CN112384626A - Aav组合物、制造方法和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于自哺乳动物宿主细胞培养纯化重组AAV(rAAV)粒子的方法。本公开还提供本公开的方法所产生的药物组合物、药物组合物和使用本文描述的药物组合物治疗疾病的方法。
Description
相关申请
本申请要求临时申请USSN 62/653,139(2018年4月5日提交)、USSN 62/746,980(2018年10月17日提交)和USSN 62/773,975(2018年11月30日提交)的优先权，其各自的内容以引用的方式整体并入本文。
序列表的并入
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技术领域
本公开涉及人治疗剂、生物成品药、病毒递送人DNA序列及其制造方法的领域。
背景技术
长久以来，基于AAV的递送载体和制造这些基于AAV的递送载体的改善方法的需求仍未被满足。
发明内容
本公开提供一种用于自哺乳动物宿主细胞培养纯化AAV(AAV)粒子的方法，其包括下列步骤：(a)在适合形成多个AAV粒子的条件下，在培养基中培养多个哺乳动物宿主细胞，其中所述多个哺乳动物宿主细胞已用包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体转染以产生多个转染的哺乳动物宿主细胞；(b)收集包含所述多个转染的哺乳动物宿主细胞的所述培养基；(c)自所述多个转染的哺乳动物宿主细胞收集多个AAV粒子；(d)通过切向流过滤(TFF)浓缩所述多个AAV粒子以产生浓缩的多个AAV粒子；(e)通过密度梯度超离心富集所述浓缩的多个AAV粒子的完整AAV粒子以产生富集的多个完整AAV粒子；(f)通过阴离子交换(AEX)色谱或亲和性色谱纯化所述富集的多个完整AAV粒子以产生包含纯化且富集的多个完整AAV粒子的洗脱液；和(g)通过切向流过滤(TFF)渗滤且浓缩所述来自(f)的洗脱液至制剂缓冲剂以产生包含所述纯化且富集的多个完整AAV粒子和所述制剂缓冲剂的最终组合物。在一些实施方案中，完整AAV包含在能够在哺乳动物或人细胞中表达外源性序列的启动子控制下的外源性序列。
本公开提供一种用于自哺乳动物宿主细胞培养纯化重组AAV(rAAV)粒子的方法，其包括下列步骤：(a)在适合形成多个rAAV粒子的条件下，在培养基中培养多个哺乳动物宿主细胞，其中所述多个哺乳动物宿主细胞已用包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体转染以产生多个转染的哺乳动物宿主细胞；(b)收集包含所述多个转染的哺乳动物宿主细胞的所述培养基；(c)自所述多个转染的哺乳动物宿主细胞收集多个rAAV粒子；(d)通过切向流过滤(TFF)浓缩所述多个rAAV粒子以产生浓缩的多个rAAV粒子；(e)通过密度梯度超离心富集所述浓缩的多个rAAV粒子的完整rAAV粒子以产生富集的多个完整rAAV粒子；(f)通过阴离子交换(AEX)色谱或亲和性色谱纯化所述富集的多个完整rAAV粒子以产生包含纯化且富集的多个完整rAAV粒子的洗脱液；和(g)通过切向流过滤(TFF)渗滤且浓缩所述来自(f)的洗脱液至制剂制剂缓冲剂以产生包含所述纯化且富集的多个完整rAAV粒子和所述制剂缓冲剂的最终组合物。在一些实施方案中，完整rAAV包含在能够在哺乳动物或人细胞中表达外源性序列的启动子控制下的外源性序列。
本公开提供一种用于自哺乳动物宿主细胞培养纯化重组AAV(rAAV)粒子的方法，其包括下列步骤：(a)在适合形成多个rAAV-REP1粒子的条件下，在培养基中培养多个哺乳动物宿主细胞，其中所述多个哺乳动物宿主细胞已用包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体转染以产生多个转染的哺乳动物宿主细胞，其中所述外源性序列包含编码人Rab护送蛋白1(human Rab escortprotein 1)(REP1)蛋白质的序列；(b)收集包含所述多个转染的哺乳动物宿主细胞的所述培养基；(c)自所述多个转染的哺乳动物宿主细胞收集多个rAAV粒子；(d)通过切向流过滤(TFF)浓缩所述多个rAAV粒子以产生浓缩的多个rAAV粒子；(e)通过密度梯度超离心富集所述浓缩的多个rAAV粒子的完整rAAV粒子以产生富集的多个完整rAAV粒子；(f)通过阴离子交换(AEX)色谱或亲和性色谱纯化所述富集的多个完整rAAV粒子以产生包含纯化且富集的多个完整rAAV粒子的洗脱液；和(g)通过切向流过滤(TFF)渗滤且浓缩所述来自(f)的洗脱液至制剂缓冲剂以产生包含所述纯化且富集的多个完整rAAV粒子和所述制剂缓冲剂的最终组合物。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述编码人REP1蛋白的序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列组成：
其中Kozac共有序列以画底线指示且起始密码子以粗体指示。
在本公开的方法的一些实施方案中，人REP1蛋白包含下列氨基酸序列或由下列氨基酸序列组成：
在本公开的方法的一些实施方案中，所述培养基包含减少的胎牛血清。在一些实施方案中，所述培养基不包含减少的胎牛血清。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述培养基包含Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM)。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述培养基包含甘氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-胱氨酸二盐酸盐、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐-H2O、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐脱水物、L-缬氨酸、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、i-肌醇、氯化钙(CaCl2)(无水)、硝酸铁(Fe(NO3)3"9H2O)、硫酸镁(MgSO4)(无水)、氯化钾(KCl)、碳酸氢钠(NaHCO3)、氯化钠(NaCl)、磷酸二氢钠(NaH2PO4-H2O)和D-葡萄糖(右旋糖)。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述培养基包含无血清培养基。在一些实施方案中，所述培养基由无血清培养基组成。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述培养基包含澄清的培养基。在一些实施方案中，所述培养基由澄清的培养基组成。在本公开的方法的一些实施方案中，所述收集培养基包含无蛋白质培养基。在本公开的方法的一些实施方案中，所述收集培养基由无蛋白质培养基组成。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述哺乳动物细胞已用包含PEI转导试剂的组合物转染。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述包含外源性序列的质粒载体还包含编码5’反向末端重复(ITR)的序列和编码3’ITR的序列。在一些实施方案中，所述编码5’ITR的序列衍生自编码血清型2AAV(AAV2)的5’ITR的序列。在一些实施方案中，所述编码5’ITR的序列包含与编码血清型2AAV(AAV2)的5’ITR的序列相同的序列。在一些实施方案中，所述编码5’ITR的序列包含与编码血清型2AAV(AAV2)的5’ITR的序列不相同的序列。在一些实施方案中，所述编码3’ITR的序列衍生自编码血清型2AAV(AAV2)的3’ITR的序列。在一些实施方案中，所述编码3’ITR的序列包含与编码血清型2AAV(AAV2)的3’ITR的序列相同的序列。在一些实施方案中，所述编码3’ITR的序列包含与编码血清型2AAV(AAV2)的3’ITR的序列不相同的序列。在一些实施方案中，所述编码5’ITR的序列或所述编码3’ITR的序列包含145个碱基对(bp)。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述包含外源性序列的质粒载体、所述辅助质粒载体或所述包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体还包含编码选择标志的序列。在一些实施方案中，所述包含外源性序列的质粒载体还包含编码选择标志的序列。在一些实施方案中，所述辅助质粒载体还包含编码选择标志的序列。在一些实施方案中，所述包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体还包含编码选择标志的序列。在一些实施方案中，所述编码选择标志的序列传达对卡那霉素(kanamycin)的抵抗。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述收集步骤(c)包括机械破坏(mechanicaldisruption)所述多个转染的哺乳动物细胞以释放所述多个转染的哺乳动物细胞所产生的重组AAV(rAAV)粒子。在一些实施方案中，所述机械破坏包括微射流。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述浓缩步骤还包括(1)通过深层过滤澄清所述浓缩的多个rAAV粒子以产生浓缩且澄清的多个rAAV粒子。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述浓缩步骤还包括(2)在-80℃下冷冻所述浓缩且澄清的多个rAAV粒子以产生工艺中间物。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述富集步骤(e)包括碘克沙醇(iodixanol)密度梯度超离心以产生富集的多个rAAV粒子。在一些实施方案中，所述密度梯度是不连续性密度梯度。在一些实施方案中，所述碘克沙醇密度梯度包含分别具有15％、25％、40％和57％浓度的碘克沙醇组合物中的一种或多种。在一些实施方案中，所述富集的多个rAAV粒子分离自碘克沙醇密度梯度。在一些实施方案中，所述富集的多个rAAV粒子分离自具有40％浓度的碘克沙醇组合物与具有57％浓度的碘克沙醇组合物的界面。在一些实施方案中，将所述浓缩且澄清的多个rAAV粒子施用到本公开的密度梯度且后续进行超离心步骤。在一些实施方案中，在超离心步骤之后，富集的多个rAAV或完整rAAV粒子分离自密度梯度。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述纯化步骤(f)的亲和性色谱包含AVBSepharose基质。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述制剂缓冲剂包含Tris、MgCl2和NaCl。在一些实施方案中，所述制剂缓冲剂包含20mM Tris、1mM MgCl2和200mM NaCl，pH 8。在一些实施方案中，所述制剂缓冲剂包含20mM Tris、1mM MgCl2和200mM NaCl、pH 8以及0.001％的泊洛沙姆(poloxamer)188。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述AEX色谱包括使用UnoSphere Q或PorosAEX色谱。在一些实施方案中，所述AEX色谱还包括下列步骤：产生AEX色谱图，和选择含有完整rAAV粒子的AEX色谱图上的峰。
在本公开的用于纯化重组AAV(rAAV)粒子的方法的一些实施方案中，所述方法在步骤(g)之前还包括稀释步骤，其中所述稀释步骤包括：(1)当所述色谱包括使第一纯化的多个rAAV粒子与UnoQ接触时，则在步骤(e)之前，将来自步骤(d)的第一纯化的多个rAAV粒子稀释20倍，或(2)当色谱包括使第一纯化的多个rAAV粒子与AVB接触时，则在步骤(e)之前，将来自步骤(d)的第一纯化的多个rAAV粒子稀释6倍。在一些实施方案中，所述稀释步骤包括添加稀释缓冲剂到第一纯化的多个rAAV粒子，其中所述色谱包括使第一纯化的多个rAAV粒子与UnoQ接触且其中所述稀释缓冲剂包含10mM Tris，pH 9。在一些实施方案中，所述稀释步骤包括添加稀释缓冲剂到第一纯化的多个rAAV粒子，其中所述色谱包括使第一纯化的多个rAAV粒子与AVB接触且其中所述稀释缓冲剂包含20mM Tris、1mM MgCl2和200mMNaCl，pH 8。在一些实施方案中，步骤(e)产生包含第二纯化的多个rAAV粒子和洗脱缓冲剂的组合物。在一些实施方案中，色谱包含UnoQ且其中洗脱缓冲剂包含10mM Tris、650mMNaCl，pH 9。在一些实施方案中，色谱包含AVB且其中洗脱缓冲剂包含10.8mM NaHPO4、44.6mM柠檬酸、400mM NaCl，pH 2.6。在一些实施方案中，将洗脱缓冲剂洗脱到中和缓冲剂中。在一些实施方案中，中和缓冲剂包含1M Tris，pH 8.8。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述步骤(d)或步骤(g)的TFF使用100kDa中空纤维过滤器(HFF)执行。在一些实施方案中，所述步骤(d)或步骤(g)的TFF使用70kDa HFF执行。在一些实施方案中，所述步骤(d)或步骤(g)的TFF使用50kDa HFF执行。在一些实施方案中，所述方法的步骤(g)还包括第二TFF，所述步骤(d)的TFF和所述步骤(g)的第一TFF使用100kDa HFF执行且所述步骤(g)的第二TFF使用50kDa或70kDa HFF执行。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述宿主细胞分离自或衍生自培养的细胞系。在一些实施方案中，所述宿主细胞是HEK293细胞。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述宿主细胞分离自或衍生自原代细胞系。在一些实施方案中，所述宿主细胞是永生化细胞或干细胞。
本公开提供一种药物组合物，其包含本公开的方法所产生的多个rAAV粒子。
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，所述药物组合物包含：(a)在0.5x 1012与2.5x 1012个载体基因组(vg)/mL之间的复制缺陷和重组腺相关病毒(rAAV)；(b)小于50％空衣壳；(c)每1.0x 1012vg/mL小于4ng/mL的残余宿主细胞蛋白；和(d)每1.0x 1012vg/mL小于7x 10-3pg/ml的残余宿主细胞DNA。
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，所述药物组合物还包含(e)多个功能性vg/mL，其中功能性载体基因组中的每一个能够在转导之后在细胞中表达外源性序列。
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，在用所述药物组合物转导细胞之后，所述多个功能性vg/mL以相较于非转导细胞中对应内源性序列增加2倍的表达水平表达所述外源性序列。在一些实施方案中，在用所述药物组合物转导细胞之后，所述多个功能性vg/mL以相较于非转导细胞中对应内源性序列增加3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍或任何其他介于之间的增加倍数的表达水平表达所述外源性序列。在一些实施方案中，所述外源性序列与所述对应内源性序列相同。在一些实施方案中，所述外源性序列与所述对应内源性序列不相同。在一些实施方案中，所述外源性序列与所述对应内源性序列不相同，但所述对应多肽相同。在一些实施方案中，所述外源性序列与所述对应内源性序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或介于之间的任何百分比的同一性。在一些实施方案中，所述外源性序列相较于所述对应内源性序列经密码子优化以在哺乳动物或人中表达。在一些实施方案中，包括那些其中所述外源性序列相较于所述对应内源性序列经密码子优化以在哺乳动物或人中表达的实施方案，所述外源性序列与所述对应内源性序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或介于之间的任何百分比的同源性。
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，在用本公开的药物组合物转导细胞之后，所述外源性序列编码蛋白质。在一些实施方案中，所述外源性序列所编码的所述蛋白质具有等于或大于非转导细胞的对应序列所编码的蛋白质的活性水平的活性水平。在一些实施方案中，所述外源性序列与所述对应内源性序列相同。在一些实施方案中，所述外源性序列与所述对应内源性序列不相同。在一些实施方案中，所述外源性序列与所述对应内源性序列不相同，但所述对应多肽相同。在一些实施方案中，所述外源性序列与所述对应内源性序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或介于之间的任何百分比的同一性。在一些实施方案中，包括那些其中所述外源性序列相较于所述对应内源性序列经密码子优化以在哺乳动物或人中表达的实施方案，所述外源性序列与所述对应内源性序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或介于之间的任何百分比的同源性。在一些实施方案中，所述活性包含与配体或底物结合、活化配体或底物和/或将一个或多个官能团转移到配体或底物。在一些实施方案中，所述蛋白质包含REP-1蛋白且所述活性包含REP-1底物的异戊烯化(prenylation)。
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，所述药物组合物包含(a)在1.0x 1012与2.0x 1012个载体基因组(vg)/mL之间的复制缺陷和重组腺相关病毒(AAV)。在一些实施方案中，所述药物组合物包含(a)约1.0x 1012个载体基因组(vg)/mL的复制缺陷和重组腺相关病毒(AAV)。在一些实施方案中，所述药物组合物包含(a)1.0x 1012个载体基因组(vg)/mL的复制缺陷和重组腺相关病毒(AAV)。
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，所述药物组合物包含(b)小于50％空衣壳。在本公开的药物组合物的一些实施方案中，所述药物组合物包含(b)小于30％空衣壳。
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，所述复制缺陷和重组腺相关病毒(rAAV)含有分离自或衍生自血清型2AAV(AAV2)的序列。在一些实施方案中，所述分离自或衍生自AAV2的序列包含编码反向末端重复(ITR)的序列。在一些实施方案中，所述复制缺陷和重组腺相关病毒(rAAV)含有编码5’ITR的序列和编码3’ITR的序列。在一些实施方案中，所述编码5’ITR的序列和所述编码3’ITR的序列包含AAV2 ITR的野生型序列。
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，所述宿主细胞分离自或衍生自培养的细胞系。在一些实施方案中，所述宿主细胞是HEK293细胞。
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，所述宿主细胞分离自或衍生自原代细胞系。在一些实施方案中，所述宿主细胞是永生化细胞或干细胞。
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，所述最终组合物的所述多个完整rAAV的每个完整rAAV还包含：核酸序列，所述核酸序列自5’至3’包含：(a)编码AAV2 5’ITR的序列，(b)编码早期增强子元件的序列，(c)编码启动子的序列，(d)编码外显子和内含子的序列，(e)编码剪接受体位点的序列，(f)编码Rab护送蛋白1(REP1)蛋白质的序列，(g)编码转录后调节元件(PRE)的序列，(h)编码聚腺苷酸化(polyA)位点的序列，和(i)编码AAV2 3’ITR的序列。(还参见美国专利第9,834,788号，其内容以引用的方式整体并入本文)。
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，包括那些其中所述最终组合物的所述多个完整rAAV的每个完整rAAV还包含核酸序列且所述核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)的实施方案，所述早期增强子元件包含分离自或衍生自巨细胞病毒(CMV)的序列。在一些实施方案中，所述早期增强子元件包含下列核酸序列或由下列核酸序列组成：
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，包括那些其中所述最终组合物的所述多个完整rAAV的每个完整rAAV还包含核酸序列且所述核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)的实施方案，所述编码启动子的序列包含下列序列或由下列序列组成：分离自或衍生自编码鸡β肌动蛋白(CBA)基因的序列。在一些实施方案中，所述编码启动子的序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列组成：
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，包括那些其中所述最终组合物的所述多个完整rAAV的每个完整rAAV还包含核酸序列且所述核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)的实施方案，所述编码外显子和内含子的序列包含下列序列或由下列序列组成：分离自或衍生自编码鸡β肌动蛋白(CBA)基因的序列。在一些实施方案中，所述编码外显子和内含子的序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列组成：
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，包括那些其中所述最终组合物的所述多个完整rAAV的每个完整rAAV还包含核酸序列且所述核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)的实施方案，所述编码剪接受体位点的序列包含分离自或衍生自编码家兔(Oryctolagus cuniculus)β球蛋白剪接受体位点的序列。在一些实施方案中，所述编码家兔β球蛋白剪接受体位点的序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列组成：
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，包括那些其中所述最终组合物的所述多个完整rAAV的每个完整rAAV还包含核酸序列且所述核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)的实施方案，所述包含早期增强子元件的序列、所述包含启动子的序列、所述包含内含子和外显子的序列和所述包含剪接受体位点的序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列组成：
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，包括那些其中所述最终组合物的所述多个完整rAAV的每个完整rAAV还包含核酸序列且所述核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)的实施方案，所述包含早期增强子元件的序列、所述包含启动子的序列、所述包含内含子和外显子的序列和所述包含剪接受体位点的序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列组成：
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，包括那些其中所述最终组合物的所述多个完整rAAV的每个完整rAAV还包含核酸序列且所述核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)的实施方案，所述编码REP1蛋白的序列包含分离自或衍生自哺乳动物REP1序列的序列。在一些实施方案中，所述哺乳动物REP1序列分离自或衍生自小鼠、大鼠、兔、非人灵长动物或人。在一些实施方案中，所述哺乳动物REP1序列分离自或衍生自人。在一些实施方案中，所述编码人REP1蛋白的序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列组成：
在一些实施方案中，所述人REP1蛋白包含下列氨基酸序列或由下列氨基酸序列组成：
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，包括那些其中所述最终组合物的所述多个完整rAAV的每个完整rAAV还包含核酸序列且所述核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)的实施方案，所述编码PRE的序列包含分离自或衍生自土拨鼠肝炎病毒(WPRE)的序列。在一些实施方案中，所述编码WPRE的序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列组成：
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，包括那些其中所述最终组合物的所述多个完整rAAV的每个完整rAAV还包含核酸序列且所述核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)的实施方案，所述编码聚腺苷酸化(polyA)位点的序列包含分离自或衍生自哺乳动物基因的序列。在一些实施方案中，所述编码聚腺苷酸化(polyA)位点的序列包含分离自或衍生自牛生长激素基因(BGH)的序列。在一些实施方案中，所述编码polyA位点的序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列组成：
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，包括那些其中所述最终组合物的所述多个完整rAAV的每个完整rAAV还包含核酸序列且所述核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)的实施方案，所述编码AAV2 5’ITR的序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列组成：
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，包括那些其中所述最终组合物的所述多个完整rAAV的每个完整rAAV还包含核酸序列且所述核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)的实施方案，所述编码AAV2 3’ITR的序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列组成：
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，包括那些其中所述最终组合物的所述多个完整rAAV的每个完整rAAV还包含核酸序列且所述核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)的实施方案，所述自5’至3’包含元件(a)至(i)的核酸包含DNA序列或由DNA序列组成。在一些实施方案中，所述自5’至3’包含元件(a)至(i)的核酸包含单链DNA序列或由单链DNA序列组成。
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，包括那些其中所述最终组合物的所述多个完整rAAV的每个完整rAAV还包含核酸序列且所述核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)的实施方案，所述最终组合物的所述多个完整rAAV的每个完整rAAV包含分离自或衍生自AAV2的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述AAV2衣壳蛋白包含与下列氨基酸序列具有至少95％同一性的序列：
在一些实施方案中，所述AAV2衣壳蛋白包含下列氨基酸序列：
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，包括那些其中所述最终组合物的所述多个完整rAAV的每个完整rAAV还包含核酸序列且所述核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)的实施方案，所述药物组合物还包含制剂缓冲剂。在一些实施方案中，所述制剂缓冲剂包含Tris、MgCl2和NaCl。在一些实施方案中，所述制剂缓冲剂包含20mM Tris、1mM MgCl2和200mM NaCl，pH 8。在一些实施方案中，所述制剂缓冲剂包含20mM Tris、1mM MgCl2和200mMNaCl、pH 8以及0.001％的泊洛沙姆188。
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，包括那些其中所述最终组合物的所述多个完整rAAV的每个完整rAAV还包含核酸序列且所述核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)的实施方案，所述多个完整rAAV的浓度在1x 108个基因组粒子(gp)/mL与1x 1014gp/mL之间(终点包括在内)。在一些实施方案中，所述多个完整rAAV的浓度在0.5x 1010gp/mL与2.5x 1012gp/mL之间(终点包括在内)。在一些实施方案中，所述多个完整rAAV的浓度在1x1011gp/mL与5x 1013gp/mL之间(终点包括在内)。在一些实施方案中，所述多个完整rAAV的浓度在1x 1011gp/mL与2x 1012gp/mL之间(终点包括在内)。在一些实施方案中，所述多个完整rAAV的浓度是1x 1012gp/mL。在一些实施方案中，所述多个完整rAAV的浓度是1x 1011gp/mL。在一些实施方案中，所述多个完整rAAV的浓度使用qPCR测量。在一些实施方案中，所述qPCR使用超螺旋质粒载体作为标准。在一些实施方案中，所述qPCR使用线性化质粒载体作为标准。
本公开提供一种递送装置，其包含本公开的药物组合物。在一些实施方案中，所述递送装置包括注射器、导管和针头中的一种或多种。在一些实施方案中，所述递送装置适合通过注射施用所述药物组合物。在一些实施方案中，所述递送装置适合通过输注施用所述药物组合物。在一些实施方案中，所述递送装置适合通过视网膜下途径施用所述药物组合物。在一些实施方案中，所述递送装置适合通过脉络膜上途径施用所述药物组合物。
本公开提供一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本公开的药物组合物。
在本公开的治疗疾病或病症的方法的一些实施方案中，所述疾病或病症是视网膜的疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是无脉络膜症。
在本公开的治疗疾病或病症的方法的一些实施方案中，所述治疗有效量包含在所述药物组合物的最小有效量与最大耐受量之间的量。
在本公开的治疗疾病或病症的方法的一些实施方案中，所述最小有效量包含足以转导视网膜或其目标部分的至少一个神经元的所述药物组合物的量。在一些实施方案中，所述最小有效量包含足以转导视网膜或其目标部分的至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或介于之间的任何百分比神经元的所述药物组合物的量。在一些实施方案中，所述最小有效量包含足以改善所述受试者的视敏度(visual acuity)的所述药物组合物的量。在一些实施方案中，所述最小有效量包含足以减少视网膜疾病的征象或症状的所述药物组合物的量。在一些实施方案中，所述视网膜疾病是无脉络膜症。
在本公开的治疗疾病或病症的方法的一些实施方案中，所述最大耐受量包含足以诱发不良事件的所述药物组合物的量。在一些实施方案中，所述不良反应包含对所述药物组合物的免疫反应。在一些实施方案中，所述免疫反应包含炎症。在一些实施方案中，所述炎症是全身性的。在一些实施方案中，所述炎症是局部性的。在一些实施方案中，所述不良事件是严重的。在一些实施方案中，所述不良事件无法通过向所述受试者施用二级医疗来预防、减少或控制。在一些实施方案中，所述二级医疗包含免疫系统的抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂包含抗发炎剂。在一些实施方案中，所述抗发炎剂包含皮质类固醇。在一些实施方案中，所述皮质类固醇包含强的松(prednisone)或强的松龙(prednisolone)。
在本公开的治疗疾病或病症的方法的一些实施方案中，所述药物组合物的治疗有效量包含具有在104与107之间(终点包括在内)的感染复数(multiplicity of infection，MOI)的量。在一些实施方案中，所述药物组合物的治疗有效量包含具有在1x 106与9x 106之间(终点包括在内)的感染复数(MOI)的量。在一些实施方案中，所述药物组合物的治疗有效量包含具有在104与105之间(终点包括在内)的感染复数(MOI)的量。在一些实施方案中，所述药物组合物的治疗有效量包含具有105的感染复数(MOI)的量。
在本公开的治疗疾病或病症的方法的一些实施方案中，所述治疗有效量包含在1x108gp与1x 1013gp之间(终点包括在内)。在一些实施方案中，所述治疗有效量包含在6x109gp与1x 1013gp之间(终点包括在内)。在一些实施方案中，所述治疗有效量包含在6x109gp与7x 1012gp之间(终点包括在内)。在一些实施方案中，所述治疗有效量包含在6x109gp与5x 1012gp之间(终点包括在内)。在一些实施方案中，所述治疗有效量包含在1x1010gp与1x 1012gp之间(终点包括在内)。在一些实施方案中，所述治疗有效量包含下列或由下列组成：1x 1010gp。在一些实施方案中，所述治疗有效量包含下列或由下列组成：1x1011gp。在一些实施方案中，所述治疗有效量包含下列或由下列组成：1x 1012gp。
在本公开的治疗疾病或病症的方法的一些实施方案中，所述治疗有效量包含下列体积或由下列体积组成：在10μL与200μL之间(终点包括在内)。在一些实施方案中，所述治疗有效量包含下列体积或由下列体积组成：在10μL与50μL之间、在50μL与100μL之间、在100μL与150μL之间或在150μL与200μL之间(每个范围的终点包括在内)。在一些实施方案中，所述治疗有效量包含下列体积或由下列体积组成：在70μL与120μL之间(终点包括在内)。在一些实施方案中，所述治疗有效量包含下列体积或由下列体积组成：100μL。
在本公开的治疗疾病或病症的方法的一些实施方案中，所述治疗有效量包含下列或由下列组成：在10μL与200μL之间(终点包括在内)的体积的至少一次注射。在一些实施方案中，所述治疗有效量包含下列或由下列组成：在10μL与200μL之间(终点包括在内)的体积的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10次注射。在一些实施方案中，两次或更多次注射是在相同医学程序期间对相同眼的视网膜下空间进行。在一些实施方案中，两次或更多次注射是在相同医学程序期间对相同眼的两个或更多个不同的视网膜下空间进行。在一些实施方案中，由治疗有效量的载体接触的视网膜下空间的面积包含下列或由下列组成：在5mm2与20mm2之间。在一些实施方案中，由治疗有效量的载体接触的视网膜下空间的面积包含下列或由下列组成：10mm2。在一些实施方案中，一次或多次注射是在眼的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个不同的视网膜区进行。在一些实施方案中，一次或多次注射是在单一程序期间在眼的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个不同的视网膜区进行。在一些实施方案中，一次或多次注射是在两个或更多个程序期间在眼的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个不同的视网膜区进行。
在本公开的治疗疾病或病症的方法的一些实施方案中，所述治疗有效量包含下列或由下列组成：自相同装置施用在10μL与200μL之间(终点包括在内)的体积的至少一次注射。在本公开的治疗疾病或病症的方法的一些实施方案中，所述治疗有效量以分成在一次或多次注射之间的分次剂量通过相同装置递送。分次剂量可施用到相同的视网膜下空间或相同眼内两个或更多个不同的视网膜下空间。
在本公开的治疗疾病或病症的方法的一些实施方案中，所述施用步骤包括注射或输注。在一些实施方案中，所述施用步骤包括视网膜下、脉络膜上或玻璃体内途径。在一些实施方案中，所述施用步骤包括视网膜下注射或输注。在一些实施方案中，所述视网膜下注射或输注包括2步骤视网膜下注射。在一些实施方案中，所述施用步骤包括脉络膜上注射或输注。
在本公开的治疗疾病或病症的方法的一些实施方案中，所述受试者是男性。在一些实施方案中，所述受试者是至少18岁。在一些实施方案中，所述受试者具有基因确诊的无脉络膜症。在一些实施方案中，所述受试者已被鉴别为具有REP1基因突变。在一些实施方案中，所述受试者在至少一个眼的黄斑呈现无脉络膜症的临床征象。在一些实施方案中，所述受试者的至少一个眼具有34至73个字母的最佳矫正视力(BCVA)分数。在一些实施方案中，所述受试者具有轻微或早期阶段的无脉络膜症。在一些实施方案中，所述受试者具有晚期或严重的无脉络膜症。
在本公开的治疗疾病或病症的方法的一些实施方案中，所述方法包括治疗至少一个眼的10mm2的视网膜。在一些实施方案中，所述方法包括治疗至少一个眼的在5mm2与10mm2之间(终点包括在内)的视网膜。在一些实施方案中，所述方法包括治疗至少一个眼的在2mm2与15mm2之间(终点包括在内)的视网膜。
在本公开的治疗疾病或病症的方法的一些实施方案中，将所述药物组合物施用到所述受试者的一个眼。在一些实施方案中，将所述药物组合物施用到所述受试者的双眼。在一些实施方案中，所述受试者的双眼同时治疗。在一些实施方案中，所述受试者的双眼依序治疗。在一些实施方案中，在向所述受试者施用所述药物组合物之前，所述受试者的至少一个眼已接受过无脉络膜症的治疗。
在本公开的治疗疾病或病症的方法的一些实施方案中，所述方法包括每眼施用1至12剂(终点包括在内)。在一些实施方案中，所述方法包括至少每天一次、每周一次、每月一次、每三个月一次、每6个月一次或每年一次施用至少一剂。在一些实施方案中，所述方法包括施用多剂且其中每一剂包含相同量的所述药物组合物。在一些实施方案中，所述方法包括施用多剂且其中每一剂包含不同量的所述药物组合物。在一些实施方案中，所述方法包括施用多剂且其中每一后继剂包含比前一剂更大数量的完整rAAV。在一些实施方案中，所述方法包括施用多剂且其中每一后继剂包含比前一剂更小数量的完整rAAV。
在本公开的治疗疾病或病症的方法的一些实施方案中，所述方法包括每眼施用1至12剂(终点包括在内)。在一些实施方案中，剂量在恢复期之后提供。在一些实施方案中，恢复期为至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60分钟或介于之间的任何分钟数。在一些实施方案中，恢复期为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时。在一些实施方案中，恢复期为至少1、2、3、4、5、6或7天。在一些实施方案中，恢复期为至少1、2、3或4周。在一些实施方案中，恢复期为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在一些实施方案中，恢复期为至少1、2、3、4、5或6年。
在本公开的治疗疾病或病症的方法的一些实施方案中，包括那些其中所述方法包括每眼施用1至12剂(终点包括在内)的实施方案，所述受试者在治疗有效剂量之后经历不良事件且所述后续剂量包含比诱发所述不良事件的前一剂更小数量的完整rAAV。在一些实施方案中，所述受试者从所述不良事件恢复且向所述受试者施用后续剂量的所述药物组合物。在一些实施方案中，诱发所述不良事件的所述治疗有效剂量和所述后续剂量含有相等数量的完整rAAV。在一些实施方案中，诱发所述不良事件的所述治疗有效剂量和所述后续剂量含有不相等数量的完整rAAV。
在本公开的治疗疾病或病症的方法的一些实施方案中，所述方法在施用治疗有效量的所述药物组合物之前还包括向所述受试者施用多个安慰剂rAAV的量，其中每个安慰剂rAAV是空rAAV。在一些实施方案中，所述空rAAV不含表达外源性序列的启动子或外源性序列。在一些实施方案中，施用所述多个安慰剂rAAV的量是全身性的。在一些实施方案中，施用所述多个安慰剂rAAV的量是局部性的。在一些实施方案中，所述方法还包括(a)确定所述多个安慰剂rAAV是否诱发所述受试者的免疫反应和/或(b)确定所述受试者是否发展出对所述多个安慰剂rAAV的免疫耐受性，由此表明施用治疗有效量的所述药物组合物应该不会诱发所述受试者的免疫介导的不良事件。
在本公开的治疗疾病或病症的方法的一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用免疫反应的抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂包含抗发炎剂。在一些实施方案中，所述抗发炎剂包含皮质类固醇。在一些实施方案中，所述皮质类固醇包含强的松或泼尼松龙。在一些实施方案中，施用所述免疫反应的抑制剂是全身性的。在一些实施方案中，所述免疫反应的抑制剂口服施用。在一些实施方案中，施用所述免疫反应的抑制剂是局部性的。在一些实施方案中，所述免疫反应的抑制剂向用所述药物组合物治疗过的眼施用。在一些实施方案中，所述药物组合物和所述免疫反应的抑制剂同时施用。在一些实施方案中，所述药物组合物和所述免疫反应的抑制剂在同一天施用。在一些实施方案中，所述药物组合物和所述免疫反应的抑制剂依序施用。在一些实施方案中，所述抑制剂在施用所述药物组合物至少一天之前施用。在一些实施方案中，所述药物组合物在施用所述抑制剂至少一天之前施用。
在本公开的治疗疾病或病症的方法的一些实施方案中，所述方法还包括确定所述受试者的至少一个眼的无脉络膜症介导的伤害的初始严重性。在一些实施方案中，所述方法还包括在向所述至少一个眼施用所述药物组合物之后确定所述受试者的所述至少一个眼的无脉络膜症介导的伤害的后续严重性。在一些实施方案中，所述无脉络膜症介导的伤害的初始或后续严重性通过下列确定：确定最佳矫正视力(BCVA)测试分数、测量存活视网膜组织的面积或体积、测量保留的椭圆体带、测量视网膜敏感度、测量对比敏感度、测量色视觉、测量低亮度视敏度、测量速读或其任何组合。在一些实施方案中，所述BCVA测试利用(糖尿病视网膜病变早期治疗研究)ETDRS表。在一些实施方案中，所述BCVA测试包含手指计数、手移动、光感知及其组合中的一种或多种的评估。在一些实施方案中，存活视网膜组织包含眼底自发荧光且其中测量存活视网膜组织包含检测眼底自发荧光的水平或模式。在一些实施方案中，测量保留椭圆体带包括频域光学相干断层扫描(SD-OCT)。在一些实施方案中，测量视网膜敏感度包括微视野检查。
在本公开的治疗疾病或病症的方法的一些实施方案中，施用所述治疗有效量的所述药物组合物抑制或减少无脉络膜症的征象或症状的进展。在一些实施方案中，施用所述治疗有效量的所述药物组合物减少无脉络膜症的征象或症状。在一些实施方案中，无脉络膜症的征象或症状包括光感受器细胞丧失、RPE细胞丧失、视敏度降低、低亮度视敏度降低、保留自发荧光(AF)总面积、BCVA测试分数低、保留椭圆体带的面积减小、视网膜敏感度降低、对比敏感度降低、色视觉降低或变淡、速读速度降低或其任何组合。在一些实施方案中，所述无脉络膜症的征象或症状的严重性相对于健康视网膜确定。在一些实施方案中，所述健康视网膜属于年龄匹配的对照受试者。
本公开提供一种确定本公开的药物组合物的治疗有效量的方法，所述方法包括：(a)测量待治疗的受试者的视网膜区，(b)确定所述(a)的区是否在中央0.5mm2凹区中或在黄斑中，(c)计算所述(a)的区内的杆状细胞、锥状细胞和视网膜色素上皮(RPE)细胞的数量，和(d)将细胞总数乘以1x 105的感染复数(MOI)以计算待包括在所述治疗有效量中的基因组粒子(gp)的数量，其中所述待治疗的视网膜的最大面积是10mm2，其中所述视网膜中RPE细胞的密度是5,000个细胞/mm2，其中所述视网膜中杆状细胞的密度是75,000个杆状细胞/mm2(不包括中央0.5mm2凹区)，其中所述视网膜中锥状细胞的密度在所述中央0.5mm2凹区中是150,000个锥状细胞/mm2，且所述视网膜中锥状细胞的密度在所述中央0.5mm2凹区以外的黄斑中是25,000个/mm2。
本公开提供用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的本公开的药物组合物。
本公开提供用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的本公开的载体。
本公开提供用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的本公开的AAV或rAAV。
附图说明
图1是示例性AAV2构建体原料药制造方法(工艺2)的概览。
图2是对应图1中提供的概览的流程图。
图3是描绘示例性AAV2构建体的结构组织的图。
图4是HEK293 MCB产生的概览。
图5是AAV2构建体原料药制造方法(原始工艺)的概览。
图6是对应图5中提供的概览的流程图。
图7是描绘AAV2构建体成品药制造方法(原始工艺)的流程图。
图8是一对描绘原始方法和改善方法的细胞培养期的比较的流程图。
图9是描绘原始方法和改善方法的细胞培养期的比较的图。
图10是描绘原始方法和改善方法的细胞培养期的比较的图。
图11是描绘自原始工艺转移到改善工艺的下游方法的流程图。
图12是描绘AmpR(左长条)和KanR(右长条)质粒的产率分析AVG DRP/cm2的比较的图。
图13是描绘阐明每个细胞在AAV2构建体转导之后的构建体表达的可检测标签的平均荧光强度的图。
图14是描绘如通过流式细胞术确定的GFP阳性细胞的百分比的图，所述GFP阳性细胞的百分比指示用AAV2构建体转导之后表达构建蛋白质的细胞的百分比。
图15是描绘AAV2构建体产率分析的平均产率结果的图。
图16是描绘来自AAV2构建体(非GMP)组合物(来自改善工艺)的纯度数据的凝胶电泳相片。
图17是描绘用等效MOI的来自原始工艺和改善工艺所产生的(非GMP)组合物的AAV2构建体载体体外转导HEK293细胞之后的构建体表达和活性的凝胶电泳相片。
图18是pAAV-REP1-Kan质粒的图谱。
图19是pBC-hREP1载体的完整序列(SEQ ID NO:24)。
图20是描绘治疗眼和未治疗眼在基因疗法后2年的视敏度(实施例13)的图。2年时用早期治疗糖尿病视网膜病变研究(ETDRS)表测量12名接受视网膜下基因疗法而无并发症的无脉络膜症患者的视敏度(水平线代表中位数，盒形图代表四分位数范围且盒须代表极限)。治疗眼以蓝色显示，未治疗眼以绿色显示(分别为每个时间点的左长条和右长条)。还显示1年时的临时数据。治疗眼的视敏度在基因疗法后2年得到改善(p＝0.020)。在这段期间治疗眼相对于未治疗眼改善(p＝0.003)。
图21是描绘治疗眼和未治疗眼在基因疗法后2年的黄斑功能的图。用微视野检查测量的视网膜敏感度包括黄斑各处的点且随视网膜功能改善而增加。未治疗眼的视网膜敏感度到2年时自基线下降(p＝0.004)，但治疗眼在这段期间并无显著变化。还显示1年时的临时数据。治疗眼以蓝色显示，且未治疗眼以绿色显示(分别为每个时间点的左长条和右长条)，误差条代表平均值的标准误差。
图22是描绘实施例14中所述的GEMINI试验的设计的示意图。
图23A至图23B是描绘玻璃体切除术(A)和视网膜下注射(B)AAV2载体的示意图。(A)通过BIOM操作系统去除玻璃体凝胶的标准玻璃体切除术，随后为(B)2步骤程序：1)通过注射BSS剥离视网膜；2)通过41号规导管注射体积0.1mL载体悬浮液至视网膜下空间。
图24是描绘实施例15中所述的STAR试验的设计的示意图。
图25是显示如通过PCR确定的AAV滴度的图。X轴是初始滴度为1x 1012DNA酶抵抗粒子(DRP)/mL、1x 1011DRP/mL和1x 1011DRP/mL在平衡盐水溶液(BSS)中的样品。Y轴显示样品在图右侧所述处理之后测量的滴度。
图26是一系列3张蛋白质印迹相片，显示在使用高剂量1x 1012DRP/mL和10,000的MOI的AAV2.REP1.ENG1014-A载体的相容性研究中，rAAV2.REP-1的异戊烯化活性。从上到下显示：hREP1(83KDa)、肌动蛋白(42KDa)和生物素化Rab6a(24KDa)。蛋白质大小在左侧指示，从上到下为180、135、100、75、63、48、35、25、20、17和11KDa。样品(从左到右)一式三份是：未转导的对照、用基线载体转导的细胞、用在4℃下保持6小时的载体转导的细胞、用在4℃下保持6小时且在180分钟后注射的载体转导的细胞、用在4℃下保持6小时且在注射器中180分钟的载体转导的细胞和作为阳性对照的鱼REP1(单一样品)。
图27是一系列3张蛋白质印迹相片，显示在使用低剂量1x 1011DRP/mL和10,000的MOI的AAV2.REP1.ENG1014-A载体的相容性研究中，rAAV2.REP-1的异戊烯化活性。从上到下显示：hREP1(83KDa)、肌动蛋白(42KDa)和生物素化Rab6a(24KDa)。蛋白质大小在左侧指示，从上到下为180、135、100、75、63、48、35、25、20、17和11KDa。样品(从左到右)一式三份是：未转导的对照、用基线载体转导的细胞、用在4℃下保持6小时的载体转导的细胞、用在4℃下保持6小时且在180分钟后注射的载体转导的细胞、在4℃下保持6小时且在注射器中180分钟的载体转导的细胞和作为阳性对照的鱼REP1(单一样品)。
图28A至图28B是一对显示在使用AAV2.REP1.ENG1014-A载体的相容性研究中rAAV2.REP-1的异戊烯化活性的蛋白质印迹半定量的图表。(A)显示标准化REP1。条带密度值(a.u.)是y轴且高剂量1x 1012DRP/mL和低剂量1x 1011DRP/mL的AAV2-REP1是x轴。(B)显示标准化生物素化Rab6a。条带密度值(a.u.)是y轴且高剂量1x 1012DRP/mL和低剂量1x1011DRP/mL的AAV2-REP1是x轴。在(A)和(B)中，每一剂量的长条从左到右指示未转导的细胞、用基线载体转导的细胞、用在4℃下保持6小时的载体转导的细胞、用在4℃下保持6小时且在20℃下180分钟后注射的载体转导的细胞、用在4℃下保持6小时且在20℃下注射器中180分钟的载体转导的细胞。
图29是本公开的示例性构建体，其包含下列核苷酸序列或由下列核苷酸序列组成：所述核苷酸序列自5’至3’包含编码5’反向末端重复(ITR)的序列、编码CAG启动子的序列、编码人REP1蛋白的序列、编码突变的WPRE信号的序列、编码牛生长激素的聚腺苷酸化信号的序列和编码3’ITR的序列。
具体实施方式
本公开提供用于纯化本公开的重组AAV(rAAV)粒子的方法。本公开提供药物组合物，其包含本公开的方法所产生的rAAV粒子。在一些实施方案中，包含本公开的方法所产生的rAAV粒子的药物组合物包含：(a)在0.5x 1012与2.5x 1012个载体基因组(vg)/mL之间的复制缺陷和重组腺相关病毒(rAAV)；(b)小于50％空衣壳；(c)每1.0x 1012vg/mL小于4ng/mL的残余宿主细胞蛋白；和(d)每1.0x 1012vg/mL小于7x 10-3pg/ml的残余宿主细胞DNA。
本公开提供一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的本公开的药物组合物。在一些实施方案中，所述疾病或病症是视网膜的疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是无脉络膜症。
本公开提供一种药物组合物，其包含：(a)在0.5x 1012与2.5x 1012个载体基因组(vg)/mL之间的复制缺陷和重组腺相关病毒(rAAV)；(b)小于50％空衣壳；(c)每1.0x1012vg/mL小于4ng/mL的残余宿主细胞蛋白；和(d)每1.0x 1012vg/mL小于7x 10-3pg/ml的残余宿主细胞DNA。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含：(a)在0.5x 1012与2.5x 1012个载体基因组(vg)/mL之间的复制缺陷和重组腺相关病毒(rAAV)；(b)小于50％空衣壳；(c)每1.0x1012vg/mL小于4ng/mL的残余宿主细胞蛋白；(d)每1.0x 1012vg/mL小于7x 10-3pg/ml的残余宿主细胞DNA；和(e)多个功能性vg/mL，其中功能性载体基因组中的每一个能够在转导之后在细胞中表达外源性序列。在一些实施方案中，在用本公开的药物组合物转导细胞之后，所述多个功能性vg/mL以相较于非转导细胞中对应内源性序列增加2倍的表达水平表达所述外源性序列。在一些实施方案中，在用本公开的药物组合物转导细胞之后，所述多个功能性vg/mL以相较于非转导细胞中对应内源性序列增加3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍或任何其他介于之间的增加倍数的表达水平表达所述外源性序列。在一些实施方案中，所述外源性序列与所述对应内源性序列相同。在一些实施方案中，所述外源性序列与所述对应内源性序列不相同。在一些实施方案中，所述外源性序列与所述对应内源性序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或介于之间的任何百分比的同一性。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含：(a)在0.5x 1012与2.5x 1012个载体基因组(vg)/mL之间的复制缺陷和重组腺相关病毒(rAAV)；(b)小于50％空衣壳；(c)每1.0x1012vg/mL小于4ng/mL的残余宿主细胞蛋白；(d)每1.0x 1012vg/mL小于7x 10-3pg/ml的残余宿主细胞DNA；和(e)多个功能性vg/mL，其中功能性载体基因组中的每一个能够在转导之后在细胞中表达外源性序列。在一些实施方案中，在用本公开的药物组合物转导细胞之后，所述外源性序列编码蛋白质。在一些实施方案中，所述外源性序列所编码的所述蛋白质具有等于或大于非转导细胞的对应序列所编码的蛋白质的活性水平的活性水平。在一些实施方案中，所述外源性序列与所述对应内源性序列相同。在一些实施方案中，所述外源性序列与所述对应内源性序列不相同。在一些实施方案中，所述外源性序列与所述对应内源性序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或介于之间的任何百分比的同一性。在一些实施方案中，所述活性包含与配体或底物结合、活化配体或底物和/或将一个或多个官能团转移到配体或底物。在一些实施方案中，所述蛋白质包含REP-1蛋白且所述活性包含REP-1底物的异戊烯化。
AAV组合物
本公开的组合物包含适合向哺乳动物且优选地向人全身性或局部性施用的治疗性构建体。本公开的示例性构建体包含编码基因或其部分的序列。优选地，本公开的构建体包含编码人基因或其部分的序列。本公开的示例性构建体还可包含一个或多个编码调节元件的序列以使基因或其部分能够表达或增强表达。示例性调节元件包括但不限于启动子、内含子、增强子元件、反应元件(包括转录后反应元件或转录后调节元件)、聚腺苷(polyA)序列和促进转录有效终止的基因片段(包括β球蛋白基因片段和兔β球蛋白基因片段)。
在本公开的组合物的一些实施方案中，构建体包含对应人Rab护送蛋白第1型(REP-1)蛋白质或其部分的人基因或其部分。在本公开的组合物的一些实施方案中，构建体包含人基因或其部分，所述人基因或其部分包含密码子优化序列。在一些实施方案中，序列经密码子优化以在哺乳动物中表达。在一些实施方案中，序列经密码子优化以在人中表达。
在本公开的组合物的一些实施方案中，其中构建体包含人REP-1蛋白或其部分，所述构建体被称为“AAV2-REP1或AAV2.REP1”且国际非专有名(INN)是timrepigeneemparvovec。在一些实施方案中，构建体包含下列序列或由下列序列组成：
在一些实施方案中，构建体包含序列或由序列组成，所述序列编码具有下列序列的人REP1序列：
或所述序列与下列序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或介于之间的任何百分比同一性：
在一些实施方案中，构建体包含序列或由序列组成，所述序列编码具有下列序列的CAG启动子：
或所述序列与下列序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或介于之间的任何百分比同一性：
在一些实施方案中，构建体包含序列或由序列组成，所述序列编码具有下列序列的突变的WPRE信号：
在一些实施方案中，构建体包含序列或由序列组成，所述序列编码具有下列序列的牛生长激素的聚腺苷酸化信号：
在一些实施方案中，构建体包含序列或由序列组成，所述序列编码具有下列序列的5’ITR：
在一些实施方案中，构建体包含序列或由序列组成，所述序列编码具有下列序列的3’ITR：
在本公开的组合物的一些实施方案中，其中构建体包含人REP-1蛋白或其部分，所述构建体被称为“AAV2-REP1或AAV2.REP1”且国际非专有名(INN)是timrepigeneemparvovec。在本公开的组合物的一些实施方案中，其中构建体包含人REP-1蛋白或其部分，所述AAV2-REP1产物由编码人Rab护送蛋白第1型(REP1)的cDNA的纯化的重组血清型2腺相关病毒载体(rAAV)组成。在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒粒子含有长度4173bp的单链DNA插入序列(加上侧接每个元件的短克隆位点)，所述单链DNA插入序列包含：177bp5’反向末端重复(ITR)、934bp巨细胞病毒增强子/鸡β肌动蛋白(CBA)杂交启动子、1962bp人REP1 cDNA、589bp土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)、242bp牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH-polyA)和165bp 3’ITR。在一些实施方案中，用于产生AAV2-REP1载体的pAAV.REP-1-Kan质粒显示在图18中。在一些实施方案中，1962bp人REP1 cDNA包含下列核酸序列：
在本公开的组合物的一些实施方案中，构建体还包含对应5’反向末端重复(ITR)的序列和对应3’反向末端重复(ITR)的序列。在一些实施方案中，编码5’ITR的序列与编码3’ITR的序列相同。在一些实施方案中，编码5’ITR的序列与编码3’ITR的序列不相同。在一些实施方案中，编码5’ITR的序列与编码3’ITR的序列分离自或衍生自血清型2的腺相关病毒(AAV2)载体。在一些实施方案中，编码5’ITR的序列和编码3’ITR的序列包含野生型序列。在一些实施方案中，编码5’ITR的序列和编码3’ITR的序列包含截短野生型AAV2序列。在一些实施方案中，编码5’ITR的序列和编码3’ITR的序列相较于相同AAV血清型的野生型序列包含变异。在一些实施方案中，变异包含取代、插入、缺失、倒置或转座。在一些实施方案中，变异包含野生型或变体序列的截短或伸长。
在本公开的组合物的一些实施方案中，AAV包含对应5’反向末端重复(ITR)的序列和对应3’反向末端重复(ITR)的序列。在一些实施方案中，编码5’ITR的序列与编码3’ITR的序列相同。在一些实施方案中，编码5’ITR的序列与编码3’ITR的序列不相同。在一些实施方案中，编码5’ITR的序列和编码3’ITR的序列分离自或衍生自血清型2的腺相关病毒(AAV2)载体。在一些实施方案中，编码5’ITR的序列和编码3’ITR的序列包含野生型序列。在一些实施方案中，编码5’ITR的序列和编码3’ITR的序列包含截短野生型AAV2序列。在一些实施方案中，编码5’ITR的序列和编码3’ITR的序列相较于相同AAV血清型的野生型序列包含变异。在一些实施方案中，变异包含取代、插入、缺失、倒置或转座。在一些实施方案中，变异包含野生型或变体序列的截短或伸长。
在本公开的组合物的一些实施方案中，AAV包含形成复制缺陷AAV所必需的病毒序列。在一些实施方案中，病毒序列分离自或衍生自与编码5’ITR的序列或编码3’ITR的序列中一个或两个相同血清型的AAV。在一些实施方案中，病毒序列、编码5’ITR的序列或编码3’ITR的序列分离自或衍生自AAV2。在一些实施方案中，病毒序列、编码5’ITR的序列和编码3’ITR的序列分离自或衍生自AAV2。
在本公开的组合物的一些实施方案中，AAV包含形成复制缺陷AAV所必需的病毒序列、编码5’ITR的序列和编码3’ITR的序列，但不包含任何其他分离自或衍生自AAV的序列。在一些实施方案中，AAV是重组AAV(rAAV)，其包含形成复制缺陷AAV所必需的病毒序列、编码5’ITR的序列、编码3’ITR的序列和编码本公开的构建体的序列。
在一些实施方案中，用于在宿主细胞中产生rAAV的质粒DNA包含选择标志。示例性选择标志包括但不限于抗生素抵抗基因。示例性抗生素抵抗基因包括但不限于氨苄西林(ampicillin)和卡那霉素。示例性选择标志包括但不限于药物或小分子抵抗基因。示例性选择标志包括但不限于dapD和抑制性操作子，包括但不限于控制或抑制dapD表达的lacO/P构建体，其中质粒选择通过用能够进行操作子抑制子滴定(ORT)的质粒施用或接触转化的细胞执行。示例性选择标志包括但不限于ccd选择基因。在一些实施方案中，ccd选择基因包含编码ccdA选择基因的序列，所述ccdA选择基因救援经工程改造以表达毒性ccdB基因的宿主细胞系。示例性选择标志包括但不限于sacB，其中RNA向宿主细胞施用或接触以抑制sacB基因在蔗糖培养基中的表达。示例性选择标志包括但不限于分离杀伤机制，诸如由Hok(宿主杀伤基因)和Sok(抑制杀伤)构成的parAB+基因座。
AAV构建体结构
AAV2构建体产物由编码cDNA的纯化的重组血清型2腺相关病毒载体(rAAV)组成，所述cDNA编码治疗性构建体。示例性图提供在图3中。
在一些实施方案中，AAV2构建体包含编码5’ITR的序列、编码3’ITR的序列和编码分离自和/或衍生自血清型2腺相关病毒载体(AAV2)的衣壳蛋白的序列中的一种或多种。在一些实施方案中，AAV2构建体包含编码5’ITR的序列、编码3’ITR的序列和编码分离自和/或衍生自血清型2腺相关病毒载体(AAV2)的衣壳蛋白的序列。在一些实施方案中，AAV2构建体包含编码5’ITR的截短序列、编码5’ITR的序列和编码分离自和/或衍生自血清型2腺相关病毒载体(AAV2)的3’ITR的序列。在一些实施方案中，AAV2构建体包含野生型AAV2 ITR(野生型5’ITR和野生型3’ITR)。
在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒粒子含有单链DNA插入序列(加上侧接每个元件的短克隆位点)，所述单链DNA插入序列包含：(a)5’反向末端重复(ITR)、(b)适合在哺乳动物细胞中表达的启动子、(c)编码治疗性构建体的cDNA和(d)3’ITR。
在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒粒子含有单链DNA插入序列(加上侧接每个元件的短克隆位点)，所述单链DNA插入序列包含：(a)145bp 5’反向末端重复(ITR)、(b)适合在哺乳动物细胞中表达的启动子、(c)编码治疗性构建体的cDNA和(d)145bp 3’ITR。在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒粒子含有单链DNA插入序列(加上侧接每个元件的短克隆位点)，所述单链DNA插入序列包含：(a)5’反向末端重复(ITR)、(b)适合在哺乳动物细胞中表达的启动子、(c)编码治疗性构建体的cDNA和(d)3’ITR，其中5’ITR或3’ITR包含下列或由下列组成：134bp、135bp、136bp或137bp。
在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒粒子含有单链DNA插入序列(加上侧接每个元件的短克隆位点)，所述单链DNA插入序列包含：(a)145bp 5’反向末端重复(ITR)、(b)适合在哺乳动物细胞中表达的启动子、(c)编码治疗性构建体的cDNA、(e)聚腺苷酸化序列(polyA)和(f)145bp 3’ITR。在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒粒子含有单链DNA插入序列(加上侧接每个元件的短克隆位点)，所述单链DNA插入序列包含：(a)5’反向末端重复(ITR)、(b)适合在哺乳动物细胞中表达的启动子、(c)编码治疗性构建体的cDNA、(e)聚腺苷酸化序列(polyA)和(f)3’ITR，其中5’ITR或3’ITR包含下列或由下列组成：134bp、135bp、136bp或137bp。
在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒粒子含有单链DNA插入序列(加上侧接每个元件的短克隆位点)，所述单链DNA插入序列包含：(a)145bp 5’反向末端重复(ITR)、(b)适合在哺乳动物细胞中表达的启动子、(c)编码治疗性构建体的cDNA、(d)转录后调节元件(PRE)、(e)聚腺苷酸化序列(polyA)和(f)145bp 3’ITR。在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒粒子含有单链DNA插入序列(加上侧接每个元件的短克隆位点)，所述单链DNA插入序列包含：(a)5’反向末端重复(ITR)、(b)适合在哺乳动物细胞中表达的启动子、(c)编码治疗性构建体的cDNA、(d)转录后调节元件(PRE)、(e)聚腺苷酸化序列(polyA)和(f)3’ITR，其中5’ITR或3’ITR包含下列或由下列组成：134bp、135bp、136bp或137bp。
在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒粒子含有单链DNA插入序列(加上侧接每个元件的短克隆位点)，所述单链DNA插入序列包含：(a)145bp 5’反向末端重复(ITR)、(b)启动子，任选地934bp巨细胞病毒增强子/鸡β肌动蛋白(CBA)杂交启动子、(c)编码治疗性构建体的cDNA、(d)589bp土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)、(e)242bp牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH-polyA)和(f)145bp 3’ITR。在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒粒子含有单链DNA插入序列(加上侧接每个元件的短克隆位点)，所述单链DNA插入序列包含：(a)5’反向末端重复(ITR)、(b)启动子，任选地934bp巨细胞病毒增强子/鸡β肌动蛋白(CBA)杂交启动子、(c)编码治疗性构建体的cDNA、(d)589bp土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)、(e)242bp牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH-polyA)和(f)3’ITR，其中5’ITR或3’ITR包含下列或由下列组成：134bp、135bp、136bp或137bp。
本公开的AAV或构建体可包含编码能够在哺乳动物细胞中表达的启动子的序列。优选地，本公开的AAV或构建体可包含编码能够在人细胞中表达的启动子的序列。本公开的示例性启动子包括但不限于组成性活性启动子、细胞类型特异性启动子、病毒启动子、哺乳动物启动子和杂交或重组启动子。在本公开的组合物的一些实施方案中，AAV2构建体的治疗性构建体在鸡β肌动蛋白启动子(CBA)启动子的控制下。在本公开的组合物的一些实施方案中，CBA启动子包含编码巨细胞病毒(CMV)增强子的序列和编码鸡β肌动蛋白启动子的序列(不同地称为CBA或CAG)。
本公开的AAV或构建体可包含编码转录后调节元件(PRE)的序列。本公开的示例性PRE包括但不限于土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)。在本公开的组合物的一些实施方案中，AAV在编码本公开的治疗性构建体的cDNA的直接下游包含源自病毒S转录物的3’区域的589bp WPRE。所述WPRE对于天然mRNA转录物的高水平表达来说很重要，其作用是增强无内含子基因的mRNA加工和运输。在本公开的组合物的一些实施方案中，WPRE已被修饰以通过剥蚀翻译起始位点来预防病毒X抗原的表达。这通过缺失We2启动子/增强子和突变We1启动子达成。
本公开的AAV或构建体可包含聚腺苷(polyA)序列。本公开的示例性polyA序列包括但不限于牛生长激素聚腺苷酸化(BGH-polyA)序列。BGH-polyA序列用于增强基因表达且已显示比其他polyA序列诸如SV40和人胶原蛋白polyA产生三倍高的表达水平。所述增加的表达大多与上游启动子的类型或转基因无关。使用BGH-polyA和WPRE序列两者的增加的表达水平允许较低待注射的AAV或质粒载体的总体剂量，因而不太可能产生宿主免疫反应。
在一个示例性实施方案中，pBC-hREP1载体包含下列或由下列组成：如SEQ ID NO:24所示的核酸序列。
在本公开的组合物的一些实施方案中，所述组合物包含原料药。如本文所用，原料药包含本公开的rAAV，所述rAAV包含本公开的构建体。
在本公开的组合物的一些实施方案中，所述组合物包含成品药。如本文所用，成品药包含配制成用于向受试者施用以治疗或预防疾病或病症的原料药。
本公开的示例性成品药的组分、其功能和规格列于表1中。
表1：AAV2构建体成品药的组成
剂型
本公开的组合物可配制成用于全身性或局部性施用。
本公开的组合物可配制成注射或输注用悬浮液。
本公开的组合物可配制成用于通过任何途径注射或输注，包括但不限于玻璃体内注射或输注、视网膜下注射或输注或脉络膜上注射或输注。
本公开的组合物可配制为在1.0x 10^10DRP/mL与1.0x 10^14DRP/mL之间(终点包括在内)的浓度。在一些实施方案中，本公开的组合物可配制为约1.0x 10^12DRP/mL的浓度。在一些实施方案中，本公开的组合物可配制为1.0x 10^12DRP/mL的浓度。在一些实施方案中，本公开的组合物可配制为在0.1x 10^12DRP/mL与10.0x 10^12DRP/mL之间(终点包括在内)的浓度。在一些实施方案中，本公开的组合物可配制为在0.1x 10^12DRP/mL与5.0x10^12DRP/mL之间(终点包括在内)的浓度。在一些实施方案中，本公开的组合物可配制为在0.1x 10^12DRP/mL与2.0x 10^12DRP/mL之间(终点包括在内)的浓度。在一些实施方案中，本公开的组合物可配制为在0.5x 10^12DRP/mL与1.5x 10^12DRP/mL之间(终点包括在内)的浓度。在一些实施方案中，本公开的组合物可配制为在0.7x 10^12DRP/mL与1.3x 10^12DRP/mL之间(终点包括在内)的浓度。在一些实施方案中，本公开的组合物可配制为在0.8x 10^12DRP/mL与1.2x 10^12DRP/mL之间(终点包括在内)的浓度。在一些实施方案中，本公开的组合物可配制为在0.9x 10^12DRP/mL与1.1x 10^12DRP/mL之间(终点包括在内)的浓度。
本公开的组合物可在施用之前使用本公开的稀释剂稀释。在一些实施方案中，稀释剂与用于制备AAV2构建体成品药的制剂缓冲剂相同。在一些实施方案中，稀释剂与用于制备AAV2构建体成品药的制剂缓冲剂不相同。
本公开的组合物(包括表1中所述的AAV2构建体成品药)可配制为含有1.0x 10^12DRP/mL的注射用悬浮液。如果协议有所需要，则AAV2构建体成品药可在施用之前在诊所里(即，由医疗专业人员)使用本公开的稀释剂稀释。在一些实施方案中，这种稀释剂是用于制备AAV2构建体成品药的相同的制剂缓冲剂。
药物制剂
本公开的组合物可包含原料药。在一些实施方案中，原料药包含下列或由下列组成：AAV2构建体。在一些实施方案中，原料药包含下列或由下列组成：AAV2构建体和制剂缓冲剂。在一些实施方案中，所述制剂缓冲剂包含20mM Tris、1mM MgCl2和200mM NaCl，pH 8。在一些实施方案中，所述制剂缓冲剂包含20mM Tris、1mM MgCl2和200mM NaCl、pH 8以及0.001％的泊洛沙姆188。
赋形剂
本公开的组合物可包含成品药。在一些实施方案中，成品药包含下列或由下列组成：原料药和制剂缓冲剂。在一些实施方案中，成品药包含下列或由下列组成：在制剂缓冲剂中稀释的原料药。在一些实施方案中，成品药包含下列或由下列组成：在制剂缓冲剂中稀释至最终成品药AAV2构建体载体基因组(vg)浓度的AAV2构建体原料药。
眼制剂
本公开的组合物可配制成包含下列、主要由下列组成或由下列组成：用于眼注射或输注的最佳浓度的AAV2构建体原料药。
本公开的组合物可包含增加或增强本公开的AAV的稳定性的一种或多种缓冲剂。在一些实施方案中，本公开的组合物可包含确保或增强本公开的AAV2的稳定性的一种或多种缓冲剂。或者或另外，本公开的组合物可包含预防、降低或最小化AAV粒子聚集的一种或多种缓冲剂。在一些实施方案中，本公开的组合物可包含预防、降低或最小化AAV2粒子聚集的一种或多种缓冲剂。
本公开的组合物可包含诱导或维持中性或微碱性pH的一种或多种组分。在一些实施方案中，本公开的组合物包含诱导或维持在7与9之间(终点包括在内)的中性或微碱性pH的一种或多种组分。在一些实施方案中，本公开的组合物包含诱导或维持pH约8的一种或多种组分。在一些实施方案中，本公开的组合物包含诱导或维持在7.5与8.5之间的pH的一种或多种组分。在一些实施方案中，本公开的组合物包含诱导或维持在7.7与8.3之间的pH的一种或多种组分。在一些实施方案中，本公开的组合物包含诱导或维持在7.9与8.1之间的pH的一种或多种组分。在一些实施方案中，本公开的组合物包含诱导或维持pH 8的一种或多种组分。
在本公开的组合物与细胞接触之后，AAV2构建体表达基因或其部分，导致产生所述基因或其部分所编码的产物。在一些实施方案中，所述细胞是靶细胞。在一些实施方案中，靶细胞是视网膜细胞。在一些实施方案中，视网膜细胞是神经元。在一些实施方案中，神经元是光感受器。在一些实施方案中，细胞在体内(in vivo)、体外(in vitro)、离体(exvivo)或原位(in situ)。在一些实施方案中，包括那些其中细胞在体内的实施方案，接触发生在向受试者施用组合物之后。在一些实施方案中，AAV2构建体表达基因或其部分，导致以治疗有效的基因产物表达水平产生所述基因或其部分所编码的产物。在一些实施方案中，基因产物是蛋白质。
批次制剂
本公开的组合物可以每批次在1至1000小瓶之间(终点包括在内)的规模制造。在本公开的组合物的一些实施方案中，组合物、原料药或成品药可以每批次在50至500小瓶之间(终点包括在内)的规模制造。在本公开的组合物的一些实施方案中，组合物、原料药或成品药可以每批次在100至415小瓶之间(终点包括在内)的规模制造。
本公开的示例性批次可包含在0.01mL与5mL之间(终点包括在内)的本公开的组合物、原料药或成品药。在一些实施方案中，本公开的批次可包含在0.01mL与1mL之间(终点包括在内)的本公开的组合物、原料药或成品药。在一些实施方案中，本公开的批次可包含在0.1mL与1mL之间(终点包括在内)的本公开的组合物、原料药或成品药。在一些实施方案中，本公开的批次可包含在0.1mL与5mL之间(终点包括在内)的本公开的组合物、原料药或成品药。在一些实施方案中，本公开的批次可包含在0.25mL与.35mL之间(终点包括在内)的本公开的组合物、原料药或成品药。在一些实施方案中，本公开的批次可包含约0.3mL的本公开的组合物、原料药或成品药。在一些实施方案中，本公开的批次可包含0.3mL的本公开的组合物、原料药或成品药。
表2：AAV2构建体成品药小瓶的示例性批次制剂
| 组分 | 数量 | 参考标准 |
| AAV2构建体 | 1.25x 10^14DRP | 实验室内部，GMP |
| Tris，pH 8.0 | 20mM | EP、BP、USP、JPC |
| MgCl<sub>2</sub>(无水) | 1mM | EP、BP、USP、JPC、FCC |
| NaCl | 200mM | EP、BP、USP、JP |
| 泊洛沙姆188 | 0.001％ | EP、USP |
| 注射用水 | 加足量至125mL | EP、USP |
在本公开的用于制备成品药的方法的一些实施方案中，原料药在+35±2℃下解冻，且视需要以无菌制剂缓冲剂稀释到目标浓度(1.0x 10^12DRP/mL)。
在本公开的组合物的一些实施方案中，AAV2构建体成品药的目标最终DRP滴度是1x 10^12DRP/mL，最小可接受滴度和最大可接受滴度分别是0.8x 10^12DRP/mL和1.5x 10^12DRP/mL。将AAV2构建体成品药无菌过滤且以每小瓶0.3mL的体积填充到具有溴丁基橡皮塞的3mL 2R第I型玻璃小瓶中。然后将小瓶冷冻并储存在≤-60℃下。对于QP放行和分销到试验中心之前的产品标记和储存，将成品药转移到合格临床分销商。将成品药储存在≤-60℃下的温度监测冷冻器中直到QP放行和分销。
组合物的储存
在本公开的组合物的一些实施方案中，包括那些其中组合物包含成品药且组合物是以无菌小瓶供应的实施方案，组合物可储存在低于零度(℃)下。在一些实施方案中，可将组合物解冻和冷冻而不丧失成品药的疗效或无菌包装的完整性。在一些实施方案中，可对组合物进行多轮解冻和冷冻而不丧失成品药的疗效或无菌包装的完整性。
在本公开的组合物的一些实施方案中，包括那些其中组合物包含成品药且组合物是以无菌小瓶供应的实施方案，组合物可储存在室温下。
有机材料
用于制备本公开的缓冲剂和培养基的起始材料被认证为不含动物来源材料。
药典材料：见表3。
表3：
| 组分 | 示例性供应商/目录编号 | 等级 |
| 盐酸(浓缩) | Merck/1370072500 | NF |
| 氯化镁(六水合物) | Merck/1058321000 | USP |
| 氯化钾 | Merck/1049355000 | USP |
| 氯化钠 | Merck/1162245000 | USP |
| 氢氧化钠(颗粒) | Merck/1064821000 | NF |
| Tris碱 | Merck/1083861000 | USP |
| 乙醇(无水) | Merck/1009862500 | USP |
| 注射用水 | EP、USP | |
| 柠檬酸(一水合物) | Merck/137003 | EP、USP |
| H3PO4 | Merck/100563 | EP、USP |
| Na2HPO4.2H2O | Merck/106580 | EP、USP |
| 泊洛沙姆188 | Merck/137065 | EP、USP |
NF＝国家处方集；USP＝美国药典；EP＝欧洲药典
非药典材料：见表4。
表4.
CEP＝欧洲药典适用性证书
动物来源原料
胎牛血清是动物来源。这些原料的来源、制造商和用途概述于表5中。
表5.
过滤器和色谱基质
用于过滤原料药和成品药的过滤器是Sartopore 0.45μm和0.2μm过滤器。过滤器在购买时并非无菌的，而是在合约制造商公司内部通过高压灭菌来灭菌。它们是在3.2巴下通过起泡点测试来测试完整性。
所有色谱材料在使用前都以分析证书放行。购买预装填管柱，且在使用前消毒。
AAV2构建体成品药的制造方法
“原始工艺”(工艺1)
AAV2构建体原料药的示例性制造工艺概览示于图8中。对应所述工艺的流程图提供在图9和图10中。图8、图9和图10描述的制造工艺可在本文中称为“工艺1”。
工艺1的示例性改变提供在下表6中。工艺2的一些实施方案可包括表6中描述的改变。
表6.
工艺1(上游工艺)的优化
工艺1的起始材料自发展细胞库(DCB)的单一小瓶的HEK293细胞起始。所述DCB使用单一小瓶的ATCC HEK293细胞产生。将CS10用于培养HEK293细胞，但将这种培养的规模从12个CS10增加到24个CS10以为后续同时执行的工艺发展产生额外的材料。程序以2x 12个CS10进行直到转导的时间点，此时在相同操作内处理24个CS10。
细胞培养容器和原料：表7强调用于两种不同制造工艺的原料之间的关键差异且提供关于改变的任何重要性的备注。
表7:
细胞培养：用于改善工艺的细胞来源是来自单一小瓶的DCB HEK293细胞。由于这与用于产生原始工艺批次的库不同，因此虽然ATCC细胞的原始来源相同，但培养规模增加(12个CS10增加到24个CS10)且在细胞扩增期间使用不同来源的血清支持细胞生长，所述阶段据此来调适。相较于由原始工艺产生的批次的10次传代，改善工艺的预培养细胞生长包括8次传代。此外，根据原始工艺传代后的细胞密度可变，但根据改善工艺则是固定的。图8示出在两个试验中心之间工艺的细胞培养期的比较。
使用细胞密度测量值评估原始工艺与改善工艺之间的细胞生长。结果指示通过改善工艺产生的细胞生长较快。这可能潜在地归因于不同血清来源和/或基于改善工艺的固定接种密度的细胞传代方案。对于两种工艺，一旦细胞生长稳定化，则显示种群倍增时间为20小时至30小时(图10)。
在工艺2的一些实施方案中，包括那些利用表7中所列的原料(血清除外)的实施方案，细胞培养和/或细胞生长培养基包含下列或由下列组成：无血清培养基。
转导：作为改善工艺的一部分的转导使用与原始工艺相同的方法执行。
细胞收集：根据改善工艺，收集分成2次可代表原始工艺(1x 12个CS10)的12个CS10收集。在收集之后，使用PANDA装置破坏细胞且确定载体的滴度。在改善工艺期间使用的PANDA装置相较于在原始工艺期间使用的细胞破坏器来自不同的制造商(见下表8)，但具有在与原始工艺的细胞破坏器相同的压力(80巴)下执行细胞裂解的能力。
表8：在原始工艺与改善工艺中使用的细胞破坏设备的比较
上游加工后的载体滴度：来自1x 12个CS10的上游工艺载体材料的滴度(6.4x1015DRP/批次)(根据改善工艺)与来自上游工艺的相同规模所产生的载体材料的滴度(1.44x1015DRP/批次)(根据原始工艺)可相比。
工艺1(下游工艺)的优化
自原始工艺转移到改善工艺的下游工艺示于图11中。
实验材料和原料：可能的话，在下游“改善”工艺中选择使用与原始工艺中所使用的设备和原料以及供应商相同的设备和原料以及供应商。
下游性能：个别工艺阶段的观察结果概述在下文中。
表9：细胞破坏/裂解
表10：冷冻/解冻步骤
表11：澄清
表12：浓度和渗滤
表13：碘克沙醇梯度
*在原始工艺期间，可在级分15％、25％和40％中目视观察到杂质条带(多个条带)。然而，所述特性并未在改善工艺期间观察到且只在40％级分中见到一个条带。多余条带可与较高杂质含量联系起来。
肝素渗析、渗滤和过滤步骤：从碘克沙醇梯度步骤到最终产品，产物是透明且无色的。在这些步骤期间并无明确的非预期观察结果。
“改善工艺”(工艺2)
一批产物自由24个康宁10层容器组成的单一生产活动制备，所述容器含有产生AAV2构建体生物产物的质粒DNA转染的HEK293细胞。细胞块和细胞培养基自24个康宁10层容器收集并汇集且随后进行单一纯化工艺。预期自单一活动制备的一批产物产生≥5x 1013个病毒粒子(vp；在本文中也称为载体粒子)的原料药。
AAV2构建体原料药的示例性制造工艺的概览示于图1中。对应所述工艺的流程图提供在图2中。在所述实施例中描述的制造工艺在本文中可称为“工艺2”。
在工艺2的一些实施方案中，自24个康宁10层容器收集并汇集的细胞培养基包含无血清培养基。在工艺2的一些实施方案中，自24个康宁10层容器收集并汇集的细胞培养基由无血清培养基组成。
细胞扩增和康宁细胞叠层(Corning Cell Stack)接种
见图2的对应以下提供的示例性制造工艺的详细描述的示意图。
步骤1：解冻和接种用于产生AAV2构建体原料药的细胞。取决于所使用的细胞类型，可调整以下的温度、持续时间、旋转速度和体积以得到最佳结果。对于以下描述的示例性实施方案，优化使用HEK293细胞的条件。
解冻HEK293细胞并将其接种到1个T75培养瓶中：将一小瓶HEK293 MCB在37±2℃下解冻。将细胞转移到含有9mL冷生长培养基(含5％FBS的DMEM培养基)的15mL试管中。将小瓶用1mL的生长培养基冲洗。将悬浮液在4℃下以300g离心5分钟，丢弃上清液并将细胞悬浮于10mL的预热生长培养基。确定细胞密度并将细胞悬浮液转移到含有10.5mL的生长培养基的T75cm2培养瓶以获得20mL的最终体积。将T75cm2培养瓶转移到在37±1℃、增湿的4-6％CO2气氛下的孵育箱。解冻后24±4小时，将生长培养基替换成20mL的预热生长培养基。
在解冻HEK293细胞并将其接种到1个T75培养瓶的步骤的一些实施方案中，将细胞转移到含有9mL冷生长培养基的15mL试管。在一些实施方案中，生长培养基包含下列或由下列组成：甘氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-胱氨酸二盐酸盐、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐-H2O、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐脱水物、L-缬氨酸、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、i-肌醇、氯化钙(CaCl2)(无水)、硝酸铁(Fe(NO3)3"9H2O)、硫酸镁(MgSO4)(无水)、氯化钾(KCl)、碳酸氢钠(NaHCO3)、氯化钠(NaCl)、磷酸二氢钠(NaH2PO4-H2O)和D-葡萄糖(右旋糖)。在一些实施方案中，生长培养基包含下列或由下列组成：无血清培养基。在一些实施方案中，生长培养基包含下列或由下列组成：澄清的培养基。
步骤2：扩增用于产生AAV2构建体原料药的细胞。取决于所使用的细胞类型，可调整以下的温度、持续时间和体积以得到最佳结果。对于以下描述的示例性实施方案，优化使用HEK293细胞的条件。
扩增1个T75培养瓶至1个T175CB或3个T75培养瓶：丢弃培养基并将细胞用预热的PBS洗涤。将细胞用TrypLE细胞解离试剂松动。使T培养瓶或细胞叠层(Cell Stack)在设定为37±1℃的孵育箱中孵育5至10分钟并通过温和拍打容器使细胞完全脱壁。添加生长培养基以抑制TrypLE。用于不同支撑体的生长培养基、PBS和TrypLE的体积呈现在表14中。然后汇集所有细胞悬浮液。
表14：培养基和溶液的体积
确定细胞计数和细胞存活率并根据表15将细胞接种、孵育并传代。
表15：传代工艺参数
工艺控制(IPC)：细胞计数和细胞存活率
步骤3：扩增1个T175CB至4个T175CB或扩增3个T75培养瓶至4个T175CB：见步骤2。
IPC：细胞计数和细胞存活率。
步骤4：扩增4个T175CB至8个T175CB：见步骤2。
IPC：细胞计数和细胞存活率。
步骤5：扩增6个T175CB至3个CS2CB：见步骤2。
IPC：细胞计数和细胞存活率。
步骤6：扩增2个CS2CB至3个CS10CB：见步骤2。
IPC：细胞计数和细胞存活率。
步骤7：扩增2个CS10CB至8个CS10CB：见步骤2。
IPC：细胞计数和细胞存活率。
步骤8：扩增8个CS10CB至24个CS10CB。见步骤2。
IPC：细胞计数和细胞存活率。
质粒DNA转染
步骤9：转染用于产生AAV2构建体原料药的细胞。取决于所使用的细胞类型，可调整以下的温度、持续时间、旋转速度和体积以得到最佳结果。对于以下描述的示例性实施方案，优化使用HEK293细胞的条件。
使用聚乙烯亚胺(PEI)，将HEK293细胞用三种质粒转染。
依序添加特定比率的三种质粒(pAAV.构建体-Kan、pHELP-Kan和pNLRep-Cap2-Kan)。
表16：转染条件
质粒和PEI用生长培养基制备。
所需的质粒DNA的量呈现在表17中。
表17：质粒DNA的量
将所需量的PEI混合物转移到DNA混合物以形成PEI-DNA复合物，振荡10秒并在室温下孵育。将PEI-DNA复合物转移到8.2L生长培养基中。将生长培养基和PEI-DNA复合物的混合物均质化，将PEI-DNA复合物瓶冲洗并将生长培养基和PEI-DNA复合物的混合物再次均质化。将培养基自CS10CB引流并将2L的生长培养基/PEI-DNA复合物混合物转移到CS10CB。将转染的CS10CB转移到设定在37±1℃、增湿的4-6％CO2气氛下的孵育箱。
将转染混合物保持在细胞上24±1小时，然后将培养基替换成DMEM谷氨酰胺。
IPC：细胞计数和细胞存活率。
步骤10：收集用于产生AAV2构建体原料药的细胞。取决于所使用的细胞类型，可调整以下的温度、持续时间、旋转速度和体积以得到最佳结果。对于以下描述的示例性实施方案，优化使用HEK293细胞的条件。
收集在转染后60±13小时进行。
产物通过下列步骤收集：
·将一半的培养基转移到收集袋。
·振荡CS10CB并收集剩余的培养基和细胞。
·将200mL的HBSS-EDTA转移到CS10CB并在室温下孵育10分钟。
·孵育时间结束时，将缓冲剂引流到收集袋。
对所有容器重复所述收集工艺。
在收集之后，添加MgCl2 1M至最终浓度5mM且添加全能核酸酶至最终浓度90U/mL。
IPC：外来病毒(Adventitious Virus)、生物负载、支原体、物理滴度(Physicaltitre)。
步骤11：微射流裂解。
将PANDA破坏器用最少3L的Tris 20mM、MgCl2 1mM、NaCl 50mM pH 8缓冲剂平衡。将含有用全能核酸酶处理的收集物的袋子连接至裂解组装件。将产物在80±10巴的压力下装载在PANDA系统上并收集在新袋子中。在装载产物后，将系统用2x 200mL的Tris 20mM、MgCl2 1mM、NaCl 50mM pH 8缓冲剂冲洗。汇集两次具有裂解产物的冲洗液。
IPC：物理滴度
步骤12：全能核酸酶孵育：
将微射流细胞在室温下孵育全能核酸酶内切核酸酶活性过夜达18小时的最大持续时间。
步骤13：冷冻/解冻：
最终裂解步骤在-15℃至-25℃下冷冻，随后在室温下解冻过夜以促进细胞碎片聚集以利于澄清步骤。
纯化
步骤14：澄清微射流裂解物。
过滤工艺利用前过滤器(Sartopure GF，0.65μm，0.4m2)，随后利用减少生物负载的过滤器(Sartopore 2，0.2μm，0.2m2)，并利用Tris 20mM、MgCl2 1mM、NaCl 50mM pH 8缓冲剂进行冲洗。
IPC：Picogreen、物理滴度
步骤15：大规模TFF浓缩和渗滤。
所述工艺使用切向流过滤(TFF)的原理达成体积减少和初始纯化。体积减少可大至100倍。盐和表面活性剂溶液(SSS，4.14M NaCl+非离子表面活性剂)以裂解物重量的1/10添加到澄清的裂解物中。纯化通过用20mM Tris pH 8.0、1mM MgCl2、500mM NaCl、0.1％非离子表面活性剂渗滤(100kDa)浓缩物达成以“洗涤”样品的较小分子量杂质。需要这部分以达成高浓度水平但无蛋白质/AAV粒子沉淀。
IPC：物理滴度、总粒子(ELISA)、完整粒子/空粒子比。
步骤16：碘克沙醇纯化。
所述工艺设计成使用四层不连续性碘克沙醇梯度(15％、25％、40％、57％)来纯化rAAV。所述正交纯化步骤大大富集含有DNA的rAAV粒子的制剂，同时去除大部分缺乏DNA的rAAV粒子(空粒子)，这是基于这些粒子在超离心之后在碘克沙醇梯度培养基中的差别浮力密度。含有DNA的rAAV的密度导致rAAV迁移到40％碘克沙醇层，而大部分污染性细胞性蛋白质迁移到25％/40％界面。具有蛋白质和DNA的rAAV的聚集可改变粒子的浮力密度，因此在15％碘克沙醇层中包括1M NaCl最小化这种聚集。
分离通过经受超离心中的高g力处理的碘克沙醇(Optiprep 57％溶液)的不连续性梯度达成。收集40％级分直到达到杂质条带(约3mL)。
将收集的级分汇集并储存在+2/+8℃下直到后续纯化步骤。
步骤17：稀释：
将纯化步骤结束时获得的级分用Tris 10mM，pH 9.0缓冲剂稀释20倍以用于通过阴离子交换色谱纯化GMP批量G214/REP1/FC001。对于通过AVB亲和性进行的纯化，将纯化(密度梯度)步骤结束时汇集的级分用20mM Tris、1mM MgCl2和200mM NaCl，pH 8缓冲剂稀释6倍。
IPC：物理滴度、总粒子(ELISA)、完整粒子/空粒子比、Picogreen
步骤18：阴离子交换色谱。
阴离子交换色谱在室温下执行，以Unosphere Q(UnoQ)介质(Biorad)在14mL/min流速的Tris 10mM、NaCl 200mM pH 9下装填Vantage VL 11x 250管柱(装填体积约9.5mL)。管柱首先用Tris 10mM、NaCl 1M pH 9缓冲剂调理且接着用Tris 10mM，pH 9缓冲剂调理，以获得等于pH 9.0±0.2的pH和等于Tris 10mM，pH 9.0导电率±10％的导电率。
稀释的产物通过Sartoscale 0.2μm 17cm2过滤器过滤。
将其装载在管柱上且用平衡缓冲剂冲洗管柱。在用Tris 10mM、NaCl 45mM pH 9缓冲剂第二次洗涤之后，将产物用最少30倍管柱体积的Tris 10mM、NaCl 650mM pH 9缓冲剂洗脱。
将洗脱的产物储存在+2/+8℃下直到下一步骤。
IPC：Picogreen、物理滴度
步骤18：AVB Sepharose亲和性色谱。
亲和性色谱在室温下执行，以AVB Sepharose HP(GE Healthcare)装填Vantage-LVL22x250管柱(8±1cm床高)，在Tris 20mM、MgCl2 1mM、NaCl 200mM pH 8缓冲剂中装填并冲洗，然后用H3PO4 0.17M、NaCl 1M消毒30分钟。在消毒之后，管柱以Tris 20mM、MgCl2 1mM、NaCl 200mM pH 8缓冲剂平衡，接着装载用Tris 20mM、MgCl21mM、NaCl 200mM pH 8稀释的产物(来自步骤16的汇集级分)。在管柱装载之前，稀释的产物通过Sartoscale 0.2μm17cm2过滤器过滤。一旦完成装载，则用大约35倍管柱体积的Tris 20mM、MgCl2 1mM、NaCl200mM pH 8缓冲剂洗涤管柱，然后用大约20倍管柱体积的Na2HPO4 10.8mM、柠檬酸44.6mM、NaCl 400mM pH 2.6缓冲剂洗脱。在洗脱之后，立即用大约4倍管柱体积的Tris 1M pH8缓冲剂中和洗脱液。
将洗脱产物储存在+2/+8℃下直到下一步骤。
IPC：Picogreen、物理滴度。
步骤19：渗析和最终制剂。
所述工艺利用渗析将AAV产物配制到所需最终制剂缓冲剂(20mM Tris，pH 8、1mMMgCl2、200mM NaCl，任选地含有0.001％的泊洛沙姆)中。
洗脱产物的切向流过滤使用具有100kDa分子量截留的中空纤维滤筒(Spectrum)进行。滤筒和系统以Tris 20mM、MgCl2 1mM、NaCl 200mM pH 8缓冲剂平衡以在渗透侧获得pH 8.0±0.2。
将产物浓缩至最小体积，之后以连续模式对最小6倍体积的制剂缓冲剂进行渗滤。收集滞留物。用制剂缓冲剂冲洗系统。将这种冲洗液收集在不同容器中。
IPC：物理滴度。
步骤20：亚微米过滤纯化的本体原料药。
如果需要较长期储存(＞60天)，则使用0.2μm过滤器亚微米过滤产物。一旦原料药被完全过滤，则用最终制剂缓冲剂冲洗过滤器。
在QC取样之后，将纯化的本体原料药储存在＜-60℃下。
自原料药制造成品药的方法
本公开提供数种自原料药(作为起始材料)制造成品药的示例性工艺/方法。这些示例性方法中的两种是工艺1(原始工艺)和工艺2(改善工艺)。如本文所述，工艺2包括对工艺1的改变和/或改善。
在工艺1和工艺2两者中，将原料药解冻、稀释、无菌过滤并填充到初级包装容器中。然而，改善工艺(工艺2)引入下列对原始程序的改变(工艺控制保持不变)：
·解冻温度从室温改变到+35±2℃
·初级包装从0.5mL聚丙烯冷冻小瓶改变成3mL第I型玻璃小瓶和溴丁基橡皮塞
·每单一小瓶填充大小从0.1mL/小瓶改变到0.3mL/小瓶
本公开的组合物可以液体供应。在本公开的组合物的一些实施方案中，包括那些其中组合物包含成品药的实施方案，成品药以无菌玻璃小瓶供应。在一些实施方案中，无菌玻璃小瓶是无菌透明玻璃小瓶。在一些实施方案中，无菌玻璃小瓶用塞子加盖。在一些实施方案中，塞子是塑料的。在一些实施方案中，将无菌玻璃小瓶加盖且进一步以封缄封瓶。
制造工艺的优化
在回顾原始制造工艺(工艺1)之后，鉴别出改善未来临床和商业产品的质量和/或使工艺更强健的机会且实施为工艺2。所采取的工艺发展活动分属两个类别：(1)工艺改变；(2)工艺优化。工艺发展策略和原理的概述提供在表18中且每个类别在下文更详细地讨论。
表18：对工艺1的改变的概述
MCB＝主细胞库
简言之，为了产生工艺2，对产生MCB的细胞来源、三种质粒的抗生素选择基因、上游加工步骤的规模、转导试剂、亲和性色谱步骤和最终产品容器和密封做出改变。
HEK293主细胞库
工艺1：用于产生第一临床批次的MCB自经AAV2产生优化的细胞产生。这种细胞系在细胞如何优化和暴露于动物来源材料两方面的历史的可追溯性有限。
对工艺1的改变：将寄存于ATCC(用于产生工艺1之前体细胞库)的HEK293细胞的原始小瓶用于起始新的GMP MCB的制造。将这种MCB(现已表征并测试)用于支持临床AAV载体制造且可用于商业制造。细胞传代数、所使用的材料、所遵循的方法和所执行的细胞库表征研究的全方位可追溯性提供增加的对产品质量、可追溯性和安全性的再保证。工作细胞库后续在优良制造规范(GMP)的条件下自单一小瓶GMP MCB产生以形成GMP WCB。这种WCB(现已表征并测试)可用于商业制造。细胞传代数、所使用的材料、所遵循的方法和所执行的细胞库表征研究的全方位可追溯性提供增加的对产品质量、可追溯性和安全性的再保证。
遵照限定的协议评估ATCC来源HEK293细胞的可相比性，由此通过基因组滴度评估直接与原始Stratagene细胞比较载体产生。载体滴度以一式三份评估且同时评估来自可相比传代极限的细胞，包括低传代和高传代两者。还评估了细胞的生长动力学和存活率。此外，细胞用绿色荧光蛋白(GFP)表达载体处理以评估转导效率。
还遵照与原始临床批次相同的批次制造协议评估ATCC来源细胞作为完整规模非GMP工程改造运行与质粒改变(见下文)的组合的一部分。测试所述批次的工艺控制测试、本体收集、原料药和成品药测试的全部项目(对于生物负载、内毒素、无菌性和外来剂(adventitious agents)的那些测试除外)且与先前获自临床批次(原始工艺)的相同测试结果比较。
一旦建立了ATCC HEK293细胞的适用性之后，制备GMP MCB且全面测试外来剂、同一性、纯度和安全性。GMP MCB经QA放行用于后续GMP制造。
载体质粒
工艺1：三种用于产生AAV2构建体载体的质粒构建体含有编码氨苄西林抵抗的基因，其用于在质粒产生期间选择。虽然氨苄西林(β-内酰胺抗生素)并未用于AAV2构建体载体的制造工艺，但去除AmpR是优选的，避免了来自质粒产生工艺的残余氨苄西林到AAV2构建体产生工艺的任何遗留的潜力并且还去除了编码氨苄西林抵抗的基因存在于最终包装产品中的潜力。
对工艺1的改变：将每个质粒修饰以将氨苄西林抵抗基因替换成编码卡那霉素抵抗的基因。其余质粒骨架并未改变。在质粒制造期间，用于质粒选择的氨苄西林可能遗留到AAV2构建体产生工艺且对具有β-内酰胺抗生素敏感性的患者构成潜在风险。此外，存在来自质粒材料的氨苄西林抵抗基因最后可能被包装到最终载体产品中且理论上赋予或转移抗生素抵抗给接受者。虽然认为任一风险的可能性低，但应理解可能的话应避免使用β-内酰胺。因此，产品的安全性特性通过将AmpR替换成KanR来改善。
将新的质粒完整定序且这种定序提供只有抵抗基因改变的确认。
评价使用新质粒产生AAV2构建体的可相比性研究遵照限定的协议进行。同时使用AmpR(旧)和KanR(新)质粒两者转染HEK293细胞且通过评估基因组滴度来比较载体产生。执行一式三份测试并报告载体滴度的比较。
在展示可接受的滴度之后，还遵照与原始临床批次相同的批次制造协议评估修饰的质粒作为完整规模非GMP产生运行与细胞改变(详见上文)的组合的一部分。测试所述批次的本体收集、原料药和成品药测试的全部项目(对于生物负载、内毒素、无菌性和外来剂的那些测试除外)且与获自临床批次(原始工艺)的相同测试结果比较。一旦产生来自这种技术运行的数据且认为所述数据可接受之后，则实施适用于GMP产品制造的质粒的制造。
肝素色谱
工艺1：亲和性色谱管柱用于选择性纯化AAV2构建体。管柱内使用的动物源性基质(例如肝素)可供应为适用于制造人治疗性产品的GMP材料。虽然动物源性基质的来源、制造和供应从GMP和人用角度来看都获得认证，但使用任何动物源性原料仍存在病毒安全性风险。
对工艺1的改变：替代地，探讨非动物源性色谱基质作为当前填充动物源性基质(例如肝素)的亲和性管柱的替换。起初根据改善工艺在第一GMP批次使用离子交换色谱树脂替换动物源性基质和后续引入非动物源性亲和性色谱树脂。实施这种改变以达成减少与动物源性原料相关的生物安全性风险。
评估不同的色谱基质且适用性基于最终产品的纯度/杂质特性、滴度和效力。
最终产品容器和容器密封
原始工艺：成品药以每小瓶0.1mL的体积填充到0.5mL无菌聚丙烯旋盖垫片式小瓶。
对工艺1的改变：将0.3mL成品药填充到第1型硼硅酸玻璃注射小瓶中，用溴丁基塞子和卷缩(防揭换)小瓶封缄密封。实施这种改变以达成改善的最终成品药的完整性、改善使用期间的包护(containment)、改善初级容器产品接触材料的药物可接受性、易于目视检查和安全性(通过防揭换封缄提供安全性)。
评估成品药在玻璃小瓶中的相容性通过产品收率和产品稳定性执行。
上游工艺步骤的规模扩大
工艺1：将单一小瓶的HEK293 MCB通过连续传代扩增和规模扩大到12个十层细胞叠层。
对工艺1的改变：将单一小瓶的HEK293 MCB通过连续传代扩增和规模扩大到24个十层细胞叠层。实施这种改变以达成增加上游工艺的规模，以允许额外材料以供工艺测试和控制以及增加的原料药体积以供测试和灌装(fill finish)。另外，实施这种改变以达成增加的成品药可用性。
评估细胞存活率、生长速率和细胞产率的分析以确定最佳且一致的性能。
工艺优化
原始制造工艺的许多工艺步骤在物理和化学定义方面保持不变；然而，进行进一步评价以改善工艺理解和表征且确保在工艺一致性和强健性方面的最佳工艺性能。
HEK293细胞培养和扩增
工艺1：将单一小瓶的HEK293 MCB通过连续传代扩增和规模扩大到12个十层细胞工厂。
工艺优化：在细胞培养规模从12个CS10改变至24个CS10的同时，执行研究以优化接种密度且评估生长动力学以得到最佳细胞培养性能。优化操作(非工艺)改变以改善工艺步骤的控制和再现性，以确保工艺一致性和强健性。具体地，优化工艺的所述方面以从12个CS10增加到24个CS10以改善产率。
执行细胞存活率、生长速率和细胞产率的分析以确定最佳和一致的性能。
质粒三重转染和收集
工艺1：三种质粒转染HEK293细胞在氯喹预处理细胞之后通过磷酸钙DNA沉淀执行。
工艺优化：优化转染(包括细胞接种条件)，比较磷酸钙和聚乙烯亚胺。优化质粒浓度/比率。确定培养基交换和收集的最佳转染后天数。优化操作(非工艺)改变以改善工艺步骤的控制和再现性，以确保工艺一致性和强健性。自工艺去除氯喹以改善安全性。
以小规模执行进一步的优化，包括细胞接种密度、用于细胞生长的培养基、FBS浓度和DNA:PEI比。一旦建立了优化转染工艺，则以完整规模使用PEI执行工艺且与使用磷酸钙的相同工艺比较以展示可相比性。
微射流细胞破坏
工艺1：所述工艺使用微射流机来机械裂解细胞以释放细胞内病毒。
工艺优化：未对所述工艺步骤执行改变。发展研究着重于使用适合GMP制造和包护的卫生微射流机来优化且限定操作条件。实施操作(非工艺)改变以改善工艺步骤的控制和再现性且改善工艺理解和表征，以确保工艺一致性和强健性。确定产物纯度和载体滴度的工艺控制测试的一致性。
密度梯度超离心
工艺1：密度梯度纯化以减少工艺杂质。
工艺优化：由于当前梯度纯化方法是手动的，因此有可能会造成工艺变异性。在纯化方法原理保持不变的情况下，评估使所述工艺步骤更为强健且半自动化的机会。实施操作(非工艺)改变以改善工艺步骤的控制和再现性且改善工艺理解和表征，以确保工艺一致性和强健性。确定产物纯度和载体滴度的测试的一致性。
超滤(UF)/渗滤(DF)
工艺1：缓冲剂通过UF/DF和渗析交换。
工艺优化：优化涉及通过UF/DF和渗析交换缓冲剂的每个工艺步骤以建立关键工艺参数，同时为了产品质量确保接触材料的可接受性。实施这种改变以确保工艺一致性和强健性、改善工艺理解和表征并确保产品接触材料的适用性。评估病毒产率和杂质特性。
切换编码抗生素抵抗的质粒
表达治疗性构建体的AAV2构建体临床载体经由暂时转导平台利用三种质粒产生；含有治疗性构建体/转基因和启动子和反向末端重复序列的载体质粒、含有AAV2-Rep和Cap序列的AAV辅助质粒以及最后为编码必需腺病毒基因E2A、E4和VA的辅助质粒。所有根据原始工艺产生的三种用于产生AAV2构建体临床载体的质粒含有氨苄西林(Amp)可选标志。为了避免患者对残余氨苄西林的敏感性和理论转移AmpR基因到最终载体的顾虑，将质粒再工程改造以将Amp可选标志序列交换成卡那霉素(Kan)抵抗序列。执行完整定序以证实所有三种质粒的其余质粒骨架保持相同。在小规模体外研究中评价这些质粒产生rAAV的产率性能，以建立它们用于cGMP产生的适用性。所述质粒的实验分析经由与由先前用于产生AAV2构建体临床载体的质粒组成的对照进行产率的头对头比较且描述于下文。一旦在小规模体外研究中确定了质粒适用性，则在完整规模、非GMP工艺中评估KanR质粒。
主细胞库细胞系的改变
从原始工艺产生的AAV2构建体临床载体利用HEK293细胞系(原始工艺1)，所述HEK293细胞由GMP设施衍生、测试且库存自商购自Stratagene的HEK293细胞系。全面测试并表征所述细胞库，但没有细胞库的完整记载历史。为了确保HEK293细胞的全方位可追溯性，新细胞源自ATCC，评价其与原始工艺1细胞的可相比性且用于GMP MCB产生。以头对头比较方式筛选三个细胞系(两个HEK293细胞系和一个293T细胞系)的下列参数以确定用于产生AAV2构建体载体的最佳细胞系：1)经由使用基于AAV的eGFP质粒的GFP平均荧光强度和GFP百分比的一般转导效率；2)经由DRP(DNA酶抵抗粒子)分析评估AAV2构建体的产率的AAV2构建体产物的特定转导效率；3)通过细胞计数和存活细胞百分比的生长动力学；和4)持续传代且再测试产率和转导效率以与较晚传代的细胞比较转导效率。
改善AAV2纯化色谱的强健性
将原始第1/2期制造工艺中的动物源性(例如肝素)亲和性管柱步骤替换成非动物源性离子交换(AEX)管柱UnoQ，以改善潜在安全性顾虑(来自动物源性基质的外来污染的潜力)。图2显示工艺的流程图，强调关键工艺步骤和最终管柱色谱步骤(步骤18)。在最终UnoQ纯化步骤之前，低盐稀释步骤降低导电率且支持AAV2构建体与管柱的有效结合。所述阶段的成功性能的可接受的盐浓度(导电率)范围展示为非常窄。如果导电率过高，则产物无法与AEX管柱结合且丧失在溢流道中。如果导电率过低，则产物可能发生聚集导致产物在纯化期间丧失。这影响产物产率和浓度且因此影响批次成功(低产率批次在支持临床研究所需的材料方面将是不可行的)。然而UnoQ步骤对产物疗效或安全性没有任何负面影响，正如使用所述改善工艺成功产生非临床AAV2构建体批次和GMP批次所展示。
为了提出在AEX之前需要的窄盐范围，评估替代性非动物源性亲和性色谱管柱(来自GE Healthcare的AVB Sepharose)。在为了确保维持如下所述的产物可相比性的全面发展期之后，将亲和性管柱(具有动物源性基质)替换成AVB以制造后续的GMP批次。
AVB Sepharose是对腺相关病毒具有亲和性的亲和性培养基，其用于AAV2纯化，能够实现高纯度和产率产生。亲和性配体是来自在酵母菌中表达的单链抗体的14kDa片段。AVB管柱允许AAV2构建体的良好结合和洗脱且可在较高盐(导电率)下执行。因此，AVB管柱代表最少化产物丧失的强健工艺步骤。AVB是非动物源性的，因此其使用不构成对安全性的外来污染物风险。
本公开的原料药的控制
示例性原料药通过表19中所列的测试表征。
表19：
n/a：不适用
分析程序
物理滴度：基因组滴度使用qPCR确定。这种方法允许定量基因组拷贝数。用缓冲剂稀释载体原液样品。对样品进行DNA酶处理且病毒衣壳用蛋白酶K裂解以释放基因组DNA。接着制作稀释系列。使用对CAG序列具有特异性的基于Taqman的引物/探针组，对每个样品的复制品进行qPCR。取标准质粒稀释系列的线性范围中的每个点的平均值且将每个点的对数拷贝数对平均CT值作图以产生标准曲线。rAAV载体的滴度可自标准曲线计算且表达为DNA酶抵抗粒子(DRP)/mL。
感染单位(IU)滴度：这种测定定量AAV感染粒子的数量。定量通过用载体样品的连续稀释和提供辅助功能的统一浓度的野生型腺病毒感染RC32细胞(表达AAV2 Rep/Cap的HeLa)执行。在感染后数天，将细胞裂解稀释以减少PCR抑制剂且以与上述物理滴度测定相同的方式通过qPCR测定，不同的是省略DNA酶和蛋白酶K消化且仅执行qPCR部分。个别孔被评分为AAV扩增阳性或阴性。评分的孔用于使用Karber方法确定TCID50，单位为IU/mL。
总粒子：测定使用ELISA技术(AAV2滴定ELISA试剂盒)。将对组装的AAV2衣壳上的构象表位具有特异性的单克隆抗体涂覆到微量滴定条上且用于捕获来自样本的AAV2粒子。捕获的AAV粒子以两个步骤检测。首先抗AAV2的生物素缀合的单克隆抗体与免疫复合物结合。在第二步骤中，链霉亲和素过氧化酶缀合物与生物素分子反应。添加底物溶液导致呈色反应，其与特异性结合的病毒粒子的量成正比。吸光度在450nm下以光度测定方式测量。
完整:空比(透射电子显微镜)：AAV2粒子的完整:空比可使用负染色透射电子显微镜(TEM)确定。将样品施加到固定的网格。使用透射电子显微镜观测样品且基于完整(即含有DNA)和空AAV2衣壳粒子的形态学执行计数。完整粒子:空粒子比自粒子计数计算。
完整:空比(分析型超离心)：AAV2粒子的完整:空比可使用分析型超离心(AUC)确定。AUC优于其他方法的优点在于非破坏性，意味着样品在AUC之后可回收用于额外的测试。将包含空和完整AAV2粒子的样品施加到液体组合物，在超离心期间AAV2移动经过所述液体组合物。测量一个或多个AAV2粒子的沉降速度提供关于AAV粒子的大小和形状的流体动力学信息。沉降平衡的测量提供关于AAV2粒子的溶液摩尔质量、化学计量、缔合常数和溶液非理想性的热力学信息。在AUC期间获得的示例性测量值是径向浓度分布或“扫描”。在一些实施方案中，扫描以数分钟(速度沉降)至数小时(平衡沉降)范围的间隔获得。本公开的方法的扫描可含有光学测量值(例如吸光度、干涉和/或荧光)。超离心速度可在10,000转/分钟(rpm)与75,000rpm之间(终点包括在内)的范围内。由于完整AAV2粒子和空AAV2粒子展示不同的AUC测量值，因此样品的完整/空比可使用这种方法确定。
载体同一性(DNA)：这种测定提供病毒DNA序列的确认。测定通过消化病毒衣壳和纯化病毒DNA执行。可能的话，DNA以正向和反向两者最小2倍覆盖定序(一些区域，例如ITR难以定序)。DNA定序片段重叠群与预期序列比较以证实同一性。
总蛋白质：这种测定通过使用Micro-BCA试剂盒定量存在于测试物品中的蛋白质的总量。为了清除制剂缓冲剂的基质效应，将样品用丙酮沉淀且沉淀的蛋白质在分析之前用相等体积的水再悬浮。蛋白质浓度确定通过混合测试物品或稀释的测试物品与试剂盒中提供的Micro-BCA试剂执行。同样使用牛血清白蛋白(BSA)标准的稀释液执行。将混合物在60℃下孵育且在562nm下测量吸光度。标准曲线使用线性回归拟合自标准吸光度和已知浓度产生。未知样品根据线性回归定量。
纯度：这种测定提供AAV纯度的半定量确定。基于AAV2衣壳粒子ELISA的结果，样品通过SpeedVac浓缩并将4x 10^10或1x 10^11个粒子装载到SDS-PAGE凝胶并分离衣壳蛋白。SYPRO Orange染色凝胶的密度测定法分析允许计算相对于衣壳蛋白(Vp1、Vp2和Vp3)的大约杂质水平。
可复制型AAV：在野生型腺病毒的存在或不存在下，使用测试物品转导HEK293细胞。将进行三轮连续细胞扩增且在每个扩增步骤提取总基因组DNA。
rcAAV2通过即时定量PCR检测。两个序列是分离的基因组DNA；一个序列对AAV2Rep基因具有特异性，并且一个序列对HEK293细胞的内源性基因(人白蛋白)具有特异性。确定每个细胞的Rep基因的相对拷贝数。阳性对照是单独测试或在rAAV载体制剂存在下的野生型AAV病毒血清型2。
测定的检测极限对每个测试批次挑战。检测极限是测试样品的每1x 10^8或1x 10^10基因组拷贝数10个rcAAV。如果测试样品是Rep序列阴性的，则这种样品的结果将报告为：无复制，测试样品的每1x 10^8(或1x 10^10)基因组拷贝数＜10个rcAAV。如果测试样品是Rep序列阳性的，则这种样品的结果将报告为：复制。
HEK293宿主细胞蛋白：HEK293宿主细胞蛋白(HCP)测定是免疫酶测定。纯化的病毒样品在涂覆有亲和性纯化的捕获抗体的微量滴定条中反应。二次辣根过氧化酶(HRP)缀合酶同时反应，导致形成固相抗体-HCP-酶标记抗体的夹心复合物。洗涤微量滴定条以去除任何未结合的反应物。HEK293 HCP的数量通过添加3,3’,5,5’四甲基联苯胺过氧化酶(HRP底物)到每个孔检测。在读板仪上读取水解的底物的量，并且其与存在的HEK293 HCP的浓度成正比。
总DNA：Picogreen试剂是结合双链DNA且形成高度发光复合物的超敏感荧光核酸染色(λ激发＝480nm-λ发射＝520nm)。这种荧光发射强度与溶液中的dsDNA数量成正比。使用具有已知浓度的DNA标准曲线，测试样品中的DNA含量通过转换测量的荧光获得。
HEK293宿主细胞DNA：原始工艺测量3种不同扩增子的大小和数量，然而改善工艺测量包括高分子量和剪切DNA的总hcDNA。改善工艺的资格数据展示测定具有特异性且足够敏感地符合评估每剂量hcDNA＜10ng/剂量的要求(WHO生物制剂标准化专家委员会，2013)。
残余BSA：残余BSA使用市售ELISA试剂盒(Bethyl所制造和销售)定量。所述ELISA试剂盒的科学原理非常类似于宿主细胞蛋白ELISA所指明的科学原理。
残余全能核酸酶：这种测定使用对全能核酸酶内切核酸酶具有特异性的纯化的多克隆抗体，通过夹心式ELISA检测测试样品中的残余全能核酸酶。通过比较样品信号与在同一时间测定的全能核酸酶内切核酸酶标准达成准确测量。
生物负载测定：这种程序用于定量确定(如果可检测的话)样品中存在的生物负载的量。使用的方法涉及用两个膜各自膜过滤一半的样品。将膜放置到分开的琼脂培养基板上，将板依序在需氧和厌氧条件下在20-25℃和30-35℃下孵育。在孵育结束时，需氧菌、厌氧菌和真菌计数表达为CFU/mL样品。
内毒素测定：这种测定用于确定细菌内毒素是否存在于测试物品中。定量程序通过动力学-显色方法执行。已知量的内毒素与测试物品平行测试，以准确确定细菌内毒素的水平。测试物品的干涉潜力通过以指明水平的内毒素加药测试物品加上LAL试剂检查。在抑制/增强测试之后，确定测试物品的内毒素含量。
残余AVB：残余AVB分析使用商用ELISA试剂盒CaptureSelectTMAVB Sepharose HPLigand Leakage ELISA(Life Technologies制造)执行。夹心式ELISA原理涉及用抗亲和性配体多克隆山羊抗体涂覆微量滴定板以捕获样品中存在的AVB。检测经由生物素化亲和性纯化的抗AVB配体多克隆山羊抗体和链霉亲和素辣根过氧化酶缀合物进行。样品中的残余AVB的浓度通过相对于标准曲线测量确定。
AAV组合物的稳定性
本公开的组合物当储存在＜-60℃下时维持长期稳定性。例如，当储存在-80℃与40℃(大约人体温度)之间(终点包括在内)的温度下时，本公开的组合物维持长期稳定性。例如，当储存在-80℃与5℃之间(终点包括在内)的温度下时，本公开的组合物维持长期稳定性。例如，当储存在-80℃、-20℃或5℃下时，本公开的组合物维持长期稳定性。在一些实施方案中，本公开的组合物配制为液体或悬浮液，等分到一个或多个容器(例如小瓶)且储存在＜-60℃下。在一些实施方案中，本公开的组合物配制为液体或悬浮液，等分到一个或多个容器(例如小瓶)且储存在-80℃、-20℃或5℃下。
当储存在＜-60℃下时，本公开的组合物可以最佳的表面积对体积比提供在容器中以维持长期稳定性。当储存在-80℃、-20℃或5℃下时，本公开的组合物可以最佳的表面积对体积比率提供在容器中以维持长期稳定性。在一些实施方案中，本公开的组合物配制为液体或悬浮液，等分到一个或多个容器(例如小瓶)且当考虑所有储存要求时以尽可能大的表面积对体积比储存在一个或多个容器中。
当储存在环境相对湿度下时，本公开的组合物维持长期稳定性。
临床剂量设计
无脉络膜症(CHM)是一种最初在19世纪描述的遗传性X连锁视网膜营养不良。编码REP1的CHM基因的缺失或突变导致脉络膜、RPE和视网膜的退化。无脉络膜症的特征在发病男性中为进行性脉络膜视网膜退化，而在女性携带者的征象则较轻。发病男性的症状可从夜盲演变成外周视野丧失，中央视力保留直到生命晚期。虽然女性携带者通常无症状，但可用仔细眼底检查观察到脉络膜视网膜退化的征象。这些征象在十岁之后变得更易于明显可见。
CHM由CHM基因(Xq21)的突变造成，所述基因编码Rab香叶基-香叶基转移酶的组分A(称为REP1)。REP1是细胞内运输所必需的，并且因此是正常视网膜功能所必需的。当REP1缺乏时(正如CHM患者的情形)，视网膜色素上皮、光感受器和脉络膜逐渐丧失功能和萎缩，最终导致眼盲。在发展本公开的药物组合物之前，CHM无治疗可用。
使用腺相关病毒(AAV)载体的视网膜基因疗法给药涉及计算可能给予终生效应的单次剂量。在传统的全身性药物给药中，药物的半衰期在血液中测量并且这决定了一天当中重复剂量施用的频率，使得峰值水平无毒性且谷底水平足以维持药效学活性。在传统给药方案中，使用健康志愿者以得出药物清除率且因此计算药物半衰期是有可能的，并且由此估计必需血浆水平以计算施用的剂量和频率。可作出调整，例如在肝衰竭的情况下，可减少通过肝脏代谢的药物的给药。在儿科病例中，给药可根据体重调整以适合较小的血液体积和目标器官。这些主动滴定剂量的传统方法对于眼科基因疗法施用带来挑战，因为在本公开的药物组合物的治疗方法和用途的优选实施方案中，治疗的目标是仅给与一个将达成终生治疗效应的剂量。
在本公开的方法的一些实施方案中，药物组合物经由视网膜下注射向眼施用以靶向RPE和光感受器细胞层。作为视网膜下注射手术程序的一部分，玻璃体切除术在视网膜下注射之前对待治疗的眼执行。这种玻璃体切除术之后为视网膜下输注平衡盐溶液以形成半球状泡。在本公开的一些实施方案中，半球状泡的面积是大约10mm2或半球状泡的面积是10mm2。在本公开的一些实施方案中，本公开的药物组合物配制为最终体积0.1mL且注射到预形成的泡，允许药物组合物自行均匀分布在视网膜表面(例如10mm2的视网膜表面)。因此，在那些其中形成半球状泡以供注射药物组合物的实施方案中，所述泡促进组合物的完整rAAV均匀分布在视网膜的RPE细胞层。在注射药物组合物之后，所述泡在手术后数小时内消失。
玻璃体切除术/视网膜下手术的潜在并发症是手术后立即降低视敏度(VA)。另一潜在且较长期的并发症是形成白内障。这两个因素都影响执行VA测试时的视力，并且因此当确定剂量范围的结果时，特别是当VA是有效剂量确定的单独预测因子时，考虑这些因素。
选择基因疗法试验中的适当剂量与传统评估剂量范围的方式不同。目标是施用已知为安全的可能的最高有效剂量。这么做的主要原因是事实上视网膜光感受器的感染复数(MOI)非常高，大约是105个基因组粒子(gp)/视网膜细胞。鉴于此，在一些实施方案中，并且取决于待治疗的个别受试者的生物学，可治疗的视网膜的最大面积是大约10mm2，且可治疗的视网膜区域在黄斑周围，所述区域中的杆状细胞、锥状细胞和视网膜色素上皮(RPE)细胞的总数相当于大约1x 106个细胞，研究(描述于实施例13)中的低剂量组群(1010gp)仅提供1x 104gp的MOI，而相同研究中高剂量组(1011gp)提供1x105gp的MOI。
实施例13中提供第I/II期数据。本研究的高剂量(1011gp)已显示是安全且有效的。在某些实施方案中，类固醇疗法方案可用于处理受试者对药物组合物的AAV的任何免疫反应。如实施例13中所述，一剂1011gp的本公开的药物组合物导致在105gp的优选范围的MOI。
评估无脉络膜症的治疗剂量
待测量的一个参数是视力功能的改善。这假设视力功能参数受到遗传缺陷的不良影响且可能因此可逆到某种程度，因此在成功基因转移之后可测量改善。在治疗CHM的方法的一些实施方案中，测量的视力功能参数，所述视力功能参数包括但不限于视敏度(VA)、视网膜敏感度和黑暗适应视力测量值。然而，对于一些受试者，取决于缺陷的严重性和退化阶段，上述视力功能参数中的一些可认为是正常的。在本公开的治疗方法的一些实施方案中，受试者的视力功能参数在治疗之后改善且这种改善导致视力功能参数测量值等于那些获自未接受治疗的健康受试者(未罹患CHM)的测量值。在一些实施方案中，健康受试者是例如年龄匹配的个体，以考虑与CHM无关的天然年龄相关视力恶化。此外，由于男性和女性的色视觉敏度可有所不同，因此在一些实施方案中，健康受试者是具有相同XY染色体组成的个体。在本公开的治疗方法的一些实施方案中，包括那些其中受试者已经历显著视网膜伤害(神经元丧失)或其中视网膜的未受影响区域小和/或不连续的实施方案，可能无法预期完全视力功能恢复。在那些其中仅部分恢复是可能的实施方案中，视力功能的改善当与受试者的基线功能(在施用药物组合物之前对所述受试者和治疗眼评估的功能)比较时，所述改善可为明显。即使在其中仅部分恢复是可能的实施方案中，治疗提高眼的基线功能和受试者的视力功能，使得CHM和/或年龄相关视网膜退化延缓或减少，由此延长受试者可用视力的生命期。
目标区中视网膜细胞的解剖学密度
为了计算体内临床治疗的MOI，确定载体粒子总数和待治疗区域中的靶细胞数量。这些数量取决于暴露到载体的视网膜面积和所述区域中不同细胞类型中的每一种的密度。
本公开的药物组合物在诱导的视网膜剥离之后经由视网膜下注射向CHM患者施用。例如，如果假设视网膜剥离具有大约2至3个盘直径的线性尺寸，则所述视网膜剥离区域相当于直径3-4mm的圆或大约10mm2的面积。
本公开提供示例性细胞性密度以用于示例性剂量计算，然而，本公开的药物组合物的剂量不受限于这些示例性计算。在中央黄斑中，正常人受试者的RPE细胞密度是5,000个细胞/mm2(基于40至50岁年龄组患者的死后研究)。在中央黄斑中，正常人受试者的杆状细胞密度是75,000个细胞/mm2，但排除大约0.5mm2的中央凹区。在中央黄斑中，正常人受试者的锥状细胞密度是在中央0.5mm2凹中150,000个/mm2(总共75,000个)+凹区以外的黄斑中25,000个/mm2。因此，在本公开的基于这些示例性细胞密度的一些实施方案中，在标准10mm2剥离中暴露到本公开的药物组合物的rAAV的三种细胞类型中的每一种的总数可自上述计算如下：(a)RPE：5,000个细胞/mm2，在10mm2中总共＝5x 104个；(b)杆状细胞：75,000个细胞/mm2，但排除中央0.5mm2凹，在10mm2中总共＝7.1x 105个；和(c)锥状细胞：在中央0.5mm2凹中150,000个细胞/mm2(75,000个)，但凹外仅25,000个/mm2，在10mm2中总共＝3.1x 105个。RPE、杆状细胞和锥状细胞密度在黄斑的中央10mm2中不同且有约一个对数单位的差异，其中见到最低密度(且因此最高MOI)与RPE相关。
缩写表
AAV 腺相关病毒
AmpR 氨苄西林抵抗
ATCC 美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)
AVG 平均
BCA 二喹啉甲酸
BGH-polyA 牛生长激素聚腺苷酸化序列
bp 碱基对
BSA 牛血清白蛋白
BSE 牛海绵状脑病
BSS 平衡盐溶液
℃ 摄氏度
CBA 巨细胞病毒增强子/鸡β肌动蛋白
CEP 欧洲药典适用性证书
c.f. Conferre(比较)
CFU 集落形成单位
CI 置信区间
cm 厘米
CT 循环阈值
CV 变异系数
cGMP 当前优良制造规范
CHM 无脉络膜症
CMV 巨细胞病毒
CNS 中枢神经系统
DCB 发展细胞库
DF 渗滤
DLS 动态光散射
DMEM Dulbecco氏改良Eagle氏培养基
DNA 脱氧核糖核酸
DP 成品药
DRP DNA酶抵抗粒子测定
dsDNA 双链DNA
EDTA 乙二胺四乙酸
EF 伸长因子
EFS 伸长因子1α短
ERA 有效过滤面积
EGFP 增强绿色荧光蛋白
ELISA 酶联免疫吸附测定
EP 欧洲药典
et al. et alii(和他人)
EtBr 溴化乙锭
FACS 荧光激活细胞分选
FBS 胎牛血清
FC 最终容器
FTM 流体巯基乙酸盐培养基
g x重力
GAD 谷氨酸脱羧酶
GGPP 香叶基香叶基焦磷酸酯
GF 凝胶过滤
GFP 绿色荧光蛋白
GLP 优良实验室规范
GMP 优良制造规范
gp 基因组粒子
gp/mL 基因组粒子/mL
h 小时
HBSS Hanks氏平衡盐溶液
HCP 宿主细胞蛋白
HEK 人胚胎肾
HI-FBS 热灭活FBS
HPLC 高效液相色谱
HRP 辣根过氧化酶
HSA 人血清白蛋白
INN 国际非专有名
IPC 工艺控制
IST 调查员委托试验
ITR 反向末端重复
IU 感染单位
KanR 卡那霉素抵抗
kb 千碱基
kDa 千道尔顿
kg 千克
kGy 千戈瑞
L 升
LOQ 定量极限
LAL 鲎变形细胞裂解物
LOD 检测极限
μL 微升
μm 微米
m 米
M 摩尔
mbars 毫巴
MCB 主细胞库
mDa 百万道尔顿
mg 毫克
MIA(IMP) 制造商/输入商许可
min 分钟
mL 毫升
mm 毫米
mM 毫摩尔浓度
mOsm 毫渗透摩尔
MSC 微生物安全柜
N/A 不适用
ND 未确定
NEAA 非必需氨基酸
ng 纳克
NF 国家处方集
nm 纳米
No. 编号
OCT 最佳切割温度
OD 光学密度
OD600 在600nm下测量的光学密度
ONL 外核层
p 机率
Pa 帕斯卡
PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳
PB 纯化的本体
PBDS 纯化的本体原料药
PCR 聚合酶链式反应
PDA 光电二极管阵列检测器
PEI 聚乙烯亚胺
PETG 聚对苯二甲酸乙二酯
pfu 空斑形成单位
pg 皮克
ppm 百万分率
PSG 纯蒸汽发生器
psi 磅/平方英寸
PTC 考虑点
QC 质量控制
QP 合格人士
QFPERT 定量荧光产物增强反转录酶
qPCR 定量聚合酶链式反应
qs 足量
rAAV 重组AAV
R&D 研究发展
rcAAV 可复制型AAV
rDNA 重组DNA
REP1 Rab护送蛋白第1型
RH 相对湿度
RO 逆渗透
RPE 视网膜色素上皮
RPE65 视网膜色素上皮65蛋白
rpm 转/分钟
s 秒
SCDM 大豆-酪蛋白消化培养基
SDA 沙保弱(Sabouraud)右旋糖琼脂
SDS 十二烷基硫酸钠
SLO 激光扫描眼底镜检查
SOP 标准操作程序
SSS 盐和表面活性剂溶液
ST DEV 标准偏差
TAMC 总需氧微生物计数
TBA 待分配
TCID50 半数组织培养感染剂量
TFF 切向流过滤
TSA 胰蛋白酶大豆琼脂
TT 技术转移
TYMC 总酵母菌/霉菌计数
U 单元
UF 超滤
USP 美国药典
UV 紫外线
vg 载体基因组
vp 病毒粒子
v/v 体积对体积
WFI 注射用水
WPRE 土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件
WT 野生型
μl 微升
μm 微米
实施例
实施例1：原始工艺和改善工艺的比较分析测试数据
除非另外说明，否则提供来自原始工艺的样品用于改善工艺的数据分析，使得数据可使用相同方法(当适用时)自两组批次产生，以允许直接相对比较所产生的数据。针对以下提供的数据，测量值取自一批或多批AAV2构建体，其中所有批次的构建体都相同。
分析通过改善工艺产生的中间产物的物理滴度(qPCR)、总蛋白质(Micro-BCA)、总DNA(Picogreen)和纯度(SDS-PAGE/Sypro Orange染色)。
来自原始工艺的样品的基因组滴度数据取自所提供的测试文件。
本文呈现的来自原始工艺中中间样品的总蛋白质和总DNA数据根据改善工艺自原始工艺产生的起始材料产生。
用于确定完整粒子对空粒子比的电子显微镜(EM)分析在工艺自原始工艺转移到改善工艺时尚未完整建立。原始工艺不涉及在制造之时的任何测试以确定临床批次内的完整粒子对空粒子比，也不评估纯化(密度梯度)步骤或测量最终成品药，因此无法取得数据进行改善工艺与原始工艺的纯化(密度梯度)工艺步骤的比较。因此，完整粒子对空粒子比并不用作可相比性的评估。相反地，如通过qPCR测量的物理滴度(或基因组粒子)确定被视为成功转移整个工艺和成功转移个别工艺步骤的合适确定，因为这对于载体产物具有特异性且因此代表完整衣壳。然而，对于原始工艺，基于分析型超离心(AUC)的方法用于评估仅供参考的完整对空比。这种测试的结果呈现在表33中。
EM是优选的方法且已对所有到目前为止制造的批次执行。此外，追溯性使用EM分析以测试来自原始工艺的两个批次以给出完整对空比的理解。这种测试展示改善工艺能够产生可相比的完整衣壳对空衣壳比(如表20中所示)。
表20：电子显微镜分析
| 批次 | 如EM所估计的空衣壳 |
| (原始工艺)成品药* | 11％ |
| (原始工艺)原料药 | 11％ |
| (改善工艺)原料药-批次1 | 15％ |
| (改善工艺)原料药-批次2 | 24％ |
| (改善工艺)原料药-批次3 | 51％** |
*无DS可用于测试。对DP执行的测试仅供参考，然而原料药与成品药之间的加工有限，因此我们相信这将代表原料药的结果。
**注意所述值稍高于预期。根据改善工艺，在所述批次观察到较高比率的空粒子似乎是因为在级分收集/选择完整衣壳期间自离心管去除较大体积的材料的操作操纵所致。在未来批次实施矫正行动以处理所述问题，且在这次调查之后制造的批次2具有预期降低数量的空衣壳。
起始材料和参考材料(两者都来自原始工艺)的分析结果汇总在表21中。
表21：
改善工艺所产生的收集材料比原始工艺所产生的收集材料含有较高的总蛋白质浓度。然而，原始工艺与改善工艺之间最终原料药的纯度特性类似，并未检测到大量杂质。原始工艺与改善工艺之间的滴度收率也类似。
关于定义成功技术转移工艺的接受标准，改善工艺受到控制且改善工艺的个别工艺步骤的性能类似于原始工艺期间所观察到的性能。改善工艺的工艺收率(载体滴度)在原始工艺所获得的收率的20％内。改善工艺的最终产品纯度(DNA/蛋白质含量)在原始工艺所获得的纯度的20％内，具有类似的SDS-PAGE特性。
实施例2：制造工艺的优化
针对以下提供的数据，测量值取自一批或多批AAV2构建体，其中所有批次的构建体都相同。
质粒三重转染和收集
工艺1：三种质粒转染HEK293细胞在氯喹预处理细胞之后通过磷酸钙DNA沉淀执行。
工艺优化：优化转染(包括细胞接种条件)，比较磷酸钙和聚乙烯亚胺。优化质粒浓度/比率。确定培养基交换和收集的最佳转染后天数。优化操作(非工艺)改变以改善工艺步骤的控制和再现性，以确保工艺一致性和强健性。自工艺去除氯喹以改善安全性。
执行载体滴度产率分析。比较聚乙烯亚胺(PEI)转染试剂与磷酸钙(用于工艺1)以确定前者是否可用于替换磷酸钙作为更强健的转染试剂。还评价对用氯喹预处理的要求。所有参数都通过使用未验证的方法通过qPCR确定物理滴度来评估。
表22呈现初始结果，其中在用PEI转染之后的载体滴度直接与使用磷酸钙所获得的滴度比较，包括氯喹的存在和不存在下的情况。所有研究都用含有谷氨酰胺的DMEM培养基执行，这是所有上游工艺步骤使用的培养基。
表22：比较转染试剂-物理滴度
本工作展示使用PEI成功转导，虽然相较于使用磷酸钙转染时具有较低物理滴度结果。本工作还展示当使用PEI作为转染试剂时，氯喹预处理没有必要且可自工艺去除。
基于所述结果，以小规模执行进一步的优化，包括细胞接种密度、细胞生长的培养基、FBS浓度和DNA:PEI比。一旦建立了优化转染工艺，则以完整规模使用PEI执行工艺且与使用磷酸钙的相同工艺比较以展示可相比性。
表23显示获自完整规模制造的数据，其展示PEI作为转染试剂的适用性和可相比性。基于所述数据，选择PEI作为首选转染试剂以允许相较于磷酸钙更强健的工艺步骤。
表23：比较完整规模制造中的转染试剂-物理滴度
| 转染试剂 | 转染后滴度 |
| PEI | 11.9x 10^14DRP/培养瓶(5.41x 10^11DRP/mL) |
| 磷酸钙 | 6.644x 10^14DRP/培养瓶(3.02x 10^11DRP/mL) |
另外，改善工艺所产生的批次的总体生产率和工艺产率与原始工艺所产生者可相比(表24)，展示PEI作为转染试剂的适用性。
表24：比较总体生产率和工艺产率-来自原始工艺和改善工艺的批次
实施例3：切换质粒编码的抗生素抵抗-从AmpR到KanR
针对以下提供的数据，测量值取自一批或多批AAV2构建体，其中所有批次的构建体都相同。
研究材料和程序
用于产生原始工艺所产生的临床批次的含有氨苄西林的质粒充当在DNA酶抵抗粒子(DRP)/cm2方面分析AAV2.构建体载体产率的对照。实验自相同的细胞解冻事件执行，且所有细胞在整个实验中接受相同的处理、培养基、试剂和生长条件。
测试的质粒：pAAV.构建体(KAN)；pNLREP-CAP2(KAN)；pHELP(KAN)；pAAV.构建体，CN1055CM(原始工艺；Amp版本，用作对照)；pNLREP-CAP2，CN1054CM(原始工艺；Amp版本，用作对照)；pHELP，CN2291CM(原始工艺；Amp版本，用作对照)。
每一组质粒都执行一式三份测试。三个1-叠层用pAAV.构建体(KAN)、pNLREP-CAP2(KAN)和pHELP(KAN)转染。三个1-叠层用等效含AmpR的质粒转染。在转导后16至26小时再喂养细胞，并在转导后44至52小时收集培养基和细胞，且确定每个1-叠层的DRP产率。
结果
经由qPCR确定测试的3份复制品的平均DRP/cm2。分开分析培养基和细胞裂解物两者的产率，接着相加以确定每份复制品的总载体产率，接着除以平方厘米数。
表25：AmpR和KanR质粒的产率分析DRP/cm2
用于制造原料药和成品药的再工程改造(Kan)质粒的接受标准定义为不小于对照质粒产率的四倍。再克隆Kan版本的质粒符合接受标准。基于所获得的类似的DRP产率和序列确认，含有KanR的质粒被认为适合产生临床批次的AAV2构建体。
实施例4：主细胞库细胞系改变成ATCC
HEK-293
针对以下提供的数据，测量值取自一批或多批AAV2构建体，其中所有批次的构建体都相同。
研究材料和程序
用于由原始工艺产生GMP批次的原始工艺1细胞系充当转染效率和AAV2构建体载体产率的对照。持续传代和再测试产率和转染效率先前未针对原始工艺1使用的细胞评估且测试仅供参考。针对转染效率、产率分析和生长动力学的实验自一个或多个相同细胞解冻事件执行，且所有细胞在整个筛选实验中接受相同的处理、培养基、试剂和生长条件。
测试的细胞系：ATCC＝[HEK-293](
CRL-1573TM)；Bioreliance＝293细胞(G95001 2)，工艺1细胞系；和293T＝293T/17[HEK 293T/17](
CRL-l 1268TM)。值得注意的是，包括293T细胞作为替代来源。
针对转染效率和产率分析，单层的每个细胞系用相关质粒转染且在转染后16至26小时再喂养。在转导后44至52小时收集细胞和培养基以进行GFP或AAV2构建体DRP分析。
生长动力学通过用10^7或2.5x 10^6个细胞/培养瓶接种T175培养瓶评价，且在接种后1、2、3、4和7天记录细胞健康、融汇率、细胞计数和存活率。这在传代≥15重复。
结果
平均荧光强度：平均荧光强度经由流式细胞术分析以测量GFP蛋白质表达水平加上转染的细胞数量作为与病毒产率相关的总体基因表达的指标。
表26：平均荧光强度结果
GFP百分比：如通过流式细胞术所确定的GFP阳性细胞百分比显示在图13和图14中。
AAV2构建体产率分析：产生DRP滴度测定结果以进行每一处理(1-叠层)所收集的细胞+培养基中按照qPCR分析的AAV2构建体产率的头对头比较分析。
适用于临床制造的细胞系的接受标准被视为每处理不大于对照(原始工艺1细胞)四倍的差异。实验1(Exp1)在细胞传代7进行且实验2(Exp2)在传代15进行。
表27：AAV2构建体产率分析结果
生长动力学：生长动力学通过记录以两种密度同时接种的T175培养瓶在接种后1、2、3、4和7天的细胞计数和存活率评价。每个实验由两个连续传代复制品组成。实验1在传代7进行且在传代8自解冻重复。实验2在传代15进行且在传代16自解冻重复。存活细胞的数量和百分比由Trypan Blue染色确定。
表28：生长动力学结果
所有四个细胞系都以与预期基于先前相对于相关产率分析的经验为良好转导效率一致的水平表达GFP。两个来自ATCC的细胞系：HEK293(CRL-1573)和293T(CRL-11268)自解冻展现良好的细胞生长和扩增。值得注意的是，Bioreliance细胞系具有较慢初始生长和扩增，其总体细胞健康相对于其他细胞系和对照较差。两个实验中Bioreliance细胞系也无法符合产率在对照四倍内的接受标准，其中两个ATCC细胞系都在最小接受标准内。
为了进一步产生AAV2构建体载体，基于以上呈现的本公开的制造工艺的示例性实施方案的结果，选择ATCC细胞系HEK293(CRL-1573)。
实施例5：制造工艺的分析发展
针对以下提供的数据，测量值取自一批或多批AAV2构建体，其中所有批次的构建体都相同。
作为自原始制造工艺转移到改善制造工艺的策略的一部分，平行发展分析策略。可能的话，将原始工艺发展的方法转移到改善工艺或下一代工艺。
表29：分析方法的概要
NA＝不适用
原始rcAAV测定和改善的rcAAV测定都利用人胚胎肾细胞(HEK293)，所述细胞用AAV2构建体稀释液感染或用野生型(wt)AAV感染作为对照。细胞接着用腺病毒血清型5(Ad5)共感染以提供rcAAV的辅助功能(如果存在的话)。在最大细胞病变效应(CPE)下，细胞裂解。这构成载体的传代0(P0)的结束。在传代1(扩增1)中，使用一部分P0裂解物接种共感染Ad5和不共感染Ad5的HEK293细胞。没有Ad5的细胞用以确定输入细胞的DNA水平，而具有Ad5的细胞容许rcAAV2构建体或在对照的情况下的wt AAV的扩增。在原始测定中，当Ad5阳性样品在第一扩增之后达到最大CPE时，细胞通过PCR分析。在改善测定中，细胞裂解/扩增步骤在PCR分析之前总共执行3次。
测定被验证为改善工艺的极限测试。原始临床批次或工程改造批次都未被分析作为这种验证的一部分，因此直接比较所获得的结果是不可能的。原始测定未被验证。总结来说，这两种方法提供无显著差异的结果。
原始工艺和改善工艺的hcDNA测量都在Taqman仪器上使用qPCR。原始测定测量三种不同的扩增子(102bp、401bp和765bp)，其中每种扩增子的敏感度(LOD)为20pg/mL。改善工艺所使用的测定具有单一扩增子且敏感度(LOQ)为1.3156ng/mL。并未进行方法的头对头比较，然而，hcDNA方法后续符合资格且展示适合目的。因此，对于可相比性评估并无不利冲击。
原始工艺使用市售ELISA试剂盒(Bethyl Laboratories,Cat#E10-113)测量残余BSA。所述原始工艺使用的试剂盒的敏感度是12.6ng/mL。市售ELISA试剂盒(AlphaDiagnostics,Cat#8100)用于改善工艺。所述试剂盒未被验证但敏感度定义为最低校正标准，即1ng/mL。两种试剂盒中使用的一抗的制造商断言所述一抗特异性检测人BSA。并未进行方法的头对头比较；然而，到目前所测试的所有批次都展示非常低水平的残余BSA(低于方法的敏感度)。
因此，结论是所有批次都含有可相比的低水平的残余BSA。
此外，由于BSA可造成人的过敏反应，世界卫生组织(WHO)设定了每剂疫苗50ng或更少残余BSA的准则。例如，对于一剂100μL的AAV2构建体，BSA的浓度极限将为500ng/mL。原始工艺和改善工艺中使用的两种ELISA试剂盒测定都具有低于这种所需极限的敏感度水平，且因此被认为在可接受的极限内测量残余BSA是可相比的。
感染滴度
感染滴度测定自原始工艺转移到改善工艺。测定的细胞培养部分和PCR都作为这种转移的一部分遵照原始工艺中使用的程序执行。AAV2构建体(非GMP)(通过原始工艺)在测定转移期间在3个场合分析且所获得的结果与感染滴度2.90x 1010IU/mL比较。所获得的结果提供在表30中。
表30：感染滴度测定
| 样品 | 结果(IU/mL) | 通过/失败 |
| 场合1 | 4.31x 10^10 | 通过 |
| 场合2 | 9.28x 10^10 | 通过 |
| 场合3 | 3.56x 10^10 | 通过 |
| 平均 | 5.72x 10^10 | - |
| 标准偏差 | 3.11x 10^10 | - |
| 精确度(CV％) | 54.4 | - |
获自测定转移研究的数据并无显著差异，即在获自原始工艺的结果的4倍范围内。
原始工艺所产生的AAV构建体(非GMP)根据改善工艺在3个场合分析，且相对于报告滴度(4.95x 10^12DRP/mL)(原始工艺)的结果提供在表31中。如果在根据原始工艺报告的结果的3倍范围内，则数据被视为可接受。
表31：物理滴度测定-可相比性数据
| 样品 | 结果(IU/mL) | 通过/失败 |
| 场合1 | 9.57x 10^12 | 通过 |
| 场合2 | 7.99x 10^12 | 通过 |
| 场合3 | 7.75x 10^12 | 通过 |
| 平均 | 8.44x 10^12 | - |
| 标准偏差 | 9.888x 10^11 | - |
| 精确度(CV％) | 10.3 | - |
测定后续被验证且获得表32中的AAV构建体(非GMP)(来自原始工艺)材料的额外值(仅1000和10,000倍稀释结果)。
表32：AAV构建体(非GMP)(原始工艺)的物理滴度结果(测定后验证)
AAV2构建体(非GMP)材料(来自原始工艺)常规地在DS和DP样品分析中作为内部参考对照(一级参考)分析，其中系统适用性接受标准设定为在标称滴度(4.95x 10^12DRP/mL)(通过原始工艺确定)的3倍差异内，以确保方法的持续可比较性能。
实施例6：改善工艺所产生的组合物的比较
针对以下提供的数据，测量值取自一批或多批AAV2构建体，其中所有批次的构建体都相同。
为了展示工艺改变/优化(改变工艺1以产生工艺2)并未影响所产生的载体材料的关键质量属性，执行可相比性评估。
一旦对细胞、质粒、转染条件、亲和性色谱管柱、规模和最终容器进行了工艺改变，且关于工艺1的优化工作已完成之后，则限定制造临床第3期材料的新工艺且执行完整规模“工程改造”批次以测量工艺性能以及原料药和成品药与原始工艺所产生的材料的等效性。
以下分析比较改善工艺的完整规模工程改造批次和GMP批次所产生的数据与原始工艺所产生的工程改造批次和临床材料。
对原始工艺所产生的工程改造批次(AAV2构建体(非GMP))执行额外测试(见下表33)以提供与改善工艺所产生的工程改造批次的比较信息。
表33：原始工艺和改善工艺所产生的AAV2构建体(非GMP)批次的比较
*对纯化的本体(原料药)执行的测试
**使用非GMP分析执行的测试
***所报告的物理滴度根据原始工艺执行
****根据改善工艺在验证研究中分析
额外分析信息和数据
物理滴度：填充的成品药临床材料(GMP产品)的目标物理滴度是1x 10^12DRP/mL(通过原始工艺产生)。对于原始工艺所制造的工程改造批次(非GMP产品)，并无目标滴度，且AAV2构建体(非GMP)代表如果所述批次进展为成品药，则将被稀释成目标填充浓度的原料药。对于改善工艺所产生的AAV2构建体(非GMP)，目标浓度是1-2x 10^12DRP/mL。AAV2构建体(非GMP)的报告滴度1.87x 10^11DRP/mL低于预期，但这是因为最终切向流超滤步骤(TFF2)中的最小滞留体积限制最终原料药可浓缩的程度。具体而言，这种不完全浓缩导致所述批次为6倍不足浓缩。如果物理和感染滴度用这种6倍稀释校正，则批次之间的物理滴度、感染滴度和物理滴度:感染滴度比类似，如表34中概述。评价使用较低滞留体积(较小)的TFF滤筒以达成较高浓缩系数。
表34：物理滴度、感染滴度和物理滴度:感染滴度比的比较
纯度：纯度通过用Sypro Orange染色的还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析测量。图16显示改善工艺所产生的AAV2构建体(非GMP)批次产生的纯度特性。数据显示存在3个病毒衣壳(VP1、VP2和VP3)蛋白，且未检测到额外杂质。
构建蛋白质表达：在引入构建蛋白质表达的定量测定(经由ELISA方法)之前，使用定性非GMP测定执行初步分析。以下描述的这种基于细胞的体外测定能够在人细胞系中测量构建体表达和表达的构建体的生物活性两者。所述测定具有3组分：
·细胞培养和病毒载体转导
·用于检测构建蛋白质表达的蛋白质印迹
·用于检测构建蛋白质活性的测定
细胞培养使用HEK293细胞执行，所述细胞用已知和可相比物理滴度的AAV2构建体载体转导。这些细胞以低于这种测定内所检测的水平或以其极限表达构建蛋白质，允许因为AAV2构建体载体的细胞转导和表达所致的构建蛋白质表达增加的比较性定性评估。在转导和孵育之后，收集细胞裂解物且将胞质液级分用于蛋白质印迹和体外测定，以分别确定构建蛋白质表达和活性。蛋白质检测使用对构建蛋白质具有特异性的单克隆抗体执行且表达水平标准化至例如细胞内B-肌动蛋白表达以提供半定量分析。
图17显示的数据说明在用来自原始工艺和改善工艺的工程改造批量转导培养的HEK293细胞之后构建体表达和功能活性的结果。两个批量的构建蛋白质染色都是阳性，且指示构建蛋白质表达水平相较于在未转导的对照293细胞中所见的基线构建蛋白质表达水平增加。两个批量的构建蛋白质的底物检测也都为阳性，且指示底物活性水平相较于在未转导的对照293细胞中所见的基线水平增加。另外，原始和改善的工程改造运行两者的构建体表达和底物活性水平似乎是可相比的，展示这些批次的效力可相比。GMP批次的数据还显示构建体表达和活性增加。
优化工艺的产物：
安全性：生物负载和内毒素数据指示没有与引入新污染物有关的安全性问题。就此而言，来自原始工艺和改善工艺的批次并无显著差异。
杂质：所有批次的工艺相关杂质水平(HCP、残余全能核酸酶、BSA、总蛋白质)并无显著差异。
注意到宿主细胞DNA(hcDNA)水平上有一些差异。都是原始工艺所产生的AAV2构建体(非GMP)与AAV2构建体(GMP)之间的差异可能是因为事实上AAV2构建体(非GMP)在非GMP实验室产生，而AAV2构建体(GMP)在对于工艺步骤、工艺操作、取样、测试和原料有较多控制的GMP无尘室中产生，因此允许获得较佳且较可再现的结果。此外，在质粒转导细胞之后较长的孵育时间用于产生AAV2构建体(非GMP)；自细胞进料至收集72小时相较于用于产生AAV2构建体(GMP)的细胞的23小时。较长时间的孵育可允许更多细胞生长和由那些细胞释放更多的hcDNA。
这些差异可解释在原始工艺所产生的2批材料之间观察到的hcDNA水平差异。
相反地，对于所有改善工艺所产生的AAV2构建体(非GMP)和2个GMP批量，hcDNA水平低许多(分别为530pg/mL或＜LOD)。在用于产生这些批次的工艺中，存在能够去除残余DNA的色谱纯化和抛光步骤。
产物特征：所有批次的外观、pH和渗透压无显著差异。
载体特征：当以非定量测定评估时，改善工艺所产生的非GMP和GMP批次显示可相比的构建体表达和生物活性。这些批次也具有与原始工艺所产生的批次可相比的纯度，而无可检测的杂质。
完整载体衣壳对空载体衣壳比的数据类似，且以上呈现的构建体表达和活性的数据证实改善工艺所产生的(非GMP)批次的完整载体衣壳对空载体衣壳比相当于原始工艺所产生的GMP批次，且不负面影响载体转导人细胞的能力且展示生物活性。
同一性(载体序列)的数据证实所有批次的完整序列的同源性，并无突变引入。同一性还通过检测体外构建体表达和生物活性的能力证实，两者都依赖侧接AAV ITR的完整和功能性构建蛋白质。
任何批次都未检测到可复制型AAV。由于质粒和载体基因的本质，不太可能有rcAAV存在，但在放行用于临床研究之前将持续评估任何GMP批次以确保患者安全性。
工艺产率：
表35概述改善工艺的总体工艺产率。从两倍数量的10层细胞工厂(24相对原始工艺的12)，制造出两倍数量的病毒粒子(DRP)(6.7x 10^13相对原始工艺的3.4x 10^13)。总体工艺收率较低，但部分原因是在改善工艺开发期间执行额外在原始批次产生期间不包括的工艺中和质量控制测试。
表35：相对工艺产率和收率
*所报告的物理滴度使用原始工艺执行
**约10％丧失在样品中(IPC、QC)
基于以上呈现的数据，自新的优化工艺所产生的AAV2构建体非临床批次被认为与原始工艺所产生的非临床和临床批次可相比。所述工艺用于产生根据改善工艺的第一GMP批次。
实施例7：改善AAV2纯化色谱的强健性
在引入AVB之后评估所有与产品质量和疗效有关的测试参数，且AVB色谱源性产物的质量或疗效特性没有可检测的变化，如表36至表41中详述。
此外，引入检测残余AVB配体的新方法且展示在任何使用AVB Sepharose管柱制造的所有材料中都没有可检测的AVB配体。
以AAV2构建体收集材料(图2，步骤13)执行七次AVB工程改造运行以评价聚集预防和步骤产率，其中5次运行为小规模(1.5L至7L)且2次运行为较大规模(16L)。AVB步骤在所有实验中执行良好，具有良好的步骤收率，产率为40％至78％(且平均产率为64％)。在任何实验中都未检测到显著聚集。在AVB色谱之后，潜在杂质或工艺污染物的水平都低且与先前展示的水平一致，且最终载体产物显示良好的效力和感染滴度。从AVB Sepharose纯化步骤规模缩小运行得出结论，所有测定结果(表36)都显示与原始第1/2期工艺(采用动物源性基质填充的亲和性色谱)和初始“改善”工艺AAV2构建体GMP临床材料(UnoQ阴离子交换工艺)良好的可相比性。
表36：AVB Sepharose纯化步骤-测定结果
*完整规模下的等效滴度
**校正丧失一支离心管的产率
***评估聚集的R&D方法
表37：AVB Sepharose纯化步骤-测定结果
*样品体积不允许浓缩至最终滴度。
在通过小规模开发运行展示产物可相比性和改善工艺强健性且使用AVB亲和性色谱步骤扩大规模产生批量之后，使用AVB工艺制造AAV2构建体GMP。这种GMP批次的所有分析测试结果符合规格和预期。
(改善工艺所产生的)AAV2构建体GMP原料药和成品药的初步分析结果概述在下表38和表39中。所有测试符合规格和预期。
表38：AAV2构建体GMP(来自改善工艺)的初步放行测试结果
表39：改善工艺的AAV2构建体GMP原料药的初步表征测试结果
当相较于原始工艺的工艺和产物，纯化工艺改善导致可相比的AAV2构建体原料药和改善的工艺强健性。
在通过改善工艺制造期间，完整粒子对空粒子比确定为特征测试。
表40中给出潜在产物相关杂质。
表40：
| 潜在产物相关杂质 | 控制 |
| 可复制型AAV | 可复制型AAV测定* |
| 空AAV粒子 | 大部分通过梯度纯化去除 |
*原料药放行测试。
表41中给出潜在工艺相关杂质及其控制。
表41：
| 潜在工艺相关杂质 | 控制(原料药放行测试) |
| 全能核酸酶 | 残余全能核酸酶ELISA |
| 内毒素 | 内毒素测定-动力学LAL |
| 牛血清白蛋白 | 残余BSA ELISA |
| 宿主细胞蛋白 | HEK293宿主细胞蛋白ELISA |
| 宿主细胞DNA | HEK293宿主细胞DNA qPCR |
| 总DNA | Picogreen残余双链DNA分析 |
| AVB配体 | 残余AVB ELISA |
实施例8：原料药的控制
针对以下提供的数据，测量值取自一批或多批AAV2构建体，其中所有批次的构建体都相同。
分析程序验证：以下呈现方法验证结果(如果有)的概要。
物理滴度：这种测定已被验证以满足下列标准(见表42)。“实际值”是本公开的示例性AAV2构建体的值。
表42：
DRP:IU比-计算：无需验证。值通过物理滴度和感染单位滴度测定数据的计算确定。
总粒子：总粒子测定已被验证。验证结果的概要呈现在表43中。“实际值”是本公开的示例性AAV2构建体的测量值。
表43：总粒子测定验证概要
完整:空比：未执行药物特定测定验证。计数在GMP符合设施中执行的透射电子显微镜图像上的完整和空AAV2粒子。
载体同一性(DNA)：未执行药物特定测定验证。DNA定序使用GMP符合设施中的合格方法和设备执行。
总蛋白质测定：这种测定被验证以符合下列标准(见表44)。
表44：总蛋白质测定验证标准
纯度测定(SDS-PAGE)：纯度测定已被验证。呈现验证结果的概要(表45)。“实际值”是本公开的示例性AAV2构建体的测量值。
表45：纯度测定验证概要
可复制型AAV：可复制型AAV测定已被验证以符合如ICH Q2(R1)中所指明的关于杂质极限测试的相关验证要求(见表46)。验证结果的概要呈现在下文中。“实际值”是本公开的示例性AAV2构建体的测量值。
表46：可复制型AAV测定验证概要
总DNA：总DNA测定已被验证。呈现验证结果的概要(见表47)。所提供的“实际值”是本公开的示例性AAV2构建体的测量值。
表47：总DNA测定验证概要
HEK293宿主细胞DNA：HEK293宿主细胞DNA测定已符合资格(见表48)。资格结果的概要呈现在下文中。所提供的“实际值”是本公开的示例性AAV2构建体的测量值。
表48：宿主细胞DNA测定资格概要
生物负载测定：这是调和成符合EP 2.6.12和USP<61>要求的药典方法。资格/验证根据相关药典专论进行。
内毒素测定：这是调和成符合EP 2.6.14和USP<85>要求的药典方法。资格/验证根据相关药典专论进行。
实施例9：使用工艺2制造的组合物的批次分析结果
针对以下提供的数据，测量值取自一批或多批AAV2构建体，其中所有批次的构建体都相同。
来自2个非GMP批次和2个GMP批次的批次分析数据呈现在下表50中。
表50：根据工艺2制造的AAV2构建体原料药的质量控制测试结果
脚注：
(*)分析根据工艺1进行。(**)未执行以保留材料用于稳定性研究。(***)结果不符合规格；获得结果之后设定规格。(****)所获得的结果作为测定验证的一部分。通过工艺2确定滴度，使用质粒DNA作为测定标准(1.87x 10^11DRP/mL)而非使用报告的物理滴度值。(*****)测定不符合效度标准。样品不足以再分析。
实施例10：使用工艺1制造的组合物的批次分析结果
针对以下提供的数据，测量值取自一批或多批AAV2构建体，其中所有批次的构建体都相同。
已根据工艺1制造一个临床GMP批次。来自所述原料药批次的批次分析数据提供在表51中。
表51：质量控制测试结果
1来自IPC测试的结果。
实施例11：AAV组合物的稳定性
分析AAV2构建体原料药的等分试样的长期稳定性以支持＜-60℃的AAV2构建体原料药储存条件。本研究放大在-80℃、-20℃和5℃下进行中的成品药即时稳定性和稳定性加速研究。
将AAV2构建体原料药等分到代表完整大小AAV2构建体原料药容器的小容器(5mLPETG旋盖瓶)以确保有足够容器可用于长时间的稳定性测试。这些容器具有相同的产物接触材料且经选择以最佳代表最终AAV2构建体原料药容器，表面积对体积比除外。据信小容器等分试样的较小体积和较大表面积对体积比代表关于AAV2构建体原料药长期稳定性的“最差情况”。
将等分的AAV2构建体原料药放置在-80±10℃、环境相对湿度下。
如果可用于完成完整36个月研究的AAV2构建体原料药等分试样不足，则研究将在较早时间点截短。
缩减型支持性稳定性研究使用来自小规模AAV2构建体(非GMP)批次的材料起始。本研究使用100μl等分试样储存在＜-60℃下的2mL聚丙烯冷冻管中。据信小容器等分试样的较小填充体积和较大表面积对体积比代表关于AAV2构建体原料药长期稳定性的“最差情况”。研究将在2、6和12个月的时间点评估原料药稳定性。本研究的额外细节呈现在下文中。
测试要求
基于下列原理选择用于基本稳定性协议的测定(见表52)。
表52：用于基本原料药稳定性协议的测试
选择用于支持性稳定性协议的测定包括如表53中所指示的物理滴度、纯度、总粒子和效力。这些稳定性测试和时间点(表54和表57)被视为最适合可用于执行研究的材料量。载体聚集的评估未包括在本研究中，因为所述方法目前处于发展之中以用于AAV2载体材料。容器完整性也排除于研究之外，因为这是缩减型支持性稳定性研究。
表53：用于支持性原料药稳定性协议的测试
表54：储存在-80℃±10℃下的AAV2构建体基本原料药稳定性研究的稳定性协议和保质期规格
表55：储存在<-60℃下的AAV2构建体支持性原料药稳定性研究的稳定性协议和保质期规格
表56：储存在-80℃±10℃下的AAV2构建体基本原料药稳定性研究的稳定性数据
表57：储存在＜-60℃下的AAV2构建体支持性原料药稳定性研究的稳定性数据
X：表示未来稳定性时间点。
实施例12：临床成品药的分析
针对以下提供的数据，测量值取自一批或多批AAV2构建体，其中所有批次的构建体都相同。
除了相应的规格之外，AAV2构建体成品药放行测试所执行的分析程序详述于表58中。
表58：成品药规格
分析程序：用于控制成品药的方法概述如下。
外观(EP 2.2.1、2.2.2和2.9.20和USP<631>)：目视检查产品的透明度、颜色和外来粒子的不存在/存在。产品将对比白色和黑色背景进行检查。
pH(EP 2.2.3和USP<791>)：产品的pH将使用具有温度补偿的微型pH电极确定。
渗透压(EP 2.2.35和USP<785>)：渗透压通过凝固点下降方法确定。
物理滴度：最终产品的物理滴度将如本文中所述执行。
感染单位滴度测定：最终产品的感染滴度测定将如本文中所述执行。
效力：本测定用于展示构建蛋白质在测试物品转导的细胞中过度产生且具有活性。细胞(HEK293)以非常低水平表达内源性构建蛋白质，允许因为AAV2构建体载体的细胞转导和表达所致的构建蛋白质表达相较于非转导细胞增加的比较性评估。在转导之后，将细胞裂解且构建体在裂解物中的浓度通过蛋白质印迹或ELISA测量。表达的构建蛋白质的活性在细胞裂解物上使用反应测量，所述反应使用蛋白质印迹或ELISA测量并入底物的生物素标记的GPP。
无菌性测试(EP 2.6.1和USP<71>)：所述程序用于确定测试物品是否未被存活细菌和真菌污染。将测试物品无菌转移到大豆-酪蛋白消化培养基(SCDM)和流体巯基乙酸盐培养基(FTM)。将这些培养液孵育14天且检查细菌和真菌生长的证据。
内毒素(EP 2.6.14和USP<85>)：所述测定用于确定细菌内毒素是否存在测试物品中。定量程序通过动力学-显色方法执行。已知量的内毒素与测试物品平行测试，以准确确定细菌内毒素的水平。测试物品干涉潜力通过以指明水平的内毒素加药测试物品加上LAL试剂检查。在抑制/增强测试之后，接着确定测试物品的内毒素含量。
分析程序验证：以下呈现方法验证结果(如果有)的概要。
外观：这是调和成符合EP 2.2.1/2.2.2和USP<631>要求的药典方法。资格/验证根据相关药典专论进行。
pH：这是调和成符合EP 2.2.3和USP<791>要求的药典方法。资格/验证根据相关药典专论进行。
渗透压：这是调和成符合EP 2.2.35和USP<785>要求的药典方法。资格/验证根据相关药典专论进行。
无菌性：这是调和成符合EP 2.6.1和USP<71>要求的药典方法。资格/验证根据相关药典专论进行。
实施例13：临床剂量设计
无脉络膜症是目前无法治愈的罕见X连锁视网膜营养不良，在儿童期晚期呈现且导致眼盲。本实施例提供评估视网膜基因疗法的非随机、两年、第1至2期开放标签临床试验的主要终点，使用腺相关病毒第2型(AAV2)载体表达无脉络膜症转基因(NCT01461213)。起初招募12名患者，其中5名接受1x 1010基因组粒子(gp)的AAV.REP1且6名接受1x 1011gp的AAV.REP1。一名患者的手术并发症导致视网膜变薄且减少载体剂量为小于1010gp。安全性和疗效的主要结果测量是两年的视敏度。视网膜敏感度和解剖学变化是次要终点。在整组14名患者中，两年中位数视敏度在治疗眼改善4.5个字母，相较之下，未治疗眼丧失1.5个字母(p＝0.03)。对于12名接受基因疗法且没有并发症的患者，治疗眼两年增加超过他们的基线水平5.5个字母(p＝0.02)。相较于未治疗眼，这代表有利于接受基因疗法的眼两年中位数4.5个字母增加(p＝0.003)。此时，相较于12个未治疗眼中没有一个眼，12个治疗眼中的6个眼增加超过一行视力(＞5个字母)。在最后一次随诊(范围2至5年)中，相较于12个未治疗眼中仅4个眼，所有12个按协议接受基因疗法的研究眼维持或增加视敏度。这相当于眼之间15.9个字母(＞3行)的平均差异。在两年随诊期期间，治疗眼与未治疗眼之间的次要终点未见统计显著差异，诸如微视野检查、视网膜厚度或丧失视网膜外缘。无脉络膜症的视网膜基因疗法似乎安全且可能有益于视敏度。
在这种未加盲、非随机分组、前瞻介入性基因疗法临床试验中，以知情同意书招募14名参与者且使用AAV2.REP1载体对一个眼进行基因疗法治疗。通常，选择接受治疗的眼在基线具有较差的视敏度，但在3例中，因为其他因素如视野缩小选择视敏度较佳的眼。所有参与者都是年龄25至73岁的男性，且证实CHM基因中没有突变。所述试验的主要目的是评估手术后两年关于维持视力的安全性。最初12名患者被招募到两个六名患者的剂量组群，监测每一名患者24个月。然而，两名患者的并发症导致在试验中途延迟24个月和与所使用的手术技术和免疫抑制方案有关的协议改变。伦理委员会核准试验延长以及进一步招募两名患者，使得总共12名患者按协议接受基因疗法治疗且没有并发症。
在第一组群的6名患者中，使用超螺旋质粒载体参考测定的视网膜下注射至多1x1010基因组粒子(gp)是以两步骤程序注射视网膜下。这包括用通过41号规(G)铁氟龙导管(DORC BV,Zuidland,Netherlands)递送的平衡盐溶液初始剥离视网膜和二次注射AAV.REP1载体到新产生的视网膜下空间。在第六名患者(C1)，难以剥离视网膜和拉伸乳突黄斑束导致减少基因疗法剂量为＜6x 109且后续视网膜变薄，但所有其他患者都按协议接受完整低剂量的1x 1010gp(L1-5)或高剂量的1x 1011gp(C2和H1-7)。最初口服泼尼松龙以1mg/kg在基因疗法之前施用3天和之后施用7天，但C2在手术后2周发展出玻璃体炎和视网膜炎，因而不良地影响他的视力。后续修改协议，以使H1-7接受延长的泼尼松龙方案：0.5mg/kg(第8-14天)、0.25mg/kg(第15-16天)、接着0.125mg/kg(第17-18天)。注射系统中的气泡扩张到H3的视网膜下空间且延缓载体施用，因为感觉载体将被视网膜下空气替换。修改注射系统以允许更受控地输注载体到视网膜下空间和减少困住气泡的可能性。协议允许如果手术因素指示而延缓载体施用且H3在稍晚当施用完整剂量载体而没有并发症的日期重新接受视网膜基因疗法。
为了协助观测视网膜剥离和监测视网膜拉伸，对H3-7引入术中光学相干断层扫描(OCT)成像。这包括在不同阶段移进和移出手术区以评估视网膜下注射平面和视网膜拉伸角度的垂直对齐的海德堡Spectralis。
在无脉络膜症中，与许多其他视网膜退化不同，丧失RPE导致下方脉络膜的瘢痕形成反应，接着变得牢固附着到残余视网膜。然而，功能性视网膜的中央小岛仍保持完整且可在其内鉴别在RPE与光感受器之间用于载体施用的组织平面。然而，如果将流体过快地注射到这个平面，则发展中的流体泡将形成紧绷气泡且拉伸中央视网膜，因为外周瘢痕组织将防止视网膜下流体向外传播到视网膜外周。所述视网膜拉伸反应具有两个负面结果。首先其可能直接伤害神经感觉性视网膜-在C1中，乳突黄斑束受到如先前报告的拉伸，因为这个区域中缺乏外核层，因此比起中央视网膜，这个区域较薄且根据虎克定律(Hooke’s Law)在给定压力下受到更多拉伸。其次，泡中的较高流体压力将导致载体悬浮液通过加宽的视网膜造孔回流到玻璃体中，因而减少递送的治疗剂量且增加发炎风险。因此，在C1中的并发症(其中载体自1ml注射器手动注射)之后，设计并测试新的载体施用装置，其允许精确脚踏板控制载体的缓慢输注。这成功地用于H3-7，在这些人中载体施用并未引起并发症(uncomplicated)。使用重液体全氟正辛烷气泡(Bausch&Lomb,Rochester,New York,USA)稳定P10和P11在载体输注期间视网膜变薄的病灶区域。
视力功能根据早期治疗糖尿病视网膜病变研究(ETDRS)协议以最佳矫正视力(BCVA)评估。此外，在基线、1年和2年执行Pelli-Robson对比敏感度测试。使用MAIA微视野计(CenterVue SpA,Padova,Italy)的微视野检查测试遵照先前描述的协议[MacLaren等，2014]，除了H3-7以外，使用标准非定制化20°(38种刺激)中央网格。针对具有显著视野限缩的参与者(H4-6)，他们在20°网格上可能达成几乎不可检测或0dB平均阈值敏感度，则替代地使用10°中央网格。在L3主观报告色视觉改善之后，将使用Farnworth-Munsell 100色调(FM100)测试的色视觉评估添加在协议改变中且包括在H1-7中。虽然H2、H5、H6和H7报告进一步主观描述治疗眼的颜色感知改善，但所述测试证实难以在晚期视野丧失的患者中执行。解剖学评估包括使用Spectralis(Heidelberg Engineering,Heidelberg,Germany)的频域光学相干断层扫描(OCT)和眼底自发荧光(AF)成像(BluePeak,HeidelbergEngineering)。评估对AAV的T细胞反应的免疫学测试(ELISpot)遵照先前描述的方法[MacLaren等，2014]。
由于在研究中包括近乎最大视敏度的眼的天花板效应，发现ETDRS分数偏斜(Shapiro-Wilk常态性检验，α0.05)，因此呈现为具有四分位数范围(IQR)的中位数值。使用Wilcoxon符号等级检验比较治疗眼与对照眼之间的变化。发现微视野检查数据和解剖学评估为常态分布且使用成对t检验比较。
结果
在招募的总共14名患者中，其中13名接受1x 1010gp(L1-5)或1x 1011gp(C2和H1-7)的AAV.REP1载体(表59)。有两名患者C1和C2出现与载体施用相关的显著不良事件(AE)。在C1中，手术并发症导致视网膜变薄和载体施用给药不足。在C2中，手术后2周出现显著视网膜发炎，其最有可能与载体相关。在H3中，视网膜下气泡防止第一次尝试时的载体施用，但二次载体递送成功，而在稍晚的日期没有并发症。针对协议(特别是关于手术方面)设计改变，以减少这些不良事件在未来发生的机会。伦理委员会核准进一步招募两名患者，由此提供12名(包括5名低剂量(L1-5)和7名高剂量(H1-7))按协议治疗的患者，随诊期为两年。
表59：试验参与者的人口统计特征。
所有参与者都是高加索男性，具有基因确诊的无脉络膜症且被列出以进行基因疗法手术。L1-5和H1-7分别以低剂量和高剂量进行未引起并发症的基因疗法。在C1中的手术引起视网膜拉伸的并发症导致给药不足。C2发展出明显的手术后眼内发炎，其导致视敏度急性降低和随后一旦发炎缓解之后的缓慢反弹。
视敏度评估
总计来说，12名接受AAV.REP1载体视网膜下注射而没有并发症和2名因为不良事件接受偏离协议的治疗。在2年试验终点，14个治疗眼的中位数视敏度改善4.5个字母(IQR：-2.0至8.8)且14个未治疗眼下降-1.5个字母(IQR：-5.0至0.0)。因此，总体而言有利于治疗眼，尽管2名患者具有显著的并发症(Wilcoxon符号等级检验，W＝68，z＝2.12，p＝0.034)。之后，为了评价调查药品(IMP)的疗效的目的，12名按协议接受基因疗法治疗的患者(L1-5和H1-7)与2名具有手术或医疗并发症的患者(C1和C2)分开报告。
由于试验中途延迟以优化手术技术，前5名患者(L1-5)具有5年随诊，而最后5名(H3-7)最近才达到2年随诊，具有介于之间的中间随诊期。因此数据以两种方式呈现：第一种是按照协议所限定的原始终点所有12名患者为2年，且第二种是最后随诊点，其中L1-5和H1-2延长超过2年。
到2年时，12个治疗眼的中位数视敏度改善5.5个字母(IQR：2.5至9.0)(Wilcoxon符号等级检验，W＝60，z＝2.33，p＝0.020)。相对地，未治疗眼在这段期间小量丧失-1.0个字母(IQR：-5.0至+1.0)(表60和图20)。这代表治疗眼相较于未治疗对侧眼中位数增加4.5个字母(IQR：2.0至14.0)(Wilcoxon符号等级检验，W＝76，z＝2.96，p＝0.003)。在最后一次随诊，治疗眼增加中位数6.5个字母(IQR：3.8至10.3)，然而未治疗眼丧失-2.0个字母(IQR：-5.3至0.3)。这代表治疗眼相较于未治疗眼中位数增加8个字母(IQR：4.0至18.5)(Wilcoxon符号等级检验，W＝78，z＝3.04，p＝0.002)。
到最后一次随诊，所有12个接受基因疗法的治疗眼视敏度维持或增加，但12个未治疗眼中8个眼在此期间有不同量的恶化。视敏度是可变的生物读数，但测试以标准方式执行且到24个月没有一个未治疗眼增加超过一行(＞5个字母)。相对地，到24个月12个治疗眼中6个眼(50％)增加超过一行。相较于未治疗眼，12名患者中4名在24个月见到增加两行或更多行(表60：粗体)。这到最后一次随诊进一步增加到12人中6人(50％)，其中4人具有有利于治疗眼的增加三行或更多行(≥15个字母)(表60：粗体)。在最后一次随诊，12名患者中每一位的治疗眼的视敏度相对于未治疗眼改善(中位数＝8.5个字母，IQR：4.0至18.5)，相当于平均增加15.9个字母(＞3行)，有利于接受基因疗法的眼。
表60：所有12名参与者在2年和最后一次随诊的视敏度结果(最佳矫正ETDRS分数)。gp＝AAV2.REP1载体的基因组粒子；Med＝中位数；TE＝治疗眼；CE＝对照眼；m＝月；y＝年；DIFF＝眼之间的差异；FU＝随诊；眼之间的视力变化2行(10个字母)或更多行以粗体显示。
微视野检查比起视敏度评估较宽广黄斑区域的平均视网膜敏感度，但执行的时间较长且需要专注，特别是固视(fixation)不良的患者[Jolly等，2017]。治疗眼的平均视网膜敏感度在基线是4.0±0.7分贝(dB)和在2年是3.3±0.6，代表无统计显著性的小幅下降(p＝0.07)。相对地，未治疗眼从基线处4.8±0.8dB显著下降到2年3.3±0.7dB(p＝0.004)。虽然在2年研究终点存在相较于未治疗眼有利于治疗眼的相对增加0.8±0.53dB(95％CI：-0.3至1.8dB)，但并无统计显著性(p＝0.17)。在1年的数据和期间分析显示在图21中。到这个阶段，治疗眼的平均视网膜敏感度丧失小于未治疗眼0.9±0.5dB(95％CI：0.0至1.8dB)，建议在2年见到的相对于未治疗眼的改善可能长期持久。
微视野检查还提供关于固视的有用信息，也就是具有最大敏感度的视网膜位点(通常是凹)。所有患者除了L1之外仍保留一些程度的凹或凹旁固视，与这种疾病的视野丧失的向心本质一致。先前注意到L1改变他的固视(或优选视网膜位点)成为使用这个治疗的小岛，同时舍弃视网膜的未治疗小岛。这在这个患者中维持长达5年，与视敏度持续改善一致。
保留视网膜结构：解剖学评估包括光学相干断层扫描(OCT，其给出横截面图以测量视网膜厚度)和自发荧光(其产生可用来估计生存视网膜区域的图谱)。没有将眼随机分组，其中在12名研究患者中的9名中选择在视敏度方面较晚期的眼进行基因疗法(表59)。
OCT主要用于安全性以评估可能因为例如手术创伤或是否因为REP1蛋白过度表达而有长期毒性效应所发生的视网膜变薄。12个按协议治疗的眼在基线的固视点(如微视野检查所指示)的平均厚度是224.8μm，相较之下，未治疗眼的平均厚度为251.9μm。到24个月，治疗眼减少到平均207.7μm且未治疗眼减少到245.6μm，这具有统计显著性(n＝12，p＝0.04)。然而，另外的子群分析揭示在前7个接受手动注射载体到视网膜下空间的眼(L1-5和H1-2)中，视网膜变薄在治疗眼(平均23.1μm)中高于未治疗眼(6.4μm)(n＝7，p＝0.02)。然而，在改善载体递送系统之后接受自动化注射的眼(H3-7)中，并未检测到显著差异(n＝5，p＝0.72)。
针对区域测量，自发荧光区域与自椭圆体带的多个切片计算的生存光感受器的区域相关。在整组12名患者中，到2年时治疗眼保留81.1±3.2％的自发荧光区域，而未治疗眼保留类似的80.8±2.1％。然而，应注意的是，AF缩小仅自退化前缘处的最外层的视网膜细胞发生，且2年的时间不足以评估视网膜基因疗法对于较健康中央区的长期效应。只有一名患者(H5)到2年时没有可测量的下降(100％保留)且这仅在他的治疗眼中观察到。5名患者的长期(5年)随诊显示类似的模式，其中治疗眼中剩余66.1±5.0％的自发荧光，相较之下，未治疗眼中剩余64.9±3.6％(表S2B)。然而，应注意的是这好坏参半，因为患者视敏度大幅增加远优于他人。另外，在这段时间内，所测量的退化速率的显著患者间差异甚至出现在未手术眼，范围在58％至78％。这强调了不需要过度解读有限的非随机分组数据集。
不良事件
所有入选患者在基线时没有目视显著的白内障，因为需要清楚视野以进行41号规视网膜切开术，但白内障形成是玻璃体切除术手术广为周知且几乎不可避免的不良反应。在2名参与者中(H5和H6)，先前已进行白内障手术。一名患者发展出目视显著的白内障，其在基因疗法后1年去除(H3)，但四名其他患者(L2、L4、L5、H2)在完成2年随诊后接受白内障手术。剩余五名患者(L1、L3、H1、H4和H7)尚未进行白内障手术，虽然依照LOCS III白内障分级所有都具有白内障进展征象。在整组14名患者和甚至包括两名具有并发症的患者中，治疗眼在这段期间内的视敏度相对于未治疗眼改善。只考虑12名在没有偏离协议的情况下进行未引起并发症的视网膜基因疗法的患者，到2年终点时，治疗眼的视敏度相较于他们的基线改善。在所分析的最近时间点，即长达5年，所有12个治疗眼维持或增加视敏度超过他们的基线水平，尽管在这段期间12个未治疗眼中的8个眼的视敏度存在可变的丧失。对于视敏度的有利效应与良好安全性特性的组合使得有必要进一步评估无脉络膜症基因疗法作为完全随机分组前瞻性第III期临床试验的潜在治疗(见实施例14)。
虽然低剂量或高剂量组群在视敏度增加之间并无显著差异，然而应注意的是这是一个非常小的研究组，只有5名患者以较低(1x 1010)剂量治疗。考虑到人先天抗病毒免疫系统的异质性本质，阈值剂量有可能在一些患者具有治疗性，但非所有患者。因此可能有利的是以最大耐受剂量治疗，只要未见到毒性效应即可。高剂量患者长时间优异保留视力功能支持这种方法。还值得注意的是，本研究选择的患者通常是末期，残余视网膜中的小岛非常小且因此没有太多剩余的视网膜细胞可治疗。对于早期阶段的患者低剂量可能不足够，他们将暴露到载体的目标区域大得多。还应注意的是用于本研究的药物制剂不包含可能改善治疗疗效的PRE或WPRE元件。
除了H5之外，剩余患者自发荧光区域的进一步缩小与其他临床前模型不一致，其中由单一基因替换所导致的视力功能的改善不变地与延缓视网膜退化相关。然而，在此，应记住重要的是在2年时间范围内所测量的退化的恶化仅为视网膜退化的最边缘且这部分可能过于恶化而无法救援。视敏度增加相对地主要发生在中央视网膜。同时无脉络膜症的视网膜难以剥离超出生存视网膜边缘，导致其上覆泡的拉伸。视网膜下空间的下凹形状将增加泡的中央高度，因此当流体重吸收后，其将为视网膜重新附着的最后部分。这可能潜在地提供中央视网膜相较于最外周处额外暴露于载体数小时。最后，应注意的是眼未随机分组且在基线一些患者中见到的生存视网膜区域的眼间差异指示不对称的退化速率。通过治疗较差的眼，定义上将偏重于治疗较快速退化的眼。
虽然在整个研究期间所有治疗眼的视敏度都得以维持或增加，但以微视野检查所测量的视网膜敏感度显示下降趋势且虽然数值上优于未治疗眼，但两者之间并无统计显著差异。这极有可能是因为相较于阅读高对比视力表上的单一字母，微视野检查的执行变异性增加。然而，这些测试的测量结果确实具有些微差异。微视野检查从平均分布在中央视网膜的10至30度的许多点评估视网膜功能，然而视敏度自通常具有最大敏感度且位于中央的单一点进行测量。维持视网膜敏感度因此因成功转导所测量的直到生存视网膜边缘的整个区域而有所改善。例如，如果仅20％的中央视网膜色素上皮细胞被载体成功转导且如果这些细胞位于凹之下，则这可能足以见到视敏度增加。然而，剩余80％的非转导细胞将持续退化且这种下降将反映在微视野检查随时间的逐渐下降中，但视敏度仍将保持稳定。然而，如果基因疗法成功停止成功转导区域的退化，则最终只有转导的细胞仍保持且微视野检查读数稳定随时间保持恒定。这种“高原”效应目前出现在L1中，他也维持视敏度增加且具有最长的随诊期。或者，可能是简单因子，即通过微视野检查所测量的视网膜敏感度比高对比视敏度对白内障形成更敏感。在玻璃体切除术后2年时间点，10名有晶状体协议治疗患者中仅一名进行白内障手术。
当判读本研究和任何其他涉及递送载体到视网膜下的基因疗法研究时，手术的成功是关键因子。一种视网膜拉伸的潜在不良事件与手术相关。发炎的其他显著不良事件可能同样与手术相关，像是在注射期间有载体回流进玻璃体，已知这会触发发炎。在试验中途的协议改变之后，采用自动化视网膜下注射系统，以允许精确和受控递送载体到视网膜下空间。这进一步通过术中视网膜扫描(OCT)促进，其提供被剥离的视网膜的即时横截面图像且帮助鉴别一些更晚期患者的视网膜下空间。这些额外的手术改进将改善未来基因疗法研究的安全性。然而，所述第I/II期临床试验的结果显示用于无脉络膜症的基因疗法大致上是安全的。
实施例14：Gemini研究
这是一个AAV2-REP1用于具有基因确诊的CHM的成人男性受试者的多中心、开放标签、前瞻性、双侧介入性安全性研究。
所述研究将由筛选访视和随后的2个治疗阶段(第1阶段和第2阶段)组成，其中每个阶段至多9次访视(图22)。在筛选访视时，评估受试者双眼的参与资格。调查员分配眼的治疗顺序(即分别为研究眼1[SE1]和研究眼2[SE2])，每个眼分配一个数字。所述分配与受试者合作完成；然而，通常选择先治疗较差的眼。SE1和SE2手术程序之间的目标间隔在筛选访视时确定。每个研究眼治疗后至少随诊12个月，每个治疗阶段至多9次访视：访视1(第0天，注射日访视)；访视2(第1天，手术后随诊访视)；访视3(第3天)；访视4(第7天)；访视5(第14天)；访视6(第1个月)；访视7(第3个月)；访视8(第6个月)和访视9(第12个月)。
在第1阶段的访视1(第0天，SE1注射日访视)，受试者的SE1进行玻璃体切除术和视网膜剥离且接受视网膜下注射AAV2-REP1。访视2至9根据研究程序的时间表进行，除非第2阶段在这段时间期间开始。在第1阶段期间访视2至9的眼科评估在双眼中执行。
在第2阶段的访视1(第0天，SE2注射日访视)，受试者的对侧、未治疗眼(SE2)进行玻璃体切除术和视网膜剥离并且视网膜下注射AAV2-REP1。受试者不再遵照第1阶段的访视时间表，而是根据研究程序的时间表进入第2阶段访视2至9。第2阶段的访视2至9排定的眼科评估将在双眼中执行。
在整个研究期间评估受试者的安全性和疗效；评估在研究程序的时间表中概述。发展出白内障的受试者可视临床需要而进行白内障手术。如果执行白内障手术，则在相应眼第12个月(访视9)之前至少4周进行。
主要终点是评价双侧施用AAV2-REP1之后的安全性。研究的次要终点包括如通过糖尿病视网膜病变早期治疗研究(ETDRS)表所测量的最佳矫正视力(BCVA)相较于基线的变化、自发荧光(AF)相较于基线的变化、频域光学相干断层扫描(SD-OCT)相较于基线的变化和微视野检查相较于基线的变化。
纳入标准：
在筛选访视时，如果受试者符合所有下列纳入标准，则有资格参与研究。纳入标准：(1)_愿意且能够签署参与双眼治疗研究的知情同意书、(2)男性且年龄≥18岁、(3)具有基因确诊的CHM、(4)双眼黄斑区内具有临床可见的活性疾病、(5)如果先前未接受AAV2-REP1治疗，双眼具有≥74个ETDRS字母的BCVA(相当于优于或等于6/9或20/32斯内伦(Snellen)、十进制数0.63、LogMar 0.2)，如果在替代研究中接受AAV2-REP1的先前治疗，则未治疗眼≥74个ETDRS字母(相当于优于或等于6/9或20/32斯内伦、十进制数0.63、LogMar0.2)。如果先前在替代研究中用AAV2-REP1治疗，则受试者在主办者核准之后可能有资格参与。
排除标准：
在筛选访视时，如果受试者符合任何下列排除标准则没有资格参与研究。排除标准：(1)任一个眼具有弱视或发炎性病症的病史；(2)不愿意在任一个眼用AAV2-REP1治疗之后的3个月期间使用屏障式避孕方法；(3)任一个眼在筛选访视3个月内曾接受先前眼内手术；(4)具有任何其他显著的眼或非眼疾病/病症，因此调查员认为可能使受试者因为参与研究而承受风险，或可能影响研究结果或受试者参与研究的能力；和(5)在过去12周已参与另一涉及调查产品的试验性研究或在先前任何时间接受基于基因/细胞的疗法，除非是在另一AAV2-REP1的研究中接受治疗。调查员认为可能使受试者因为参与研究而承受风险，或可能影响研究结果或受试者参与研究的能力的所述显著眼或非眼疾病/病症包括但不限于具有下列的潜在受试者：a)口服皮质类固醇(例如泼尼松龙/强的松)的禁忌症；b)任一个眼有临床显著的白内障；c)调查员临床认为不是适合进行视网膜下手术的候选者。
测试产品、剂量和施用模式：受试者的每一个眼将进行玻璃体切除术和视网膜剥离且接受体积0.1mL视网膜下注射含有1x 1011个AAV2-REP1基因组粒子的研究药物。
评价标准：安全性评价基于全面眼科检查(包括眼内压[IOP]、裂隙灯检查、晶状体混浊分级和散瞳眼底镜检查)；眼底摄影；不良事件(AE)报告；载体脱落(shedding)和免疫原性取样；和生命征象。
疗效：疗效评价基于BCVA(如通过ETDRS表所测量)、眼底自发荧光、SD-OCT和微视野检查。
统计学方法：未执行正式样品大小计算。连续变量使用叙述统计学随时间概述(即平均值、标准偏差、95％置信区间[CI]、中位数、Q1、Q3、P05、P95、最小值和最大值)。类别变量使用计数、百分比和95％CI随时间描述。概要按访视和眼制表。未执行正式统计检验。AE按系统器官分类、优选术语和眼概述。概述经历AE的受试者数和眼数两者以及事件数。将产生类似的研究药物/程序相关AE、导致停药的AE和严重AE的概要。AE还按最高严重性、与研究药物/程序的关系和开始和缓解时间概述。将描述载体脱落和免疫反应特性。剩余安全性评价使用叙述统计学分析。
CHM无法治愈且在发展本公开的药物组合物之前，治疗顶多为支持性。向本试验的受试者施用的药物组合物AAV2-REP1是AAV2粒子包封野生型人REP1基因的1.962kB互补脱氧核糖核酸(cDNA)。AAV2-REP1表达高水平的人REP1蛋白，恢复REP1至人CHM纤维母细胞，提供人CHM细胞的功能救援，在CHM小鼠视网膜体内表达蛋白质且当过度表达一个对数单位时无毒性。另外，过度表达人REP1蛋白不显著负面影响视网膜功能。
考虑到CHM影响双眼，本研究展示双侧AAV2-REP1施用。来自AAV2载体的非临床和临床研究的新生数据展示AAV2载体引发最小免疫反应，包括在双侧施用之后。本研究的目标在于提供AAV2-REP1的依序、双侧治疗的安全性和耐受性的重要洞见。
施用的治疗
有资格参与的受试者的每个眼进行玻璃体切除术和视网膜剥离。在第1阶段访视1(第0天，SE1注射日访视)，受试者的SE1接受体积0.1mL视网膜下注射含有1x 1011AAV2-REP1gp的研究药物。在第2阶段访视1(第0天，SE2注射日访视)，受试者的SE2接受相同视网膜下注射AAV2-REP1。
药物组合物的描述
AAV2载体含有编码REP1的重组人cDNA(AAV2-REP1)。载体基因组(AAV2-CBA-hREP1-WPRE-BGH)包含强烈组成性表达盒、杂交CBA启动子、编码REP1的人cDNA、修饰的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)序列和侧接AAV2反向末端重复的牛生长激素聚腺苷酸化(BGH-polyA)序列。cDNA片段原始分离自未受影响个体的人视网膜cDNA文库。
AAV2-REP1成品药配制于无菌、20mM Tris缓冲溶液pH 8.0且含有1mM MgCl2、200mM NaCl和0.001％PF68。成品药是透明至微乳光、无色、无菌过滤的悬浮液，目标浓度为1x 1012gp/mL。
AAV2-REP1供应在加塞且加盖的无菌小瓶中。总共供应0.3mL载体悬浮液给待治疗的每个眼。在运送之前，将每个小瓶放置在标记的二次容器中。成品药待储存在控制存取、温度监测的冷冻器中＜-60℃(＜-76℉)下。
玻璃体切除术程序和注射AAV2-REP1
注射AAV2-REP1由有适当资格和经验的视网膜外科医师执行。由于在CHM中剥离视网膜的复杂性和不可预测性(其中视网膜和脉络膜中多处可能极薄且融合)，已经发展了修改的视网膜下基因疗法技术。这涉及在玻璃体切除术后以2步骤执行载体递送。2步骤程序的优点在于可保守处理视网膜剥离的任何非预期并发症，最小化关于载体逃脱进入玻璃体的顾虑。另外，注射可延缓到较晚日期，如果例如产生需要用气体治疗的黄斑孔洞。此外，由于剥离凹所需的流体体积是可变的，通过去除来自第一步骤的载体，仍可将对基因组粒子而言精确一致的剂量施用到视网膜下空间。
起初，受试者的相应研究眼进行标准玻璃体切除术和后方玻璃状膜的剥离(图23)。所有手术都将使用标准BIOM玻璃体切除术系统进行。通常偏好23号规缝合方法以避免任何伤口渗漏的潜在风险。视网膜将用通过连接到玻璃体注射组的41号规视网膜下导管注射的0.1mL至0.5mL平衡盐溶液(BSS)剥离。单次剂量的AAV2-REP1将通过相同进入位点注射到视网膜下流体。
在程序的第二步骤中，自眼去除BSS导管且制备用于注射的AAV2-REP1。将一剂1.0x 1011AAV2-REP1 gp通过相同进入位点注射到视网膜下空间。载体需要在1mL注射器中预注(primed)以避免形成气泡，且使用接头以使1mL注射器可与玻璃体切除术机器的恒压管线连接。视网膜下注射将靶向任何黄斑区域，但可能的话还包括凹。在每一例中，注射载体以使视网膜下流体覆盖所有如眼底自发荧光所鉴别的尚未经历脉络膜视网膜退化的中央区域的边缘界线。在封闭伤口后，小心处置所有可能通过眼的灌洗流体以限制潜在载体扩散。
相伴疗法：
受试者不可在过去12周已参与另一涉及调查产品的试验性研究或在先前任何时间接受基于基因/细胞的疗法，除非是在另一AAV2-REP1的研究中接受治疗。在整个研究期间，调查员可能开立任何相伴药物处方或给予认为必要的治疗以提供适当支持护理。在筛选访视时收集相伴药物的详细数据且在每次研究访视(适用的话包括ET访视)时更新。在研究期间使用的相伴药物(包括口服皮质类固醇)应记录在受试者的病案和eCRF中；除外的是在进行研究程序过程中使用的任何药物(例如麻醉剂、散瞳眼药水)。
为了最小化手术所导致的发炎和对载体/转基因的潜在或非预期免疫反应，在每次手术之前将给予所有受试者21天疗程的口服强的松/泼尼松龙。因此，每次手术将为1mg/kg/天的强的松/泼尼松龙总共10天(始于载体注射之前2天、注射当天，然后7天)；随后0.5mg/kg/天共7天；0.25mg/kg/天共2天；和0.125mg/kg/天共2天(总共21天)。皮质类固醇使用的详细数据由每个受试者自行记载在日记卡上。
研究程序
在每次研究访视时，应尝试在双眼中执行所有程序。
筛选访视
调查员向每位潜在研究受试者解释研究目的、程序和受试者责任。筛选程序将由下列组成(所有眼科评估将在双眼中进行)：人口学、医学和眼科病史、生命征象、体重、载体脱落取样(血液、泪液(双眼)、尿液、唾液)、免疫原性取样(酶联免疫吸附测定[ELISA]和酶联免疫斑点法[ELISPOT])、BCVA、全面眼科检查(包括IOP、裂隙灯检查、晶状体混浊和散瞳眼底检查)、SD-OCT、自发荧光、微视野检查、7视野彩色眼底摄影(包括视野1、2和3的立体摄影)、严重AE(SAE)监测、用药回顾。
符合所有纳入标准且不符合任一排除标准的受试者将被分配一个受试者编号且入选到研究中。调查员分配眼治疗的顺序(即分别为SE1和SE2)。这将与受试者合作完成；然而，通常选择先治疗较差的眼。SE1和SE2手术程序之间的目标间隔在本次访视时确定。
对于每位受试者，SE1治疗与SE2治疗之间的间隔预期在数周至数月的范围。虽然所述间隔基于个案决定，但应尽量安排不同的治疗间隔时间表(例如相隔1、3或6+个月)以更佳地表征依序治疗施用的免疫学和安全性特性。
下一次研究访视(第1阶段访视1)排定在筛选访视的10周内。受试者将出席第1阶段访视2至9，除非第二手术访视(第2阶段访视1)开始，这将标志研究第2阶段的开始。鉴于第二手术访视(第2阶段访视1)的时间将随受试者而异，因此研究第1阶段的持续时间也将可变。
在第1阶段访视1(用于SE1)和第2阶段访视1(用于SE2)给予受试者两个21天疗程的口服皮质类固醇(例如泼尼松龙/强的松)且指导他们在下一次手术之前2天开始服用药物。将发放日记卡给受试者以记载每一21天期间的皮质类固醇依从性。指导受试者从他们接受治疗时起3个月期间使用屏障式避孕。
第1阶段和第2阶段的程序时间表相同；在每个阶段期间，将在SE1和SE2两者中进行程序。
如果受试者先前参与AAV2-REP1用于治疗CHM的临床试验且在一个眼接受AAV2-REP1，则未治疗眼将在筛选访视时被分配为SE2且受试者将直接进入第2阶段。
第1阶段和第2阶段，访视1(第0天，注射日访视)
在访视1(第0天，注射日访视)时执行下列评估：全面眼科检查(包括IOP、裂隙灯检查、晶状体混浊和散瞳眼底检查)、AE/SAE监测和相伴药物回顾(包括回顾皮质类固醇日记卡)。
受试者接着在他们的第一(SE1)眼中进行玻璃体切除术且接受体积0.1mL视网膜下注射AAV2-REP1(含有1x 1011gp)。
小心监测受试者在所述程序期间的AE发生。受试者在手术后1、3、7和14天回到试验中心进行手术后随诊(分别为访视2[第1天]、访视3[第3天]、访视4[第7天]和访视5[第14天])。
为了允许准确表征AAV2-REP1安全性和免疫原性特性，如果先前眼内手术在计划治疗日期的3个月内对相同眼执行，则不应发生SE2的治疗。如果眼内手术在3个月内发生，则SE2的治疗应延迟直到经过3个月间隔之时且眼完全术后恢复。
第1阶段和第2阶段，访视2(第1天手术后访视)
访视2对每一个眼执行眼科评估和程序。在访视2(第1天)时，受试者回到试验中心进行他们在访视1(第1阶段[SE1]或第2阶段[SE2])进行手术的相同眼的第一次手术后访视。执行下列评估：生命征象、载体脱落取样(血液、泪液(双眼)、尿液、唾液)、免疫原性取样(ELISA和ELISPOT)、BCVA、全面眼科检查(包括IOP、裂隙灯检查、晶状体混浊和散瞳眼底检查)、SD-OCT、AE/SAE监测、用药回顾(包括回顾皮质类固醇日记卡)。
第1阶段和第2阶段，访视3(第3天)
访视3(第3天)对每一个眼执行眼科评估和程序。在访视3(第3天)时，受试者回到试验中心进行他们在访视1(第1阶段[SE1]或第2阶段[SE2])进行手术的相同眼的第二次手术后访视。将执行下列评估：生命征象、载体脱落取样(血液、泪液(双眼)、尿液、唾液)、BCVA、全面眼科检查(包括IOP、裂隙灯检查、晶状体混浊和散瞳眼底检查)、AE/SAE监测和用药回顾(包括回顾皮质类固醇日记卡)。
第1阶段和第2阶段，访视4(第7天)
访视4(第7天±1天)对每一个眼执行眼科评估和程序。在访视4(第7天±1天)时，受试者回到试验中心进行他们在访视1(第1阶段[SE1]或第2阶段[SE2])进行手术的相同眼的第三次手术后访视。将执行下列评估：生命征象、载体脱落取样(血液、泪液(双眼)、尿液、唾液)、免疫原性取样(ELISA和ELISPOT)、BCVA、全面眼科检查(包括IOP、裂隙灯检查、晶状体混浊和散瞳眼底检查)、SD-OCT、自发荧光、AE/SAE监测和用药回顾(包括回顾皮质类固醇日记卡)。
第1阶段和第2阶段，访视5(第14天)
访视5(第14天±3天)对每一个眼执行眼科评估和程序。在访视5(第14天±3天)时，受试者回到试验中心进行他们在访视1(第1阶段[SE1]或第2阶段[SE2])进行手术的相同眼的第四次手术后访视。将执行下列评估：生命征象、载体脱落取样(血液、泪液(双眼)、尿液、唾液)、免疫原性取样(ELISA和ELISPOT)、BCVA、全面眼科检查(包括IOP、裂隙灯检查、晶状体混浊和散瞳眼底检查)、SD-OCT、自发荧光、AE/SAE监测和用药回顾(包括回顾皮质类固醇日记卡)。
第1阶段和第2阶段，访视6(第1个月)和访视7(第3个月)
访视6(第1个月±7天)和访视7(第3个月±14天)将对于每一个眼执行眼科评估和程序。执行下列评估：生命征象、载体脱落取样(血液、泪液(双眼)、尿液、唾液)、免疫原性取样(ELISA和ELISPOT)、BCVA、全面眼科检查(包括IOP、裂隙灯检查、晶状体混浊和散瞳眼底检查)、SD-OCT、自发荧光、微视野检查、AE/SAE监测和用药回顾(包括回顾和收回皮质类固醇日记卡)。
第1阶段和第2阶段，访视8(第6个月)和访视9(第12个月)
访视8(第6个月±14天)和访视9(第12个月±14天)对每一个眼执行眼科评估和程序。执行下列评估：生命征象(仅访视9，第12个月)、免疫原性取样(ELISA和ELISPOT)、BCVA、全面眼科检查(包括IOP、裂隙灯检查、晶状体混浊和散瞳眼底检查)、SD-OCT、自发荧光、微视野检查、
视野彩色眼底摄影(包括视野1、2和3的立体摄影)(仅访视9，第12个月)、AE/SAE监测和用药回顾。
提前终止
如果受试者在任何时间中止研究，试验中心应穷尽所有合理努力确保进行ET访视。应执行下列评估(所有眼科评估都将对双眼进行)：生命征象、载体脱落取样(血液、泪液(双眼)、尿液、唾液(只有在ET访视发生在治疗后3个月内的情况下))、免疫原性取样(ELISA和ELISPOT)、BCVA、全面眼科检查(包括IOP、裂隙灯检查、晶状体混浊和散瞳眼底检查)、SD-OCT、自发荧光、微视野检查、7视野彩色眼底摄影(包括视野1、2和3的立体摄影)、AE/SAE监测和用药回顾。
不良事件
AE是临床调查受试者的任何不良医学事件，所述事件不一定与研究药物/手术程序具有因果关系。因此，AE可为时间上与使用研究药物/手术程序相关的任何不利且非预期的征象(包括异常实验室发现)、症状或疾病，不论是否与调查产品或本协议中描述的手术程序有关。AE还包括在研究期间恶化(即频率或强度增加)的任何既有病况(除CHM以外)或疾病。
严重不良事件
SAE定义为下列的任何不良医学事件：导致死亡、危及生命、需要住院或延长目前的住院、导致持续或显著失能/无能力、先天异常/先天缺陷、导致视力丧失或危及视力、另一种或多种重要医学事件。“严重”定义中的术语“危及生命”是指受试者在事件发生时有死亡风险的事件。其并不是指如果更为严重，则理论上可能造成死亡的事件。因既有病况住院(包括选择性手术)但未恶化者不构成SAE。当其他不导致死亡、不危及生命或不需要住院的事件基于适当医学判断可能危害受试者且可能需要医学或手术介入以预防上列结果之一时，所述事件可视为SAE。
下列视力丧失或危及视力事件应被报告为SAE：相较于基线，VA持续降低≥15个ETDRS表上的字母，手术相关事件除外。持续定义为恢复前维持48小时或更久；恢复定义为VA回到基线VA的5个字母内。
手术相关VA降低事件定义为VA降低的发生与手术施用研究药物具有密切时间相关性(＜24小时内)且在手术后第7天(第1/2阶段，访视4)缓解。这些事件不应被报告为AE或SAE。然而，如果调查员认为这些事件就持续时间或严重性的演变无法用程序解释，则应被报告为AE。这将包括但不限于其中异常的手术后VA降低过程是与另一可归因于手术或研究药物的并发症相关或其中异常的手术后VA降低过程可归因于另一可鉴别原因的案例。调查员认为AE实际上或潜在性需要任何手术或医学介入以预防永久视力丧失。
实验室评估
载体脱落
收集血液、泪液(双眼)、尿液和唾液样品且使用适当测定测试载体脱落和分散的证据。
免疫原性
为了评价免疫原性，将在表61(研究程序的时间表)中所指示的时间收集血液。计划免疫测定以评估基于抗体和细胞的对抗AAV2-REP1的反应。将使用ELISPOT测定对转基因的T细胞介导免疫反应且将使用基于ELISA的方法测定抗体反应。
生命征象
生命征象(脉搏、收缩压和舒张压)将在表61(研究程序的时间表)中所指示的时间测量。生命征象应在受试者坐下至少5分钟后测量。
全面眼科检查
将在表61(研究程序的时间表)中所指示的时间执行双眼的全面眼科检查。每次眼科检查将包括IOP、裂隙灯检查、晶状体混浊分级和散瞳眼底镜检查。任何给定受试者的研究访视都应使用相同的裂隙灯机器和照明条件。除了上列参数之外，小心检查受试者在载体施用后是否有眼内发炎存在。白内障还可因玻璃体切除术程序发展且可潜在地影响VA。因此，应记载手术前的晶状体混浊和颜色分级。发展出白内障的受试者可视临床需要而进行白内障手术。如果执行白内障手术，则应在对应眼第12个月(访视9)之前至少4周进行。
7视野彩色眼底摄影
将在表61(研究程序的时间表)中所指示的时间执行七视野彩色眼底摄影。眼底摄影将在散瞳之后由认证技术人员执行。应执行视野1、2和3的立体摄影。试验中心应将所有眼底相片寄送到中央阅读中心(CRC)进行审查；CRC将输入数据到电子数据采集(EDC)系统。有关眼底摄影的完整技术规格，请参照研究操作手册(其将包括关于如何取得测量值的CRC程序)。
疗效评估
视敏度
为了评价视敏度(VA)在研究期间的变化，使用ETDRS VA表在表61(研究程序的时间表)中所指示的时间执行双眼的BCVA评估。BCVA测试应在散瞳之前执行，且在测量BCVA之前应进行远距屈光(distance refraction)。起初，在距离表4米处阅读字母。如果在4米处读出＜20个字母，则应执行在1米处的测试。BCVA应报告为受试者准确读出的字母数。BCVA评估者将为具有进行评估的适当资格者。
眼底自发荧光
为了评估存活视网膜组织的区域的变化，在表61(研究程序的时间表)中所指示的时间对双眼执行眼底自发荧光。
频域光学相干断层扫描(SD-OCT)
在表61(研究程序的时间表)中所指示的时间对双眼执行SD-OCT。SD-OCT用于量化椭圆体带的完整性以及来自外核层和脉络膜的信号的减少。此外，评估凹变化。
微视野检查
在表61(研究程序的时间表)中所指示的时间对双眼进行微视野检查。进行微视野检查以评估黄斑内视网膜敏感度的变化。
实施例15：Star研究
本研究是开放标签、结果评估者加盲、前瞻性、随机分组、平行对照组、多中心、全球、介入性研究。所述研究由8次访视和12个月评价期组成。在筛选/基线访视时，评估每位受试者的参与资格。分配有资格参与受试者的研究眼，且受试者以2:1:2比随机分组以接受AAV2-REP1高剂量(1.0x 1011个基因组粒子[gp])、AAV2-REP1低剂量(1.0x 1010gp)或进入未治疗对照组。
在注射日访视(访视2，第0天)时，AAV2-REP1高和低剂量治疗组的受试者进行玻璃体切除术且以双盲方式接受研究眼视网膜下注射分配的治疗剂量的AAV2-REP1；这些受试者接着在第1天(访视3)和第7天(访视4)回到试验中心进行2次手术后随诊访视。对照组的受试者不进行手术，他们的研究眼(即对照研究眼)不接受任何研究药物也不出席2次试验中心的手术后访视。相反地，试验中心在第0天(访视2)、第1天(访视3)和第7天(访视4)以电话联系对照组。自访视2(第0天)起随诊所有受试者12个月。
收集每位受试者的双眼的研究数据。由于AAV2-REP1治疗需要在全身麻醉下进行侵入性手术程序，因此并未对主办者、调查员和受试者进行研究程序(即玻璃体切除术和视网膜下注射)的加盲，然而在治疗组内，对主办者、调查员和受试者加盲分配的剂量(1.0x1011gp或1.0x 1010gp)。为了进一步最小化治疗眼和未治疗眼评价的潜在偏差，所有筛选/基线访视(访视1)和自第1个月(访视5)以后(包括第12个月主要终点评价)的主观眼科评估都将由加盲评估者进行。
在整个研究期间如研究程序的时间表中所指示评估受试者的疗效和安全性。发展出白内障的受试者可视临床需要进行白内障手术；如果执行手术，则应在第12个月访视/研究结束(EOS)访视之前至少4周进行。
受试者
大约140位受试者以2:1:2比随机分组；AAV2-REP1高剂量(1.0x 1011gp)组56位受试者、AAV2-REP1低剂量(1.0x 1010gp)组28位受试者且未治疗对照组56位受试者。
纳入标准：如果受试者符合所有下列纳入标准，则有资格参与研究：(1)愿意且能够签署参与双眼治疗研究的知情同意书、(2)男性且年龄≥18岁、(3)具有基因确诊的CHM、(4)研究眼黄斑区内具有临床可见的活性疾病、(5)研究眼具有34至73个ETDRS字母的BCVA(相当于劣于或等于6/12或20/40斯内伦敏度，但优于或等于6/60或20/200斯内伦敏度)。
排除标准：如果受试者符合任何下列排除标准则没有资格参与研究：(1)符合资格的眼具有弱视病史；(2)如果用AAV2-REP1治疗，不愿意在3个月期间使用屏障式避孕方法；(3)研究眼在访视1的3个月内执行先前眼内手术；(4)具有任何其他显著的眼或非眼疾病/病症，因此调查员认为可能使受试者因为参与研究而承受风险、或可能影响研究结果或受试者参与研究的能力(包括但不限于口服皮质类固醇(例如泼尼松龙/强的松)的禁忌症、有临床显著的白内障、调查员临床认为不是适合进行视网膜下手术的候选者)；和(5)在过去12周已参与另一涉及调查产品的试验性研究或在先前任何时间接受基于基因/细胞的疗法。
测试产品、剂量和施用模式：所有接受活性治疗的受试者在他们的研究眼进行玻璃体切除术且接受体积0.1mL视网膜下注射含有高剂量(1.0x 1011gp)AAV2-REP1或低剂量(1.0x 1010gp)AAV2-REP1的研究药物。
评价标准：
主要疗效终点是在第12个月通过糖尿病视网膜病变早期治疗研究(ETDRS)表所测量的最佳矫正视力(BCVA)相较于基线改善≥15个字母的受试者比例。关键次要终点是当相较于BCVA在12个月内的变化时第12个月的BCVA相较于基线改善≥15个字母的受试者比例。其他次要终点包括：(1)第12个月的BCVA相较于基线增加＞10个字母的受试者比例；(2)在第4、第8和第12个月所收集的BCVA相较于基线的平均变化的平均；(3)第12个月保留自发荧光(AF)总面积相较于基线的变化；(4)第12个月保留椭圆体带面积(频域光学相干断层扫描[SD-OCT])相较于基线的变化；(5)第12个月微视野检查相较于基线的变化；(6)第12个月对比敏感度分数相较于基线的变化；(7)第12个月色视觉相较于基线的变化；(8)第12个月阅读速度测试相较于基线的变化；(9)第12个月通过ETDRS表测量的BCVA维持；(10)第12个月25项视力功能问卷(VFQ-25)相较于基线的变化。探察性疗效终点包括其他解剖学和功能性结果测量的评价。安全性终点包括安全性评估的评价，包括不良事件(AE)。
疗效：疗效评价基于BCVA、眼底AF、SD-OCT、微视野检查、对比敏感度、色视觉、阅读速度测试评估、VFQ-25和低亮度视敏度(LLVA)。
安全性：安全性评价基于全面眼科检查(包括眼内压、裂隙灯检查、晶状体混浊分级和散瞳眼底镜检查)、眼底摄影、AE报告、免疫原性和生命征象。因疗效评估(例如BCVA)所收集的任何安全性信息适当地用于总体安全性评估。
研究设计
图24提供本研究设计的示意图。
在筛选/基线访视(访视1)时，评估每位受试者双眼的参与资格。如果受试者仅具有1个符合资格的眼，则所述眼被指定为“研究眼”且受试者的另一(无参与资格)眼被指定为“对侧眼”。如果受试者具有2个符合资格的眼，则“研究眼”的选择根据临床理由作出且通常是受到较严重影响的眼。所述决定作为知情同意过程的一部分与每位受试者详细讨论并且经其同意。如果双眼之间的退化相对对称，则考虑受试者选择。
在筛选/基线访视时，有资格参与的受试者将以2:1:2比随机分组到AAV2-REP1高剂量组(1.0x 1011gp)、AAV2-REP1低剂量组(1.0x 1010gp)或未治疗对照组。为了促进对研究设计的了解，基于治疗组分配和研究/对侧眼的指定，将眼分成4类：AAV2-REP1研究眼(包括高和低剂量)；AAV2-REP1对侧眼(包括高和低剂量)；对照研究眼；和对照对侧眼。
在注射日访视(访视2，第0天)时，AAV2-REP1治疗组的受试者进行玻璃体切除术和视网膜剥离，然后以双盲方式接受研究眼(即AAV2-REP1研究眼)视网膜下注射AAV2-REP1高剂量(1.0x 1011gp)或AAV2-REP1低剂量(1.0x 1010gp)；这些受试者接着在第1天(访视3)和第7天(访视4)回到试验中心进行2次手术后随诊访视。对照组的受试者不进行手术、不接受研究药物也不出席2次试验中心的安全性手术后访视。相反地，试验中心在第0天(访视2)、第1天(访视3)和第7天(访视4)以电话联系对照组。自访视2(第0天)起随诊所有受试者12个月。
收集每位受试者双眼的研究数据。由于AAV2-REP1治疗需要在全身麻醉下进行侵入性手术程序，因此并未对主办者、调查员和受试者进行研究程序(即玻璃体切除术和视网膜下注射)的加盲，然而在治疗组中，对主办者、调查员和受试者加盲(即双盲)分配的剂量(1.0x 1011gp或1.0x 1010gp)。为了进一步最小化治疗眼和非治疗眼评价的潜在偏差，所有筛选/基线访视(访视1)和自第1个月(访视5)以后的主观眼科评估由加盲的评估者进行。在整个研究期间评估受试者的疗效和安全性。疗效评价基于BCVA、眼底AF、SD-OCT、微视野检查、对比敏感度、色视觉、阅读速度测试、VFQ-25和低亮度视敏度(LLVA)。安全性评价基于全面眼科检查(包括眼内压[IOP]、裂隙灯检查、晶状体混浊分级和散瞳眼底镜检查)、眼底摄影、不良事件(AE)报告、实验室评估(免疫原性)和生命征象。因疗效评估(例如BCVA)所收集的任何安全性信息适当地用于总体安全性评估。
发展出白内障的受试者可视临床需要而进行白内障手术；如果执行手术，则应在第12个月访视/研究结束(EOS)访视(主要终点)之前至少4周进行。
如果受试者完成第12个月评估，则被视为已完成研究。试验结束是最后一位受试者完成他的第12个月评估(或如果过早停药的提前终止[ET]评估)的日期，或如果最后一位受试者失去随诊，则为最后一次数据收集的日期。在研究完成之后，邀请治疗的受试者参与长期随诊研究，容许在治疗后5年期间进行持续疗效和安全性监测。
施用的治疗
在筛选/基线访视时，有资格参与的受试者以2:1:2比随机分组以接受AAV2-REP1低剂量(1.0x 1010gp)或AAV2-REP1高剂量(1.0x 1011gp)，而未治疗对照组的受试者不接受虚假手术或研究药物。在注射日访视(访视2，第0天)时，AAV2-REP1在AAV2-REP1组的受试者进行玻璃体切除术之后作为视网膜下注射施用。
药物组合物的描述
AAV2载体含有编码REP1的重组人cDNA(AAV2-REP1)。载体基因组(AAV2-CBA-hREP1-WPRE-BGH)包含强烈组成性表达盒、杂交CBA启动子、编码REP1的人cDNA、修饰的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)序列和侧接AAV2反向末端重复的牛生长激素聚腺苷酸化(BGH-polyA)序列。cDNA片段原始分离自未受影响个体的人视网膜cDNA文库。
AAV2-REP1成品药配制于无菌、20mM Tris缓冲溶液pH 8.0且含有1mM MgCl2、200mM NaCl和0.001％PF68。成品药是透明至微乳光、无色、无菌过滤的悬浮液，目标浓度为1x 1012gp/mL。
AAV2-REP1供应在加塞且加盖的无菌小瓶中。总共供应0.3mL载体悬浮液给待治疗的每个眼。在运送之前，将每个小瓶放置在标记的二次容器中。成品药待储存在控制存取、温度监测的冷冻器中＜-60℃(＜-76℉)下。
玻璃体切除术程序和注射AAV2-REP1
注射AAV2-REP1由有适当资格和经验的视网膜外科医师执行。由于在CHM中剥离视网膜的复杂性和不可预测性(其中视网膜和脉络膜中多处可能极薄且融合)，已经发展了修改的视网膜下基因疗法技术。这涉及在玻璃体切除术后以2步骤执行载体递送。2步骤程序的优点在于可保守处理视网膜剥离的任何非预期并发症，最小化关于载体逃脱进入玻璃体的顾虑。另外，注射可延缓到较晚日期，如果例如产生需要用气体治疗的黄斑孔洞。此外，由于剥离凹所需的流体体积是可变的，通过去除来自第一步骤中的载体，仍可将对基因组粒子而言精确一致的剂量施用到视网膜下空间。
起初，受试者的相应研究眼进行标准玻璃体切除术和后方玻璃状膜的剥离(图23)。所有手术都将使用标准BIOM玻璃体切除术系统进行。通常偏好23号规缝合方法以避免任何伤口渗漏的潜在风险。视网膜将用通过连接到玻璃体注射组的41号规视网膜下导管注射的0.1mL至0.5mL平衡盐溶液(BSS)剥离。单次剂量的AAV2-REP1将通过相同进入位点注射到视网膜下流体。
在程序的第二步骤中，自眼去除BSS导管且制备用于注射的AAV2-REP1。将一剂1.0x 1011AAV2-REP1 gp通过相同进入位点注射到视网膜下空间。载体需要在1mL注射器中预注以避免形成气泡，且使用接头以使1mL注射器可与玻璃体切除术机器的恒压管线连接。视网膜下注射将靶向任何黄斑区域，但可能的话还包括凹。在每一例中，注射载体以使视网膜下流体覆盖所有如眼底自发荧光所鉴别的尚未经历脉络膜视网膜退化的中央区域的边缘界线。在封闭伤口后，小心处置所有可能通过眼的灌洗流体以限制潜在载体扩散。
随机分组
在筛选/基线访视时，所有患者都被分配筛选鉴别符，其包括中心编号和受试者编号。如果受试者在筛选/基线访视时符合所有资格标准，则分配研究眼，且受试者以2:1:2比随机分组以接受AAV2-REP1高剂量(1.0x 1011gp)、AAV2-REP1低剂量(1.0x 1010gp)或进入未治疗对照组。随机分组使用验证的系统产生，所述系统将治疗组的随机分配自动化为随机分组编号且依手术组分层。
相伴疗法：
受试者不可在过去12周已参与另一涉及调查产品的试验性研究或在先前任何时间接受基于基因/细胞的疗法，除非是在另一AAV2-REP1的研究中接受治疗。在整个研究期间，调查员可能开立任何相伴药物处方或给予认为必要的治疗以提供适当支持护理。在筛选访视时收集相伴药物的详细数据且在每次研究访视(适用的话包括ET访视)时更新。在研究期间使用的相伴药物(包括口服皮质类固醇)应记录在受试者的病案和eCRF中；除外的是在进行研究程序过程中使用的任何药物(例如麻醉剂、散瞳眼药水)。
为了最小化手术所导致的发炎和对载体/转基因的潜在或非预期免疫反应，在每次手术之前将给予所有受试者21天疗程的口服强的松/泼尼松龙。因此，每次手术将为1mg/kg/天的强的松/泼尼松龙总共10天(始于载体注射之前2天、注射当天，然后7天)；随后0.5mg/kg/天共7天；0.25mg/kg/天共2天；和0.125mg/kg/天共2天(总共21天)。皮质类固醇使用的详细数据由每个受试者自行记载在日记卡上。
研究访视和程序
研究程序的时间表呈现在表62中：研究程序的时间表。
访视1(筛选/基线访视)
调查员向每位潜在研究受试者解释研究目的、程序和受试者责任。确定受试者符合协议要求的意愿和能力。
获得知情同意书之后，分配受试者鉴别别符编号给受试者且评价以确定参与资格。筛选/基线程序由下列组成(如果有需要，则可将评估分散在连续2天)：人口学、医学和眼科病史(只有具有基因确诊的CHM的受试者可进入研究。基因确认必须在访视1之前取得)；生命征象；体重；免疫测定取样(酶联免疫吸附测定[ELISA]和酶联免疫斑点法[ELISPOT])；BCVA；LLVA；全面眼科检查，包括IOP、裂隙灯检查、晶状体混浊和散瞳眼底检查；SD-OCT；AF；微视野检查；对比敏感度测试；色视觉测试；7视野彩色眼底摄影(包括视野1、2和3的立体摄影)；阅读速度测试(适用的话)；VFQ-25；严重AE(SAE)监测；用药回顾；和发放皮质类固醇(如果随机分组到AAV2-REP1组)。为了在访视1(筛选/基线)捕获准确的BCVA值，BCVA评估采用下列条件：如果研究眼在访视1(筛选/基线)的BCVA值相较于先前NIGHT研究访视(适用的话)≥±10个字母增加或丧失，则必须再重复BCVA 2次，导致在访视1总共3次BCVA测量。为了促进额外BCVA测量，所述访视应在2天进行，在第1天测量BCVA两次和第2天测量一次(在散瞳之前)。所有3个BCVA值必须记录在eCRF中。使用最高分数决定受试者的参与资格。如果研究眼在访视1(筛选/基线)的BCVA值相较于先前NIGHT研究访视＜±10个字母差异，则收集一次的BCVA且不再重复。
符合所有纳入标准且不符合任一排除标准的受试者被分配一个研究眼且入选到研究中。此时，告知受试者随机分组结果(即AAV2-REP1治疗或对照组)且指导他们在研究期间不将治疗组分配揭示给加盲的评估者。随机分组到AAV2-REP1治疗组的受试者(连同调查员和主办者)保持对分配的剂量加盲。
下一次研究访视(访视2)排定在筛选/基线访视的8周内。给予随机分组到AAV2-REP1组的受试者21天疗程的口服皮质类固醇(例如泼尼松龙/强的松)且指导他们在下一次研究访视(访视2)之前2天开始服用药物。指导随机分组到AAV2-REP1组的受试者从他们接受治疗时起3个月期间使用屏障式避孕。
如果受试者随机分组到对照组，则访视2由电话联系组成。
访视2(第0天，注射日访视或电话联系)
在访视2(第0天)时，所有AAV2-REP1组的受试者将到手术试验中心且执行下列评估：全面眼科检查，包括IOP、裂隙灯检查、晶状体混浊和散瞳眼底检查；AE/SAE监测；相伴药物回顾；和皮质类固醇依从性回顾。
AAV2-REP1组的受试者在他们的研究眼进行玻璃体切除术且接受含有AAV2-REP1低剂量(1x 1010vg)或AAV2-REP1高剂量(1x 1012vg)的AAV2-REP1视网膜下注射。小心监测受试者在程序期间的AE发生。受试者在手术后1天和7天回到试验中心进行手术后随诊(分别为访视3[第1天]和访视4[第7天])。
对照组的受试者在同意的日期和时间接受研究访视电话联系。试验中心在电话联系期间进行下列评估：AE/SAE监测和相伴药物回顾。
访视3(第1天手术后访视)
在访视3(第1天)时，AAV2-REP1组的受试者回到手术试验中心进行手术后访视。执行下列评估：生命征象；免疫测定取样(仅ELISA)；BCVA；全面眼科检查，包括IOP、裂隙灯检查、晶状体混浊和散瞳眼底检查；SD-OCT；AE/SAE监测；用药回顾；和皮质类固醇依从性回顾。提醒受试者从治疗时起3个月期间使用屏障式避孕的要求。
对照组的受试者在同意的日期和时间接受研究访视电话联系。试验中心在电话联系期间进行下列评估：AE/SAE监测和相伴药物回顾。
访视4(第7天手术后访视±3天)
在访视4(第7天±3天)时，AAV2-REP1组的受试者回到他们的主试验中心(即执行他们的访视1筛选/基线访视的相同试验中心)进行第二次手术后访视。然而，对于那些从非手术试验中心前往手术试验中心的受试者，并且如果发生手术后并发症或任何其他研究外科医师和手术试验中心调查员认为适当的安全性理由，访视4可在手术试验中心进行。在这种情况下，手术后随诊应持续在手术试验中心进行，直到外科医师/手术试验中心调查员同意让受试者出院到非手术试验中心接受护理。执行下列评估：生命征象；免疫测定取样(ELISA和ELISPOT)；BCVA；LLVA；全面眼科检查，包括IOP、裂隙灯检查、晶状体混浊和散瞳眼底检查；SD-OCT；AF；微视野检查；AE/SAE监测；用药回顾；和皮质类固醇依从性回顾。
对照组的受试者在同意的日期和时间接受研究访视电话联系。试验中心在电话联系期间进行下列评估：AE/SAE监测和相伴药物回顾。
访视5(第1个月±7天)
所有受试者从访视5以后出席他们的主试验中心(即执行他们的访视1筛选/基线访视的相同试验中心)。在访视5(第1个月±7天)时，所有受试者执行下列评估(如果有需要，则可将评估分散在连续2天)：生命征象；免疫测定取样(ELISA和ELISPOT)；BCVA；LLVA；全面眼科检查，包括IOP、裂隙灯检查、晶状体混浊和散瞳眼底检查；SD-OCT；AF；微视野检查；AE/SAE监测；用药回顾；皮质类固醇依从性回顾。
访视6(第4个月±7天)
在访视6(第4个月±7天)时，执行下列评估(如果有需要，则可将评估分散在连续2天)：免疫测定取样(ELISA和ELISPOT)；BCVA；LLVA；全面眼科检查，包括IOP、裂隙灯检查、晶状体混浊和散瞳眼底检查；SD-OCT；AF；微视野检查；对比敏感度测试；色视觉测试；AE/SAE监测和用药回顾。
访视7(第8个月±14天)
在访视7(第8个月±14天)时，执行下列评估(如果有需要，则可将评估分散在连续2天)：BCVA；LLVA；全面眼科检查，包括IOP、裂隙灯检查、晶状体混浊和散瞳眼底检查；SD-OCT；AF；微视野检查；对比敏感度测试；色视觉测试；AE/SAE监测和用药回顾。
访视8(第12个月±14天，研究结束访视)
在访视8(第12个月±14天)时，执行下列评估(如果有需要，则可将评估分散在连续2天)：生命征象；BCVA；LLVA；全面眼科检查，包括IOP、裂隙灯检查、晶状体混浊和散瞳眼底检查；SD-OCT；AF；微视野检查；对比敏感度测试；色视觉测试；7视野彩色眼底摄影(包括视野1、2和3的立体摄影)；阅读速度测试(适用的话)；VFQ-25；AE/SAE监测和用药回顾。
提前终止访视
如果受试者在任何时间中止研究，试验中心应穷尽所有合理努力确保进行ET访视。应执行下列评估：生命征象；免疫测定取样(ELISA和ELISPOT)，如果ET访视发生在第4个月内；BCVA；LLVA；全面眼科检查，包括IOP、裂隙灯检查、晶状体混浊和散瞳眼底检查；SD-OCT；AF；微视野检查；对比敏感度测试；色视觉测试；7视野彩色眼底摄影(包括视野1、2和3的立体摄影)；阅读速度测试(适用的话)；VFQ-25；AE/SAE监测和用药回顾。
疗效评估
对于所有访视，应尝试在双眼中执行所有程序。
最佳矫正视力
为了评价视敏度(VA)在研究期间的变化，使用ETDRS VA表在表62：研究程序的时间表中所指示的时间执行双眼的BCVA评估。BCVA检查应在散瞳之前执行，且在测量BCVA之前应进行远距屈光。起初，在距离表4米处阅读字母。如果在4米处读出＜20个字母，则应执行在1米处的测试。BCVA应报告为受试者准确读出的字母数。在筛选/基线访视时，具有34至73个ETDRS字母的BCVA(相当于劣于或等于6/12或20/40斯内伦敏度，但优于或等于6/60或20/200斯内伦敏度)的眼将有资格参与研究。如果受试者无法读出BCVA表上的任何字母，则测试受试者的手指计数、手移动或光感知。
眼底自发荧光
为了评估存活视网膜组织的区域的变化，在表62：研究程序的时间表中所指示的时间执行双眼的眼底AF。所有眼底AF影像由试验中心的认证技术人员在受试者散瞳之后执行。
频域光学相干断层扫描(SD-OCT)
将在表2：研究程序的时间表中所指示的时间执行双眼的SD-OCT。SD-OCT测量由试验中心的认证技术人员在受试者散瞳之后进行。SD-OCT用于评估一些变量，包括量化椭圆体带的完整性和来自外核层和脉络膜的信号的减少。此外，由于已经在早期阶段的CHM注意到进行性凹变厚，因此评估凹变化。
微视野检查
在表62：研究程序的时间表中所指示的时间进行双眼的微视野检查。微视野检查由认证技术人员进行以评估黄斑内视网膜敏感度的变化。
对比敏感度
在表62：研究程序的时间表中所指示的时间测量双眼的对比敏感度。对比敏感度在散瞳之前使用Pelli-Robson表测量。
色视觉
在表62：研究程序的时间表中所指示的时间在散瞳之前测试双眼的色视觉。每次评估以相同顺序分开测试眼。
低亮度视敏度
在表62：研究程序的时间表中所指示的时间测量双眼的LLVA。本测试应在BCVA测试之后、在散瞳之前执行，且在测量LLVA之前应进行远距屈光。LLVA通过在每个眼前方放置2.0对数单位中性密度滤光器并使受试者阅读正常光照的ETDRS表来测量。起初，在距离表4米处阅读字母。如果在4米处读出＜20个字母，则应执行在1米处的测试。LLVA报告为受试者准确读出的字母数。
阅读速度测试
阅读性能将在表62：研究程序的时间表中所指示的时间在散瞳之前使用国际阅读速度文字(IReST)评价，其提供17种语言的阅读性能标准化评估(Trauzettel-Klosinski等，2012)。
VFQ-25问卷
受试者在表62：研究程序的时间表中所指示的时间完成VFQ-25。所述问卷测量对眼疾人士而言最重要的自我报告视力靶向性健康状态维数(Mangione等，2001)。VFQ-25的改善使用个别分数、子量表分数和总体复合分数评价。
安全性评估
全面眼科检查
在表62：研究程序的时间表中所指示的时间进行双眼的全面眼科检查。针对AAV2-REP1组的受试者，全面眼科检查在适用的研究访视在玻璃体切除术和施用研究药物之前进行。眼科检查将包括IOP、裂隙灯检查、晶状体混浊分级和散瞳眼底镜检查。任何给定受试者的研究访视都应使用相同的裂隙灯机器和照明条件。
除了上列参数之外，小心检查相关受试者在载体施用后是否有眼内发炎存在。白内障还可因玻璃体切除术程序发展且可潜在地影响VA。因此，应通过已建立的临床晶状体混浊分类系统记载手术前的晶状体混浊和颜色分级。白内障手术在CHM受试者中是有效的且无任何特定风险。因此，如果临床需要，则发展出白内障的受试者可进行白内障手术。如果执行白内障手术，则应在第12个月访视/EOS访视之前至少4周进行。
视野彩色眼底摄影
为了协助客观临床评估进行性视网膜变化，在表62：研究程序的时间表中所指示的时间执行双眼的7视野彩色眼底摄影。眼底摄影由认证技术人员在散瞳之后执行。应执行视野1、2和3的立体摄影。
不良事件
AE是临床调查受试者的任何不良医学事件，所述事件不一定与研究药物/手术程序具有因果关系。因此，AE可为时间上与使用研究药物/手术程序相关的任何不利且非预期的征象(包括异常实验室发现)、症状或疾病，不论是否与调查产品或本协议中描述的手术程序有关。AE还包括在研究期间恶化(即频率或强度增加)的任何既有病况(除CHM以外)或疾病。
严重不良事件
SAE定义为下列的任何不良医学事件：导致死亡、危及生命、需要住院或延长目前的住院、导致持续或显著失能/无能力、先天异常/先天缺陷、导致视力丧失或危及视力、另一种或多种重要医学事件。“严重”定义中的术语“危及生命”是指受试者在事件发生时有死亡风险的事件。其并不是指如果更为严重，则理论上可能造成死亡的事件。因既有病况住院(包括选择性手术)但未恶化者不构成SAE。当其他不导致死亡、不危及生命或不需要住院的事件基于适当医学判断可能危害受试者且可能需要医学或手术介入以预防上列结果之一时，所述事件可视为SAE。
下列视力丧失或危及视力事件应被报告为SAE：相较于基线，VA持续降低≥15个ETDRS表上的字母，手术相关事件除外。持续定义为恢复前维持48小时或更久；恢复定义为VA回到基线VA的5个字母内。
手术相关VA降低事件定义为VA降低的发生与手术施用研究药物具有密切时间相关性(＜24小时内)且在手术后第7天(第1/2阶段，访视4)缓解。这些事件不应被报告为AE或SAE。然而，如果调查员认为这些事件就持续时间或严重性的演变无法用程序解释，则应被报告为AE。这将包括但不限于其中异常的手术后VA降低过程与另一可归因于手术或研究药物的并发症相关或其中异常的手术后VA降低过程可归因于另一可鉴别原因的案例。调查员认为AE实际上或潜在性需要任何手术或医学介入以预防永久视力丧失。
疗效分析
统计检验以0.05的α水平执行(除非另外指明)。统计检验和95％CI将是双边的。
主要疗效终点
主要终点计算为在第12个月访视时BCVA相较于基线增加≥15个字母的受试者比例。如果第12个月访视的VA缺失，则缺失值将使用LOCF方法插补。主要终点使用包括95％CI的类别数据的概要统计概述。使用费雪精准检验比较研究组之间(高剂量相较于对照、低剂量相较于对照)主要终点的成功比例。
关键次要疗效终点
关键次要终点是STAR试验内治疗的研究眼在第12个月访视时BCVA相较于基线增加≥15个字母的受试者比例，相较于NIGHT研究中自第4个月(访视2)至第16个月(访视5)BCVA增加≥15个字母的受试者比例(NSR-CHM-OS1)的成对样品分析。关键次要终点分析以历史对照组全分析集执行。治疗后(STAR数据)和治疗前(NIGHT数据)的关键次要终点将使用包括95％CI的类别数据的概要统计概述。将使用McNemar检验分开比较每一治疗组治疗前和治疗后之间类别变量的成功比例。
其他次要疗效终点
使用与类别主要终点相同的程序概述和分析类别次要终点。
连续次要终点使用包括95％CI的连续数据的概要统计概述。相较于基线的平均变化及其95％CI的治疗差异基于ANCOVA模型的LSMEANS计算，包括手术组、评估的基线值、研究组和研究组与手术组之间的交互作用。使用上述ANCOVA模型比较研究组之间(高剂量相较于对照、低剂量相较于对照)相较于基线的变化。针对VFQ-25的总体复合分数，将年龄和种族的协变量添加到模型。
安全性分析
安全性分析并未执行显著性检验。安全性分析是描述性，适当时计算95％CI。
不良事件
AE使用药事管理医学字典编码。将使用数据库上锁时当前的字典版本。事件按系统器官分类、优选术语和组别概述。概述经历AE的眼/受试者数和事件数。产生类似的研究药物/程序相关AE、导致停药的AE和SAE概要。AE按最高严重性、与研究药物/程序的关系计开始和缓解时间概述。
全面眼科检查
IOP和IOP相较于基线的变化依照访视、依照治疗和依照眼概述。异常裂隙灯检查发现和散瞳眼底镜检查发现和相较于基线的偏移依照访视、依照治疗和依照眼概述。晶状体混浊类别和相较于基线的偏移依照访视、依照治疗和依照眼概述。
视野彩色眼底摄影
彩色眼底摄影类别和相较于基线的偏移依照访视、依照治疗和依照眼概述。
专利引文
除非明确排除或另有限制，否则本文中引用的每份文件(包括任何交叉引用或相关专利或申请)皆以引用的方式整体并入本文中。任何文件的引用并非认同其是本文中所公开或要求的任何发明的现有技术或其单独或与任何其他一个或多个参考文献的任何组合教示、建议或公开任何所述发明。另外，在本文件中的术语的任何意义或定义与以引用的方式并入本文的文件中的相同术语的任何意义或定义相冲突的情况下，以指派给本文件中的所述术语的意义或定义为主。
其他实施方案
虽然已说明并描述了本公开的具体实施方案，但是在不脱离本公开的精神和范围的情况下可作出各种其他改变和修改。随附权利要求书的范围包括属于本公开的范围内的所有这样的改变和修改。
【序列表】
<110> 夜星克有限公司(NightstaRx Limited)
<120> AAV组合物、制造方法和使用方法
<130> NIGH-013/001WO
<150> US 62/653,139
<151> 2018-04-05
<150> US 62/746,980
<151> 2018-10-17
<150> US 62/773,975
<151> 2018-11-30
<160> 25
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1992
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> REP1基因
<222> (1)..(1992)
<400> 1
gatatcgaat tcctgcagcc cggcggcacc atggcggata ctctcccttc ggagtttgat 60
gtgatcgtaa tagggacggg tttgcctgaa tccatcattg cagctgcatg ttcaagaagt 120
ggccggagag ttctgcatgt tgattcaaga agctactatg gaggaaactg ggccagtttt 180
agcttttcag gactattgtc ctggctaaag gaataccagg aaaacagtga cattgtaagt 240
gacagtccag tgtggcaaga ccagatcctt gaaaatgaag aagccattgc tcttagcagg 300
aaggacaaaa ctattcaaca tgtggaagta ttttgttatg ccagtcagga tttgcatgaa 360
gatgtcgaag aagctggtgc actgcagaaa aatcatgctc ttgtgacatc tgcaaactcc 420
acagaagctg cagattctgc cttcctgcct acggaggatg agtcattaag cactatgagc 480
tgtgaaatgc tcacagaaca aactccaagc agcgatccag agaatgcgct agaagtaaat 540
ggtgctgaag tgacagggga aaaagaaaac cattgtgatg ataaaacttg tgtgccatca 600
acttcagcag aagacatgag tgaaaatgtg cctatagcag aagataccac agagcaacca 660
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gaatataaag gatatgaaga gatcacattt tatgaatatt taaagactca aaaattaacc 1020
cccaacctcc aatatattgt catgcattca attgcaatga catcagagac agccagcagc 1080
accatagatg gtctcaaagc taccaaaaac tttcttcact gtcttgggcg gtatggcaac 1140
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<211> 653
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> REP1蛋白质
<222> (1)..(653)
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1 5 10 15
Gly Leu Pro Glu Ser Ile Ile Ala Ala Ala Cys Ser Arg Ser Gly Arg
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重组合成
<400> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重组合成
<400> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重组合成
<400> 5
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<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重组合成
<400> 6
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<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重组合成
<400> 7
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<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重组合成
<400> 8
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<211> 1992
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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<223> 重组合成
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130 135 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145 150 155 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260 265 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275 280 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290 295 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305 310 315 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325 330 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340 345 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355 360 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370 375 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385 390 395 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405 410 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420 425 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435 440 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450 455 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465 470 475 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485 490 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500 505 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515 520 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530 535 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545 550 555 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565 570 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr
580 585 590
Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp
595 600 605
Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr
610 615 620
Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys
625 630 635 640
His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn
645 650 655
Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln
660 665 670
Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys
675 680 685
Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr
690 695 700
Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr
705 710 715 720
Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725 730 735
<210> 16
<211> 4213
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重组合成
<400> 16
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct 180
aggtaccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 240
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 300
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 360
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 420
tcgctattac catggtcgag gtgagcccca cgttctgctt cactctcccc atctcccccc 480
cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt attttgtgca gcgatggggg 540
cggggggggg gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg 600
cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta 660
tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg 720
ctgcgcgctg ccttcgcccc gtgccccgct ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc 780
tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga gcgggcggga cggcccttct cctccgggct 840
gtaattagcg cttggtttaa tgacggcttg tttcttttct gtggctgcgt gaaagccttg 900
aggggctccg ggagggccct ttgtgcgggg ggagcggctc ggggctgtcc gcggggggac 960
ggctgccttc gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc 1020
tctagagcct ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac 1080
gtgctggtta ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tggatcctag cttgatatcg 1140
aattcctgca gcccggcggc accatggcgg atactctccc ttcggagttt gatgtgatcg 1200
taatagggac gggtttgcct gaatccatca ttgcagctgc atgttcaaga agtggccgga 1260
gagttctgca tgttgattca agaagctact atggaggaaa ctgggccagt tttagctttt 1320
caggactatt gtcctggcta aaggaatacc aggaaaacag tgacattgta agtgacagtc 1380
cagtgtggca agaccagatc cttgaaaatg aagaagccat tgctcttagc aggaaggaca 1440
aaactattca acatgtggaa gtattttgtt atgccagtca ggatttgcat gaagatgtcg 1500
aagaagctgg tgcactgcag aaaaatcatg ctcttgtgac atctgcaaac tccacagaag 1560
ctgcagattc tgccttcctg cctacggagg atgagtcatt aagcactatg agctgtgaaa 1620
tgctcacaga acaaactcca agcagcgatc cagagaatgc gctagaagta aatggtgctg 1680
aagtgacagg ggaaaaagaa aaccattgtg atgataaaac ttgtgtgcca tcaacttcag 1740
cagaagacat gagtgaaaat gtgcctatag cagaagatac cacagagcaa ccaaagaaaa 1800
acagaattac ttactcacaa attattaaag aaggcaggag atttaatatt gatttagtat 1860
caaagctgct gtattctcga ggattactaa ttgatcttct aatcaaatct aatgttagtc 1920
gatatgcaga gtttaaaaat attaccagga ttcttgcatt tcgagaagga cgagtggaac 1980
aggttccgtg ttccagagca gatgtcttta atagcaaaca acttactatg gtagaaaagc 2040
gaatgctaat gaaatttctt acattttgta tggaatatga gaaatatcct gatgaatata 2100
aaggatatga agagatcaca ttttatgaat atttaaagac tcaaaaatta acccccaacc 2160
tccaatatat tgtcatgcat tcaattgcaa tgacatcaga gacagccagc agcaccatag 2220
atggtctcaa agctaccaaa aactttcttc actgtcttgg gcggtatggc aacactccat 2280
ttttgtttcc tttatatggc caaggagaac tcccccagtg tttctgcagg atgtgtgctg 2340
tgtttggtgg aatttattgt cttcgccatt cagtacagtg ccttgtagtg gacaaagaat 2400
ccagaaaatg taaagcaatt atagatcagt ttggtcagag aataatctct gagcatttcc 2460
tcgtggagga cagttacttt cctgagaaca tgtgctcacg tgtgcaatac aggcagatct 2520
ccagggcagt gctgattaca gatagatctg tcctaaaaac agattcagat caacagattt 2580
ccattttgac agtgccagca gaggaaccag gaacttttgc tgttcgggtc attgagttat 2640
gttcttcaac gatgacatgc atgaaaggca cctatttggt tcatttgact tgcacatctt 2700
ctaaaacagc aagagaagat ttagaatcag ttgtgcagaa attgtttgtt ccatatactg 2760
aaatggagat agaaaatgaa caagtagaaa agccaagaat tctgtgggct ctttacttca 2820
atatgagaga ttcgtcagac atcagcagga gctgttataa tgatttacca tccaacgttt 2880
atgtctgctc tggcccagat tgtggtttag gaaatgataa tgcagtcaaa caggctgaaa 2940
cacttttcca ggaaatctgc cccaatgaag atttctgtcc ccctccacca aatcctgaag 3000
acattatcct tgatggagac agtttacagc cagaggcttc agaatccagt gccataccag 3060
aggctaactc ggagactttc aaggaaagca caaaccttgg aaacctagag gagtcctctg 3120
aataatctag tcgattcgaa ttcgatatca agcttatcga taatcaacct ctggattaca 3180
aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat 3240
acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct 3300
ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac 3360
gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca 3420
cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca 3480
tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg 3540
tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga 3600
ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg gaccttcctt 3660
cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga 3720
gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc atcgataccg tcgactcgct gatcagcctc 3780
gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac 3840
cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg 3900
tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga 3960
ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggctt ctgaggcgga 4020
aagaaccagc tggggctcga ctagagcatg gctacgtaga taagtagcat ggcgggttaa 4080
tcattaacta caaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct 4140
cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggcggcctc agtgagcgag 4200
cgagcgcgca gag 4213
<210> 17
<211> 1962
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 17
atggcggata ctctcccttc ggagtttgat gtgatcgtaa tagggacggg tttgcctgaa 60
tccatcattg cagctgcatg ttcaagaagt ggccggagag ttctgcatgt tgattcaaga 120
agctactatg gaggaaactg ggccagtttt agcttttcag gactattgtc ctggctaaag 180
gaataccagg aaaacagtga cattgtaagt gacagtccag tgtggcaaga ccagatcctt 240
gaaaatgaag aagccattgc tcttagcagg aaggacaaaa ctattcaaca tgtggaagta 300
ttttgttatg ccagtcagga tttgcatgaa gatgtcgaag aagctggtgc actgcagaaa 360
aatcatgctc ttgtgacatc tgcaaactcc acagaagctg cagattctgc cttcctgcct 420
acggaggatg agtcattaag cactatgagc tgtgaaatgc tcacagaaca aactccaagc 480
agcgatccag agaatgcgct agaagtaaat ggtgctgaag tgacagggga aaaagaaaac 540
cattgtgatg ataaaacttg tgtgccatca acttcagcag aagacatgag tgaaaatgtg 600
cctatagcag aagataccac agagcaacca aagaaaaaca gaattactta ctcacaaatt 660
attaaagaag gcaggagatt taatattgat ttagtatcaa agctgctgta ttctcgagga 720
ttactaattg atcttctaat caaatctaat gttagtcgat atgcagagtt taaaaatatt 780
accaggattc ttgcatttcg agaaggacga gtggaacagg ttccgtgttc cagagcagat 840
gtctttaata gcaaacaact tactatggta gaaaagcgaa tgctaatgaa atttcttaca 900
ttttgtatgg aatatgagaa atatcctgat gaatataaag gatatgaaga gatcacattt 960
tatgaatatt taaagactca aaaattaacc cccaacctcc aatatattgt catgcattca 1020
attgcaatga catcagagac agccagcagc accatagatg gtctcaaagc taccaaaaac 1080
tttcttcact gtcttgggcg gtatggcaac actccatttt tgtttccttt atatggccaa 1140
ggagaactcc cccagtgttt ctgcaggatg tgtgctgtgt ttggtggaat ttattgtctt 1200
cgccattcag tacagtgcct tgtagtggac aaagaatcca gaaaatgtaa agcaattata 1260
gatcagtttg gtcagagaat aatctctgag catttcctcg tggaggacag ttactttcct 1320
gagaacatgt gctcacgtgt gcaatacagg cagatctcca gggcagtgct gattacagat 1380
agatctgtcc taaaaacaga ttcagatcaa cagatttcca ttttgacagt gccagcagag 1440
gaaccaggaa cttttgctgt tcgggtcatt gagttatgtt cttcaacgat gacatgcatg 1500
aaaggcacct atttggttca tttgacttgc acatcttcta aaacagcaag agaagattta 1560
gaatcagttg tgcagaaatt gtttgttcca tatactgaaa tggagataga aaatgaacaa 1620
gtagaaaagc caagaattct gtgggctctt tacttcaata tgagagattc gtcagacatc 1680
agcaggagct gttataatga tttaccatcc aacgtttatg tctgctctgg cccagattgt 1740
ggtttaggaa atgataatgc agtcaaacag gctgaaacac ttttccagga aatctgcccc 1800
aatgaagatt tctgtccccc tccaccaaat cctgaagaca ttatccttga tggagacagt 1860
ttacagccag aggcttcaga atccagtgcc ataccagagg ctaactcgga gactttcaag 1920
gaaagcacaa accttggaaa cctagaggag tcctctgaat aa 1962
<210> 18
<211> 942
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重组合成
<400> 18
ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga 60
cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat 120
atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc 180
cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct 240
attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc 300
ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg 360
gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg 420
cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg 480
aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg agtcgctgcg 540
cgctgccttc gccccgtgcc ccgctccgcc gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga 600
ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat 660
tagcgcttgg tttaatgacg gcttgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag ccttgagggg 720
ctccgggagg gccctttgtg cggggggagc ggctcggggc tgtccgcggg gggacggctg 780
ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg gcggctctag 840
agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg gcaacgtgct 900
ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattggat cc 942
<210> 19
<211> 593
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重组合成
<400> 19
atcgataatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat 60
gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct 120
tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag 180
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ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct 360
cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga aatcatcgtc ctttccttgg 420
ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg 480
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cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc ccc 593
<210> 20
<211> 269
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重组合成
<400> 20
cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc 60
gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa 120
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gcttctgagg cggaaagaac cagctgggg 269
<210> 21
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重组合成
<400> 21
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct 130
<210> 22
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重组合成
<400> 22
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
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g 121
<210> 23
<211> 1962
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
atggcggata ctctcccttc ggagtttgat gtgatcgtaa tagggacggg tttgcctgaa 60
tccatcattg cagctgcatg ttcaagaagt ggccggagag ttctgcatgt tgattcaaga 120
agctactatg gaggaaactg ggccagtttt agcttttcag gactattgtc ctggctaaag 180
gaataccagg aaaacagtga cattgtaagt gacagtccag tgtggcaaga ccagatcctt 240
gaaaatgaag aagccattgc tcttagcagg aaggacaaaa ctattcaaca tgtggaagta 300
ttttgttatg ccagtcagga tttgcatgaa gatgtcgaag aagctggtgc actgcagaaa 360
aatcatgctc ttgtgacatc tgcaaactcc acagaagctg cagattctgc cttcctgcct 420
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agcgatccag agaatgcgct agaagtaaat ggtgctgaag tgacagggga aaaagaaaac 540
cattgtgatg ataaaacttg tgtgccatca acttcagcag aagacatgag tgaaaatgtg 600
cctatagcag aagataccac agagcaacca aagaaaaaca gaattactta ctcacaaatt 660
attaaagaag gcaggagatt taatattgat ttagtatcaa agctgctgta ttctcgagga 720
ttactaattg atcttctaat caaatctaat gttagtcgat atgcagagtt taaaaatatt 780
accaggattc ttgcatttcg agaaggacga gtggaacagg ttccgtgttc cagagcagat 840
gtctttaata gcaaacaact tactatggta gaaaagcgaa tgctaatgaa atttcttaca 900
ttttgtatgg aatatgagaa atatcctgat gaatataaag gatatgaaga gatcacattt 960
tatgaatatt taaagactca aaaattaacc cccaacctcc aatatattgt catgcattca 1020
attgcaatga catcagagac agccagcagc accatagatg gtctcaaagc taccaaaaac 1080
tttcttcact gtcttgggcg gtatggcaac actccatttt tgtttccttt atatggccaa 1140
ggagaactcc cccagtgttt ctgcaggatg tgtgctgtgt ttggtggaat ttattgtctt 1200
cgccattcag tacagtgcct tgtagtggac aaagaatcca gaaaatgtaa agcaattata 1260
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gagaacatgt gctcacgtgt gcaatacagg cagatctcca gggcagtgct gattacagat 1380
agatctgtcc taaaaacaga ttcagatcaa cagatttcca ttttgacagt gccagcagag 1440
gaaccaggaa cttttgctgt tcgggtcatt gagttatgtt cttcaacgat gacatgcatg 1500
aaaggcacct atttggttca tttgacttgc acatcttcta aaacagcaag agaagattta 1560
gaatcagttg tgcagaaatt gtttgttcca tatactgaaa tggagataga aaatgaacaa 1620
gtagaaaagc caagaattct gtgggctctt tacttcaata tgagagattc gtcagacatc 1680
agcaggagct gttataatga tttaccatcc aacgtttatg tctgctctgg cccagattgt 1740
ggtttaggaa atgataatgc agtcaaacag gctgaaacac ttttccagga aatctgcccc 1800
aatgaagatt tctgtccccc tccaccaaat cctgaagaca ttatccttga tggagacagt 1860
ttacagccag aggcttcaga atccagtgcc ataccagagg ctaactcgga gactttcaag 1920
gaaagcacaa accttggaaa cctagaggag tcctctgaat aa 1962
<210> 24
<211> 5357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重组合成
<400> 24
ctaaattgta agcgttaatt tttgttaaaa ttaaattttt gttaaatcag ctcatttttt 60
aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa aagaatagac cgagataggg 120
ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga ctccaacgtc 180
aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat ggcccactac gtgaaccatc accctaatca 240
agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca ctaaatcgga accctaaagg gagcccccga 300
tttagagctt gacggggaaa gccggcgaag ctggcgagaa aggaagggaa gaaagcgaaa 360
ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta gcggtcacgc tgcgcgtcgt aaccaccaca 420
cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc gcgtcccatt cgccattcag gctgcgcaac 480
tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga 540
tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa 600
acgacggcca gtgagcgcgc gtaatacgac tcactatagg gcgaattggg taccgggccc 660
cccctcgagg tcgacggtat cgataagcta ggatcctagc tgatatcgaa ttcctgcagc 720
ccggcggcac catggcggat actctccctt cggagtttga tgtgatcgta atagggacgg 780
gtttgcctga atccatcatt gcagctgcat gttcaagaag tggccggaga gttctgcatg 840
ttgattcaaa gaagctacta tggaggaaac tgggccagtt ttagcttttc aggactattg 900
tcctggctaa aggaatacca ggaaaacagt gacattgtaa gtgacagtcc agtgtggcaa 960
gaccagatcc ttgaaaatga agaagccatt gctcttagca ggaaggacaa aactattcaa 1020
catgtggaag tattttgtta tgccagtcag gatttgcatg aagatgtcga agaagctggt 1080
cactgcagaa aaatcatgct cttgtgacat ctgcaaactc cacagaagct gcagattctg 1140
cctcctgcct acggaggatg agtcattaag cactatgagc tgtgaaatgc tcacagaaca 1200
aactccaagc agcgatccag agaatgcgcg ctagaagtaa atggtgctga agtgacaggg 1260
gaaaaagaaa accattgtga tgataaaact tgtgtgccat caacttacgc agaagacatg 1320
agtgaaaatg tcgctatagc agaagatacc acagagcaac caaagaaaaa cagaattact 1380
tactcacaaa ttattaaaga aggcaggaga tttaatattg atttagtatc aaagctgctg 1440
tattctcgag gattactaat tgatcttcta atcaaatcta atgttagtcg atatgcagag 1500
tttaaaaata ttaccaggat tcttgcattt cgagaggacg agtggaacag gttccgtgtt 1560
ccagagccag atgtctttaa tagcaaacaa cttactatgg tagaaagcga atgctaatga 1620
aatttcttac attttgtatg gaatatgaga aatatctgat gaatataaag gatatgaaga 1680
gatcacattt tatgaatatt taaagactca aaaattaacc cccaacctcc aatatattgt 1740
catgcattca attgcaatga catcagagac agccagcagc accatagatg gtctccaaag 1800
ctaccaaaaa ctttcttcac tgtcttgggc ggtatggcaa cactccattt ttgtttcctt 1860
tatatggcca aggagaactc ccccagtgtt tctgcaggat gtgtgctgtg tttggtggaa 1920
tttattgtct tcgccattca gtacagtgcc ttgtagtgga caaagaatcc agaaaatgta 1980
aagcaattat agatcagttt ggtcagagaa taatctctga gcatttcctc gtggaggaca 2040
gttactttcc tgagaacatg tgctcacgtg tgcaatacag gcagatctcc agggcagtgc 2100
tgattacaga tagatctgtc ctaaaaacag attcagatca acagatttcc attttgacag 2160
tgccagcaga ggaaccagaa cttttgctgt tcgggtcatt gagttatgtt cttcaacgat 2220
gacatgcatg aaaggcacct atttggttca tttgacttgc acatcttcta aaacagcaag 2280
agaagattta gaatcagttg tgcagaaatt gtttgttcca tatactgaaa tggagataga 2340
aaatgaacaa gtagaaaagc caagaattct gtgggctctt tacttcaata tgagagttcg 2400
tcagacatca gcaggagctc ttataatgat ttaccatcca acgtttatgt ctgctctggc 2460
ccagattgtg gtttaggaaa tgataatgca gtcaaacagg ctgaaacact tttccaggaa 2520
atctgcccca atgaagattt ctgtccccct ccaccaaatc cctgaagaca ttatccttga 2580
tggagacagt ttacagccag aggctcagaa tccagtgcca taccagaggc taactcggag 2640
actttcaagg aaagcacaaa ccttggaaac ctagaggagt cctctgaata attagagcgg 2700
ccaacgcgtt ggccgccacc gcggtggagc tccagctttt gttcccttta gtgagggtta 2760
attgcgcgct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc 2820
acaattccac acaacatacg accggaagca taaagtgtaa gcctggggtg cctaatgagt 2880
gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc 2940
gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg 3000
ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt 3060
atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 3120
gaacatgtga gcaaaagcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gtgctggcgt 3180
ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 3240
ggcgaaaccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 3300
ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 3360
cgtggcgctt tctcatagct cacgcgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 3420
agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact 3480
atctcttgag tccaacccgg taagacagac ttatcgccac tggcagccac tggtaacagg 3540
attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 3600
ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 3660
aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttg 3720
tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 3780
ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 3840
tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt tcgaccgaat aaatacctgt gacggaagat 3900
cacttgcaaa taaataaatc cggttccctg ttgataccgg gaagccctgg gccaactttt 3960
ggcgaaaatg agacgttgat cggcacgtaa gaggttccaa ctttcaccat aatgaaataa 4020
gatcactacc gggcgtattt tttgagttgt cgagattttc aggagctaag gaagctaaaa 4080
tggagaaaaa aatcactgga tataccaccg ttgatatatc ccaatggcat cgtaaagaac 4140
attttgaggc atttcagtca gttgctcaat gtacctataa ccagaccgtt cagctggata 4200
ttacggcctt tttaaagacc gtaaagaaaa ataagcacaa gttttatccg gcctttattc 4260
acattcttgc ccgcctgatg aatgctcatc cggaattagt atggcaatga aagacggtga 4320
gctggtgata tgggatagtg ttcacccttg ttacaccgtt ttccatgagc aaactgaaac 4380
gttttcatcg ctctggagtg aataccaacg agatttccgg cagtttctac acatatattc 4440
gcaagatgtg gcgtgttagg tgaaaacctg gcctatttcc ctaaagggtt tattgagaat 4500
atgtttttcg tctcagccaa tccctgggtg agtttcacca gttttgattt aaacgtggcc 4560
aatatggaaa cttcttcgcc ccgttttcac catgggcaaa tattatacgc aaggcgacaa 4620
ggcgacaagg tgctgatgcc gctggcgatt caggttcatc atgccgtttg tgatggcttc 4680
catgtcggca gaatgcttaa tgaattacaa cagtactgcg atgagtggca gggcggggcg 4740
taattttttt aaggcagtta ttggtgccct taaacgctgg ttgctacgcc tgaataatga 4800
taataagcgg atgaatggca gaaattcgaa agcaaattcg acccggtcgt cggttcaggg 4860
cagggtcgtt aaatagccgc ttatgtctat tgctggttta ccggtttatt gactaccgga 4920
agcagtgtga ccgtgtgctt cttctcaaat gcctgaggcc agtttgctca ggctctcccc 4980
gtggaggtaa taattgacga tatgatcctt tttttctgat caaaagtgct catcattgga 5040
aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttgatgt 5100
aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccacg tttctgggtg 5160
agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 5220
aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcaagggt tattgtctca 5280
tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca ataggggttc cgcgcacatt 5340
tccccgaaaa gtgccac 5357
<210> 25
<211> 4213
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重组合成
<400> 25
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct 180
aggtaccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 240
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 300
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 360
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 420
tcgctattac catggtcgag gtgagcccca cgttctgctt cactctcccc atctcccccc 480
cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt attttgtgca gcgatggggg 540
cggggggggg gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg 600
cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta 660
tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg 720
ctgcgcgctg ccttcgcccc gtgccccgct ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc 780
tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga gcgggcggga cggcccttct cctccgggct 840
gtaattagcg cttggtttaa tgacggcttg tttcttttct gtggctgcgt gaaagccttg 900
aggggctccg ggagggccct ttgtgcgggg ggagcggctc ggggctgtcc gcggggggac 960
ggctgccttc gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc 1020
tctagagcct ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac 1080
gtgctggtta ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tggatcctag cttgatatcg 1140
aattcctgca gcccggcggc accatggcgg atactctccc ttcggagttt gatgtgatcg 1200
taatagggac gggtttgcct gaatccatca ttgcagctgc atgttcaaga agtggccgga 1260
gagttctgca tgttgattca agaagctact atggaggaaa ctgggccagt tttagctttt 1320
caggactatt gtcctggcta aaggaatacc aggaaaacag tgacattgta agtgacagtc 1380
cagtgtggca agaccagatc cttgaaaatg aagaagccat tgctcttagc aggaaggaca 1440
aaactattca acatgtggaa gtattttgtt atgccagtca ggatttgcat gaagatgtcg 1500
aagaagctgg tgcactgcag aaaaatcatg ctcttgtgac atctgcaaac tccacagaag 1560
ctgcagattc tgccttcctg cctacggagg atgagtcatt aagcactatg agctgtgaaa 1620
tgctcacaga acaaactcca agcagcgatc cagagaatgc gctagaagta aatggtgctg 1680
aagtgacagg ggaaaaagaa aaccattgtg atgataaaac ttgtgtgcca tcaacttcag 1740
cagaagacat gagtgaaaat gtgcctatag cagaagatac cacagagcaa ccaaagaaaa 1800
acagaattac ttactcacaa attattaaag aaggcaggag atttaatatt gatttagtat 1860
caaagctgct gtattctcga ggattactaa ttgatcttct aatcaaatct aatgttagtc 1920
gatatgcaga gtttaaaaat attaccagga ttcttgcatt tcgagaagga cgagtggaac 1980
aggttccgtg ttccagagca gatgtcttta atagcaaaca acttactatg gtagaaaagc 2040
gaatgctaat gaaatttctt acattttgta tggaatatga gaaatatcct gatgaatata 2100
aaggatatga agagatcaca ttttatgaat atttaaagac tcaaaaatta acccccaacc 2160
tccaatatat tgtcatgcat tcaattgcaa tgacatcaga gacagccagc agcaccatag 2220
atggtctcaa agctaccaaa aactttcttc actgtcttgg gcggtatggc aacactccat 2280
ttttgtttcc tttatatggc caaggagaac tcccccagtg tttctgcagg atgtgtgctg 2340
tgtttggtgg aatttattgt cttcgccatt cagtacagtg ccttgtagtg gacaaagaat 2400
ccagaaaatg taaagcaatt atagatcagt ttggtcagag aataatctct gagcatttcc 2460
tcgtggagga cagttacttt cctgagaaca tgtgctcacg tgtgcaatac aggcagatct 2520
ccagggcagt gctgattaca gatagatctg tcctaaaaac agattcagat caacagattt 2580
ccattttgac agtgccagca gaggaaccag gaacttttgc tgttcgggtc attgagttat 2640
gttcttcaac gatgacatgc atgaaaggca cctatttggt tcatttgact tgcacatctt 2700
ctaaaacagc aagagaagat ttagaatcag ttgtgcagaa attgtttgtt ccatatactg 2760
aaatggagat agaaaatgaa caagtagaaa agccaagaat tctgtgggct ctttacttca 2820
atatgagaga ttcgtcagac atcagcagga gctgttataa tgatttacca tccaacgttt 2880
atgtctgctc tggcccagat tgtggtttag gaaatgataa tgcagtcaaa caggctgaaa 2940
cacttttcca ggaaatctgc cccaatgaag atttctgtcc ccctccacca aatcctgaag 3000
acattatcct tgatggagac agtttacagc cagaggcttc agaatccagt gccataccag 3060
aggctaactc ggagactttc aaggaaagca caaaccttgg aaacctagag gagtcctctg 3120
aataatctag tcgattcgaa ttcgatatca agcttatcga taatcaacct ctggattaca 3180
aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat 3240
acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct 3300
ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac 3360
gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca 3420
cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca 3480
tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg 3540
tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga 3600
ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg gaccttcctt 3660
cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga 3720
gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc atcgataccg tcgactcgct gatcagcctc 3780
gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac 3840
cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg 3900
tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga 3960
ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggctt ctgaggcgga 4020
aagaaccagc tggggctcga ctagagcatg gctacgtaga taagtagcat ggcgggttaa 4080
tcattaacta caaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct 4140
cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggcggcctc agtgagcgag 4200
cgagcgcgca gag 4213
Claims (213)
1.一种用于自哺乳动物宿主细胞培养纯化重组AAV(rAAV)粒子的方法，其包括下列步骤：
(a)在适合形成多个rAAV粒子的条件下，在培养基中培养多个哺乳动物宿主细胞，其中所述多个哺乳动物宿主细胞已用包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体转染以产生多个转染的哺乳动物宿主细胞；
(b)收集包含所述多个转染的哺乳动物宿主细胞的所述培养基；
(c)自所述多个转染的哺乳动物宿主细胞收集多个rAAV粒子；
(d)通过切向流过滤(TFF)浓缩所述多个rAAV粒子以产生浓缩的多个rAAV粒子；
(e)通过密度梯度超离心富集所述浓缩的多个rAAV粒子的完整rAAV粒子以产生富集的多个完整rAAV粒子；
(f)通过阴离子交换(AEX)色谱或亲和性色谱纯化所述富集的多个完整rAAV粒子以产生包含纯化且富集的多个完整rAAV粒子的洗脱液；和
(g)通过切向流过滤(TFF)渗滤和浓缩所述来自(f)的洗脱液至制剂缓冲剂以产生包含所述纯化且富集的多个完整rAAV粒子和所述制剂缓冲剂的最终组合物。
2.一种用于自哺乳动物宿主细胞培养纯化重组AAV(rAAV)粒子的方法，其包括下列步骤：
(a)在适合形成多个rAAV-REP1粒子的条件下，在培养基中培养多个哺乳动物宿主细胞，其中所述多个哺乳动物宿主细胞已用包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体转染以产生多个转染的哺乳动物宿主细胞，其中所述外源性序列包含编码人Rab护送蛋白1(REP1)蛋白质的序列；
(b)收集包含所述多个转染的哺乳动物宿主细胞的所述培养基；
(c)自所述多个转染的哺乳动物宿主细胞收集多个rAAV粒子；
(d)通过切向流过滤(TFF)浓缩所述多个rAAV粒子以产生浓缩的多个rAAV粒子；
(e)通过密度梯度超离心富集所述浓缩的多个rAAV粒子的完整rAAV粒子以产生富集的多个完整rAAV粒子；
(f)通过阴离子交换(AEX)色谱或亲和性色谱纯化所述富集的多个完整rAAV粒子以产生包含纯化且富集的多个完整rAAV粒子的洗脱液；和
(g)通过切向流过滤(TFF)渗滤和浓缩所述来自(f)的洗脱液至制剂缓冲剂以产生包含所述纯化且富集的多个完整rAAV粒子和所述制剂缓冲剂的最终组合物。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述培养基包含减少量的胎牛血清。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述培养基不包含减少量的胎牛血清。
5.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述培养基包含无血清培养基。
6.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述培养基由无血清培养基组成。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述培养基包含无蛋白质培养基。
8.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述培养基由无蛋白质培养基组成。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述培养基包含甘氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-胱氨酸二盐酸盐、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐-H2O、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐脱水物、L-缬氨酸、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、i-肌醇、氯化钙(CaCl2)(无水)、硝酸铁(Fe(NO3)3"9H2O)、硫酸镁(MgSO4)(无水)、氯化钾(KCl)、碳酸氢钠(NaHCO3)、氯化钠(NaCl)、磷酸二氢钠(NaH2PO4-H2O)和D-葡萄糖(右旋糖)。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞已用包含PEI转导试剂的组合物转染。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述包含外源性序列的质粒载体还包含编码5’反向末端重复(ITR)的序列和编码3’ITR的序列。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述编码5’ITR的序列衍生自编码血清型2AAV(AAV2)的5’ITR的序列。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中所述编码5’ITR的序列包含与编码血清型2AAV(AAV2)的5’ITR的序列相同的序列。
14.如权利要求11或12所述的方法，其中所述编码5’ITR的序列包含与编码血清型2AAV(AAV2)的5’ITR的序列不相同的序列。
15.如权利要求11至14中任一项所述的方法，其中所述编码3’ITR的序列衍生自编码血清型2AAV(AAV2)的3’ITR的序列。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述编码3’ITR的序列包含与编码血清型2AAV(AAV2)的3’ITR的序列相同的序列。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述编码3’ITR的序列包含与编码血清型2AAV(AAV2)的3’ITR的序列不相同的序列。
18.如权利要求11至17中任一项所述的方法，其中所述编码5’ITR的序列或所述编码3’ITR的序列包含145个碱基对(bp)。
19.如权利要求11至17中任一项所述的方法，其中所述编码5’ITR的序列或所述编码3’ITR的序列包含134、135、136或137个碱基对(bp)或由134、135、136或137个碱基对组成。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述包含外源性序列的质粒载体、所述辅助质粒载体或所述包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体还包含编码选择标志的序列。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述编码选择标志的序列传达对卡那霉素的抵抗。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述收集步骤(c)包括机械破坏所述多个转染的哺乳动物细胞以释放所述多个转染的哺乳动物细胞所产生的重组AAV(rAAV)粒子。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述机械破坏包括微射流。
24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述浓缩步骤还包括(1)通过深层过滤澄清所述浓缩的多个rAAV粒子以产生浓缩且澄清的多个rAAV粒子。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述浓缩步骤还包括(2)在-80℃下冷冻所述浓缩且澄清的多个rAAV粒子以产生工艺中间物。
26.如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述富集步骤(e)包括碘克沙醇密度梯度超离心以产生富集的多个rAAV粒子。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述碘克沙醇密度梯度包含具有15％、25％、40％和57％浓度的碘克沙醇组合物。
28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述纯化步骤(f)的亲和性色谱包含AVB Sepharose基质。
29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述制剂缓冲剂包含Tris、MgCl2和NaCl。
30.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述制剂缓冲剂包含20mM Tris、1mMMgCl2和200mM NaCl，pH 8。
31.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述制剂缓冲剂包含20mM Tris、1mMMgCl2、200mM NaCl、pH 8以及0.001％的泊洛沙姆188。
32.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述AEX色谱还包括下列步骤：
产生AEX色谱图，和
选择含有完整rAAV粒子的AEX色谱图上的峰。
33.如权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述步骤(d)或步骤(g)的TFF使用100kDa中空纤维过滤器(HFF)执行。
34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述步骤(d)或步骤(g)的TFF使用50kDa HFF执行。
35.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述方法的步骤(g)还包含第二TFF，其中所述步骤(d)的TFF和所述步骤(g)的第一TFF使用100kDa HFF执行且其中所述步骤(g)的第二TFF使用50kDa HFF执行。
36.如权利要求2至35中任一项所述的方法，其中所述编码人REP1蛋白的序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列组成：
37.如权利要求36所述的组合物，其中所述人REP1蛋白包含下列氨基酸序列或由下列氨基酸序列组成：
38.一种药物组合物，其包含如权利要求1至37中任一项所述的方法所产生的多个rAAV粒子。
39.如权利要求38所述的药物组合物，其包含：
(a)在0.5x1012与2.5x1012个载体基因组(vg)/mL之间的复制缺陷和重组腺相关病毒(rAAV)；
(b)小于50％空衣壳；
(c)每1.0x1012vg/mL小于4ng/mL的残余宿主细胞蛋白；和
(d)每1.0x1012vg/mL小于7x10-3pg/ml的残余宿主细胞DNA。
40.如权利要求39所述的药物组合物，其中所述组合物还包含
(e)多个功能性vg/mL，其中功能性载体基因组中的每一个能够在转导之后在细胞中表达外源性序列。
41.如权利要求40所述的药物组合物，其中在用所述药物组合物转导细胞之后，所述多个功能性vg/mL以相较于非转导细胞中对应内源性序列增加2倍的表达水平表达所述外源性序列。
42.如权利要求40所述的药物组合物，其中在用所述药物组合物转导细胞之后，所述多个功能性vg/mL以相较于非转导细胞中对应内源性序列增加3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍或任何其他介于之间的增加倍数的表达水平表达所述外源性序列。
43.如权利要求41或42所述的药物组合物，其中所述外源性序列与所述对应内源性序列相同。
44.如权利要求41或42所述的药物组合物，其中所述外源性序列与所述对应内源性序列不相同。
45.如权利要求41、42或44所述的药物组合物，其中所述外源性序列与所述对应内源性序列不相同，但所述外源性序列所编码的蛋白质与所述内源性序列所编码的蛋白质相同。
46.如权利要求42或43所述的药物组合物，其中所述外源性序列与所述对应内源性序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或介于之间的任何百分比的同一性。
47.如权利要求37至44中任一项所述的药物组合物，其中所述外源性序列相较于所述内源性序列经密码子优化。
48.如权利要求47所述的药物组合物，其中所述外源性序列与所述对应内源性序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或介于之间的任何百分比的同源性。
49.如权利要求38至48中任一项所述的药物组合物，其中在用本公开的药物组合物转导细胞之后，所述外源性序列编码蛋白质。
50.如权利要求49所述的药物组合物，其中所述外源性序列所编码的所述蛋白质具有等于或大于非转导细胞的对应序列所编码的蛋白质的活性水平的活性水平。
51.如权利要求50所述的药物组合物，其中所述外源性序列与所述对应内源性序列相同。
52.如权利要求50所述的药物组合物，其中所述外源性序列与所述对应内源性序列不相同。
53.如权利要求52所述的药物组合物，其中所述外源性序列与所述对应内源性序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或介于之间的任何百分比的同一性。
54.如权利要求49至52中任一项所述的药物组合物，其中所述活性包含与配体或底物结合、活化配体或底物和/或将一个或多个官能团转移到配体或底物。
55.如权利要求38至54中任一项所述的药物组合物，其中所述蛋白质包含REP-1蛋白且所述活性包含REP-1底物的异戊烯化。
56.如权利要求38至55中任一项所述的药物组合物，其包含
(a)在1.0x1012与2.0x1012个载体基因组(vg)/mL之间的复制缺陷和重组腺相关病毒(AAV)。
57.如权利要求38至55中任一项所述的药物组合物，其包含
(a)约1.0x1012个载体基因组(vg)/mL的复制缺陷和重组腺相关病毒(AAV)。
58.如权利要求38至55中任一项所述的药物组合物，其包含
(a)1.0x1012个载体基因组(vg)/mL的复制缺陷和重组腺相关病毒(AAV)。
59.如权利要求38至55中任一项所述的药物组合物，其包含
(b)小于50％空衣壳或小于30％空衣壳。
60.如权利要求38至59中任一项所述的药物组合物，其中所述复制缺陷和重组腺相关病毒(rAAV)含有分离自或衍生自血清型2AAV(AAV2)的序列。
61.如权利要求60所述的药物组合物，其中所述分离自或衍生自AAV2的序列包含编码反向末端重复(ITR)的序列。
62.如权利要求60或61所述的药物组合物，其中所述复制缺陷和重组腺相关病毒(rAAV)含有编码5’ITR的序列和编码3’ITR的序列。
63.如权利要求62所述的药物组合物，其中所述编码5’ITR的序列和所述编码3’ITR的序列包含AAV2 ITR的野生型序列。
64.如权利要求38至63中任一项所述的药物组合物，其中所述宿主细胞分离自或衍生自培养的细胞系。
65.如权利要求64所述的药物组合物，其中所述宿主细胞是HEK293细胞。
66.如权利要求38至63中任一项所述的药物组合物，其中所述宿主细胞分离自或衍生自原代细胞系。
67.如权利要求66所述的药物组合物，其中所述宿主细胞是永生化细胞或干细胞。
68.如权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞分离自或衍生自培养的细胞系。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述宿主细胞是HEK293细胞。
70.如权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞分离自或衍生自原代细胞系。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述宿主细胞是永生化细胞或干细胞。
72.如权利要求38至67中任一项所述的药物组合物，其中所述最终组合物的所述多个完整rAAV粒子的每个完整rAAV还包含：
核酸序列，所述核酸序列自5’至3’包含：
(a)编码AAV2 5’ITR的序列，
(b)编码早期增强子元件的序列，
(c)编码启动子的序列，
(d)编码外显子和内含子的序列，
(e)编码剪接受体位点的序列，
(f)编码Rab护送蛋白1(REP1)蛋白质的序列，
(g)编码转录后调节元件(PRE)的序列，
(h)编码聚腺苷酸化(polyA)位点的序列，和
(i)编码AAV2 3’ITR的序列。
73.如权利要求72所述的药物组合物，其中所述早期增强子元件包含分离自或衍生自巨细胞病毒(CMV)的序列。
74.如权利要求73所述的药物组合物，其中所述早期增强子元件包含下列核酸序列或由下列核酸序列组成：
75.如权利要求73所述的药物组合物，其中所述早期增强子元件包含下列核酸序列或由下列核酸序列组成：
76.如权利要求72至75中任一项所述的药物组合物，其中所述编码所述启动子的序列包含下列序列或由下列序列组成：分离自或衍生自编码鸡β肌动蛋白(CBA)基因的序列。
77.如权利要求72至75中任一项所述的药物组合物，其中所述编码所述外显子和内含子的序列包含下列序列或由下列序列组成：分离自或衍生自编码鸡β肌动蛋白(CBA)基因的序列。
78.如权利要求72至75中任一项所述的药物组合物，其中所述编码所述启动子的序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列组成：
79.如权利要求72至78中任一项所述的药物组合物，其中所述编码所述外显子和内含子的序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列组成：
80.如权利要求72至79中任一项所述的药物组合物，其中所述编码所述剪接受体位点的序列包含分离自或衍生自编码家兔β球蛋白剪接受体位点的序列的序列。
81.如权利要求80所述的药物组合物，其中所述编码所述家兔β球蛋白剪接受体位点的序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列组成：
82.如权利要求72至81中任一项所述的药物组合物，其中所述包含所述早期增强子元件的序列、所述包含所述启动子的序列、所述包含所述内含子和外显子的序列和所述包含所述剪接受体位点的序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列组成：
83.如权利要求72至81中任一项所述的药物组合物，其中所述包含所述早期增强子元件的序列、所述包含所述启动子的序列、所述包含所述内含子和外显子的序列和所述包含所述剪接受体位点的序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列组成：
84.如权利要求72至83中任一项所述的药物组合物，其中所述编码所述REP1蛋白的序列包含分离自或衍生自哺乳动物REP1序列的序列。
85.如权利要求84所述的药物组合物，其中所述哺乳动物REP1序列分离自或衍生自小鼠、大鼠、兔、非人灵长动物或人。
86.如权利要求84所述的药物组合物，其中所述哺乳动物REP1序列分离自或衍生自人。
87.如权利要求86所述的药物组合物，其中所述编码所述人REP1蛋白的序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列组成：
88.如权利要求86或87所述的组合物，其中所述人REP1蛋白包含下列氨基酸序列或由下列氨基酸序列组成：
89.如权利要求72至88中任一项所述的药物组合物，其中所述编码所述PRE的序列包含分离自或衍生自土拨鼠肝炎病毒(WPRE)的序列。
90.如权利要求89所述的药物组合物，其中所述编码所述WPRE的序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列组成：
91.如权利要求72至90中任一项所述的药物组合物，其中所述编码聚腺苷酸化(polyA)位点的序列包含分离自或衍生自哺乳动物基因的序列。
92.如权利要求91所述的药物组合物，其中所述编码聚腺苷酸化(polyA)位点的序列包含分离自或衍生自牛生长激素基因(BGH)的序列。
93.如权利要求92所述的组合物，其中所述编码所述polyA位点的序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列组成：
94.如权利要求72至93中任一项所述的药物组合物，其中所述编码所述AAV2 5’ITR的序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列组成：
95.如权利要求72至93中任一项所述的药物组合物，其中所述编码所述AAV2 3’ITR的序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列组成：
96.如权利要求72至95中任一项所述的药物组合物，其中所述自5’至3’包含元件(a)至(i)的核酸包含DNA序列或由DNA序列组成。
97.如权利要求96所述的药物组合物，其中所述自5’至3’包含元件(a)至(i)的核酸包含单链DNA序列或由单链DNA序列组成。
98.如权利要求72至97中任一项所述的药物组合物，其中所述最终组合物的所述多个完整rAAV的每个rAAV包含分离自或衍生自AAV2的衣壳蛋白。
99.如权利要求98所述的药物组合物，其中所述AAV2衣壳蛋白包含与下列氨基酸序列具有至少95％同一性的序列：
100.如权利要求98所述的药物组合物，其中所述AAV2衣壳蛋白包含下列氨基酸序列：
101.如权利要求72至100中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含制剂缓冲剂。
102.如权利要求101所述的药物组合物，其中所述制剂缓冲剂包含Tris、MgCl2和NaCl。
103.如权利要求101所述的药物组合物，其中所述制剂缓冲剂包含20mM Tris、1mMMgCl2和200mM NaCl，pH 8。
104.如权利要求101所述的药物组合物，其中所述制剂缓冲剂包含20mM Tris、1mMMgCl2、200mM NaCl、pH 8以及0.001％的泊洛沙姆188。
105.如权利要求72至104中任一项所述的药物组合物，其中所述多个完整rAAV的浓度在1x108个基因组粒子(gp)/mL与1x1014gp/mL之间(终点包括在内)。
106.如权利要求105所述的药物组合物，其中所述多个完整rAAV的浓度在0.5x1010gp/mL与2.5x1012gp/mL之间(终点包括在内)。
107.如权利要求105所述的药物组合物，其中所述多个完整rAAV的浓度在1x1011gp/mL与5x1013gp/mL之间(终点包括在内)。
108.如权利要求105所述的药物组合物，其中所述多个完整rAAV的浓度在1x1011gp/mL与2x1012gp/mL之间(终点包括在内)。
109.如权利要求105所述的药物组合物，其中所述多个完整rAAV的浓度是1x1012gp/mL。
110.如权利要求105所述的药物组合物，其中所述多个完整rAAV的浓度是1x1011gp/mL。
111.如权利要求72至110中任一项所述的药物组合物，其中所述多个完整rAAV的浓度使用qPCR测量。
112.如权利要求111所述的药物组合物，其中所述qPCR使用超螺旋质粒载体作为标准。
113.如权利要求111所述的药物组合物，其中所述qPCR使用线性化质粒载体作为标准。
114.一种递送装置，其包含如权利要求72至113中任一项所述的药物组合物。
115.如权利要求114所述的递送装置，其中所述递送装置包括注射器、导管和针头中的一种或多种。
116.如权利要求114所述的递送装置，其中所述递送装置适合通过注射施用所述药物组合物。
117.如权利要求114所述的递送装置，其中所述递送装置适合通过输注施用所述药物组合物。
118.如权利要求114至117中任一项所述的递送装置，其中所述递送装置适合通过视网膜下途径施用所述药物组合物。
119.如权利要求114至117中任一项所述的递送装置，其中所述递送装置适合通过脉络膜上途径施用所述药物组合物。
120.一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求38至113中任一项所述的药物组合物。
121.如权利要求120所述的方法，其中所述疾病或病症是视网膜的疾病或病症。
122.如权利要求120或121所述的方法，其中所述疾病或病症是无脉络膜症。
123.如权利要求120至122中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量包含在所述药物组合物的最小有效量与最大耐受量之间的量。
124.如权利要求123所述的方法，其中所述最小有效量包含足以转导视网膜或其目标部分的至少一个神经元的所述药物组合物的量。
125.如权利要求123所述的方法，其中所述最小有效量包含足以转导视网膜或其目标部分的至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或介于之间的任何百分比的神经元的所述药物组合物的量。
126.如权利要求123至125中任一项所述的方法，其中所述最小有效量包含足以改善所述受试者的视敏度的所述药物组合物的量。
127.如权利要求123至125中任一项所述的方法，其中所述最小有效量包含足以减少视网膜疾病的征象或症状的所述药物组合物的量。
128.如权利要求127所述的方法，其中所述视网膜疾病是无脉络膜症。
129.如权利要求123至128中任一项所述的方法，其中所述最大耐受量包含足以诱发不良事件的所述药物组合物的量。
130.如权利要求129所述的方法，其中所述不良反应包含对所述药物组合物的免疫反应。
131.如权利要求130所述的方法，其中所述免疫反应包含炎症。
132.如权利要求131所述的方法，其中所述炎症是全身性的。
133.如权利要求131所述的方法，其中所述炎症是局部性的。
134.如权利要求129至133中任一项所述的方法，其中所述不良事件是严重的。
135.如权利要求134所述的方法，其中所述不良事件无法通过向所述受试者施用二级医疗来预防、减少或控制。
136.如权利要求120至135中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的所述治疗有效量包含具有在104与106之间(终点包括在内)的感染复数(MOI)的量。
137.如权利要求136所述的方法，其中所述药物组合物的所述治疗有效量包含具有在104与105之间(终点包括在内)的感染复数(MOI)的量。
138.如权利要求136所述的方法，其中所述药物组合物的所述治疗有效量包含具有105的感染复数(MOI)的量。
139.如权利要求120至135中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量包含在1x108gp与1x1013gp之间(终点包括在内)。
140.如权利要求120至135中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量包含在6x109gp与1x1013gp之间(终点包括在内)。
141.如权利要求120至135中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量包含在6x109gp与7x1012gp之间(终点包括在内)。
142.如权利要求120至135中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量包含在6x109gp与5x1012gp之间(终点包括在内)。
143.如权利要求120至135中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量包含在1x1010gp与1x1012gp之间(终点包括在内)。
144.如权利要求120至135中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量包含下列或由下列组成：1x1010gp。
145.如权利要求120至135中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量包含下列或由下列组成：1x1011gp。
146.如权利要求120至135中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量包含下列或由下列组成：1x1012gp。
147.如权利要求120至146中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量包含下列体积或由下列体积组成：在10μL与200μL之间(终点包括在内)。
148.如权利要求147所述的方法，其中所述治疗有效量包含下列体积或由下列体积组成：在10μL与50μL之间、在50μL与100μL之间、在100μL与150μL之间或在150μL与200μL之间(各范围的终点包括在内)。
149.如权利要求120至148中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量包含下列体积或由下列体积组成：在70μL与120μL之间(终点包括在内)。
150.如权利要求120至149中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量包含下列体积或由下列体积组成：100μL。
151.如权利要求120至150中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括注射或输注。
152.如权利要求120至151中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括视网膜下、脉络膜上或玻璃体内途径。
153.如权利要求120至152中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括视网膜下注射或输注。
154.如权利要求153所述的方法，其中所述视网膜下注射或输注包括2步骤视网膜下注射。
155.如权利要求120至152中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括脉络膜上注射或输注。
156.如权利要求120至155中任一项所述的方法，其中所述受试者是男性。
157.如权利要求156所述的方法，其中所述受试者是至少18岁。
158.如权利要求120至157中任一项所述的方法，其中所述受试者具有基因确诊的无脉络膜症。
159.如权利要求154所述的方法，其中所述受试者被鉴别为具有REP1基因的突变。
160.如权利要求120至159中任一项所述的方法，其中所述受试者在至少一个眼的黄斑中呈现无脉络膜症的临床征象。
161.如权利要求120至160中任一项所述的方法，其中所述受试者在至少一个眼具有34至73个字母的最佳矫正视力(BCVA)分数。
162.如权利要求120至161中任一项所述的方法，其中所述受试者具有轻微或早期阶段的无脉络膜症。
163.如权利要求120至162中任一项所述的方法，其中所述受试者具有晚期或严重的无脉络膜症。
164.如权利要求120至163中任一项所述的方法，其中所述方法包括治疗至少一个眼的10mm2的视网膜。
165.如权利要求164所述的方法，其中所述方法包括治疗至少一个眼的在5mm2与10mm2之间(终点包括在内)的视网膜。
166.如权利要求164所述的方法，其中所述方法包括治疗至少一个眼的在2mm2与15mm2之间(终点包括在内)的视网膜。
167.如权利要求120至166中任一项所述的方法，其中所述药物组合物向所述受试者的一个眼施用。
168.如权利要求120至162167中任一项所述的方法，其中所述药物组合物向所述受试者的双眼施用。
169.如权利要求168所述的方法，其中所述受试者的双眼同时治疗。
170.如权利要求169所述的方法，其中所述受试者的双眼依序治疗。
171.如权利要求120至170中任一项所述的方法，其中在向所述受试者施用所述药物组合物之前，所述受试者的至少一个眼已接受过无脉络膜症的治疗。
172.如权利要求120至171中任一项所述的方法，其中所述方法包括每个眼施用在1与12剂之间(终点包括在内)。
173.如权利要求172所述的方法，其中所述方法包括至少每天一次、每周一次、每月一次、每三个月一次、每6个月一次或每年一次施用至少一剂。
174.如权利要求173所述的方法，其中所述方法包括施用多剂且其中每一剂包含相同量的所述药物组合物。
175.如权利要求173所述的方法，其中所述方法包括施用多剂且其中每一剂包含不同量的所述药物组合物。
176.如权利要求172至175中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用多剂且其中每一后继剂包含比前一剂更大数量的完整rAAV。
177.如权利要求172至175中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用多剂且其中每一后继剂包含比前一剂更小数量的完整rAAV。
178.权利要求172至177中任一项所述的方法，其中所述受试者在一剂之后经历不良事件且其中所述后续剂包含比诱发所述不良事件之前一剂更小数量的完整rAAV。
179.权利要求178所述的方法，其中所述受试者从所述不良事件恢复且其中向所述受试者施用后续剂量的所述药物组合物。
180.权利要求179所述的方法，其中诱发所述不良事件的所述剂量和所述后续剂量含有相等数量的完整rAAV。
181.权利要求179所述的方法，其中诱发所述不良事件的所述剂量和所述后续剂量含有不相等数量的完整rAAV。
182.权利要求120至181中任一项所述的方法，其中所述方法在施用治疗有效量的所述药物组合物之前还包含向所述受试者施用多个安慰剂rAAV的量，其中每个安慰剂rAAV是空rAAV。
183.权利要求182所述的方法，其中所述空rAAV不含有表达外源性序列的启动子或外源性序列。
184.权利要求120至183中任一项所述的方法，其中施用所述多个安慰剂rAAV的量是全身性的。
185.权利要求120至183中任一项所述的方法，其中施用所述多个安慰剂rAAV的量是局部性的。
186.如权利要求182至185中任一项所述的方法，其中所述方法还包括
(a)确定所述多个安慰剂rAAV是否诱发所述受试者的免疫反应和/或
(b)确定所述受试者是否发展出对所述多个安慰剂rAAV的免疫耐受性，由此表明施用治疗有效量的所述药物组合物应该不会诱发所述受试者的免疫介导的不良事件。
187.如权利要求120至186中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用免疫反应的抑制剂。
188.如权利要求187所述的方法，其中所述抑制剂包含抗发炎剂。
189.如权利要求188所述的方法，其中所述抗发炎剂包含皮质类固醇。
190.权利要求189所述的方法，其中所述皮质类固醇包含强的松或泼尼松龙。
191.权利要求187至190中任一项所述的方法，其中所述施用所述免疫反应的抑制剂是全身性的。
192.权利要求191所述的方法，其中所述免疫反应的抑制剂口服施用。
193.权利要求187至190中任一项所述的方法，其中所述施用所述免疫反应的抑制剂是局部性的。
194.权利要求193所述的方法，其中所述免疫反应的抑制剂向用所述药物组合物治疗过的眼施用。
195.权利要求187至194中任一项所述的方法，其中所述药物组合物和所述免疫反应的抑制剂同时施用。
196.权利要求195所述的方法，其中所述药物组合物和所述免疫反应的抑制剂在同一天施用。
197.权利要求187至194中任一项所述的方法，其中所述药物组合物和所述免疫反应的抑制剂依序施用。
198.权利要求197所述的方法，其中所述抑制剂在所述施用所述药物组合物至少一天之前施用。
199.权利要求193所述的方法，其中所述药物组合物在所述施用所述抑制剂至少一天之前施用。
200.权利要求120至199中任一项所述的方法，其中所述方法还包括确定所述受试者的至少一个眼的无脉络膜症介导的伤害的初始严重性。
201.如权利要求120至200中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在向所述至少一个眼施用所述药物组合物之后确定所述受试者的所述至少一个眼的无脉络膜症介导的伤害的后续严重性。
202.如权利要求200或201所述的方法，其中所述无脉络膜症介导的伤害的所述初始或后续严重性通过下列确定：确定最佳矫正视力(BCVA)测试分数、测量存活视网膜组织的面积或体积、测量保留椭圆体带、测量视网膜敏感度、测量对比敏感度、测量色视觉、测量低亮度视敏度、测量速读或其任何组合。
203.如权利要求202所述的方法，其中所述BCVA测试利用(糖尿病视网膜病变早期治疗研究)ETDRS表。
204.如权利要求202或203所述的方法，其中所述BCVA测试包含手指计数、手移动、光感知和其组合中的一种或多种的评估。
205.如权利要求202所述的方法，其中存活视网膜组织包含眼底自发荧光且其中测量存活视网膜组织包括检测眼底自发荧光的水平或模式。
206.如权利要求202所述的方法，其中测量保留椭圆体带包括频域光学相干断层扫描(SD-OCT)。
207.如权利要求202所述的方法，其中测量视网膜敏感度包括微视野检查。
208.如权利要求120至207中任一项所述的方法，其中施用所述治疗有效量的所述药物组合物抑制或减少无脉络膜症的征象或症状的进展。
209.如权利要求120至207中任一项所述的方法，其中施用所述治疗有效量的所述药物组合物减少无脉络膜症的征象或症状。
210.如权利要求120至207中任一项所述的方法，其中无脉络膜症的征象或症状包括光感受器细胞丧失、RPE细胞丧失、视敏度降低、低亮度视敏度降低、保留自发荧光(AF)总面积、BCVA测试分数低、保留椭圆体带的面积减小、视网膜敏感度降低、对比敏感度降低、色视觉降低或变淡、速读速度降低或其任何组合。
211.如权利要求210所述的方法，其中所述无脉络膜症的征象或症状的严重性相对于健康视网膜确定。
212.如权利要求211所述的方法，其中所述健康视网膜属于年龄匹配的对照受试者。
213.一种确定如权利要求38至212中任一项所述的药物组合物的治疗有效量的方法，所述方法包括：
(a)测量待治疗的受试者的视网膜区，
(b)确定所述(a)的区是否在中央0.5mm2凹区中或在黄斑中，
(c)计算所述(a)的区中的杆状细胞、锥状细胞和视网膜色素上皮(RPE)细胞的数量，和
(d)将细胞总数乘以1x105的感染复数(MOI)以计算待包括在所述治疗有效量中的基因组粒子(gp)的数量，
其中所述待治疗的视网膜的最大面积是10mm2，
其中所述视网膜中RPE细胞的密度是5,000个细胞/mm2，
其中所述视网膜中杆状细胞的密度是75,000个杆状细胞/mm2(不包括所述中央0.5mm2凹区)，
其中所述视网膜中锥状细胞的密度在所述中央0.5mm2凹区中是150,000个锥状细胞/mm2，且所述视网膜中锥状细胞的密度在所述中央0.5mm2凹区以外的黄斑中是25,000个/mm2。
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