JP2023550548A

JP2023550548A - 操作されたウイルスカプシドおよび使用方法

Info

Publication number: JP2023550548A
Application number: JP2023552156A
Authority: JP
Inventors: リウ，シェンジアン; チェン，ハイフェン; ゴン，シャオミン
Original assignee: アビラマックス・バイオファーマ・インコーポレイテッド
Priority date: 2020-11-10
Filing date: 2021-11-09
Publication date: 2023-12-01
Also published as: US20240035045A1; AU2021378270A1; CA3196439A1; WO2022103766A3; AU2021378270A9; KR20230107285A; EP4243848A2; WO2022103766A2; CN117062615A

Abstract

改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドを含む組成物および方法が、本明細書において提供される。提供された組成物を利用する方法および眼用治療薬としての方法も提供される。【選択図】図１

Description

[0001]相互参照
本願は、２０２０年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６３／１１１，７３９号の利益を主張するものであり、なお、この出願の全体が参照により本明細書に組み入れられる。

[0002]配列リスト
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいて電子的に提出されており、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる配列リストを含む。２０２１年１１月８日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、５９５６１７０１６０１＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、１９８，１０２バイトのサイズである。

[0003]アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子導入のための効率的で安全なベクターとしてかなりの注目を集めている非エンベロープタンパク質カプシドを伴う、小さな一本鎖ＤＮＡを含む非病原性のパルボウイルスである。組換えＡＡＶベクターは、１７６のフェーズＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの臨床試験において使用されたかまたは現在使用されている。ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ベクターは、３つのヒト疾患：レーバーの先天性黒内障（ＬＣＡ）、芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ不全（ＡＡＤＣ）、および先天性脈絡膜欠如において、臨床効果を示している。

[0004]過去の１０年間において、一部は非ヒト霊長類に由来する、少なくとも１２の追加のＡＡＶ血清型ベクターが、利用可能となった。ＡＡＶ１ベクターは、リポタンパク質リパーゼ欠損症に対する遺伝子療法において良好に使用されており、ＡＡＶ８ベクターは、血友病Ｂに対する可能性のある遺伝子療法において臨床効果を示している。より近年では、ＡＡＶ５ベクターが、血友病Ａにおいて効果的であるとして報告されている。ＡＡＶ９ベクターは、ポンペ病に対する遺伝子療法において良好に使用されており、脊髄筋萎縮に対する遺伝子療法において素晴らしい有効性を示した。ＡＡＶ１－ＬＰＬベクターは、アリポジーンチパルボベックと命名された薬物として承認され、２０１２年にヨーロッパにおいてＧｌｙｂｅｒａの商品名で販売された。２０１７年に、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）を発現するＡＡＶ２ベクターが、薬物ボレチジーンネパルボベック（Ｌｕｘｔｕｒｎａ）として、合衆国において食品医薬品局によって承認された。様々なヒト疾患に対する可能性のある遺伝子療法のために、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ１０ベクターによっていくつかの追加のフェーズＩおよびＩＩの臨床試験が行われたかまたは現在行われている。

[0005]これらの顕著な実績にもかかわらず、この技術の最大限の可能性は、改良されたカーゴ送達のためにＡＡＶベクターが改変された後にのみ、実現されることがより一層明確となった。

[0006]その他は同等の非改変ＡＡＶカプシドと比較して、ＡＡＶカプシドのＶＰドメインにおける外因性ポリペプチド配列を含む改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドが、本明細書において提供される。ある態様において、外因性ポリペプチド配列は、式１の配列：Ｘ０－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ１－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４－Ｘ５（配列番号９３）を含み、式中、Ｘ０は、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、またはメチオニン（Ｍ）であり、Ｘ１は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）であり、Ｘ２は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭであり、Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、またはＱであり、Ｘ４は、Ｋ、Ｒ、Ｅ、またはＡであり、任意選択で、式１は、プロリン（Ｐ）またはＲであるＸ５をさらに含む。ある実施形態において、式１は、Ｘ_５を含み、この場合、Ｘ_５は、プロリン（Ｐ）またはＲである。ある実施形態において、カプシドは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、およびその任意の組合せである。ある実施形態において、カプシドは、ＡＡＶ２を含む。ある実施形態において、カプシドは、少なくとも２つの血清型を含む。ある実施形態において、当該少なくとも２つの血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、およびＡＡＶ１３から選択される。ある実施形態において、式１は、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９４）、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９５）、またはＶ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９６）を含む。ある実施形態において、式１は、Ｖ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９６）を含み、この場合、Ｖ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９６）は、Ｖ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号９７）またはＶ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｋ（配列番号９８）を含む。ある実施形態において、式１は、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９４）を含み、この場合、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９４）は、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号９９）またはＬ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｓ－Ｘ４（配列番号１００）を含む。ある実施形態において、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号９９）は、ａ）Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｒ（配列番号１０１）；ｂ）Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｋ（配列番号１０２）；ｃ）Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｅ（配列番号１０３）；またはｄ）Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ａ（配列番号１０４）を含む。ある実施形態において、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｓ－Ｘ４（配列番号１００）は、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｓ－Ｋ（配列番号１０５）を含む。ある実施形態において、式１は、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９５）を含み、この場合、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９５）は、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号１０６）を含む。ある実施形態において、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号１０６）は、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｋ（配列番号１０７）を含む。ある実施形態において、式１は、表２の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。ある実施形態において、式１は、表２のポリペプチド配列を含む。ある実施形態において、ＡＡＶカプシドのＶＰドメインは、ＶＰ１である。ある実施形態において、ＡＡＶカプシドのＶＰドメインは、ＶＰ２である。ある実施形態において、ＡＡＶカプシドのＶＰドメインは、ＶＰ３である。ある実施形態において、ＡＡＶカプシドは、変異をさらに含む。ある実施形態において、変異は、ＶＰ１またはＶＰ２領域にある。ある実施形態において、変異は、ＶＰ１またはＶＰ３領域にある。ある実施形態において、変異は、ＶＰ２またはＶＰ３領域にある。ある実施形態において、変異は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３領域にある。ある実施形態において、変異は、点変異、ミスセンス変異、ナンセンス変異、欠失、重複、フレームシフト、または反復伸長である。ある実施形態において、変異は、点変異である。ある実施形態において、点変異は、保存的変異を含む。ある実施形態において、保存的変異は、非極性脂肪族アミノ酸から非極性脂肪族アミノ酸、極性アミノ酸から極性アミノ酸、正に帯電したアミノ酸から正に帯電したアミノ酸、負に帯電したアミノ酸から負に帯電したアミノ酸、および芳香族アミノ酸から芳香族アミノ酸からなる群から選択される。ある実施形態において、点変異は、帯電したアミノ酸残基から極性または非極性アミノ酸残基への変化を含む。ある実施形態において、帯電したアミノ酸は、正に帯電している。ある実施形態において、帯電したアミノ酸は、負に帯電している。ある実施形態において、変異は、配列番号１の残基においてである。ある実施形態において、変異は、配列番号１の４５２、４５３、４６６、４６７、４６８、４７１、５８５、５８６、５８７、および５８８からなる群から選択される残基においてである。ある実施形態において、点変異は、配列番号１の５８５位または５８８位におけるＲからＡである。ある実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶカプシドのＶＰ１ドメインにおける少なくとも第２の外因性ポリペプチド配列をさらに含む。ある実施形態において、外因性ポリペプチド配列および第２の外因性ポリペプチド配列は、それぞれ独立して、ＡＡＶカプシドのループにある。ある実施形態において、外因性ポリペプチド配列および第２の外因性ポリペプチド配列は、それぞれ独立して、ＡＡＶカプシドのＶＰ１ドメインのループ３および／またはループ４にある。

[0007]（ａ）外因性配列を欠くその他は同等のＡＡＶカプシド配列と比較して、ＶＰドメインの少なくとも２つのループにおける外因性配列を含む改変されたカプシド；および（ｂ）導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、複数の細胞と接触すると、複数の細胞と（ａ）を欠くその他は同等のＡＡＶベクターとの接触と比較して、前記複数の細胞における接触後において導入遺伝子の少なくとも３倍の発現の増加を有する、ベクターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、本明細書において提供される。ある実施形態において、外因性配列は、式１：Ｘ０－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ１－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号１０８）を含むポリペプチドをコードし、式中、Ｘ０は、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、またはメチオニン（Ｍ）であり、Ｘ１は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）であり、Ｘ２は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭであり、Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、またはＱであり、Ｘ４は、Ｋ、Ｒ、Ｅ、またはＡであり、任意選択で、式１は、プロリン（Ｐ）またはＲであるＸ５をさらに含む。ある態様において、式１は、Ｘ_５を含み、この場合、Ｘ_５は、プロリン（Ｐ）またはＲである。ある実施形態において、カプシドは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、およびその任意の組合せのカプシドである。ある実施形態において、カプシドは、ＡＡＶ２を含む。ある態様において、カプシドは、少なくとも２つの血清型を含む。ある実施形態において、当該少なくとも２つの血清型は、ＡＡＶ２およびＡＡＶ５、ＡＡＶ２およびＡＡＶ６、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８、ＡＡＶ２およびＡＡＶ９、ＡＡＶ２およびＡＡＶ１、ならびにＡＡＶ２およびＡＡＶ１２である。ある実施形態において、式１は、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９４）、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９５）、またはＶ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９６）を含む。ある実施形態において、式１は、Ｖ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９６）を含み、この場合、Ｖ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９６）は、Ｖ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号９７）またはＶ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｋ（配列番号９８）を含む。ある実施形態において、式１は、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９４）を含み、この場合、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９４）は、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号９９）またはＬ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｓ－Ｘ４（配列番号１００）を含む。ある実施形態において、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号９９）は、ａ）Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｒ（配列番号１０１）；ｂ）Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｋ（配列番号１０２）；ｃ）Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｅ（配列番号１０３）；またはｄ）Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ａ（配列番号１０４）を含む。ある実施形態において、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｓ－Ｘ４（配列番号１００）は、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｓ－Ｋ（配列番号１０５）を含む。ある実施形態において、式１は、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９５）を含み、この場合、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９５）は、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号１０６）を含む。ある実施形態において、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号１０６）は、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｋ（配列番号１０７）を含む。ある実施形態において、式１は、表２の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。ある実施形態において、式１は、表２のポリペプチド配列を含む。ある実施形態において、ＶＰはＶＰ１である。ある実施形態において、ＶＰはＶＰ２である。ある実施形態において、ＶＰはＶＰ３である。ある実施形態において、少なくとも２つのループは、ＶＰ１ドメインのループ３およびループ４である。ある実施形態において、導入遺伝子は、眼用治療薬をコードする。ある実施形態において、眼用治療薬は、少なくとも網膜疾患の症状を減少させる、網膜疾患を処置する、または網膜疾患を排除するのに効果的である。ある実施形態において、眼用治療薬は、抗体もしくはその生物学的に活性な断片および生物製剤からなる群から選択される。ある実施形態において、治療薬は生物製剤であり、この場合、生物製剤は、リポタンパク質リパーゼ、レチノイドイソメロヒドロラーゼＲＰＥ６５、または補体因子Ｈから選択されるポリペプチドを含む。ある実施形態において、治療薬は、抗体またはその生物学的に活性な断片であり、この場合、抗体またはその生物学的に活性な断片は、抗ＶＥＧＦ、抗ＶＥＧＦＬ、抗トロンボスポンジン１、抗ＣＤ４７、抗ＴＮＦアルファ、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ５２、および抗ＣＤ１１ａ、抗補体因子５および抗補体因子３から選択される。ある実施形態において、網膜疾患は、色盲、新生血管形成関連網膜障害、例えば、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、滲出型加齢黄斑変性症（ｗＡＭＤ）、地図状萎縮（ＧＡ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、緑内障、バーデット・ビードル症候群、ベスト病、先天性脈絡膜欠如、レーバー先天性黒内障、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、黄斑変性、ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）、網膜色素変性症、レフサム病、シュタルガルト病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）、遺伝性網膜疾患（ＩＲＤ）、桿体錐体ジストロフィー、錐体桿体ジストロフィー、小口病、ＭａｌａｔｔｉａＬｅｖｅｎｔｉｎｅｓｅ（家族性優性ドルーゼン）、青色錐体一色型色覚異常、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）、およびぶどう膜炎黄斑浮腫（ＵＭＯ）などからなる群から選択される。ある実施形態において、網膜疾患は、ＡＭＤである。ある実施形態において、ＡＭＤは滲出型ＡＭＤである。ある実施形態において、ＡＭＤは萎縮型ＡＭＤである。ある実施形態において、ベクターは、Ｒｅｐをコードする配列をさらに含む。ある実施形態において、Ｒｅｐは、改変されており、この場合、改変は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、またはＲｅｐ４０の少なくとも１つにある。ある実施形態において、Ｒｅｐは、カプシドとは異なるＡＡＶ血清型である。ある実施形態において、ＶＰはＶＰ１である。ある実施形態において、ＶＰはＶＰ２である。ある実施形態において、ＶＰはＶＰ３である。ある実施形態において、発現の増加は、複数の細胞と（ａ）を欠くその他は同等のＡＡＶベクターとの接触と比較して、少なくとも５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、または５００倍の増加を含む。ある実施形態において、改変されたカプシドは、配列番号２８～配列番号４７を含む配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を含む。ある実施形態において、ベクターは、配列番号３４の改変されたカプシドを含む。

[0008]改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドを含む操作されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンが、本明細書において提供される。

[0009]複数のＡＡＶビリオンを含む組成物も、本明細書において提供される。

[0010]ベクターを細胞にトランスフェクトすることによって生成された操作された細胞、または操作されたビリオンも、本明細書において提供される。

[0011]操作された細胞から単離された複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子が、本明細書において提供される。

[0012]単位剤形においてアデノ随伴ウイルス粒子を含む組成物が、本明細書において提供される。ある実施形態において、組成物は低温保存される。

[0013]ａ）改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシド；ｂ）ベクター；またはｃ）操作されたビリオンを含む容器が提供される。ある実施形態において、容器は、バイアル、注射器、または針である。ある実施形態において、容器は、眼送達のために構成される。

[0014]ａ）改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシド；ｂ）ベクター；またはｃ）操作されたビリオンを含む医薬組成物が提供される。ある実施形態において、医薬組成物は、単位剤形である。

[0015]複数の細胞をベクターまたは操作されたビリオンと接触させる工程を含む、操作された細胞を作製する方法も提供される。

[0016]表２の外因性配列を含む改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドが提供される。ある態様において、カプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびその組合せからなる群から選択される血清型である。

[0017]改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドを作製する方法であって、表２の配列をコードするポリ核酸を、ＡＡＶカプシドをコードする配列に導入し、それにより、改変されたＡＡＶカプシドを生成する工程を含む、方法が提供される。ある態様において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびその組合せからなる群から選択される血清型である。

[0018]疾患または状態の処置を必要とする対象における疾患または状態を処置する方法であって、外因性ポリペプチド配列を欠くその他は同等のＡＡＶカプシド配列と比較して、ＶＰドメインの少なくとも２つのループにおける外因性ポリペプチド配列を含む改変されたカプシドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む医薬組成物の治療有効量を投与する工程を含み、外因性ポリペプチド配列は、表２の配列を含む、方法が提供される。ある態様において、ＡＡＶベクターは、導入遺伝子を含む配列をさらに含む。

[0019]疾患または状態の処置を必要とする対象における疾患または状態を処置する方法であって、（ａ）外因性配列を欠くその他は同等のＡＡＶカプシド配列と比較して、ＶＰドメインの少なくとも２つのループにおける外因性配列を含む改変されたカプシド；および（ｂ）導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む医薬組成物の治療有効量を投与する工程を含み、ベクターが、複数の細胞と接触すると、複数の細胞と（ａ）を欠くその他は同等のＡＡＶベクターとの接触と比較して、複数の細胞におけるトランスフェクション後において導入遺伝子の少なくとも３倍の増加した発現を有する、方法が提供される。ある態様において、発現の増加は、複数の細胞と（ａ）を欠くその他は同等のＡＡＶベクターとの接触と比較して、少なくとも５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、または５００倍の増加を含む。

[0020]疾患または状態の処置を必要とする対象における疾患または状態を処置する方法であって、その他は同等の非改変ＡＡＶカプシドと比較して、ＡＡＶカプシドのＶＰドメインにおける外因性ポリペプチド配列を含む改変されたカプシドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む医薬組成物の治療有効量を投与する工程を含み、外因性ポリペプチド配列は、式１の配列：Ｘ０－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ１－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号１０８）を含み、式中、Ｘ０は、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、またはメチオニン（Ｍ）であり、Ｘ１は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）であり、Ｘ２は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭであり、Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、またはＱであり、Ｘ４は、Ｋ、Ｒ、Ｅ、またはＡであり、任意選択で、式１は、プロリン（Ｐ）またはＲであるＸ５をさらに含む、方法も提供される。ある態様において、式１は、Ｘ_５を含み、この場合、Ｘ_５は、プロリン（Ｐ）またはＲである。ある態様において、カプシドは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、およびその任意の組合せである。ある態様において、カプシドは、ＡＡＶ２を含む。ある実施形態において、カプシドは、少なくとも２つの血清型を含む。ある実施形態において、当該少なくとも２つの血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、およびＡＡＶ１３から選択される。ある実施形態において、式１は、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９４）、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９５）、またはＶ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９６）を含む。ある実施形態において、式１は、Ｖ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９６）を含み、この場合、Ｖ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９６）は、Ｖ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号９７）またはＶ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｋ（配列番号９８）を含む。ある実施形態において、式１は、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９４）を含み、この場合、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９４）は、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号９９）またはＬ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｓ－Ｘ４（配列番号１００）を含む。ある実施形態において、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号９９）は、ａ）Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｒ（配列番号１０１）；ｂ）Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｋ（配列番号１０２）；ｃ）Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｅ（配列番号１０３）；またはｄ）Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ａ（配列番号１０４）を含む。ある実施形態において、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｓ－Ｘ４（配列番号１００）は、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｓ－Ｋ（配列番号１０５）を含む。ある実施形態において、式１は、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９５）を含み、この場合、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９５）は、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号１０６）を含む。ある実施形態において、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号１０６）は、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｋ（配列番号１０７）を含む。ある実施形態において、式１は、表２の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。ある実施形態において、式１は、表２のポリペプチド配列を含む。ある実施形態において、投与する工程は、硝子体内注射、網膜下注射、マイクロインジェクション、または超眼注射によって行われる。ある実施形態において、投与する工程は、硝子体内注射によって行われる。ある実施形態において、疾患または状態は、眼疾患または状態である。ある実施形態において、疾患または状態は、非眼疾患または状態である。ある実施形態において、眼疾患または状態は、網膜疾患または状態である。ある実施形態において、眼疾患または状態は、色盲、新生血管形成関連網膜障害、例えば、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、滲出型加齢黄斑変性症（ｗＡＭＤ）、地図状萎縮（ＧＡ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、緑内障、バーデット・ビードル症候群、ベスト病、先天性脈絡膜欠如、レーバー先天性黒内障、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、黄斑変性、ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）、網膜色素変性症、レフサム病、シュタルガルト病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）、遺伝性網膜疾患（ＩＲＤ）、桿体錐体ジストロフィー、錐体桿体ジストロフィー、小口病、ＭａｌａｔｔｉａＬｅｖｅｎｔｉｎｅｓｅ（家族性優性ドルーゼン）、青色錐体一色型色覚異常、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）、およびぶどう膜炎黄斑浮腫（ＵＭＯ）などからなる群から選択される。ある実施形態において、眼疾患または状態は、ＡＭＤである。ある実施形態において、ＡＭＤは滲出型ＡＭＤである。ある実施形態において、ＡＭＤは萎縮型ＡＭＤである。ある実施形態において、投与する工程は、少なくとも疾患もしくは状態の症状を減少させる、疾患もしくは状態を処置する、および／または疾患もしくは状態を排除するのに十分である。ある実施形態において、ベクターは、治療ポリペプチドをコードする導入遺伝子をさらに含む。ある実施形態において、治療薬は、抗体もしくはその生物学的に活性な断片または生物製剤からなる群から選択される。ある実施形態において、治療薬は生物製剤であり、この場合、生物製剤は、リポタンパク質リパーゼ、レチノイドイソメロヒドロラーゼＲＰＥ６５、補体因子Ｈから選択されるポリペプチドを含む。ある実施形態において、治療薬は、抗体またはその生物学的に活性な断片であり、この場合、抗体またはその生物学的に活性な断片は、抗ＶＥＧＦ、抗ＶＥＧＦＬ、抗トロンボスポンジン１、抗ＣＤ４７、抗ＴＮＦアルファ、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ５２、および抗ＣＤ１１ａから選択される。ある実施形態において、投与する工程の前に、対象は、遺伝子検査を受ける。ある実施形態において、遺伝子検査は、ＲＰＥ６５、ＣＲＢ１、ＡＩＰＬ１、ＣＦＨ、またはＲＰＧＲＩＰから選択される遺伝子における変異を検出する。ある実施形態において、投与する工程は、約１．０×１０^９ｖｇ、１．０×１０^１０、１．０×１０^１１ｖｇ、３．０×１０^１１ｖｇ、６×１０^１１ｖｇ、８．０×１０^１１ｖｇ、１．０×１０^１２ｖｇ、１．０×１０^１３ｖｇ、１．０×１０^１４ｖｇ、または１．０×１０^１５ｖｇのベクターの投薬量を送達する工程を含む。ある実施形態において、投与する工程は反復される。ある実施形態において、投与する工程は、１日２回、１日おき、１週間あたり２回、隔月、３カ月ごと、１カ月あたり１回、１カ月おき、半年ごと、毎年、または年２回実施される。ある実施形態において、当該方法は、さらに、二次療法を投与する工程を含む。ある実施形態において、ＶＰはＶＰ１を含む。ある実施形態において、ＶＰはＶＰ２を含む。ある実施形態において、ＶＰはＶＰ３を含む。

[0021]参照による組み入れ
本明細書において言及した全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み入れられることが具体的かつ個別的に示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられるものとする。

[0022]本開示の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲における詳細と共に、示される。本開示の特徴および利点のより良い理解は、本開示の原理が利用される実例的な実施形態を示す以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することにより得られ、その図面は以下である：

[0023]ＡＡＶ２カプシドおよびそのバリアントの構造モデリングを示す図である。左パネルは、灰色に色付けされた６０ｍｅｒのＡＡＶ２カプシドを示し、参照単量体が濃い灰色で色付けされ、各単量体上の挿入について異なる色で示される。右パネルは、ループ３およびループ４にペプチド挿入を有する、ＡＡＶ２の単量体ＶＰを示す。 [0024]ＡＡＶ２ベクターの純度を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。Ｍ、タンパク質ラダー；レーン１～１０、ＡＭＩ０５１～ＡＭＩ０５７、Ｖ４６７、７ｍ８対照ベクター、および野生型（ＷＴ）対照ＡＡＶ２。各レーンは、１ｅ＋１１ｖｇをロードされた。 [0025]ヒト細胞株における改変されたＡＡＶ２カプシドバリアントの形質導入効率を示す図である。ＨＥＫ２９３およびＡＲＰＥ－１９細胞は、ＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰベクターの野生型（ｗｔ．、ＡＡＶ２－Ｖ１０４）および改変されたカプシドバリアント（ＡＡＶ２－Ｖ４６６、ＡＡＶ２－Ｖ４６７、およびＡＡＶ２－Ｖ４７１）で、１ｅ＋５ｖｇ／細胞のＭＯＩにおいて形質導入された。ヒト細胞株における改変されたＡＡＶ２カプシドバリアントの形質導入効率を示す図である。ＨＥＫ２９３導入遺伝子発現は、形質導入から７２時間後、蛍光顕微鏡観察により分析された。図３Ｃおよび図３Ｄは、本明細書に記載された、改変されたＡＡＶ：アミノ酸残基５８８位（アスパラギン、Ｎ）の後にＬＡＬＧＱＴＴＫＰＡ外因性ポリペプチド（配列番号１４）の挿入を含む改変されたＡＡＶ１；アミノ酸残基５８８位（セリン、Ｓ）の後にＬＡＬＧＱＴＴＫＰＡ外因性ポリペプチド（配列番号１４）のＳ５８８挿入を含む改変されたＡＡＶ２；およびアミノ酸残基５８８位（セリン、Ｓ）の後にＬＡＬＧＱＴＴＫＰＡ外因性ポリペプチド（配列番号１４）のＳ５８８挿入を含む改変されたＡＡＶ６により形質導入されたヒトＨＥＫ２９３細胞（図３Ｃ）およびヒトＡＲＰＥ－１９細胞（図３Ｄ）におけるＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ発現のＥＬＩＳＡ測定を示す。図３Ｃおよび図３Ｄは、本明細書に記載された、改変されたＡＡＶ：アミノ酸残基５８８位（アスパラギン、Ｎ）の後にＬＡＬＧＱＴＴＫＰＡ外因性ポリペプチド（配列番号１４）の挿入を含む改変されたＡＡＶ１；アミノ酸残基５８８位（セリン、Ｓ）の後にＬＡＬＧＱＴＴＫＰＡ外因性ポリペプチド（配列番号１４）のＳ５８８挿入を含む改変されたＡＡＶ２；およびアミノ酸残基５８８位（セリン、Ｓ）の後にＬＡＬＧＱＴＴＫＰＡ外因性ポリペプチド（配列番号１４）のＳ５８８挿入を含む改変されたＡＡＶ６により形質導入されたヒトＨＥＫ２９３細胞（図３Ｃ）およびヒトＡＲＰＥ－１９細胞（図３Ｄ）におけるＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ発現のＥＬＩＳＡ測定を示す。 [0026]２８日目におけるＧＦＰ発現の代表的なフラットマウント画像を示す図である。ＧＦＰ発現は、ホールマウント染色後、マウス網膜フラットマウント上で調べられた。群２および３におけるＧＦＰ発現は、有意によりロバストであり、それゆえに、画像は、細胞内ＧＦＰが識別され得るように、より低いゲイン設定で取得された。 [0027]２８日目の眼の免疫組織化学的分析からの代表的な画像を示す図である。３つの異なる抗体カクテルが、発現したＧＦＰ局在化を評価するために利用された。ＧＦＰは、群３の眼において豊富であったため、一次および二次抗体は、それの全部を完全には捕獲せず、その結果として、免疫標識ＧＦＰに加えて、内因性ＧＦＰの検出を生じた（群３、カラム１）。 [0028]イメージングされた全ての３つの抗体カクテルおよび眼にわたるＧＦＰ発現のグラフ表示である。ＧＦＰ発現は、全ての眼にわたる眼発現の調査について、全ての網膜層および網膜外層、ならびに使用された全ての抗体カクテルにわたって、スコアリングされた；各眼は一行によって表されている。灰色セルは、陽性ＧＦＰ発現が観察された場所を示す；白色セルは、ＧＦＰ発現の欠如を示す。略語：ＧＣＬ／ＩＬＭ－神経節細胞層／内境界膜；ＩＰＬ－内網状層；ＩＮＬ－内顆粒層；ＯＰＬ－外網状層；ＯＮＬ－外顆粒層；ＩＳ－内節；ＯＳ－外節；ＲＰＥ－網膜色素上皮；Ｃ－脈絡膜；Ｓ－強膜；Ｍ－筋肉；ＯＮＨ－視神経乳頭。 [0029]眼のｉｎｖｉｖｏ眼底イメージングおよび免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色を示す図であり、野生型（ｗｔ）ＡＡＶ２が、マウスの眼の硝子体内に（ＩＶＴ）投与された。ＷｔＡＡＶ２－ＧＦＰは、眼底イメージングとＩＨＣ切片の両方に示されているように、十分なＧＦＰ発現には至らなかった。図は配列番号１３３を開示する。 [0030]眼のｉｎｖｉｖｏ眼底イメージングおよびＩＨＣ染色を示す図であり、本明細書に記載された、改変されたＡＡＶ２（アミノ酸残基５８７の後に挿入されたＬＫＬＧＱＴＴＫＰＡ（配列番号１３）を有する改変されたＡＡＶ２を含むＡＡＶ２－ＡＭＩ０５３－ＧＦＰ）が、マウスの眼へＩＶＴ経路を介して投与された。改変されたＡＡＶ２は、眼底イメージングおよびＩＨＣ切片においてＧＦＰ発現を示し、ＧＦＰシグナルは、細胞の複数の層で検出された。図は配列番号１１６を開示する。 [0031]眼のｉｎｖｉｖｏ眼底イメージングおよびＩＨＣ染色を示す図であり、本明細書に記載された、改変されたＡＡＶ２（アミノ酸残基５８７の後に挿入されたＬＡＬＧＱＴＴＫＰＡ（配列番号１４）を有する改変されたＡＡＶ２を含むＡＡＶ２－ＡＭＩ０５４－ＧＦＰ）が、マウスの眼へＩＶＴ経路を介して投与された。改変されたＡＡＶ２は、眼底イメージングおよびＩＨＣ切片においてＧＦＰ発現を示し、ＧＦＰシグナルは、細胞の複数の層で検出された。図は配列番号１１７を開示する。 [0032]眼のｉｎｖｉｖｏ眼底イメージングおよびＩＨＣ染色を示す図であり、本明細書に記載された、改変されたＡＡＶ２（アミノ酸残基４５３の後に挿入されたＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号６）を有する改変されたＡＡＶ２を含むＡＡＶ２－Ｖ４６６－ＧＦＰ）が、マウスの眼へＩＶＴ経路を介して投与された。改変されたＡＡＶ２は、眼底イメージングおよびＩＨＣ切片においてＧＦＰ発現を示し、ＧＦＰシグナルは、細胞の複数の層で検出された。図は配列番号１１０を開示する。 [0033]野生型（Ｗｔ）かまたは本明細書に記載された、改変されたＡＡＶかのいずれかで形質導入された眼の異なる眼線維層におけるＡＡＶ形質導入を示すＡＡＶ網膜形質導入指数（ＡＲＣＴＩ）を示す図である。 [0034]マウスレーザー誘発性脈絡膜新生血管形成（ＬＣＮＶ）研究の結果を示す図であり、改変されたＡＡＶがＬＣＮＶの前にマウスへ投与された。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、またはＡＡＶ６は、ＶＰ１カプシドにおけるＬＡＬＧＱＴＴＫＰＡ（配列番号１４）の挿入で改変され、マウスの眼への送達のための導入遺伝子としてアフリベルセプト（ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ）を有する。改変されたＡＡＶ１（群５、ＡＡＶ１．Ｎ５４－アフリベルセプト）は、ＶＰ１カプシドのＳ５８８アミノ酸残基の後に挿入されたＬＡＬＧＱＴＴＫＰＡ（配列番号１４）を含む。ＡＡＶ２（群３、ＡＡＶ２．Ｎ５４－アフリベルセプト）は、ＶＰ１カプシドのＮ５８７アミノ酸残基の後に挿入されたＬＡＬＧＱＴＴＫＰＡ（配列番号１４）を含む。ＡＡＶ６（群４、ＡＡＶ６．Ｎ５４－アフリベルセプト）は、ＶＰ１カプシドのＳ５８８アミノ酸残基の後に挿入されたＬＡＬＧＱＴＴＫＰＡ（配列番号１４）を含む。 [0035]図１３Ａは、図１２のＬＣＮＶ研究からの眼における脈絡膜新生血管形成の面積を示す図である。Δアフリベルセプトは、オープンリーディングフレームに破壊を含むＡＡＶがマウスの眼に投与された、シャム対照である。媒体群と比較して、全ての３つの改変されたＡＡＶ群は、眼における脈絡膜新生血管形成の面積の有意な減少を示した（ＡＡＶ６．Ｎ５４－アフリベルセプト、ｐ＜０．００１；ＡＡＶ１．Ｎ５４－アフリベルセプト、ｐ＜０．０１；およびＡＡＶ２．Ｎ５４－アフリベルセプト、ｐ＜０．０５）。図１３Ｂは、ＡＡＶ６．Ｎ５４－アフリベルセプトを投与された群が、眼における脈絡膜新生血管形成の面積の有意な減少を示し続けたことを示す図である（ＡＡＶ６．Ｎ５４－アフリベルセプト、ｐ＜０．０５）。 [0036]図１２からのＬＣＮＶ研究マウスから得られた眼（左および中央パネル）および血清（右パネル）試料におけるアフリベルセプト濃度を示す図である。 [0037]図１２からのマウスにおける、ＬＣＮＶにより誘発された網膜損傷に対する網膜アフリベルセプト保護効果のフルオレセイン血管造影法（ＦＡ）分析を示す図である。レーザー処理により引き起こされた網膜傷害に対する眼杯におけるアフリベルセプト濃度の相関は、逆相関であった。 [0038]２１日目の眼底画像を示す図である。眼の後部が、カラーチャネルとコバルトブルーチャネルの両方においてイメージングされた。ＧＦＰ発現についてのイメージング取得設定は、群６の動物において較正され、レベルは、本研究にわたって一貫性を保たれた。 [0039]２８日目の眼の免疫組織化学的分析からの代表的な画像を示す図である。凍結切片（１４μｍ）は、ＧＦＰ、ＲＰＥ６５、ファロイジン、およびＤＡＰＩの局在化について評価された。マージされた画像は、左に示され、ＧＦＰチャネルのプルアウトは右に示されている。 [0040]共焦点顕微鏡観察を使用する２８日目の眼の免疫組織化学的分析からの代表的な画像を示す図である。凍結切片（１４μｍ）は、ＧＦＰ、ＲＰＥ６５、ファロイジン、およびＤＡＰＩの局在化について評価された。マージされた画像は、左に示され、ＧＦＰは右に示されている。 [0041]ブタの眼におけるＡＡＶ２．ＡＭＩ０５４－ＧＦＰ（ＬＡＬＧＱＴＴＫＰＡ（配列番号１４）挿入を含む改変されたＡＡＶ２）の硝子体内送達を示す図である。ＩＨＣ染色は、網膜層におけるＧＦＰ蛍光を示した。ＡＡＶ２．ＡＭＩ０５４－ＧＦＰを投与された眼の各網膜層におけるＧＦＰ発現を示す図である。 [0042]ＡＡＶ２．ＡＭＩ０５４－ＧＦＰを投与された眼とＡＡＶ２．７Ｍ８－ＧＦＰ（対照）を投与された眼のブタ網膜におけるＧＦＰ発現の比較を示す図である。ＡＡＶ２．ＡＭＩ０５４－ＧＦＰで形質導入された網膜は、ＡＡＶ２．７Ｍ８－ＧＦＰで形質導入された網膜とは対照的に、全ての網膜層においてＧＦＰ発現を示した。ＡＡＶ２．ＡＭＩ０５４－ＧＦＰ形質導入網膜におけるＧＦＰ蛍光は、ＡＡＶ２．７Ｍ８－ＧＦＰ形質導入網膜の２倍、強かった。

[0043]以下の説明および実施例は、本発明の実施形態を詳細に例示するものである。本発明は、本明細書において説明される特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって変更することができることは理解すべきである。当業者は、本発明の様々な変更例および修正例が存在し、それらは本発明の範囲内に包含されることを認識するであろう。

[0044]定義
用語「ＡＡＶ」、「ＡＡＶコンストラクト」、または「組換えＡＡＶ」、または「ＡＡＶ」は、公知の血清型のいずれかのアデノ随伴ウイルス、例えば、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、もしくはｓｃＡＡＶ、ｒｈ１０、キメラもしくはハイブリッドＡＡＶ、またはそれらの任意の組合せ、誘導体、またはバリアントなどを意味する。ＡＡＶは、小さな非エンベロープ一本鎖ＤＮＡウイルスである。それらは、非病原性パルボウイルスであり、複製のために、ヘルパーウイルス、例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびＣＭＶなどを必要とし得る。野生型ＡＡＶは、一般住民において一般的であり、任意の公知の病理にも関連しない。ハイブリッドＡＡＶは、ＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質と別のＡＡＶ血清型由来のゲノム物質とを含むＡＡＶである。キメラＡＡＶは、２つ以上のＡＡＶ血清型に由来する遺伝子配列および／またはタンパク質配列を含み、それら２つ以上のＡＡＶ血清型の遺伝子配列に対してなされた変異を含み得る。例示的なキメラＡＡＶは、キメラＡＡＶカプシド、例えば、２つ以上のＡＡＶ血清型に由来するアミノ酸の１つまたは複数の領域を有するカプシドタンパク質を含み得る。ＡＡＶバリアントは、その親ＡＡＶと比較して、そのゲノムまたはタンパク質における１つまたは複数のアミノ酸変異を含むＡＡＶ、例えば、その親ＡＡＶと比較して、そのカプシドタンパク質における１つまたは複数のアミノ酸変異を含むＡＡＶである。ＡＡＶは、本明細書に使用される場合、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶを包含し、この場合、霊長類ＡＡＶは、非霊長類に感染するＡＡＶを意味し、非霊長類ＡＡＶは、非霊長類動物に感染するＡＡＶ、例えば、鳥類に感染するトリＡＡＶなどを意味する。いくつかの場合において、野生型ＡＡＶは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含み、この場合、ｒｅｐ遺伝子は、ウイルス複製に必要であり、ｃａｐ遺伝子は、カプシドタンパク質の合成に必要である。本明細書において使用される場合、用語「組換えＡＡＶ」および「ｒＡＡＶ」は、交換可能である。

[0045]用語「組換えＡＡＶベクター」または「ＡＡＶベクター」または「ＡＡＶベクター」は、上記において言及したＡＡＶ血清型のいずれかに由来するベクターを意味する。いくつかの場合において、ＡＡＶベクターは、全部または一部が除去されたＡＡＶ野生型遺伝子の１つまたは複数、例えば、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子などを含み得るが、遺伝子療法のためのＡＡＶウイルスのパッケージングおよび使用に必要である機能的エレメントを含む。例えば、オープンリーディングフレームまたはクローニングされた外因性配列に隣接する機能的逆方向末端反復配列またはＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの複製およびパッケージングにとって重要であることが公知であるが、ＩＴＲ配列は、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換など、野生型ヌクレオチド配列から改変することができ、それにより、当該ＡＡＶは、本明細書において説明される実施形態のための使用、例えば、遺伝子療法または遺伝子送達システムなどにとって好適である。いくつかの態様において、自己相補的ベクター（ｓｃ）、例えば、自己相補的ＡＡＶベクターなどを使用することができ、それは、参照により本明細書に組み入れられるＷｕ，ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ．２００７，１８（２）：１７１～８２に記載されるように、ウイルス性第２鎖ＤＮＡ合成のための要件を回避することができ、導入遺伝子タンパク質の発現のより高い割合をもたらし得る。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、最適な血清型、プロモーター、および導入遺伝子の選択を可能にするように生成することができる。いくつかの場合において、ベクターは、標的ベクター、あるいは選択的に免疫細胞に結合または感染する改変されたベクターであり得る。

[0046]用語「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶビリオン」は、本明細書において説明されるようなＡＡＶベクターをカプシドで包んだ少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質を含むカプシドを含むウイルス粒子を意味し、この場合、ベクターは、いくつかの実施形態において、非相同ポリヌクレオチド配列または導入遺伝子をさらに含み得る。ビリオンは、操作されたビリオンであり得る。

[0047]本明細書において使用される場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」ならびに参照値およびその文法的同等物との関連におけるその文法的同等物は、その値からプラスまたはマイナス１０％の範囲の値を包含し得る。例えば、「約１０」の量は、９～１１の量を包含する。参考値との関連において、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、その値からプラスまたはマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の範囲の値も含み得る。

[0048]用語「対象」、「宿主」、「個体」、および「患者」は、動物、典型的には哺乳動物を意味するために、本明細書において相互互換的に使用される。任意の好適な哺乳動物は、本明細書において説明される組成物（例えば、操作されたガイドＲＮＡなど）を投与することができ、または本明細書において説明される方法によって処置することができる。対象は、脊椎動物または無脊椎動物であり得る。対象は、実験室動物であり得る。哺乳動物の非限定的な例としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、モンキー、マカクサルなど）、家畜（例えば、イヌおよびネコ）、農場動物（例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、および実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）が挙げられる。いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。哺乳動物は、任意の年齢または任意の発育段階（例えば、成人、十代、小児、幼児、または子宮内の哺乳動物）であり得る。哺乳動物は、雄または雌であり得る。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。対象は、患者であり得る。対象は、疾患を患い得る。対象は、疾患の症状を示し得る。対象は、疾患の症状を示さないが依然として疾患を有している場合もある。対象は、介護人の医療介護下にあり得る（例えば、対象は、入院して、医師によって処置される）。

[0049]用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は、相互互換的に使用され、それらの最も広い意味において、２つ以上のサブユニットアミノ酸の化合物、アミノ酸アナログ、またはペプチドミメティックスを意味するために使用される。この用語は、改変；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作、例えば、標識成分とのコンジュゲーションなどをなされているアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書において使用される場合、用語「アミノ酸」は、天然および／または非天然または合成アミノ酸のいずれか、例えば、グリシンおよびＤ体もしくはＬ体の両方の光学異性体、ならびにアミノ酸アナログ、ならびにペプチドミメティックスなどを意味する。サブユニットは、ペプチド結合によって結合され得る。別の実施形態において、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどによって結合され得る。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならず、タンパク質の配列またはペプチドの配列を含み得るアミノ酸の最大数に制限はない。本明細書において使用される場合、用語「アミノ酸」は、天然および／または非天然または合成アミノ酸のいずれか、例えば、グリシンならびにＤ体およびＬ体の両方の光学異性体、アミノ酸アナログ、ならびにペプチドミメティックスなどを意味する。本明細書において使用される場合、用語「融合タンパク質」は、２つ以上の天然に存在するタンパク質または組換えによって産生されたタンパク質に由来するドメインで構成されたタンパク質を意味し、この場合、概して、各ドメインは、異なる機能を果たす。これに関して、用語「リンカー」は、任意選択で、融合タンパク質ドメインのコンフォメーションを保存するため、および／またはそれぞれの機能を妨げ得る融合タンパク質ドメインの間の好ましくない相互作用を防ぐために、これらのドメインを一緒に連結させるために使用されるタンパク質断片を意味する。

[0050]ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対してある特定のパーセント「配列同一性」を有し、それは、アラインした場合に、２つの配列を比較したときに塩基またはアミノ酸のパーセンテージが同じであることを意味する。配列類似性は、いくつかの異なる方式において特定することができる。配列同一性を特定するために、方法およびコンピュータプログラム、例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／のワールドワイドウェブ上で利用可能なＢＬＡＳＴなどを使用して配列をアラインすることができる。別のアラインメントアルゴリズムは、ＯｘｆｏｒｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．の全額出資子会社である、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｉｎｇＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（マディソン、ウィスコンシン州、米国）のパッケージにおいて利用可能なＦＡＳＴＡである。アラインメントのための他の技術は、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６６：ＣｏｍｐｕｔｅｒＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓ（１９９６），ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ａｄｉｖｉｓｉｏｎｏｆＨａｒｃｏｕｒｔＢｒａｃｅ＆Ｃｏ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡにおける方法に記載されている。特に関心を持たれているのは、配列のギャップを許容するアラインメントプログラムである。Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アラインメントにおけるギャップを許容するタイプのアルゴリズムの１つである。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３～１８７（１９９７）を参照されたい。さらに、ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈアラインメントを使用するＧＡＰプログラムも、配列をアラインするために利用することができる。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３～４５３（１９７０）を参照されたい。

[0051]概要
改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシド含有組成物ならびにその使用方法が、本明細書において提供される。改変されたＡＡＶカプシドは、その他は同等の非改変ＡＡＶカプシドと比較して、外因性配列を含み得る。外因性配列は、外因性ポリペプチド配列を意味することができる。ＡＡＶカプシドは、それらを付与するように改変することができ、それらを利用する任意の組成物および／または方法は機能性を向上させ、それにより、結果として、特に眼用使用のための、より良好な治療薬をもたらす。

[0052]ＡＡＶ野生型（ＷＴ）ゲノムは、少なくとも３つの遺伝子：ｒｅｐ、ｃａｐ、およびＸを含む。Ｘ遺伝子は、１９９９年に最初に説明され、ゲノムの３’末端に位置され（ＡＡＶ２のヌクレオチド３９２９～４３９３）、ならびに、ゲノム複製において支持的機能を有するタンパク質をコードすると考えられる。ｒｅｐおよびｃａｐに対するさらなる詳しい情報は入手可能である。ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶＷＴゲノムの前半に位置され、ウイルス性転写制御および複製ならびに新たに産生された予めアセンブルされているカプシド内へのウイルスゲノムのパッケージングのために必要な非構造タンパク質（Ｒｅｐタンパク質）のファミリーをコードする。ＡＡＶゲノムの後半は、ｃａｐ遺伝子を含み、それは、ウイルスタンパク質（ＶＰ）ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３、ならびにアセンブリー活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードする。カプシドモノマーである全てのＶＰの転写は、単一のプロモーター（ＡＡＶ２の場合はｐ４０）によって制御され、結果として単一のｍＲＮＡを生じる。スプライシング（ＶＰ１）および珍しい翻訳開始コドン（ＶＰ２）は、ＶＰ３と比較してＶＰ１およびＶＰ２の存在がおよそ１０倍低い原因である。予想されるように、単一遺伝子によってコードされる場合、ＡＡＶＶＰは、それらのアミノ酸の大部分を共有する。詳細には、ＶＰ３配列全体は、ＶＰ２およびＶＰ１内に含まれ（「共通ＶＰ３領域」）、ならびに、ＶＰ２およびＶＰ１は、およそ６５のアミノ酸も共有する（「共通ＶＰ１／ＶＰ２領域」）。ＶＰ１のみが、そのＮ末端にユニーク配列を含む（およそ１３８のアミノ酸、ＶＰ１ユニーク）。ＡＡＰは、２０１０年に、代替のｃａｐＯＲＦにおいてコードされた２３ｋＤタンパク質として特定された。それは、新たに産生されたＶＰタンパク質を安定化するため、および細胞質から細胞核内と輸送するために使用される。興味深いことに、ＡＡＶ血清型１～３、６～９、およびｒｈ１０は、ＡＡＰの不在下においてカプシドを産生しないが、低分子量だが検出可能なカプシドの産生は、ＡＡＶ４およびＡＡＶ５において報告されている。

[0053]ある態様において、ＡＡＶは、改変を含み得る。改変は、ｒｅｐ、ｃａｐ、および／またはＡＡＶのポリペプチド配列をコードするＸの改変であり得る。いくつかの場合において、改変は、ｃａｐポリペプチドの改変であり得る。ｃａｐポリペプチドは、ＶＰドメインの任意の１つ、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３において改変され得る。いくつかの場合において、ＶＰ１は、改変されている。いくつかの場合において、ＶＰ２は、改変されている。いくつかの場合において、ＶＰ３は、改変されている。いくつかの態様において、ＶＰドメインの２つまたは全ては改変することができる。いくつかの場合において、ＶＰ１およびＶＰ２は、改変されている。いくつかの場合において、ＶＰ１およびＶＰ３は、改変されている。さらに、ＶＰ２およびＶＰ３は、改変することができ、あるいは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、改変されている。他の組合せ、例えば、ＲｅｐおよびＣａｐ、ＣａｐおよびＸ、ＲｅｐおよびＸ、ならびに／あるいはＲｅｐ、Ｃａｐ、およびＸにおける改変などが想定される。例えば、Ｒｅｐおよび／またはＸ改変と併せて前述のＶＰ改変の任意の１つなど、ドメインの任意の組合せを改変することができる。いくつかの場合において、ＲｅｐならびにＶＰ１および／またはＶＰ２は、改変されている。いくつかの態様において、主題のＲｅｐは改変されている。ｒｅｐ改変は、本明細書において提供される改変を含み得、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、またはＲｅｐ４０の少なくとも１つに存し得る。いくつかの場合において、Ｒｅｐは、主題のカプシドとは異なるＡＡＶ血清型である。

[0054]いくつかの場合において、改変は、ＡＡＶカプシドの改変である。ＡＡＶ血清型のカプシドは、ＶＰ３のおよそ５０のコピー、ＶＰ２の５つのコピー、およびＶＰ１の５つのコピーによって、６０のＶＰモノマーからアセンブルされる。トポロジー的に突き出したカプシド表面構造は、細孔であるか、あるいは各五回対称軸における「チャネル様構造」、各二回対称軸における窪み、ならびに、各三回対称軸を囲む３つの突出である。細孔は、カプシド内部と外部との間の交換を可能にする。各二回軸においてより正確なフロアである窪みは、ウイルス性カプシドの最も薄い部分である。三回軸の周りの突出は、９つのいわゆる可変部（ＶＲ）のうち５つを抱える。詳細には、ＶＲ－ＩＶ、－Ｖ、および－ＶＩＩＩは、突出の先端においてループ（ループ１～４）を形成し、その一方で、ＶＲ－ＶＩおよび－ＶＩＩは、それらの塩基において見出される。ＶＲは、血清型の間で異なり、抗体と受容体との結合における血清型特異的変形例の原因となる。それらの露出した位置および受容体結合におけるそれらの機能により、突出のＶＲ形成ループは、ＡＡＶ向性（細胞表面ターゲッティング）を再方向付けまたは拡張することを目的としたカプシド改変のための理想的な位置である。再方向付けされた向性（ベクター再ターゲッティング）は、例えば、部位特異的変異誘発によって、天然の受容体結合の切断を、新規の非天然ＡＡＶ受容体によって形質導入を調整するリガンドの挿入と組み合わせるが、向性拡張を伴うＡＡＶベクターは、それらの天然受容体結合能力を維持しつつ余分な受容体によって細胞を形質導入する能力を得る。

[0055]いくつかの態様において、ＡＡＶカプシドの改変は、外因性ポリペプチド配列の挿入を意味し得る。他の態様において、改変は、ポリペプチド配列における欠失を意味し得る。改変は、ポリペプチド配列における少なくとも１つのカノニカルまたは非カノニカルアミノ酸残基の改変も意味し得る。

[0056]挿入は、少なくとも１つの外因性アミノ酸残基をＡＡＶカプシドをコードする配列に挿入することを含み得る。アミノ酸は、カノニカルアミノ酸または非カノニカルアミノ酸を意味し得る。任意の数のアミノ酸残基を挿入することができる。いくつかの場合において、挿入部位は、ＡＡＶカプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶ、例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶの溶媒アクセス可能な部分であり得る。ＡＡＶカプシドのＧＨループ／ループＩＶについては、ｖａｎＶｌｉｅｔら（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：８０９；Ｐａｄｒｏｎら（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７；およびＳｈｅｎら（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：１９５５を参照されたい。

[0057]いくつかの場合において、改変は、式１の配列：Ｘ０－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ１－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号１０８）を含む外因性ポリペプチド配列の挿入を含む。

[0058]いくつかの場合において、Ｘ０は、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、またはメチオニン（Ｍ）である。いくつかの場合において、Ｘ１は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）である。いくつかの場合において、Ｘ２は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭであり、この場合、Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、またはＱである。いくつかの場合において、Ｘ４は、Ｋ、Ｒ、Ｅ、またはＡである。いくつかの場合において、式１は、さらに、Ｘ５を含む。Ｘ５は、プロリン（Ｐ）またはＲであり得る。

[0059]いくつかの場合において、式１は、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９４）、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９５）、またはＶ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９６）を含む。いくつかの場合において、式１は、Ｖ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９６）を含む。いくつかの場合において、外因性ポリペプチドは、Ｖ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号９７）および／またはＶ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｋ（配列番号９８）である。いくつかの場合において、外因性ポリペプチドは、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９４）を含む。いくつかの場合において、外因性ポリペプチドは、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号９９）および／またはＬ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｓ－Ｘ４（配列番号１００）を含む。いくつかの場合において、外因性ポリペプチドは、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｒ（配列番号１０１）、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｋ（配列番号１０２）、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｅ（配列番号１０３）、および／またはＬ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ａ（配列番号１０４）を含む。いくつかの場合において、外因性ポリペプチドは、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｓ－Ｋ（配列番号１０５）を含む。いくつかの場合において、外因性ポリペプチドは、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９５）を含む。いくつかの場合において、外因性ポリペプチドは、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号１０６）を含む。いくつかの場合において、外因性ポリペプチドは、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｋ（配列番号１０７）を含む。

[0060]いくつかの場合において、外因性ポリペプチドは、式１の配列を含む。いくつかの場合において、式Ｉの配列は、表２の配列と少なくとも６０％、６２％、６４％、６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、または最高で約１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの場合において、外因性ポリペプチドは、残基に対して０～２の改変を有する表２のうちの１つである。いくつかの場合において、外因性ポリペプチドは、配列番号１３と少なくとも９０％、９５％、９７％、または最高で約９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの場合において、外因性ポリペプチドは、配列番号１３または配列番号１３に対して０～２の置換を有するポリペプチドを含む。

[0061]いくつかの場合において、外因性ポリペプチドの少なくとも２つ、例えば、式１によって説明されるものなどが、本明細書において提供されるＡＡＶのカプシド配列中に挿入される。当該少なくとも２つの外因性ポリペプチドは、同じ位置または異なる位置に挿入することができる。ある態様において、表２において提供される外因性ポリペプチド配列の任意の１つは、改変されたＡＡＶカプシドを生成するために、非改変ＡＡＶカプシド配列、例えば、表１において提供される野生型配列などに挿入することができる。

[0062]同様に、欠失は、ＡＡＶカプシドをコードする配列における少なくとも１つのアミノ酸残基を除去することを含み得る。任意の数のアミノ酸を除去することができる。

[0063]いくつかの場合において、少なくとも、または最大で：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または最高で約５０の外因性アミノ酸残基を、ＡＡＶカプシドをコードするポリペプチド配列において挿入および／または除去することができる。いくつかの場合において、少なくとも、または最大で：外因性アミノ酸残基の１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、またはそれらの組合せを、ＡＡＶカプシドをコードするポリペプチド配列において挿入および／または除去することができる。いくつかの場合において、対応する非改変ＡＡＶカプシドタンパク質と比べて、約５または最大で約５から約１１のアミノ酸が、カプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶにおける挿入部位に挿入される。例えば、挿入部位は、ＡＡＶ２のアミノ酸５８７と５８８の間、または別のＡＡＶ血清型のカプシドサブユニットにおける対応する位置であり得る。挿入部位５８７～５８８は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質に基づいていることは留意されるべきである。約５から約１１のアミノ酸は、ＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９など）における対応する部位に挿入することができる。

[0064]いくつかの実施形態において、挿入部位は、任意のＡＡＶ血清型のＶＰ１のアミノ酸５７０～６１４の間に位置される２つの隣接するアミノ酸の間の単一の挿入部位であり、例えば、挿入部位は、任意のＡＡＶ血清型またはバリアントのＶＰ１のアミノ酸５７０～６１０、アミノ酸５８０～６００、アミノ酸５７０～５７５、アミノ酸５７５～５８０、アミノ酸５８０～５８５、アミノ酸５８５～５９０、アミノ酸５９０～６００、またはアミノ酸６００～６１４に位置される２つの隣接するアミノ酸の間である。例えば、挿入部位は、アミノ酸５８０から５８１、アミノ酸５８１から５８２、アミノ酸５８３から５８４、アミノ酸５８４から５８５、アミノ酸５８５から５８６、アミノ酸５８６から５８７、アミノ酸５８７から５８８、アミノ酸５８８から５８９、またはアミノ酸５８９から５９０の間であり得る。挿入部位は、アミノ酸５７５から５７６、アミノ酸５７６から５７７、アミノ酸５７７から５７８、アミノ酸５７８から５７９、またはアミノ酸５７９から５８０の間であり得る。挿入部位は、アミノ酸５９０から５９１、アミノ酸５９１から５９２、アミノ酸５９２から５９３、アミノ酸５９３から５９４、アミノ酸５９４から５９５、アミノ酸５９５から５９６、アミノ酸５９６から５９７、アミノ酸５９７から５９８、アミノ酸５９８から５９９、またはアミノ酸５９９から６００の間であり得る。

[0065]いくつかの態様において、挿入部位は、ＡＡＶ２のアミノ酸５８７から５８８の間、ＡＡＶ１のアミノ酸５９０から５９１の間、ＡＡＶ５のアミノ酸５７５から５７６の間、ＡＡＶ６のアミノ酸５９０から５９１の間、ＡＡＶ７のアミノ酸５８９から５９０の間、ＡＡＶ８のアミノ酸５９０から５９１の間、ＡＡＶ９のアミノ酸５８８から５８９の間、またはＡＡＶ１０のアミノ酸５８８から５８９の間であり得る。

[0066]別の例として、挿入部位は、表１に示されるように、ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸４５０から４６０の間であり得る。例えば、挿入部位は、ＡＡＶ２のアミノ酸４５３（例えば、Ｎ末端に直接隣接して）、ＡＡＶ１のアミノ酸４５４、ＡＡＶ６のアミノ酸４５４、ＡＡＶ７のアミノ酸４５６、ＡＡＶ８のアミノ酸４５６、ＡＡＶ９のアミノ酸４５４、またはＡＡＶ１０のアミノ酸４５６であり得る。

[0067]いくつかの実施形態において、主題のカプシドタンパク質は、表１において説明されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＨループを含む。当業者は、様々なＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質のアミノ酸配列との比較に基づいて、「ＡＡＶ２のアミノ酸５８７～５８８に対応する」挿入部位が、任意の所定のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質にあるであろうことを知っているだろう。

[0068]いくつかの場合において、外因性ポリペプチドは、表２または式１の例示的なポリペプチドの任意の１つのアミノ末端および／またはカルボキシル末端に、０～４のスペーサーアミノ酸（Ｙ_１～Ｙ_４）を有し得る。好適なスペーサーアミノ酸としては、これらに限定されるわけではないが、ロイシン、アラニン、グリシン、および／またはセリンが挙げられる。

[0069]ＡＡＶカプシドの改変は、ポリペプチド配列における少なくとも１つのアミノ酸残基の改変を含み得る。いくつかの場合において、改変は、本明細書において説明されるように、任意のＡＡＶカプシド位置においてなすことができ、任意の数の改変を含み得る。いくつかの場合において、改変は、変異を含み得る。変異は、点変異、ミスセンス変異、ナンセンス変異、欠失、重複、フレームシフト、および／または反復伸長を含み得る。

[0070]ある態様において、アミノ酸は、非極性の脂肪族残基、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、またはプロリンなどであり得る。ある態様において、アミノ酸残基は、芳香族であり、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンである。ある態様において、アミノ酸残基は、極性で、非帯電であり、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、またはグルタミンである。ある態様において、アミノ酸は、正に帯電しており、リシン、アルギニン、またはヒスチジンである。ある態様において、アミノ酸は、負に帯電しており、アスパルテートまたはグルタメートである。

[0071]いくつかの場合において、変異は、点変異である。点変異は、帯電したアミノ酸残基から極性または非極性アミノ酸残基への変化を含む。いくつかの場合において、帯電したアミノ酸は、正に帯電している。いくつかの場合において、帯電したアミノ酸は、負に帯電している。

[0072]点変異は、保存的変異であり得る。保存的変異の非限定的な例は、非極性脂肪族アミノ酸から非極性脂肪族アミノ酸、極性アミノ酸から極性アミノ酸、正に帯電したアミノ酸から正に帯電したアミノ酸、負に帯電したアミノ酸から負に帯電したアミノ酸、および芳香族アミノ酸から芳香族アミノ酸を含む。例えば、２０の天然に存在するアミノ酸は、同様の特性を共有し得る。脂肪族アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンであり得る。ヒドロキシルまたは硫黄／セレン含有アミノ酸は、セリン、システイン、セレノシステイン、トレオニン、またはメチオニンであり得る。環状アミノ酸は、プロリンであり得る。芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンであり得る。塩基性アミノ酸は、ヒスチジン、リシン、およびアルギニンであり得る。酸性アミノ酸は、アスパルテート、グルタメート、アスパラギン、またはグルタミンであり得る。保存的変異は、セリンからグリシン、セリンからアラニン、セリンからセリン、セリンからトレオニン、セリンからプロリンであり得る。保存的変異は、アルギニンからアスパラギン、アルギニンからリシン、アルギニンからグルタミン、アルギニンからアルギニン、アルギニンからヒスチジンであり得る。保存的変異は、ロイシンからフェニルアラニン、ロイシンからイソロイシン、ロイシンからバリン、ロイシンからロイシン、ロイシンからメチオニンであり得る。保存的変異は、プロリンからグリシン、プロリンからアラニン、プロリンからセリン、プロリンからトレオニン、プロリンからプロリンであり得る。保存的変異は、トレオニンからグリシン、トレオニンからアラニン、トレオニンからセリン、トレオニンからトレオニン、トレオニンからプロリンであり得る。保存的変異は、アラニンからグリシン、アラニンからトレオニン、アラニンからプロリン、アラニンからアラニン、アラニンからセリンであり得る。保存的変異は、バリンからメチオニン、バリンからフェニルアラニン、バリンからイソロイシン、バリンからロイシン、バリンからバリンであり得る。保存的変異は、グリシンからアラニン、グリシンからトレオニン、グリシンからプロリン、グリシンからセリン、グリシンからグリシンであり得る。保存的変異は、イソロイシンからフェニルアラニン、イソロイシンからイソロイシン、イソロイシンからバリン、イソロイシンからロイシン、イソロイシンからメチオニンであり得る。保存的変異は、フェニルアラニンからトリプトファン、フェニルアラニンからフェニルアラニン、フェニルアラニンからチロシンであり得る。保存的変異は、チロシンからトリプトファン、チロシンからフェニルアラニン、チロシンからチロシンであり得る。保存的変異は、システインからセリン、システインからトレオニン、システインからシステインであり得る。保存的変異は、ヒスチジンからアスパラギン、ヒスチジンからリシン、ヒスチジンからグルタミン、ヒスチジンからアルギニン、ヒスチジンからヒスチジンであり得る。保存的変異は、グルタミンからグルタミン酸、グルタミンからアスパラギン、グルタミンからアスパラギン酸、グルタミンからグルタミンであり得る。保存的変異は、アスパラギンからグルタミン酸、アスパラギンからアスパラギン、アスパラギンからアスパラギン酸、アスパラギンからグルタミンであり得る。保存的変異は、リシンからアスパラギン、リシンからリシン、リシンからグルタミン、リシンからアルギニン、リシンからヒスチジンであり得る。保存的変異は、アスパラギン酸からグルタミン酸、アスパラギン酸からアスパラギン、アスパラギン酸からアスパラギン酸、アスパラギン酸からグルタミンであり得る。保存的変異は、グルタミンからグルタミン、グルタミンからアスパラギン、グルタミンからアスパラギン酸、グルタミンからグルタミンであり得る。保存的変異は、メチオニンからフェニルアラニン、メチオニンからイソロイシン、メチオニンからバリン、メチオニンからロイシン、メチオニンからメチオニンであり得る。保存的変異は、トリプトファンからトリプトファン、トリプトファンからフェニルアラニン、トリプトファンからチロシンであり得る。

[0073]さらなるアミノ酸変異の非限定的な例は、ＡからＲ、ＡからＮ、ＡからＤ、ＡからＣ、ＡからＱ、ＡからＥ、ＡからＧ、ＡからＨ、ＡからＩ、ＡからＬ、ＡからＫ、ＡからＭ、ＡからＦ、ＡからＰ、ＡからＳ、ＡからＴ、ＡからＷ、ＡからＹ、ＡからＶ、ＲからＮ、ＲからＤ、ＲからＣ、ＲからＱ、ＲからＥ、ＲからＧ、ＲからＨ、ＲからＩ、ＲからＬ、ＲからＫ、ＲからＭ、ＲからＦ、ＲからＰ、ＲからＳ、ＲからＴ、ＲからＷ、ＲからＹ、ＲからＶ、ＮからＤ、ＮからＣ、ＮからＱ、ＮからＥ、ＮからＧ、ＮからＨ、ＮからＩ、ＮからＬ、ＮからＫ、ＮからＭ、ＮからＦ、ＮからＰ、ＮからＳ、ＮからＴ、ＮからＷ、ＮからＹ、ＮからＶ、ＤからＣ、ＤからＱ、ＤからＥ、ＤからＧ、ＤからＨ、ＤからＩ、ＤからＬ、ＤからＫ、ＤからＭ、ＤからＦ、ＤからＰ、ＤからＳ、ＤからＴ、ＤからＷ、ＤからＹ、ＤからＶ、ＣからＱ、ＣからＥ、ＣからＧ、ＣからＨ、ＣからＩ、ＣからＬ、ＣからＫ、ＣからＭ、ＣからＦ、ＣからＰ、ＣからＳ、ＣからＴ、ＣからＷ、ＣからＹ、ＣからＶ、ＱからＥ、ＱからＧ、ＱからＨ、ＱからＩ、ＱからＬ、ＱからＫ、ＱからＭ、ＱからＦ、ＱからＰ、ＱからＳ、ＱからＴ、ＱからＷ、ＱからＹ、ＱからＶ、ＥからＧ、ＥからＨ、ＥからＩ、ＥからＬ、ＥからＫ、ＥからＭ、ＥからＦ、ＥからＰ、ＥからＳ、ＥからＴ、ＥからＷ、ＥからＹ、ＥからＶ、ＧからＨ、ＧからＩ、ＧからＬ、ＧからＫ、ＧからＭ、ＧからＦ、ＧからＰ、ＧからＳ、ＧからＴ、ＧからＷ、ＧからＹ、ＧからＶ、ＨからＩ、ＨからＬ、ＨからＫ、ＨからＭ、ＨからＦ、ＨからＰ、ＨからＳ、ＨからＴ、ＨからＷ、ＨからＹ、ＨからＶ、ＩからＬ、ＩからＫ、ＩからＭ、ＩからＦ、ＩからＰ、ＩからＳ、ＩからＴ、ＩからＷ、ＩからＹ、ＩからＶ、ＬからＫ、ＬからＭ、ＬからＦ、ＬからＰ、ＬからＳ、ＬからＴ、ＬからＷ、ＬからＹ、ＬからＶ、ＫからＭ、ＫからＦ、ＫからＰ、ＫからＳ、ＫからＴ、ＫからＷ、ＫからＹ、ＫからＶ、ＭからＦ、ＭからＰ、ＭからＳ、ＭからＴ、ＭからＷ、ＭからＹ、ＭからＶ、ＦからＰ、ＦからＳ、ＦからＴ、ＦからＷ、ＦからＹ、ＦからＶ、ＰからＳ、ＰからＴ、ＰからＷ、ＰからＹ、ＰからＶ、ＳからＴ、ＳからＷ、ＳからＹ、ＳからＶ、ＴからＷ、ＴからＹ、ＴからＶ、ＷからＹ、ＷからＶ、ＹからＶならびに前に説明した変異のいずれかの逆であり得る。

[0074]前述の改変、挿入、欠失、および／または変異のいずれも、ＡＡＶ配列における任意の残基においてなすことができる。配列は、カプシド配列であり得る。他の場合において、配列は、カプシド配列ではなく、むしろＲｅｐ配列および／またはＸ配列であってもよい。配列は、前に説明したＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３にあり得る。いくつかの場合において、配列の改変は、カプシド配列のループ、例えば、ループ３および／またはループ４などの改変である。いくつかの場合において、改変は、表１の配列の残基の改変である。

[0075]

[0076]いくつかの場合において、改変、例えば、挿入、欠失、および／または変異などは、表１のカプシドポリペプチド配列の残基の改変である。いくつかの場合において、改変は、１～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、またはそれらの組合せである。いくつかの場合において、改変は、位置２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、またはそれらの組合せにおける残基においてなされる。いくつかの場合において、改変は、位置３００～５００またはそれらの組合せにおける残基においてなされる。ある態様において、挿入部位は、ＡＡＶカプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶ、例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶの溶媒アクセス可能な部分である。ＧＨループについては、例えば、ｖａｎＶｌｉｅｔら（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：８０９；Ｐａｄｒｏｎら（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７；およびＳｈｅｎら（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：１９５５を参照されたい。例えば、挿入部位は、ＡＡＶ２のアミノ酸５７０～６１１内、ＡＡＶ１のアミノ酸５７１～６１２内、ＡＡＶ５のアミノ酸５６０～６０１内、ＡＡＶ６のアミノ酸５７１～６１２内、ＡＡＶ７のアミノ酸５７２～６１３内、ＡＡＶ８のアミノ酸５７３～６１４内、ＡＡＶ９のアミノ酸５７１～６１２内、またはＡＡＶ１０のアミノ酸５７３～６１４内である。

[0077]例えば、挿入部位は、ＡＡＶ２のアミノ酸５８７から５８８の間、ＡＡＶ１のアミノ酸５９０から５９１の間、ＡＡＶ５のアミノ酸５７５から５７６の間、ＡＡＶ６のアミノ酸５９０から５９１の間、ＡＡＶ７のアミノ酸５８９から５９０の間、ＡＡＶ８のアミノ酸５９０から５９１の間、ＡＡＶ９のアミノ酸５８８から５８９の間、またはＡＡＶ１０のアミノ酸５８９から５９０の間であり得る。いくつかの場合において、改変は、ＡＡＶ２の位置４５２、４５３、４６６、４６７、４６８、４７１、５８５、５８６、５８７、および／または５８８において行われる。いくつかの場合において、改変は、ＡＡＶ２の位置４５２または４５３において行われる。いくつかの場合において、改変は、ＡＡＶ２の位置５８７または５８８において行われる。いくつかの場合において、改変は、配列番号１の位置４５２、４５３、４６６、４６７、４６８、４７１、５８５、５８６、５８７、および／または５８８における挿入である。いくつかの場合において、改変は、変異であり、変異は、配列番号１のＲ５８５ＡまたはＲ５８８Ａである。

[0078]いくつかの実施形態において、主題の改変されたＡＡＶカプシドは、対応する非改変ＡＡＶカプシドタンパク質と比べて、ループ（ループ３および／または４）における約５のアミノ酸から約１１のアミノ酸の挿入以外の、任意の他のアミノ酸改変である変異、置換、挿入、または欠失を含まない。他の実施形態において、主題のバリアントＡＡＶカプシドは、非改変ＡＡＶカプシドタンパク質と比べてループ３および／またはループ４における約５から約１１のアミノ酸の挿入に加えて、非改変ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して、１から約２５のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を含む。ある実施形態において、主題のＡＡＶビリオンカプシドは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比べてＧＨループまたはループＩＶにおける約７から約１０のアミノ酸の挿入以外の、任意の他のアミノ酸の置換、挿入、または欠失を含まない。他の実施形態において、主題のＡＡＶビリオンカプシドは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比べてＧＨループまたはループＩＶにおける約７から約１０のアミノ酸の挿入に加えて、親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して１から約２５のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を含む。例えば、いくつかの実施形態において、主題のＡＡＶビリオンカプシドは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比べてＧＨループまたはループＩＶにおける約７から約１０のアミノ酸の挿入に加えて、親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して、１から約５、約５から約１０、約１０から約１５、約１５から約２０、または約２０から約２５のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を含む。

[0079]いくつかの場合において、キメラＡＡＶカプシドが、本明細書において提供される。キメラカプシドは、少なくとも２つのＡＡＶ血清型に由来するポリペプチド配列を含む。キメラカプシドは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、および／またはＡＡＶ１３から選択される配列のミックスを含み得る。いくつかの場合において、キメラ血清型は、ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３の間において異なっている。いくつかの場合において、キメラカプシドは、ＡＡＶ４およびＡＡＶ６、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６、ＡＡＶ１１およびＡＡＶ６、ＡＡＶ１２およびＡＡＶ６、ならびにそれらの任意の組合せから選択される少なくとも２つの血清型に由来する配列を含む。いくつかの場合において、第１のＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ４であり得、第２の血清型は、ＡＡＶ６であり得る。いくつかの場合において、キメラＡＡＶベクターの第１のＡＡＶ血清型および第２のＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１１およびＡＡＶ６であり得る。いくつかの場合において、キメラＡＡＶベクターの第１のＡＡＶ血清型および第２のＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１２およびＡＡＶ６であり得る。いくつかの場合において、キメラカプシドは、ＡＡＶ２およびＡＡＶ５あるいはＡＡＶ２およびＡＡＶ６から選択される配列を含む。いくつかの場合において、キメラカプシドは、ＡＡＶ２およびＡＡＶ５、ＡＡＶ２およびＡＡＶ６、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８、ＡＡＶ２およびＡＡＶ９、ＡＡＶ２およびＡＡＶ１、ならびにＡＡＶ２およびＡＡＶ１２から選択される配列を含む。

[0080]本明細書において提供されるＡＡＶに対する改変は、別の非改変または野生型ＡＡＶと比較して、改変されたＡＡＶへの増強された活性を付与し得る。本明細書において提供される改変は、細胞の形質導入、向性を向上させ得、および／またはカプシドに関連する免疫原性を減少させ得る。

[0081]いくつかの場合において、本明細書において提供される改変は、細胞の形質導入を増強する。細胞の形質導入は、細胞に感染するＡＡＶの能力（ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏ）および／または導入遺伝子を細胞に送達する能力を意味し得る。

[0082]いくつかの場合において、本明細書において提供される改変は、向性を増強する。増強された向性は、別の非改変ＡＡＶと比較して、余分な受容体によって細胞を形質導入する能力を獲得することを意味する。いくつかの態様において、増強された向性は、眼細胞の感染力を向上させることができ、それにより、改変されたＡＡＶを使って遺伝子療法を向上させることができる。いくつかの場合において、本明細書において提供される改変は、双極細胞、網膜神経節細胞、水平細胞、アマクリン細胞、上皮細胞、網膜色素細胞、光受容体、またはそれらの任意の組合せから選択される眼細胞に対する向性を向上させ得る。いくつかの場合において、改変は、網膜細胞に対する向性を向上させる。

[0083]さらに、本明細書において、ＡＡＶベクターも提供される。ＡＡＶベクターは、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、ＡＡＰ、およびＸ配列を含む。典型的には、ＡＡＶウイルスゲノムは、パッケージングシグナルおよび複製開始点として機能するＩＴＲに隣接する。ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶＳ１におけるウイルス転写、複製、パッケージング、および統合の制御を担う多機能性タンパク質（Ｒｅｐタンパク質）のファミリーをコードする。ＡＡＶ２に対して、４つのＲｅｐタンパク質が説明される。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８の発現は、ＡＡＶ２特異的ｐ５プロモーターによって制御され、その一方で、ｐ１９は、より小さいＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０）の発現を制御する。Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０は、それぞれ、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２のスプライスバリアントである。数値は分子量を示している。全てがｃａｐ遺伝子においてコードされる、ＡＡＰならびにウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１（９０ｋＤａ）、ＶＰ２（７２ｋＤａ）、およびＶＰ３（６０ｋＤａ）の発現は、ｐ４０プロモーターによって制御される。Ｘ遺伝子は、ｃａｐ遺伝子によって共有される領域内のゲノムの３’末端に位置され、それ自身のプロモーター（ｐ８１）を所有する。Ｘタンパク質は、ウイルス複製を増強すると考えられるが、ＡＡＰは、カプシドアセンブリーにとって必須である。この３つの異なるＶＰは、１（ＶＰ１）：１（ＶＰ２）：１０（ＶＰ３）の比において、正二十面体ＡＡＶ２カプシドに貢献する。

[0084]本明細書において開示される改変されたカプシドタンパク質は、単離、例えば、精製することができる。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される改変されたカプシドは、ＡＡＶベクターまたはＡＡＶビリオン（例えば、組換えＡＡＶビリオン、ｒＡＡＶ）に含まれる。他の実施形態において、そのような改変されたＡＡＶベクターおよび／またはＡＡＶバリアントビリオンは、霊長類網膜、例えば、ヒト網膜における眼疾患を処置するｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏ方法において使用される。

[0085]改変されたＡＡＶカプシドを含むベクターも、本明細書において提供される。前に説明した改変のいずれも、本明細書において提供されるベクターに包含することができる。いくつかの場合において、ＡＡＶベクターは、外因性配列を欠くその他は同等のＡＡＶカプシド配列と比較して、ＶＰドメインの少なくとも２つのループにおける外因性配列を含む改変されたカプシドを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供されるベクターは、導入遺伝子配列をさらに含み得る。

[0086]ＷＴカプシドタンパク質からＡＡＶカプシドを改変する方法も、本明細書において開示される。改変されたカプシドを作製する例示的な方法は、本明細書の実施例２において説明される。いくつかの場合において、変異を含む改変されたカプシドを作製する方法は、ＷＴカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発、飽和変異、ループ交換変異誘発、断片シャッフリング変異誘発、およびそれらの組合せからなる群から選択されるタイプの変異誘発に供する工程を含む。いくつかの態様において、対象のＡＡＶｃａｐにおける変異は、任意の公知の方法を使用して生成される。ＡＡＶｃａｐ遺伝子の変異誘発のための好適な方法としては、これらに限定されるわけではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの方法、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発などが挙げられる。変異を生成する方法は、当技術分野において十分に説明されている。例えば、Ｚｈａｏら（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２３４～２３５；米国特許第６，５７９，６７８号；同第６，５７３，０９８号；および同第６，５８２，９１４号を参照されたい。

[0087]ある態様において、本明細書において開示される変異カプシドは、ＡＡＶライブラリーの使用によって生成することができる。そのようなＡＡＶライブラリーは、様々な定方向進化法によって、ＡＡＶカプシドの構造タンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を変異させることによって生成され、例えば、ＢａｒｔｅｌらＡｍ．Ｓｏｃ．ＧｅｎｅＣｅｌｌＴｈｅｒ．ｌ５ｔｈＡｎｎｕ．Ｍｅｅｔ．２０，Ｓ１４０（２０１２）；Ｂｏｗｌｅｓ，Ｄ．らＪ．Ｖｉｒｏｌ．７７，４２３～４３２（２００３）；ＧｒａｙらＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８，５７０～５７８（２０１０）；Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．らＪ．Ｖｉｒｏｌ．８２，５８８７～５９１１；Ｋｏｅｒｂｅｒ，Ｊ．Ｔ．らＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６，１７０３～１７０９（２００８）；ＬｉＷ．らＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６，１２５２～１２６０（２００８）；Ｋｏｅｒｂｅｒ，Ｊ．Ｔ．らＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．４３４，１６１～１７０（２００８）；Ｋｏｅｒｂｅｒ，Ｊ．Ｔ．らＨｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１８，３６７～３７８（２００７）；およびＫｏｅｒｂｅｒ，Ｊ．Ｔ．らＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７，２０８８～２０９５（２００９）を参照されたい。そのような技術は、これらに限定されるものではないが、以下の通りである：ｉ）所定の変更可能な率においてランダム点変異をＡＡＶｃａｐオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に導入するエラープローンＰＣＲ；ｉｉ）複数のＡＡＶ血清型の遺伝子ライブラリーを得るために、ＡＡＶｃａｐ遺伝子のランダムキメラを生じさせる、Ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏウイルス組換えまたは「ＤＮＡシャッフリング」；ｉｉｉ）ｃａｐＯＲＦにおける縮重オリゴヌクレオチドのライゲーションによる、カプシドの決定部位におけるランダムペプチド挿入；ｉｖ）トランスポゾン変異誘発を使用した、ＡＡＶｃａｐＯＲＦのランダム位置へのペプチドコード配列の決められた挿入：ｖ）ＡＡＶカプシドの表面ループを、「ループスワッピング」ライブラリーを生成するために天然ＡＡＶ血清型およびバリアントの間で各アミノ酸位置の保存のレベルに基づいて生体情報的に（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ）設計されたペプチド配列のライブラリーと交換すること；ｖｉ）祖先のバリアントのライブラリーを生成するための、ＡＡＶ血清型の間における縮重の位置でのランダムアミノ酸置換（Ｓａｎｔｉａｇｏ－Ｏｒｔｉｚら，２０１５）；ならびにそのようなそれらの技術の組合せ。

[0088]いくつかの実施形態において、改変されたカプシドは、時差伸長プロセス（ｓｔａｇｇｅｒｅｄｅｘｔｅｎｓｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ）を使用して生成させることができる。時差伸長プロセスは、ＰＣＲベースの方法を使用したｃａｐ遺伝子の増幅を伴う。テンプレートｃａｐ遺伝子は、特異的ＰＣＲプライマーを使用してプライミングされ、その後、変性および非常に短いアニーリング／ポリメラーゼ触媒伸長の反復サイクルが行われる。各サイクルにおいて、成長断片は、配列相補性に基づいて異なるテンプレートに対してアニールし、さらに伸長する。変性、アニーリング、および伸長のサイクルは、全長配列が形成されるまで反復される。結果として得られる全長配列は、野生型ＡＡＶｃａｐ遺伝子と比較して、ｃａｐ遺伝子における少なくとも１つの変異を含む。１つまたは複数の変異を含むＡＡＶｃａｐ配列を含むＰＣＲ産物は、野生型ＡＡＶゲノムを含むプラスミド中に挿入される。結果は、ＡＡＶｃａｐ変異体のライブラリーである。したがって、本開示は、約１０～約１０^１０のメンバーを含み、かつＡＡＶｃａｐ遺伝子における変異を含む、変異体ＡＡＶｃａｐ遺伝子ライブラリーを提供する。所定のライブラリーのメンバーは、ＡＡＶｃａｐ遺伝子における約１～約５０の変異を有する。主題のライブラリーは、１０～約１０^９の異なるメンバーを含み、それぞれは、ＡＡＶｃａｐ遺伝子における異なる変異（複数可）を有する。ｃａｐ変異体ライブラリーが生成された後は、ウイルス粒子が産生され、次いで、変更されたカプシドの特性に基づいて選択され得る。ライブラリープラスミドＤＮＡは、好適な対象宿主細胞（例えば、２９３細胞および／またはＡＲＰＥ－１９細胞）にトランスフェクトされ、その後、ヘルパーウイルスの細胞に導入される。トランスフェクトされた宿主細胞によって産生されたウイルス粒子（「ＡＡＶライブラリー粒子）が収集される。

[0089]ある態様において、ＡＡＶライブラリーが生成された後は、次いで、ビリオンがパッケージされ、それにより、各ＡＡＶ粒子は、そのカプシドをコードするｃａｐ遺伝子を囲む改変されたカプシドで構成され、精製される。いくつかの場合において、改変を含む、ライブラリーのバリアントは、次いで、ＡＡＶの分野の当業者にとって公知で、容易に利用可能なｉｎｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎｖｉｖｏ選択的圧力技術に供される。例えば、Ｍａｈｅｓｈｒｉ，Ｎ．らＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．２４，１９８～２０４（２００６）；Ｄａｌｋａｒａ，Ｄ．らＳｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５，ｌ８９ｒａ７６（２０１３）；Ｌｉｓｏｗｓｋｉ，Ｌ．らＮａｔｕｒｅ．５０６，３８２～２８６（２０１３）；Ｙａｎｇ，Ｌ．らＰＮＡＳ．１０６，３９４６～３９５１（２００９）；Ｇａｏ，Ｇ．らＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３，７７～８７（２００６）；およびＢｅｌｌ，Ｐ．らＨｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．２２，９８５～９９７（２０１１）を参照されたい。例えば、これらに限定されるものではないが、改変されたＡＡＶは、ｉ）異なる断片の溶出によって変更された結合特性を有するバリアントがもたらされるアフィニティーカラム；ｉｉ）増加した有効性および／または組織特異性を有するＡＡＶバリアントをもたらす、人体の細胞の挙動を模倣する組織試料または不死化細胞株から単離された初代細胞；ｉｉｉ）標的組織に首尾よく感染したＡＡＶバリアントをもたらす、臨床遺伝子療法環境を模倣した動物モデル；ｉｖ）グラフト化されたヒト細胞に感染した主題の改変を含むＡＡＶバリアントをもたらすヒト異種移植モデル；ならびに／あるいは選択されたそれらの技術の組合せを使用して選択することができる。ビリオンが選択された後は、それらは、公知の技術、例えば、これらに限定されるものではないが、アデノウイルス媒介性複製、ＰＣＲ増幅、次世代配列決定およびクローニングなどによって回収され得る。次いで、選択技術のラウンドを繰り返すことによって、ウイルスクローンが富化され、目的の選択されたバリアントｃａｐ遺伝子を回収するために、ＡＡＶＤＮＡが単離される。そのような選択されたバリアントは、さらなる改変または変異に供することができ、そのため、ＡＡＶウイルス適応性を繰り返し増加させるためのさらなる選択工程のための新しい出発点として機能し得る。ただし、ある特定の場合において、良好なカプシドは、追加の変異なしで生成された。

[0090]本明細書において開示される主題の改変されたＡＡＶは、硝子体内投与の後の霊長類網膜スクリーニングの使用を伴う、ｉｎｖｉｖｏ定方向進化の使用によって生成させることができる。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される改変されたカプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオン中に存在する場合、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質または野生型ＡＡＶを含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の形質導入と比較して、網膜細胞の形質導入の増加を与える。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書において開示されるバリアントカプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオン中に存在する場合、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質または野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンよりも効率的な霊長類網膜細胞の形質導入を与え、例えば、網膜細胞は、親ＡＡＶカプシドタンパク質または野生型ＡＡＶを含むＡＡＶビリオンより多くの、対象バリアントＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンを取り込む。

[0091]疾患または状態の処置を必要とする対象における疾患または状態を処置する方法も、本明細書において提供される。主題の方法は、その他は同等の非改変ＡＡＶカプシドと比較して、ＡＡＶカプシドのＶＰドメインにおける外因性ポリペプチド配列を含む改変されたカプシドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む医薬組成物の治療有効量を投与する工程を含み得、外因性ポリペプチド配列は、式１の配列：Ｘ０－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ１－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号１０８）を含み、式中、Ｘ０は、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、またはメチオニン（Ｍ）であり、Ｘ１は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）であり、Ｘ２は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭであり、Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、またはＱであり、Ｘ４は、Ｋ、Ｒ、Ｅ、またはＡであり、任意選択で、式１は、プロリン（Ｐ）またはＲであるＸ５をさらに含む。

[0092]いくつかの場合において、主題のＡＡＶベクターは、配列番号２８～配列番号４７に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を含む配列を含む。ある実施形態において、ＡＡＶベクターは、配列番号３４の改変されたカプシドを含む。

[0093]改変されたＡＡＶカプシドを含む操作されたＡＡＶビリオンも本明細書において提供される。操作されたＡＡＶビリオンは、ｒＡＡＶベクター複製およびパッケージングのために宿主細胞または「プロデューサー」細胞を利用して生成することができる。そのようなプロデューサー細胞（通常は、哺乳動物宿主細胞）は、概して、ｒＡＡＶ産生のためのいくつかの異なるタイプの成分を含むかまたは含むように改変される。第１の成分は、宿主パッケージング細胞によって複製しベクター粒子内にパッケージすることができる組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターゲノム（または、「操作されたＡＡＶ」）である。ｒＡＡＶプロベクター（ｐｒｏ－ｖｅｃｔｏｒ）は、遺伝子療法との関連においてそれによって別の細胞を遺伝子的に変更することが所望される、主題の導入遺伝子を含み得る（ｒＡＡＶベクター粒子内へのそのような導入遺伝子のパッケージングは、様々な哺乳動物細胞に導入遺伝子を送達するために効果的に使用することができるため）。導入遺伝子は、概して、ＡＡＶベクターの除去、複製、およびパッケージングの際、ならびに宿主細胞ゲノムへのベクターの統合の際に、認識される配列を含む２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接する。

[0094]別の成分は、ＡＡＶ複製のためのヘルパー機能を提供することができるヘルパーウイルスであり得る。アデノウイルスは、一般的に用いられるが、当技術分野において公知の他のヘルパーウイルスも使用することができる。あるいは、必要なヘルパーウイルス機能は、ヘルパーウイルスから遺伝的に単離することができ、コード遺伝子は、トランスにおいてヘルパーウイルス機能を提供するために使用することができる。ＡＡＶベクターエレメントおよびヘルパーウイルス（またはヘルパーウイルス機能）は、同時または連続して順不同に宿主細胞に導入することができる。

[0095]プロデューサー細胞に提供されるＡＡＶ産生のための追加の成分は、「ＡＡＶパッケージング遺伝子」、例えば、それぞれ、複製およびカプシド形成タンパク質を提供するＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子などである。ＡＡＶパッケージング遺伝子のいくつかの異なるバリエーション（ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子を天然プロモーターの制御下に残すことができるかまたは異種プロモーターに作動可能に連結することができる、ｒｅｐ－ｃａｐカセットならびに別々のｒｅｐおよび／またはｃａｐカセットを含む）を提供することができる。そのようなＡＡＶパッケージング遺伝子は、当技術分野において公知であり、下記においてより詳細に説明されるように、一時的にまたは安定してのいずれかにおいて、宿主パッケージング細胞に導入することができる。

[0096]本開示は、本明細書において、宿主細胞、例えば、これらに限定されるわけではないが、主題の核酸を含む単離された（遺伝子改変された）宿主細胞などをさらに提供する。本明細書において開示される発明による宿主細胞は、単離された細胞、例えば、ｉｎｖｉｔｒｏ細胞培養由来の細胞などであり得る。そのような宿主細胞は、本明細書において説明される主題の改変されたＡＡＶビリオンの産生にとって有用である。一実施形態において、そのような宿主細胞は核酸によって安定して遺伝子改変される。他の実施形態において、宿主細胞は、核酸によって一時的に遺伝子改変される。そのような核酸は、確立された技術、例えば、これらに限定されるわけではないが、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム媒介性トランスフェクションなどを使用して、宿主細胞中に安定してまたは一時的に導入される。安定な形質転換のために、核酸は、概して、選択可能なマーカー、例えば、いくつかの周知の選択可能なマーカーのいずれか、例えば、ネオマイシン耐性などをさらに含むであろう。そのような宿主細胞は、核酸を様々な細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、マウス細胞、および霊長類細胞（例えば、ヒト細胞）などのいずれかに導入することによって生成される。例示的な哺乳動物細胞としては、これらに限定されるわけではないが、初代細胞および細胞株が挙げられ、この場合、例示的な細胞株としては、これらに限定されるわけではないが、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、３Ｔ３マウス繊維芽細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞などが挙げられる。例示的な宿主細胞としては、これらに限定されるわけではないが、ＨｅＬａ細胞（例えば、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ－２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１６５８）、Ｈｕｈ－７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞などが挙げられる。宿主細胞は、ＡＡＶを産生する昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９細胞などに感染させるためにバキュロウイルスを使用することによっても、作製することができる（例えば、米国特許第７，２７１，００２号；米国特許出願第１２／２９７，９５８号を参照されたい）。いくつかの実施形態において、遺伝子改変された宿主細胞は、上記において説明されるバリアントＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に加えて、１つまたは複数のＡＡＶｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。他の実施形態において、宿主細胞は、主題のベクターをさらに含む。主題の改変されたビリオンは、そのような宿主細胞を使用して生成させることができる。ビリオンを生成する方法は、例えば、米国特許出願公開第２００５／００５３９２２号および米国特許出願公開第２００９／０２０２４９０号に記載される。

[0097]いくつかの場合において導入遺伝子を含む、主題の操作されたＡＡＶビリオンは、当業者に公知の方法論を使用して産生することができる。当該方法は、概して、（１）主題の操作されたＡＡＶベクターを宿主細胞に導入する工程；（２）ＡＡＶヘルパー構築物を宿主細胞に導入する工程であって、ヘルパー構築物は、ＡＡＶベクターから失われたＡＡＶヘルパー機能を補うために宿主細胞において発現することができるＡＡＶコード領域を含む、工程；（３）１つまたは複数のヘルパーウイルスおよび／またはアクセサリー機能ベクターを、宿主細胞中に導入する工程であって、ヘルパーウイルスおよび／またはアクセサリー機能ベクターは、宿主細胞における効率的な組換えＡＡＶ（「ｒＡＡＶ」）ビリオン産生を支援することができるアクセサリー機能を提供する、工程；および（４）操作されたＡＡＶビリオンを産生するために宿主細胞を培養する工程を伴う。ＡＡＶ発現ベクター、ＡＡＶヘルパー構築物、およびヘルパーウイルスもしくはアクセサリー機能ベクター（複数可）は、標準的トランスフェクション技術を使用して、同時にまたは連続してのどちらかにおいて、宿主細胞に導入することができる。ＡＡＶ発現ベクターは、少なくとも、転写の方向において作動可能に連結された成分、転写開始領域を含む制御エレメント、目的のＤＮＡ、および転写終了領域として提供するために、公知の技術を使用して構築される。制御エレメントは、哺乳動物筋肉細胞において機能的であるように選択することができる。作動可能に連結された成分を含む、結果として得られる構築物は、機能的ＡＡＶＩＴＲ配列と結合させることができる（５’および３’）。

[0098]いくつかの場合において、ＡＡＶ－２配列に対して、ＡＡＶＩＴＲの公知のヌクレオチド配列を利用することができ、例えば、Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ５：７９３～８０１；Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．「ＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅａｎｄｔｈｅｉｒＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」ｉｎＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓａｎｄＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．）を参照されたい。いくつかの態様において、本明細書において提供される組成物および方法において使用されるＡＡＶＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって改変してもよい。さらに、ＡＡＶＩＴＲは、本明細書において提供される、いくつかのＡＡＶ血清型、例えば、これらに限定されるわけではないが、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－７などのいずれからも得られ得る。さらに、ＡＡＶ発現ベクターにおける選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ＩＴＲは、それらが意図されるように機能する限り、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターに由来する目的の配列の除去およびレスキューを可能にし、ＡＡＶＲｅｐ遺伝子産物が細胞中に存在する場合にレシピエント細胞ゲノムへのＤＮＡ分子の統合を可能にするように機能する限り、必ずしも、同じＡＡＶ血清型または分離株と同一である必要もまたはそれらから得られる必要もない。ＩＴＲは、Ｒｅｐタンパク質の適切な混合物の存在下でのベクター配列の複製を可能にする。ＩＴＲは、ＡＡＶ粒子を生成するためにカプシドへのベクター配列の組み入れも可能にする。

[0099]本開示は、変更されたカプシドタンパク質を伴うアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンを提供し、この場合、ＡＡＶビリオンは、硝子体内注射によって投与された場合、野生型ＡＡＶなどの非改変ＡＡＶと比較して、眼細胞のより高い感染力を示す。本開示は、網膜細胞などの細胞に導入遺伝子を送達する方法、および眼疾患を処置する方法をさらに提供する。網膜細胞は、光受容体（例えば、桿体：錐体）、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）、ミュラー細胞（ミュラーグリア細胞）、両極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞であり得る。

[0100]疾患または状態の処置を必要とする対象における疾患または状態を処置する方法であって、改変されたカプシドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む医薬組成物の治療有効量を投与する工程を含む、方法が、本明細書において提供される。いくつかの場合において、改変されたカプシドは、外因性ポリペプチド配列を欠くその他は同等のＡＡＶカプシド配列と比較して、ＶＰドメインの少なくとも２つのループにおける外因性ポリペプチド配列を含む。いくつかの態様において、外因性ポリペプチド配列は、表２の配列を含む。いくつかの場合において、主題のＡＡＶベクターは、導入遺伝子を含む配列をさらに含む。疾患または状態の処置を必要とする対象における疾患または状態を処置する方法であって、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む医薬組成物の治療有効量を投与する工程を含む、方法も提供される。主題のＡＡＶベクターは、（ａ）外因性配列を欠くその他は同等のＡＡＶカプシド配列と比較して、ＶＰドメインの少なくとも２つのループにおける外因性配列を含む改変されたカプシド；および／または（ｂ）導入遺伝子を含み得る。いくつかの場合において、ベクターは、複数の細胞と接触すると、複数の細胞と（ａ）を欠くその他は同等のＡＡＶベクターとの接触と比較して、複数の細胞においてトランスフェクション後に導入遺伝子の少なくとも３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、３０倍、６０倍、または１００倍の発現の増加を有する。いくつかの場合において、発現の増加は、複数の細胞と（ａ）を欠くその他は同等のＡＡＶベクターとの接触と比較して、少なくとも５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、または５００倍の増加を含む。

[0101]複数の主題のＡＡＶビリオンを含む組成物も、本明細書において提供される。主題のＡＡＶベクターまたは主題のＡＡＶビリオンを細胞にトランスフェクトすることによって生成された操作された細胞も提供される。いくつかの態様において、ウイルス粒子は、主題の操作された細胞から単離することができる。操作された細胞から単離された複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子も提供することができる。さらに、単位剤形においてアデノ随伴ウイルス粒子を含む組成物が提供される。いくつかの場合において、主題の組成物は、低温保存することができる。

[0102]導入遺伝子も、本明細書において提供される。好適な導入遺伝子としては、これらに限定されるわけではないが、疾患の処置のために使用されるタンパク質をコードするものが挙げられる。いくつかの態様において、疾患は、眼疾患である。別の実施例において、好適な疾患は、網膜疾患であり得る。いくつかの態様において、導入遺伝子は、治療薬、例えば、眼用治療薬などをコードすることができる。眼用治療薬は、少なくとも疾患、例えば、眼疾患などの症状を減じるために効果的であり得る。いくつかの態様において、治療薬は、少なくとも網膜疾患の症状を減少させる、網膜疾患を処置する、または
網膜疾患を排除するために効果的であり得る。好適な眼用治療薬は、抗体もしくはその生物学的に活性な断片および／または生物製剤を意味し得る。抗体および生物製剤の標的は、ＰＤＧＦ－ＢＢ、Ｃ５補体、Ｃ３補体、ＴＮＦ－アルファ、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ０１、ＤＤＩＴ４、ＫＳＰ、ＰＥＤＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＬ、トロンボスポンジン１、ＣＤ４７、アルファ５ベータ１インテグリン、エンドスタチン、アンギオスタチン、病理血管、またはそれらの任意の組合せを含み得る。

[0103]いくつかの場合において、眼用治療薬は、抗体またはその生物学的に活性な断片である。抗体は、モノクローナル抗体であり得る。いくつかの場合において、抗体は、完全ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る。好適な抗体は、抗ＶＥＧＦ、抗ＶＥＧＦＬ、抗トロンボスポンジン１、抗ＣＤ４７、抗ＴＮＦアルファ、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ５２、および抗ＣＤ１１ａ、抗補体因子５、ならびに／あるいは抗補体因子３であり得る。いくつかの場合において、抗体または生物学的に活性な断片は、リツキシマブ、インフリキシマブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、ＪＳＭ６４２７、および／またはコンバセプトを含む。

[0104]別の実施形態において、抗体は、ラニビズマブ（Ｓｃ－ラニビズマブ）の一本鎖バージョンである。ラニビズマブは、ＶＥＧＦ－Ａの全てのアイソフォームに結合してそれをブロックするモノクローナルＩｇＧｌ抗体断片（Ｆａｂ）である。ラニビズマブは、定常軽鎖（ＣＬ）および定常重鎖１（ＣＨ１）ドメインの間のジスルフィド結合によって連結される２つの別々の鎖（軽鎖および重鎖）として細菌において発現される。硝子体内ラニビズマブの承認された用量は、適応症に応じて０．０５ｍＬ中において０．３ｍｇまたは０．５ｍｇのどちらかである。ラニビズマブは、滲出型加齢黄斑変性症、網膜静脈閉塞症の後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、および糖尿病性網膜症の処置のために承認される。

[0105]いくつかの場合において、眼用治療薬は、生物製剤である。いくつかの態様において、生物製剤は、巨大分子、例えば、タンパク質、ペプチド、アプタマー、および／または非翻訳ＲＮＡ、例えば、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ＲＮＡｉ、およびｓｉＲＮＡなどから選択される。いくつかの態様において、本明細書において提供される組成物、例えば、改変されたカプシドを含むＡＡＶビリオンなどは、治療薬をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、治療薬は、干渉ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、治療薬は、アプタマーである。いくつかの実施形態において、治療薬は、ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、治療薬は、遺伝子機能の部位選択的ノックダウンを提供する部位選択的ヌクレアーゼである。

[0106]いくつかの場合において、生物製剤は、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、二重ｓｉＲＮＡ、遺伝子、ポリペプチド、またはタンパク質足場である。いくつかの場合において、生物製剤は、リポタンパク質リパーゼ、レチノイドイソメロヒドロラーゼＲＰＥ６５、または補体因子Ｈから選択される。いくつかの場合において、生物製剤は、ＶＥＧＦ－Ａ、例えばベバシラニブを標的にするｓｉＲＮＡを含む。いくつかの場合において、生物製剤は、ＲＮＡアプタマー、例えば、ペガプタニブなどである。いくつかの場合において、生物製剤は、ポリペプチド、例えば、融合タンパク質、例えば、アフリベルセプトなどである。いくつかの場合において、生物製剤は、ＤＮＡアプタマー、例えば、フォビスタなどである。いくつかの場合において、生物製剤は、タンパク質足場、例えば、ＤＡＲＰｉｎｓなどである。

[0107]ある態様において、生物製剤は、アフリベルセプトである。アフリベルセプトは、ヒトＩｇＧ１のＦｃタンパク質に融合したヒトＶＥＧＦ受容体１および２の細胞外ドメインを含む組換え融合タンパク質であり得る。アフリベルセプトは、天然受容体よりも高い親和性を有するＶＥＧＦ－ＡおよびＰＤＧＦに結合する可溶性デコイ受容体として機能する。硝子体内アフリベルセプト注射の承認された適用は、２．０ｍｇであり、その投薬は、適応症に従って異なる。アフリベルセプトは、新生血管（滲出型）加齢黄斑変性症、網膜静脈閉塞症の後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、および糖尿病性網膜症の処置に対して示される。

[0108]いくつかの態様において、生物学的治療薬は、アプタマーであり、目的の例示的なアプタマーとしては、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）に対するアプタマーが挙げられる。例えば、Ｎｇら（２００６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙ５：１２３；およびＬｅｅら（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０２：１８９０２を参照されたい。例えば、ＶＥＧＦアプタマーは、ヌクレオチド配列５’－ｃｇｃａａｕｃａｇｕｇａａｕｇｃｕｕａｕａｃａｕｃｃｇ－３’（配列番号１０９）を含み得る。ＰＤＧＦ特異的アプタマー、例えば、Ｅ１００３０なども、使用にとって好適であり；例えば、ＮｉａｎｄＨｕｉ（２００９）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ２２３：４０１；およびＡｋｉｙａｍａら（２００６）Ｊ．ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．２０７：４０７）を参照されたい。

[0109]いくつかの態様において、生物学的治療薬は、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）であり、好適なＲＮＡｉとしては、細胞内のアポトーシス因子または血管新生因子のレベルを下げることができるＲＮＡｉが挙げられる。例えば、ＲＮＡｉは、細胞内のアポトーシスを誘導または促進する遺伝子産物のレベルを下げるｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡであり得る。遺伝子産物がアポトーシスを誘導または促進する遺伝子は、本明細書において、「プロアポトーシス遺伝子」と呼ばれ、それらの遺伝子の産物（ｍＲＮＡ；タンパク質）は、「プロアポトーシス遺伝子産物」と呼ばれる。プロアポトーシス遺伝子産物としては、例えば、Ｂａｘ、Ｂｉｄ、Ｂａｋ、およびＢａｄ遺伝子産物が挙げられる。例えば、米国特許第７，８４６，７３０号を参照されたい。干渉ＲＮＡも、例えば、血管由来の産物、例えば、ＶＥＧＦ（例えば、Ｃａｎｄ５；例えば、米国特許出願公開第２０１１／０１４３４００号；米国特許出願公開第２００８／０１８８４３７号；およびＲｅｉｃｈら（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０を参照されたい）、ＶＥＧＦＲ１（例えば、Ｓｉｒｎａ－０２７；例えば、Ｋａｉｓｅｒら（２０１０）Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１５０：３３；およびＳｈｅｎら（２００６）ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１３：２２５を参照されたい）、またはＶＥＧＦＲ２（Ｋｏｕら（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：１５０６４）に対するものであり得る。米国特許第６，６４９，５９６号、同第６，３９９，５８６号、同第５，６６１，１３５号、同第５，６３９，８７２号、および同第５，６３９，７３６号；ならびに米国特許第７，９４７，６５９号および同第７，９１９，４７３号も参照されたい。

[0110]いくつかの場合において、生物製剤は、ポリペプチドを含む。ポリペプチドは、網膜細胞の機能、例えば、桿体もしくは錐体光受容体細胞、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、両極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮細胞の機能を高めることができる。例示的なポリペプチドとしては、神経保護ポリペプチド（例えば、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＴ４、ＮＧＦ、およびＮＴＮ）；抗血管形成ポリペプチド（例えば、可溶性血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体；ＶＥＧＦ結合抗体；ＶＥＧＦ結合抗体断片（例えば、一本鎖抗ＶＥＧＦ抗体）；エンドスタチン；タムスタチン；アンギオスタチン；可溶性Ｆｌｔポリペプチド（Ｌａｉら（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：６５９）；可溶性Ｆｌｔポリペプチドを含むＦｃ融合タンパク質（例えば、Ｐｅｃｈａｎら（２００９）ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１６：１０を参照されたい）；色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）；可溶性Ｔｉｅ－２受容体など）；メタロプロテイナーゼ－３の組織阻害剤（ＴＩＭＰ－３）；光反応性オプシン、例えば、ロドプシン；抗アポトーシスポリペプチド（例えば、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－Ｘ１）；などが挙げられる。好適なポリペプチドとしては、これらに限定されるわけではないが、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；線維芽細胞増殖因子２；ニュールツリン（ＮＴＮ）；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；神経増殖因子（ＮＧＦ）；ニューロトロフィン－４（ＮＴ４）；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ；上皮細胞増殖因子；ロドプシン；アポトーシスのＸ連鎖阻害剤；およびソニックヘッジホッグが挙げられる。

[0111]いくつかの場合において、ポリペプチドは、レチノスキシン、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ制御剤（ＲＧＰＲ）－相互作用タンパク質－１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｑ９６ＫＮ７、Ｑ９ＥＰＱ２、およびＱ９ＧＬＭ３を参照されたい）、ペリフェリン－２（Ｐｒｐｈ２）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０００３１３を参照されたい）、ペリフェリン、網膜色素上皮特異的タンパク質（ＲＰＥ６５）、（例えば、ＧｅｎＢａｎｋＡＡＣ３９６６０；およびＭｏｒｉｍｕｒａら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：３０８８を参照されたい）、ＣＨＭ（コロイデレミア（ｃｈｏｒｏｉｄｅｒｍｉａ）（Ｒａｂｅｓｃｏｒｔｐｒｏｔｅｉｎ１））、不全であるかまたは失われた場合に先天性脈絡膜欠如を引き起こすポリペプチド（例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（１９９４）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３：１０１７；およびｖａｎＢｏｋｈｏｖｅｎら（１９９４）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３：１０４１を参照されたい）；ならびにＣｒｕｍｂｓｈｏｍｏｌｏｇ１（ＣＲＢ１）、不全であるかまたは失われた場合にレーバー先天性黒内障および網膜色素変性症を引き起こすポリペプチド（例えば、ｄｅｎＨｏｌｌａｎｄｅｒｅｔａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２３：２１７；およびＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＣＡＭ２３３２８を参照されたい）を含み得る。好適なポリペプチドとしては、不全であるかまたは失われた場合に色覚異常を引き起こすポリペプチドも挙げられ、この場合、そのようなポリペプチドとしては、例えば、錐体光受容体ｃＧＭＰ作動性チャネルサブユニットアルファ（ＣＮＧＡ３）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００１２８９；およびＢｏｏｉｊら（２０１１）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ１１８：１６０～１６７を参照されたい）；錐体光受容体ｃＧＭＰ作動性カチオンチャネルベータサブユニット（ＣＮＧＢ３）（例えば、Ｋｏｈｌら（２００５）ＥｕｒＪＨｕｍＧｅｎｅｔ．１３（３）：３０２を参照されたい）；グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）、アルファ形質導入活性ポリペプチド２（ＧＮＡＴ２）（ＡＣＨＭ４）；およびＡＣＨＭ５；ならびに不全であるかまたは欠いている場合に様々な形態の色盲を引き起こすポリペプチドが挙げられる。

[0112]いくつかの場合において、生物製剤は、遺伝子機能の部位選択的ノックダウンを提供する部位選択的エンドヌクレアーゼを含み、例えば、この場合、エンドヌクレアーゼは、網膜疾患に関連する対立遺伝子をノックアウトする。例えば、優性対立遺伝子は、野生型の場合に、網膜構造タンパク質であり、および／または正常な網膜機能を提供する、欠陥のある遺伝子コピーをコードし、部位選択的エンドヌクレアーゼは、欠陥のある対立遺伝子を標的にすることができ、欠陥のある対立遺伝子をノックアウトすることができる。欠陥のある対立遺伝子をノックアウトすることに加えて、部位選択的ヌクレアーゼは、欠陥のある対立遺伝子によってコードされたタンパク質の機能的なコピーをコードするドナーＤＮＡによる相同的組換えを刺激するためにも使用することができる。したがって、例えば、主題のＡＡＶビリオンは、欠陥のある対立遺伝子をノックアウトする両方の部位選択的エンドヌクレアーゼを送達するために使用することができ、欠陥のある対立遺伝子の機能的コピーを送達するために使用することができ、結果として欠陥のある対立遺伝子の修復を生じ、それにより、機能的網膜タンパク質（例えば、機能的レチノスキシン、機能的ＲＰＥ６５、機能的ペリフェリンなど）の産生を提供する。例えば、Ｌｉら（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ４７５：２１７を参照されたい。いくつかの実施形態において、主題のＡＡＶビリオンは、部位選択的エンドヌクレアーゼをコードする導入遺伝子および欠陥のある対立遺伝子の機能的コピーをコードする異種ヌクレオチド配列を含み、この場合、機能的コピーは、機能的網膜タンパク質をコードする。機能的網膜タンパク質としては、例えば、レチノスキシン、ＲＰＥ６５、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ制御剤（ＲＧＰＲ）－相互作用タンパク質－１、ペリフェリン、ペリフェリン－２などが挙げられる。使用にとって好適な部位選択的エンドヌクレアーゼとしては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、およびＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が挙げられ、この場合、そのような部位選択的エンドヌクレアーゼは、天然には存在せず、特定の遺伝子を標的にするように改変される。そのような部位選択的ヌクレアーゼは、ゲノム内の特定の位置を切断するように操作することができ、次いで、非相同的末端接合は、いくつかのヌクレオチドを挿入または除去しつつ、破壊を修復することができる。そのような部位選択的エンドヌクレアーゼ（「ＩＮＤＥＬ」とも呼ばれる）は、次いで、フレームからタンパク質を除去し、遺伝子を効率的にノックアウトする。例えば、米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号を参照されたい。

[0113]いくつかの実施形態において、細胞タイプ特異的または組織特異的プロモーターは、主題の治療薬をコードする導入遺伝子に作動可能に連結させることができ、それにより、遺伝子産物は、特定の細胞タイプ（複数可）または組織（複数可）において選択的または優先的に産生される。いくつかの実施形態において、誘導プロモーターは、導入遺伝子配列に作動可能に連結されるであろう。いくつかの場合において、プロモーターは、光受容体特異的調節エレメント（例えば、光受容体特異的プロモーター）、例えば、光受容体細胞における作動可能に連結された遺伝子の選択的発現を付与する調節エレメントに作動可能に連結することができる。好適な光受容体特異的調節エレメントとしては、例えば、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター（Ｙｏｕｎｇら（２００３）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４４：４０７６）；ベータホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーター（Ｎｉｃｏｕｄら（２００７）Ｊ．ＧｅｎｅＭｅｄ．９：１０１５）；網膜色素変性症遺伝子プロモーター（上記のＮｉｃｏｕｄら（２００７））；光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（上記のＮｉｃｏｕｄら（２００７））；ＩＲＢＰ遺伝子プロモーター（Ｙｏｋｏｙａｍａら（１９９２）ＥｘｐＥｙｅＲｅｓ．５５：２２５）などが挙げられる。

[0114]いくつかの実施形態において、主題の改変されたＡＡＶによって送達される生物製剤は、血管形成を阻害するように作用することができる。ある特定の好ましい実施形態において、主題の改変されたＡＡＶによって送達される生物製剤は、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、およびＰＤＧＦからなる群から選択される１つまたは複数の哺乳動物ＶＥＧＦタンパク質の活性を阻害するように機能し得る。特に好ましい実施形態において、主題のＡＡＶバリアントによって送達される生物製剤は、ＶＥＧＦ－Ａの活性を阻害する。ＶＥＧＦ－Ａは、択一的スプライシングによって生成される９つのアイソフォームを有し、最も生理学的に関連するのは、ＶＥＧＦ１６５である。ＶＥＧＦ－Ａレベルは、滲出型加齢黄斑変性症、糖尿病性黄斑浮腫、および網膜静脈閉塞症によって患者の硝子体において高められることが見出されている。眼におけるＶＥＧＦ－Ａの活性を阻害し、したがって、硝子体ＶＥＧＦ－Ａが高い患者を処置するために効果的である、遺伝子産物（複数可）としては、これらに限定されるわけではないが、アフリベルセプト、ラニビズマブ、ブロルシズマブ、ベバシズマブ、および可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１（ｓＦＬＴｌ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｕ０１１３４）が挙げられる。いくつかの実施形態において、（ｉ）本明細書において説明されるバリアントＡＡＶカプシドタンパク質および（ｉｉ）ＶＥＧＦ阻害剤を含む導入遺伝子を含む感染性ＡＡＶビリオンが提供される。ある実施形態において、導入遺伝子は、複数の配列を含み、各配列は、異なるＶＥＧＦ－Ａ阻害剤をコードする。ある実施形態において、導入遺伝子は、アフリベルセプトであり得る。

[0115]本明細書において提供される組成物および方法は、主題の導入遺伝子の送達を、その他は同等の非改変ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶカプシドよりも少なくとも約３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または最高で１００％高めるのに十分であり得る。いくつかの場合において、改変は、主題の導入遺伝子の送達を、その他は同等の非改変ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶカプシドよりも少なくとも約１倍、６倍、１１倍、１６倍、２１倍、２６倍、３１倍、３６倍、４１倍、４６倍、５１倍、５６倍、６１倍、６６倍、７１倍、７６倍、８１倍、８６倍、９１倍、９６倍、１０１倍、１０６倍、１１１倍、１１６倍、１２１倍、１２６倍、１３１倍、１３６倍、１４１倍、１４６倍、１５１倍、１５６倍、１６１倍、１６６倍、１７１倍、１７６倍、１８１倍、１８６倍、１９１倍、１９６倍、２０１倍、２０６倍、２１１倍、２１６倍、２２１倍、２２６倍、２３１倍、２３６倍、２４１倍、２４６倍、２５１倍、２５６倍、２６１倍、２６６倍、２７１倍、２７６倍、２８１倍、２８６倍、２９１倍、２９６倍、３０１倍、３０６倍、３１１倍、３１６倍、３２１倍、３２６倍、３３１倍、３３６倍、３４１倍、３４６倍、または３５０倍高めるのに十分であり得る。

[0116]主題のＡＡＶビリオンは、その他は同等のＷＴＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞（光受容体、神経節細胞、ＲＰＥ細胞、アマクリン細胞、水平細胞、ミュラー細胞など）の感染力と比較して、少なくとも１倍、６倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上増加した網膜細胞の感染力を示し得る。

[0117]いくつかの実施形態において、主題の改変された組成物、例えば、ＡＡＶビリオンは、非網膜細胞、例えば、眼の外側の細胞よりも、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、または５０倍以上の特異性において網膜細胞に選択的に感染する。例えば、いくつかの実施形態において、主題のＡＡＶビリオンは、網膜細胞に選択的に感染し、例えば、主題の操作されたＡＡＶビリオンは、非網膜細胞、例えば、眼の外側の細胞よりも、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、または５０倍以上の特異性において光受容体細胞に感染する。ある実施形態において、主題のＡＡＶビリオンは、その他は同等のＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上増加した網膜細胞の感染力を示す。いくつかの場合において、主題のＡＡＶビリオンは、硝子体内注射によって投与される場合の、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むその他は同等の非改変ＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、硝子体内注射によって投与される場合に、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上増加した網膜細胞の感染力を示す。ある実施形態において、主題のＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる光受容体細胞の感染力と比較して、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上増加した光受容体（桿体または錐体）細胞の感染力を示す。いくつかの実施形態において、主題のＡＡＶビリオンは、硝子体内注射によって投与される場合の、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる光受容体細胞の感染力と比較して、硝子体内注射によって投与される場合に、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上増加した光受容体（桿体または錐体）細胞の感染力を示す。いくつかの実施形態において、主題のＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるＲＧＣの感染力と比較して、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上増加したＲＧＣの感染力を示す。いくつかの実施形態において、主題のＡＡＶビリオンは、硝子体内注射によって投与される場合の、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるＲＧＣの感染力と比較して、硝子体内注射によって投与される場合に、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上増加したＲＧＣの感染力を示す。

[0118]ある態様において、形質導入、感染力、および／または向性は、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて感染細胞における導入遺伝子の存在を特定することによって検出される。網膜細胞の形質導入における増加、例えば、形質導入の効率の増加、より広範な形質導入、より好ましい形質導入などは、遺伝子発現を測定するための当技術分野における様々な方法によって、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏにおいて容易に評価され得る。例えば、ＡＡＶは、遍在するプロモーターまたは組織特異的プロモーターの制御下において、レポーター遺伝子、例えば、蛍光タンパク質を含む発現カセットを含むゲノムによってパッケージされ得、形質導入の程度は、例えば、蛍光顕微鏡によって、蛍光タンパク質を検出することによって評価される。別の実施例として、ＡＡＶは、バーコード化された核酸配列を含むゲノムによってパッケージされ得、形質導入の程度は、例えば、ＰＣＲによって、核酸配列を検出することによって評価される。別の実施例として、ＡＡＶは、網膜疾患の処置のための治療遺伝子を含む発現カセットを含むゲノムによってパッケージされ得、形質導入の程度は、ＡＡＶを投与された罹患患者における網膜疾患の処置を検出することによって評価される。例えば、細胞は、本明細書において説明される改変されたカプシドＡＡＶ組成物を用いて形質導入することができ、導入遺伝子の存在は、顕微鏡法、フローサイトメトリー、ＰＣＲベースのアッセイ、ＥＬＩＳＡ、組織学、またはそれらの任意の組合せによって特定することができる。

[0119]本開示はさらに、導入遺伝子を、それを必要とする対象に送達する方法を提供する。当該方法は、概して、主題の組成物、例えば、改変されたＡＡＶカプシドを含む組成物、例えば、これらに限定されるわけではないが、ＡＡＶビリオン、ＡＡＶベクター、またはそれらの組合せなどを個体に導入する工程を伴う。

[0120]形質導入された細胞および／または、例えば、形質導入の潜在性を示すような、ＡＡＶビリオンは、次いで、下記においてより完全に説明される医薬組成物へと製剤化することができ、組成物は、様々な技術によって、例えば、硝子体内、筋肉内、静脈内、皮下、および／または腹腔内注射などによって、対象に形質導入される。

[0121]ｉｎｖｉｖｏ送達のために、主題のＡＡＶビリオンは、医薬組成物へと製剤化することができ、概して、硝子体内または非経口的に投与されるであろう（例えば、筋肉内、皮下、腫瘍内、経皮、髄腔内などの投与経路によって投与される）。

[0122]本明細書において説明される組成物は、医薬組成物へと製剤化することができる。いくつかの態様において、医薬組成物は、処置を必要とする対象、ヒトまたは哺乳動物などを処置するために使用することができる。いくつかの場合において、対象は、疾患、例えば、眼疾患と診断され得る。いくつかの態様において、主題の医薬組成物は、二次療法と共に同時投与される。

[0123]前に説明した組成物のいずれかを含む医薬組成物も、本明細書において提供することができる。医薬組成物は、単位剤形であり得る。ある態様において、本明細書において提供される医薬組成物は、改変されたＡＡＶカプシドを含む。

[0124]ある態様において、本開示は、ａ）上記において説明される主題のＡＡＶビリオン；およびｂ）薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝剤を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、当該薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝剤は、ヒトにおける使用にとって好適である。

[0125]そのような賦形剤、担体、希釈剤、および緩衝剤としては、過度の毒性なしで投与することができる任意の薬剤が挙げられる。薬学的に許容される賦形剤としては、これらに限定されるわけではないが、液体、例えば、水、塩水、グリセロール、およびエタノールが挙げられる。薬学的に許容される塩、例えば、鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など、ならびに有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などはそれに含まれ得る。さらに、補助物質、例えば、湿潤剤および乳化剤、ｐＨ緩衝物質、なども、そのようなビヒクル中に存在してもよい。様々な薬学的に許容される賦形剤は、当技術分野において公知であり、本明細書において詳細に説明する必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、様々な刊行物、例えば、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ」，２０ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓａｎｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌら，ｅｄｓ．，７ｔｈｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；およびＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅら，ｅｄｓ．，３ｒｄｅｄ．Ａｍｅｒ．ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＡｓｓｏｃなどにおいて十分に説明されている。

[0126]本明細書において提供される医薬組成物は、疾患を予防および／または処置するために用いることができる。いくつかの態様において、疾患は、眼疾患である。いくつかの場合において、眼疾患は、若年性疾患である。いくつかの場合において、眼疾患は、高齢の疾患である。いくつかの場合において、眼疾患は、網膜の疾患である。本明細書において提供される医薬組成物および方法によって予防および／または処置することができる眼疾患は、色盲、新生血管形成関連網膜障害、例えば、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、滲出型加齢黄斑変性症（ｗＡＭＤ）、地図状萎縮（ＧＡ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、緑内障、バーデット・ビードル症候群、ベスト病、先天性脈絡膜欠如、レーバー先天性黒内障、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、黄斑変性、ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）、網膜色素変性症、レフサム病、シュタルガルト病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）、遺伝性網膜疾患（ＩＲＤ）、桿体錐体ジストロフィー、錐体桿体ジストロフィー、小口病、ＭａｌａｔｔｉａＬｅｖｅｎｔｉｎｅｓｅ（家族性優性ドルーゼン）、青色錐体一色型色覚異常、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）、およびぶどう膜炎黄斑浮腫（ＵＭＯ）などである。いくつかの場合において、網膜疾患は、ＡＭＤである。いくつかの場合において、網膜疾患は、滲出型ＡＭＤである。いくつかの場合において、網膜疾患は、萎縮型ＡＭＤである。さらなる眼疾患は、急性黄斑性視神経網膜障害；ベーチェット病；脈絡膜血管新生；糖尿病性ぶどう膜炎；ヒストプラスマ症；黄斑変性、例えば、急性黄斑変性、非浸出性加齢黄斑変性症、および滲出性加齢黄斑変性症など；水腫、例えば、黄斑浮腫、嚢胞様黄斑浮腫、および糖尿病性黄斑浮腫など；多病巣性脈絡膜炎；後眼部位または位置に影響する眼外傷；眼腫瘍；網膜障害、例えば、網膜中心静脈閉塞症、糖尿病性網膜症（例えば、増殖性糖尿病性網膜症など）、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜動脈閉塞性疾患、網膜剥離、ぶどう膜炎網膜疾患；交感性眼炎；フォークト－小柳－原田（ＶＫＨ）症候群；ぶどう膜拡散（ｕｖｅａｌｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）；眼のレーザー処置によって引き起こされたかまたは影響を受けた後眼部の状態；光線力学的療法によって引き起こされたかまたは影響を受けた後眼部の状態；光凝固；放射線網膜症；網膜上膜障害；網膜静脈分枝閉塞症；前部虚血性視神経症；非網膜症糖尿病性網膜機能障害；網膜分離症；網膜色素変性症；緑内障；アッシャー症候群；錐体桿体ジストロフィー；シュタルガルト病（眼底黄点症）；遺伝的黄斑変性症；脈絡網膜変性症；レーバー先天性黒内障；先天性な定常夜盲症；先天性脈絡膜欠如；バーデット・ビードル症候群；黄斑部毛細血管拡張症；レーバー遺伝性視神経症；早発網膜症；および色覚の障害、例えば、色盲、赤色盲、緑色盲、および青黄色盲などを含む。

[0127]いくつかの場合において、主題の組成物を投与することができる対象は、受けているか、受けるか、または二次療法の投与に後に受ける。二次療法は、眼への使用のための任意の療法を含み得る。いくつかの場合において、二次療法は、栄養療法、ビタミン、レーザー治療、例えば、レーザー光凝固など、光力学療法、ビスダイン、抗ＶＥＧＦ療法、アイウェア、点眼剤、局部麻酔薬、視能矯正視覚療法、行動性／知覚的視覚療法などを含む。いくつかの態様において、前に説明した生物製剤のいずれも、二次療法と見なすことができる。

[0128]本開示は、個体における網膜細胞に導入遺伝子を送達する方法であって、個体に上記において説明される主題のＡＡＶビリオンを投与する工程を含む、方法を提供する。導入遺伝子を網膜細胞に送達する工程は、網膜疾患の処置を提供することができる。網膜細胞は、光受容体、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、両極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮細胞であり得る。いくつかの場合において、網膜細胞は、光受容体細胞、例えば、桿体または錐体細胞である。

[0129]本開示は、網膜疾患を処置する方法であって、前に説明した主題のＡＡＶビリオンの有効量をそれを必要とする個体に投与する工程を含む、方法を提供する。主題のＡＡＶビリオンは、眼内注射によって、硝子体内注射によって、または投与の任意の他の便利な様式または経路によって、投与することができる。投与の他の便利な様式または経路としては、例えば、静脈内、鼻腔内などが挙げられる。硝子体内注射によって投与される場合、主題のビリオンは、硝子体を通って移動することができ、内境界膜（ｉｎｔｅｒｎａｌｌｉｍｉｔｉｎｇｍｅｍｂｒａｎｅ）（本明細書において、内境界膜（ｉｎｎｅｒｌｉｍｉｔｉｎｇｍｅｍｂｒａｎｅ）または「ＩＬＭ」とも呼ばれ；網膜と硝子体の間の境界を形成する網膜の表面上の薄くて透明な無細胞膜、アストロサイトとミュラー細胞のエンドフィートとによって形成される）を横断することができ、ならびに／あるいは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンの能力と比較して、より効率的に網膜の層を通って移動することができる。

[0130]本開示は、本明細書において、網膜疾患を処置する方法であって、上記において説明され本明細書において開示される目的の導入遺伝子を含む改変されたＡＡＶビリオンの有効量を、それを必要とする個体に投与する工程を含む、方法も提供する。当業者は、１つまたは複数の機能的または解剖学的パラメーター、例えば、視力、視野、明所および暗所に対する電気生理学的応答性、色覚、コントラスト感度、解剖学的構造、網膜の健康および血管構造、眼球運動、固視優位性（ｆｉｘａｔｉｏｎｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）、および安定性における変化を調べることによって、主題のビリオンの有効量、ならびに疾患が処置されたことを、容易に特定することができるであろう。

[0131]網膜機能およびその変化を評価する非限定的な方法としては、視力の評価（例えば、最良矯正視力［ＢＣＶＡ］、歩行、ナビゲーション、対象物検出、および判別）、視野の評価（例えば、静的および動的視野測定）、臨床検査の実施（例えば、前眼部および後眼部の細隙灯検査）、明所および暗所の全ての波長に対する電気生理学的応答性の評価（例えば、全ての形態の網膜電図記録（ＥＲＧ）［全視野、多焦点、およびパターン］、全ての形態の視覚性誘発電位（ＶＥＰ）、眼電図記録（ＥＯＧ）、色覚、暗順応、および／またはコントラスト感度）が挙げられる。解剖学的構造および網膜の健康およびその変化を評価する非限定的な方法としては、光学的コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）、眼底写真撮影、補償光学走査型レーザー検眼鏡検査（ＡＯ－ＳＬＯ）、蛍光および／または自発蛍光；眼球運動および眼運動の測定（例えば、眼振、固視優位性、および安定性）、報告された転帰の測定（視覚および非目視誘導挙動および活性における患者報告の変化、患者報告の転帰［ＰＲＯ］、クオリティオブライフのアンケートベースの評価、神経機能の日常活動および測定（例えば、機能的磁気共鳴画像法（ＭＲＩ））が挙げられる。

[0132]いくつかの実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンの有効量は、結果として、網膜機能、解剖学的健全性、または網膜の健康の低下率の減少、例えば、２倍、３倍、４倍、もしくは５倍、またはそれ以上の低下率の減少をもたらし、結果として、疾患の進行の減少をもたらし、例えば、１０倍またはそれ以上の低下率の減少をもたらし、結果として、疾患の進行の減少をもたらす。いくつかの実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンの有効量は、結果として、視機能、網膜機能、網膜の解剖学的構造または健康における改善、および／または眼球運動における改善、および／または神経機能における改善における利得、例えば、２倍、３倍、４倍、もしくは５倍、またはそれ以上の、網膜機能、網膜の解剖学的構造または健康、および／または眼球運動における改善、例えば、１０倍またはそれ以上の、網膜機能、網膜の解剖学的構造または健康、および／または眼球運動における改善をもたらす。当業者によって容易に理解されるように、所望の治療効果を達成するために必要な用量は、典型的には、１×１０^８から約１×１０^１５の範囲の組換えビリオンであり、それは、典型的には、当業者によって、１×１０^８から約１×１０^１５の「ベクターゲノム」と呼ばれる。

[0133]いくつかの態様において、本明細書において提供される組成物、例えば、医薬組成物などは、それを必要とする対象に投与される。いくつかの場合において、投与は、約ベクター０．５×１０^９ｖｇ、１．０×１０^９ｖｇ、１．０×１０^１０、１．０×１０^１１ｖｇ、３．０×１０^１１ｖｇ、６×１０^１１ｖｇ、８．０×１０^１１ｖｇ、１．０×１０^１２ｖｇ、１．０×１０^１３ｖｇ、１．０×１０^１４ｖｇ、１．０×１０^１５ｖｇ、１．５×１０^１５ｖｇのＡＡＶベクターの投薬量を送達する工程を含む。例えば、ｉｎｖｉｖｏ注射、すなわち、眼への直接の注射の場合、治療有効用量は、約１０^６から約１０^１５のオーダーの主題のＡＡＶビリオン、例えば、約１０^８から１０^１２のオーダーの操作されたＡＡＶビリオンであり得る。ｉｎｖｉｔｒｏ形質導入の場合、細胞に送達される操作されたＡＡＶビリオンの有効量は、約１０^８から約１０^１３のオーダーの操作されたＡＡＶビリオンであろう。他の有効な投薬量は、用量反応曲線を確立する通常のトライアルによって、当業者によって容易に確立することができる。

[0134]投与は、任意の期間において繰り返すことができる。いくつかの態様において、投与する工程は、１日２回、１日おき、１週間あたり２回、隔月、３カ月ごと、１カ月あたり１回、１カ月おき、半年ごと、毎年、または年２回実施される。

[0135]投薬処置は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールであってもよい。その上、対象は、必要に応じて多くの用量として投与してもよい。当業者は、用量の適切な回数を容易に決定することができる。いくつかの態様において、医薬組成物は、硝子体内注射、網膜下注射、マイクロインジェクション、または超眼注射によって投与される。

[0136]いくつかの態様において、本明細書において提供される医薬組成物の投与の前、その際、および／またはその後に、変異に対して対象を遺伝子試験によってスクリーニングすることができる。変異に対してスクリーニングすることができる関連遺伝子は、ＲＰＥ６５、ＣＲＢ１、ＡＩＰＬ１、ＣＦＨ、またはＲＰＧＲＩＰを含む。

[0137]本明細書において提供される組成物のいずれかを含むキットも提供される。ａ）主題の改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシド；ｂ）主題のベクター；またはｃ）主題の操作されたビリオンを含む容器も提供される。ある態様において、容器は、バイアル、注射器、または針である。いくつかの場合において、容器は、眼送達のために構成される。

[0138]キットは、好適に等分された組成物を含み得る。キットの成分は、水性媒体中においてまたは凍結乾燥形態のどちらかにおいてパッケージされ得る。キットの容器手段は、概して、成分がその中に位置され得る、好ましくは好適に等分され得る、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器、または別の容器手段を含むであろう。キット中に２つ以上の成分が存在する場合、キットは、概して、中に追加の成分が別々に位置され得るような第２、第３、または他の追加の容器も含むであろう。ただし、成分の様々な組合せが、バイアル中に含まれてもよい。キットは、典型的には、成分を商用販売のために厳重に拘束して収容するための手段も含むであろう。そのような容器は、中に所望のバイアルが保持される注射器またはブロー成形されたプラスチック容器を含み得る。

[0139]いくつかの場合において、本明細書において説明される組成物を含むパッケージされた製品は、適切に標識され得る。いくつかの場合において、本明細書において説明される医薬組成物は、適正製造基準（ｃＧＭＰ）および表示規制に従って製造され得る。いくつかの場合において、本明細書において開示される医薬組成物は、無菌であり得る。

実施例１
改変されたＡＡＶカプシドのデザイン
[0140]デカノイル－Ｌ－ペプチジル断片（１０個のアミノ酸残基）を、最初の分析として部分的にランダム化した。最初のペプチド断片の出発のアミノ酸配列は、式１：Ｘ０－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ１－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号１０８）として提供され、式中、Ｘ０は、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、またはメチオニン（Ｍ）であり、Ｘ１は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）であり、Ｘ２は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭであり、Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、またはＱであり、Ｘ４は、Ｋ、Ｒ、Ｅ、またはＡであり、Ｘ_５は、プロリン（Ｐ）またはＲである。

[0141]改変されたペプチドは、ＡＡＶ２（または本明細書で提供されているような他の適切なＡＡＶ血清型）ウイルスタンパク質（ＶＰ１）のループ３および／またはループ４へ部分的に挿入され、公開の構造モデリングシステムを使用して分析される。非改変ＡＡＶ２カプシドの野生型ループ構造と比較して、類似した表現型および／または構造的外観を有する立体構造を、生物学的評価のために選択した。表２は、例示的なＡＡＶ２Ｒｅｐおよび改変されたＡＡＶ２カプシド領域を提供する。

実施例２
改変されたＡＡＶカプシドの生成
ＡＡＶ２Ｒｅｐおよび改変されたＡＡＶ２カプシド遺伝子を有するｐＦＢシャトルプラスミドの構築
[0142]ＰＣＲを利用して、所望の変異ペプチドをＶ４４９プラスミドバックボーンのＡＡＶ２カプシド遺伝子へ挿入した。簡単に述べれば、プラスミドＶ４４９－ｐＦＢ－ｉｎＣａｐ２－ｉｎＲｅｐ－ｋｏｚａｋ－ｈｒ２を、制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＸｂａＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）で切断して、９１１３ｂｐのバックボーン断片を単離した。所望の変異ペプチドのＤＮＡ配列を含有する５’ＰＣＲ断片および３’ＰＣＲ断片はそれぞれ、鋳型としてＶ４４９－ｐＦＢ－ｉｎＣａｐ２－ｉｎＲｅｐ－ｋｏｚａｋ－ｈｒ２を使用して、増幅され、その後、２回目のＰＣＲにより、一緒に連結されて、単一のＰＣＲ断片を形成した。連結されたＰＣＲ断片はそれぞれ、Ｖ４４９－ｐＦＢ－ｉｎＣａｐ２－ｉｎＲｅｐ－ｋｏｚａｋ－ｈｒ２のＢｓｉＷＩおよびＸｂａＩ部位へ、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒＨｉＦｉＤＮＡアセンブリーキット（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を使用して、クローニングされて、所望のクローンを作出した。しかしながら、クローンＶ４７１－ｐＦＢ－ｉｎＣａｐ２－４５２＿５８７ＲｔｏＫ－ｉｎＲｅｐ－ｋｏｚａｋ－ｈｒ２は、ＰＣＲ反応のための鋳型およびＨｉＦｉアセンブリーのためのバックボーンとして、Ｖ４６７－ｐＦＢ－ｉｎＣａｐ２－５８７ＲｔｏＫ－ｉｎＲｅｐ－ｋｏｚａｋ－ｈｒ２を使用して、作出された。生じたクローンを、制限酵素消化で検証し、変異部位を、ＤＮＡ配列決定分析により確認した。クローン番号およびＰＣＲプライマーは、表３に提供される。

[0143]ＰＣＲ反応およびＤＮＡ配列決定分析に使用されるプライマーの配列が表４に提供される。

組換えバキュロウイルスの作製
[0144]組換えバキュロウイルスを、Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃバキュロウイルス発現システムを使用して、製造会社の使用説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に従って生成した。簡単に述べれば、前に記載されているような標的遺伝子を含有するｐＦＢシャトルプラスミドをそれぞれ、ＴＥ緩衝液中１ｎｇ／μＬへ希釈し、各ＤＮＡの２ｎｇを、カテプシン遺伝子が欠失した、バクミドＤＮＡ分子を含有するΔｃａｔｈ－ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細菌（Ｖｉｒｏｖｅｋ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）の２０μＬと混合し、氷上で３０分間、インキュベートし、続いて、４２℃で３０秒間、熱ショックを与えた。氷上で２分間のインキュベーション後、その細菌を３７℃で４時間培養して回収し、その後、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、７μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリン、４０μｇ／ｍＬのＩＰＴＧ、および１００μｇ／ｍＬのＸ－ｇａｌを含有する寒天プレート上にプレーティングした。３７℃で４８時間のインキュベーション後、組換えバクミドＤＮＡを含有する白色コロニーを採取し、無菌条件下で、ミニプレップバクミドＤＮＡを精製した。各バクミドＤＮＡの約５μｇおよびＧｅｎｅＪｅｔ試薬（ＳｉｇｎａＧｅｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｆｒｅｄｒｉｃｋ、ＭＤ）の１０μＬをそれぞれ、１００ｕＬＥＳＦＡＦ培地（ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ、Ｄａｖｉｓ、ＣＡ）中に希釈し、その後、約３０分間、一緒に混合して、トランスフェクション混合物を形成した。Ｓｆ９細胞を、６ウェルプレートにおいて、２ｍＬＥＳＦＡＦ培地中１．５ｅ＋６細胞／ウェルで、２８℃、約３０分間、プレーティングした。Ｓｆ９細胞から古い培地を除去した後、各トランスフェクション混合物を、８００μＬＥＳＦＡＦ培地中に希釈し、その後、Ｓｆ９細胞へ加えた。２８℃で一晩のインキュベーション後、Ｓｆ９細胞を含む各ウェルに、さらに１ｍＬＥＳＦＡＦ培地を加えた。合計４日間のインキュベーション時間後、組換えバキュロウイルスを、細胞を含まずに収集し、１：２００の比に増幅して、ＡＡＶ産生プロセスに使用するのに十分な量の組換えバキュロウイルスが生成された。

[0145]Ｓｆ９細胞培養物を、コーニングボトルにおいて、１００ユニット／ｍＬのペニシリンおよび１００ｕｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）を含有するＥＳＦＡＦ培地（ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ）中、１５０ｒｐｍおよび２８℃で穏やかに撹拌しながら、維持した。細胞が約１ｅ＋７細胞／ｍＬへ成長したならば、維持のために、それらを、新鮮培地の新しいボトルへ１：４に分割し、連続培養した。

実施例３
ＡＡＶ産生および精製
[0146]ＡＡＶ２Ｒｅｐ遺伝子および変異体ＡＡＶ２カプシド遺伝子、ならびにＣＭＶ－ＧＦＰ、それぞれを有する組換えバキュロウイルスを使用して、ＡＡＶ産生のためにＳｆ９細胞に同時感染させた。簡単に述べれば、ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を有する１０ｍｏｉのｒＢＶ、ならびにＣＭＶ－ＧＦＰを有する５ｍｏｉのｒＢＶを使用して、振盪インキュベーターにおいて１８０ｒｐｍの振盪速度で、２８℃、３日間、５０％新鮮なＥＳＦＡＦ培地に約５ｅ＋６細胞／ｍＬの密度でのＳｆ９細胞株に同時感染させた。感染の終了時に、細胞ペレットを、３，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により収集した。その細胞を、５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２ｍＭＭｇＣｌ２、１％サルコシル、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、および１２５ユニット／ｍＬベンゾナーゼを含有するＳｆ９溶解緩衝液において、激しいボルテックス、続いて、３５０ｒｐｍ、３７℃で１時間、振盪して、溶解させた。振盪の終了時に、塩濃度を、５００ｍＭに調整し、可溶化液を、８，０００ｒｐｍで、４℃、２０分間の遠心分離により清澄化した。清澄化された可溶化液を、５ｍＬ１．５０ｇ／ｃｃおよび１０ｍＬ１．３０ｇ／ｃｃの塩化セシウム溶液を含有する、ＳＷ２８スウィングバケットローター用のウルトラクリア遠心チューブへ移した。２８，０００ｒｐｍ、１５℃で約１８時間の遠心分離後、ＡＡＶバンドを注射器で収集し、７０ｔｉ遠心機ローター用のウルトラクリア遠心チューブへ移した。遠心チューブを、１．３８ｇ／ｃｃ塩化セシウム溶液で満たし、ヒートシールした。ＡＡＶ試料を、６５，０００ｒｐｍ、１５℃、約１８時間の超遠心分離の第２ラウンドに供し、ＡＡＶバンドを、注射器で収集した。精製されたＡＡＶ試料を、０．００１％プルロニック（登録商標）Ｆ－６８を含有するＰＢＳ緩衝液へ緩衝液交換し、０．２２μｍ注射器フィルターで濾過滅菌した。滅菌されたＡＡＶ試料を、４℃で１カ月以内、保存し、その後、長期保存のために－８０℃へ移した。ＡＡＶ力価を、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するリアルタイムＰＣＲ方法で決定した。一部の態様では、ＡＡＶ力価は、ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）ＡＡＶベクター感染力価アッセイにより決定することができる。ＴＣＩＤ５０ＡＡＶ力価アッセイは、まず、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を補充したＤＭＥＭを含む完全培地中、形質導入され得る細胞を培養することにより、測定することができる。細胞は、９６ウェルプレートにおいて培養され、その後、本明細書に記載された改変されたＡＡＶのいずれか１つにより形質導入され得る。形質導入は、１ミリリットルあたり３．２ｅ＋８個のアデノウイルス粒子の最終濃度になるようにアデノウイルスを希釈することを含み得る。改変されたＡＡＶベクターは、力価アッセイのために段階希釈により希釈され得る。その後、細胞は、異なる段階希釈された改変されたＡＡＶベクターにより形質導入され得る。ＤＮＡは、形質導入細胞から抽出され得る。その後、抽出されたＤＮＡは、増幅シグナルを得るように、Ｔａｑｍａｎプローブを用いてＴａｑｍａｎサーモサイクリング条件下でアッセイされ得る。増幅シグナルの対数期は、改変されたＡＡＶベクターの段階希釈から得られた濃度に対応し得る。

ゲル電気泳動
[0147]ＡＡＶカプシドタンパク質を可視化するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を実施した。ＡＡＶ試料を、ＳＤＳゲルローディング緩衝液と混合し、９５℃で５分間、加熱し、１ｅ＋１１ｖｇ／レーンのＡＡＶベクターを、ロードし、ローディング色素がゲル底に到達するまで１００Ｖで電気泳動した。ＡＡＶカプシドタンパク質を、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅＳａｆｅＳｔａｉｎキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。ゲル画像を、ＢＩＯ－ＲＡＤ分子イメージャーＧｅｌ－ＤｏｃＸＲ＋（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で記録した。ＡＡＶゲノムを可視化するために、アガロースゲル電気泳動を実施した。ＡＡＶ試料を、０．１％ＳＤＳを含有するＰＢＳ緩衝液中に希釈し、８０℃で１０分間、加熱した。ヒーターのスイッチを切って、室温へゆっくり冷却した後、２ｅ＋１１ｖｇ／レーンのＡＡＶベクターを、ＳＹＢＲＳａｆｅＤＮＡゲル染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含有するＴＡＥ緩衝液中１％アガロースゲル上にロードし、１００Ｖで1時間、電気泳動した。画像をＢＩＯ－ＲＡＤ分子イメージャーで記録した。

ＡＲＰＥ１９およびＨＥＫ２９３の細胞培養およびｉｎｖｉｔｒｏ形質導入
[0148]ＡＲＰＥ－１９（ＡＴＣＣＣＲＬ２３０２）は、それが細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）およびＲＰＥ特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）などの典型的なＲＰＥマーカーを発現するため、ＲＰＥ細胞の適切なモデルである。細胞を、１０％熱失活ウシ胎仔血清（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ－１２栄養培地（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２；ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）において維持した。細胞を、インキュベーター内で、加湿雰囲気中、３７℃、５％ＣＯ２で維持し、３～４日ごとに、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて継代した。実験のために、最初の１０継代内のＲＰＥ細胞を選択し、適切な培養プレートへ置いた。

[0149]ＨＥＫ２９３細胞を、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ－１５７３；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から入手し、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）中で培養した。培地に１０％ウシ胎仔血清（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補充した。細胞を、インキュベーター内で、加湿雰囲気中、３７℃、５％ＣＯ２で維持し、３～４日ごとに、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて継代した。

実施例４
ＡＡＶ２カプシドバリアントのｉｎｖｉｔｒｏ形質導入アッセイ
[0150]ＡＲＰＥ－１９細胞またはＨＥＫ２９３細胞を、１２ウェルプレートに６０％コンフルエンシーで播種し、コンフルエンシー未満に増殖させた。細胞に、感染の２～４時間前に栄養供給し、培地を、２％ＦＢＳへ交換し、細胞を、１ｍｌ中の野生型またはカプシド改変されたＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰに１時間、曝した。その後、完全培地を加え、インキュベーションを３～７日間、継続した。全ての感染を、同数のｖｇ（２．０ｅ＋１３個）を用いて実施し、結果として、１．０ｅ＋５ｖｇ／細胞の推定ＭＯＩを生じた。ＧＦＰの発現を、モノクロＤＰ８０カメラを備えた倒立蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＣｅｎｔｅｒＶａｌｌｅｙ、ＰＡ、ＵＳＡ）において分析した。全ての画像を、ｄｉｇｉＣＡＭＣｏｎｔｒｏｌを使用して同じ非飽和曝露時間で取得した。

[0151]ＡＲＰＥ－１９細胞、ＨＥＫ２９３細胞、または任意の他の細胞型の、改変されたＡＡＶベクターのいずれか１つでの形質導入は、以下の材料および装置を利用することを含み得る：ＡＶＭＸ－１１０としても公知の、ＡＡＶ２．Ｎ５４．ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ（ＡＭＩ０５４－ＡＭＩ１２０－ｓｃＣＭＶ－アフリベルセプト－ＧＣＲＳ）を精製し、製剤化緩衝液（９．２３ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬでの濃度、－８０℃で保存した）へ緩衝液交換を行い、；ヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ２９３、ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－１５７３）を解凍し、継代数を日常的に記述した；１０％ＦＢＳ（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０－２０２０）を含むＥＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０－２００３）を使用して、細胞を培養して、形質導入した。その培地を４℃で保存する；トリプシン－ＥＤＴＡ（０．２５％）、フェノールレッド（ＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２５２０００５６）；１×ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）：培養グレードの滅菌水（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０５２９ＬＳ）で１０×ＰＢＳ（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０２５８０２）に希釈する。４℃で保存する；６ウェル培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒｂｉｏ－ｏｎｅ／Ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５７１６０）；バイオセーフティキャビネット（ＬａｂｃｏｎｃｏＰｕｒｉｆｉｅｒクラスＩＩ）；３７℃および５％ＣＯ２に設定されたインキュベーター（Ｔｈｅｒｍａｆｏｒｍａ、シリーズＩＩウォータージャケット付きＣＯ２インキュベーター）；およびＶ２２６－ＡＭＩ０６７（陽性対照、Ｖ２２６－ｐＦＢ－ｉｎＣａｐ２－７ｍ８－ＡＭＩ０６７－ｓｃＣＭＶ－アフリベルセプト－ＧＣ）。形質導入手順は以下を含み得る：継代数および細胞生存率の記録を残しながら、１０％ＦＢＳを補充したＥＭＥＭ培地を含むＴ－７５フラスコにおいてＨＥＫ２９３細胞（または任意の他の細胞型）を培養する；フラスコをインキュベーターから取り出し、古い培地を除去し、フラスコを１０ｍＬの１×ＰＢＳですすぐ；１×ＰＢＳを捨て、０．５ｍＬのトリプシン溶液を加え、フラスコを１～２分間、放置する；トリプシンを中和するために、１０倍ｖ／ｖの量（５ｍＬ）の、血清含有培地を加え、細胞を培養フラスコから解離させる；細胞懸濁液を１５ｍＬチューブに移し、３００ｇで３分間、遠心分離する；１ｍＬのＥＭＥＭ培地を加えて、細胞を再懸濁する。細胞をカウントし、培地を加えることにより、細胞数を１．０ｅ＋０６／ｍＬに調整する；１ｍＬを６ウェルプレートの各ウェルに加える；プレートをインキュベーターへ戻し、２４時間、細胞を、ウェルの底に付着させる；２４時間後、ＭＯＩ１００，０００におけるＡＡＶ２．Ｎ５４．ＶＥＧＦ－ＴｒａｐおよびＶ２２６－ＡＭＩ０６７（陽性対照）を新鮮培地中１．０ｅ＋１１（＝１．０ｅ＋０６＊１００，０００）個／ｍＬのウイルス粒子の総量へ調製する；１ｍＬのＡＡＶ２．Ｎ５４．ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ、もしくは陽性対照、または新鮮培地（陰性対照）を２連でウェルに加える；６ウェルプレートをインキュベーターに戻す；さらに２４時間後、培地を全ウェルにおいて１ｍＬ／ウェルの新鮮培地と置き換え、プレートをインキュベーターに戻す；形質導入後４日目、プレートの各ウェルから上清を収集し、１．５ｍＬ無菌エッペンドルフチューブへ、アッセイの必要条件により３００～５００μＬ／チューブで分注する；各収集された上清におけるＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ濃度を、ＶＥＧＦ－ＴｒａｐＥＬＩＳＡを使用して定量化し、または上清を－８０℃で保存する。表５は、改変されたＡＡＶベクター（改変されたＡＡＶ２．Ｎ５４）が、野生型ＡＡＶ２と比較して、感染力の増加を呈することを示すＡＡＶ感染力の例示的な研究を表す。

実施例５
網膜へのＡＡＶ２向性の改変
[0152]ペプチドディスプレイおよびｒＡＡＶ２ベクター産生のための足場としてのＡＡＶ２の能力を研究するために、３～１０ａａの長さを有するペプチドをＡＡＶ２上にディスプレイさせた。この範囲は、耐容性が良く、カプシド再ターゲティングに十分であり得る。ｃａｐ遺伝子内の領域を、アセンブルされた粒子上の突出した場所、すなわち、ループ３およびループ４におけるコードされたペプチドのディスプレイの見込みがあるインフレームのオリゴヌクレオチド挿入のために選択した。図１に示されているように、ｒＡＡＶ２におけるペプチド挿入は、ループ３かまたはループ４かのいずれかの先端に位置し、それは、親ＡＡＶ２においてとは違って、ループ３またはループ４よりもさらに外へ広がっている（図１、右パネル）。ＡＡＶ２構造の表面図は、挿入が、６０個全てのＶＰサブユニットに存在することを示している。

[0153]表６に示されているように、改変されたカプシドを有する一連のＡＡＶ２ベクターは成功裏に産生および精製された。図２に示されているように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、２ラウンドの塩化セシウム密度勾配超遠心分離後、ＡＡＶ２ベクターが、痕跡量のみの混入タンパク質を有し、９８％より高く純粋であったことを示している。表７は、ＨＥＫ２９３細胞またはＡＲＰＥ１９細胞が、本明細書に記載された改変されたＡＡＶベクターで形質導入された場合の、ＨＥＫ２９３細胞またはＡＲＰＥ１９細胞における（本明細書に記載されたＡＡＶベクターを介して細胞へ送達された）ＧＦＰの発現を示す。表７は、登場順に、それぞれ、配列番号１１０～１１３、１１１、１１４～１２６、１１８、１１７、および１２７～１２８を示す。

実施例６
ヒト細胞株における形質導入効率への改変されたＡＡＶ２カプシドバリアントの効果
[0154]ＨＥＫ２９３細胞およびＡＲＰＥ－１９（１９歳の男性の眼に由来した、自発的に生じた網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞株）を利用して、ＡＡＶ２の形質導入効率または感染力を決定した。全ての改変されたカプシドバリアントの形質導入効率を、ＨＥＫ２９３細胞とＡＲＰＥ－１９細胞の両方において試験した。図３Ａに示されているように、ＨＥＫ２９３細胞とＡＲＰＥ－１９細胞の両方におけるＧＦＰの発現レベルは、ＡＡＶ２－Ｖ４６７バリアントが最も効率的であり、次に、ＡＡＶ２－Ｖ４７１およびＡＡＶ２－Ｖ４６６バリアントであることを示した。ＡＡＶ２のＲ５８５またはＲ５８８の位置に単一の変異またはその組合せを有するＡＡＶ２バリアントは、細胞を形質導入することができなかった（図３Ｂ）。ＡＡＶ２カプシドのループ３またはループ４における他のペプチドの挿入は、その導入遺伝子発現を劇的に低下させた。

[0155]ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐは、本明細書に記載されたＥＬＩＳＡプロトコールを用いて測定することができる。一部の態様では、ＥＬＩＳＡプロトコールは、以下のような材料および装置を利用する：ＶＥＧＦ－ｔｒａｐ；ＰＢＳ中－８０℃で保存されたＡＡＶ－２－ＶＥＧＦ－ｔｒａｐ１００ｕＬ／バイアル（その濃度は、市販のＥＬＩＳＡにより決定された４．５６ｍｇ／ｍＬである）；ＶＥＧＦ：１００μｇ／ｍＬ；ＨＥＫ２９３細胞に発現しかつ精製された抗原（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｚ０３０７３）；ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ（ビオチン）血清吸着処理済み（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ９８６１８）；ＨＲＰ－ストレプトアビジンコンジュゲート（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ７４０３）；ＴＭＢ基質：１－Ｓｔｅｐ（商標）ＵｌｔｒａＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号３４０２８）；９６ウェルマイクロプレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ：ＶＥＲＳＡｍａｘ波長可変マイクロプレートリーダー）；コーティング緩衝液：３．７ｇ炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）および０．６４ｇ炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）；１ＬのＭｉｌｌｉＱ水、ｐＨ９．６０、保存条件：ＲＴ（室温）、１カ月間；１×ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）：８．０ｇ塩化ナトリウム、１．３ｇリン酸二ナトリウム、０．２ｇリン酸一ナトリウム、および１．０リットルＭｉｌｌｉ－Ｑ水、ｐＨ７．４、保存条件：ＲＴ、１年間、洗浄緩衝液（ＰＢＳＴ）：１×リン酸緩衝食塩水、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）、保存条件：ＲＴ、調製日から３０日間期限；ブロッキング緩衝液（ＢＢ）：０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）および１％カゼインを含む１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、保存条件：４℃、調製日から３０日間；希釈緩衝液（ＤＢ）：ブロッキング緩衝液と同じ；ＴＭＢ基質についての停止溶液（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１７１５２９）；品質管理試料：市販のアフリベルセプトＥＬＩＳＡキットからのＶＥＧＦ－ｔｒａｐ標準（６ｎｇ／ｍＬ）；ならびに９６ウェルマイクロプレート。

[0156]ＥＬＩＳＡプロトコールは以下の手順を含み得る：ＶＥＧＦ（１００μｇ／ｍＬ）ストックをコーティング緩衝液（１０ｍＬのコーティング緩衝液に対して１０μＬのＶＥＧＦストック）で０．１μｇ／ｍＬに希釈する；コーティング抗原を９６ウェルマイクロプレートへ１００μＬ／ウェルで加え、プレートをカバーして、２～８℃でおよそ１２時間または一晩、置く；コーティング抗原を捨て、プレートを３００μＬ／ウェルのＰＢＳ－Ｔ洗浄緩衝液で３回、洗浄する；３００μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液を加え、プレートをカバーして、３７±１℃で１２０分間、インキュベートする；以下の通り、ＶＥＧＦ－ｔｒａｐ標準（４．５６ｍｇ／ｍＬ）を希釈緩衝液で１２．５ｎｇ／ｍＬに希釈する：４．５６ｍｇ／ｍＬを１０μｇ／ｍＬへ４５６倍希釈し、１０μｇ／ｍＬを１μｇ／ｍＬへ１０倍希釈し、１μｇ／ｍＬを１００ｎｇ／ｍＬへ１０倍希釈する；７００μＬの希釈緩衝液中１００ｎｇ／ｍＬ溶液の１００μＬを加える、これは、１２．５ｎｇ／ｍＬの最初の標準点である；ＶＥＧＦ－ｔｒａｐ標準の残りを、１：２段階希釈スキームを使用して、２連で調製する；希釈された標準試料、品質管理試料、および未知の試料をプレートへ、各希釈についてウェルあたり１００μＬ、２連で移す；プレートをカバーし、プレートを３７±１℃で６０分間、インキュベートする；プレート内の反応物を捨て、３００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液で６回、洗浄する；ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ（ビオチン）血清吸着処理済みを希釈緩衝液（０．０１２５μｇ／ｍＬ）で１：４０，０００に希釈し、１００μＬ／ウェルを加える；プレートをカバーして、３７±１℃で６０分間、インキュベートする；反応ミックスを捨て、プレートを３００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液で６回、洗浄する；ストレプトアビジン－ＨＲＰを希釈緩衝液で１：４０，０００に希釈し、１００μＬ／ウェルを加える；プレートをカバーして、３７±１℃で６０分間、インキュベートする；プレート内の反応物を捨て、３００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液で６回、洗浄する；プレートを１×ＰＢＳで１回、すすいで、残存するＴｗｅｅｎ２０を除去する；ＴＭＢ基質を１００μＬ／ウェルで加え、プレートをカバーして、３７±１℃で１５分間、インキュベートする；１００μＬ／ウェルの停止溶液を加えることにより反応を停止する；ならびにプレートを、マイクロプレートリーダーにおいて、参照波長として６００ｎｍと共に、４５０ｎｍ波長フィルターで読み取る。

[0157]図３Ｃおよび図３Ｄは、ＶＰ１－ＡＭＩ０５４改変されたＡＡＶ１、ＡＡＶ２、およびＡＡＶ６：アミノ酸残基５８８位（アスパラギン、Ｎ）の後にＬＡＬＧＱＴＴＫＰＡ外因性ポリペプチド（配列番号１４）の挿入を含む改変されたＡＡＶ１；アミノ酸残基５８８位（セリン、Ｓ）の後にＬＡＬＧＱＴＴＫＰＡ外因性ポリペプチド（配列番号１４）のＳ５８８挿入を含む改変されたＡＡＶ２；およびアミノ酸残基５８８位（セリン、Ｓ）の後にＬＡＬＧＱＴＴＫＰＡ外因性ポリペプチド（配列番号１４）のＳ５８８挿入を含む改変されたＡＡＶ６により媒介されたＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ遺伝子の発現を示す。図３Ｃは、改変されたＡＡＶ１、ＡＡＶ２、またはＡＡＶ６により形質導入されたＨＥＫ２９３細胞におけるＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ発現を示す。図３Ｄは、改変されたＡＡＶ１、ＡＡＶ２、またはＡＡＶ６により形質導入されたＡＲＰＥ－１９細胞におけるＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ発現を示す。

実施例７
マウス研究
[0158]動物を、最短３日間の間、研究環境に順応させる。順応期間の完了時、各動物は、研究参加についての適合性の決定のために実験動物専門家により身体的に調べられる。検査には、皮膚および外耳、眼、腹部、行動、ならびに全身状態が挙げられるが、それらに限定されない。良好な健康状態であると決定された動物は、本研究に放出される。

[0159]動物は、施設内標準操作手順（ＳＯＰｓ）に従って研究群へランダムに割り当てられる。動物は、対応するケージカード番号、耳パンチ、および番号により一意的に識別される。表８および表９は、マウス研究についての試験パラメーターおよび食餌を示す。

投与スキーム
[0160]注射前の０日目において、マウスにブプレノルフィン０．０１～０．０５ｍｇ／ｋｇＳＱを与えた。局所的散瞳薬（１．０％トロピカミドＨＣＬ、および２．５％フェニレフリンＨＣＬ）を、注射の少なくとも１５分前にアプライした。動物を、硝子体内注射のために鎮静化させ、０．５％プロパラカインＨＣＬの１滴を両眼にアプライした。あるいは、マウスは、吸入イソフルランで麻酔され得る。結膜を優しく、Ｄｕｍｏｎｔ＃４鉗子で掴み、３３Ｇ針およびＨａｍｉｌｔｏｎＳｙｒｉｎｇｅを使用して注射した。注射器内容物を投薬した後、注射器針をゆっくり引き抜いた。注射手順後、オフロキサシン点眼液の１滴を、眼用潤滑剤と共に眼球表面へ局所的にアプライした。

パラメーター
[0161]
特に眼に対して注意を払いながら、ケージ側面からの観察と共に、死亡および罹患の評価を１日１回、行った。眼球検査を、細隙灯生体顕微鏡を使用して実施し、本明細書に示された時点における眼球表面形態を評価した。カラーおよびコバルトブルー（ＥＧＦＰ発現）眼底イメージングの両方を、実験計画表における時点において全動物の両眼に関して行った。動物に、トロピカミド（１．０％）とフェニレフリン（２．５％）のカクテルを局所的に与えて、眼を散大かつ突出させ、局所眼用麻酔剤を、眼にアプライした（プロパラカイン０．５％または類似したもの）。カラー眼底写真撮影に続いて、コバルトブルー写真撮影を行った。２８日目における最終イメージング手順後に、動物を、二酸化炭素窒息により安楽死させ、頚椎脱臼または開胸術により死亡が確認された。

眼組織収集および処理
[0162]最終の生存中のイメージング手順後、眼球を除去し、すぐに、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）において、室温で４時間（凍結切片分析）または室温で３０分間（フラットマウント分析）、固定した。フラットマウント分析に指定された眼を、１×ＰＢＳですすぎ、解剖まで４℃で保存した。凍結切片に指定された眼は、ＰＢＳで洗浄し、包埋まで４℃で保存される。

[0163]凍結切片分析：眼を、３％アガロース／５％スクロース中にすぐに包埋して、３０％スクロース中に４℃で一晩、沈め、または次の日に包埋するまで、１×ＰＢＳ中に保存する。塊を、薄片にし、免疫組織化学的検査のために処理する。免疫組織化学的検査に指定されたスライドを、核局在化のためのＤＡＰＩと並行して、ロドプシン、ＲＰＥ６５、およびＧＦＰに対する抗体で染色する。二次抗体は以下の通りであり得る：ロバ抗マウスＣｙ３（ロドプシン）、ロバ抗ウサギＣｙ５（ＲＰＥ６５）、およびロバ抗ニワトリＣｙ２（ＧＦＰ）。

[0164]眼球フラットマウント分析：手術用顕微鏡を使用して、眼から、無関係の組織を切り取り、前部、レンズ、および硝子体を除去した。眼杯を、冷たいメタノール中に３０分間、置き、その後、冷たいＰＢＳで１５分間、３回、すすいだ。眼杯を、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ；核染色）および以下の抗体の３つの組合せを含有する冷たいＩＣＣ中に置いた：内境界膜を標識する抗ラミニン（１／１，０００）、桿体を標識する抗ロドプシンクローン４Ｄ２（１／５００）、ミューラー細胞を標識する抗グルタミンシンテターゼクローンＧＳ－６（１／１，５００）、錐体を標識するＰＮＡレクチン（１／４０）。眼杯を、４℃で穏やかに回転させながら、４時間、インキュベートし、冷たいＩＣＣ緩衝液で洗浄した。染色後、眼杯を、４％ＰＦＡ中に５分間、固定し、その後、１×ＰＢＳで１回、すすいだ。強膜－脈絡膜／ＲＰＥ複合体を網膜から、鋭い曲剪刀を使用して、除去した。網膜を、フラットマウントし、カバーし、密封した。２次元（２Ｄ）蛍光顕微鏡画像を取得し、デジタル化し、ＩｍａｇｅＰｒｏＰｌｕｓまたはＣｅｌｌＳｅｎｓ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）ソフトウェアを使用して分析し、取得後分析を、ＩｍａｇｅＪまたはＣｅｌｌＳｅｎｓソフトウェアを用いて、実施する（図４）。

[0165]凍結切片分析：凍結した塊を凍結切片（１４μｍ厚さ）にし、免疫組織化学的検査のために処理した。免疫組織化学的検査に指定された各スライドを、ＧＦＰおよび網膜細胞層の異なるマーカーに対する抗体を含有する以下の３つの異なるカクテルで染色した：カクテル１）ＧＦＰ、ロドプシン、およびラミニン；２）ＧＦＰ、ＲＰＥ６５、およびＰＮＡレクチン；３）ＧＦＰ、グルタミン酸シンテターゼＧＳ－６、およびファロイジン。結果は図５に示されている。全ての３つの抗体カクテルにわたるＧＦＰ発現のグラフ表示およびイメージングされた全ての眼は、図６に示されている。

[0166]図７～図１１および表９～表１１は、野生型（ｗｔ）ＡＡＶベクターかまたは本明細書に記載された改変されたＡＡＶ２ベクターかのいずれかを投与されたマウス眼のｉｎｖｉｖｏイメージングを示す。図７は、野生型ＡＡＶベクターを投与されたマウス眼の眼底画像およびＩＨＣ染色を示す。ｗｔＡＡＶ２－ＧＦＰは、眼底イメージングとＩＨＣ切片の両方に示されているように、十分なＧＦＰ発現をもたらさなかった。図８は、眼のｉｎｖｉｖｏ眼底イメージングおよびＩＨＣ染色を示し、本明細書に記載された改変されたＡＡＶ２（アミノ酸残基５８７の後に挿入されたＬＫＬＧＱＴＴＫＰＡ（配列番号１３）を有する改変されたＡＡＶ２を含むＡＡＶ２－ＡＭＩ０５３－ＧＦＰ）が、マウスの眼へＩＶＴ経路を介して投与された。その改変されたＡＡＶ２は、眼底イメージングおよびＩＨＣ切片においてＧＦＰ発現を示し、ＧＦＰシグナルが、細胞の複数の層において検出された。図９は、眼のｉｎｖｉｖｏ眼底イメージングおよびＩＨＣ染色を示し、本明細書に記載された改変されたＡＡＶ２（アミノ酸残基５８７の後に挿入されたＬＡＬＧＱＴＴＫＰＡ（配列番号１４）を有する改変されたＡＡＶ２を含むＡＡＶ２－ＡＭＩ０５４－ＧＦＰ）が、マウスの眼へＩＶＴ経路を介して投与された。その改変されたＡＡＶ２は、眼底イメージングおよびＩＨＣ切片においてＧＦＰ発現を示し、ＧＦＰシグナルが、細胞の複数の層において検出された。図１０は、眼のｉｎｖｉｖｏ眼底イメージングおよびＩＨＣ染色を示し、本明細書に記載された改変されたＡＡＶ２（アミノ酸残基４５３の後に挿入されたＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号６）を有する改変されたＡＡＶ２を含むＡＡＶ２－Ｖ４６６－ＧＦＰ）が、マウスの眼へＩＶＴ経路を介して投与された。その改変されたＡＡＶ２は、眼底イメージングおよびＩＨＣ切片においてＧＦＰ発現を示し、ＧＦＰシグナルが、細胞の複数の層において検出された。表１０は、ＡＡＶ２－ＶＰ１－ＧＦＰＩＶＴ注射から２５～２９日後のマウスの眼底画像を示す。

[0167]図１１は、野生型（ｗｔ）かまたは本明細書に記載された改変されたＡＡＶかのいずれかで形質導入された眼の異なる視神経線維層におけるＡＡＶ形質導入を示すＡＡＶ網膜形質導入指数（ＲＣＴＩ）を示す。ＲＣＴＩを、硝子体内経路から投与されたベクターにより発光した細胞層（すなわち、ＡＡＶ２－ＡＭＩ０５３－ＧＦＰが、硝子体構造の内境界膜（ＩＬＭ）を横断して伝播し、細胞上の受容体との結合を介して様々な細胞を形質導入した）のカラー強度のスコアから計算した。ベクターが細胞に侵入しかつ発現したことを示すＧＦＰシグナルの出現。カラー強度の４つのスケールを使用して、ＡＡＶ形質導入能力を見積もった：検出されたカラー：明るい：１ポイントまたは＋；明るく、鮮やかなカラー：２ポイントまたは＋＋；強いカラー：３ポイントまたは＋＋＋；および非常に輝いているカラー：４ポイントまたは＋＋＋＋。表１１は、ＡＡＶ２形質導入網膜の例示的なＲＣＴＩスコアリング、および登場順に、配列番号１２９～１３２を示す。表１２は、ヒト細胞（ＨＥＫ２９３細胞またはＡＲＰＥ１９細胞）またはマウス網膜の両方におけるＡＡＶ２形質導入の例示的なＲＣＴＩスコアリング、および登場順に、配列番号１２９～１３２を示す。

[0168]図７～図１１および表１０～表１２に示されているように、Ｎ５４ペプチド（ＬＡＬＧＱＴＴＫＰＡ）は、全てのＡＡＶベクターのＶＰ１へ挿入されて、ベクターの内境界膜（ＩＬＭ）を横断しての伝播および網膜細胞における発現を増強することができる。ＶＦＧＦ－Ｔｒａｐタンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞において、ＡＡＶ６．Ｎ５４－ＶＥＧＦ－ｔｒａｐにより誘導されて、最も高いレベルで発現し、次いでＡＡＶ２．Ｎ５４－ＶＥＧＦ－ｔｒａｐにより、およびＡＡＶ１．Ｎ５４－ＶＥＧＦ－ｔｒａｐによることが見出された。ＡＲＰＥ－１９細胞において、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐタンパク質は、ＡＡＶ２．Ｎ５４－ＶＥＧＦ－ｔｒａｐおよびＡＡＶ６．Ｎ５４－ＶＥＧＦ－ｔｒａｐのどちらを介しても、同じように発現した。

[169]図１２～図１５および表１２～表１６は、野生型ＡＡＶベクターまたは本明細書に記載された改変されたＡＡＶベクターで形質導入されたマウスを用いて行われたＬＣＮＶ研究を示す。図１２は、ＬＣＮＶ研究を示し、改変されたＡＡＶが、ＬＣＮＶの前にマウスへ投与された。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、またはＡＡＶ６は、ＶＰ１カプシドにおけるＬＡＬＧＱＴＴＫＰＡ（配列番号１４）の挿入で改変され、マウスの眼への送達のための導入遺伝子としてアフリベルセプト（ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ）を有した。改変されたＡＡＶ１（群５、ＡＡＶ１．Ｎ５４－アフリベルセプト）は、ＶＰ１カプシドのＳ５８８アミノ酸残基の後に挿入されたＬＡＬＧＱＴＴＫＰＡ（配列番号１４）を含む。ＡＡＶ２（群３、ＡＡＶ２．Ｎ５４－アフリベルセプト）は、ＶＰ１カプシドのＮ５８７アミノ酸残基の後に挿入されたＬＡＬＧＱＴＴＫＰＡ（配列番号１４）を含む。ＡＡＶ６（群４、ＡＡＶ６．Ｎ５４－アフリベルセプト）は、ＶＰ１カプシドのＳ５８８アミノ酸残基の後に挿入されたＬＡＬＧＱＴＴＫＰＡ（配列番号１４）を含む。図１３Ａは、ＬＣＮＶ研究の眼における脈絡膜新生血管形成の面積を示す。Δアフリベルセプトは、オープンリーディングフレームに破壊を含むＡＡＶがマウスの眼に投与された、シャム対照であった。媒体群と比較して、全ての３つの改変されたＡＡＶ群は、眼における脈絡膜新生血管形成の面積の有意な減少を示した（ＡＡＶ６．Ｎ５４－アフリベルセプト、ｐ＜０．００１；ＡＡＶ１．Ｎ５４－アフリベルセプト、ｐ＜０．０１；およびＡＡＶ２．Ｎ５４－アフリベルセプト、ｐ＜０．０５）。図１３Ｂは、ＡＡＶ６．Ｎ５４－アフリベルセプトを投与された群が、眼において脈絡膜新生血管形成の面積の有意な減少を示し続けたことを示す（ＡＡＶ６．Ｎ５４－アフリベルセプト、ｐ＜０．０５）。図１４は、ＬＣＮＶ研究マウスから得られた眼球および血清試料におけるアフリベルセプト濃度を示す。図１５は、マウスにおける、ＬＣＮＶにより誘発された網膜損傷に対する網膜アフリベルセプト保護効果のフルオレセイン血管造影法（ＦＡ）分析を示す。レーザー処理により引き起こされた網膜傷害に対する眼杯におけるアフリベルセプト濃度の相関は、逆相関であった。図３Ｃ、図３Ｄ、表１３、および表１４に示されているように、ＡＡＶ６．Ｎ５４－アフリベルセプト群におけるＬＣＮＶ面積での最も顕著な減少は、その改変されたＡＡＶ６により媒介されて発現したＶＥＧＦ－Ｔｒａｐの増加に対応した。

[0170]表１５および表１６は、眼へ投与された後のＡＡＶベクターの局在化およびＡＡＶベクターのカーゴ（例えば、アフリベルセプト）の発現を決定するための例示的な追加の研究を示す。表１５の研究は、本明細書に記載された眼底画像およびＩＨＣを利用することに少なくとも一部、基づき得る。表１６の研究は、ＬＣＮＶ、ＦＡ、ＯＣＴ、ＦＰ、組織学的検査、およびＩＨＣを利用することに少なくとも一部、基づき得る。

実施例８
離乳した家畜ブタモデルにおける硝子体内送達のためのＡＡＶ２．Ｎ５４カプシドのｉｎｖｉｖｏ試験
[0171]眼疾患の処置のための遺伝子治療薬の硝子体内送達は、それが網膜剥離を引き起こさず、汎網膜形質導入をもたらすことができ、かつ外来患者向け診療所において局所麻酔下で実施することができるため、選り抜きの好ましい方法である。野生型ＡＡＶベクターは、組織に形質導入するために眼の内境界膜（ＩＬＭ）を十分には横断しない。そのようなものとして、ＩＬＭを透過する能力がある改変されたＡＡＶカプシドは、意図された標的への遺伝子治療薬の送達の成功に必要とされる。実施例８は、離乳した家畜ブタモデルにおいて眼組織へ深く、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を送達する能力がある、操作されたＡＡＶ２．Ｎ５４ベクターの結果を提示する。

クローニングおよびＡＡＶベクター産生
[0172]ＡＡＶ２野生型カプシド遺伝子を、新規のＡＡＶバリアントカプシドを操作するための出発材料として使用した。簡単に述べれば、いくつかのペプチド配列を操作し、最適化ＤＮＡ配列へ逆転写し、ＡＡＶ２野生型カプシド遺伝子の特定の位置へクローニングして、ＡＭＩ０５３、ＡＭＩ０５４、ＡＭＩ１０１、ＡＭＩ１０４、およびＡＭＩ１０５プラスミドを作出した。組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を生成し、ｒＢＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰと一緒に使用して、Ｓｆ９－Ｖ４３２－ＡＧ細胞を同時感染させ、ＧＦＰを発現するＡＡＶベクターを産生させた。ＡＡＶベクターを、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）密度勾配超遠心分離の２ラウンドを用いて、精製した。ＰＤ－１０脱塩カラムでの脱塩の２ラウンドにより、ＣｓＣｌを除去し、製剤化緩衝液へ製剤化した。

実験計画
[0173]動物を、６つの群へ分け、表１７に従って、異なるＡＡＶベクターの硝子体内注射について群あたり２匹の動物とした。

外科手術
[0174]被験物質を、すぐに注射できる形式で作製し、使用するまで－７０℃未満で保存した。注射の３０分前に、各被験物質を解凍し、短時間、遠心分離して（１，０００ｒｐｍ×１０秒間）、液体をチューブの底に集め、その後、３７℃の水浴中で２０分間、加熱し、ウイルス凝集を低下させるためにボルテックスした；液体をチューブの底に凝縮させるために各チューブを振盪した。

[0175]手術の前日に、動物を、麻酔投与前の一晩、絶食させた。硝子体内注射の当日、ブプレノルフィン（０．０１～０．０５ｍｇ／ｋｇ）を、注射前、各動物へ筋肉内に（ＩＭ）与えた。麻酔注射のおよそ１５分前に、動物にアトロピン（０．０１～０．０５ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）を与えた。その後、動物を、注射のためにケタミン／デクスメデトミジン（ＩＭ）で麻酔し、眼を、局所５％ベタジン溶液を使用して、無菌的に調製し、続いて、無菌食塩水ですすぎ、０．５％プロパラカインＨＣＬおよび１０％フェニレフリンＨＣＬの１滴をアプライした。結膜をコリブリ型鉗子で優しく掴み、レンズとの接触を避けるために針をわずかに後方に向けて、（毛様体扁平部を通って）上方縁の２～３ｍｍ後方へ注射した（２７～３０Ｇ針）。注射を行い、針をゆっくり引き抜いた。注射手順後、抗生物質点眼液の１滴を眼球表面へ局所的にアプライした。その後、動物に、デクスメデトミジンの効果を逆転させるために、アチパメゾールを筋肉内に与え、手術から正常に回復させた。

ケージ側面からの観察
[0176]特に両眼に対して注意を払いながら、ケージ側面からの観察と共に、罹患および死亡を毎日、観察した。この研究の過程において罹患も死亡もなかった。

眼球検査
[0177]眼球検査のための散瞳を、局所１％トロピカミドＨＣＬ（検査の１５分前に各眼において１滴）を使用して行った。眼球表面形態、前部および後部炎症、白内障形成、ならびに網膜変化を評価するための細隙灯生体顕微鏡および倒像検眼鏡を使用する完全な眼球検査（改変されたＨａｃｋｅｔｔおよびＭｃＤｏｎａｌｄ）を、上記の実験計画表に従って、行った。これらの評価の間、眼所見は認められなかった。全ての群は、評価された全ての時点においてゼロ（０）のスコアを有し、所見は認められなかった。

眼底イメージング
[0178]２１日目における眼底イメージング手順の前日、動物を麻酔投与前の一晩、絶食させた。研究計画表に示された通りの日において、動物をケタミン／デクスメデトミジン（ＩＭ）で麻酔し、ＲｅｔＣａｍ３（Ｎａｔｕｓ）を使用してイメージングした。まず、カラー画像を、次に、コバルトブルー画像を取得した。設定を、全群にわたって一定に保った。取得設定を、群６（Ｖ２２６）陽性対照動物に設定した。

結果
[0179]実験の間中ずっと、異常な眼所見は観察されなかった。全動物が研究プロトコールに従って良い状態にあることを確かめるために、眼球検査のための散瞳を、局所１％トロピカミドＨＣＬ（検査の１５分前に各眼において１滴）を使用して行った。眼球表面形態、前部および後部炎症、白内障形成、ならびに網膜変化を評価するための細隙灯生体顕微鏡および倒像検眼鏡を使用する完全な眼球検査（改変されたＨａｃｋｅｔｔおよびＭｃＤｏｎａｌｄ）を、上記の実験計画表に従って、行った。これらの評価の間、眼所見は認められなかった。

ブタ眼組織におけるＧＦＰ発現の実証
[0180]ＧＦＰ遺伝子を有する異なるＡＡＶベクターのブタ眼への硝子体内注射から２１日後、眼底イメージングに基づいて、全ての６つの群の動物の目においてＧＦＰ発現が観察された。しかしながら、眼底イメージングにおいて示されているように、群１、３、４、および５におけるＧＦＰ発現レベルは低く、一方、群２および６は、はるかに高いＧＦＰ発現レベルを有した（図１６）。眼底画像のスコアリングスケールでのさらなる検査は、群６が両方の動物において＋＋＋スコアによって表される最も高いＧＦＰ発現を有することを示し、次いで、５つの＋＋および１つのシングル＋スコアを有する群２が続いた。群１、３、および４は、１つの＋スコアの類似した発現レベルを有した。群５は、最も低い発現レベルを有した（表１８）。

ＡＡＶ２．Ｎ５４ベクターの眼組織への深部透過のＩＨＣによる実証
[0181]凍結切片（１４μｍ）を、眼組織におけるＧＦＰ、ＲＰＥ６５、ファロイジン、およびＤＡＰＩの局在化について評価し、その結果は図１７に示されている。マージされた画像は、左側に示されており、ＧＦＰチャネルのプルアウトは右側に示されている。これらの結果は、ＡＭＩ０５４から産生された、操作されたＡＡＶ（ＡＡＶ２．Ｎ５４と名付けられた）を注射された群２の動物（６２１ＯＳ）が、Ｖ２２６から作製されたＡＡＶを注射された対照群６（６２８ＯＳ）と比較した場合、眼組織におけるＧＦＰのより強くかつより深い透過を示したことを示している。凍結切片をスコアリングスケールでより詳細に調べたとき、これらの結果がさらに確認された（表１９）。凍結切片分析に登録された全ての眼にわたる眼ＧＦＰ発現の調査について、ＧＦＰ発現を、全ての網膜層および網膜外層にわたってスコアリングした；各眼は一行によって表されている。濃い灰色のセル（＋＋＋）は、ＧＦＰ発現が最も高かった場所を示す；中位の緑色セル（＋＋）は、中程度のＧＦＰ発現があった場所を示す；中位の灰色セル（＋）は、弱いＧＦＰ発現があった場所を示す；薄い灰色セル（－）は、ＧＦＰ発現がなかった場所を示す。略語：ＧＣＬ／ＩＬＭ－神経節細胞層／内境界膜；ＩＰＬ－内網状層；ＩＮＬ－内顆粒層；ＯＰＬ－外網状層；ＯＮＬ－外顆粒層；ＩＳ－内節；ＯＳ－外節；ＲＰＥ－網膜色素上皮；Ｃ－脈絡膜；Ｓ－強膜。

[0182]調べた凍結切片は最初、標準顕微鏡で実施したので、群２の動物（６２０ＯＤおよび６２１ＯＤ）の凍結切片を、共焦点顕微鏡でさらに調べた。その結果は図１８に示されている。これらの鮮明な画像から、本発明者らは、ＧＦＰ発現細胞が、ＧＣＬ層からＲＰＥ層まで広く分布していることを確認することができる。これは、ＡＡＶ２．Ｎ５４カプシドが、ＩＬＭを効率的に横断し、ブタ眼の眼組織をＲＰＥ層まで深く、透過し得ることを明らかに実証している。

[0183]図１９Ａは、ブタの眼へのＡＡＶ２．ＡＭＩ０５４－ＧＦＰ（ＬＡＬＧＱＴＴＫＰＡ（配列番号１４）挿入を含む改変されたＡＡＶ２）の硝子体内送達を示す。ＩＨＣ染色は、網膜層におけるＧＦＰ蛍光を示した。図１９Ｂは、ＡＡＶ２．ＡＭＩ０５４－ＧＦＰを投与された眼の各網膜層におけるＧＦＰ発現を示す。凍結切片動物番号６２０－ＯＤの共焦点画像番号１２２を、ヒト網膜ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色方法の発表された画像と整列させた。ブタモデル研究の結果は、ＡＡＶ２．ＶＰ１へのＮ５８７位のＣ末端側におけるＮ５４ペプチド（配列ＬＡＬＧＱＴＴＫＰＡ（配列番号１４））挿入を有するＡＡＶ２．Ｎ５４－ＧＦＰが、網膜層および細胞を通しての、強い蛍光、深くかつ広い分布により例証されるＧＦＰ発現における非常に高い送達効果を生じることを実証した（図１９Ｂ）。ＧＦＰの強くかつ広い発現は、ＡＡＶ２．Ｎ５４カプシドが、導入遺伝子を大型動物およびヒトの対応する層および細胞へ送達することを示した。図２０は、ＡＡＶ２．ＡＭＩ０５４－ＧＦＰを投与された眼とＡＡＶ２．７Ｍ８－ＧＦＰ（対照）を投与された眼との間でのブタ網膜におけるＧＦＰ発現の比較を示す。ＡＡＶ２．ＡＭＩ０５４－ＧＦＰで形質導入された網膜は、ＡＡＶ２．７Ｍ８－ＧＦＰで形質導入された網膜とは対照的に、全ての網膜層においてＧＦＰ発現を示した。ＡＡＶ２．ＡＭＩ０５４－ＧＦＰ形質導入網膜におけるＧＦＰ蛍光は、ＡＡＶ２．７Ｍ８－ＧＦＰ形質導入網膜の２倍、強かった。表２０は、本明細書に記載された５つの改変されたＡＡＶ：ＡＭＩ０５３、ＡＭＩ０５４、ＡＭＩ１０１、ＡＭＩ１０４、またはＡＭＩ１０５により形質導入されたヒト細胞（ＨＥＫ２９３細胞またはＡＲＰＥ１９細胞）、マウスモデル、およびブタモデルにおけるＧＦＰ発現強度レベルを示す。＋の増加する数は、形質導入細胞において検出された増加するＧＦＬ強度を表示する。

[0184]この研究は、離乳した家畜ブタ（ハンプシャー（Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ）交雑種）において、離乳したブタにおける単回の硝子体内注射後のＧＦＰ発現パターンへの６つの異なるＡＡＶ２ウイルスカプシド変異体の効果を評価するために行われた。臨床検査において、７日目および２１日目に眼所見は認められなかった。ＧＦＰは、コバルトブルー眼底イメージングによりｉｎｖｉｖｏで全ての群において容易に観察された。ＧＦＰ発現を、群１、２、３、４、および６において、凍結切片における断面分析によりさらに評価した。群６（Ｖ２２６；陽性対照）は、眼底イメージングと断面分析の両方において強くかつ広いＧＦＰ発現を呈した。ＧＦＰシグナルは、ＧＣＬ層からＯＰＬ層まで最も強いが、ＯＮＬ層からＲＰＥ層までにおいてあまり強くなかった。群２（ＡＭＩ０５４）もまた、ＧＦＰの強くかつ広い眼底発現、およびＧＣＬ層からＯＳ層までの発現、合計７層の強い発現を有した。眼底イメージングに関する群１（ＡＭＩ０５３）、群３（ＡＭＩ１０１）、および群４（ＡＭＩ１０４）の間での軽度の差もまた、断面分析において明らかであり、群１由来の６１８ＯＤが、外網状層（ＯＰＬ）を通しての広くかつ明るい発現を有した。群３（ＡＭＩ１０１）におけるＧＦＰ発現は、神経節細胞層において明るく、残りの層を通しては中程度であった。群４において、ＧＦＰ発現は、網膜を通して中～低程度であった。群１、２、および６についての内顆粒層および外網状層において非常に高い発現が認められた。これらのＧＦＰ陽性細胞の形態学的分析は、アマクリン細胞アイデンティティを示した；将来的な研究は、アマクリンマーカーがＧＦＰと共存するかどうかを評価するために共標識アプローチを利用するつもりである。脈絡膜および強膜ＧＦＰ発現は、眼のいずれにおいても観察されず、ＲＰＥＧＦＰ発現は、他の網膜層と比較して、わずかであった。まとめると、群２（ＡＡＶ２．Ｎ５４）は、ＧＦＰ発現の最も広い層を示し、強いＧＦＰ発現と共に眼組織の７つの層を深く透過することにより、群６（Ｖ２２６）を凌いだ。

実施例９
非ヒト霊長類における硝子体内投与後のＡＡＶＧＦＰ候補の体内分布および導入遺伝子発現の評価
[0185]アフリカミドリザルにおける硝子体内（ＩＶＴ）投与後のＡＡＶ候補の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現の体内分布および濃度を評価すること。サルは、細隙灯生体顕微鏡観察、眼底検査、カラー眼底イメージング、共焦点走査レーザー検眼鏡検査（ｃＳＬＯ）、および光干渉断層撮影（ＯＣＴ）によるＡＡＶ中和抗体（ｎＡｂ）血清陰性、全血球数（ＣＢＣ）、一般的な健康問題、および眼の健康状態を評価するためのベースラインスクリーニングを受ける。正常な所見を有するｎＡｂ陰性サルが本研究に登録され、処置群に割り当てられる（表２１）。ベースラインスクリーニングおよび全てのその後の手順のために、効果をもたらし得る筋肉内ケタミン（８ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１．６ｍｇ／ｋｇ）を用いての麻酔、ならびに局所１０％フェニレフリン、１％トロピカミド、および／または１％シクロペントラートを用いての瞳孔散大を達成する。

硝子体内（ＩＶＴ）投薬
[0186]局所プロパラカイン０．５％を投与し、３０秒間、効力を生じさせ、開眼器を配置し、その後、眼球表面を５％ベタジン溶液、続いて無菌０．９％食塩水ですすぐ。ＩＶＴ注射を、処置割当（表２１）に従って両眼（ＯＵ）に実施し、３１ゲージ８ｍｍ（５／１６インチ）針／注射器（ＵｌｔｉｃａｒｅＶｅｔＲｘＵ－１００または等価物）を使用して、縁の約２ｍｍ後方へ鋸状縁のレベルで下耳側へ挿入する。注射後、局所抗生物質眼軟膏（ネオマイシン、ポリミキシン、バシトラシン、または等価物）を投与する。

全身的免疫抑制レジメン
[0187]動物に、－１日目に、その後、３週間の間、週１回、メチルプレドニゾロン（８ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内（ＩＭ）送達を与える（表２２）。

眼圧検査
[0188]指定された時点（表２２）において、眼圧（ＩＯＰ）を、イヌ（ｄ）較正設定に設定されたＴｏｎｏＶｅｔ眼圧計を使用して、ＯＵで測定する。各眼から３つの測定値をとり、平均ＩＯＰを計算する。

細隙灯検査
[0189]指定された時点（表２２）において、両眼（ＯＵ）を、細隙灯生体顕微鏡観察により検査する。非ヒト霊長類眼科スコアリングシステムを使用するスコアリングを適用して、臨床眼所見を定量化し、要約スコアを検査項目から導き出す。

眼底イメージング
[0190]指定された時点（表２２）において、ＧＦＰ発現を検出するためのカラー前部および眼底イメージング、ならびに蛍光眼底イメージングを、Ｃａｎｏｎ６ＤデジタルイメージングハードウェアおよびＮｅｗＶｉｓｉｏｎ眼底画像分析システムソフトウェアと共にＴｏｐｃｏｎＴＲＣ－５０ＥＸ網膜カメラを使用して、各四分円において取得された追加の辺縁画像と共に、黄斑を中心とする５０°視野に関して、ＯＵで実施する。カラー眼底写真を、シャッター速度（Ｔｖ）１／２５秒、ＩＳＯ４００、およびフラッシュ１８で撮影した。単色およびカラー蛍光画像は、励起およびバリアフィルター（４８０ｎｍ励起／５２５ｎｍバリアフィルター）の嵌め込み、Ｔｖ１／５秒、ＩＳＯ３２００、およびフラッシュ３００で撮影する。蛍光写真は、ＧＦＰ発現の程度を定義するためにスコアリングシステムを使用して評価し、必要に応じて定量分析を適用する（眼の中心窩、周辺、および血管周囲領域において、０＝存在なし；１＝痕跡量；２＝少し；３＝中程度；４＝明るい、および５＝強いのスコア）。

光干渉断層撮影（ＯＣＴ）および共焦点走査レーザー検眼鏡検査（ｃＳＬＯ）
[0191]指定された時点（表２２）において、ＯＣＴおよびｃＳＬＯを、ＨｅｙｅｘＴｒｕＴｒａｃｋおよびベースライン画像を参照するＡｕｔｏＲｅｓｃａｎ追跡イメージング機能を用いる、ＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇＳｐｅｃｔｒａｌｉｓＯＣＴＨＲＡ（またはＯＣＴＰｌｕｓ）を使用してＯＵで実施する。ｃＳＬＯ赤外（ＩＲ）および自己蛍光（ＡＦ）網膜画像を、広角５０°レンズを使用して取得し、続いて、高密度スキャン間隔で黄斑全体の全体的ＯＣＴボリュームスキャンを行う。画像を、必要に応じて、ＯＣＴ網膜厚データおよびＧＦＰ発現の定量分析を用いて、定量的に評価する。瞳孔サイズおよび透光体の透明性によって許される場合、広角レンズを用いて辺縁視野を取得し、および／または各画像ファイルに捕獲されている網膜の面積を最大限にするために合成画像機能を用いる。

臨床観察
[0192]一般的な健康問題を、投薬の１週間前から開始するケージ側面からの観察により、１日２回、確認する。飼料消費および全体的な食欲を、毎日の給餌前に、飼料皿およびケージ洗浄前のケージ床の目視検査により評価する。動物を、腫脹、変色、斜視、または目をこすることを含む、眼炎症の徴候について評価する。

体重
[0193]動物の体重を、指定された時点（表２２）において測定する。

鑑別を伴うＣＢＣ血液像
[0194]指定された時点（表２２）において、０．５～１ｍＬ全血を採取し、Ｈｅｍａｖｅｔアナライザーによる鑑別を伴うＣＢＣ血液像の決定のために、Ｋ３ＥＤＴＡｌａｖｅｎｄｅｒ－ｔｏｐチューブに直接、移す。

血清収集
[0195]全血（３ｍＬ）を、指定された時点（表２２）において、大腿静脈または伏在静脈を介して採取する。血液を、（抗凝血剤の非存在下の）バキュテナーチューブに移し、室温でおよそ１時間、インキュベートし、その後、４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間、遠心分離、および血清アリコート（１時点あたり約０．５ｍＬ×２アリコート）の単離を行う。アリコートを－７０℃未満で、保存しかつｎＡｂ分析のために指定研究所へ輸送する。

終了
[0196]定義された終点前の最終画像品質を確認した後、サルを、筋肉内への、効果をもたらし得るケタミン（８ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１．６ｍｇ／ｋｇ）で鎮静させ、ペントバルビタールナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇＩＶ）で安楽死させる。

眼収集
[0197]１２時の位置に角膜縁における縫合を配置した後、眼球を除去し、過剰な眼窩組織を切り取る。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）および免疫組織化学（ＩＨＣ）染色のための眼収集：約２００ｕＬの硝子体を取り除いた後、群２～６由来の３個の眼および群１由来の１個の眼を、約４００ｕＬの４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）の硝子体腔への注射により固定し、その後、４％ＰＦＡ中、室温で２４時間、浸漬し、その後、０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳへ移し、ＣｒｅｄｏＣｕｂｅ温度制御低温容器中に４℃で、保存しかつ後極の黄斑領域にわたる最低２０個の水平切片のＨ＆ＥおよびＧＦＰＩＨＣ染色ならびに分析のためにスポンサー指定研究所へ輸送する。硝子体を、－７０℃未満で、保存しかつＥＬＩＳＡによるタンパク質分析のためにスポンサーへ輸送する。タンパク質およびＲＮＡ分析のための眼収集：各群由来の１個の眼を、自然組織平面に沿って室温で解体する前に、液体窒素蒸気中で急速冷凍する。前部を除去し、その後、凍結眼杯に縦方向切断を配置して、凍結後極をフラットマウントし、硝子体を採取する。硝子体液（約２．５ｍＬ全量）を、２つのアリコートへ分ける。フラットマウントを、上方および下方の半フラットマウントへ分け、網膜を、ＲＰＥ／脈絡膜から分離し、それぞれを個々に収集する。全ての試料を、標識された低温バイアル中に入れ、－７０℃未満で、保存しかつＧＦＰＥＬＩＳＡ分析によるタンパク質分析およびＲＴ－ＰＣＲによるｍＲＮＡ分析のためにスポンサーへ輸送する。組織のクロスコンタミネーションを最小限にするために、眼と眼の間、および組織と組織の間で、装置を水、その後、７０％イソプロピルアルコール中でクリーニングする。

データ解析
[0198]統計的方法：表２２に列挙されたプロトコール定義の評価項目から生じたデータは、表２３に詳細が示されているように、並べられ、要約され、解析される。サンプルサイズを考慮して、適切な場合、記述統計学が適用される。

実施例１０
[0199]レーザー誘発性脈絡膜新生血管形成の非ヒト霊長類モデルにおける硝子体内ＡＡＶベクター候補の有効性研究および長期ＰＫ研究
[0200]脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）のレーザー誘発性モデルでのアフリカミドリザルにおける硝子体内（ＩＶＴ）投与後の、滲出型加齢黄斑変性症（ｗＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）、およびポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）をターゲットする、アフリベルセプトを発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター候補の発現した遺伝子の長期眼内ＰＫおよび有効性の評価の決定。サルは、ＡＡＶ中和抗体（ｎＡｂ）血清陰性、全血球数（ＣＢＣ）、一般的な健康問題、および眼の健康状態を、眼圧検査、細隙灯生体顕微鏡観察、眼底検査、カラー眼底写真撮影、フルオレセイン血管造影法（ＦＡ）、共焦点走査レーザー検眼鏡検査（ｃＳＬＯ）、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）により評価するためのベースラインスクリーニングを受ける。正常な所見を有するｎＡｂ陰性サルが本研究に登録され、性別およびベースライン体重によりランダム化された処置群に割り当てられる（表２４）。イメージングに必要な時間に対応するために、サルを、連日のＣＮＶのレーザー誘発、投薬、およびイメージングのために３つのコホートに分ける（表２５）。ベースラインスクリーニングおよび全てのその後の手順のために、効果をもたらし得る筋肉内ケタミン（８ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１．６ｍｇ／ｋｇ）を用いて麻酔、ならびに局所１０％フェニレフリン、１％トロピカミド、および／または１％シクロペントラートを用いて瞳孔散大を達成する。

全身的免疫抑制レジメン
[0201]－１日目およびさらに４週間の間、週１回におけるメチルプレドニゾン（８ｍｇ／日）の筋肉内（ＩＭ）送達（表２５）。

硝子体内投薬
[0202]局所プロパラカイン０．５％を投与し、開眼器を配置し、その後、眼球表面を５％ベタジン溶液で、続いて無菌０．９％食塩水ですすぐ。ＩＶＴ注射を、処置割当（表２４）に従って両眼（ＯＵ）で実施し、３１ゲージ８ｍｍ（５／１６インチ）針を使用して、縁の約２ｍｍ後方へ鋸状縁のレベルで下耳側へ挿入する。注射後、局所抗生物質眼軟膏（ネオマイシン、ポリミキシン、バシトラシン、または等価物）を投与する。

ＣＮＶのレーザー誘発
[0203]レーザー光凝固を、指定された時点（表２５）において行う。局所１０％フェニレフリン塩酸および１％シクロペントラート点眼液を用いて、レーザー処理の前に、瞳孔散大を達成する。１％アトロピンゲル化点眼液の局所投与を、追加として、瞳孔散大を増強するためにレーザー処理の１晩または２晩前に適用する。眼科医がＩｒｉｄｅｘＯｃｕｌｉｇｈｔＴＸ５３２ｎｍレーザーを１００ｍｓのレーザー耐久性、スポットサイズ５０μｍ、出力７５０ｍＷで用いることにより、各眼における黄斑周辺領域内に６つのレーザースポットが対称的に配置される。レーザー病変を立証するためにレーザー処理後すぐにカラー眼底写真撮影を実施する。レーザー直後の重度の網膜／網膜下出血を示し、かつ追跡検査の時点まで消散していない、いかなるスポットも分析から排除される。

眼圧検査
[0204]指定された時点（表２５）において、眼圧（ＩＯＰ）測定を、イヌ（ｄ）較正設定に設定されたＴｏｎｏＶｅｔ（ｉＣａｒｅ、Ｆｉｎｌａｎｄ）眼圧計を使用して、実施する。各眼から各時点において３つの測定値をとり、平均ＩＯＰを定める。

細隙灯生体顕微鏡観察
[0205]指定された時点（表２５）において、細隙灯生体顕微鏡観察を用いて眼内炎症を検査する。非ヒト霊長類眼科検査スコアリングシステムを使用するスコアリングを適用して、臨床眼所見を定量化し、要約スコアを検査項目から導き出す。

カラー眼底写真撮影およびフルオレセイン血管造影法
[0206]指定された時点（表２５）において、両側カラー眼底画像を、Ｃａｎｏｎ６ＤデジタルイメージングハードウェアおよびＮｅｗＶｉｓｉｏｎ眼底画像分析システムソフトウェアと共にＴｏｐｃｏｎＴＲＣ－５０ＥＸ網膜カメラを使用して、窩を中心とする５０°視野に関して、取得する。フルオレセイン血管造影法（ＦＡ）を、０．１ｍＬ／ｋｇの１０％フルオレセインナトリウムの静脈内投与で実施する。血管造影図シリーズ間でのフルオレセインの洗い流しを可能にするために、ＯＤＦＡを、ＯＳ血管造影法の２時間より前に先行させる。ＣＮＶ病変の血管造影図におけるフルオレセイン漏出は、画像強度の均一調整後作成された合成画像を評価して、グレード分類される（Ｉ～ＩＶ；表２６）。後期の生の血管造影図の画像蛍光濃度測定分析もまた、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して実施する。

光干渉断層撮影
[0207]指定された時点（表２５）において、ＯＣＴを、視線追跡ならびにＨＥＹＥＸ画像捕獲および分析ソフトウェアと共にＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇＳｐｅｃｔｒａｌｉｓＯＣＴＰｌｕｓを使用して、実施する。後部網膜を包含する全体的なボリュームスキャンを実施する。レーザー前の検査時点において、網膜厚マップおよび断面ディスプレイ画像を取得する。レーザー後の検査時点において、各病変を中心とする、眼あたり６つの星形スキャン、加えて、高密度スキャン間隔での６つのレーザースポットを包含する黄斑全体の全体的ボリュームスキャンを実施する。各レーザー病変における各星形スキャン内の最大ＣＮＶ複合体形成の主軸を定義し、ＣＮＶ複合体境界を描写するためにＩｍａｇｅＪ内のフリーハンドツールを使用して、ＣＮＶ複合体面積を測定し、平方ミクロン（μｍ^２）での最大複合体面積を計算する。

臨床観察
[0208]一般的な健康問題を、投薬の１週間前から開始して、ケージ側面観察により週２回、確認する。全体的な食欲について、毎日の個々の飼料消費を、日常的摂食後、飼料皿、またはケージ洗浄前のケージ床の目視検査により評価する。これらの観察中、動物を、斜視または眼をこするような症状に特に注意を払いながら、眼炎症の徴候について観察する。

体重
[0209]体重を、指定された時点（表２５）において収集する。

[0210]血清収集
[0211]前に詳述しているように、動物を鎮静下に維持しながら、全血（４ｍＬ）を、指定された時点（表２４）において、大腿静脈または伏在静脈を介して採取する。血液を、（抗凝血剤の非存在下の）バキュテナーチューブに移し、室温でおよそ１時間、インキュベートし、その後、４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間、遠心分離、および血清アリコート（１時点あたり約０．７５ｍＬ×２アリコート）の単離を行う。アリコートを－７０℃未満で、保存しかつｎＡｂ分析のためにスポンサー指定の研究所へ輸送する。

[0212]房水および硝子体液収集
[0213]房水（それぞれ、５０μＬおよび研究終了時点に全量約１５０μＬ）を、ＩＶＴ注射についてのように、眼の滅菌調製後、３１ゲージ針を有する０．３ｍＬインスリン用注射器を使用して、指定された時点（表２５）においてサンプリングする。硝子体液（それぞれ、５０μＬおよび研究終了時点に約１５０μＬ）を、ＩＶＴ注射についてのように、眼の滅菌調製後、２８ゲージ針を有する０．５ｍＬインスリン用注射器を使用して、指定された時点（表２５）においてサンプリングする。両側の房水および／または硝子体穿刺後（研究終了時点を除く）、局所３剤抗生物質ネオマイシン、ポリミキシン、バシトラシンの眼軟膏（または等価物）を投与する。房水および硝子体試料を、前標識されたクライオチューブへ移し、濡れた氷上に置き、収集から３０分以内に－７０℃未満に保存する。

[0214]終了
[0215]終点前の画像品質を確認した後、動物を、ペントバルビタールナトリウム（効果をもたらし得る１００ｍｇ／ｋｇＩＶ）で安楽死させる。

[0216]眼収集
[0217]眼球を除去し、過剰な眼窩組織を切り取る。フラットマウント免疫組織化学（ＩＨＣ）染色および画像分析のための眼収集：各群由来の３組の両眼に、約２００の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を注射し、その後、ＰＦＡ中、６時間、後固定し、ＣｒｅｄｏＣｕｂｅ温度制御低温容器中に４℃で、保存しかつさらなる処理のためにスポンサー指定研究所へ輸送する。鋸状縁のレベルでの円周切断により前部を除去し、その後、ＩＨＣおよび共焦点イメージングのためのフラットマウンティングを可能にするために、眼杯において縦方向に切断する。タンパク質分析のための眼収集：各群由来の３組の両眼を、自然組織平面に沿って室温で解体する前に、液体窒素蒸気中で急速冷凍する。前部を除去し、その後、凍結眼杯に縦方向切断を配置して、凍結後極をフラットマウントし、硝子体を収集する。硝子体液（約２．５ｍＬ全量）を、２つのアリコートへ分ける。網膜を、ＲＰＥ／脈絡膜から分離し、それぞれを個々に収集する。

データ解析
表２５に列挙されたプロトコール定義の評価項目から生じたデータは、表２７に詳細が示されているように、並べられ、要約され、解析される。データが、必要とされる仮定を満たす場合、特定化された統計解析を実施する。データが、定義された統計的方法についての仮定を満たすことができない場合には、可能ならば、代替の方法が用いられ得る。Ｐ値≦０．０５が統計的有意であると見なされる。

[0218]本発明の好ましい実施形態が本明細書に示されかつ記載されているが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者に明らかであろう。多数のバリエーション、変化、および置換が、本発明から逸脱することなく、今、当業者の頭に浮かぶだろう。本明細書に記載された本発明の実施形態の様々な代替物が、本発明を実施することにおいて用いられ得ることは理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が、本発明の範囲を定義すること、ならびにこれらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造およびそれらの等価物がそれらにより網羅されることが意図される。

Claims

改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドであって、その他は同等の非改変ＡＡＶカプシドと比較して、ＡＡＶカプシドのＶＰドメインにおける外因性ポリペプチド配列を含み、外因性ポリペプチド配列は、式１の配列：Ｘ０－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ１－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４－Ｘ５（配列番号９３）
を含み、
式中、Ｘ０は、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、またはメチオニン（Ｍ）であり、
Ｘ１は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）であり、
Ｘ２は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭであり、
Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、またはＱであり、
Ｘ４は、Ｋ、Ｒ、Ｅ、またはＡであり、任意選択で、式１は、プロリン（Ｐ）またはＲであるＸ５をさらに含む、改変されたＡＡＶカプシド。
式１は、Ｘ_５を含み、Ｘ_５は、プロリン（Ｐ）またはＲである、請求項１に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、およびその任意の組合せのカプシドである、請求項１～２のいずれか一項に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
ＡＡＶ２を含む、請求項３に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
少なくとも２つの血清型を含む、請求項３に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
少なくとも２つの血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、およびＡＡＶ１３から選択される、請求項５に記載の改変されたカプシド。
式１は、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９４）、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９５）、またはＶ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９６）を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
式１は、Ｖ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９６）を含み、Ｖ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９６）は、Ｖ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号９７）またはＶ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｋ（配列番号９８）を含む、請求項６に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
式１は、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９４）を含み、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９４）は、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号９９）またはＬ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｓ－Ｘ４（配列番号１００）を含む、請求項６に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号９９）は、
ａ）Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｒ（配列番号１０１）；
ｂ）Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｋ（配列番号１０２）；
ｃ）Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｅ（配列番号１０３）；または
ｄ）Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ａ（配列番号１０４）
を含む、請求項９に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｓ－Ｘ４（配列番号１００）は、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｓ－Ｋ（配列番号１０５）を含む、請求項９に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
式１は、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９５）を含み、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９５）は、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号１０６）を含む、請求項６に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号１０６）は、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｋ（配列番号１０７）を含む、請求項１２に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
式１は、表２の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
式１は、表２のポリペプチド配列を含む、請求項１４に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
ＡＡＶカプシドのＶＰドメインは、ＶＰ１である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
ＡＡＶカプシドのＶＰドメインは、ＶＰ２である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
ＡＡＶカプシドのＶＰドメインは、ＶＰ３である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
変異をさらに含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
変異は、ＶＰ１またはＶＰ２領域にある、請求項１９に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
変異は、ＶＰ１またはＶＰ３領域にある、請求項１９に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
変異は、ＶＰ２またはＶＰ３領域にある、請求項１９に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
変異は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３領域にある、請求項１９に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
変異は、点変異、ミスセンス変異、ナンセンス変異、欠失、重複、フレームシフト、または反復伸長である、請求項１９～２３のいずれか一項に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
変異は、点変異である、請求項２４に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
点変異は、保存的変異を含む、請求項２４に記載の改変されたＡＡＣカプシド。
保存的変異は、非極性脂肪族アミノ酸から非極性脂肪族アミノ酸、極性アミノ酸から極性アミノ酸、正に帯電したアミノ酸から正に帯電したアミノ酸、負に帯電したアミノ酸から負に帯電したアミノ酸、および芳香族アミノ酸から芳香族アミノ酸からなる群から選択される、請求項２６に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
点変異は、帯電したアミノ酸残基から極性または非極性アミノ酸残基への変化を含む、請求項２７に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
帯電したアミノ酸は、正に帯電している、請求項２８に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
帯電したアミノ酸は、負に帯電している、請求項２８に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
変異は、配列番号１の残基にある、請求項１６～２７のいずれか一項に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
変異は、配列番号１の４５２、４５３、４６６、４６７、４６８、４７１、５８５、５８６、５８７、および５８８からなる群から選択される残基にある、請求項３１に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
点変異は、配列番号１の５８５位または５８８位におけるＲからＡである、請求項２５～３２のいずれか一項に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
ＡＡＶカプシドのＶＰ１ドメインにおける少なくとも第２の外因性ポリペプチド配列をさらに含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
外因性ポリペプチド配列および第２の外因性ポリペプチド配列は、それぞれ独立して、ＡＡＶカプシドのループにある、請求項３４に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
外因性ポリペプチド配列および第２の外因性ポリペプチド配列は、それぞれ独立して、ＡＡＶカプシドのＶＰ１ドメインのループ３および／またはループ４にある、請求項３５に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
（ａ）外因性配列を欠くその他は同等のＡＡＶカプシド配列と比較して、ＶＰドメインの少なくとも２つのループにおける外因性配列を含む改変されたカプシド、および（ｂ）導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、複数の細胞と接触すると、複数の細胞と（ａ）を欠くその他は同等のＡＡＶベクターの接触と比較して、前記複数の細胞における接触後において導入遺伝子の少なくとも３倍の発現の増加を有する、ベクター。
外因性配列は、式１：Ｘ０－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ１－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号１０８）を含むポリペプチドをコードし、式中、Ｘ０は、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、またはメチオニン（Ｍ）であり、Ｘ１は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）であり、Ｘ２は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭであり、Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、またはＱであり、Ｘ４は、Ｋ、Ｒ、Ｅ、またはＡであり、任意選択で、式１は、プロリン（Ｐ）またはＲであるＸ５をさらに含む、請求項３７に記載のベクター。
式１は、Ｘ_５を含み、Ｘ_５は、プロリン（Ｐ）またはＲである、請求項３８に記載のベクター。
カプシドは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、およびその任意の組合せのカプシドである、請求項３７～３９のいずれか一項に記載のベクター。
カプシドは、ＡＡＶ２を含む、請求項４０に記載のベクター。
カプシドは、少なくとも２つの血清型を含む、請求項４０に記載のベクター。
少なくとも２つの血清型は、ＡＡＶ２およびＡＡＶ５、ＡＡＶ２およびＡＡＶ６、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８、ＡＡＶ２およびＡＡＶ９、ＡＡＶ２およびＡＡＶ１、ならびにＡＡＶ２およびＡＡＶ１２である、請求項４２に記載のベクター。
式１は、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９４）、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９５）、またはＶ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９６）を含む、請求項３８～４３のいずれか一項に記載のベクター。
式１は、Ｖ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９６）を含み、Ｖ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９６）は、Ｖ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号９７）またはＶ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｋ（配列番号９８）を含む、請求項４４に記載のベクター。
式１は、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９４）を含み、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９４）は、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号９９）またはＬ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｓ－Ｘ４（配列番号１００）を含む、請求項４４に記載のベクター。
Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号９９）は、
ａ）Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｒ（配列番号１０１）；
ｂ）Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｋ（配列番号１０２）；
ｃ）Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｅ（配列番号１０３）；または
ｄ）Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ａ（配列番号１０４）
を含む、請求項４６に記載のベクター。
Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｓ－Ｘ４（配列番号１００）は、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｓ－Ｋ（配列番号１０５）を含む、請求項４６に記載のベクター。
式１は、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９５）を含み、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９５）は、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号１０６）を含む、請求項４４に記載のベクター。
Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号１０６）は、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｋ（配列番号１０７）を含む、請求項４９に記載のベクター。
式１は、表２の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項３８～５０のいずれか一項に記載のベクター。
式１は、表２のポリペプチド配列を含む、請求項５１に記載のベクター。
ＶＰはＶＰ１である、請求項３７～５２のいずれか一項に記載のベクター。
ＶＰはＶＰ２である、請求項３７～５２のいずれか一項に記載のベクター
ＶＰはＶＰ３である、請求項３７～５２のいずれか一項に記載のベクター。
少なくとも２つのループは、ＶＰ１ドメインのループ３およびループ４である、請求項３７～５３のいずれか一項に記載のベクター。
導入遺伝子は、眼用治療薬をコードする、請求項３７～５６のいずれか一項に記載のベクター。
眼用治療薬は、少なくとも網膜疾患の症状を減少させる、網膜疾患を処置する、または網膜疾患を排除するのに効果的である、請求項５７に記載のベクター。
眼用治療薬は、抗体またはその生物学的に活性な断片ならびに生物製剤からなる群から選択される、請求項５８に記載のベクター。
治療薬は生物製剤であり、生物製剤は、リポタンパク質リパーゼ、レチノイドイソメロヒドロラーゼＲＰＥ６５、または補体因子Ｈから選択されるポリペプチドを含む、請求項５９に記載のベクター。
治療薬は抗体またはその生物学的に活性な断片であり、抗体またはその生物学的に活性な断片は、抗ＶＥＧＦ、抗ＶＥＧＦＬ、抗トロンボスポンジン１、抗ＣＤ４７、抗ＴＮＦアルファ、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ５２、および抗ＣＤ１１ａ、抗補体因子５および抗補体因子３から選択される、請求項５９に記載のベクター。
網膜疾患は、色盲、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、滲出型加齢黄斑変性症（ｗＡＭＤ）、地図状萎縮（ＧＡ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、緑内障、バーデット・ビードル症候群、ベスト病、先天性脈絡膜欠如、レーバー先天性黒内障、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、黄斑変性、ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）、網膜色素変性症、レフサム病、シュタルガルト病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）、遺伝性網膜疾患（ＩＲＤ）、桿体錐体ジストロフィー、錐体桿体ジストロフィー、小口病、ＭａｌａｔｔｉａＬｅｖｅｎｔｉｎｅｓｅ（家族性優性ドルーゼン）、青色錐体一色型色覚異常、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）、およびぶどう膜炎黄斑浮腫（ＵＭＯ）からなる群から選択される、請求項５８～６１のいずれか一項に記載のベクター。
網膜疾患は、ＡＭＤである、請求項６２に記載のベクター。
ＡＭＤは滲出型ＡＭＤである、請求項６３に記載のベクター。
ＡＭＤは萎縮型ＡＭＤである、請求項６３に記載のベクター。
Ｒｅｐをコードする配列をさらに含む、請求項３７～６５のいずれか一項に記載のベクター。
Ｒｅｐは、改変されており、改変は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、またはＲｅｐ４０の少なくとも１つにある、請求項６６に記載のベクター。
Ｒｅｐは、カプシドとは異なるＡＡＶ血清型である、請求項６６～６７のいずれか一項に記載のベクター。
ＶＰはＶＰ１である、請求項３７～６８のいずれか一項に記載のベクター。
ＶＰはＶＰ２である、請求項３７～６８のいずれか一項に記載のベクター。
ＶＰはＶＰ３である、請求項３７～６８のいずれか一項に記載のベクター。
発現の増加は、複数の細胞と（ａ）を欠くその他は同等のＡＡＶベクターの接触と比較して、少なくとも５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、または５００倍の増加を含む、請求項３７～７１のいずれか一項に記載のベクター。
改変されたカプシドは、配列番号２８～配列番号４７を含む配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を含む、請求項３７～７２のいずれか一項に記載のベクター。
配列番号３４の改変されたカプシドを含む、請求項７３に記載のベクター。
請求項１～３６のいずれか一項に記載の改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドを含む操作されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオン。
請求項７５に記載の複数のＡＡＶビリオンを含む組成物。
請求項３７～７４のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項７５～７６に記載の操作されたビリオンを細胞にトランスフェクトすることによって生成された、操作された細胞。
請求項７７に記載の操作された細胞から単離された複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子。
単位剤形において請求項７８に記載のアデノ随伴ウイルス粒子を含む組成物。
低温保存される、請求項７９に記載の組成物。
ａ）請求項１～３６のいずれか一項に記載の改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシド；ｂ）請求項３７～７４のいずれか一項に記載のベクター；またはｃ）請求項７５～７６のいずれか一項に記載の操作されたビリオンを含む容器。
バイアル、注射器、または針である、請求項８１に記載の容器。
眼送達のために構成された、請求項８１～８２のいずれか一項に記載の容器。
ａ）請求項１～３６のいずれか一項に記載の改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシド；ｂ）請求項３７～７４のいずれか一項に記載のベクター；またはｃ）請求項７５～７６のいずれか一項に記載の操作されたビリオンを含む医薬組成物。
単位剤形である、請求項８４に記載の医薬組成物。
複数の細胞を、請求項３７～７４のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項７５～７６のいずれか一項に記載の操作されたビリオンと接触させる工程を含む、操作された細胞を作製する方法。
表２の外因性配列を含む改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシド。
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびその組合せからなる群から選択される血清型である、請求項８７に記載の改変されたＡＡＶカプシド。
改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドを作製する方法であって、表２の配列をコードするポリ核酸を、ＡＡＶカプシドをコードする配列に導入し、それにより改変されたＡＡＶカプシドを生成する工程を含む、方法。
ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびその組合せからなる群から選択される血清型である、請求項８９に記載の方法。
疾患または状態の処置を必要とする対象における疾患または状態を処置する方法であって、外因性ポリペプチド配列を欠くその他は同等のＡＡＶカプシド配列と比較して、ＶＰドメインの少なくとも２つのループにおける外因性ポリペプチド配列を含む改変されたカプシドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む医薬組成物の治療有効量を投与する工程を含み、外因性ポリペプチド配列は表２の配列を含む、方法。
ＡＡＶベクターは、導入遺伝子を含む配列をさらに含む、請求項８０に記載の方法。
疾患または状態の処置を必要とする対象における疾患または状態を処置する方法であって、（ａ）外因性配列を欠くその他は同等のＡＡＶカプシド配列と比較して、ＶＰドメインの少なくとも２つのループにおける外因性配列を含む改変されたカプシド；および（ｂ）導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む医薬組成物の治療有効量を投与する工程を含み、ベクターが、複数の細胞と接触すると、複数の細胞と（ａ）を欠くその他は同等のＡＡＶベクターの接触と比較して、複数の細胞におけるトランスフェクション後において導入遺伝子の少なくとも３倍の発現の増加を有する、方法。
発現の増加は、複数の細胞と（ａ）を欠くその他は同等のＡＡＶベクターの接触と比較して、少なくとも５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、または５００倍の増加を含む、請求項８２に記載の方法。
疾患または状態の処置を必要とする対象における疾患または状態を処置する方法であって、その他は同等の非改変ＡＡＶカプシドと比較して、ＡＡＶカプシドのＶＰドメインにおける外因性ポリペプチド配列を含む改変されたカプシドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む医薬組成物の治療有効量を投与する工程を含み、外因性ポリペプチド配列は、式１の配列：
Ｘ０－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ１－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号１０８）
を含み、
式中、Ｘ０は、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、またはメチオニン（Ｍ）であり、
Ｘ１は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）であり、
Ｘ２は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭであり、
Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、またはＱであり、
Ｘ４は、Ｋ、Ｒ、Ｅ、またはＡであり、任意選択で、式１は、プロリン（Ｐ）またはＲであるＸ５をさらに含む、方法。
式１は、Ｘ_５を含み、Ｘ_５は、プロリン（Ｐ）またはＲである、請求項９５に記載の方法。
カプシドは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、およびその任意の組合せである、請求項９５～９６のいずれか一項に記載の方法。
カプシドは、ＡＡＶ２を含む、請求項９７に記載の方法。
カプシドは、少なくとも２つの血清型を含む、請求項９７に記載の方法。
少なくとも２つの血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、およびＡＡＶ１３から選択される、請求項９９に記載の改変されたカプシド。
式１は、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９４）、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９５）、またはＶ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９６）を含む、請求項９５～１００のいずれか一項に記載の方法。
式１は、Ｖ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９６）を含み、Ｖ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９６）は、Ｖ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号９７）またはＶ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｋ（配列番号９８）を含む、請求項１０１に記載の方法。
式１は、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９４）を含み、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９４）は、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号９９）またはＬ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｓ－Ｘ４（配列番号１００）を含む、請求項１０１に記載の方法。
Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号９９）は、
ａ）Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｒ（配列番号１０１）；
ｂ）Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｋ（配列番号１０２）；
ｃ）Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｅ（配列番号１０３）；または
ｄ）Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ａ（配列番号１０４）
を含む、請求項１０３に記載の方法。
Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｓ－Ｘ４（配列番号１００）は、Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｓ－Ｋ（配列番号１０５）を含む、請求項１０３に記載の方法。
式１は、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９５）を含み、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｘ１－Ｘ４（配列番号９５）は、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号１０６）を含む、請求項１０１に記載の方法。
Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｘ４（配列番号１０６）は、Ｌ－Ｋ－Ｌ－Ｇ－Ｘ３－Ｘ１－Ｔ－Ｋ（配列番号１０７）を含む、請求項１０６に記載の方法。
式１は、表２の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項９５～１０７のいずれか一項に記載の方法。
式１は、表２のポリペプチド配列を含む、請求項１０８に記載の方法。
投与する工程は、硝子体内注射、網膜下注射、マイクロインジェクション、または超眼注射によって行われる、請求項９１～１０９のいずれか一項に記載の方法。
投与する工程は、硝子体内注射によって行われる、請求項１１０に記載の方法。
疾患または状態は、眼疾患または状態である、請求項９１～１１１のいずれか一項に記載の方法。
疾患または状態は、非眼疾患または状態である、請求項９１～１１１のいずれか一項に記載の方法。
眼疾患または状態は、網膜疾患または状態である、請求項９１～１１２のいずれか一項に記載の方法。
眼疾患または状態は、色盲、新生血管形成関連網膜障害、例えば、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、滲出型加齢黄斑変性症（ｗＡＭＤ）、地図状萎縮（ＧＡ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、緑内障、バーデット・ビードル症候群、ベスト病、先天性脈絡膜欠如、レーバー先天性黒内障、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、黄斑変性、ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）、網膜色素変性症、レフサム病、シュタルガルト病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）、遺伝性網膜疾患（ＩＲＤ）、桿体錐体ジストロフィー、錐体桿体ジストロフィー、小口病、ＭａｌａｔｔｉａＬｅｖｅｎｔｉｎｅｓｅ（家族性優性ドルーゼン）、青色錐体一色型色覚異常、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）、およびぶどう膜炎黄斑浮腫（ＵＭＯ）からなる群から選択される、請求項１１２または１１４に記載の方法。
眼疾患または状態は、ＡＭＤである、請求項１１５に記載の方法。
ＡＭＤは滲出型ＡＭＤである、請求項１１６に記載の方法。
ＡＭＤは萎縮型ＡＭＤである、請求項１１６に記載の方法。
投与する工程は、少なくとも疾患もしくは状態の症状を減少させる、疾患もしくは状態を治療する、および／または疾患もしくは状態を排除するのに十分である、請求項９１～１１８のいずれか一項に記載の方法。
ベクターは、治療ポリペプチドをコードする導入遺伝子をさらに含む、請求項９５～１１９のいずれか一項に記載の方法。
治療薬は、抗体もしくはその生物学的に活性な断片または生物製剤からなる群から選択される、請求項１２０に記載の方法。
治療薬は生物製剤であり、生物製剤は、リポタンパク質リパーゼ、レチノイドイソメロヒドロラーゼＲＰＥ６５、補体因子Ｈから選択されるポリペプチドを含む、請求項１２１に記載の方法。
治療薬は、抗体またはその生物学的に活性な断片であり、抗体またはその生物学的に活性な断片は、抗ＶＥＧＦ、抗ＶＥＧＦＬ、抗トロンボスポンジン１、抗ＣＤ４７、抗ＴＮＦアルファ、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ５２、および抗ＣＤ１１ａから選択される、請求項１２１に記載の方法。
投与する工程の前に、対象は、遺伝子検査を受ける、請求項９１～１２３のいずれか一項に記載の方法。
遺伝子検査は、ＲＰＥ６５、ＣＲＢ１、ＡＩＰＬ１、ＣＦＨ、またはＲＰＧＲＩＰから選択される遺伝子における変異を検出する、請求項１２４に記載の方法。
投与する工程は、約１．０×１０^９ｖｇ、１．０×１０^１０、１．０×１０^１１ｖｇ、３．０×１０^１１ｖｇ、６×１０^１１ｖｇ、８．０×１０^１１ｖｇ、１．０×１０^１２ｖｇ、１．０×１０^１３ｖｇ、１．０×１０^１４ｖｇ、または１．０×１０^１５ｖｇのベクターの投薬量を送達する工程を含む、請求項９１～１２５のいずれか一項に記載の方法。
投与する工程は反復される、請求項９１～１２６のいずれか一項に記載の方法。
投与する工程は、１日２回、１日おき、１週間あたり２回、隔月、３カ月ごと、１カ月あたり１回、１カ月おき、半年ごと、毎年、または年２回実施される、請求項１１８に記載の方法。
二次療法を投与する工程をさらに含む、請求項９１～１２８のいずれか一項に記載の方法。
ＶＰはＶＰ１を含む、請求項９１～１２９のいずれか一項に記載の方法。
ＶＰはＶＰ２を含む、請求項９１～１２９のいずれか一項に記載の方法。
ＶＰはＶＰ３を含む、請求項９１～１２９のいずれか一項に記載の方法。