BR112020015746A2

BR112020015746A2 - Sistema e método de bioprocessamento.

Info

Publication number: BR112020015746A2
Application number: BR112020015746-5A
Authority: BR
Inventors: Weston Blaine Griffin; D. Corwin Alex; Xiaohua Zhang; Reginald Donovan Smith; Zhen Liu; Chengkun Zhang; Vandana Keskar; Brian Michael Davis; Kashan Shaikh
Original assignee: Global Life Sciences Solutions Usa Llc
Priority date: 2018-02-09
Filing date: 2019-02-08
Publication date: 2020-12-08
Also published as: CN111971382A; SG11202007439TA; WO2019155028A1; JP2024019666A; JP7462949B2; RU2020126463A; AU2019219295A1; SG11202007425YA; KR20200120664A; KR20200120665A; JP2021513343A; SG11202007435RA; CN111954710A; CN112041423A; AU2019219294A1; JP2021513350A; JP7403906B2; EP3749748A1; AU2019219292A1; EP3749744A1

Abstract

trata-se de um sistema de bioprocessamento que inclui um primeiro módulo configurado para enriquecer e isolar uma população de células, um segundo módulo configurado para ativar, modificar geneticamente e expandir a população de células e um terceiro módulo configurado para recolher a população expandida de células.

Description

SISTEMA E MÉTODO DE BIOPROCESSAMENTO FUNDAMENTOS CAMPO DA TÉCNICA

[001] Modalidades da invenção referem-se geralmente a sistemas e métodos de bioprocessamento e, mais particularmente, a um sistema e métodos de bioprocessamento para a produção de imunoterapias celulares.

DISCUSSÃO DA TÉCNICA

[002] Várias terapias médicas envolvem a extração, cultura e expansão de células para uso em processos terapêuticos a jusante. Por exemplo, a terapia com células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) é uma terapia celular que redireciona as células T de um paciente para atingir e destruir especificamente células tumorais. O princípio básico do design das células CAR-T envolve receptores recombinantes que combinam as funções de ligação ao antígeno e ativação das células T. A premissa geral das células CAR-T é gerar artificialmente células T direcionadas aos marcadores encontrados nas células cancerígenas. Os cientistas podem remover as células T de uma pessoa, alterar as mesmas geneticamente e devolver as mesmas ao paciente para atacar as células cancerígenas. As células CAR-T podem ser derivadas do sangue de um paciente (autólogo) ou de outro doador saudável (alogênico).

[003] A primeira etapa na produção de células CAR-T envolve o uso de aférese, por exemplo, aférese de leucócitos, para remover o sangue do corpo de um paciente e separar os leucócitos. Após o recolhimento de uma quantidade suficiente de leucócitos, o produto da leucaférese é enriquecido para as células T, o que envolve a lavagem das células do tampão de leucaférese. Subconjuntos de células T com biomarcadores específicos são, então, isolados da subpopulação enriquecida com o uso de conjugados ou marcadores de anticorpos específicos.

[004] Após o isolamento das células T direcionadas, as células são ativadas em um determinado ambiente no qual as mesmas podem proliferar ativamente. Por exemplo, as células podem ser ativadas com o uso de microesferas magnéticas revestidas com anticorpos monoclonais anti- CD3/anti-CD28 ou células apresentadoras de antígenos artificiais baseados em células (aAPCs), que podem ser removidas da cultura com o uso de separação magnética. As células T são então transduzidas com os genes CAR através de vetores integradores de gamarretrovírus (RV) ou lentivírus (LV). O vetor viral usa maquinaria viral para se ligar às células do paciente e, ao entrar nas células, o vetor introduz material genético na forma de RNA. No caso da terapia celular com CAR-T, esse material genético codifica o CAR. O RNA é transcrito reversamente no DNA e integra-se permanentemente no genoma das células do paciente; permitindo que a expressão de CAR seja mantida à medida que as células se dividem e crescem em grandes números em um biorreator. O CAR é, então, transcrito e traduzido pelas células do paciente, e o CAR é expresso na superfície celular.

[005] Depois que as células T são ativadas e transduzidas com o vetor viral que codifica o CAR, as células são expandidas para grandes números em um biorreator para atingir a densidade celular desejada. Após a expansão, as células são recolhidas, lavadas, concentradas e formuladas para infusão em um paciente.

[006] Os sistemas e métodos existentes para fabricar uma dose infusível de células T CAR requerem muitas operações complexas que envolvem um grande número de pontos de contato humanos, o que adiciona tempo ao processo geral de fabricação e aumenta o risco de contaminação. Embora os esforços recentes para automatizar o processo de fabricação tenham eliminado alguns pontos de contato humanos, esses sistemas ainda sofrem com gargalos de alto custo, inflexibilidade e fluxo de trabalho. Em particular, os sistemas que utilizam maior automação são muito caros e inflexíveis, pois exigem que os clientes adaptem seus processos ao equipamento específico do sistema.

[007] Tendo em vista o exposto, é necessário um sistema de bioprocessamento para imunoterapias celulares que reduza o risco de contaminação aumentando a automação e diminuindo o manuseio humano. Além disso, é necessário um sistema de bioprocessamento para a fabricação de terapia celular, que equilibre as necessidades de flexibilidade no desenvolvimento e consistência na produção em volume, além de atender ao desejo de diferentes clientes de executar processos diferentes.

BREVE DESCRIÇÃO

[008] Certas modalidades proporcionais em escopo ao assunto reivindicado originalmente estão resumidas abaixo. Essas modalidades não pretendem limitar o escopo do objeto reivindicado, mas, sim, essas modalidades destinam-se apenas a prover um breve sumário das modalidades possíveis. De fato, a divulgação pode abranger uma variedade de formas que podem ser semelhantes ou diferentes das modalidades estabelecidas abaixo.

[009] Em uma modalidade, um sistema de bioprocessamento inclui um primeiro módulo configurado para enriquecer e isolar uma população de células, um segundo módulo configurado para ativar, transduzir geneticamente e expandir a população de células e um terceiro módulo configurado para recolher a população expandida de células.

[0010] Em outra modalidade, um sistema de bioprocessamento inclui um primeiro módulo configurado para enriquecer e isolar células, uma pluralidade de segundos módulos, cada segundo módulo configurado para ativar, transduzir geneticamente e expandir as células e um terceiro módulo configurado para recolher as células após a expansão. Cada segundo módulo é configurado para suportar a ativação, transdução genética e expansão de diferentes populações de células em paralelo.

[0011] Em outra modalidade, um método de bioprocessamento inclui as etapas de um primeiro módulo, enriquecer e isolar uma população de células, em um segundo módulo, ativar, transduzir geneticamente e expandindo a população de células e, em um terceiro módulo, recolher a população expandida de células. As etapas de ativação, transdução genética e expansão da população de células são realizadas sem remover a população de células do segundo módulo.

[0012] Em outra modalidade, um aparelho para bioprocessamento inclui um alojamento e uma gaveta a receber dentro do alojamento. A gaveta incluindo uma pluralidade de paredes laterais e um fundo que define uma câmara de processamento e um topo geralmente aberto. A gaveta é móvel entre uma posição fechada na qual a gaveta é recebida dentro do compartimento e uma posição aberta na qual a gaveta se estende do compartimento permitindo acesso à câmara de processamento através do topo aberto. O aparelho também inclui pelo menos uma placa de leito posicionada dentro da câmara de processamento e configurada para receber um vaso de biorreator.

[0013] Em outra modalidade, um método de bioprocessamento inclui as etapas de deslizar uma gaveta com uma pluralidade de paredes laterais, um fundo e um topo geralmente aberto de uma posição fechada dentro de um alojamento para uma posição aberta para estender a gaveta do alojamento, através do topo aberto, posicionar um vaso de biorreator, através do topo geralmente aberto, em uma placa de leito estático posicionado dentro da gaveta, deslizar a gaveta para a posição fechada e controlar um atuador de engate de gaveta para engatar uma pluralidade de linhas de fluxo de fluido com pelo menos um bomba e uma pluralidade de atuadores lineares de válvula de diafragma.

[0014] Em outra modalidade, um sistema para bioprocessamento inclui um alojamento, uma primeira gaveta a receber dentro do alojamento, em que a primeira gaveta inclui uma pluralidade de paredes laterais e um fundo que define uma primeira câmara de processamento e um topo geralmente aberto, pelo menos uma primeira placa de base posicionada dentro da câmara de processamento da primeira gaveta e configurada para receber ou engatar um primeiro vaso de biorreator na mesma, uma segunda gaveta a receber dentro do compartimento em relação empilhada com a primeira gaveta, em que a segunda gaveta inclui uma pluralidade de paredes laterais e um fundo que define uma segunda câmara de processamento e um topo geralmente aberto e pelo menos uma segunda placa de leito posicionada dentro da câmara de processamento da segunda gaveta e configurada para receber ou de outra forma engatar um segundo vaso de biorreator na mesma. A primeira gaveta e a segunda gaveta são móveis entre uma posição fechada na qual a primeira gaveta e/ou a segunda gaveta são recebidas dentro do compartimento e uma posição aberta na qual a primeira gaveta e/ou a segunda gaveta se estendem do compartimento permitindo o acesso às câmaras de processamento, respectivamente, através do topo aberto.

[0015] Em ainda outra modalidade um aparelho para bioprocessamento inclui um compartimento, uma gaveta a receber dentro do compartimento, em que a gaveta inclui uma pluralidade de paredes laterais e uma superfície inferior que define uma câmara de processamento e um topo geralmente aberto, em que a gaveta é móvel entre uma posição fechada na qual a gaveta é recebida dentro do alojamento e uma posição aberta na qual a gaveta se estende a partir do alojamento, permitindo acesso à câmara de processamento através do topo aberto, pelo menos uma placa do leito posicionada dentro da câmara de processamento adjacente à superfície inferior, e um kit a receber dentro da câmara de processamento. O kit inclui uma pluralidade de paredes laterais e uma superfície inferior que define um compartimento interior e um topo geralmente aberto, uma abertura formada na superfície inferior do kit, em que a abertura tem um perímetro e um vaso de biorreator posicionado acima da pelo menos uma abertura dentro do compartimento interno e suportado pela superfície inferior, de modo que uma porção do vaso de biorreator seja acessível através da abertura na superfície inferior. O kit é recebido dentro da câmara de processamento, de modo que a placa do leito se estenda através da abertura na superfície inferior da bandeja para suportar o vaso de biorreator acima da superfície inferior do kit.

[0016] Em ainda outra modalidade, um sistema para bioprocessamento inclui uma bandeja com uma pluralidade de paredes laterais e uma superfície inferior que define um compartimento interior e um topo geralmente aberto, pelo menos uma abertura formada na superfície inferior, e pelo menos uma abertura tendo um perímetro , um primeiro bloco de suporte de tubulação integrado à bandeja e configurado para receber pelo menos um tubo de bomba e manter o pelo menos um tubo de bomba em posição para engate seletivo com uma bomba, um segundo bloco de suporte de tubulação integrado à bandeja e configurado para receber um pluralidade de tubos de válvula de diafragma e manter cada tubo de válvula de diafragma da pluralidade de tubos de válvula de diafragma em posição para engate seletivo com um respectivo atuador de uma matriz de válvula de diafragma e um vaso de biorreator posicionado acima de pelo menos uma abertura dentro do compartimento interior e suportado pela superfície inferior, de modo que uma porção do vaso de biorreator seja acessível através da abertura na superfície inferior.

[0017] Em ainda outra modalidade, um sistema para bioprocessamento inclui uma câmara de processamento que tem uma pluralidade de paredes laterais, uma superfície inferior e um topo geralmente aberto, uma placa de leito posicionada dentro da câmara de processamento adjacente à superfície inferior e uma bandeja. A bandeja inclui uma pluralidade de paredes laterais e uma superfície inferior que define um compartimento interior e um topo geralmente aberto e uma abertura na superfície inferior da bandeja, em que a abertura tem um perímetro. O perímetro da abertura é formado e/ou dimensionado de modo que um vaso de biorreator possa ser posicionado acima da abertura e apoiado pela superfície inferior da bandeja enquanto uma porção do vaso de biorreator é acessível através da abertura na superfície inferior. A bandeja é recebida dentro da câmara de processamento, de modo que a placa do leito se estenda através da abertura na superfície inferior da bandeja para suportar o vaso de biorreator.

[0018] Em ainda outra modalidade um sistema para bioprocessamento inclui uma bandeja com uma pluralidade de paredes laterais e uma superfície inferior que define um compartimento interior e um topo geralmente aberto e pelo menos uma abertura na superfície inferior, a abertura delimitada por uma borda perimétrica, em que a abertura é formada e/ou dimensionada de modo que um vaso de biorreator possa ser posicionado acima da abertura e suportado pela superfície inferior da bandeja dentro do compartimento interior.

[0019] Em ainda outra modalidade, um método de bioprocessamento inclui as etapas de colocação de um vaso de biorreator em uma bandeja descartável, em que a bandeja descartável tem uma pluralidade de paredes laterais e uma superfície inferior definindo um compartimento interior, um topo geralmente aberto, uma abertura formada no fundo superfície e uma pluralidade de abas ou projeções que se estendem para a abertura a partir da superfície inferior, dispor o vaso de biorreator dentro da bandeja de modo que o vaso de biorreator seja suportado pela pluralidade de abas acima da abertura e colocar a bandeja em uma câmara de processamento que tem uma placa de base, de modo que a placa de base seja recebida através da abertura na bandeja e suporte o vaso de biorreator.

[0020] Em ainda outra modalidade, um módulo de tubulação para um sistema de bioprocessamento inclui um primeiro bloco de suporte de tubulação configurado para receber pelo menos um tubo de bomba e manter o pelo menos um tubo de bomba em posição para engate seletivo com uma bomba peristáltica e um segundo bloco de suporte de tubulação configurado para receber uma pluralidade de tubos de válvula de pressão e manter cada tubo de válvula de diafragma da pluralidade de tubos de válvula de diafragma em posição para engate seletivo com um respectivo atuador de uma matriz de válvula de pressão. O primeiro bloco de suporte de tubulação e o segundo bloco de suporte de tubulação estão interconectados.

[0021] Em ainda outra modalidade um sistema para bioprocessamento inclui uma bandeja com uma pluralidade de paredes laterais e uma superfície inferior que define um compartimento interior e um topo geralmente aberto, em que a bandeja é configurada para receber, apoiar ou de outro modo engatar um vaso de biorreator, um conjunto de bombas posicionado adjacente à parede lateral traseira da bandeja, um conjunto de válvulas de diafragma posicionado adjacente à parede lateral traseira da bandeja e um módulo de tubulação posicionado na parte traseira da bandeja. O módulo de tubulação inclui um primeiro bloco de suporte de tubulação configurado para receber pelo menos um tubo de bomba e manter o pelo menos um tubo de bomba em posição para engate seletivo com o conjunto da bomba e um segundo bloco de suporte de tubulação configurado para receber uma pluralidade de tubos de válvula de diagrama e manter cada tubo da válvula de diafragma da pluralidade de tubos de válvula de diafragma em posição para engate seletivo com um respectivo atuador da matriz de válvula de diafragma.

[0022] Em ainda outra modalidade, um vaso de biorreator inclui uma placa de fundo, um corpo de vaso acoplado à placa de fundo, em que o corpo de vaso e a placa de fundo definem um compartimento interior entre os mesmos e uma pluralidade de rebaixos formados na placa de fundo, em que cada rebaixo da uma pluralidade de rebaixos é configurado para receber um pino de alinhamento correspondente em uma placa de leito para alinhar o vaso de biorreator na placa de leito.

[0023] Em ainda outra modalidade um método para bioprocessamento inclui conectar operativamente uma placa inferior a um corpo de vaso para definir um compartimento interior entre os mesmos, em que a placa inferior e o corpo de vaso formam um vaso de biorreator, alinhar um rebaixo na placa inferior com um pino de alinhamento de um sistema de bioprocessamento e assentar o vaso de biorreator em uma placa de base do sistema de bioprocessamento.

[0024] Em ainda outra modalidade, um sistema de bioprocessamento inclui um primeiro conjunto de fluidos que tem uma primeira linha de conjunto de fluidos conectada a uma primeira porta de um primeiro vaso de biorreator através de uma primeira linha de biorreator de um primeiro vaso de biorreator, em que a primeira linha de biorreator do primeiro vaso de biorreator inclui uma primeira válvula de linha de biorreator para prover comunicação seletiva de fluido entre o primeiro conjunto de fluidos e a primeira porta do primeiro vaso de biorreator, em que um segundo conjunto de fluidos tem uma segunda linha de conjunto de fluidos conectada a uma segunda porta do primeiro vaso de biorreator através de uma segunda linha de biorreator do primeiro vaso de biorreator, em que a segunda linha de biorreator do primeiro vaso de biorreator inclui uma segunda válvula de linha de biorreator para prover comunicação fluida seletiva entre o segundo conjunto de fluidos e a segunda porta do primeiro vaso de biorreator e uma linha de interconexão que provê comunicação fluida entre o primeiro conjunto de fluidos e o segundo conjunto de fluidos e para comunicação fluida entre a segunda linha de biorreator do primeiro vaso de biorreator e a primeira linha de biorreator do primeiro vaso de biorreator.

[0025] Em ainda outra modalidade, um método de bioprocessamento inclui prover um primeiro conjunto de fluidos que tem uma primeira linha de conjunto de fluidos conectada a uma primeira porta de um primeiro vaso de biorreator através de uma primeira linha de biorreator do primeiro vaso de biorreator, prover um segundo conjunto de fluidos que tem uma segunda linha de conjunto de fluidos conectada a um segundo orifício do primeiro vaso de biorreator através de uma segunda linha de biorreator do primeiro vaso de biorreator e prover uma linha de interconexão entre a segunda linha de biorreator do primeiro vaso de biorreator e a primeira linha de biorreator do primeiro vaso de biorreator, em que a linha de interconexão permite a comunicação fluida entre o primeiro conjunto de fluidos e o segundo conjunto de fluidos, e a comunicação fluida entre a segunda linha de biorreator do primeiro vaso de biorreator e a primeira linha de biorreator do primeiro vaso de biorreator.

[0026] Em ainda outra modalidade, um método de bioprocessamento para terapia celular inclui modificar geneticamente uma população de células em um vaso de biorreator para produzir uma população de células geneticamente modificadas e expandir a população de células geneticamente modificadas dentro do vaso de biorreator para gerar inúmeras células geneticamente modificadas suficientes para uma ou mais doses para uso em um tratamento de terapia celular sem remover a população de células geneticamente modificadas do vaso de biorreator.

[0027] Em ainda outra modalidade, um método de bioprocessamento inclui revestir um vaso de biorreator com um reagente para aumentar a eficiência da modificação genética de uma população de células, modificar geneticamente células de uma população de células para produzir uma população de células geneticamente modificadas e expandir a população de células geneticamente modificadas no vaso de biorreator sem remover as células geneticamente modificadas do vaso de biorreator.

[0028] Em ainda outra modalidade, um método de bioprocessamento inclui ativar células de uma população de células em um vaso de biorreator com o uso de microesferas magnéticas ou não magnéticas para produzir uma população de células ativadas, modificar geneticamente as células ativadas no vaso de biorreator para produzir uma população de genes células modificadas,

lavar as células geneticamente modificadas no vaso de biorreator para remover materiais indesejados e expandir a população de células geneticamente modificadas no vaso de biorreator para produzir uma população expandida de células transduzidas. A ativação, modificação genética, lavagem e expansão são realizadas no vaso de biorreator sem remover as células do vaso de biorreator.

[0029] Em ainda outra modalidade, um kit para uso em um sistema de bioprocessamento inclui um saco de processo, um saco de origem, um vaso de adição de microesfera e uma alça de processo configurado para estar em comunicação fluida com o saco de processo, o saco de origem e o vaso de adição de microesfera. A alça de processo inclui adicionalmente tubos de bomba configurados para comunicação fluida com uma bomba.

[0030] Em ainda outra modalidade, um aparelho para bioprocessamento inclui um kit que compreende um saco de processo, um saco de origem e um vaso de adição de microesferas configurado para estar em comunicação fluida com uma alça de processo, em que a alça de processo compreende adicionalmente tubulação de bomba configurada para comunicação fluida com uma bomba, um gerador de campo magnético configurado para gerar um campo magnético, uma pluralidade de ganchos para suspender o saco de origem, o saco de processo e o vaso de adição de microesferas, em que cada gancho da pluralidade de ganchos é operacionalmente conectado a uma célula de carga configurada para detectar um peso do saco conectado a isso, pelo menos um sensor de bolha de ar e uma bomba configurada para estar em comunicação fluida com a alça de processo.

[0031] Em uma modalidade, um método de bioprocessamento inclui combinar uma suspensão que compreende uma população de células com microesferas magnéticas para formar uma população de células ligadas a esferas na suspensão, isolar a população de células ligadas a esferas em uma coluna de isolamento magnético e coletar células alvo da população de células.

[0032] Em uma modalidade, é provido um meio legível por computador não transitório. O meio legível por computador não transitório inclui instruções configuradas para adaptar um controlador para manter um primeiro ambiente alvo em um vaso de biorreator contendo uma população de células durante um primeiro período de incubação para produzir uma população de células geneticamente modificadas a partir da população de células, iniciar um fluxo de meio para o vaso de biorreator, manter um segundo ambiente alvo no vaso de biorreator por um segundo período de incubação para produzir uma população expandida de células geneticamente modificadas.

[0033] Em uma outra modalidade, é provido um meio legível por computador não transitório. O meio legível por computador não transitório inclui instruções configuradas para adaptar um controlador para manter um primeiro ambiente alvo em um primeiro vaso de biorreator por um primeiro período de incubação para ativar uma população de células no primeiro biorreator e manter um segundo ambiente alvo no primeiro vaso de biorreator por um segundo período de incubação para produzir uma população de células geneticamente modificadas a partir da população de células.

[0034] Em ainda uma outra modalidade, é provido um meio legível por computador não transitório. O meio legível por computador não transitório inclui instruções configuradas para adaptar um controlador para receber dados relacionados a uma massa e/ou volume de um vaso de biorreator contendo uma população de células suspensas em um meio de cultura, atuar uma primeira bomba para bombear meio fresco para o vaso de biorreator, atuar uma segunda bomba para bombear o material gasto do vaso de biorreator para um saco de resíduos e controlar um ponto de ajuste operacional de pelo menos uma dentre a primeira bomba e a segunda bomba,

dependendo dos dados relacionados à massa e/ou volume do vaso de biorreator.

DESENHOS

[0035] A presente invenção será mais bem compreendida através da leitura da seguinte descrição de modalidades não limitativas, com referência aos desenhos anexos, em que: A Figura | é uma ilustração esquemática de um sistema de bioprocessamento de acordo com uma modalidade da invenção.

[0036] A Figura 2 é uma ilustração esquemática de um sistema de bioprocessamento de acordo com uma outra modalidade da invenção.

[0037] A Figura 3 é um diagrama de blocos que ilustra a configuração/sistema de fluxo de fluido de um subsistema de ativação, modificação genética e expansão celular do sistema de bioprocessamento da Figura 1.

[0038] A Figura 4 é uma vista detalhada de uma porção do diagrama de blocos da Figura 3, ilustrando um primeiro conjunto de fluidos da configuração/sistema de fluxo de fluido.

[0039] A Figura 5 é uma vista detalhada de uma porção do diagrama de blocos da Figura 3, ilustrando um segundo conjunto de fluidos da configuração/sistema de fluxo de fluido.

[0040] A Figura 6 é uma vista detalhada de uma porção do diagrama de blocos da Figura 3, ilustrando um conjunto de amostragem da configuração/sistema de fluxo de fluido.

[0041] A Figura 7 é uma vista em detalhes de uma porção do diagrama de blocos da Figura 3 ilustrando um caminho de fluxo de filtração da configuração/sistema de fluxo de fluido.

[0042] A Figura 8 é uma vista em perspectiva de um vaso de biorreator de acordo com uma modalidade da invenção.

[0043] A Figura 9 é uma vista explodida do vaso de biorreator da

Figura 8.

[0044] A Figura 10 é uma vista em seção transversal explodida do vaso de biorreator da Figura 8.

[0045] A Figura 11 é uma vista em perspectiva inferior explodida do vaso de biorreator da Figura 8.

[0046] A Figura 12 é uma vista em perspectiva superior e frontal de um kit complementar descartável do sistema de bioprocessamento da Figura 1, de acordo com uma modalidade da invenção.

[0047] A Figura 13 é outra vista em perspectiva superior e frontal do kit complementar descartável da Figura 12.

[0048] A Figura 14 é uma vista em perspectiva superior e posterior do kit complementar descartável da Figura 12.

[0049] A Figura 15 é uma vista em perspectiva de uma bandeja do kit complementar descartável da Figura 12, de acordo com uma modalidade da invenção.

[0050] A Figura 16 é uma vista em perspectiva frontal de um módulo de tubulação do kit complementar descartável da Figura 12, de acordo com uma modalidade da invenção.

[0051] A Figura 17 é uma vista em perspectiva traseira do módulo de tubulação da Figura 16.

[0052] A Figura 18 é uma vista em elevação de um segundo bloco de suporte de tubulação do módulo de tubulação, de acordo com uma modalidade da invenção.

[0053] A Figura 19 é uma vista em seção transversal do segundo bloco de suporte de tubulação da Figura 18.

[0054] A Figura 20 é outra vista frontal em perspectiva do kit complementar da Figura 12, mostrando a arquitetura de fluxo integrada na mesma.

[0055] A Figura 21 é uma vista posterior em perspectiva do kit complementar da Figura 12, mostrando a arquitetura de fluxo integrada na mesma.

[0056] A Figura 22 é uma vista em elevação frontal do kit complementar da Figura 12, mostrando a arquitetura de fluxo integrada na mesma.

[0057] A Figura 23 é uma vista em perspectiva de um aparelho de bioprocessamento de acordo com uma modalidade da invenção.

[0058] A Figura 24 é uma vista em perspectiva de uma gaveta do aparelho de bioprocessamento para receber o kit complementar da Figura 12, de acordo com uma modalidade da invenção.

[0059] A Figura 25 é uma vista em planta superior da gaveta da Figura 24.

[0060] A Figura 26 é uma vista em perspectiva frontal de uma câmara de processamento da gaveta da Figura 24.

[0061] A Figura 27 é uma vista de plano superior da câmara de processamento da gaveta.

[0062] A Figura 28 é uma vista de plano superior de uma placa do leito do aparelho de bioprocessamento da Figura 23.

[0063] A Figura 28A é uma vista de plano superior dos componentes de hardware alojados sob a base da Figura 28.

[0064] A Figura 29 é uma vista em elevação lateral do aparelho de bioprocessamento da Figura 12.

[0065] A Figura 30 é uma vista em perspectiva de um atuador de engate de gaveta do aparelho de bioprocessamento da Figura 12.

[0066] A Figura 31 é uma vista de plano superior da gaveta do aparelho de bioprocessamento, ilustrando uma posição de folga de um atuador de engate de gaveta, do conjunto de bombas e da matriz de solenoides.

[0067] A Figura 32 é uma vista de plano superior da gaveta do aparelho de bioprocessamento, ilustrando uma posição de engate do atuador de engate de gaveta, do conjunto de bombas e da matriz de solenoides.

[0068] A Figura 33 é uma vista em perspectiva do aparelho de bioprocessamento, ilustrando o kit complementar na posição dentro da câmara de processamento da gaveta.

[0069] A Figura 34 é uma vista de plano superior do aparelho de bioprocessamento, ilustrando o kit complementar na posição dentro da câmara de processamento da gaveta.

[0070] A Figura 35 é uma vista em perspectiva de um conjunto de bombas peristálticas do aparelho de bioprocessamento.

[0071] A Figura 36 é uma vista em elevação lateral do conjunto de bombas peristálticas e um módulo de suporte de tubulação do kit complementar, ilustrando a relação entre os componentes.

[0072] A Figura 37 é uma vista em perspectiva de uma matriz de solenoide e bigornas de válvula de diafragma que formam uma matriz de válvula de diafragma do aparelho de bioprocessamento.

[0073] A Figura 38 é uma outra vista em perspectiva do conjunto de válvulas de diafragma do aparelho de bioprocessamento.

[0074] A Figura 39 é uma outra vista em perspectiva do conjunto de válvulas de diafragma, ilustrando o posicionamento do módulo de suporte de tubulação do kit complementar em relação ao conjunto de válvulas de diafragma, em uma posição engatada.

[0075] A Figura 40 é uma vista em seção transversal da gaveta do aparelho de bioprocessamento, ilustrando uma posição assentada do vaso de biorreator na placa do leito.

[0076] A Figura 41 é uma vista em elevação lateral de um biorreator recebido em uma placa de leito, ilustrando um modo de operação de agitação/mistura do sistema de biorreator.

[0077] A Figura 42 é uma vista lateral em seção transversal do biorreator recebido na placa do leito, ilustrando o modo de operação de agitação/mistura do sistema de biorreator.

[0078] A Figura 43 é uma ilustração esquemática do vaso de biorreator mostrando um nível de fluido dentro do vaso de biorreator durante o modo de operação de agitação/mistura.

[0079] A Figura 44 é uma vista detalhada em seção transversal de uma interface entre os pinos de localização na placa do leito e os rebaixos de recebimento em um vaso de biorreator durante o modo de operação de agitação/mistura.

[0080] A Figura 45 é uma vista em perspectiva de um aparelho de bioprocessamento que tem um painel frontal virado para baixo de acordo com uma modalidade da invenção, mostrando a gaveta de processamento do mesmo em uma posição aberta.

[0081] A Figura 46 é uma outra vista em perspectiva do aparelho de bioprocessamento da Figura 45, mostrando a gaveta de processamento do mesmo em uma posição aberta.

[0082] A Figura 47 é uma vista em perspectiva ampliada de um compartimento auxiliar do aparelho de bioprocessamento da Figura 45, mostrando a gaveta de processamento em uma posição fechada com acesso ao compartimento auxiliar.

[0083] A Figura 48 é uma outra vista em perspectiva ampliada do compartimento auxiliar do aparelho de bioprocessamento da Figura 45, mostrando a gaveta de processamento na posição fechada com acesso ao compartimento auxiliar.

[0084] A Figura 49 é uma vista em perspectiva do aparelho de bioprocessamento da Figura 45, mostrando a gaveta de processamento do mesmo na posição fechada com acesso ao compartimento auxiliar.

[0085] A Figura 50 é uma outra vista em perspectiva do aparelho de bioprocessamento da Figura 45, mostrando a gaveta de processamento do mesmo na posição fechada com acesso ao compartimento auxiliar.

[0086] A Figura 51 é uma vista em perspectiva do compartimento auxiliar do aparelho de bioprocessamento, de acordo com outra modalidade da invenção.

[0087] A Figura 52 é uma vista em perspectiva de um sistema de bioprocessamento que tem uma bandeja de resíduos, de acordo com uma modalidade da invenção.

[0088] As Figuras 53 a 77 são ilustrações esquemáticas de um protocolo automatizado e genérico do sistema de bioprocessamento que usa a arquitetura de fluxo de fluido da Figura 3, de acordo com uma modalidade da invenção.

[0089] A Figura 78 é uma vista em perspectiva de um aparelho de enriquecimento e isolamento de acordo com uma modalidade da invenção.

[0090] A Figura 79 é um fluxograma de processo do aparelho de enriquecimento e isolamento da Figura 78.

[0091] A Figura 80 é uma ilustração esquemática da arquitetura de fluxo de fluido do aparelho da Figura 78, para realizar o enriquecimento e o isolamento de uma população de células.

[0092] A Figura 81 é um fluxograma de um método de bioprocessamento que usa o sistema da Figura 1, de acordo com uma modalidade da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0093] Será realizada abaixo referência em detalhes a modalidades exemplificadores da invenção, exemplos das quais são ilustrados nos desenhos anexos. Sempre que possível, os mesmos caracteres de referência usados nos desenhos se referem às mesmas partes ou partes semelhantes.

[0094] Conforme usado aqui, o termo “flexível” ou “dobrável” se refere a uma estrutura ou material que é flexível ou que tem a capacidade de ser dobrado sem quebrar, e também pode se referir a um material que é compactável ou expansível. Um exemplo de uma estrutura flexível é um saco formado por filme de polietileno. Os termos “rígido” e “semirrígido” são usados aqui de forma intercambiável para descrever estruturas que são “não dobráveis”, ou seja, estruturas que não dobram, colapsam ou deformam sob forças normais para reduzir substancialmente sua dimensão alongada. Dependendo do contexto, “semirrígido” também pode denotar uma estrutura que é mais flexível que um elemento “rígido”, por exemplo, um tubo ou conduto dobrável, mas ainda assim que não colapsar longitudinalmente sob condições e forças normais.

[0095] Um “vaso”, como o termo é usado neste documento, significa um saco flexível, um recipiente flexível, um recipiente semirrígido, um recipiente rígido ou um tubo flexível ou semirrígido, conforme o caso. O termo “vaso”, conforme aqui usado, destina-se a abranger vasos de biorreator com uma parede ou uma porção de uma parede semirrígida ou rígida, bem como outros recipientes ou condutos comumente usados no processamento biológico ou bioquímico, incluindo, por exemplo, sistemas de cultura/purificação de células, sistemas de mistura, sistemas de preparação de meios/tampões e sistemas de filtragem/purificação, por exemplo, sistemas de cromatografia e filtro de fluxo tangencial e seus caminhos de fluxo associados. Como usado aqui, o termo “saco” significa um recipiente ou vaso flexível ou semirrígido usado, por exemplo, como dispositivo de contenção para vários fluidos e/ou meios.

[0096] Conforme usado aqui, “acoplamento de maneira fluida” ou “comunicação fluida” significa que os componentes do sistema têm a capacidade de receber ou transferir fluido entre os componentes. O termo fluido inclui gases, líquidos ou combinações dos mesmos. Conforme usado aqui, “comunicação elétrica” ou “acoplado eletricamente” significa que certos componentes são configurados para se comunicarem entre si por meio de sinalização direta ou indireta por meio de conexões elétricas diretas ou indiretas. Conforme usado aqui, “acoplado operacionalmente” se refere a uma conexão que pode ser direta ou indireta. A conexão não é necessariamente uma fixação mecânico.

[0097] Conforme usado aqui, o termo “bandeja” se refere a qualquer objeto, com a capacidade de suportar pelo menos temporariamente uma pluralidade de componentes. A bandeja pode ser fabricada a partir de uma variedade de materiais adequados. Por exemplo, a bandeja pode ser fabricada a partir de materiais econômicos adequados para esterilização e produtos descartáveis de uso único.

[0098] Conforme usado aqui, o termo “sistema funcionalmente fechado” se refere a uma pluralidade de componentes que compõem um caminho de fluido fechado que pode ter portas de entrada e saída, para adicionar ou remover fluido ou ar do sistema, sem comprometer a integridade do caminho de fluido fechado (por exemplo, para manter um caminho de fluido biomédico estéril internamente), em que os orifícios podem compreender, por exemplo, filtros ou membranas em cada orifício para manter a integridade estéril quando fluidos ou ar são adicionados ou removidos do sistema. Os componentes, dependendo de uma determinada modalidade, podem compreender, sem limitação, um ou mais condutos, válvulas (por exemplo, desviadores multiporta), vasos, receptáculos e orifícios.

[0099] Modalidades da invenção proveem sistemas e métodos para a fabricação de imunoterapias celulares a partir de uma amostra biológica (por exemplo, sangue, tecido, etc.). Em uma modalidade, um sistema de bioprocessamento inclui um primeiro módulo configurado para enriquecer e isolar uma população de células, um segundo módulo configurado para ativar, modificar geneticamente e expandir a população de células e um terceiro módulo configurado para recolher a população expandida de células. Em uma modalidade, o sistema pode incluir uma pluralidade de segundos módulos, em que cada segundo módulo é configurado para ativar, modificar geneticamente e expandir as células. Em algumas modalidades, os segundos módulos são configurados para suportar a ativação, modificação genética e expansão de diferentes populações de células em paralelo.

[00100] Em referência à Figura 1, ilustra-se esquematicamente um sistema de bioprocessamento 10 de acordo com uma modalidade da invenção. O sistema de bioprocessamento 10 é configurado para uso na fabricação de imunoterapias celulares (por exemplo, imunoterapias celulares autólogas), em que, por exemplo, é coletada amostra de sangue humano, fluido, tecido ou célula e uma terapia celular é gerada a partir de ou com base na amostra coletada. Um tipo de imunoterapia celular que pode ser fabricada com o uso do sistema de bioprocessamento 10 é a terapia com células T do receptor de antígeno quimérico (CAR), embora outras terapias celulares também possam ser produzidas com o uso do sistema da invenção ou aspectos do mesmo sem se afastar dos aspectos mais amplos da invenção. Conforme ilustrado na Figura 1, a fabricação de uma terapia com células T CAR geralmente começa com a coleta do sangue de um paciente e a separação dos linfócitos por aférese. A coleta/aférese pode ocorrer em um ambiente clínico, e o produto da aférese é, então, enviado para um laboratório ou instalação de fabricação para produção de células T CAR. Em particular, uma vez que o produto de aférese é recebido para processamento, uma população de células desejada (por exemplo, glóbulos brancos) é enriquecida ou separada do sangue coletado para a fabricação da terapia celular, e as células alvo de interesse são isoladas da mistura celular inicial. As células alvo de interesse são, então, ativadas, geneticamente modificadas para atingir e destruir especificamente células tumorais e expandidas para atingir a densidade celular desejada. Após a expansão, as células são recolhidas e uma dose é formulada. A formulação é frequentemente criopreservada e entregue em um ambiente clínico para descongelamento, preparação e, finalmente, infusão no paciente.

[00101] Com referência adicional à Figura 1, o sistema de bioprocessamento 10 da invenção inclui uma pluralidade de módulos ou subsistemas distintos que são configurados para executar um subconjunto específico de etapas de fabricação de uma maneira substancialmente automatizada, funcionalmente fechada e escalonável. Em particular, o sistema de bioprocessamento 10 inclui um primeiro módulo 100 configurado para executar as etapas de enriquecimento e isolamento, um segundo módulo 200 configurado para executar as etapas de ativação, modificação genética e expansão e um terceiro módulo 300 configurado para executar a etapa de recolher a população celular expandida. Em uma modalidade, cada módulo 100, 200, 300 pode ser acoplado de forma comunicativa a um controlador dedicado (por exemplo, primeiro controlador 110, segundo controlador 210 e terceiro controlador 310, respectivamente). Os controladores 110, 210 e 310 são configurados para prover controle substancialmente automatizado sobre os processos de fabricação em cada módulo. Enquanto o primeiro módulo 100, o segundo módulo 200 e o terceiro módulo 300 são ilustrados como incluindo controladores dedicados para controlar a operação de cada módulo, é contemplado que uma unidade de controle principal possa ser utilizada para prover controle global sobre os três módulos. Cada módulo 100, 200, 300 é projetado para trabalhar em conjunto com os outros módulos para formar um sistema de bioprocessamento único e coerente 10, como discutido em detalhes abaixo.

[00102] Mediante a automatização dos processos em cada módulo, a consistência do produto de cada módulo pode ser aumentada e os custos associados a extensas manipulações manuais reduzidos. Além disso, conforme discutido em detalhes a seguir, cada módulo 100, 200, 300 é substancialmente fechado, o que ajuda a garantir a segurança do paciente, diminuindo o risco de contaminação externa, garante a conformidade regulamentar e ajuda a evitar os custos associados aos sistemas abertos. Ademais, cada módulo 100, 200, 300 é escalável, para suportar o desenvolvimento em baixos números de pacientes e a fabricação comercial em altos números de pacientes.

[00103] Com referência adicional à Figura 1, a maneira particular pela qual as etapas do processo são compartimentadas em módulos distintos, cada um dos quais provê bioprocessamento fechado e automatizado, permite a utilização eficiente de equipamentos de capital até um ponto até então não observado na técnica. Como será reconhecido, a etapa de expandir a população de células para alcançar a densidade celular desejada antes do recolhimento e formulação é tipicamente a etapa que consome mais tempo no processo de fabricação, enquanto as etapas de enriquecimento e isolamento e as etapas de recolhimento e formulação, bem como as etapas de ativação e modificação genética, consomem muito menos tempo. Consequentemente, as tentativas de automatizar todo o processo de fabricação da terapia celular, além de serem logicamente desafiadoras, podem exacerbar gargalos no processo que dificultam o fluxo de trabalho e diminuem a eficiência da fabricação. Em particular, em um processo totalmente automatizado, enquanto as etapas de enriquecimento, isolamento, ativação e modificação genética das células podem ocorrer rapidamente, a expansão das células geneticamente modificadas ocorre muito lentamente. Consequentemente, a fabricação de uma terapia celular a partir de uma primeira amostra (por exemplo, o sangue de um primeiro paciente) progrediria rapidamente até a etapa de expansão, o que requer uma quantidade substancial de tempo para atingir a densidade celular desejada para o recolhimento. Com um sistema totalmente automatizado, todo o processo/sistema seria monopolizado pelo equipamento de expansão que realiza a expansão das células da primeira amostra, e o processamento de uma segunda amostra não poderia começar até que todo o sistema fosse liberado para uso. Nesse aspecto, com um sistema de bioprocessamento — totalmente — automatizado, todo o sistema fica essencialmente offline e indisponível para o processamento de uma segunda amostra até todo o processo de fabricação da terapia celular, desde o enriquecimento até o recolhimento/formulação na primeira amostra.

[00104] Modalidades da invenção, no entanto, permitem o processamento paralelo de mais de uma amostra (do mesmo ou de diferentes pacientes) para prover uma utilização mais eficiente dos recursos de capital. Essa vantagem é um resultado direto da maneira particular pela qual as etapas do processo são separadas nos três módulos 100, 200, 300, conforme mencionado acima. Com referência particular à Figura 2, em uma modalidade, um único primeiro módulo 100 e/ou um único terceiro módulo 300 podem ser utilizados em conjunto com múltiplos segundos módulos, por exemplo, segundos módulos 200a, 200b, 200c, em um sistema de bioprocessamento 12, para prover processamento paralelo e assíncrono de várias amostras do mesmo ou de diferentes pacientes. Por exemplo, um primeiro produto de aférese de um primeiro paciente pode ser enriquecido e isolado com o uso do primeiro módulo 100 para produzir uma primeira população de células-alvo isoladas, e a primeira população de células-alvo pode ser transferida para um dos segundos módulos, por exemplo, módulo 200a, para ativação, modificação genética e expansão sob controle do controlador 210a. Uma vez que a primeira população de células alvo é transferida para fora do primeiro módulo 100, o primeiro módulo fica novamente disponível para uso para processar um segundo produto de aférese de, por exemplo, um segundo paciente. Uma segunda população de células alvo produzidas no primeiro módulo 100 a partir da amostra coletada no segundo paciente pode ser transferida para outro segundo módulo, por exemplo, segundo módulo 200b, para ativação, modificação genética e expansão sob controle do controlador 201DB.

[00105] De modo similar, depois que a segunda população de células alvo é transferida para fora do primeiro módulo 100, o primeiro módulo fica novamente disponível para uso para processar um terceiro produto de aférese de, por exemplo, um terceiro paciente. Uma terceira população-alvo de células produzidas no primeiro módulo 100 a partir da amostra retirada do terceiro paciente pode então ser transferida para outro segundo módulo, por exemplo, segundo módulo 200c, para ativação, modificação genética e expansão sob controle do controlador 201c. Nesse aspecto, a expansão de, por exemplo, células CAR-T para um primeiro paciente pode ocorrer simultaneamente com a expansão de células CAR-T para um segundo paciente, um terceiro paciente, etc.

[00106] Essa abordagem também permite que o pós-processamento ocorra de forma assíncrona, conforme necessário. Em outras palavras, nem todas as células do paciente crescem ao mesmo tempo. As culturas podem atingir a densidade final em momentos diferentes, mas os múltiplos segundos módulos 200 não estão ligados e o terceiro módulo 300 pode ser usado conforme necessário. Com a presente invenção, embora as amostras possam ser processadas em paralelo, as mesmas não precisam ser feitas em lotes.

[00107] O recolhimento das populações expandidas de células dos segundos módulos 200a, 200b e 200c pode igualmente ser realizado com o uso de um único terceiro módulo 300 quando cada população expandida de células estiver pronta para o recolhimento.

[00108] Consequentemente, ao separar as etapas de ativação, modificação genética e expansão, que consomem mais tempo e que compartilham certos requisitos operacionais e/ou exigem condições de cultura semelhantes, em um módulo autônomo, automatizado e funcionalmente fechado, o outro equipamento de sistema que é utilizado para enriquecimento, isolamento, recolhimento e formulação não está ligado ou offline enquanto é realizada a expansão de uma população de células. Como resultado, a fabricação de múltiplas terapias celulares pode ser realizada simultaneamente, maximizando o uso do equipamento e da área útil e aumentando a eficiência geral do processo e da instalação. Prevê-se que segundos módulos adicionais possam ser adicionados ao sistema de bioprocessamento 10 para prover o processamento paralelo de qualquer número de populações de células, conforme desejado. Consequentemente, o sistema de bioprocessamento da invenção permite a funcionalidade plug-and-play, que permite que uma instalação de fabricação aumente ou diminua com facilidade.

[00109] Em uma modalidade, o primeiro módulo 100 pode ser qualquer sistema ou dispositivo com a capacidade de produzir, a partir de um produto de aférese retirado de um paciente, uma população alvo de células enriquecidas e isoladas para uso em um processo biológico, como a fabricação de medicamentos de imunoterapias e regenerativos. Por exemplo, o primeiro módulo 100 pode ser uma versão modificada de um Sistema de Processamento de Células Sefia, disponível junto à GE Healtheare. À configuração do primeiro módulo 100 de acordo com algumas modalidades da invenção é discutida em detalhes a seguir.

[00110] Em uma modalidade, o terceiro módulo 300 pode ser similarmente qualquer sistema ou dispositivo capaz de recolher e/ou formular células CAR-T ou outras células modificadas produzidas pelo segundo módulo 200 para infusão em um paciente, para uso em imunoterapias celulares ou medicamentos regenerativos. Em algumas modalidades, o terceiro módulo 300 pode ser igualmente um Sistema de Processamento de Células Sefia, disponível junto à GE Healthcare. Em algumas modalidades, o primeiro módulo 100 pode primeiro ser utilizado para enriquecimento e isolamento de células (que são então transferidas para o segundo módulo 200 para ativação, transdução e expansão (e, em algumas modalidades, recolhimento)) e, então, também usadas na final do processo de recolhimento e/ou formulação de células. Nesse aspecto, em algumas modalidades, o mesmo equipamento pode ser utilizado para as etapas de enriquecimento e isolamento de células front-end, bem como as etapas de recolhimento e/ou formulação de back-end.

[00111] Focando primeiro o segundo módulo 200, a capacidade de combinar as etapas do processo de ativação celular, modificação genética e expansão celular em um único módulo 200 funcionalmente fechado e automatizado que provê as eficiências do fluxo de trabalho descritas acima é ativada pela configuração específica de componentes dentro do segundo módulo 200 e uma arquitetura de fluxo exclusiva que provê uma interconectividade específica entre esses componentes. As Figuras 3 a 77, discutidas abaixo, ilustram vários aspectos do segundo módulo 200 de acordo com várias modalidades da invenção. Referindo-se primeiro à Figura 3, é ilustrado um esquema que ilustra a arquitetura de fluxo de fluido 400 (também amplamente referido aqui como subsistema de bioprocessamento 400 ou sistema de bioprocessamento 400) dentro do segundo módulo 200 que provê ativação celular, modificação genética e expansão (em alguns casos, recolhimento). O sistema 400 inclui um primeiro vaso de biorreator 410 e um segundo vaso de biorreator 420. O primeiro vaso de biorreator inclui pelo menos uma primeira porta 412 e uma primeira linha de biorreator 414 em comunicação fluida com a primeira porta 412 e uma segunda porta 416 e uma segunda linha 416 e uma segunda linha de biorreator 418 em comunicação fluida com a segunda porta 416. De modo similar. o segundo vaso de biorreator inclui pelo menos uma primeira porta 422 e uma primeira linha de biorreator 424 em comunicação fluida com a primeira porta 422 e uma segunda porta 426 e uma segunda linha 426 e uma segunda linha de biorreator 428 em comunicação fluida com a segunda porta 426. Juntos, o primeiro vaso de biorreator 410 e o segundo vaso de biorreator 420 formam uma matriz de biorreator 430. Embora o sistema 400 seja mostrado como tendo dois vasos de biorreator, as modalidades da invenção podem incluir um único biorreator ou mais de dois vasos de biorreator.

[00112] A primeira e a segunda linhas de biorreator 414, 418, 424, 428 do primeiro e do segundo vasos de biorreator 410, 420 incluem, cada uma,

uma respectiva válvula para controlar um fluxo de fluido através dos mesmos, como discutido a seguir. Em particular, a primeira linha de biorreator 414 do primeiro vaso de biorreator 410 inclui uma primeira válvula de linha de biorreator 432, enquanto a segunda linha de biorreator 418 do primeiro vaso de biorreator 410 inclui uma segunda válvula de linha de biorreator 424. De modo similar, a primeira linha de biorreator 424 do segundo vaso de biorreator 420 inclui uma primeira válvula de linha de biorreator 436, enquanto a segunda linha de biorreator 428 do segundo vaso de biorreator 420 inclui uma segunda válvula de linha de biorreator 438.

[00113] Com referência adicional à Figura 3, o sistema 400 também inclui um primeiro conjunto de fluidos 440 que tem uma primeira linha de conjunto de fluidos 442, um segundo conjunto de fluidos 444 que tem uma segunda linha de conjunto de fluidos 446 e um conjunto de amostragem 448. Uma linha de interconexão 450 com uma válvula de linha de interconexão 452 provê comunicação fluida entre o primeiro conjunto de fluidos 440 e o segundo conjunto de fluidos 444. Conforme mostrado na Figura 3, a linha de interconexão 450 também provê comunicação fluida entre a segunda linha de biorreator 418 e a primeira linha de biorreator 414 do primeiro vaso de biorreator 410, permitindo a circulação de um fluido ao longo de uma primeira alça de circulação do primeiro vaso de biorreator. De modo similar, a linha de interconexão também provê comunicação fluida entre a segunda linha de biorreator 428 e a primeira linha de biorreator 424 do segundo vaso de biorreator 420, permitindo a circulação de um fluido ao longo de uma segunda alça de circulação do segundo vaso de biorreator. Ademais, a linha de interconexão 450 provê ainda comunicação fluida entre a segunda porta 416 e a segunda linha de biorreator 418 do primeiro vaso de biorreator 410, e a primeira porta 422 e a primeira linha de biorreator 424 do segundo vaso de biorreator 420, permitindo a transferência de conteúdo do primeiro vaso de biorreator 410 para o segundo vaso de biorreator 420, como discutido a seguir. Conforme ilustrado na Figura 3, a linha de interconexão 450, em uma modalidade, se estende das segundas linhas de biorreator 418, 428 até a interseção da primeira linha de biorreator 414 do primeiro vaso de biorreator 410 e da primeira linha de conjunto de fluidos 442.

[00114] Conforme ilustrado na Figura 3, o primeiro e o segundo conjuntos de fluidos 440, 450 são dispostos ao longo da linha de interconexão

450. Adicionalmente, em uma modalidade, o primeiro conjunto de fluidos está em comunicação fluida com a primeira porta 412 do primeiro vaso de biorreator 410 e a primeira porta do segundo vaso de biorreator 420 através da primeira linha de biorreator 414 do primeiro vaso de biorreator e do primeiro biorreator linha 424 do segundo vaso de biorreator 420, respectivamente. O segundo conjunto de fluidos 444 está em comunicação fluida com a segunda porta 416 do primeiro vaso de biorreator 410 e a segunda porta 426 do segundo vaso de biorreator 420 através da linha de interconexão 450.

[00115] Uma primeira bomba ou bomba de linha de interconexão 454 capaz de prover fluxo de fluido bidirecional é disposta ao longo da primeira linha de conjunto de fluidos 442 e uma segunda bomba ou bomba de linha de circulação 456 capaz de prover fluxo de fluido bidirecional é disposta ao longo da interconexão 450, cuja função e finalidade serão discutidas abaixo. Em uma modalidade, as bombas 454, 456 são bombas de alto alcance dinâmico. Como também mostrado na Figura 3, uma fonte de ar estéril 458 é conectada à linha de interconexão 450 através de uma linha de fonte de ar estéril 460. Uma válvula 462 posicionada ao longo da linha de fonte de ar estéril 460 provê comunicação fluida seletiva entre a fonte de ar estéril 458 e a linha de interconexão 450. Embora a Figura 3 mostre a fonte de ar estéril 458 conectada à linha de interconexão 450, em outras modalidades, a fonte de ar estéril pode ser conectada ao primeiro conjunto de fluidos 440, ao segundo conjunto de fluidos 444 ou ao caminho de fluxo de fluido intermediário à segunda válvula de linha de biorreator e ao primeiro biorreator válvula de linha do primeiro biorreator ou do segundo biorreator, sem se afastar dos aspectos mais amplos da invenção.

[00116] Com referência adicional agora às Figuras 4 a 6, são mostradas vistas detalhadas do primeiro conjunto de fluidos 440, do segundo conjunto de fluidos 444 e do conjunto de amostragem 448. Com referência específica à Figura 4, o primeiro conjunto de fluidos 440 inclui uma pluralidade de caudas de tubulação 464a-f, em que cada uma é configurada para conexão seletiva/removível a um dentre uma pluralidade de primeiros reservatórios 466a-f. Cada cauda de tubulação 464a-f do primeiro conjunto de fluidos 440 inclui uma válvula de cauda de tubulação 468a-f para controlar seletivamente um fluxo de fluido para ou a partir de um respectivo da pluralidade de primeiros reservatórios 466a-f do primeiro conjunto de fluidos 440. Embora a Figura 4 mostre especificamente que o primeiro conjunto de fluidos 440 inclui seis reservatórios de fluido, um número maior ou menor de reservatórios pode ser utilizado para prover a entrada ou coleta de vários fluidos de processamento, conforme desejado. É contemplado que cada cauda de tubulação 464a-f possa ser conectada individualmente a um reservatório 466a-f, respectivamente, em um tempo necessário durante a operação do conjunto de fluido 440, como descrito abaixo.

[00117] Com referência específica à Figura 5, o segundo conjunto de fluido 444 inclui uma pluralidade de caudas de tubulação 470a-d, em que cada é configurada para conexão seletiva/removível a um dentre uma pluralidade de segundos reservatórios 472a-d. Cada cauda de tubulação 470a- d do segundo conjunto de fluido 444 inclui uma válvula de cauda de tubulação 474a-e para controlar seletivamente um fluxo de fluido para ou de um respectivo da pluralidade de segundos reservatórios 472a-d do primeiro conjunto de fluidos 444. Embora a Figura 5 mostre especificamente que o segundo conjunto de fluidos 444 inclui quatro reservatórios de fluido, um número maior ou menor de reservatórios pode ser utilizado para prover a entrada ou coleta de vários fluidos de processamento, conforme desejado. Em uma modalidade, pelo menos um dos segundos reservatórios, por exemplo, o segundo reservatório 472a-f é um reservatório de coleta para coletar uma população expandida de células, como discutido a seguir. Em uma modalidade, o segundo reservatório 472a é um reservatório de resíduos, cujo objetivo é discutido abaixo. A invenção ainda contempla que um ou mais reservatórios 472a-d possam ser pré-conectados às suas respectivas caudas 470a-d, em que cada reservatório adicional é conectado à sua respectiva cauda a tempo de ser usado no segundo conjunto de fluidos 440.

[00118] Em uma modalidade, os primeiros reservatórios 466a-f e os segundos reservatórios 472a-d são sacos flexíveis de uso único descartáveis. Em uma modalidade, os sacos são sacos substancialmente bidimensionais, com painéis opostos soldados ou presos juntos em torno de seus perímetros e suporte de conduto de conexão para conexão à sua respectiva cauda, como é conhecido na técnica.

[00119] Em uma modalidade, os reservatórios/sacos podem ser conectados às caudas de tubulação do primeiro e do segundo conjuntos de tubulação com o uso de um dispositivo de soldagem estéril. Em uma modalidade, um dispositivo de soldagem pode ser posicionado próximo ao módulo 200, e o dispositivo de soldagem utilizado para soldar uma das caudas de tubulação a fim de seguir o tubo no saco (mantendo a esterilidade). Assim, o operador pode prover o saco no momento em que é necessário (por exemplo, agarrando uma extremidade do tubo e inserindo sua extremidade livre no dispositivo de soldagem, colocando a extremidade livre do tubo do saco adjacente à extremidade da extremidade da tubulação, cortando os tubos com uma lâmina de barbear nova e aquecendo as extremidades cortadas à medida que a navalha é puxada, enquanto as duas extremidades do tubo são forçadas juntas enquanto ainda derretidas, para que se solidifiquem novamente). Por outro lado, um saco pode ser removido soldando a linha do saco e cortando na solda para separar as duas linhas fechadas. Consequentemente, os reservatórios/sacos podem ser conectados individualmente quando desejado, e a presente invenção não exige que todos os reservatórios/sacos sejam conectados no início de um protocolo, pois um operador terá acesso às caudas de tubulação apropriadas durante todo o processo conectar um reservatório/saco a tempo para seu uso. De fato, embora seja possível que todos os reservatórios/sacos estejam pré-conectados, a invenção não requer pré-conexão, e uma vantagem do segundo módulo 200 é que permite ao operador acessar os conjuntos/linhas de fluido durante as operações para que os sacos gastas possam ser conectadas de maneira estéril e desconectadas para que outros sacos possam ser esterilizados durante um protocolo, conforme discutido abaixo.

[00120] Conforme ilustrado na Figura 6, o conjunto de amostragem 448 inclui uma ou mais linhas de amostragem, por exemplo, linhas de amostragem 476a-476d, conectadas fluidamente à linha de interconexão 450. Cada uma das linhas de amostra 476a-476d pode incluir uma válvula de linha de amostra 478a-d que é atuável seletivamente para permitir que o fluido flua da linha de interconexão 450 através das linhas de amostra 476a-476d. Como também mostrado aqui, uma extremidade distal de cada linha de amostragem 476a-476d é configurada para conexão seletiva a um dispositivo de coleta de amostras (por exemplo, dispositivos de coleta de amostras 280a e 280d) para coleta do fluido da linha de interconexão 450. Os dispositivos de coleta de amostras podem assumir a forma de qualquer dispositivo de amostragem conhecido na técnica, como, por exemplo, uma seringa, tubo de imersão, saco, etc. Embora a Figura 6 ilustre o conjunto de amostragem 448 que está conectado à linha de interconexão, em outras modalidades o conjunto de amostragem pode ser acoplado de forma fluida ao primeiro conjunto de fluido 440, o segundo conjunto de fluido 444 um caminho de fluxo de fluido intermediário à segunda válvula de linha de biorreator 434 e às primeiras válvulas de linha de biorreator 432 do primeiro vaso de biorreator 410 e/ou um caminho de fluxo de fluido intermediário a segunda válvula de linha de biorreator 438 e a primeira válvula de linha de biorreator 436 do segundo vaso de biorreator 420. O conjunto de amostragem 448 provê amostragem totalmente fechada funcionalmente de um fluido em um ou mais pontos no sistema 400, conforme desejado.

[00121] Voltando à Figura 3, em uma modalidade, o sistema 400 também pode incluir uma linha de filtração 482 que está conectada em dois pontos ao longo da linha de interconexão 450 e define uma alça de filtragem ao longo da linha de interconexão 450. Um filtro 484 é posicionado ao longo da linha de filtração 482 para remover resíduos de permeado de um fluido que atravessa a linha de filtração 482. Como mostrado aqui, a linha de filtração 482 inclui uma válvula de linha de filtração a montante 486 e uma válvula de linha de filtração a jusante 488 posicionada a montante e a jusante do filtro 484, respectivamente. Uma linha de resíduos 490 provê comunicação de fluido entre o filtro 484 e o segundo conjunto de fluido 444 e, em particular, com a cauda de tubulação 470u do segundo conjunto de fluido 444, que está conectado ao reservatório de resíduos 472a. Nesse aspecto, a linha de resíduos 490 transporta resíduos removidos do fluido que passa através da linha de filtração 482 pelo filtro 484 para o reservatório de resíduos 472a. Conforme ilustrado na Figura 3, a linha de filtração 482 envolve a válvula da linha de interconexão 452, de modo que um fluxo de fluido através da linha de interconexão 450 possa ser forçado através da linha de filtração 482, como discutido a seguir. Uma bomba de permeado 492 posicionada ao longo da linha de resíduos 490 é operável para bombear os resíduos removidos pelo filtro para o reservatório de resíduos 472a. Em uma modalidade, o filtro 484 é desejavelmente um filtro de fibra oca alongado, embora outros meios de filtragem de fluxo tangencial ou de fluxo cruzado conhecidos na técnica, como, por exemplo, um filtro de membrana de chapa plana, também possam ser utilizados sem se afastar do aspectos mais amplos da invenção.

[00122] Em uma modalidade, as válvulas do primeiro conjunto de fluido 440 e do segundo conjunto de fluido 444, bem como as válvulas de linha de biorreator (ou seja, válvulas 432, 434, 436, 438, válvula de linha estéril 462, válvula de linha de interconexão 452 e válvulas de linha de filtragem 486, 488 são válvulas de diafragma construídas da maneira a seguir descrita. Em uma modalidade, as próprias linhas não precisam incluir as válvulas de diafragma e a representação das válvulas de diafragma nas Figuras 3 a 8 pode simplesmente indicar locais onde as válvulas de diafragma podem operar nas linhas para impedir o fluxo de fluido. Em particular, conforme discutido abaixo, as válvulas de diafragma da arquitetura de fluxo 400 podem ser providas pelos respectivos atuadores (por exemplo, solenoides) que operam/atuam contra uma bigorna correspondente enquanto o caminho/linha do fluido está no meio de “trincar” a linha para impedir o fluxo de fluido através da mesma.

[00123] Em uma modalidade, as bombas 454, 456 e 492 são bombas peristálticas e as bombas são integradas em um único conjunto, conforme discutido a seguir. Desejavelmente, a operação dessas válvulas e bombas é direcionada automaticamente de acordo com um protocolo programado, de modo a permitir a operação adequada do módulo 200. É contemplado que o segundo controlador 210 possa direcionar a operação dessas válvulas e bombas pelo módulo 200.

[00124] Voltando agora às Figuras 8 a 11, é ilustrada a configuração do primeiro vaso de biorreator 410 de acordo com uma modalidade da invenção. Como o segundo vaso de biorreator 420 é desejavelmente, embora não seja necessário, idêntico em configuração ao primeiro vaso de biorreator 410, por simplicidade, apenas o primeiro vaso de biorreator 410 será descrito abaixo. Em uma modalidade, os vasos de biorreator 410, 420 são vasos de biorreator à base de membrana de silicone, habilitados para perfusão, que suportam a ativação, transdução e expansão de uma população de células nos mesmos. Os vasos de biorreator 410, 420 podem ser usados para cultura celular, processamento celular e/ou expansão celular para aumentar a densidade celular para uso em terapêutica médica ou outros processos. Embora o vaso de biorreator possa ser aqui descrito como sendo usado em conjunto com tipos de células específicos, deve-se entender que o vaso de biorreator pode ser usado para ativação, modificação genética e/ou expansão de qualquer tipo de célula adequado. Além disso, as técnicas descritas podem ser usadas em conjunto com células aderentes, isto é, células que aderem e/ou proliferam em uma superfície de expansão celular. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo vasos de biorreator 410, 420 podem ser construídos e funcionar como descrito na Patente nº de série U.S. 15/893.336, depositada em 9 de fevereiro de 2018, que está aqui incorporada a título de referência na sua totalidade.

[00125] Conforme mostrado nas Figuras 8 e 9, o primeiro vaso de biorreator 410 pode incluir uma placa de fundo 502 e um corpo de vaso 504 acoplado à placa de fundo 502. A placa de fundo 502 pode ser uma estrutura rígida para suportar uma cultura de células. No entanto, a placa inferior pode ser uma placa não sólida (por exemplo, pode ser aberta e/ou porosa) para permitir que o oxigênio seja provido à cultura celular, conforme discutido em mais detalhes com referência à Figura 9. Na modalidade ilustrada, a placa inferior 502 é de forma retangular, ou quase retangular. Em outras modalidades, a placa inferior 502 pode ter qualquer outra forma que permita um vaso de baixo perfil e/ou maximize o espaço no local em que o primeiro vaso de biorreator pode ser utilizado ou armazenado.

[00126] Em uma modalidade, o corpo de vaso 504 inclui uma estrutura rígida, geralmente côncava que, quando acoplada à placa inferior 502, forma uma cavidade ou compartimento interior 506 do primeiro vaso do biorreator

410. Conforme mostrado aqui, o corpo de vaso 504 pode ter uma forma de perímetro que é semelhante à forma do perímetro da placa inferior 502, de modo que o corpo de vaso 504 e a placa inferior 502 possam ser acoplados um ao outro. Adicionalmente, como na modalidade ilustrada, o corpo de vaso 504 pode ser fabricado de um material transparente ou translúcido que pode permitir a inspeção visual do conteúdo do primeiro vaso de biorreator 410 e/ou pode permitir que a luz entre no primeiro vaso de biorreator 410. O compartimento interior 506 formado pela placa inferior 502 e o corpo de vaso 504 pode conter um meio celular e a cultura celular durante o uso do primeiro vaso de biorreator para ativação celular, modificação genética (isto é, transdução) e/ou expansão celular.

[00127] Conforme mais bem mostrado nas Figuras 8 a 11, o primeiro vaso de biorreator 410 pode incluir várias portas através do corpo de vaso 504 que podem permitir a comunicação fluida entre o compartimento interior 506 e a parte externa do primeiro vaso de biorreator 410 para certos processos relacionados à ativação, transdução/modificação genética e expansão de células, como entrada de meio e remoção de resíduos. As portas podem incluir, por exemplo, primeira porta 412 e segunda porta 416. As portas 416 podem ser dispostas em qualquer local no corpo do recipiente 504, incluindo através de uma superfície superior 508 e/ou qualquer um dos lados 510 do corpo do recipiente 504, como na modalidade ilustrada. Como será discutido em mais detalhes neste documento, a estrutura específica do primeiro vaso de biorreator 410, incluindo a quantidade e posição particulares dos orifícios 412, 416, permite que o primeiro vaso de biorreator 410 seja usado para apoiar a ativação de células, modificação genética de células e expansão de alta densidade celular.

[00128] A Figura 9 é uma vista explodida de uma modalidade do primeiro vaso de biorreator 410. A placa inferior 502 do primeiro vaso de biorreator 410 pode ser o fundo ou o suporte do primeiro vaso de biorreator

410. Como discutido anteriormente, a placa inferior 502 pode ser formada por uma estrutura não-sólida. Na modalidade ilustrada, a placa inferior 502 contém uma grade 510 que pode ser estruturalmente rígida, além de prover abertura para permitir a troca livre de gás através da placa inferior 502 para o compartimento interior 506 que contém a cultura de células. A grade 510 pode incluir vários furos 512 definidos entre áreas sólidas ou barras transversais 514 entre cada furo 512 da grade 510. Dessa forma, os orifícios 512 podem prover aberturas para a troca de gases, e as barras transversais 514 podem prover suporte estrutural para outras estruturas e a cultura de células dentro do compartimento interior 506 do primeiro vaso de biorreator 410.

[00129] Para prover suporte adicional para a cultura de células dentro do compartimento interior 506 do primeiro vaso de biorreator 410, o primeiro vaso de biorreator 410 pode incluir uma membrana 516 que pode ser disposta acima de uma superfície superior 518 da placa inferior 502. A membrana 516 pode ser uma membrana permeável a gases, impermeável a líquidos. À membrana 516 também pode ser selecionada com propriedades que permitem alta permeabilidade ao gás, altas taxas de transferência de gás e/ou alta permeabilidade ao oxigênio e dióxido de carbono. Portanto, a membrana 516 pode suportar altas densidades celulares (por exemplo, até cerca de 35 mm/cm?) dentro do compartimento interior 506. O recurso de permeabilidade ao gás da membrana 516 pode permitir que as trocas gasosas livres suportem a cultura celular e/ou a expansão celular. Como tal, a membrana 516 pode ser uma superfície de cultura celular e/ou superfície de expansão celular. À membrana 516 pode ter uma espessura relativamente pequena (por exemplo, 0,010 polegadas ou 0,02 cm), o que pode permitir que a membrana 516 seja permeável ao gás. Além disso, a membrana 516 pode ser formada a partir de um material permeável ao gás, como silicone ou outro material permeável ao gás.

[00130] A planicidade da membrana 516 pode aumentar a área da superfície para a cultura de células se estabilizar para ativação, transdução e/ou expansão. Para permitir que a membrana 516 permaneça plana durante o uso do primeiro vaso de biorreator 410, uma folha de malha 520 pode ser disposta entre a placa inferior 502 e a membrana 516. A folha de malha 520 pode prover suporte estrutural à membrana 516, de modo que a membrana 516 possa permanecer plana e não possa ceder ou distorcer sob o peso da cultura de células e/ou qualquer meio celular adicionado ao primeiro vaso de biorreator 410 para cultura de células e/ou expansão celular. Além disso, a característica de malha da folha de malha 520 pode permitir o suporte da membrana 516, enquanto sua porosidade ainda permite a livre troca de gás entre o compartimento interior 506 do primeiro vaso de biorreator 410 e o ambiente imediatamente fora do primeiro vaso de biorreator 410. A folha de malha pode ser uma malha de poliéster ou qualquer outro material de malha adequado que possa prover suporte à membrana e permitir a livre troca de gás.

[00131] Como discutido anteriormente, o corpo do recipiente 504 pode ser acoplado à placa inferior 502 para formar o compartimento interior 506 do primeiro vaso do biorreator 410. Como tal, a folha de malha 520 e a membrana 516 podem ser dispostas dentro ou pelo menos parcialmente dentro do compartimento interior 506. Um anel de vedação 522 pode ser usado para vedar o primeiro vaso de biorreator 410 quando o corpo do recipiente 504 é acoplado à placa inferior 502. Em uma modalidade, o anel de vedação 522 pode ser um anel de vedação biocompatível (tamanho 173, Anel de Vedação de Fluoroelastômero Soft Viton&). O anel de vedação 522 pode encaixar dentro de uma ranhura 524 formada em uma superfície perimétrica 526 do corpo de vaso 504. A superfície perimétrica 526 enfrenta a superfície superior 518 da placa 502 quando o corpo 504 é acoplado à placa 502. Como tal, o anel de vedação 522 pode ser comprimido dentro da ranhura 524 e contra a superfície superior 518 da placa 516 e/ou da placa inferior 502. Tal compressão do anel de vedação 522 deseja selar o primeiro vaso de biorreator

410 sem qualquer ligação química ou epóxi. Como o primeiro vaso de biorreator 410 pode ser usado para ativação, transdução e expansão de células biológicas, o anel de vedação 522 é desejavelmente formado a partir de um material adequadamente biocompatível, autoclavável, estável à radiação gama e/ou material estável à esterilização por ETO.

[00132] Como discutido acima, o primeiro vaso de biorreator 410 pode incluir várias portas, como a primeira porta 412 e a segunda porta 416. As portas 412, 416 podem ser dispostas através do corpo de vaso 504 e podem permitir a comunicação entre o compartimento interior 506 e a parte externa do primeiro vaso de biorreator 410 para certos processos relacionados à cultura celular, ativação celular, transdução celular e/ou expansão celular, como entrada de fluido ou meio, remoção de resíduos, coleta e amostragem. Cada porta 416 pode incluir uma abertura 526 e um respectivo acessório ou tubulação 528 (por exemplo, um acessório luer, acessório de farpa, etc.). Em algumas modalidades, a abertura 526 pode ser configurada de modo a permitir que a tubulação seja ligada diretamente e destacar a necessidade de um acessório (por exemplo, um rebaixamento).

[00133] Em uma modalidade, além da primeira porta 412 e segunda porta 416, o primeiro vaso de biorreator 410 pode incluir adicionalmente uma porta de balanço de ar 530 disposta na superfície superior 508 do corpo de vaso 504. A porta de balanço de ar 530 pode ser construída de forma semelhante à primeira porta 412 e segunda porta 416, onde números de referência semelhantes denotam partes semelhantes. A porta de balanço de ar 530 pode adicionalmente prover troca de gás entre o compartimento interior 506 e fora do primeiro vaso de biorreator 410 para uso pela cultura de células para expansão. Adicionalmente, a porta de balanço de ar 530 pode ajudar a manter a pressão atmosférica dentro do compartimento interior 506 para prover um ambiente dentro do compartimento interior 506 para cultura celular e/ou expansão celular. A porta de equilíbrio do ar 530 pode ser disposta através da superfície superior 508 do corpo de vaso 504, como na modalidade ilustrada, ou em qualquer outra posição sobre o corpo de vaso 504. Uma posição central através da superfície superior 508 do corpo de vaso 504 pode ajudar a evitar o umedecimento da porta de balanço de ar 530 durante a mistura da cultura de células através da inclinação do primeiro vaso de biorreator 410, como discutido em mais detalhes abaixo.

[00134] Cada elemento do primeiro vaso de biorreator 410, incluindo a placa inferior 502, o corpo do recipiente 504, as portas 412, 416 e 530, a membrana 516, a folha de malha 520 e o anel de vedação 522, pode ser fabricado de material que são biocompatíveis, autoclaváveis e radiação gama e/ou esterilização por ETO estável. Como tal, cada elemento e o primeiro vaso de biorreator 410 como uma unidade inteira, podem ser usados para ativação, transdução e expansão de células biológicas e/ou para outros processos do processo de fabricação de células.

[00135] O primeiro vaso de biorreator 410 pode permitir a cultura celular e/ou expansão celular via perfusão, que pode prover nutrientes necessários para apoiar o crescimento celular e reduzir as impurezas na cultura celular. Perfusão contínua é a adição de um suprimento de meio fresco à crescente cultura de células com remoção simultânea de meio gasto (por exemplo, meio usado). A primeira porta 412 e a segunda porta 416 podem ser usadas para o processo de perfusão, como discutido abaixo. A primeira porta 412 pode permitir a comunicação entre o compartimento interior 506 e a parte externa do primeiro vaso de biorreator 410 e pode ser usada para adicionar um meio fresco ao primeiro vaso de biorreator 410 (tal como a partir de um reservatório de meio de cultura do primeiro conjunto de fluido 440 ) Em algumas modalidades, o primeiro orifício 412 pode ser disposto e se estender através do corpo de vaso 504 em qualquer local acima da superfície da cultura de células e meio dentro do primeiro vaso do biorreator 410. Em algumas modalidades, a primeira porta 412 pode ser disposta de modo que entre em contato ou se estenda através da superfície da cultura de células e meio dentro do primeiro vaso de biorreator 410.

[00136] A segunda porta 416 pode ser disposta em qualquer local que esteja total ou parcialmente submerso sob a superfície da cultura de células e o meio dentro do primeiro vaso de biorreator 410. Por exemplo, a segunda porta 416 pode ser uma porta quase lateral disposta através de um dos lados 510 do corpo de vaso 504. Em algumas modalidades, a segunda porta 416 pode ser disposta de modo que a segunda porta 416 não chegue ao fundo do compartimento interior 506 (por exemplo, a membrana 516). Em algumas modalidades, a segunda porta 416 pode alcançar a parte inferior do compartimento interior 506. A segunda porta 416 pode ser uma porta de funcionalidade dupla. Como tal, a segunda porta pode ser usada para puxar o meio de perfusão para fora do compartimento interior 506 do primeiro vaso de biorreator 410 para facilitar a perfusão da cultura de células. Adicionalmente, a segunda porta 416 também pode ser usada para remover as células da cultura de células. Como observado acima, em algumas modalidades, a segunda porta pode não alcançar a superfície inferior do compartimento interior 506 do primeiro vaso de biorreator 410. Por exemplo, a segunda porta 416 pode estar localizada a aproximadamente 0,5 cm de distância da membrana 516. Portanto, em uma posição plana estática, a segunda porta 416 pode ser usada para remover o meio de cultura celular gasto sem retirar as células da cultura celular, devido ao fato de que as células podem se depositar na membrana 516 (por exemplo, a superfície de expansão celular) por gravidade. Assim, na posição plana estática, a segunda porta 416 pode facilitar o processo de perfusão e pode permitir um aumento na densidade celular da crescente cultura celular dentro do primeiro vaso de biorreator 410. Quando se deseja que as células sejam removidas do compartimento interior 506, por exemplo, durante o recolhimento da cultura de células, para minimizar o volume de retenção, o primeiro vaso de biorreator 410 pode ser inclinado em direção à segunda porta 416, provendo acesso às células para a remoção de célula, da maneira descrita a seguir.

[00137] Além disso, em uma modalidade, a segunda porta 416 pode não incluir um filtro e, portanto, o processo de perfusão pode estar livre de filtro. Como tal, pode não haver bloqueio físico das células de entrar na segunda porta 416 quando a segunda porta 416 é usada para remoção de meio. Adicionalmente, a segunda porta 416 pode ser inclinada de modo que, embora a segunda porta 416 esteja disposta lateralmente através do lado 22 do corpo de vaso 504, a segunda porta 416 pode ser inclinada em direção à membrana 516 e à placa inferior 502. O recurso inclinado da segunda porta 416 pode permitir que a segunda porta 416 seja posicionada relativamente baixa no corpo de vaso 504 mais próximo da superfície da membrana 36, minimizando a interferência com o anel de vedação 522 e a ranhura 524 para ajudar a manter a vedação da primeiro vaso de biorreator 410 quando em uso. Além disso, em algumas modalidades, o recurso inclinado da segunda porta 416 pode diminuir a velocidade do fluxo de fluido através da segunda porta 416 quando o meio usado é removido. Adicionalmente, o diâmetro da porta em conjunto com a taxa de fluxo de fluido da segunda porta 416 pode ser tal que uma velocidade de inalação através da segunda porta 416 usada para puxar o meio para fora do compartimento interior 506 pode minimizar a força de sucção nas células individuais adjacentes à segunda porta 416, de modo que a força seja menor que a força gravitacional que puxa as células em direção à membrana 516. Portanto, como discutido acima, a segunda porta 416 pode ser usada para remover o meio de perfusão para facilitar a perfusão da cultura de células sem remover substancialmente as células da cultura de células. À medida que o tempo de assentamento das células aumenta, uma concentração celular do meio removido pode diminuir para uma faixa incomensurável facilitada pela posição da segunda porta 416. Adicionalmente, a posição da abertura interior 540 pode ser alterada para alterar o tempo de assentamento recomendado da célula. As posições mais próximas da membrana 516 podem estar associadas a tempos de assentamento mais longos, enquanto as posições no topo ou mais próximas de um topo do meio estão associadas a tempos de assentamento mais curtos, devido ao fato de que as células se assentam e são primeiro esgotadas do topo do meio de crescimento.

[00138] Em uma modalidade, a segunda porta 416 pode, portanto, ser usada não apenas para remoção do meio usado durante o processo de perfusão, mas também pode ser usada para remover células da cultura de células do compartimento interior 506, por exemplo, durante o recolhimento da cultura celular. Para facilitar uma maior remoção do meio de perfusão usado e a remoção de células, o corpo de vaso 504 pode incluir uma parede lateral em forma de viga ou em ângulo 532. A parede lateral em forma de viga 532 inclui, assim, um ápice, ou ponto, 534. O ápice 534 da parede lateral 532 pode ainda incluir a segunda porta 416 através da qual o corpo de vaso 504 é disposto próximo ao ponto 534 quando o corpo de vaso 504 acoplado à placa inferior 502. O lado angular 532 e o ponto 534 podem permitir maior drenagem do meio e/ou células da cultura de células quando o primeiro vaso de biorreator 410 é inclinado em direção à segunda porta 416, por exemplo, em um ângulo de 5 graus.

[00139] O uso de perfusão para aumentar as células facilitado pelas posições da primeira porta 412 e da segunda porta 416 pode permitir uma baixa altura de meio (por exemplo, 0,3 a 2,0 cm) dentro do compartimento interior 506, como discutido em mais detalhes com referência a Figura 10. Uma altura de meio relativamente baixa dentro do compartimento interior 506 pode permitir que o primeiro vaso de biorreator 410 seja um recipiente de perfil relativamente baixo, enquanto permite um aumento na densidade celular máxima possível. Adicionalmente, o uso de perfusão com o primeiro vaso de biorreator 410 pode suportar o crescimento celular provendo meio fresco para as células dentro do compartimento interior 506, mas também

44 /110 permite a remoção de impurezas na cultura celular, de modo que a lavagem celular adicional em um dispositivo separado possa não é necessário uma vez que um objetivo específico de densidade celular é alcançado dentro do primeiro vaso de biorreator 410. Por exemplo, através da perfusão sem filtro, o primeiro vaso de biorreator 410 pode prover meio fresco e reduzir as impurezas na cultura de células a uma taxa de troca de volume total por dia (por exemplo, resultando em uma redução de impureza a uma taxa de aproximadamente 1 log por 2,3 dias). Portanto, a estrutura do primeiro vaso de biorreator 410 pode permitir o uso de perfusão para aumentar a cultura de células dentro do primeiro vaso de biorreator 410, o que pode permitir a expansão da cultura de células para uma alta densidade alvo com um nível de impureza reduzido. Como também discutido a seguir, através da perfusão sem filtro, o primeiro vaso de biorreator 410 pode prover meio fresco a uma taxa de substancialmente mais volumes por dia (por exemplo, maior que 2 volumes por dia) para semeadura, enxágue, lavagem/redução residual e/ou drenagem/recolhimento das células após a expansão.

[00140] Para facilitar uma estrutura de baixo perfil do primeiro vaso de biorreator 410, uma altura de meio relativamente baixa dentro do compartimento interior 506 pode ser mantida. A Figura 10 é uma vista em seção transversal do primeiro vaso de biorreator 410 que ilustra uma altura 536 do meio celular 538 dentro do primeiro vaso de biorreator 410. Como discutido anteriormente, o corpo do vaso 504 pode ser acoplado à placa inferior 502 para formar o compartimento interior 506 dentro do qual a expansão da cultura de células pode ser alcançada através da perfusão. Como tal, o meio de substituição ou fresco 538 pode ser provido para o crescimento celular através da primeira porta 412 disposta através do corpo de vaso 504 e o meio existente ou usado 538 pode ser removido através da segunda porta 416 disposta através do lado 510 do corpo de vaso 504. O processo de perfusão pode facilitar a altura média relativamente baixa 536 do meio 538 dentro do compartimento interior 506 do primeiro vaso de biorreator 410. À altura relativamente baixa 536 do meio de perfusão 538 dentro do compartimento interior 506 pode permitir que o primeiro vaso de biorreator 410 seja uma estrutura de baixo perfil, o que, portanto, pode permitir um sistema de fabricação de células compacto como um todo.

[00141] A altuõra 536 do meio de perfusão 538 dentro do compartimento interior 506 do primeiro vaso de biorreator 410 pode estar entre 0,3 cm e 2 cm e a altura do ambiente suspenso 542, isto é, um intervalo formado entre o meio 538 e a superfície superior 508 do corpo do vaso 504 no compartimento interior 506, pode ser de aproximadamente 2 cm. Assim, pode haver menos de 2 ml de meio por cm? e menos de 4 ml de volume total por em?, incluindo o meio, a cultura de células e o espaço livre. Uma altura de meio relativamente baixa 536 pode permitir que uma proporção entre o volume de meio e a área de superfície da membrana 516 esteja abaixo de um determinado valor. Como tal, a proporção entre o volume médio e a área de superfície da membrana pode estar abaixo de um nível limite, ou dentro de uma faixa desejável, facilitada pelo uso de perfusão para crescer as células da cultura de células. Por exemplo, o nível do limite pode ser uma razão entre 0,3 e 2,0. A baixa proporção entre o volume médio e a área de superfície da membrana pode permitir que o primeiro vaso de biorreator 410 tenha uma estrutura compacta ou de baixo perfil, enquanto ainda permite que seja alcançada uma cultura celular de alta densidade celular.

[00142] Como discutido anteriormente, a segunda porta 416 de dupla funcionalidade 416 pode ser disposta através do corpo do recipiente 504 de modo que seja total ou parcialmente submersa sob uma superfície 544 do meio 538 dentro do primeiro vaso do biorreator 410. Em algumas modalidades, a segunda porta 416 pode ser disposta de modo que a segunda porta 416 chegue ao fundo do compartimento interior 506 (por exemplo, a membrana 516). O posicionamento da segunda porta 416 pode facilitar a

46 /110 remoção de meio e impurezas da cultura de células dentro do compartimento interior 506, sem remoção das células até que tal remoção seja desejada, por exemplo, recolhimento. A segunda porta sem filtro 416, juntamente com a primeira porta 412, pode permitir o uso de perfusão para prover o meio de crescimento 538 às células para expansão celular e remover o meio 538 usado e outras impurezas ou subprodutos. A posição da primeira porta 412 e da segunda porta de funcionamento duplo 416 em relação ao corpo do vaso 504 facilita uma configuração na qual a altuóora 536 do meio dentro do compartimento interior 506 seja mantida em um nível relativamente baixo e, portanto, permita que o primeiro vaso de biorreator 410 seja um vaso de perfil relativamente baixo, enquanto ainda permite a geração de uma cultura de células de alta densidade.

[00143] Com referência específica à Figura 11, a placa inferior 502 do vaso de biorreator 410 inclui uma variedade de recursos que permitem o uso do vaso de biorreator como parte do sistema de bioprocessamento mais amplo e, em particular, o segundo módulo 200 do sistema de bioprocessamento

10. Como mostrado aqui, a placa inferior 502 inclui uma pluralidade de rebaixos 550 formados em uma superfície inferior da placa inferior 502, cuja finalidade será descrita a seguir. Em uma modalidade, os rebaixos podem estar localizados adjacentes aos cantos da placa inferior 502. Os rebaixos 550 podem ser geralmente de forma cilíndrica e terminar em uma superfície interior do tipo cúpula ou hemisférica. Como também mostrado na Figura 11, a placa inferior 502 pode incluir uma estrutura de verificação de posição 552 que está configurada para interagir com um sensor do segundo módulo 200 para garantir o posicionamento adequado do primeiro vaso de biorreator 410 dentro do segundo módulo 200. Em uma modalidade, a estrutura de verificação de posição pode ser uma quebra de feixe que está configurada para interromper um feixe óptico do segundo módulo 200 quando o primeiro vaso de biorreator 410 está adequadamente assentado no mesmo.

47 /110

[00144] A placa inferior 502 também inclui um par de superfícies de engate planas 554 formadas na superfície inferior adjacente, que são deslocadas a partir de uma linha central da placa inferior (que se estende através da largura da placa inferior). Desejavelmente, as superfícies de engate 554 são afastadas ao longo de uma linha central longitudinal da placa inferior 502, de modo a serem posicionadas adjacentes às extremidades opostas da placa inferior 502. A placa inferior 502 pode adicionalmente incluir pelo menos uma abertura ou abertura 556 para permitir a detecção do conteúdo do primeiro vaso de biorreator 410 por um aparelho de bioprocessamento que engata e opera o vaso de biorreator.

[00145] Em uma modalidade, o primeiro e o segundo vasos de biorreator 410, 420 e a arquitetura de fluido 400 podem ser integrados a um conjunto ou kit 600 da maneira descrita abaixo. Em uma modalidade, o kit 600 é um kit descartável de uso único. Conforme mais bem mostrado nas Figuras 12 a 14, o primeiro recipiente de bioprocessamento 410 e o segundo recipiente de bioprocessamento 420 são recebidos lado a lado dentro de uma bandeja 610 do kit descartável 600 e os vários tubos da arquitetura de fluxo 400 dispostos dentro da bandeja 610 da maneira descrita a seguir.

[00146] Com referência adicional à Figura 15, a bandeja 610 inclui uma pluralidade de paredes laterais geralmente finas, rígidas ou semirrígidas, incluindo uma parede frontal 612, uma parede traseira 614 e lados laterais opostos 616, 618 que limitam perimetricamente uma superfície inferior 620 e um topo geralmente aberto. As paredes laterais e a superfície inferior 620 definem um compartimento interior 622 da bandeja 610. Em uma modalidade, a parte superior aberta da bandeja 610 é delimitada por uma flange periférica 624 que apresenta uma superfície para receber tampa removível (não mostrada) que envolve o compartimento interior 622, bem como para assentar de forma desejável em uma borda superior de uma gaveta de um aparelho de bioprocessamento, como indicado abaixo. A superfície inferior 620 da bandeja 610 inclui um número de aberturas correspondentes ao número de vasos de biorreator no sistema de bioprocessamento. Por exemplo, a bandeja 610 pode incluir uma primeira abertura 626 e uma segunda abertura 628. À superfície inferior 620 também pode incluir uma abertura adicional 630 adjacente à primeira e segunda aberturas 626, 628 para a finalidade descrita abaixo. Em uma modalidade, a bandeja 610 pode ser termoformada, impressa em 3D ou moldada por injeção, embora outras técnicas e processos de fabricação também possam ser utilizados sem se afastar dos aspectos mais amplos da invenção.

[00147] Conforme melhor mostrado na Figura 15, cada uma dentre a primeira e a segunda abertura 626, 628 tem um perímetro que é moldado e/ou dimensionado de modo que o primeiro e o segundo vasos de biorreator 410, 420 possam ser posicionados acima das respectivas aberturas 626, 628 e suportados pela superfície inferior 620 da bandeja 610 dentro do compartimento interior 622, enquanto ainda permite que uma porção dos vasos de biorreator 610, 620 seja acessível a partir da parte inferior da bandeja 610 através das respectivas aberturas 626, 628. Em uma modalidade, o perímetro das aberturas inclui pelo menos uma aba ou projeção para suportar os vasos do biorreator acima das respectivas aberturas. Por exemplo, o perímetro de cada abertura 626, 628 pode incluir abas 632 que se projetam para dentro em direção ao centro das aberturas 626, 628 para apoiar os vasos de biorreator 410, 420 colocados sobre a mesma. Conforme mostrado nas Figuras 12 e 15, a bandeja 610 também pode incluir uma ou mais saliências que se estendem para cima acima das aberturas 626, 628 para inibir o movimento lateral dos vasos de biorreator quando são recebidos acima das respectivas aberturas 626, 628. As saliências, portanto, servem como dispositivos de alinhamento que facilitam o posicionamento adequado dos vasos de biorreator 410, 420 dentro da bandeja 610 e ajudam a impedir o movimento inadvertido dos vasos de biorreator 410, 420 durante o

49 /110 carregamento ou o posicionamento do kit 600 no segundo módulo 200, como discutido abaixo.

[00148] Com referência adicional às Figuras 12 e 13, a bandeja 610 pode incluir uma ou mais nervuras de suporte 636 formadas na superfície inferior da bandeja 610. As nervuras de suporte 636 podem se estender através da largura e/ou comprimento da bandeja 610 e conferir rigidez e força à bandeja 610, facilitando o movimento e a manipulação do kit 600. As nervuras 636 podem ser formadas integralmente com a bandeja ou podem ser adicionadas como um componente auxiliar através de meios de fixação conhecidos na técnica. (Consulte a Figura 13). Em uma modalidade, a bandeja 610 inclui uma abertura 638 para receber uma placa de engate, também referida aqui como módulo de tubulação 650, através da mesma, que retém as linhas de fluxo de fluido de maneira organizada e as mantém em posição de engate pelas bombas e válvulas de diafragma. Em outras modalidades, o módulo de tubulação 650 pode ser formado integralmente com a parede traseira 614 da bandeja 610.

[00149] As Figuras 16 e 17 ilustram a configuração do módulo de tubulação 650 de acordo com uma modalidade da invenção. Como mostrado aqui, o módulo de tubulação 650 inclui um primeiro bloco de suporte de tubulação 652 configurado para receber a primeira linha de conjunto de fluido 442, a linha de interconexão 450 e a linha de resíduos 490 do sistema de fluxo de fluido 400 e reter a primeira linha de conjunto de fluido 442, a linha de interconexão 450 e a linha de resíduos de permeado 490 em posição para engate seletivo com os respectivos cabeçotes de bomba 454, 456, 492 de um conjunto de bomba peristáltica descrito abaixo em conexão com as Figuras 35 e 36. Em uma modalidade, a linha de conjunto de fluido 442, a linha de interconexão 450 e a linha de resíduos 490 são mantidas na orientação de extensão horizontal e espaçada verticalmente pelo primeiro bloco de suporte de tubulação 652. Em particular, como mais bem mostrado na Figura 17, o primeiro bloco de suporte de tubulação 652 engata cada uma das linhas 442, 450, 490 em dois locais afastados 656, 658 (como clipes ou interferência simples entre os tubos e ranhuras no bloco de suporte de tubulação 652) que definem um vazio entre os mesmos. Como também mostrado na Figura 17, o primeiro bloco de suporte de tubulação 652 inclui uma abertura de folga 660 que está configurada para receber um sapato (não mostrado) do conjunto de bomba peristáltica. Essa configuração permite a compressão peristáltica das linhas 442, 450, 490 contra o sapato pelas respectivas cabeças da bomba da bomba (ou bombas) peristáltica, de modo a prover uma força motriz respectiva de fluido através das linhas, como discutido abaixo.

[00150] Com referência adicional às Figuras 16 a 18, o módulo de tubulação 650 inclui adicionalmente um segundo bloco de suporte de tubulação 654 formado integralmente com (ou de outro modo acoplado a) o primeiro bloco de suporte de tubulação 652. O segundo bloco de suporte de tubulação 654 é configurado para receber todas as linhas de fluxo de fluido do sistema de fluxo de fluido 400 com as quais as válvulas de diafragma estão associadas. Por exemplo, o segundo bloco de suporte de tubulação 654 é configurado para reter as caudas de tubulação 464a-f do primeiro conjunto de fluido 440, as caudas de tubulação 470a-d do segundo conjunto de fluido 444, a primeira linha de biorreator 414 e a segunda linha de biorreator 418 do primeiro vaso de biorreator 410, a primeira linha de biorreator 424 e a segunda linha de biorreator 428 do segundo vaso de biorreator 420, a linha de fonte de ar estéril 460, a linha de interconexão 450 e a linha de interconexão 450 e a linha de filtragem 482 (e, em algumas modalidades, a linhas de amostragem 476a-476d). Similar ao primeiro bloco de suporte de tubulação 652, o segundo bloco de suporte de tubulação 654 pode manter esses tubos na orientação de extensão horizontal e espaçamento vertical. Em particular, o segundo bloco de suporte de tubulação 654 pode incluir uma pluralidade ou fendas verticalmente espaçadas e horizontalmente estendidas 666 que são configuradas para receber as linhas contidas no mesmo. As Figuras 18 e 19 também ilustra melhor a configuração das fendas 666 que retêm todas as linhas de fluxo que são acionadas por/fazem interface com as válvulas de diafragma. Desejavelmente, as fendas 666 seguem o contorno do bloco 654, mas se estendem particularmente através da placa traseira plana, de modo a abrir em direção ao filtro 484. Conforme mostrado na Figura 18, em uma modalidade, o segundo bloco de suporte de tubulação 654 pode ter uma ou mais fendas de tubulação estreitas 682 na parte inferior do segundo bloco de suporte de tubulação 654 para reter uma alça da linha de interconexão 450, a partir da qual as linhas de amostragem se estendem, e uma ranhura de tubulação de linha de resíduos 684 para receber a cauda de tubulação 470a que está conectada ao reservatório de resíduos 472a.

[00151] O segundo bloco de suporte de tubulação 654 pode incluir uma placa traseira plana 662 com uma pluralidade de aberturas 664 correspondentes à pluralidade de linhas de fluxo de fluido retidas pelo segundo bloco de suporte de tubulação 654. Em particular, pelo menos uma abertura 664 é alinhada horizontalmente com cada fenda 666 e a linha de nela retida na mesma. Conforme melhor mostrado na Figura 16, o segundo bloco de suporte de tubulação 654 inclui duas aberturas de folga 668, 670 que são configuradas para receber uma bigorna (não mostrada) de um conjunto de válvula de diafragma através do mesmo. Essa configuração permite a compressão seletiva das caudas de tubulação 464a-f do primeiro conjunto de fluido 440, das caudas de tubulação 470a-d do segundo conjunto de fluido 444, da primeira linha de biorreator 414 e da segunda linha de biorreator 418 e da segunda linha de biorreator 418 do primeiro vaso de biorreator 410, a primeira linha de biorreator 424 e a segunda linha de biorreator 428 do segundo vaso de biorreator 420, a linha de fonte de ar estéril 460, a linha de interconexão 450 e a linha de filtragem 482 contra a bigorna por um respectivo pistão de um atuador do conjunto de válvulas de diafragma,

impedir ou permitir seletivamente o fluxo de fluido, conforme discutido abaixo. Conforme mostrado nas Figuras 18 e 19, as aberturas 664 podem ser dispostas na primeira e na segunda colunas posicionadas lado a lado, em que as aberturas na primeira coluna de aberturas são deslocadas na direção vertical em relação às aberturas na segunda coluna de aberturas, de modo que as aberturas na primeira coluna das aberturas não estão alinhadas horizontalmente com as aberturas na segunda coluna de aberturas. Essa configuração permite que o módulo de tubulação 650, a bandeja 610 e o kit 600, como um todo, tenham um perfil baixo.

[00152] Em uma modalidade, o filtro 484 (mostrado na Figura 16 como um módulo de filtro de fibra oca alongado) pode ser integrado ao módulo de tubulação 650, como montando o filtro 484 no módulo de tubulação 650 através do uso de clipes de retenção 672. Quando o filtro 484 é um filtro de fibra oca, o filtro 484 pode estender substancialmente todo o comprimento do módulo de tubulação 650 e pode incluir uma primeira extremidade de entrada 674 para receber um fluxo de entrada de fluido da linha de filtragem 482 e uma segunda extremidade de saída 676 para transportar o retido, após a remoção do permeado/resíduo, de volta à linha de filtração 482 e à linha de interconexão 450 para circulação em um dentre o primeiro vaso de biorreator 410 ou o segundo vaso de biorreatores 420. O filtro 484 também pode incluir uma porta de permeado 678 adjacente à segunda extremidade de saída 676 para conexão com a linha de resíduos 490 para transportar os resíduos/permeado para reservatório de permeado/resíduo 472a. Finalmente, o módulo de tubulação 650 pode incluir uma pluralidade de recursos 680 para receber clipes e organizar as linhas de biorreator (por exemplo, primeira e segunda linhas de biorreator 414, 418 do primeiro vaso de biorreator 410 e/ou primeira e segunda linhas de biorreator 424, 428 do segundo vaso de biorreator 420).

[00153] Similar à bandeja 610, o módulo de tubulação 650 pode ser termoformado, impresso em 3D ou moldado por injeção, embora outras técnicas e processos de fabricação também possam ser utilizados sem se afastar dos aspectos mais amplos da invenção. Como discutido acima, em uma modalidade, o módulo de tubulação 650 pode ser formado integralmente com a bandeja 610. Em outras modalidades, o módulo de tubulação 650 pode ser um componente separado que é recebido de forma removível pela bandeja

610.

[00154] As Figuras 20 a 22 mostram várias vistas de uma modalidade do kit 600, ilustrando o primeiro vaso de biorreator 410 e o segundo vaso de biorreator 420 recebido dentro da bandeja 610 e as linhas de fluido da arquitetura de fluxo 400 recebidas pelo módulo de tubulação 650. Como mostrado aqui, em vez de ter uma abertura 630, o kit 600 como mostrado nas Figuras 20 a 22 inclui um piso sólido de modo a prover um espaço de amostragem 631 na bandeja 610 para receber um recipiente que mantém as linhas de amostragem (por exemplo, linhas de amostragem 476a, 476b). O kit 600 provê uma plataforma modular para processamento de células que pode ser facilmente configurada e descartada após o uso. As caudas de tubulação do primeiro e do segundo conjuntos de fluidos 440, 444 permitem a funcionalidade plug-and-play, permitindo a conexão rápida e fácil de vários sacos de meio, reagente, resíduo, amostragem e coleta para permitir que uma variedade de processos a sejam realizados em uma única plataforma. Em uma modalidade, a conexão e a desconexão podem ser realizadas cortando e soldando esterilmente os segmentos de tubo, como discutido acima, como com um dispositivo TERUMO, ou pressionando, soldando e cortando o segmento de cauda, como é conhecido na técnica.

[00155] Voltando agora às Figuras 23 a 25, o kit 600 é configurado especificamente para ser recebido por um aparelho de bioprocessamento 700 que contém todo o hardware (isto é, controladores, bombas, atuadores de válvula de pressão, etc.) necessários para acionar o kit 600 como parte de um método de bioprocessamento. Em uma modalidade, o aparelho de bioprocessamento 700 e o kit 600 (contendo a arquitetura de fluxo 400 e os vasos de biorreator 410, 420) juntos formam o segundo módulo de bioprocessamento 200 descrito acima em conexão com as Figuras 1 e 2. O aparelho de bioprocessamento 700 inclui um alojamento 710 com uma pluralidade de gavetas 712, 714, 716 que podem ser recebidas dentro do alojamento 710. Embora a Figura 23 descreva um aparelho 700 contendo três gavetas, o aparelho pode ter apenas uma única gaveta, duas gavetas ou mais de três gavetas para prover operações simultâneas de bioprocessamento a serem realizadas dentro de cada gaveta. Em particular, em uma modalidade, cada gaveta 712, 714, 716 pode ser um módulo de bioprocessamento independente para realizar os processos de ativação celular, modificação genética e/ou expansão (isto é, equivalente aos segundos módulos 200a 200b e 200c descritos acima em conexão com a Figura 2). Nesse aspecto, qualquer número de gavetas pode ser adicionado ao aparelho 700 para prover processamento paralelo de várias amostras do mesmo ou de diferentes pacientes. Em uma modalidade, em vez de cada gaveta compartilhar um compartimento comum, em uma modalidade, cada gaveta pode ser recebida dentro de um compartimento dedicado e os alojamentos podem ser empilhados um sobre o outro.

[00156] Conforme mostrado nas Figuras 23 e 24, cada gaveta, por exemplo, a gaveta 712, inclui uma pluralidade de paredes laterais 718 e uma superfície inferior 720 que define uma câmara de processamento 722 e um topo geralmente aberto. A gaveta 712 é móvel entre uma posição fechada na qual a gaveta é totalmente recebida dentro do alojamento 710, como mostrado nas gavetas 714 e 716 na Figura 23, e uma posição aberta, como mostrado para a gaveta 712 nas Figuras 23 e 24, na qual a gaveta 712 se estende a partir do alojamento 710, permitindo o acesso à câmara de processamento 722 através do topo aberto. Em uma modalidade, uma ou mais das paredes laterais

718 são controladas por temperatura para controlar uma temperatura dentro da câmara de processamento 722. Por exemplo, uma ou mais das paredes laterais 718 podem incluir um elemento de aquecimento embutido (não mostrado) ou estar em comunicação térmica com um elemento de aquecimento, de modo que as paredes laterais 718 e/ou a câmara de processamento 722 possam ser aquecidas a uma temperatura desejada para manter a câmara de processamento 722 a uma temperatura desejada (por exemplo, 37 graus Celsius) como otimizada para as etapas do processo a serem executadas pelo módulo 200. Em algumas modalidades, a superfície inferior 720 e a parte inferior da superfície superior do alojamento (acima da câmara de processamento quando a gaveta está fechada) pode ser controlada por temperatura de uma maneira similar (por exemplo, um elemento de aquecimento embutido). Um compartimento de hardware 724 da gaveta 712 atrás da câmara de processamento 722 pode abrigar todos os componentes de hardware do aparelho 700, como discutido em detalhes a seguir. Em uma modalidade, a gaveta 712 pode adicionalmente incluir um compartimento auxiliar 730 adjacente à câmara de processamento 722 para alojar os reservatórios contendo meios, reagentes, etc., que estão conectados ao primeiro conjunto de fluido 440 e ao segundo conjunto de fluido 444. Em uma modalidade, o compartimento auxiliar 730 pode ser refrigerado.

[00157] Cada gaveta, por exemplo, a gaveta 712, pode ser recebida de forma deslizante em trilhos de guia opostos 726 montados no interior do alojamento 710. Um atuador linear pode ser operacionalmente conectado à gaveta 712 para mover seletivamente a gaveta 712 entre as posições aberta e fechada. O atuador linear é operável para prover um movimento suave e controlado da gaveta 712 entre as posições aberta e fechada. Em particular, o atuador linear é configurado para abrir e fechar a gaveta 712 a uma velocidade substancialmente constante (e mínima aceleração e desaceleração na parada e início do movimento) para minimizar a perturbação do conteúdo do vaso (ou vasos) de biorreator.

[00158] A Figura 25 é uma vista de plano superior do interior da gaveta, mostrando a câmara de processamento 722, o compartimento de hardware 724 e o compartimento auxiliar 730 da gaveta 712. Conforme ilustrado aqui, o compartimento de hardware 724 está localizado atrás da câmara de processamento 722 inclui uma fonte de alimentação 732, uma placa de controle de movimento e eletrônicos de acionamento 734 que são integrados ou não em comunicação com o segundo controlador de módulo 210, um solenoide de baixa energia matriz 736, o conjunto de bomba 738 (que inclui cabeças de bomba para as bombas 454, 456, 492) e um atuador de engate de gaveta 740. O compartimento de hardware 724 da gaveta 712 inclui adicionalmente uma sapata de bomba 742 e um par de bigornas de válvula de diafragma 744 para interface com o conjunto de bomba 738 e a matriz de solenoide 736, respectivamente, conforme descrito a seguir. Em uma modalidade, a sapata da bomba 742 e a bigorna solenoide 744 são fixadas à placa de base frontal da câmara de processamento (a placa frontal). O compartimento de hardware (e os componentes descritos) estão todos montados na placa da base traseira. Ambas as placas são montadas de maneira deslizante nos trilhos. Adicionalmente, o atuador de engate da gaveta 740 acopla as duas placas e é usado para trazer as duas placas (e os componentes transportados nas placas para uma posição de engate (trazendo as cabeças do rolo da bomba para a sapata da bomba e, assim, apertando o tubo da bomba se inserido entre isso). Como é ainda descrito aqui, o conjunto da bomba provê operação seletiva nas linhas 442, 450 e 490 do caminho do fluido 400 para prover forças motrizes peristálticas respectivas independentes. De modo similar, o bloco de suporte de tubulação 654 da bandeja 600 será posicionado entre a matriz de solenoide 736 e as bigornas 744, como será descrito mais adiante.

[00159] Como também ilustrado na Figura 25, duas placas de leito, por exemplo, primeira e segunda placas de leito 746, 748, estão localizadas dentro da câmara de processamento 722 na superfície inferior 720 e se estendem para cima ou salientes da mesma. Em uma modalidade, a câmara de processamento 722 pode abrigar uma placa de leito simples, ou mais de duas placas de leito. As placas de leito 746, 748 são configuradas para receber ou engatar o primeiro vaso de biorreator 410 e o segundo vaso de biorreator 420 nas mesmas. Como também mostrado na Figura 25, a gaveta 712 também inclui uma placa 750 configurada com células de carga posicionadas adjacentes às placas de leito 746, 748 dentro da câmara de processamento 722 para detectar um peso de um reservatório, por exemplo, reservatório de resíduos 472a posicionado na mesma.

[00160] As Figuras 26 a 28 ilustram melhor a configuração das placas 746, 748, com a Figura 28A mostrando os componentes de hardware posicionados abaixo da placa da cama. Como usado aqui, as placas de leito 746, 748 e os componentes de hardware (isto é, sensores, motores, atuadores, etc. integrados a isso ou posicionados por baixo, como mostrado na Figura 28A) coletivamente podem ser chamadas de placa de leito. A primeira e a segunda placas de leito 746, 748 são substancialmente idênticas em configuração e operação, mas por simplicidade, a descrição a seguir das placas de leito 746, 748 faz referências apenas à primeira placa de leito 746. As placas de leito 746, 748 têm uma superfície superior substancialmente plana 752 que tem um formato e área de superfície que geralmente correspondem ao formato e área da placa inferior 502 do primeiro vaso de biorreator 410. Por exemplo, a placa do leito pode ser geralmente de forma retangular. As placas de leito 746, 748 também podem incluir áreas de alívio ou folga 758, que geralmente correspondem à posição das projeções ou abas 632 da bandeja 610, cuja finalidade será descrita abaixo. As placas de leito 746, 748 são suportadas por uma pluralidade de células de carga 760 (por exemplo, quatro células de carga 760 posicionadas abaixo de cada canto da placa de leito 746). As células de carga 760 são configuradas para detectar o peso do primeiro vaso de biorreator 410 durante o bioprocessamento, para uso pelo controlador 210.

[00161] Em uma modalidade, a placa do leito 746 pode incluir um elemento de aquecimento embutido ou estar em comunicação térmica com um elemento de aquecimento, de modo que a câmara de processamento 722 e/ou o conteúdo do primeiro vaso de biorreator 410 colocado na mesma possa ser mantido a uma temperatura desejada. Em uma modalidade, o elemento de aquecimento pode ser igual ou diferente do elemento de aquecimento que aquece as paredes laterais 718, a parede superior e a superfície inferior.

[00162] Como ilustrado, a placa de leito 746 inclui vários pinos de localização ou alinhamento 754 que se projetam acima da superfície superior 452 da placa do leito 746. O número de pinos de localização 754 e a posição e espaçamento dos pinos de localização 754 pode corresponder ao número, posição e espaçamento dos rebaixos 550 na superfície inferior da placa inferior 502 dos vasos de biorreator 410, 420. Como indicado abaixo, os pinos de localização 754 são recebíveis dentro dos rebaixos 550 na placa inferior 502 do primeiro vaso de biorreator 410 quando o primeiro vaso de biorreator 410 é posicionado dentro da câmara de processamento 722 para garantir o alinhamento adequado do primeiro vaso de biorreator 410 na primeira placa de leito 746.

[00163] Com referência adicional às Figuras 26 a 28, a placa de leito 746 pode adicionalmente incluir um sensor integrado 756 para detectar o alinhamento (ou desalinhamento) adequado do primeiro vaso de biorreator 410 na primeira placa de leito 746. Em uma modalidade, o sensor 756 é um feixe óptico infravermelho, embora outros tipos de sensores, como um interruptor de alavanca, também possam ser utilizados sem se afastar dos aspectos mais amplos da invenção. O sensor é configurado para interagir com a estrutura de verificação de posição 552 na placa inferior 502 quando o primeiro vaso de biorreator 410 está adequadamente assentado na primeira placa de leito 746. Por exemplo, quando o sensor 756 é um feixe óptico infravermelho e a estrutura de verificação de posição 552 é uma quebra de feixe (isto é, uma aba plana), com uma estrutura de verificação de posição substancialmente opaca a IR 552, quando o primeiro vaso de biorreator 410 está totalmente assentado na placa de base 746, a quebra do feixe interrompe o feixe óptico infravermelho (isto é, quebra o feixe). Isso sinalizará ao controlador 210 que o primeiro vaso de biorreator 410 está assentado adequadamente. Se, após o posicionamento do primeiro vaso de biorreator 410 na primeira placa de leito 746, o controlador não detecta que o feixe óptico infravermelho do sensor 756 está quebrado, isso indica que o primeiro vaso de biorreator 410 não está total ou adequadamente assentado na placa de leito 746 e esse ajuste é necessário. O sensor 756 na placa de base 746 e a estrutura de verificação de posição 552 na placa inferior 502 do primeiro vaso de biorreator 410, portanto, assegura que o primeiro vaso de biorreator 410 esteja assentado na posição nivelada na placa de base 746 (conforme determinado pelos pinos de alinhamento) antes de iniciar o bioprocessamento.

[00164] Referindo-se ainda mais às Figuras 26 a 28A, a placa de leito 746 inclui adicionalmente um sensor de temperatura incorporado 759 que está posicionado de modo a ficar alinhado com a abertura 556 na placa inferior 502 do primeiro vaso de biorreator 410. O sensor de temperatura 759 é configurado para medir ou detectar um ou mais parâmetros dentro do vaso de biorreator 410, como, por exemplo, um nível de temperatura dentro do vaso de biorreator 410. Em uma modalidade, a placa de leito 746 pode incluir adicionalmente um detector de temperatura de resistência 760 configurado para medir uma temperatura da superfície superior 752 e um sensor de dióxido de carbono (localizado sob a placa de leito) para medir um nível de dióxido de carbono dentro do vaso do biorreator.

[00165] Conforme mostrado mais adiante nas Figuras 26 a 28A, cada placa de base 746, 748 inclui um mecanismo atuador 761 (por exemplo, um motor) que inclui, por exemplo, um par de braços de came opostos 762. Os braços de came 762 são recebidos dentro das fendas 764 nas placas de leito 746, 748 e são giratórios em torno do pino de came 766 entre uma posição de folga em que os braços de came 762 estão posicionados abaixo da superfície superior 752 da placa de leito 746 e uma posição de engate onde os braços de came 762 se estendem acima da superfície superior 752 da placa do leito e entram em contato com as superfícies de engate planas opostas 554 da placa inferior 502 do primeiro vaso de biorreator 410 quando o primeiro vaso de biorreator 410 é recebido no topo da primeira placa de leito 746. Como discutido em detalhes abaixo, o mecanismo do atuador é operável para inclinar o vaso do biorreator sobre a placa do leito para proporcionar agitação e/ou auxiliar na drenagem do vaso do biorreator.

[00166] Em referência às Figuras 29 a 32, são mostradas vistas mais detalhadas do atuador linear 768 e do acionador de gaveta 740 no compartimento de hardware 724 da gaveta 712. Em referência à Figura 29, e como indicado acima, o atuador linear 768 é operável para mover a gaveta 712 entre as posições aberta e fechada. Em uma modalidade, o atuador linear 768 é eletricamente conectado a um interruptor oscilante 770 no exterior do alojamento 710, o que permite o controle do usuário do movimento da gaveta. O atuador linear 770 provê movimento controlado da gaveta 712 para impedir a perturbação do conteúdo dos vasos de biorreator dentro da gaveta 712. Em uma modalidade, o atuador linear 768 tem um curso de aproximadamente 16” e tem uma velocidade máxima de aproximadamente 2 polegadas por segundo.

[00167] Voltando agora à Figura 30, o atuador de engate de gaveta 740 inclui um parafuso de avanço 772 e um braço de forquilha 774 que se prende a uma placa frontal 751 dentro da gaveta 712. O atuador de engate da gaveta é operacionalmente conectado ao conjunto da bomba 738 e à matriz de solenoides 736 e é operável para mover o conjunto da bomba 738 e o matriz de solenoides 736 entre uma primeira posição de folga e uma posição de engate.

[00168] As Figuras 31 e 32 ilustrar melhor a posição de folga e a posição de engate do conjunto de bomba 738 e da matriz de solenoides 736. Conforme ilustrado na Figura 31, na posição de folga, o conjunto da bomba 738 e o matriz de solenoides 736 são espaçados do sapato da bomba 742 e das bigornas da válvula de diafragma 744, respectivamente. Após a atuação do parafuso guia 772, o mecanismo de engate da gaveta 740 move o conjunto da bomba 738 e a matriz de solenoides linearmente para a frente para a posição mostrada na Figura 32. Nessa posição, os cabeçotes de bomba do conjunto de bomba 738 engatam as linhas 442, 450, 490 no primeiro bloco de suporte de tubulação 652 e a matriz de solenoides 736 é posicionado próximo o suficiente das bigornas da válvula de diafragma 744 que um pistão/atuador da matriz de solenoide 736 pode comprimir/prender suas respectivas linhas de fluxo de fluido do segundo bloco de suporte de tubulação 654 contra a bigorna (ou bigornas) de válvula de diafragma 744, impedindo desse modo o fluxo através dessa linha de fluxo de fluido.

[00169] Voltando à Figura 24, e com referência adicional às Figuras 33 a 39, em operação, a gaveta 712 pode ser movida de forma controlável para a posição aberta, acionando a chave oscilante 770 na parte externa do alojamento 710. O kit complementar descartável 600 que contém o módulo de tubulação 650 (que mantém todos os tubos e caudas de tubulação da arquitetura de fluxo 400) e o primeiro e o segundo vasos de biorreator 410, 420 são então abaixados na posição dentro da câmara de processamento 722. À medida que o kit 600 é baixado na câmara de processamento 722, a sapata da bomba 742 é recebida através da abertura de folga 660 do primeiro bloco de suporte de tubulação 652, de modo que os tubos da bomba 442, 450, 490 sejam posicionados entre a sapata de bomba 742 e os cabeçotes de bomba 454, 456, 492 do conjunto de bomba peristáltica 738. A Figura 35 é uma vista em perspectiva do conjunto de bomba peristáltica 738, mostrando o posicionamento das cabeças de bomba 454, 456, 492 em relação entre si. À Figura 36 ilustra o posicionamento das cabeças de bomba 454, 456, 492 em relação aos tubos de bomba 442, 450, 490 quando o kit 600 é recebido dentro da câmara de processamento 722. Conforme mostrado aqui, os tubos da bomba 442, 450, 490 são posicionados entre a sapata de bomba 742 e os cabeçotes de bomba 454, 456, 492. Em operação, quando o atuador de engate de gaveta 740 posiciona o conjunto de bomba 738 na posição de engate, os cabeçotes de bomba 454, 456, 492 são seletivamente acionáveis sob controle do controlador 210 para iniciar, manter e interromper um fluxo de fluido através dos tubos 442 450, 490.

[00170] Da mesma forma, quando o kit 600 é baixado na câmara de processamento 722, as bigornas da válvula de diafragma 744 são recebidas através das aberturas de folga 668, 670 do segundo bloco de suporte de tubulação 654, de modo que as caudas de tubulação 464a-f do primeiro conjunto de fluido 440, as caudas de tubulação 470a-d do segundo conjunto de fluido 444, a primeira linha de biorreator 414 e a segunda linha de biorreator 418 do primeiro vaso de biorreator 410, a primeira linha de biorreator 424 e a segunda linha de biorreator 424 e a segunda linha de biorreator 428 do segundo vaso de biorreator 420, a linha de fonte de ar estéril 460, a linha de interconexão 450 e a linha de filtragem 482 que são retidas pelo segundo bloco de suporte de tubulação 654 são posicionadas entre a matriz de solenoide 736 e as bigornas de válvula de diafragma 744. Essa configuração é mais bem ilustrada nas Figuras 37 a 39 (Figuras 37 e 38 ilustrando a relação entre a matriz de solenoide 736 e as bigornas da válvula de diafragma 744 antes de receber a placa traseira 662 do segundo bloco de suporte de tubulação 654 no espaço 776).

[00171] Como mostrado aqui, cada solenoide 778 da matriz de solenoides 736 inclui um pistão 780 que é extensível linearmente através de uma abertura associada (das aberturas 664) na placa traseira 662 do segundo bloco de suporte de tubulação 654 para prender um tubo associado contra a válvula de pressão bigorna 744. Nesse aspecto, a matriz de solenoide 736 e a bigorna 744 juntas formam uma matriz de válvula de diafragma (que inclui as válvulas do primeiro conjunto de fluido 440 e segundo conjunto de fluido 444, bem como as válvulas da linha de biorreator, ou seja, válvulas 432, 434, 436, 438, válvula de linha estéril 462, válvula de linha de interconexão 452 e válvulas de linha de filtragem 486, 488). Em particular, as válvulas de diafragma da arquitetura de fluxo 400 são providas pelos respectivos solenoides 778 (isto é, pistões dos solenoides) da matriz de solenoides 736 operando/atuando “contra sua respectiva bigorna 744 enquanto O caminho/linha de fluido está no meio. Em particular, em operação, quando o atuador de engate de gaveta 740 posiciona a matriz de solenoide 736 na posição de engate, cada solenoide 778 é seletivamente atuável sob controle do controlador 210 para prender uma linha de fluxo de fluido associada contra a bigorna 744 para impedir um fluxo de fluido através do mesmo. A presente invenção contempla que cada linha de fluido esteja posicionada entre uma face plana da bigorna e um cabeçote de atuador de solenoide plano. Alternativamente, a cabeça do atuador de solenoide pode incluir um cabeçote conformado, como duas superfícies cônicas que se encontram em uma borda alongada semelhante a uma chave de fenda Phillips, que é otimizada para prover uma força de aperto desejada na linha de fluido resilientemente flexível. Alternativamente, a face da bigorna pode incluir uma crista alongada ou projeção que se estende em direção a cada linha de fluido, de modo que um cabeçote de solenoide planar possa comprimir a linha de fluido contra essa crista que se estende transversalmente, de modo a fechar a linha ao fluxo de fluido através da mesma.

[00172] Em referência às Figuras 33, 34 e 40, quando o kit 600 é baixado na câmara de processamento da gaveta, o primeiro vaso de biorreator

410 e o segundo vaso de biorreator 420 são suportados acima das aberturas 626, 628 pelo perímetro das aberturas e, em particular, pelas abas/projeções

632. À medida que o kit é abaixado ainda mais, as placas de leito 746, 748 se estendem através das aberturas 626, 628 e recebem ou engatam nos vasos de biorreatores 410, 420. O formato das aberturas 626, 628 e a superfície superior 752 das placas 746, 748 (por exemplo, áreas de alívio 758 das placas 746, 748 que correspondem às abas/projeções 632 da bandeja 610) permitem que a bandeja 610 continue a viagem descendente uma vez que os vasos de biorreator 410, 420 são recebidos pelas placas de leito 746, 748, de modo que a superfície inferior da bandeja 610 e as abas/projeções 632 estejam assentadas em um local inferior à superfície superior 752 das placas de leito 746 , 748, de modo que os vasos de biorreator 410, 420 possam ser suportados pelas placas de leito 746, 748 em relação espaçada à superfície inferior 620 da bandeja 610. Isso garante que a bandeja 610 não interfira com a sede nivelada dos vasos de biorreator 410, 420 nas placas de leito 746, 748.

[00173] Como as placas do leito 746, 748 se estendem através das aberturas 726, 728 na bandeja 610, os pinos de localização 754 nas placas do leito 746, 748 são recebidos nos rebaixos correspondentes 550 na placa inferior 502 dos vasos de biorreator 410, 420, garantir que os vasos de biorreator 410, 420 estejam adequadamente alinhados com as placas de leito 410, 420. Quando assentada adequadamente nas placas do leito 746, 748, a quebra do feixe 552 quebra o feixe óptico do sensor 756 nas placas da cama, indicando ao controlador que os vasos de biorreator 410, 420 estão na posição correta. Como as placas do leito 746, 748 e as alturas dos pinos de alinhamento estão niveladas, a interrupção do feixe óptico do sensor 756 pela quebra do feixe 552 também assegura que os vasos de biorreator 410, 420 estejam nivelados. Nessa posição assentada adequadamente, o sensor 759 nas placas do leito 746, 748 é alinhado com a abertura 556 na placa inferior 502 para permitir a detecção de parâmetros de processamento dentro do compartimento interior dos vasos de biorreator 410, 420, respectivamente. Além disso, na posição totalmente assentada, os braços de came 762 das placas de leito 746, 748 estão alinhados com as superfícies de engate planas 554 na placa inferior 502 dos vasos de biorreator 410, 420, respectivamente.

[00174] A Figura 40 é uma vista frontal em seção transversal que ilustra essa posição totalmente assentada do primeiro vaso de biorreator 410 na placa de leito 746. Conforme mostrado na Figura 40, um elemento de aquecimento na forma de uma almofada de aquecimento 782 e módulo de aquecimento 784 pode ser posicionado abaixo da placa do leito 746 para aquecer a placa do leito 746. Conforme mostrado na Figura 40, um módulo de detecção de dióxido de carbono 786 também pode ser posicionado sob a placa do leito para detectar um conteúdo de dióxido de carbono dentro da câmara de processamento 722.

[00175] Como mostrado adicionalmente na Figura 40, em uma modalidade, as paredes laterais 718 e inferior da gaveta 712 (e a parede superior do alojamento) podem compreender uma tampa 788, uma camada de espuma isolante 790 para ajudar a minimizar a perda de calor da câmara de processamento 722, um aquecedor de filme 792 para aquecer as paredes como descrito acima e uma placa de metal interna 794. Em uma modalidade, a placa de metal interna 794 pode ser formada de alumínio, embora outros materiais termicamente condutores também possam ser utilizados sem se afastar dos aspectos mais amplos da invenção. À gaveta 712 pode adicionalmente incluir uma ou mais vedações de escova 796 para ajudar a minimizar a perda de calor da câmara de processamento 722 e uma ruptura térmica 798 para minimizar ou impedir o fluxo de energia térmica da gaveta 712 para outros componentes do aparelho 700 (como como alojamento 710 ou outras gavetas (por exemplo, gavetas 714,716)).

[00176] Referindo-se mais uma vez à Figura 34, quando o kit 600 é recebido na câmara de processamento 722, a célula de carga 750 no fundo da câmara de processamento 722 adjacente à segunda placa do leito 748 se estende através da abertura 730 na bandeja 610, de modo que um saco de lixo 472a possa ser conectado à cauda do tubo 470u e posicionado na célula de carga 750. Como mostrado aqui, quando o kit 600 é recebido dentro da gaveta 712, o segundo bloco de suporte de tubulação 654 retém a tubulação de tal modo que as caudas de tubulação 464a-f do primeiro conjunto de fluido 440 e as caudas de tubulação 470b-d do segundo conjunto de fluido 444 estender para o compartimento auxiliar 730 para a conexão dos reservatórios ao mesmo. Em uma modalidade, as linhas de amostragem 476a-476d também se estendem para o compartimento auxiliar 730.

[00177] Voltando agora às Figuras 41 a 44, é ilustrada a operação dos braços de came 762 das placas de leito 746, 748. Conforme mostrado aqui, os braços de came 762 são móveis entre uma posição retraída, em que estão posicionados abaixo da superfície superior das placas de leito 746, 748 e uma posição de engate, em que são girados em torno do pino de came 766 e se estendem acima das placas de leito 746, 748 engatar as superfícies de engate planas 554 dos vasos de biorreator 410, 420 para levantar os vasos de biorreator 410, 420 das placas de leito 746, 748. Como os braços de came 762 são retraídos abaixo da superfície superior das placas de leito 746, 748 em um estado padrão e os vasos de biorreator 410, 420 são suportados nas placas de leito niveladas 746, 748 (e, particularmente, os pinos de alinhamento de nível 754), nenhuma energia é necessária para manter os vasos do biorreator em uma posição nivelada. Em particular, quando os vasos de biorreator 410, 420 são recebidos nas placas de leito 746, 748, os mesmos estão na posição nivelada. No caso de uma interrupção de energia, os vasos de biorreator 410, 420 permanecem assentados nas placas de leito niveladas 746, 748 e não requerem nenhum ajuste contínuo usando os braços de came 762 para manter a posição nivelada. Isso contrasta com alguns sistemas que podem exigir ajuste constante do biorreator com o uso de servomotores para manter uma posição nivelada. De fato, com a configuração dos braços de came 762 da invenção, o atuador só precisa ser energizado ao inclinar os vasos do biorreator para agitação/mistura, conforme discutido abaixo, o que minimiza a contribuição de calor para a câmara de processamento 722.

[00178] Conforme mostrado nas Figuras 41 a 43, os braços de came 762 podem ser operados sequencialmente para agitar o conteúdo dos vasos de biorreator 410, 420. Por exemplo, quando se deseja agitar o conteúdo do vaso de biorreator 410, um dos braços de came será acionado para levantar uma extremidade do vaso de biorreator 410 para fora da placa de leito 746 (e fora do engate com os pinos de localização 754 na placa de leito 746, enquanto a extremidade oposta permanece assentada na placa de leito e os pinos de localização 754 na extremidade não elevada permanecem recebidos nos rebaixos correspondentes 550 na placa inferior 502. O braço do came levantado será girado de volta para a posição de folga abaixo da placa de leito e o braço do came oposto será girado para a posição de engate para elevar a extremidade oposta do vaso do biorreator fora da placa de leito e dos pinos de localização.

[00179] Em uma modalidade, o sistema de atuação de came pode ser projetado de modo que os braços de came 762 possam ser posicionados sem tocar no vaso de biorreator, impedindo a interrupção da cultura e permitindo que os braços de came 762 sejam posicionados (ou testados) em qualquer ponto durante o longo períodos de processamento celular. Assim, embora a presente invenção contemple que outros meios de oscilação ou agitação possam ser providos para os vasos do biorreator, tendo dois braços de came 762 em lados opostos da placa do leito, a altura total do mecanismo de mistura pode ser minimizada. Por exemplo, um movimento de +/- 5 graus pode ser alcançado com um atuador central (localizado centralmente na placa de leito), mas quase o mesmo movimento de uma embarcação pode ser alcançado com o movimento de O a 5 graus da embarcação acionado por um braço de came em ambos os lados do vaso, efetivamente dando ao vaso um movimento de +/- 5 graus na metade da altura. Além disso, o movimento dos braços de came 762 (por exemplo, velocidade de rotação de braço de came e temporização entre os braço de came opostos) pode ser ajustado para maximizar a formação de ondas no vaso para maximizar a amplitude das ondas e, assim (idealmente) maximizar a homogeneidade do conteúdo de vaso e tempo para alcançar a homogeneidade. A temporização também pode ser ajustada com base no volume em um vaso com uma dada geometria para maximizar a eficiência da mistura.

[00180] Em uma modalidade, o sensor óptico 756 pode ser usado para confirmar que o primeiro vaso de biorreator 410 foi reposicionado corretamente após cada movimento de agitação de came. É ainda contemplado que o reposicionamento correto do vaso de biorreator possa ser examinado e verificado mesmo entre movimentos de came alternados. Isso permite a detecção rápida de desalinhamento, em tempo substancialmente real, permitindo que um operador intervenha para recolocar o vaso de biorreator “sem desvio substancill da operação/protocolo de bioprocessamento.

[00181] A Figura 43 é uma ilustração esquemática que mostra a posição de um fluido 800 dentro do vaso de biorreator durante esse processo de agitação. Conforme mostrado na Figura 42, em uma modalidade, um sensor de posição inicial 802 integrado à placa de leito 746 pode ser utilizado pelo controlador para determinar quando os braços de came 762 retornaram à posição de folga abaixo da superfície superior da placa de leito 746. Isso é útil na coordenação do movimento dos braços de came 762 para prover uma frequência de mistura desejada nos vasos de biorreator. Em uma modalidade, os braços de came 762 são configurados para prover um ângulo de inclinação máximo de 5 graus em relação à placa de leito 746.

[00182] Em referência à Figura 44, a interface entre os pinos de localização 754 da placa do leito e os rebaixos 550 na placa inferior 502 do vaso de biorreator 410 durante a mistura/agitação é ilustrada. Em uma modalidade, os rebaixos 550 têm uma superfície interior do tipo cúpula ou hemisférica e um diâmetro, dl, que é maior que um diâmetro, d2, dos pinos de localização 754. Conforme ilustrado na Figura 44, essa configuração provê folga entre os pinos de localização 754 e os rebaixos 550, o que permite a inclinação do vaso de biorreator 410 quando os pinos de localização 554 são recebidos nos rebaixos 550.

[00183] Em uma modalidade, cada gaveta do aparelho de bioprocessamento 700, por exemplo, a gaveta 712, desejavelmente inclui um painel frontal virado para baixo 810 montado de maneira articulada no mesmo, como mostrado nas Figuras 45 a 50. O painel frontal virado para baixo 810 permite acesso ao compartimento auxiliar 730 sem ter que abrir a gaveta 712, como melhor mostrado nas Figuras 45, 49 e 50. Como será reconhecido, essa configuração permite amostragem em processo e troca de sacos de meio. Em conexão com o disposto acima, em uma modalidade, o compartimento auxiliar 730 pode ser configurado com uma pluralidade de trilhos deslizantes telescópicos 812, provendo meios de fixação 815 dos quais Os vários reservatórios/sacos de meio podem ser suspensos. Os trilhos 812 são móveis entre uma posição retraída dentro do compartimento 730, como representado na Figura 48, para uma posição estendida para fora do compartimento 730, como mostrado na Figura 49. Quando um saco coletor está cheio, ou um saco de meio/fluido precisa ser substituído, os trilhos 812 podem ser simplesmente estendidos para fora e o saco destampada. Um novo saco pode ser conectado à sua respectiva cauda e, então, ser suspenso de um trilho e deslizada de volta para o compartimento auxiliar 730 sem ter que abrir a gaveta 712 ou interromper o processamento. Em uma modalidade, os trilhos 812 podem ser montados nas hastes transversais que se estendem transversalmente 814. Os trilhos 812 podem, assim, ser deslizáveis lateralmente nas hastes 814, e extensíveis e retráteis no compartimento auxiliar. Além disso, quando a gaveta estiver aberta (Figura 46), os trilhos 812 podem girar em torno da haste transversal traseira, de modo a liberar o compartimento 730 para permitir que um usuário rosqueie as caudas de tubulação em direção à frente do compartimento 730, proporcionando um terceiro grau de liberdade.

[00184] Conforme ilustrado na Figura 51, em outra modalidade, os sacos de meio/ fluido podem ser montados em uma plataforma 820 que é giratória para fora do compartimento auxiliar 730 de uma posição retraída para uma posição de acesso. Por exemplo, a plataforma 820 pode ser montada para movimento ao longo de uma pista de guia 822 formada nas paredes laterais do compartimento auxiliar 730.

[00185] Em referência à Figura 52, em uma modalidade, o aparelho de bioprocessamento 700 pode adicionalmente incluir uma bandeja de resíduos de baixo perfil 816 recebida dentro do compartimento 710 abaixo de cada gaveta, por exemplo, a gaveta 712. A bandeja de resíduos 816 é montada independentemente em sua gaveta para ser móvel entre uma posição fechada e aberta. Na posição fechada, a bandeja 816 deseja estender-se nivelada com a superfície frontal da gaveta, enquanto na bandeja de posição aberta 816 expõe sua própria câmara 819 para ser acessível a um operador. À câmara 819 provê fácil armazenamento de grandes sacos de resíduo conectados ao caminho de fluido de sua bandeja sobreposta 600 e provê acesso a isso sem ter que abrir a gaveta 712. Além disso, na posição fechada, a bandeja de resíduos 816 posiciona a câmara 819 no registro subjacente com sua gaveta e é dimensionada e configurada de modo a ser operável para conter qualquer vazamento da câmara de processamento 722 ou do compartimento auxiliar

730.

[00186] Em uma modalidade, cada gaveta pode incluir uma câmera posicionada acima da câmara de processamento (por exemplo, acima de cada vaso de biorreator 410, 420) para permitir o monitoramento visual do interior da gaveta 712 sem ter que abrir a gaveta 712. Em uma modalidade, a câmera (ou uma câmera adicional) pode ser integrada ao conjunto da placa de leito ou em uma parede lateral olhando lateralmente para o vaso (ou vasos) de biorreator.

[00187] O segundo módulo 200 da invenção provê, portanto, a automação do processamento celular até uma extensão até então não vista na técnica. Em particular, a arquitetura de fluxo de fluido 400, o conjunto de bomba 738 e o conjunto de válvulas de diafragma 736 permite a manipulação automatizada de fluido entre os vasos de biorreator 410, 420 e as sacos conectados ao primeiro e ao segundo conjuntos de fluido 740, 744 (por exemplo, adição de fluido, transferência, drenagem, lavagem, etc.). Como discutido abaixo, essa configuração também permite concentração e lavagem de filtro de fibra oca, perfusão sem filtro e aplicação de primer de linha. O uso do atuador de engate de gaveta 740 também para engate e desengate automático do kit de entrada 600, minimizando ainda mais os pontos de contato humanos. De fato, pontos de contato humanos podem ser necessários apenas para adição e remoção de sacos de origem/meio, amostragem e entrada de dados (por exemplo, volume de amostra, densidade celular, etc.).

[00188] Em referência às Figuras 53 a 77, é ilustrado um protocolo genérico automatizado para um fluxo de trabalho com revestimento de Ab imobilizado, adição de Ab solúvel, vetor gama-retroviral com expansão no mesmo vaso, com o uso do segundo módulo 200 e arquitetura de fluxo de fluido 400. Esse protocolo genérico provê ativação (ilustrado nas Figuras 53 a 59), preparação pré-transdução e transdução (ilustrado nas Figuras 60 a 71), expansão (Figuras 72 a 76) e, para algumas modalidades, recolhimento (Figura 77) de uma população de células de maneira automatizada e funcionalmente fechada. Ao descrever a operação das válvulas de diafragma, abaixo, quando uma válvula não é usada para uma operação específica, a válvula está em seu estado/posição fechada. Consequentemente, depois que uma válvula é aberta para permitir uma operação específica e, uma vez concluída essa operação, a válvula é fechada antes de prosseguir para a próxima operação/etapa.

[00189] Conforme mostrado na Figura 53, em uma primeira etapa, as válvulas 432 e 468e são abertas e a primeira bomba de linha de montagem de fluido 454 é acionada para bombear uma solução de revestimento de anticorpo (Ab) do reservatório 466f conectada ao primeiro conjunto de fluido 440 ao primeiro vaso de biorreator 410 através da primeira porta 412 do mesmo. A solução de revestimento de anticorpo é incubada por um período de tempo e, então, drenada através da linha de interconexão para um reservatório de resíduos 472a do primeiro conjunto de fluido 440 abrindo as válvulas 434, 474a e ativando a bomba de linha de circulação 456. Conforme descrito aqui, a drenagem do vaso de biorreator 410 pode ser facilitada pela inclinação do vaso de biorreator 410 com o uso dos braços de came 462.

[00190] Após drenar a solução de revestimento de anticorpo, as válvulas 432 e 468e são abertas e a bomba 454 é acionada para bombear um tampão de lavagem do reservatório 466e conectado ao primeiro conjunto de fluido 440 ao primeiro vaso de biorreator 410 através da primeira linha de biorreator. O tampão de lavagem é, então, drenado através da linha de interconexão 450 para o reservatório de resíduos 472a, atuando a bomba de linha de circulação 456 e abrindo a válvula 474a. Em uma modalidade, esse procedimento de lavagem e drenagem pode ser repetido várias vezes para enxaguar com o uso do primeiro vaso do biorreator 410.

[00191] Voltando à Figura 55, depois de enxaguar o primeiro vaso de biorreator 410 com o tampão, as células em um saco de sementes 466e (que foram previamente enriquecidas e isoladas com o uso do primeiro módulo 100) são transferidas para o primeiro vaso de biorreator abrindo as válvulas 468e e 432 e atuando a bomba 454 . As células são bombeadas através da primeira linha de biorreator 414 do primeiro vaso de biorreator 410 e entram no vaso de biorreator 410 através da primeira porta 412. Conforme mostrado na Figura 56, as válvulas 432 e 468a são, então, abertas e a bomba 454 é acionada para bombear uma segunda solução de anticorpo (Ab) do reservatório 466a conectado ao primeiro conjunto de fluido 440 ao primeiro vaso de biorreator 410 através da primeira porta 412.

[00192] Após bombear a segunda solução de anticorpo para o primeiro vaso de biorreator, o segundo vaso de solução de anticorpo 466a é, então, enxaguado e o meio de enxágue é bombeado para o primeiro vaso de biorreator. Em particular, conforme mostrado na Figura 57, as válvulas 474b, 452 e 468a são abertas e o meio de enxágue de um reservatório/saco de meio de enxágue 472b do segundo conjunto de fluido 444 é bombeado com o uso da bomba 454 para o segundo reservatório de solução de anticorpo 466a para enxaguar o reservatório. Após o enxágue, a válvula 432 é aberta e o meio de enxágue é bombeado do reservatório 466a para o primeiro vaso de biorreator

410. Em uma modalidade, o segundo reservatório de solução de anticorpo 466a pode ser lavado várias vezes com o uso desse procedimento.

[00193] Depois de enxaguar o segundo reservatório de solução de anticorpo 4664, o saco de inóculo/célula de semente 466d também pode ser opcionalmente enxaguado. Em particular, conforme mostrado na Figura 58, as válvulas 474b, 452 e 468d são abertas e o meio de enxágue de um reservatório/saco de meio de enxágue 472b do segundo conjunto de fluido 444 é bombeado para o saco de inóculo/célula de semente 466d para enxaguar o saco com o uso da bomba 454. Após o enxágue, a válvula 432 é aberta e o meio de enxágue é bombeado do saco 466d para o primeiro vaso de biorreator 410 com o uso da bomba 454. Ao bombear o meio de lavagem para o primeiro vaso de biorreator 410 após enxaguar o saco de inoculo/célula de semente 466d, a densidade celular no primeiro vaso de biorreator 410 é reduzida. Nesse momento, uma amostra pode ser retirada para medir um ou mais parâmetros da solução no primeiro vaso de biorreator antes da ativação (por exemplo, para garantir que a densidade celular desejada esteja presente antes da ativação). Em particular, conforme mostrado na Figura 58, as válvulas 434, 452 e 432 são abertas e a bomba 456 é atuada para bombear o conteúdo do primeiro vaso de biorreator 410 ao longo de uma primeira alça de circulação do primeiro vaso de biorreator (isto é, fora da segunda porta 416, através da linha de interconexão 450, e de volta ao primeiro vaso de biorreator 410 através da primeira linha de biorreator 414 e da primeira porta 412 do primeiro vaso de biorreator 410). Para retirar uma amostra, um primeiro vaso de amostra 280a (por exemplo, um tubo de imersão, seringa, etc.) é conectado à primeira cauda de tubo de amostra 476u e a válvula 478u é aberta para desviar parte do fluxo através da linha de interconexão 450 para o primeiro vaso de amostra 280a para análise.

[00194] Se a análise da amostra retirada indicar que todos os parâmetros da solução estão dentro de faixas predeterminadas, a solução dentro do primeiro vaso de biorreator 410 é incubada por um período de tempo predeterminado para ativação da população de células em solução, como ilustrado na Figura 59. Por exemplo, em uma modalidade, a população de células no primeiro vaso de biorreator 410 pode ser incubada por aproximadamente 24 a 48 horas.

[00195] Agora, em referência à Figura 60, após a ativação, para preparar a transdução, as válvulas 438 e 474b podem ser abertas e a bomba 456 operada para bombear a solução RetroNectin do reservatório 472b para o segundo vaso de biorreator 420 através da segunda porta 426 do segundo vaso de biorreator 420. Depois de bombear a solução RetroNectin para o segundo vaso de biorreator 420 para o revestimento RetroNectin do segundo vaso de biorreator 420, a solução é incubada no segundo vaso de biorreator 420 por um período de tempo predeterminado. Como mostrado adicionalmente na Figura 60, após a incubação, toda a solução RetroNectin é, então, drenada do segundo vaso de biorreator 420 para o reservatório de resíduos 472a, por meio da abertura das válvulas 438 e 474a e da atuação da bomba de linha de circulação 456. Durante essas etapas de revestimento, incubação e drenagem da RetroNectin (relacionadas ao segundo vaso de biorreator 420), deve-se notar que a população de células ativadas permanece no primeiro vaso de biorreator 410. Deve-se observar que não é necessário que RetroNectin ou outros reagentes para aumentar a eficiência da modificação genética sejam utilizados em todos os processos.

[00196] Conforme mostrado na Figura 61, após o revestimento RetroNectin, um saco de tampão de enxágue 472b é conectada ao segundo conjunto de fluido 444 (ou já pode estar presente e conectada a uma das caudas de tubulação) e as válvulas 474b e 438 são abertas e a bomba 456 é atuada para bombear o tampão do saco 472b para o segundo vaso de biorreator 420. Como discutido acima, alternativamente, o tampão pode ser bombeado através da primeira porta 422 do segundo vaso de biorreator 420, ao invés de abrir as válvulas 452 e 436.

[00197] Voltando agora à Figura 62, após um período de tempo definido, todo o tampão no segundo vaso de biorreator 420, é drenado para o reservatório de resíduos 472a do segundo conjunto de fluido 444, por meio da abertura das válvulas 438 e 474a e da atuação da bomba de linha de interconexão 456.

[00198] Nesse ponto, conforme mostrado na Figura 63, uma amostra de pré-concentração pós-ativação pode ser retirada das células no primeiro vaso de biorreator 410. Conforme mostrado aqui, as válvulas 434, 486, 488 e 432 são abertas e a bomba 456 atuada para circular a solução no primeiro vaso de biorreator 410 para fora da segunda porta 434, através da linha de interconexão, através da linha de filtragem 48 e filtro 484, através da primeira linha de biorreator 414 do primeiro vaso de biorreator 410 e de volta ao primeiro vaso de biorreator 410 através da primeira porta 412. Para retirar uma amostra, um segundo vaso de amostra 280b (por exemplo, um tubo de imersão, seringa, etc.) é conectado à segunda cauda de tubo de amostra 476b e a válvula 478b é aberta para desviar parte do fluxo através da linha de interconexão 450 para o segundo vaso de amostra 280b para análise.

[00199] Agora, em referência à Figura 64, e, dependendo da concentração obtida da amostra, a concentração pode ser realizada por meio da circulação do conteúdo do primeiro vaso de biorreator 410 através do filtro

484. Conforme discutido acima, isso é realizado por meio da abertura das válvulas 434, 486, 488 e 432 e da bomba de atuação 456, que ocasiona a circulação da solução no primeiro vaso de biorreator 410 da segunda porta 416, através da segunda linha de biorreator 418, através da linha de interconexão 450, através da linha de filtragem 482 e filtro 484, através da primeira linha de biorreator 414 do primeiro vaso de biorreator 410 e de volta ao primeiro vaso de biorreator 410 através da primeira porta 412. À medida que o fluido atravessa o filtro 484, os resíduos são removidos e a bomba de permeado 492 bombeia esses resíduos para o reservatório de resíduos 472c do segundo conjunto de fluido 444 através da linha de resíduos 490. Em uma modalidade, esse procedimento é repetido até que o volume no primeiro vaso de biorreator 410 seja concentrado até um volume predeterminado.

[00200] Voltando à Figura 65 após concentração, a população celular concentrada no vaso de ativação (isto é, primeiro vaso 410 contendo uma população celular concentrada) é lavada em volume constante por perfusão. Em particular, como mostrado aqui, o meio de um saco de meio 466b do primeiro conjunto de fluido 440 é bombeado para o primeiro vaso de biorreator 410 através da primeira porta 412 através da linha de interconexão 450 ao mesmo tempo em que o meio é bombeada para fora do primeiro vaso de biorreator 410 através da segunda porta 416, de modo que um volume constante seja mantido no primeiro vaso de biorreator 410. À medida que o meio é adicionado e removido do recipiente 410, os resíduos podem ser

7T7T/110 filtrados pelo filtro 484 e direcionados para o reservatório de resíduos 472c.

[00201] Uma amostra pós-lavagem pode ser retirada das células no primeiro vaso de biorreator 410 de uma maneira similar àquela descrita anteriormente para a amostragem pré-concentração. Em particular, conforme mostrado na Figura 66, as válvulas 434, 486, 488 e 432 são abertas e a bomba 456 atuada para circular o fluido no primeiro vaso de biorreator 410 para fora da segunda porta 434, através da linha de interconexão, através da linha de filtragem 48 e filtro 484, através da primeira linha de biorreator 414 do primeiro vaso de biorreator 410 e de volta ao primeiro vaso de biorreator 410 através da primeira porta 412. Para retirar uma amostra, um terceiro vaso de amostra 280c (por exemplo, um tubo de imersão, seringa, etc.) é conectado à terceira cauda de tubo de amostra 476c e a válvula 478c é aberta para desviar parte do fluxo através da linha de interconexão 450 para o terceiro vaso de amostra 280c para análise.

[00202] Conforme mostrado na Figura 67, um saco contendo um vetor viral descongelado é conectado ao primeiro conjunto de fluido 440, como através da cauda de tubulação 464c. As válvulas 468c e 436 são, então, abertas e a bomba 454 atuada para transferir a solução de revestimento de vetor viral do saco 466c para o segundo vaso de biorreator 420 através da primeira porta 422. A incubação é, então, realizada por um período de tempo predeterminado, para revestimento de vírus do segundo vaso de biorreator

420. Após a incubação, a solução de revestimento do vetor viral é drenada do segundo vaso de biorreator 420 para o reservatório de resíduos 472a, por meio da abertura das válvulas 438 e 474a e da atuação da bomba de linha de circulação 456. Em modalidades, vetores virais e não virais podem ser utilizados como agentes para transdução/modificação genética.

[00203] Conforme ilustrado na Figura 68, após o segundo vaso de biorreator 420 ser revestido com o vetor viral, as células pós-lavagem do primeiro vaso de biorreator 410 são transferidas para o segundo vaso de biorreator 420 para transdução/modificação genética. Em particular, as válvulas 434, 452 e 436 são abertas e a bomba de linha de circulação 456 é atuada para bombear as células para fora do primeiro vaso de biorreator 420 através da segunda porta 416 do primeiro vaso de biorreator 410, através da linha de interconexão 450, para o primeiro linha de biorreator 424 do segundo vaso de biorreator 420 e no segundo vaso de biorreator 420 através da primeira porta 422 do segundo vaso de biorreator 420.

[00204] O meio do saco de meio 466b é, então, adicionado ao segundo vaso de biorreator 420, por meio da abertura das válvulas 468b e 436 e da atuação da bomba 454 para aumentar o volume total da solução no segundo vaso de biorreator 420 para um volume predeterminado, como ilustrado na Figura 69. Em referência à Figura 70, uma amostra de pré-transdução pode, então, ser tomada por meio da abertura das válvulas 438, 452 e 436 e da atuação da bomba de linha de circulação 456 para bombear a solução no segundo vaso de biorreator 420 ao longo de uma alça de circulação do segundo vaso de biorreator (isto é, fora da segunda porta 426, através da linha de interconexão 450, e de volta ao segundo vaso de biorreator 420 através da primeira linha de biorreator 414 e da primeira porta 422 do segundo vaso de biorreator 420). Para retirar uma amostra, um quarto vaso de amostra 280e (por exemplo, um tubo de imersão, seringa, etc.) é conectado à quarta cauda de tubo de amostra 476e€ e a válvula 478e é aberta para desviar parte do fluxo através da linha de interconexão 450 para o quarto vaso de amostra 280e para análise.

[00205] Se a análise da quarta amostra tomada indicar que todos os parâmetros estão dentro de faixas predeterminadas necessárias para uma transdução bem-sucedida, a população de células dentro do segundo vaso de biorreator 420 é incubada por um período de tempo predeterminado para a transdução da população de células em solução, como ilustrado na Figura 71. Por exemplo, em uma modalidade, a população de células no segundo vaso de biorreator 420 pode ser incubada por 24 horas para transdução.

[00206] Em referência à Figura 72, após a transdução, o meio é adicionado ao segundo vaso de biorreator 420 para alcançar um volume de expansão predeterminado no segundo vaso de biorreator 420. Conforme mostrado aqui, para adicionar meio, as válvulas 468b e 436 são abertas e a bomba 454 é atuada para bombear meio de crescimento/perfusão do saco de meio 466b para o segundo vaso de biorreator 420 através da primeira porta 422 do segundo vaso de biorreator até que o volume de expansão predeterminado seja atingido.

[00207] Conforme ilustrado na Figura 73, uma amostra de pré- expansão pode, então, ser tomada por meio da abertura das válvulas 438, 452 e 436 e da atuação da bomba de linha de circulação 456 para bombear a solução no segundo vaso de biorreator 420 ao longo da alça de circulação do segundo vaso de biorreator 420, conforme indicado acima (isto é, fora da segunda porta 426, através da linha de interconexão 450, e de volta ao segundo vaso de biorreator 420 através da primeira linha de biorreator 414 e da primeira porta 422 do segundo vaso de biorreator 420). Para retirar uma amostra, um quinto vaso de amostra 280e (por exemplo, um tubo de imersão, seringa, etc.) é conectado à quinta cauda de tubo de amostra 476e e a válvula 478e é aberta para desviar parte do fluxo através da linha de interconexão 450 para o quinto vaso de amostra 280e para análise.

[00208] Se a análise da quinta amostra tomada indicar que todos os parâmetros estão dentro de faixas predeterminadas necessárias para uma expansão bem-sucedida da população de células, a população de células dentro do segundo vaso de biorreator 420 é incubada por um período predeterminado de tempo, por exemplo, 4 horas, para deixar as células assentarem.

[00209] Posteriormente a esse período de incubação ou em um tempo predeterminado posterior, a perfusão a uma taxa de 1 volume por dia (1x perfusão) é realizada por meio do bombeamento do meio do saco de meio 466b para o segundo vaso de biorreator 420 pela primeira porta 422 ao mesmo tempo que meio gasto/usado é bombeado para fora do segundo vaso de biorreator 420 através da segunda porta 426 (e através da linha de interconexão 450 para o reservatório de resíduos 472a), como mostrado na Figura 74. Essa perfusão é realizada por meio da abertura das válvulas 468Db, 436, 438 e 474a e da atuação da primeira bomba 454 e da bomba de linha de circulação 456. Durante essa 1x perfusão, o meio do saco de meio 466b é introduzido no segundo vaso de biorreator 420 a uma taxa substancialmente igual àquela do meio conforme usado é removido do segundo vaso de biorreator 420 e enviado ao lixo, para manter um volume substancialmente constante dentro do segundo vaso de biorreator 420.

[00210] A amostragem pode, então, ser realizada conforme necessário/desejado para monitorar o processo de expansão e/ou para determinar quando uma densidade celular desejada é atingida. Como discutido acima, as amostras podem ser retiradas por meio da abertura das válvulas 438, 452 e 436 e da atuação da bomba de linha de circulação 456 para bombear a solução no segundo vaso de biorreator 420 ao longo da alça de circulação do segundo vaso de biorreator 420, como indicado acima (ou seja, fora da segunda porta 426, através da segunda linha de biorreator 428, através da linha de interconexão 450 e de volta para o segundo vaso de biorreator 420 através da primeira linha de biorreator 424 e primeira porta 422 do segundo vaso de biorreator 420). Para retirar uma amostra, outro vaso de amostra 280x (por exemplo, um tubo de imersão, seringa, etc.) é conectado a uma cauda de tubulação de amostra do conjunto de amostras 448 e uma válvula da cauda de tubulação é aberta para desviar parte do fluxo através da linha de interconexão 450 ao vaso de amostra 280x para análise, como mostrado na Figura 75. Após cada operação de amostragem, a incubação sem perfusão é realizada por um período de tempo predeterminado, por exemplo,

quatro horas, para permitir que as células se assentem antes de reiniciar a perfusão.

[00211] Conforme mostrado na Figura 76, posteriormente a esse período de incubação, a perfusão a uma taxa de 1 volume por dia (1x perfusão) é realizada por meio do bombeamento do meio do saco de meio 466b para o segundo vaso de biorreator 420 pela primeira porta 422 ao mesmo tempo que meio gasto/usado é bombeado para fora do segundo vaso de biorreator 420 através da segunda porta 426 (e através da linha de interconexão 450 para o reservatório de resíduos 472a), como mostrado na Figura 74. Essa perfusão é realizada por meio da abertura das válvulas 468b, 436, 438 e 474a e da atuação da primeira bomba 454 e da bomba de linha de circulação 456.

[00212] Quando a amostragem indica uma densidade celular viável (VCD) de um valor limite predeterminado (por exemplo, 5 mm/ml), a perfusão a uma taxa de 2 volumes por dia (2x perfusão) é realizada por meio do bombeamento do meio do saco de meio 466b para o segundo vaso de biorreator 420 através da primeira porta 422 ao mesmo tempo que o meio gasto/usado é bombeado para fora do segundo vaso de biorreator 420 através da segunda porta 426 (e através da linha de interconexão 450 para o reservatório de resíduos 472a), como mostrado na Figura 76. Essa perfusão é realizada por meio da abertura das válvulas 468b, 436, 438 e 474a e da atuação da primeira bomba 454 e da bomba de linha de circulação 456. Durante essa 2x perfusão, o meio do saco de meio 466b é introduzido no segundo vaso de biorreator 420 a uma taxa substancialmente igual àquela do meio conforme usado é removido do segundo vaso de biorreator 420 e enviado ao lixo, para manter um volume substancialmente constante dentro do segundo vaso de biorreator 420.

[00213] Finalmente, com referência à Figura 77, depois que uma densidade celular viável desejada é alcançada, as células podem ser recolhidas por meio da abertura das válvulas 438 e 474e e da atuação da bomba de linha de circulação 456. A população expandida de células é, então, bombeada para fora do segundo vaso de biorreator 420 através da segunda porta 426, através da linha de interconexão 450 e para um saco de coleta 472e conectada à cauda de tubulação 470e do segundo conjunto de tubulação 444. Estas células podem, então, ser formuladas de uma maneira até agora conhecida na técnica para entrega e infusão em um paciente.

[00214] O segundo módulo 200 do sistema de bioprocessamento 10 e a arquitetura de fluxo 400 e os vasos de biorreator 410, 420, portanto, proveem uma plataforma flexível na qual uma variedade de operações de bioprocessamento pode ser realizada de uma maneira substancialmente automatizada e funcionalmente fechada. Em particular, embora as Figuras 53 a 77 ilustrem um protocolo genérico exemplificador que pode ser realizado com o uso do sistema de bioprocessamento 10 da invenção (particularmente, usando o segundo módulo 200), o sistema não é tão limitado a esse respeito. De fato, vários protocolos automatizados podem ser ativados pelo sistema da invenção, incluindo vários protocolos específicos do cliente.

[00215] Ao contrário dos sistemas existentes, o segundo módulo 200 do sistema de bioprocessamento 10 é um sistema automatizado funcionalmente fechado que abriga o primeiro e o segundo vasos de biorreator 410, 420 e os sistemas de manuseio e contenção de fluidos, todos mantidos em condições ambientais favoráveis à cultura celular (isto é, dentro de um ambiente controlado por temperatura e gás) para permitir a ativação, transdução e expansão celular. Conforme discutido acima, o sistema inclui carregamento automatizado de kits e capacidade de amostragem fechada. Nessa configuração, o sistema permite todas as etapas de ativação, transdução, expansão, amostragem, perfusão e lavagem de células imunes em um único sistema. Também provê ao usuário a flexibilidade de combinar todas as etapas em um único vaso de biorreator (por exemplo, primeiro vaso de biorreator 410) ou usar ambos os vasos de biorreator 410, 420 para ativação e lavagem de ponta a ponta. Em uma modalidade, um único vaso de biorreator de expansão (por exemplo, vaso de biorreator 420) tem a capacidade de gerar de maneira robusta uma dose de bilhões de células T. Doses únicas ou múltiplas podem ser geradas in situ com alta recuperação e alta viabilidade. Além disso, o sistema foi projetado para dar ao usuário final a flexibilidade de executar diferentes protocolos para a fabricação de células imunes geneticamente modificadas.

[00216] Algumas das vantagens comerciais providas pelo sistema de bioprocessamento da invenção incluem tecnologia de fabricação robusta e escalável para comercialização de produtos, simplificando os fluxos de trabalho, reduzindo a intensidade da mão-de-obra, reduzindo a carga na infraestrutura da sala limpa, reduzindo os nós de falha, reduzindo os custos e a capacidade de aumentar a escala de operações.

[00217] Como discutido acima em conexão com o fluxo de trabalho genérico, o sistema da invenção, o sistema de bioprocessamento 10 e a arquitetura de fluxo 400 e os vasos de biorreatores 410, 420 do segundo módulo 200 proveem concentração de cultura, lavagem, perfusão lenta, perfusão rápida, e processos de perfusão “round robin' a serem executados de maneira automatizada e funcionalmente fechada. Por exemplo, como discutido acima, a bomba 456 na linha de interconexão 450 pode ser usada para circular o fluido de uma das portas do biorreator através da linha de filtragem 482 e filtro 484 e, então, de volta para outra porta no biorreator, durante a operação a bomba de permeado 492 (tipicamente em uma porcentagem da bomba de circulação 456, como por exemplo, cerca de 10%], em uma etapa de concentração. A concentração pode ser executada em malha aberta ou pode ser interrompida com base em um volume medido removido do biorreator ou em um volume medido acumulado nos resíduos. Em uma modalidade, o filtro, as velocidades da bomba, a área do filtro, o número de

84 /110 lúmens, etc. são todos dimensionados adequadamente para o número total de células e a densidade de células alvo para limitar a incrustação e a perda excessiva de células devido ao cisalhamento.

[00218] Em uma modalidade, e como discutido acima, o sistema da invenção também pode ser usado para lavar, por exemplo, para remover resíduos como o vetor viral restante após a incubação. A lavagem envolve as mesmas etapas descritas acima para a concentração, exceto a bomba 454 na primeira linha de montagem de fluido 442 é usada para bombear em meios de cultura adicionais para substituir o fluido bombeado da bomba de resíduos de permeado 492. A taxa de introdução de novo meio pode corresponder à taxa de remoção de fluido pela bomba de permeado 492. Isso permite que um volume constante seja mantido no vaso do biorreator e os resíduos podem ser removidos exponencialmente com o tempo, desde que o conteúdo do biorreator seja bem misturado (a circulação pode ser suficiente). Em modalidades, esse mesmo processo pode ser utilizado após a ativação para a lavagem com base em filtração de fibra oca no local da suspensão de células para remover resíduos. Para superfícies revestidas e não revestidas, a lavagem do reagente de ativação solúvel também pode ser realizada por perfusão baseada em filtro.

[00219] Como também discutido acima, a bomba 454 na primeira linha de montagem de fluido 442 pode ser usada para adicionar meio a um determinado vaso de biorreator, enquanto a bomba 456 na linha de interconexão 450 é usada para mover o meio usada para o saco de resíduos no segundo fluido montagem, em processo de perfusão. Em uma modalidade, a gravidade pode ser usada para assentar as células, e o meio gasto pode ser bombeado para fora a uma velocidade tal que não perturbe significativamente as células dentro do vaso do biorreator. Esse processo pode envolver a operação das bombas 454 e 456 de malha aberta na mesma taxa. Em uma modalidade, uma bomba (454 ou 456) pode ser acionada a uma taxa definida,

85 /110 e a taxa da outra bomba pode ser ajustada com base na massa/volume do vaso de biorreator ou na massa/volume do saco de resíduos (ou a massa/volume de um saco de origem medida).

[00220] Em conexão com o disposto acima, é contemplado que o controle da bomba possa ser baseado em uma medição de peso dos vasos do biorreator (usando a retroalimentação das células de carga 760). Por exemplo, a configuração do sistema permite a calibração imediata da bomba com base nas leituras da célula de carga, permitindo que o sistema acomode automaticamente alterações no desempenho do tubo/bomba ao longo do tempo. Além disso, este método pode ser usado para controle de malha fechada em uma taxa de variação de massa (volume) ao esvaziar ou encher um vaso de biorreator.

[00221] A Figura 81 ilustra uma modalidade exemplificadora de um método 480 de uso do segundo módulo 200 em um processo de perfusão. O método 480 inclui ativar uma primeira bomba 454 para bombear meio fresco para o vaso de biorreator 410 contendo uma população geneticamente modificada de células, em 482, ativar uma segunda bomba 456 para bombear meio usado do vaso de biorreator 410 para um saco de resíduos 472a, em 484, adquirindo dados de massa relacionados a uma massa do vaso de biorreator (por exemplo, vaso de biorreator 410) com o uso das células de carga associadas à placa do leito, em 486, determinando se a massa do vaso de biorreator 410 mudou ou permanece substancialmente constante, em 488, e se a massa do vaso de biorreator mudou, ajustando um parâmetro operacional de pelo menos uma da primeira bomba e a segunda bomba para manter uma massa substancialmente constante do vaso de biorreator 410, em 490. Por exemplo, se for determinado que a massa do vaso de biorreator 410 diminuiu, isso indica que o meio gasto está sendo removido do vaso de biorreator a uma taxa maior que a taxa de adição de meio fresco ao vaso de biorreator. Por conseguinte, e em resposta, a taxa de fluxo da primeira bomba pode ser aumentada e/ou a taxa de fluxo da segunda bomba pode ser diminuída para manter uma massa (e volume) substancialmente constante no vaso do biorreator 410. Dados de massa adicionais podem, então, ser adquiridos e ajustes adicionais na operação da bomba são realizados, se necessário, para manter uma massa/volume substancialmente constante no vaso de biorreator

410. Se a massa for determinada como substancialmente constante após algum período de tempo de operação da primeira e segunda bombas, as bombas podem ser mantidas em seus pontos de ajuste operacionais atuais (por exemplo, taxas de fluxo), como mostrado em 492.

[00222] Em outra modalidade, o sistema de bioprocessamento permite a perfusão do tipo round-robin dos vários vasos de biorreator no sistema com o uso da arquitetura de fluxo 400. Por exemplo, a bomba de circulação 456 e a bomba 545 ao longo da primeira linha de montagem de fluido 442 são usadas para perfundir células dentro do primeiro vaso de biorreator 410 em conjunto com os estados apropriados da válvula de diafragma, como descrito acima. A perfusão das células dentro do primeiro vaso de biorreator 410 pode então ser interrompida ou pausada e, então, a bomba de circulação 456 e a bomba 454 e as válvulas de diafragma apropriadas podem ser acionadas para perfundir células dentro do segundo vaso de biorreator 420. Nesse aspecto, a perfusão dos vários biorreatores pode ser realizada sequencialmente (isto é, a perfusão do primeiro vaso de biorreator 410 por um período de tempo, depois a perfusão do segundo vaso de biorreator 420 por um período de tempo, de maneira repetitiva e alternada). Isso permite a perfusão de qualquer número de vasos de biorreator no sistema sem exigir o uso de mais bombas, sacos de meio ou sacos de resíduo.

[00223] Com a perfusão do tipo round-robin, as bombas podem funcionar continuamente, podem funcionar intermitentemente juntas (ciclo de serviço) ou podem funcionar sequencialmente (origem, depois resíduo, repetir), de modo a manter o volume/massa nos vários vasos do biorreator cerca do mesmo nível. A perfusão do tipo round-robin (acionar intermitentemente o conjunto de bombas e aguardar um intervalo de tempo) também permitiria a perfusão de vários vasos com o uso das mesmas duas bombas, conforme indicado. Além disso, a perfusão do tipo round-robin permite uma taxa de câmbio efetiva mais baixa (como cerca de 1 VoFday), mesmo que as bombas não possuam um ótimo intervalo dinâmico low-end. Além disso, a perfusão do tipo round-robin também permite que cada vaso seja perfundido com meio diferente conforme controlado pelas válvulas no primeiro conjunto de fluido 440.

[00224] Além disso, em uma modalidade, a perfusão rápida pode ser usada para remoção residual (por exemplo, para remoção de Ab pós-ativação e/ou remoção residual pós-transdução). Em um processo de perfusão rápida, o processo de perfusão descrito acima pode ser executado muito mais rápido que os 1 a 5 volumes/dia típicos, como, por exemplo, entre 8 a 20 volumes/dia ou mais que 20 volumes/dia para obter uma redução de 1 log em questão de minutos a horas. Em uma modalidade, a taxa de perfusão é equilibrada contra a perda de células. Em algumas modalidades, a perfusão rápida pode permitir a eliminação do filtro oco 484 e ainda atender aos imperativos biológicos da remoção rápida de resíduos após certas etapas.

[00225] Como descrito acima, o sistema da invenção facilita a lavagem de um saco/ reservatório conectado ao primeiro conjunto de fluido 440 com o uso de um tampão de enxágue ou fluido de outro saco/reservatório conectado ao segundo conjunto de fluido 444 com o uso da bomba 454 na primeira linha de conjunto de fluido 442. Além disso, as linhas de fluido da arquitetura/sistema de fluxo 400 podem ser limpas com ar estéril da fonte de ar estéril 458 para impedir que as células fiquem nas linhas e morram ou para impedir que o meio ou reagentes fiquem nas linhas e degradem ou se tornem utilizados. A fonte de ar estéril 458 também pode ser usada para limpar os reagentes das linhas, de modo a garantir que nenhum reagente seja bombeado para os vasos de biorreator 410, 420 do que o pretendido. A fonte de ar estéril 458 também pode ser usada para limpar linhas até o saco conectado (do primeiro ou segundo conjunto de fluido 440, 444) para limpar a soldagem de tubo estéril para limitar a transferência. Alternativamente, ou além de limpar as linhas com o uso da fonte de ar estéril 458, as linhas podem ser limpas com o uso do ar puxado de um dos vasos do biorreator, desde que a porta pela qual o ar é puxado não esteja imersa e o vaso do biorreator tenha uma porta de equilíbrio de ar 530.

[00226] Como discutido acima, o sistema permite a gaveta fechada, em processo de amostragem do conteúdo do vaso (ou vasos) do biorreator. Durante a amostragem, o vaso do qual a amostra deve ser puxada pode ser agitado com o uso dos braços de came 762, por meio da circulação do conteúdo do recipiente com o uso da bomba de linha de circulação 456 e com o uso do conjunto de amostragem 448 para retirar uma amostra da linha de interconexão 450 . Em uma modalidade, apenas células não ligadas à microesfera podem ser agitadas.

[00227] Como também discutido acima, o sistema da invenção permite que a população de células seja coletada após a obtenção de uma densidade celular alvo. Em uma modalidade, a coleta da população expandida de células transduzidas pode incluir células em movimento para uma das sacos conectados ao segundo conjunto de fluido 444 com o uso da bomba 456 na linha de interconexão 450 ou por meio da circulação das células com a bomba de interconexão 456 para mover as células para um saco conectado ao primeiro conjunto de fluido 440. Esse processo pode ser usado para coleta final ou para um grande volume de amostra ou para automatizar completamente o processo de amostragem (por exemplo, conectando uma seringa ou saco ao primeiro conjunto de fluido 440, circulando o conteúdo do vaso do biorreator e puxando uma porção de um volume de amostra desejado a partir do conteúdo circulado com a bomba de montagem de fluido 454 e movendo-se em direção à seringa/saco). Nesse caso, a bomba de circulação 456 e as válvulas podem, então, ser usadas para limpar as linhas de circulação de fluido/células. Além disso, a bomba 454 na primeira linha de montagem de fluido 442 pode ser usada para continuar a empurrar todo o volume de amostra aliquotado para o recipiente de amostra, com o uso do ar na linha para concluir a transferência de amostra para o recipiente sem uma quantidade reconhecível de células restantes nas linhas.

[00228] Enquanto as modalidades descritas acima descrevem um fluxo de trabalho em que a ativação de células é realizada em um primeiro vaso de biorreator e as células ativadas são transferidas para o segundo vaso de biorreator para transdução e expansão, em uma modalidade, o sistema da invenção pode permitir a ativação e operações de transdução a serem realizadas em um primeiro vaso de biorreator e expansão das células geneticamente modificadas realizadas em um segundo vaso de biorreator. Além disso, em uma modalidade, o sistema da invenção pode permitir o processamento in situ de células T isoladas, em que as operações da unidade de ativação, transdução e expansão são todas realizadas dentro de um único vaso de biorreator. Em uma modalidade, a invenção simplifica o protocolo existente, permitindo um vaso de ativação, transdução e expansão “one-pot' simplificada e fácil de automação.

[00229] Em tal modalidade, o ativador de células T pode ser Dynabeads do tamanho de um mícron e um vetor lentiviral é usado para transdução. Em particular, conforme aqui descrito, Dynabeads do tamanho de um mícron servem ao duplo objetivo de isolar e ativar células T. Em uma modalidade, a ativação (e isolamento) das células T pode ser realizada em um dos vasos de biorreator 410 com o uso de Dynabeads da maneira indicada acima. Posteriormente, as células ativadas são transduzidas por vírus para modificação genética, como na maneira descrita acima em conexão com as Figuras 60 a 71. Após a ativação e a transdução viral, o vírus pode então ser lavado para fora do vaso de biorreator 410 com o uso do método de perfusão sem filtro descrito acima que retém as células e as Dynabeads do tamanho de um mícron no vaso de biorreator 410. Isso permite a expansão celular no mesmo vaso de biorreator 410 que é usado para ativação e transdução. O método de perfusão sem filtro também permite que a lavagem da cultura ocorra sem a necessidade de primeiro imobilizar as microesferas de ativação que precisam ser retidas juntamente com as células durante a expansão. Em particular, quando o vírus é eliminado, as Dynabeads do tamanho de um mícron não são fluidizadas na taxa de perfusão lenta e são retidas no vaso. Partículas virais do tamanho de nanômetros e macromoléculas residuais são fluidizadas durante a perfusão lenta e são lavadas.

[00230] Em uma modalidade, após a expansão, as células podem ser recolhidas da maneira descrita acima em conjunto com a Figura 77. Após o recolhimento, pode ser utilizado um processo de desbaste magnético para remover as Dynabeads das células coletadas. Em outras modalidades, as etapas de recolhimento da população expandida de células e de separação das células são realizadas simultaneamente com o uso de perfusão, em que o meio de cultura é introduzido através de uma porta de alimentação no vaso de biorreator enquanto o meio de cultura de células, incluindo a população expandida de células, é removido o vaso de biorreator através de uma porta de drenagem no vaso de biorreator. Em particular, quando é requerida uma dissociação final da cultura, a perfusão sem filtro pode ser usada para dissolver as esferas do tamanho de mícrons, aproveitando a diferença de peso das células e dos complexos célula-Dynabead. Para debrear a cultura, todo o conteúdo do vaso de biorreator seria misturado (com o uso, por exemplo, dos braços de came 762 do mecanismo do atuador da maneira descrita acima). Após mistura/agitação, as Dynabeads pesadas afundariam e assentariam na membrana de silício 516 dentro de 10 a 15 minutos. Em contraste, as células precisam de mais de 4 horas para se acomodar sobre a membrana 516. Após um período de espera de 10 a 15 minutos após a mistura/agitação, a suspensão celular pode ser retirada lentamente com o uso de perfusão sem perturbar as Dynabeads assentadas. A linha média de entrada pode ser usada para manter a altura média do leito dentro do vaso de biorreator. Assim, a invenção aqui descrita simplifica o protocolo atual de Dynabeads, eliminando a necessidade de várias transferências de células no meio do processo e etapas discretas de lavagem e desbaste e minimiza custos e riscos potenciais. Mediante a remoção de microesferas da cultura ao mesmo tempo em que o recolhimento das células, a necessidade de dispositivos magnéticos ou descartáveis adicionais, que normalmente são necessários, pode ser eliminada.

[00231] Ao contrário de outros sistemas de cultura estáticos, livres de perfusão, o vaso de biorreator à base de membrana permeável aos gases 410 da invenção suporta cultura de células de alta densidade (por exemplo, até 35 mm/cm?). Assim, todos os quatro processos unitários de ativação com o uso de Dynabeads, transdução, lavagem e expansão podem ser realizados no mesmo vaso de Dbiorreator, de maneira totalmente automatizada e funcionalmente fechada. O sistema de bioprocessamento da invenção simplifica, portanto, o protocolo atual, eliminando a necessidade de transferência de células no meio do processo e etapas de lavagem discretas, além de minimizar custos e riscos potenciais resultantes de vários pontos de contato humanos.

[00232] Em uma modalidade, os dois vasos de biorreator 410, 420 do sistema podem ser executados com a mesma cultura inicial ou duas culturas divididas simultâneas, por exemplo, células CD4+ em um vaso de biorreator 410 e células CD8+ no outro vaso de biorreator 420. Uma cultura dividida permite o processamento paralelo independente e a expansão de dois tipos de células que podem ser combinados antes da infusão no paciente.

[00233] Embora vários fluxos de trabalho CAR-T possíveis para a geração e expansão de células geneticamente modificadas com o uso do sistema de bioprocessamento da invenção tenham sido descritos acima, os fluxos de trabalho aqui descritos não pretendem ser abrangentes, pois outros fluxos de trabalho CAR-T também são habilitados pelo sistema da invenção. Além disso, embora o sistema da invenção e, em particular, o segundo módulo 200 do sistema, tenha sido descrito em conexão com a fabricação de células CAR-T, o sistema da invenção também é compatível com a fabricação de outras células imunes, como células TCR-T e células NK. Ademais, enquanto modalidades da invenção descrevem o uso dos dois vasos de biorreator 410, 420 em um processo sequencial de duas etapas em que a saída do primeiro vaso de biorreator 410 é adicionada ao segundo vaso de biorreator 420 para etapas de processamento adicionais (por exemplo, ativação no primeiro vaso de biorreator e transdução e expansão no segundo vaso de biorreator), em algumas modalidades, os dois vasos de biorreator podem ser usados para fluxos de trabalho idênticos em duplicado. Razões exemplificadoras para o uso sequencial de um segundo vaso de biorreator podem incluir modificações químicas residuais (por exemplo, revestimentos ou reagentes imobilizados) que não podem ser lavadas do primeiro biorreator que são prejudiciais em etapas posteriores ou se a superexposição de células ocorrer em etapas anteriores ou uma necessidade pré-revestir uma superfície de Dbiorreator antes da adição de células (por exemplo, revestimento RetroNectin).

[00234] Exemplos adicionais de fluxos de trabalho potenciais de vasos únicos de biorreator que são ativados pelo sistema da invenção incluem (1) ativação de ativador solúvel, transdução viral, perfusão sem filtro e expansão em um único vaso de biorreator, (2) ativação baseada em Dynabead, transdução viral, perfusão sem filtro e expansão em um único vaso de biorreator e (3) ativação baseada em microesferas TransAct, transdução viral, perfusão e expansão sem filtro em um único vaso.

[00235] Além disso, outros exemplos de fluxos de trabalho potenciais de múltiplos vasos de biorreatores que são ativados pelo sistema da invenção incluem (1) ativação de ativador solúvel, transdução viral, perfusão e expansão sem filtro no primeiro vaso de biorreator 410 e ativação de ativador solúvel, transdução Lentiviral, perfusão sem filtro e expansão no segundo vaso de biorreator 420, usar tipos de células idênticas ou culturas divididas nos dois vasos de biorreator; (2) ativação baseada em Dynabead, transdução viral, perfusão e expansão sem filtro no primeiro vaso de biorreator 410 e ativação baseada em Dynabead, transdução lentiviral, perfusão e expansão sem filtro no segundo vaso de biorreator 420, usar tipos celulares idênticos ou culturas divididas em os dois vasos de biorreator; (3) ativação baseada em microesferas TransAct, transdução viral, perfusão sem filtro e expansão no primeiro vaso de biorreator 410 e ativação baseada em TransAct, transdução lentiviral, perfusão e expansão sem filtro no segundo vaso de biorreator 420, usar tipos celulares idênticos ou culturas divididas nos dois vasos de biorreator; (4) ativação do ativador solúvel no primeiro vaso de biorreator 410 e revestimento, transdução e expansão de RetroNectin no segundo vaso de biorreator 420; (5) ativação do ativador imobilizado no primeiro vaso de biorreator 410 e revestimento, transdução e expansão de RetroNectin no segundo vaso de biorreator 420; (6) ativação de Dynabead no primeiro vaso de biorreator 410 e revestimento, transdução e expansão de RetroNectin no segundo vaso de biorreator 420; d) ativação de Dynabead e transdução lentiviral no primeiro vaso de biorreator 410 e expansão no segundo vaso de biorreator 420; (8) ativação TransAct no primeiro vaso de biorreator 410 e revestimento RetroNectin, transdução e expansão no segundo vaso de biorreator 420; (9) ativação de ativador solúvel no primeiro vaso de biorreator 410 e expansão de células eletroporadas ex situ ou outras células modificadas não virais no segundo vaso de biorreator 420; (10) ativação TransAct no primeiro vaso de biorreator 410 e expansão de células eletroporadas ex situ ou outras células modificadas não virais no segundo vaso de biorreator 420; (11)

ativação de Dynabead no primeiro vaso de biorreator 410 e expansão de células eletroporadas ex sifu ou outras células modificadas não virais no segundo vaso de biorreator 420; (12) expansão de células NK alogênicas no primeiro vaso de biorreator 410 e expansão de células NK alogênicas no segundo vaso de biorreator 420 (expansão baseada em moléculas pequenas, sem modificação genética; (13) expansão de células NK alogênicas no primeiro vaso de biorreator 410 e expansão de células NK alogênicas no segundo vaso de biorreator 420 (expansão baseada em células alimentadoras, sem modificação genética); e (14) ativação de ativador solúvel, transdução viral, perfusão sem filtro e expansão de células CAR-NK alogênicas ou CAR- NK 92 no primeiro vaso de biorreator 410 e/ou no primeiro e segundo vasos de biorreator 410,420 (sem revestimento de RetroNectin e em que se usa Polybrene para auxiliar na transdução).

[00236] Embora as modalidades descritas acima ilustrem sensores de monitoramento de processo que são integrados aos vasos de biorreator e/ou à placa de leito (por exemplo, na membrana, integrada na membrana, na parede lateral do vaso, etc.), em outras modalidades, está contemplado que sensor adicional pode ser adicionado à arquitetura de fluido 400, por exemplo, ao longo das próprias linhas de fluxo de fluido). Esses sensores podem ser sensores compatíveis-descartáveis para monitorar parâmetros como pH, oxigênio dissolvido, condutividade de densidade/turbidez (sensor óptico) e viabilidade dentro dos fluidos circulados. Mediante a organização dos sensores no circuito de circulação (por exemplo, o circuito de circulação do primeiro vaso de biorreator e/ou o circuito de circulação do segundo vaso de biorreator), a construção do vaso pode ser simplificada. Adicionalmente, em algumas modalidades, os sensores ao longo da alça de circulação podem prover uma representação mais precisa do conteúdo do vaso quando circulados (em vez de medir quando as células estão estáticas dentro do vaso). Ainda mais, um sensor de taxa de fluxo (por exemplo, baseado em ultrassom)

pode ser adicionado ao circuito de fluxo para medir o desempenho do bombeamento e usado em conjunto com um algoritmo para corrigir os parâmetros de bombeamento, conforme necessário.

[00237] Como indicado acima, o primeiro e o terceiro módulos 100, 300 podem assumir qualquer forma de qualquer sistema ou dispositivo (ou dispositivos) conhecido na técnica que tenha a capacidade de enriquecer e isolar células, e recolher e/ou formular. A Figura 78 ilustra uma configuração possível de um dispositivo/aparelho 900 que pode ser usado no sistema de bioprocessamento 10 como o primeiro módulo 100, para enriquecimento e isolamento de células com o uso de vários tipos de esferas de isolamento magnético (incluindo, por exemplo, microesferas Miltenyi, microesferas Dynabeads e StemCell EasySep). Conforme mostrado aqui, o aparelho 900 inclui uma base 910 que abriga uma câmara de processamento centrífuga 912, um conjunto de bomba peristáltica de alta faixa dinâmica 914, um pequeno tubo de bomba de diâmetro interno 916 recebido pelo conjunto de bomba peristáltica, um coletor de torneira 918, sensores ópticos 920 e uma câmara de aquecimento-resfriamento-mistura 922. Conforme indicado abaixo, o coletor de torneira 918 provê um meio simples e confiável de interface de várias linhas de fluido ou gás usando, por exemplo, conexões luer. Em uma modalidade, a bomba 914 é classificada para prover taxas de fluxo tão baixas quanto cerca de 3 ml/min e tão altas quanto cerca de 150 ml/min).

[00238] Como mostrado adicionalmente na Figura 78, o aparelho 900 pode incluir um conjunto de cabide geralmente em forma de T 924 que se estende a partir da base 910 e inclui uma pluralidade de ganchos 926 para suspender uma pluralidade de recipientes ou sacos de processamento e/ou origem. Em uma modalidade, pode haver seis ganchos. Cada gancho pode incluir um sensor de peso integrado para detectar o peso de cada vaso/saco. Em uma modalidade, as sacos podem incluir um saco de origem de amostra 930, um saco de processo 932, um saco tampão de isolamento 934, um saco de lavagem 936, um primeiro saco de armazenamento 938, um segundo saco de armazenamento 940, um saco de resíduos pós-isolamento 942, um saco de lixo de lavagem 944, um saco de meio 946, um saco de liberação 948 e um saco de coleta 950.

[00239] O aparelho 900 é configurado para ser usado com, ou incluir, um suporte de isolamento de célula magnética 960, conforme aqui provido. O suporte de isolamento de célula magnética 960 pode ser removível acoplado a um gerador de campo magnético 962 (por exemplo, placas de campo magnético 964, 966). O suporte de isolamento de célula magnética 960 acomoda um elemento ou material de retenção magnética 968, como uma coluna de separação, matriz ou tubo. Em uma modalidade, o suporte de isolamento de célula magnética 960 pode ser construído como descrito no Pedido de Patente no de série U.S. 15/829.615, depositado em 1 de dezembro de 2017, que está aqui incorporado a título de referência na sua totalidade. O aparelho 900 pode estar sob controle de um controlador (por exemplo, controlador 110), operando de acordo com as instruções executadas por um processador e armazenadas na memória. Tais instruções podem incluir os parâmetros do campo magnético. Em uma modalidade, o aparelho 900 pode adicionalmente incluir uma seringa 952 que pode ser utilizada para a adição de microesferas, como discutido a seguir.

[00240] Voltando agora à Figura 79, é mostrado um protocolo genérico 1000 do aparelho 700. Como ilustrado, em uma primeira etapa 1010, o enriquecimento é realizado pela redução de plaquetas e plasma em uma amostra. Nas modalidades em que as Dynabeads são utilizadas como microesferas de isolamento magnético, uma etapa de lavagem 1012 para remover os resíduos na suspensão de Dynabead pode, então, ser realizada. Após o enriquecimento, as células são, então, transferidas para o saco de processo 932, na etapa 1014. Em algumas modalidades, uma porção das células enriquecidas pode ser armazenada em um primeiro saco de armazenamento 938, na etapa 1016, antes da transferência para o saco de processo 932. Na etapa 1018, as esferas de isolamento magnético são injetadas no saco de processo, como por meio do uso da seringa 952, na etapa

1020. Em uma modalidade, as microesferas de isolamento magnético são microesferas Miltenyi ou microesferas StemCell EasySep. Quando as Dynabeads são utilizadas, as Dynabeads lavadas da etapa 1012 são ressuspensas no saco de processo 932. Em uma modalidade, em vez de utilizar uma seringa, as microesferas de isolamento magnético podem ser alojadas em um saco ou vaso que está conectado ao sistema, e as microesferas podem ser arrastadas para o sistema pela bomba 914.

[00241] As microesferas e células no saco de processo 932 são, então, incubadas por um período de tempo, na etapa 1020. Nas modalidades em que as microesferas de isolamento magnético são microesferas nanodimensionadas Miltenyi, uma lavagem de sedimentação é realizada na etapa 1022 para remover o excesso de microesferas de tamanho nanométrico e uma porção das células ligadas a microesferas incubadas é armazenada no segundo saco de armazenamento 940, na etapa 1024. Após a incubação, as células ligadas a microesferas são isoladas com o uso de um ímã, por exemplo, placas de campo magnético 964, 966 do suporte de isolamento de célula magnética 960, na etapa 1026. As células residuais ligadas a microesferas são, então, enxaguadas e isoladas, na etapa 1028. Finalmente, nas modalidades em que Miltenyi ou Dynabeads são utilizadas, na etapa 1030, as células ligadas a microesferas isoladas são coletadas no saco de coleta 950. Nas modalidades em que as microesferas StemCell EasySep são utilizadas, a etapa adicional 1032 de liberação das células das microesferas para remover as microesferass e a etapa opcional 1034 de lavagem/concentração das células coletadas é realizada.

[00242] Uma descrição mais detalhada do protocolo genérico da Figura 79 que usa o aparelho 900 é descrita em mais detalhes abaixo, com referência específica à Figura 80, que é uma ilustração esquemática da arquitetura de fluxo 1100 do aparelho 900. Para começar, o processo de enriquecimento (etapa 1010) é iniciado transferindo o produto de aférese contido no saco de origem 930 e o tampão de lavagem do saco de tampão de lavagem 936 para a câmara 912 para lavagem com o uso de tampão de lavagem, a fim de reduzir a quantidade de plaquetas e soro. Nesse ponto, o material de origem enriquecido está localizado na câmara 912. Para iniciar o processo de isolamento, uma coluna de separação recebida pelo suporte de isolamento da célula magnética 960 é iniciada iniciando um fluxo de um tampão do saco de tampão de isolamento 934 para o saco de processo 932 através do coletor 918 e através da coluna para aplicação de prime na coluna.

[00243] Conforme descrito acima, em certas modalidades, como quando Dynabeads são utilizadas como esferas de isolamento magnético, uma etapa de lavagem (etapa 1012) é realizada para remover quaisquer resíduos no tampão de suspensão de microesferas. A etapa de lavagem inclui a injeção das microesferas com o uso da seringa 952 enquanto circula em uma alça de processo 1110 (por exemplo, do saco de processo 932, através do tubo peristáltico da bomba 914, através do coletor 918 e de volta ao saco de processo 932), a limpeza da alça de processo 1110 e, então, captura das microesferas fluindo o saco de processo 932 para o saco de resíduos de isolamento 942 enquanto o gerador de campo magnético 962 em “LIGADO”. Nas modalidades em que nenhuma lavagem é desejada, o saco de processo 932 é escoado para o saco de resíduos de isolamento 942 para garantir que o saco de processo 932 esteja desobstruído. Conforme usado aqui, no caso de um ímã permanente, LIGADO significa que o elemento ou material de retenção magnética 968 (por exemplo, a coluna de separação, matriz ou tubo) está na posição apropriada dentro do campo magnético. DESLIGADO significa que a seção da tubulação é removida do campo magnético.

[00244] Em seguida, as células enriquecidas na câmara de processamento 912 são transferidas para o saco de processo 932 (etapa 1014) e um tampão de isolamento do saco de tampão de isolamento 934 é puxado para dentro da câmara de processamento 912 para enxaguar a câmara 912 de quaisquer células restantes. Após a lavagem, o fluido é expelido para o saco de processo 932. Esse processo de lavagem pode ser repetido, conforme desejado. Depois que todas as células foram transferidas para o saco de processo 932, a câmara 912 é limpa puxando tampão do saco de tampão de isolamento 934 para dentro da câmara 912 e expelindo o fluido para o saco de origem 930. Esse processo de enxágue pode ser repetido, conforme desejado.

[00245] O conteúdo do saco de processo 932 pode então ser misturado circulando o conteúdo ao longo da alça de processo 1110, antes de limpar a alça de processo 1110 retornando todo o conteúdo ao saco de processo 932. Como indicado acima, em uma modalidade, uma porção das células enriquecidas pode ser armazenada nesse ponto mediante a transferência de uma porção do conteúdo do saco de processo 932 para o primeiro saco de armazenamento 938 (etapa 1016). A linha de processo 1112 e a primeira linha de saco de armazenamento 1114 podem então ser desobstruídas.

[00246] Nas modalidades em que a etapa de lavagem das microesferas não é utilizada, as microesferas são então injetadas na alça de processo 1110 com o uso da seringa 952 e a alça de processo 1110 é desobstruída (etapa 1018). Nas modalidades em que a etapa de lavagem das microesferas é utilizada, as microesferas são ressuspensas e circuladas através da alça de processo 1110 (etapa 1018) e da coluna 968, e a alça de processo é desobstruída através da coluna 968.

[00247] Conforme discutido acima, após a adição das microesferas de isolamento magnético, as células podem ser incubadas por um período de tempo (etapa 1020). Em uma modalidade, antes da incubação, o conteúdo do saco de processo 932 pode ser transferido para o segundo saco de armazenamento 940 e o segundo saco de armazenamento 940 é agitado (como usando a câmara de mistura de aquecimento e resfriamento 922). O conteúdo do segundo saco de armazenamento 940 é, então, transferido de volta para o saco de processo 932. O tampão do saco de tampão de isolamento 934 é, então, aspirado para a câmara de processamento 912 e o conteúdo da câmara é expelido para o segundo saco de armazenamento 940 e, então, transferido para o saco de processo 932 para enxaguar o segundo saco de armazenamento

940.

[00248] Em qualquer modalidade, as células são então incubadas juntamente com as microesferas de isolamento magnético, circulando as células ao longo da alça de processo 1110 por um tempo de incubação prescrito. Após a incubação, a alça de processo 1110 é desobstruída.

[00249] Conforme discutido acima, após a incubação, a etapa opcional de lavagem das microesferas em excesso (por exemplo, microesferas nanodimensionadas) pode ser realizada (etapa 1022). A lavagem do excesso de microesferas nanodimensionadas inclui iniciar um fluxo do saco de processo 932 para o segundo saco de armazenamento 940, arrastar o conteúdo do segundo saco de armazenamento 940 para a câmara de processamento 912, transferir o tampão do saco de tampão de isolamento 934 para o saco de processo 932, transferir o conteúdo do saco de processo 932 para o segundo saco de armazenamento 940 e puxar o conteúdo do segundo saco de armazenamento 940 para a câmara de processamento. As etapas do fluxo do saco de isolamento 934 para o saco de processo 932 e, então, para o segundo saco de armazenamento 940 podem ser repetidas conforme desejado para lavar as microesferas em excesso. Em uma modalidade, a câmara 912 pode, então, ser preenchida com tampão do saco de tampão de isolamento 934, iniciando a rotação da câmara 912 e expelindo o sobrenadante para o saco de resíduos 742. Essas etapas podem ser repetidas conforme desejado. Em uma modalidade, as células na câmara são expelidas para o saco de processo 932, o saco de tampão de isolamento 934 é puxado para a câmara 932 e a câmara é, então, expelida para o saco de processo 932. Esse processo também pode ser repetido conforme desejado. A mistura da alça do processo e a limpeza da alça do processo são realizadas.

[00250] Em algumas modalidades, uma porção da população de células incubadas pode ser armazenada no segundo saco de armazenamento 940 (etapa 1024). Para fazer isso, uma porção do conteúdo do saco de processo 932 pode ser transferida para o segundo saco de armazenamento 940 e, então, a linha de processo e a segunda linha de armazenamento 1116 são desobstruídas.

[00251] Em qualquer um dos processos descritos acima, após a incubação, as células ligadas às microesferas são isoladas com o uso dos ímãs 964, 966 (etapa 1026). Isso é realizado fluindo do saco de processo 932 para o saco de resíduos 942 enquanto o gerador de campo magnético 962 está “LIGADO”. Os resíduos residuais são limpos pelo bombeamento de tampão do saco de tampão de isolamento 934 para o saco de processo 932 e, então, bombeando do saco de processo 932 para o saco de resíduos 942 com o gerador de campo magnético 962 “LIGADO'.

[00252] Em uma modalidade, o enxágue sem ressuspensão pode ser realizado por meio do bombeamento do tampão do saco de tampão de isolamento 934 para o saco de processo 932, do enxágue da alça de processo 1110, da desobstrução da alça de processo 1110 e do fluxo do saco de processo 932 para o saco de resíduos 942 com o gerador de campo magnético 962 “LIGADO”'.

[00253] Em outra modalidade, o enxágue via ressuspensão pode ser realizado por meio do bombeamento de tampão do saco de tampão de isolamento 934 para o saco de processo 932 com o gerador de campo magnético 962 “DESLIGADO, da circulação na alça de processo 1110, da desobstrução da alça de processo, e do fluxo do saco de processo 932 para o saco de resíduos 942 com o gerador de campo magnético 962 “LIGADO”.

[00254] Em uma modalidade, o resíduo residual pode ser desobstruído por meio do bombeamento do tampão do saco de tampão de isolamento 934 para o saco de processo 932 e do fluxo do saco de processo 932 para o saco de resíduos 942 com o gerador de campo magnético 962 “LIGADO”.

[00255] Após lavagem e isolamento das células residuais ligadas a microesferas, as células isoladas ligadas a microesferas são, então, coletadas (etapa 1028). Quando as células ligadas a microesferas devem ser coletadas sem liberar as células das microesferas, em um método, o meio do saco de meio 946 é simplesmente bombeado através da coluna 968 para o saco de coleta 950 com o gerador de campo magnético 962 “DESLIGADO”. Em outro método, o tampão do saco de tampão de isolamento 934 é bombeado para o saco de processo 932 e o saco de processo 932 é, então, bombeado para o saco de coleta 950 com o gerador de campo magnético 962 “DESLIGADO'. Esse segundo método provê lavagem pós-isolamento. Em um terceiro método, o meio do saco de meio 946 é bombeado para o saco de processo 932 através da coluna 966 (se nenhuma lavagem pós-isolamento for necessária). Alternativamente, o tampão do saco de tampão de isolamento 934 é bombeado para o saco de processo 932 através da coluna 966 (se a lavagem pós-isolamento for desejada). Em qualquer um dos processos, o conteúdo do saco de processo 932 é, então, circulado na alça de processo 1110, a alça de processo 1110 é desobstruída retornando ao saco de processo 932 e o conteúdo do saco de processo 932 é bombeado para o saco de coleta 950 para coletar as células ligadas a microesferas.

[00256] Quando as células ligadas a microesferas devem ser coletadas após a liberação das células das microesferas, vários processos potenciais podem ser realizados. Por exemplo, em uma modalidade, as células/microesferas podem ser ressuspensas com o ímã “DESLIGADO' bombeando um tampão de liberação do saco 948 através da coluna para o saco de processo 932, circulando na alça de processo 1110 e limpando a alça de processo retornando o fluido para o saco de processo 932. Em seguida, a incubação e a coleta são realizadas com o ímã “LIGADO' por meio da incubação na alça de processo 1110, da desobstrução da alça de processo 1110, da coleta das células liberadas por meio do bombeamento do saco de processo 932 através da coluna 966 para o saco de coleta 950, do bombeamento tampão do saco de tampão de isolamento 934 para o saco de processo 932 e da coleta de resíduos por meio do bombeamento do conteúdo do saco de processo 932 através da coluna 966 para o saco de coleta 950. As microesferas liberadas (etapa 1032) podem, então, ser descartadas, com o ímã “DESLIGADO”, por meio do bombeamento de tampão do saco de tampão de isolamento 934 através da coluna 966 para o saco de processo 932, da circulação na alça de processo 1110, da desobstrução da alça de processo 1110 e do bombeamento do conteúdo do saco de processo 932 para o saco de resíduos 942.

[00257] Em conexão com o disposto acima, em uma modalidade, a lavagem/concentração (etapa 1034) pode ser realizada por meio do bombeamento do conteúdo do saco de coleta 950 para a câmara de processamento 912, do bombeamento do tampão do saco de tampão de isolamento 934 para o saco de processo 932, e da transferência do tampão do saco de processo 932 para a câmara de processamento 912. Os ciclos de lavagem podem, então, ser realizados por meio do preenchimento da câmara de processamento 912 com tampão de saco de tampão de isolamento 934, da rotação da câmara 912, da expulsão do sobrenadante para o saco residual 942, da repetição das etapas de centrifugação e expulsão, conforme desejado. Finalmente, a transferência das células para Oo saco coletor após a lavagem/concentração pode ser realizada por meio da transferência do meio do saco de meio 946 para o saco coletor 950, do bombeamento do conteúdo do saco coletor para a câmara de processamento 912, da expulsão do conteúdo da câmara 912 para o saco coletor 950 e, em seguida, da

104 /110 desobstrução manual da linha entre a câmara de processamento 912 e o saco coletor 950.

[00258] Em uma modalidade, um dos sacos, por exemplo, o saco de processo 932 pode incluir uma porta superior 1118 com um filtro para que o ar estéril possa ser introduzido no sistema (quando o saco de processo 932 estiver vazio) para limpar as linhas, conforme necessário, como nas várias etapas do processo discutidas acima. A desobstrução das linhas pode ser realizada como uma primeira etapa no processo de enriquecimento/isolamento e/ou durante o processo. Em uma modalidade, o ar do saco coletor 950 pode ser usado para desobstruir qualquer uma das linhas do sistema (por exemplo, o ar do saco coletor 950 pode ser usado para desobstruir a linha de processo 1112, então o ar na linha de processo 1112 pode ser usado para desobstruir a linha de tubulação desejada (ou seja, linhas 1114, 1116, etc.), preenchendo assim a linha de processo 1112 com líquido do saco de processo 932 e finalmente desobstruindo a linha de processo 1112 novamente com o uso de ar do saco coletor 950).

[00259] Em uma modalidade, o saco de processamento 932 pode ser moldado por sopro e ter um ângulo alto nos lados (tendo uma forma 3D com um saco de ar definido acima do nível do líquido) para limitar a pegajosidade de microesferas microdimensionadas às paredes laterais, particularmente durante a promoção prolongada de mistura durante incubação baseada em circulação.

[00260] Em uma modalidade, a seringa 952 permite a adição de pequenos volumes (como alíquotas de suspensão de microesferas) à alça de fluxo baseado em circulação 1110. Em uma modalidade, a seringa 952 permite a adição de pequenos volumes (como alíquotas de suspensão de microesferas) à alça de fluxo baseado em circulação 1110.

[00261] Em uma modalidade, um dos sensores 920 pode ser configurado para medir o fluxo de fluido. Por exemplo, um dos sensores 920 pode ser um detector de bolhas ou um detector óptico que pode ser usado como uma medida secundária de confirmação para garantir um controle de fluxo preciso (além das células de carga integradas aos ganchos 926. Isso pode ser usado na prática durante o isolamento, onde se deseja fluir o volume no saco de processo através do ímã sem introduzir ar na coluna. A célula de carga indica que O saco de processo está quase vazio dentro de alguma tolerância esperada da variabilidade da célula de carga e, então, o detector de bolhas 920 identifica a interface de líquido/ar à direita, a fim de interromper o fluxo. O sensor 920 pode, portanto, ser usado pelo controlador para impedir a entrada de ar na alça, o que pode gerar porções para desalojar células, ou expor células ao ambiente seco, ou puxar inadvertidamente material para os sacos de lixo em situações em que a bomba não é interrompida após a drenagem completa do saco de processo. Em uma modalidade, o detector de bolhas 920 pode, portanto, ser usado em combinação com as células de carga integradas aos ganchos para melhorar a precisão do controle de volume, reduzindo assim a perda de células e/ou impedindo a entrada de ar no tubo e na coluna da coluna.

[00262] Como mencionado acima em uma modalidade, o ar pode ser puxado para dentro da alça para a geração intencional de uma porção de ar que pode ser usada para desalojar células ligadas a microesferas dentro da coluna/tubo de isolamento, para coleta. Em uma modalidade, uma solução tampão pode ser circulada através da coluna de isolamento para eluir as células ligadas a microesferas da coluna de isolamento, alternativa ou adicionalmente, com o uso de uma porção de ar.

[00263] Em uma modalidade, dois ou mais tubos de bomba peristáltica com diferentes diâmetros internos conectados em série podem ser empregados, a fim de permitir uma faixa ampliada de taxas de fluxo para uma única bomba. Para alternar entre os tubos, a tampa da bomba é aberta, o tubo existente fisicamente removido, o tubo desejado inserido fisicamente e o cabeçote da bomba é, então, fechado.

[00264] Em algumas modalidades, o sistema 900 pode ser usado para eluição de complexos de células de microesferas isolados/capturados. Em particular, é contemplado que uma interface ar-líquido possa ser usada para auxiliar na remoção de complexos das paredes laterais do tubo ou dos espaços intersticiais da coluna. O ar pode circular através de ou ser arrastado pela coluna/tubo. Sem a interface ar/líquido, pode ser difícil remover um leito cheio de microesferas/células ligadas a microesferas apenas com o controle da taxa de fluxo, sem aumentar significativamente a taxa de cisalhamento (que tem um potencial impacto negativo na viabilidade celular). Juntamente com a taxa de fluxo, é possível remover complexos de células de microesferas sem remover o Ímã.

[00265] Em conexão com o disposto acima, o sistema 900 suporta o conceito de eluir os complexos de células de microesferas positivamente selecionados diretamente no meio de escolha (com base nas etapas a jusante). Isso elimina uma etapa de troca/lavagem de tampão. Em uma modalidade, também é previsto eluir diretamente no meio e no vetor viral para iniciar a incubação. Esse conceito também pode permitir adicionar vetor viral ao saco final. Em uma modalidade, em vez de eluir células ligadas a microesferas com tampão, o meio pode ser usado como o fluido de eluição. Da mesma forma, o tampão de liberação pode ser usado para eluir as microesferas StemCell para subsequente liberação celular das microesferas. Mediante a substituição do tampão em porções do sistema 900 pelo meio, a diluição pode ser minimizada.

[00266] Conforme descrito acima, o aparelho 900 do primeiro módulo 100 é um kit único que provê enriquecimento reduzido por plaquetas e plasma seguido de isolamento magnético das células alvo. O aparelho 900 é automatizado de modo a permitir que as etapas de enriquecimento, isolamento e coleta, e todas as etapas intermediárias, sejam realizadas com intervenção

107 /110 humana mínima. Como o segundo módulo 200, o primeiro módulo 100 e o aparelho 900 são funcionais fechados para minimizar o risco de contaminação e são flexíveis para — lidar — com vários volumes de terapia/dosagens/concentrações de células e têm a capacidade de suportar vários tipos de células além para células CAR-T.

[00267] Deve ser entendido que o sistema da presente invenção pode incluir os componentes eletrônicos, software, memória, armazenamento, bancos de dados necessários, firmware, máquinas de lógica/estado, microprocessadores, enlaces de comunicação, telas ou outras interfaces de usuário visuais ou de áudio, dispositivos de impressão, e quaisquer outras interfaces de entrada/saída para executar as funções descritas aqui e/ou para alcançar os resultados aqui descritos. Por exemplo, o sistema pode incluir pelo menos um processador e estruturas de armazenamento de dados/memória do sistema, que podem incluir memória de acesso aleatório (RAM) e memória somente para leitura (ROM). O pelo menos um processador do sistema pode incluir um ou mais microprocessadores convencionais e um ou mais coprocessadores suplementares, como coprocessadores matemáticos ou similares. As estruturas de armazenamento de dados discutidas neste documento podem incluir uma combinação apropriada de memória magnética, óptica e/ou semicondutora e podem incluir, por exemplo, RAM, ROM, unidade flash, um disco óptico como um CD e/ou um disco rígido ou drive.

[00268] Adicionalmente, um aplicativo de software que adapta o controlador (ou controladores), por exemplo, o controlador 110, 210 e/ou 310, para executar os métodos descritos neste documento pode ser lido na memória principal do pelo menos um processador a partir de um meio legível por computador. O termo “meio legível por computador”, conforme usado neste documento, se refere a qualquer meio que proveja ou participe na provisão de instruções para pelo menos um processador do sistema (ou qualquer outro processador de um dispositivo aqui descrito) para execução. Esse meio pode assumir várias formas, incluindo, entre outros, mídia não volátil e mídia volátil. Mídia não volátil inclui, por exemplo, discos ópticos, magnéticos ou optomagnéticos, como memória. As mídias voláteis incluem DRAM (Memória Dinâmica de Acesso Aleatório), que normalmente constitui a memória principal. As formas comuns de mídia legível por computador incluem, por exemplo, um disquete, um disco flexível, disco rígido, fita magnética, qualquer outro meio magnético, um CD-ROM, DVD, qualquer outro meio óptico, uma RAM, uma PROM, uma EPROM ou EEPROM (memória somente leitura programável apagável eletronicamente), FLASH- EEPROM, qualquer outro chip ou cartucho de memória ou qualquer outro meio do qual um computador possa ler.

[00269] Enquanto nas modalidades a execução de sequências de instruções no aplicativo de software faz com que pelo menos um processador execute os métodos/processos descritos neste documento, circuitos com fio podem ser usados no lugar de, ou em combinação com, instruções de software para implementação dos métodos/processos da presente invenção. Portanto, as modalidades da presente invenção não estão limitadas a nenhuma combinação específica de hardware e/ou software. Além disso, está previsto que todos os métodos, protocolos e fluxos de trabalho descritos neste documento possam ser realizados via software, software que pode ser um ou vários aplicativos, programas, etc.

[00270] Além disso, é contemplado que o software possa ser configurado para executar os métodos, protocolos e/ou fluxos de trabalho em um modo totalmente autônomo, em um modo semiautônomo ou em um modo fechado. Em um modo totalmente autônomo, o software inclui instruções configuradas para adaptar o controlador (ou controladores) do sistema para executar substancialmente uma operação, método, protocolo ou fluxo de trabalho inteiro do início ao fim automaticamente, uma vez iniciado por um usuário ou operador (ou seja, sem intervenção por um operador e sem exigir pontos de contato humanos). Em um modo de operação semiautônomo, o software inclui instruções configuradas para adaptar o controlador (ou controladores) do sistema para executar substancialmente todo um método de operação, protocolo ou fluxo de trabalho do início ao fim, uma vez iniciado por um usuário ou operador, exceto que o software pode instruir o controlador (ou controladores) a pausar a operação do sistema de bioprocessamento ou de componentes do mesmo e solicitar a um usuário ou operador que tome determinadas ações específicas necessárias para executar o método, protocolo ou fluxo de trabalho, como conectar ou desconectar a sacos ou reservatórios de coleta, resíduos, meio, célula ou outros sacos ou reservatórios, para recolher uma amostra, etc. Em um modo fechado de operação, o software inclui instruções configuradas para adaptar o controlador (ou controladores) do sistema para gerar uma série de avisos direcionando um usuário ou operador a tomar determinadas ações específicas necessárias para executar um determinado método de operação, protocolo ou fluxo de trabalho, como conectar ou desconectar sacos ou reservatórios de coleta, resíduos, meio, célula ou outros sacos ou reservatórios para recolher amostras, etc., e controlar autonomamente a operação de sistema entre cada intervenção discreta do operador. No modo fechado de operação, o sistema de bioprocessamento depende muito mais do operador, em que o controlador (ou controladores) somente executa etapas de bioprocessamento pré-programadas, uma vez iniciadas por um operador.

[00271] Conforme usado aqui, um elemento ou etapa recitado no singular e prosseguido com o termo “um” ou “uma” deve ser entendido como não excluindo o plural dos ditos elementos ou etapas, a menos que tal exclusão seja explicitamente declarada. Ademais, as referências a “uma modalidade” da presente invenção não se destinam a ser interpretadas como excluindo a existência de modalidades adicionais que também incorporam os recursos citados. Além disso, a menos que explicitamente indicado o contrário, as modalidades “que compreendem”, “que incluem” ou “que têm” um elemento ou uma pluralidade de elementos com uma propriedade específica podem incluir elementos adicionais que não apresentam essa propriedade.

[00272] Essa descrição escrita usa exemplos para revelar várias modalidades da invenção, incluindo o melhor modo, e também para permitir que um versado na técnica pratique as modalidades da invenção, incluindo fabricar e usar quaisquer dispositivos ou sistemas e executar quaisquer métodos incorporados. O escopo patenteável da invenção é definido pelas reivindicações e pode incluir outros exemplos que ocorrem a um versado na técnica. Esses outros exemplos devem estar dentro do escopo das reivindicações se os mesmos tiverem elementos estruturais que não diferem da linguagem literal das reivindicações, ou se incluírem elementos estruturais equivalentes com diferenças substanciais em relação às linguagens literais das reivindicações.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Sistema de bioprocessamento, caracterizado pelo fato de que compreende: um primeiro módulo configurado para enriquecer e isolar uma população de células; um segundo módulo configurado para ativar, modificar geneticamente e expandir a população de células; e um terceiro módulo configurado para recolher a população expandida de células.

2. Sistema de bioprocessamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: o segundo módulo contém um vaso de biorreator configurado para prover a modificação genética e a expansão da população de células sem remoção da população de células do vaso de biorreator.

3. Sistema de bioprocessamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: o segundo módulo contém um vaso de biorreator configurado para prover a ativação, a modificação genética e a expansão da população de células sem remoção da população de células do vaso de biorreator.

4. Sistema de bioprocessamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: o segundo módulo inclui um primeiro vaso de biorreator e um segundo vaso de biorreator interconectados fluidamente com o primeiro vaso de biorreator.

5. Sistema de bioprocessamento de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que: o primeiro vaso de biorreator é configurado para realizar a ativação e modificação genética da população de células; em que o segundo biorreator é configurado para realizar a expansão da população de células.

6. Sistema de bioprocessamento de acordo com a reivindicação 5, em que o sistema de bioprocessamento é caracterizado pelo fato de que é configurado para efetuar a ativação e modificação genética das células no primeiro vaso do biorreator, transferência das células do primeiro vaso do biorreator para o segundo vaso do biorreator e expansão das células no segundo vaso do biorreator de maneira autônoma.

7. Sistema de bioprocessamento de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que: o primeiro vaso de biorreator é configurado para realizar a ativação da população de células; e o segundo biorreator é configurado para realizar modificação genética e expansão da população de células.

8. Sistema de bioprocessamento de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que: o vaso de biorreator é configurado para perfusão sem filtro.

9. Sistema de bioprocessamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: a população de células é uma primeira população de células; e em que o sistema de bioprocessamento é configurado para suportar a ativação, modificação genética e expansão da primeira população de células no segundo módulo simultaneamente com enriquecimento e isolamento de uma segunda população de células no primeiro módulo.

10. Sistema de bioprocessamento de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que: a primeira população de células é diferente da segunda população de células.

11. Sistema de bioprocessamento, caracterizado pelo fato de que compreende:

um primeiro módulo configurado para enriquecer e isolar células; uma pluralidade de segundos módulos, em que cada segundo módulo é configurado para ativar, modificar geneticamente e expandir as células; e um terceiro módulo configurado para recolher as células após a expansão; em que cada segundo módulo é configurado para suportar a ativação, modificação genética e expansão de diferentes populações de células em paralelo.

12. Sistema de bioprocessamento de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que: o primeiro módulo é configurado para enriquecimento e isolamento de cada população de células diferente antes da transferência para um dentre a pluralidade de segundos módulos para ativação, modificação genética e expansão.

13. Sistema de Dbioprocessamento de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que: o sistema de bioprocessamento está configurado para executar o enriquecimento e o isolamento de uma das diferentes populações de células no primeiro módulo simultaneamente com a ativação, modificação genética e expansão de outra das diferentes populações de células no segundo módulo.

14. Método de bioprocessamento para terapia celular, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende: em um primeiro módulo, enriquecer e isolar uma população de células; em um segundo módulo, ativar, modificar geneticamente e expandir a população de células; e em um terceiro módulo, recolher a população expandida de células.

15. Método de bioprocessamento de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que: a etapa de ativar, modificar geneticamente e expandir a população de células no segundo módulo inclui ativar e modificar geneticamente a população de células em um primeiro vaso de biorreator do segundo módulo, transferir a população de células para um segundo vaso de biorreator do segundo módulo e expandir a população de células no segundo vaso biorreator.

16. Método de Dbioprocessamento de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que: a etapa de ativar, modificar geneticamente e expandir a população de células no segundo módulo inclui ativar a população de células em um primeiro vaso de biorreator do segundo módulo, transferir a população de células para um segundo vaso de biorreator do segundo módulo, e modificar geneticamente e expandir a população de células no segundo vaso biorreator.

17. Método de bioprocessamento de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que: a etapa de ativar, modificar geneticamente e expandir a população de células no segundo módulo inclui ativar, modificar geneticamente e expandir a população de células em um primeiro e segundo vasos biorreator do segundo módulo.

18. Método de Dbioprocessamento de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que: a população de células é uma primeira população de células; e em que o método inclui adicionalmente as etapas de transferência da primeira população de células do primeiro módulo para o segundo módulo após enriquecimento e isolamento da primeira população de células no primeiro módulo, para ativação, modificação genética e expansão da primeira população de células no segundo módulo; e introduzir uma segunda população de células no primeiro módulo para enriquecimento e isolamento da segunda população de células no primeiro módulo simultaneamente com a ativação, modificação genética e expansão da primeira população de células no segundo módulo.

19. Método de Dbioprocessamento de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que: a primeira população de células é diferente da segunda população de células.