BR112020019730A2 - método in vitro para o diagnóstico de dano ao tecido muscular cardíaco, kit e painel de marcadores - Google Patents
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Abstract
métodoin vitropara o diagnóstico de dano ao tecido muscular cardíaco, kit e painel de marcadores". a presente invenção refere-se a métodos de diagnóstico de dano ao tecido muscular cardíaco, determinação da extensão do dano ao tecido muscular cardíaco e diferenciação entre dano ao músculo cardíaco atrial e dano ao músculo cardíaco ventricular em um paciente pela determinação do nível de um biomarcador selecionado a partir de mybph, mybphl e isoformas destes em uma amostra obtida do referido paciente. além disso, a invenção refere-se a um kit e um painel de marcadores para uso em tais métodos.
Description
[001] A presente invenção refere-se a métodos de diagnóstico de dano ao tecido muscular cardíaco, determinação da extensão do dano ao tecido muscular cardíaco e diferenciação entre dano ao músculo cardíaco atrial e dano ao músculo cardíaco ventricular em um paciente. Além disso, a invenção refere- se a um kit e um painel de marcadores para uso em tais métodos.
[002] As doenças cardíacas, principalmente as doenças das artérias coronárias (DAC), são as principais causas de morbimortalidade nos países desenvolvidos. Com base nas estatísticas populacionais, pode-se calcular que aproximadamente 310 ataques cardíacos por cem mil pessoas com mais de 18 anos de idade e aproximadamente 150 mortes por cem mil adultos podem ser esperados a cada ano em países desenvolvidos. Na medicina cardiovascular, enzimas e outras proteínas liberadas do coração em processo de morte foram identificadas como biomarcadores. Particularmente, elas são mensuráveis em alta concentração no sangue, por exemplo, após um ataque cardíaco. Os primeiros biomarcadores para danos ao músculo cardíaco foram descritos na década de 1950. Entre esses, foram descritas as enzimas aspartato aminotransferase (AST) e a lactato desidrogenase (LDH). Nos anos 1970 e 1980, outros biomarcadores foram descobertos, por exemplo, a creatina quinase (CK), sua isoenzima creatina quinase de banda miocárdica (CK-MB), mioglobina e troponina (troponina T e troponina I). As troponinas e a CK-MB ainda estão em uso clínico para a identificação de danos ao tecido muscular cardíaco. A medição da concentração destes biomarcadores no sangue é geralmente repetida periodicamente, uma vez que um aumento e/ou uma diminuição na concentração destes biomarcadores no sangue permitir tirar conclusões sobre a ocorrência ou o início de um ataque cardíaco, a extensão do ataque cardíaco e o sucesso de uma terapia contra o ataque cardíaco.
[003] Todos os biomarcadores citados anteriormente têm em comum o fato de não permitirem a diferenciação entre dano ao músculo cardíaco atrial (no átrio do coração) e dano ao músculo cardíaco ventricular (no ventrículo). Nenhum biomarcador específico para dano ao músculo cardíaco atrial ou para dano ao músculo cardíaco ventricular foi descoberto até agora.
Esse biomarcador específico seria altamente relevante, particularmente no campo da cirurgia cardíaca no contexto de cuidados pós-operatório.
[004] Em pacientes com fibrilação atrial, uma arritmia cardíaca, uma ablação do átrio cardíaco para tratar a fibrilação atrial é frequentemente realizada durante a cirurgia cardíaca. As linhas de ablação são definidas no átrio do coração seguindo um esquema específico para prevenir a transmissão de impulsos elétricos que fazem os átrios fibrilarem ao invés de contraírem em um padrão regular. Essa ablação pode ser realizada como crioablação endocárdica após a abertura do átrio direito e esquerdo ou como ablação epicárdica por radiofrequência das veias pulmonares como procedimento concomitante. Tanto a crioablação endocárdica quanto a ablação por radiofrequência epicárdica causam danos às células musculares cardíacas. Assim, o tratamento da fibrilação atrial por ablação de uma parte do tecido muscular cardíaco inclui a destruição das células do músculo cardíaco do átrio e, portanto, causa um aumento pós-operatório de biomarcadores inespecíficos (CK-MB e troponina) no sangue. Uma vez que os biomarcadores usados até agora não diferenciam entre dano ao músculo cardíaco atrial e dano ao músculo ventricular, a avaliação pós- operatória para determinar se o aumento dos biomarcadores é devido ao dano ocasionado pelas linhas de ablação no átrio ou se é devido a um dano adicional ao músculo cardíaco do ventrículo não é possível. Por essas razões, os pacientes frequentemente precisam ser submetidos a diagnósticos invasivos adicionais, por exemplo, angiografia coronariana por meio de um cateter cardíaco, a fim de, por exemplo, excluir um ataque cardíaco perioperatório. Além dessa indicação, um biomarcador refletindo um dano atrial pode ser de grande interesse como um parâmetro para monitorar o sucesso de uma terapia de ablação, por exemplo, após terapia de ablação intervencionista baseada em cateter.
[005] Nesse sentido, há demanda para a implementação de um biomarcador atrial para a detecção específica de dano atrial. Tal biomarcador atrial específico evitará investigação médica invasiva desnecessária em pacientes, especialmente em pacientes foram submetidos a um tratamento por ablação.
[006] A presente invenção refere-se a um método de diagnóstico do dano ao tecido do músculo cardíaco, de preferência dano ao tecido do músculo cardíaco atrial, em um paciente, em que o método compreende determinar o nível de um biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco atrial selecionado a partir do grupo que consiste em MYBPH (Entrada do Banco de Dados Uniprot: Q13203, sequência de proteína de SEQ ID NO: 7), MYBPHL (Entrada do Banco de Dados Uniprot: A2RUH7, sequência de proteína de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 6), MYOT (Entrada do Banco de Dados Uniprot: Q9UBF9, sequência de proteína de SEQ ID NO: 9), ASNSD1 (Entrada do Banco de Dados Uniprot: Q9NWL6, sequência de proteína de SEQ ID NO: 10), CHFR (Entrada do Banco de Dados Uniprot: Q96EP1, sequência de proteína de SEQ ID NO: 11), NTN1 (Entrada do Banco de Dados Uniprot: O95631, sequência de proteína de SEQ ID NO: 12), RFC5 (Entrada do Banco de Dados Uniprot: P38251, sequência de proteína de SEQ ID NO: 13), POLI (Entrada do Banco de Dados Uniprot: Q9UNA4, sequência de proteína de SEQ ID NO: 14), COMP (Entrada do Banco de Dados Uniprot: P49747, sequência de proteína de SEQ
ID NO: 15), POF1B (Entrada do Banco de Dados Uniprot: Q8WVV4, sequência de proteína de SEQ ID NO: 16), PLA2G2A (Entrada do Banco de Dados Uniprot:
P14555, sequência de proteína de SEQ ID NO: 17), HDAC10 (Entrada do Banco de Dados Uniprot: Q969S8, sequência de proteína de SEQ ID NO: 18), ASPG
(Entrada do Banco de Dados Uniprot: Q86U10, sequência de proteína de SEQ
ID NO: 19), FMOD (Entrada do Banco de Dados Uniprot: Q06828, sequência de proteína de SEQ ID NO: 20), CA13 (Entrada do Banco de Dados Uniprot:
Q8N1Q1, sequência de proteína de SEQ ID NO: 21), CACNA2D2 (Entrada do
Banco de Dados Uniprot: Q9NY47, sequência de proteína de SEQ ID NO: 22),
GNL3L (Entrada do Banco de Dados Uniprot: Q9NY47, sequência de proteína de SEQ ID NO: 23), COL2A1 (Entrada do Banco de Dados Uniprot: P02458,
sequência de proteína de SEQ ID NO: 24), PDLIM4 (Entrada do Banco de Dados
Uniprot: P50479, sequência de proteína de SEQ ID NO: 25), LEPREL1 (Entrada do Banco de Dados Uniprot: Q8IVL5, sequência de proteína de SEQ ID NO: 26),
OMD (Entrada do Banco de Dados Uniprot: Q99983, sequência de proteína de
SEQ ID NO: 27), DGKZ (Entrada do Banco de Dados Uniprot: Q99983,
sequência de proteína de SEQ ID NO: 28), NT5DC2 (Entrada do Banco de Dados Uniprot: Q9H857, sequência de proteína de SEQ ID NO: 29), ITLN1
(Entrada do Banco de Dados Uniprot: Q8WWA0, sequência de proteína de SEQ
ID NO: 30), NTM (Entrada do Banco de Dados Uniprot: Q9P121, sequência de proteína de SEQ ID NO: 31), PRKG2 (Entrada do Banco de Dados Uniprot:
Q13237, sequência de proteína de SEQ ID NO: 32), CHGB (Entrada do Banco de Dados Uniprot: P05060, sequência de proteína de SEQ ID NO: 33), FAM179A
(Entrada do Banco de Dados Uniprot: Q6ZUX3, sequência de proteína de SEQ
ID NO: 34), CKMT1A (Entrada do Banco de Dados Uniprot: P12532, sequência de proteína de SEQ ID NO: 35), CKMT1B (Entrada do Banco de Dados Uniprot:
F8WCN3, sequência de proteína de SEQ ID NO: 36), LTBP3 (Entrada do Banco de Dados Uniprot: Q9NS15, sequência de proteína de SEQ ID NO: 37),
METTL7B (Entrada do Banco de Dados Uniprot: Q6UX53, sequência de proteína de SEQ ID NO: 38), LTBP2 (Entrada do Banco de Dados Uniprot: Q14767, sequência de proteína de SEQ ID NO: 39), OGDHL (Entrada do Banco de Dados Uniprot: Q9ULD0, sequência de proteína de SEQ ID NO: 40), PAM (Entrada do Banco de Dados Uniprot: P19021, sequência de proteína de SEQ ID NO: 41), SBK3 (Entrada do Banco de Dados Uniprot: P0C264, sequência de proteína de SEQ ID NO: 42), SFRP1 (Entrada do Banco de Dados Uniprot: Q8N474, sequência de proteína de SEQ ID NO: 43), SGSm1 (Entrada do Banco de Dados Uniprot: Q9NS15, sequência de proteína de SEQ ID NO: 70) e/ou suas (diferentes) isoformas em uma amostra obtida do referido paciente e comparando o nível do biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco atrial determinado no referido paciente com o nível do mesmo biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco atrial observado em um indivíduo controle, em que se o nível do biomarcador para dano tecidual do músculo cardíaco atrial determinado no referido paciente estiver aumentado em comparação com o nível do biomarcador para dano tecidual do músculo cardíaco atrial no indivíduo controle, o referido paciente é diagnosticado com uma lesão no tecido do músculo cardíaco.
[007] Em diversos exemplos de realização do método descrito na presente invenção, as isoformas ou homólogos de MYBPHL têm sequências de proteínas que têm pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de proteínas de MYBPHL, a saber, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência, de preferência ao longo de todo o comprimento e de preferência com as sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 3 e 6. Por exemplo, as isoformas de MYBPHL são selecionadas a partir do grupo que consiste na isoforma 1 de MYBPHL (sequência de DNA: SEQ ID NO: 1, sequência de DNA codificante: SEQ ID NO: 2, sequência de proteína: SEQ ID NO: 3) e isoforma 2 de MYBPHL (sequência de DNA: SEQ ID NO: 4, sequência de DNA codificante: SEQ ID NO: 5, sequência de proteína: SEQ ID NO: 6). De modo geral, “isoforma”, conforme utilizado no presente pedido, refere-se a uma proteína funcionalmente semelhante que compartilha pelo menos 70% de identidade de sequência, de preferência pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência com a respectiva proteína de referência, de preferência a longo de todo o comprimento. Também estão englobados homólogos de todas as isoformas explicitamente divulgadas no presente documento, particularmente as isoformas 1 e 2 de MYBPHL, que compartilham pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de proteína de uma isoforma de referência, ou seja, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência, de preferência ao longo de todo o comprimento e de preferência com as sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 3 e 6.
[008] Em determinados exemplos de realização do método descrito na presente invenção, o método compreende avaliar a extensão do dano tecidual do músculo cardíaco atrial no referido paciente, determinando a razão entre o nível do biomarcador para o dano ao tecido muscular cardíaco atrial na amostra obtida do referido paciente e o nível do biomarcador para o dano ao tecido muscular cardíaco atrial de controle individual.
[009] Em vários exemplos de realização do método descrito no presente documento, o método compreende ainda determinar o nível de outro biomarcador (biomarcador adicional) para danos no tecido muscular cardíaco, em que o método é adequado para diferenciar entre danos no tecido muscular atrial e danos no tecido muscular ventricular. O biomarcador adicional para dano ao tecido muscular cardíaco é um biomarcador diferente dos biomarcadores para dano ao tecido muscular cardíaco atrial mencionados acima e pode ser um biomarcador geral para dano ao tecido muscular cardíaco selecionado a partir do grupo que consiste em CK-MB ou Troponina.
Alternativamente ou adicionalmente, o outro biomarcador (biomarcador adicional) para dano ao tecido muscular cardíaco é, por exemplo, um biomarcador específico para dano ao tecido muscular cardíaco ventricular, por exemplo, FHL-2 (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q14192, sequência de proteína de SEQ ID NO: 44), SMYD2
(entrada do Banco de Dados Uniprot: Q9NRG4, sequência de proteína de SEQ
ID NO: 45), FASTKD1 (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q53R41, sequência de proteína de SEQ ID NO: 46), PRR33 (entrada do Banco de Dados Uniprot:
A8MZF0, sequência de proteína de SEQ ID NO: 47), SORBS2 (entrada do Banco de Dados Uniprot: O94875, sequência de proteína de SEQ ID NO: 48),
CRISPLD1 (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q9H336, sequência de proteína de SEQ ID NO: 49), NPHP4 (entrada do Banco de Dados Uniprot:
O75161, sequência de proteína de SEQ ID NO: 50), ANKRD2 (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q9GZV1, sequência de proteína de SEQ ID NO: 51),
TMEM159 (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q96B96, sequência de proteína de SEQ ID NO: 52), ATP7A (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q04656,
sequência de proteína de SEQ ID NO: 53), C12ORF73 (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q69YU5, sequência de proteína de SEQ ID NO: 54), NAV1
(entrada do Banco de Dados Uniprot: Q8NEY1, sequência de proteína de SEQ
ID NO: 8), ATP5B (entrada do Banco de Dados Uniprot: P06576, sequência de proteína de SEQ ID NO: 55), HSPB7 (entrada do Banco de Dados Uniprot:
Q9UBY9, sequência de proteína de SEQ ID NO: 56), TMEM88 (entrada do
Banco de Dados Uniprot: Q6PEY1, sequência de proteína de SEQ ID NO: 57),
WDR62 (entrada do Banco de Dados Uniprot: O43379, sequência de proteína de SEQ ID NO: 58), ACTN3 (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q08043,
sequência de proteína de SEQ ID NO: 59), TRIM72 (entrada do Banco de Dados
Uniprot: Q6ZMU5, sequência de proteína de SEQ ID NO: 60), EGFLAM (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q63HQ2, sequência de proteína de SEQ ID NO:
61), LRRC39 (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q96DD0, sequência de proteína de SEQ ID NO: 62), DPYSL4 (entrada do Banco de Dados Uniprot: O14531, sequência de proteína de SEQ ID NO: 63), PFKFB2 (entrada do Banco de Dados Uniprot: O60825, sequência de proteína de SEQ ID NO: 64), ABCB6 (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q9NP58, sequência de proteína de SEQ ID NO: 65), METTL2B (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q6P1Q9, sequência de proteína de SEQ ID NO: 66), METTL2A (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q96IZ6, sequência de proteína de SEQ ID NO: 67), CARNS1 (entrada do Banco de Dados Uniprot: A5YM72, sequência de proteína de SEQ ID NO: 68), SPTBN1 (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q01082, sequência de proteína de SEQ ID NO: 69) ou isoformas dos mesmos.
[010] Em alguns exemplos de realização do método descrito na presente invenção, a etapa de determinação do nível do referido biomarcador é realizada em uma amostra obtida do referido paciente, ou seja, preferencialmente in vitro. A amostra pode ser um fluido corporal, de preferência sangue total, soro sanguíneo ou plasma sanguíneo.
[011] Em certos exemplos de realização do método descrito na presente invenção, o paciente é um ser humano.
[012] Em diversos exemplos de realização do método descrito no presente documento, determinar o nível do biomarcador para dano do tecido muscular cardíaco atrial e/ou determinar o nível do biomarcador adicional compreende determinar a concentração de proteína do biomarcador para dano do tecido muscular cardíaco atrial e/ou determinar a concentração de proteína do biomarcador adicional, por exemplo, em uma amostra obtida de um paciente, tal como uma amostra de sangue, soro ou plasma.
[013] Em diversos exemplos de realização do método descrito na presente invenção, a determinação do nível de biomarcador compreende a determinação da concentração da proteína biomarcadora, em que a concentração de proteína é determinada por um imunoensaio, ELISA, espectrometria de massa, cromatografia, Western Blot ou eletroforese em gel, tal como SDS-PAGE. Alternativamente ou adicionalmente, podem ser determinados ácidos nucleicos circulantes, particularmente RNA, tal como mRNA. Para a detecção de ácido nucleico, vários métodos de captura e amplificação de ácido nucleico podem ser usados. A detecção pode ser alcançada, por exemplo, usando sondas de detecção específicas que são marcadas de forma detectável. Tais técnicas são amplamente conhecidas no estado da técnica e podem ser escolhidas por aqueles versados na técnica com base em seus conhecimentos gerais.
[014] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um kit para uso no método da invenção, em que o kit compreende reagentes para determinar o nível do biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco atrial e reagentes para determinar o nível do biomarcador adicional para dano ao músculo cardíaco em uma amostra. Em certos exemplos de realização, o kit compreende reagentes para um ensaio ELISA, como um anticorpo de captura e um anticorpo de detecção específico para o biomarcador de escolha.
[015] Além disso, a presente invenção refere-se a um painel de marcadores que compreende pelo menos um biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco atrial e pelo menos um biomarcador adicional para dano ao músculo cardíaco para uso no método da invenção. Também estão englobados kits para a detecção de tal painel de marcadores compreendendo pelo menos um reagente de detecção específico para o pelo menos um biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco atrial e pelo menos um reagente de detecção para o pelo menos outro biomarcador (biomarcador adicional) para dano ao músculo cardíaco.
[016] O termo “anticorpo” é utilizado no sentido mais amplo e cobre especificamente, por exemplo, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos com especificidade poliepitópica, anticorpos de cadeia única, anticorpos multiespecíficos e fragmentos de anticorpos. Esses anticorpos podem ser quiméricos, humanizados, humanos e sintéticos. Os anticorpos ou outros reagentes de detecção utilizados na presente invenção são preferencialmente específicos para o seu alvo pretendido, ou seja, discriminam nas suas afinidades de ligação entre o alvo e outros componentes não alvo. A diferença na ligação, tal como, por exemplo, afinidade de ligação, pode ser pelo menos 10 vezes, de preferência 100 vezes ou mais. Se um reagente de detecção é descrito como sendo específico para uma determinada isoforma, isso significa que ele permite a discriminação sobre outras isoformas na medida em que se liga à isoforma direcionada com maior afinidade, tal como uma afinidade 10 vezes maior ou mais, em relação às isoformas não direcionadas.
[017] A “porcentagem (%) de identidade de sequência” ou “porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos” ou “homologia” com relação as sequências polipeptídicas e de anticorpos identificados na presente invenção é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos na sequência candidata que é idêntica aos resíduos de aminoácidos da sequência polipeptídica ao qual está sendo comparada, após o alinhamento das sequências e considerando qualquer substituição conservadora como parte da identidade de sequência. O alinhamento para os propósitos de determinação da porcentagem de identidade de sequências de aminoácidos pode ser atingido de várias formas que se encontram dentro do conhecimento da técnica, tais como o uso de softwares de computador disponíveis ao público, tal como os softwares BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo qualquer algoritmo necessário para atingir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências que estão sendo comparadas. Em diversos exemplos de realização, a respectiva divulgação com respeito às identidades de sequência refere-se a porcentagens com base em todo o comprimento da consulta (query) e/ou sequência de referência, em particular a sequência de referência. Isso significa que se uma identidade de sequência de 95% for dada para uma sequência candidata, a referida sequência terá 95% de sequência para a referência ao longo de todo o comprimento da referência.
[018] A Figura 1 mostra os resultados de uma análise de expressão gênica do biomarcador MYBPHL (Figura 1A) e do biomarcador FHL2 (Figura 1B) em tecidos retirados do átrio esquerdo (LA), átrio direito (RA) e ventrículo esquerdo (LV) por meio de uma biópsia nos pacientes.
[019] A Figura 2 mostra os resultados de uma análise de expressão gênica dos biomarcadores MYBPHL, FHL2, MYBPC3 e MYBPH, bem como as isoformas de MYBPHL (isoforma 1 de MYBPHL e isoforma 2 de MYBPHL) em tecidos retirados de 9 tecidos musculares do ventrículo esquerdo e 9 tecidos musculares do átrio esquerdo obtidos por biópsias nos pacientes, em que a análise da expressão gênica foi realizada por qPCR.
[020] A Figura 3 mostra a separação dos produtos de amplificação do biomarcador isoforma 2 de MYBPHL em tecidos retirados do átrio esquerdo e ventrículo esquerdo, em que a separação foi realizada por eletroforese em gel.
[021] A Figura 4 mostra a separação dos produtos de amplificação do biomarcador isoforma 2 de MYBPHL em tecidos não cardíacos, em que a separação foi realizada por eletroforese em gel.
[022] A Figura 5 mostra os resultados da medição da concentração de proteína MYBPHL em uma amostra de sangue de plasma tomadas em pontos de tempo de medição periódicos ao longo de um período de tempo definido, em que a amostra de plasma é retirada de pacientes que sofrem de fibrilação atrial e foram submetidos a uma ablação.
[023] A Figura 6 mostra os resultados da medição da concentração de proteína MYBPHL em uma amostra de sangue e plasma tomadas em pontos de tempo de medição periódicos ao longo de um período de tempo definido, em que a amostra e o plasma são coletados de pacientes sofrendo de fibrilação atrial e submetidos a uma ablação endocárdica (A) ou ablação epicárdica (B).
[024] A Figura 7 mostra a alteração na concentração da proteína MYBPHL no plasma sanguíneo de acordo com a Figura 6a.
[025] A Figura 8 mostra os resultados da medição da concentração da proteína MYBPHL em uma amostra de plasma sanguíneo retirada de um grupo de pacientes que sofrem de infarto do miocárdio com elevação de ST, por exemplo, pacientes com lesão definitiva no ventrículo. As amostras de sangue foram tomadas em dois pontos de tempo de medição, um, antes da intervenção cirúrgica e um 72 horas após a intervenção cirúrgica, em que a intervenção cirúrgica foi realizada por meio de um cateter cardíaco.
[026] A Figura 9 A mostra os resultados da medição da concentração da proteína CK-MB nas amostras de sangue obtidas do mesmo grupo de pacientes do exemplo 2. A Figura 9B mostra a alteração na concentração da proteína CK-MB nas amostras de sangue de acordo com a Figura 9A.
[027] A Figura 10 mostra uma correlação entre os valores de concentração MYBPHL em uma amostra de plasma de 12 pacientes que foram submetidos a uma ablação e os valores de concentração de CK-MB nas amostras de plasma dos mesmos pacientes.
[028] A Figura 11 mostra uma representação da razão entre a alteração em vezes de MYBPHL e a alteração em vezes de FHL-2. Nas duas colunas da esquerda da representação são mostrados os resultados para os pacientes que sofrem de infarto do miocárdio com elevação de ST, enquanto que sobre as seis colunas da esquerda da representação, são mostrados os resultados para os pacientes que sofrem de fibrilação atrial e passaram por uma ablação.
[029] A invenção é baseada na surpreendente descoberta pelos inventores de que biomarcadores específicos para dano ao tecido muscular cardíaco, de preferência dano ao tecido muscular cardíaco atrial, selecionados a partir do grupo que consiste em MYBPH, MYBPHL, MYOT, ASNSD1, CHFR, NTN1, RFC5, POLI, COMP, POF1B, PLA2G2A, HDAC10, ASPG, FMOD, CA13, CACNA2D2, GNL3L, COL2A1, PDLIM4, LEPREL1, OMD, DGKZ, NT5DC2, ITLN1, NTM, PRKG2, CHGB, FAM179A, CKMT1A, CKMT1B, LTBP3, SGSM1, METTL7B, LTBP2, OGDHL, PAM, SBK3, SFRP1 e/ou suas isoformas são detectáveis em amostras de sangue de pacientes com dano no tecido muscular cardíaco, enquanto esses biomarcadores específicos não são detectados em tecidos de controle benignos e saudáveis e, portanto, podem servir como marcadores para dano ao tecido muscular cardíaco, preferencialmente para dano ao tecido muscular cardíaco atrial. Em diversos exemplos de realização, os marcadores são selecionados a partir de MYBPHL e suas isoformas. As isoformas de um biomarcador têm sequências de proteínas que podem ter pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de proteínas do biomarcador, a saber, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência e que normalmente compartilham certos aspectos de funcionalidade ou mesmo funcionalidade idêntica. Em diversos exemplos de realização, essas isoformas correspondem em comprimento à sequência de referência, ou seja, não diferem em comprimento em mais de 10%, de preferência em não mais do que 5%, ainda mais preferencialmente em não mais do que 2% do comprimento total. As sequências de aminoácidos da isoforma 1 de MYBPHL e da isoforma 2 de MYBPHL são apresentadas nas SEQ ID NOs: 3 e 6, respectivamente. Se for feita referência a isoformas indicando uma porcentagem de identidade de sequência, essas sequências nas SEQ ID NOs: 3 e 6 devem ser usadas como referências, se não for explicitamente indicado de outra forma. É entendido ainda que quando é feita referência a entradas de banco de dados de proteínas, a referida referência se destina a cobrir todas as isoformas listadas sob a referida entrada. Da mesma forma, quando aqui é feita referência a uma sequência de aminoácidos específica, entende-se que a referida referência é citada apenas a título de exemplo e pretende-se que diferentes isoformas da referida proteína que podem diferir em sua sequência de aminoácidos, e podem, por exemplo, estar listadas nas entradas de banco de dados aqui referenciadas, também estejam incluídas no escopo da invenção.
[030] A presente invenção, portanto, refere-se a um método (a) para diagnosticar dano ao tecido muscular cardíaco, de preferência dano ao tecido muscular cardíaco atrial, (b) para determinar a extensão do dano ao tecido muscular cardíaco e/ou (c) para diferenciar entre dano ao músculo cardíaco atrial e dano ao músculo cardíaco ventricular em um paciente. Em alguns exemplos de realização, os respectivos métodos também podem abranger o tratamento médico que segue a etapa de diagnóstico. Por exemplo, se um paciente é diagnosticado com dano ao tecido muscular cardíaco, o referido paciente pode ser tratado por administração de um medicamento, intervenção médica adicional ou mesmo cirúrgica.
[031] Os marcadores divulgados na presente invenção podem ser detectados em amostras de fluidos corporais, por exemplo, em uma amostra de sangue e, assim, fornecer um método alternativo ou melhorado para o diagnóstico de danos ao tecido muscular cardíaco. Como tal método não requer equipamento caro, os custos para o diagnóstico de dano ao tecido muscular cardíaco, de preferência dano ao tecido muscular cardíaco atrial, podem ser reduzidos. Além disso, o novo método pode ser realizado por qualquer pessoal médico treinado e, portanto, não exige que o paciente viaje para centros de triagem específicos. Isso permite exames médicos mais frequentes. Como mencionado na parte introdutória, outra vantagem deste método é que os pacientes, por exemplo, que foram submetidos a tratamento de fibrilação atrial por ablação, não precisam ser submetidos aos diagnósticos invasivos atualmente utilizados a fim de, por exemplo, excluir um diagnóstico de ataque cardíaco perioperatório, que é uma vantagem significativa dos métodos da presente invenção.
[032] Os métodos da invenção são, em diversos exemplos de realização, realizados in vitro em uma amostra obtida a partir de um paciente. A referida amostra, tal como foi descrito acima, pode ser um fluido corpóreo, como sangue ou componente do sangue, tal como plasma ou soro.
[033] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de diagnóstico do dano ao tecido muscular cardíaco, de preferência dano ao tecido muscular cardíaco atrial, em um paciente ou uma amostra obtida a partir de um paciente, em que o método compreende determinar o nível de um biomarcador de dano ao tecido muscular cardíaco atrial selecionado a partir do grupo que consiste em MYBPH (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q13203), MYBPHL (proteína de ligação à miosina H-like; entrada do Banco de Dados Uniprot: A2RUH7), MYOT (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q9UBF9), ASNSD1 (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q9NWL6), CHFR (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q96EP1), NTN1 (entrada do Banco de Dados Uniprot: O95631), RFC5 (entrada do Banco de Dados Uniprot: P40937), POLI (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q9UNA4), COMP (entrada do Banco de Dados Uniprot: P49747), POF1B (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q8WVV4), PLA2G2A (entrada do Banco de Dados Uniprot: P14555), HDAC10 (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q969S8), ASPG (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q86U10), FMOD (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q06828), CA13 (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q8N1Q1), CACNA2D2 (entrada do Banco de Dados
Uniprot: Q9NY47), GNL3L (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q9NVN8),
COL2A1 (entrada do Banco de Dados Uniprot: P02458), PDLIM4 (entrada do
Banco de Dados Uniprot: P50479), LEPREL1 (entrada do Banco de Dados
Uniprot: Q8IVL5), OMD (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q99983), DGKZ
(entrada do Banco de Dados Uniprot: Q13574), NT5DC2 (entrada do Banco de
Dados Uniprot: Q9H857), ITLN1 (entrada do Banco de Dados Uniprot:
Q8WWA0), NTM (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q9P121), PRKG2
(entrada do Banco de Dados Uniprot: Q13237), CHGB (entrada do Banco de
Dados Uniprot: P05060), FAM179A (entrada do Banco de Dados Uniprot:
Q6ZUX3), CKMT1A / CKMT1B (entrada do Banco de Dados Uniprot: P12532),
LTBP3 (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q9NS15), SGSM1 (entrada do
Banco de Dados Uniprot: Q2NKQ1), METTL7B (entrada do Banco de Dados
Uniprot: Q6UX53), LTBP2 (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q14767),
OGDHL (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q9ULD0), PAM (entrada do Banco de Dados Uniprot: P19021), SBK3 (entrada do Banco de Dados Uniprot:
P0C264), SFRP1 (entrada do Banco de Dados Uniprot: Q8N474) e/ou as respectivas isoformas, em particular as isoformas que estão listadas sob as entradas dos bancos de dados em questão, sendo as aqui enumeradas por referência à sua sequência de aminoácidos como exemplos de realização particulares, em uma amostra obtida do paciente e comparando o nível do biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco atrial determinado no paciente com o nível do biomarcador para dano do tecido muscular cardíaco atrial observado em um indivíduo de controle, em que se o nível do biomarcador para dano do tecido muscular cardíaco atrial determinado no paciente estiver aumentado em comparação com o nível do biomarcador para dano do tecido muscular cardíaco atrial no indivíduo controle, o referido paciente é diagnosticado com um dano ao tecido muscular cardíaco, por exemplo, dano ao tecido muscular cardíaco atrial.
[034] Os inventores identificaram uma proteína de ligação à miosina H-like (MBPHL = MYBPHL) como um biomarcador para danos nos tecidos do músculo do coração, por exemplo, como um biomarcador específico para danos ao tecido muscular pela fibrilação cardíaca (vide o Exemplo 1 e Figura 1). Conforme mostrado na Figura 1 e na Figura 2, o gene MYBPHL é expresso tanto no átrio do coração quanto no ventrículo do coração. No entanto, a expressão gênica de MYBPHL no átrio é claramente maior que no ventrículo, ou seja, 150 vezes maior no átrio esquerdo e 350 vezes maior no átrio direito em comparação com o ventrículo esquerdo. Isto significa que, embora um aumento no nível proteico de MYBPHL seja detectado, por exemplo, no plasma sanguíneo de um paciente, na ocorrência de um dano ao tecido muscular cardíaco, o nível de proteína MYBPHL aumenta de fora significativamente maior no caso do paciente sofrer de dano ao tecido muscular cardíaco atrial em comparação a quando o paciente sofre de dano ao tecido muscular cardíaco ventricular. Assim, a MYBPHL pode ser usada como biomarcador específico para danos ao tecido muscular cardíaco atrial.
[035] Em diversos exemplos de realização, MYBPHL ou uma isoforma do mesmo é usada como um primeiro biomarcador para danos ao tecido muscular cardíaco atrial. O referido marcador pode ser combinado com qualquer um ou mais dos outros biomarcadores para dano ao tecido muscular cardíaco atrial, como divulgado acima. Em diversos exemplos de realização, pode ser combinado com MYBPH ou uma isoforma dessa proteína.
Consequentemente, em diversos exemplos de realização da invenção, um ou mais, tais como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais, tais como 20, 30 ou todos os 37 biomarcadores listados acima para danos ao tecido muscular cardíaco atrial podem ser usados. E eles podem ser combinados com qualquer um ou mais dos biomarcadores adicionais para danos gerais ao músculo cardíaco, divulgados acima.
[036] A Figura 8 mostra os resultados da medição da concentração da proteína MYBPHL em uma amostra de plasma sanguíneo retirada de um grupo de pacientes que sofrem de infarto do miocárdio com elevação de ST, por exemplo, pacientes com lesão definitiva no ventrículo, antes e após uma intervenção cirúrgica para tratar o infarto do miocárdio com elevação de ST. Infartos do miocárdio com elevação ST levam a danos combinados no ventrículo e no átrio. A Figura 8 mostra que a concentração de proteína MYBPHL, antes da intervenção cirúrgica, está aumentada devido ao dano ventricular e ao dano atrial. 72 horas após a intervenção para tratar o infarto do miocárdio com elevação de ST, a concentração da proteína MYBPHL é reduzida.
Assim, os resultados do experimento mostrado na Figura 8 confirmam a adequação do biomarcador MYBPHL como biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco.
[037] Além disso, os inventores identificaram a proteína de ligação à miosina H (MBPH = MYBPH), e as isoformas de MYBPHL, por exemplo, isoforma 1 de MYBPHL e isoforma 2 de MYBPHL, como biomarcadores adicionais adequados para o diagnóstico de danos ao tecido muscular cardíaco atrial. A Figura 2 mostra que, embora o gene da isoforma 1 de MYBPHL seja expresso nos 9 átrios esquerdos estudados, bem como nos 9 ventrículos esquerdos estudados, a expressão do gene da isoforma 1 de MYBPHL é cerca de 210 vezes maior no átrio do que no ventrículo. O gene MYBPH e o gene da isoforma 2 de MYBPHL são expressos principalmente no átrio esquerdo (5 átrios esquerdos contra 2 ventrículos esquerdos para MYBPH e 7 átrios esquerdos contra 1 ventrículo esquerdo para a isoforma 2 de MYBPHL). A Figura 3, que mostra a separação dos produtos de amplificação do biomarcador isoforma 2 de MYBPHL do átrio esquerdo e do ventrículo esquerdo, confirma esta observação.
Portanto, os biomarcadores MYBPH e isoforma 2 de MYBPHL são biomarcadores altamente específicos para danos ao tecido muscular cardíaco atrial. A Figura 4 mostra a separação dos produtos de amplificação do biomarcador isoforma 2 de MYBPHL em tecidos não cardíacos. A Figura 4 mostra que a isoforma 2 de MYBPHL não foi observada nos tecidos não cardíacos, como vasos arteriais que contêm células musculares lisas e amostras do músculo esquelético, o que confirma a especificidade da isoforma MYBPLH 2 para o músculo do coração, especificamente para o átrio esquerdo. Em contraste, MYBPH mostrou uma expressão enriquecida em músculo esquelético.
[038] O nível do biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco atrial observado em um indivíduo controle é o nível de biomarcador determinado em um indivíduo normal saudável ou em um paciente controle. Um indivíduo normal e saudável é uma pessoa para a qual nenhum problema cardíaco ou um problema cardíaco insignificante foi observado. Um paciente controle pode ser um paciente sofrendo de uma condição cardíaca, por exemplo, a cerca de se submeter a uma cirurgia como um bypass das artérias coronárias ou uma cirurgia de válvula, e em que um procedimento de MAZE que consiste em uma ablação do átrio, ou seja, dano ao tecido muscular cardíaco atrial, será realizado durante a cirurgia. Um paciente controle também pode ser um paciente portador de defeito cardíaco e que foi submetido a uma troca isolada de válvula aórtica por meio de uma máquina coração-pulmão, uma vez que tal paciente geralmente não apresenta alteração no átrio. Além disso, o paciente controle pode ser um paciente que foi submetido a um implante de uma válvula cardíaca baseado em cateter sem o uso de uma máquina coração-pulmão.
[039] Um nível elevado do biomarcador no paciente significa que sua concentração está aumentada em relação ao indivíduo controle. Este termo inclui que, no indivíduo saudável normal, o biomarcador é detectável em uma concentração que permanece estável ou quase estável ao longo do tempo, enquanto a concentração de biomarcador em um paciente com danos nos tecidos musculares cardíaco é variável e é maior do que a concentração de biomarcador medido no indivíduo normal e saudável. Também é possível definir uma razão, também chamada de alteração em vezes, entre o nível de biomarcador no paciente e o nível de biomarcador no indivíduo controle, em que, quando a razão está no intervalo de 1,5 a 40, por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 10, 12, 15, 20, 30, o nível de biomarcador no paciente é definido como um aumento em comparação com o nível no indivíduo controle. Em diversos exemplos de realização, um “nível aumentado” refere-se a um aumento de pelo menos 1,5 vezes, de preferência um aumento de pelo menos 2 vezes, em relação ao nível observado em um indivíduo saudável.
[040] O nível observado em um indivíduo controle/saudável também pode ser um valor médio calculado com base em níveis determinados em uma pluralidade de indivíduos controle/saudáveis. O nível do indivíduo controle/saudável também pode ser o nível do paciente antes do referido paciente ser submetido à terapia ou cirurgia ou vivenciado um evento que causou dano ao músculo cardíaco. Os termos “indivíduo saudável” e “indivíduo controle” são usados de forma intercambiável no presente documento.
[041] Em determinados exemplos de realização do método descrito neste documento, o método compreende avaliar a extensão do dano ao tecido muscular cardíaco no paciente, determinando a razão (também chamada de alteração em vezes) entre o nível de biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco atrial na amostra obtida do paciente e o nível de biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco atrial em um indivíduo saudável/controle.
[042] A Figura 5 mostra a evolução da concentração de proteína MYBPHL em amostras de sangue de pacientes submetidos ao procedimento de MAZE, uma ablação do átrio, ou seja, danos ao tecido muscular cardíaco atrial.
Conforme mostrado na Figura 5, a concentração de proteína MYBPHL é a maior concentração de proteína MYBPHL após a ablação do átrio, ou seja, no momento da chegada do paciente à unidade de terapia intensiva. A concentração de proteína MYBPHL diminui ao longo do tempo, por exemplo, dentro de 24 horas após a ablação, uma vez que não está mais ocorrendo danos ao tecido muscular cardíaco atrial. Também a Figura 6 mostra a evolução da concentração de proteína MYBPHL em amostras de sangue de pacientes submetidos à ablação endocárdica ou ablação epicárdica. A ablação endocárdica é uma forma mais agressiva de ablação em comparação com a ablação epicárdica. Como mostrado na Figura 6, a concentração de proteína MYBPHL é mais elevada em pacientes com ablação endocárdica do que nos pacientes com ablação epicárdica. Portanto, como mostrado nos experimentos ilustrados na Figura 5 e Figura 6, a concentração de proteína MYBPHL e, portanto, sua alteração em vezes, é proporcional à extensão do dano ao tecido muscular cardíaco atrial. Em outras palavras, quanto maior o dano ao tecido muscular cardíaco, mais alto é o nível de MYBPHL. Além disso, o biomarcador MYBPHL tem a vantagem de ser um biomarcador sensível, uma vez que o nível de MYBPHL ainda é detectável 24 horas após a ablação atrial, enquanto o biomarcador conhecido Mioglobina não é mais detectado na amostra do paciente após 24 horas.
[043] Em diversos exemplos de realização do método descrito na presente invenção o método compreende ainda a determinação na amostra do paciente do nível de biomarcador adicional para danos ao tecido muscular cardíaco, em que o método é adequado para distinguir entre dano ao tecido muscular atrial e dano ao tecido muscular ventricular.
[044] A diferenciação entre o dano ao tecido muscular atrial e o dano ao tecido muscular ventricular pode ser alcançada determinando o nível de um biomarcador adicional para dano ao tecido muscular cardíaco na amostra do paciente. O método pode compreender ainda a comparação entre o nível do biomarcador adicional com o nível do biomarcador específico para danos ao tecido muscular cardíaco atrial, e/ou comparando o nível do biomarcador adicional na amostra do paciente com o nível do biomarcador adicional em uma amostra obtida de um indivíduo controle para obter a variação em vezes. O biomarcador adicional para dano ao tecido muscular cardíaco pode ser um biomarcador geral para dano ao tecido muscular cardíaco selecionado a partir do grupo que consiste em CK-MB ou troponina. Além disso, o biomarcador adicional para danos ao tecido muscular cardíaco pode ser um biomarcador específico para dano ao tecido muscular cardíaco ventricular. Conforme mostrado na Figura 2, o FHL-2 é um biomarcador específico para dano ao tecido muscular cardíaco ventricular, uma vez que os níveis de expressão do gene FHL- 2 são quase 50 vezes maiores no ventrículo esquerdo em comparação com o átrio esquerdo.
[045] Quando o biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco adicional é um biomarcador geral para dano ao tecido muscular cardíaco, de um modo preferido selecionado a partir do grupo que consiste em CK-MB ou troponina, a relação entre a concentração de proteína do biomarcador geral na amostra do paciente e a concentração de proteína do biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco atrial pode ser calculada. Alternativamente ou adicionalmente, o nível de biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco atrial e o nível de biomarcador geral para dano ao tecido muscular cardíaco podem ser determinados em pontos de tempo de medição periódica durante um período de tempo definido, por exemplo, a cada duas horas, por exemplo, mais de 24 horas ou 72 horas. Se o nível do biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco atrial e o nível do biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco geral diminuir ao longo do período de tempo definido, por exemplo, proporcionalmente um ao outro, o paciente é diagnosticado com um dano ao tecido muscular cardíaco atrial (vide, por exemplo, o exemplo 5, Figura 9 e Figura 10). Se o nível de biomarcador para danos ao tecido muscular cardíaco atrial diminui quando o nível do biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco geral permanece estável ou aumenta, o paciente é diagnóstico com danos ao tecido muscular cardíaco ventricular.
[046] Quando o biomarcador adicional para um dano ao tecido muscular cardíaco é um biomarcador específico para dano ao tecido muscular cardíaco ventricular, de preferência FHL-2, a razão entre a alteração, em vezes, de MYBPHL e a alteração, em vezes, de FHL-2 é calculada, por exemplo, em pontos de tempo de medição periódica durante um período de tempo definido, por exemplo, a cada duas horas, por exemplo, mais de 24 horas ou 72 horas.
Quando a razão entre a alteração em vezes de MYBPHL e a alteração em vezes de FHL-2 é superior a 1,5, por exemplo, em uma faixa de 1,5 a 4, o paciente é diagnosticado com dano ao tecido muscular cardíaco atrial (vide o exemplo 6, Figura 10).
[047] Além disso, a diferenciação entre o dano ao tecido muscular atrial e o dano ao tecido muscular ventricular pode ser alcançada medindo o nível dos biomarcadores muito específicos para os danos ao tecido muscular cardíaco atrial selecionados a partir do grupo que consiste em MYBPH ou MYBPHLt2 em uma amostra do paciente e comparando estes níveis com o nível desses biomarcadores muito específicos em um indivíduo controle. Quando a razão entre o nível dos biomarcadores muito específicos na amostra do paciente e o nível dos biomarcadores muito específicos na amostra de um indivíduo controle está no intervalo de 1,5 a 40, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 12, 15, 20, 30, o paciente é diagnosticado com dano ao tecido muscular cardíaco atrial.
[048] Em diversos exemplos de realização da invenção, a amostra é uma amostra biológica, por exemplo, um fluido corporal, célula ou amostra de tecido. Os fluidos corporais compreendem, mas não estão limitados a sangue, plasma sanguíneo, soro sanguíneo, leite materno, fluido cerebrospinal, cerúmen (cera do ouvido), endolinfa e perilinfa, suco gástrico, muco (incluindo drenagem nasal e catarro), fluido peritoneal, fluido pleural saliva, sebo (óleo da pele), sêmen, suor, lágrimas, secreção vaginal, fluido de aspiração do mamilo, vômito e urina. Em certos exemplos de realização dos métodos detalhados acima, o fluido corporal é selecionado a partir do grupo que consiste em sangue, soro, plasma, urina e saliva. A amostra de tecido pode ser tecido do coração e a amostra de células pode compreender células do tecido cardíaco. Em diversos exemplos de realização, as amostras usadas são amostras de sangue, uma vez que permitem um ensaio muito simples e rápido dos níveis de biomarcadores.
[049] Em alguns exemplos de realização, o paciente é um mamífero, de preferência um humano.
[050] Geralmente, o termo “mamífero”, conforme utilizado na presente invenção, compreende humanos, macacos, porcos, vacas, gatos, cães, porquinhos-da-índia, coelhos, camundongos, ovelhas, cabras e cavalos.
[051] Para a detecção dos marcadores da presente invenção, podem ser utilizados parceiros de ligação específicos. Em alguns exemplos de realização, os parceiros de ligação específicos são úteis para detectar a presença de um marcador em uma amostra, em que o marcador é uma proteína ou RNA. O marcador e seu parceiro de ligação representam um par de moléculas de ligação, que interagem entre si por meio de uma variedade de forças moleculares, incluindo, por exemplo, força iônica, covalente, hidrofóbica, de van der Waals e ligação de hidrogênio. De preferência, esta ligação é específica.
“Ligação específica” significa que os membros de um par de ligação ligam-se de maneira preferencial, isto é, geralmente com uma afinidade significativamente maior do que a de parceiros de ligação não específicos. A afinidade de ligação para parceiros de ligação específicos é, geralmente, pelo menos 10 vezes, de preferência pelo menos 100 vezes maior do que para parceiros de ligação não específicos.
[052] Os parceiros de ligação exemplares para os marcadores da invenção são selecionados a partir do grupo que consiste em anticorpos, fragmentos e variantes de anticorpos, moléculas com propriedades semelhantes a anticorpos, tais como muteínas de lipocalina ou Spiegelmers ou aptâmeros. Os fragmentos de anticorpos e variantes incluem fragmentos Fv, anticorpos lineares de cadeia única e semelhantes, todos conhecidos pelos especialistas na técnica.
São particularmente preferidos os anticorpos.
[053] Em diversos exemplos de realização dos métodos detalhados acima, a determinação do nível de um biomarcador específico para dano ao tecido muscular cardíaco atrial compreende determinar a quantidade de proteína do biomarcador presente em uma amostra. Em outros exemplos de realização, a determinação do nível de um marcador inclui a determinação do nível de expressão de um biomarcador para danos ao tecido muscular cardíaco atrial, por exemplo, o nível de RNA. Geralmente, a determinação do nível de um biomarcador compreende marcadores que determinam o nível de mRNA e/ou o nível de proteína de um biomarcador.
[054] Consequentemente, em alguns exemplos de realização, o nível de pelo menos um ou mais biomarcadores é determinado no nível de mRNA. Em outros exemplos de realização, o nível de pelo menos um ou mais biomarcadores é determinado no nível de proteína. Em diversos exemplos de realização, pelo menos um ou mais marcadores são determinados no nível do mRNA e pelo menos um ou mais marcadores são determinados no nível da proteína.
[055] Se um marcador for determinado no nível de mRNA, o mRNA pode ser mRNA transcrito, mRNA truncado em 5' e/ou 3' ou formas de mRNA alteradas por splicing alternativo.
[056] Se um marcador for determinado ao nível de proteína, a proteína pode ser a proteína de comprimento total ou um fragmento desta. O fragmento de proteína pode ser uma proteína truncada, ou seja, sem um ou mais aminoácidos, por exemplo, no N-terminal ou C-terminal ou ambos. Isso pode ser devido ao processamento pós-tradução ou devido à ação de proteases presentes na célula ou amostra. Os marcadores determinados nos métodos da invenção, portanto, também incluem fragmentos de ocorrência natural, de preferência fragmentos imunogênicos. Além disso, a proteína pode ser modificada pós-tradução, por exemplo, fosforilada, hidroxilada, glicosilada, N- glicosilada, O-glicosilada, ubiquitinilada, acetatada, metilada, prenilada ou sulfatada. Entende-se que, se tais fragmentos forem determinados, as identidades de sequência fornecidas referem-se a toda a sequência do fragmento em relação a todo o comprimento da parte correspondente da sequência de referência.
[057] Em diversos exemplos de realização, os métodos apresentam a determinação dos marcadores ao nível de proteína, ou seja, em particular MYBPHL e suas respectivas isoformas. Tais métodos podem ser preferencialmente realizados em amostras de sangue ou soro obtidas de um paciente.
[058] Em determinados exemplos de realização dos métodos da invenção, são determinados os níveis de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 ou 100 ou mais biomarcadores.
[059] Em diversos exemplos de realização do método da presente invenção, a determinação do nível de um biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco atrial compreende determinar o nível de proteína do biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco atrial em uma amostra.
[060] Em alguns desses exemplos de realização, o nível de um ou mais biomarcadores é determinado no nível de proteína e/ou mRNA.
Consequentemente, em alguns exemplos de realização, os métodos envolvem a determinação do nível dos biomarcadores apenas no nível de proteína.
[061] Os métodos detalhados acima, em que o nível de pelo menos um ou mais marcadores é determinado no nível da proteína, compreendem, em alguns exemplos de realização, a determinação do nível da proteína por um imunoensaio, espectrometria de massa, cromatografia, Western Blot ou eletroforese em gel.
[062] Em alguns exemplos de realização, o imunoensaio pode ser, mas não está limitado a, um ensaio imunoadsorvente enzima-associado (ELISA), Western blot, teste de aglutinação, ensaio tipo biotina/avidina, radioimunoensaio, imunoeletroforese e imunoprecipitação. As reações geralmente incluem a revelação de marcadores, tais como marcadores fluorescentes, quimioluminescentes, radioativos, enzimáticos ou moléculas corantes, ou outros métodos para detectar a formação de um complexo entre o antígeno e o anticorpo ou anticorpos reagidos com ele. Estes e outros imunoensaios são bem conhecidos no estado da técnica (David Wild (Ed.): The Immunoassay Handbook. 3ª ed. Elsevier Science Publishing Company, Amsterdam 2005).
[063] Os ensaios mencionados acima podem envolver a separação de proteína não ligada em uma fase líquida de um suporte de fase sólida ao qual os complexos antígeno-anticorpo estão ligados. Os suportes sólidos que podem ser usados na prática da invenção incluem substratos tais como nitrocelulose (por exemplo, na forma de membrana ou poço de microtitulação); polivinilcloreto (por exemplo, folhas ou poços de microtitulação); látex de poliestireno (por exemplo, contas ou placas de microtitulação); fluoreto de polivinilidina; papel diazotado; membranas de náilon; esferas ativadas, esferas responsivas magneticamente e semelhantes.
[064] Mais particularmente, pode ser usado um método ELISA, em que os poços de uma placa de microtitulação são revestidos com um anticorpo contra a proteína a ser testada. Uma amostra biológica contendo ou com suspeita de conter o marcador é então adicionada aos poços revestidos. Após um período de incubação suficiente para permitir a formação de complexos de anticorpo-antígeno, a(s) placa(s) pode(m) ser lavada(s) para remover frações não ligadas e uma molécula de ligação secundária detectavelmente marcada adicionada. A molécula de ligação secundária é deixada reagir com qualquer proteína marcadora de amostra capturada, a placa é lavada e a presença da molécula de ligação secundária detectada usando métodos bem conhecidos no estado da técnica.
[065] Em certos exemplos de realização dos métodos detalhados acima, se a determinação for via espectrometria de massa, a espectrometria de massa pode ser selecionada a partir do grupo que compreende medições de MS usando EI, CI, ESI, APLI, APPI e APCI.
[066] A determinação de biomarcador no nível de proteína empregando cromatografia pode ser selecionada a partir do grupo que compreende cromatografia líquida, HPLC, FPLC, cromatografia inteligente, cromatografia em gel, cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de fase reversa e cromatografia de troca iônica (Introduction to Modern Liquid Chromatography, Lloyd R. Snyder, 5 Wiley, 2009).
[067] Em diversos exemplos de realização, se o biomarcador for detectado por meio de eletroforese em gel, a eletroforese em gel pode ser selecionada a partir do grupo, mas não se limitando a eletroforese em gel de agarose, eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio poliacrilamida (SDS- PAGE), eletroforese em gel 2D, eletroforese em gel nativo e eletroforese em gel de poliacrilamida contínua preparativa quantitativa (QPNC-PAGE).
[068] Obviamente, em determinados exemplos de realização dos métodos da presente invenção, pelo menos dois métodos de determinação podem ser acoplados um ao outro de uma maneira subsequente. Em uma foma variante, a eletroforese em gel pode ser seguida por análise por espectroscopia de massa. Alternativamente, a eletroforese em gel pode ser seguida por Western
Blot, a cromatografia pode ser seguida por análise de espectroscopia de massa 15, a cromatografia pode ser seguida por um imunoensaio, por exemplo, ELISA.
[069] Em outros exemplos de realização dos métodos da presente invenção, a determinação do nível do biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco atrial compreende determinar o nível de mRNA do biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco atrial em uma amostra. Em variantes alternativas desses exemplos de realização, o nível de um ou mais outros biomarcadores é determinado. Em alguns desses exemplos de realização, o nível de um ou mais biomarcadores é determinado no nível de proteína e/ou mRNA. Consequentemente, em alguns exemplos de realização, os métodos envolvem a determinação do nível dos biomarcadores apenas no nível de RNA.
[070] Quando nos métodos detalhados acima um biomarcador é determinado ao nível do mRNA, o nível do RNA pode ser determinado por PCR, eletroforese em gel e/ou Northern Blot.
[071] No caso de o nível de biomarcador ser determinado pelo nível de RNA, o reagente de detecção pode ser uma molécula de ácido nucleico, tal como um oligonucleotídeo. O oligonucleotídeo pode ser uma sonda de ácido nucleico que pode ser marcada para permitir a detecção ou pode ser um iniciador (primer) de oligonucleotídeo que permite a amplificação da molécula alvo.
[072] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a um kit para uso em um método conforme detalhado acima, em que o kit compreende reagentes para determinar o nível de um ou mais biomarcadores para dano ao tecido muscular cardíaco atrial e reagentes para determinar o nível do biomarcador adicional para dano ao músculo cardíaco em uma amostra. Em determinados exemplos de realização, os reagentes para determinar o nível de um biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco atrial e do biomarcador adicional para dano ao músculo cardíaco em uma amostra são anticorpos e/ou oligonucleotídeos. Em alguns dos exemplos de realização acima, o kit compreende reagentes para a determinação do nível de um biomarcador para danos ao tecido muscular cardíaco atrial e reagentes para a determinação do nível do biomarcador adicional de dano ao músculo cardíaco em uma amostra.
Em um exemplo de realização, o kit compreende outro reagente para a detecção de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 ou 100 biomarcadores adicionais.
[073] Além disso, a presente invenção provê um painel de biomarcadores compreendendo um ou mais biomarcador para danos ao tecido muscular cardíaco atrial, tal como revelado na presente invenção, e um ou mais biomarcadores adicionais para danos ao músculo cardíaco, tal como divulgado na presente invenção, para uso no método da invenção. Em determinados exemplos de realização, o painel compreende pelo menos um ou mais biomarcadores diferentes. Em um exemplo de realização, o painel de biomarcadores compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 ou 100 biomarcadores adicionais. Estes podem ser selecionados a partir daqueles divulgados na presente invenção. Também são abrangidos kits que compreendem reagentes de detecção para os marcadores incluídos no painel de biomarcadores. Os referidos reagentes de detecção podem ser, por exemplo, anticorpos específicos para o respectivo marcador.
[074] O kit descrito acima compreende, em diversos exemplos de realização, reagentes para determinar MYBPHL e suas isoformas, de preferência reagentes que permitem determinar os referidos marcadores como proteínas em uma amostra de sangue, tais como anticorpos. Da mesma forma, o painel de biomarcadores compreende, em diversos exemplos de realização, MYBPHL e suas isoformas.
EXEMPLOS EXEMPLO 1 AUMENTO DA EXPRESSÃO GÊNICA DE MYBPHL, MYBPH, ISOFORMA 1 DE
MYBPHL E ISOFORMA 2 DE MYBPHL NO TECIDO MUSCULAR CARDÍACO ATRIAL
[075] Um estudo do proteoma do coração humano foi realizado, por exemplo, de acordo com “Region and cell-type resolved quantitative proteomic map of the human heart” Doll S, Dreßen M, Geyer PE, Itzhak DN, Braun C, Doppler SA, Meier F, Deutsch MA, Lahm H, Lange R, Krane M, Mann M. Nat Commun. 2017 Nov 13;8(1):1469. doi: 10.1038/s41467-017-01747-2.
PMID: 29133944. A expressão de vários biomarcadores em amostras de tecido cardíaco obtidas de pacientes submetidos à cirurgia cardíaca por meio de biópsia foi validada por qPCR. No estudo, as amostras de tecido foram retiradas das seguintes áreas (em que o número de amostra de tecido foi n = 3): átrio esquerdo (LA), átrio direito (RA), ventrículo esquerdo (LV) e ventrículo direito (RV).
[076] A Figura 1 mostra os resultados da análise da expressão gênica do biomarcador MYBPHL e do biomarcador FHL2, em que a análise da expressão gênica foi realizada por qPCR. A Figura 1 A mostra um diferencial altamente significativo na expressão de MYBPHL no átrio esquerdo e no átrio direito em comparação com o ventrículo esquerdo. Desse modo, a expressão gênica do MYBPHL no átrio direito é 300 vezes maior do que no ventrículo esquerdo. A Figura 1B mostra um diferencial significativo na expressão de FHL2 no ventrículo esquerdo em comparação com o átrio esquerdo e o átrio direito, em que a expressão do gene de FHL 2 no ventrículo esquerdo é 28 vezes mais elevada do que no átrio esquerdo.
[077] A Figura 2 mostra os resultados da análise de expressão gênica do biomarcador MYBPHL, FHL-2, MYBPC3 e MYBPH, bem como as isoformas de MYBPHL, isoforma 1 de MYBPHL (MYBPHL t1) e isoforma 2 de MYBPHL (MYBPHL t2) em tecidos musculares retirados de 9 ventrículos esquerdos e tecidos musculares retirados de 9 átrios esquerdos obtidos por meio de biópsia em um paciente, em que a análise da expressão gênica foi realizada por qPCR. Assim, as expressões gênicas de MYBPHL, MYBPH e as duas isoformas de MYBPHL, isoforma 1 de MYBPHL e isoforma 2 de MYBPHL, são maiores no átrio esquerdo, onde a expressão diferencial de MYBPH é claramente menor do que a de MYBPHL (quase 42 vezes menor). O FHL-2 é um gene que expressa em um nível superior no ventrículo esquerdo. Além disso, a isoforma 2 de MYBPHL mostra uma alta especificidade para o átrio esquerdo, uma vez que a isoforma 2 de MYBPHL é expressa apenas em 1 amostra do ventrículo esquerdo de 9 amostras do ventrículo esquerdo, enquanto a isoforma 2 de MYBPHL é expressa em 7 amostras de átrio esquerdo de 9 amostras de átrio esquerdo.
[078] A Figura 3 mostra os resultados da análise da expressão gênica do biomarcador isoforma 2 de MYBPHL, em que a análise da expressão gênica foi mostrada por eletroforese em gel. Desse modo, a alta especificidade da isoforma 2 de MYBPHL para o átrio esquerdo é confirmada, de modo que a isoforma 2 de MYBPHL não foi detectada em nenhuma das amostras do ventrículo esquerdo, enquanto a isoforma 2 de MYBPHL foi detectada em 7 amostras das 9 amostras de átrio esquerdo.
[079] A Figura 4 mostra o nível de expressão da isoforma 2 de MYBPHL no átrio esquerdo, bem como em tecidos não cardíacos. A Figura 4 mostra que a isoforma 2 de MYBPHL não foi detectada em nenhum dos vasos arteriais contendo células musculares lisas e amostras de músculo esquelético, enquanto a isoforma 2 de MYBPHL foi detectada no átrio esquerdo, confirmando assim a alta especificidade cardíaca da isoforma 2 de MYBPHL.
EXEMPLO 2
[080] Um estudo foi realizado para determinar se o biomarcador MYBPHL poderia ser detectado no plasma sanguíneo. Foi estudado um grupo de pacientes que sofreu uma ablação (procedimento de MAZE modificado) para o tratamento da fibrilação atrial além de cirurgia cardíaca como enxerto bypass da artéria coronária ou cirurgia de válvula. No procedimento de MAZE, o dano ao músculo cardíaco específico direcionado e pretendido foi realizado no tecido muscular cardíaco endocárdico ou no tecido muscular cardíaco epicárdico do paciente. Durante um período de 24 horas nos seguintes pontos de medição, uma amostra de sangue foi retirada do paciente:
1. Pre-OP antes do início da cirurgia cardíaca;
2. 0h chegada do paciente na unidade de terapia intensiva;
3. 2h 2 horas após a chegada do paciente na unidade de terapia intensiva;
4. 4h 4 horas após a chegada do paciente na unidade de terapia intensiva;
5. 6h 6 horas após a chegada do paciente na unidade de terapia intensiva; e
6. 24h 24 horas após a chegada do paciente na unidade de terapia intensiva.
[081] A Figura 5 mostra os resultados da medição da concentração da proteína MYBPHL nas amostras de plasma sanguíneo obtidas do grupo de pacientes de 12 pacientes (n = 12), que foram submetidos a ablação endocárdica e epicárdica. A concentração de MYBPHL na amostra de plasma aumentou clara e significativamente já no ponto de tempo de medição 2. No ponto de tempo de medição 2, o máximo da concentração de plasma de MYBPHL é atingido. Ao longo do tempo, a concentração plasmática de MYBPHL diminuiu gradualmente, em que a concentração plasmática de MYBPHL no ponto de tempo de medição 6, ou seja, 24 horas após a chegada do paciente na unidade de terapia intensiva, ainda não atingiu o nível de concentração pré-operatório. Os dados mostram que MYBPHL em comparação com a mioglobina, um biomarcador inespecífico conhecido na técnica, permite a detecção no plasma sanguíneo da ocorrência de dano ao músculo cardíaco mesmo após mais de 24 horas após sua ocorrência.
EXEMPLO 3
[082] A Figura 6 mostra os resultados da medição da concentração de proteína MYBPHL em uma amostra de plasma sanguíneo ao longo de um período de tempo definido e em pontos de tempo de medição conforme descrito no Exemplo 2 em pacientes que foram submetidos a ablação endocárdica (A) ou ablação epicárdica (B). Neste estudo, um grupo de 9 pacientes (n = 9) foi submetido à ablação endocárdica (A) e um grupo de 3 pacientes (n = 3) foi submetido à ablação epicárdica (B). A ablação endocárdica é uma forma mais agressiva de ablação do que a epicárdica e leva a danos mais severos ao músculo cardíaco. Os valores pós- operatórios mostram para ambos os grupos de pacientes com ablação endocárdica e ablação epicárdica um aumento significativo da concentração da proteína MYBPHL no plasma sanguíneo, que diminui com o tempo. Entretanto, para pacientes que receberam ablação epicárdica, a concentração da proteína MYBPHL no plasma sanguíneo nunca atingiu um nível mais alto do que a concentração da proteína MYBPHL em todos os momentos de medição pós-operatória no plasma sanguíneo de pacientes que receberam ablação endocárdica. Isso mostra a sensibilidade e a correlação entre a concentração da proteína MYBPHL e o dano ao músculo cardíaco atrial presente, uma vez que a concentração da proteína MYBPHL é maior nos pacientes que receberam a ablação endocárdica mais agressiva.
[083] A Figura 7 mostra a alteração em vezes na concentração da proteína MYBPHL no plasma sanguíneo de acordo com a Figura 6. Para o caso de ablação do endocárdio, a concentração plasmática de MYBPHL pré-operatória foi arbitrariamente estabelecida em 1. No caso de ablação do endocárdio, foi medido um aumento máximo de 3 vezes na concentração de MYBPHL. O máximo corresponde ao ponto de tempo de medição do paciente na chegada a unidade de terapia intensiva. Por outro lado, no caso de ablação epicárdica, foi medido um aumento máximo de 20 vezes na concentração de MYBPHL, em que a intensidade do dano ao músculo cardíaco atrial é menor, conforme descrito na Fig.5.
EXEMPLO 4
[084] A concentração da proteína MYBPHL foi medida em um grupo de pacientes que apresentou infarto agudo do miocárdio com elevação do segmento ST. A Figura 8 mostra os resultados da medição da concentração de proteína MYBPHL nas amostras de plasma sanguíneo. As amostras de sangue foram coletadas em dois pontos de tempo, um antes da intervenção e um de 72 horas após a intervenção. A intervenção foi realizada por meio de cateter cardíaco. Devido à patologia de infarto agudo do miocárdio com elevação de ST, os pacientes deste grupo sofreram de um dano ventricular definitivo junto com um dano cardíaco atrial, como mostrado na Figura 8, onde a concentração plasmática de MYBPHL mais alta é encontrada no ponto de tempo de medição 1, por exemplo, antes da intervenção. Esta concentração plasmática de MYBPHL é semelhante à concentração plasmática de MYBPHL encontrada em pacientes tratados por procedimento de MAZE epicárdico. 72 horas após a intervenção, a concentração plasmática de MYBPHL diminuiu para valores semelhantes aos obtidos no exemplo 3 antes dos pacientes serem tratados por MAZE (Figura 5 e Figura 6a) ou em indivíduos saudáveis. Os dados deste estudo mostram que a concentração plasmática de MYBPHL aumenta muito no caso de uma lesão aguda do músculo cardíaco e diminui com o tempo para atingir os valores normais quando a patologia não está mais presente.
EXEMPLO 5
[085] A Figura 9 A mostra os resultados da medição da concentração da proteína CK-MB nas amostras de sangue obtidas do mesmo grupo de pacientes do exemplo 2. A Figura 9B mostra a alteração na concentração da proteína CK-MB nas amostras de soro de acordo com a Figura 9A. Em comparação com MYBPHL, a concentração de proteína CK-MB atingiu seu valor máximo também no ponto de tempo de medição 2. Neste ponto de tempo de medição 2, a concentração de proteína CK-MB é 15 vezes maior que a Concentração da proteína CK-MB antes da ablação.
[086] A Figura 10 mostra uma correlação entre os valores de concentração MYBPHL em uma amostra de plasma de 12 pacientes que foram submetidos a uma ablação e os valores de concentração de CK-MB nas amostras de soro sanguíneo dos mesmos pacientes nos mesmos tempos de medição. A CK-MB, embora inespecífica para dano ao músculo atrial ou ao músculo ventricular, é um biomarcador estabelecido para a detecção de dano ao músculo cardíaco, em que sua concentração é conhecida como estando correlacionada com a extensão do dano ao músculo cardíaco. Como mostrado na Figura 10, uma correlação de 1- para -1 pode ser provada entre os valores de concentração de MYBPHL e valores de concentração de CK-MB.
EXEMPLO 6
DIFERENCIAÇÃO ENTRE DANO AO TECIDO MUSCULAR CARDÍACO ATRIAL E DANO AO TECIDO MUSCULAR CARDÍACO VENTRICULAR USANDO A ALTERAÇÃO (EM VEZES) DE BIOMARCADOR MYBPHL E A ALTERAÇÃO (EM VEZES) DO BIOMARCADOR FHL- 2
[087] A Figura 11 mostra uma representação da razão entre a alteração em vezes de MYBPHL e a alteração em vezes de FHL-2. Nas duas colunas da esquerda da representação são mostrados os resultados para os pacientes que sofrem de infarto do miocárdio com elevação de ST, enquanto que sobre as seis colunas da direita da representação, são mostrados os resultados para os pacientes que sofrem de fibrilação atrial e passaram por uma ablação. A razão entre a variação em vezes de MYBPHL e a variação em vezes de FHL-2 aumenta em até 2 para pacientes submetidos à ablação atrial. Em contrapartida, a razão entre a alteração em vezes de MYBPHL e a alteração em vezes de FHL- 2 permanece estável em cerca de 1 antes e depois da intervenção em pacientes que sofreram de infarto do miocárdio com elevação de ST, por exemplo, dano ao tecido muscular cardíaco ventricular.
[088] Todos os documentos citados no presente são incorporados ao presente pela referência em sua totalidade.
[089] A invenção aqui descrita de forma ilustrativa pode ser adequadamente praticada na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações que não estejam especificamente divulgados no presente pedido. Desta maneira, por exemplo, os termos “compreendendo”, “incluindo”, “contendo” e etc. devem ser interpretados de maneira expansiva e sem qualquer limitação. Adicionalmente, os termos e expressões empregados no presente foram utilizados como termos de descrição e não de limitação, e não há intenção no uso de tais termos e expressões para excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou partes destas, mas reconhece-se que várias modificações são possíveis dentro do escopo da invenção reivindicada.
Assim, deve ser entendido que, embora a presente invenção tenha sido especificamente divulgada por exemplos de realização preferidos e características opcionais, os técnicos hábeis no assunto podem facilmente realizar recursos opcionais, alterações e variações das invenções enunciadas no presente, e que tais modificações e variações são consideradas dentro do escopo das invenções divulgadas no presente documento. A invenção foi descrita de maneira abrangente e genérica. Cada uma das espécies mais restritas e agrupamentos subgenéricos abrangidos na divulgação genérica também fazem parte da presente invenção.
Isso inclui a descrição genérica da invenção com uma condição ou limitação negativa removendo qualquer assunto do gênero, independentemente de o material excluído ser ou não especificamente citado no presente documento.
Claims (14)
1. MÉTODO IN VITRO PARA O DIAGNÓSTICO DE DANO AO TECIDO MUSCULAR CARDÍACO, preferivelmente dano ao tecido muscular cardíaco atrial, sendo o método caracterizado por compreender: (a) determinar o nível de um biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco atrial selecionado a partir do grupo que consiste em MYBPHL e suas isoformas em uma amostra in vitro; e (b) comparar o nível determinado na etapa (a) com o nível do biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco atrial observado em um indivíduo controle, em que se o nível determinado na etapa (a) estiver aumentado em comparação com o nível do biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco atrial no indivíduo controle, o dano ao tecido muscular cardíaco é diagnosticado.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas isoformas de MYBPHL serem selecionadas a partir do grupo que consiste em isoforma 1 de MYBPHL e isoforma 2 de MYBPHL.
3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela isoforma 1 de MYBPHL e isoforma 2 de MYBPHL terem as sequências de aminoácidos estabelecidas na SEQ ID NO: 3 ou 6.
4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo nível de um ou mais biomarcadores adicionais para dano ao músculo cardíaco atrial ser determinado na etapa (a), sendo os referidos biomarcadores selecionados a partir de MYBPH, MYOT, ASNSD1, CHFR, NTN1, RFC5, POLI, COMP, POF1B, PLA2G2A, HDAC10, ASPG, FMOD, CA13, CACNA2D2, GNL3L, COL2A1, PDLIM4, LEPREL1, OMD, DGKZ, NT5DC2, ITLN1, NTM, PRKG2, CHGB, FAM179A, CKMT1A, CKMT1B, LTBP3, SGSM1, METTL7B, LTBP2, OGDHL, PAM, SBK3, SFRP1 e suas isoformas e na etapa (b) os níveis dos referidos biomarcadores determinados na etapa (a) são comparados com os níveis dos respectivos marcadores em um indivíduo controle.
5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por incluir ainda a determinação da extensão do dano ao tecido muscular cardíaco, cuja extensão dos danos ao músculo cardíaco é avaliada por determinação da relação entre o nível do biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco atrial na amostra in vitro e o nível do biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco atrial em um indivíduo controle.
6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por compreender adicionalmente: (c) na amostra in vitro, determinar do nível de um biomarcador adicional para um dano ao tecido muscular cardíaco, em que o método é adequado para diferenciar entre o dano ao tecido muscular atrial e o dano ao tecido muscular ventricular.
7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo biomarcador adicional ser um biomarcador específico para dano ao tecido muscular cardíaco ventricular, de preferência FHL-2, SMYD2, FASTKD1, PRR33, SORBS2, CRISPLD1, NPHP4, ANKRD2, TMEM159, ATP7A, C12ORF73, NAV1, ATP5B, HSPB7, TMEM88, WDR62, ACTN3, TRIM72, EGFLAM, LRRC39, DPYSL4, PFKFB2, ABCB6, METTL2B, METTL2A, CARNS1, SPTBN1 ou isoformas dos mesmos.
8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo biomarcador adicional ser um biomarcador geral para dano ao tecido muscular cardíaco, de preferência selecionado a partir do grupo que consiste em CK-MB ou Troponina.
9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela amostra ser soro sanguíneo ou plasma sanguíneo.
10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações
1 a 9, caracterizado pela amostra in vitro ser de um humano.
11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pela determinação do nível do biomarcador compreender a determinação da concentração proteica de biomarcador.
12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pela concentração de proteína ser determinada por um imunoensaio, ELISA, espectrometria de massa, cromatografia, Western Blot ou eletroforese em gel.
13. KIT, para uso em um método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 12, caracterizado pelo kit compreender reagentes para a determinação do nível do biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco atrial e reagentes para a determinação do nível do biomarcador adicional de dano ao músculo cardíaco em uma amostra.
14. PAINEL DE MARCADORES, caracterizado por compreender um biomarcador para dano ao tecido muscular cardíaco atrial e outros biomarcadores adicionais para dano ao músculo cardíaco, para uso em um método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 12.
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