monitoramento de AE/SAE e revisão de medicação concomitante (incluindo revisão do cartão diário de corticosteroides).
[00532] Os indivíduos então são submetidos à vitrectomia e recebem um volume de 0,1 mL de injeção sub-retinal de AAV2-REP1, contendo 1 × 1011 gp em seu primeiro olho (SE1).
[00533] Os indivíduos são cuidadosamente monitorados quanto à ocorrência de AEs durante o procedimento. Os indivíduos retornam ao sítio 1, 3, 7 e 14 dias após a cirurgia para acompanhamento pós- operatório (Visita 2 [Dia 1], Visita 3 [Dia 3], Visita 4 [Dia 7] e Visita 5 [Dia 14], respectivamente).
[00534] Para permitir a caracterização precisa da segurança de
AAV2-REP1 e perfil de imunogenicidade, o tratamento de SE2 não deve ocorrer se uma cirurgia intraocular anterior foi realizada no mesmo olho dentro de 3 meses da data de tratamento planejada. Se a cirurgia intraocular ocorreu dentro de 3 meses, o tratamento de SE2 deve ser adiado até o momento em que o intervalo de 3 meses tenha decorrido e haja recuperação pós-operatória completa do olho. Período 1 e 2, Visita 2 (visita pós-operatória no dia 1)
[00535] Para a Visita 2, as avaliações e procedimentos oculares são realizados em cada olho. Na Visita 2 (Dia 1), os indivíduos retornam ao sítio para sua primeira visita pós-operatória para o mesmo olho que foi submetido à cirurgia na Visita 1 (Período 1 [SE1] ou Período 2 [SE2]). As seguintes avaliações são realizadas: sinais vitais, amostra de excreção vetorial – sangue, lágrimas (ambos os olhos), urina, saliva, amostra de imunogenicidade (ELISA e ELISPOT), BCVA, exame oftálmico completo (incluindo IOP, exame de lâmpada de fenda, opacidade de lente e exame de fundo de olho dilatado), SD- OCT, monitoramento de AE/SAE, revisão de medicação (incluindo revisão do cartão diário de corticosteroides). Período 1 e 2, Visita 3 (Dia 3)
[00536] Para a Visita 3 (Dia 3), as avaliações e procedimentos oculares são realizados em cada olho. Na Visita 3 (Dia 3), os indivíduos retornam ao sítio para sua segunda visita pós-operatória para o mesmo olho que foi submetido à cirurgia na Visita 1 (Período 1 [SE1] ou Período 2 [SE2]). As seguintes avaliações serão realizadas: sinais vitais, amostra de excreção vetorial – sangue, lágrimas (ambos os olhos), urina, saliva, BCVA, exame oftálmico completo (incluindo PIO, exame com lâmpada de fenda, opacidade do cristalino e exame de fundo dilatado), monitoramento de AE/SAE e revisão de medicação (incluindo revisão do cartão diário de corticosteroides).
Período 1 e 2, Visita 4 (Dia 7)
[00537] Para a Visita 4 (Dia 7 ± 1 dia), as avaliações e procedimentos oculares são realizados em cada olho. Na Visita 4 (Dia 7 ± 1 dia), os indivíduos retornam ao sítio para sua terceira visita pós-operatória para o mesmo olho que foi submetido à cirurgia na Visita 1 (Período 1 [SE1] ou Período 2 [SE2]).
[00538] As seguintes avaliações serão realizadas: amostra de excreção vetorial – sangue, lágrimas (ambos os olhos), urina, saliva, amostra de imunogenicidade (ELISA e ELISPOT), BCVA, exame oftálmico completo (incluindo IOP, exame de lâmpada de fenda, opacidade de lente e exame de fundo de olho dilatado), SD-OCT, autofluorescência, monitoramento de AE/SAE e revisão de medicação (incluindo revisão do cartão diário de corticosteroides). Período 1 e 2, Visita 5 (Dia 14)
[00539] Para a Visita 5 (Dia 14 ± 3 dias), as avaliações e procedimentos oculares são realizados em cada olho. Na Visita 5 (Dia 14 ± 3 dias), os indivíduos retornam ao sítio para sua quarta visita pós- operatória para o mesmo olho que foi submetido à cirurgia na Visita 1 (Período 1 [SE1] ou Período 2 [SE2]). As seguintes avaliações serão realizadas: amostra de excreção vetorial – sangue, lágrimas (ambos os olhos), urina, saliva, amostra de imunogenicidade (ELISA e ELISPOT), BCVA, exame oftálmico completo (incluindo IOP, exame de lâmpada de fenda, opacidade de lente e exame de fundo de olho dilatado), SD-OCT, autofluorescência, monitoramento de AE/SAE e revisão de medicação (incluindo revisão do cartão diário de corticosteroides) Período 1 e 2, visita 6 (mês 1) e visita 7 (mês 3)
[00540] Para a Visita 6 (mês 1 ± 7 dias) e Visita 7 (mês 3 ± 14 dias), avaliações e procedimentos oculares serão realizados em cada olho. As seguintes avaliações são realizadas: amostra de excreção vetorial – sangue, lágrimas (ambos os olhos), urina, saliva, amostra de imunogenicidade (ELISA e ELISPOT), BCVA, exame oftálmico completo (incluindo IOP, exame de lâmpada de fenda, opacidade de lente e exame de fundo de olho dilatado), SD-OCT, autofluorescência, monitoramento de AE/SAE e revisão de medicação (incluindo revisão do cartão diário de corticosteroides). Período 1 e 2, visita 8 (mês 6) e visita 9 (mês 12)
[00541] Para a Visita 8 (mês 6 ± 14 dias) e Visita 9 (mês 12 ± 14 dias), as avaliações e procedimentos oculares são realizados em cada olho. As seguintes avaliações são realizadas: sinais vitais (visita 9, mês 12 apenas), amostragem de imunogenicidade (ELISA e ELISPOT), BCVA, exame oftálmico completo (incluindo IOP, exame de lâmpada de fenda, opacidade de lente e exame de fundo dilatado), SD-OCT, autofluorescência, microperimetria, retinografia colorida de 7 campos (incluindo fotografias estéreo para os campos 1, 2 e 3) (Visita 9, Mês 12 apenas), monitoramento AE/SAE e revisão de medicação. Encerramento Antecipado
[00542] No caso de um indivíduo interromper o estudo a qualquer momento, o centro deve envidar todos os esforços razoáveis para garantir que uma visita ET seja realizada. As avaliações a seguir devem ser realizadas (todas as avaliações oftálmicas serão realizadas em ambos os olhos): sinais vitais, amostra de excreção vetorial - sangue, lágrimas (ambos os olhos), urina, saliva (apenas se a visita ET ocorrer dentro de 3 meses após o tratamento), amostragem de imunogenicidade (ELISA e ELISPOT), BCVA, exame oftálmico completo (incluindo IOP, exame de lâmpada de fenda, opacidade de lente e exame de fundo dilatado), SD-OCT, autofluorescência, microperimetria, retinografia colorida de 7 campos (incluindo estéreo fotografias para os campos 1, 2 e 3), monitoramento de AE/SAE e revisão de medicação.
Evento Adverso
[00543] Um AE é qualquer ocorrência médica desagradável em um indivíduo de investigação clínica, que não tem necessariamente uma relação causal com o medicamento em estudo/procedimento cirúrgico. Um AE pode, portanto, ser qualquer sinal desfavorável e não intencional (incluindo um achado laboratorial anormal), sintoma ou doença temporariamente associada ao uso do medicamento em estudo/procedimento cirúrgico, seja ou não relacionado ao produto investigacional ou ao procedimento cirúrgico descrito em este protocolo. Os AEs também devem incluir qualquer condição pré-existente (diferente de CHM) ou doença que piora durante o estudo (ou seja, aumentos na frequência ou intensidade). Eventos Adversos Graves
[00544] Um SAE é definido como qualquer ocorrência médica desagradável que: resulta em morte, é fatal, requer internação hospitalar ou prolongamento da hospitalização existente, resulta em deficiência/incapacidade persistente ou significativa, é uma anomalia congênita/defeito de nascença, resulta em perda de visão ou ameça a visão, é/são outro(s) evento(s) médico(s) importante(s). O termo 'risco de vida' na definição de 'grave' refere-se a um evento em que o indivíduo está em risco de morte no momento do evento. Não se refere a um evento que hipoteticamente poderia causar a morte se fosse mais grave. A hospitalização por quadro pré-existente, incluindo procedimentos eletivos, que não se agravou, não constitui SAE. Outros eventos que podem não resultar em morte, não são fatais ou não requerem hospitalização podem ser considerados um SAE quando, com base no julgamento médico apropriado, o evento pode colocar o indivíduo em risco e pode exigir intervenção médica ou cirúrgica para prevenir um dos resultados listados acima.
[00545] A seguinte perda de visão ou eventos de ameaça à visão devem ser relatados como SAEs: diminuição sustentada em VA de ≥ 15 letras no gráfico ETDRS em comparação com a linha de base, exceto para eventos relacionados à cirurgia. Sustentado é definido como a duração de 48 horas ou mais até a recuperação; recuperação definida como VA retornou dentro de 5 letras da VA de avaliação inicial.
[00546] Eventos relacionados à cirurgia de diminuição de VA são definidos como diminuições de VA ocorrendo em associação temporal próxima (dentro de <24 horas) com a administração cirúrgica da medicação do estudo, e que estão resolvendo no Dia 7 (Período 1/2, Visita 4) após cirurgia. Esses eventos não devem ser relatados como um AE ou SAE. No entanto, devem ser relatados como um AE se, na opinião do investigador, sua evolução em termos de duração ou gravidade não puder ser explicada pelo procedimento. Isso incluiria, mas não se limitaria aos casos em que o curso anormal de diminuição de VA pós-cirurgia está associado a outra complicação atribuível à cirurgia ou à medicação do estudo, ou em que o curso anormal de diminuição de VA pós-cirurgia pode ser atribuído a outro causa identificável. Os AEs que, na opinião do investigador, realmente ou potencialmente requerem qualquer intervenção cirúrgica ou médica para prevenir a perda permanente da visão. Avaliações de Laboratório Excreção vetoriales
[00547] Amostras de sangue, lágrimas (ambos os olhos), urina e saliva são coletadas e testadas usando um ensaio apropriado para evidências de excreção e dispersão vetorial. Imunogenicidade
[00548] Para a avaliação da imunogenicidade, o sangue será coletado nos horários indicados na Tabela 61 (Cronograma de Procedimentos do Estudo). Os imunoensaios são planejados para avaliar as respostas baseadas em anticorpos e células contra AAV2-
REP1. Os ensaios ELISPOT serão usados para respostas imunes mediadas por células T ao transgene, e as respostas de anticorpos serão avaliadas usando métodos baseados em ELISA. Sinais Vitais
[00549] Os sinais vitais (frequência cardíaca e pressão arterial sistólica e diastólica) serão medidos nos horários indicados na Tabela 61 (Cronograma de Procedimentos do Estudo). Os sinais vitais devem ser medidos após o indivíduo estar sentado por pelo menos 5 minutos. Exame Oftálmico Completo
[00550] Um exame oftalmológico completo será realizado para ambos os olhos nos momentos indicados na Tabela 61 (Cronograma de procedimentos do estudo). O exame oftálmico incluirá IOP, exame com lâmpada de fenda, graduação da opacidade do cristalino e oftalmoscopia dilatada. A mesma máquina de lâmpada de fenda e condições de iluminação devem ser usadas nas visitas de estudo para qualquer indivíduo. Além dos parâmetros listados acima, os indivíduos relevantes são examinados cuidadosamente quanto à presença de inflamação intraocular após a administração do vetor. A catarata também pode se desenvolver como resultado do procedimento de vitrectomia e pode afetar a VA. A graduação pré-operatória da opacidade e cor da lente deve, portanto, ser documentada. Os indivíduos que desenvolvem catarata podem ser submetidos à cirurgia de catarata, se considerada clinicamente necessária. Se a cirurgia de catarata for realizada, ela será realizada pelo menos 4 semanas antes do mês 12 (visita 9) para o respectivo olho. Retinografia colorida de 7 campos
[00551] A retinografia colorida de sete campos será realizada para ambos os olhos nos momentos indicados na Tabela 61 (Cronograma de Procedimentos de Estudo). A retinografia é realizada por técnicos certificados após a dilatação da pupila. As fotos estéreo devem ser realizadas para os campos 1, 2 e 3. Todas as fotografias de fundo serão enviadas pelos sítios ao Centro Central de Leitura (CRC) para revisão; o CRC irá inserir os dados no sistema de captura eletrônica de dados (EDC). Para especificações técnicas completas para retinografia, consulte o Manual de Operações do Estudo (que incluirá procedimentos do CRC sobre como as medições devem ser feitas).
AVALIAÇÃO DE EFICÁCIA Acuidade visual
[00552] Para avaliar as mudanças na acuidade visual (VA) durante o período de estudo, a BCVA é avaliada usando o gráfico de VA ETDRS e realizada em ambos os olhos nos tempos indicados na Tabela 61: (Cronograma de Procedimentos de Estudo). O teste de BCVA deve ser realizado antes da dilatação da pupila e a distância de refração deve ser realizada antes da medição de BCVA. Inicialmente, as letras são lidas a uma distância de 4 metros do gráfico. Se < 20 letras forem lidas a 4 metros, o teste a 1 metro deve ser realizado. A BCVA deve ser relatada como o número de letras lidas corretamente pelo indivíduo. Para BCVA, os avaliadores serão devidamente qualificados para realizar a avaliação. Autofluorescência de Fundo
[00553] Para avaliar as alterações na área de tecido retiniano viável, a autofluorescência do fundo é realizada em ambos os olhos nos momentos indicados na Tabela 61 (Cronograma de Procedimentos de Estudo). Tomografia de Coerência Ótica de Domínio Espectral (SD-OCT)
[00554] SD-OCT são realizados em ambos os olhos nos momentos indicados na Tabela 61 (Cronograma de Procedimentos de Estudo). SD- OCT é usado para quantificar a integridade da zona elipsoide e a redução do sinal da camada nuclear externa e da coroide. Além disso, as alterações foveais são avaliadas.
Microperimetria
[00555] A microperimetria é realizada em ambos os olhos nos momentos indicados na Tabela 61 (Cronograma de procedimentos de estudo). A microperimetria é conduzida para avaliar as mudanças na sensibilidade da retina dentro da mácula.
Tabela 61: Cronograma de procedimentos de estudo Período 1/Período 2 do Estudo Visitac Visitad Não ET Agendada Visita V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 Injeção Dia 0 Diab Dia 1 Dia 3 Dia/Mês do Estudo (Triagem ≤ Pós- Pós- Dia 7 Dia 14 M1 M3 M6 M 12 Janela da Visita Triagema 10 semanas) op op ± 1d ± 3d ± 7d ± 14d ± 14d ± 14d Avaliação/Procedimentos (Todos os indivíduos/olhos) Consentimento Informado X Perfil demográfico, histórico médico e ocular X Sinais vitais (frequência cardíaca, pressão sanguínea) X X X X X Pesoe X Amostragem da excreção vetorialf X X X X X X X X' Amostragem de imunogenicidade (ELISA e ELISPOT) X X X X X X X X X 223/248
BCVA X X X X X X X X X X Exame oftalmológico completoh X X X X X X X X X X X X SD-OCT X X X X X X X X X X X Autofluorescência X X X X X X X X Microperimetria X X X X X X Retinografia colorida de 7 campos X X X Droga em estudo/injeção sub- X retinal/vitrectomia/descolamento da retina Monitoramento de AE/SAEj X X X X X X X X X X X X Medicação concomitantek X X X X X X X X X X X X
Exemplo 15: Estudo Estelar
[00556] Este estudo é um estudo aberto, com avaliador de resultados mascarado, prospectivo, randomizado, controlado em grupo paralelo, multicêntrico, global e intervencionista. O estudo consiste em 8 visitas com um período de avaliação de 12 meses. Na visita de triagem/avalição inicial, cada indivíduo é avaliado quanto à elegibilidade. Para os indivíduos elegíveis, um olho do estudo é atribuído e os indivíduos são randomizados em uma razão de 2:1:2 para receber uma alta dose de AAV2-REP1 (1,0×1011 partículas do genoma [gp]), AAV2-REP1 baixa dose (1,0×1010 gp) ou para entrar no grupo de controle não tratado.
[00557] Na Visita do Dia da Injeção (Visita 2, Dia 0), os indivíduos nos braços de tratamento de alta e baixa dose de AAV2-REP1 são submetidos a vitrectomia e recebem uma injeção sub-retiniana da dose de tratamento atribuída de AAV2-REP1 em seu olho de estudo em uma dupla maneira mascarada; esses indivíduos então retornam ao sítio para duas visitas de acompanhamento pós-operatório no Dia 1 (Visita 3) e no Dia 7 (Visita 4). Os indivíduos no grupo de controle não são submetidos a cirurgia, recebem qualquer medicamento do estudo em seu olho do estudo (isto é, olho do estudo de controle) ou comparecem às duas visitas pós-operatórias no sítio. Em vez disso, ocorre um contato telefônico do sítio para o grupo de controle no Dia 0 (Visita 2), Dia 1 (Visita 3) e Dia 7 (Visita 4). Todos os indivíduos são acompanhados por 12 meses a partir da Visita 2 (Dia 0).
[00558] Os dados do estudo são coletados para ambos os olhos de cada indivíduo. Uma vez que o tratamento AAV2-REP1 requer um procedimento cirúrgico invasivo sob anestesia geral, o patrocinador, o investigador e o indivíduo são desmascarados para o procedimento do estudo (ou seja, vitrectomia e injeção sub-retiniana), no entanto, dentro dos grupos tratados, o patrocinador, o investigador e o indivíduo é mascarado para a dose atribuída (1,0×1011 gp o 1,0×1010 gp). Para minimizar adicionalmente o potencial de enviesamento das avaliações oculares tratadas e não tratadas, todas as avaliações oftálmicas subjetivas na visita de triagem/avaliação inicial (Visita 1) e a partir do Mês 1 (Visita 5) em diante (incluindo a avaliação do desfecho primário do mês 12) serão conduzidas por um assessor mascarado.
[00559] Os indivíduos são avaliados quanto à eficácia e segurança ao longo do estudo, conforme indicado no Cronograma de Procedimentos do Estudo. Os indivíduos que desenvolvem catarata podem ser submetidos à cirurgia de catarata se considerado clinicamente necessário; se a cirurgia for realizada, ela deve ser realizada pelo menos 4 semanas antes da visita do mês 12/final do estudo (EOS). Indivíduos
[00560] Aproximadamente 140 indivíduos randomizados em uma razão de 2:1:2; 56 indivíduos no grupo de alta dose AAV2-REP1 (1,0×1011 gp), 28 indivíduos no grupo de baixa dose AAV2-REP1 (1,0×1010 gp) e 56 indivíduos no grupo de controle não tratado.
[00561] Critérios de inclusão: os indivíduos são elegíveis para participação no estudo se atenderem a todos os seguintes critérios de inclusão: (1) estão dispostos e são capazes de dar consentimento informado para a participação no estudo, (2) são do sexo masculino e ≥18 anos de idade, (3) têm um diagnóstico geneticamente confirmado de CHM, (4) têm doença ativa clinicamente visível na região macular no olho do estudo, (5) têm um BCVA de 34-73 letras ETDRS (equivalente a pior ou igual a 6/12 ou acuidade de Snellen de 20/40, mas melhor ou igual a 6/60 ou acuidade de Snellen de 20/200) no olho do estudo.
[00562] Critérios de exclusão: os indivíduos não são elegíveis para participação no estudo se atenderem a qualquer um dos seguintes critérios de exclusão: (1) têm um histórico de ambliopia no olho elegível,
(2) não estão dispostos a usar métodos anticoncepcionais de barreira, por um período de 3 meses, se tratado com AAV2-REP1, (3) cirurgia intraocular anterior realizada no olho do estudo dentro de 3 meses da Visita 1, (4) ter qualquer outra doença/distúrbio ocular ou não ocular significativo que, na opinião do investigador, pode colocar os indivíduos em risco devido à participação no estudo ou pode influenciar os resultados do estudo ou a capacidade do indivíduo de participar do estudo (incluindo, mas não se limitando a, uma contra-indicação ao corticosteroide oral (por exemplo, prednisolona/prednisona), com catarata clinicamente significativa, que, na opinião clínica do investigador, não é um candidato adequado para cirurgia sub-retiniana), e (5) ter participado de outro estudo de pesquisa envolvendo um produto investigacional nas últimas 12 semanas ou recebeu uma terapia baseada em genes/células em qualquer momento anterior.
[00563] Produto de teste, dosagem e modo de administração: Todos os indivíduos recebendo tratamento ativo são submetidos à vitrectomia e recebem um volume de 0,1 mL de injeção sub-retinal da droga do estudo contendo alta dose (1,0 × 1011 gp) de AAV2-REP1 ou dose baixa (1,0 ×1010 gp) de AAV2-REP1 em seu olho de estudo.
[00564] Critérios de Avaliação:
[00565] O desfecho primário de eficácia é a proporção de indivíduos com melhora ≥15 letras da linha de base na melhor acuidade visual corrigida (BCVA) no mês 12, conforme medido pelo gráfico do estudo de tratamento precoce da retinopatia diabética (ETDRS). O desfecho secundário chave é a proporção de indivíduos com uma melhoria ≥15 letras da linha de base no BCVA no Mês 12 quando comparado com a mudança no BCVA ao longo de 12 meses. Outros desfechos secundários incluem (1) proporção de indivíduos com um aumento> 10 letras da linha de base em BCVA no mês 12, (2) média da mudança média da linha de base em BCVA coletada ao longo dos meses 4, 8 e
12, (3) mudança de linha de base na área total de autofluorescência (AF) preservada no mês 12, (4) alteração da linha de base na área da zona de elipsoide preservada (tomografia de coerência óptica de domínio espectral [SD-OCT]) no mês 12, (5) alteração da linha de base em microperimetria no mês 12, (6) alteração da linha de base no escore de sensibilidade ao contraste no mês 12, (7) alteração da linha de base na visão de cores no mês 12, (8) alteração da linha de base no teste de velocidade de leitura no mês 12, (9) manutenção de BCVA no mês 12, conforme medido pelo gráfico ETDRS, (10) alteração da linha de base no Questionário de Função Visual de 25 itens (VFQ-25) no mês 12. Um desfecho exploratório de eficácia inclui avaliação de bronzeamento de outras medidas de resultados anatômicas e funcionais. Um desfecho de segurança inclui uma avaliação de avaliações de segurança, incluindo eventos adversos (AEs).
[00566] Eficácia: A avaliação da eficácia é baseada em BCVA, AF de fundo, SD-OCT, microperimetria, sensibilidade ao contraste, visão de cores, avaliações de teste de velocidade de leitura, VFQ-25 e acuidade visual de baixa luminância (LLVA).
[00567] Segurança: A avaliação de segurança é baseada em exame oftálmico completo (incluindo pressão intraocular, exame de lâmpada de fenda, graduação de opacidade de lente e oftalmoscopia dilatada), retinografia, relatório de AE, imunogenicidade e sinais vitais. Qualquer informação de segurança coletada como resultado das avaliações de eficácia (por exemplo, BCVA) é usada na avaliação geral de segurança, conforme apropriado. Projeto do Estudo
[00568] A Figura 24 fornece um esquema do desenho deste estudo.
[00569] Na visita de triagem/linha de base (Visita 1), cada indivíduo é avaliado quanto à elegibilidade de ambos os olhos. Se um indivíduo tiver apenas 1 olho elegível, esse olho é designado como o "olho do estudo" e o outro olho (não elegível) do indivíduo é designado como o "olho fellow." Se um indivíduo tem 2 olhos elegíveis, a seleção do "olho do estudo" é feita por motivos clínicos e geralmente é o pior olho afetado. Esta decisão é discutida em detalhes e acordada com cada indivíduo como parte do processo de consentimento informado. A escolha do indivíduo é considerada nos casos em que a degeneração é relativamente simétrica entre os dois olhos.
[00570] Na visita de triagem/linha de base, os indivíduos elegíveis serão randomizados em uma razão de 2:1:2 para o grupo de alta dose AAV2-REP1 (1,0×1011 gp), o grupo de baixa dose AAV2-REP1 (1,0×1010 gp) ou o grupo de controle não tratado. Para facilitar a compreensão do desenho do estudo, os olhos são classificados em 4 categorias com base na atribuição do grupo de tratamento e na designação do estudo/olho fellow: olho do estudo AAV2-REP1 (inclui dose alta e baixa); AAV2-REP1-olho fellow (inclui dose alta e baixa); controle-olho de estudo; e Controle-olho fellow.
[00571] Na visita do dia da injeção (Visita 2, Dia 0), os indivíduos nos grupos de tratamento AAV2-REP1 são submetidos a vitrectomia e descolamento de retina antes de receber uma injeção sub-retinal de AAV2-REP1 em dose alta (1,0×1011 gp) ou AAV2-REP1 baixa dose (1,0×1010 gp) no olho do estudo (isto é, olho do estudo AAV2-REP1) de maneira duplamente mascarada; esses indivíduos então retornam ao sítio para 2 visitas de acompanhamento pós-operatório no Dia 1 (Visita 3) e Dia 7 (Visita 4). Os indivíduos do grupo de controle não são submetidos à cirurgia, recebem a droga do estudo ou participam das 2 visitas pós-operatórias de segurança no sítio. Em vez disso, ocorre um contato telefônico do sítio para o grupo de controle no Dia 0 (Visita 2), Dia 1 (Visita 3) e Dia 7 (Visita 4). Todos os indivíduos são acompanhados por 12 meses a partir da Visita 2 (Dia 0).
[00572] Os dados do estudo são coletados para ambos os olhos de cada indivíduo. Uma vez que o tratamento AAV2-REP1 requer um procedimento cirúrgico invasivo sob anestesia geral, o patrocinador, o investigador e o indivíduo são desmascarados para o procedimento do estudo (ou seja, vitrectomia e injeção sub-retinal), no entanto, dentro dos grupos tratados, o patrocinador, o investigador e o indivíduo são mascarados (isto é, máscara dupla) para a dose designada (1,0×10 11 gp ou 1,0×1010 gp). Para minimizar ainda mais o potencial enviesamento das avaliações oculares tratadas e não tratadas, todas as avaliações oftálmicas subjetivas na visita de triagem/linha de base (Visita 1) e do mês 1 (Visita 5) em diante, são conduzidas por um avaliador mascarado. Os indivíduos são avaliados quanto à eficácia e segurança ao longo do estudo. A avaliação da eficácia é baseada em BCVA, AF de fundo, SD- OCT, microperimetria, sensibilidade ao contraste, visão de cores, avaliações de teste de velocidade de leitura, VFQ-25 e acuidade visual de baixa luminância (LLVA). A avaliação de segurança é baseada em exame oftálmico completo (incluindo pressão intraocular [IOP], exame de lâmpada de fenda, graduação de opacidade de lente e oftalmoscopia dilatada), retinografia, relatório de evento adverso (AE), avaliações laboratoriais (imunogenicidade) e sinais vitais. Qualquer informação de segurança coletada como resultado das avaliações de eficácia (por exemplo, BCVA) é usada na avaliação geral de segurança, conforme apropriado.
[00573] Os indivíduos que desenvolvem catarata podem ser submetidos à cirurgia de catarata se considerado clinicamente necessário; se a cirurgia for realizada, ela deve ser realizada pelo menos 4 semanas antes da visita do mês 12/final do estudo (EOS) (desfecho primário).
[00574] Um indivíduo é considerado como tendo concluído o estudo se ele concluir as avaliações do mês 12. O final do ensaio é a data em que o último indivíduo conclui suas avaliações do mês 12 (ou avaliações de encerramento antecipado [ET] no caso de interrupção prematura) ou a data da última coleta de dados se o último indivíduo for perdido para acompanhamento. Após a conclusão do estudo, os indivíduos tratados são convidados a participar de um estudo de acompanhamento de longo prazo que permite o monitoramento contínuo da eficácia e segurança por um período de 5 anos após o tratamento. Tratamentos Administrados
[00575] Na visita de triagem/linha de base, os indivíduos elegíveis são randomizados em uma razão de 2:1:2 para receber uma dose baixa de AAV2-REP1 (1,0×1010 gp) ou uma dose alta de AAV2-REP1 (1,0 1011 gp), enquanto os indivíduos no grupo de controle não tratado, não recebeu cirurgia simulada ou medicação do estudo. Na visita do dia da injeção (Visita 2, Dia 0), AAV2-REP1 é administrado como uma injeção sub-retinal após vitrectomia para indivíduos nos grupos AAV2-REP1. Descrição da Composição Farmacêutica
[00576] O vetor AAV2 contém cDNA humano recombinante que codifica REP1 (AAV2-REP1). O genoma do vetor (AAV2-CBA-hREP1- WPRE-BGH) é composto por um cassete de expressão constitutivo forte, um promotor CBA híbrido, o cDNA humano que codifica REP1, uma sequência do elemento regulador pós-transcricional (WPRE) modificado do vírus da hepatite da marmota, e uma sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (BGH-poliA) flanqueada por repetições terminais invertidas de AAV2. O fragmento de cDNA foi originalmente isolado de uma biblioteca de cDNA retinal humana de indivíduos não afetados.
[00577] O produto farmacêutico AAV2-REP1 é formulada em uma solução tamponada com Tris 20 mM estéril, pH 8,0, e contém MgCl2 de 1 mM, NaCl de 200 mM e PF68 de 0,001%. O produto farmacêutico é uma suspensão límpida a ligeiramente opalescente, incolor e filtrada por esterilização com uma concentração alvo de 1× 1012 gp/mL.
[00578] AAV2-REP1 é fornecido em frascos estéreis, rolhados e tampados. Um total de 0,3 mL de suspensão de vetor é fornecido para cada olho a ser tratado. Antes do envio, cada frasco é colocado em um recipiente secundário rotulado. O produto farmacêutico deve ser armazenado a <−60°C (−76°F) em um acesso controlado, freezer com temperatura monitorada. Procedimento de vitrectomia e injeção de AAV2-REP1
[00579] A injeção de AAV2-REP1 é realizada por um cirurgião de retina devidamente qualificado e experiente. Devido à complexidade e imprevisibilidade do descolamento da retina no CHM, no qual a retina e a coroide podem ser extremamente finas e fundidas em alguns lugares, foi desenvolvida uma modificação na técnica de terapia gênica sub- retinal. Isso envolve a realização da entrega do vetor em 2 etapas após a vitrectomia. Uma vantagem de um procedimento de 2 etapas é que quaisquer complicações inesperadas do descolamento da retina podem ser gerenciadas de forma conservadora, minimizando as preocupações com o escape do vetor para o vítreo. Além disso, a injeção poderia ser adiada para uma data posterior se, por exemplo, um buraco macular fosse criado que exigisse tratamento com gás. Além disso, uma vez que o volume de fluido necessário para destacar a fóvea é variável, removendo o vetor da primeira etapa, uma dose consistente precisa em termos de partículas do genoma ainda pode ser aplicada no espaço sub- retinal.
[00580] Inicialmente, os indivíduos são submetidos a uma vitrectomia padrão e descolamento do hialoide posterior no respectivo olho do estudo (Figura 23). Todas as cirurgias serão realizadas usando o sistema de vitrectomia padrão BIOM. Uma abordagem suturada de calibre 23 é geralmente preferida para evitar quaisquer riscos potenciais de vazamento da ferida. A retina será descolada com 0,1-0,5 mL de solução salina balanceada (BSS) injetada através de uma cânula sub-
retinal calibre 41 conectada a um conjunto de injeção de vítreo. Uma única dose de AAV2-REP1 será injetada no fluido sub-retinal através do mesmo sítio de entrada.
[00581] Na segunda etapa do procedimento, a cânula BSS é removida do olho e AAV2-REP1 é preparada para injeção. Uma dose de 1,0×1011 AAV2-REP1 gp é injetada no espaço sub-retinal através do mesmo sítio de entrada. O vetor precisa ser preparado na seringa de 1 mL para evitar a formação de bolhas de ar e um conector é usado para que a seringa de 1 mL possa ser conectada à linha de pressão constante da máquina de vitrectomia. A injeção sub-retinal terá como alvo qualquer área da mácula, mas também incluirá a fóvea, se possível. Em cada caso, o vetor é injetado de modo que o fluido sub-retinal se sobreponha a todos os limites da borda da região central que ainda não sofreu degeneração coriorretiniana, conforme identificado pela autofluorescência do fundo. Após o fechamento da ferida, deve-se ter o cuidado de descartar todos os fluidos de irrigação que possam ter passado pelo olho para limitar a disseminação potencial do vetor. Randomização
[00582] Na visita de triagem/linha de base, todos os pacientes recebem um identificador de triagem, que inclui o número do centro e o número do paciente. Se o indivíduo atender a todos os critérios de elegibilidade na visita de triagem/linha de base, um olho do estudo é atribuído e o indivíduo é randomizado em uma razão de 2:1:2 para receber uma dose alta de AAV2-REP1 (1,0×1011 gp), AAV2-REP1 dose baixa (1,0×1010 gp) ou para entrar no grupo de controle não tratado. A randomização é gerada usando um sistema validado que automatiza a atribuição aleatória de grupos de tratamento para números de randomização e estratificado por grupo cirúrgico.
[00583] Terapia Concomitante:
[00584] Os indivíduos não podem ter participado de outro estudo de pesquisa envolvendo um produto experimental nas últimas 12 semanas ou recebido uma terapia baseada em genes/células em qualquer momento anterior, exceto se tratados em outro estudo com AAV2- REP1. Ao longo do estudo, os investigadores podem prescrever quaisquer medicamentos ou tratamentos concomitantes considerados necessários para fornecer cuidados de suporte adequados. Os detalhes dos medicamentos concomitantes são coletados na visita de triagem e atualizados em cada visita do estudo (incluindo a Visita ET, se aplicável). Os medicamentos concomitantes (incluindo corticosteroide oral) tomados durante o estudo devem ser registrados nos prontuários médicos do participante e na eCRF; uma exceção a isso é qualquer medicamento usado durante a realização de um procedimento de estudo (por exemplo, anestesia, colírio dilatador).
[00585] Para minimizar a inflamação resultante da cirurgia e respostas imunes potenciais ou inesperadas ao vetor/transgene, todos os indivíduos receberão um curso de prednisona/prednisolona oral de 21 dias antes de cada cirurgia. Assim, para cada cirurgia, seria de 1 mg/kg/dia de prednisona/prednisolona por um total de 10 dias (começando 2 dias antes da injeção do vetor, no dia da injeção e depois por 7 dias); seguido de 0,5 mg/kg/dia por 7 dias; 0,25 mg/kg/dia por 2 dias; e 0,125 mg/kg/dia por 2 dias (21 dias no total). Os detalhes do uso de corticosteroides são capturados por cada indivíduo em um cartão de diário.
VISITAS DE ESTUDO E PROCEDIMENTOS
[00586] A programação dos procedimentos do estudo é apresentada na Tabela 62: Programação dos procedimentos do estudo. Visita 1 (Visita de triagem/linha de base)
[00587] O investigador explica o propósito do estudo, procedimentos e responsabilidades do indivíduo para cada indivíduo de estudo potencial. A vontade e a capacidade do indivíduo de atender aos requisitos do protocolo são determinadas.
[00588] Após o consentimento informado ter sido obtido, o indivíduo recebe um número identificador de indivíduo e é avaliado para determinar a elegibilidade. Os procedimentos de triagem/linha de base consistem no seguinte (as avaliações podem ser distribuídas por 2 dias consecutivos, se necessário): Demografia, história médica e ocular (apenas indivíduos com diagnóstico geneticamente confirmado de CHM podem entrar no estudo. A confirmação genética deve estar disponível antes da Visita 1); Sinais vitais; Peso; Amostragem de imunoensaio (ensaio de imunoabsorção enzimática [ELISA] e immunospot ligado a enzima [ELISPOT]); BCVA; LLVA; Exame oftálmico completo, incluindo IOP, exame com lâmpada de fenda, opacidade do cristalino e exame de fundo de olho dilatado; SD-OCT; AF; Microperimetria; Teste de sensibilidade ao contraste; Teste de visão de cores; Retinografia colorida de 7 campos (incluindo fotografias estéreo para os campos 1, 2 e 3); Teste de velocidade de leitura (se aplicável); VFQ-25; Monitoramento de AE sério (SAE); Revisão de medicação; e dispensação de corticosteroide (se randomizado para grupos AAV2- REP1). A fim de capturar valores de BCVA precisos na Visita 1 (Triagem/Linha de Base), as seguintes condições se aplicam à avaliação de BCVA: Se o valor de BCVA na Visita 1 (Triagem/Linha de Base) for ≥ ± 10 letras de ganho ou perda no olho do estudo em comparação com a visita de estudo NOITE anterior (se aplicável), então a BCVA deve ser repetida mais duas vezes, resultando em um total de 3 medidas de BCVA na Visita 1. Para facilitar as medidas de BCVA adicionais, esta visita deve ser realizada durante 2 dias, com a BCVA medida duas vezes no Dia 1 e uma vez no Dia 2 (antes da dilatação da pupila). Todos os 3 valores de BCVA devem ser registrados na eCRF. A pontuação mais alta será usada para definir a elegibilidade do indivíduo. Se o valor de BCVA na Visita 1 (Triagem/Linha de base) for
<± 10 letras de diferença no olho do estudo em comparação com a visita de estudo NOITE anterior, então o BCVA será coletado uma vez e não será repetido.
[00589] Os indivíduos que atendem a todos os critérios de inclusão e nenhum dos critérios de exclusão têm um olho de estudo atribuído e são inscritos no estudo. Neste momento, os indivíduos são informados sobre o resultado da randomização (ou seja, tratamento AAV2-REP1 ou o grupo de controle) e instruídos a não revelar sua atribuição de grupo de tratamento aos avaliadores mascarados durante o estudo. Os indivíduos randomizados para os grupos de tratamento AAV2-REP1 (junto com os Investigadores e o patrocinador) permanecem mascarados para a dose designada.
[00590] A próxima visita de estudo (Visita 2) deve ser agendada dentro de 8 semanas da Visita de triagem/linha de base. Os indivíduos randomizados para os grupos AAV2-REP1 recebem um curso de corticosteroide oral de 21 dias (por exemplo, prednisolona/prednisona) e são instruídos a começar a tomar a droga 2 dias antes da próxima visita do estudo (Visita 2). Os indivíduos randomizados para os grupos AAV2-REP1 são instruídos a usar contracepção de barreira por um período de 3 meses a partir do momento em que são tratados.
[00591] Se o indivíduo for randomizado para o grupo de controle, a Visita 2 consiste em uma chamada telefônica. Visita 2 (Dia 0, Visita do Dia da Injeção ou Contato por Telefone)
[00592] Na Visita 2 (Dia 0), todos os indivíduos nos grupos AAV2- REP1 visitarão o sítio cirúrgico e as seguintes avaliações serão realizadas: Exame oftálmico completo, incluindo IOP, exame com lâmpada de fenda, opacidade do cristalino e exame de fundo dilatado; Monitoramento de AE/SAE; Revisão de medicação concomitante; e revisão de conformidade com corticosteroides.
[00593] Os indivíduos nos grupos AAV2-REP1 são submetidos à vitrectomia e recebem uma injeção sub-retinal de AAV2-REP1, contendo uma dose baixa de AAV2-REP1 (1×1010 vg) ou uma dose alta de AAV2-REP1 (1×1012 vg) no olho do estudo. Os indivíduos são cuidadosamente monitorados quanto à ocorrência de AEs durante o procedimento. Os indivíduos retornam ao sítio 1 e 7 dias após a cirurgia para acompanhamento pós-operatório (Visitas 3 [Dia 1] e 4 [Dia 7], respectivamente).
[00594] Os indivíduos do grupo de controle recebem uma visita telefônica do estudo na data e hora combinadas. Os locais realizam as seguintes avaliações durante a chamada telefônica: monitoramento de AE/SAE e revisão de medicação concomitante. Visita 3 (visita pós-operatória do Dia 1)
[00595] Na Visita 3 (Dia 1), os indivíduos nos grupos AAV2-REP1 retornam ao sítio da cirurgia para uma visita pós-operatória. São realizadas as seguintes avaliações: Sinais vitais; Amostragem de imunoensaio (apenas ELISA); BCVA; Exame oftálmico completo, incluindo IOP, exame com lâmpada de fenda, opacidade do cristalino e exame de fundo de olho dilatado; SD-OCT; Monitoramento de AE/SAE; Revisão de medicação; e revisão de conformidade com corticosteroides. Os indivíduos são lembrados da necessidade de usar anticoncepcionais de barreira por um período de 3 meses a partir do momento do tratamento.
[00596] Os indivíduos do grupo de controle recebem uma visita telefônica do estudo na data e hora combinadas. Os locais realizam as seguintes avaliações durante a chamada telefônica: monitoramento de AE/SAE e revisão de medicação concomitante. Visita 4 (visita pós-operatória do dia 7 ± 3 dias)
[00597] Na Visita 4 (Dia 7 ± 3 dias), os indivíduos nos grupos AAV2- REP1 retornam ao seu sítio hospedeiro (ou seja, mesmo sítio onde sua Visita de triagem/linha de base da Visita 1 foi realizada) para uma segunda visita pós-operatória. No entanto, para aqueles indivíduos que viajaram de um sítio não cirúrgico para um sítio cirúrgico, e no caso de uma complicação pós-operatória ou por qualquer outro motivo de segurança considerado apropriado pelo cirurgião do estudo e pelo investigador do sítio cirúrgico, a Visita 4 pode ser realizada no sítio da cirurgia. Nesse caso, o acompanhamento pós-operatório deve continuar no sítio cirúrgico até que o cirurgião/investigador do sítio cirúrgico concorde em dar alta ao paciente aos cuidados do sítio não cirúrgico. São realizadas as seguintes avaliações: Sinais vitais; Amostragem por imunoensaio (ELISA e ELISPOT); BCVA; LLVA; Exame oftálmico completo, incluindo IOP, exame com lâmpada de fenda, opacidade do cristalino e exame de fundo de olho dilatado; SD-OCT; AF; Microperimetria, monitoramento AE/SAE; Revisão de medicação e revisão de conformidade com corticosteroides.
[00598] Os indivíduos do grupo de controle recebem uma visita telefônica do estudo na data e hora combinadas. Os locais realizam as seguintes avaliações durante a chamada telefônica: monitoramento de AE/SAE e revisão de medicação concomitante. Visita 5 (Mês 1 ± 7 dias)
[00599] Todos os indivíduos comparecem ao sítio hospedeiro (ou seja, mesmo sítio onde a visita de triagem/linha de base da Visita 1 foi realizada) a partir da Visita 5 em diante. Na visita 5 (mês 1 ± 7 dias), as seguintes avaliações são realizadas para todos os indivíduos (as avaliações podem ser distribuídas por 2 dias consecutivos, se necessário): Sinais vitais; Amostragem por imunoensaio (ELISA e ELISPOT]); BCVA; LLVA; Exame oftálmico completo, incluindo iOP, exame com lâmpada de fenda, opacidade do cristalino e exame de fundo de olho dilatado; SD-OCT; AF; Microperimetria; Monitoramento de AE/SAE; Revisão de medicação; Revisão de conformidade com corticosteroides
Visita 6 (mês 4 ± 7 dias)
[00600] Na Visita 6 (Mês 4 ± 7 dias), são realizadas as seguintes avaliações (as avaliações podem ser distribuídas por 2 dias consecutivos, se necessário): Amostragem de imunoensaio (ELISA e ELISPOT); BCVA; LLVA; Exame oftálmico completo, incluindo PIO, exame com lâmpada de fenda, opacidade do cristalino e exame de fundo de olho dilatado; SD-OCT; AF; Microperimetria; Teste de sensibilidade ao contraste; Teste de visão de cores; Monitoramento de AE/SAE e revisão de medicação. Visita 7 (mês 8 ± 14 dias)
[00601] Na Visita 7 (Mês 8 ± 14 dias), são realizadas as seguintes avaliações (as avaliações podem ser distribuídas por 2 dias consecutivos, se necessário): BCVA, LLVA; Exame oftálmico completo, incluindo IOP, exame com lâmpada de fenda, opacidade do cristalino e exame de fundo de olho dilatado; SD-OCT; AF; Microperimetria; Teste de sensibilidade ao contraste; Teste de visão de cores; Monitoramento de AE/SAE e revisão de medicação. Visita 8 (mês 12 ± 14 dias, final da visita de estudo)
[00602] Na visita 8 (mês 12 ± 14 dias), são realizadas as seguintes avaliações (as avaliações podem ser distribuídas por 2 dias consecutivos, se necessário): Sinais vitais; BCVA; LLVA; Exame oftálmico completo, incluindo IOP, exame com lâmpada de fenda, opacidade do cristalino e exame de fundo de olho dilatado; SD-OCT; AF; Microperimetria; Teste de sensibilidade ao contraste; Teste de visão de cores; Retinografia colorida de 7 campos (incluindo fotografias estéreo para os campos 1, 2 e 3); Teste de velocidade de leitura (se aplicável); VFQ-25; Monitoramento de AE/SAE e revisão de medicação. Visita de encerramento antecipado
[00603] No caso de um indivíduo interromper o estudo a qualquer momento, o centro deve envidar todos os esforços razoáveis para garantir que uma visita ET seja realizada. Devem ser realizadas as seguintes avaliações: Sinais vitais; Amostragem de imunoensaio (ELISA e ELISPOT) se a visita ET ocorrer no mês 4; BCVA; LLVA; Exame oftálmico completo, incluindo IOP, exame com lâmpada de fenda, opacidade do cristalino e exame de fundo de olho dilatado; SD- OCT; AF; Microperimetria; Teste de sensibilidade ao contraste; Teste de visão de cores; Retinografia colorida de 7 campos (incluindo fotografias estéreo para os campos 1, 2 e 3); Teste de velocidade de leitura (se aplicável); VFQ-25; Monitoramento de AE/SAE e revisão de medicação.
AVALIAÇÃO DE EFICÁCIA
[00604] Para todas as visitas, deve-se tentar realizar todos os procedimentos em ambos os olhos. Melhor acuidade visual corrigida
[00605] Para avaliar as mudanças na acuidade visual (VA) durante o período de estudo, a BCVA é avaliada para ambos os olhos usando o gráfico de VA ETDRS nos tempos indicados na Tabela 62: Cronograma de Procedimentos de Estudo. O teste de BCVA deve ser realizado antes da dilatação da pupila e a distância de refração deve ser realizada antes da medição de BCVA. Inicialmente, as letras são lidas a uma distância de 4 metros do gráfico. Se <20 letras forem lidas a 4 metros, o teste a 1 metro deve ser realizado. A BCVA deve ser relatada como o número de letras lidas corretamente pelo indivíduo. Na visita de triagem/linha de base, olhos com BCVA de 34-73 letras ETDRS (equivalente a pior ou igual a 6/12 ou 20/40 de acuidade Snellen, mas melhor ou igual a 6/60 ou 20/200 acuidade Snellen) serão elegíveis para o estudo. Se um indivíduo não consegue ler nenhuma letra no gráfico BCVA, o indivíduo é testado para contagem de dedos, movimentos de mão ou percepção de luz.
Autofluorescência de Fundo
[00606] Para avaliar as alterações na área do tecido retinal viável, a AF do fundo é realizada para ambos os olhos nos momentos indicados na Tabela 62: Esquema de procedimentos de estudo. Todas as imagens de AF do fundo são realizadas por técnicos certificados no sítio após a dilatação da pupila do indivíduo. Tomografia de Coerência Ótica de Domínio Espectral (SD-OCT)
[00607] O SD-OCT será realizado para ambos os olhos nos momentos indicados na Tabela 2: Cronograma de procedimentos do estudo. As medições SD-OCT são feitas por técnicos certificados no sítio após a dilatação da pupila do indivíduo. O SD-OCT foi emitido para avaliar uma série de variáveis, incluindo a quantificação da integridade da zona do elipsoide e a redução do sinal da camada nuclear externa e da coroide. Além disso, uma vez que o espessamento foveal progressivo foi observado na fase inicial da CHM, as alterações foveais são avaliadas. Microperimetria
[00608] A microperimetria é conduzida para ambos os olhos nos tempos indicados na Tabela 62: Cronograma de procedimentos de estudo. A microperimetria é conduzida por técnicos certificados para avaliar as alterações na sensibilidade da retina na mácula. Sensibilidade ao contraste
[00609] A sensibilidade ao contraste é medida para ambos os olhos nos momentos indicados na Tabela 62: Cronograma de procedimentos do estudo. A sensibilidade ao contraste é medida antes da dilatação da pupila usando um gráfico de Pelli-Robson. Visão de cores
[00610] A visão de cores é testada para ambos os olhos antes da dilatação da pupila nos momentos indicados na Tabela 62: Cronograma de procedimentos de estudo. Os olhos são testados separadamente e na mesma ordem em cada avaliação. Acuidade visual de baixa luminância
[00611] LLVA é medida para ambos os olhos nos momentos indicados na Tabela 62: Cronograma de procedimentos do estudo. O teste deve ser realizado após o teste de BCVA, antes da dilatação da pupila, e a distância de refração deve ser realizada antes da medição do LLVA. O LLVA é medido colocando um filtro de densidade neutra de unidade de 2,0 log sobre a frente de cada olho e fazendo com que o indivíduo leia o gráfico ETDRS normalmente iluminado. Inicialmente, as letras são lidas a uma distância de 4 metros do gráfico. Se <20 letras forem lidas a 4 metros, o teste a 1 metro deve ser realizado. LLVA deve ser relatada como o número de letras lidas corretamente pelo indivíduo. Teste de velocidade de leitura
[00612] O desempenho de leitura será avaliado antes da dilatação da pupila nos momentos indicados na Tabela 62: Cronograma de procedimentos de estudo usando textos de velocidade de leitura internacional (IReST), que fornecem avaliação padronizada do desempenho de leitura em 17 idiomas (Trauzettel-Klosinski et al., 2012). Questionário VFQ-25
[00613] Os participantes completam o VFQ-25 nos horários indicados na Tabela 62: Cronograma de procedimentos do estudo. Este questionário mede as dimensões do estado de saúde auto-relatado e direcionado para a visão que são mais importantes para pessoas com doenças oculares (Mangione et al, 2001). A melhoria no VFQ-25 é avaliada usando pontuações individuais, pontuações de subescala e a pontuação composta geral.
AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA Exame Oftálmico Completo
[00614] Um exame oftálmico completo é conduzido para ambos os olhos nos momentos indicados na Tabela 62: Programa de
Procedimentos de Estudo. Para indivíduos nos grupos AAV2-REP1, o exame oftálmico completo é conduzido antes da vitrectomia e da administração da medicação do estudo na visita do estudo aplicável. O exame oftálmico incluirá IOP, exame com lâmpada de fenda, graduação da opacidade do cristalino e oftalmoscopia dilatada. A mesma máquina de lâmpada de fenda e condições de iluminação devem ser usadas nas visitas de estudo para qualquer indivíduo.
[00615] Além dos parâmetros listados acima, os indivíduos relevantes são examinados cuidadosamente quanto à presença de inflamação intraocular após a administração do vetor. A catarata também pode se desenvolver como resultado do procedimento de vitrectomia e pode afetar a VA. A classificação pré-operatória da opacidade e cor do cristalino deve, portanto, ser documentada pelo sistema de classificação de opacidade clínica estabelecido. A cirurgia de catarata é eficaz em indivíduos com CHM e sem quaisquer riscos específicos. Portanto, se clinicamente indicado, os indivíduos que desenvolvem catarata podem ser submetidos à cirurgia de catarata. Se a cirurgia de catarata for realizada, ela deve ser realizada pelo menos 4 semanas antes da Visita do mês 12/Visita EOS. Retinografia colorida de campo
[00616] Para auxiliar na avaliação clínica objetiva de alterações progressivas da retina, a retinografia colorida de 7 campos é realizada para ambos os olhos nos momentos indicados na Tabela 62: Cronograma de procedimentos de estudo. A retinografia é realizada por técnicos certificados após a dilatação da pupila. As fotos estéreo devem ser executadas para os campos 1, 2 e 3. Evento Adverso
[00617] Um AE é qualquer ocorrência médica desagradável em um indivíduo de investigação clínica, que não tem necessariamente uma relação causal com o medicamento em estudo/procedimento cirúrgico.
Um AE pode, portanto, ser qualquer sinal desfavorável e não intencional (incluindo um achado laboratorial anormal), sintoma ou doença temporariamente associada ao uso do medicamento em estudo/procedimento cirúrgico, seja ou não relacionado ao produto investigacional ou ao procedimento cirúrgico descrito em este protocolo. Os AEs também devem incluir qualquer condição pré-existente (diferente de CHM) ou doença que piora durante o estudo (ou seja, aumentos na frequência ou intensidade). Eventos Adversos Graves
[00618] Um SAE é definido como qualquer ocorrência médica desagradável que: Resulta em morte, É fatal, Requer internação hospitalar ou prolongamento da hospitalização existente, Resulta em deficiência/incapacidade persistente ou significativa, É uma anomalia congênita/defeito de nascença, Resulta em perda de visão ou a visão é ameaçadora, é outro evento médico importante. O termo 'risco de vida' na definição de 'grave' refere-se a um evento em que o indivíduo está em risco de morte no momento do evento. Não se refere a um evento que hipoteticamente poderia causar a morte se fosse mais grave. A hospitalização por quadro pré-existente, incluindo procedimentos eletivos, que não se agravou, não constitui SAE. Outros eventos que podem não resultar em morte, não são fatais ou não requerem hospitalização podem ser considerados um SAE quando, com base no julgamento médico apropriado, o evento pode colocar o indivíduo em risco e pode exigir intervenção médica ou cirúrgica para prevenir um dos resultados listados acima.
[00619] A seguinte perda de visão ou eventos de ameaça à visão devem ser relatados como SAEs: Diminuição sustentada em VA de ≥ 15 letras no gráfico ETDRS em comparação com a linha de base, exceto para eventos relacionados à cirurgia. Sustentado é definido como a duração de 48 horas ou mais até a recuperação; recuperação definida como VA retornou dentro de 5 letras da VA basal.
[00620] Eventos relacionados à cirurgia de diminuição de VA são definidos como diminuições de VA ocorrendo em associação temporal próxima (dentro de <24 horas) com a administração cirúrgica da medicação do estudo, e que estão resolvendo no Dia 7 (Período 1/2, Visita 4) após cirurgia. Esses eventos não devem ser relatados como um AE ou SAE. No entanto, devem ser relatados como um AE se, na opinião do investigador, sua evolução em termos de duração ou gravidade não puder ser explicada pelo procedimento. Isso incluiria, mas não se limitaria aos casos em que o curso anormal de diminuição de VA pós-cirurgia está associado a outra complicação atribuível à cirurgia ou à medicação do estudo, ou onde o curso anormal de diminuição de VA pós-cirurgia pode ser atribuído a outra causa identificável. AEs que, na opinião do investigador, realmente ou potencialmente requerem qualquer intervenção cirúrgica ou médica para prevenir a perda permanente da visão. Análises de Eficácia
[00621] Os testes estatísticos são realizados no nível alfa de 0,05 (a menos que especificado de outra forma). Os testes estatísticos e CIs de 95% serão bilaterais. Desfecho de eficácia primária
[00622] O desfecho primário é calculado como a proporção de indivíduos com um aumento ≥15 letras da linha de base em BCVA na visita do mês 12. Se VA estiver ausente na visita do mês 12, o valor ausente será imputado usando o método LOCF. O desfecho primário é resumido usando as estatísticas de resumo para dados categóricos, incluindo o CI de 95%.
[00623] A proporção de sucessos para o desfecho primário é comparada entre os braços do estudo (dose alta vs controle, dose baixa vs controle) usando o teste Exato de Fisher.
Desfecho de eficácia secundária principal
[00624] O desfecho secundário principal é uma análise de amostra pareada da proporção de indivíduos com um aumento de ≥15 letras da linha de base em BCVA na visita do mês 12 em olhos de estudo tratados dentro do estudo STAR, em comparação com a proporção de indivíduos com ≥15 letras Ganho de BCVA do mês 4 (Visita 2) ao mês 16 (Visita 5) no estudo NIGHT (NSR-CHM-OS1). A análise do desfecho secundário principal é realizada no conjunto de análise de controle histórico completo. O desfecho secundário principal será resumido, pós- tratamento (dados STAR) e pré-tratamento (dados NIGHT), usando as estatísticas de resumo para dados categóricos, incluindo o CI de 95%. A proporção de sucessos para variáveis categóricas será comparada entre pré e pós-tratamento em cada braço de tratamento separadamente usando o teste de McNemar. Outros Desfechos de eficácia secundários
[00625] Os desfechos secundários categóricos são resumidos e analisados usando o mesmo procedimento que o desfecho primário categórico.
[00626] Os desfechos secundários contínuos são resumidos usando as estatísticas de resumo para dados contínuos, incluindo o CI de 95%. A diferença de tratamento na alteração média da linha de base e seu CI de 95% é calculada com base no LSMEANS do modelo ANCOVA incluindo Grupo de cirurgia, valor de linha de base da avaliação, braços de estudo e a interação entre braços de estudo e Grupo de cirurgia. A alteração da linha de base é comparada entre os braços do estudo (dose alta vs controle, dose baixa vs controle) usando o modelo ANCOVA acima. Para a pontuação geral composta de VFQ-25, as covariáveis Idade e Raça são adicionadas ao modelo. Análises de Segurança
[00627] Nenhum teste de significância é realizado para análises de segurança. As análises de segurança são descritivas, com CIs de 95% calculados quando apropriado. Eventos Adversos
[00628] Os AEs são codificados usando o Dicionário Médico para Indivíduos Regulatórios. A versão do dicionário atual no momento do bloqueio do banco de dados será usada. Os eventos são resumidos por classe de sistema de órgãos, termo preferido e grupo. Tanto o número de olhos/indivíduos experimentando um AE quanto o número de eventos são resumidos. Resumos semelhantes são produzidos para AEs relacionados à droga/ procedimento do estudo, AEs que levam à descontinuação e SAEs. Os AEs são resumidos por gravidade máxima, relação com a droga/procedimento do estudo e tempo para início e resolução. Exame Oftálmico Completo
[00629] IOP e a alteração da linha de base na IOP são resumidas por visita, por tratamento e a olho nu. Os achados anormais do exame da lâmpada de fenda e os achados da oftalmoscopia dilatada e a mudança da linha de base são resumidos por visita, por tratamento e por olho. As categorias de opacidade da lente e o deslocamento da linha de base são resumidos por visita, por tratamento e a olho nu. Retinografia Colorida de Campo
[00630] As categorias de descobertas da retinografia colorida e a mudança da linha de base são resumidas por visita, por tratamento e a olho nu.
Tabela 62: Cronograma dos Procedimentos do Estudo. Encerra- Visita não Visita Visita Visita Visita Visita Visita mento agendada Visita Visita 1a 2b 3b Visita 4b 5a 6a 7a 8a,c Antecipadod e Dia 0 Dia 1 Dia 7 Mês Mês Triagem/Valor Dia da Pós Pós op. 1 4 Mês 8 Mês 12 Dia do Estudo/Janela de Visita de referência injeção op.  3d  7d  7d  14d  14d Avaliações/Procedimentos (Todos os indivíduos/olhos, salvo quando especificado em contrário) Consentimento informado X Perfil demográfico, histórico médico e ocular X Sinais vitais (frequência cardíaca, pressão sanguínea) X X X X X X 247/248 Pesog X Amostra sanguínea de imunoensaio (ELISA)h X X X X X Xq Amostra sanguínea de imunoensaio (ELISPOT)h X X X X Xq BCVA Xi X X X X X X X X
LLVA X X X X X X X Exame oftalmológico completoi X X X X X X X X X X SD-OCT X X X X X X X X X Autofluorescência X X X X X X X X Microperimetria X X X X X X X Sensibilidade ao contrastej X X X X X Visão de cores X X X X X Retinografia colorida de 7 camposk X X X Teste de velocidade de leitural X X X VFQ-25m X X X
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
[00631] Todos os documentos citados neste documento, incluindo qualquer pedido ou patente relacionados ou referenciados, é incorporado neste documento por referência na sua totalidade, a menos que expressamente excluído ou limitado de outra forma. A citação de qualquer documento não é uma admissão de que é técnica anterior com respeito a qualquer invenção divulgada ou reivindicada neste documento ou sozinha, ou em qualquer combinação com qualquer outra referência ou referências, ensinamentos, sugestões ou divulgações de qualquer invenção. Além disso, na medida em que qualquer significado ou definição de um termo neste documento conflita com algum significado ou definição do mesmo termo em um documento incorporado por referência, o significado ou definição atribuído a esse termo neste documento irá prevalecer.
OUTRAS MODALIDADES
[00632] Embora modalidades particulares da descrição tenham sido ilustradas e descritas, várias outras mudanças e modificações podem ser feitas sem se afastar do sentido e do escopo da descrição. O sentido das reivindicações anexas inclui todas as mudanças e modificações que estão dentro do escopo desta descrição.

Claims (213)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para a purificação de uma partícula de AAV recombinante (rAAV) a partir de uma cultura de células hospedeiras de mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) cultivar uma pluralidade de células hospedeiras de mamíferos em um meio de cultura sob condições adequadas para a formação de uma pluralidade de partículas de rAAV, em que a pluralidade de células hospedeiras de mamíferos foi transfectada com um vetor de plasmídeo compreendendo uma sequência exógena, um vetor de plasmídeo auxiliar, e um vetor de plasmídeo compreendendo uma sequência que codifica uma proteína Rep viral e uma proteína Cap viral para produzir uma pluralidade de células hospedeiras de mamífero transfectadas; (b) colher o meio de cultura que compreende a pluralidade de células hospedeiras de mamífero transfectadas; (c) colher uma pluralidade de partículas de rAAV da pluralidade de células hospedeiras de mamífero transfectadas; (d) concentrar a pluralidade de partículas de rAAV por filtração de fluxo tangencial (TFF) para produzir uma pluralidade concentrada de partículas de rAAV; (e) enriquecer a pluralidade concentrada de partículas de rAAV para partículas de rAAV completas por ultracentrifugação de gradiente de densidade para produzir uma pluralidade enriquecida de partículas de rAAV completas; (f) purificar a pluralidade enriquecida de partículas de rAAV completas por cromatografia de troca aniônica (AEX) ou cromatografia de afinidade para produzir um eluato compreendendo uma pluralidade purificada e enriquecida de partículas de rAAV completas; e (g) diafiltrar e concentrar o eluato de (f) em um tampão de formulação por filtração de fluxo tangencial (TFF) para produzir uma composição final que compreende a pluralidade purificada e enriquecida de partículas completas de rAAV e o tampão de formulação.
2. Método para a purificação de uma partícula de AAV recombinante (rAAV) a partir de uma cultura de células hospedeiras de mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) cultivar uma pluralidade de células hospedeiras de mamíferos em um meio de cultura sob condições adequadas para a formação de uma pluralidade de partículas de rAAV-REP1, em que a pluralidade de células hospedeiras de mamíferos foi transfectada com um vetor de plasmídeo compreendendo uma sequência exógena em que a sequência endógena compreende uma sequência que codifica uma proteína Rab humana acompanhante 1 (REP1), um vetor de plasmídeo auxiliar, e um vetor de plasmídeo compreendendo uma sequência que codifica uma proteína Rep viral e uma proteína Cap viral para produzir uma pluralidade de células hospedeiras de mamífero transfectadas; (b) colher o meio de cultura que compreende a pluralidade de células hospedeiras de mamífero transfectadas; (c) colher uma pluralidade de partículas de rAAV da pluralidade de células hospedeiras de mamífero transfectadas; (d) concentrar a pluralidade de partículas de rAAV por filtração de fluxo tangencial (TFF) para produzir uma pluralidade concentrada de partículas de rAAV; (e) enriquecimento da pluralidade concentrada de partículas de rAAV para partículas de rAAV completas por ultracentrifugação de gradiente de densidade para produzir uma pluralidade enriquecida de partículas de rAAV completas; (f) purificar a pluralidade enriquecida de partículas de rAAV completas por cromatografia de troca aniônica (AEX) ou cromatografia de afinidade para produzir um eluato compreendendo uma pluralidade purificada e enriquecida de partículas de rAAV completas; e
(g) diafiltrar e concentrar o eluato de (f) em um tampão de formulação por filtração de fluxo tangencial (TFF) para produzir uma composição final que compreende a pluralidade purificada e enriquecida de partículas completas de rAAV e o tampão de formulação.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compreende uma quantidade reduzida de soro fetal bovino.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura não compreende uma quantidade reduzida de soro fetal bovino.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compreende um meio sem soro.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura consiste em um meio sem soro.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compreende um meio livre de proteínas.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura consiste em um meio livre de proteínas.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compreende glicina, cloridrato de L-Arginina, dicloridrato de L-Cistina, L-Glutamina, cloridrato de L-Histidina-H2O, L-isoleucina, L-Leucina, L-Lisina cloridrato, L-metionina, L-fenilalanina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, sal dissódico de L-tirosina desidratado, L-valina, cloreto de colina, pantotenato de D-cálcio, ácido fólico, niacinamida, cloridrato de piridoxina, riboflavina, cloridrato de tiamina, i-Inositol, Cloreto de Cálcio
(CaCl2) (anidro), Nitrato Férrico (Fe(NO3)3"9H2O), Sulfato de Magnésio(MgSO4) (anidro), Cloreto de Potássio (KCl), Bicarbonato de Sódio (NaHCO3), Cloreto de sódio (NaCl), fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4-H2O) e D-glicose (dextrose).
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizado pelo fato de que as células de mamífero foram transfectadas com uma composição que compreende um reagente de transdução PEI.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizado pelo fato de que o vetor de plasmídeo compreendendo uma sequência exógena, compreende ainda uma sequência que codifica uma repetição terminal invertida 5 '(ITR) e uma sequência que codifica uma ITR 3'.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a sequência que codifica uma ITR 5' é derivada de uma sequência que codifica uma ITR 5' de um AAV do sorotipo 2 (AAV2).
13. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a sequência que codifica uma ITR 5' compreende uma sequência que é idêntica a uma sequência que codifica uma ITR 5' de um AAV do sorotipo 2 (AAV2).
14. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a sequência que codifica uma ITR 5' compreende uma sequência que não é idêntica a uma sequência que codifica uma ITR 5' de um AAV do sorotipo 2 (AAV2).
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11-14, caracterizado pelo fato de que a sequência que codifica uma ITR 3' é derivada de uma sequência que codifica uma ITR 3' de um AAV do sorotipo 2 (AAV2).
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a sequência que codifica uma ITR 3' compreende uma sequência que é idêntica a uma sequência que codifica uma ITR 3' de um AAV do sorotipo 2 (AAV2).
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a sequência que codifica uma ITR 3' compreende uma sequência que não é idêntica a uma sequência que codifica uma ITR 3' de um AAV do sorotipo 2 (AAV2).
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11-17, caracterizado pelo fato de que a sequência que codifica uma ITR 5' ou a sequência que codifica uma ITR 3' compreende 145 pares de bases (pb).
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11-17, caracterizado pelo fato de que a sequência que codifica uma ITR 5' ou a sequência que codifica uma ITR 3' compreende ou consiste em 134, 135, 136 ou 137 (pb).
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-19, caracterizado pelo fato de que o vetor plasmídico compreendendo uma sequência exógena, o vetor plasmídeo auxiliar ou o vetor plasmídeo compreendendo uma sequência que codifica uma proteína Rep viral e uma proteína Cap viral, compreende ainda uma sequência que codifica um marcador de seleção.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a sequência que codifica um marcador de seleção transmite resistência à canamicina.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-21, caracterizado pelo fato de que a etapa de coleta (c) compreende uma interrupção mecânica da pluralidade de células de mamífero transfectadas para liberar partículas de AAV recombinante (rAAV) produzidas pela pluralidade de células de mamífero transfectadas.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a interrupção mecânica compreende uma microfluidização.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-23, caracterizado pelo fato de que a etapa de concentração compreende ainda (1) clarificar a pluralidade concentrada de partículas de rAAV por uma filtração de profundidade para produzir uma pluralidade concentrada e clarificada de partículas de rAAV.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a etapa de concentração compreende ainda (2) congelar a pluralidade concentrada e clarificada de partículas de rAAV a -80°C para produzir um intermediário de processo.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-25, caracterizado pelo fato de que a etapa de enriquecimento (e) compreende uma ultracentrifugação de gradiente de densidade de iodixanol para produzir uma pluralidade enriquecida de partículas de rAAV.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o gradiente de densidade de iodixanol compreende composições de iodixanol com concentrações de 15%, 25%, 40% e 57%.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-27, caracterizado pelo fato de que a cromatografia de afinidade da etapa de purificação (f) compreende uma matriz de AVB Sepharose.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-28, caracterizado pelo fato de que o tampão de formulação compreende Tris, MgCl2 e NaCl.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-27, caracterizado pelo fato de que o tampão de formulação compreende Tris 20 mM, MgCl2 1 mM, e NaCl 200 mM em pH 8.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações
1-28, caracterizado pelo fato de que o tampão de formulação compreende Tris 20 mM, MgCl2 1 mM, NaCl 200 mM em pH 8 e poloxâmero 188 em 0,001%.
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-31, caracterizado pelo fato de que a cromatografia AEX compreende ainda as etapas de gerar um cromatograma AEX e selecionar um pico no cromatograma AEX contendo partículas de rAAV completas.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-32, caracterizado pelo fato de que o TFF da etapa (d) ou etapa (g) é realizado usando um filtro de fibra oca de 100 kDa (HFF).
34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-33, caracterizado pelo fato de que o TFF da etapa (d) ou etapa (g) é realizado usando um HFF de 50 kDa.
35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-34, caracterizado pelo fato de que a etapa (g) o método compreende ainda um segundo TFF, em que o TFF da etapa (d) e o primeiro TFF da etapa (g) são realizados usando um HFF de 100 kDa e em que o segundo TFF da etapa (g) é realizado usando um HFF de 50 kDa.
36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-35, caracterizado pelo fato de que a sequência que codifica a proteína REP1 humana compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico de: 1 gatatcgaat tcctgcagcc cggcggcacc atggcggata ctctcccttc ggagtttgat 61 gtgatcgtaa tagggacggg tttgcctgaa tccatcattg cagctgcatg ttcaagaagt 121 ggccggagag ttctgcatgt tgattcaaga agctactatg gaggaaactg ggccagtttt 181 agcttttcag gactattgtc ctggctaaag gaataccagg aaaacagtga cattgtaagt 241 gacagtccag tgtggcaaga ccagatcctt gaaaatgaag aagccattgc tcttagcagg 301 aaggacaaaa ctattcaaca tgtggaagta ttttgttatg ccagtcagga tttgcatgaa 361 gatgtcgaag aagctggtgc actgcagaaa aatcatgctc ttgtgacatc tgcaaactcc
421 acagaagctg cagattctgc cttcctgcct acggaggatg agtcattaag cactatgagc 481 tgtgaaatgc tcacagaaca aactccaagc agcgatccag agaatgcgct agaagtaaat 541 ggtgctgaag tgacagggga aaaagaaaac cattgtgatg ataaaacttg tgtgccatca 601 acttcagcag aagacatgag tgaaaatgtg cctatagcag aagataccac agagcaacca 661 aagaaaaaca gaattactta ctcacaaatt attaaagaag gcaggagatt taatattgat 721 ttagtatcaa agctgctgta ttctcgagga ttactaattg atcttctaat caaatctaat 781 gttagtcgat atgcagagtt taaaaatatt accaggattc ttgcatttcg agaaggacga 841 gtggaacagg ttccgtgttc cagagcagat gtctttaata gcaaacaact tactatggta 901 gaaaagcgaa tgctaatgaa atttcttaca ttttgtatgg aatatgagaa atatcctgat 961 gaatataaag gatatgaaga gatcacattt tatgaatatt taaagactca aaaattaacc 1021 cccaacctcc aatatattgt catgcattca attgcaatga catcagagac agccagcagc 1081 accatagatg gtctcaaagc taccaaaaac tttcttcact gtcttgggcg gtatggcaac 1141 actccatttt tgtttccttt atatggccaa ggagaactcc cccagtgttt ctgcaggatg 1201 tgtgctgtgt ttggtggaat ttattgtctt cgccattcag tacagtgcct tgtagtggac 1261 aaagaatcca gaaaatgtaa agcaattata gatcagtttg gtcagagaat aatctctgag 1321 catttcctcg tggaggacag ttactttcct gagaacatgt gctcacgtgt gcaatacagg 1381 cagatctcca gggcagtgct gattacagat agatctgtcc taaaaacaga ttcagatcaa 1441 cagatttcca ttttgacagt gccagcagag gaaccaggaa cttttgctgt tcgggtcatt 1501 gagttatgtt cttcaacgat gacatgcatg aaaggcacct atttggttca tttgacttgc 1561 acatcttcta aaacagcaag agaagattta gaatcagttg tgcagaaatt gtttgttcca 1621 tatactgaaa tggagataga aaatgaacaa gtagaaaagc caagaattct gtgggctctt 1681 tacttcaata tgagagattc gtcagacatc agcaggagct gttataatga tttaccatcc 1741 aacgtttatg tctgctctgg cccagattgt ggtttaggaa atgataatgc agtcaaacag 1801 gctgaaacac ttttccagga aatctgcccc aatgaagatt tctgtccccc tccaccaaat 1861 cctgaagaca ttatccttga tggagacagt ttacagccag aggcttcaga atccagtgcc 1921 ataccagagg ctaactcgga gactttcaag gaaagcacaa accttggaaa cctagaggag 1981 tcctctgaat aa (SEQ ID Nº: 1)
37. Composição, de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que a proteína REP1 humana compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de
1 MADTLPSEFD VIVIGTGLPE SIIAAACSRS GRRVLHVDSR
SYYGGNWASF SFSGLLSWLK 61 EYQENSDIVS DSPVWQDQIL ENEEAIALSR KDKTIQHVEV
FCYASQDLHE DVEEAGALQK 121 NHALVTSANS TEAADSAFLP TEDESLSTMS CEMLTEQTPS
SDPENALEVN GAEVTGEKEN 181 HCDDKTCVPS TSAEDMSENV PIAEDTTEQP KKNRITYSQI
IKEGRRFNID LVSKLLYSRG 241 LLIDLLIKSN VSRYAEFKNI TRILAFREGR VEQVPCSRAD
VFNSKQLTMV EKRMLMKFLT 301 FCMEYEKYPD EYKGYEEITF YEYLKTQKLT PNLQYIVMHS
IAMTSETASS TIDGLKATKN 361 FLHCLGRYGN TPFLFPLYGQ GELPQCFCRM CAVFGGIYCL
RHSVQCLVVD KESRKCKAII 421 DQFGQRIISE HFLVEDSYFP ENMCSRVQYR QISRAVLITD
RSVLKTDSDQ QISILTVPAE 481 EPGTFAVRVI ELCSSTMTCM KGTYLVHLTC TSSKTAREDL
ESVVQKLFVP YTEMEIENEQ 541 VEKPRILWAL YFNMRDSSDI SRSCYNDLPS NVYVCSGPDC
GLGNDNAVKQ AETLFQEICP 601 NEDFCPPPPN PEDIILDGDS LQPEASESSA IPEANSETFK ESTNLGNLEE SSE (SEQ ID Nº: 2)
38. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade de partículas de rAAV produzidas pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1-37.
39. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que compreende (a) entre 0,5 e 2,5 x 1012 genomas de vetor (vg)/mL de vírus adenoassociado com replicação deficiente e recombinante (rAAV); (b) menos de 50% de capsídeos vazias; (c) menos de 4 ng/mL de proteína da célula hospedeira residual por 1,0 x1012 vg/mL; e
(d) menos de 7 x 10-3 pg/ml de DNA residual da célula hospedeira por 1,0 x1012 vg/ml.
40. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que a composição compreende ainda (e) uma pluralidade de vg/mL funcional, em que cada um dos genomas de vetor funcional é capaz de expressar uma sequência exógena em uma célula após a transdução.
41. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que, após a transdução de uma célula com a composição farmacêutica, a pluralidade de vg/mL funcional expressa a sequência exógena em um aumento de 2 vezes quando comparado a um nível de expressão de uma sequência endógena correspondente em uma célula não transduzida.
42. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que, após a transdução de uma célula com a composição farmacêutica, a pluralidade de vg/mL funcional expressa a sequência exógena em 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes, 18 vezes, 19 vezes, 20 vezes, ou qualquer outro incremento de aumento dentro desses valores, quando comparado a um nível de expressão de uma sequência endógena correspondente em uma célula não transduzida.
43. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 41 ou 42, caracterizada pelo fato de que a sequência exógena e a sequência endógena correspondente são idênticas.
44. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 41 ou 42, caracterizada pelo fato de que a sequência exógena e a sequência endógena correspondente não são idênticas.
45. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 41, 42 ou 44, caracterizada pelo fato de que a sequência exógena e a sequência endógena correspondente não são idênticas, mas uma proteína codificada pela sequência exógena e uma proteína codificada pela sequência endógena são idênticas.
46. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 42 ou 43, caracterizada pelo fato de que a sequência exógena e a sequência endógena correspondente têm pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou qualquer porcentagem entre identidade.
47. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37-44, caracterizada pelo fato de que a sequência exógena é otimizada por códons quando comparada com a sequência endógena.
48. Composição farmacêutica acordo com a reivindicação de 47, caracterizada pelo fato de que a sequência exógena e a sequência endógena correspondente têm pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou qualquer porcentagem intermediária de homologia.
49. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-48, caracterizada pelo fato de que, após a transdução de uma célula com uma composição farmacêutica da divulgação, a sequência exógena codifica uma proteína.
50. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que a proteína codificada pela sequência exógena tem um nível de atividade igual ou maior que um nível de atividade de uma proteína codificada por uma sequência correspondente de uma célula não transduzida.
51. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 50, caracterizada pelo fato de que a sequência exógena e a sequência endógena correspondente são idênticas.
52. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 50, caracterizada pelo fato de que a sequência exógena e a sequência endógena correspondente não são idênticas.
53. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 52, caracterizada pelo fato de que a sequência exógena e a sequência endógena correspondente têm pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou qualquer porcentagem entre identidade.
54. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49-52, caracterizada pelo fato de que a atividade compreende a ligação, ativação e/ou transferência de um ou mais grupos funcionais para um ligante ou substrato.
55. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-54, caracterizada pelo fato de que a proteína compreende uma proteína REP-1 e a atividade compreende uma prenilação do substrato REP-1.
56. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-55, caracterizada pelo fato de que compreende (a) entre 1,0 e 2,0 x 1012 genomas de vetor (vg)/mL de vírus adenoassociado com replicação defeituosa e recombinante (AAV).
57. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-55, caracterizada pelo fato de que compreende (a) cerca de 1,0 x 1012 genomas de vetor (vg)/mL de vírus adenoassociado com replicação defeituosa e recombinante (AAV).
58. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-55, caracterizada pelo fato de que compreende (a) genomas de vetor 1,0x 1012 (vg)/mL de vírus adenoassociado com replicação defeituosa e recombinante (AAV).
59. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-55, caracterizada pelo fato de que compreende
(b) menos de 50% de capsídeos vazias ou menos de 30% de capsídeos vazias.
60. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-59, caracterizada pelo fato de que o vírus adenoassociado com replicação defeituosa e recombinante (rAAV) contém uma sequência isolada ou derivada de um AAV do sorotipo 2 (AAV2).
61. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 60, caracterizada pelo fato de que a sequência isolada ou derivada de um AAV2 compreende uma sequência que codifica uma repetição terminal invertida (ITR).
62. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 60 ou 61, caracterizada pelo fato de que o vírus adenoassociado com replicação deficiente e recombinante (rAAV) contém uma sequência que codifica uma ITR 5' e uma sequência que codifica uma ITR 3'.
63. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 62, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica uma ITR 5' e a sequência que codifica uma ITR 3' compreende uma sequência de tipo selvagem de uma ITR de AAV2.
64. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-63, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é isolada ou derivada de uma linhagem celular cultivada.
65. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 64, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula HEK293.
66. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-63, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é isolada ou derivada de uma linhagem celular primária.
67. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 66, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula imortalizada ou uma célula-tronco.
68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-37, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é isolada ou derivada de uma linhagem celular cultivada.
69. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula HEK293.
70. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-37, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é isolada ou derivada de uma linhagem celular primária.
71. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula imortalizada ou uma célula-tronco.
72. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-67, caracterizada pelo fato de que cada rAAV completo da pluralidade de partículas de rAAV completo da composição final compreende ainda: uma sequência de ácido nucleico compreendendo, de 5' a 3': (a) uma sequência que codifica uma ITR 5' de AAV2, (b) uma sequência que codifica um elemento potenciador inicial, (c) uma sequência que codifica um promotor, (d) uma sequência que codifica um éxon e um íntron, (e) uma sequência que codifica um sítio aceptor de junção, (f) uma sequência que codifica uma proteína da proteína 1 acompanhante Rab (REP1), (g) uma sequência que codifica um elemento regulador pós-transcricional (PRE), (h) uma sequência que codifica um sítio de poliadenilação (poliA), e
(i) uma sequência que codifica uma ITR 3' de AAV2.
73. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que o elemento potenciador precoce compreende uma sequência isolada ou derivada de um Citomegalovírus (CMV).
74. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 73, caracterizada pelo fato de que o elemento intensificador precoce compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico de 1 ATTGACGT CAATAATGAC GTATGTTCCC ATAGTAACGC
CAATAGGGAC TTTCCATTGA 61 CGTCAATGGG TGGAGTATTT ACGGTAAACT GCCCACTTGG
CAGTACATCA AGTGTATCAT 121 ATGCCAAGTA CGCCCCCTAT TGACGTCAAT GACGGTAAAT
GGCCCGCCTG GCATTATGCC 181 CAGTACATGA CCTTATGGGA CTTTCCTACT TGGCAGTACA
TCTACGTATT AGTCATCGCT 241 ATTACCATGG (SEQ ID Nº: 3).
75. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 73, caracterizada pelo fato de que o elemento intensificador precoce compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico de 1 CCATTGACGT CAATAATGAC GTATGTTCCC ATAGTAACGC
CAATAGGGAC TTTCCATTGA 61 CGTCAATGGG TGGAGTATTT ACGGTAAACT GCCCACTTGG
CAGTACATCA AGTGTATCAT 121 ATGCCAAGTA CGCCCCCTAT TGACGTCAAT GACGGTAAAT
GGCCCGCCTG GCATTATGCC 181 CAGTACATGA CCTTATGGGA CTTTCCTACT TGGCAGTACA
TCTACGTATT AGTCATCGCT
241 ATTACCATGG (SEQ ID Nº: 4).
76. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72-75, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica o promotor compreende ou consiste em uma sequência isolada ou derivada de uma sequência que codifica um gene de beta actina de galinha (CBA).
77. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72-75, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica o éxon e o íntron compreende ou consiste em uma sequência isolada ou derivada de uma sequência que codifica um gene de beta actina de galinha (CBA).
78. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72-75, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica o promotor compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico de 1 TCGAGGTGAG CCCCACGTTC TGCTTCACTC TCCCCATCTC
CCCCCCCTCC CCACCCCCAA 61 TTTTGTATTT ATTTATTTTT TAATTATTTT GTGCAGCGAT
GGGGGCGGGG GGGGGGGGGG 121 GGCGCGCGCC AGGCGGGGCG GGGCGGGGCG
AGGGGCGGGG CGGGGCGAGG CGGAGAGGTG 181 CGGCGGCAGC CAATCAGAGC GGCGCGCTCC GAAAGTTTCC
TTTTATGGCG AGGCGGCGGC 241 GGCGGCGGCC CTATAAAAAG CGAAGCGCGC
GGCGGGCGGG AGTCGCTGCG CGCTGCCTTC 301 GCCCCGTGCC CCGCTCCGCC GCCGCCTCGC
GCCGCCCGCC CCGGCTCTGA CTGACCGCGT 361 TACTCCCACA GGTGAGCGGG CGGGACGGCC CTTCTCCTCC
GGGCTGTAAT TAGCGCTTGG 421 TTTAATGACG GCTTGTTTCT TTTCTGTGGC TGCGTGAAAG
CCTTGAGGGG CTCCGGGAGG 481 GCCCTTTGTG CGGGGGGAGC GGCTCGGGG (SEQ ID Nº: 5).
79. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72-78, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica o éxon e o íntron compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico de 1 TCGAGGTGAG CCCCACGTTC TGCTTCACTC TCCCCATCTC
CCCCCCCTCC CCACCCCCAA 61 TTTTGTATTT ATTTATTTTT TAATTATTTT GTGCAGCGAT
GGGGGCGGGG GGGGGGGGGG 121 GGCGCGCGCC AGGCGGGGCG GGGCGGGGCG
AGGGGCGGGG CGGGGCGAGG CGGAGAGGTG 181 CGGCGGCAGC CAATCAGAGC GGCGCGCTCC GAAAGTTTCC
TTTTATGGCG AGGCGGCGGC 241 GGCGGCGGCC CTATAAAAAG CGAAGCGCGC
GGCGGGCGGG AGTCGCTGCG CGCTGCCTTC 301 GCCCCGTGCC CCGCTCCGCC GCCGCCTCGC
GCCGCCCGCC CCGGCTCTGA CTGACCGCGT 361 TACTCCCACA GGTGAGCGGG CGGGACGGCC CTTCTCCTCC
GGGCTGTAAT TAGCGCTTGG 421 TTTAATGACG GCTTGTTTCT TTTCTGTGGC TGCGTGAAAG
CCTTGAGGGG CTCCGGGAGG 481 GCCCTTTGTG CGGGGGGAGC GGCTCGGGG (SEQ ID Nº: 5).
80. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72-79, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica o sítio aceptor de junção compreende uma sequência isolada ou derivada de uma sequência que codifica um sítio aceptor de junção de beta globina de Oryctolagus cuniculus.
81. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 80, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica o sítio aceptor de junção de beta globina de Oryctolagus cuniculus compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico de 1 CTCTGCT AACCATGTTC ATGCCTTCTT CTTTTTCCTA
CAGCTCCTGG GCAACGTGCT 61 GGTTATTGTG CTGTCTCATC ATTTTGGCAA AGAATT (SEQ ID Nº: 6)
82. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72-81, caracterizada pelo fato de que a sequência que compreende o elemento intensificador inicial, a sequência que compreende o promotor, a sequência que compreende o íntron e éxon e a sequência que compreende o sítio aceptor de junção compreendem ou consistem no ácido nucleico sequência de 1 TCGAGGTGAG CCCCACGTTC TGCTTCACTC TCCCCATCTC
CCCCCCCTCC CCACCCCCAA 61 TTTTGTATTT ATTTATTTTT TAATTATTTT GTGCAGCGAT
GGGGGCGGGG GGGGGGGGGG 121 GGCGCGCGCC AGGCGGGGCG GGGCGGGGCG AGGGGCGGGG
CGGGGCGAGG CGGAGAGGTG 181 CGGCGGCAGC CAATCAGAGC GGCGCGCTCC GAAAGTTTCC
TTTTATGGCG AGGCGGCGGC 241 GGCGGCGGCC CTATAAAAAG CGAAGCGCGC GGCGGGCGGG
AGTCGCTGCG CGCTGCCTTC 301 GCCCCGTGCC CCGCTCCGCC GCCGCCTCGC GCCGCCCGCC
CCGGCTCTGA CTGACCGCGT 361 TACTCCCACA GGTGAGCGGG CGGGACGGCC CTTCTCCTCC
GGGCTGTAAT TAGCGCTTGG 421 TTTAATGACG GCTTGTTTCT TTTCTGTGGC TGCGTGAAAG
CCTTGAGGGG CTCCGGGAGG 481 GCCCTTTGTG CGGGGGGAGC GGCTCGGGGC TGTCCGCGGG
GGGACGGCTG CCTTCGGGGG 541 GGACGGGGCA GGGCGGGGTT CGGCTTCTGG CGTGTGACCG
GCGGCTCTAG AGCCTCTGCT 601 AACCATGTTC ATGCCTTCTT CTTTTTCCTA CAGCTCCTGG
GCAACGTGCT GGTTATTGTG 661 CTGTCTCATC ATTTTGGCAA AGAATTGGAT C (SEQ ID Nº: 7).
83. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72-81, caracterizada pelo fato de que a sequência que compreende o elemento intensificador inicial, a sequência que compreende o promotor, a sequência que compreende o íntron e éxon e a sequência que compreende o sítio aceptor de junção compreendem ou consistem no ácido nucleico sequência de 1 CCATTGACGT CAATAATGAC GTATGTTCCC ATAGTAACGC
CAATAGGGAC TTTCCATTGA 61 CGTCAATGGG TGGAGTATTT ACGGTAAACT GCCCACTTGG
CAGTACATCA AGTGTATCAT 121 ATGCCAAGTA CGCCCCCTAT TGACGTCAAT GACGGTAAAT
GGCCCGCCTG GCATTATGCC 181 CAGTACATGA CCTTATGGGA CTTTCCTACT TGGCAGTACA
TCTACGTATT AGTCATCGCT 241 ATTACCATGG TCGAGGTGAG CCCCACGTTC TGCTTCACTC
TCCCCATCTC CCCCCCCTCC 301 CCACCCCCAA TTTTGTATTT ATTTATTTTT TAATTATTTT
GTGCAGCGAT GGGGGCGGGG 361 GGGGGGGGGG GGCGCGCGCC AGGCGGGGCG GGGCGGGGCG
AGGGGCGGGG CGGGGCGAGG 421 CGGAGAGGTG CGGCGGCAGC CAATCAGAGC GGCGCGCTCC
GAAAGTTTCC TTTTATGGCG 481 AGGCGGCGGC GGCGGCGGCC CTATAAAAAG CGAAGCGCGC
GGCGGGCGGG AGTCGCTGCG 541 CGCTGCCTTC GCCCCGTGCC CCGCTCCGCC GCCGCCTCGC
GCCGCCCGCC CCGGCTCTGA 601 CTGACCGCGT TACTCCCACA GGTGAGCGGG CGGGACGGCC
CTTCTCCTCC GGGCTGTAAT 661 TAGCGCTTGG TTTAATGACG GCTTGTTTCT TTTCTGTGGC
TGCGTGAAAG CCTTGAGGGG
721 CTCCGGGAGG GCCCTTTGTG CGGGGGGAGC GGCTCGGGGC
TGTCCGCGGG GGGACGGCTG 781 CCTTCGGGGG GGACGGGGCA GGGCGGGGTT CGGCTTCTGG
CGTGTGACCG GCGGCTCTAG 841 AGCCTCTGCT AACCATGTTC ATGCCTTCTT CTTTTTCCTA
CAGCTCCTGG GCAACGTGCT 901 GGTTATTGTG CTGTCTCATC ATTTTGGCAA AGAATTGGAT C (SEQ ID Nº: 8).
84. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72-83, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica a proteína REP1 compreende uma sequência isolada ou derivada de uma sequência REP1 de mamífero.
85. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 84, caracterizada pelo fato de que a sequência REP1 de mamífero é isolada ou derivada de um camundongo, um rato, um coelho, um primata não humano ou um ser humano.
86. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 84, caracterizada pelo fato de que a sequência REP1 de mamífero é isolada ou derivada de um ser humano.
87. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 86, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica a proteína REP1 humana compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico de 1 gatatcgaat tcctgcagcc cggcggcacc atggcggata ctctcccttc ggagtttgat 61 gtgatcgtaa tagggacggg tttgcctgaa tccatcattg cagctgcatg ttcaagaagt 121 ggccggagag ttctgcatgt tgattcaaga agctactatg gaggaaactgggccagtttt 181 agcttttcag gactattgtc ctggctaaag gaataccagg aaaacagtgacattgtaagt 241 gacagtccag tgtggcaaga ccagatcctt gaaaatgaag aagccattgctcttagcagg 301 aaggacaaaa ctattcaaca tgtggaagta ttttgttatg ccagtcagga tttgcatgaa 361 gatgtcgaag aagctggtgc actgcagaaa aatcatgctc ttgtgacatctgcaaactcc
421 acagaagctg cagattctgc cttcctgcct acggaggatg agtcattaagcactatgagc 481 tgtgaaatgc tcacagaaca aactccaagc agcgatccag agaatgcgctagaagtaaat 541 ggtgctgaag tgacagggga aaaagaaaac cattgtgatg ataaaacttgtgtgccatca 601 acttcagcag aagacatgag tgaaaatgtg cctatagcag aagataccacagagcaacca 661 aagaaaaaca gaattactta ctcacaaatt attaaagaag gcaggagatttaatattgat 721 ttagtatcaa agctgctgta ttctcgagga ttactaattg atcttctaat caaatctaat 781 gttagtcgat atgcagagtt taaaaatatt accaggattc ttgcatttcg agaaggacga 841 gtggaacagg ttccgtgttc cagagcagat gtctttaata gcaaacaact tactatggta 901 gaaaagcgaa tgctaatgaa atttcttaca ttttgtatgg aatatgagaa atatcctgat 961 gaatataaag gatatgaaga gatcacattt tatgaatatt taaagactcaaaaattaacc 1021 cccaacctcc aatatattgt catgcattca attgcaatga catcagagacagccagcagc 1081 accatagatg gtctcaaagc taccaaaaac tttcttcact gtcttgggcggtatggcaac 1141 actccatttt tgtttccttt atatggccaa ggagaactcc cccagtgttt ctgcaggatg 1201 tgtgctgtgt ttggtggaat ttattgtctt cgccattcag tacagtgcct tgtagtggac 1261 aaagaatcca gaaaatgtaa agcaattata gatcagtttg gtcagagaataatctctgag 1321 catttcctcg tggaggacag ttactttcct gagaacatgt gctcacgtgtgcaatacagg 1381 cagatctcca gggcagtgct gattacagat agatctgtcc taaaaacaga ttcagatcaa 1441 cagatttcca ttttgacagt gccagcagag gaaccaggaa cttttgctgt tcgggtcatt 1501 gagttatgtt cttcaacgat gacatgcatg aaaggcacct atttggttca tttgacttgc 1561 acatcttcta aaacagcaag agaagattta gaatcagttg tgcagaaatt gtttgttcca
1621 tatactgaaa tggagataga aaatgaacaa gtagaaaagc caagaattct gtgggctctt 1681 tacttcaata tgagagattc gtcagacatc agcaggagct gttataatga tttaccatcc 1741 aacgtttatg tctgctctgg cccagattgt ggtttaggaa atgataatgc agtcaaacag 1801 gctgaaacac ttttccagga aatctgcccc aatgaagatt tctgtccccc tccaccaaat 1861 cctgaagaca ttatccttga tggagacagt ttacagccag aggcttcaga atccagtgcc 1921 ataccagagg ctaactcgga gactttcaag gaaagcacaa accttggaaa cctagaggag 1981 tcctctgaat aa (SEQ ID Nº: 9).
88. Composição, de acordo com a reivindicação 86 ou 87, caracterizada pelo fato de que a proteína REP1 humana compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de 1 MADTLPSEFD VIVIGTGLPE SIIAAACSRS GRRVLHVDSR
SYYGGNWASF SFSGLLSWLK 61 EYQENSDIVS DSPVWQDQIL ENEEAIALSR KDKTIQHVEV
FCYASQDLHE DVEEAGALQK 121 NHALVTSANS TEAADSAFLP TEDESLSTMS CEMLTEQTPS
SDPENALEVN GAEVTGEKEN 181 HCDDKTCVPS TSAEDMSENV PIAEDTTEQP KKNRITYSQI
IKEGRRFNID LVSKLLYSRG 241 LLIDLLIKSN VSRYAEFKNI TRILAFREGR VEQVPCSRAD
VFNSKQLTMV EKRMLMKFLT 301 FCMEYEKYPD EYKGYEEITF YEYLKTQKLT PNLQYIVMHS
IAMTSETASS TIDGLKATKN 361 FLHCLGRYGN TPFLFPLYGQ GELPQCFCRM CAVFGGIYCL
RHSVQCLVVD KESRKCKAII 421 DQFGQRIISE HFLVEDSYFP ENMCSRVQYR QISRAVLITD
RSVLKTDSDQ QISILTVPAE 481 EPGTFAVRVI ELCSSTMTCM KGTYLVHLTC TSSKTAREDL
ESVVQKLFVP YTEMEIENEQ 541 VEKPRILWAL YFNMRDSSDI SRSCYNDLPS NVYVCSGPDC
GLGNDNAVKQ AETLFQEICP 601 NEDFCPPPPN PEDIILDGDS LQPEASESSA IPEANSETFK ESTNLGNLEE SSE (SEQ ID Nº: 10).
89. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72-88, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica o PRE compreende uma sequência isolada ou derivada de um vírus da hepatite da marmota (WPRE).
90. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 89, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica o WPRE compreende ou consiste em uma sequência de ácido nucleico de 1 atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc 61 cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta 121 tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt 181 ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg 241 gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta 301 ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt 361 tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg 421 cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca 481 atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc 541 gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgc (SEQ ID Nº: 11).
91. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72-90, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica um sítio de poliadenilação (poliA) compreende uma sequência isolada ou derivada de um gene de mamífero.
92. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 91, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica um sítio de poliadenilação (poliA) compreende uma sequência isolada ou derivada de um gene do hormônio de crescimento bovino (BGH).
93. Composição, de acordo com a reivindicação 92, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica o sítio poliA compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico de 1 tcgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc 61 cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga 121 aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga 181 cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat 241 ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg (SEQ ID Nº: 12).
94. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72-93, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica a ITR 5' de AAV2 compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico de 1 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 61 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 121 aggggttcct tgtagttaat gatt (SEQ ID Nº: 13).
95. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72-93, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica a ITR 3' de AAV2 compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico de 1 AGGAACCCCT AGTGATGGAG TTGGCCACTC CCTCTCTGCG
CGCTCGCTCG CTCACTGAGG 61 CCGGGCGACC AAAGGTCGCC CGACGCCCGG GCGGCCTCAG
TGAGCGAGCG AGCGCGCAGA 121 G (SEQ ID Nº: 14).
96. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72-95, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que compreende, de 5' a 3', os elementos (a) a (i) compreendem ou consistem em uma sequência de DNA.
97. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 96, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico compreendendo, de 5' a 3', os elementos (a) a (i) compreendem ou consistem em uma sequência de DNA de fita simples.
98. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72-97, caracterizada pelo fato de que cada rAAV da pluralidade de rAAV completo da composição final compreende uma proteína de capsídeo isolada ou derivada de um AAV2.
99. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 98, caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo de AAV2 compreende uma sequência com pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos 1 MAADGYLPDW LEDTLSEGIR QWWKLKPGPP PPKPAERHKD
DSRGLVLPGY KYLGPFNGLD 61 KGEPVNEADA AALEHDKAYD RQLDSGDNPY LKYNHADAEF
QERLKEDTSF GGNLGRAVFQ 121 AKKRVLEPLG LVEEPVKTAP GKKRPVEHSP VEPDSSSGTG
KAGQQPARKR LNFGQTGDAD 181 SVPDPQPLGQ PPAAPSGLGT NTMATGSGAP MADNNEGADG
VGNSSGNWHC DSTWMGDRVI 241 TTSTRTWALP TYNNHLYKQI SSQSGASNDN HYFGYSTPWG
YFDFNRFHCH FSPRDWQRLI
301 NNNWGFRPKR LNFKLFNIQV KEVTQNDGTT TIANNLTSTV
QVFTDSEYQL PYVLGSAHQG 361 CLPPFPADVF MVPQYGYLTL NNGSQAVGRS SFYCLEYFPS
QMLRTGNNFT FSYTFEDVPF 421 HSSYAHSQSL DRLMNPLIDQ YLYYLSRTNT PSGTTTQSRL
QFSQAGASDI RDQSRNWLPG 481 PCYRQQRVSK TSADNNNSEY SWTGATKYHL NGRDSLVNPG
PAMASHKDDE EKFFPQSGVL 541 IFGKQGSEKT NVDIEKVMIT DEEEIRTTNP VATEQYGSVS
TNLQRGNRQA ATADVNTQGV 601 LPGMVWQDRD VYLQGPIWAK IPHTDGHFHP SPLMGGFGLK
HPPPQILIKN TPVPANPSTT 661 FSAAKFASFI TQYSTGQVSV EIEWELQKEN SKRWNPEIQY
TSNYNKSVNV DFTVDTNGVY 721 SEPRPIGTRY LTRNL (SEQ ID Nº: 15).
100. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 98, caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo de AAV2 compreende a sequência de aminoácidos 1 MAADGYLPDW LEDTLSEGIR QWWKLKPGPP PPKPAERHKD
DSRGLVLPGY KYLGPFNGLD 61 KGEPVNEADA AALEHDKAYD RQLDSGDNPY LKYNHADAEF
QERLKEDTSF GGNLGRAVFQ 121 AKKRVLEPLG LVEEPVKTAP GKKRPVEHSP VEPDSSSGTG
KAGQQPARKR LNFGQTGDAD 181 SVPDPQPLGQ PPAAPSGLGT NTMATGSGAP MADNNEGADG
VGNSSGNWHC DSTWMGDRVI 241 TTSTRTWALP TYNNHLYKQI SSQSGASNDN HYFGYSTPWG
YFDFNRFHCH FSPRDWQRLI 301 NNNWGFRPKR LNFKLFNIQV KEVTQNDGTT TIANNLTSTV
QVFTDSEYQL PYVLGSAHQG
361 CLPPFPADVF MVPQYGYLTL NNGSQAVGRS SFYCLEYFPS
QMLRTGNNFT FSYTFEDVPF 421 HSSYAHSQSL DRLMNPLIDQ YLYYLSRTNT PSGTTTQSRL
QFSQAGASDI RDQSRNWLPG 481 PCYRQQRVSK TSADNNNSEY SWTGATKYHL NGRDSLVNPG
PAMASHKDDE EKFFPQSGVL 541 IFGKQGSEKT NVDIEKVMIT DEEEIRTTNP VATEQYGSVS
TNLQRGNRQA ATADVNTQGV 601 LPGMVWQDRD VYLQGPIWAK IPHTDGHFHP SPLMGGFGLK
HPPPQILIKN TPVPANPSTT 661 FSAAKFASFI TQYSTGQVSV EIEWELQKEN SKRWNPEIQY
TSNYNKSVNV DFTVDTNGVY 721 SEPRPIGTRY LTRNL (SEQ ID Nº: 15).
101. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72-100, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica compreende ainda um tampão de formulação.
102. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de que o tampão de formulação compreende Tris, MgCl2 e NaCl.
103. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de que o tampão de formulação compreende Tris 20 mM, MgCl2 1 mM e NaCl 200 mM em pH 8.
104. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de que o tampão de formulação compreende Tris 20 mM, MgCl2 1 mM, NaCl 200 mM a pH 8 e poloxâmero 188 a 0,001%.
105. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72-104, caracterizada pelo fato de que a pluralidade de rAAVs completos está a uma concentração de entre
1x108 partículas de genoma (gp)/mL e 1x1014 gp /mL, incluindo os pontos finais.
106. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 105, caracterizada pelo fato de que a pluralidade de rAAVs completos está em uma concentração de entre 0,5x1010 gp/mL e 2,5x1012 gp/mL, incluindo os pontos finais.
107. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 105, caracterizada pelo fato de que a pluralidade de rAAVs completos está a uma concentração de entre 1x1011 gp/mL e 5x1013 gp/mL, incluindo os pontos finais.
108. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 105, caracterizada pelo fato de que a pluralidade de rAAVs completos está em uma concentração de entre 1x1011 gp/mL e 2x1012 gp/mL, incluindo os pontos finais.
109. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 105, caracterizada pelo fato de que a pluralidade de rAAVs completos está a uma concentração de 1x1012 gp/mL.
110. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 105, caracterizada pelo fato de que a pluralidade de rAAVs completos está a uma concentração de 1x1011 gp/mL.
111. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72-110, caracterizada pelo fato de que a concentração da pluralidade de rAAVs completos é medida usando qPCR.
112. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 111, caracterizada pelo fato de que o qPCR usa um vetor de plasmídeo superenrolado como padrão.
113. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 111, caracterizada pelo fato de que o qPCR usa um vetor plasmídeo linearizado como padrão.
114. Dispositivo de distribuição, caracterizado pelo fato de que compreende a composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 72-113.
115. Dispositivo de distribuição, de acordo com a reivindicação 114, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de distribuição compreende um ou mais dentre uma seringa, um cateter e uma agulha.
116. Dispositivo de distribuição, de acordo com a reivindicação 114, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de distribuição é adequado para administrar a composição farmacêutica por injeção.
117. Dispositivo de distribuição, de acordo com a reivindicação 114, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de distribuição é adequado para administrar a composição farmacêutica por infusão.
118. Dispositivo de distribuição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 114-117, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de distribuição é adequado para administrar a composição farmacêutica por uma via sub-retiniana.
119. Dispositivo de distribuição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 114-117, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de distribuição é adequado para administrar a composição farmacêutica por uma via supracoroidal.
120. Método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo com necessidade dele, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindicações 38-113.
121. Método, de acordo com a reivindicação 120, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é uma doença ou distúrbio retiniano.
122. Método, de acordo com a reivindicação 120 ou 121, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é Coroideremia.
123. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-122, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz compreende uma quantidade entre uma quantidade minimamente eficaz e uma quantidade máxima tolerável da composição farmacêutica.
124. Método, de acordo com a reivindicação 123, caracterizado pelo fato de que a quantidade minimamente eficaz compreende uma quantidade da composição farmacêutica suficiente para transduzir pelo menos um neurônio de uma retina ou uma porção- alvo do mesmo.
125. Método, de acordo com a reivindicação 123, caracterizado pelo fato de que a quantidade minimamente eficaz compreende uma quantidade da composição farmacêutica suficiente para transduzir pelo menos 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou qualquer porcentagem entre os neurônios de uma retina ou uma porção-alvo deles.
126. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 123-125, caracterizado pelo fato de que a quantidade minimamente eficaz compreende uma quantidade da composição farmacêutica suficiente para melhorar a acuidade visual do indivíduo.
127. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 123-125, caracterizado pelo fato de que a quantidade minimamente eficaz compreende uma quantidade da composição farmacêutica suficiente para reduzir um sinal ou sintoma de uma doença retinal.
128. Método, de acordo com a reivindicação 127,
caracterizado pelo fato de que a doença retinal é Coroideremia.
129. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 123-128, caracterizado pelo fato de que a quantidade máxima tolerável compreende uma quantidade da composição farmacêutica suficiente para induzir um evento adverso.
130. Método, de acordo com a reivindicação 129, caracterizado pelo fato de que o efeito adverso compreende uma resposta imune à composição farmacêutica.
131. Método, de acordo com a reivindicação 130, caracterizado pelo fato de que a resposta imune compreende inflamação.
132. Método, de acordo com a reivindicação 131, caracterizado pelo fato de que a inflamação é sistêmica.
133. Método, de acordo com a reivindicação 131, caracterizado pelo fato de que a inflamação é local.
134. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 129-133, caracterizado pelo fato de que o evento adverso é grave.
135. Método, de acordo com a reivindicação 134, caracterizado pelo fato de que o evento adverso não pode ser evitado, reduzido ou controlado pela administração de um tratamento médico secundário ao indivíduo.
136. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-135, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica compreende uma quantidade com uma multiplicidade de infecção (MOI) entre 104 e 106, incluindo os pontos finais.
137. Método, de acordo com a reivindicação 136, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica compreende uma quantidade com uma multiplicidade de infecção (MOI) entre 104 e 105, incluindo os pontos finais.
138. Método, de acordo com a reivindicação 136, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica compreende uma quantidade com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 105.
139. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-135, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz compreende entre 1x108 gp e 1x1013 gp, incluindo os pontos finais.
140. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-135, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz compreende entre 6x109 gp e 1x1013 gp, incluindo os pontos finais.
141. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-135, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz compreende entre 6x109 gp e 7x1012 gp, incluindo os pontos finais.
142. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-135, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz compreende entre 6x109 gp e 5x1012 gp, incluindo os pontos finais.
143. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-135, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz compreende entre 1x1010 gp e 1x1012 gp, incluindo os pontos finais.
144. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-135, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz compreende ou consiste em 1x1010 gp.
145. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-135, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz compreende ou consiste em 1x1011 gp.
146. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-135, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz compreende ou consiste em 1x1012 gp.
147. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-146, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz compreende ou consiste em um volume entre 10 µL e 200 µL, incluindo os pontos finais.
148. Método, de acordo com a reivindicação 147, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz compreende ou consiste em um volume entre 10 µL e 50 µL, entre 50 µL e 100 µL, entre 100 µL e 150 µL ou entre 150 µL e 200 µL, incluindo os pontos finais, para cada intervalo.
149. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-148, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz compreende ou consiste em um volume entre 70 µL e 120 µL, incluindo os pontos finais.
150. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-149, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz compreende ou consiste em um volume de 100 µL.
151. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-150, caracterizado pelo fato de que a etapa de administração compreende uma injeção ou uma infusão.
152. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-151, caracterizado pelo fato de que a etapa de administração compreende uma via sub-retiniana, supracoroidal ou intravítrea.
153. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-152, caracterizado pelo fato de que a etapa de administração compreende uma injeção sub-retiniana ou infusão.
154. Método, de acordo com a reivindicação 153, caracterizado pelo fato de que a injeção ou infusão sub-retiniana compreende uma injeção sub-retiniana de 2 etapas.
155. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-152, caracterizado pelo fato de que a etapa de administração compreende uma injeção supracoroidal ou infusão.
156. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-155, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é do sexo masculino.
157. Método, de acordo com a reivindicação 156, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem pelo menos 18 anos de idade.
158. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-157, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem um diagnóstico geneticamente confirmado de coroideremia.
159. Método, de acordo com a reivindicação 154, caracterizado pelo fato de que o indivíduo foi identificado como tendo uma mutação no gene REP1.
160. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-159, caracterizado pelo fato de que o indivíduo apresenta um sinal clínico de coroideremia em uma mácula de pelo menos um olho.
161. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-160, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem uma pontuação de Melhor Acuidade Visual Corrigida (BCVA) de 34-73 letras em pelo menos um olho.
162. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-161, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem coroideremia leve ou em estágio inicial.
163. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-162, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem coroideremia avançada ou grave.
164. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-163, caracterizado pelo fato de que o método compreende o tratamento de 10 mm2 de uma retina de pelo menos um olho.
165. Método, de acordo com a reivindicação 164, caracterizado pelo fato de que o método compreende o tratamento entre 5 mm2 e 10 mm2, inclusive dos pontos finais, de uma retina de pelo menos um olho.
166. Método, de acordo com a reivindicação 164, caracterizado pelo fato de que o método compreende o tratamento entre 2 mm2 e 15 mm2, inclusive dos pontos finais, de uma retina de pelo menos um olho.
167. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-166, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é administrada a um olho do indivíduo.
168. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-167, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é administrada a ambos os olhos do indivíduo.
169. Método, de acordo com a reivindicação 168, caracterizado pelo fato de que os olhos do indivíduo são tratados simultaneamente.
170. Método, de acordo com a reivindicação 169, caracterizado pelo fato de que os olhos do indivíduo são tratados sequencialmente.
171. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-170, caracterizado pelo fato de que pelo menos um olho do indivíduo foi tratado para coroideremia antes da administração da composição farmacêutica ao indivíduo.
172. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-171, caracterizado pelo fato de que o método compreende a administração entre 1 e 12 doses por olho, incluindo os pontos finais.
173. Método, de acordo com a reivindicação 172, caracterizado pelo fato de que o método compreende a administração de pelo menos uma dose pelo menos uma vez por dia, uma vez por semana, uma vez por mês, uma vez a cada três meses, uma vez a cada 6 meses ou uma vez por ano.
174. Método, de acordo com a reivindicação 173, caracterizado pelo fato de que o método compreende a administração de doses múltiplas e em que cada dose compreende a mesma quantidade da composição farmacêutica.
175. Método, de acordo com a reivindicação 173, caracterizado pelo fato de que o método compreende a administração de doses múltiplas e em que cada dose não compreende a mesma quantidade da composição farmacêutica.
176. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 172-175, caracterizado pelo fato de que o método compreende a administração de doses múltiplas e em que cada dose sucessiva compreende um número maior de rAAV completo do que a dose anterior.
177. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 172-175, caracterizado pelo fato de que o método compreende a administração de doses múltiplas e em que cada dose sucessiva compreende um número menor de rAAV completo do que a dose anterior.
178. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 172-177, caracterizado pelo fato de que o indivíduo experimentou um evento adverso após uma dose e em que a dose subsequente compreende um número menor de rAAV completo do que a dose anterior que induziu o evento adverso.
179. Método, de acordo com a reivindicação 178, caracterizado pelo fato de que o indivíduo se recupera do evento adverso e em que uma dose subsequente da composição farmacêutica é administrada ao indivíduo.
180. Método, de acordo com a reivindicação 179, caracterizado pelo fato de que a dose que induziu o evento adverso e a dose subsequente contêm um número igual de rAAV completo.
181. Método, de acordo com a reivindicação 179, caracterizado pelo fato de que a dose que induziu o evento adverso e a dose subsequente não contêm um número igual de rAAV completo.
182. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-181, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a administração de uma quantidade de uma pluralidade de rAAVs de placebo ao indivíduo antes da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica, em que cada rAAV de placebo é um rAAV vazio.
183. Método, de acordo com a reivindicação 182, caracterizado pelo fato de que o rAAV vazio não contém um promotor para expressar uma sequência exógena ou uma sequência exógena.
184. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-183, caracterizado pelo fato de que a administração da quantidade de uma pluralidade de rAAVs de placebo é sistêmica.
185. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-183, caracterizado pelo fato de que a administração da quantidade de uma pluralidade de rAAVs de placebo é local.
186. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 182-185, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda (a) determinar se a pluralidade de rAAVs de placebo induziu uma resposta imune no indivíduo e/ou (b) determinar se o indivíduo desenvolveu uma tolerância imunológica à pluralidade de rAAVs de placebo, indicando assim que a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica não deve induzir um evento adverso mediado imunologicamente no indivíduo.
187. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-186, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a administração de um supressor de uma resposta imune.
188. Método, de acordo com a reivindicação 187, caracterizado pelo fato de que o supressor compreende um agente anti- inflamatório.
189. Método, de acordo com a reivindicação 188, caracterizado pelo fato de que o agente anti-inflamatório compreende um corticosteroide.
190. Método, de acordo com a reivindicação 189, caracterizado pelo fato de que o corticosteroide compreende prednisona ou prednisolona.
191. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 187-190, caracterizado pelo fato de que a administração do supressor de uma resposta imune é sistêmica.
192. Método, de acordo com a reivindicação 191, caracterizado pelo fato de que o supressor de uma resposta imune é administrado por via oral.
193. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 187-190, caracterizado pelo fato de que a administração do supressor de uma resposta imune é local.
194. Método, de acordo com a reivindicação 193, caracterizado pelo fato de que o supressor de uma resposta imune é administrado ao olho tratado com a composição farmacêutica.
195. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 187-194, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica e o supressor de uma resposta imune são administrados simultaneamente.
196. Método, de acordo com a reivindicação 195, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica e o supressor de uma resposta imune são administrados no mesmo dia.
197. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 187-194, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica e o supressor de uma resposta imune são administrados sequencialmente.
198. Método, de acordo com a reivindicação 197, caracterizado pelo fato de que a administração do supressor precede a administração da composição farmacêutica em pelo menos um dia.
199. Método, de acordo com a reivindicação 193, caracterizado pelo fato de que a administração da composição farmacêutica precede a administração do supressor em pelo menos um dia.
200. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-199, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda determinar uma gravidade inicial de dano mediado por coroideremia em pelo menos um olho do indivíduo.
201. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-200, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda determinar uma gravidade subsequente de dano mediado por coroideremia em pelo menos um olho do indivíduo após a administração da composição farmacêutica a pelo menos um olho.
202. Método, de acordo com a reivindicação 200 ou 201, caracterizado pelo fato de que a gravidade inicial ou subsequente do dano mediado por coroideremia é determinada determinando uma pontuação de teste de Melhor Acuidade Visual Corrigida (BCVA), medindo uma área ou um volume de tecido retinal viável, medindo uma zona elipsoide preservada, medindo a sensibilidade retinal, medindo a sensibilidade ao contraste, medindo a visão de cores, medindo a acuidade visual de baixa luminância, medindo a velocidade de leitura ou qualquer combinação respectiva.
203. Método, de acordo com a reivindicação 202, caracterizado pelo fato de que o teste de BCVA utiliza um gráfico ETDRS (Estudo de Tratamento Precoce de Retinopatia Diabética, "Early Treatment of Diabetic Retinopathy Study").
204. Método, de acordo com a reivindicação 202 ou 203, caracterizado pelo fato de que o teste de BCVA compreende uma avaliação de um ou mais dentre contagem de dedos, movimento da mão, percepção de luz e uma combinação respectiva.
205. Método, de acordo com a reivindicação 202, caracterizado pelo fato de que o tecido retiniano viável compreende autofluorescência de fundo e em que a medição de tecido retiniano viável compreende a detecção de um nível ou padrão de autofluorescência de fundo de olho.
206. Método, de acordo com a reivindicação 202, caracterizado pelo fato de que medir uma zona de elipsoide preservada compreende Tomografia de Coerência Óptica de Domínio Espectral (SD-OCT).
207. Método, de acordo com a reivindicação 202, caracterizado pelo fato de que medir a sensibilidade retinal compreende microperimetria.
208. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-207, caracterizado pelo fato de que a administração da quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica inibe ou reduz a progressão de um sinal ou sintoma de coroideremia.
209. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-207, caracterizado pelo fato de que a administração da quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica reduz um sinal ou sintoma de coroideremia.
210. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120-207, caracterizado pelo fato de que um sinal ou sintoma de coroideremia compreende uma perda de células fotorreceptoras, uma perda de células RPE, uma diminuição da acuidade visual, diminuição da acuidade visual de baixa luminescência, área total de autofluorescência preservada (AF), uma pontuação baixa em um teste de BCVA, uma área diminuída de zona elipsoide preservada, sensibilidade retiniana diminuída, sensibilidade ao contraste diminuída, visão de cores diminuída ou desbotada, taxas diminuídas de leitura rápida ou qualquer combinação destes.
211. Método, de acordo com a reivindicação 210, caracterizado pelo fato de que a gravidade do sinal ou sintoma de coroideremia é determinada em relação a uma retina saudável.
212. Método, de acordo com a reivindicação 211, caracterizado pelo fato de que a retina saudável pertence a um indivíduo controle de mesma idade.
213. Método para determinar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindicações 38-212, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) medir uma área de uma retina de um indivíduo a ser tratado,
(b) determinar se a área de (a) está na área foveal central de 0,5 mm2 ou na mácula, (c) calcular o número de bastonetes, cones e células epiteliais pigmentares da retina (RPE) dentro da área de (a), e (d) multiplicar o número total de células por uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1x105 para calcular um número de partículas do genoma (gp) a serem incluídas na quantidade terapeuticamente eficaz, em que a área máxima da retina a ser tratada é de 10 mm2, em que a densidade de células RPE na retina é de 5.000 células por mm2, em que a densidade de bastonetes na retina é de 75.000 bastonetes por mm2 exclusivo da área foveal central de 0,5 mm2, em que a densidade de cones na retina é 150.000 cones por mm2 na área foveal central de 0,5 mm2 e a densidade de cones na retina é de 25.000 por mm2 na mácula fora da área foveal central de 0,5 mm2.
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