KR20230107285A - 조작된 바이러스 캡시드 및 사용 방법 - Google Patents

Abstract

변형된 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드를 포함하는 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 또한, 제공된 조성물 및 방법을 안구 치료제로서 이용하는 방법이 제공된다.

Description

조작된 바이러스 캡시드 및 사용 방법

상호 참조

본 출원은 2020년 11월 10일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 63/111,739의 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2021년 11월 8일에 생성된 상기 ASCII 카피는 59561701601_SL.txt로 명명되고, 198,102 바이트 크기이다.

아데노-연관 바이러스 (AAV)는 유전자 전달을 위한 효율적이고 안전한 벡터로서 유의한 주목을 받았던, 비-외피보유 단백질 캡시드를 갖는 소형의 단일-가닥 DNA-함유 비-병원성 파르보바이러스이다. 재조합 AAV 벡터는 176가지의 I, II, 및 III상 임상 시험에서 사용되었거나 현재 사용되고 있다. AAV 혈청형 2 (AAV2) 벡터는 3종의 인간 질환 레베르 선천성 흑암시 (LCA), 방향족 L-아미노산 데카르복실라제 결핍 (AADC), 및 맥락막결손에서 임상 효능을 나타내었다.

지난 10년간, 일부는 비-인간 영장류로부터 유래된, 적어도 12종의 추가의 AAV 혈청형 벡터가 또한 이용가능하게 되었다. AAV1 벡터는 지단백질 리파제 결핍에 대한 유전자 요법에 성공적으로 사용되었고, AAV8 벡터는 B형 혈우병에 대한 잠재적 유전자 요법에서 임상 효능을 나타내었다. 보다 최근에, AAV5 벡터는 A형 혈우병에서 효과적인 것으로 보고되었다. AAV9 벡터는 폼페병에 대한 유전자 요법에 성공적으로 사용되었고, 척수성 근육 위축에 대한 유전자 요법에서 인상적인 효능을 나타내었다. AAV1-LPL 벡터는 알리포겐 티파르보벡(alipogene tiparvovec)으로 지정된 약물로서 승인되었고, 2012년에 유럽에서 글리베라(Glybera)라는 상표명으로 시판되었다. 2017년에, 망막 색소 상피-특이적 65 kDa 단백질 (RPE65)을 발현하는 AAV2 벡터는 미국에서 약물 보레티진 네파르보벡(voretigene neparvovec) (룩스투르나(Luxturna))으로서 미국 식품 의약품국에 의해 승인되었다. 광범위한 인간 질환에 대한 잠재적인 유전자 요법을 위해 다수의 추가적인 I상 및 II상 임상 시험이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, 및 AAV10 벡터로 추구되었거나 현재 추구되고 있다.

이들 놀라운 달성에도 불구하고, AAV 벡터가 개선된 화물 전달을 위해 변형된 후에만 이러한 기술의 완전한 잠재력이 실현될 것임이 점점 더 명백해졌다.

달리 대등한 비변형된 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드와 비교하여 AAV 캡시드의 VP 도메인 내에 외인성 폴리펩티드 서열을 포함하는 변형된 AAV 캡시드가 본원에 제공된다. 한 측면에서, 외인성 폴리펩티드 서열은 식 1의 서열: X0-X1-X2-X1-X3-X1-X1-X4-X5 (서열식별번호(SEQ ID NO): 93)를 포함하며, 여기서 X0은 발린 (V), 이소류신 (I), 류신 (L), 페닐알라닌 (F), 트립토판 (W), 티로신 (Y) 또는 메티오닌 (M)이고, 여기서 X1은 알라닌 (A), 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q), 세린 (S), 트레오닌 (T), 글루탐산 (E), 아스파르트산 (D), 리신 (K), 아르기닌 (R), 또는 히스티딘 (H)이고, 여기서 X2는 V, I, L, 또는 M이고, 여기서 X3은 E, S, 또는 Q이고, 여기서 X4는 K, R, E, 또는 A이고, 임의로 여기서 식 1은 프롤린 (P) 또는 R인 X5를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 식 1은 X₅를 포함하고, 여기서 X₅는 프롤린 (P) 또는 R이다. 한 실시양태에서, 캡시드는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, 및 그의 임의의 조합의 것이다. 한 실시양태에서, 캡시드는 AAV2를 포함한다. 한 실시양태에서, 캡시드는 적어도 2종의 혈청형을 포함한다. 한 실시양태에서, 적어도 2종의 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAV11, AAV12, 및 AAV13으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 식 1은 L-A-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 94), L-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 95) 또는 V-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 96)를 포함한다. 한 실시양태에서, 식 1은 V-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 96)를 포함하고, 여기서 V-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 96)는 V-K-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 97) 또는 V-K-L-G-X3-X1-X1-K (서열식별번호: 98)를 포함한다. 한 실시양태에서, 식 1은 L-A-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 94)를 포함하고, 여기서 L-A-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 94)는 L-A-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 99) 또는 L-A-L-G-X3-X1-S-X4 (서열식별번호: 100)를 포함한다. 한 실시양태에서, L-A-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 99)는 a) L-A-L-G-X3-X1-T-R (서열식별번호: 101); b) L-A-L-G-X3-X1-T-K (서열식별번호: 102); c) L-A-L-G-X3-X1-T-E (서열식별번호: 103); 또는 d) L-A-L-G-X3-X1-T-A (서열식별번호: 104)를 포함한다. 한 실시양태에서, L-A-L-G-X3-X1-S-X4 (서열식별번호: 100)는 L-A-L-G-X3-X1-S-K (서열식별번호: 105)를 포함한다. 한 실시양태에서, 식 1은 L-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 95)를 포함하고, 여기서 L-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 95)는 L-K-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 106)를 포함한다. 한 실시양태에서, L-K-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 106)는 L-K-L-G-X3-X1-T-K (서열식별번호: 107)를 포함한다. 한 실시양태에서, 식 1은 표 2의 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 식 1은 표 2의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, AAV 캡시드의 VP 도메인은 VP1이다. 한 실시양태에서, AAV 캡시드의 VP 도메인은 VP2이다. 한 실시양태에서, AAV 캡시드의 VP 도메인은 VP3이다. 한 실시양태에서, AAV 캡시드는 돌연변이를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 돌연변이는 VP1 또는 VP2 영역 내에 존재한다. 한 실시양태에서, 돌연변이는 VP1 또는 VP3 영역 내에 존재한다. 한 실시양태에서, 돌연변이는 VP2 또는 VP3 영역 내에 존재한다. 한 실시양태에서, 돌연변이는 VP1, VP2, 및 VP3 영역 내에 존재한다. 한 실시양태에서, 돌연변이는 점 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 결실, 중복, 프레임시프트 또는 반복 확장이다. 한 실시양태에서, 돌연변이는 점 돌연변이이다. 한 실시양태에서, 점 돌연변이는 보존적 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, 보존적 돌연변이는 비극성 지방족 아미노산에서 비극성 지방족 아미노산, 극성 아미노산에서 극성 아미노산, 양으로 하전된 아미노산에서 양으로 하전된 아미노산, 음으로 하전된 아미노산에서 음으로 하전된 아미노산, 및 방향족 아미노산에서 방향족 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 점 돌연변이는 하전된 아미노산 잔기에서 극성 또는 비-극성 아미노산 잔기로의 변화를 포함한다. 한 실시양태에서, 하전된 아미노산은 양으로 하전된 것이다. 한 실시양태에서, 하전된 아미노산은 음으로 하전된 것이다. 한 실시양태에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 잔기 내에 존재한다. 한 실시양태에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 452, 453, 466, 467, 468, 471, 585, 586, 587 및 588로 이루어진 군으로부터 선택된 잔기 내에 존재한다. 한 실시양태에서, 점 돌연변이는 서열식별번호: 1의 위치 585 또는 588에서 R→A이다. 한 실시양태에서, AAV 캡시드는 AAV 캡시드의 VP1 도메인 내에 적어도 제2 외인성 폴리펩티드 서열을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 외인성 폴리펩티드 서열 및 제2 외인성 폴리펩티드 서열은 각각 독립적으로 AAV 캡시드의 루프 내에 존재한다. 한 실시양태에서, 외인성 폴리펩티드 서열 및 제2 외인성 폴리펩티드 서열은 각각 독립적으로 AAV 캡시드의 VP1 도메인의 루프 3 및/또는 루프 4 내에 존재한다.

(a) 외인성 서열이 결여된 달리 대등한 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드 서열과 비교하여 VP 도메인의 적어도 2개의 루프 내에 외인성 서열을 포함하는 변형된 캡시드; 및 (b) 트랜스진을 포함하는 AAV 벡터가 본원에 제공되며, 여기서 상기 벡터는 복수의 세포와 접촉 시, (a)가 결여된 달리 대등한 AAV 벡터와 복수의 세포를 접촉시킨 경우와 비교하여 상기 복수의 세포에서 접촉 후에 트랜스진의 적어도 3배 증가된 발현을 갖는다. 한 실시양태에서, 외인성 서열은 식 1: X0-X1-X2-X1-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 108)를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하며, 여기서 X0은 발린 (V), 이소류신 (I), 류신 (L), 페닐알라닌 (F), 트립토판 (W), 티로신 (Y) 또는 메티오닌 (M)이고, 여기서 X1은 알라닌 (A), 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q), 세린 (S), 트레오닌 (T), 글루탐산 (E), 아스파르트산 (D), 리신 (K), 아르기닌 (R), 또는 히스티딘 (H)이고, 여기서 X2는 V, I, L, 또는 M이고, 여기서 X3은 E, S, 또는 Q이고, 여기서 X4는 K, R, E, 또는 A이고, 임의로 여기서 식 1은 프롤린 (P) 또는 R인 X5를 추가로 포함한다. 한 측면에서, 식 1은 X₅를 포함하고, 여기서 X₅는 프롤린 (P) 또는 R이다. 한 실시양태에서, 캡시드는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, 및 그의 임의의 조합의 것이다. 한 실시양태에서, 캡시드는 AAV2를 포함한다. 한 측면에서, 캡시드는 적어도 2종의 혈청형을 포함한다. 한 실시양태에서, 적어도 2종의 혈청형은 AAV2 및 AAV5, AAV2 및 AAV6, AAV2 및 AAV8, AAV2 및 AAV9, AAV2 및 AAV1, 및 AAV2 및 AAV12이다. 한 실시양태에서, 식 1은 L-A-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 94), L-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 95) 또는 V-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 96)를 포함한다. 한 실시양태에서, 식 1은 V-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 96)를 포함하고, 여기서 V-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 96)는 V-K-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 97) 또는 V-K-L-G-X3-X1-X1-K (서열식별번호: 98)를 포함한다. 한 실시양태에서, 식 1은 L-A-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 94)를 포함하고, 여기서 L-A-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 94)는 L-A-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 99) 또는 L-A-L-G-X3-X1-S-X4 (서열식별번호: 100)를 포함한다. 한 실시양태에서, L-A-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 99)는 a) L-A-L-G-X3-X1-T-R (서열식별번호: 101); b) L-A-L-G-X3-X1-T-K (서열식별번호: 102); c) L-A-L-G-X3-X1-T-E (서열식별번호: 103); 또는 d) L-A-L-G-X3-X1-T-A (서열식별번호: 104)를 포함한다. 한 실시양태에서, L-A-L-G-X3-X1-S-X4 (서열식별번호: 100)는 L-A-L-G-X3-X1-S-K (서열식별번호: 105)를 포함한다. 한 실시양태에서, 식 1은 L-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 95)를 포함하고, 여기서 L-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 95)는 L-K-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 106)를 포함한다. 한 실시양태에서, L-K-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 106)는 L-K-L-G-X3-X1-T-K (서열식별번호: 107)를 포함한다. 한 실시양태에서, 식 1은 표 2의 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 식 1은 표 2의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, VP는 VP1이다. 한 실시양태에서, VP는 VP2이다. 한 실시양태에서, VP는 VP3이다. 한 실시양태에서, 적어도 2개의 루프는 VP1 도메인의 루프 3 및 루프 4이다. 한 실시양태에서, 트랜스진은 안구 치료제를 코딩한다. 한 실시양태에서, 안구 치료제는 적어도 망막 질환의 증상을 감소시키거나, 망막 질환을 치료하거나, 또는 망막 질환을 제거하는 데 효과적이다. 한 실시양태에서, 안구 치료제는 항체 또는 그의 생물학적 활성 단편 및 생물제제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 치료제는 생물제제이고, 여기서 생물제제는 지단백질 리파제, 레티노이드 이소머로히드롤라제 RPE65, 또는 보체 H로부터 선택된 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 치료제는 항체 또는 그의 생물학적 활성 단편이고, 여기서 항체 또는 그의 생물학적 활성 단편은 항-VEGF, 항-VEGFL, 항-트롬보스폰딘-1, 항-CD47, 항-TNF-알파, 항-CD20, 항-CD52, 및 항-CD11a, 항-보체 5, 및 항-보체 3으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 망막 질환은 완전색맹, 신생혈관화 관련 망막 장애 예컨대 연령-관련 황반 변성 (AMD), 습성-연령-관련 황반 변성 (wAMD), 지도형 위축 (GA), 당뇨병성 망막병증 (DR), 당뇨병성 황반 부종 (DME), 녹내장, 바르데-비들 증후군, 베스트병, 맥락막결손, 레베르 선천성 흑암시, 레베르 유전성 시신경병증 (LHON), 황반 변성, 폴립양 맥락막 혈관병증 (PCV), 색소성 망막염, 레프숨병, 스타르가르트병, 어셔 증후군, X-연관 망막층간분리 (XLRS), 유전성 망막 질환 (IRD), 간체-추체 이영양증, 추체-간체 이영양증, 오구치병, 말라티아 레벤티네스 (가족성 우성 드루젠), 청색-원추 단색형 색각, 망막 정맥 폐쇄 (RVO), 및 포도막성 황반 부종 (UMO)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 망막 질환은 AMD이다. 한 실시양태에서, AMD는 습성 AMD이다. 한 실시양태에서, AMD는 건성 AMD이다. 한 실시양태에서, 벡터는 Rep를 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, Rep는 변형되고, 여기서 변형은 Rep 78, Rep 68, Rep 52 또는 Rep 40 중 적어도 1개 내에 존재한다. 한 실시양태에서, Rep는 캡시드와 상이한 AAV 혈청형의 것이다. 한 실시양태에서, VP는 VP1이다. 한 실시양태에서, VP는 VP2이다. 한 실시양태에서, VP는 VP3이다. 한 실시양태에서, 증가된 발현은 (a)가 결여된 달리 대등한 AAV 벡터와 복수의 세포를 접촉시킨 경우와 비교하여 적어도 5-배, 10-배, 20-배, 50-배, 100-배, 200-배 또는 500-배 증가를 포함한다. 한 실시양태에서, 변형된 캡시드는 서열식별번호: 28-서열식별번호: 47을 포함하는 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 34의 변형된 캡시드를 포함한다.

변형된 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드를 포함하는 조작된 아데노-연관 바이러스 (AAV) 비리온이 본원에 제공된다.

복수의 AAV 비리온을 포함하는 조성물이 또한 본원에 제공된다.

또한, 세포를 벡터 또는 조작된 비리온으로 형질감염시킴으로써 생성된 조작된 세포가 본원에 제공된다.

조작된 세포로부터 단리된 복수의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 입자가 본원에 제공된다.

아데노-연관 바이러스 입자를 단위 투여 형태로 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 한 실시양태에서, 조성물은 동결보존된다.

a) 변형된 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드; b) 벡터; 또는 c) 조작된 비리온을 포함하는 용기가 제공된다. 한 실시양태에서, 용기는 바이알, 시린지 또는 바늘이다. 한 실시양태에서, 용기는 안구 전달을 위해 구성된다.

a) 변형된 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드; b) 벡터; 또는 c) 조작된 비리온을 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 단위 투여 형태이다.

또한, 복수의 세포를 벡터 또는 조작된 비리온과 접촉시키는 것을 포함하는, 조작된 세포를 제조하는 방법이 제공된다.

표 2로부터의 외인성 서열을 포함하는 변형된 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드가 제공된다. 한 측면에서, 캡시드는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV8, AAV9, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형의 것이다.

표 2의 서열을 코딩하는 폴리핵산을 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드를 코딩하는 서열 내로 도입함으로써 변형된 AAV 캡시드를 생성하는 것을 포함하는, 변형된 AAV 캡시드를 제조하는 방법이 제공된다. 한 측면에서, AAV 캡시드는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV8, AAV9, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형의 것이다.

외인성 폴리펩티드 서열이 결여된 달리 대등한 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드 서열과 비교하여 VP 도메인의 적어도 2개의 루프 내에 외인성 폴리펩티드 서열을 포함하는 변형된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터를 포함하는 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 외인성 폴리펩티드 서열은 표 2의 서열을 포함한다. 한 측면에서, AAV 벡터는 트랜스진을 포함하는 서열을 추가로 포함한다.

(a) 외인성 서열이 결여된 달리 대등한 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드 서열과 비교하여 VP 도메인의 적어도 2개의 루프 내에 외인성 서열을 포함하는 변형된 캡시드; 및 (b) 트랜스진을 포함하는 AAV 벡터를 포함하는 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 벡터는 복수의 세포와 접촉 시, (a)가 결여된 달리 대등한 AAV 벡터와 복수의 세포를 접촉시킨 경우와 비교하여 복수의 세포에서 형질감염 후에 트랜스진의 적어도 3배 증가된 발현을 갖는다. 한 측면에서, 증가된 발현은 (a)가 결여된 달리 대등한 AAV 벡터와 복수의 세포를 접촉시킨 경우와 비교하여 적어도 5-배, 10-배, 20-배, 50-배, 100-배, 200-배 또는 500-배 증가를 포함한다.

달리 대등한 비변형된 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드와 비교하여 AAV 캡시드의 VP 도메인 내에 외인성 폴리펩티드 서열을 포함하는 변형된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터를 포함하는 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 방법이 또한 제공되며, 외인성 폴리펩티드 서열은 식 1의 서열: X0-X1-X2-X1-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 108)를 포함하고, 여기서 X0은 발린 (V), 이소류신 (I), 류신 (L), 페닐알라닌 (F), 트립토판 (W), 티로신 (Y) 또는 메티오닌 (M)이고, 여기서 X1은 알라닌 (A), 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q), 세린 (S), 트레오닌 (T), 글루탐산 (E), 아스파르트산 (D), 리신 (K), 아르기닌 (R), 또는 히스티딘 (H)이고, 여기서 X2는 V, I, L, 또는 M이고, 여기서 X3은 E, S, 또는 Q이고, 여기서 X4는 K, R, E, 또는 A이고, 임의로 여기서 식 1은 프롤린 (P) 또는 R인 X5를 추가로 포함한다. 한 측면에서, 식 1은 X₅를 포함하고, 여기서 X₅는 프롤린 (P) 또는 R이다. 한 측면에서, 캡시드는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, 및 그의 임의의 조합의 것이다. 한 측면에서, 캡시드는 AAV2를 포함한다. 한 실시양태에서, 캡시드는 적어도 2종의 혈청형을 포함한다. 한 실시양태에서, 적어도 2종의 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAV11, AAV12, 및 AAV13으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 식 1은 L-A-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 94), L-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 95) 또는 V-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 96)를 포함한다. 한 실시양태에서, 식 1은 V-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 96)를 포함하고, 여기서 V-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 96)는 V-K-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 97) 또는 V-K-L-G-X3-X1-X1-K (서열식별번호: 98)를 포함한다. 한 실시양태에서, 식 1은 L-A-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 94)를 포함하고, 여기서 L-A-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 94)는 L-A-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 99) 또는 L-A-L-G-X3-X1-S-X4 (서열식별번호: 100)를 포함한다. 한 실시양태에서, L-A-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 99)는 a) L-A-L-G-X3-X1-T-R (서열식별번호: 101); b) L-A-L-G-X3-X1-T-K (서열식별번호: 102); c) L-A-L-G-X3-X1-T-E (서열식별번호: 103); 또는 d) L-A-L-G-X3-X1-T-A (서열식별번호: 104)를 포함한다. 한 실시양태에서, L-A-L-G-X3-X1-S-X4 (서열식별번호: 100)는 L-A-L-G-X3-X1-S-K (서열식별번호: 105)를 포함한다. 한 실시양태에서, 식 1은 L-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 95)를 포함하고, 여기서 L-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 95)는 L-K-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 106)를 포함한다. 한 실시양태에서, L-K-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 106)는 L-K-L-G-X3-X1-T-K (서열식별번호: 107)를 포함한다. 한 실시양태에서, 식 1은 표 2의 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 식 1은 표 2의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 투여는 유리체내 주사, 망막하 주사, 미세주사, 또는 안구상 주사를 통한다. 한 실시양태에서, 투여는 유리체내 주사를 통한다. 한 실시양태에서, 질환 또는 상태는 안구 질환 또는 상태이다. 한 실시양태에서, 질환 또는 상태는 비-안구 질환 또는 상태이다. 한 실시양태에서, 안구 질환 또는 상태는 망막의 질환 또는 상태이다. 한 실시양태에서, 안구 질환 또는 상태는 완전색맹, 신생혈관화 관련 망막 장애 예컨대 연령-관련 황반 변성 (AMD), 습성-연령-관련 황반 변성 (wAMD), 지도형 위축 (GA), 당뇨병성 망막병증 (DR), 당뇨병성 황반 부종 (DME), 녹내장, 바르데-비들 증후군, 베스트병, 맥락막결손, 레베르 선천성 흑암시, 레베르 유전성 시신경병증 (LHON), 황반 변성, 폴립양 맥락막 혈관병증 (PCV), 색소성 망막염, 레프숨병, 스타르가르트병, 어셔 증후군, X-연관 망막층간분리 (XLRS), 유전성 망막 질환 (IRD), 간체-추체 이영양증, 추체-간체 이영양증, 오구치병, 말라티아 레벤티네스 (가족성 우성 드루젠), 청색-원추 단색형 색각, 망막 정맥 폐쇄 (RVO), 및 포도막성 황반 부종 (UMO)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 안구 질환 또는 상태는 AMD이다. 한 실시양태에서, AMD는 습성 AMD이다. 한 실시양태에서, AMD는 건성 AMD이다. 한 실시양태에서, 투여는 적어도 질환 또는 상태의 증상을 감소시키고/거나, 질환 또는 상태를 치료하고/거나, 질환 또는 상태를 제거하는 데 충분하다. 한 실시양태에서, 벡터는 치료 폴리펩티드를 코딩하는 트랜스진을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 치료제는 항체 또는 그의 생물학적 활성 단편 또는 생물제제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 치료제는 생물제제이고, 여기서 생물제제는 지단백질 리파제, 레티노이드 이소머로히드롤라제 RPE65, 보체 H로부터 선택된 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 치료제는 항체 또는 그의 생물학적 활성 단편이고, 여기서 항체 또는 그의 생물학적 활성 단편은 항-VEGF, 항-VEGFL, 항-트롬보스폰딘-1, 항-CD47, 항-TNF-알파, 항-CD20, 항-CD52, 및 항-CD11a로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 투여 전에 대상체는 유전자 검사를 거친다. 한 실시양태에서, 유전자 검사는 RPE65, CRB1, AIPL1, CFH 또는 RPGRIP로부터 선택된 유전자에서 돌연변이를 검출한다. 한 실시양태에서, 투여는 약 1.0 x 10⁹ vg, 1.0 x 10¹⁰, 1.0 x 10¹¹ vg, 3.0 x 10¹¹ vg, 6 x 10¹¹ vg, 8.0 x 10¹¹ vg, 1.0 x 10¹² vg, 1.0 x 10¹³ vg, 1.0 x 10¹⁴ vg, 또는 1.0 x 10¹⁵ vg의 벡터의 투여량을 전달하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 투여는 반복된다. 한 실시양태에서, 투여는 1일 2회, 격일, 1주 2회, 2개월마다, 3개월마다, 1개월 1회, 격월, 반년마다, 매년마다 또는 격년마다 수행된다. 한 실시양태에서, 방법은 2차 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, VP는 VP1을 포함한다. 한 실시양태에서, VP는 VP2를 포함한다. 한 실시양태에서, VP는 VP3을 포함한다.

참조로 포함됨

본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.

본 개시내용의 신규 특색은 첨부된 청구범위에 특정하게 제시된다. 본 개시내용의 특색 및 이점의 보다 나은 이해는 본 개시내용의 원리가 이용되는 예시적 실시양태를 제시하는 하기 상세한 설명, 및 첨부된 도면을 참조하여 수득될 것이다:
도 1은 AAV2 캡시드 및 그의 변이체의 구조적 모델링을 보여준다. 좌측 패널은 회색으로 채색된 AAV2 캡시드의 60량체를 보여주며, 참조 단량체는 암회색으로 채색되고, 각각의 단량체 상의 삽입에 대해서는 상이한 색으로 채색된다. 우측 패널은 루프3 및 루프4에 펩티드 삽입을 갖는 AAV2의 단량체 VP를 보여준다.
도 2는 AAV2 벡터의 순도를 보여주는 SDS-PAGE를 보여준다. M, 단백질 래더; 레인 1 내지 10, AMI051 - AMI057, V467, 7m8 대조군 벡터, 및 야생형 (WT) 대조군 AAV2. 각각의 레인에 1e+11 vg를 로딩하였다.
도 3a는 인간 세포주에서의 변형된 AAV2 캡시드 변이체의 형질도입 효율을 보여준다. HEK293 및 ARPE-19 세포를 AAV2-CMV-GFP 벡터의 야생형 (wt., AAV2-V104) 및 변형된 캡시드 변이체 (AAV2-V466, AAV2-V467, 및 AAV2-V471)로 1e+5 vg/세포의 MOI로 형질도입하였다. 도 3b는 인간 세포주에서의 변형된 AAV2 캡시드 변이체의 형질도입 효율을 보여준다. HEK293 트랜스진 발현을 형질도입 72시간 후에 형광 현미경검사에 의해 분석하였다. 도 3c 및 도 3d는 본원에 기재된 변형된 AAV: 아미노산 잔기 위치 588 (아스파라긴, N) 다음에 LALGQTTKPA 외인성 폴리펩티드 (서열식별번호: 14)의 삽입을 포함하는 변형된 AAV1; 아미노산 잔기 위치 588 (세린, S) 다음에 LALGQTTKPA 외인성 폴리펩티드 (서열식별번호: 14)의 S588 삽입을 포함하는 변형된 AAV2; 및 아미노산 잔기 위치 588 (세린, S) 다음에 LALGQTTKPA 외인성 폴리펩티드 (서열식별번호: 14)의 S588 삽입을 포함하는 변형된 AAV2를 포함하는 변형된 AAV6에 의해 형질도입된 인간 HEK293 세포 (도 3c) 및 인간 ARPE-19 세포 (도 3d)에서의 VEGF-트랩 발현의 ELISA 측정을 보여준다.
도 4는 제28일의 GFP 발현의 대표적인 플랫 마운트 영상이다. GFP 발현을 마우스 망막 플랫 마운트 상에서 전체 마운트 염색 후에 검사하였다. 군 2 및 3에서의 GFP 발현은 유의하게 더 강건하였고, 따라서 하위세포 GFP가 식별될 수 있도록 보다 낮은 획득 설정에서 영상을 획득하였다.
도 5는 제28일의 눈의 면역조직화학적 분석으로부터의 대표적인 영상이다. 3종의 상이한 항체 칵테일을 이용하여 발현된 GFP 국재화를 평가하였다. GFP는 군 3의 눈에서 너무 풍부하여 1차 및 2차 항체가 모두를 완전히 포획하지 못하여, 면역표지된 GFP에 더하여 내인성 GFP의 검출이 발생하였다 (군 3, 칼럼 1).
도 6은 모든 3종의 항체 칵테일 및 영상화된 눈에 걸친 GFP 발현의 그래프 표현이다. 모든 눈에 걸친 안구 발현의 조사를 위해, GFP 발현을 모든 망막 및 망막외 층에 걸쳐 및 사용된 모든 항체 칵테일에 걸쳐 점수화하였고; 각각의 눈은 단일 행에 의해 나타내어진다. 회색 셀은 양성 GFP 발현이 관찰된 위치를 나타내고; 백색 셀은 GFP 발현 부재를 나타낸다. 약어: GCL/ILM - 신경절 세포층/내부 경계막; IPL - 내부 총상층; INL - 내핵층; OPL - 외부 총상층; ONL - 외핵층; IS - 내부 분절; OS - 외부 분절; RPE - 망막 색소 상피; C - 맥락막; S - 공막; M - 근육; ONH - 시신경 유두.
도 7은 야생형 (wt) AAV2를 유리체내로 (IVT) 마우스의 눈에 투여한 눈의 생체내 안저 영상화 및 면역조직화학 (IHC) 염색을 예시한다. Wt AAV2-GFP는 안저 영상화 및 IHC 섹션 둘 다에 제시된 바와 같이 충분한 GFP 발현을 유도하지 않았다. 도면은 서열식별번호: 133을 개시한다.
도 8은 본원에 기재된 변형된 AAV2 (아미노산 잔기 587 다음에 삽입된 LKLGQTTKPA (서열식별번호: 13)를 갖는 변형된 AAV2를 포함하는 AAV2-AMI053-GFP)를 IVT 경로를 통해 마우스의 눈에 투여한 눈의 생체내 안저 영상화 및 IHC 염색을 예시한다. 변형된 AAV2는 안저 영상화 및 IHC 섹션에서 GFP 발현을 나타내었고, GFP 신호는 세포의 다중 층에서 검출되었다. 도면은 서열식별번호: 116을 개시한다.
도 9는 본원에 기재된 변형된 AAV2 (아미노산 잔기 587 다음에 삽입된 LALGQTTKPA (서열식별번호: 14)를 갖는 변형된 AAV2를 포함하는 AAV2-AMI054-GFP)를 IVT 경로를 통해 마우스의 눈에 투여한 눈의 생체내 안저 영상화 및 IHC 염색을 예시한다. 변형된 AAV2는 안저 영상화 및 IHC 섹션에서 GFP 발현을 나타내었고, GFP 신호는 세포의 다중 층에서 검출되었다. 도면은 서열식별번호: 117을 개시한다.
도 10은 본원에 기재된 변형된 AAV2 (아미노산 잔기 453 다음에 삽입된 LALGETTRPA (서열식별번호: 6)를 갖는 변형된 AAV2를 포함하는 AAV2-V466-GFP)를 IVT 경로를 통해 마우스의 눈에 투여한 눈의 생체내 안저 영상화 및 IHC 염색을 예시한다. 변형된 AAV2는 안저 영상화 및 IHC 섹션에서 GFP 발현을 나타내었고, GFP 신호는 세포의 다중 층에서 검출되었다. 도면은 서열식별번호: 110을 개시한다.
도 11은 야생형 (Wt) 또는 본원에 기재된 변형된 AAV로 형질도입된 눈의 상이한 광섬유 층에서의 AAV 형질도입을 예시하는 AAV 망막 형질도입 지수 (ARCTI)를 예시한다.
도 12는 마우스 레이저-유도된 맥락막 신생혈관화 (LCNV) 연구의 결과를 예시하며, 여기서 변형된 AAV는 LCNV 전에 마우스에게 투여되었다. AAV1, AAV2, 또는 AAV6을 VP1 캡시드 내의 LALGQTTKPA (서열식별번호: 14)의 삽입에 의해 변형시켰고, 이는 마우스의 눈에 전달하기 위한 트랜스진으로서 아플리베르셉트 (VEGF-트랩)를 운반하였다. 변형된 AAV1 (군 5, AAV1. N54-아플리베르셉트)은 VP1 캡시드의 S588 아미노산 잔기 다음에 삽입된 LALGQTTKPA (서열식별번호: 14)를 포함한다. AAV2 (군 3, AAV2. N54-아플리베르셉트)는 VP1 캡시드의 N587 아미노산 잔기 다음에 삽입된 LALGQTTKPA (서열식별번호: 14)를 포함한다. AAV6 (군 4, AAV6. N54-아플리베르셉트)은 VP1 캡시드의 S588 아미노산 잔기 다음에 삽입된 LALGQTTKPA (서열식별번호: 14)를 포함한다.
도 13a는 도 12의 LCNV 연구로부터의 눈에서의 맥락막 신생혈관화의 면적을 예시한다. Δ아플리베르셉트는 오픈 리딩 프레임 내에 붕괴를 포함하는 AAV를 마우스의 눈에 투여한 모의 대조군이었다. 비히클 군과 비교하여, 모든 3종의 변형된 AAV 군은 눈에서 맥락막 신생혈관화의 면적의 유의한 감소를 보여주었다 (AAV6.N54-아플리베르셉트, p<0.001; AAV1.N54-아플리베르셉트, p<0.01; 및 AAV2.N54-아플리베르셉트, p<0.05). 도 13b는 AAV6.N54-아플리베르셉트가 투여된 군이 눈에서 맥락막 신생혈관화의 면적의 유의한 감소를 계속해서 보여주었음을 예시한다 (AAV6.N54-아플리베르셉트, p<0.05).
도 14는 도 12로부터의 LCNV 연구 마우스로부터 수득된 안구 (좌측 및 중간 패널) 및 혈청 (우측 패널) 샘플 중의 아플리베르셉트 농도를 예시한다.
도 15는 도 12로부터의 마우스에서 LCNV에 의해 유도된 망막 손상에 대한 망막 아플리베르셉트 보호 효과의 플루오레세인 혈관조영 (FA) 분석을 예시한다. 안배 내의 아플리베르셉트 농도 대 레이저링에 의해 유발된 망막 손상의 상관관계는 역으로 상관되었다.
도 16은 제21일의 안저 영상을 예시한다. 눈의 후방 절편을 컬러 및 코발트 블루 채널 둘 다에서 영상화하였다. GFP 발현에 대한 영상화 획득 설정을 군 6 동물에 대해 보정하고, 수준을 연구에 걸쳐 일관되게 유지시켰다.
도 17은 제28일의 눈의 면역조직화학적 분석으로부터의 대표적인 영상을 예시한다. 동결절편 (14 μm)을 GFP, RPE65, 팔로이딘 및 DAPI의 국재화에 대해 평가하였다. 병합 영상은 좌측에 제시되고, GFP 채널의 풀아웃은 우측에 제시된다.
도 18은 공초점 현미경을 사용한 제28일의 눈의 면역조직화학적 분석으로부터의 대표적인 영상을 예시한다. 동결절편 (14 μm)을 GFP, RPE65, 팔로이딘 및 DAPI의 국재화에 대해 평가하였다. 병합 영상은 좌측에 제시되고, GFP는 우측에 제시된다.
도 19a는 돼지의 눈으로의 AAV2.AMI054-GFP (LALGQTTKPA (서열식별번호: 14) 삽입을 포함하는 변형된 AAV2)의 유리체내 전달을 예시한다. IHC 염색은 망막 층에서의 GFP 형광을 보여주었다. 도 19b는 AAV2.AMI054-GFP가 투여된 눈의 각각의 망막 층에서의 GFP 발현을 예시한다.
도 20은 AAV2.AMI054-GFP 또는 AAV2.7M8-GFP (대조군)가 투여된 눈 사이의 돼지 망막에서의 GFP 발현의 비교를 예시한다. AAV2.AMI054-GFP로 형질도입된 망막은 AAV2.7M8-GFP로 형질도입된 망막과 대조적으로 모든 망막 층에서 GFP 발현을 나타내었다. AAV2.AMI054-GFP 형질도입된 망막에서의 GFP 형광은 AAV2.7M8-GFP 형질도입된 망막보다 2배 더 강하였다.

하기 설명 및 실시예는 본 발명의 실시양태를 상세히 예시한다. 본 발명은 본원에 기재된 특정한 실시양태로 제한되지 않으며, 따라서 달라질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 범주 내에 포괄되는 본 발명의 수많은 변경 및 변형이 존재한다는 것을 인식할 것이다.

정의

용어 "AAV", "AAV 구축물", 또는 "재조합 AAV" 또는 "AAV"는 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, 또는 scAAV, rh10, 키메라 또는 하이브리드 AAV, 또는 그의 임의의 조합, 유도체, 또는 변이체를 포함한, 공지된 혈청형 중 임의의 것의 아데노-연관 바이러스를 지칭한다. AAV는 소형의 비-외피보유 단일-가닥 DNA 바이러스이다. 이들은 비-병원성 파르보바이러스이고, 복제를 위해 헬퍼 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스, 백시니아 바이러스 및 CMV를 필요로 할 수 있다. 야생형 AAV는 일반 인구에서 흔하고, 임의의 공지된 병리상태와 연관되지 않는다. 하이브리드 AAV는 1종의 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 및 또 다른 AAV 혈청형으로부터의 게놈 물질을 포함하는 AAV이다. 키메라 AAV는 2종 이상의 AAV 혈청형으로부터 유래된 유전자 및/또는 단백질 서열을 포함하고, 그러한 2종 이상의 AAV 혈청형의 유전자 서열에 대해 이루어진 돌연변이를 포함할 수 있다. 예시적인 키메라 AAV는 키메라 AAV 캡시드, 예를 들어 2종 이상의 AAV 혈청형으로부터 유래된 아미노산의 1개 이상의 영역을 갖는 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. AAV 변이체는 그의 모 AAV와 비교하여 그의 게놈 또는 단백질에서 적어도 1개의 아미노산 돌연변이, 예를 들어 그의 모 AAV와 비교하여 그의 캡시드 단백질에서 적어도 1개의 아미노산 돌연변이를 포함하는 AAV이다. 본원에 사용된 AAV는 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 및 양 AAV를 포함하며, 여기서 영장류 AAV는 비-영장류를 감염시키는 AAV를 지칭하고, 여기서 비-영장류 AAV는 비-영장류 동물을 감염시키는 AAV, 예컨대 조류 동물을 감염시키는 조류 AAV를 지칭한다. 일부 경우에, 야생형 AAV는 rep 및 cap 유전자를 함유하며, 여기서 rep 유전자는 바이러스 복제에 요구되고, cap 유전자는 캡시드 단백질의 합성에 요구된다. 본원에 사용된 용어 "재조합 AAV" 및 "rAAV"는 상호교환가능하다.

용어 "재조합 AAV 벡터" 또는 "AAV 벡터" 또는 "AAV 벡터"는 상기 언급된 AAV 혈청형 중 임의의 것으로부터 유래된 벡터를 지칭한다. 일부 경우에, AAV 벡터는 전체적으로 또는 부분적으로 결실된 AAV 야생형 유전자 중 1종 이상, 예컨대 rep 및/또는 cap 유전자를 포함할 수 있지만, 유전자 요법을 위한 AAV 바이러스의 패키징 및 사용에 요구되는 기능적 요소를 함유한다. 예를 들어, 오픈 리딩 프레임에 플랭킹된 기능적 역전된 말단 반복부 또는 ITR 서열 또는 내부에서 클로닝되는 외인성 서열은 AAV 비리온의 복제 및 패키징에 중요한 것으로 공지되어 있지만, ITR 서열은 야생형 뉴클레오티드 서열로부터 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환을 포함하여 변형될 수 있으므로, AAV는 본원에 기재된 실시양태, 예컨대 유전자 요법 또는 유전자 전달 시스템에 사용하기에 적합하다. 일부 측면에서, 본원에 참조로 포함된 문헌 [Wu, Hum Gene Ther. 2007, 18(2):171-82]에 기재된 바와 같이, 자기-상보적 벡터 (sc), 예컨대 자기-상보적 AAV 벡터가 사용될 수 있으며, 이는 바이러스 제2-가닥 DNA 합성에 대한 요건을 우회할 수 있고, 트랜스진 단백질의 보다 높은 발현율로 이어질 수 있다. 일부 측면에서, AAV 벡터는 최적 혈청형, 프로모터 및 트랜스진의 선택을 가능하게 하기 위해 생성될 수 있다. 일부 경우에, 벡터는 면역 세포에 선택적으로 결합하거나 이를 감염시키는 표적화된 벡터 또는 변형된 벡터일 수 있다.

용어 "AAV 비리온" 또는 "AAV 비리온"은 본원에 기재된 바와 같은 AAV 벡터를 캡시드화하는 적어도 1개의 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 포함하는 바이러스 입자를 지칭하며, 여기서 벡터는 일부 실시양태에서 이종 폴리뉴클레오티드 서열 또는 트랜스진을 추가로 포함할 수 있다. 비리온은 조작된 비리온일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 참조 수치 및 그의 문법적 등가물과 관련하여 용어 "약" 및 그의 문법적 등가물은 그러한 값으로부터 플러스 또는 마이너스 10% 값의 범위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 양 "약 10"은 9 내지 11의 양을 포함한다. 참조 수치와 관련하여 용어 "약"은 또한 그러한 값으로부터 플러스 또는 마이너스 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 값의 범위를 포함할 수 있다.

용어 "대상체", "숙주", "개체" 및 "환자"는 동물, 전형적으로 포유 동물을 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 임의의 적합한 포유동물은 본원에 기재된 바와 같은 조성물 (예컨대, 조작된 가이드 RNA)을 투여받을 수 있거나 또는 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 치료될 수 있다. 대상체는 척추동물 또는 무척추동물일 수 있다. 대상체는 실험 동물일 수 있다. 포유동물의 비제한적 예는 인간, 비-인간 영장류 (예를 들어, 유인원, 긴팔원숭이, 침팬지, 오랑우탄, 원숭이, 마카크 등), 가축 (예를 들어, 개 및 고양이), 농장 동물 (예를 들어, 말, 소, 염소, 양, 돼지) 및 실험 동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 기니 피그)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 포유동물은 임의의 연령 또는 임의의 발달 단계 (예를 들어, 성인, 10대, 소아, 영아, 또는 자궁내 포유동물)일 수 있다. 포유동물은 남성 또는 여성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 대상체는 환자일 수 있다. 대상체는 질환을 앓고 있을 수 있다. 대상체는 질환의 증상을 나타낼 수 있다. 대상체는 질환의 증상을 나타내지 않을 수 있지만, 여전히 질환을 가질 수 있다. 대상체는 관리인의 의료 관리 하에 있을 수 있다 (예를 들어, 대상체는 입원하고, 의사에 의해 치료됨).

용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 상호교환가능하게 사용되고, 그의 가장 넓은 의미에서 2개 이상의 서브유닛 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩티드모방체의 화합물을 지칭한다. 상기 용어는 또한 변형된 아미노산 중합체; 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작, 예컨대 표지 성분과의 접합을 포괄한다. 본원에 사용된 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체 둘 다를 포함한 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산, 및 아미노산 유사체 및 펩티드모방체를 지칭한다. 서브유닛은 펩티드 결합에 의해 연결될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 서브유닛은 다른 결합, 예를 들어 에스테르, 에테르 등에 의해 연결될 수 있다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하고, 단백질 또는 펩티드의 서열을 구성할 수 있는 아미노산의 최대 수에 대해서는 제한이 없다. 본원에 사용된 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 및 L 광학 이성질체 둘 다를 포함한 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산, 및 아미노산 유사체 및 펩티드모방체를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "융합 단백질"은 1개 초과의 자연 발생 또는 재조합적으로 생산된 단백질로부터의 도메인으로 구성된 단백질을 지칭하며, 여기서 일반적으로 각각의 도메인은 상이한 기능을 제공한다. 이와 관련하여, 용어 "링커"는 이들 도메인을 함께 연결하는 데 - 임의로 융합된 단백질 도메인의 입체형태를 보존하고/거나 그의 각각의 기능을 손상시킬 수 있는 융합된 단백질 도메인 사이의 불리한 상호작용을 방지하는 데 사용되는 단백질 단편을 지칭한다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 또 다른 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 특정 퍼센트 "서열 동일성"을 가지며, 이는 정렬되었을 때, 2개의 서열을 비교하는 경우에 그러한 백분율의 염기 또는 아미노산이 동일하다는 것을 의미한다. 서열 유사성은 다수의 상이한 방식으로 결정될 수 있다. 서열 동일성을 결정하기 위해, 서열은 월드 와이드 웹 ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/상에서 이용가능한 BLAST를 비롯한 방법 및 컴퓨터 프로그램을 사용하여 정렬될 수 있다. 또 다른 정렬 알고리즘은 옥스포드 몰레큘라 그룹, 인크.(Oxford Molecular Group, Inc.)의 전체 소유 자회사인 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨팅 그룹(Genetics Computing Group) (GCG) 패키지에서 이용가능한 FASTA이다. 정렬을 위한 다른 기술은 문헌 [Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & Co., San Diego, Calif., USA]에 기재되어 있다. 서열에서 갭을 허용하는 정렬 프로그램이 특히 관심대상이다. 스미스-워터맨은 서열 정렬에서 갭을 허용하는 알고리즘의 한 유형이다. 문헌 [Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997)]을 참조한다. 또한, 니들만(Needleman) 및 분쉬(Wunsch) 정렬 방법을 사용하는 GAP 프로그램을 이용하여 서열을 정렬할 수 있다. 문헌 [J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)]을 참조한다.

개관

변형된 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드-함유 조성물 및 그의 사용 방법이 본원에 제공된다. 변형된 AAV 캡시드는 달리 대등한 비변형된 AAV 캡시드와 비교하여 외인성 서열을 포함할 수 있다. 외인성 서열은 외인성 폴리펩티드 서열을 지칭할 수 있다. AAV 캡시드는 이를 부여하기 위해 변형될 수 있고, 이것을 이용하는 임의의 조성물 및/또는 방법은 기능성을 개선시켜, 특히 안구 사용을 위한 보다 우수한 치료제를 생성할 수 있다.

AAV 야생형 (WT) 게놈은 적어도 3개의 유전자 rep, cap, 및 X를 함유한다. 1999년에 처음 기재된 X 유전자는 게놈의 3' 단부에 위치하고 (AAV2에서 뉴클레오티드 3929-4393), 게놈 복제에서 지지 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 것으로 보인다. rep 및 cap에 대해 유의하게 더 많은 정보가 이용가능하다. rep 유전자는 AAV WT 게놈의 제1 절반에 위치하고, 바이러스 전사 제어 및 복제뿐만 아니라 바이러스 게놈의 새로 생성된 사전-어셈블리된 캡시드 내로의 패키징에 요구되는 비-구조 단백질 (Rep 단백질)의 패밀리를 코딩한다. AAV 게놈의 제2 절반은 바이러스 단백질 (VP), VP1, VP2, 및 VP3, 및 어셈블리-활성화 단백질 (AAP)을 코딩하는 cap 유전자를 함유한다. 캡시드 단량체인 모든 VP의 전사는 단일 프로모터 (AAV2의 경우에 p40)에 의해 제어되어 단일 mRNA를 생성한다. 스플라이싱 (VP1) 및 비통상적 번역 개시 코돈 (VP2)은 VP3과 비교하여 VP1 및 VP2이 대략 10배 더 적게 존재하는 원인이 된다. 예상된 바와 같이, 단일 유전자에 의해 코딩되는 경우에, AAV VP는 그의 아미노산의 대부분을 공유한다. 구체적으로, 전체 VP3 서열은 또한 VP2 및 VP1 내에 함유되고 ("공통 VP3 영역"), 또한 VP2 및 VP1은 대략 65개의 아미노산을 공유한다 ("공통 VP1/VP2 영역"). 단지 VP1만이 그의 N 말단에 고유한 서열을 함유한다 (대략 138개 아미노산, VP1 고유). AAP는 2010년에 대안적 cap ORF에 코딩된 23 kD 단백질로서 확인되었다. 이는 새롭게 생산된 VP 단백질을 안정화시키고 세포질로부터 세포 핵 내로 수송하는 데 사용된다. 흥미롭게도, AAV 혈청형 1-3, 6-9, 및 rh10은 AAP의 부재 하에 캡시드를 생산하는 데 실패하였지만, AAV4 및 AAV5에 대해 낮지만 검출가능한 캡시드 생산이 보고되었다.

한 측면에서, AAV는 변형을 포함할 수 있다. 변형은 AAV의 rep, cap, 및/또는 X 코딩 폴리펩티드 서열의 변형일 수 있다. 일부 경우에, 변형은 cap 폴리펩티드의 변형일 수 있다. cap 폴리펩티드는 VP 도메인 중 어느 하나, 예를 들어 VP1, VP2 및/또는 VP3에서 변형될 수 있다. 일부 경우에, VP1이 변형된다. 일부 경우에, VP2가 변형된다. 일부 경우에, VP3이 변형된다. 일부 측면에서, VP 도메인 중 2개 또는 모두가 변형될 수 있다. 일부 경우에, VP1 및 VP2가 변형된다. 일부 경우에, VP1 및 VP3이 변형된다. 추가적으로, VP2 및 VP3이 변형될 수 있거나, 또는 VP1, VP2, 및 VP3이 변형된다. 다른 조합, 예컨대 Rep 및 Cap, Cap 및 X, Rep 및 X, 및/또는 Rep, Cap, 및 X에서의 변형이 고려된다. 도메인의 임의의 조합, 예컨대 Rep 및/또는 X 변형과 함께 상기 언급된 VP 변형 중 어느 하나가 변형될 수 있다. 일부 경우에, Rep 및 VP1 및/또는 VP2가 변형된다. 일부 측면에서, 대상 Rep가 변형된다. rep 변형은 본원에 제공된 바와 같은 변형을 포함할 수 있고, Rep 78, Rep 68, Rep 52 또는 Rep 40 중 적어도 하나에 존재할 수 있다. 일부 경우에, Rep는 대상 캡시드와 상이한 AAV 혈청형의 것이다.

일부 경우에, 변형은 AAV 캡시드의 변형이다. AAV 혈청형의 캡시드는 대략 50 카피의 VP3, 5 카피의 VP2, 및 5 카피의 VP1을 갖는 60 VP 단량체로부터 어셈블리된다. 위상학적으로 두드러진 캡시드 표면 구조는 각각 5중의 세공 또는 "채널-유사-구조", 각각 2중의 함몰부, 및 각각 3중의 대칭 축을 둘러싸는 3개의 돌출부이다. 세공은 캡시드 내부와 외부 사이의 교환을 가능하게 한다. 함몰부, 보다 정확하게는 각각의 2중 축에서의 바닥은 바이러스 캡시드의 가장 얇은 부분이다. 3중 축 주위의 돌출부는 9개의 소위 가변 영역 (VR) 중 5개를 보유한다. 구체적으로, VR-IV, -V, 및 -VIII은 돌출부의 상단에서 루프 (루프 1-4)를 형성하는 한편, VR-VI 및 -VII은 그의 기저에서 발견된다. VR은 혈청형 사이에서 상이하고, 항체 및 수용체 결합에서 혈청형-특이적 변이를 담당한다. 그의 노출된 위치 및 수용체 결합에서의 그의 기능 때문에, 돌출부의 루프를 형성하는 VR은 AAV 향성 (세포 표면 표적화)을 재-지시하거나 확장시키는 것을 목표로 캡시드 변형을 위한 이상적인 위치이다. 재-지시된 향성 (벡터 재-표적화)은 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발에 의한 천연 수용체 결합의 제거와 신규 비-천연 AAV 수용체를 통한 형질도입을 매개하는 리간드의 삽입을 조합하지만, 향성 확장을 갖는 AAV 벡터는 그의 천연 수용체 결합 능력은 유지하면서 여분의 수용체를 통해 세포를 형질도입하는 능력을 획득한다.

일부 측면에서, AAV 캡시드의 변형은 외인성 폴리펩티드 서열의 삽입을 지칭할 수 있다. 다른 측면에서, 변형은 폴리펩티드 서열에서의 결실을 지칭할 수 있다. 변형은 또한 폴리펩티드 서열에서 정규 또는 비-정규인 적어도 1개의 아미노산 잔기의 변형을 지칭할 수 있다.

삽입은 적어도 1개의 외인성 아미노산 잔기를 AAV 캡시드를 코딩하는 서열 내로 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 아미노산은 정규 아미노산 또는 비-정규 아미노산을 지칭할 수 있다. 임의의 수의 아미노산 잔기가 삽입될 수 있다. 일부 경우에, 삽입 부위는 AAV 캡시드 단백질의 GH 루프, 또는 루프 IV 내, 예를 들어, AAV 캡시드 단백질의 GH 루프, 또는 루프 IV의 용매-접근가능한 부분 내일 수 있다. AAV 캡시드의 GH 루프/루프 IV에 대해서는, 예를 들어 문헌 [van Vliet et al., (2006) Mol. Ther. 14:809; Padron et al., (2005) J. Virol. 79:5047; 및 Shen et al., (2007) Mol. Ther. 15:1955]을 참조한다.

일부 경우에, 변형은 식 1의 서열을 포함하는 외인성 폴리펩티드 서열의 삽입을 포함한다:

X0-X1-X2-X1-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 108)

일부 경우에, X0은 발린 (V), 이소류신 (I), 류신 (L), 페닐알라닌 (F), 트립토판 (W), 티로신 (Y) 또는 메티오닌 (M)이다. 일부 경우에, X1은 알라닌 (A), 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q), 세린 (S), 트레오닌 (T), 글루탐산 (E), 아스파르트산 (D), 리신 (K), 아르기닌 (R), 또는 히스티딘 (H)이다. 일부 경우에, X2는 V, I, L, 또는 M이고, 여기서 X3은 E, S, 또는 Q이다. 일부 경우에, X4는 K, R, E, 또는 A이다. 일부 경우에, 식 1은 X5를 추가로 포함한다. X5는 프롤린 (P) 또는 R일 수 있다.

일부 경우에, 식 1은 L-A-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 94), L-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 95), 또는 V-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 96)를 포함한다. 일부 경우에, 식 1은 V-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 96)를 포함한다. 일부 경우에, 외인성 폴리펩티드는 V-K-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 97) 및/또는 V-K-L-G-X3-X1-X1-K (서열식별번호: 98)이다. 일부 경우에, 외인성 폴리펩티드는 L-A-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 94)를 포함한다. 일부 경우에, 외인성 폴리펩티드는 L-A-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 99) 및/또는 L-A-L-G-X3-X1-S-X4 (서열식별번호: 100)를 포함한다. 일부 경우에, 외인성 폴리펩티드는 L-A-L-G-X3-X1-T-R (서열식별번호: 101), L-A-L-G-X3-X1-T-K (서열식별번호: 102), L-A-L-G-X3-X1-T-E (서열식별번호: 103), 및/또는 L-A-L-G-X3-X1-T-A (서열식별번호: 104)를 포함한다. 일부 경우에, 외인성 폴리펩티드는 L-A-L-G-X3-X1-S-K (서열식별번호: 105)를 포함한다. 일부 경우에, 외인성 폴리펩티드는 L-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 95)를 포함한다. 일부 경우에, 외인성 폴리펩티드는 L-K-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 106)를 포함한다. 일부 경우에, 외인성 폴리펩티드는 L-K-L-G-X3-X1-T-K (서열식별번호: 107)를 포함한다.

일부 경우에, 외인성 폴리펩티드는 식 1의 서열을 포함한다. 일부 경우에, 식 I의 서열은 표 2의 서열과 적어도 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 최대 약 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 경우에, 외인성 폴리펩티드는 잔기에 대해 0-2개의 변형을 갖는 표 2 중 1개이다. 일부 경우에, 외인성 폴리펩티드는 서열식별번호: 13에 대해 적어도 90%, 95%, 97%, 또는 최대 약 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 외인성 폴리펩티드는 서열식별번호: 13 또는 서열식별번호: 13에 대해 0-2개의 치환을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.

일부 경우에, 외인성 폴리펩티드, 예컨대 식 1에 의해 기재된 것 중 적어도 2개가 본원에 제공된 AAV의 캡시드 서열 내로 삽입된다. 적어도 2개의 외인성 폴리펩티드는 동일한 위치 또는 상이한 위치에 삽입될 수 있다. 한 측면에서, 표 2에 제공된 외인성 폴리펩티드 서열 중 어느 하나는 비변형된 AAV 캡시드 서열, 예컨대 표 1에 제공된 야생형 서열에 삽입되어 변형된 AAV 캡시드를 생성할 수 있다.

유사하게, 결실은 AAV 캡시드를 코딩하는 서열에서 적어도 1개의 아미노산 잔기를 결실시키는 것을 포함할 수 있다. 임의의 수의 아미노산이 결실될 수 있다.

일부 경우에, 적어도 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49개, 또는 최대 약 50개의 외인성 아미노산 잔기가 AAV 캡시드를 코딩하는 폴리펩티드 서열에 삽입되고/거나 결실될 수 있다. 일부 경우에, 적어도 또는 최대 1-5, 5-10, 10-15, 15-20개, 또는 그의 조합의 외인성 아미노산 잔기가 AAV 캡시드를 코딩하는 폴리펩티드 서열에 삽입되고/거나 결실될 수 있다. 일부 경우에, 약 또는 최대 약 5개의 아미노산 내지 약 11개의 아미노산이 상응하는 비변형된 AAV 캡시드 단백질에 비해 캡시드 단백질의 GH 루프 또는 루프 IV 내의 삽입 부위에 삽입된다. 예를 들어, 삽입 부위는 AAV2의 아미노산 587과 588, 또는 또 다른 AAV 혈청형의 캡시드 서브유닛의 상응하는 위치 사이일 수 있다. 삽입 부위 587-588은 AAV2 캡시드 단백질을 기초로 한 것임에 주목한다. 약 5개 아미노산 내지 약 11개 아미노산이 AAV2이외의 AAV 혈청형 (예를 들어, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9 등) 내의 상응하는 부위에 삽입될 수 있다.

일부 실시양태에서, 삽입 부위는 임의의 AAV 혈청형의 VP1의 아미노산 570-614 사이에 위치한 2개의 인접한 아미노산 사이의 단일 삽입 부위이고, 예를 들어 삽입 부위는 임의의 AAV 혈청형 또는 변이체의 VP1의 아미노산 570-610, 아미노산 580-600, 아미노산 570-575, 아미노산 575-580, 아미노산 580-585, 아미노산 585-590, 아미노산 590-600, 또는 아미노산 600-614에 위치한 2개의 인접한 아미노산 사이이다. 예를 들어, 삽입 부위는 아미노산 580과 581, 아미노산 581과 582, 아미노산 583과 584, 아미노산 584와 585, 아미노산 585와 586, 아미노산 586과 587, 아미노산 587과 588, 아미노산 588과 589, 또는 아미노산 589와 590 사이일 수 있다. 삽입 부위는 아미노산 575와 576, 아미노산 576과 577, 아미노산 577과 578, 아미노산 578과 579, 또는 아미노산 579와 580 사이일 수 있다. 삽입 부위는 아미노산 590과 591, 아미노산 591과 592, 아미노산 592와 593, 아미노산 593과 594, 아미노산 594와 595, 아미노산 595와 596, 아미노산 596과 597, 아미노산 597과 598, 아미노산 598과 599, 또는 아미노산 599와 600 사이일 수 있다.

일부 측면에서, 삽입 부위는 AAV2의 아미노산 587과 588 사이, AAV1의 아미노산 590과 591 사이, AAV5의 아미노산 575와 576 사이, AAV6의 아미노산 590과 591 사이, AAV7의 아미노산 589와 590 사이, AAV8의 아미노산 590과 591 사이, AAV9의 아미노산 588과 589 사이, 또는 AAV10의 아미노산 588과 589 사이일 수 있다.

또 다른 예로서, 삽입 부위는 표 1에 제시된 바와 같은 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 450과 460 사이일 수 있다. 예를 들어, 삽입 부위는 AAV2의 아미노산 453, AAV1의 아미노산 454, AAV6의 아미노산 454, AAV7의 아미노산 456, AAV8의 아미노산 456, AAV9의 아미노산 454, 또는 AAV10의 아미노산 456 (예를 들어, 그에 대해 바로 N-말단)일 수 있다.

일부 실시양태에서, 대상 캡시드 단백질은 표 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 GH 루프를 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다양한 AAV 혈청형의 캡시드 단백질의 아미노산 서열의 비교에 기초하여, "AAV2의 아미노산 587-588에 상응하는" 삽입 부위가 임의의 주어진 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 내에 존재할 것임을 알 것이다.

일부 경우에, 외인성 폴리펩티드는 표 2 또는 식 1의 예시적인 폴리펩티드 중 어느 하나의 아미노 말단 및/또는 카르복실 말단에 0 내지 4개의 스페이서 아미노산 (Y₁-Y₄)을 가질 수 있다. 적합한 스페이서 아미노산은 류신, 알라닌, 글리신 및/또는 세린을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

AAV 캡시드의 변형은 폴리펩티드 서열 내의 적어도 1개의 아미노산 잔기의 변형을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 변형은 본원에 기재된 바와 같은 임의의 AAV 캡시드 위치에서 이루어질 수 있고, 임의의 수의 변형을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 변형은 돌연변이를 포함할 수 있다. 돌연변이는 점 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 결실, 중복, 프레임시프트 및/또는 반복 확장을 포함할 수 있다.

한 측면에서, 아미노산은 비-극성 지방족 잔기, 예컨대 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신 또는 프롤린일 수 있다. 한 측면에서, 아미노산 잔기는 방향족이고, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판이다. 한 측면에서, 아미노산 잔기는 극성, 비-하전된 것이고, 세린, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌, 아스파라긴 또는 글루타민이다. 한 측면에서, 아미노산은 양으로 하전된 것이고, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘이다. 한 측면에서, 아미노산은 음으로 하전된 것이고, 아스파르테이트 또는 글루타메이트이다.

일부 경우에, 돌연변이는 점 돌연변이이다. 점 돌연변이는 하전된 아미노산 잔기로부터 극성 또는 비-극성 아미노산 잔기로의 변화를 포함한다. 일부 경우에, 하전된 아미노산은 양으로 하전된 것이다. 일부 경우에, 하전된 아미노산은 음으로 하전된 것이다.

점 돌연변이는 보존적 돌연변이일 수 있다. 보존적 돌연변이의 비제한적 예는 비극성 지방족 아미노산에서 비극성 지방족 아미노산, 극성 아미노산에서 극성 아미노산, 양으로 하전된 아미노산에서 양으로 하전된 아미노산, 음으로 하전된 아미노산에서 음으로 하전된 아미노산, 및 방향족 아미노산에서 방향족 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 20개의 자연 발생 아미노산은 유사한 특징을 공유할 수 있다. 지방족 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 또는 이소류신일 수 있다. 히드록실 또는 황/셀레늄-함유 아미노산은 세린, 시스테인, 셀레노시스테인, 트레오닌 또는 메티오닌일 수 있다. 시클릭 아미노산은 프롤린일 수 있다. 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판일 수 있다. 염기성 아미노산은 히스티딘, 리신 및 아르기닌일 수 있다. 산성 아미노산은 아스파르테이트, 글루타메이트, 아스파라긴 또는 글루타민일 수 있다. 보존적 돌연변이는 세린에서 글리신, 세린에서 알라닌, 세린에서 세린, 세린에서 트레오닌, 세린에서 프롤린일 수 있다. 보존적 돌연변이는 아르기닌에서 아스파라긴, 아르기닌에서 리신, 아르기닌에서 글루타민, 아르기닌에서 아르기닌, 아르기닌에서 히스티딘일 수 있다. 보존적 돌연변이는 류신에서 페닐알라닌, 류신에서 이소류신, 류신에서 발린, 류신에서 류신, 류신에서 메티오닌일 수 있다. 보존적 돌연변이는 프롤린에서 글리신, 프롤린에서 알라닌, 프롤린에서 세린, 프롤린에서 트레오닌, 프롤린에서 프롤린일 수 있다. 보존적 돌연변이는 트레오닌에서 글리신, 트레오닌에서 알라닌, 트레오닌에서 세린, 트레오닌에서 트레오닌, 트레오닌에서 프롤린일 수 있다. 보존적 돌연변이는 알라닌에서 글리신, 알라닌에서 트레오닌, 알라닌에서 프롤린, 알라닌에서 알라닌, 알라닌에서 세린일 수 있다. 보존적 돌연변이는 발린에서 메티오닌, 발린에서 페닐알라닌, 발린에서 이소류신, 발린에서 류신, 발린에서 발린일 수 있다. 보존적 돌연변이는 글리신에서 알라닌, 글리신에서 트레오닌, 글리신에서 프롤린, 글리신에서 세린, 글리신에서 글리신일 수 있다. 보존적 돌연변이는 이소류신에서 페닐알라닌, 이소류신에서 이소류신, 이소류신에서 발린, 이소류신에서 류신, 이소류신에서 메티오닌일 수 있다. 보존적 돌연변이는 페닐알라닌에서 트립토판, 페닐알라닌에서 페닐알라닌, 페닐알라닌에서 티로신일 수 있다. 보존적 돌연변이는 티로신에서 트립토판, 티로신에서 페닐알라닌, 티로신에서 티로신일 수 있다. 보존적 돌연변이는 시스테인에서 세린, 시스테인에서 트레오닌, 시스테인에서 시스테인일 수 있다. 보존적 돌연변이는 히스티딘에서 아스파라긴, 히스티딘에서 리신, 히스티딘에서 글루타민, 히스티딘에서 아르기닌, 히스티딘에서 히스티딘일 수 있다. 보존적 돌연변이는 글루타민에서 글루탐산, 글루타민에서 아스파라긴, 글루타민에서 아스파르트산, 글루타민에서 글루타민일 수 있다. 보존적 돌연변이는 아스파라긴에서 글루탐산, 아스파라긴에서 아스파라긴, 아스파라긴에서 아스파르트산, 아스파라긴에서 글루타민일 수 있다. 보존적 돌연변이는 리신에서 아스파라긴, 리신에서 리신, 리신에서 글루타민, 리신에서 아르기닌, 리신에서 히스티딘일 수 있다. 보존적 돌연변이는 아스파르트산에서 글루탐산, 아스파르트산에서 아스파라긴, 아스파르트산에서 아스파르트산, 아스파르트산에서 글루타민일 수 있다. 보존적 돌연변이는 글루타민에서 글루타민, 글루타민에서 아스파라긴, 글루타민에서 아스파르트산, 글루타민에서 글루타민일 수 있다. 보존적 돌연변이는 메티오닌에서 페닐알라닌, 메티오닌에서 이소류신, 메티오닌에서 발린, 메티오닌에서 류신, 메티오닌에서 메티오닌일 수 있다. 보존적 돌연변이는 트립토판에서 트립토판, 트립토판에서 페닐알라닌, 트립토판에서 티로신일 수 있다.

추가의 아미노산 돌연변이의 비제한적 예는 A에서 R, A에서 N, A에서 D, A에서 C, A에서 Q, A에서 E, A에서 G, A에서 H, A에서 I, A에서 L, A에서 K, A에서 M, A에서 F, A에서 P, A에서 S, A에서 T, A에서 W, A에서 Y, A에서 V, R에서 N, R에서 D, R에서 C, R에서 Q, R에서 E, R에서 G, R에서 H, R에서 I, R에서 L, R에서 K, R에서 M, R에서 F, R에서 P, R에서 S, R에서 T, R에서 W, R에서 Y, R에서 V, N에서 D, N에서 C, N에서 Q, N에서 E, N에서 G, N에서 H, N에서 I, N에서 L, N에서 K, N에서 M, N에서 F, N에서 P, N에서 S, N에서 T, N에서 W, N에서 Y, N에서 V, D에서 C, D에서 Q, D에서 E, D에서 G, D에서 H, D에서 I, D에서 L, D에서 K, D에서 M, D에서 F, D에서 P, D에서 S, D에서 T, D에서 W, D에서 Y, D에서 V, C에서 Q, C에서 E, C에서 G, C에서 H, C에서 I, C에서 L, C에서 K, C에서 M, C에서 F, C에서 P, C에서 S, C에서 T, C에서 W, C에서 Y, C에서 V, Q에서 E, Q에서 G, Q에서 H, Q에서 I, Q에서 L, Q에서 K, Q에서 M, Q에서 F, Q에서 P, Q에서 S, Q에서 T, Q에서 W, Q에서 Y, Q에서 V, E에서 G, E에서 H, E에서 I, E에서 L, E에서 K, E에서 M, E에서 F, E에서 P, E에서 S, E에서 T, E에서 W, E에서 Y, E에서 V, G에서 H, G에서 I, G에서 L, G에서 K, G에서 M, G에서 F, G에서 P, G에서 S, G에서 T, G에서 W, G에서 Y, G에서 V, H에서 I, H에서 L, H에서 K, H에서 M, H에서 F, H에서 P, H에서 S, H에서 T, H에서 W, H에서 Y, H에서 V, I에서 L, I에서 K, I에서 M, I에서 F, I에서 P, I에서 S, I에서 T, I에서 W, I에서 Y, I에서 V, L에서 K, L에서 M, L에서 F, L에서 P, L에서 S, L에서 T, L에서 W, L에서 Y, L에서 V, K에서 M, K에서 F, K에서 P, K에서 S, K에서 T, K에서 W, K에서 Y, K에서 V, M에서 F, M에서 P, M에서 S, M에서 T, M에서 W, M에서 Y, M에서 V, F에서 P, F에서 S, F에서 T, F에서 W, F에서 Y, F에서 V, P에서 S, P에서 T, P에서 W, P에서 Y, P에서 V, S에서 T, S에서 W, S에서 Y, S에서 V, T에서 W, T에서 Y, T에서 V, W에서 Y, W에서 V, Y에서 V, 및 역으로의 이전에 기재된 돌연변이 중 임의의 것일 수 있다.

상기 언급된 변형, 삽입, 결실 및/또는 돌연변이 중 어느 하나는 AAV 서열 내의 임의의 잔기에서 이루어질 수 있다. 서열은 캡시드 서열일 수 있다. 다른 경우에, 서열은 캡시드 서열이 아니라 Rep 및/또는 X 서열일 수 있다. 서열은 이전에 기재된 바와 같이 VP1, VP2, 및/또는 VP3 내에 존재할 수 있다. 일부 경우에, 서열 변형은 캡시드 서열의 루프, 예컨대 루프 3 및/또는 루프 4의 변형이다. 일부 경우에, 변형은 표 1의 서열의 잔기의 변형이다.

표 1: 예시적인 야생형 AAV 캡시드 폴리펩티드 서열

일부 경우에, 변형, 예컨대 삽입, 결실, 및/또는 돌연변이는 표 1의 캡시드 폴리펩티드 서열의 잔기의 변형, 예컨대 삽입, 결실, 및/또는 돌연변이이다. 일부 경우에, 변형은 1-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 또는 그의 조합이다. 일부 경우에, 변형은 위치 200-300, 300-400, 400-500, 500-600의 잔기 또는 그의 조합 내에 존재한다. 일부 경우에, 변형은 위치 300-500의 잔기 또는 그의 조합 내에 존재한다. 한 측면에서, 삽입 부위는 AAV 캡시드 단백질의 GH 루프, 또는 루프 IV 내, 예를 들어, AAV 캡시드 단백질의 GH 루프, 또는 루프 IV의 용매-접근가능한 부분 내이다. GH 루프에 대해서는, 예를 들어 문헌 [van Vliet et al., (2006) Mol. Ther. 14:809; Padron et al., (2005) J. Virol. 79:5047; 및 Shen et al., (2007) Mol. Ther. 15:1955]을 참조한다. 예를 들어, 삽입 부위는 AAV2의 아미노산 570-611 내, AAV1의 아미노산 571-612 내, AAV5의 아미노산 560-601 내, AAV6의 아미노산 571 내지 612 내, AAV7의 아미노산 572 내지 613 내, AAV8의 아미노산 573 내지 614 내, AAV9의 아미노산 571 내지 612 내, 또는 AAV10의 아미노산 573 내지 614 내이다.

예를 들어, 삽입 부위는 AAV2의 아미노산 587과 588 사이, AAV1의 아미노산 590과 591 사이, AAV5의 아미노산 575와 576 사이, AAV6의 아미노산 590과 591 사이, AAV7의 아미노산 589와 590 사이, AAV8의 아미노산 590과 591 사이, AAV9의 아미노산 588과 589 사이, 또는 AAV10의 아미노산 589와 590 사이일 수 있다. 일부 경우에, 변형은 AAV2의 위치 452, 453, 466, 467, 468, 471, 585, 586, 587, 및/또는 588에 존재한다. 일부 경우에, 변형은 AAV2의 위치 452 또는 453에 존재한다. 일부 경우에, 변형은 AAV2의 위치 587 또는 588에 존재한다. 일부 경우에, 변형은 서열식별번호: 1의 위치 452, 453, 466, 467, 468, 471, 585, 586, 587, 및/또는 588에서의 삽입이다. 일부 경우에, 변형은 돌연변이이고, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 R585A 또는 R588A이다.

일부 실시양태에서, 대상 변형된 AAV 캡시드는 상응하는 비변형된 AAV 캡시드 단백질에 비해 루프 (루프 3 및/또는 4)에서의 약 5개 아미노산 내지 약 11개 아미노산의 삽입 이외에, 임의의 다른 아미노산 변형 돌연변이, 치환, 삽입 또는 결실을 포함하지 않는다. 다른 실시양태에서, 대상 변이체 AAV 캡시드는 비변형된 AAV 캡시드 단백질에 비해 루프 3 및/또는 루프 4에서의 약 5개 아미노산 내지 약 11개 아미노산의 삽입에 더하여, 비변형된 AAV 캡시드 단백질와 비교하여 1 내지 약 25개 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 대상 AAV 비리온 캡시드는 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질에 비해 GH 루프 또는 루프 IV에서의 약 7개 아미노산 내지 약 10개 아미노산의 삽입 이외에, 임의의 다른 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함하지 않는다. 다른 실시양태에서, 대상 AAV 비리온 캡시드는 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질에 비해 GH 루프 또는 루프 IV에서의 약 7개 아미노산 내지 약 10개 아미노산의 삽입에 더하여, 모 AAV 캡시드 단백질과 비교하여 1 내지 약 25개 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 대상 AAV 비리온 캡시드는 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질에 비해 GH 루프 또는 루프 IV에서의 약 7개 아미노산 내지 약 10개 아미노산의 삽입에 더하여, 모 AAV 캡시드 단백질과 비교하여 1 내지 약 5, 약 5 내지 약 10, 약 10 내지 약 15, 약 15 내지 약 20, 또는 약 20 내지 약 25개 아미노산의 삽입, 결실, 또는 치환을 포함한다.

일부 경우에, 키메라 AAV 캡시드가 본원에 제공된다. 키메라 캡시드는 적어도 2개의 AAV 혈청형으로부터의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 키메라 캡시드는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, 및/또는 AAV13으로부터 선택된 서열의 믹스를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 키메라 혈청형은 VP1, VP2, 및/또는 VP3 사이에서 상이하다. 일부 경우에, 키메라 캡시드는 AAV4 및 AAV6, AAV5 및 AAV6, AAV11 및 AAV6, AAV12 및 AAV6, 및 그의 임의의 조합으로부터 선택된 적어도 2종의 혈청형으로부터의 서열을 포함한다. 일부 경우에, 제1 AAV 혈청형은 AAV4일 수 있고, 제2 혈청형은 AAV6일 수 있다. 일부 경우에, 키메라 AAV 벡터의 제1 AAV 혈청형 및 제2 AAV 혈청형은 AAV11 및 AAV6일 수 있다. 일부 경우에, 키메라 AAV 벡터의 제1 AAV 혈청형 및 제2 AAV 혈청형은 AAV12 및 AAV6일 수 있다. 일부 경우에, 키메라 캡시드는 AAV2 및 AAV5 또는 AAV2 및 AAV6으로부터의 서열을 포함한다. 일부 경우에, 키메라 캡시드는 AAV2 및 AAV5, AAV2 및 AAV6, AAV2 및 AAV8, AAV2 및 AAV9, AAV2 및 AAV1, 및 AAV2 및 AAV12로부터의 서열을 포함한다.

본원에 제공된 AAV에 대한 변형은 달리 비변형된 또는 야생형 AAV와 비교하여 변형된 AAV에 증진된 활성을 부여할 수 있다. 본원에 제공된 변형은 세포 형질도입, 향성을 개선시키고/거나 캡시드와 연관된 면역원성을 감소시킬 수 있다.

일부 경우에, 본원에 제공된 변형은 세포 형질도입을 증진시킨다. 세포 형질도입은 세포를 (생체내 또는 시험관내) 감염시키고/거나 트랜스진을 세포 내로 전달하는 AAV의 능력을 지칭할 수 있다.

일부 경우에, 본원에 제공된 변형은 향성을 증진시킨다. 향성 증진은 달리 비변형된 AAV와 비교하여 여분의 수용체를 통해 세포를 형질도입하는 능력을 획득하는 것을 지칭한다. 일부 측면에서, 증진된 향성은 안구 세포의 감염성을 개선시킴으로써, 변형된 AAV의 이용에 의한 유전자 요법을 개선시킬 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 변형은 양극, 망막 신경절, 수평, 무축삭, 상피, 망막 색소, 광수용체, 또는 그의 임의의 조합으로부터 선택된 안구 세포에 대한 향성을 개선시킬 수 있다. 일부 경우에, 변형은 망막 세포에 대한 향성을 개선시킨다.

AAV 벡터가 또한 본원에 제공된다. AAV 벡터는 역전된 말단 반복부 (ITR), Rep, Cap, AAP, 및 X 서열을 포함한다. 전형적으로, AAV 바이러스 게놈은 패키징 신호 및 복제 기점으로서의 역할을 하는 ITR에 플랭킹된다. rep 유전자는 AAVS1에서의 바이러스 전사, 복제, 패키징 및 통합의 제어를 담당하는 다중기능적 단백질 (Rep 단백질)의 패밀리를 코딩한다. AAV2에 대해, 4개의 Rep 단백질이 기재된다. Rep78 및 Rep68의 발현은 AAV2-특이적 p5 프로모터에 의해 제어되는 한편, p19는 보다 소형의 Rep 단백질 (Rep52 및 Rep40)의 발현을 제어한다. Rep68 및 Rep40은 각각 Rep78 및 Rep52의 스플라이스 변이체이다. 숫자는 분자량을 나타낸다. 모두 cap 유전자에서 코딩되는 AAP 및 바이러스 캡시드 단백질 VP1 (90 kDa), VP2 (72 kDa) 및 VP3 (60 kDa)의 발현은 p40 프로모터에 의해 제어된다. X 유전자는 cap 유전자와 공유된 영역 내의 게놈의 3' 단부에 위치하고, 그 자체의 프로모터 (p81)를 보유한다. X 단백질은 바이러스 복제를 증진시키는 것으로 보이지만, AAP는 캡시드 어셈블리에 필수적이다. 3개의 상이한 VP는 이십면체 AAV2 캡시드에 1 (VP1):1 (VP2):10 (VP3) 비로 기여한다.

본원에 개시된 변형된 캡시드 단백질은 단리, 예를 들어 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 변형된 캡시드는 AAV 벡터 또는 AAV 비리온 (예를 들어 재조합 AAV 비리온 rAAV)에 포함된다. 다른 실시양태에서, 이러한 변형된 AAV 벡터 및/또는 AAV 변이체 비리온은 영장류 망막, 예를 들어 인간 망막에서 안구 질환을 치료하는 생체내 또는 생체외 방법에 사용된다.

변형된 AAV 캡시드를 포함하는 벡터가 또한 본원에 제공된다. 이전에 기재된 변형 중 어느 하나는 본원에 제공된 벡터에 포괄될 수 있다. 일부 경우에, AAV 벡터는 외인성 서열이 결여된 달리 대등한 AAV 캡시드 서열과 비교하여 VP 도메인의 적어도 2개의 루프 내에 외인성 서열을 포함하는 변형된 캡시드를 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 제공된 벡터는 트랜스진 서열을 추가로 포함할 수 있다.

또한, WT 캡시드 단백질로부터 AAV 캡시드를 변형시키는 방법이 본원에 개시된다. 변형된 캡시드를 제조하는 예시적인 방법은 본원의 실시예 2에 기재되어 있다. 일부 경우에, 돌연변이를 포함하는 변형된 캡시드를 제조하는 방법은 WT 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 폴리머라제 연쇄 반응 돌연변이유발, 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발, 포화 돌연변이유발, 루프-스와핑 돌연변이유발, 단편 셔플링 돌연변이유발 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 유형의 돌연변이유발에 적용하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 대상 AAV cap에서의 돌연변이는 임의의 공지된 방법을 사용하여 생성된다. AAV cap 유전자의 돌연변이유발에 적합한 방법은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)-기반 방법, 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 돌연변이를 생성하는 방법은 관련 기술분야에 널리 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Zhao et al., (1998) Nat. Biotechnol. 16:234-235]; 미국 특허 번호 6,579,678; 6,573,098; 및 6,582,914를 참조한다.

한 측면에서, 본원에 개시된 돌연변이체 캡시드는 AAV 라이브러리 및/또는 라이브러리들의 사용을 통해 생성될 수 있다. 이러한 AAV 라이브러리 또는 라이브러리들은 다양한 방향적 진화 방법에 의해 AAV 캡시드의 구조 단백질을 코딩하는 유전자인 cap 유전자를 돌연변이시키는 것에 의해 생성되며, 예를 들어 문헌 [Bartel et al., Am. Soc. Gene Cell Ther. l5th Annu. Meet. 20, S140 (2012); Bowles, D. et al., J. Virol. 77, 423-432 (2003); Gray et al., Mol. Ther. 18, 570-578 (2010); Grimm, D. et al., J. Virol. 82, 5887-5911; Koerber, J. T. et al., Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008); Li W. et al., Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008); Koerber, J. T. et al., Methods Mol. Biol. 434, 161- 170 (2008); Koerber, J. T. et al., Hum. Gene Ther. 18, 367-378 (2007); 및 Koerber, J. T. et al., Mol. Ther. 17, 2088-2095 (2009)]을 참조한다. 이러한 기술은, 비제한적으로, 하기와 같다: i) 무작위 점 돌연변이를 미리 결정된, 변형가능한 비율로 AAV cap 오픈 리딩 프레임 (ORF) 내로 도입하기 위한 오류-유발 PCR; ii) AAV cap 유전자의 무작위 키메라를 생성하여 다중 AAV 혈청형을 갖는 유전자 라이브러리를 수득하기 위한 시험관내 또는 생체내 바이러스 재조합 또는 "DNA 셔플링"; iii) cap ORF 내의 축중성 올리고뉴클레오티드의 라이게이션에 의한 캡시드의 규정된 부위에서의 무작위 펩티드 삽입; iv) 트랜스포손 돌연변이유발을 사용한 AAV cap ORF의 무작위 위치 내로의 펩티드-코딩 서열의 규정된 삽입; v) "루프-스와프" 라이브러리를 생성하기 위한 천연 AAV 혈청형 및 변이체 사이의 각각의 아미노산 위치의 보존 수준에 기초하여 생물정보적으로 설계된 펩티드 서열의 라이브러리로의 AAV 캡시드의 표면 루프의 대체; vi) 조상 변이체의 라이브러리를 생성하기 위한 AAV 혈청형 사이의 축중성 위치에서의 무작위 아미노산 치환 (Santiago-Ortiz et al., 2015); 및 이러한 기술의 조합.

일부 실시양태에서, 변형된 캡시드는 시차를 둔 연장 과정을 사용하여 생성될 수 있다. 시차를 둔 연장 과정은 PCR-기반 방법을 사용한 cap 유전자의 증폭을 수반한다. 주형 cap 유전자를 특이적 PCR 프라이머를 사용하여 프라이밍한 후, 변성 및 매우 짧은 어닐링/폴리머라제-촉매된 연장 사이클을 반복한다. 각각의 사이클에서, 성장하는 단편은 서열 상보성을 기초로 상이한 주형에 어닐링되고, 추가로 연장된다. 변성, 어닐링 및 연장 사이클은 전장 서열이 형성될 때까지 반복된다. 생성된 전장 서열은 야생형 AAV cap 유전자와 비교하여 cap 유전자에 적어도 1개의 돌연변이를 포함한다. 1개 이상의 돌연변이를 포함하는 AAV cap 서열을 포함하는 PCR 생성물은 야생형 AAV 게놈을 함유하는 플라스미드 내로 삽입된다. 그 결과는 AAV cap 돌연변이체의 라이브러리이다. 따라서, 본 개시내용은 약 10 내지 약 10¹⁰개의 구성원을 포함하고, AAV cap 유전자 내에 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 AAV cap 유전자 라이브러리를 제공한다. 주어진 라이브러리의 구성원은 AAV cap 유전자에 약 1 내지 약 50개의 돌연변이를 갖는다. 대상체 라이브러리는 각각 AAV cap 유전자에서 상이한 돌연변이(들)를 갖는 10 내지 약 10⁹개의 별개의 구성원을 포함한다. cap 돌연변이체 라이브러리가 생성되면, 변경된 캡시드 특성에 기초하여 선택될 수 있는 바이러스 입자가 생산된다. 라이브러리 플라스미드 DNA로 적합한 대상 숙주 세포 (예를 들어, 293 세포 및/또는 ARPE-19 세포)를 형질감염시킨 후, 세포 내로 헬퍼 바이러스를 도입한다. 형질감염된 숙주 세포에 의해 생산된 바이러스 입자 ("AAV 라이브러리 입자)를 수집한다.

한 측면에서, AAV 라이브러리 또는 라이브러리들이 생성되면, 각각의 AAV 입자가 캡시드를 코딩하는 cap 유전자를 둘러싸는 변형된 캡시드를 구성하도록 비리온이 패키징되고, 정제된다. 일부 경우에, 변형을 포함하는 라이브러리의 변이체는 이어서 AAV 분야의 통상의 기술자에게 공지되고 용이하게 이용가능한 시험관내 및/또는 생체내 선택 압력 기술에 적용된다. 예를 들어, 문헌 [Maheshri, N. et al., Nature Biotech. 24, 198-204 (2006); Dalkara, D. et al., Sci. Transl. Med. 5, l89ra76 (2013); Lisowski, L. et al., Nature. 506, 382-286 (2013); Yang, L. et al., PNAS. 106, 3946-3951 (2009); Gao, G. et al., Mol. Ther. 13, 77-87 (2006); 및 Bell, P. et al., Hum. Gene. Ther. 22, 985-997 (2011)]을 참조한다. 예를 들어, 비제한적으로, 변형된 AAV는 i) 상이한 분획의 용리가 변경된 결합 특성을 갖는 변이체를 생성하는 친화도 칼럼; ii) 증가된 효율 및/또는 조직 특이성을 갖는 AAV 변이체를 생성하는 - 인간 신체 내의 세포의 거동을 모방하는 조직 샘플 또는 불멸 세포주로부터 단리된 - 1차 세포; iii) 성공적으로 감염된 표적 조직을 갖는 AAV 변이체를 생성하는 - 임상 유전자 요법 환경을 모방하는 - 동물 모델; iv) 감염된 그라프트된 인간 세포를 갖는 대상 변형을 포함하는 AAV 변이체를 생성하는 인간 이종이식편 모델; 및/또는 그의 선택 기술의 조합을 사용하여 선택될 수 있다. 비리온이 선택되면, 이는 공지된 기술, 예컨대 비제한적으로 아데노바이러스-매개된 복제, PCR 증폭, 차세대 서열분석 및 클로닝 등에 의해 회수될 수 있다. 이어서, 바이러스 클론은 반복된 라운드의 선택 기술을 통해 풍부화되고, 선택된 관심 변이체 cap 유전자를 회수하기 위해 AAV DNA가 단리된다. 이러한 선택된 변이체는 추가의 변형 또는 돌연변이에 적용될 수 있고, 따라서 이는 AAV 바이러스 적합도를 반복적으로 증가시키기 위한 추가의 선택 단계를 위한 새로운 출발점으로서의 역할을 한다. 그러나, 특정 경우에, 성공적인 캡시드는 추가의 돌연변이 없이 생성되었다.

본원에 개시된 대상 변형된 AAV는 유리체내 투여 후 영장류 망막 스크린의 사용을 수반하는 생체내 방향적 진화의 사용을 통해 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 변형된 캡시드 단백질은, AAV 비리온에 존재하는 경우에, 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질 또는 야생형 AAV를 포함하는 AAV 비리온에 의한 망막 세포의 형질도입과 비교하여 망막 세포의 증가된 형질도입을 부여한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 변이체 캡시드 단백질은, AAV 비리온에 존재하는 경우에, 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질 또는 야생형 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온보다 영장류 망막 세포의 보다 효율적인 형질도입을 부여하고, 예를 들어 망막 세포는 모 AAV 캡시드 단백질 또는 야생형 AAV를 포함하는 AAV 비리온보다 대상 변이체 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온을 보다 많이 흡수한다.

또한, 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 대상 방법은 달리 대등한 비변형된 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드와 비교하여 AAV 캡시드의 VP 도메인 내에 외인성 폴리펩티드 서열을 포함하는 변형된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터를 포함하는 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 외인성 폴리펩티드 서열은 식 1의 서열: X0-X1-X2-X1-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 108)를 포함하고, 여기서 X0은 발린 (V), 이소류신 (I), 류신 (L), 페닐알라닌 (F), 트립토판 (W), 티로신 (Y) 또는 메티오닌 (M)이고, 여기서 X1은 알라닌 (A), 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q), 세린 (S), 트레오닌 (T), 글루탐산 (E), 아스파르트산 (D), 리신 (K), 아르기닌 (R), 또는 히스티딘 (H)이고, 여기서 X2는 V, I, L, 또는 M이고, 여기서 X3은 E, S, 또는 Q이고, 여기서 X4는 K, R, E, 또는 A이고, 임의로 여기서 식 1은 프롤린 (P) 또는 R인 X5를 추가로 포함한다.

일부 경우에, 대상 AAV 벡터는 서열식별번호: 28-서열식별번호: 47에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, AAV 벡터는 서열식별번호: 34의 변형된 캡시드를 포함한다.

또한, 변형된 AAV 캡시드를 포함하는 조작된 AAV 비리온이 본원에 제공된다. 조작된 AAV 비리온은 rAAV 벡터 복제 및 패키징을 위해 숙주 또는 "생산자" 세포를 이용하여 생성될 수 있다. 이러한 생산자 세포 (통상적으로 포유동물 숙주 세포)는 일반적으로 rAAV 생산을 위한 여러 상이한 유형의 성분을 포함하거나 또는 이를 포함하도록 변형된다. 제1 성분은 숙주 패키징 세포에 의해 벡터 입자로 복제 및 패키징될 수 있는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터 게놈 (또는 "조작된 AAV")이다. rAAV 프로-벡터는 유전자 요법과 관련하여 또 다른 세포를 유전자 변경시키는 것을 목적으로 하는 대상 트랜스진을 포함할 수 있다 (이러한 트랜스진의 rAAV 벡터 입자 내로의 패키징은 트랜스진을 다양한 포유동물 세포에 전달하는 데 효과적으로 사용될 수 있기 때문임). 트랜스진은 일반적으로 AAV 벡터의 절제, 복제 및 패키징 동안, 뿐만 아니라 벡터의 숙주 세포 게놈 내로의 통합 동안 인식되는 서열을 포함하는 2개의 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR)에 플랭킹된다.

또 다른 성분은 AAV 복제를 위한 헬퍼 기능을 제공할 수 있는 헬퍼 바이러스일 수 있다. 아데노바이러스가 통상적으로 사용되지만, 다른 헬퍼 바이러스가 또한 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 사용될 수 있다. 대안적으로, 필수적인 헬퍼 바이러스 기능은 헬퍼 바이러스로부터 유전적으로 단리될 수 있고, 코딩 유전자는 헬퍼 바이러스 기능을 트랜스로 제공하는 데 사용될 수 있다. AAV 벡터 요소 및 헬퍼 바이러스 (또는 헬퍼 바이러스 기능)는 숙주 세포 내로 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 도입될 수 있다.

생산자 세포에 제공될 AAV 생산을 위한 추가의 성분은 "AAV 패키징 유전자", 예컨대 각각 복제 및 캡시드화 단백질을 제공하는 AAV rep 및 cap 유전자이다. AAV 패키징 유전자의 여러 상이한 버전이 제공될 수 있다 (rep-cap 카세트 및 별개의 rep 및/또는 cap 카세트를 포함하고, 여기서 rep 및/또는 cap 유전자는 천연 프로모터의 제어 하에 놓일 수 있거나 또는 이종 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있음). 이러한 AAV 패키징 유전자는 관련 기술분야에 공지되고 하기에 보다 상세히 기재된 바와 같이 숙주 패키징 세포 내로 일시적으로 또는 안정하게 도입될 수 있다.

본원의 개시내용은 숙주 세포, 예컨대 비제한적으로 대상 핵산을 포함하는 단리된 (유전자 변형된) 숙주 세포를 추가로 제공한다. 본원에 개시된 본 발명에 따른 숙주 세포는 단리된 세포, 예컨대 시험관내 세포 배양물로부터의 세포일 수 있다. 이러한 숙주 세포는 본원에 기재된 바와 같은 대상 변형된 AAV 비리온을 생산하는 데 유용하다. 한 실시양태에서, 이러한 숙주 세포는 핵산으로 안정하게 유전자 변형된다. 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 핵산으로 일시적으로 유전자 변형된다. 이러한 핵산은 전기천공, 인산칼슘 침전, 리포솜-매개된 형질감염 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 확립된 기술을 사용하여 숙주 세포 내로 안정하게 또는 일시적으로 도입된다. 안정한 형질전환을 위해, 핵산은 일반적으로 선택 마커, 예를 들어 몇몇 널리 공지된 선택 마커 중 임의의 것, 예컨대 네오마이신 저항성 등을 추가로 포함할 것이다. 이러한 숙주 세포는 임의의 다양한 세포, 예를 들어 뮤린 세포 및 영장류 세포 (예를 들어, 인간 세포)를 비롯한 예를 들어 포유동물 세포 내로 핵산을 도입함으로써 생성된다. 예시적인 포유동물 세포는 1차 세포 및 세포주를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 여기서 예시적인 세포주는 293 세포, COS 세포, HeLa 세포, 베로 세포, 3T3 마우스 섬유모세포, C3H10T1/2 섬유모세포, CHO 세포 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 숙주 세포는 비제한적으로 HeLa 세포 (예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) No. CCL-2), CHO 세포 (예를 들어, ATCC No. CRL9618, CCL61, CRL9096), 293 세포 (예를 들어, ATCC No. CRL-1573), 베로 세포, NIH 3T3 세포 (예를 들어, ATCC No. CRL-1658), Huh-7 세포, BHK 세포 (예를 들어, ATCC No. CCL10), PC12 세포 (ATCC No. CRL1721), COS 세포, COS-7 세포 (ATCC No. CRL1651), RAT1 세포, 마우스 L 세포 (ATCC No. CCLI.3), 인간 배아 신장 (HEK) 세포 (ATCC No. CRL1573), HLHepG2 세포 등을 포함한다. 숙주 세포는 또한 바큘로바이러스를 사용하여 AAV를 생산하는 곤충 세포, 예컨대 Sf9 세포를 감염시켜 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 7,271,002; 미국 특허 출원 일련 번호 12/297,958 참조). 일부 실시양태에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 상기 기재된 바와 같은 변이체 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 더하여, 1개 이상의 AAV rep 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 대상 벡터를 추가로 포함한다. 대상 변형된 비리온은 이러한 숙주 세포를 사용하여 생성될 수 있다. 비리온을 생성하는 방법은 예를 들어 미국 특허 공개 번호 2005/0053922 및 미국 특허 공개 번호 2009/0202490에 기재되어 있다.

일부 경우에 트랜스진을 포함하는 대상 조작된 AAV 비리온은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법론을 사용하여 생산될 수 있다. 방법은 일반적으로 (1) 대상 조작된 AAV 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계; (2) AAV 헬퍼 구축물을 숙주 세포 내로 도입하는 단계이며, 여기서 헬퍼 구축물은 숙주 세포에서 발현될 수 있는 AAV 코딩 영역을 포함하여 AAV 벡터로부터 누락된 AAV 헬퍼 기능을 보완하는 것인 단계; (3) 1종 이상의 헬퍼 바이러스 및/또는 보조 기능 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계이며, 여기서 헬퍼 바이러스 및/또는 보조 기능 벡터는 숙주 세포에서 효율적인 재조합 AAV ("rAAV") 비리온 생산을 지지할 수 있는 보조 기능을 제공하는 것인 단계; 및 (4) 숙주 세포를 배양하여 조작된 AAV 비리온을 생산하는 단계를 수반한다. AAV 발현 벡터, AAV 헬퍼 구축물 및 헬퍼 바이러스 또는 보조 기능 벡터(들)는 표준 형질감염 기술을 사용하여 동시에 또는 연속적으로 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. AAV 발현 벡터는 공지된 기술을 사용하여, 전사 방향으로 작동가능하게 연결된 성분으로서 적어도 전사 개시 영역을 포함하는 제어 요소, 관심 DNA 및 전사 종결 영역를 제공하기 위해 구축된다. 제어 요소는 포유동물 근육 세포에서 기능적이도록 선택될 수 있다. 작동가능하게 연결된 성분을 함유하는 생성된 구축물은 기능적 AAV ITR 서열과 결합될 수 있다 (5' 및 3').

일부 경우에, AAV ITR의 공지된 뉴클레오티드 서열이 이용될 수 있으며, 예를 들어, AAV-2 서열에 대해 문헌 [Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Berns, K. I. "Parvoviridae and their Replication" in Fundamental Virology, 2nd Edition, (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.)]을 참조한다. 일부 측면에서, 본원에 제공된 조성물 및 방법에 사용된 AAV ITR은 야생형 뉴클레오티드 서열을 가질 필요가 없고, 예를 들어 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변형될 수 있다. 추가적으로, AAV ITR은 본원에 제공된 여러 AAV 혈청형 중 임의의 것, 예컨대 비제한적으로 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-7 등으로부터 유래될 수 있다. 또한, AAV 발현 벡터에서 선택된 뉴클레오티드 서열에 플랭킹된 5' 및 3' ITR은 이들이 의도된 바와 같이, 즉 숙주 세포 게놈 또는 벡터로부터 관심 서열의 절제 및 구출을 가능하게 하고, AAV Rep 유전자 생성물이 세포 내에 존재하는 경우에 수용자 세포 게놈 내로의 DNA 분자의 통합을 가능하게 하는 기능을 하는 한, 반드시 동등하거나 또는 동일한 AAV 혈청형 또는 분리주로부터 유래될 필요는 없다. ITR은 Rep 단백질의 적절한 혼합물의 존재 하에 벡터 서열의 복제를 가능하게 한다. ITR은 또한 벡터 서열이 캡시드 내로 혼입되어 AAV 입자를 생성하는 것을 가능하게 한다.

본 개시내용은 변경된 캡시드 단백질을 갖는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 비리온을 제공하며, 여기서 AAV 비리온은 유리체내 주사를 통해 투여되는 경우에 비변형된 AAV, 예컨대 야생형 AAV와 비교하여 안구 세포의 보다 큰 감염성을 나타낸다. 본 개시내용은 트랜스진을 세포, 예컨대 망막 세포에 전달하는 방법, 및 안구 질환을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 망막 세포는 광수용체 (예를 들어, 간상; 원추), 망막 신경절 세포 (RGC), 뮐러 세포 (뮐러 신경교 세포), 양극 세포, 무축삭 세포, 수평 세포, 또는 망막 색소 상피 (RPE) 세포일 수 있다.

변형된 캡시드를 포함하는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 포함하는 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 경우에, 변형된 캡시드는 외인성 폴리펩티드 서열이 결여된 달리 대등한 AAV 캡시드 서열과 비교하여 VP 도메인의 적어도 2개의 루프 내에 외인성 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 외인성 폴리펩티드 서열은 표 2의 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 AAV 벡터는 트랜스진을 포함하는 서열을 추가로 포함한다. 또한, 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 포함하는 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 방법이 제공된다. 대상 AAV 벡터는 (a) 외인성 서열이 결여된 달리 대등한 AAV 캡시드 서열과 비교하여 VP 도메인의 적어도 2개의 루프 내에 외인성 서열을 포함하는 변형된 캡시드; 및/또는 (b) 트랜스진을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 벡터는, 복수의 세포와의 접촉 시, (a)가 결여된 달리 대등한 AAV 벡터와 복수의 세포를 접촉시킨 경우와 비교하여 복수의 세포에서 형질감염 후 트랜스진의 적어도 3배, 4-배, 5-배, 10-배, 15-배, 30-배, 60-배, 또는 100-배 증가된 발현을 갖는다. 일부 경우에, 증가된 발현은 (a)가 결여된 달리 대등한 AAV 벡터와 복수의 세포를 접촉시킨 경우와 비교하여 적어도 5-배, 10-배, 20-배, 50-배, 100-배, 200-배 또는 500-배 증가를 포함한다.

복수의 대상 AAV 비리온을 포함하는 조성물이 또한 본원에 제공된다. 세포를 대상 AAV 벡터 또는 대상 AAV 비리온으로 형질감염시킴으로써 생성된 조작된 세포가 또한 제공된다. 일부 측면에서, 바이러스 입자는 대상 조작된 세포로부터 단리될 수 있다. 조작된 세포로부터 단리된 복수의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 입자가 또한 제공될 수 있다. 추가적으로, 아데노-연관 바이러스 입자를 단위 투여 형태로 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 경우에, 대상 조성물은 동결보존될 수 있다.

또한 트랜스진이 본원에 제공된다. 적합한 트랜스진은 질환의 치료에 사용되는 단백질을 코딩하는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 측면에서 질환은 안구 질환이다. 또 다른 예에서, 적합한 질환은 망막 질환일 수 있다. 일부 측면에서, 트랜스진은 치료제, 예컨대 안구 치료제를 코딩할 수 있다. 안구 치료제는 적어도 질환, 예컨대 안구 질환의 증상을 감소시키는 데 효과적일 수 있다. 일부 측면에서, 치료제는 적어도 망막 질환의 증상을 감소시키거나, 망막 질환을 치료하거나, 또는 망막 질환을 제거하는 데 효과적일 수 있다. 적합한 안구 치료제는 항체 또는 그의 생물학적 활성 단편 및/또는 생물제제를 지칭할 수 있다. 항체 및 생물제제의 표적은 PDGF-BB, C5 보체, C3 보체, TNF-알파, VEGF-A, VEGFR01, DDIT4, KSP, PEDF, VEGF, VEGFL, 트롬보스폰딘-1, CD47, 알파 5 베타 1 인테그린, 엔도스타티스 안지오스타틴, 병리학적 혈관, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 안구 치료제는 항체 또는 그의 생물학적 활성 단편이다. 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 일부 경우에, 항체는 완전 인간 또는 인간화 항체일 수 있다. 적합한 항체는 항-VEGF, 항-VEGFL, 항-트롬보스폰딘-1, 항-CD47, 항-TNF-알파, 항-CD20, 항-CD52, 및 항-CD11a, 항-보체 5, 및/또는 항-보체 3일 수 있다. 일부 경우에, 항체 또는 생물학적 활성 단편은 리툭시맙, 인플릭시맙, 라니비주맙, 베바시주맙, JSM6427, 및/또는 콘베르셉트를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 항체는 라니비주맙의 단일-쇄 버전 (sc-라니비주맙)이다. 라니비주맙은 VEGF-A의 모든 이소형에 결합하여 이를 차단하는 모노클로날 IgG1 항체 단편 (Fab)이다. 라니비주맙은 박테리아에서 불변 경쇄 (CL)와 불변 중쇄 1 (CH1) 도메인 사이에 디술피드 결합에 의해 연결된 2개의 별개의 쇄 (경쇄 및 중쇄)로서 발현된다. 유리체내 라니비주맙의 승인된 용량은 적응증에 따라 0.05 mL 중 0.3 또는 0.5 mg이다. 라니비주맙은 습성 연령-관련 황반 변성, 망막 정맥 폐쇄 후 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종 및 당뇨병성 망막병증의 치료를 위해 승인되었다.

일부 경우에, 안구 치료제는 생물제제이다. 일부 측면에서, 생물제제는 거대분자, 예컨대 단백질, 펩티드, 압타머, 및/또는 비-번역된 RNA, 예컨대 안티센스 RNA, 리보자임, RNAi 및 siRNA로부터 선택된다. 일부 측면에서, 본원에 제공된 조성물, 예컨대 변형된 캡시드를 포함하는 AAV 비리온은 치료제를 코딩하는 트랜스진을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 간섭 RNA이다. 일부 실시양태에서, 치료제는 압타머이다. 일부 실시양태에서, 치료제는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 치료제는 유전자 기능의 부위-특이적 녹-다운을 제공하는 부위-특이적 뉴클레아제이다.

일부 경우에, 생물제제는 DNA 압타머, RNA 압타머, 이중 siRNA, 유전자, 폴리펩티드, 또는 단백질 스캐폴드이다. 일부 경우에, 생물제제는 지단백질 리파제, 레티노이드 이소머로히드롤라제 RPE65, 또는 보체 H로부터 선택된다. 일부 경우에, 생물제제는 VEGF-A를 표적화하는 siRNA, 예를 들어 베바시라닙을 포함한다. 일부 경우에, 생물제제는 RNA 압타머, 예컨대 페갑타닙이다. 일부 경우에, 생물제제는 폴리펩티드, 예컨대 융합 단백질, 예컨대 아플리베르셉트이다. 일부 경우에, 생물제제는 DNA 압타머, 예컨대 포비스타이다. 일부 경우에, 생물제제는 단백질 스캐폴드 예컨대 DARPin이다.

한 측면에서, 생물제제는 아플리베르셉트이다. 아플리베르셉트는 인간 IgG1의 Fc 부분에 융합된 인간 VEGF 수용체 1 및 2의 세포외 도메인을 포함하는 재조합 융합 단백질일 수 있다. 아플리베르셉트는 천연 수용체보다 더 큰 친화도로 VEGF-A 및 PDGF에 결합하는 가용성 디코이 수용체로서 작용한다. 유리체내 아플리베르셉트 주사의 승인된 용량은 2.0 mg이고, 그의 용량은 적응증에 따라 달라진다. 아플리베르셉트는 신생혈관 (습성) 연령-관련 황반 변성, 망막 정맥 폐쇄 후 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종 및 당뇨병성 망막병증의 치료를 위해 지시된다.

일부 측면에서, 생물학적 치료제는 압타머이고, 예시적인 관심 압타머는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 대한 압타머를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Ng et al., (2006) Nat. Rev. Drug Discovery 5:123; 및 Lee et al., (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:18902]을 참조한다. 예를 들어, VEGF 압타머는 뉴클레오티드 서열 5'-cgcaaucagugaaugcuuauacauccg-3' (서열식별번호: 109)를 포함할 수 있다. PDGF-특이적 압타머, 예를 들어, E10030이 또한 사용하기에 적합하며; 예를 들어, 문헌 [Ni and Hui (2009) Ophthalmologica 223:401; 및 Akiyama et al., (2006) J. Cell Physiol. 207:407)]을 참조한다.

일부 측면에서, 생물학적 치료제는 간섭 RNA (RNAi)이고, 적합한 RNAi는 세포에서 아폽토시스 또는 혈관신생 인자의 수준을 감소시킬 수 있는 RNAi를 포함한다. 예를 들어, RNAi는 세포에서 아폽토시스를 유도하거나 촉진하는 유전자 생성물의 수준을 감소시키는 shRNA 또는 siRNA일 수 있다. 유전자 생성물이 아폽토시스를 유도하거나 촉진하는 유전자는 본원에서 "아폽토시스촉진 유전자"로 지칭되고, 그러한 유전자의 생성물 (mRNA; 단백질)은 "아폽토시스촉진 유전자 생성물"로 지칭된다. 아폽토시스촉진 유전자 생성물은, 예를 들어 Bax, Bid, Bak 및 Bad 유전자 생성물을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 7,846,730을 참조한다. 간섭 RNA도 또한 혈관신생 생성물, 예를 들어 VEGF (예를 들어, Cand5; 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2011/0143400; 미국 특허 공개 번호 2008/0188437; 및 문헌 [Reich et al., (2003) Mol. Vis. 9:210] 참조), VEGFR1 (예를 들어, Sirna-027; 예를 들어, 문헌 [Kaiser et al., (2010) Am. J. Ophthalmol. 150:33; 및 Shen et al., (2006) Gene Ther. 13:225] 참조), 또는 VEGFR2 (Kou et al., (2005) Biochem. 44:15064)에 대한 것일 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 6,649,596, 6,399,586, 5,661,135, 5,639,872, 및 5,639,736; 및 미국 특허 번호 7,947,659 및 7,919,473을 참조한다.

일부 경우에, 생물제제는 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드는 망막 세포의 기능, 예를 들어 간상 또는 원추 광수용체 세포, 망막 신경절 세포, 뮐러 세포, 양극 세포, 무축삭 세포, 수평 세포, 또는 망막 색소 상피 세포의 기능을 증진시킬 수 있다. 예시적인 폴리펩티드는 신경보호 폴리펩티드 (예를 들어, GDNF, CNTF, NT4, NGF, 및 NTN); 항혈관신생 폴리펩티드 (예를 들어, 가용성 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 수용체; VEGF-결합 항체; VEGF-결합 항체 단편 (예를 들어, 단일 쇄 항-VEGF 항체); 엔도스타틴; 툼스타틴; 안지오스타틴; 가용성 Flt 폴리펩티드 (Lai et al., (2005) Mol. Ther. 12:659); 가용성 Flt 폴리펩티드를 포함하는 Fc 융합 단백질 (예를 들어, 문헌 [Pechan et al., (2009) Gene Ther. 16:10] 참조); 색소 상피-유래 인자 (PEDF); 가용성 Tie-2 수용체 등); 메탈로프로테이나제 조직 억제제-3 (TIMP-3); 광-반응성 옵신, 예를 들어 로돕신; 항아폽토시스 폴리펩티드 (예를 들어, Bcl-2, Bcl-X1) 등을 포함한다. 적합한 폴리펩티드는 신경교세포 유래 신경영양 인자 (GDNF); 섬유모세포 성장 인자 2; 뉴르투린 (NTN); 섬모 신경영양 인자 (CNTF); 신경 성장 인자 (NGF); 뉴로트로핀-4 (NT4); 뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF); 표피 성장 인자; 로돕신; 아폽토시스의 X-연관 억제제; 및 소닉 헤지호그를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

일부 경우에, 폴리펩티드는 레티노스키신, 색소성 망막염 GTPase 조절인자 (RGPR)-상호작용 단백질-1 (예를 들어, 진뱅크(GenBank) 수탁 번호 Q96KN7, Q9EPQ2, 및 Q9GLM3 참조), 페리페린-2 (Prph2) (예를 들어, 진뱅크 수탁 번호 NP_000313 참조, 페리페린, 망막 색소 상피-특이적 단백질 (RPE65) (예를 들어, 진뱅크 AAC39660; 및 문헌 [Morimura et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3088] 참조), 결손 또는 누락 시, 맥락막결손을 유발하는 폴리펩티드인 (예를 들어, 문헌 [Donnelly et al., (1994) Hum. Mol. Genet. 3:1017; 및 van Bokhoven et al., (1994) Hum. Mol. Genet. 3:1041] 참조) CHM (맥락막결손 (랩 에스코트(Rab escort) 단백질 1)); 및 결손 또는 누락 시, 레베르 선천성 흑암시 및 색소성 망막염을 유발하는 폴리펩티드인 (예를 들어, 문헌 [den Hollander et al., (1999) Nat. Genet. 23:217; 및 진뱅크 수탁 번호 CAM23328 참조) 크룸스(Crumbs) 상동체 1 (CRB1)을 포함할 수 있다. 적합한 폴리펩티드는 또한 결손 또는 누락 시 완전색맹으로 이어지는 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 이러한 폴리펩티드는, 예를 들어 원추 광수용체 cGMP-게이팅 채널 서브유닛 알파 (CNGA3) (예를 들어, 진뱅크 수탁 번호 NP_001289; 및 문헌 [Booij et al., (2011) Ophthalmology 118:160-167] 참조); 원추 광수용체 cGMP-게이팅 양이온 채널 베타-서브유닛 (CNGB3) (예를 들어, 문헌 [Kohl et al., (2005) Eur J Hum Genet. 13(3):302] 참조); 구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질 (G 단백질), 알파 형질도입 활성 폴리펩티드 2 (GNAT2) (ACHM4); 및 ACHM5; 및 결손 또는 결여 시 다양한 형태의 색맹으로 이어지는 폴리펩티드를 포함한다.

일부 경우에, 생물제제는 유전자 기능의 부위-특이적 녹-다운을 제공하는 부위-특이적 엔도뉴클레아제를 포함하며, 예를 들어 여기서 엔도뉴클레아제는 망막 질환과 연관된 대립유전자를 녹아웃시킨다. 예를 들어, 우성 대립유전자가, 야생형일 때 망막 구조 단백질이고/거나 정상 망막 기능을 제공하는 유전자의 결손 카피를 코딩하는 경우에, 부위-특이적 엔도뉴클레아제는 결손 대립유전자에 표적화되어 결손 대립유전자를 녹아웃시킬 수 있다. 결손 대립유전자를 녹아웃시키는 것에 더하여, 부위-특이적 뉴클레아제는 또한 결손 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질의 기능적 카피를 코딩하는 공여자 DNA와의 상동 재조합을 자극하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 대상 AAV 비리온은 결손 대립유전자를 녹아웃시키는 부위-특이적 엔도뉴클레아제를 전달하는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 또한 결손 대립유전자의 기능적 카피를 전달하는 데에도 사용되어 결손 대립유전자의 복구를 발생시킴으로써, 기능적 망막 단백질 (예를 들어, 기능적 레티노스키신, 기능적 RPE65, 기능적 페리페린 등)의 생산을 제공할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Li et al., (2011) Nature 475:217]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 대상 AAV 비리온은 부위-특이적 엔도뉴클레아제를 코딩하는 트랜스진; 및 결손 대립유전자의 기능적 카피를 코딩하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 기능적 카피는 기능적 망막 단백질을 코딩한다. 기능적 망막 단백질은 예를 들어 레티노스키신, RPE65, 색소성 망막염 GTPase 조절제 (RGPR)-상호작용 단백질-1, 페리페린, 페리페린-2 등을 포함한다. 사용하기에 적합한 부위-특이적 엔도뉴클레아제는, 예를 들어 CRISPR, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN); 및 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)를 포함하며, 여기서 이러한 부위-특이적 엔도뉴클레아제는 비-자연 발생이고, 특정 유전자를 표적화하도록 변형된다. 이러한 부위-특이적 뉴클레아제는 게놈 내의 특이적 위치를 절단하도록 조작될 수 있고, 이어서 비-상동 말단 연결은 여러 뉴클레오티드를 삽입 또는 결실시키면서 파괴를 복구할 수 있다. 이어서, 이러한 부위-특이적 엔도뉴클레아제 (또한 "INDEL"로도 지칭됨)는 단백질을 프레임 밖으로 버리고, 유전자를 효과적으로 녹아웃시킨다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2011/0301073을 참조한다.

일부 실시양태에서, 유전자 생성물이 특정한 세포 유형(들) 또는 조직(들)에서 선택적으로 또는 우선적으로 생산되도록, 세포 유형-특이적 또는 조직-특이적 프로모터가 대상 치료제를 코딩하는 트랜스진에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유도성 프로모터는 트랜스진 서열에 작동가능하게 연결될 것이다. 일부 경우에, 프로모터는 광수용체-특이적 조절 요소 (예를 들어, 광수용체-특이적 프로모터), 예를 들어, 광수용체 세포에 작동가능하게 연결된 유전자의 선택적 발현을 부여하는 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다. 적합한 광수용체-특이적 조절 요소는, 예를 들어, 로돕신 프로모터; 로돕신 키나제 프로모터 (Young et al., (2003) Ophthalmol. Vis. Sci. 44:4076); 베타 포스포디에스테라제 유전자 프로모터 (Nicoud et al., (2007) J. Gene Med. 9:1015); 색소성 망막염 유전자 프로모터 (Nicoud et al., (2007) 상기 문헌); 광수용체간 레티노이드-결합 단백질 (IRBP) 유전자 인핸서 (Nicoud et al., (2007) 상기 문헌); IRBP 유전자 프로모터 (Yokoyama et al., (1992) Exp Eye Res. 55:225) 등을 포함한다.

일부 실시양태에서, 대상 변형된 AAV에 의해 전달된 생물제제는 혈관신생을 억제하는 작용을 할 수 있다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 대상 변형된 AAV에 의해 전달된 생물제제는 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및 PDGF로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 포유동물 VEGF 단백질의 활성을 억제하는 작용을 할 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 대상 AAV 변이체에 의해 전달된 생물제제는 VEGF-A의 활성을 억제한다. VEGF-A는 대안적 스플라이싱에 의해 생성된 9종의 이소형을 가지며, 그 중 가장 생리학적으로 관련된 것은 VEGF 165이다. VEGF-A 수준은 습성 연령-관련 황반 변성, 당뇨병성 황반 부종 및 망막 정맥 폐쇄를 갖는 환자의 유리체에서 상승되는 것으로 밝혀졌다. 눈에서 VEGF-A의 활성을 억제하고 따라서 상승된 유리체 VEGF-A를 갖는 환자를 치료하는 데 효과적인 유전자 생성물(들)은 아플리베르셉트, 라니비주맙, 브롤루시주맙, 베바시주맙, 및 가용성 fms-유사 티로신 키나제 1 (sFLT1) (진뱅크 수탁 번호 U01134)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, (i) 본원에 기재된 바와 같은 변이체 AAV 캡시드 단백질 및 (ii) VEGF 억제제를 포함하는 트랜스진을 포함하는 감염성 AAV 비리온이 제공된다. 한 실시양태에서, 트랜스진은 각각 별개의 VEGF-A 억제제를 코딩하는 다중 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 트랜스진은 아플리베르셉트일 수 있다.

본원에 제공된 조성물 및 방법은 예를 들어 달리 대등한 비변형된 AAV, AAV 캡시드보다 적어도 약 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 최대 100% 더 많이 대상 트랜스진의 전달을 증진시키는 데 충분할 수 있다. 일부 경우에, 변형은 달리 대등한 비변형된 AAV, 예를 들어 AAV 캡시드보다 적어도 약 1-배, 6-배, 11-배, 16-배, 21-배, 26-배, 31-배, 36-배, 41-배, 46-배, 51-배, 56-배, 61-배, 66-배, 71-배, 76-배, 81-배, 86-배, 91-배, 96-배, 101-배, 106-배, 111-배, 116-배, 121-배, 126-배, 131-배, 136-배, 141-배, 146-배, 151-배, 156-배, 161-배, 166-배, 171-배, 176-배, 181-배, 186-배, 191-배, 196-배, 201-배, 206-배, 211-배, 216-배, 221-배, 226-배, 231-배, 236-배, 241-배, 246-배, 251-배, 256-배, 261-배, 266-배, 271-배, 276-배, 281-배, 286-배, 291-배, 296-배, 301-배, 306-배, 311-배, 316-배, 321-배, 326-배, 331-배, 336-배, 341-배, 346-배, 또는 350-배 더 많이 대상 트랜스진의 전달을 증진시키는 데 충분할 수 있다.

대상 AAV 비리온은 달리 대등한 WT AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 망막 세포 (광수용체, 신경절 세포, RPE 세포, 무축삭 세포, 수평 세포, 뮐러 세포 등)의 감염성과 비교하여 망막 세포의 적어도 1-배, 6-배, 10-배, 15-배, 20-배, 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 감염성을 나타낼 수 있다.

일부 실시양태에서, 대상 변형된 조성물, 예컨대 AAV 비리온은 비-망막 세포, 예를 들어, 눈 외부의 세포보다 10-배, 15-배, 20-배, 25-배, 50-배, 또는 50-배 초과의 특이성으로 망막 세포를 선택적으로 감염시킨다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 대상 AAV 비리온은 망막 세포를 선택적으로 감염시키고, 예를 들어, 대상 조작된 AAV 비리온은 비-망막 세포, 예를 들어, 눈 외부의 세포보다 10-배, 15-배, 20-배, 25-배, 50-배, 또는 50-배 초과의 특이성으로 광수용체 세포를 감염시킨다. 한 실시양태에서, 대상 AAV 비리온은 달리 대등한 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 망막 세포의 감염성과 비교하여 망막 세포의 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 감염성을 나타낸다. 일부 경우에, 대상 AAV 비리온은 유리체내 주사를 통해 투여되는 경우에, 유리체내 주사를 통해 투여되는 경우의 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 달리 대등한 비변형된 AAV 비리온에 의한 망막 세포의 감염성과 비교하여, 망막 세포의 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 감염성을 나타낸다. 한 실시양태에서, 대상 AAV 비리온은 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 광수용체 세포의 감염성과 비교하여, 광수용체 (간상 또는 원추) 세포의 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 감염성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 대상 AAV 비리온은 유리체내 주사를 통해 투여되는 경우에, 유리체내 주사를 통해 투여되는 경우의 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 광수용체 세포의 감염성과 비교하여, 광수용체 (간상 또는 원추) 세포의 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 감염성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 대상 AAV 비리온은 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 RGC의 감염성과 비교하여, RGC의 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 감염성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 대상 AAV 비리온은 유리체내 주사를 통해 투여되는 경우에, 유리체내 주사를 통해 투여되는 경우의 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 RGC의 감염성과 비교하여, RGC의 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 감염성을 나타낸다.

한 측면에서, 형질도입, 감염성 및/또는 향성은 시험관내에서 감염된 세포에서 트랜스진의 존재를 결정함으로써 검출된다. 망막 세포의 형질도입의 증가, 예를 들어 형질도입의 증가된 효율, 보다 넓은 형질도입, 보다 우선적인 형질도입 등은 유전자 발현을 측정하는 관련 기술분야의 임의의 수의 방법에 의해 시험관내 또는 생체내에서 용이하게 평가될 수 있다. 예를 들어, AAV는 편재성 또는 조직 특이적 프로모터의 제어 하에 리포터 유전자, 예를 들어 형광 단백질을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 게놈과 함께 패키징될 수 있고, 형질도입의 정도는 예를 들어 형광 현미경검사에 의해 형광 단백질을 검출함으로써 평가될 수 있다. 또 다른 예로서, AAV는 바 코딩된 핵산 서열을 포함하는 게놈과 함께 패키징될 수 있고, 형질도입의 정도는 예를 들어 PCR에 의해 핵산 서열을 검출함으로써 평가될 수 있다. 또 다른 예로서, AAV는 망막 질환의 치료를 위한 치료 유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 게놈과 함께 패키징될 수 있고, 형질도입의 정도는 AAV가 투여된 고통받는 환자에서 망막 질환의 치료를 검출함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 세포는 본원에 기재된 변형된 캡시드 AAV 조성물을 이용하여 형질도입될 수 있고, 트랜스진의 존재는 현미경검사, 유동 세포측정법, PCR-기반 검정, ELISA, 조직학, 또는 그의 임의의 조합을 통해 결정될 수 있다.

본 개시내용은 트랜스진의 전달을 필요로 하는 대상체에게 트랜스진을 전달하는 방법을 추가로 제공한다. 방법은 일반적으로 대상 조성물, 예컨대 AAV 비리온, AAV 벡터, 또는 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 변형된 AAV 캡시드를 포함하는 조성물을 개체에게 도입하는 것을 수반한다.

이어서, 형질도입된 세포 및/또는 예를 들어 형질도입 잠재력을 나타내는 AAV 비리온은 하기에 보다 상세히 기재된 제약 조성물로 제제화될 수 있고, 조성물은 다양한 기술에 의해, 예컨대 유리체내로, 근육내, 정맥내, 피하 및/또는 복강내 주사에 의해 대상체 내로 도입될 수 있다.

생체내 전달을 위해, 대상 AAV 비리온은 제약 조성물로 제제화될 수 있고, 일반적으로 유리체내로 또는 비경구로 투여될 것이다 (예를 들어, 근육내, 피하, 종양내, 경피, 척수강내 등의 투여 경로를 통해 투여됨).

전반에 걸쳐 기재된 조성물은 제약 조성물로 제제화될 수 있다. 일부 측면에서, 제약 조성물은 치료를 필요로 하는 대상체, 예컨대 인간 또는 포유동물을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 질환, 예를 들어, 안구 질환으로 진단될 수 있다. 일부 측면에서, 대상 제약 조성물은 2차 요법과 공투여된다.

또한, 이전에 기재된 조성물 중 임의의 것을 포함하는 제약 조성물이 본원에 제공될 수 있다. 제약 조성물은 단위 투여 형태일 수 있다. 한 측면에서, 본원에 제공된 제약 조성물은 변형된 AAV 캡시드를 포함한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 a) 상기 기재된 바와 같은 대상 AAV 비리온; 및 b) 제약상 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 완충제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제약상 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 완충제는 인간에서 사용하기에 적합하다.

이러한 부형제, 담체, 희석제 및 완충제는 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 제약 작용제를 포함한다. 제약상 허용되는 부형제는 액체, 예컨대 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 제약상 허용되는 염, 예를 들어 무기 산 염, 예컨대 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트, 술페이트 등; 및 유기 산의 염, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등이 그 안에 포함될 수 있다. 추가적으로, 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등이 이러한 비히클 중에 존재할 수 있다. 매우 다양한 제약상 허용되는 부형제가 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 본원에서 상세하게 논의될 필요는 없다. 제약상 허용되는 부형제는, 예를 들어 문헌 [A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy," 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., eds., 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., eds., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.]을 포함한 다양한 간행물에 충분히 기재되어 있다.

본원에 제공된 제약 조성물은 질환을 예방 및/또는 치료하는 데 이용될 수 있다. 일부 측면에서, 질환은 안구 질환이다. 일부 경우에, 안구 질환은 소아 질환이다. 일부 경우에, 안구 질환은 고령의 질환이다. 일부 경우에, 안구 질환은 망막의 질환이다. 본원에 제공된 제약 조성물 및 방법으로 예방 및/또는 치료될 수 있는 안구 질환은 완전색맹, 신생혈관화 관련 망막 장애 예컨대 연령-관련 황반 변성 (AMD), 습성-연령-관련 황반 변성 (wAMD), 지도형 위축 (GA), 당뇨병성 망막병증 (DR), 당뇨병성 황반 부종 (DME), 녹내장, 바르데-비들 증후군, 베스트병, 맥락막결손, 레베르 선천성 흑암시, 레베르 유전성 시신경병증 (LHON), 황반 변성, 폴립양 맥락막 혈관병증 (PCV), 색소성 망막염, 레프숨병, 스타르가르트병, 어셔 증후군, X-연관 망막층간분리 (XLRS), 유전성 망막 질환 (IRD), 간체-추체 이영양증, 추체-간체 이영양증, 오구치병, 말라티아 레벤티네스 (가족성 우성 드루젠), 청색-원추 단색형 색각, 망막 정맥 폐쇄 (RVO), 및 포도막성 황반 부종 (UMO)이다. 일부 경우에, 망막 질환은 AMD이다. 일부 경우에, 망막 질환은 습성 AMD이다. 일부 경우에, 망막 질환은 건성 AMD이다. 추가의 안구 질환은 급성 황반 신경망막병증; 베체트병; 맥락막 신생혈관화; 당뇨병성 포도막염; 히스토플라스마증; 황반 변성, 예컨대 급성 황반 변성, 비-삼출성 연령 관련 황반 변성 및 삼출성 연령 관련 황반 변성; 부종, 예컨대 황반 부종, 낭포양 황반 부종 및 당뇨병성 황반 부종; 다초점성 맥락막염; 후안구 부위 또는 위치에 영향을 미치는 안구 외상; 안구 종양; 망막 장애, 예컨대 중심 망막 정맥 폐쇄, 당뇨병성 망막병증 (증식성 당뇨병성 망막병증 포함), 증식성 유리체망막병증 (PVR), 망막 동맥 폐쇄성 질환, 망막 박리, 포도막성 망막 질환; 교감신경성 안염; 보그트 코야나기-하라다 (VKH) 증후군; 포도막 확산; 안구 레이저 치료에 의해 유발되거나 또는 그에 의해 영향을 받는 후안구 상태; 광역학 요법에 의해 유발되거나 또는 그에 의해 영향을 받는 후안구 상태; 광응고, 방사선 망막병증; 망막전막 장애; 분지 망막 정맥 폐쇄; 전안부 허혈성 시신경병증; 비-망막병증 당뇨병성 망막 기능장애; 망막층간분리; 색소성 망막염; 녹내장; 어셔 증후군, 추체-간체 이영양증; 스타르가르트병 (노란점안저); 유전성 황반 변성; 맥락망막 변성; 레베르 선천성 흑암시; 선천성 비진행성 야맹증; 맥락막결손; 바르데-비들 증후군; 황반 모세혈관확장증; 레베르 유전성 시신경병증; 미숙아 망막병증; 및 완전색맹, 적색맹, 녹색맹, 및 청색맹을 포함한 색각 장애를 포함한다.

일부 경우에, 대상 조성물을 투여할 수 있는 대상체는 2차 요법을 제공받고 있거나, 제공받거나, 또는 2차 요법의 투여 후에 제공받는다. 2차 요법은 안구 사용을 위한 임의의 요법을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 2차 요법은 영양 요법, 비타민, 레이저 치료, 예컨대 레이저 광응고, 광역학 요법, 비수다인, 항-VEGF 요법, 눈-착용, 점안제, 감각마비제, 시각 교정 요법, 행동/지각 시각 요법 등을 포함한다. 일부 측면에서, 이전에 기재된 생물제제 중 임의의 것이 2차 요법으로 간주될 수 있다.

본 개시내용은 개체에게 상기 기재된 바와 같은 대상 AAV 비리온을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 트랜스진을 망막 세포에 전달하는 방법을 제공한다. 트랜스진을 망막 세포에 전달하는 것은 망막 질환의 치료를 제공할 수 있다. 망막 세포는 광수용체, 망막 신경절 세포, 뮐러 세포, 양극 세포, 무축삭 세포, 수평 세포, 또는 망막 색소 상피 세포일 수 있다. 일부 경우에, 망막 세포는 광수용체 세포, 예를 들어, 간상 또는 원추 세포이다.

본 개시내용은 망막 질환의 치료를 필요로 하는 개체에게 유효량의 이전에 기재된 바와 같은 대상 AAV 비리온을 투여하는 것을 포함하는, 망막 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 대상 AAV 비리온은 안내 주사를 통해, 유리체내 주사에 의해, 또는 임의의 다른 편리한 투여 방식 또는 경로에 의해 투여될 수 있다. 다른 편리한 투여 방식 또는 경로는, 예를 들어 정맥내, 비강내 등을 포함한다. 유리체내 주사를 통해 투여되는 경우에, 대상 비리온은 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온의 능력과 비교하여, 유리체를 통해 이동하여 체내 경계막 (또한 본원에서 내부 경계막, 또는 "ILM"으로도 지칭됨; 성상세포 및 뮐러 세포의 종말 발에 의해 형성된, 망막과 유리체 사이의 경계를 형성하는 망막의 표면 상의 얇고 투명한 무세포 막)을 횡단할 수 있고/거나, 망막의 층을 통해 보다 효율적으로 이동한다.

본원의 개시내용은 또한 망막 질환의 치료를 필요로 하는 개체에게 상기 기재되고 본원에 개시된 바와 같은 관심 트랜스진을 포함하는 변형된 AAV 비리온의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 망막 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 대상 비리온의 유효량, 및 1종 이상의 기능적 또는 해부학적 파라미터, 예를 들어 시력, 시야, 명암에 대한 전기생리학적 반응성, 색각, 대조 감수성, 해부학, 망막 건강 및 혈관계, 안구 운동성, 주시 선호, 및 안정성에서의 변화에 대해 시험함으로써 질환이 치료되었음을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.

망막 기능 및 그의 변화를 평가하기 위한 비제한적 방법은 시력 (예를 들어, 최상의-교정 시력 [BCVA], 보행, 주행, 물체 검출 및 판별)을 평가하는 것, 시야 (예를 들어, 정적 및 동역학적 시야 시야측정)를 평가하는 것, 임상 검사 (예를 들어, 눈의 전안부 및 후안부의 슬릿 램프 검사)를 수행하는 것, 모든 파장의 명암 (예를 들어, 모든 형태의 망막전위도검사 (ERG) [전시야, 다초점 및 패턴], 모든 형태의 시각 유발 전위 (VEP), 전기안구촬영 (EOG), 색각, 암순응 및/또는 대비 감수성)에 대한 전기생리학적 반응성을 평가하는 것을 포함한다. 해부학 및 망막 건강 및 그의 변화를 평가하기 위한 비제한적 방법은 광 간섭 단층촬영 (OCT), 안저 촬영, 적응 광학 스캐닝 레이저 검안경검사 (AO-SLO), 형광 및/또는 자가형광; 안구 운동성 및 눈 운동 (예를 들어 안진, 주시 선호, 및 안정성)을 측정하는 것, 보고된 결과를 측정하는 것 (시각 및 비-시각-유도 행동 및 활동에서의 환자-보고 변화, 환자-보고 결과 [PRO], 삶의 질, 일상 활동의 설문지-기반 평가 및 신경학적 기능의 측정 (예를 들어 기능적 자기 공명 영상화 (MRI))을 포함한다.

일부 실시양태에서, 유효량의 대상 rAAV 비리온은 망막 기능, 해부학적 완전성, 또는 망막 건강의 상실 속도의 감소, 예를 들어 상실 및 그에 따른 질환의 진행 속도의 2-배, 3-배, 4-배, 또는 5-배 또는 그 초과의 감소, 예를 들어 상실 및 그에 따른 질환의 진행 속도의 10-배 이상의 감소를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 유효량의 대상 rAAV 비리온은 시각 기능, 망막 기능의 획득, 망막 해부학 또는 건강의 개선, 및/또는 안구 운동성의 개선 및/또는 신경학적 기능의 개선, 예를 들어 망막 기능, 망막 해부학 또는 건강의 2-배, 3-배, 4-배 또는 5-배 또는 그 초과의 개선, 및/또는 안구 운동성의 개선, 예를 들어 망막 기능, 망막 해부학 또는 건강의 10-배 이상의 개선, 및/또는 안구 운동성의 개선을 발생시킨다. 통상의 기술자에게 용이하게 인지될 바와 같이, 목적하는 치료 효과를 달성하기 위해 필요한 용량은 전형적으로 1 x 10⁸ 내지 약 1 x 10¹⁵개의 재조합 비리온의 범위 내일 것이고, 이는 전형적으로 통상의 기술자에 의해 1 x 10⁸ 내지 약 1 x 10¹⁵개의 "벡터 게놈"으로서 지칭된다.

일부 측면에서, 본원에 제공된 조성물, 예컨대 제약 조성물은 그를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, 투여는 약 벡터 0.5 x 10⁹ vg, 1.0 x 10⁹ vg, 1.0 x 10¹⁰, 1.0 x 10¹¹ vg, 3.0 x 10¹¹ vg, 6 x 10¹¹ vg, 8.0 x 10¹¹ vg, 1.0 x 10¹² vg, 1.0 x 10¹³ vg, 1.0 x 10¹⁴ vg, 1.0 x 10¹⁵ vg, 1.5 x 10¹⁵ vg의 AAV 벡터의 투여량을 전달하는 것을 포함한다. 예를 들어, 생체내 주사, 즉 눈 내로 직접 주사하는 경우에, 치료 유효 용량은 대략, 약 10⁶ 내지 약 10¹⁵개의 대상 AAV 비리온, 예를 들어, 약 10⁸ 내지 10¹²개의 조작된 AAV 비리온일 수 있다. 시험관내 형질도입의 경우에, 세포에 전달될 조작된 AAV 비리온의 유효량은 대략, 약 10⁸ 내지 약 10¹³개의 조작된 AAV 비리온일 것이다. 다른 유효 투여량이 용량 반응 곡선을 확립하는 상용 시험을 통해 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 확립될 수 있다.

투여는 임의의 양의 시간 동안 반복될 수 있다. 일부 측면에서, 투여는 1일 2회, 격일, 1주 2회, 2개월마다, 3개월마다, 1개월 1회, 격월, 반년마다, 매년마다 또는 격년마다 수행된다.

투여량 치료는 단일 용량 스케줄 또는 다중 용량 스케줄일 수 있다. 또한, 대상체는 적절한 만큼 많은 용량을 투여받을 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 적절한 용량 횟수를 용이하게 결정할 수 있다. 일부 측면에서, 제약 조성물은 유리체내 주사, 망막하 주사, 미세주사, 또는 안구상 주사를 통해 투여된다.

일부 측면에서, 대상체는 본원에 제공된 제약 조성물의 투여 전, 동안 및/또는 후에 돌연변이에 대한 유전자 검사를 통해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이에 대해 스크리닝될 수 있는 관련 유전자는 RPE65, CRB1, AIPL1, CFH, 또는 RPGRIP를 포함한다.

본원에 제공된 조성물 중 임의의 것을 포함하는 키트가 또한 제공된다. 또한, a) 대상 변형된 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드; b) 대상 벡터; 또는 c) 대상 조작된 비리온을 포함하는 용기가 제공된다. 한 측면에서, 용기는 바이알, 시린지 또는 바늘이다. 일부 경우에, 용기는 안구 전달을 위해 구성된다.

키트는 적합하게 분취된 조성물을 포함할 수 있다. 키트의 성분은 수성 매질 또는 동결건조 형태로 포장될 수 있다. 키트의 용기 수단은 일반적으로 적어도 1개의 바이알, 시험 튜브, 플라스크, 병, 시린지, 또는 성분이 배치될 수 있는, 바람직하게는 적합하게 분취될 수 있는 또 다른 용기 수단을 포함할 것이다. 키트 내에 1종 초과의 성분이 존재하는 경우에, 키트는 또한 일반적으로 추가의 성분이 개별적으로 배치될 수 있는 제2, 제3 또는 다른 추가의 용기를 함유할 것이다. 그러나, 성분의 다양한 조합이 바이알에 포함될 수 있다. 키트는 또한 전형적으로 상업적 판매를 위해 성분을 근접 국한시켜 함유하는 수단을 포함할 것이다. 이러한 용기는 목적하는 바이알이 담기는 사출 또는 블로우 성형된 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.

일부 경우에, 본원에 기재된 조성물을 포함하는 포장된 제품은 적절하게 라벨링될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 제약 조성물은 우수 제조 관리기준 (cGMP) 및 라벨링 규정에 따라 제조될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 제약 조성물은 무균일 수 있다.

실시예

실시예 1: 변형된 AAV 캡시드의 설계

데카노일-L-펩티딜 단편 (10개의 아미노산 잔기)을 초기 분석을 위해 부분적으로 무작위화하였다. 초기 펩티드 단편의 출발 아미노산 서열은 식 1: X0-X1-X2-X1-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 108)로서 제공되며, 여기서 X0은 발린 (V), 이소류신 (I), 류신 (L), 페닐알라닌 (F), 트립토판 (W), 티로신 (Y) 또는 메티오닌 (M)이고, 여기서 X1은 알라닌 (A), 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q), 세린 (S), 트레오닌 (T), 글루탐산 (E), 아스파르트산 (D), 리신 (K), 아르기닌 (R), 또는 히스티딘 (H)이고, 여기서 X2는 V, I, L, 또는 M이고, 여기서 X3은 E, S, 또는 Q이고, 여기서 X4는 K, R, E, 또는 A이고, 여기서 X₅는 프롤린 (P) 또는 R이다.

변형된 펩티드를 AAV2 (또는 본원에 제공된 바와 같은 다른 적합한 AAV 혈청형) 바이러스 단백질 (VP1)의 루프 3 및/또는 루프 4 내로 부분적으로 삽입하고, 공중 구조 모델링 시스템을 사용하여 분석한다. 비변형된 AAV2 캡시드의 야생형 루프 구조와 비교하여 유사한 표현형 및/또는 구조적 외관을 갖는 입체형태를 생물학적 평가를 위해 선택하였다. 표 2: 예시적인 AAV2 Rep 및 변형된 AAV2 캡시드 영역을 제공한다.

표 2: AAV 캡시드 내로 삽입될 수 있는 예시적인 외인성 폴리펩티드 서열. 예시적인 삽입 부위가 AAV2에 대해 제시되지만, 다른 AAV 혈청형의 대등한 위치가 또한 고려된다. 클론 V471은 서열식별번호: 26에 대해 452 및 587 위치에서 펩티드의 이중 삽입을 갖는다.

실시예 2: 변형된 AAV 캡시드의 생성

AAV2 Rep 및 변형된 AAV2 캡시드 유전자를 보유하는 pFB 셔틀 플라스미드의 구축

PCR을 이용하여 목적하는 돌연변이체 펩티드를 V449 플라스미드 백본의 AAV2 캡시드 유전자 내로 삽입하였다. 간략하게, 플라스미드 V449-pFB-inCap2-inRep-코작-hr2를 제한 효소 BsiWI 및 XbaI (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 매사추세츠주 입스위치)로 절단하여 9113bp의 백본 단편을 단리하였다. 목적하는 돌연변이체 펩티드의 DNA 서열을 함유하는 5' PCR 단편 및 3'-PCR 단편을 주형으로서 V449-pFB-inCap2-inRep-코작-hr2를 사용하여 각각 증폭시킨 다음, 제2 PCR에 의해 함께 연결하여 단일 PCR 단편을 형성하였다. 연결된 PCR 단편을 엔이빌더 하이파이(NEBuilder HiFi) DNA 어셈블리 키트 (뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 사용하여 V449-pFB-inCap2-inRep-코작-hr2의 BsiWI 및 XbaI 부위 내로 각각 클로닝하여 목적하는 클론을 생성하였다. 그러나, 클론 V471-pFB-inCap2-452_587RtoK-inRep-코작-hr2는 PCR 반응을 위한 주형으로서 및 하이파이 어셈블리를 위한 백본으로서 V467-pFB-inCap2-587RtoK-inRep-코작-hr2를 사용하여 생성하였다. 생성된 클론을 제한 소화에 의해 확인하고, 돌연변이 부위를 DNA 서열 분석에 의해 확증하였다. 클론 번호 및 PCR 프라이머를 표 3에 제공한다.

표 3: 클로닝 동안 PCR 단편을 생성하는 데 사용된 클론 번호 및 상응하는 PCR 프라이머의 목록. 주: a. A035는 1874와 동일한 DNA 서열을 갖는다; b. A038은 1871과 동일한 DNA 서열을 갖는다.

PCR 반응 및 DNA 서열 분석에 사용된 프라이머의 서열은 표 4에 제공된다.

표 4: 변형된 AAV 캡시드를 생성하는 데 사용된 PCR 반응에 사용된 프라이머의 DNA 서열.

재조합 바큘로바이러스의 생성

재조합 바큘로바이러스는 Bac-투-Bac 바큘로바이러스 발현 시스템을 제조업체의 지침 (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드)에 따라 사용하여 생성하였다. 간략하게, 이전에 기재된 바와 같은 표적 유전자를 함유하는 pFB 셔틀 플라스미드를 각각 TE 완충제 중에 1ng/μL로 희석하고, 각각의 DNA 2 ng을 카텝신 유전자가 결실된 바크미드 DNA 분자를 함유하는 Δcath-DH10Bac 적격 박테리아 (비로벡(Virovek), 캘리포니아주 헤이워드) 20 μL와 혼합하고, 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 42℃에서 30초 동안 열-쇼크를 가하였다. 얼음 상에서 2분 동안 인큐베이션한 후, 박테리아를 37℃에서 4시간 동안 배양하여 회수한 다음, 50 μg/mL의 카나마이신, 7 μg/mL의 겐타마이신, 10 μg/mL의 테트라시클린, 40 μg/mL의 IPTG, 및 100 μg/mL의 X-gal을 함유하는 한천 플레이트 상에 플레이팅하였다. 37℃에서 48시간의 인큐베이션 후에, 재조합 바크미드 DNA를 함유하는 백색 콜로니를 골라내고, 미니프렙 바크미드 DNA를 멸균 조건 하에 정제하였다. 각각의 바크미드 DNA 약 5 μg 및 진젯(GeneJet) 시약 (시그나겐 래보러토리즈(SignaGen Laboratories), 메릴랜드주 프레드릭) 10 μL를 각각 100uL ESFAF 배지 (익스프레션 시스템즈(Expression Systems), 캘리포니아주 데이비스) 중에 희석한 다음, 약 30분 동안 함께 혼합하여 형질감염 혼합물을 형성하였다. Sf9 세포를 6-웰 플레이트에 28℃에서 약 30분 동안 2 mL ESFAF 배지 중 1.5e+6개 세포/웰로 플레이팅하였다. Sf9 세포로부터 오래된 배지를 제거한 후, 각각의 형질감염 혼합물을 800 μL ESFAF 배지 중에 희석한 다음, Sf9 세포에 첨가하였다. 28℃에서 밤새 인큐베이션한 후, Sf9 세포를 갖는 각각의 웰에 추가의 1 mL ESFAF 배지를 첨가하였다. 4일의 총 인큐베이션 시간 후에, 재조합 바큘로바이러스를 세포 없이 수집하고, 1:200 비로 증폭시켜 AAV 생산 과정에 사용하기 위해 준비된 충분한 양의 재조합 바큘로바이러스를 생성하였다.

Sf9 세포 배양물을 150rpm 및 28℃에서 완만하게 진탕되고 있는 코닝(Corning) 병 내의 100 유닛/mL 페니실린 및 100ug/mL 스트렙토마이신 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 캘리포니아주 플레전턴)을 함유하는 ESF AF 배지 (익스프레션 시스템즈) 중에 유지시켰다. 세포가 ~1e+7개 세포/mL로 성장하면, 이를 새로운 병 내의 신선한 배지 중에 1:4로 분할하고, 유지 목적을 위해 계속해서 배양하였다.

실시예 3: AAV 생산 및 정제

AAV2 Rep 유전자 및 돌연변이체 AAV2 캡시드 유전자, 및 CMV-GFP를 각각 보유하는 재조합 바큘로바이러스를 사용하여 AAV 생산을 위해 Sf9 세포를 공동-감염시켰다. 간략하게, Rep 및 Cap 유전자를 보유하는 10 moi rBV 및 CMV-GFP를 보유하는 5 moi rBV를 사용하여 진탕기 인큐베이터에서 180rpm의 진탕 속도 하에 28℃에서 3일 동안 50% 신선한 ESFAF 배지를 사용하여 ~5e+6개 세포/mL의 밀도로 Sf9 세포주를 공동-감염시켰다. 감염 말미에, 세포 펠릿을 3,000 rpm에서 10분 동안의 원심분리에 의해 수집하였다. 세포를 50mM 트리스-HCl, pH8.0, 2mM MgCl2, 1% 사르코실, 1% 트리톤 X-100, 및 125 유닛/mL 벤조나제를 함유하는 Sf9 용해 완충제 중에서 격렬한 볼텍싱으로 용해시킨 다음, 350 rpm, 37℃에서 1시간 동안 진탕시켰다. 진탕 말미에, 염 농도를 500 mM로 조정하고, 용해물을 4℃에서 20분 동안 8,000 rpm에서의 원심분리에 의해 청정화하였다. 청정화된 용해물을 5 mL 1.50 g/cc 및 10 mL 1.30 g/cc 염화세슘 용액을 함유하는 SW28 스윙 버킷 로터용 초투명 원심분리 튜브로 옮겼다. 28,000 rpm, 15℃에서 ~18시간 동안 원심분리한 후, AAV 밴드를 시린지로 수집하고, 70 ti 원심분리 로터용 초투명 원심분리 튜브로 옮겼다. 원심분리 튜브를 1.38 g/cc 염화세슘 용액으로 충전하고, 열-밀봉하였다. AAV 샘플을 ~18시간 동안 65,000 rpm, 15℃에서 제2 라운드의 초원심분리에 적용하고, AAV 밴드를 시린지로 수집하였다. 정제된 AAV 샘플을 0.001% 플루로닉 F-68을 함유하는 PBS 완충제로 완충제-교환하고, 0.22 μm 시린지 필터로 여과-멸균하였다. 멸균된 AAV 샘플을 4℃에서 1개월 내로 저장한 후, 장기간 저장을 위해 -80℃로 옮겼다. 퀀트스튜디오(QuantStudio) 7 플렉스 실시간 PCR 시스템 (인비트로젠)을 사용하여 실시간 PCR 방법으로 AAV 역가를 결정하였다. 일부 측면에서, AAV 역가는 TCID50 (중앙 조직 배양 감염성 용량) AAV 벡터 감염 역가 검정으로 결정할 수 있다. TCID50 AAV 역가 검정은 먼저 형질도입될 세포를 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액이 보충된 DMEM을 포함하는 완전 배지 내로 배양함으로써 측정할 수 있다. 세포를 96-웰 플레이트에서 배양하고, 후속적으로 본원에 기재된 변형된 AAV 중 어느 하나에 의해 형질도입할 수 있다. 형질도입은 아데노바이러스를 희석하여 밀리리터당 3.2e+8개의 아데노바이러스 입자의 최종 농도를 만드는 것을 포함할 수 있다. 변형된 AAV 벡터를 역가 검정을 위해 연속 희석에 의해 희석할 수 있다. 이어서, 세포를 상이한 연속 희석된 변형된 AAV 벡터에 의해 형질도입할 수 있다. 형질도입된 세포로부터 DNA를 추출할 수 있다. 이어서, 추출된 DNA를 택맨 열순환 조건 하에 택맨 프로브를 사용하여 검정하여 증폭 신호를 수득할 수 있다. 증폭 신호의 지수기는 변형된 AAV 벡터의 연속 희석물로부터 수득된 농도에 상응할 수 있다.

겔 전기영동

AAV 캡시드 단백질을 가시화하기 위해, SDS-PAGE 전기영동을 수행하였다. AAV 샘플을 SDS-겔 로딩 완충제와 혼합하고, 95℃에서 5분 동안 가열하고, 1e+11vg/레인의 AAV 벡터를 로딩하고, 로딩 염료가 겔 바닥에 도달할 때까지 100V에서 전기영동하였다. AAV 캡시드 단백질을 심플리블루 세이프스테인 키트(SimplyBlue SafeStain Kit) (써모 피셔 사이언티픽)로 염색하였다. 겔 영상을 바이오-라드(BIO-RAD) 몰레큘라 이미저 겔-독 XR+ (바이오-라드, 캘리포니아주 허큘레스)로 기록하였다. AAV 게놈을 가시화하기 위해, 아가로스 겔 전기영동을 수행하였다. AAV 샘플을 0.1% SDS를 함유하는 PBS 완충제 중에 희석하고, 80℃에서 10분 동안 가열하였다. 가열기를 끄고 실온으로 천천히 냉각시킨 후, 2e+11 vg/레인의 AAV 벡터를 SYBR 세이프 DNA 겔 염색제 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드)를 함유하는 TAE 완충제 중 1% 아가로스 겔 상에 로딩하고, 100V에서 1시간 동안 전기영동하였다. 영상을 바이오-라드 몰레큘라 이미저로 기록하였다.

세포 배양 및 시험관내 형질도입 ARPE19 및 HEK293

ARPE-19 (ATCC CRL2302)는 전형적인 RPE 마커, 예컨대 세포 레틴알데히드-결합 단백질 (CRALBP) 및 RPE-특이적 65 kDa 단백질 (RPE65)을 발현하기 때문에 RPE 세포에 적합한 모델이다. 세포를 10% 열-불활성화 태아 소 혈청 (깁코(Gibco) BRL) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지/F-12 영양 배지 (DMEM/F-12; 깁코 BRL, 미국 캘리포니아주 칼스배드) 중에 유지시켰다. 세포를 가습 분위기 하의 37℃ 및 5% CO2의 인큐베이터 내에 유지시키고, 3-4일마다 0.25% 트립신-EDTA (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 캘리포니아주 칼스배드)로 계대배양하였다. 처음 10회 계대배양 내의 RPE 세포를 선택하고, 실험을 위해 적절한 배양 플레이트에 넣었다.

HEK293 세포는 ATCC (CRL-1573; 미국 버지니아주 마나사스)로부터 입수하고, 고 글루코스 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM; 깁코 BRL, 미국 캘리포니아주 칼스배드)에서 배양하였다. 배지를 10% 태아 소 혈청 (깁코 BRL) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충하였다. 세포를 가습 분위기 하의 37℃ 및 5% CO2의 인큐베이터 내에 유지시키고, 3-4일마다 0.25% 트립신-EDTA (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 캘리포니아주 칼스배드)로 계대배양하였다.

실시예 4: AAV2 캡시드 변이체의 시험관내 형질도입 검정

ARPE-19 세포 또는 HEK293 세포를 12-웰 플레이트에 60% 전면생장률로 시딩하고, 전면생장률 미만으로 성장시켰다. 세포를 감염 2-4시간 전에 공급하고, 배지를 2% FBS로 바꾸고, 세포를 야생형 또는 캡시드 변형된 AAV2-CMV-GFP에 1 ml로 1시간 동안 노출시켰다. 그 후, 완전 배지를 첨가하고, 3 내지 7일 동안 계속해서 인큐베이션하였다. 모든 감염은 동일한 수의 vg (2.0e+13)로 수행하였으며, 이는 1.0e+5 vg/세포의 추정 MOI를 생성하였다. GFP의 발현을 모노크롬 DP80 카메라가 장착된 도립 형광 현미경 (올림푸스, 미국 펜실베니아주 센터 밸리)에서 분석하였다. 모든 영상을 디지캠컨트롤(digiCAMControl)을 사용하여 동일한 비-포화 노출 시간에 포획하였다.

ARPE-19 세포, HEK293 세포, 또는 임의의 다른 세포 유형을 변형된 AAV 벡터 중 어느 하나로 형질도입하는 것은 하기 물질 및 장비를 이용하는 것을 포함할 수 있다: AVMX-110으로도 공지된 AAV2.N54.VEGF-트랩 (AMI054-AMI120-scCMV-아플리베르셉트-GCRS)을 정제하고, 제제 완충제 (9.23e+12 vg/mL의 농도 및 -80℃에서 저장됨)로 완충제 교환하고; 인간 배아 신장 (HEK293, ATCC, Cat# CRL-1573) 세포를 해동시키고, 계대 횟수를 상용적으로 문서화하고; 10% FBS (ATCC, Cat# 30-2020)를 함유하는 EMEM 배지 (ATCC, Cat# 30-2003)를 사용하여 세포를 배양하고 형질도입하였다. 배지는 4℃에서 저장하고; 트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드 (써모피셔 사이언티픽, Cat# 25200056); 1X PBS (포스페이트 완충 염수): 10X PBS (피셔 사이언티픽, 하이클론(Hyclone), Cat# SH3025802)를 배양 등급 멸균수 (피셔 사이언티픽, 하이클론, Cat# SH30529LS)로 희석한다. 4℃에서 저장하고; 6-웰 배양 플레이트 (그라이너 바이오-원(Greiner bio-one)/셀스타(Cellstar), Cat# 657 160); 생물안전 캐비닛 (랩콘코 퓨리파이어 클래스 II(Labconco Purifier Class II)); 37℃ 및 5% CO2로 설정된 인큐베이터 (써마 포르마(Therma forma), 시리즈 II 워터 재킷 CO2 인큐베이터); 및 V226-AMI067 (양성 대조군, V226-pFB-inCap2-7m8-AMI067-scCMV-아플리베르셉트-GC). 형질도입 절차는 다음을 포함할 수 있다: HEK293 세포 (또는 임의의 다른 세포 유형)를 10% FBS가 보충된 EMEM 배지가 담긴 T-75 플라스크에서 배양하고, 계대 횟수 및 세포 생존율의 기록을 유지하고; 플라스크를 인큐베이터에서 꺼내고, 오래된 배지를 제거하고, 플라스크를 10 mL의 1X PBS로 헹구고; 1X PBS를 폐기하고, 0.5 mL의 트립신 용액을 첨가하고, 플라스크를 1-2분 동안 정치시키고; 혈청을 함유하는 10회 v/v (5 mL)의 배지를 첨가하여 트립신을 중화시키고, 세포가 배양 플라스크로부터 해리되도록 하고; 세포 현탁액을 15 mL 튜브 내로 옮기고, 300 g에서 3분 동안 원심분리하고; 1 mL의 EMEM 배지를 첨가하여 세포를 재현탁시킨다. 세포를 계수하고, 배지를 첨가하고; 6-웰 플레이트의 각각의 웰 내로 1 mL를 첨가하고; 플레이트를 24시간 동안 인큐베이터 내로 다시 넣어 세포가 웰의 바닥에 부착되도록 하고; 24시간 후에 신선한 배지 중 1.0e+11 (= 1.0e+06 *100,000)/mL의 바이러스 입자의 총량으로 MOI 100,000의 AAV2.N54.VEGF-트랩 및 V226-AMI067 (양성 대조군)을 제조하고; 1 mL의 AAV2.N54.VEGF-트랩, 또는 양성 대조군, 또는 신선한 배지 (음성 대조군)를 웰에 이중으로 첨가하고; 6-웰 플레이트를 다시 인큐베이터 내로 배치하고; 또 다른 24시간 후에 모든 웰에서 배지를 1 mL/웰의 신선한 배지로 대체하고, 플레이트를 다시 인큐베이터 내로 배치하고; 형질도입 후 제4일에 플레이트의 각각의 웰로부터 상청액을 수집하고, 검정 요건에 따라 300-500 μL/튜브로 1.5 mL 멸균 에펜도르프 튜브 내로 분취하고; VEGF-트랩 ELISA를 사용하여 각각의 수집된 상청액에서 VEGF-트랩 농도를 정량하거나 또는 상청액을 -80℃에서 저장함으로써 세포 수를 1.0e+06/mL로 조정한다. 표 5는 변형된 AAV 벡터 (변형된 AAV2.N54)가 야생형 AAV2와 비교하여 증가된 감염성을 나타내었음을 보여주는 AAV 감염성의 예시적인 연구를 예시한다.

표 5. AAV2.N54는 야생형 AAV2 참조 표준물보다 3x 더 높은 감염성을 보여주었다.

N54 펩티드 삽입을 갖는 AAV2 VP1 캡시드 및 AAV2 야생형 참조 표준물의 감염성

실시예 5: 망막에 대한 AAV2 향성의 변형

펩티드 디스플레이 및 rAAV2 벡터 생산을 위한 스캐폴드로서의 AAV2의 능력을 연구하기 위해, 3-10 aa의 길이를 갖는 펩티드를 AAV2 상에 디스플레이하였다. 이러한 범위는 잘 허용되고, 캡시드 재표적화에 충분할 수 있다. cap 유전자 내의 영역은 어셈블리된 입자 상의 두드러진 위치, 즉 루프 3 및 루프 4에서 코딩된 펩티드의 디스플레이를 보장하는 인-프레임 올리고뉴클레오티드 삽입을 위해 선택되었다. 도 1에 제시된 바와 같이, rAAV2에서의 펩티드 삽입은 모 AAV2에서와 달리 루프 3 또는 루프 4의 상부에 위치하며, 이는 이제 루프 3 또는 루프 4보다 추가로 더 연장된다 (도 1 우측 패널). AAV2 구조의 표면도는 삽입이 모든 60개의 VP 서브유닛 상에서 일어난다는 것을 나타낸다.

변형된 캡시드를 갖는 일련의 AAV2 벡터를 표 6에 제시된 바와 같이 성공적으로 생산하고 정제하였다. SDS-PAGE는 2 라운드의 염화세슘 밀도 초원심분리 후, AAV2 벡터가 98% 초과로 순수하며, 도 2에 제시된 바와 같이 단지 미량의 오염 단백질만을 가짐을 나타낸다. 표 7은 HEK293 세포 또는 ARPE19 세포에서의 GFP (본원에 기재된 AAV 벡터를 통해 세포 내로 전달됨)의 발현을 예시하며, 여기서 HEK293 세포 또는 ARPE19 세포는 본원에 기재된 변형된 AAV 벡터로 형질도입되었다. 표 7은 출현 순서로 각각 서열식별번호: 110-113, 111, 114-126, 118, 117, 및 127-128을 개시한다.

표 6. AAV-2 벡터 생산 (벡터 프렙 품질, 순도 및 농도)

표 7. 변형된 AAV-VP1 패킹된 GFP를 사용한 인간 세포의 형질도입.

실시예 6: 인간 세포주에서의 형질도입 효율에 대한 변형된 AAV2 캡시드 변이체의 효과

HEK 293 세포를 이용하여, 19세 남성의 눈으로부터 유래된 자발적 발생 망막 색소 상피 (RPE) 세포주인 AAV2 및 ARPE-19의 형질도입 효율 또는 감염성을 결정하였다. 모든 변형된 캡시드 변이체의 형질도입 효율을 HEK293 및 ARPE-19 세포 둘 다에서 시험하였다. 도 3a에 제시된 바와 같이, HEK293 및 ARPE-19 세포 둘 다에서의 GFP의 발현 수준은 AAV2-V467 변이체가 가장 효율적이었고, 이어서 AAV2-V471 및 AAV2-V466 변이체임이 문서화되었다. AAV2의 R585 또는 R588의 위치에 단일 돌연변이 또는 그의 조합을 갖는 AAV2 변이체는 세포를 형질도입하는 데 실패하였다 (도 3b). AAV2 캡시드의 루프3 또는 루프4에서 다른 펩티드의 삽입은 트랜스진 발현을 극적으로 감소시켰다.

VEGF-트랩은 본원에 기재된 ELISA 프로토콜로 측정될 수 있다. 일부 측면에서, ELISA 프로토콜은 물질 및 장비, 예컨대 하기를 이용한다: VEGF-트랩; PBS 중 -80℃에서 저장된 AAV-2-VEGF-트랩 100 uL/바이알 (농도는 상업적 ELISA에 의해 결정된 4.56 mg/mL임); VEGF: 100 μg/mL; HEK293 세포에서 발현되고 정제된 항원 (진스크립트(GeneScript), Cat# Z03073); 사전흡착된 염소 항-인간 IgG Fc (비오틴) (압캠(Abcam), Cat# ab98618); HRP-스트렙타비딘 접합체 (압캠, Cat# ab7403); TMB 기질: 1-스텝(1-Step)™ 울트라 TMB-ELISA 기질 용액 (써모피셔, Cat# 34028); 96-웰 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이스(Molecular Device): 베르사맥스(VERSAmax) 가변 마이크로플레이트 판독기); 코팅 완충제: 3.7 g 중탄산나트륨 (NaHCO3) 및 0.64 g 탄산나트륨 (Na2CO3); 1 L의 밀리 Q 물, pH 9.60, 저장 조건: 1개월 동안 RT (실온); 1X PBS (포스페이트 완충 염수): 8.0 g 염화나트륨, 1.3 g 이염기성 인산나트륨, 0.2 g 일염기성 인산나트륨, 및 1.0-리터 밀리-Q 물, pH 7.4, 저장 조건: 1년 동안 RT, 세척 완충제 (PBST): 1X 포스페이트 완충 염수, 0.1% 트윈 20 (v/v), 저장 조건: 제조일로부터 30일 만기 동안 RT; 차단 완충제 (BB): 0.1% 트윈 20 (v/v) 및 1% 카세인을 함유하는 1X 포스페이트 완충 염수 (PBS), 저장 조건: 제조일로부터 30일 동안 4℃; 희석 완충제 (DB): 차단 완충제와 동일함; TMB 기질에 대한 정지 용액 (압캠, Cat# ab171529); 품질 관리 샘플: 상업용 아플리베르셉트 ELISA 키트로부터의 VEGF-트랩 표준물 (6 ng/mL); 및 96-웰 마이크로플레이트.

ELISA 프로토콜은 하기 절차를 포함할 수 있다: VEGF (100 μg/mL) 스톡을 코팅 완충제로 0.1 μg/mL로 희석하고 (10 μL의 VEGF 스톡을 10 mL의 코팅 완충제로); 코팅 항원을 96-웰 마이크로플레이트에 100 μL/웰로 첨가하고, 플레이트를 덮고 2-8℃에서 대략 12시간 동안 또는 밤새 두고; 코팅 항원을 폐기하고, 플레이트를 300 μL/웰의 PBS-T 세척 완충제로 3회 세척하고; 300 μL/웰의 차단 완충제를 첨가하고, 플레이트를 덮고 37±1℃에서 120분 동안 인큐베이션하고; VEGF-트랩 표준물 (4.56 mg/mL)을 희석 완충제로 하기와 같이 12.5 ng/mL로 희석하고: 4.56 mg/mL를 10 μg/mL로 456-배 희석하고, 10 μg/mL를 1 μg/mL로 10-배 희석하고, 1 μg/mL를 100 ng/mL로 10-배 희석하고; 12.5 ng/mL의 제1 표준점인 700 μL의 희석 완충제 중 100 ng/mL 용액 100 μL를 첨가하고; 1:2 연속 희석 스킴을 이중으로 사용하여 나머지 VEGF-트랩 표준물을 제조하고; 희석된 표준물 샘플, 품질 관리 샘플 및 미지의 샘플을 각각의 희석을 위해 이중으로 웰당 100 μL로 플레이트로 옮기고; 플레이트를 덮고, 플레이트를 37±1℃에서 60분 동안 인큐베이션하고; 플레이트 내의 반응물을 폐기하고, 세척 완충제로 300 μL/웰로 6회 세척하고; 1:40,000으로 사전흡착된 염소 항-인간 IgG Fc (비오틴)를 희석 완충제 (0.0125 μg/mL)로 희석하고, 100 μL/웰로 첨가하고; 플레이트를 덮고, 37±1℃에서 60분 동안 인큐베이션하고; 반응 믹스를 폐기하고, 플레이트를 세척 완충제로 300 μL/웰로 6회 세척하고; 스트렙타비딘-HRP를 희석 완충제로 1:40,000으로 희석하고, 100 μL/웰로 첨가하고; 플레이트를 엎고, 37±1℃에서 60분 동안 인큐베이션하고; 플레이트 내의 반응물을 폐기하고, 세척 완충제로 300 μL/웰로 6회 세척하고; 플레이트를 1X PBS로 1회 헹구어 나머지 트윈 20을 제거하고; TMB 기질을 100 μL/웰로 첨가하고, 플레이트를 덮고, 37±1℃에서 15분 동안 인큐베이션하고; 정지 용액 100 μL/웰을 첨가하여 반응을 정지시키고; 플레이트를 마이크로플레이트 판독기에서 참조 파장으로서 600 nm를 사용하여, 450 nm 파장 필터에서 판독한다.

도 3c 및 도 3d는 VP1-AMI054 변형된 AAV1, AAV2 및 AAV6: 아미노산 잔기 위치 588 (아스파라긴, N) 다음에 LALGQTTKPA 외인성 폴리펩티드 (서열식별번호: 14)의 삽입을 포함하는 변형된 AAV1; 아미노산 잔기 위치 588 (세린, S) 다음에 LALGQTTKPA 외인성 폴리펩티드 (서열식별번호: 14)의 S588 삽입을 포함하는 변형된 AAV2; 및 아미노산 잔기 위치 588 (세린, S) 다음에 LALGQTTKPA 외인성 폴리펩티드 (서열식별번호: 14)의 S588 삽입을 포함하는 변형된 AAV2를 포함하는 변형된 AAV6에 의해 매개되는 VEGF-트랩 유전자의 발현을 예시한다. 도 3c는 변형된 AAV1, AAV2, 또는 AAV6에 의해 형질도입된 HEK293 세포에서의 VEGF-트랩 발현을 예시한다. 도 3d는 변형된 AAV1, AAV2, 또는 AAV6에 의해 형질도입된 ARPE-19 세포에서의 VEGF-트랩 발현을 예시한다.

실시예 7: 뮤린 연구

동물을 최소 3일 동안 연구 환경에 순응시킨다. 순응 기간의 완료 시에, 각각의 동물을 연구 참여에 대한 적합성의 결정을 위해 실험 동물 기술자가 물리적으로 검사한다. 검사는 피부 및 외이, 눈, 복부, 행동 및 전반적 신체 상태를 포함할 것이나, 이에 제한되지는 않을 것이다. 건강이 양호한 것으로 결정된 동물이 연구에 배포될 것이다.

동물을 시설 표준 작업 절차 (SOP)에 따라 연구군에 무작위로 배정한다. 동물은 상응하는 케이지 카드 번호, 귀 펀치 및 번호에 의해 고유하게 확인된다. 표 8 및 표 9는 뮤린 연구를 위한 시험 파라미터 및 식이를 보여준다.

표 8. 뮤린 시험 시스템 파라미터

표 9. 뮤린 식이 파라미터

투여 계획

주사 전 제0일에, 마우스에게 부프레노르핀 0.01-0.05 mg/kg을 SQ 제공하였다. 국소 동공확대제 (1.0% 트로픽아미드 HCL, 및 2.5% 페닐에프린 HCL)을 주사의 적어도 15분 전에 적용하였다. 동물을 유리체내 주사를 위해 신경안정시키고, 1 방울의 0.5% 프로파라카인 HCL을 양쪽 눈에 적용하였다. 대안적으로, 마우스를 흡입 이소플루란으로 마취시킬 수 있다. 결막을 듀몬트 #4 겸자로 부드럽게 잡고, 33 G 바늘 및 해밀턴 시린지를 사용하여 주사하였다. 시린지 내용물을 분배한 후, 시린지 바늘을 천천히 회수하였다. 주사 절차 후, 1 방울의 오플록사신 안과용 용액을 눈 윤활제와 함께 안구 표면에 국소로 적용하였다.

파라미터

사망률 및 이환율을 케이지-측 관찰과 함께 1일 1회 평가하였고, 특히 눈에 주의를 기울였다. 슬릿 램프 생체현미경을 사용하여 안구 검사를 수행하여 본원에 나타낸 시점에 안구 표면 형태를 평가하였다. 컬러 및 코발트 블루 (EGFP 발현) 안저 영상화 둘 다를 실험 설계 표의 시점에 모든 동물의 양쪽 눈에 대해 수행하였다. 동물에게 트로피카미드 (1.0%) 및 페닐에프린 (2.5%)의 칵테일을 국소로 제공하여 눈을 확장 및 돌출시키고, 국소 눈 마취제를 눈에 적용하였다 (프로파라카인 0.5% 또는 유사). 컬러 안저 촬영 후, 코발트 블루 촬영을 수행하였다. 제28일에 최종 영상화 절차 후에, 동물을 이산화탄소 질식을 통해 안락사시키고, 경추 탈구 또는 개흉술에 의해 사망을 확실하게 하였다.

안구 조직 수집 및 프로세싱

최종의 생전 영상화 절차 후, 눈을 적출하고, 즉시 포스페이트-완충 염수 (PBS) 중 4% 파라포름알데히드 (PFA) 중에 실온에서 4시간 동안 (동결절편 분석) 또는 실온에서 30분 동안 (플랫 마운트 분석) 고정시켰다. 플랫 마운트 분석을 위해 지정된 눈을 1x PBS로 헹구고, 절개 시까지 4℃에서 저장하였다. 동결절편화를 위해 지정된 눈을 PBS로 세척하고, 포매 시까지 4℃에서 저장한다.

동결절편 분석: 눈을 즉시 3% 아가로스/5% 수크로스 중에 포매시키고, 4℃에서 30% 수크로스 중에 밤새 침강시키거나, 또는 다음날 포매될 때까지 1x PBS 중에 저장한다. 블록을 절편화하고, 면역조직화학을 위해 프로세싱한다. 면역조직화학을 위해 지정된 슬라이드를 핵 국재화에 대한 DAPI와 함께 로돕신, RPE65 및 GFP에 대한 항체로 염색한다. 2차 항체는 하기와 같이: 당나귀 항-마우스 Cy3 (로돕신), 당나귀 항-토끼 Cy5 (RPE65), 및 당나귀 항-닭 Cy2 (GFP)일 수 있다.

안구 플랫마운트 분석: 해부 현미경을 사용하여, 눈에서 이질 조직을 트리밍하고, 전안부, 수정체 및 유리체를 제거하였다. 안배를 차가운 메탄올에 30분 동안 둔 다음, 차가운 PBS로 15분 동안 3회 헹구었다. 안배를 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI; 핵 염색) 및 하기 항체 중 3종의 조합을 함유하는 차가운 ICC에 두었다: 내부 경계막을 표지하는 항-라미닌 (1/1,000), 간체를 표지하는 항-로돕신 클론 4D2 (1/500), 뮐러 세포를 표지하는 항-글루타민 신테타제 클론 GS-6 (1/1,500), 추체를 표지하는 PNA 렉틴 (1/40). 안배를 4℃에서 부드럽게 회전시키면서 4시간 동안 인큐베이션하고, 차가운 ICC 완충제로 세척하였다. 염색 후, 안배를 4% PFA 중에 5분 동안 고정시킨 다음, 1x PBS로 1회 헹구었다. 공막-맥락막/RPE 복합체를 미세 만곡 가위를 사용하여 망막으로부터 제거하였다. 망막을 플랫 마운팅하고, 덮고, 밀봉하였다. 2차원 (2D) 형광 현미경검사 영상을 획득하고, 디지털화하고, 이미지 프로플러스(Image ProPlus) 또는 셀센스(CellSens) (올림푸스(Olympus)) 소프트웨어를 사용하여 분석하고, 획득후 분석은 이미지J 또는 셀센스 소프트웨어를 사용하여 수행한다 (도 4).

동결절편 분석: 동결된 블록을 동결절편화하고 (14 μm 두께), 면역조직화학을 위해 프로세싱하였다. 면역조직화학을 위해 지정된 각각의 슬라이드를 GFP에 대한 항체 및 망막 세포층의 상이한 마커를 함유하는 3종의 상이한 칵테일로 염색하였다: 칵테일 1) GFP, 로돕신 및 라미닌; 2) GFP, RPE65 및 PNA 렉틴; 3) GFP, 글루타메이트 신테타제 GS-6 및 팔로이딘. 결과를 도 5에 제시한다. 모든 3종의 항체 칵테일 및 영상화된 모든 눈에 걸친 GFP 발현의 그래프 표현을 도 6에 제시한다.

도 7- 도 11 및 표 9-표 11은 야생형 (wt) AAV 벡터 또는 본원에 기재된 변형된 AAV2 벡터를 투여한 마우스 눈의 생체내 영상화를 예시한다. 도 7은 야생형 AAV 벡터를 투여한 마우스 눈의 안저 영상 및 IHC 염색을 예시한다. wt AAV2-GFP는 안저 영상화 및 IHC 섹션 둘 다에 제시된 바와 같이 충분한 GFP 발현으로 이어지지 않았다. 도 8은 본원에 기재된 변형된 AAV2 (아미노산 잔기 587 다음에 삽입된 LKLGQTTKPA (서열식별번호: 13)를 갖는 변형된 AAV2를 포함하는 AAV2-AMI053-GFP)를 IVT 경로를 통해 마우스의 눈에 투여한 눈의 생체내 안저 영상화 및 IHC 염색을 예시한다. 변형된 AAV2는 안저 영상화 및 IHC 섹션에서 GFP 발현을 나타내었고, GFP 신호는 세포의 다중 층에서 검출되었다. 도 9는 본원에 기재된 변형된 AAV2 (아미노산 잔기 587 다음에 삽입된 LALGQTTKPA (서열식별번호: 14)를 갖는 변형된 AAV2를 포함하는 AAV2-AMI054-GFP)를 IVT 경로를 통해 마우스의 눈에 투여한 눈의 생체내 안저 영상화 및 IHC 염색을 예시한다. 변형된 AAV2는 안저 영상화 및 IHC 섹션에서 GFP 발현을 나타내었고, GFP 신호는 세포의 다중 층에서 검출되었다. 도 10은 본원에 기재된 변형된 AAV2 (아미노산 잔기 453 다음에 삽입된 LALGETTRPA (서열식별번호: 6)를 갖는 변형된 AAV2를 포함하는 AAV2-V466-GFP)를 IVT 경로를 통해 마우스의 눈에 투여한 눈의 생체내 안저 영상화 및 IHC 염색을 예시한다. 변형된 AAV2는 안저 영상화 및 IHC 섹션에서 GFP 발현을 나타내었고, GFP 신호는 세포의 다중 층에서 검출되었다. 표 10은 AAV2-VP1-GFP IVT 주사의 25-29일 후의 마우스의 안저 영상을 예시한다.

표 10. 출현 순서로, AAV2-VP1-GFP IVT 주사 및 각각 서열식별번호: 110-113, 111, 114-126, 118, 117, 및 127-128의 25-29일 후 마우스의 안저 영상

도 11은 야생형 (wt) 또는 본원에 기재된 변형된 AAV로 형질도입된 눈의 상이한 광섬유 층에서의 AAV 형질도입을 예시하는 AAV 망막 형질도입 지수 (RCTI)를 예시한다. 유리체내 경로로부터 투여된 벡터 (즉, 유리체 구조의 내부 경계막 (ILM)을 가로질러 전달된 AAV2-AMI053-GFP, 세포 상의 수용체에 대한 결합을 통해 다양한 세포가 형질도입됨)별로 조사된 세포 층의 색 강도의 점수로부터 RCTI를 계산하였다. GFP 신호의 출현은 세포에 진입 및 발현된 벡터를 나타낸다. 4개의 척도의 색 강도를 사용하여 AAV 형질도입 능력을 추정하였다: 검출된 색: 투명: 1점 또는 +; 투명; 밝은 색: 2점 또는 ++; 강한 색: 3점; 및 매우 빛나는 색 또는 +++: 4점 또는 ++++. 표 11은 출현 순서로 AAV2 형질도입된 망막 및 서열식별번호: 129-132의 예시적인 RCTI 점수화를 예시한다. 표 12는 출현 순서로 둘 다의 인간 세포 (HEK293 세포 또는 ARPE19 세포) 또는 마우스 망막에서의 AAV2 형질도입 및 서열식별번호: 129-132의 예시적인 RCTI 점수화를 예시한다.

표 11. 형질도입된 마우스의 AAV2-망막 형질도입 IHC RCTI 점수화

표 12. 변형된 AAV2로 형질도입된 세포 또는 마우스 망막의 RCTI 점수화

도 7-도 11 및 표 10-표 12에 제시된 바와 같이, N54 펩티드 (LALGQTTKPA)를 모든 AAV 벡터의 VP1 내로 삽입하여, 내부 경계막 (ILM)을 가로지른 벡터 전달 및 망막 세포에서의 발현을 증진시킬 수 있다. VFGF-트랩 단백질은 HEK293 세포에서 AAV6.N54-VEGF-트랩에 의해 유도되어 최고 수준으로 발현되고, 이어서 AAV2.N54-VEGF-트랩, 및 AAV1.N54-VEGF-트랩인 것으로 밝혀졌다. ARPE-19 세포에서, VEGF-트랩 단백질은 AAV2.N54-VEGF-트랩 및 AAV6.N54-VEGF-트랩 둘 다를 통해 유사하게 발현되었다.

도 12- 도 15 및 표 12-표 16은 야생형 AAV 벡터 또는 본원에 기재된 변형된 AAV 벡터로 형질도입된 마우스로 수행된 LCNV 연구를 예시한다. 도 12는 변형된 AAV가 LCNV 전에 마우스에게 투여된 LCNV 연구를 예시한다. AAV1, AAV2, 또는 AAV6을 VP1 캡시드 내의 LALGQTTKPA (서열식별번호: 14)의 삽입에 의해 변형시켰고, 이는 마우스의 눈에 전달하기 위한 트랜스진으로서 아플리베르셉트 (VEGF-트랩)를 운반하였다. 변형된 AAV1 (군 5, AAV1. N54-아플리베르셉트)은 VP1 캡시드의 S588 아미노산 잔기 다음에 삽입된 LALGQTTKPA (서열식별번호: 14)를 포함한다. AAV2 (군 3, AAV2. N54-아플리베르셉트)는 VP1 캡시드의 N587 아미노산 잔기 다음에 삽입된 LALGQTTKPA (서열식별번호: 14)를 포함한다. AAV6 (군 4, AAV6. N54-아플리베르셉트)은 VP1 캡시드의 S588 아미노산 잔기 다음에 삽입된 LALGQTTKPA (서열식별번호: 14)를 포함한다. 도 13a는 LCNV 연구의 눈에서의 맥락막 신생혈관화의 면적을 예시한다. Δ아플리베르셉트는 오픈 리딩 프레임 내에 붕괴를 포함하는 AAV를 마우스의 눈에 투여한 모의 대조군이었다. 비히클 군과 비교하여, 모든 3종의 변형된 AAV 군은 눈에서 맥락막 신생혈관화의 면적의 유의한 감소를 보여주었다 (AAV6.N54-아플리베르셉트, p<0.001; AAV1.N54-아플리베르셉트, p<0.01; 및 AAV2.N54-아플리베르셉트, p<0.05). 도 13b는 AAV6.N54-아플리베르셉트가 투여된 군이 눈에서 맥락막 신생혈관화의 면적의 유의한 감소를 계속해서 보여주었음을 예시한다 (AAV6.N54-아플리베르셉트, p<0.05). 도 14는 LCNV 연구 마우스로부터 수득된 안구 및 혈청 샘플 중의 아플리베르셉트 농도를 예시한다. 도 15는 마우스에서 LCNV에 의해 유도된 망막 손상에 대한 망막 아플리베르셉트 보호 효과의 플루오레세인 혈관조영 (FA) 분석을 예시한다. 안배 내의 아플리베르셉트 농도 대 레이저링에 의해 유발된 망막 손상의 상관관계는 역으로 상관되었다. AAV6.N54-아플리베르셉트 군에서 가장 현저한 LCNV 면적 감소는 도 3c, 도 3d, 표 13, 및 표 14를 제시된 바와 같이 변형된 AAV6에 의해 매개된 증가된 VEGF-트랩 발현에 상응하였다.

표 13. 3종의 변형된 AAV 벡터에 의한 마우스에서의 아플리베르셉트 발현 수준

표 14. 변형된 AAV2에 비해 변형된 AAV6의 이점

표 15 및 표 16은 눈에 투여된 후의 AAV 벡터의 국재화 및 AAV 벡터의 화물 (예를 들어, 아플리베르셉트)의 발현을 결정하기 위한 예시적인 추가 연구를 예시한다. 표 15의 연구는 적어도 부분적으로 본원에 기재된 안저 영상 및 IHC의 이용에 기초할 수 있다. 표 16의 연구는 적어도 부분적으로 LCNV, FA, OCT, FP, 조직학 및 IHC의 이용에 기초할 수 있다.

표 15. AAV 벡터 국재성 연구

표 16. AAV 벡터 효능 및 발현 연구

실시예 8. 이유 농장 돼지 모델에서의 유리체내 전달에 대한 AAV2.N54 캡시드의 생체내 시험

안구 질환의 치료를 위한 유전자 요법 약물의 유리체내 전달은 망막 박리를 유발하지 않고, 범-망막 형질도입으로 이어질 수 있고, 외래-환자 클리닉에서 국부 마취 하에 수행될 수 있기 때문에 바람직한 선택 방법이다. 야생형 AAV 벡터는 조직을 형질도입시키기에는 눈의 내부 경계막 (ILM)을 불량하게 통과한다. 따라서, ILM을 관통할 수 있는 변형된 AAV 캡시드는 유전자 요법 약물을 의도된 표적에 성공적으로 전달하기 위해 필요하다. 실시예 8은 이유 농장 돼지 모델에서 녹색 형광 단백질 (GFP)을 눈 조직 내로 깊이 전달할 수 있는 조작된 AAV2.N54 벡터의 결과를 제시한다.

클로닝 및 AAV 벡터 생산

AAV2 야생형 캡시드 유전자를 출발 물질로서 사용하여 신규 AAV 변이체 캡시드를 조작하였다. 간략하게, 여러 펩티드 서열을 조작하고, 최적화된 DNA 서열로 역전사시키고, AAV2 야생형 캡시드 유전자의 특정 위치 내로 클로닝하여 AMI053, AMI054, AMI101, AMI104 및 AMI105 플라스미드를 생성하였다. 재조합 바큘로바이러스 (rBV)를 생성하고, rBV-CMV-GFP와 함께 사용하여 Sf9-V432-AG 세포를 공동-감염시켜 GFP를 발현하는 AAV 벡터를 생산하였다. AAV 벡터를 2 라운드의 염화세슘 (CsCl) 밀도 구배 초원심분리에 의해 정제하였다. CsCl을 PD-10 탈염 칼럼을 사용한 2 라운드의 탈염을 통해 제거하고, 제제 완충제 내로 제제화하였다.

실험 설계

동물을 표 17에 따라 상이한 AAV 벡터의 유리체내 주사를 위해 군당 2마리의 동물의 6개의 군으로 나누었다.

표 17. 돼지 눈 내로 상이한 AAV 벡터의 유리체내 주사를 위한 실험 설계

외과적 절차

시험 물품을 즉시-주사 포맷으로 제조하고, 사용 시까지 < -70℃에서 저장하였다. 주사 30분 전에, 각각의 시험 물품을 해동시키고, 간략하게 원심분리 (1,000 rpm x 10초)하여 튜브의 바닥에 액체를 수집한 다음, 37℃ 수조에서 20분 동안 가열하고, 볼텍싱하여 바이러스 응집을 감소시키고; 각각의 튜브를 진탕시켜 튜브의 바닥에 액체를 응축시켰다.

절차 전날에, 동물을 밤새 금식시킨 후 마취제 투여하였다. 유리체내 주사일에, 부프레노르핀 (0.01 - 0.05 mg/kg)을 주사 전에 각각의 동물에게 근육내로 (IM) 제공하였다. 마취제 주사의 대략 15분 전에, 동물에게 아트로핀 (0.01-0.05 mg/kg, IM)을 제공하였다. 이어서, 동물을 주사를 위해 케타민/덱스메데토미딘으로 (IM) 마취시키고, 국소 5% 베타딘 용액을 사용하여 눈을 무균 상태로 준비한 후, 멸균 염수로 헹구고, 1 방울의 0.5% 프로파라카인 HCL 및 10% 페닐에프린 HCL을 적용하였다. 결막을 콜리브리 겸자로 부드럽게 잡고, 수정체와의 접촉을 피하기 위해 바늘을 약간 후방으로 향하게 하여 (평면부를 통해) 상윤부에서 2-3 mm 후방에 주사 (27-30G 바늘)하였다. 주사를 수행하고, 바늘을 천천히 회수하였다. 주사 절차 후, 1 방울의 항생제 안과용 용액을 안구 표면에 국소로 적용하였다. 이어서, 동물에게 아티파메졸을 IM 투여하여 덱스메데토미딘의 효과를 역전시키고, 절차로부터 정상적으로 회복되도록 하였다.

케이지측 관찰

이환율 및 사망률을 케이지-측 관찰과 함께 매일 관찰하였고, 특히 양쪽 눈에 주의를 기울였다. 이러한 연구 과정 동안 이환율 또는 사망률은 존재하지 않았다.

안구 검사

안구 검사를 위한 동공확대는 국소 1% 트로픽아미드 HCL을 사용하여 수행하였다 (검사 15분 전에 각각의 눈에 1 방울). 안구 표면 형태, 전안부 및 후안부 염증, 백내장 형성, 및 망막 변화를 평가하기 위해 슬릿 램프 생체현미경 및 간접 검안경을 사용하여 완전 안구 검사 (변형된 하켓(Hackett) 및 맥도날드(McDonald))를 상기 실험 설계 표에 따라 수행하였다. 이들 평가 동안 안구 소견은 나타나지 않았다. 모든 군은 평가된 모든 시점에 0의 점수를 가졌고, 어떠한 소견도 주목되지 않았다.

안저 영상화

제21일에 안저 영상화 절차 전날, 동물을 밤새 금식시킨 후 마취제 투여하였다. 연구 설계 표에 나타낸 바와 같은 날에, 동물을 케타민/덱스메데토미딘 (IM)으로 마취시키고, 레트 캠 3 (나투스)을 사용하여 영상화하였다. 컬러 영상을 먼저 획득한 후, 코발트 블루 영상을 획득하였다. 모든 군에 걸쳐 설정을 일정하게 유지시켰다. 획득 설정은 군 6 (V226) 양성 대조군 동물로 설정하였다.

결과

전체 실험 동안 비정상적 안구 소견은 관찰되지 않았다. 모든 동물이 연구 프로토콜에 따라 양호한 상태에 있는지 확인하기 위해, 국소 1% 트로피카미드 HCL (검사 15분 전에 각각의 눈에 1 방울)을 사용하여 안구 검사를 위한 동공확대를 수행하였다. 안구 표면 형태, 전안부 및 후안부 염증, 백내장 형성, 및 망막 변화를 평가하기 위해 슬릿 램프 생체현미경 및 간접 검안경을 사용하여 완전 안구 검사 (변형된 하켓(Hackett) 및 맥도날드(McDonald))를 상기 실험 설계 표에 따라 수행하였다. 이들 평가 동안 안구 소견은 나타나지 않았다.

돼지 눈 조직에서의 GFP 발현의 입증

GFP 유전자를 보유하는 상이한 AAV 벡터를 돼지 눈에 유리체내 주사하고 21일 후에, 모든 6개의 동물 군의 눈에서 안저 영상화에 기초하여 GFP 발현을 관찰하였다. 그러나, 군 1, 3, 4, 및 5의 GFP 발현 수준은 낮은 반면, 군 2 및 6은 안저 영상화에 나타난 바와 같이 훨씬 더 높은 GFP 발현 수준을 가졌다 (도 16). 점수화 척도를 사용한 안저 영상의 추가의 검사는 군 6이 둘 다의 동물에서 +++ 점수로 표시되는 가장 높은 GFP 발현을 가졌고, 이어서 군 2가 5 ++ 및 1 단일 + 점수를 가졌음을 보여준다. 군 1, 3, 및 4는 1 + 점수의 유사한 발현 수준을 가졌다. 군 5는 가장 낮은 발현 수준을 가졌다 (표 18).

표 18. 상이한 동물 군에서의 GFP 발현 수준을 보여주는 점수화 척도

IHC에 의한 눈 조직 내로의 AAV2.N54 벡터의 깊은 침투의 입증

동결절편 (14 μm)을 눈 조직에서의 GFP, RPE65, 팔로이딘, 및 DAPI의 국재화에 대해 평가하였고, 결과를 도 17에 제시한다. 병합 영상은 좌측에 제시되고, GFP 채널의 풀아웃은 우측에 제시된다. 이들 결과는 AMI054로부터 생산된 조작된 AAV (AAV2.N54로 지정됨)가 주사된 군 2 동물 (621 OS)이 V226으로부터 제조된 AAV가 주사된 대조군 6 (628 OS)과 비교하여 눈 조직에서 GFP의 더 강하고 더 깊은 침투를 보여주었음을 나타낸다. 이들 결과는 동결절편을 점수화 척도로 보다 상세하게 검사한 경우에 추가로 확인되었다 (표 19). 동결절편 분석에 등록된 모든 눈에 걸친 안구 GFP 발현의 조사를 위해, GFP 발현을 모든 망막 및 망막외 층에 걸쳐 점수화하였고; 각각의 눈은 단일 행에 의해 나타내어진다. 암회색 세포 (+++)는 GFP 발현이 가장 높은 곳을 나타내고; 중간 녹색 세포 (++)는 중간 GFP 발현이 있는 곳을 나타내고; 중간 회색 세포 (+)는 약한 GFP 발현이 있는 곳을 나타내고; 담회색 세포 (-)는 GFP가 부재하는 곳을 나타낸다. 약어: GCL/ILM - 신경절 세포층/내부 경계막; IPL - 내부 총상층; INL - 내핵층; OPL - 외부 총상층; ONL - 외핵층; IS - 내부 분절; OS - 외부 분절; RPE - 망막 색소 상피; C - 맥락막; S - 공막.

표 19. 둘 다의 항체 칵테일 및 모든 동결절편화된 눈에 걸친 GFP 발현을 보여주는 점수화 척도

검사된 동결절편은 먼저 표준 현미경으로 수행하였기 때문에, 군 2 동물의 동결절편 (620 OD 및 621 OD)을 공초점 현미경으로 추가로 검사하였다. 결과를 도 18에 제시한다. 이들 뚜렷한 영상으로부터, 본 발명자들은 GFP 발현 세포가 GCL에서 RPE 층으로 광범위하게 분포되어 있음을 확인할 수 있다. 이는 AAV2.N54 캡시드가 ILM을 효율적으로 통과할 수 있고, 눈 조직을 돼지 눈의 RPE 층까지 깊게 침투할 수 있다는 것을 명백하게 입증한다.

도 19a는 돼지의 눈으로의 AAV2.AMI054-GFP (LALGQTTKPA (서열식별번호: 14) 삽입을 포함하는 변형된 AAV2)의 유리체내 전달을 예시한다. IHC 염색은 망막 층에서의 GFP 형광을 보여주었다. 도 19b는 AAV2.AMI054-GFP가 투여된 눈의 각각의 망막 층에서의 GFP 발현을 예시한다. 동결절편 동물 No. 620-OD의 공초점 영상 #122를 인간 망막 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색 방법의 공개된 영상과 정렬하였다. 돼지 모델 연구의 결과는 N587 위치의 C-말단에서 AAV2.VP1 내로의 N54 펩티드 (서열 LALGQTTKPA (서열식별번호: 14)) 삽입을 갖는 AAV2.N54-GFP가, 망막 층 및 세포 전반에 걸친 강한 형광, 깊고 넓은 분포에 의해 예시되는, GFP 발현에서의 높은 전달 효과를 생성하였다는 것을 입증하였다 (도 19b). GFP의 강하고 광범위한 발현은 AAV2.N54 캡시드가 트랜스진을 대형 동물 및 인간의 상응하는 층 및 세포로 전달하였음을 나타내었다. 도 20은 AAV2.AMI054-GFP 또는 AAV2.7M8-GFP (대조군)가 투여된 눈 사이의 돼지 망막에서의 GFP 발현의 비교를 예시한다. AAV2.AMI054-GFP로 형질도입된 망막은 AAV2.7M8-GFP로 형질도입된 망막과 대조적으로 모든 망막 층에서 GFP 발현을 나타내었다. AAV2.AMI054-GFP 형질도입된 망막에서의 GFP 형광은 AAV2.7M8-GFP 형질도입된 망막보다 2배 더 강하였다. 표 20은 본원에 기재된 5종의 변형된 AAV: AMI053, AMI054, AMI101, AMI104 또는 AMI105에 의해 형질도입된 인간 세포 (HEK293 세포 또는 ARPE19 세포), 마우스 모델, 및 돼지 모델에서의 GFP 발현 강도 수준을 예시한다. +의 증가하는 수는 형질도입된 세포에서 검출된 GFL 강도의 증가를 나타낸다.

표 20. 형질도입된 인간 세포, 마우스 모델, 및 돼지 모델에서의 GFP 발현 강도

본 연구는 이유 농장 돼지 (햄프셔 교배)에서 수행하여, 이유 돼지에서의 단일 유리체내 주사 후 GFP 발현 패턴에 대한 6종의 상이한 AAV2 바이러스 캡시드 돌연변이체의 효과를 평가하였다. 제7일 및 제21일의 임상 검사에서 안구 소견은 나타나지 않았다. GFP는 코발트 블루 안저 영상화를 통해 모든 군에서 생체내 용이하게 관찰되었다. 동결절편에 대한 단면 분석을 통해 군 1, 2, 3, 4 및 6에서 GFP 발현을 추가로 평가하였다. 군 6 (V226; 양성 대조군)은 안저 영상화 및 단면 분석 둘 다에서 강하고 넓은 GFP 발현을 나타내었다. GFP 신호는 GCL에서 OPL 층까지 가장 강했지만, ONL에서 RPE 층까지는 덜 강하였다. 군 2 (AMI054)도 또한 GFP의 강하고 넓은 안저 발현, 및 GCL에서 OS 층까지의 발현, 총 7-층의 강한 발현을 가졌다. 안저 영상화에서 군 1 (AMI053), 3 (AMI101) 및 4 (AMI104) 사이의 보통의 차이는 또한 외부 총상층 (OPL)을 통한 넓고 밝은 발현을 갖는 군 1로부터의 618 OD를 사용한 단면 분석에서 명백하였다. 군 3 (AMI101)에서의 GFP 발현은 신경절 세포 층에서 밝았고, 나머지 층을 통해서는 중간 정도였다. 군 4에서, GFP 발현은 망막 전반에 걸쳐 중간 정도 내지 낮았다. 군 1, 2 및 6에 대해 내핵 및 외부 총상층에서 매우 높은 발현이 주목되었다. 이들 GFP 양성 세포의 형태학적 분석은 무축삭 세포 아이덴티티를 나타내었고; 추후 연구는 무축삭 마커가 GFP와 공동-국재화되는지 평가하기 위해 공동-표지화 접근법을 이용하여야 한다. 맥락막 및 공막 GFP 발현은 어떠한 눈에서도 관찰되지 않았고, RPE GFP 발현은 다른 망막 층과 비교하여 희미하였다. 종합하면, 군 2 (AAV2.N54)는 가장 넓은 GFP 발현 층을 나타내었고, 강한 GFP 발현으로 눈 조직의 7개 층을 깊이 관통함으로써 군 6 (V226)을 능가하였다.

실시예 9. 비인간 영장류에서 유리체내 투여 후 AAV GFP 후보의 생체분포 및 트랜스진 발현의 평가

아프리카 녹색 원숭이에서 유리체내 (IVT) 투여 후 AAV 후보의 녹색 형광 단백질 (GFP) 발현의 생체분포 및 농도를 평가하기 위함. 원숭이는 슬릿 램프 생체현미경검사, 안저검사, 컬러 안저 영상화, 공초점 스캐닝 레이저 검안경검사 (cSLO), 및 광 간섭 단층촬영 (OCT)에 의해 AAV 중화 항체 (nAb) 혈청음성, 전혈구 계수 (CBC), 전반적 웰빙, 및 안구 건강을 평가하기 위해 기준선 스크리닝을 거칠 것이다. 정상 소견을 갖는 nAb 음성 원숭이를 연구에 등록하고, 처리군 (표 21)에 배정할 것이다. 기준선 스크리닝 및 모든 후속 절차를 위해, 근육내 케타민 (8mg/kg) 및 크실라진 (1.6 mg/kg)으로 마취를 달성하고, 국소 10% 페닐에프린, 1% 트로픽아미드 및/또는 1% 시클로펜톨레이트로 동공 확장을 실시할 것이다.

표 21. 처리 배정

유리체내 (IVT) 투여

국소 프로파라카인 0.5%를 투여하고, 30초 동안 효과가 발휘되도록 하고, 개안기를 위치시킨 다음, 안구 표면을 5% 베타딘 용액으로 헹구고, 이어서 멸균 0.9% 염수로 헹굴 것이다. 윤부의 ~2 mm 후방의 거상연 수준에서 측두하로 삽입된 31-게이지 5/16-인치 바늘/시린지 (울티케어(Ulticare) VetRx U-100 또는 등가물)를 사용하여 처리 배정 (표 21)에 따라 양쪽 눈 (OU)에 IVT 주사를 수행할 것이다. 주사 후, 국소 항생제 안과용 연고 (네오마이신, 폴리믹신, 바시트라신 또는 등가물)를 투여할 것이다.

전신 면역억제 요법

동물은 제-1일에, 이어서 3주 동안 매주 메틸프레드니솔론 (8 mg/kg)의 근육내 (IM) 전달을 받을 것이다 (표 22).

표 22. 연구 스케줄

X는 모든 군에서 발생하는 사건을 나타낸다

* 메틸프레드니솔론 (8 mg/kg IM)을 매주 투여하였다

+ 동물은 제28일 검사 데이터의 검토 후에 안락사될 것이고, 이는 후속일이 될 수 있다.

안압측정

지정된 시점 (표 22)에 개 (d) 보정 설정으로 설정된 토노베트(TonoVet) 안압계를 사용하여 안내압 (IOP)을 OU 측정할 것이다. 각각의 눈으로부터 3개의 측정치를 취하고, 평균 IOP를 계산할 것이다.

슬릿 램프 검사

지정된 시점 (표 22)에, 양쪽 눈 (OU)을 슬릿 램프 생체현미경검사에 의해 검사할 것이다. 검사 성분으로부터 유래된 요약 점수 및 비인간 영장류 안과 점수화 시스템을 사용하여 정성적 임상 안과 소견에 대해 점수화를 적용할 것이다.

안저 영상화

지정된 시점 (표 22)에, GFP 발현을 검출하기 위한 컬러 전방 및 안저 영상화 및 형광 안저 영상화를, 캐논(Canon) 6D 디지털 영상화 하드웨어 및 뉴 비전(New Vision) 안저 영상 분석 시스템 소프트웨어를 갖는 탑콘(Topcon) TRC-50EX 망막 카메라를 사용하여 각각의 4분면에서 획득한 추가의 주변 영상과 함께 황반 상에 중심을 두고 50^o 시야로 OU 수행할 것이다. 컬러 안저 사진은 셔터 속도 (Tv) 1/25초, ISO 400 및 플래시 18로 포획할 것이다. 단색 및 컬러 형광 영상은 결속된 여기자 및 장벽 필터 (480nm 여기자/525nm 장벽 필터), Tv 1/5초, ISO 3200 및 플래시 300으로 포획하였다. 눈의 망막중심와, 주변 및 혈관주위 영역에서 0 = 부재; 1 = 미량; 2 = 경미; 3 = 중간 정도; 4 = 밝음 및 5 = 강함의 점수로 적절하게 적용되는 정량 분석에 의해 GFP 발현의 정도를 규정하기 위해 점수화 시스템을 사용하여 형광 사진을 평가할 것이다.

광 간섭 단층촬영 (OCT) 및 공초점 주사 레이저 검안경검사 (cSLO)

지정된 시점 (표 22)에, 기준선 영상을 참조하는 헤이엑스 트루트랙(Heyex TruTrack) 및 오토레스캔(AutoRescan) 추적 영상화 기능을 이용하는 하이델베르크 스펙트랄리스(Heidelberg Spectralis) OCT HRA (또는 OCT 플러스)를 사용하여 OCT 및 cSLO를 OU 수행할 것이다. cSLO 적외선 (IR) 및 자가형광 (AF) 망막 영상은 광각 50° 렌즈에 이어 조밀한 스캔 간격으로의 전체 황반의 전반적 OCT 부피 스캔을 사용하여 수득할 것이다. 영상은 적절한 경우에 OCT 망막 두께 데이터 및 GFP 발현의 정량 분석에 의해 정성적으로 평가될 것이다. 동공 크기 및 매체 선명도에 의해 허용되는 경우에, 광각 렌즈를 사용하여 주변 시야를 수득할 것이고/거나 각각의 영상 파일에 포획되는 망막 면적을 최대화하기 위해 복합 영상 기능을 이용할 것이다.

임상 관찰

투여 1주 전에 시작하여 케이지측 관찰에 의해 1일 2회 전반적 웰빙을 확인할 것이다. 매일 사료공급 전에 케이지를 세척하기 전에 사료 팬 및 케이지 바닥의 육안 검사에 의해 사료 소비 및 전반적인 식욕을 평가할 것이다. 동물을 종창, 변색, 사시증, 또는 눈 문지름을 비롯한 안구 염증의 징후에 대해 평가할 것이다.

체중

지정된 시점 (표 22)에 동물 체중을 측정할 것이다.

감별 CBC

지정된 시점 (표 22)에, 0.5-1 mL 전혈을 수집하고, 헤마베트(Hemavet) 분석기에 의한 감별 CBC의 결정을 위해 K3EDTA 라벤더-탑 튜브로 바로 옮길 것이다.

혈청 수집

전혈 (3 mL)을 지정된 시점 (표 22)에 대퇴 또는 복재 정맥을 통해 수집할 것이다. 혈액을 바큐테이너 튜브로 (항응고제의 부재 하에) 옮기고, 실온에서 대략 1시간 동안 인큐베이션한 후, 4℃에서 10분 동안 4000 rpm으로 원심분리하고, 혈청 분취물을 단리할 것이다 (시점당 ~0.5 mL x 2 분취물). -70℃ 미만에서 분취물을 저장하고, nAb 분석을 위해 지정 실험실로 운송할 것이다.

종료

규정된 종료 전에 최종 영상 품질을 확인한 후, 원숭이를 케타민 (8 mg/kg) 및 크실라진 (1.6 mg/kg)으로 근육내로 진정시켜 효과가 발휘되도록 하고, 소듐 펜토바르비탈 (100 mg/kg IV)로 안락사시킬 것이다.

눈 수집

윤부의 12시 위치에 봉합사를 놓은 후, 눈을 적출하고, 과량의 안와 조직을 트리밍할 것이다. 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 및 면역조직화학 (IHC) 염색을 위한 눈 수집: ~200 uL의 유리체를 채취한 후, 군 2-6으로부터의 3개의 눈 및 군 1로부터의 1개의 눈을 ~400 uL의 4% 파라포름알데히드 (PFA)의 유리체 챔버 내로의 주사에 의해 고정시키고, 이어서 4% PFA 중에 실온에서 24시간 동안 침지시킨 다음, 0.05% 아지드화나트륨을 함유하는 PBS로 옮기고, 크레도 큐브(Credo Cube) 온도-제어 저온 용기 내에서 4℃에서 저장하고, H&E 및 GFP IHC 염색 및 후극의 황반 영역에 걸친 최소 20개의 수평 절편을 분석하기 위해 의뢰자 지정 실험실로 운송할 것이다. -70℃ 미만에서 유리체를 저장하고, ELISA에 의한 단백질 분석을 위해 의뢰자에게 운송할 것이다. 단백질 및 RNA 분석을 위한 눈 수집: 각각의 군으로부터의 1개의 눈을 액체 질소 증기 중에서 급속 동결시킨 후, 천연 조직 평면을 따라 실온에서 해부할 것이다. 전안부를 제거할 것이고, 이어서 종방향 절단부를 동결된 안배에 위치시켜 동결된 후극을 플랫 마운팅하고 유리체를 수집할 것이다. 유리체액 (~2.5 mL 전체 부피)을 2개의 분취액으로 나눌 것이다. 플랫 마운트를 상부 및 하부 절반-플랫 마운트로 나눌 것이고, 망막을 RPE/맥락막으로부터 분리하고, 각각을 개별적으로 수집할 것이다. 모든 샘플을 라벨링된 크리오바이알에 넣고, -70℃ 미만에서 저장하고, GFP ELISA 분석에 의한 단백질 분석 및 RT-PCR에 의한 mRNA 분석을 위해 의뢰자에게 운송할 것이다. 조직 교차 오염을 최소화하기 위해 눈과 조직 사이에서 기기를 물에 이어서 70%이소프로필 알콜 중에서 세정할 것이다.

데이터 분석

통계적 방법: 표 22에 열거된 프로토콜-규정된 종점으로부터 생성된 데이터를 수집하고, 요약하고, 표 23에 상세화된 바와 같이 분석할 것이다. 샘플 크기가 주어지면, 적절한 경우에 기술 통계학이 적용될 것이다.

표 23. 데이터 산출물

실시예 10. 레이저-유도된 맥락막 신생혈관화의 비-인간 영장류 모델에서의 유리체내 AAV 벡터 후보의 효능 연구 및 장기간 PK 연구

레이저-유도된 맥락막 신생혈관화 (CNV) 모델에서 아프리카 녹색 원숭이에의 유리체내 (IVT) 투여 후, 습성 연령-관련 황반 변성 (wAMD), 당뇨병성 황반 부종 (DME), 망막 정맥 폐쇄 (RVO) 및 폴립양 맥락막 혈관병증 (PCV)을 표적화하는 아플리베르셉트를 발현하는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터 후보의, 발현된 유전자의 장기간 안구 PK의 결정 & 효능의 평가.

원숭이는 안압측정, 슬릿 램프 생체현미경검사, 안저검사, 컬러 안저 촬영, 플루오레세인 혈관조영 (FA), 공초점 스캐닝 레이저 검안경검사 (cSLO), 광 간섭 단층촬영 (OCT)에 의해 AAV 중화 항체 (nAb) 혈청음성, 전혈구 계수 (CBC), 전반적 웰빙, 및 안구 건강을 평가하기 위해 기준선 스크리닝을 거칠 것이다. 정상 소견을 갖는 nAb 음성 원숭이를 연구에 등록하고, 성별 및 기준선 체중에 의해 무작위화된 처리군 (표 24)에 배정할 것이다. 영상화에 필요한 시간을 수용하기 위해, 원숭이를 연속 일의 CNV 레이저-유도, 투여, 및 영상화를 위해 3개의 코호트로 나눌 것이다 (표 25). 기준선 스크리닝 및 모든 후속 절차를 위해, 근육내 케타민 (8 mg/kg) 및 크실라진 (1.6 mg/kg)으로 마취를 달성하고, 국소 10% 페닐에프린, 1% 트로픽아미드 및/또는 1% 시클로펜톨레이트로 동공 확장을 실시할 것이다.

표 24. 처리 배정

표 25. 연구 스케줄

# 42마리의 동물이 등록되고, >72?가 중화 항체에 대해 스크리닝되고, 최대 >24 - 36?이 안과적 건강에 대해 스크리닝된다

X는 모든 군에서 발생하는 사건을 나타낸다

* 컬러 안저 사진은 레이저 직후에 수행될 것이다. 국소 1% 아트로핀 겔은 레이저 처리의 1 또는 2일 전 밤에 적용될 것이다

** 군 6은 레이저 모델 유도 후에 투여될 것이다

*** 제0일 방수 및 유리체 천자는 IVT 투여 전에 채취될 것이다

$ PK 선별된 동물: n =2, d70, d114 & d169 - 방수 & 유리체 PK/ADA를 위한 눈 수집 & 망막 독성 분석을 위한 풀 마운트, PK & ADA를 위한 혈청 채취, 독성에 대한 IHC를 위한 간 제거

n=2 d169 IOP & 선별 전 슬릿 램프

전신 면역억제 요법

연구 제-1일 및 또 다른 4주 동안 매주 메틸프레드니손 (8 mg/kg)의 근육내 (IM) 전달 (표 25).

유리체내 투여

국소 프로파라카인 0.5%를 투여하고, 개안기를 위치시킨 다음, 안구 표면을 5% 베타딘 용액으로 헹구고, 이어서 멸균 0.9% 염수로 헹굴 것이다. 윤부의 ~2 mm 후방의 거상연 수준에서 측두하로 삽입된 31-게이지 5/16-인치 바늘을 사용하여 처리 배정 (표 24)에 따라 양쪽 눈 (OU)에 IVT 주사를 수행할 것이다. 주사 후, 국소 항생제 안과용 연고 (네오마이신, 폴리믹신, 바시트라신 또는 등가물)를 투여할 것이다.

CNV의 레이저 유도

레이저 광응고는 지정된 시점에 수행할 것이다 (표 25). 동공 확장은 레이저 처리 전에 국소 10% 페닐에프린 히드로클로라이드 및 1% 시클로펜톨레이트 안과용 용액을 사용하여 달성할 것이다. 동공확대를 증진시키기 위해 레이저 처리의 1 또는 2일 전 밤에 추가적으로 1% 아트로핀 안과용 겔의 국소 투여가 적용될 것이다. 안과의사는 이리덱스 오쿨라이트(Iridex Oculight) TX 532 nm 레이저를 이용하여 레이저 지속시간 100 ms, 스팟 크기 50 μm, 전력 750 mW로, 각각의 눈의 황반주위 영역 내에 6개의 레이저 스팟을 대칭적으로 배치할 것이다. 레이저 병변을 문서화하기 위해 레이저 처리 직후에 컬러 안저 촬영을 수행할 것이다. 레이저 직후에 중증 망막/망막하 출혈을 입증하고 추적 검사 시까지 해소되지 않은 임의의 스팟은 분석에서 배제될 것이다.

안압측정

지정된 시점 (표 25)에 개 (d) 보정 설정으로 설정된 토노베트(TonoVet) (아이케어(iCare), 핀란드) 안압계를 사용하여 안내압 (IOP) 측정을 수행할 것이다. 각각의 시점에 각각의 눈으로부터 3개의 측정치를 취하고, 평균 IOP를 정의할 것이다.

슬릿 램프 생체현미경검사

지정된 시점 (표 25)에 슬릿 램프 생체현미경검사를 사용하여 안내 염증을 검사할 것이다. 검사 성분으로부터 유래된 요약 점수와 함께 비인간 영장류 안과 검사 점수화 시스템을 사용하여 정성적 임상 안과 소견에 대해 점수화를 적용할 것이다.

컬러 안저 촬영 및 플루오레세인 혈관조영

지정된 시점 (표 25)에, 캐논 6D 디지털 영상화 하드웨어 및 뉴 비전 안저 영상 분석 시스템 소프트웨어를 갖는 탑콘 TRC-50EX 망막 카메라를 사용하여 망막중심와 상에 중심을 두고 50^o 시야로 양측 컬러 안저 영상을 포획할 것이다. 플루오레세인 혈관조영 (FA)은 0.1 mL/kg의 10% 소듐 플루오레세인의 정맥내 투여로 수행할 것이다. OD FA를 OS 혈관조영보다 2시간 초과만큼 먼저 행하여 혈관조영상 영상 시리즈 사이의 플루오레세인의 세척을 가능하게 할 것이다. CNV 병변의 혈관조영상에서의 플루오레세인 누출은 영상 강도의 균일한 조정 후에 생성된 복합사항을 평가하여 등급화할 것이다 (I-IV; 표 26). 또한 이미지J 소프트웨어를 사용하여 후기 미가공 혈관조영상의 영상 형광 밀도측정 분석을 수행할 것이다.

표 26. 레이저 병변 등급화 척도

광 간섭 단층촬영

지정된 시점 (표 25)에 시선 추적 및 헤이엑스 영상 포획 및 분석 소프트웨어를 갖는 하이델베르크 스펙트랄리스 OCT 플러스를 사용하여 OCT를 수행할 것이다. 후방 망막을 포괄하는 전체 부피 스캔을 수행할 것이다. 레이저 전 검사에서, 망막 두께 맵 및 단면 디스플레이 영상을 수득할 것이다. 레이저-후 검사에서, 각각의 병변에 중심을 두고 눈당 6개의 별-형상 스캔, 뿐만 아니라 조밀한 스캔 간격으로 6개의 레이저 스팟을 포괄하는 전체 황반의 전반적 부피 스캔을 수행할 것이다. 각각의 레이저 병변에서 각각의 별-형상 스캔 내의 최대 CNV 복합체 형성의 주축을 규정할 것이고, CNV 복합체 면적을 이미지J 내의 프리핸드 도구를 사용하여 측정하여 CNV 복합체 경계를 파악하고 최대 복합체 면적을 제곱 마이크로미터 (μm²)로 계산할 것이다.

임상 관찰

투여 1주 전에 시작하여 케이지측 관찰에 의해 1일 2회 전반적 웰빙을 확인할 것이다. 전반적인 식욕에 대한 상용 사료공급 후 케이지를 세척하기 전에 사료 팬 또는 케이지 바닥의 육안 검사에 의해 매일 개별 사료 소비를 평가할 것이다. 이들 관찰 동안, 동물을 안구 염증의 징후에 대해, 특히 사시증 또는 눈 문지름과 같은 증상에 주목하여 관찰할 것이다.

체중

지정된 시점 (표 25)에 체중을 수집할 것이다.

혈청 수집

동물을 이전에 상술된 바와 같이 진정 하에 유지시키면서 전혈 (4 mL)을 지정된 시점 (표 24)에 대퇴 또는 복재 정맥을 통해 수집할 것이다. 혈액을 바큐테이너 튜브로 (항응고제의 부재 하에) 옮기고, 실온에서 대략 1시간 동안 인큐베이션한 후, 4℃에서 10분 동안 4000 rpm으로 원심분리하고, 혈청 분취물을 단리할 것이다 (시점당 ~0.75 mL x 2 분취물). -70℃ 미만에서 분취물을 저장하고, nAb 분석을 위해 의뢰자 지정 실험실로 운송할 것이다.

방수 및 유리체액 수집

방수 (각각 50 μL 및 연구 종료 시 전체 부피 ~150 μL)는 IVT 주사에 대해서와 같이 눈의 멸균 준비 후에 31-게이지 바늘을 갖는 0.3 mL 인슐린 시린지를 사용하여 지정된 시점 (표 25)에 샘플링할 것이다. 유리체액 (각각 50 μL 및 연구 종료 시 ~150 μL)은 IVT 주사에 대해서와 같이 눈의 멸균 준비 후에 28-게이지 바늘을 갖는 0.5 mL 인슐린 시린지를 사용하여 지정된 시점 (표 25)에 샘플링할 것이다. 양측 방수 및/또는 유리체 천자 후에 (연구 종료 제외), 국소 삼중 항생제 네오마이신, 폴리믹신, 바시트라신 안과용 연고 (또는 등가물)를 투여할 것이다. 방수 및 유리체 샘플을 사전-라벨링된 크리오튜브로 옮기고, 습윤 얼음 상에 놓고, 수집 30분 내에 -70℃ 미만에서 저장할 것이다.

종료

종료-전 영상 품질을 확인한 후에 동물을 소듐 펜토바르비탈 (효과를 얻기 위해 100 mg/kg IV)로 안락사시킬 것이다.

눈 수집

눈을 적출하고, 과량의 안와 조직을 트리밍할 것이다. 플랫 마운트 면역조직화학 (IHC) 염색 및 영상 분석을 위한 눈 수집: 각각의 군으로부터의 3쌍의 눈에 ~200 4% 파라포름알데히드 (PFA)를 주사한 다음, PFA 중에 6시간 동안 후-고정하고, 크레도 큐브 온도-제어 저온 용기 내에서 4℃에서 저장하고, 추가 프로세싱을 위해 의뢰자 지정 실험실로 운송할 것이다. 전안부를 거상연 수준에서 원주방향 절단에 이어 안배에서 종방향 절단에 의해 제거하여 IHC 및 공초점 영상화를 위한 플랫 마운팅을 가능하게 할 것이다. 단백질 분석을 위한 눈 수집: 각각의 군으로부터의 3쌍의 눈을 액체 질소 증기 중에서 급속 동결시킨 후, 천연 조직 평면을 따라 실온에서 해부할 것이다. 전안부를 제거할 것이고, 이어서 종방향 절단부를 동결된 안배에 위치시켜 동결된 후극을 플랫 마운팅하고 유리체를 수집할 것이다. 유리체액 (~2.5 mL 전체 부피)을 2개의 분취액으로 나눌 것이다. 망막을 RPE/맥락막으로부터 분리하고, 각각을 개별적으로 수집할 것이다.

데이터 분석

표 25에 열거된 프로토콜-규정된 종점으로부터 생성된 데이터를 수집하고, 요약하고, 표 27에 상세화된 바와 같이 분석할 것이다. 명시된 통계적 분석은 데이터가 요구되는 가정을 충족시키는 경우에 수행할 것이다. 데이터가 규정된 통계적 방법에 대한 가정을 충족시키지 못하면, 가능한 경우에 대안적 방법이 사용될 수 있다. P 값 ≤0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주될 것이다.

표 27: 데이터 분석 카테고리

본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 제시되고 기재되었지만, 이러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다는 것이 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 발명을 벗어나지 않으면서 다수의 변경, 변화 및 치환이 본 발명에 이르러 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이루어질 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 하기 청구범위는 본 발명의 범주를 규정하고, 이들 청구범위의 범주 내의 방법 및 구조 및 그의 등가물이 그에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> AVIRMAX, INC. <120> ENGINEERED VIRAL CAPSIDS AND METHODS OF USE <130> 59561-701601 <140> <141> <150> 63/111,739 <151> 2020-11-10 <160> 133 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 735 <212> PRT <213> Adeno-associated dependoparvovirus A <400> 1 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly 145 150 155 160 Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270 Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr 435 440 445 Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln 450 455 460 Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly 465 470 475 480 Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn 485 490 495 Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly 500 505 510 Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp 515 520 525 Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys 530 535 540 Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr 545 550 555 560 Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr 565 570 575 Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr 580 585 590 Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp 595 600 605 Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr 610 615 620 Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys 625 630 635 640 His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn 645 650 655 Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln 660 665 670 Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys 675 680 685 Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr 690 695 700 Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr 705 710 715 720 Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 2 <211> 734 <212> PRT <213> Adeno-associated dependoparvovirus A <400> 2 Met Thr Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser Glu 1 5 10 15 Gly Val Arg Glu Trp Trp Ala Leu Gln Pro Gly Ala Pro Lys Pro Lys 20 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 38 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly 145 150 155 160 Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 48 cgagactgca ggctctagat tacag 25 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 49 ggagtaccag ctcccgtacg tcctc 25 <210> 50 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 50 ctagcactcg gcgaaacaac aagacctgct accaccacgc agtcaaggc 49 <210> 51 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 51 agcaggtctt gttgtttcgc cgagtgctag tccacttgga gtgtttgtt 49 <210> 52 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 52 ctagcactcg gcgaaacaac aaagcctgct aggcaagcag ctaccgcag 49 <210> 53 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 53 agcaggcttt gttgtttcgc cgagtgctag gttgcctctc tggaggttg 49 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primer <400> 59 cgagactgca ggctctagat tacag 25 <210> 60 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 60 cttaggcttt gttgtctggc cgagtgctag gttgcctctc tggaggttg 49 <210> 61 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 61 ctagcactcg gccagacaac aaagcctaag aggcaagcag ctaccgcag 49 <210> 62 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 62 tgcaggcttt gttgtctggc cgagctttag gttgcctctc tggaggttg 49 <210> 63 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 63 ctaaagctcg gccagacaac aaagcctgca aggcaagcag ctaccgcag 49 <210> 64 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 64 tgcaggcttt gttgtctggc cgagtgctag gttgcctctc tggaggttg 49 <210> 65 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 65 ctagcactcg gccagacaac aaagcctgca aggcaagcag ctaccgcag 49 <210> 66 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 66 tagctgcttg tgcgttgcct gcctggaggt tggtagatac agaac 45 <210> 67 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 67 acctccaggc aggcaacgca caagcagcta ccgcagatgt caaca 45 <210> 68 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 68 tagctgcttg cctgttgcct gcctggaggt tggtagatac agaac 45 <210> 69 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 69 acctccaggc aggcaacagg caagcagcta ccgcagatgt caaca 45 <210> 70 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 70 tagctgcttg tgcgttgcct ctctggaggt tggtagatac agaac 45 <210> 71 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 71 acctccagag aggcaacgca caagcagcta ccgcagatgt caaca 45 <210> 72 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 72 ctagcactcg gccagacaac aaagcctgca accaccacgc agtcaaggc 49 <210> 73 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 73 tgcaggcttt gttgtctggc cgagtgctag tccacttgga gtgtttgtt 49 <210> 74 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 74 ctagcactcg gccagacaac aaagcctgca ggaaccacca cgcagtcaa 49 <210> 75 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 75 tgcaggcttt gttgtctggc cgagtgctag acttggagtg tttgttctg 49 <210> 76 <211> 49 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Sequence: Synthetic primer <400> 81 tgcaggcttt gttgtctggc cgagtgctag tctctggagg ttggtagat 49 <210> 82 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 82 gtggcactcg gccagacaac aaagcctgca aggcaagcag ctaccgcag 49 <210> 83 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 83 tgcaggcttt gttgtctggc cgagtgccac gttgcctctc tggaggttg 49 <210> 84 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 84 ctagcactcg gccagacaac aaagcctgca ggaaccacca cgcagtcaa 49 <210> 85 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 85 tgcaggcttt gttgtctggc cgagtgctag acttggagtg tttgttctg 49 <210> 86 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 86 ctggcactcg gcgagtcgac agcgcggggc aacaggcaag cagctaccg 49 <210> 87 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 87 gccccgcgct gtcgactcgc cgagtgccag gcctctctgg aggttggta 49 <210> 88 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 88 ctggcactcg gcgagacaag caagcgggca aacaggcaag cagctaccg 49 <210> 89 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 89 tgcccgcttg cttgtctcgc cgagtgccag gcctctctgg aggttggta 49 <210> 90 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 90 ctagcactcg gccagagcac aaagcctgca aacaggcaag cagctaccg 49 <210> 91 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 91 tgcaggcttt gtgctctggc cgagtgctag gcctctctgg aggttggta 49 <210> 92 <211> 742 <212> PRT <213> Adeno-associated dependoparvovirus A <400> 92 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Lys Gln Leu Glu Gln Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Gln Arg Leu Ala Thr Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Ile Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Leu Glu Lys Thr Pro Asn Arg Pro Thr Asn Pro Asp Ser Gly Lys 145 150 155 160 Ala Pro Ala Lys Lys Lys Gln Lys Asp Gly Glu Pro Ala Asp Ser Ala 165 170 175 Arg Arg Thr Leu Asp Phe Glu Asp Ser Gly Ala Gly Asp Gly Pro Pro 180 185 190 Glu Gly Ser Ser Ser Gly Glu Met Ser His Asp Ala Glu Met Arg Ala 195 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S, or Q <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> A, N, Q, S, T, E, D, K, R, or H <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> A, N, Q, S, T, E, D, K, R, or H <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> K, R, E, or A <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> P or R <400> 93 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 94 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> E, S, or Q <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> A, N, Q, S, T, E, D, K, R, or H <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> A, N, Q, S, T, E, D, K, R, or H <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> K, R, E, or A <400> 94 Leu Ala Leu Gly Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 95 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> E, S, or Q <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> A, N, Q, S, T, E, D, K, R, or H <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> A, N, Q, S, T, E, D, K, R, or H <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> K, R, E, or A <400> 95 Leu Lys Leu Gly Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 96 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> E, S, or Q <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> A, N, Q, S, T, E, D, K, R, or H <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> A, N, Q, S, T, E, D, K, R, or H <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> K, R, E, or A <400> 96 Val Lys Leu Gly Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 97 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> E, S, or Q <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> A, N, Q, S, T, E, D, K, R, or H <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> K, R, E, or A <400> 97 Val Lys Leu Gly Xaa Xaa Thr Xaa 1 5 <210> 98 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> E, S, or Q <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> A, N, Q, S, T, E, D, K, R, or H <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> A, N, Q, S, T, E, D, K, R, or H <400> 98 Val Lys Leu Gly Xaa Xaa Xaa Lys 1 5 <210> 99 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> E, S, or Q <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> A, N, Q, S, T, E, D, K, R, or H <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> K, R, E, or A <400> 99 Leu Ala Leu Gly Xaa Xaa Thr Xaa 1 5 <210> 100 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> E, S, or Q <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> A, N, Q, S, T, E, D, K, R, or H <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> K, R, E, or A <400> 100 Leu Ala Leu Gly Xaa Xaa Ser Xaa 1 5 <210> 101 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> E, S, or Q <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> A, N, Q, S, T, E, D, K, R, or H <400> 101 Leu Ala Leu Gly Xaa Xaa Thr Arg 1 5 <210> 102 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> E, S, or Q <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> A, N, Q, S, T, E, D, K, R, or H <400> 102 Leu Ala Leu Gly Xaa Xaa Thr Lys 1 5 <210> 103 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> E, S, or Q <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> A, N, Q, S, T, E, D, K, R, or H <400> 103 Leu Ala Leu Gly Xaa Xaa Thr Glu 1 5 <210> 104 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> E, S, or Q <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> A, N, Q, S, T, E, D, K, R, or H <400> 104 Leu Ala Leu Gly Xaa Xaa Thr Ala 1 5 <210> 105 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> E, S, or Q <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> A, N, Q, S, T, E, D, K, R, or H <400> 105 Leu Ala Leu Gly Xaa Xaa Ser Lys 1 5 <210> 106 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> E, S, or Q <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> A, N, Q, S, T, E, D, K, R, or H <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> K, R, E, or A <400> 106 Leu Lys Leu Gly Xaa Xaa Thr Xaa 1 5 <210> 107 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> E, S, or Q <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> A, N, Q, S, T, E, D, K, R, or H <400> 107 Leu Lys Leu Gly Xaa Xaa Thr Lys 1 5 <210> 108 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> V, I, L, F, W, Y, or M <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> A, N, Q, S, T, E, D, K, R, or H <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> V, I, L, or M <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> A, N, Q, S, T, E, D, K, R, or H <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> E, S, or Q <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> A, N, Q, S, T, E, D, K, R, or H <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> A, N, Q, S, T, E, D, K, R, or H <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> K, R, E, or A <400> 108 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 109 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 109 cgcaaucagu gaaugcuuau acauccg 27 <210> 110 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 110 Thr Pro Ser Gly Leu Ala Leu Gly Glu Thr Thr Arg Pro Ala Thr Thr 1 5 10 15 Thr Gln <210> 111 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 111 Gln Arg Gly Asn Leu Ala Leu Gly Glu Thr Thr Lys Pro Ala Arg Gln 1 5 10 15 Ala Ala <210> 112 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 112 Asn Thr Pro Ser Ala Leu Gly Glu Thr Thr Lys Pro Gly Thr Thr Thr 1 5 10 15 <210> 113 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 113 Asn Thr Pro Ser Ala Leu Gly Glu Thr Thr Lys Pro Gly Thr Thr Thr 1 5 10 15 <210> 114 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 114 Gln Arg Gly Asn Leu Lys Leu Gly Gln Thr Thr Lys Pro Lys Arg Gln 1 5 10 15 Ala Ala <210> 115 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 115 Gln Arg Gly Asn Leu Ala Leu Gly Gln Thr Thr Lys Pro Lys Arg Gln 1 5 10 15 Ala Ala <210> 116 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 116 Gln Arg Gly Asn Leu Lys Leu Gly Gln Thr Thr Lys Pro Ala Arg Gln 1 5 10 15 Ala Ala <210> 117 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 117 Gln Arg Gly Asn Leu Ala Leu Gly Gln Thr Thr Lys Pro Ala Arg Gln 1 5 10 15 Ala Ala <210> 118 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 118 Thr Pro Ser Gly Leu Ala Leu Gly Gln Thr Thr Lys Pro Ala Thr Thr 1 5 10 15 Thr Gln <210> 119 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 119 Gln Arg Gly Asn Leu Ala Leu Gly Gln Thr Thr Glu Pro Ala Arg Gln 1 5 10 15 Ala Ala <210> 120 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 120 Arg Gly Asn Arg Leu Ala Leu Gly Gln Thr Thr Lys Pro Ala Gln Ala 1 5 10 15 Ala Thr <210> 121 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 121 Asn Leu Gln Arg Leu Ala Leu Gly Gln Thr Thr Lys Pro Ala Gly Asn 1 5 10 15 Arg Gln <210> 122 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 122 Gln Arg Gly Asn Val Ala Leu Gly Gln Thr Thr Lys Pro Ala Arg Gln 1 5 10 15 Ala Ala <210> 123 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 123 Leu Gln Arg Gly Leu Ala Leu Gly Glu Ser Thr Ala Arg Gly Asn Arg 1 5 10 15 Gln Ala <210> 124 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 124 Leu Gln Arg Gly Leu Ala Leu Gly Glu Thr Ser Lys Arg Ala Asn Arg 1 5 10 15 Gln Ala <210> 125 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 125 Leu Gln Arg Gly Leu Ala Leu Gly Gln Ser Thr Lys Pro Ala Asn Arg 1 5 10 15 Gln Ala <210> 126 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 126 Asn Thr Pro Ser Leu Ala Leu Gly Gln Thr Thr Lys Pro Ala Gly Thr 1 5 10 15 Thr Thr <210> 127 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 127 Gln Arg Gly Asn Leu Ala Leu Gly Gln Thr Thr Lys Pro Ala Leu Ala 1 5 10 15 Leu Gly Gln Thr Thr Lys Pro Ala Arg Gln Ala Ala 20 25 <210> 128 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 128 Gln Arg Gly Asn Val Lys Leu Gly Gln Thr Thr Lys Pro Ala Arg Gln 1 5 10 15 Ala Ala <210> 129 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 129 Leu Ala Leu Gly Glu Thr Ser Arg Pro Ala Gly 1 5 10 <210> 130 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 130 Leu Lys Leu Gly Gln Thr Ser Lys Pro Ala Gly 1 5 10 <210> 131 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 131 Leu Ala Leu Gly Gln Thr Ser Lys Pro Ala Gly 1 5 10 <210> 132 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 132 Leu Ala Leu Gly Glu Thr Ser Lys Pro Ala Gly 1 5 10 <210> 133 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 133 Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala 1 5

Claims (132)

1. 달리 대등한 비변형된 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드와 비교하여 AAV 캡시드의 VP 도메인 내에 외인성 폴리펩티드 서열을 포함하는 변형된 AAV 캡시드로서, 외인성 폴리펩티드 서열은 식 1의 서열을 포함하고:
   X0-X1-X2-X1-X3-X1-X1-X4-X5 (서열식별번호: 93)
   여기서 X0은 발린 (V), 이소류신 (I), 류신 (L), 페닐알라닌 (F), 트립토판 (W), 티로신 (Y) 또는 메티오닌 (M)이고,
   여기서 X1은 알라닌 (A), 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q), 세린 (S), 트레오닌 (T), 글루탐산 (E), 아스파르트산 (D), 리신 (K), 아르기닌 (R), 또는 히스티딘 (H)이고,
   여기서 X2는 V, I, L 또는 M이고,
   여기서 X3은 E, S, 또는 Q이고,
   여기서 X4는 K, R, E 또는 A이고, 임의로 여기서 식 1은 프롤린 (P) 또는 R인 X5를 추가로 포함하는 것인 변형된 AAV 캡시드.
2. 제1항에 있어서, 식 1이 X₅를 포함하고, 여기서 X₅는 프롤린 (P) 또는 R인 변형된 AAV 캡시드.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 캡시드가 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, 및 그의 임의의 조합의 것인 변형된 AAV 캡시드.
4. 제3항에 있어서, 캡시드가 AAV2를 포함하는 것인 변형된 AAV 캡시드.
5. 제3항에 있어서, 캡시드가 적어도 2종의 혈청형을 포함하는 것인 변형된 AAV 캡시드.
6. 제5항에 있어서, 적어도 2종의 혈청형이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAV11, AAV12, 및 AAV13으로부터 선택된 것인 변형된 캡시드.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 식 1이 L-A-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 94), L-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 95), 또는 V-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 96)를 포함하는 것인 변형된 AAV 캡시드.
8. 제6항에 있어서, 식 1이 V-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 96)를 포함하고, 여기서 V-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 96)는 V-K-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 97) 또는 V-K-L-G-X3-X1-X1-K (서열식별번호: 98)를 포함하는 것인 변형된 AAV 캡시드.
9. 제6항에 있어서, 식 1이 L-A-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 94)를 포함하고, 여기서 L-A-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 94)는 L-A-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 99) 또는 L-A-L-G-X3-X1-S-X4 (서열식별번호: 100)를 포함하는 것인 변형된 AAV 캡시드.
10. 제9항에 있어서, L-A-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 99)가
    a) L-A-L-G-X3-X1-T-R (서열식별번호: 101);
    b) L-A-L-G-X3-X1-T-K (서열식별번호: 102);
    c) L-A-L-G-X3-X1-T-E (서열식별번호: 103); 또는
    d) L-A-L-G-X3-X1-T-A (서열식별번호: 104)
    를 포함하는 것인 변형된 AAV 캡시드.
11. 제9항에 있어서, L-A-L-G-X3-X1-S-X4 (서열식별번호: 100)가 L-A-L-G-X3-X1-S-K (서열식별번호: 105)를 포함하는 것인 변형된 AAV 캡시드.
12. 제6항에 있어서, 식 1이 L-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 95)를 포함하고, 여기서 L-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 95)는 L-K-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 106)를 포함하는 것인 변형된 AAV 캡시드.
13. 제12항에 있어서, L-K-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 106)가 L-K-L-G-X3-X1-T-K (서열식별번호: 107)를 포함하는 것인 변형된 AAV 캡시드.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 식 1이 표 2의 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 변형된 AAV 캡시드.
15. 제14항에 있어서, 식 1이 표 2의 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 변형된 AAV 캡시드.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 캡시드의 VP 도메인이 VP1인 변형된 AAV 캡시드.
17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 캡시드의 VP 도메인이 VP2인 변형된 AAV 캡시드.
18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 캡시드의 VP 도메인이 VP3인 변형된 AAV 캡시드.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 캡시드가 돌연변이를 추가로 포함하는 것인 변형된 AAV 캡시드.
20. 제19항에 있어서, 돌연변이가 VP1 또는 VP2 영역 내에 존재하는 것인 변형된 AAV 캡시드.
21. 제19항에 있어서, 돌연변이가 VP1 또는 VP3 영역 내에 존재하는 것인 변형된 AAV 캡시드.
22. 제19항에 있어서, 돌연변이가 VP2 또는 VP3 영역 내에 존재하는 것인 변형된 AAV 캡시드.
23. 제19항에 있어서, 돌연변이가 VP1, VP2, 및 VP3 영역 내에 존재하는 것인 변형된 AAV 캡시드.
24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이가 점 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 결실, 중복, 프레임시프트 또는 반복 확장인 변형된 AAV 캡시드.
25. 제24항에 있어서, 돌연변이가 점 돌연변이인 변형된 AAV 캡시드.
26. 제24항에 있어서, 점 돌연변이가 보존적 돌연변이를 포함하는 것인 변형된 AAC 캡시드.
27. 제26항에 있어서, 보존적 돌연변이가 비극성 지방족 아미노산에서 비극성 지방족 아미노산, 극성 아미노산에서 극성 아미노산, 양으로 하전된 아미노산에서 양으로 하전된 아미노산, 음으로 하전된 아미노산에서 음으로 하전된 아미노산, 및 방향족 아미노산에서 방향족 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 변형된 AAV 캡시드.
28. 제27항에 있어서, 점 돌연변이가 하전된 아미노산 잔기에서 극성 또는 비-극성 아미노산 잔기로의 변화를 포함하는 것인 변형된 AAV 캡시드.
29. 제28항에 있어서, 하전된 아미노산이 양으로 하전된 것인 변형된 AAV 캡시드.
30. 제28항에 있어서, 하전된 아미노산이 음으로 하전된 것인 변형된 AAV 캡시드.
31. 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이가 서열식별번호: 1의 잔기 내에 존재하는 것인 변형된 AAV 캡시드.
32. 제31항에 있어서, 돌연변이가 서열식별번호: 1의 452, 453, 466, 467, 468, 471, 585, 586, 587, 및 588로 이루어진 군으로부터 선택된 잔기 내에 존재하는 것인 변형된 AAV 캡시드.
33. 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 점 돌연변이가 서열식별번호: 1의 위치 585 또는 588에서 R→A인 변형된 AAV 캡시드.
34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 캡시드가 AAV 캡시드의 VP1 도메인 내에 적어도 제2 외인성 폴리펩티드 서열을 추가로 포함하는 것인 변형된 AAV 캡시드.
35. 제34항에 있어서, 외인성 폴리펩티드 서열 및 제2 외인성 폴리펩티드 서열이 각각 독립적으로 AAV 캡시드의 루프 내에 존재하는 것인 변형된 AAV 캡시드.
36. 제35항에 있어서, 외인성 폴리펩티드 서열 및 제2 외인성 폴리펩티드 서열이 각각 독립적으로 AAV 캡시드의 VP1 도메인의 루프 3 및/또는 루프 4 내에 존재하는 것인 변형된 AAV 캡시드.
37. (a) 외인성 서열이 결여된 달리 대등한 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드 서열과 비교하여 VP 도메인의 적어도 2개의 루프 내에 외인성 서열을 포함하는 변형된 캡시드; 및 (b) 트랜스진을 포함하는 AAV 벡터로서, 여기서 상기 벡터는 복수의 세포와 접촉 시, (a)가 결여된 달리 대등한 AAV 벡터와 복수의 세포를 접촉시킨 경우와 비교하여 상기 복수의 세포에서 접촉 후에 트랜스진의 적어도 3배 증가된 발현을 갖는 것인 AAV 벡터.
38. 제37항에 있어서, 외인성 서열이 식 1: X0-X1-X2-X1-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 108)를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하며, 여기서 X0은 발린 (V), 이소류신 (I), 류신 (L), 페닐알라닌 (F), 트립토판 (W), 티로신 (Y) 또는 메티오닌 (M)이고, 여기서 X1은 알라닌 (A), 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q), 세린 (S), 트레오닌 (T), 글루탐산 (E), 아스파르트산 (D), 리신 (K), 아르기닌 (R), 또는 히스티딘 (H)이고, 여기서 X2는 V, I, L, 또는 M이고, 여기서 X3은 E, S, 또는 Q이고, 여기서 X4는 K, R, E, 또는 A이고, 임의로 여기서 식 1은 프롤린 (P) 또는 R인 X5를 추가로 포함하는 것인 벡터.
39. 제38항에 있어서, 식 1이 X₅를 포함하고, 여기서 X₅는 프롤린 (P) 또는 R인 벡터.
40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 캡시드가 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, 및 그의 임의의 조합의 것인 벡터.
41. 제40항에 있어서, 캡시드가 AAV2를 포함하는 것인 벡터.
42. 제40항에 있어서, 캡시드가 적어도 2종의 혈청형을 포함하는 것인 벡터.
43. 제42항에 있어서, 적어도 2종의 혈청형이 AAV2 및 AAV5, AAV2 및 AAV6, AAV2 및 AAV8, AAV2 및 AAV9, AAV2 및 AAV1, 및 AAV2 및 AAV12인 벡터.
44. 제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 식 1이 L-A-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 94), L-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 95), 또는 V-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 96)를 포함하는 것인 벡터.
45. 제44항에 있어서, 식 1이 V-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 96)를 포함하고, 여기서 V-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 96)는 V-K-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 97) 또는 V-K-L-G-X3-X1-X1-K (서열식별번호: 98)를 포함하는 것인 벡터.
46. 제44항에 있어서, 식 1이 L-A-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 94)를 포함하고, 여기서 L-A-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 94)는 L-A-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 99) 또는 L-A-L-G-X3-X1-S-X4 (서열식별번호: 100)를 포함하는 것인 벡터.
47. 제46항에 있어서, L-A-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 99)가
    a) L-A-L-G-X3-X1-T-R (서열식별번호: 101);
    b) L-A-L-G-X3-X1-T-K (서열식별번호: 102);
    c) L-A-L-G-X3-X1-T-E (서열식별번호: 103); 또는
    d) L-A-L-G-X3-X1-T-A (서열식별번호: 104)
    를 포함하는 것인 벡터.
48. 제46항에 있어서, L-A-L-G-X3-X1-S-X4 (서열식별번호: 100)가 L-A-L-G-X3-X1-S-K (서열식별번호: 105)를 포함하는 것인 벡터.
49. 제44항에 있어서, 식 1이 L-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 95)를 포함하고, 여기서 L-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 95)는 L-K-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 106)를 포함하는 것인 벡터.
50. 제49항에 있어서, L-K-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 106)가 L-K-L-G-X3-X1-T-K (서열식별번호: 107)를 포함하는 것인 벡터.
51. 제38항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 식 1이 표 2의 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 벡터.
52. 제51항에 있어서, 식 1이 표 2의 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 벡터.
53. 제37항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, VP가 VP1인 벡터.
54. 제37항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, VP가 VP2인 벡터.
55. 제37항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, VP가 VP3인 벡터.
56. 제37항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 루프가 VP1 도메인의 루프 3 및 루프 4인 벡터.
57. 제37항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 안구 치료제를 코딩하는 것인 벡터.
58. 제57항에 있어서, 안구 치료제가 적어도 망막 질환의 증상을 감소시키거나, 망막 질환을 치료하거나, 또는 망막 질환을 제거하는 데 효과적인 것인 벡터.
59. 제58항에 있어서, 안구 치료제가 항체 또는 그의 생물학적 활성 단편 및 생물제제로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 벡터.
60. 제59항에 있어서, 치료제가 생물제제이고, 여기서 생물제제는 지단백질 리파제, 레티노이드 이소머로히드롤라제 RPE65, 또는 보체 H로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하는 것인 벡터.
61. 제59항에 있어서, 치료제가 항체 또는 그의 생물학적 활성 단편이고, 여기서 항체 또는 그의 생물학적 활성 단편은 항-VEGF, 항-VEGFL, 항-트롬보스폰딘-1, 항-CD47, 항-TNF-알파, 항-CD20, 항-CD52, 및 항-CD11a, 항-보체 5, 및 항-보체 3으로부터 선택된 것인 벡터.
62. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 망막 질환이 완전색맹, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 습성-연령-관련 황반 변성 (wAMD), 지도형 위축 (GA), 당뇨병성 망막병증 (DR), 당뇨병성 황반 부종 (DME), 녹내장, 바르데-비들 증후군, 베스트병, 맥락막결손, 레베르 선천성 흑암시, 레베르 유전성 시신경병증 (LHON), 황반 변성, 폴립양 맥락막 혈관병증 (PCV), 색소성 망막염, 레프숨병, 스타르가르트병, 어셔 증후군, X-연관 망막층간분리 (XLRS), 유전성 망막 질환 (IRD), 간체-추체 이영양증, 추체-간체 이영양증, 오구치병, 말라티아 레벤티네스 (가족성 우성 드루젠), 청색-원추 단색형 색각, 망막 정맥 폐쇄 (RVO), 및 포도막성 황반 부종 (UMO)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 벡터.
63. 제62항에 있어서, 망막 질환이 AMD인 벡터.
64. 제63항에 있어서, AMD가 습성 AMD인 벡터.
65. 제63항에 있어서, AMD가 건성 AMD인 벡터.
66. 제37항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, Rep를 코딩하는 서열을 추가로 포함하는 벡터.
67. 제66항에 있어서, Rep가 변형되고, 여기서 변형은 Rep 78, Rep 68, Rep 52 또는 Rep 40 중 적어도 1개 내에 존재하는 것인 벡터.
68. 제66항 또는 제67항에 있어서, Rep가 캡시드와 상이한 AAV 혈청형의 것인 벡터.
69. 제37항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, VP가 VP1인 벡터.
70. 제37항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, VP가 VP2인 벡터.
71. 제37항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, VP가 VP3인 벡터.
72. 제37항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 증가된 발현이 (a)가 결여된 달리 대등한 AAV 벡터와 복수의 세포를 접촉시킨 경우와 비교하여 적어도 5-배, 10-배, 20-배, 50-배, 100-배, 200-배 또는 500-배 증가를 포함하는 것인 벡터.
73. 제37항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 캡시드가 서열식별번호: 28-서열식별번호: 47을 포함하는 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 포함하는 것인 벡터.
74. 제73항에 있어서, 서열식별번호: 34의 변형된 캡시드를 포함하는 벡터.
75. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 변형된 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드를 포함하는 조작된 아데노-연관 바이러스 (AAV) 비리온.
76. 복수의 제75항의 AAV 비리온을 포함하는 조성물.
77. 세포를 제37항 내지 제74항 중 어느 한 항의 벡터 또는 제75항 또는 제76항의 조작된 비리온으로 형질감염시킴으로써 생성된 조작된 세포.
78. 제77항의 조작된 세포로부터 단리된 복수의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 입자.
79. 제78항의 아데노-연관 바이러스 입자를 단위 투여 형태로 포함하는 조성물.
80. 제79항에 있어서, 동결보존된 조성물.
81. a) 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 변형된 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드; b) 제37항 내지 제74항 중 어느 한 항의 벡터; 또는 c) 제75항 또는 제76항의 조작된 비리온을 포함하는 용기.
82. 제81항에 있어서, 바이알, 시린지 또는 바늘인 용기.
83. 제81항 또는 제82항에 있어서, 안구 전달을 위해 구성된 용기.
84. a) 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 변형된 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드; b) 제37항 내지 제74항 중 어느 한 항의 벡터; 또는 c) 제75항 또는 제76항의 조작된 비리온을 포함하는 제약 조성물.
85. 제84항에 있어서, 단위 투여 형태인 제약 조성물.
86. 복수의 세포를 제37항 내지 제74항 중 어느 한 항의 벡터 또는 제75항 또는 제76항의 조작된 비리온과 접촉시키는 것을 포함하는, 조작된 세포를 제조하는 방법.
87. 표 2로부터의 외인성 서열을 포함하는 변형된 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드.
88. 제87항에 있어서, 캡시드가 AAV1, AAV2, AAV5, AAV8, AAV9, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형의 것인 변형된 AAV 캡시드.
89. 표 2의 서열을 코딩하는 폴리핵산을 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드를 코딩하는 서열 내로 도입함으로써 변형된 AAV 캡시드를 생성하는 것을 포함하는, 변형된 AAV 캡시드를 제조하는 방법.
90. 제89항에 있어서, AAV 캡시드가 AAV1, AAV2, AAV5, AAV8, AAV9, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형의 것인 방법.
91. 외인성 폴리펩티드 서열이 결여된 달리 대등한 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드 서열과 비교하여 VP 도메인의 적어도 2개의 루프 내에 외인성 폴리펩티드 서열을 포함하는 변형된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터를 포함하는 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 방법으로서, 여기서 외인성 폴리펩티드 서열은 표 2의 서열을 포함하는 것인 방법.
92. 제80항에 있어서, AAV 벡터가 트랜스진을 포함하는 서열을 추가로 포함하는 것인 방법.
93. (a) 외인성 서열이 결여된 달리 대등한 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드 서열과 비교하여 VP 도메인의 적어도 2개의 루프 내에 외인성 서열을 포함하는 변형된 캡시드; 및 (b) 트랜스진을 포함하는 AAV 벡터를 포함하는 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 방법으로서, 여기서 벡터는 복수의 세포와 접촉 시, (a)가 결여된 달리 대등한 AAV 벡터와 복수의 세포를 접촉시킨 경우와 비교하여 복수의 세포에서 형질감염 후에 트랜스진의 적어도 3배 증가된 발현을 갖는 것인 방법.
94. 제82항에 있어서, 증가된 발현이 (a)가 결여된 달리 대등한 AAV 벡터와 복수의 세포를 접촉시킨 경우와 비교하여 적어도 5-배, 10-배, 20-배, 50-배, 100-배, 200-배 또는 500-배 증가를 포함하는 것인 방법.
95. 달리 대등한 비변형된 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드와 비교하여 AAV 캡시드의 VP 도메인 내에 외인성 폴리펩티드 서열을 포함하는 변형된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터를 포함하는 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 방법으로서, 외인성 폴리펩티드 서열은 식 1의 서열을 포함하고:
    X0-X1-X2-X1-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 108),
    여기서 X0은 발린 (V), 이소류신 (I), 류신 (L), 페닐알라닌 (F), 트립토판 (W), 티로신 (Y) 또는 메티오닌 (M)이고,
    여기서 X1은 알라닌 (A), 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q), 세린 (S), 트레오닌 (T), 글루탐산 (E), 아스파르트산 (D), 리신 (K), 아르기닌 (R), 또는 히스티딘 (H)이고,
    여기서 X2는 V, I, L 또는 M이고,
    여기서 X3은 E, S, 또는 Q이고,
    여기서 X4는 K, R, E 또는 A이고, 임의로 여기서 식 1은 프롤린 (P) 또는 R인 X5를 추가로 포함하는 것인 방법.
96. 제95항에 있어서, 식 1이 X₅를 포함하고, 여기서 X₅는 프롤린 (P) 또는 R인 방법.
97. 제95항 또는 제96항에 있어서, 캡시드가 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, 및 그의 임의의 조합의 것인 방법.
98. 제97항에 있어서, 캡시드가 AAV2를 포함하는 것인 방법.
99. 제97항에 있어서, 캡시드가 적어도 2종의 혈청형을 포함하는 것인 방법.
100. 제99항에 있어서, 적어도 2종의 혈청형이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAV11, AAV12, 및 AAV13으로부터 선택된 것인 변형된 캡시드.
101. 제95항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 식 1이 L-A-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 94), L-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 95) 또는 V-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 96)를 포함하는 것인 방법.
102. 제101항에 있어서, 식 1이 V-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 96)를 포함하고, 여기서 V-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 96)는 V-K-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 97) 또는 V-K-L-G-X3-X1-X1-K (서열식별번호: 98)를 포함하는 것인 방법.
103. 제101항에 있어서, 식 1이 L-A-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 94)를 포함하고, 여기서 L-A-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 94)는 L-A-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 99) 또는 L-A-L-G-X3-X1-S-X4 (서열식별번호: 100)를 포함하는 것인 방법.
104. 제103항에 있어서, L-A-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 99)가
     a) L-A-L-G-X3-X1-T-R (서열식별번호: 101);
     b) L-A-L-G-X3-X1-T-K (서열식별번호: 102);
     c) L-A-L-G-X3-X1-T-E (서열식별번호: 103); 또는
     d) L-A-L-G-X3-X1-T-A (서열식별번호: 104)
     를 포함하는 것인 방법.
105. 제103항에 있어서, L-A-L-G-X3-X1-S-X4 (서열식별번호: 100)가 L-A-L-G-X3-X1-S-K (서열식별번호: 105)를 포함하는 것인 방법.
106. 제101항에 있어서, 식 1이 L-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 95)를 포함하고, 여기서 L-K-L-G-X3-X1-X1-X4 (서열식별번호: 95)는 L-K-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 106)를 포함하는 것인 방법.
107. 제106항에 있어서, L-K-L-G-X3-X1-T-X4 (서열식별번호: 106)가 L-K-L-G-X3-X1-T-K (서열식별번호: 107)를 포함하는 것인 방법.
108. 제95항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 식 1이 표 2의 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 방법.
109. 제108항에 있어서, 식 1이 표 2의 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 방법.
110. 제91항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 유리체내 주사, 망막하 주사, 미세주사, 또는 안구상 주사를 통하는 것인 방법.
111. 제110항에 있어서, 투여가 유리체내 주사를 통하는 것인 방법.
112. 제91항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 상태가 안구 질환 또는 상태인 방법.
113. 제91항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 상태가 비-안구 질환 또는 상태인 방법.
114. 제91항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 안구 질환 또는 상태가 망막의 질환 또는 상태인 방법.
115. 제112항 또는 제114항에 있어서, 안구 질환 또는 상태가 완전색맹, 신생혈관화 관련 망막 장애 예컨대 연령-관련 황반 변성 (AMD), 습성-연령-관련 황반 변성 (wAMD), 지도형 위축 (GA), 당뇨병성 망막병증 (DR), 당뇨병성 황반 부종 (DME), 녹내장, 바르데-비들 증후군, 베스트병, 맥락막결손, 레베르 선천성 흑암시, 레베르 유전성 시신경병증 (LHON), 황반 변성, 폴립양 맥락막 혈관병증 (PCV), 색소성 망막염, 레프숨병, 스타르가르트병, 어셔 증후군, X-연관 망막층간분리 (XLRS), 유전성 망막 질환 (IRD), 간체-추체 이영양증, 추체-간체 이영양증, 오구치병, 말라티아 레벤티네스 (가족성 우성 드루젠), 청색-원추 단색형 색각, 망막 정맥 폐쇄 (RVO), 및 포도막성 황반 부종 (UMO)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
116. 제115항에 있어서, 안구 질환 또는 상태가 AMD인 방법.
117. 제116항에 있어서, AMD가 습성 AMD인 방법.
118. 제116항에 있어서, AMD가 건성 AMD인 방법.
119. 제91항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 적어도 질환 또는 상태의 증상을 감소시키고/거나, 질환 또는 상태를 치료하고/거나, 질환 또는 상태를 제거하는 데 충분한 것인 방법.
120. 제95항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 치료 폴리펩티드를 코딩하는 트랜스진을 추가로 포함하는 것인 방법.
121. 제120항에 있어서, 치료제가 항체 또는 그의 생물학적 활성 단편 또는 생물제제로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
122. 제121항에 있어서, 치료제가 생물제제이고, 여기서 생물제제는 지단백질 리파제, 레티노이드 이소머로히드롤라제 RPE65, 보체 H로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
123. 제121항에 있어서, 치료제가 항체 또는 그의 생물학적 활성 단편이고, 여기서 항체 또는 그의 생물학적 활성 단편은 항-VEGF, 항-VEGFL, 항-트롬보스폰딘-1, 항-CD47, 항-TNF-알파, 항-CD20, 항-CD52, 및 항-CD11a로부터 선택된 것인 방법.
124. 제91항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 투여 전에 대상체가 유전자 검사를 거치는 것인 방법.
125. 제124항에 있어서, 유전자 검사가 RPE65, CRB1, AIPL1, CFH 또는 RPGRIP로부터 선택된 유전자에서 돌연변이를 검출하는 것인 방법.
126. 제91항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 약 1.0 x 10⁹ vg, 1.0 x 10¹⁰, 1.0 x 10¹¹ vg, 3.0 x 10¹¹ vg, 6 x 10¹¹ vg, 8.0 x 10¹¹ vg, 1.0 x 10¹² vg, 1.0 x 10¹³ vg, 1.0 x 10¹⁴ vg, 또는 1.0 x 10¹⁵ vg의 벡터의 투여량을 전달하는 것을 포함하는 것인 방법.
127. 제91항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 반복되는 것인 방법.
128. 제118항에 있어서, 투여가 1일 2회, 격일, 1주 2회, 2개월마다, 3개월마다, 1개월 1회, 격월, 반년마다, 매년마다 또는 격년마다 수행되는 것인 방법.
129. 제91항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 2차 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
130. 제91항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, VP가 VP1을 포함하는 것인 방법.
131. 제91항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, VP가 VP2를 포함하는 것인 방법.
132. 제91항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, VP가 VP3을 포함하는 것인 방법.

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