BR112020015639A2 - Composições e métodos para o tratamento de câncer e distúrbios imunológicos usando bactérias veillonella - Google Patents

Composições e métodos para o tratamento de câncer e distúrbios imunológicos usando bactérias veillonella Download PDF

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Baundauna Bose
Christopher Jh Davitt
Maria Sizova
Sofia M. R. Carlton
Andrea Itano
Holly Ponichtera
Taylor A. Cormack
Kritika Ramani
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Abstract

composições e métodos para o tratamento de câncer e distúrbios imunológicos usando bactérias veillonella. a presente invenção refere-se a métodos e composições relacionados com bactérias veillonella úteis como agentes terapêuticos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “COMPO- SIÇÕES E MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DE CÂNCER E DIS- TÚRBIOS IMUNOLÓGICOS USANDO BACTÉRIAS VEILLONELLA”.
PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade aos Pedidos Provisórios de Patentes dos EUA com os números de série 62/626,789, depositado em 6 de fevereiro de 2018, 62/666,944, depositado em 4 de maio de 2018 e 62/703,269, depositado em 25 de julho de 2018, o con- teúdo de cada um dos quais é no presente documento incorporado a título de referência na sua totalidade.
SUMÁRIO
[0002] Em certos aspectos, são no presente documento proporcio- nados métodos e composições (por exemplo, composições bacterianas, composições farmacêuticas) relacionados ao tratamento e/ou preven- ção de doenças (por exemplo, câncer, doença autoimune, doença infla- matória, doença metabólica), em um sujeito (por exemplo, um sujeito humano) compreendendo a administração de uma composição bacteri- ana compreendendo bactérias Veillonella (por exemplo, Veillonella to- betsuensis, Veillonella parvula) e/ou um produto de tais bactérias (por exemplo, vesículas extracelulares (EV) e/ou biomassa farmaceutica- mente ativa (PhABs)). São também no presente documento proporcio- nados métodos para produzir e/ou identificar tal bactéria e/ou produto bacteriano. Em algumas modalidades, são no presente documento pro- porcionados biorreatores compreendendo tais bactérias. Em algumas modalidade, as bactérias Veillonella (por exemplo, Veillonella tobetsu- ensis, Veillonella parvula) são uma cepa de bactérias listada na Tabela
1. Em algumas modalidades, as bactérias são uma cepa compreen- dendo pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência
(por exemplo, pelo menos 99,5% de identidade de sequência, pelo me- nos 99,6% de identidade de sequência, pelo menos 99,7% de identi- dade de sequência, pelo menos 99,8% de identidade de sequência, pelo menos 99,9% de identidade de sequência) com a sequência nucleotí- dica (por exemplo, sequência genômica, sequência 16S, sequência CRISPR) das cepas bacterianas listadas na Tabela 1. Em algumas mo- dalidades, a administração da composição bacteriana trata o distúrbio imunológico no sujeito. Em algumas modalidades, o distúrbio imunoló- gico é uma doença autoimune. Em algumas modalidades, o distúrbio imunológico é uma doença inflamatória. Em algumas modalidades, o distúrbio imunológico é uma alergia.
[0003] Em algumas modalidades, são no presente documento pro- porcionadas vesículas extracelulares (EV) produzidas e/ou geradas por, e/ou isoladas de bactérias, Veillonella (por exemplo, Veillonella tobetsu- ensis, Veillonella parvula) no presente documento proporcionadas Em algumas modalidades, as composições bacterianas compreendem tanto EV de Veillonella quanto bactérias Veillonella inteiras (por exem- plo, bactérias vivas, bactérias mortas, bactérias atenuadas). Em certas modalidades, são no presente documento proporcionadas composições bacterianas compreendendo bactérias Veillonella na ausência de EV de Veillonella. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem EV de Veillonella na ausência de bactérias Veillonella.
[0004] Em certas modalidade, são no presente documento propor- cionados métodos de tratamento de um sujeito que tem um distúrbio imunológico (por exemplo, uma doença autoimune, uma doença infla- matória, uma alergia), compreendendo a administração de uma compo- sição bacteriana compreendendo uma bactéria Veillonella (por exemplo uma bactéria morta, uma bactéria viva e/ou uma bactéria atenuada) ao sujeito. Em certas modalidades, são no presente documento proporcio-
nados métodos de tratamento de um sujeito que tem uma doença me- tabólica compreendendo a administração de uma composição bacteri- ana no presente documento descrita ao sujeito. Em algumas modalida- des, a bactéria é uma cepa de bactérias listada na Tabela 1. Em algu- mas modalidades, a bactéria é uma cepa compreendendo pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência (por exemplo, identidade de sequência genômica, identidade de sequência 16S, iden- tidade de sequência CRISPR) (por exemplo, pelo menos 99,5% de iden- tidade de sequência, pelo menos 99,6% de identidade de sequência, pelo menos 99,7% de identidade de sequência, pelo menos 99,8% de identidade de sequência, pelo menos 99,9% de identidade de sequên- cia) com a sequência nucleotídica correspondente das cepas bacteria- nas listadas na Tabela 1. Em algumas modalidades, pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bactérias na composição bacteriana são cepas bacterianas listadas na Tabela 1. Em algumas modalidades, todas ou substancialmente todas as bactérias na formulação bacteriana são ce- pas bacterianas listadas na Tabela 1. Em algumas modalidade, a for- mulação bacteriana compreende pelo menos 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 1 x 107, 2 x 107, 3 x 107, 4 x 107, 5 x 107, 6 x 107, 7 x 107, 8 x 107, 9 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5 x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 108, 9 x 108 ou 1 x 109 unidades formadoras de colônias de bactérias Veillonella (por exemplo uma cepa de bactérias listada na Tabela 1).
[0005] Em certas modalidades, são no presente documento propor- cionados métodos de tratamento de um sujeito que tem câncer, com- preendendo a administração de uma composição bacteriana no pre- sente documento descrita ao sujeito.
[0006] Em algumas modalidades, o método compreende ainda a administração de um antibiótico ao sujeito. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a administração de uma ou mais outras te- rapias contra câncer (por exemplo, remoção cirúrgica de um tumor, a administração de um agente quimioterápico, a administração de radio- terapia e/ou a administração de uma imunoterapia contra câncer, tal como um inibidor de ponto de controle imunológico, um anticorpo espe- cífico para câncer, uma vacina contra câncer, uma célula apresentadora de antígeno iniciada, uma célula T específica para câncer, uma célula T com o receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para câncer, uma proteína de ativação imunológica e/ou um adjuvante) ao sujeito.
[0007] Em algumas modalidades, o método compreende ainda a administração de uma outra bactéria terapêutica. Em algumas modali- dades, o método compreende ainda a administração de um supressor imunológico e/ou um agente anti-inflamatório. Em algumas modalida- des, o método compreende ainda a administração de um agente tera- pêutico contra doença metabólica.
[0008] Em certas modalidades, são no presente documento propor- cionadas composições bacterianas compreendendo uma cepa bacteri- ana listada na Tabela 1 (por exemplo, uma bactéria morta, uma bactéria viva e/ou uma bactéria atenuada) e/ou um produto de tais bactérias (por exemplo, vesículas extracelulares (EV) e/ou biomassas farmaceutica- mente ativas (PhABs)). Em algumas modalidades, pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bactérias na composição bacteriana são uma cepa de bactérias listada na Tabela 1. Em algumas modalidades, as bactérias são uma cepa de bactérias listada na Tabela 1. Em algumas modalidades, as bactérias são uma cepa compreendendo pelo menos 99% de identidade de sequência (por exemplo, identidade de sequência genômica, identidade de sequência 16S, identidade de sequência
CRISPR) (por exemplo, pelo menos 99,5% de identidade de sequência, pelo menos 99,6% de identidade de sequência, pelo menos 99,7% de identidade de sequência, pelo menos 99,8% de identidade de sequên- cia, pelo menos 99,9% de identidade de sequência) com a sequência nucleotídica correspondente da cepa de bactérias listada na Tabela 1. Em algumas modalidades, todas ou substancialmente todas as bacté- rias na formulação bacteriana são uma cepa bacteriana listada na Ta- bela 1. Em algumas modalidade, a formulação bacteriana compreende pelo menos 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 1 x 107, 2 x 107, 3 x 107, 4 x 107, 5 x 107, 6 x 107, 7 x 107, 8 x 107, 9 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5 x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 108, 9 x 108 ou 1 x 109 unidades formadoras de colônias de uma cepa bacteriana listada na Tabela 1. Em algumas modalidades, a composição bacteriana compreende EV e/ou PhABs (por exemplo, células inteiras, frações de células, sobrenadante de fermentação, frações de sobrenadante e/ou vesículas extracelulares) feitas a partir de uma cepa bacteriana listada na Tabela 1.
[0009] Em algumas modalidades, a composição bacteriana é admi- nistrada por via oral, intravenosa, intratumoral ou subcutânea. Em algu- mas modalidades, a composição bacteriana é administrada em 2 ou mais (por exemplo, 3 ou mais, 4 ou mais ou 5 ou mais doses). Em algu- mas modalidades, a administração das duas ou mais doses ao sujeito é separada por pelo menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias ou 21 dias. Em algumas modalidades, uma segunda bactéria é administrada como parte de um consórcio ecológico.
[0010] Em certas modalidades, a composição compreende uma proporção específica entre as bactérias Veillonella e as partículas de EV de Veillonella.
Por exemplo, em algumas modalidade, a composição far- macêutica compreende pelo menos 1 bactéria Veillonella por cada 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8. 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48. 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68. 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78. 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88. 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98. 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x103, 2x103, 3x103, 4x103, 5x103, 6x103, 7x103, 8x103, 9x103, 1x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108 , 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, e/ou 1x1012 partículas de EV de Veil- lonella.
Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compre- ende cerca de 1 bactéria Veillonella por cada 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3,
8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48. 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,
68. 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78. 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88. 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98. 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x103, 2x103, 3x103, 4x103, 5x103, 6x103, 7x103, 8x103, 9x103, 1x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108 , 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, e/ou 1x1012 partículas de EV de Veillonella. Em algu- mas modalidades, a composição farmacêutica compreende não mais do que 1 bactéria Veillonella por cada1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8. 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8. 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48. 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68. 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78. 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88. 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98. 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x103,
2x103, 3x103, 4x103, 5x103, 6x103, 7x103, 8x103, 9x103, 1x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108 , 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, e/ou 1x1012 partículas de EV de Veillonella.
Em algumas mo- dalidades, a composição farmacêutica compreende pelo menos 1 partí- cula de EV de Veillonella por cada1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8. 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48. 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68. 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78. 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88. 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98. 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x103, 2x103, 3x103, 4x103, 5x103, 6x103, 7x103, 8x103, 9x103, 1x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108 , 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010,
3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, e/ou 1x1012 bactéria Veillonella. Em algumas modalidades, a composi- ção farmacêutica compreende cerca de 1 partícula de EV de Veillonella por cada 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8. 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8. 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48. 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68. 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77,
78. 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88. 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98. 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x103, 2x103, 3x103, 4x103, 5x103, 6x103, 7x103, 8x103, 9x103, 1x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108 , 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, e/ou 1x1012 bactéria Veillo- nella. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compre- ende não mais do que 1 partícula de EV de Veillonella por cada 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8. 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2,
6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48. 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68. 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78. 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88. 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98. 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x103, 2x103, 3x103, 4x103, 5x103, 6x103, 7x103, 8x103, 9x103, 1x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108 , 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, e/ou 1x1012 bactérias Veillonella.
[0011] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana su- prime a resposta imunológica em hipersensibilidade de tipo retardado (DTH). Em determinadas modalidades, a composição bacteriana induz uma célula T reguladora ou uma resposta anti-inflamatória. Em determi- nadas modalidades, a composição bacteriana inibe respostas antígeno- específicas. Em determinadas modalidades, a composição bacteriana trata dermatite alérgica de contato. Em determinadas modalidades, a composição bacteriana trata miocardite autoimune. Em determinadas modalidades, a composição bacteriana trata diabetes mellitus tipo 1. Em determinadas modalidades, a composição bacteriana trata granulomas. Em determinadas modalidades, a composição bacteriana trata neuro-
patias periféricas. Em determinadas modalidades, a composição bacte- riana trata tireoidite de Hashimoto. Em determinadas modalidades, a composição bacteriana trata esclerose múltipla. Em determinadas mo- dalidades, a composição bacteriana trata artrite reumatoide.
[0012] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana trata inflamação do cólon. Em determinadas modalidades, a composi- ção bacteriana trata colite. Colite pode ser aguda e autolimitada ou de longo prazo. Em determinadas modalidades, a composição bacteriana trata colite ulcerativa. Em determinadas modalidades, a composição bacteriana trata doenças digestivas. Em determinadas modalidades, a composição bacteriana trata doença de Crohn. Em determinadas mo- dalidades, a composição bacteriana trata doença inflamatória intestinal (DII). Em determinadas modalidades, a composição bacteriana trata co- lite microscópica. Em determinadas modalidades, a composição bacte- riana trata colite colagenosa. Em determinadas modalidades, a compo- sição bacteriana trata colite por derivação. Em determinadas modalida- des, a composição bacteriana trata colite química. Em determinadas modalidades, a composição bacteriana trata colite isquêmica. Em deter- minadas modalidades, a composição bacteriana trata colite indetermi- nada. Em determinadas modalidades, a composição bacteriana trata colite atípica. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a administração de um terapêutico adicional (por exemplo, um antibiótico, um imunossupressor, um agente anti-inflamatório) ao sujeito. Em algu- mas modalidades, o método compreende ainda a administração de uma segunda bactéria terapêutica ao sujeito.
[0013] Em algumas modalidades, o sujeito é um mamífero. Em al- gumas modalidades, o sujeito é um ser humano. Em algumas modali- dades, o sujeito é um mamífero não humano (por exemplo, um cachorro, um gato, uma vaca, um cavalo, um porco, um jumento, uma cabra, um camelo, um camundongo, um rato, um porquinho da índia, uma ovelha,
uma lhama, um macaco, um gorila ou um chimpanzé).
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0014] Fig. 1 mostra a eficácia das Cepas A, B e C de Veillonella administradas por via oral na redução do inchaço antígeno-específico da orelha (espessura da orelha) em 24 horas, em comparação com o veículo (controle negativo), Dexametasona anti-inflamatória (controle positivo) e Bifidobacterium animalis lactis, em um modelo de camun- dongo de hipersensibilidade do tipo retardado baseado em KLH.
[0015] Fig. 2 mostra a eficácia da Cepa B de Veillonella irradiada (25kGy), administrada por via oral, na redução do inchaço antígeno-es- pecífico da orelha (espessura da orelha) em 24 horas, em comparação com o veículo (controle negativo) após o desafio com antígeno em um modelo de hipersensibilidade do tipo retardado baseado em KLH. Tanto a Cepa B de Veillonella viva como a irradiada foram eficazes na inibição do inchaço da orelha, mas a Cepa B de Veillonella irradiada foi ainda mais eficaz que a Cepa B viva e foi ainda mais eficaz que o controle positivo, Dexametasona. Ambos os grupos viáveis e irradiados da Cepa C de Veillonella demonstraram eficácia, mas, ao contrário da irradiação da Cepa B, a irradiação da Cepa C de Veillonella não aumentou nem diminuiu a sua eficácia.
[0016] Fig. 3 mostra a eficácia da Cepa B de Veillonella irradiada (25kGy), administrada por via oral, na redução do inchaço antígeno-es- pecífico da orelha (espessura da orelha) em 48 horas, em comparação com o veículo (controle negativo) após o desafio com antígeno em um modelo de hipersensibilidade do tipo retardado baseado em KLH. Tanto a Cepa B de Veillonella viva como a irradiada foram eficazes na inibição do inchaço da orelha, mas a Cepa B de Veillonella irradiada foi ainda mais eficaz que a Cepa B viva e foi ainda mais eficaz que o controle positivo, Dexametasona. Ambos os grupos viáveis e irradiados da Cepa C de Veillonella demonstraram eficácia, mas, ao contrário da irradiação da Cepa B, a irradiação da Cepa C de Veillonella não aumentou nem diminuiu a sua eficácia.
[0017] Fig. 4 mostra a eficácia das EV das Cepas A e B de Veillo- nella em comparação com o anti-PD-1 ou veículo injetados por via in- traperitoneal (i.p.), em um modelo de carcinoma colorretal de camun- dongo.
[0018] Fig. 5 mostra a eficácia das EV das Cepas A e B de Veillo- nella em comparação com o anti-PD-1 ou veículo injetados por via in- traperitoneal (i.p.), em um modelo de carcinoma colorretal de camun- dongo no dia 11.
[0019] Fig. 6 mostra a eficácia dependente da dose e da via de ad- ministração das EV das Cepas A e B de Veillonella em comparação com anti-PD-1 ou veículo injetados por via intraperitoneal (i.p.), em um mo- delo de carcinoma colorretal de camundongo.
[0020] Fig. 7 mostra a eficácia dependente da dose e da via de ad- ministração das EV das Cepas A e B de Veillonella em comparação com o anti-PD-1 ou veículo injetados por via intraperitoneal (i.p.), em um mo- delo de carcinoma colorretal de camundongo no dia 11.
[0021] Fig. 8 mostra a eficácia das Cepas D, E, F e G de Veillonella irradiadas (25kGy) na redução do inchaço antígeno-específico da orelha (espessura da orelha) em 24 horas, em comparação com o veículo (con- trole negativo) e dexametasona anti-inflamatória (controle positivo), em um modelo de camundongo de hipersensibilidade do tipo retardado ba- seado em KLH
[0022] Fig. 9 mostra a eficácia das Cepas B, E, F e G de Veillonella irradiadas (25kGy) na redução da inflamação antígeno-específica da orelha em 24 horas, em comparação com o veículo (controle negativo) e Dexametasona anti-inflamatória (controle positivo) após o desafio com antígeno em um modelo de hipersensibilidade do tipo retardado base- ado em KLH. Ambas as Cepas B e E de Veillonella vivas e irradiadas foram eficazes na inibição da inflamação da orelha, mas a Cepa E de Veillonella irradiada foi ainda mais eficaz que a cepa E viva. Para a Cepa F de Veillonella, a irradiação gama levou a uma cepa de Veillonella, que não apresentava desempenho, a se tornar eficaz. Todos os grupos re- ceberam 10 mg do pó por dose.
[0023] Fig. 10 mostra que a Cepa C de Veillonella foi eficaz na re- dução da pontuação de atividade NASH (NAS) em camundongos que receberam uma dieta deficiente em metionina e colina (MCD), o que induz sintomas de NASH.
[0024] Fig. 11 mostra que a Cepa C de Veillonella reduziu a Fibrose em camundongos que foram alimentados com uma dieta MCD.
[0025] Fig. 12 mostra que a Cepa C de Veillonella reduziu o Coles- terol Hepático Total em camundongos que foram alimentados com uma dieta MCD.
[0026] Fig. 13 mostra que a Cepa C de Veillonella reduziu os Trigli- cerídeos Hepáticos em camundongos que foram alimentados com uma dieta MCD.
[0027] Fig. 14 mostra a eficácia das EV da Cepa A de Veillonella parvula e das EV das Cepas A e B de Veillonella atypica em compara- ção com a dos anti-PD-1 ou veículo administrados por via intraperitoneal (i.p.) em um modelo de carcinoma colorretal de camundongo no dia 11. O teste de Welch é realizado para tratamento vs. veículo.
[0028] Fig. 15 mostra a eficácia das EV da Cepa A de Veillonella parvula e das EV das Cepas A e B de Veillonella atypica em compara- ção com a dos anti-PD-1 ou veículo administrados por via intraperitoneal (i.p.) em um modelo de carcinoma colorretal de camundongo no dia 11. O teste de Welch é realizado para tratamento vs. anti-PD-1.
DESCRIÇÃO DETALHADA Geral
[0029] Em certos aspectos, são no presente documento proporcio- nados métodos e composições relacionados ao tratamento e/ou preven- ção de doenças (por exemplo, câncer, doença autoimune, doença infla- matória, doença metabólica), em um sujeito (por exemplo, um sujeito humano) compreendendo a administração de uma composição bacteri- ana compreendendo bactérias Veillonella (por exemplo, Veillonella to- betsuensis, Veillonella parvula) bem como métodos de produção e/ou identificação de tal bactéria. Definições
[0030] “Adjuvante” ou “terapia adjuvante” se refere amplamente a um agente que afeta uma resposta imunológica ou fisiológica em um paciente ou sujeito. Por exemplo, um adjuvante pode aumentar a pre- sença de um antígeno ao longo do tempo ou em uma área de interesse como um tumor, ajudar a absorver uma célula apresentadora de antí- geno, ativar macrófagos e linfócitos e suportar a produção de citocinas. Alterando-se uma resposta imunológica, um adjuvante pode permitir que uma dose menor de um agente de interação imunológica aumente a eficácia ou segurança de uma dose particular do agente de interação imunológica. Por exemplo, um adjuvante pode prevenir a exaustão de células T.
[0031] “Administração” se refere amplamente a uma via de admi- nistração de uma composição a um sujeito. Exemplos de vias de admi- nistração incluem administração oral, administração retal, administração tópica, inalação (nasal) ou injeção. A administração por injeção inclui administração intravenosa (IV), intramuscular (IM), intratumoral (IT) e subcutânea (SC). As composições farmacêuticas no presente docu- mento descritas podem ser administradas de qualquer forma por qual- quer via eficaz, incluindo, mas não se limitando a, intratumoral, oral, pa- renteral, enteral, intravenosa, intraperitoneal, tópica, transdérmica (por exemplo, usando qualquer emplastro padrão), intradérmica, oftálmica,
(intra)nasal, local, não oral, tal como aerossol, inalação, subcutânea, in- tramuscular, bucal, sublingual, (trans)retal, vaginal, intra-arterial e intra- tecal, transmucosal (por exemplo, sublingual, lingual, (trans)bucal, (trans)uretral, vaginal (por exemplo, trans e perivaginal), intravesical, in- trapulmonar, intraduodenal, intragástrica e intrabrônquica. Em modali- dades preferidas, as composições farmacêuticas no presente docu- mento descritas são administradas por via oral, retal, intratumoral, tó- pica, intravesical, por injeção no, ou adjacente ao, linfonodo drenante, por via intravenosa, por inalação ou aerossol ou por via subcutânea.
[0032] Como no presente documento usado, o termo “anticorpo” pode se referir tanto a um anticorpo intacto como a um seu fragmento de ligação ao antígeno. Anticorpos intactos são glicoproteínas que in- cluem pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada inclui uma região variável de cadeia pesada (no presente documento abreviada como VH) e uma região constante de cadeia pesada. Cada cadeia leve inclui uma região variável de cadeia leve (no presente documento abre- viada como VL) e uma região constante de cadeia leve. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de determinação de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas re- giões de framework (FR). Cada VH e VL é composta por três CDR e quatro FR, dispostas a partir da terminação amino até à terminação car- bóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. O termo “anticorpo” inclui, por exemplo, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), anticorpos de cadeia simples e fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno.
[0033] Os termos “fragmento de ligação ao antígeno” e “porção de ligação ao antígeno” de um anticorpo, como no presente documento usado, se referem a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade para se ligar a um antígeno. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos pelo termo “fragmento de ligação ao antígeno” de um anticorpo incluem Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, Fv ligado a dissulfeto, Fd, diacorpos, anticorpos de cadeia simples, NANOBODIES®, CDRH3 isolado e outros fragmentos de anticorpo que retêm pelo menos uma porção da região variável de um anticorpo intacto. Estes fragmentos de anticorpo podem ser obtidos usando técnicas recombinantes e/ou enzi- máticas convencionais e podem ser triadas quanto à ligação ao antí- geno da mesma maneira que os anticorpos intactos.
[0034] “Câncer" se refere amplamente a um crescimento anormal não controlado das células de um hospedeiro, levando à invasão do te- cido circundante e, potencialmente, de tecido distal ao sítio inicial de crescimento celular anormal no hospedeiro. As principais classes in- cluem carcinomas, que são cânceres do tecido epitelial (por exemplo, pele, células escamosas); sarcomas, que são cânceres do tecido con- juntivo (por exemplo, osso, cartilagem, gordura, músculo, vasos sanguí- neos, etc.); leucemias, que são cânceres de tecido formador de sangue (por exemplo, tecido da medula óssea); linfomas e mielomas, que são cânceres de células imunológicas; e cânceres do sistema nervoso cen- tral, que incluem cânceres do cérebro e do tecido da coluna vertebral. “Câncer (ou cânceres)”, “neoplasia (ou neoplasias)” e “tumor (ou tumo- res)” são no presente documento usados de forma intercambiável. Como no presente documento usado, “câncer” se refere a todos os tipos de câncer ou neoplasia ou tumores malignos, incluindo leucemias, car- cinomas e sarcomas, novos ou recorrentes. Exemplos específicos de cânceres são: carcinomas, sarcomas, mielomas, leucemias, linfomas e tumores do tipo misto. Exemplos não limitativos de cânceres são cân- ceres novos ou recorrentes do cérebro, melanoma, bexiga, mama, colo do útero, cólon, cabeça e pescoço, rim, pulmão, pulmão de células não pequenas, mesotelioma, ovário, próstata, sarcoma, estômago, útero e meduloblastoma.
[0035] O termo “mutante de LPS ou mutante de lipopolissacarídeo” se refere amplamente a bactérias selecionadas que compreendem a perda de LPS. A perda de LPS pode ser causada por mutações ou dis- rupções de genes envolvidos na biossíntese de lipídios A, tais como lpxA, lpxC e lpxD. As bactérias compreendendo mutantes de LPS po- dem ser resistentes a aminoglicosídeos e polimixinas (polimixina B e colistina).
[0036] “Aumento celular" se refere amplamente ao influxo de célu- las ou expansão de células em um ambiente que não estão substanci- almente presentes no ambiente antes da administração de uma compo- sição e não estão presentes na própria composição. As células que au- mentam o ambiente incluem células imunológicas, células estromais, células bacterianas e fúngicas. Os ambientes de particular interesse são os microambientes em que as células cancerígenas residem ou estão localizadas. Em alguns casos, o microambiente é um microambiente tu- moral ou um linfonodo drenante tumoral. Em outros casos, o microam- biente é um sítio de tecido pré-cancerígeno ou o sítio de administração local de uma composição ou um sítio no qual a composição se acumu- lará após administração remota.
[0037] “Clado" se refere às OTU ou membros de uma árvore filoge- nética que estão a jusante de um nó estatisticamente válido em uma árvore filogenética. O clado compreende um conjunto de folhas termi- nais na árvore filogenética que é uma unidade evolutiva monofilética distinta e que compartilha, até certo ponto, similaridade de sequência. “Unidades taxonômicas operacionais”, "OTU", se referem a uma folha terminal em uma árvore filogenética e são definidas por uma sequência de ácidos nucleicos, por exemplo, o genoma inteiro, ou uma sequência genética específica e todas as sequências que compartilham identidade de sequência com essa sequência de ácidos nucleicos no nível de es- pécie. Em algumas modalidades, a sequência genética específica pode ser a sequência 16S ou uma porção da sequência 16S. Em outras mo- dalidades, os genomas inteiros de duas entidades são sequenciados e comparados. Em uma outra modalidade, regiões selecionadas, tais como etiquetas de sequência multilócus (MLST), genes específicos ou conjuntos de genes podem ser geneticamente comparadas. Em moda- lidades de 16S, as OTU que compartilham ≧97% de identidade média de nucleotídeos através de toda a 16S ou parte da região variável da 16S são consideradas a mesma OTU (ver, por exemplo, Claesson M J, Wang Q, O'Sullivan O, Greene-Diniz R, Cole J R, Ros R P e O'Toole P W. 2010. Comparison of two next-generation sequencing technologies for resolving highly complex microbiota composition using tandem vari- able 16S rRNA gene regions. Nucleic Acids Res 38: e200. Konstantini- dis K T, Ramette A e Tiedje J M. 2006. The bacterial species definition in the genomic era. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 361: 1.929 a
1.940.). Em modalidades que envolvem o genoma completo, MLST, ge- nes específicos ou conjuntos de genes, as OTU que compartilham ≧95% de identidade média de nucleotídeos são consideradas a mesma OTU (ver, por exemplo, Achtman M e Wagner M. 2008. Microbial diver- sity and the genetic nature of microbial species. Nat. Rev. Microbiol. 6: 431 a 440. Konstantinidis K T, Ramette A e Tiedje J M. 2006. The bac- terial species definition in the genomic era. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 361: 1.929 a 1.940.). OTU são frequentemente definidas pela comparação de sequências entre organismos. Geralmente, sequências com menos de 95% de identidade de sequência não são consideradas como parte da mesma OTU. OTU também podem ser caracterizadas por qualquer combinação de marcadores ou genes nucleotídicos, em particular genes altamente conservados (por exemplo, genes “de manu- tenção”), ou uma combinação destes. Tal caracterização emprega, por exemplo, dados WGS ou uma sequência genômica completa.
[0038] Uma “combinação” de duas ou mais cepas microbianas inclui a coexistência física das duas cepas microbianas, no mesmo material ou produto ou em produtos fisicamente conectados, bem como a coad- ministração ou colocalização temporal das cepas microbianas monoclo- nais.
[0039] O termo “diminuir” ou “depletar” significa uma alteração, de modo que a diferença seja, dependendo das circunstâncias, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1/100, 1/1.000, 1/10.000, 1/100.000, 1/1.000.000 ou indetectável após o tratamento em comparação com um estado de pré-tratamento.
[0040] O termo “consórcio ecológico” é um grupo de bactérias que trocam metabólitos e corregulam positivamente uma à outra, em con- traste com duas bactérias que induzem sinergia de hospedeiro através da ativação de trajetórias de hospedeiro complementares para eficácia aprimorada.
[0041] O termo “epitopo” significa um determinante de proteína ca- paz de ligação específica a um anticorpo. Epitopos normalmente con- sistem em grupamentos de moléculas de superfície quimicamente ativa, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar. Certos epitopos podem ser definidos por uma sequência de aminoácidos particular à qual um anticorpo tem capacidade para se ligar.
[0042] Como no presente documento usado, “bactérias genetica- mente modificadas” são quaisquer bactérias que tenham sido genetica- mente alteradas a partir de seu estado natural por intervenção humana e a progênie de quaisquer tais bactérias. Bactérias geneticamente mo- dificadas incluem, por exemplo, os produtos de modificação genética direcionada, os produtos de triagens mutagênicas aleatórias e os pro- dutos de evolução dirigida.
[0043] O termo “gene” é usado amplamente para se referir a qual- quer ácido nucleico associado a uma função biológica. O termo “gene” se aplica a uma sequência genômica específica, bem como a um cDNA ou um mRNA codificado por essa sequência genômica.
[0044] “Identidade”, como entre sequências de ácidos nucleicos de duas moléculas de ácido nucleico, pode ser determinada como uma por- centagem de identidade usando algoritmos de computador conhecidos, tais como o programa “FASTA”, usando, por exemplo, os parâmetros predefinidos como em Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:2444 (outros programas incluem o pacote de programa de GCG (De- vereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA Atschul, S. F., et al., J Molec Biol 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Mrtin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994 e Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Por exemplo, a função BLAST do banco de dados do Centro Nacional para Informações sobre Biotecnologia (NCBI) pode ser usada para determi- nar a identidade. Outros programas comercial ou publicamente disponí- veis incluem o programa “MegAlign” da DNAStar (Madison, Wis.) e o programa “Gap” do Grupo de Genética Computacional da Universidade de Wisconsin (UWG) (Madison Wis.)).
[0045] Como no presente documento usado, o termo “distúrbio imu- nológico” se refere a qualquer doença, distúrbio ou sintoma de doença causado por uma atividade do sistema imunológico, incluindo doenças autoimunes, doenças inflamatórias e alergias. Distúrbios imunológicos incluem, mas não estão limitados a, doenças autoimunes (por exemplo, Lúpus, Escleroderma, anemia hemolítica, vasculite, diabetes tipo um, doença de Grave, artrite reumatoide, esclerose múltipla, síndrome de Goodpasture, anemia perniciosa e/ou miopatia), doenças inflamatórias
(por exemplo, acne vulgar, asma, doença celíaca, prostatite crônica, glo- merulonefrite, doença inflamatória intestinal, doença inflamatória pél- vica, lesão por reperfusão, artrite reumatoide, sarcoidose, rejeição de transplantes, vasculite e/ou cistite intersticial) e/ou alergias (por exem- plo, alergias alimentares, alergias a fármacos e/ou alergias ambientais).
[0046] O termo “aumentar” significa uma alteração, de modo que a diferença seja, dependendo das circunstâncias, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2 vezes, 4 vezes, 10 vezes, 100 vezes, 10^3 vezes, 10^4 vezes, 10^5 vezes, 10^6 vezes e/ou 10^7 ve- zes maior após o tratamento em comparação com um estado de pré- tratamento. Propriedades que podem ser aumentadas incluem células imunológicas, células bacterianas, células estromais, células supresso- ras derivadas de mieloides, fibroblastos, metabólitos e citocinas.
[0047] O “espaçador transcrito interno” ou “ ITS” é uma pedaço de RNA não funcional localizado entre RNA ribossômicos estruturais (rRNA) em um transcrito precursor comum, frequentemente usado para identificação de espécies eucarióticas em fungos particulares. O rRNA de fungos que forma o núcleo do ribossoma é transcrito como um gene sinal e consiste nas regiões 8S, 5.8S e 28S com ITS4 e 5 entre as regi- ões 8S e 5.8S e 5.8S e 28S, respectivamente. Estes dois segmentos intercistrônicos entre as regiões 18S e 5.8S e 5.8S e 28S são removidos por splicing e contêm variações significativas entre as espécies para fins de identificação como precedentemente descrito (Schoch et al., Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi. PNAS 109:6.241 a 6.246. 2.012). O rDNA 18S é tradicionalmente usado para reconstrução filogenética, entre- tanto, o ITS pode desempenhar essa função, visto que geralmente é altamente conservado, mas contém regiões hipervariáveis que abrigam diversidade nucleotídica suficiente para diferenciar gêneros e espécies da maioria dos fungos.
[0048] O termo “isolado” ou “enriquecido” engloba um micróbio, bactérias ou outra entidade ou substância que foi (1) separada de pelo menos alguns dos componentes aos quais a mesma estava associada quando inicialmente produzida (independentemente de ser na natureza ou em uma configuração experimental) e/ou (2) produzida, preparada, purificada e/ou fabricada pela mão do homem.
Micróbios isolados po- dem ser separados de pelo menos cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90% ou mais dos outros componentes aos quais foram inicialmente associados.
Em algumas modalidades, micróbios isolados são mais que cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou mais que cerca de 99% puros.
Como no presente documento usado, uma substância é “pura” se for substancialmente livre de outros compo- nentes.
Os termos “purificar”, “purificando” e “purificado” se referem a um micróbio ou outro material que tenha sido separado de pelo menos parte dos componentes com os quais foi associado quando inicialmente produzido ou gerado (por exemplo, na natureza ou em um ambiente ex- perimental), ou durante qualquer momento após sua produção inicial.
Um micróbio ou uma população microbiana pode ser considerado puri- ficado se for isolado aquando a produção ou após a mesma, tal como de um material ou ambiente contendo o micróbio ou população microbi- ana, e um micróbio ou população microbiana purificado pode conter até cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90% ou acima de cerca de 90% de outros materiais e ainda ser considerado “isolado”. Em algumas modalidades, micróbios ou população microbi- ana purificados são mais que cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou mais que cerca de 99% puros. No caso das composições microbianas no presente documento proporcionadas, o um ou mais tipos microbia- nos presentes na composição podem ser independentemente purifica- dos de um ou mais outros micróbios produzidos e/ou presentes no ma- terial ou ambiente que contém o tipo microbiano. As composições mi- crobianas e os seus componentes microbianos são geralmente purifica- dos a partir de produtos residuais do habitat.
[0049] “Metabólito”, como no presente documento usado, se refere a qualquer e todos os compostos moleculares, composições, moléculas, íons, cofatores, catalisadores ou nutrientes usados como substratos em qualquer reação metabólica celular ou microbiana ou resultante como compostos de produto, composições, moléculas, íons, cofatores, catali- sadores ou nutrientes de qualquer reação metabólica celular ou micro- biana.
[0050] “Micróbio” se refere a qualquer organismo natural ou gene- ticamente modificado caracterizado como uma bactéria, fungo, alga mi- croscópica, protozoário e aos estágios de desenvolvimento ou estágios do ciclo de vida (por exemplo, vegetativo, esporo (incluindo esporula- ção, dormência e germinação), latente, biofilme) associados ao orga- nismo. Exemplos de micróbios intestinais incluem: Actinomyces graeve- nitzii, Actinomyces odontolyticus, Akkermansia muciniphila, Bacteroides caccae, Bacteroides fragilis, Bacteroides putredinis, Bacteroides thetai- otaomicron, Bacteroides vultagus, Bifidobacterium adolescentis, Bifido- bacterium bifidum, Bilophila wadsworthia, Lactococcus lactis, Butyri- vibrio, Campylobacter gracilis, Clostridia cluster III, Clostridia cluster IV, Clostridia cluster IX (grupo Acidaminococcaceae), Clostridia cluster XI, Clostridia cluster XIII (grupo Peptostreptococcus), Clostridia cluster XIV, Clostridia cluster XV, Collinsella aerofaciens, Coprococcus, Corynebac-
terium sunsvallense, Desulfomonas pigra, Dorea formicigenerans, Do- rea longicatena, Escherichia coli, Eubacterium hadrum, Eubacterium re- ctale, Faecalibacteria prausnitzii, Gemella, Lactococcus, Lanchnospira, Mollicutes cluster XVI, Mollicutes cluster XVIII, Prevotella, Rothia muci- laginosa, Ruminococcus callidus, Ruminococcus gnavus, Ruminococ- cus torques e Streptococcus.
[0051] “Microbioma” se refere amplamente aos micróbios que resi- dem sobre ou no corpo de um sujeito ou paciente. Os micróbios em um microbioma podem incluir bactérias, vírus, microrganismos eucarióticos e/ou vírus. Micróbios individuais em um microbioma podem ser metabo- licamente ativos, dormentes, latentes ou existirem como esporos, po- dem existir de modo planctônico ou em biofilmes, ou podem estar pre- sentes no microbioma de maneira sustentável ou transitória. O microbi- oma pode ser um microbioma comensal ou em estado saudável ou um microbioma em estado de doença. O microbioma pode ser nativo ao sujeito ou paciente, ou componentes do microbioma podem ser modu- lados, introduzidos ou depletados devido a mudanças no estado de sa- úde (por exemplo, estado pré-cancerígeno ou cancerígeno) ou condi- ções de tratamento (por exemplo, tratamento com antibióticos, exposi- ção a diferentes micróbios). Em alguns aspectos, o microbioma ocorre em uma superfície da mucosa. Em alguns aspectos, o microbioma é um microbioma do trato gastrointestinal. Em alguns aspectos, o microbioma é um microbioma tumoral.
[0052] Um “perfil de microbioma” ou uma “assinatura de microbi- oma” de um tecido ou amostra se refere a uma caracterização pelo me- nos parcial da constituição bacteriana de um microbioma. Em algumas modalidades, um perfil de microbioma indica que pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 ou mais cepas bacterianas estão presentes ou ausentes em um microbioma.
[0053] “Modificado”, em referência a uma bactéria, se refere ampla- mente a uma bactéria que sofreu uma mudança da sua forma do tipo selvagem. Exemplos de modificações bacterianas incluem modificação genética, expressão gênica, modificação de fenótipo, formulação, modi- ficação química e dose ou concentração. Exemplos de propriedades aprimoradas são descritos ao longo deste relatório descritivo e incluem, por exemplo, atenuação, auxotrofia, ancoragem ou antigenicidade. A modificação de fenótipo pode incluir, a título de exemplo, crescimento de bactérias em meios que modificam o fenótipo de uma bactéria, que aumentam ou diminuem a virulência.
[0054] Como no presente documento usado, um gene é “superex- presso” em uma bactéria se for expresso em um nível mais elevado em uma bactéria geneticamente modificada, sob pelo menos algumas con- dições, do que é expresso por uma bactéria do tipo selvagem da mesma espécie sob as mesmas condições. De modo similar, um gene é “su- bexpresso” em uma bactéria se for expresso em um nível mais baixo em uma bactéria geneticamente modificada, sob pelo menos algumas condições, do que é expresso por uma bactéria do tipo selvagem da mesma espécie sob as mesmas condições.
[0055] Os termos “polinucleotídeo” e “ácido nucleico” são usados de modo intercambiável. Os mesmos se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, ou análogos dos mesmos. Os polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional e podem realizar qualquer função. Os seguintes são exemplos não limitativos de polinucleotídeos: regiões codificadoras ou não codificadoras de um gene ou fragmento de gene, loci (lócus) definidos a partir de análise de ligação, éxons, íntrons, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência, RNA ribossômico, ribozi- mas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramifica-
dos, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA iso- lado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeos. Se presentes, as modificações na estrutura do nucleotídeo podem ser conferidas antes ou após a montagem do polímero. Um polinucleotídeo pode ser ainda modificado, tal como por conjugação com um componente de identifica- ção. Em todas as sequências de ácidos nucleicos no presente docu- mento proporcionadas, os nucleotídeos U são intercambiáveis com nu- cleotídeos T.
[0056] “Unidades taxonômicas operacionais” e "OTU (ou OTU)" re- ferem-se a uma folha terminal em uma árvore filogenética e são defini- das por uma sequência de ácidos nucleicos, por exemplo, o genoma inteiro, ou uma sequência genética específica e todas as sequências que compartilham identidade de sequência com essa sequência de áci- dos nucleicos no nível de espécie. Em algumas modalidades, a sequên- cia genética específica pode ser a sequência 16S ou uma porção da sequência 16S. Em outras modalidades, os genomas inteiros de duas entidades são sequenciados e comparados. Em uma outra modalidade, regiões selecionadas, tais como etiquetas de sequência multilócus (MLST), genes específicos ou conjuntos de genes podem ser genetica- mente comparadas. Para 16S, as OTU que compartilham ≥ 97% de identidade média de nucleotídeos através de toda a 16S ou parte da região variável da 16S são consideradas a mesma OTU. Ver, por exem- plo, Claesson MJ, Wang Q, O'Sullivan O, Greene-Diniz R, Cole JR, Ross RP e O'Toole PW. 2010. Comparison of two next-generation sequencing technologies for resolving highly complex microbiota composition using tandem variable 16S rRNA gene regions. Nucleic Acids Res 38: e200. Konstantinidis KT, Ramette A, e Tiedje JM. 2.006. The bacterial species definition in the genomic era. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 361:
1929 a 1940. Para genomas completos, MLST, genes específicos, além da 16S, ou conjuntos de genes, as OTU que compartilham ≥ 95% de identidade média de nucleotídeos são consideradas a mesma OTU. Ver, por exemplo, Achtman M e Wagner M. 2008. Microbial diversity and the genetic nature of microbial species. Nat. Rev. Microbiol. 6: 431 a 440. Konstantinidis KT, Ramette A, e Tiedje JM. 2.006. The bacterial species definition in the genomic era. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 361: 1929 a 1940. OTU são frequentemente definidas pela comparação de sequências entre organismos. Geralmente, sequências com menos de 95% de identidade de sequência não são consideradas como parte da mesma OTU. OTU também podem ser caracterizadas por qualquer combinação de marcadores ou genes nucleotídicos, em particular, ge- nes altamente conservados (por exemplo, genes "de manutenção"), ou uma combinação dos mesmos. Unidades taxonômicas operacionais (OTU) com atribuições taxonômicas realizadas para, por exemplo, gê- nero, espécie e clado filogenético, são no presente documento propor- cionadas.
[0057] Como no presente documento usado, uma substância é “pura” se for substancialmente livre de outros componentes. Os termos “purificar”, “purificando” e “purificado” se referem a uma EV ou outro ma- terial que tenha sido separado de pelo menos parte dos componentes com os quais foi associado quando inicialmente produzido ou gerado (por exemplo, na natureza ou em um ambiente experimental), ou du- rante qualquer momento após sua produção inicial. Uma EV pode ser considerada purificada se for isolada na produção ou após a mesma, tal como de um ou mais outros componentes bacterianos, e um micróbio ou população microbiana purificado pode conter até cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90% ou acima de cerca de
90% de outros materiais e ainda ser considerado “purificado”. Em algu- mas modalidades, EV purificadas são mais que cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou mais que cerca de 99% puros. Composições de EV e os seus componentes microbianos são, por exemplo, purificadas a partir de produtos residuais do habitat.
[0058] Como no presente documento usado, o termo “composição de EV purificada” ou “composição de EV” se refere a uma preparação que inclui EV que foram separadas de pelo menos uma substância as- sociada encontrada em um material-fonte (por exemplo, separadas de pelo menos um outro componente bacteriano) ou qualquer material as- sociado às EV em qualquer processo usado para produzir a preparação. Também se refere a uma composição que foi significativamente enri- quecida ou concentrada. Em algumas modalidades, as EV são concen- tradas em 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 100 vezes,
1.000 vezes, 10.000 vezes ou mais de 10.000 vezes.
[0059] Como no presente documento usado, “ligação específica” se refere à capacidade de um anticorpo para se ligar a um antígeno prede- terminado ou à capacidade de um polipeptídeo para se ligar a seu par- ceiro de ligação predeterminado. Tipicamente, um anticorpo ou polipep- tídeo se liga especificamente a seu antígeno predeterminado ou par- ceiro de ligação com uma afinidade correspondente a um KD de cerca de 10-7 M ou menos, e se liga ao antígeno predeterminado/parceiro de ligação com uma afinidade (como expressa por KD) que é pelo menos 10 vezes menor, pelo menos 100 vezes menor ou pelo menos 1.000 vezes menor que sua afinidade para a ligação a um antígeno não espe- cífico e não relacionado/parceiro de ligação (por exemplo, BSA, case- ína). Alternativamente, a ligação específica se aplica mais amplamente a um sistema de dois componentes, em que um componente é uma proteína, lipídio ou carboidrato, ou combinação destes, e engata com o segundo componente que é uma proteína, lipídio, carboidrato ou com- binação destes de uma forma específica.
[0060] Os termos “sujeito” ou “paciente” se referem a qualquer ani- mal. Um sujeito ou um paciente descrito como "em necessidade do mesmo" se refere a alguém em necessidade de um tratamento para uma doença. Mamíferos (isto é, animais mamíferos) incluem seres hu- manos, animais de laboratório (por exemplo, primatas, ratos, camun- dongos), gado (por exemplo, vacas, ovelhas, cabras, porcos) e animais de laboratório (por exemplo, cães, gatos, roedores). Por exemplo, o su- jeito pode ser um mamífero não humano incluindo, mas não limitado a, um cachorro, um gato, uma vaca, um cavalo, um porco, um jumento, uma cabra, um camelo, um camundongo, um rato, um porquinho da ín- dia, uma ovelha, uma lhama, um macaco, um gorila ou um chimpanzé. O sujeito ou paciente pode estar saudável, ou pode estar sofrendo de um distúrbio imunológico em qualquer estágio de desenvolvimento.
[0061] “Cepa” se refere a um membro de uma espécie bacteriana com uma assinatura genética de modo que possa ser diferenciado de membros intimamente relacionados da mesma espécie bacteriana. A assinatura genética pode ser a ausência da totalidade ou parte de pelo menos um gene, a ausência da totalidade ou parte de pelo menos uma região reguladora (por exemplo, um promotor, um terminador, um ribos- witch, um sítio de ligação a ribossoma), a ausência (“cura”) de pelo me- nos um plasmídeo nativo, a presença de pelo menos um gene recombi- nante, a presença de pelo menos um gene mutado, a presença de pelo menos um gene externo (um gene derivado de uma outra espécie), a presença de pelo menos uma região reguladora mutada (por exemplo, um promotor, um terminador, um riboswitch, um sítio de ligação a ribos- soma), a presença de pelo menos um plasmídeo não nativo, a presença de pelo menos um cassete de resistência a antibiótico ou uma combi- nação destes. Assinaturas genéticas entre cepas diferentes podem ser identificadas por amplificação de PCR, opcionalmente seguida por se- quenciamento de DNA da região genômica (ou regiões genômicas) de interesse ou de todo o genoma. No caso em que uma cepa (em compa- ração com uma outra da mesma espécie) ganhou ou perdeu resistência a antibiótico ou ganhou ou perdeu uma capacidade biossintética (tal como uma cepa auxotrófica), as cepas podem ser diferenciadas por se- leção ou contrasseleção usando um antibiótico ou nutriente/metabólito, respectivamente.
[0062] Como no presente documento usado, o termo “tratar” uma doença em um sujeito ou “tratar” um sujeito com suspeita de ter uma doença, se refere à submissão do sujeito a um tratamento farmacêutico, por exemplo, a administração de um ou mais agentes, de modo que pelo menos um sintoma da doença seja diminuído ou impedido de piorar. Assim, em uma modalidade, “tratar” se refere, entre outros, ao retarda- mento da progressão, agilização da remissão, indução da remissão, au- mento da remissão, aceleração da recuperação, aumento da eficácia ou diminuição da resistência a terapêuticos alternativos, ou uma combina- ção destes. Bactérias
[0063] Em certos aspectos, são no presente documento proporcio- nados métodos de uso de uma composição bacteriana compreendendo bactérias Veillonella e/ou um produto de tais bactérias (por exemplo, vesículas extracelulares (EV) e/ou biomassa farmaceuticamente ativa (PhABs)). Em algumas modalidades, as bactérias Veillonella são das espécies seguintes: Veillonella tobetsuensis ou Veillonella parvula. Em algumas modalidades, as bactérias Veillonella são das espécies seguin- tes: Veillonella atypica ou Veillonella dispar. Em algumas modalidades, as bactérias são uma cepa de bactérias listada na Tabela 1.
Tabela 1: Cepas Bacterianas Cepa Nome do organismo Sequência 16S SEQ ID NO >S11-19-357F SEQ ID NO 1 AGCAACGCCGCGTGAGTGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAAGCTCTGTTAATCGGGA-
CGAAAGGCCTTCTTGCGAATAGTTAGAAGGATTGACGGTACCGGAATAGAAAGCCACGGCTAACTACG TGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCG- CGCGCAGGCGGATCGGTCAGTCTGTCTTAAAAGTTCGGGGCTTAACCCCGTGAGGGGATGGAAACTG CTGATCTAGAGTATCGGAGAGGAAAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATAT-
A Veillonella tobetsuensis TAGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGACGAAAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCCAG GGGAGCGAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCTGGCCGTAAACGATGGGTACTAGGTGTAG-
GAGGTATCGACCCCTTCTGTGCCGGAGTTAACGCAATAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAA GGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATT- CGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATTGATGGACAGAACTAGAGATAGTTCCTCTTCT TCGGAAGCCAGAAAACAGGTGGTGCACGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGT-
TAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCTTATGTTGCCAGCACTTCGGGTGGGAACTCAT >S14-201 Contig GAGTGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAAGCTCTGTTAATCGGGACGAAAGGCCTT- SEQ ID NO 2 CTTGCGAA-
TAGTGAGAAGGATTGACGGTACCGGAATAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAA TACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGATAGGT- CAGTCTGTCTTAAAAGTTCGGGGCTTAACCCCGTGATGGGATGGAAACTGCCAATCTAGAGTATCGGA GAGGAAAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAAGAACACCAGTGG- CGAAGGCGACTTTCTGGACGAAAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCCAGGGGAGCGAACGGGATTAG ATACCCCGGTAGTCCTGGCCGTAAACGATGGGTACTAGGTGTAGGAGGTATCGACCCCTT- CTGTGCCGGAGTTAACGCAATAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGG
B Veillonella parvula AATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGAAGAAC-
CTTACCAGGTCTTGACATTGATGGACAGAACCAGAGATGGTTCCTCTTCTTCGGAAGCCAGAAAACAG GTGGTGCACGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCG- CAACCCCTATCTTATGTTGCCAGCACTTTGGGTGGGGACTCATGAGAGACTGCCGCAGACAATGCGG AGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTA- CAATGGGAGTTAATAGACGGAAGCGAGATCGCGAGATGGAGCAAACCCGAGAAACACTCTCTCAGTT CGGATCGTAGGCTGCAACTCGCCTACGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCA- TACTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAAAGTCGGAAGTGCC
CAAAGCCGGTGGGGTAACCTTC >S14-205 Contig GAGTGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAAGCTCTGTTAATCGGGACGAAAGGCCTT- SEQ ID NO. 3 CTTGCGAA-
TAGTGAGAAGGATTGACGGTACCGGAATAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAA TACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGATAGGT- CAGTCTGTCTTAAAAGTTCGGGGCTTAACCCCGTGATGGGATGGAAACTGCCAATCTAGAGTATCGGA GAGGAAAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAAGAACACCAGTGG- CGAAGGCGACTTTCTGGACGAAAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCCAGGGGAGCGAACGGGATTAG ATACCCCGGTAGTCCTGGCCGTAAACGATGGGTACTAGGTGTAGGAGGTATCGACCCCTT- CTGTGCCGGAGTTAACGCAATAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGG
C Veillonella parvula AATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGAAGAAC-
CTTACCAGGTCTTGACATTGATGGACAGAACCAGAGATGGTTCCTCTTCTTCGGAAGCCAGAAAACAG GTGGTGCACGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCG- CAACCCCTATCTTATGTTGCCAGCACTTTGGGTGGGGACTCATGAGAGACTGCCGCAGACAATGCGG AGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTA- CAATGGGAGTTAATAGACGGAAGCGAGATCGCGAGATGGAGCAAACCCGAGAAACACTCTCTCAGTT CGGATCGTAGGCTGCAACTCGCCTACGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCA- TACTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAAAGTCGGAAGTGCC CAAAGCCGGTG
[0064] Em algumas modalidades, as bactérias são uma cepa com- preendendo pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de se- quência (por exemplo, pelo menos 99,5% de identidade de sequência,
pelo menos 99,6% de identidade de sequência, pelo menos 99,7% de identidade de sequência, pelo menos 99,8% de identidade de sequên- cia, pelo menos 99,9% de identidade de sequência) com a sequência nucleotídica (por exemplo, sequência nucleotídica genômica, 16S ou CRISPR) das cepas bacterianas listadas na Tabela 1.
[0065] O requerente representa que a ATCC é um depositário que oferece a permanência do depósito e acessibilidade pronta ao mesmo pelo público se uma patente for concedida. Todas as restrições sobre a disponibilidade ao público do material assim depositado serão irrevoga- velmente removidas mediante a concessão de uma patente. O material ficará disponível durante a pendência do pedido de patente a alguém determinado pelo Comissionário a ser intitulado ao mesmo mediante 37 CFR 1.14 e 35 U.S.C. 122. O material depositado será mantido com todos os cuidados necessários para manter o mesmo viável e não con- taminado por um período de pelo menos cinco anos após a solicitação mais recente do fornecimento de uma amostra do plasmídeo depositado e, de qualquer forma, por um período de pelo menos trinta (30) anos após a data de depósito ou pela vida executável da patente, o período que for mais longo. O requerente reconhece seu dever de substituir o depósito se o depositário for incapaz de fornecer uma amostra quando solicitado devido à condição do depósito.
[0066] Em algumas modalidades, as bactérias descritas no pre- sente documento são modificadas para aprimorar a colonização e/ou o enxerto no trato gastrointestinal mamífero (por exemplo, metabolismo modificado, tal como degradação de mucina aprimorada, perfil de com- petição intensificado, mobilidade aumentada, adesão aumentada às cé- lulas epiteliais intestinais, quimiotaxia modificada). Em algumas modali- dades, as bactérias descritas no presente documento são modificadas para intensificar seu efeito imunomodulador e/ou terapêutico (por exem-
plo, quer isoladamente ou em combinação com outro agente terapêu- tico). Em algumas modalidades, as bactérias descritas no presente do- cumento são modificadas para intensificar a ativação imunológica (por exemplo, através da produção modificada de polissacarídeos, pili, fím- brias, adesinas, vesículas). Em algumas modalidades, as bactérias no presente documento descritas no presente documento são modificadas para aprimorar a fabricação bacteriana (por exemplo, tolerância mais elevada ao oxigênio, tolerância aprimorada à congelação-descongela- ção, tempos de geração mais curtos).
[0067] As bactérias Veillonella (por exemplo, Veillonella tobetsuen- sis, Veillonella parvula) podem ser cultivadas de acordo com métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, as bactérias Veillonella (por exem- plo, uma cepa de bactérias listada na Tabela 1) pode ser cultivada em Meio ATCC 2722, Meio ATCC 1490 ou outro meio usando métodos di- vulgados, por exemplo, em Caballero et al., 2017. "Cooperating Com- mensals Restore Colonization Resistance to Vancomycin-Resistant En- terococcus faecium" Cell Host & Microbe 21:592–602, que está no pre- sente documento incorporado a título de referência na sua totalidade. Produção de EV
[0068] Em certos aspectos, as EV de bactérias Veillonella (por exemplo, Veillonella tobetsuensis, Veillonella parvula) no presente do- cumento descritas podem ser preparadas usando qualquer método co- nhecido na técnica.
[0069] Em algumas modalidades, as EV de bactérias Veillonella de modulação imunológica (por exemplo, Veillonella tobetsuensis, Veillo- nella parvula) são preparadas sem uma etapa de purificação de EV. Por exemplo, em algumas modalidades, as bactérias Veillonella de modula- ção imunológica (por exemplo, Veillonella tobetsuensis, Veillonella par- vula), compreendendo as EV no presente documento descritas, são mortas usando um método que deixa as EV de bactérias Veillonella de modulação imunológica (por exemplo, Veillonella tobetsuensis, Veillo- nella parvula) intactas e os componentes bacterianos resultantes, inclu- indo as EV, são usados nos métodos e composições no presente docu- mento descritos. Em algumas modalidades, as bactérias Veillonella de modulação imunológica (por exemplo, Veillonella tobetsuensis, Veillo- nella parvula) são mortas usando um antibiótico (por exemplo, usando um antibiótico no presente documento descrito). Em algumas modalida- des, as bactérias Veillonella de modulação imunológica (por exemplo, Veillonella tobetsuensis, Veillonella parvula) são mortas usando irradia- ção UV.
[0070] Em algumas modalidades, as EV no presente documento descritas são purificadas a partir de um ou mais outros componentes bacterianos. Métodos para purificar EV provenientes de bactérias são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, as EV são prepara- das a partir de culturas bacterianas usando métodos descritos em S. Bin Park, et al. PLoS ONE. 6(3):e17629 (2011) ou G. Norheim, et al. PLoS ONE. 10(9): e0134353 (2015), cada um dos quais é no presente docu- mento incorporado a título de referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, as bactérias são cultivadas até elevada densidade óptica e, então, centrifugadas para sedimentar as bactérias (por exemplo, a
10.000 x g durante 30 min a 4°C, a 15.500 x g durante 15 min a 4°C ). Em algumas modalidades, os sobrenadantes de cultura são, então, pas- sados através do filtro para excluir as células bacterianas intactas (por exemplo, um filtro de 0,22 µm). Em algumas modalidades, os sobrena- dantes são então submetidos a filtração de fluxo tangencial, durante a qual o sobrenadante é concentrado, espécies menores que 100 kDa são removidas e o meio é parcialmente trocado por PBS. Em algumas mo- dalidades, os sobrenadantes filtrados são centrifugados para sedimen- tar as EV bacterianas (por exemplo, a 100.000-150.000 x g durante 1-3 horas a 4°C, a 200.000 x g durante 1-3 horas a 4°C). Em algumas mo- dalidades, as EV são ainda purificadas ressuspendendo os sedimentos de EV resultantes (por exemplo, em PBS) e aplicando as EV ressuspen- sas a um gradiente Optiprep (iodixanol) ou gradiente (por exemplo, um gradiente descontínuo de 30 a 60%, um gradiente descontínuo de 0 a 45%), seguido de centrifugação (por exemplo, a 200.000 x g durante 4- 20 horas a 4°C). As bandas de EV podem ser coletadas, diluídas com PBS e centrifugadas para sedimentar as EV (por exemplo, a 150.000 x g durante 3 horas a 4°C, a 200.000 x g durante 1 hora a 4°C). As EV purificadas podem ser armazenadas, por exemplo, a -80°C ou -20°C até ao uso. Em algumas modalidades, as EV são ainda purificadas por tra- tamento com DNase e/ou proteinase K.
[0071] Por exemplo, em algumas modalidades, culturas de bacté- rias de Veillonella de modulação imunológica (por exemplo, Veillonella tobetsuensis, Veillonella parvula) no presente documento divulgadas podem ser centrifugadas a 11.000 x g durante 20-40 min a 4 °C para sedimentar as bactérias. Os sobrenadantes de cultura podem ser pas- sados através de um filtro de 0,22 µm para excluir células bacterianas intactas. Os sobrenadantes filtrados podem, então, ser concentrados usando métodos que podem incluir, mas não se limitam a, precipitação com sulfato de amônio, ultracentrifugação ou filtração. Por exemplo, para precipitação com sulfato de amônio, sulfato de amônio 1,5-3 M pode ser adicionado ao sobrenadante filtrado lentamente, com agitação a 4°C. As precipitações pode ser incubadas a 4°C durante 8-48 horas e, então, centrifugadas a 11.000 x g durante 20 a 40 min a 4°C. Os sedimentos resultantes contêm EV de bactérias Veillonella de modula- ção imunológica (por exemplo, Veillonella tobetsuensis, Veillonella par- vula) e outros detritos. Usando ultracentrifugação, os sobrenadantes fil- trados podem ser centrifugados a 100.000-200.000 x g durante 1-16 ho- ras a 4°C. O sedimento desta centrifugação contém EV de bactérias
Veillonella de modulação imunológica (por exemplo, Veillonella tobetsu- ensis, Veillonella parvula) e outros detritos, tais como grandes comple- xos proteicos. Em algumas modalidades, usando uma técnica de filtra- ção, tal como através do uso de um filtro rotatório Amicon Ultra ou por filtração de fluxo tangencial, os sobrenadantes podem ser filtrados de modo a reter espécies de peso molecular > 50 ou 100 kDa.
[0072] Alternativamente, as EV podem ser obtidas a partir de cultu- ras de bactérias Veillonella de modulação imunológica (por exemplo, Veillonella tobetsuensis, Veillonella parvula) continuamente durante o crescimento ou em pontos temporais selecionados durante o cresci- mento, por exemplo, pela conexão de um biorreator a um sistema de fluxo tangencial alternado (ATF) (por exemplo, XCell ATF da Repligen). O sistema ATF retém as células intactas (>0,22 um) no biorreator e per- mite que os componentes menores (por exemplo, EV, proteínas livres) passem através de um filtro para coleta. Por exemplo, o sistema pode ser configurado de modo que o filtrado <0,22 μm seja, então, passado através de um segundo filtro de 100 kDa, permitindo que espécies, tais como EV entre 0,22 μm e 100 kDa, sejam coletadas e espécies menores que 100 kDa sejam bombeadas de volta para o biorreator. Alternativa- mente, o sistema pode ser configurado para permitir que o meio no bior- reator seja reabastecido e/ou modificado durante o desenvolvimento da cultura. As EV coletadas por este método podem ser ainda purificadas e/ou concentradas por ultracentrifugação ou filtração como descrito acima para sobrenadantes filtrados.
[0073] As EV obtidas por métodos no presente documento propor- cionados podem ser ainda purificadas por cromatografia em coluna ba- seada no tamanho, por cromatografia de afinidade, por cromatografia de troca iônica e por ultracentrifugação em gradiente, usando métodos que podem incluir, mas que não se limitam a, uso de um gradiente de sacarose ou gradiente Optiprep. Sucintamente, usando um método com gradiente de sacarose, se a precipitação com sulfato de amônio ou a ultracentrifugação foram usadas para concentrar os sobrenadantes fil- trados, os sedimentos são ressuspensos em sacarose a 60%, Tris 30 mM, pH 8,0. Se filtração foi usada para concentrar o sobrenadante fil- trado, o concentrado é trocado de tampão para sacarose a 60%, Tris 30 mM, pH 8,0, usando uma coluna Amicon Ultra. As amostras são aplica- das a um gradiente de sacarose descontínuo a 35-60% e centrifugadas a 200.000 x g durante 3-24 horas a 4°C. Sucintamente, usando um mé- todo com gradiente Optiprep, se a precipitação com sulfato de amônio ou ultracentrifugação foram usadas para concentrar os sobrenadantes filtrados, os sedimentos são ressuspensos em PBS e 3 volumes de Op- tiprep a 60% são adicionados à amostra. Em algumas modalidades, se a filtração foi usada para concentrar o sobrenadante filtrado, o concen- trado é diluído usando Optiprep a 60% até uma concentração final de Optiprep a 35%. As amostras são aplicadas a um gradiente Optiprep descontínuo a 0-45% e centrifugadas a 200.000 x g durante 3-24 horas a 4°C, por exemplo, 4-24 horas a 4°C.
[0074] Em algumas modalidades, para confirmar a esterilidade e o isolamento das preparações de EV, as EV são diluídas em série em meio de ágar usado para cultura de rotina das bactérias a serem testa- das e incubadas usando condições de rotina. Preparações não estéreis são passadas através de um filtro de 0,22 μm para excluir as células intactas. Para aumentar ainda mais a pureza, as EV isoladas podem ser tratadas com DNase ou proteinase K.
[0075] Em algumas modalidades, para a preparação de EV usadas para injeções in vivo, as EV purificadas são processadas como descrito precedentemente (G. Norheim, et al. PLoS ONE. 10(9): e0134353 (2015)). Sucintamente, após a centrifugação em gradiente de sacarose, as bandas contendo EV são ressuspensas até uma concentração final de 50 µg/mL em uma solução contendo sacarose a 3% ou outra solução adequada para injeção in vivo conhecida por um perito na técnica. Esta solução pode também conter adjuvante, por exemplo, hidróxido de alu- mínio a uma concentração de 0-0,5% (p/v). Em algumas modalidades, para preparação de EV usadas para injeções in vivo, EV em PBS são esterilizadas por filtração para < 0,22 μm.
[0076] Em certas modalidades, para tornar as amostras compatí- veis com testes adicionais (por exemplo, para remover a sacarose antes do imageamento TEM ou ensaios in vitro), as amostras são trocadas de tampão para PBS ou Tris 30 mM, pH 8,0, usando filtração (por exemplo, colunas Amicon Ultra), diálise ou ultracentrifugação (200.000 x g, ≥ 3 horas, 4°C) e ressuspensão.
[0077] Em algumas modalidades, a esterilidade das preparações de EV pode ser confirmada plaqueando uma porção das EV em meio de ágar usado para cultura padrão das bactérias usadas na geração das EV e incubando-a usando condições padrão.
[0078] Em algumas modalidades, as EV selecionadas são isoladas e enriquecidas por cromatografia e porções químicas de superfície de ligação em EV. Em outras modalidades, as EV selecionadas são isola- das e/ou enriquecidas por separação de células por fluorescência por métodos que usam reagentes de afinidade, corantes químicos, proteí- nas recombinantes ou outros métodos conhecidos por um perito na téc- nica. Composições Bacterianas/Farmacêuticas
[0079] Em certos aspectos, são no presente documento proporcio- nados métodos de uso de uma composição bacteriana compreendendo bactérias Veillonella e/ou um produto de tais bactérias (por exemplo, vesículas extracelulares (EV) e/ou biomassa farmaceuticamente ativa (PhABs)). Em algumas modalidades, as bactérias são uma cepa de bac- térias listada na Tabela 1. Em algumas modalidades, as bactérias são uma cepa compreendendo pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 99,5% de identidade de sequência, pelo menos 99,6% de identidade de sequência, pelo me- nos 99,7% de identidade de sequência, pelo menos 99,8% de identi- dade de sequência, pelo menos 99,9% de identidade de sequência) com a sequência nucleotídica de uma cepa bacteriana listada na Tabela 1. Em algumas modalidades, a formulação bacteriana compreende uma bactéria e/ou uma combinação de bactérias no presente documento descritas e um transportador farmaceuticamente aceitável (por exem- plo, uma composição farmacêutica).
[0080] Em algumas modalidades, pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bactérias na composição bacteriana são bacté- rias Veillonella (por exemplo, uma cepa de bactérias listada na Tabela 1). Em algumas modalidades, substancialmente todas as bactérias na composição bacteriana são bactérias Veillonella (por exemplo, uma cepa de bactérias listada na Tabela 1). Em certas modalidades, a com- posição bacteriana compreende pelo menos 1 x 103 unidades formado- ras de colônias (UFC), 1 x 104 unidades formadoras de colônias (UFC), 1 x 105 unidades formadoras de colônias (UFC), 5 x 105 unidades for- madoras de colônias (UFC), 1 x 106 unidades formadoras de colônias (UFC), 2 x 106 unidades formadoras de colônias (UFC), 3 x 106 unida- des formadoras de colônias (UFC), 4 x 106 unidades formadoras de co- lônias (UFC), 5 x 106 unidades formadoras de colônias (UFC), 6 x 106 unidades formadoras de colônias (UFC), 7 x 106 unidades formadoras de colônias (UFC), 8 x 106 unidades formadoras de colônias (UFC), 9 x 106 unidades formadoras de colônias (UFC), 1 x 107 unidades for- madoras de colônias (UFC), 2 x 107 unidades formadoras de colônias
(UFC), 3 x 107 unidades formadoras de colônias (UFC), 4 x 107 unida- des formadoras de colônias (UFC), 5 x 107 unidades formadoras de co- lônias (UFC), 6 x 107 unidades formadoras de colônias (UFC), 7 x 107 unidades formadoras de colônias (UFC), 8 x 107 unidades formadoras de colônias (UFC), 9 x 107 unidades formadoras de colônias (UFC), 1 x 108 unidades formadoras de colônias (UFC), 2 x 108 unidades for- madoras de colônias (UFC), 3 x 108 unidades formadoras de colônias (UFC), 4 x 108 unidades formadoras de colônias (UFC), 5 x 108 unida- des formadoras de colônias (UFC), 6 x 108 unidades formadoras de co- lônias (UFC), 7 x 108 unidades formadoras de colônias (UFC), 8 x 108 unidades formadoras de colônias (UFC), 9 x 108 unidades formadoras de colônias (UFC), 1 x 109 unidades formadoras de colônias (UFC), 5 x 109 unidades formadoras de colônias (UFC), 1 x 1010 unidades for- madoras de colônias (UFC), 5 x 1010 unidades formadoras de colônias (UFC), 1 x 1011 unidades formadoras de colônias (UFC), 5 x 1011 unida- des formadoras de colônias (UFC), 1 x 1012 unidades formadoras de co- lônias (UFC), 5 x 1012 unidades formadoras de colônias (UFC), 1 x 1013 unidades formadoras de colônias (UFC), de bactérias Veillonella (por exemplo, uma cepa de bactérias listada na Tabela 1.)
[0081] Em algumas modalidades, pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bactérias na composição são selecionadas dentre as espécies bacterianas no presente docu- mento descritas. 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bactérias na composição são selecionadas dentre as cepas bacterianas no presente documento descritas.
[0082] Em algumas modalidades, as composições no presente do- cumento descritas podem incluir apenas uma espécie de bactérias no presente documento descrita ou podem incluir duas ou mais espécies de bactérias no presente documento descritas. Por exemplo, 1, 2 ou 3 das cepas no presente documento descritas, em qualquer combinação, podem estar incluídas nas composições no presente documento propor- cionadas.
[0083] Em algumas modalidades, a composição bacteriana compre- ende uma bactéria morta, uma bactéria viva e/ou uma bactéria atenu- ada. As bactérias podem ser mortas por calor por pasteurização, esteri- lização, tratamento a temperatura elevada, cozimento por pulverização e/ou secagem por pulverização (tratamentos térmicos podem ser reali- zados a 50ºC, 65ºC, 85ºC ou uma variedade de outras temperaturas e/ou uma quantidade variada de tempo). As bactérias podem também ser mortas ou inativadas usando irradiação γ (irradiação gama), exposi- ção à luz UV, inativação por formalina e/ou métodos de congelamento, ou uma combinação destes. Por exemplo, as bactérias podem ser ex- postas a 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou 50 kGy de radiação antes da administração. Em algumas modalidades, as bactérias (por exemplo, Veillonella tobetsuensis, Veillonella parvula) são mortas usando irradiação gama. Em algumas modalidades, as bactérias são mortas ou inativadas usando irradiação de elétrons (por exemplo, radi- ação beta) ou irradiação de raios x.
[0084] As bactérias podem ser deixadas crescer até várias fases de crescimento e testadas quanto à eficácia em diferentes diluições e em diferentes momentos durante a fase de crescimento. Por exemplo, as bactérias podem ser testadas quanto à eficácia após a administração na fase estacionária (incluindo fase estacionária inicial ou tardia) ou em vários pontos temporais durante a fase exponencial. Além da inativação por vários métodos, as bactérias podem ser testadas quanto à eficácia usando diferentes razões de células vivas versus células inativadas, ou diferentes razões de células em várias fases de crescimento.
[0085] Em certas modalidades, são no presente documento propor- cionadas composições farmacêuticas compreendendo EV de Veillonella (por exemplo, EV de Veillonella tobetsuensis, EV de Veillonella parvula) e/ou bactérias Veillonella (por exemplo, Veillonella tobetsuensis, Veillo- nella parvula). no presente documento proporcionada (por exemplo, uma composição de EV), como as divulgadas no Pedido Provisório de Patente dos EUA N.º 62/578,559, no presente documento incorporado a título de referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, a composição de EV compreende uma EV e/ou uma combinação de EV no presente documento descrita e um transportador farmaceuticamente aceitável.
[0086] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem EV de Veillonella substancialmente, ou inteiramente, isentas de bactérias. Em algumas modalidades, as composições farma- cêuticas compreendem tanto EV de Veillonella quanto bactérias Veillo- nella inteiras (por exemplo, bactérias vivas, bactérias mortas, bactérias atenuadas). Em certas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem bactérias Veillonella que são substancialmente, ou intei- ramente, isentas de EV.
[0087] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica com- preende pelo menos 1 bactéria Veillonella por cada 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8. 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8. 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8. 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8. 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8. 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8. 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8. 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8. 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8. 9,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47,
48. 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68. 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78. 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85,
86, 87, 88. 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98. 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x103, 2x103, 3x103, 4x103, 5x103, 6x103, 7x103, 8x103, 9x103, 1x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108 , 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, e/ou 1x1012 partículas de EV de Veillonella.
[0088] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica com- preende cerca de 1 bactéria Veillonella por cada 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8. 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8. 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8. 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8. 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8. 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8. 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8. 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8. 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8. 9,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48. 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,
68. 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78. 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88. 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98. 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x103, 2x103, 3x103, 4x103, 5x103, 6x103, 7x103, 8x103, 9x103, 1x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107,
1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108 , 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, e/ou 1x1012 partículas de EV de Veillonella.
[0089] Em certas modalidades, a composição farmacêutica compre- ende uma certa proporção entre as partículas de bactérias Veillonella e as partículas de EV de Veillonella. O número de partículas de bactérias Veillonella pode ser baseado no número real de partículas ou (se as bactérias estiverem vivas) no número de UFC. O número de partículas pode ser estabelecido combinando-se um número definido de EV de Veillonella purificadas com um número definido de bactérias Veillonella purificadas, modificando-se as condições de crescimento sob as quais as bactérias Veillonella são cultivadas ou modificando-se as próprias bactérias Veillonella para produzir mais ou menos EV de Veillonella.
[0090] Em algumas modalidades, para quantificar os números de EV de Veillonella e/ou bactérias Veillonella presentes em uma amostra bacteriana, microscopia eletrônica (por exemplo, EM de seções conge- ladas ultrafinas) pode ser usada para visualizar as vesículas e bactérias e contar seus números relativos. Alternativamente, combinações de análise de rastreamento de nanopartículas (NTA), contagem com con- tador Coulter e dispersão dinâmica de luz (DLS) ou uma combinação destas técnicas podem ser usadas. A NTA e o contador Coulter contam partículas e mostram seus tamanhos. A DLS fornece a distribuição de tamanho de partículas, mas não a concentração. As bactérias têm, fre- quentemente, diâmetros de 1-2 μm. O intervalo total é de 0,2-20 μm. Resultados combinados da contagem com contador Coulter e NTA po- dem revelar os números de bactérias em uma determinada amostra. A contagem com contador Coulter revela os números de partículas com diâmetros de 0,7-10 μm. A NTA revela os números de partículas com diâmetros de 50-1.400 nm. Para a maioria das amostras bacterianas, o contador Coulter isoladamente pode revelar o número de bactérias em uma amostra. As EV têm um diâmetro de 20-250 nm. A NTA permitirá a contagem dos números de partículas que têm diâmetro de 50-250 nm. A DLS revela a distribuição de partículas de diferentes diâmetros em um intervalo aproximado de 1 nm - 3 μm.
[0091] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica com- preende não mais do que 1 bactéria Veillonella por cada 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8. 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8. 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8. 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8. 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8. 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8. 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8. 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8. 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8. 9,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,
28. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48. 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68. 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78. 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88. 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98. 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x103, 2x103, 3x103, 4x103, 5x103, 6x103, 7x103, 8x103, 9x103, 1x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108 , 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, e/ou 1x1012 partículas de EV de Veillonella.
[0092] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica com- preende pelo menos 1 partícula de EV de Veillonella por cada 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8. 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8. 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8. 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8. 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8. 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8. 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8. 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8. 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8. 9,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48. 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68. 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78. 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88. 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98. 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x103, 2x103, 3x103, 4x103, 5x103, 6x103, 7x103, 8x103, 9x103, 1x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107 , 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108 , 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, e/ou 1x1012 bactérias Veillonella.
[0093] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica com- preende cerca de1 partícula de EV de Veillonella por cada1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8. 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8. 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8. 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8. 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8. 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8. 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8. 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8. 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7,
9,8. 9,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48. 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68. 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78. 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88. 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98. 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x103, 2x103, 3x103, 4x103, 5x103, 6x103, 7x103, 8x103, 9x103, 1x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107 , 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108 , 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, e/ou 1x1012 bactérias Veillonella. Em algu- mas modalidades, a composição farmacêutica compreende não mais do que 1 partícula de EV de Veillonella por cada1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8. 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8. 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8. 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8. 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8. 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8. 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8. 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8. 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8. 9,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48. 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,
68. 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78. 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88. 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98. 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x103, 2x103, 3x103, 4x103, 5x103, 6x103, 7x103, 8x103, 9x103,
1x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108 , 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, e/ou 1x1012 bactérias Veillonella.
[0094] Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%das partículas na composição farmacêutica são EV de Veillonella.
[0095] Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das partículas na composição farmacêutica são bactérias Veillonella.
[0096] Em algumas modalidades, não mais do que 1%, 2%, 3%,
4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das partícu- las na composição farmacêutica são EV de Veillonella.
[0097] Em algumas modalidades, não mais do que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das partícu- las na composição farmacêutica são bactérias Veillonella.
[0098] Em algumas modalidades, cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das partículas na composição farmacêutica são EV de Veillonella.
[0099] Em algumas modalidades, cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%,
6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das partículas na composição farmacêutica são bactérias Veillonella.
[0100] Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da proteína na composição farmacêutica é proteína de EV de Veillonella.
[0101] Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da proteína na composição farmacêutica é proteína de bactérias Veillonella.
[0102] Em algumas modalidades, não mais do que 1%, 2%, 3%,
4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da proteína na composição farmacêutica é proteína de EV de Veillonella.
[0103] Em algumas modalidades, não mais do que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da proteína na composição farmacêutica é proteína de bactérias Veillonella.
[0104] Em algumas modalidades, cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da proteína na composição farmacêutica é proteína de EV de Veillonella.
[0105] Em algumas modalidades, cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%,
6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da proteína na composição farmacêutica é proteína de bactérias Veillonella.
[0106] Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% dos lipídios na composição farmacêutica são lipídios de EV de Veillonella.
[0107] Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% dos lipídios na composição farmacêutica são lipídios de bactérias Veillonella.
[0108] Em algumas modalidades, não mais do que 1%, 2%, 3%,
4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% dos lipídios na composição farmacêutica são lipídios de EV de Veillonella.
[0109] Em algumas modalidades, não mais do que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% dos lipídios na composição farmacêutica são lipídios de bactérias Veillonella.
[0110] Em algumas modalidades, cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% dos lipídios na composição farmacêutica são lipídios de EV de Veillonella.
[0111] Em algumas modalidades, cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%,
6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% dos lipídios na composição farmacêutica são lipídios de bactérias Veillonella.
[0112] Em algumas modalidades, as EV de Veillonella na compo- sição farmacêutica são purificadas a partir de um ou mais outros com- ponentes bacterianos. Em algumas modalidades, a composição farma- cêutica compreende ainda outros componentes bacterianos. Em algu- mas modalidades, a composição farmacêutica compreende células de bactérias.
[0113] Como descrito em detalhe abaixo, as composições farma- cêuticas no presente documento divulgadas podem ser especialmente formuladas para administração sob a forma sólida ou líquida, incluindo aquelas adaptadas para administração por via oral ou retal.
[0114] Em algumas modalidades, a composição no presente docu- mento descrita pode ser uma composição farmacêutica, um suplemento dietético, ou um produto alimentício (por exemplo, um alimento ou be- bida). Em algumas modalidades, o produto alimentício é uma ração ani- mal.
[0115] Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica para administração oral no presente documento descrita compreende um componente adicional que permite a entrega eficiente das bactérias ao cólon. Em algumas modalidades, a preparação farmacêutica que permite a entrega das bactérias ao cólon pode ser usada. Exemplos de tais formulações incluem composições sensíveis a pH, como formula- ções em sachê tamponadas ou polímeros entéricos, que liberam seus conteúdos quando o pH se torna alcalino após os polímeros entéricos atravessarem o estômago. Quando uma composição sensível a pH é usada para formular a preparação farmacêutica, a composição sensível a pH pode ser um polímero cujo limite de pH da decomposição da com- posição é entre cerca de 6,8 e cerca de 7,5.
[0116] Uma outra modalidade de uma composição farmacêutica útil para a entrega das bactérias ao cólon é uma que garanta a entrega ao cólon retardando a liberação das bactérias em aproximadamente 3 a 5 horas, o que corresponde o tempo de trânsito no intestino delgado. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica para liberação retar- dada inclui um invólucro de hidrogel. O hidrogel é hidratado e dilata me- diante contato com o fluidos gastrointestinais, com o resultado que os conteúdos são efetivamente liberados (predominantemente liberado no cólon). As unidades de dosagem de liberação retardada incluem com- posições contendo bactérias que têm um material que reveste, ou sele- tivamente reveste, as bactérias. Exemplos de tal material de revesti- mento seletivo incluem polímeros degradáveis in vivo, polímeros gradu- almente hidrolisáveis, polímeros gradualmente solúveis em água e/ou polímeros degradáveis por enzimas. Uma ampla variedade de materiais de revestimento para retardar eficientemente a liberação está disponível e inclui, por exemplo, polímeros à base de celulose, tais como hidroxi- propilcelulose, polímeros de ácido acrílico e copolímeros, tais como po- límeros e copolímeros de ácido metacrílico, e polímeros e copolímeros de vinila, tais como polivinilpirrolidona.
[0117] Exemplos de composições que permitem a entrega ao cólon incluem ainda composições bioadesivas que se aderem especifica- mente à membrana mucosa colônica (por exemplo, um polímero des-
crito no relatório descritivo da Patente dos EUA N.º 6,368,586, no pre- sente documento incorporada a título de referência) e composições em que um inibidor de protease é incorporado para proteger particularmente uma preparação biofarmacêutica nos tratos gastrointestinais contra a decomposição devido a uma atividade de uma protease.
[0118] Um exemplo de um sistema que permite que a entrega ao cólon é um sistema de entrega de uma composição ao cólon por mu- dança de pressão, de modo que os conteúdos sejam liberados usando a mudança de pressão causada pela geração de gás na fermentação bacteriana em uma porção distal do estômago. Tal sistema não é parti- cularmente limitado e um exemplo mais específico do mesmo é uma cápsula que tem os conteúdos dispersos em uma base de supositório e que é revestido com um polímero hidrofóbico (por exemplo, etilcelulose).
[0119] Um outro exemplo do sistema que permite a entrega ao có- lon é um sistema de entrega de uma composição ao cólon, sendo que o sistema é especificamente decomposto por uma enzima (por exemplo, uma hidrolase de carboidrato ou uma redutase de carboidrato ) presente no cólon. Tal sistema não é particularmente limitado e exemplos mais específicos dos mesmos incluem sistemas que usam componentes ali- mentícios como polissacarídeos não amiláceos, amilose, goma de xan- tana e azopolímeros.
[0120] Em algumas modalidades, formulações probióticas contendo uma cepa bacteriana listada na Tabela 1 são proporcionadas como for- mas encapsuladas, com revestimento entérico ou em pó, com doses que variam até 1011 ufc (por exemplo, até 1010 ufc). Em algumas moda- lidades, a composição compreende 5 x 1011 ufc de uma cepa bacteriana listada na Tabela 1 e 10% (p/p) de amido de milho em uma cápsula. A cápsula tem revestimento entérico para liberação duodenal em pH 5,5. Em algumas modalidades, a cápsula tem revestimento entérico para li- beração duodenal em pH 5,5. Em algumas modalidades, a composição compreende um pó de bactérias seco por congelamento de uma cepa bacteriana listada na Tabela 1, que é considerada em situação de "Su- posição Qualificada de Segurança" (QPS). Em algumas modalidades, a composição é estável a temperatura de congelação ou refrigeração.
[0121] Os métodos para produzir composições microbianas podem incluir três etapas de processamento principais. As etapas são: depósito de organismo, produção de organismo e preservação. Em certas moda- lidades, uma amostra que contém uma abundância da cepa bacteriana (por exemplo, uma cepa de bactérias listada na Tabela 1) pode ser cul- tivada evitando-se uma etapa de isolamento.
[0122] Para o depósito, as cepas incluídas na composição microbi- ana podem ser (1) isoladas diretamente a partir de um espécime ou to- madas a partir de um estoque depositado, (2) opcionalmente cultivadas em um ágar ou caldo nutritivo, que suporta o crescimento para gerar biomassa viável e (3) a biomassa opcionalmente preservada em múlti- plas alíquotas em armazenamento a longo prazo.
[0123] Em modalidades que usam uma etapa de cultura, o ágar ou caldo pode conter nutrientes que fornecem elementos essenciais e fa- tores específicos que possibilitam o crescimento. Um exemplo seria um meio composto por 20 g/L de glicose, 10 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de peptona de soja, 2 g/L de ácido cítrico, 1,5 g/L de fosfato de sódio monobásico, 100 mg/L de citrato de amônio férrico, 80 mg/L de sulfato de magnésio, 10 mg/L de cloreto de hemina, 2 mg/L de cloreto de cálcio, 1 mg/L de menadiona. Outro exemplo seria um meio composto por 10 g/L de extrato bovino, 10 g/L de peptona, 5 g/L de cloreto de sódio, 5 g/L de dextrose, 3 g/L de extrato de levedura, 3 g/L de acetato de sódio, 1 g/L de amido solúvel e 0,5 g/L de HCl de L-cisteína a pH 6,8. Uma variedade de meios microbiológicos e variações são bem conhecidas na técnica (por exemplo, R.M. Atlas, Handbook of Microbiological Media (2010) CRC Press). O meio de cultura pode ser adicionado à cultura no início, pode ser adicionado durante a cultura ou pode ser fluído de modo intermitente/contínuo através da cultura. As cepas na composição bac- teriana podem ser cultivadas sozinhas, como um subconjunto da com- posição microbiana, ou como uma coleção inteira compreendendo a composição microbiana. Como um exemplo, uma primeira cepa pode ser cultivada juntamente com uma segunda cepa em uma cultura contí- nua misturada, a uma taxa de diluição inferior à taxa de crescimento máximo de uma das células para impedir que a cultura seja lavada para fora do cultivo.
[0124] A cultura inoculada é incubada mediante condições favorá- veis por um tempo suficiente para construir biomassa. Para as compo- sições microbianas para uso humano, isso é frequentemente à tempe- ratura de 37 °C, pH e outros parâmetros com valores similares ao nicho humano normal. O ambiente pode ser controlado ativamente, contro- lado passivamente (por exemplo, por meio de tampões), ou pode ser permitido derivar. Por exemplo, para composições bacterianas anaeró- bicas, um ambiente anóxico/redutor pode ser empregado. Isso pode ser alcançado por adição de agentes de redução, tais como cisteína, ao caldo e/ou privando o mesmo de oxigênio. Como um exemplo, uma cul- tura de uma composição bacteriana pode ser cultivada a 37 °C, pH 7, no meio acima, pré-reduzida com 1 g/L de HCl de cisteína.
[0125] Quando a cultura tiver gerado biomassa suficiente, a mesma pode ser preservada para depósito. Os organismos podem ser coloca- dos em um meio químico que protege contra congelamento (adicio- nando “crioprotetores”), secagem (“lioprotetores”) e/ou choque osmótico (“osmoprotetores”), dispensados em múltiplos recipientes (opcional- mente idênticos) para criar um banco uniforme e, então, tratando a cul- tura para preservação. Os recipientes são geralmente impermeáveis e têm fechos que asseguram o isolamento do ambiente. O tratamento de criopreservação é alcançado congelando-se um líquido em temperatu- ras ultrabaixas (por exemplo, a ou abaixo de - 80 °C). A preservação seca remove a água da cultura por evaporação (no caso de secagem por pulverização ou “secagem fria”) ou por sublimação (por exemplo, para secagem por congelamento, secagem por congelamento por pul- verização). A remoção de água aprimora a estabilidade de armazena- mento da composição microbiana a longo prazo em temperaturas ele- vadas acima de condições criogênicas. Se a composição microbiana compreende, por exemplo, espécies formadoras de esporos e resulta na produção de esporos, a composição final pode ser purificada por meios adicionais, tais como centrifugação em gradiente de densidade. O depósito de composição microbiana pode ser realizado cultivando-se e preservando-se as cepas individualmente, ou misturando-se as cepas em conjunto para criar um banco combinado. Como um exemplo de cri- opreservação, uma cultura de composição microbiana pode ser colhida através de centrifugação para sedimentar as células do meio de cultura, o sobrenadante decantado e substituído por caldo de cultura fresco con- tendo 15% de glicerol. A cultura pode, então, ser aliquotada em criotu- bos de 1 mL, vedada e colocada a -80 °C para retenção de viabilidade a longo prazo. Este procedimento alcança a viabilidade aceitável medi- ante a recuperação do armazenamento congelado.
[0126] A produção microbiana pode ser conduzida usando etapas de cultura similares ao depósito, incluindo a composição do meio e con- dições de cultura descritos acima. Pode ser conduzida em maiores es- calas de operação, especialmente para desenvolvimento clínico ou pro- dução comercial. Em escalas maiores, pode haver vários subcultivos da composição microbiana antes do cultivo final. No final do cultivo, a cul- tura é colhida para possibilitar a formulação adicional em uma forma de dosagem para administração. Isso pode envolver a concentração, re- moção de componentes indesejáveis do meio e/ou introdução em um ambiente químico que preserva a composição microbiana e torna a mesma aceitável para administração por meio da via escolhida. Por exemplo, uma composição microbiana pode ser cultivada a uma con- centração de 1010 UFC/mL, então concentrada 20 vezes por microfiltra- ção de fluxo tangencial; o meio gasto pode ser trocado por diafiltração com um meio conservante que consiste em 2% de gelatina, 100 mM de trealose e 10 mM de tampão de fosfato de sódio. A suspensão pode, então, ser seca por congelamento em um pó e titulada.
[0127] Após a secagem, o pó pode ser mesclado a uma potência adequada, e misturado com outras culturas e/ou um agente de enchi- mento, tal como celulose microcristalina, para consistência e facilidade de manuseio, e a composição bacteriana formulada como no presente documento proporcionado.
[0128] Em certos aspectos, são proporcionadas composições bac- terianas para administração a sujeitos. Em algumas modalidades, as composições bacterianas são combinadas com materiais ativos e/ou inativos adicionais para produzir um produto final, que pode ser em uni- dade de dosagem unitária ou em um formato de doses múltiplas.
[0129] Em algumas modalidades, a composição compreende pelo menos um carboidrato. Um “carboidrato” se refere a um açúcar ou polí- mero de açúcares. Os termos “sacarídeo”, “polissacarídeo”, “carboi- drato” e “oligossacarídeo” podem ser usados de forma intercambiável. A maioria dos carboidratos são aldeídos ou cetonas com muitos grupos hidroxila, normalmente um em cada átomo de carbono da molécula. Os carboidratos têm geralmente a fórmula molecular CnH2nOn. Um carboi- drato pode ser um monossacarídeo, um dissacarídeo, trissacarídeo, oli- gossacarídeo ou polissacarídeo. A maioria dos carboidratos básicos é um monossacarídeo, tal como glicose, sacarose, galactose, manose, ri- bose, arabinose, xilose e frutose. Dissacarídeos são dois monossacarí- deos unidos. Dissacarídeos exemplificativos incluem sacarose, maltose,
celobiose e lactose. Tipicamente, um oligossacarídeo inclui entre três e seis unidades de monossacarídeo (por exemplo, rafinose, estaquiose) e polissacarídeos incluem seis ou mais unidades de monossacarídeo. Polissacarídeos exemplificativos incluem amido, glicogênio e celulose. Os carboidratos podem conter unidades de sacarídeo modificadas, tais como 2'-desoxirribose, em que um grupo hidroxila é removido, 2'-fluo- rorribose, em que um grupo hidroxila é substituído por um flúor, ou N- acetilglucosamina, uma forma de glicose contendo nitrogênio (por exemplo, 2'-fluororribose, desoxirribose e hexose). Os carboidratos po- dem existir em muitas formas diferentes, por exemplo, conformistas, for- mas cíclicas, formas acíclicas, estereoisômeros, tautômeros, anômeros e isômeros.
[0130] Em algumas modalidades, a composição compreende pelo menos um lipídio. Como no presente documento usado, um “lipídio” in- clui gorduras, óleos, triglicerídeos, colesterol, fosfolipídios, ácidos gra- xos em qualquer forma incluindo ácidos graxos livres. Gorduras, óleos e ácidos graxos podem ser saturados, insaturados (cis ou trans) ou par- cialmente insaturados (cis ou trans). Em algumas modalidades, o lipídio compreende pelo menos um ácido graxo selecionado dentre ácido láu- rico (12:0), ácido mirístico (14:0), ácido palmítico (16:0), ácido palmito- leico (16:1), ácido margárico (17:0), ácido heptadecenoico (17:1), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2), ácido linolê- nico (18:3), ácido octadecatetraenoico (18:4), ácido araquídico (20:0), ácido eicosenoico (20:1), ácido eicosadienoico (20:2), ácido eicosate- traenoico (20:4), ácido eicosapentaenoico (20:5) (EPA), ácido docosa- noico (22:0), ácido docosenoico (22:1), ácido docosapentaenoico (22:5), ácido docosa-hexaenoico (22:6) (DHA) e ácido tetracosanoico (24:0). Em algumas modalidades, a composição compreende pelo menos um lipídio modificado, por exemplo, um lipídio que foi modificado por cozi- mento.
[0131] Em algumas modalidades, a composição compreende pelo menos um mineral suplementar ou fonte mineral. Exemplos de minerais incluem, sem limitação: cloreto, sódio, cálcio, ferro, cromo, cobre, iodo, zinco, magnésio, manganês, molibdênio, fósforo, potássio e selênio. Formas adequadas de qualquer um dos minerais supracitados incluem sais minerais solúveis, sais minerais ligeiramente solúveis, sais minerais insolúveis, minerais quelados, complexos minerais, minerais não reati- vos, tais como minerais de carbonila, e minerais reduzidos e combina- ções destes.
[0132] Em algumas modalidades, a composição compreende pelo menos uma vitamina suplementar. A pelo menos uma vitamina pode ser solúvel em gordura ou vitaminas solúveis em água. Vitaminas adequa- das incluem, mas não estão limitadas a, vitamina C, vitamina A, vitamina E, vitamina B12, vitamina K, riboflavina, niacina, vitamina D, vitamina B6, ácido fólico, piridoxina, tiamina, ácido pantotênico e biotina. Formas adequadas de qualquer uma dos supracitadas são sais da vitamina, de- rivados da vitamina, compostos que têm atividade igual ou similar à da vitamina e metabólitos da vitamina.
[0133] Em algumas modalidades, a composição compreende um excipiente. Exemplos não limitativos de excipientes adequados incluem um agente de tamponamento, um conservante, um estabilizante, um aglutinante, um agente de compactação, um lubrificante, um acentuador de dispersão, um agente de desintegração, um agente flavorizante, um adoçante e um agente colorante.
[0134] Em algumas modalidades, o excipiente é um agente de tam- ponamento. Exemplos não limitativos de agentes de tamponamento adequados incluem citrato de sódio, carbonato de magnésio, bicarbo- nato de magnésio, carbonato de cálcio e bicarbonato de cálcio.
[0135] Em algumas modalidades, o excipiente compreende um con- servante. Exemplos não limitativos de conservantes adequados incluem antioxidantes, tais como alfa-tocoferol e ascorbato, e antimicrobianos, tais como parabenos, clorobutanol e fenol.
[0136] Em algumas modalidades, a composição compreende um aglutinante como um excipiente. Exemplos não limitativos de aglutinan- tes adequados incluem amidos, amidos pré-gelatinizados, gelatina, po- livinilpirrolidona, celulose, metilcelulose, carboximetilcelulose sódica, etilcelulose, poliacrilamidas, poliviniloxoazolidona, álcoois polivinílicos, álcool de ácido graxo C12-C18, polietilenoglicol, polióis, sacarídeos, oli- gossacarídeos e combinações destes.
[0137] Em algumas modalidades, a composição compreende um lu- brificante como um excipiente. Exemplos não limitativos de lubrificantes adequados incluem estearato de magnésio, estearato de cálcio, estea- rato de zinco, óleos vegetais hidrogenados, esterotex, monoestearato de polioxietileno, talco, polietilenoglicol, benzoato de sódio, lauril sulfato de sódio, lauril sulfato de magnésio e óleo mineral leve.
[0138] Em algumas modalidades, a composição compreende um acentuador de dispersão como um excipiente. Exemplos não limitativos de dispersantes adequados incluem amido, ácido algínico, polivinilpirro- lidonas, goma de guar, caulim, bentonita, celulose de madeira purifi- cada, glicolato de amido de sódio, silicato isoamórfico e celulose micro- cristalina como tensoativos emulsificantes de elevado HLB.
[0139] Em algumas modalidades, a composição compreende um desintegrante como um excipiente. Em algumas modalidades, o desin- tegrante é um desintegrante não efervescente. Exemplos não limitativos de desintegrantes não efervescentes incluem amidos, tais como amido de milho, amido da batata, amidos pré-gelatinizados e modificados dos mesmos, adoçantes, argilas, tais como bentonita, celulose microcrista- lina, alginatos, glicolato de amido de sódio, gomas, tais como ágar, guar, alfarrobeira, caraia, pectina e tragacanto. Em algumas modalidades, o desintegrante é um desintegrante efervescente. Exemplos não limitati- vos de desintegrantes efervescentes adequados incluem bicarbonato de sódio em combinação com ácido cítrico, e bicarbonato de sódio em combinação com ácido tartárico.
[0140] Em algumas modalidades, a formulação bacteriana compre- ende um revestimento entérico ou microencapsulamento. Em certas modalidades, o revestimento entérico ou microencapsulamento apri- mora o direcionamento a uma região desejada do trato gastrointestinal. Por exemplo, em certas modalidades, a composição bacteriana com- preende um revestimento entérico e/ou microcápsulas que dissolvem a um pH associado a uma região particular do trato gastrointestinal. Em algumas modalidades, o revestimento entérico e/ou microcápsulas dis- solvem a um pH de cerca de 5,5 a 6,2 para liberação no duodeno, a um valor de pH de cerca de 7,2 a 7,5 para liberação no íleo e/ou a um valor de pH de cerca de 5,6 a 6,2 para liberação no cólon. Os revestimentos entéricos e microcápsulas exemplificativos são descritos, por exemplo, na Publicação da Patente dos EUA N.º 2016/0022592, que é no pre- sente documento incorporada a título de referência na sua totalidade.
[0141] Em algumas modalidades, a composição é um produto ali- mentício (por exemplo, um alimento ou uma bebida), tal como um ali- mento ou bebida saudável, um alimento ou bebida para crianças, um alimento ou bebida para mulheres grávidas, atletas, idosos ou outro grupo especificado, um alimento funcional, uma bebida, um alimento ou bebida para uso especificado de saúde, um suplemento dietético, um alimento ou bebida para pacientes ou uma ração animal. Exemplos es- pecíficos de alimentos e bebidas incluem várias bebidas, tais como su- cos, bebidas refrescantes, bebidas de chá, preparações para drinques, bebidas gelatinosas e bebidas funcionais; bebidas alcoólicas, tais como cervejas; alimentos contendo carboidratos, tais como produtos alimen-
tícios de arroz, macarrão, pães e massas; produtos de pasta como pre- suntos de peixe, salsichas, produtos de pasta de frutos do mar; produtos de embalagens retortáveis, tais como curries, alimento coberto com mo- lhos espessos ricos em amido e sopas chinesas; sopas; produtos lác- teos, tais como leite, bebidas lácteas, sorvetes, queijos e iogurtes; pro- dutos fermentados, tais como pastas de soja fermentadas, iogurtes, be- bidas fermentadas e picles; produtos de feijão; vários produtos de con- feitaria, incluindo biscoitos, bolachas e semelhantes, doces, gomas de mascar, gomas, sobremesas frias, incluindo geleias, caramelos de creme e sobremesas congeladas; alimentos instantâneos, tais como so- pas instantâneas e sopas instantâneas de soja; alimentos para micro- ondas; e similares Além disso, os exemplos incluem também alimentos e bebidas saudáveis nas formas de pós, grânulos, tabletes, cápsulas, líquidos, pastas e geleias.
[0142] Em certas modalidades, as bactérias no presente documento divulgadas são administradas ao sujeito em conjunto com um prebiótico. Os prebióticos são carboidratos que são geralmente digeríveis por um animal hospedeiro e são seletivamente fermentados ou metabolizados por bactérias. Os prebióticos podem ser carboidratos de cadeia curta (por exemplo, oligossacarídeos) e/ou açúcares simples (por exemplo, mono e dissacarídeos) e/ou mucinas (proteínas altamente glicosiladas) que alteram a composição ou o metabolismo de um microbioma no hos- pedeiro. Os carboidratos de cadeia curta são também chamados de oli- gossacarídeos e geralmente contêm de 2 ou 3 e até 8, 9, 10, 15 ou mais porções químicas de açúcar. Quando os prebióticos são introduzidos em um hospedeiro, os prebióticos afetam as bactérias dentro do hospe- deiro e não afetam diretamente o hospedeiro. Em certos aspectos, uma composição de prebiótico pode estimular seletivamente o crescimento e/ou a atividade de um dentre um número limitado de bactérias em um hospedeiro. Os prebióticos incluem oligossacarídeos como fruto-oligos- sacarídeos (FOS) (incluindo inulina), galacto-oligossacarídeos (GOS), trans-galacto-oligossacarídeos, xilo-oligossacarídeos (XOS), quito-oli- gossacarídeos (COS), oligossacarídeos de soja (por exemplo, estaqui- ose e rafinose) gentio-oligossacarídeos, isomalto-oligossacarídeos, mano-oligossacarídeos, malto-oligossacarídeos e mananoligossacarí- deos. Os oligossacarídeos não são necessariamente componentes úni- cos e podem ser misturas contendo oligossacarídeos com diferentes graus de oligomerização, por vezes incluindo o dissacarídeo parental e os açúcares monoméricos. Vários tipos de oligossacarídeos são encon- trados como componentes naturais em muitos alimentos comuns, inclu- indo frutas, vegetais, leite e mel. Os exemplos específicos de oligossa- carídeos são lactulose, lactossacarose, palatinose, sacarose de glico- sila, goma de guar, goma arábica, tagalose, amilose, amilopectina, pec- tina, xilano e ciclodextrinas. Os prebióticos podem também ser purifica- dos ou química ou enzimaticamente sintetizados. Administração
[0143] Em certos aspectos, é no presente documento proporcio- nado um método para entregar uma bactéria e/ou uma composição bac- teriana no presente documento descrita a um sujeito. Em algumas mo- dalidades dos métodos no presente documento proporcionados, as bac- térias são administradas em conjunto com a administração de um tera- pêutico adicional. Em algumas modalidades, as bactérias são coformu- ladas em uma composição farmacêutica com o terapêutico adicional. Em algumas modalidades, as bactérias são coadministradas com o te- rapêutico adicional. Em algumas modalidades, o terapêutico adicional é administrado ao sujeito antes da administração das bactérias (por exem- plo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou 55 minutos antes, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 horas antes, ou cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6,
7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias antes). Em algumas modalidades, o terapêutico adicional é administrado ao sujeito após a administração das bactérias (por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou 55 minutos após, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 horas após, ou cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias após). Em algumas modalidades, o mesmo modo de entrega é usado para entre- gar tanto as bactérias quanto o terapêutico adicional. Em algumas mo- dalidades, diferentes modos de entrega são usados para administrar as bactérias e o terapêutico adicional. Por exemplo, em algumas modali- dades, as bactérias são administradas oralmente enquanto o terapêu- tico adicional é administrado por meio de injeção (por exemplo, uma in- jeção intravenosa, intramuscular e/ou intratumoral).
[0144] Em certas modalidades, as composições farmacêuticas, for- mas de dosagem e kits no presente documento descritos podem ser administrados em conjunto com qualquer outro tratamento convencional para distúrbio autoimune. Estes tratamentos podem ser aplicados como necessário e/ou como indicado e podem ocorrer antes, concomitante- mente ou após a administração das composições farmacêuticas, formas de dosagem e kits no presente documento descritos.
[0145] O regime de dosagem pode ser qualquer um dentre uma va- riedade de métodos e quantidades e pode ser determinado pelo perito na técnica de acordo com os fatores clínicos conhecidos. Como é co- nhecido nas técnicas médicas, as dosagens para qualquer paciente po- dem depender de muitos fatores, incluindo a espécie do sujeito, o tama- nho, a área de superfície do corpo, a idade, o sexo, a imunocompetência e a saúde em geral, o microrganismo particular a ser administrado, a duração e a via de administração, o tipo e o estágio da doença, por exemplo, tamanho do tumor, e outros compostos, tais como fármacos sendo administrados concomitantemente. Além dos fatores acima, tais níveis podem ser afetados pela infecciosidade do microrganismo e pela natureza do microrganismo, como pode ser determinado pelo perito na técnica. Nos presentes métodos, níveis de dosagem mínima apropria- dos de microrganismos podem ser níveis suficientes para que o micror- ganismo sobreviva, se desenvolva e sofra replicação. Os métodos de tratamento no presente documento descritos podem ser adequados para o tratamento de um distúrbio imunológico (por exemplo, uma do- ença autoimune, uma doença inflamatória, uma alergia). A dose das composições farmacêuticas no presente documento descritas pode ser apropriadamente definida ou ajustada de acordo com a forma de dosa- gem, a via de administração, o grau ou estágio de uma doença-alvo e similares. Por exemplo, a dose eficaz geral dos agentes pode variar en- tre 0,01 mg/kg de peso corporal/dia e 1.000 mg/kg de peso corporal/dia, entre 0,1 mg/kg de peso corporal/dia e 1.000 mg/kg de peso corpo- ral/dia, 0,5 mg/kg de peso corporal/dia e 500 mg/kg de peso corpo- ral/dia, 1 mg/kg de peso corporal/dia e 100 mg/kg de peso corporal/dia ou entre 5 mg/kg de peso corporal/dia e 50 mg/kg de peso corporal/dia. A dose eficaz pode ser 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, ou 1000 mg/kg de peso corporal/dia ou mais, mas a dose não é limitada a estes.
[0146] Em algumas modalidades, a dose administrada a um sujeito é suficiente para prevenir o distúrbio imunológico, atrasar seu início ou retardar ou interromper sua progressão ou prevenir um relapso do dis- túrbio imunológico. Um perito na técnica reconhecerá que a dosagem dependerá de uma variedade de fatores, incluindo a força do composto particular empregado, bem como a idade, a espécie, a condição e o peso corporal do sujeito. O tamanho da dose também será determinado pela via, momento e frequência de administração, bem como a existên- cia, a natureza e a extensão de quaisquer efeitos colaterais adversos que possam acompanhar a administração de um composto particular e o efeito fisiológico desejado.
[0147] Doses e regimes de dosagem adequados podem ser deter- minados por técnicas convencionais de detecção de intervalo conheci- das pelos peritos na técnica. Geralmente, o tratamento é iniciado com dosagens menores, que são inferiores à dose ótima do composto. De- pois disso, a dosagem é aumentada por pequenos incrementos até que o efeito ótimo sob as circunstâncias seja alcançado. Um protocolo eficaz de dosagem e tratamento pode ser determinado por meios de rotina e convencionais, iniciando, por exemplo, com uma baixa dose em animais de laboratório e, então, aumentando a dosagem enquanto monitora os efeitos, e variando sistematicamente o regime de dosagem também. Es- tudos com animais são comumente usados para determinar a dose má- xima tolerável (“MTD”) de agente bioativo por quilograma de peso. Os peritos na técnica regularmente extrapolam a doses para eficácia, en- quanto evitam a toxicidade, em outras espécies, incluindo seres huma- nos.
[0148] De acordo com o disposto acima, em aplicações terapêuti- cas, as dosagens dos agentes ativos usados, de acordo com a inven- ção, variam dependendo do agente ativo, da idade, do peso e da condi- ção clínica do paciente destinatário e da experiência e julgamento do médico ou profissional que administra a terapia, entre outros fatores que afetam a dosagem selecionada. Em geral, a dose deve ser suficiente para resultar no retardamento e, preferencialmente, regressão do avanço de um distúrbio imunológico.
[0149] As administrações separadas podem incluir qualquer nú- mero de duas ou mais administrações (por exemplo, doses), incluindo duas, três, quatro, cinco ou seis administrações. Um perito na técnica pode determinar prontamente o número de administrações a realizar, ou a conveniência de realizar uma ou mais administrações adicionais, de acordo com métodos conhecidos na técnica, para monitorar métodos terapêuticos e outros métodos de monitoramento no presente docu- mento proporcionados. Em algumas modalidades, as doses podem ser separadas por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 dias ou 1, 2, 3, ou 4 semanas. Consequentemente, os métodos no presente docu- mento proporcionados incluem métodos para proporcionar ao sujeito uma ou mais administrações de uma bactéria, em que o número de ad- ministrações pode ser determinado através do monitoramento do sujeito e, com base nos resultados do monitoramento, determinar a possibili- dade de proporcionar ou não uma ou mais administrações adicionais. A decisão quanto à possibilidade de proporcionar ou não uma ou mais administrações adicionais pode ser baseada em uma variedade de re- sultados de monitoramento, incluindo, mas não se limitando a, indicação de crescimento tumoral ou inibição de crescimento tumoral, apareci- mento de novas metástases ou inibição de metástase, o título de anti- corpo antibactéria do sujeito, o título de anticorpo antitumor do sujeito, a saúde geral do sujeito e/ou o peso do sujeito.
[0150] O período de tempo entre as administrações pode ser qual- quer um dentre uma variedade de períodos de tempo. O período de tempo entre administrações pode ser uma função de qualquer um den- tre uma variedade de fatores, incluindo etapas de monitoramento, como descrito em relação ao número de administrações, ao período de tempo para que um sujeito monte uma resposta imunológica e/ou o período de tempo para que um sujeito elimine as bactérias do tecido normal. Em um exemplo, o período de tempo pode ser uma função do período de tempo para que um sujeito apresente uma resposta imunológica; por exemplo, o período de tempo pode ser maior do que o período de tempo para que um sujeito monte uma resposta imunológica, tal como mais que cerca de uma semana, mais que cerca de dez dias, mais que cerca de duas semanas ou mais que cerca de um mês; em um outro exemplo,
o período de tempo pode ser menor que o período de tempo para que um sujeito monte uma resposta imunológica, tal como menos que cerca de uma semana, menos que cerca de dez dias, menos que cerca de duas semanas ou menos que cerca de um mês. Em outro exemplo, o período de tempo pode ser uma função do período de tempo para que um sujeito elimine as bactérias do tecido normal; por exemplo, o período de tempo pode ser mais que o período de tempo para que um sujeito elimine as bactérias do tecido normal, como mais que cerca de um dia, mais que cerca de dois dias, mais que cerca de três dias, mais que cerca de cinco dias ou mais que cerca de uma semana.
[0151] Em algumas modalidades, a entrega de um terapêutico para distúrbio imunológico, em combinação com as bactérias no presente do- cumento descritas, reduz os efeitos adversos e/ou aprimora a eficácia do terapêutico para distúrbio imunológico.
[0152] A dose eficaz de um terapêutico para distúrbio imunológico no presente documento descrito é a quantidade de agente terapêutico que é eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um pa- ciente, composição e modo de administração particular, com a menor toxicidade para o paciente. O nível de dosagem eficaz pode ser identifi- cado usando os métodos no presente documento descritos e dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade das composições particulares administradas, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular a ser empregado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particula- res empregadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico prévio do paciente a ser tratado e fatores similares bem conhe- cidos nas técnicas médicas. Em geral, uma dose eficaz de uma terapia para distúrbio imunológico será a quantidade do agente terapêutico, que é a dose mais baixa eficaz para produzir um efeito terapêutico. Tal dose eficaz dependerá geralmente dos fatores descritos acima.
[0153] A toxicidade de uma terapia para distúrbio imunológico é o nível de efeitos adversos experimentados pelo sujeito durante e após o tratamento. Os eventos adversos associados à toxicidade da terapia para distúrbio imunológico incluem, mas não se limitam a, dor abdomi- nal, indigestão ácida, refluxo ácido, reações alérgicas, alopecia, anafila- xia, anemia, ansiedade, falta de apetite, artralgias, astenia, ataxia, azo- temia, perda de equilíbrio, dor óssea, hemorragia, coágulos sanguíneos, pressão sanguínea baixa, pressão sanguínea elevada, dificuldade para respirar, bronquite, hematomas, contagem baixa de glóbulos brancos, contagem baixa de hemácias, contagem baixa de plaquetas, cardiotoxi- cidade, cistite, cistite hemorrágica, arritmias, doença de válvula cardí- aca, cardiomiopatia, doença da artéria coronária, cataratas, neurotoxici- dade central, disfunção cognitiva, confusão, conjuntivite, obstipação, tosse, cãibra, cistite, trombose de veia profunda, desidratação, depres- são, diarreia, tonturas, boca seca, pele seca, dispepsia, dispneia, edema, desequilíbrio de eletrólitos, esofagite, fadiga, perda de fertili- dade, febre, flatulência, ruborização, refluxo gástrico, doença do refluxo gastroesofágico, dor genital, granulocitopenia, ginecomastia, glaucoma, perda de cabelo, síndrome de mão-pé, dor de cabeça, perda de audi- ção, insuficiência cardíaca, palpitações cardíacas, azia, hematoma, cis- tite hemorrágica, hepatotoxicidade, hiperamilasemia, hipercalcemia, hi- percloremia, hiperglicemia, hipercalemia, hiperlipasemia, hipermagne- semia, hipernatremia, hiperfosfatemia, hiperpigmentação, hipertrigliceri- demia, hiperuricemia, hipoalbuminemia, hipocalcemia, hipocloremia, hi- poglicemia, hipocalemia, hipomagnesemia, hiponatremia, hipofosfate- mia, impotência, infeção, reações do sítio de injeção, insônia, deficiên- cia de ferro, coceira, dor de articulação, insuficiência renal, leucopenia, disfunção hepática, perda de memória, menopausa, dores na boca, mu-
cosite, dor muscular, mialgias, mielossupressão, miocardite, febre neu- tropênica, náuseas, nefrotoxicidade, neutropenia, sangramento nasal, dormência, ototoxicidade, dor, eritrodisestesia palmo-plantar, pancito- penia, pericardite, neuropatia periférica, faringite, fotofobia, fotossensi- bilidade, pneumonia, pneumonite, proteinuria, êmbolo pulmonar, fibrose pulmonar, toxicidade pulmonar, erupção cutânea, batida cardíaca rá- pida, hemorragia retal, inquietação, rinite, convulsões, falta de ar, sinu- site, trombocitopenia, zumbido, infeção do trato urinário, hemorragia va- ginal, secura vaginal, vertigens, retenção de água, fraqueza, perda de peso, ganho de peso e xerostomia. Em geral, a toxicidade é aceitável se os benefícios ao sujeito, alcançados através da terapia, superarem os eventos adversos experimentados pelo sujeito devido à terapia.
[0154] Em algumas modalidades, a administração da composição bacteriana trata a doença (por exemplo, câncer, doença autoimune, do- ença inflamatória, doença metabólica). Agentes Terapêuticos
[0155] Em certos aspectos, os métodos no presente documento proporcionados incluem a administração a um sujeito de uma bactéria e/ou uma composição bacteriana no presente documento descrita (por exemplo, uma composição bacteriana compreendendo uma cepa bac- teriana listada na Tabela 1), quer isoladamente ou em combinação com outro terapêutico. Em algumas modalidades, a composição bacteriana e a outra terapia podem ser administradas ao sujeito em qualquer or- dem. Em algumas modalidades, a composição bacteriana e a outra te- rapia são administradas conjuntamente.
[0156] Em algumas modalidades, a bactéria é administrada ao su- jeito antes da terapia adicional ser administrada (por exemplo, pelo me- nos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 horas antes ou pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou
30 dias antes). Em algumas modalidades, a bactéria é administrada ao sujeito após a terapia adicional ser administrada (por exemplo, pelo me- nos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 horas após ou, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 dias após). Em algumas modalidades, a bactéria e o terapêutico adi- cional são administrados ao sujeito simultaneamente ou quase simulta- neamente (por exemplo, as administrações ocorrem dentro de uma hora uma da outra). Em algumas modalidades, é administrado ao sujeito um antibiótico antes da bactéria ser administrada ao sujeito (por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 horas antes ou, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 dias antes). Em algumas modalidades, é administrado ao su- jeito um antibiótico após a bactéria ser administrada ao sujeito (por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 horas antes ou, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 dias após). Em algumas modalidades, a bactéria e o antibiótico são administrados ao sujeito simultaneamente ou quase simultaneamente (por exemplo, administrações ocorrem dentro de uma hora uma da outra).
[0157] Em certas modalidades, o sujeito pode ser submetido a ci- rurgia. Os tipos de cirurgia incluem, mas não se limitam a, cirurgia pre- ventiva, de diagnóstico ou de teste, curativa e paliativa.
[0158] Em algumas modalidades, o terapêutico adicional é um anti- biótico. Por exemplo, se a presença de uma bactéria associada ao dis- túrbio imunológico e/ou um perfil de microbioma associado ao distúrbio imunológico for detectada, de acordo com os métodos no presente do-
cumento proporcionados, podem ser administrados antibióticos para eli- minar as bactérias associadas ao distúrbio imunológico do sujeito. “An- tibióticos” se referem amplamente a compostos com capacidade para inibir ou prevenir uma infeção bacteriana. Os antibióticos podem ser classificados de várias formas, incluindo seu uso para infeções especí- ficas, seu mecanismo de ação, sua biodisponibilidade ou seu espectro de micróbio-alvo (por exemplo, bactérias Gram-negativas vs. Gram-po- sitivas, bactérias aeróbicas vs. anaeróbicas, etc.), e estes podem ser usados para exterminar bactérias específicas em áreas específicas do hospedeiro (“nichos”) (Leekha, et al. 2011. General Principles of Antimi- crobial Therapy. Mayo Clin Proc. 86(2): 156-167). Em certas modalida- des, os antibióticos podem ser usados para atingir seletivamente bacté- rias de um nicho específico. Em algumas modalidades, os antibióticos conhecidos para tratar uma infeção particular, que inclui um nicho de distúrbio imunológico, podem ser usados para atingir micróbios associ- ados ao distúrbio imunológico, incluindo bactérias associadas ao distúr- bio imunológico nesse nicho. Em outras modalidades, os antibióticos são administrados após o tratamento bacteriano. Em algumas modali- dades, os antibióticos são administrados após o tratamento bacteriano para remover o enxerto.
[0159] Em alguns aspectos, os antibióticos podem ser selecionados com base em suas propriedades bactericidas ou bacteriostáticas. Anti- bióticos bactericidas incluem mecanismos de ação que disrompem a parede celular (por exemplo, β-lactamas), a membrana celular (por exemplo, daptomicina) ou DNA bacteriano (por exemplo, fluoroquinolo- nas). Agentes bacteriostáticos inibem a replicação bacteriana e incluem sulfonamidas, tetraciclinas e macrolidas, e atuam inibindo a síntese pro- teica. Além disso, embora alguns fármacos possam ser bactericidas em certos organismos e bacteriostáticos em outros, conhecer o organismo- alvo permite que o perito na técnica selecione um antibiótico com as propriedades adequadas. Em certas condições de tratamento, antibióti- cos bacteriostáticos inibem a atividade de antibióticos bactericidas. As- sim, em certas modalidades, antibióticos bactericidas e bacteriostáticos não são combinados.
[0160] Antibióticos incluem, mas não se limitam a, aminoglicosí- deos, ansamicinas, carbacefemas, carbapenemas, cefalosporinas, gli- copeptídeos, lincosamidas, lipopeptídeos, macrolidas, monobactamas, nitrofuranos, oxazolidononas, penicilinas, antibióticos polipeptídicos, quinolonas, fluoroquinolona, sulfonamidas, tetraciclinas e compostos antimicobacterianos, e combinações destes.
[0161] Os aminoglicosídeos incluem, mas não se limitam a, Amica- cina, Gentamicina, Canamicina, Neomicina, Netilmicina, Tobramicina, Paromomicina e Espectinomicina. Os aminoglicosídeos são eficazes, por exemplo, contra bactérias Gram-negativas, tais como Escherichia coli, Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa e Francisella tularensis, e contra certas bactérias aeróbicas, mas menos eficazes contra anaeró- bios obrigatórios/facultativos. Acredita-se que os aminoglicosídeos se liguem à subunidade ribossômica bacteriana 30S ou 50S, inibindo assim a síntese de proteína bacteriana.
[0162] As ansamicinas incluem, mas não se limitam a, Geldanami- cina, Herbimicina, Rifamicina e Estreptovaricina. Acredita-se que a Gel- danamicina e a Herbimicina inibem ou alteram a função da Proteína de Choque Térmico 90.
[0163] As carbacefemas incluem, mas não se limitam a, Loracarbef. Acredita-se que as carbacefemas inibem a síntese da parece celular bacteriana.
[0164] As carbapenemas incluem, mas não se limitam a, Ertape- nema, Doripenema, Imipenema/Cilastatina e Meropenema. Carbapene- mas são bactericidas tanto para bactérias Gram-positivas como para bactérias Gram-negativas como antibióticos de amplo espectro. Acre- dita-se que as carbapenemas inibem a síntese da parece celular bacte- riana.
[0165] As cefalosporinas incluem, mas não se limitam a, Cefadro- xila, Cefazolina, Cefalotina, Cefalexina, Cefaclor, Cefamandol, Cefoxi- tina, Cefprozila, Cefuroxima, Cefixima, Cefdinir, Cefditorem, Cefopera- zona, Cefotaxima, Cefpodoxima, Ceftazidima, Ceftibuteno, Ceftizoxima, Ceftriaxona, Cefepima, Ceftarolina fosamila e Ceftobiprol. Cefalospori- nas selecionadas são eficazes, por exemplo, contra bactérias Gram-ne- gativas e contra bactérias Gram-positivas, incluindo Pseudomonas, cer- tas cefalosporinas são eficazes contra Staphylococcus aureus resis- tente à meticilina (MRSA). Acredita-se que as cefalosporinas inibem a síntese da parece celular bacteriana pela disrupção da síntese da ca- mada de peptidoglicano das paredes celulares bacterianas.
[0166] Os glicopeptídeos incluem, mas não se limitam a, Teicopla- nina, Vancomicina e Telavancina. Os glicopeptídeos são eficazes, por exemplo, contra bactérias Gram-positivas aeróbicas e anaeróbicas, in- cluindo MRSA e Clostridium difficile. Acredita-se que os glicopeptídeos inibam a síntese da parece celular bacteriana pela disrupção da síntese da camada de peptidoglicano das paredes celulares bacterianas.
[0167] As lincosamidas incluem, mas não se limitam a, Clindamicina e Lincomicina. As lincosamidas são eficazes, por exemplo, contra bac- térias anaeróbicas, bem como Staphylococcus e Streptococcus. Acre- dita-se que as lincosamidas se liguem à subunidade ribossômica bacte- riana 50S, inibindo, assim, a síntese de proteína bacteriana.
[0168] Os lipopeptídeos incluem, mas não se limitam a, Daptomi- cina. Os lipopeptídeos são eficazes, por exemplo, contra bactérias Gram-positivas. Acredita-se que os lipopeptídeos se liguem à mem- brana bacteriana e provoquem despolarização rápida.
[0169] As macrolidas incluem, mas não se limitam a, Azitromicina,
Claritromicina, Diritromicina, Eritromicina, Roxitromicina, Troleandomi- cina, Telitromicina e Espiramicina. As macrolidas são eficazes, por exemplo, contra Streptococcus e Mycoplasma. Acredita-se que as ma- crolidas se liguem à subunidade bacteriana ou ribossômica 50S, ini- bindo, assim, a síntese de proteína bacteriana.
[0170] As monobactamas incluem, mas não se limitam a, Aztreo- nam. As monobactamas são eficazes, por exemplo, contra bactérias Gram-negativas. Acredita-se que as monobactamas inibem a síntese da parece celular bacteriana pela disrupção da síntese da camada de pep- tidoglicano das paredes celulares bacterianas.
[0171] Os nitrofuranos incluem, mas não se limitam a, Furazolidona e Nitrofurantoína.
[0172] As oxazolidononas incluem, mas não se limitam a, Linezolid, Posizolid, Radezolid e Torezolid. Acredita-se que as oxazolidononas se- jam inibidores da síntese proteica.
[0173] As penicilinas incluem, mas não se limitam a, Amoxicilina, Ampicilina, Azlocilina, Carbenicilina, Cloxacilina, Dicloxacilina, Flucloxa- cilina, Mezlocilina, Meticilina, Nafcilina, Oxacilina, Penicilina G, Penici- lina V, Piperacilina, Temocilina e Ticarcilina. As penicilinas são eficazes, por exemplo, contra bactérias Gram-positivas, anaeróbios facultativos, por exemplo, Streptococcus, Borrelia e Treponema. Acredita-se que as penicilinas inibem a síntese da parece celular bacteriana pela disrupção da síntese da camada de peptidoglicano das paredes celulares bacteri- anas.
[0174] Combinações de penicilinas incluem, mas não se limitam a, Amoxicilina/clavulanato, Ampicilina/sulbactama, Piperacilina/tazobac- tama e Ticarcilina/clavulanato.
[0175] Antibióticos polipeptídicos incluem, mas não se limitam a, Bacitracina, Colistina e Polimixina B e E. Antibióticos polipeptídicos são eficazes, por exemplo, contra bactérias Gram-negativas. Acredita-se que certos antibióticos polipeptídicos inibem o pirofosfato de isoprenila, envolvido na síntese da camada de peptidoglicano das paredes celula- res bacterianas, enquanto outros desestabilizam a membrana externa bacteriana deslocando-se contraíons bacterianos.
[0176] As quinolonas e fluoroquinolona incluem, mas não se limitam a, Ciprofloxacina, Enoxacina, Gatifloxacina, Gemifloxacina, Levofloxa- cina, Lomefloxacina, Moxifloxacina, Ácido nalidíxico, Norfloxacina, Ofloxacina, Trovafloxacina, Grepafloxacina, Esparfloxacina e Tema- floxacina. As quinolonas/fluoroquinolona são eficazes, por exemplo, contra Streptococcus e Neisseria. Acredita-se que as quinolonas/fluoro- quinolona inibem a girase ou topoisomerase IV do DNA bacteriano, ini- bindo, assim, a replicação e a transcrição do DNA.
[0177] As sulfonamidas incluem, mas não se limitam a, Mafenida, Sulfacetamida, Sulfadiazina, Sulfadiazina de prata, Sulfadimetoxina, Sulfametizol, Sulfametoxazol, Sulfanilimida, Sulfasalazina, Sulfisoxazol, Trimetoprim-Sulfametoxazol (Co-trimoxazol) e Sulfonamidocrisoidina. Acredita-se que as sulfonamidas inibem a síntese de folato por inibição competitiva de di-hidropteroato sintetase, inibindo, assim, a síntese de ácido nucleico.
[0178] As tetraciclinas incluem, mas não se limitam a, Demecloci- clina, Doxiciclina, Minociclina, Oxitetraciclina e Tetraciclina. As tetraci- clinas são eficazes, por exemplo, contra bactérias Gram-negativas. Acredita-se que as tetraciclinas se liguem à subunidade ribossômica bacteriana 30S, inibindo, assim, a síntese de proteína bacteriana.
[0179] Compostos antimicobacterianos incluem, mas não se limitam a, Clofazimina, Dapsona, Capreomicina, Ciclosserina, Etambutol, Etio- namida, Isoniazida, Pirazinamida, Rifampicina, Rifabutina, Rifapentina e Estreptomicina.
[0180] Antibióticos adequados incluem também arsfenamina, clo-
ramfenicol, fosfomicina, ácido fusídico, metronidazol, mupirocina, pla- tensimicina, quinupristina/dalfopristina, tigeciclina, tinidazol, amoxici- lina/clavulanato de trimetoprima, ampicilina/sulbactam, anfomicina risto- cetina, azitromicina, bacitracina, buforina II, carbomicina, cecropina Pl, claritromicina, eritromicinas, furazolidona, ácido fusídico, fusidato de Na, gramicidina, imipenem, indolicidina, josamicina, magainan II, metroni- dazol, nitroimidazóis, micamicina, mutacina B-Ny266, mutacina B-JHl 140, mutacina J-T8, nisina, nisina A, novobiocina, oleandomicina, ostre- ogricina, piperacilina/tazobactam, pristinamicina, ramoplanina, ranale- xina, reuterina, rifaximina, rosamicina, rosaramicina, espectinomicina, espiramicina, estafilomicina, estreptogramina, estreptogramina A, siner- gistina, taurolidina, teicoplanina, telitromicina, ticarcilina/ácido clavulâ- nico, triacetiloleandomicina, tilosina, tirocidina, tirotricina, vancomicina, vemamicina e virginiamicina.
[0181] Em algumas modalidades, o terapêutico adicional é um agente imunossupressor, um DMARD, um fármaco de controle da dor, um esteroide, um fármaco anti-inflamatório não esteroide (NSAID) ou um antagonista de citocina e combinações destes. Agentes representa- tivos incluem, mas não se limitam a, ciclosporina, retinoides, corticoste- roides, derivado do ácido propiônico, derivado do ácido acético, deriva- dos do ácido enólico, derivados do ácido fenâmico, inibidores de Cox-2, lumiracoxibe, ibuprofeno, salicilato de colina e magnésio, fenoprofeno, salsalato, difunisal, tolmetina, cetoprofeno, flurbiprofeno, oxaprozina, in- dometacina, sulindac, etodolac, cetorolac, nabumetona, naproxeno, val- decoxibe, etoricoxibe, MK0966; rofecoxibe, acetominofeno, Celecoxibe, Diclofenac, tramadol, piroxicam, meloxicam, tenoxicam, droxicam, lor- noxicam, isoxicam, ácido mefanâmico, ácido meclofenâmico, ácido flu- fenâmico, tolfenamic, valdecoxibe, parecoxibe, etodolac, indometacina, aspirina, ibuprofeno, firocoxibe, metotrexato (MTX), fármacos antimalá-
ricos (por exemplo, hidroxicloroquina e cloroquina), sulfassalazina, Le- flunomida, azatioprina, ciclosporina, sais de ouro, minociclina, ciclofos- famida, D-penicilamina, minociclina, auranofina, tacrolimus, miocrisina, clorambucila, antagonistas de TNF alfa (por exemplo, antagonistas de TNF alfa ou antagonistas do receptor de TNF alfa), por exemplo, ADA- LIMUMABE (Humira®), ETANERCEPT (Enbrel®), INFLIXIMABE (Re- micade®; TA-650), CERTOLIZUMABE PEGOL (Cimzia®; CDP870), GOLIMUMABE (Simpom®; CNTO 148), ANAKINRA (Kineret®), RITU- XIMABE (Rituxan®; MabThera®), ABATACEPT (Orencia®), TOCILIZU- MABE (RoActemra /Actemra®), antagonistas de integrina (TYSABRI® (natalizumabe)), antagonistas de IL-1 (ACZ885 (Ilaris)), Anakinra (Kine- ret®)), antagonistas de CD4, antagonistas de IL-23, antagonistas de IL- 20, antagonistas de IL-6, antagonistas de BLyS (por exemplo, Atacicept, Benlysta®/ LymphoStat-B® (belimumabe)), inibidores de p38, antago- nistas de CD20 (ocrelizumabe, ofatumumabe (Arzerra®)), antagonistas de interferon gama (fontolizumabe), prednisolona, Prednisona, dexame- tasona, Cortisol, cortisona, hidrocortisona, metilprednisolona, betameta- sona, triancinolona, beclometasoma, fludrocortisona, desoxicorticoste- rona, aldosterona, Doxiciclina, vancomicina, pioglitazona, SBI-087, SCIO-469, Cura-100, oncoxina + Viusid, TwHF, metoxisaleno, vitamina D - ergocalciferol, Milnaciprano, Paclitaxel, rosiglitazona, Tacrolimus (Prograf®), RADOOl, rapamune, rapamicina, fostamatinibe, Fentanila, XOMA 052, Fostamatinibe dissódico, rosiglitazona, curcumina (Longvida™), Rosuvastatina, Maraviroc, ramipril, Milnaciprano, Cobi- prostona, somatropina, vetor de terapia genética tgAAC94, MK0359, GW856553, esomeprazol, everolimus, trastuzumabe, inibidores de JAKl e JAK2, inibidores de pan JAK, por exemplo, piridona tetracíclica 6 (P6), 325, PF-956980, denosumabe, antagonistas de IL-6, antagonistas de CD20, antagonistas de CTLA4, antagonistas de IL-8, antagonistas de
IL-21, antagonistas de IL-22, antagonistas de integrina (Tysarbri® (na- talizumabe)), antagonistas de VGEF, antagonistas de CXCL, antagonis- tas de MMP, antagonistas de defensina, antagonistas de IL-1 (incluindo antagonistas de IL-1 beta) e antagonistas de IL-23 (por exemplo, engo- dos de receptores, anticorpos antagonistas, etc.).
[0182] Em algumas modalidades, o agente é um agente imunossu- pressor. Exemplos de agentes imunossupressores incluem, mas não se limitam a, corticosteroides, mesalazina, mesalamina, sulfassalazina, de- rivados de sulfassalazina, fármacos imunossupressores, ciclosporina A, mercaptopurina, azatiopurina, prednisona, metotrexato, anti-histaminas, glicocorticoides, epinefrina, teofilina, cromolina sódica, antileucotrienos, fármacos anticolinérgicos para rinite, antagonistas de TLR, inibidores de inflamassoma, descongestionantes anticolinérgicos, estabilizadores de mastócitos, anticorpos monoclonais anti-IgE, vacinas (por exemplo, va- cinas usadas para vacinação em que a quantidade de um alergênio é gradualmente aumentada), inibidores de citocina, tais como anticorpos anti-IL-6, inibidores de TNF, tais como infliximabe, adalimumabe, certo- lizumabe pegol, golimumabe ou etanercept, e combinações destes.
[0183] Em algumas modalidades, a terapia de distúrbio imunológico compreende a administração de bactérias terapêuticas e/ou a combina- ção terapêutica de bactérias ao sujeito, de modo que um microbioma saudável possa ser reconstituído no sujeito. Em algumas modalidades, as bactérias terapêuticas são bactérias associadas a distúrbios não imu- nológicos. Em algumas modalidades, as bactérias terapêuticas são bac- térias probióticas.
[0184] Em algumas modalidades, o terapêutico adicional é um tera- pêutico contra câncer. Em algumas modalidades, o terapêutico contra câncer é um agente quimioterápico. Exemplos de tais agentes quimio- terápicos incluem, mas não se limitam a, agentes de alquilação, tais como ciclosfosfamida; sulfonatos de alquila, tais como bussulfano, im- prossulfano e pipossulfano; aziridinas, tais como benzodopa, carbo- quona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas, inclu- indo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietiilenotio- fosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulata- cina e bulatacinona); uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo sua adozele- sina, carzelesina e análogos sintéticos de bizelesina); criptoficinas (par- ticularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (in- cluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterrobina; pancratistatina; uma sarcodictiína; espongistatina; mostardas de nitro- gênio, tais como clorambucila, clornafazina, colofosfamida, estramus- tina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosureias, tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimnustina; antibióticos, tais como os antibióticos de enediína (por exemplo, caliqueamicina, especial- mente caliqueamicina gama 11 e caliqueamicina omega 11; dinemicina, incluindo dinemicina A; bisfosfonatos, tais como clodronato; uma espe- ramicina; bem como cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos anti- bióticos relacionados à cromoproteína enedina, aclacinomosinas, acti- nomicina, autrarnicina, azasserina, bleomicinas, cactinomicina, carabi- cina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinais, dactinomicina, daunor- rubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (in- cluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirro- lino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, tais como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabólitos, tais como metotrexato e 5-fluorouracila (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, canfora, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuri- dina; androgênios, tais como calusterona, propionato de dromostano- lona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenais, tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracila; amsacrina; bestrabucila; bisantreno; eda- traxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitino; acetato de eliptinio; uma epotilona; etoglucide; nitrato de gálio; hidroxiureia; lenti- nana; lonidainina; maitansinoides, tais como maitansina e ansamitoci- nas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamete; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; complexo de polissacarídeo de PSK); razoxana; rizoxina; sizofurano; espirogermânio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2''-tri- clorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosídeo (“Ara- C”); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por exemplo paclitaxel e doxeta- xel; clorambucila; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotre- xato; complexos de coordenação de platina, tais como cisplatina, oxali- platina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposídeo (VP-16); ifosfa- mida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; novantrona; teniposídeo; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinote- cano (por exemplo, CPT-11); inibidor de topoisomerase RFS 2000; di- fluorometilomitina (DMFO); retinoides, tais como ácido retinoico; cape- citabina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos supracitados.
[0185] Em algumas modalidades, o terapêutico contra câncer é um agente imunoterápico contra câncer. Imunoterapia se refere a um trata- mento que usa o sistema imunológico de um sujeito para tratar câncer, por exemplo, inibidores de ponto de controle, vacinas contra câncer, ci- tocinas, terapia celular, células CAR-T e terapia com células dendríticas. Exemplos não limitativos de imunoterapias são inibidores do ponto de controle, incluindo, Nivolumabe (BMS, anti-PD-1), Pembrolizumabe (Merck, anti-PD-1), Ipilimumabe (BMS, anti-CTLA-4), MEDI4736 (Astra- Zeneca, anti-PD-L1) e MPDL3280A (Roche, anti-PD-L1). Outras imuno- terapias podem ser vacinas contra tumor, tais como Gardail, Cervarix, BCG, sipulencel-T, Gp100:209-217, AGS-003, DCVax-L, Algenpantu- cel-L, Tergenpantucel-L, TG4010, ProstAtak, Prostvac-V/R-TRICOM, Rindopepimul, acetato peptídico E75, IMA901, POL-103A, Belagenpu- matucel-L, GSK1572932A, MDX-1279, GV1001 e Tecemotida. A imu- noterapia pode ser administrada por meio de injeção (por exemplo, por via intravenosa, intratumoral, subcutânea ou nos linfonodos), mas pode também ser administrada por via oral, tópica ou por meio de aerossol. Imunoterapias podem compreender adjuvantes, tais como citocinas.
[0186] Em algumas modalidades, o agente imunoterápico é um ini- bidor de ponto de controle imunológico. A inibição do ponto de controle imunológico se refere amplamente à inibição dos pontos de controle que as células cancerígenas podem produzir para impedir ou regular nega- tivamente uma resposta imunológica. Exemplos de proteínas de ponto de controle imunológico incluem, mas não se limitam a, CTLA4, PD-1, PD-L1, PD-L2, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, KIR, LAG3, TIM-3 ou VISTA. Inibidores de ponto de controlo imunológico podem ser anticor- pos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, que se ligam e inibem uma proteína de ponto de controle imunológico. Exemplos de inibidores de ponto de controle imunológico incluem, mas não se limitam a, nivo- lumabe, pembrolizumabe, pidilizumabe, AMP-224, AMP-514, STI-
A1110, TSR-042, RG-7446, BMS-936559, MEDI-4736, MSB- 0020718C, AUR-012 e STI-A1010.
[0187] Em algumas modalidades, o agente imunoterápico é um an- ticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que por exemplo, se liga a um antígeno associado ao câncer. Exemplos de antígenos asso- ciados ao câncer incluem, mas não se limitam a, adipofilina, AIM-2, ALDH1A1, alfa-actinina-4, alfa-fetoproteína (“AFP”), ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX (L), proteína de fusão BCR-ABL b3a2, beta-catenina, BING-4, CA-125, CALCA, antígeno carcinoembrionário (“CEA”), CASP- 5, CASP-8, CD274, CD45, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, ciclina D1, Ciclina- A1, proteína de fusão dek-can, DKK1, EFTUD2, fator de alongamento 2, ENAH (hMena), Ep-CAM, EpCAM, EphA3, antígeno de tumor epitelial (“ETA”), proteína de fusão ETV6-AML1, EZH2, FGF5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIX, GAGE-1,2,8, GAGE-3,4,5,6,7, GAS7, glipicano-3, GnTV, gp100/Pmel17, GPNMB, HAUS3, Hepsina, HER-2/neu, HERV- K-MEL, HLA-A11, HLA-A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13Ralfa2, esterase carboxílica intestinal, K-ras, calicreína 4, KIF20A, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, KMHN1 também conhecido como CCDC110, LAGE-1, proteína de fusão LDLR-fucosiltransferase AS, Lengsina, M-CSF, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-C1, MAGE-C2, en- zima málica, mamaglobina-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, Melan-A/MART-1, Meloe, Midquina, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, mucina, MUM-1, MUM-2, MUM-3, Miosina, Miosina de classe I, N-raw, NA88-A, neo-PAP, NFYC, NY-BR-1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, polipeptídeo P, p53, PAP, PAX5, PBF, proteína de fusão pml-RARalfa, mucina epitelial polimórfica (“PEM”), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1, RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, SAGE, secernina 1, SIRT2, SNRPD1,
SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP1, survivina, proteína de fusão SYT-SSX1 ou SYT-SSX2, TAG-1, TAG-2, Telomerase, TGF-be- taRII, TPBG, TRAG-3, Triosefosfato isomerase, TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, tirosinase, tirosinase (“TYR”), VEGF, WT1, XAGE-1b/GA- GED2a. Em algumas modalidades, o antígeno é um neoantígeno.
[0188] Em algumas modalidades, o agente imunoterápico é uma va- cina contra câncer e/ou um componente de uma vacina contra câncer (por exemplo, um peptídeo e/ou proteína antigênica). A vacina contra câncer pode ser uma vacina de proteína, uma vacina de ácido nucleico ou uma combinação destas. Por exemplo, em algumas modalidades, a vacina contra câncer compreende um polipeptídeo compreendendo um epitopo de um antígeno associado ao câncer. Em algumas modalida- des, a vacina contra câncer compreende um ácido nucleico (por exem- plo, DNA ou RNA, tal como mRNA) que codifica um epitopo de um an- tígeno associado ao câncer. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é um vetor (por exemplo, um vetor bacteriano, vetor viral). Exemplos de vetores bacterianos incluem, mas não se limitam a, Mycobacterium bo- vis (BCG), Salmonella Typhimurium ssp., Salmonella Typhi ssp., espo- ros de Clostridium sp., Escherichia coli Nissle 1917, Escherichia coli K- 12/LLO, Listeria monocytogenes e Shigella flexneri. Exemplos de veto- res virais incluem, mas não se limitam a, vaccinia, adenovírus, vírus de RNA e avipox com deficiência de replicação, bouba aviária com defici- ência de replicação, varíola de canário com deficiência de replicação, MVA com deficiência de replicação e adenovírus com deficiência de re- plicação.
[0189] Em algumas modalidades, a imunoterapia contra câncer compreende a administração de uma célula apresentadora de antígeno (APC) iniciada com um antígeno específico para câncer. Em algumas modalidades, a APC é uma célula dendrítica, um macrófago ou uma célula B.
[0190] Exemplos de antígenos associados ao câncer incluem, mas não se limitam a, adipofilina, AIM-2, ALDH1A1, alfa-actinina-4, alfa-fe- toproteína (“AFP”), ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX (L), proteína de fu- são BCR-ABL b3a2, beta-catenina, BING-4, CA-125, CALCA, antígeno carcinoembrionário (“CEA”), CASP-5, CASP-8, CD274, CD45, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, ciclina D1, Ciclina-A1, proteína de fusão dek-can, DKK1, EFTUD2, fator de alongamento 2, ENAH (hMena), Ep-CAM, EpCAM, EphA3, antígeno de tumor epitelial (“ETA”), proteína de fusão ETV6-AML1, EZH2, FGF5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIX, GAGE- 1,2,8, GAGE-3,4,5,6,7, GAS7, glipicano-3, GnTV, gp100/Pmel17, GPNMB, HAUS3, Hepsina, HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA- A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13Ralfa2, esterase carboxí- lica intestinal, K-ras, Calicreína 4, KIF20A, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, KMHN1 também conhecido como CCDC110, LAGE-1, proteína de fu- são LDLR-fucosiltransferase AS, Lengsina, M-CSF, MAGE-A1, MAGE- A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE- A9, MAGE-C1, MAGE-C2, enzima málica, mamaglobina-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, melan-A/MART-1, Meloe, Mid- quina, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, mucina, MUM-1, MUM-2, MUM-3, Miosina, Miosina de classe I, N-raw, NA88-A, neo-PAP, NFYC, NY-BR-1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, polipeptídeo P, p53, PAP, PAX5, PBF, proteína de fusão pml-RARalfa, mucina epitelial poli- mórfica (“PEM”), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1, RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, SAGE, secernina 1, SIRT2, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP1, survivina, proteína de fusão SYT-SSX1 ou SYT-SSX2, TAG-1, TAG-2, Telomerase, TGF-betaRII, TPBG, TRAG-3, Triosefos- fato isomerase, TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, tirosinase, tirosinase (“TYR”), VEGF, WT1, XAGE-1b/GAGED2a.
Em algumas modalidades,
o antígeno é um neoantígeno.
[0191] Em algumas modalidades, a imunoterapia contra câncer compreende a administração de um receptor de antígeno quimérico es- pecífico para câncer (CAR). Em algumas modalidades, o CAR é admi- nistrado na superfície de uma célula T. Em algumas modalidades, a CAR se liga especificamente a um antígeno associado a câncer.
[0192] Em algumas modalidades, a imunoterapia contra câncer compreende a administração de uma célula T específica para câncer ao sujeito. Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T CD4+. Em algumas modalidades, a célula T CD4+ é uma célula T TH1, uma célula T TH2 ou uma célula T TH17. Em algumas modalidades, a célula T ex- pressa um receptor de célula T específico para um antígeno associado a câncer.
[0193] Em algumas modalidades, a vacina contra câncer é admi- nistrada com um adjuvante. Exemplos de adjuvantes incluem, mas não se limitam a, uma proteína imunomoduladora, Adjuvante 65, α-GalCer, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, fosfato de cálcio, Peptídeo β- Glucano, CpG ODN DNA, GPI-0100, lipídio A, lipopolissacarídeo, Lipo- vant, Montanida, N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutamina, Pam3CSK4, quil A, toxina da cólera (CT) e toxina lábil ao calor de Escherichia coli enterotoxigênica (LT), incluindo derivados destes (CTB, mmCT, CTA1- DD, LTB, LTK63, LTR72, dmLT) e dimicolato de trealose.
[0194] Em algumas modalidades, o agente imunoterápico é uma proteína imunomoduladora para o sujeito. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora é uma citocina ou quimiocina. Exemplos de proteínas imunomoduladoras incluem, mas não se limitam a, quimioa- trativo de linfócitos B (“BLC”), quimiocina 11 com motivo C-C (“Eotaxina- 1”), proteína quimiotática de eosinófilos 2 (“Eotaxina-2”), fator estimula- dor de colônias de granulócitos (“G-CSF”), fator estimulador de colônias de granulócitos de macrófagos (“GM-CSF”), 1-309, Molécula de Adesão
Intercelular 1 (“ICAM-1”), interferon alfa (“IFN-alfa”), interferon beta (“IFN-beta”), interferon gama ("IFN-gama"), interleucina-1 alfa (“IL-1 alfa”), interleucina-1 beta (“IL-1 beta”), antagonista do receptor de inter- leucina 1 (“IL-1 ra”), interleucina-2 (“IL-2”), interleucina-4 (“IL-4”), inter- leucina-5 (“IL-5”), interleucina-6 (“IL-6”), receptor solúvel de interleucina- 6 (“IL-6 sR”), interleucina-7 (“IL-7”), interleucina-8 (“IL-8”), interleucina- 10 (“IL-10”), interleucina- 11 (“IL-11”), subunidade beta da interleucina- 12 (“IL-12 p40” ou “IL-12 p70”), interleucina-13 (“IL-13”), interleucina-15 (“IL-15”), Interleucina-16 (“IL-16”), interleucina-17A-F (“IL-17A-F”), inter- leucina-18 (“IL-18”), interleucina-21 (“IL-21”), interleucina-22 (“IL-22”), interleucina-23 (“IL-23”), interleucina-33 (“IL-33”), ligante 2 da quimio- cina (motivo C-C) (“MCP-1”), fator estimulador de colônias de macrófa- gos (“M-CSF”), monocina induzida por interferon gama (“MIG”), ligante 2 da quimiocina (motivo C-C) (“MIP-1 alfa”), ligante 4 da quimiocina (mo- tivo C-C) (“MIP-1 beta”), proteína-1-delta inflamatória de Macrófago (“MIP-1 delta”), subunidade B do fator de crescimento derivado de pla- quetas (“PDGF-BB”), ligante 5 da quimiocina (motivo C-C), Regulado na Ativação, célula T normal expressa e secretada (“RANTES”), inibidor da TIMP metalopeptidase 1 (“TIMP-1”), inibidor da TIMP metalopeptidase 2 (“TIMP-2”), fator de necrose tumoral, linfotoxina alfa (“TNF alfa”), fator de necrose tumoral, linfotoxina beta (“TNF beta”), receptor solúvel de TNF tipo 1 (“sTNFRI”), sTNFRIIAR, fator neurotrófico derivado do cére- bro (“BDNF”), fator de crescimento básico de fibroblastos (“bFGF”), pro- teína morfogenética óssea 4 (“BMP-4”), proteína morfogenética óssea 5 (“BMP-5”), proteína morfogenética óssea 7 (“BMP-7”), fator de cresci- mento neural (“b-NGF”), fator de crescimento epidérmico (“EGF”), re- ceptor do fator de crescimento epidérmico (“EGFR”), fator de cresci- mento endotelial vascular derivado da glândula endócrina (“EG-VEGF”), fator de crescimento de fibroblastos 4 (“FGF-4”), fator de crescimento de queratinócitos (“FGF-7”), fator de diferenciação de crescimento 15
(“GDF-15”), fator neurotrófico derivado de célula glial (“GDNF”), hormô- nio de crescimento, fator de crescimento semelhante a EGF de ligação à heparina (“HB-EGF”), fator de crescimento de hepatócitos (“HGF”), proteína 1 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina (“IG- FBP-1”), proteína 2 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina (“IGFBP-2”), proteína 3 de ligação ao fator de crescimento se- melhante à insulina (“IGFBP-3”), proteína 4 de ligação ao fator de cres- cimento semelhante à insulina (“IGFBP-4”), proteína 6 de ligação ao fa- tor de crescimento semelhante à insulina (“IGFBP-6”), fator de cresci- mento 1 semelhante à insulina (“IGF-1”), insulina, fator estimulador de colônias de macrófagos (“M-CSF R”), receptor do fator de crescimento neural (“NGF R”), Neurotrofina-3 (“NT-3”), Neurotrofina-4 (“NT-4”), fator inibidor da osteoclastogênese (“Osteoprotegerina”), receptores do fator de crescimento derivado de plaquetas (“PDGF-AA”), biossíntese de fos- fatidilinositol-glicano (“PIGF”), Skp, Culina, amostras contendo F-box (“SCF”), receptor de fator de célula estaminal (“SCF R”), fator de cresci- mento transformador alfa (“TGFalfa”), fator de crescimento transforma- dor beta-1 (“TGF beta 1”), fator de crescimento transformador beta-3 (“TGF beta 3”), fator de crescimento endotelial vascular (“VEGF”), re- ceptor do fator de crescimento endotelial vascular 2 (“VEGFR2”), recep- tor do fator de crescimento endotelial vascular 3 (“VEGFR3”), VEGF-D 6Ckina, receptor de proteína tirosina cinase UFO (“Axl”), betacelulina (“BTC”), quimiocina epitelial associada a mucosas (“CCL28”), ligante 27 da quimiocina (Motivo C-C) (“CTACK”), ligante 16 da quimiocina (motivo C-X-C) 16 (“CXCL16”), quimiocina 5 de motivo C-X-C (“ENA-78”), li- gante 26 da quimiocina (motivo C-C) (“Eotaxina-3”), proteína quimiotá- tica granulocítica 2 (“GCP-2”), GRO, ligante 14 da quimiocina (motivo C- C) (“HCC-l”), ligante 16 de quimiocina (motivo C-C) (“HCC-4”), interleu- cina-9 (“IL-9”), interleucina-17 F (“IL-17F”), proteína de ligação à inter- leucina-18 (“IL-18 BPa”), interleucina-28 A (“IL-28A”), interleucina 29
(“IL-29”), interleucina 31 (“IL-31”), quimiocina 10 de motivo C-X-C (“IP- 10”), receptor CXCR3 de quimiocina (“I-TAC”), fator inibidor de leucemia (“LIF”), ligante da quimiocina leve (motivo C) (“Linfotactina”), proteína quimioatrativa de monócitos 2 (“MCP-2”), proteína quimioatrativa de mo- nócitos 3 (“MCP-3”), proteína quimioatrativa de monócitos 4 (“MCP-4”), quimiocina derivada de macrófagos (“MDC”), fator inibidor da migração de macrófagos (“MIF”), ligante 20 da quimiocina (motivo C-C) (“MIP-3 alfa”), quimiocina 19 de motivo C-C (“MIP-3 beta”), ligante 23 da quimi- ocina (motivo C-C) (“MPIF-1”), cadeia alfa da proteína estimuladora de macrófagos (“MSPalfa”), proteína 4 semelhante à 1 de montagem do nucleossomo (“NAP-2”), fosfoproteína secretada 1 (“Osteopontina”), ci- tocina pulmonar e regulada por ativação (“PARC”), fator plaquetário 4 (“PF4”), fator 1 alfa derivado de célula estromal (“SDF-1 alfa”), ligante 17 da quimiocina (motivo C-C) (“TARC”), quimiocina expressa no timo (“TECK”), linfopoietina estromal tímica (“TSLP 4-IBB”), antígeno CD 166 (“ALCAM”), Cluster de Diferenciação 80 ("B7-1"), membro 17 da super- família de receptores do fator de necrose tumoral (“BCMA”), Cluster de Diferenciação 14 (“CD14”), Cluster de Diferenciação 30 (“CD30”), Clus- ter de Diferenciação 40 (“Ligante CD40”), molécula 1 de adesão a célu- las relacionadas ao antígeno carcinoembrionário (glicoproteína biliar) (“CEACAM-1”), Receptor de Morte 6 (“DR6”), Desoxitimidina cinase (“Dtk”), glicoproteína membranar tipo 1 (“Endoglina”), receptor da prote- ína tirosina cinase erbB-3 (“ErbB3”), molécula de adesão a leucócito en- dotelial 1 (“E-Selectina”), antígeno 1 de apoptose (“Fas”), tirosina cinase 3 semelhante a Fms (“Flt-3L”), membro 1 da superfamília de receptores do fator de necrose tumoral (“GITR”), membro 14 da superfamília de receptores do fator de necrose tumoral (“HVEM”), Molécula de adesão intercelular 3 (“ICAM-3”), IL-1 R4, IL-1 RI, IL-10 Rbeta, IL-17R, IL- 2Rgama, IL-21R, proteína membranar do lisossomo 2 (“LIMPII”), lipoca-
lina associada à gelatinase de neutrófilo (“Lipocalina-2”), CD62L (“L-Se- lectina”), endotélio linfático (“LYVE-1”), sequência A relacionada ao po- lipeptídeo de MHC classe I (“MICA”), sequência B relacionada ao poli- peptídeo MHC de classe I (“MICB”), NRGl-betal, receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas do tipo beta (“PDGF Rbeta”), molé- cula de adesão a células endoteliais de plaquetas (“PECAM-1”), RAGE, receptor celular 1 do vírus da hepatite A (“TIM-1”), membro IOC da su- perfamília de receptores do fator de necrose tumoral (“TRAIL R3”), do- mínio de ligação à transglutaminase da proteína trapina (“trapina-2”), receptor da urocinase (“uPAR”), proteína 1 de adesão celular vascular (“VCAM-1”), XEDARActivina A, proteína relacionada à Agouti (“AgRP”), Ribonuclease 5 (“Angiogenina”), angiopoietina 1, angiostatina, cateprina S, CD40, proteína IB da família críptica (“Cripto-1”), DAN, proteína 1 re- lacionada a Dickkopf (“DKK-1”), caderina-E, molécula de adesão celular epitelial (“EpCAM”), ligante Fas (FasL ou CD95L), Fcg RIIB/C, FoUista- tin, Galectina-7, molécula de adesão intercelular 2 (“ICAM-2”), IL-13 R1, IL-13R2, IL-17B, IL-2 Ra, IL-2 Rb, IL-23, LAP, molécula de adesão a células neuronais (“NrCAM”), inibidor do ativador de plasminogênio 1 (“PAI-1”), receptores de fator de crescimento derivados de plaquetas (“PDGF-AB”), resistina, fator 1 derivado de células estromais (“SDF-1 beta”), sgpl30, proteína 2 secretada relacionada a frizzled (“ShhN”), le- ctinas do tipo imunoglobulina de ligação ao ácido siálico (“Siglec-5”), ST2, fator de crescimento transformador beta 2 (“TGF beta 2”), Tie-2, trombopoietina (“TPO”), membro 10D da superfamília de receptores do fator de necrose tumoral (“TRAIL R4”), receptor de ativação expresso em células mieloides 1 (“TREM-1”), fator de crescimento endotelial vas- cular C (“VEGF-C”), VEGFRlAdiponectina, adipsina (“AND”), alfa-feto- proteína (“AFP”), semelhante à angiopoietina 4 (“ANGPTL4”), microglo- bulina beta-2 (“B2M”), molécula de adesão celular basal (“BCAM”), an- tígeno de carboidrato 125 (“CA125”), antígeno de câncer 15-3 (“CA15-
3”), antígeno carcinoembrionário (“CEA”), proteína receptora cAMP (“CRP”), receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (“ErbB2”), folistatina, hormônio folículo-estimulante (“FSH”), ligante 1 da quimiocina (motivo C-X-C) (“GRO alfa”), gonadotrofina coriônica hu- mana (“beta HCG”), receptor de fator de crescimento 1 semelhante à insulina (“IGF-1 sR”), IL-1 sRII, IL-3, IL-18 Rb, IL-21, leptina, metalopro- teinase-1 de matriz (“MMP-1”), metaloproteinase-2 de matriz (“MMP-2”), metaloproteinase-3 de matriz (“MMP-3”), metaloproteinase-8 de matriz (“MMP-8”), metaloproteinase-9 de matriz (“MMP-9”), metaloproteinase- 10 de matriz (“MMP-10”), Metaloproteinase de matriz 13 (“MMP-13”), Molécula de adesão a células neurais (“NCAM-1”), Entactina (“Nidogê- nio-1”), enolase específica de neurônio (“NSE”), Oncostatina M (“OSM”), Procalcitonina, Prolactina, antígeno específico da próstata (“PSA”), lec- tina 9 semelhante a Ig de ligação ao ácido siálico (“Siglec-9”), endopep- tidase ADAM 17 (“TACE”), tireoglobulina, inibidor 4 da metaloproteinase (“TIMP-4”), TSH2B4, proteína 9 contendo domínio de desintegrina e me- taloproteinase (“ADAM-9”), angiopoietina 2, membro 13 da superfamília de ligantes do fator de necrose tumoral/ membro B da família da fosfo- proteína nuclear rica em leucina acídica (“APRIL”), proteína 2 morfoge- nética óssea (“BMP-2”), proteína 9 morfogenética óssea (“BMP-9”), componente 5a do complemento (“C5a”), catepsina L, CD200, CD97, quemerina, membro 6B da superfamília de receptores do fator de ne- crose tumoral, proteína 2 de ligação a ácidos graxos (“FABP2”), proteína de ativação de fibroblastos alfa (“FAP”), fator de crescimento de fi- broblastos 19 (“FGF-19”), galectina-3, receptor do fator de crescimento de hepatócitos (“HGF R”), IFN-gama/alfa/beta R2, fator de crescimento 2 semelhante a insulina (“IGF-2”), receptor do fator de crescimento 2 semelhante a insulina (“IGF-2 R”), receptor 6 da interleucina-1 (“IL- 1R6”), interleucina 24 (“IL-24”), interleucina 33 (“IL-33”), calicreína 14, asparaginil endopeptidase (“legumaína”), receptor de lipoproteína de baixa densidade oxidado 1 (“LOX-1”), lectina de ligação à manose (“MBL”), neprilisina (“NEP”), homólogo 1 de Notch associado à translo- cação (drosófila) (“Notch-1”), Nefroblastoma superexpressado (“NOV”), Osteoactivina, proteína 1 de morte celular programada (“PD-1”), N-ace- tilmuramoil-L-alanina amidase (“PGRP-5”), serpina A4, proteína 3 rela- cionada com frizzled secretada (“sFRP-3”), trombomodulina, receptor 2 semelhante a Toll (“TLR2”), membro 10A da superfamília de receptores do fator de necrose tumoral (“TRAIL Rl”), transferrina (“TRF”), WIF- lACE-2, albumina, AMICA, angiopoietina 4, fator de ativação de células B (“BAFF”), antígeno de carboidrato 19-9 (“CA19-9”), CD 163, Cluste- rina, CRT AM, ligante 14 de quimiocina (motivo C-X-C) (“CXCL14”), cis- tatina C, decorina (“DCN”), proteína 3 relacionada a Dickkopf (“Dkk-3”), proteína 1 semelhante a delta 1 (“DLL1”), fetuína A, fator de crescimento 1 de ligação à heparina (“aFGF”), receptor alfa de folato (“FOLR1”), fu- rina, proteína 1 de separação associada a GPCR (“GASP-1”), proteína 2 de separação associada a GPCR (“GASP-2”), receptor do fator esti- mulador de colônias de granulócitos (“GCSF R”), hepsina de serina pro- tease (“HAI-2”), receptor de interleucina-17B (“IL-17B R”), interleucina 27 (“IL-27”), gene 3 de ativação de linfócitos (“LAG-3”), apolipoproteína A-V (“LDL R”), pepsinogênio I, proteína 4 de ligação ao retinol (“RBP4”), SOST, proteoglicano de sulfato de heparano (“Sindecano-1”), membro 13B da superfamília de receptores do fator de necrose tumoral (“TACI”), inibidor da via do fator tecidual (“TFPI”), TSP-1, membro 10b da super- família de receptores do fator de necrose tumoral (“TRAIL R2”), TRANCE, Troponina I, Urocinase Ativadora de Plasminogênio (“uPA”), Caderina 5, tipo 2 ou VE-caderina (endotelial vascular) também conhe- cido como CD144 (“VE-Caderina”), proteína 1 da via de sinalização in- duzível por WNTl (“WISP-1”) e ativador de receptor do fator nuclear κ B (“RANK”).
[0195] Em algumas modalidades, o agente terapêutico contra cân- cer é um composto anticâncer. Compostos anticâncer exemplificativos incluem, mas não se limitam a, Alentuzumabe (Campath®), Alitretinoína (Panretin®), Anastrozol (Arimidex®), Bevacizumabe (Avastin®), Bexa- roteno (Targretin®), Bortezomibe (Velcade®), Bosutinibe (Bosulif®), Brentuximabe vedotina (Adcetris®), Cabozantinibe (Cometriq™), Carfil- zomibe (Kyprolis™), Cetuximabe (Erbitux®), Crizotinibe (Xalkori®), Dasatinibe (Sprycel®), Denileucina diftitox (Ontak®), Cloridrato de erlo- tinibe (Tarceva®), Everolimus (Afinitor®), Exemestano (Aromasin®), Fulvestrant (Faslodex®), Gefitinibe (Iressa®), Ibritumomabe tiuxetano (Zevalin®), Imatinibe mesilato (Gleevec®), Ipilimumabe (Yervoy™), La- patinibe ditosilato (Tykerb®), Letrozol (Femara®), Nilotinibe (Tasigna®), Ofatumumabe (Arzerra®), Panitumumabe (Vectibix®), Cloridrato de pa- zopanibe (Votrient®), Pertuzumabe (Perjeta™), Pralatrexato (Folotyn®), Regorafenibe (Stivarga®), Rituximabe (Rituxan®), Romi- depsina (Istodax®), Sorafenibe tosilato (Nexavar®), Malato de sunitinibe (Sutent®), Tamoxifeno, Tensirolimus (Torisel®), Toremifeno (Fares- ton®), Tositumomabe e 131I-tositumomabe (Bexxar®), Trastuzumabe (Herceptin®), Tretinoína (Vesanoid®), Vandetanibe (Caprelsa®), Vemu- rafenibe (Zelboraf®), Vorinostat (Zolinza®) e Ziv-aflibercept (Zaltrap®).
[0196] Compostos anticâncer exemplificativos, que modificam a função de proteínas que regulam a expressão gênica e outras funções celulares (por exemplo, inibidores de HDAC, ligantes de receptores de retinoide) são Vorinostat (Zolinza®), Bexaroteno (Targretin®) e Romi- depsina (Istodax®), Alitretinoína (Panretin®) e Tretinoína (Vesanoid®).
[0197] Compostos anticâncer exemplificativos que induzem apop- tose (por exemplo, inibidores de proteassoma, antifolatos) são Borte- zomibe (Velcade®), Carfilzomibe (Kyprolis™) e Pralatrexato (Folotyn®).
[0198] Compostos anticâncer exemplificativos que aumentam a res-
posta imunológica antitumoral (por exemplo, anti CD20, anti CD52; an- tígeno-4 associado ao linfócito T anti-citotóxico) são Rituximabe (Ritu- xan®), Alentuzumabe (Campath®), Ofatumumabe (Arzerra®) e Ipilimu- mabe (Yervoy™).
[0199] Compostos anticâncer exemplificativos que entregam agen- tes tóxicos a células cancerígenas (por exemplo, fusões anti-CD20-ra- dionuclídeo; fusões de toxina IL-2-difteria; fusões anti-CD30-monometi- lauristatina E (MMAE)) são Tositumomabe e 131I-tositumomabe (Bexxar®) e Ibritumomabe tiuxetano (Zevalin®), Denileucina diftitox (Ontak®) e Brentuximabe vedotina (Adcetris®).
[0200] Outros compostos anticâncer exemplificativos são inibidores de células pequenas e conjugados dos mesmos de, por exemplo, Janus cinase, ALK, Bcl-2, PARP, PI3K, receptor de VEGF, Braf, MEK, CDK e HSP90.
[0201] Compostos anticâncer à base de platina exemplificativos in- cluem, por exemplo, cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, satraplatina, picoplatina, Nedaplatina, Triplatina e Lipoplatina. Outros fármacos à base de metal adequados para tratamento incluem, mas não se limitam a, compostos à base de rutênio, derivados de ferroceno, compostos à base de titânio e compostos à base de gálio.
[0202] Em algumas modalidades, o terapêutico contra câncer é uma porção química radioativa que compreende um radionuclídeo. Radionu- clídeos exemplificativos incluem, mas não se limitam a, Cr-51, Cs-131, Ce-134, Se-75, Ru-97, I-125, Eu-149, Os-189m, Sb-119, I-123, Ho-161, Sb-117, Ce-139, In-111, Rh-103m, Ga-67, Tl-201, Pd-103, Au-195, Hg- 197, Sr-87m, Pt-191, P-33, Er-169, Ru-103, Yb-169, Au-199, Sn-121, Tm-167, Yb-175, In-113m, Sn-113, Lu-177, Rh-105, Sn-117m, Cu-67, Sc-47, Pt-195m, Ce-141, I-131, Tb-161, As-77, Pt-197, Sm-153, Gd- 159, Tm-173, Pr-143, Au-198, Tm-170, Re-186, Ag-111, Pd-109, Ga-73, Dy-165, Pm-149, Sn-123, Sr-89, Ho-166, P-32, Re-188, Pr-142, Ir-194,
In-114m/In-114 e Y-90.
[0203] Em algumas modalidades, o terapêutico contra câncer é um antibiótico. Por exemplo, se a presença de uma bactéria associada ao câncer e/ou um perfil de microbioma associado ao câncer for detectada, de acordo com os métodos no presente documento proporcionados, po- dem ser administrados antibióticos para eliminar as bactérias associa- das ao câncer do sujeito. “Antibióticos” se referem amplamente a com- postos com capacidade para inibir ou prevenir uma infeção bacteriana. Os antibióticos podem ser classificados de várias formas, incluindo seu uso para infeções específicas, seu mecanismo de ação, sua biodisponi- bilidade ou seu espectro de micróbio-alvo (por exemplo, bactérias Gram-negativas vs. Gram-positivas, bactérias aeróbicas vs. anaeróbi- cas, etc.), e estes podem ser usados para exterminar bactérias especí- ficas em áreas específicas do hospedeiro (“nichos”) (Leekha, et al. 2011. General Principles of Antimicrobial Therapy. Mayo Clin Proc. 86(2): 156- 167). Em certas modalidades, os antibióticos podem ser usados para atingir seletivamente bactérias de um nicho específico. Em algumas mo- dalidades, os antibióticos conhecidos para tratar uma infeção particular que inclui um nicho cancerígeno podem ser usados para atingir micró- bios associados ao câncer, incluindo bactérias associadas ao câncer nesse nicho. Em outras modalidades, os antibióticos são administrados após o tratamento bacteriano. Em algumas modalidades, os antibióticos são administrados após o tratamento bacteriano para remover o en- xerto. Distúrbios imunológicos
[0204] Em algumas modalidades, os métodos e composições no presente documento descritos se relacionam com o tratamento ou pre- venção de uma doença ou distúrbio associado a uma resposta imuno- lógica patológica, tal como uma doença autoimune, uma reação alérgica e/ou uma doença inflamatória. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é uma doença inflamatória intestinal (por exemplo, doença de Crohn ou colite ulcerativa). Em algumas modalidades, os métodos e composições no presente documento descritos se relacionam com o tra- tamento ou prevenção de hipersensibilidade de tipo retardado, miocar- dite autoimune, granulomas, neuropatias periféricas, tireoidite de Hashi- moto, inflamação do cólon, colite, colite microscópica, colite colagenosa, colite por derivação, colite química, colite isquêmica, colite indetermi- nada, colite atípica.
[0205] Os métodos no presente documento descritos podem ser usados para tratar qualquer sujeito em necessidade dos mesmos. Como no presente documento usado, um "sujeito em necessidade do mesmo" inclui qualquer sujeito que tenha uma doença ou distúrbio associado a uma resposta imunológica patológica (por exemplo, uma doença infla- matória intestinal), bem como qualquer sujeito com uma maior probabi- lidade de adquirir tal doença ou distúrbio.
[0206] As composições no presente documento descritas podem ser usadas, por exemplo, como uma composição farmacêutica para pre- venir ou tratar (reduzir, parcial ou completamente, os efeitos adversos de) uma doença autoimune, tal como doença inflamatória intestinal crô- nica, lúpus eritematoso sistêmico, psoríase, síndrome de Muckle-Wells, artrite reumatoide, esclerose múltipla ou doença de Hashimoto; uma do- ença alérgica, tal como uma alergia alimentar, polinose ou asma; uma doença infecciosa, tal como infeção com Clostridium difficile; uma do- ença inflamatória, tal como uma doença inflamatória mediada por TNF (por exemplo, uma doença inflamatória do trato gastrointestinal, tal como pouchite, uma condição inflamatória cardiovascular, tal como ate- rosclerose, ou uma doença inflamatória pulmonar, tal como doença pul- monar obstrutiva crônica); uma composição farmacêutica para suprimir a rejeição de transplante de órgãos ou outras situações nas quais a re- jeição tecidual pode ocorrer; um suplemento, alimento ou bebida para melhorar as funções imunológicas; ou um reagente para suprimir a pro- liferação ou função de células imunológicas.
[0207] Em algumas modalidades, os métodos no presente docu- mento proporcionados são úteis para o tratamento de inflamação. Em certas modalidades, a inflamação de qualquer tecido e órgãos do corpo, incluindo inflamação musculoesquelética, inflamação vascular, inflama- ção neural, inflamação do sistema digestivo, inflamação ocular, inflama- ção do sistema reprodutor e outra inflamação, como discutido abaixo.
[0208] Distúrbios imunológicos do sistema musculoesquelético in- cluem, mas não se limitam a, aquelas afecções que afetam as articula- ções esqueléticas, incluindo articulações das mãos, punho, cotovelo, ombro, mandíbula, coluna, pescoço, quadril, joelho, tornozelo e pés, e afecções que afetam os tecidos que conectam os músculos aos ossos, tais como tendões. Exemplos de tais distúrbios imunológicos, que po- dem ser tratados com os métodos e composições no presente docu- mento descritos, incluem, mas não se limitam a, artrite (incluindo, por exemplo, osteoartrite, artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite anquilosante, artrite infecciosa aguda e crônica, artrite associada à gota e pseudogota e artrite idiopática juvenil), tendinite, sinovite, tenossino- vite, bursite, fibrosite (fibromialgia), epicondilite, miosite e osteite (inclu- indo, por exemplo, doença de Paget, osteite pubiana e osteite fibrosa cística).
[0209] Distúrbios imunológicos oculares se referem a um distúrbio imunológico que afeta qualquer estrutura do olho, incluindo as pálpe- bras. Exemplos de distúrbios imunológicos oculares que podem ser tra- tados com os métodos e composições no presente documento descritos incluem, mas não se limitam a, blefarite, blefarocalase, conjuntivite, da- crioadenite, queratite, ceratoconjuntivite sicca (olho seco), esclerite, tri- quíase e uveíte
[0210] Exemplos de distúrbios imunológicos do sistema nervoso que podem ser tratados com os métodos e composições no presente documento descritos incluem, mas não se limitam a, encefalite, sín- drome de Guillain-Barre, meningite, neuromiotonia, narcolepsia, escle- rose múltipla, mielite e esquizofrenia. Exemplos de inflamação da vas- culatura ou sistema linfático que pode ser tratada com os métodos e composições no presente documento descritos incluem, mas não se li- mitam a, aterosclerose, artrite, flebite, vasculite e linfangite.
[0211] Exemplos de distúrbios imunológicos do sistema digestivo que podem ser tratados com os métodos e composições no presente documento descritos incluem, mas não se limitam a, colangite, colecis- tite, enterite, enterocolite, gastrite, gastroenterite, doença inflamatória intestinal, ileíte e proctite. Doenças inflamatórias intestinais incluem, por exemplo, certas formas reconhecidas na técnica de um grupo de afec- ções relacionadas. São conhecidas diversas formas principais de doen- ças inflamatórias intestinais, sendo que a doença de Crohn (doença in- testinal regional, por exemplo, formas inativas e ativas) e colite ulcera- tiva (por exemplo, formas inativas e ativas) são as mais comuns destes distúrbios. Além disso, a doença inflamatória intestinal abrange a sín- drome do intestino irritável, colite microscópica, enterite linfocítica-plas- mocítica, doença celíaca, colite colagenosa, colite linfocítica e enteroco- lite eosinofílica. Outras formas menos comuns de IBD incluem colite in- determinada, colite pseudomembranosa (colite necrosante), doença in- flamatória intestinal isquêmica, doença de Behcet, sarcoidose, esclero- dermia, displasia associada a IBD, massas ou lesões associadas à dis- plasia e colangite esclerosante primária.
[0212] Exemplos de distúrbios imunológicos do sistema reprodutor que podem ser tratados com os métodos e composições no presente documento descritos incluem, mas não se limitam a, cervicite, corioam- nionite, endometrite, epididimite, onfalite, ooforite, orquite, salpingite, abcesso no tubo ovariano, uretrite, vaginite, vulvite e vulvodinia.
[0213] Os métodos e composições no presente documento descri- tos podem ser usados para tratar afecções imunológicas que têm um componente inflamatório. Tais afecções incluem, mas não se limitam a, alopecia universal disseminada aguda, doença de Behcet, doença de Chagas, síndrome de fadiga crônica, disautonomia, encefalomielite, es- pondilite anquilosante, anemia aplástica, hidradenite supurativa, hepa- tite autoimune, ooforite autoimune, doença celíaca, doença de Crohn, diabetes mellitus tipo 1, arterite de células gigantes, síndrome de Goo- dpasture, doença de Grave, síndrome de Guillain-Barre, doença de Hashimoto, púrpura de Henoch-Schonlein, doença de Kawasaki, lúpus eritematoso, colite microscópica, poliarterite microscópica, doença do tecido conjuntivo misto, síndrome de Muckle-Wells, esclerose múltipla, miastenia grave, síndrome de opsoclonia-mioclonia, neurite óptica, tire- oidite de Ord, pênfigo, poliarterite nodosa, polimialgia, artrite reuma- toide, síndrome de Reiter, síndrome de Sjogren, arterite temporal, gra- nulomatose de Wegener, anemia hemolítica autoimune do tipo quente, cistite intersticial, doença de Lyme, morfeia, psoríase, sarcoidose, es- clerodermia, colite ulcerativa e vitiligo.
[0214] Os métodos e composições no presente documento descri- tos podem ser usados para tratar doenças de hipersensibilidade media- das por células T que têm um componente inflamatório. Tais afecções incluem, mas não se limitam a, hipersensibilidade ao contato, dermatite de contato (incluindo a causada por hera venenosa), urticária, alergias cutâneas, alergias respiratórias (febre do feno, rinite alérgica, alergia a ácaros residenciais) e enteropatia sensível a glúten (doença celíaca).
[0215] Outros distúrbios imunológicos que podem ser tratados com os métodos e composições incluem, por exemplo, apendicite, dermatite, dermatomiosite, endocardite, fibrosite, gengivite, glossite, hepatite, hi- dradenite supurativa, irite, laringite, mastite, miocardite, nefrite, otite,
pancreatite, parotite, pericardite, peritonoite, faringite, pleurite, pneumo- nite, prostatite, pielonefrite e estomatite, rejeição de transplante (envol- vendo órgãos tais como rim, fígado, coração, pulmão, pâncreas (por exemplo, células de ilhota), medula óssea, córnea, intestino delgado, aloenxertos de pele, homoenxertos de pele e xenoenxertos de válvulas cardíacas, doença do soro e doença do enxerto vs. hospedeiro), pan- creatite aguda, pancreatite crônica, síndrome do desconforto respirató- rio agudo, síndrome de Sexary, hiperplasia adrenal congênita, tireoidite não supurativa, hipercalcemia associada ao câncer, pênfigo, dermatite herpetiforme bolhosa, eritema multiforme grave, dermatite esfoliativa, dermatite seborreica, rinite alérgica sazonal ou perene, asma brônquica, dermatite de contato, dermatite atópica, reações de hipersensibilidade a fármacos, conjuntivite alérgica, queratite, herpes zoster oftálmico, irite e oiridociclite, coriorretinite, neurite óptica, sarcoidose sintomática, qui- mioterapia para tuberculose pulmonar fulminante ou disseminada, púr- pura trombocitopênica idiopática em adultos, trombocitopenia secundá- ria em adultos, anemia hemolítica adquirida (autoimune), leucemia e lin- fomas em adultos, leucemia aguda na infância, enterite regional, vascu- lite autoimune, esclerose múltipla, doença pulmonar obstrutiva crônica, rejeição de transplante de órgão sólido, sepse. Os tratamentos prefe- renciais incluem o tratamento de rejeição de transplante, artrite reuma- toide, artrite psoriática, esclerose múltipla, diabetes tipo 1, asma, do- ença inflamatória intestinal, lúpus eritematoso sistêmico, psoríase, do- ença pulmonar obstrutiva crônica e inflamação acompanhando afec- ções infecciosas (por exemplo, sepse).
[0216] Os métodos e composições no presente documento descri- tos podem ser usados para tratar distúrbios metabólicos e síndromes metabólicas. Tais afecções incluem, mas não se limitam a, diabetes tipo II, encefalopatia, doença de Tay-Sachs, doença de Krabbe, galactose- mia, fenilcetonúria (PKU) e doença da urina do xarope de bordo.
[0217] Os métodos e composições no presente documento descri- tos podem ser usados para tratar doenças neurodegenerativas e neuro- lógicas. Tais condições incluem, mas não se limitam a, doença de Par- kinson, doença de Alzheimer, doença de Príon, doença de Huntington, doenças neuronais motoras (MND), ataxia espinocerebelar, atrofia mus- cular espinhal, distonia, hipertensão idiopática intracraniana, epilepsia, doença do sistema nervoso, doença do sistema nervoso central, distúr- bios do movimento, esclerose múltipla, encefalopatia, neuropatia perifé- rica e disfunção cognitiva pós-operatória. Câncer
[0218] Em algumas modalidades, os métodos e composições no presente documento descritos se relacionam com o tratamento de cân- cer. Em algumas modalidades, qualquer câncer pode ser tratado usando os métodos no presente documento descritos. Exemplos de cânceres que podem ser tratados pelos métodos e composições no pre- sente documento descritos incluem, mas não se limitam a, células can- cerígenas da bexiga, sangue, osso, medula óssea, cérebro, mama, có- lon, esôfago, gastrointestino, gengiva, cabeça, rim, fígado, pulmão, na- sofaringe, pescoço, ovário, próstata, pele, estômago, testículo, língua ou útero. Além disso, o câncer pode ser especificamente do seguinte tipo histológico, embora não se limite a estes: neoplasia maligna; carci- noma; carcinoma indiferenciado; carcinoma de células gigantes e fusi- formes; carcinoma de células pequenas; carcinoma papilar; carcinoma de células escamosas; carcinoma linfoepitelial; carcinoma basocelular; carcinoma de pilomatriz; carcinoma de células de transição; carcinoma de células de transição papilar; adenocarcinoma; gastrinoma maligno; colangiocarcinoma; carcinoma hepatocelular; carcinoma hepatocelular e colangiocarcinoma combinados; adenocarcinoma trabecular; carci- noma adenoide cístico; adenocarcinoma no pólipo adenomatoso; ade-
nocarcinoma de polipose familiar coli; carcinoma sólido; tumor carci- noide maligno; adenocarcinoma bronquíolo-alveolar; adenocarcinoma papilar; carcinoma cromofóbico; carcinoma acidófilo; adenocarcinoma oxifílico; carcinoma basófilo; adenocarcinoma de células claras; carci- noma de células granulares; adenocarcinoma folicular; adenocarcinoma papilar e folicular; carcinoma esclerosante não encapsulante; carcinoma cortical adrenal; carcinoma endometroide; carcinoma de apêndice cutâ- neo; adenocarcinoma apócrino; adenocarcinoma sebáceo; adenocarci- noma ceruminoso; carcinoma mucoepidermoide; cistadenocarcinoma; cistadenocarcinoma papilar; cistadenocarcinoma seroso papilar; cista- denocarcinoma mucinoso; adenocarcinoma mucinoso; carcinoma de células de anel em sinete; carcinoma do duto infiltrante; carcinoma me- dular; carcinoma lobular; carcinoma inflamatório; doença de Paget ma- mária; carcinoma de células acinares; carcinoma adenoescamoso; ade- nocarcinoma com metaplasia escamosa; timoma maligno; tumor estro- mal maligno do ovário; tecoma maligno; tumor de células granulosas maligno; e roblastoma maligno; carcinoma de células de Sertoli; tumor de células leydig maligno; tumor de células lipídicas maligno; paragan- glioma maligno; paraganglioma extra-mamário maligno; feocromoci- toma; glomangiossarcoma; melanoma maligno; melanoma amelanotico; melanoma de espalhamento superficial; melanoma maligno em nevo pigmentado gigante; melanoma de células epitelioides; nevo azul ma- ligno; sarcoma; fibrossarcoma; histiocitoma fibroso maligno; mixossar- coma; lipossarcoma; leiomiossarcoma; rabdomiossarcoma; rabdomios- sarcoma embrionário; rabdomiossarcoma alveolar; sarcoma estromal; tumor misto maligno; tumor misto mulleriano; nefroblastoma; hepato- blastoma; carcinossarcoma; mesenquimoma maligno; tumor de Brenner maligno; tumor filodes maligno; sarcoma sinovial; mesotelioma maligno; disgerminoma; carcinoma embrionário; teratoma maligno; struma ovarii maligno; coriocarcinoma; mesonefroma maligno; hemangiossarcoma;
hemangioendotelioma maligno; sarcoma de Kaposi; hemangioperici- toma maligno; linfangiossarcoma; osteossarcoma; osteossarcoma jus- tacortical; condrossarcoma; condroblastoma maligno; condrossarcoma mesenquimal; tumor de células gigantes do osso; sarcoma de Ewing; tumor odontogênico maligno; odontossarcoma ameloblástico; amelo- blastoma maligno; fibrossarcoma ameloblástico; pinealoma maligno; cordoma; glioma maligno; ependimoma; astrocitoma; astrocitoma proto- plasmático; astrocitoma fibrilar; astroblastoma; glioblastoma; oligoden- droglioma; oligodendroblastoma; neuroectodérmico primitivo; sarcoma cerebelar; ganglioneuroblastoma; neuroblastoma; retinoblastoma; tu- mor neurogênico olfativo; meningioma maligno; neurofibrossarcoma; neurilemoma maligno; tumor de células granulares maligno; linfoma ma- ligno; doença de Hodgkin; linfoma de Hodgkin; paragranuloma; linfoma maligno de pequenos linfócitos; linfoma maligno de células grandes di- fuso; linfoma maligno folicular; micose fungoide; outros linfomas não Ho- dgkin especificados; histiocitose maligna; mieloma múltiplo; sarcoma de mastócitos; doença imunoproliferativa do intestino delgado; leucemia; leucemia linfoide; leucemia de células plasmáticas; eritroleucemia; leu- cemia celular de linfossarcoma; Leucemia mieloide; leucemia basofílica; leucemia eosinofílica; leucemia monocítica; leucemia de mastócitos; leucemia megacarioblástica; sarcoma mieloide; plasmacitoma, câncer colorretal, câncer retal e leucemia de células pilosas.
[0219] Em algumas modalidades, os métodos e composições no presente documento proporcionados se relacionam com o tratamento de uma leucemia. O termo “leucemia” significa doenças malignas am- plamente progressivas dos órgãos/sistemas hematopoiéticos e é geral- mente caracterizada por uma proliferação e desenvolvimento distorci- dos de leucócitos e seus precursores no sangue e na medula óssea. Exemplos não limitativos de doenças de leucemia incluem, leucemia não linfocítica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia granulocí- tica aguda, leucemia granulocítica crônica, leucemia promielocítica aguda, leucemia de células T do adulto, leucemia aleucêmica, uma leu- cemia leucocitêmica, leucemia basofílica, leucemia de blastócitos, leu- cemia bovina, leucemia mielocítica crônica, leucemia cutânea, leucemia embrionária, leucemia eosinofílica, leucemia de Gross, leucemia de cé- lulas de Rieder, leucemia de Schilling, leucemia de células estaminais, leucemia subleucêmica, leucemia de células indiferenciada, leucemia de células pilosas, leucemia hemoblástica, leucemia hemocitoblástica, leucemia histiocítica, leucemia de células estaminais, leucemia monocí- tica aguda, leucemia leucopênica, leucemia linfática, leucemia linfoblás- tica, leucemia linfocítica, leucemia linfogênica, leucemia linfoide, leuce- mia de células de linfossarcoma, leucemia de mastócitos, leucemia me- gacariocítica, leucemia micromieloblástica, leucemia monocítica, leuce- mia mieloblástica, leucemia mielocítica, leucemia granulocítica mieloide, leucemia mielomonocítica, leucemia de Naegeli, leucemia de células plasmáticas, leucemia plasmocítica e leucemia promielocítica.
[0220] Em algumas modalidades, os métodos e composições no presente documento proporcionados se relacionam com o tratamento de um carcinoma. O termo “carcinoma” se refere a um crescimento ma- ligno constituído por células epiteliais que tendem a se infiltrar nos teci- dos circundantes e/ou resistir aos sinais de morte celular fisiológicos e não fisiológicos e dando origem a metástases. Tipos exemplificativos não limitativos de carcinomas incluem, carcinoma acinar, carcinoma aci- noso, carcinoma adenocístico, carcinoma cístico adenoide, carcinoma adenomatoso, carcinoma do córtex adrenal, carcinoma alveolar, carci- noma celular alveolar, carcinoma de células basais, carcinoma basoce- lular, carcinoma basaloide, carcinoma de células basoescamosas, car- cinoma bronquioalveolar, carcinoma bronquiolar, carcinoma broncogê-
nico, carcinoma cerebriforme, carcinoma colangiocelular, carcinoma co- riônico, carcinoma coloide, carcinoma de comedo, carcinoma do corpo, carcinoma cribriforme, carcinoma en cuirasse, carcinoma cutâneo, car- cinoma cilíndrico, carcinoma de células cilíndricas, carcinoma de duto, carcinoma duro, carcinoma embrionário, carcinoma encefaloide, carci- noma epienoide, carcinoma epitelial adenoide, carcinoma exofítico, car- cinoma ex ulcere, carcinoma fibroso, carcinoma gelatiniforme, carci- noma gelatinoso, carcinoma de células gigantes, carcinoma de células de anel em sinete, carcinoma simplex, carcinoma de células pequenas, carcinoma solanoide, carcinoma de células esferoidais, carcinoma de células fusiformes, carcinoma esponjoso, carcinoma escamoso, carci- noma de células escamosas, carcinoma de cordas, carcinoma telan- giectásico, carcinoma telangiectoide, carcinoma de células de transição, carcinoma tuberoso, carcinoma tuberoso, carcinoma verrucoso, carci- noma viloso, carcinoma gigantocelular, carcinoma glandular, carcinoma de células granulosas, carcinoma de matriz capilar, carcinoma hema- toide, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células de Hurthle, carci- noma hialino, carcinoma hipernefroide, carcinoma embrionário infantil, carcinoma in situ, carcinoma intraepidérmico, carcinoma intraepitelial, carcinoma de Krompecher, carcinoma de células de Kulchitzky, carci- noma de células grandes, carcinoma lenticular, carcinoma lenticular, carcinoma lipomatoso, carcinoma linfoepitelial, carcinoma medular, car- cinoma melanótico, carcinoma molle, carcinoma mucinoso, carcinoma muciparo, carcinoma mucocelular, carcinoma mucoepidermoide, carci- noma mucoso, carcinoma do muco, carcinoma mixomatoide, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de células tipo grão de aveia, carcinoma ossi- ficante, carcinoma osteoide, carcinoma papilar, carcinoma periportal, carcinoma pré-invasivo, carcinoma de células espinhosas, carcinoma pultáceo, carcinoma de células renais do rim, carcinoma de células de reserva, carcinoma sarcomatoide, carcinoma schneideriano, carcinoma escirroso, carcinoma de células de Merkel, carcinoma de glândula sali- var e carcinoma do escroto.
[0221] Em algumas modalidades, os métodos e composições no presente documento proporcionados se relacionam com o tratamento de um sarcoma. O termo “sarcoma” geralmente se refere a um tumor que é constituído por uma substância semelhante ao tecido conjuntivo embrionário e é geralmente composto por células estreitamente emba- ladas embebidas em uma substância fibrilar, heterogênea ou homogê- nea. Sarcomas incluem, mas não se limitam a, condrossarcoma, fibros- sarcoma, linfossarcoma, melanossarcoma, mixossarcoma, osteossar- coma, sarcoma endometrial, sarcoma estromal, sarcoma de Ewing, sar- coma fascial, sarcoma fibroblástico, sarcoma de células grandes, sar- coma de Abemethy, sarcoma adiposo, lipossarcoma, sarcoma alveolar de partes moles, sarcoma ameloblástico, sarcoma botrioide, sarcoma cloroma, coriocarcinoma, sarcoma embrionário, sarcoma tumoral de Wilms, sarcoma granulocítico, sarcoma de Hodgkin, sarcoma hemorrá- gico pigmentado múltiplo idiopático, sarcoma imunoblástico de células B, linfoma, sarcoma imunoblástico de células T, sarcoma de Jensen, sarcoma de Kaposi, sarcoma de células de Kupffer, angiossarcoma, leu- cossarcoma, sarcoma mesenquimatoso maligno, sarcoma parosteal, sarcoma reticulocítico, sarcoma de Rous, sarcoma serocístico, sarcoma sinovial e sarcoma telangiectásico.
[0222] Neoplasias exemplificativas adicionais, que podem ser trata- das usando os métodos e composições no presente documento descri- tos incluem doença de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, mieloma múltiplo, neuroblastoma, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pulmão, rabdomiossarcoma, trombocitose primária, macroglobulinemia primária, tumores de pulmão de células pequenas, tumores cerebrais primários, câncer de estômago, câncer de cólon, insulanoma pancreático maligno,
carcinoide maligno, lesões de pele pré-malignas, câncer testicular, lin- fomas, câncer da tireoide, neuroblastoma, câncer esofágico, câncer do trato genitourinário, hipercalcemia maligna, câncer cervical, câncer en- dometrial e câncer adrenal cortical.
[0223] Em algumas modalidades, o câncer tratado é um melanoma. O termo “melanoma” é considerado um tumor que se origina do sistema melanocítico da pele e outros órgãos. Exemplos não limitativos de me- lanomas são melanoma de Harding-Passey, melanoma juvenil, mela- noma lentigo maligno, melanoma maligno, melanoma acral-lentiginoso, melanoma amelanótico, melanoma juvenil benigno, melanoma de Cloudman, melanoma S91, melanoma nodular, melanoma subungueal e melanoma de espalhamento superficial.
[0224] Categorias particulares de tumores que podem ser tratados usando os métodos e composições no presente documento descritos incluem distúrbios linfoproliferativos, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer do colo do útero, câncer endometrial, câncer ósseo, câncer de fígado, câncer de estômago, câncer de cólon, câncer pancreático, câncer da tireoide, câncer de cabeça e pescoço, câncer do sistema nervoso central, câncer do sistema nervoso periférico, câncer de pele, câncer de rim, bem como metástases de todos os citados acima. Os tipos particulares de tumores incluem carcinoma hepatocelu- lar, hepatoma, hepatoblastoma, rabdomiossarcoma, carcinoma esofa- geal, carcinoma de tireoide, ganglioblastoma, fibrossarcoma, mixossar- coma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogênico, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, tumor de Ewing, leimiossarcoma, rabdoteliossarcoma, carcinoma dutal invasivo, adenocarcinoma papilar, melanoma, carcinoma de célula escamosa pulmonar, carcinoma de cé- lula basal, adenocarcinoma (bem diferenciado, moderadamente diferen- ciado, insatisfatoriamente diferenciado ou não diferenciado), carcinoma bronquioalveolar, carcinoma de célula renal, hipernefroma, adenocarci- noma hipernefroide, carcinoma de duto biliar, coriocarcinoma, semi- noma, carcinoma embrionário, tumor de Wilms, tumor testicular, carci- noma pulmonar incluindo carcinoma pulmonar de célula pequena, de célula não pequena e de célula grande, carcinoma de bexiga, glioma, astrocioma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinea- loma, retinoblastoma, neuroblastoma, carcinoma de cólon, carcinoma retal, malignâncias hematopoiéticas incluindo todos os tipos de leuce- mia e linfoma incluindo: leucemia mielogenosa aguda, leucemia mielo- cítica aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielogenosa crônica, leucemia linfocítica crônica, leucemia de célula de masto, leucemia me- gacariocíticao, linfoma mieloide, linfoma de Hodgkin, linfoma não Hod- gkin.
[0225] Cânceres tratados em certas modalidades também incluem lesões pré-cancerígenas, por exemplo, queratose actínica (queratose solar), sinais (nevos displásicos), celite actínica (lábios do agricultor), cornos cutâneos, esôfago de Barrett, gastrite atrófica, disqueratose con- gênita, disfagia sideropênica, líquen plano, fibrose submucosa oral, elastose actínica (solar) e displasia cervical.
[0226] Cânceres tratados em algumas modalidades incluem tumo- res não cancerígenos ou benignos, por exemplo, de origem endodér- mica, ectodérmica ou mesenquimal, incluindo, mas não se limitando a, colangioma, pólipo colônico, adenoma, papiloma, cistadenoma, ade- noma de células hepáticas, mole hidatidiforme, adenoma tubular renal, papiloma de células escamosas, pólipo gástrico, hemangioma, oste- oma, condroma, lipoma, fibroma, linfangioma, leiomioma, rabdomioma, astrocitoma, nevo, meningioma e ganglioneuroma.
EXEMPLOS Exemplo 1: Imunomodulação de bactérias comensais humanas em um modelo de hipersensibilidade do tipo retardado baseado em
KLH
[0227] A hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) é um modelo animal de dermatite atópica (ou dermatite de contato alérgica), como revisado por Petersen et al. (In vivo pharmacological disease models for psoriasis e atopic dermatitis in drug discovery. Basic & Clinical Pharm & Toxicology. 2.006. 99(2): 104 a 115; ver também Irving C. Allen (edição) Mouse Models of Innate Immunity: Methods e Protocols, Methods in Mo- lecular Biology, 2013. volume 1031, DOI 10.1007/978-1-62703-481- 4_13). A mesma pode ser induzida em uma variedade de cepas de ca- mundongo e rato usando vários haptenos ou antígenos, por exemplo, um antígeno emulsionado com um adjuvante. A DTH é caracterizada por sensibilização, bem como uma reação mediada por células T espe- cíficas para antígeno que resulta em eritema, edema e infiltração celular – especialmente infiltração de células apresentadoras de antígeno (APC), eosinófilos, células T CD4+ ativadas e células Th2 que expres- sam citocina.
[0228] As formulações de teste foram preparadas para modelo de hipersensibilidade do tipo retardado baseado em KLH. O modelo de hi- persensibilidade tipo DTH proporciona um mecanismo in vivo para es- tudar a resposta imunológica mediada por células e inflamação resul- tante após exposição a um antígeno específico para o qual os camun- dongos foram sensibilizados. Diversas variações do modelo de DTH fo- ram usadas e são bem conhecidas na técnica (Irving C. Allen (ed.). Mouse Models of Innate Immunity: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Vol. 1031, DOI 10.1007/978-1-62703-481-4_13, Springer Science + Business Media, LLC 2013). Por exemplo, a emul- são de Hemocianina de Caramujo Megathura crenulata (KLH) e Adju- vante Completo de Freund (CFA) são recém preparados no dia da imu- nização (dia 0). Para esta finalidade, 8 mg de pó de KLH são pesados e são completamente ressuspensos em 16 mL de solução salina. Uma emulsão é preparada misturando a KLH/solução salina com um volume igual de solução CFA (por exemplo, 10 mL de KLH/solução salina + 10 mL de solução CFA) usando seringas e um conector de chave de três vias. KLH e CFA são vigorosamente misturados durante vários minutos para formar uma emulsão branca para obter estabilidade máxima. Um teste de gota é realizado para verificar se uma emulsão homogênea foi obtida, a mistura continua até que uma gota intacta permaneça visível na água.
[0229] No dia 0, camundongos fêmeas C57Bl/6J, com aproximada- mente 7 semanas de idade, foram iniciados com antígeno de KLH em CFA por imunização subcutânea (4 locais, 50 μL por local).
[0230] A dexametasona, um corticosteroide, é um anti-inflamatório conhecido que melhora as reações de DTH em camundongos e serve como um controle positivo para suprimir a inflamação neste modelo (Taube e Carlsten, Action of dexamethasone in the suppression of dela- yed-type hypersensitivity in reconstituted SCID mice. Inflamm Res.
2000. 49(10): 548-52). Para o grupo de controle positivo, uma solução estoque de 17 mg/mL de Dexametasona foi preparada diluindo 6,8 mg de Dexametasona em 400 μL de etanol a 96%. Para cada dia de dosa- gem, uma solução de trabalho é preparada diluindo a solução estoque 100x em PBS estéril para obter uma concentração final de 0,17 mg/mL em um frasco de septo para dosagem intraperitoneal. Os camundongos tratados com dexametasona receberam 100 μL de Dexametasona i.p. (5 mL/kg de uma solução de 0,17 mg/mL). Sacarose congelada serviu como o controle negativo (veículo). As cepas A, B e C de Veillonella foram dosadas a 1x10^10 UFC p. o. diariamente. Dexametasona (con- trole positivo), veículo (controle negativo) e Bifidobacterium animalis lac- tis (10 mg em pó) foram dosados diariamente.
[0231] No dia 8, os camundongos foram desafiados intradermica- mente (i.d.) com 10 μg de KLH em solução salina (em um volume de 10 μL) na orelha direita esquerda. A resposta inflamatória foi medida usando métodos conhecidos na técnica. A espessura do pavilhão auri- cular foi medida 24 horas após o desafio com antígeno (Fig. 1). Como determinado pela espessura da orelha, as cepas A, B e C de Veillonella foram eficazes na supressão inflamatória em comparação com camun- dongos que receberam apenas o veículo (comparável ao tratamento com Dexametasona).
[0232] A eficácia das cepas de Veillonella pode ser ainda estudada usando momentos e doses variadas. Por exemplo, o tratamento com uma composição bacteriana de Veillonella pode ser iniciado em algum momento, quer perto do momento da iniciação como no momento do desafio com DTH. Por exemplo, as Veillonella (1x109 UFC por camun- dongo por dia) podem ser administradas ao mesmo tempo que as inje- ções subcutâneas (dia 0) ou podem ser administradas antes, ou medi- ante, injeção intradérmica. As cepas de Veillonella (por exemplo, Cepa A, Cepa B ou Cepa C) podem ser administradas em doses variadas e em intervalos definidos e em várias combinações. Por exemplo, alguns camundongos são injetados por via intravenosa com a Cepa A de Veil- lonella em um intervalo de 1x104 e 5x109 células bacterianas por ca- mundongo. Alguns camundongos recebem uma mistura da cepa A e/ou cepa B e/ou cepa C. Enquanto alguns camundongos recebem uma cepa de Veillonella através da injeção i.v. injeção, outros camundongos po- dem receber uma cepa de Veillonella através de injeção intraperitoneal (i.p.), injeção subcutânea (s.c.), administração por via nasal, gavagem oral, administração tópica, injeção intradérmica (i.d.) ou outros meios de administração. Alguns camundongos podem receber uma cepa de Veil- lonella todos os dia (por exemplo, começando no dia 0), enquanto outros podem receber uma cepa de Veillonella em intervalos alternados (por exemplo, a cada dois dias ou uma vez a cada três dias) As células bac-
terianas podem estar vivas, mortas ou enfraquecidas. As células bacte- rianas podem ser coletadas frescas (ou congeladas) e administradas, ou podem ser irradiadas ou exterminadas por calor antes da administra- ção.
[0233] Por exemplo, os camundongos foram sensibilizados a KLH, como descrito acima, e os grupos receberam Veillonella viva ou irradi- ada (25 kGy). Os camundongos receberam veículo, Dexametasona, Cepa B de Veillonella viável (5,09 x 10^9), Cepa B de Veillonella irradi- ada (5,09 x 10^9, 25 kGy), Cepa C de Veillonella viável (5,38 x 10^9) ou Cepa C de Veillonella irradiada (5,38 x 10^9, 25 kGy). Os camundongos foram dosados nos dias 1-9 e desafiados no dia 8 com medições de orelha realizadas no dia 9 (24 horas) e no dia 10 (48 horas). Tanto a Cepa B de Veillonella viva como irradiada é eficaz na redução do in- chaço da orelha em 24 e 48 horas em comparação com o veículo (con- trole negativo) (Fig. 2 e Fig. 3, respectivamente). A cepa B de Veillonella irradiada foi mais eficaz do que a cepa B não irradiada e a cepa B de Veillonella irradiada foi ainda mais eficaz que a Dexametasona na inibi- ção do inchaço da orelha. Tanto o grupo viável como irradiado da Cepa C de Veillonella demonstraram eficácia nos pontos temporais de 24 e
48. Em contraste à Cepa B, a irradiação da Cepa C de Veillonella não aumentou nem diminuiu a sua eficácia.
[0234] Intervalos de dosagem celular e/ou dosagem de radiação al- ternativos podem ser estudados. Por exemplo, alguns grupos de camun- dongos podem receber entre 1x104 e 5x109 células bacterianas em uma administração. Alternativamente, algumas células bacterianas po- dem ser irradiadas a doses de radiação mais elevada ou mais baixa, por exemplo entre 15 kGy ou 35 kGy. A administração da composição de células bacterianas pode variar com a via de administração, dose e cro- nograma. Isso pode incluir gavagem oral, injeção i.v., injeção i.p., inje- ção i.d., administração tópica ou administração por via nasal.
[0235] Alguns grupos de camundongos podem ser tratados com agente(s) anti-inflamatório(s) (por exemplo, anti-CD154, bloqueio de membros da família TNF ou outro tratamento) e/ou um controle ade- quado (por exemplo, veículo ou anticorpo de controle) em vários pontos temporais e em doses eficazes.
[0236] Além disso, alguns camundongos são tratados com antibió- ticos antes do tratamento. Por exemplo, vancomicina (0,5 g/L), ampici- lina (1,0 g/L), gentamicina (1,0 g/L) e anfotericina B (0,2 g/L) são adici- onadas à água para abeberamento e o tratamento com antibiótico é sus- penso no momento do tratamento ou poucos dias antes do tratamento. Alguns camundongos imunizados são tratados sem receber antibióti- cos.
[0237] Os animais de estudo podem ser sacrificados por exsangui- nação do plexo orbital sob anestesia com CO2/O2, seguida de luxação cervical no dia 10. Para a preparação do soro, é permitido que as amos- tras de sangue coagulem antes da centrifugação. Os soros são transfe- ridos para tubos limpos, cada animal em um tubo separado. Após a ex- sanguinação de todos os animais, ambas as orelhas (cada orelha em um frasco separado), o baço, os linfonodos mesentéricos (MLN), todo o intestino delgado e o cólon são coletados em frascos criogênicos, con- gelados e armazenados a <-70 °C.
[0238] Os tecidos podem ser dissociados usando enzimas de dis- sociação de acordo com as instruções do fabricante. As células são tin- gidas para análise por citometria de fluxo usando métodos conhecidos na técnica. Os anticorpos de tingimento podem incluir anti-CD11c (célu- las dendríticas), anti-CD80, anti-CD86, anti-CD40, anti-MHCII, anti- CD8a, anti-CD4 e anti-CD103. Outros marcadores que podem ser ana- lisados incluem marcador de células imunológicas pan CD45, marcado- res de células T (CD3, CD4, CD8, CD25, Foxp3, T-bet, Gata3, Roryt,
Granzima B, CD69, PD-1, CTLA-4) e marcadores de macrófagos/miel- oides (CD11b, MHCII, CD206, CD40, CSF1R, PD-L1, Gr-1, F4/80). Além da imunofenotipagem, citocinas séricas são analisadas, incluindo, mas não se limitando a, TNFa, IL-17, IL-13, IL-12p70, IL12p40, IL-10, IL-6, IL-5, IL-4, IL-2, IL-1b, IFNy, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, MIG, IP10, MIP1b, RANTES e MCP-1. Análise de citocinas pode ser realizada em células imunológicas obtidas a partir de linfonodos ou outro tecido e/ou em células imunológicas infiltradas CD45+ purificadas obtidas ex vivo. Finalmente, a imuno-histoquímica é realizada em várias seções de te- cido para medir células T, macrófagos, células dendríticas e expressão proteica da molécula de ponto de controle. Exemplo 2: Uma avaliação de artigos de teste na modulação de co- lite induzida por DSS em Camundongos C57BL/6
[0239] Colite induzida por sulfato de dextrano sódico (DSS) é um modelo animal bem estudado de colite, como revisado por Randhawa et al. (A review on chemical-induced inflammmatory bowel disease mo- dels in rodents. Korean J Physiol Pharmacol. 2014. 18(4): 279 a 288; ver também Chassaing et al. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced co- litis in mice. Curr Protoc Immunol. 4 de fevereiro de 2014; 104: Unidade
15.25). Neste modelo, os camundongos são tratados com DSS na água para abeberamento, resultando em diarreia e perda de peso.
[0240] Para examinar a eficácia de Veillonella em colite induzida por DSS, os camundongos são divididos em grupos que recebem a Cepa A de Veillonella, a Cepa B de Veillonella, a Cepa C de Veillonella e/ou outra cepa de Veillonella. Os grupos de camundongos são tratados com DSS para induzir colite como conhecido na técnica (Randhawa et al. 2014; Chassaing et al. 2014; ver também Kim et al. Investigating intes- tinal inflammation in DSS-induced model of IBD. J Vis Exp. 2012. 60:
3.678). Por exemplo, a colite foi induzida em camundongos por exposi- ção a 3% de água para abeberamento tratada com DSS a partir do Dia
0 até ao Dia 5. Um grupo não recebeu DSS e serviu como controle in- gênuo. Os animais foram dosados com veículo de sacarose (controle negativo), cepa bacteriana (1x109 UFC por camundongo por dia) ou controle positivo anti-p40 (administrado por i. p. nos dias 0, 3, 7 e 10). Todos os animais foram pesados diariamente.
[0241] Em outros estudos, o tratamento com uma composição bac- teriana contendo uma cepa bacteriana (por exemplo, uma cepa de bac- térias listada na Tabela 1) pode ser iniciado em algum momento, tanto no dia 1 de administração de DSS como em algum momento posterior. Por exemplo, as Veillonella podem ser administradas ao mesmo tempo que a iniciação de DSS (dia 1) ou podem ser administradas após os primeiros sinais da doença (por exemplo, perda de peso ou diarreia) ou durante os estágios de colite grave. Os camundongos podem ser obser- vados diariamente em relação ao peso, morbidade, sobrevivência, pre- sença de diarreia e/ou sangue nas fezes.
[0242] A cepa bacteriana é administrada a doses variadas, interva- los variados e/ou vias de administração variadas e/ou em combinação com outras cepas de Veillonella ou outras espécies. Por exemplo, al- guns camundongos são injetados por via intravenosa com Veillonella a uma dose entre 1x104 e 5x109 células bacterianas por camundongo. Embora alguns camundongos recebam as bactérias através de injeção i.v., outros camundongos podem receber as bactérias através de inje- ção intraperitoneal (i.p.), injeção subcutânea (s.c.), administração por via nasal, gavagem oral ou outros meios de administração. Alguns ca- mundongos podem receber a cepa bacteriana todos os dia (por exem- plo, começando no dia 1), enquanto outros podem receber a cepa bac- teriana em intervalos alternados (por exemplo, a cada dois dias ou uma vez a cada três dias) Grupos adicionais de camundongos podem rece- ber alguma proporção entre células bacterianas e cepa bacteriana. As células bacterianas podem estar vivas, mortas ou enfraquecidas. As cé- lulas bacterianas podem ser coletadas frescas (ou congeladas) e admi- nistradas, ou podem ser irradiadas ou exterminadas por calor antes da administração.
[0243] As composições bacterianas contendo a cepa bacteriana po- dem ser testadas quanto à sua eficácia em um modelo de camundongo de colite induzida por DSS, quer isoladamente ou em combinação com células bacterianas inteiras, com ou sem a adição de outros agentes anti-inflamatórios.
[0244] Por exemplo, alguns grupos de camundongos podem rece- ber entre 1x104 e 5x109 células bacterianas em uma administração se- parada de, ou misturada com, a administração da cepa bacteriana. Tal como com a cepa bacteriana, a administração de células bacterianas pode variar com a via de administração, dose e cronograma. Isto pode incluir gavagem oral, injeção i.v., injeção i.p. ou administração por via nasal.
[0245] Alguns grupos de camundongos podem ser tratados com agente(s) anti-inflamatório(s) adicional(is) (por exemplo, anti-CD154, bloqueio de membros da família TNF ou outro tratamento) e/ou um con- trole adequado (por exemplo, veículo ou anticorpo de controle) em vá- rios pontos temporais e em doses eficazes.
[0246] Além disso, alguns camundongos são tratados com antibió- ticos antes do tratamento. Por exemplo, vancomicina (0,5 g/L), ampici- lina (1,0 g/L), gentamicina (1,0 g/L) e anfotericina B (0,2 g/L) são adici- onadas à água para abeberamento e o tratamento com antibiótico é sus- penso no momento do tratamento ou poucos dias antes do tratamento. Alguns camundongos recebem DSS sem receber antibióticos previa- mente.
[0247] Em vários pontos temporais, os camundongos são submeti-
dos a endoscopia por vídeo usando um endoscópio para animais pe- quenos (Karl Storz Endoskipe, Alemanha) sob anestesia com isoflurano. Imagens estáticas e vídeo são gravados para avaliar a extensão da co- lite e a resposta ao tratamento. A colite é pontuada usando critérios co- nhecidos na técnica. Material fecal é coletado para estudo.
[0248] O trato gastrointestinal (GI), os linfonodos e/ou outros tecidos podem ser removidos para análise histológica, de citocinas e/ou citomé- trica de fluxo ex vivo, usando métodos conhecidos na técnica. Por exem- plo, os tecidos são coletados e podem ser dissociados usando enzimas de dissociação de acordo com as instruções do fabricante. As células são tingidas para análise por citometria de fluxo usando métodos co- nhecidos na técnica. Os anticorpos de tingimento podem incluir anti- CD11c (células dendríticas), anti-CD80, anti-CD86, anti-CD40, anti- MHCII, anti-CD8a, anti-CD4 e anti-CD103. Outros marcadores que po- dem ser analisados incluem marcador de células imunológicas pan CD45, marcadores de células T (CD3, CD4, CD8, CD25, Foxp3, T-bet, Gata3, Roryt, Granzima B, CD69, PD-1, CTLA-4) e marcadores de ma- crófagos/mieloides (CD11b, MHCII, CD206, CD40, CSF1R, PD-L1, Gr- 1, F4/80). Além da imunofenotipagem, citocinas séricas são analisadas, incluindo, mas não se limitando a, TNFa, IL-17, IL-13, IL-12p70, IL12p40, IL-10, IL-6, IL-5, IL-4, IL-2, IL-1b, IFNy, GM-CSF, G-CSF, M- CSF, MIG, IP10, MIP1b, RANTES e MCP-1. A análise de citocinas pode ser realizada em células imunológicas obtidas a partir de linfonodos ou outro tecido, e/ou em células imunológicas infiltradas no trato GI CD45+ purificadas obtidas ex vivo. Finalmente, a imuno-histoquímica é reali- zada em várias seções de tecido para medir células T, macrófagos, cé- lulas dendríticas e expressão proteica da molécula de ponto de controle.
[0249] A fim de examinar o impacto e a longevidade da proteção contra a doença, em vez de serem sacrificados, alguns camundongos podem ser novamente desafiados com um ativador de doença. Os ca- mundongos são analisados quanto à suscetibilidade à gravidade de co- lite após novo desafio.
[0250] Após o sacrifício, o cólon, o intestino delgado, o baço e os linfonodos mesentéricos podem ser coletados de todos os animais e o sangue coletado para análise. Exemplo 3: Um modelo de camundongo de Encefalomielite Autoi- mune Experimental (EAE)
[0251] A EAE é um modelo de animal com esclerose múltipla bem estudado, como revisado por Constantinescu et al. (Experimental autoi- mmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. outubro de 2011; 164(4): 1079-1106). A mesma pode ser induzida em uma variedade de cepas de camundongo e rato usando diferentes peptídeos associados à mielina, pela transferência adotiva de células T encefalitogênicas ativadas, ou o uso de camundongos trans- gênicos TCR suscetíveis à EAE, como discutido em Mangalam et al. (Two discreet subsets of CD8+ T cells modulate PLP91-110 induced ex- perimental autoimmune encephalomyelitis em HLA-DR3 transgenic mice. J Autoimmun. junho de 2012; 38(4): 344-353).
[0252] As composições bacterianas contendo Veillonella no pre- sente documento descritas são testadas quanto à sua eficácia no mo- delo de roedor com EAE, quer isoladamente ou em combinação com células bacterianas inteiras, com ou sem a adição de outros tratamentos anti-inflamatórios. Por exemplo, camundongos C57Bl/6 fêmeas com 6 a 8 semanas de idade são obtidos da Taconic (Germantown, NY). Grupos de camundongos são administrados com duas injeções subcutâneas (s.c.), em dois sítios nas costas (superior e inferior), de 0,1 mL de glico- proteína de oligodentrócitos de mielina 35-55 (MOG35-55; 100 μg por injeção; 200 μg por camundongo (total 0,2 mL por camundongo)), emul-
sionado em adjuvante completo de Freund (CFA; 2-5 mg de mycobac- terium tuberculosis H37Ra morto/mL de emulsão). Aproximadamente 1 a 2 horas após o ocorrido acima, os camundongos são injetados por via intraperitoneal (i.p.) com 200 ng de toxina Pertussis (PTx) em 0,1 mL de PBS (2 μg/mL). Uma injeção adicional IP de PTx é administrada no dia
2. Alternativamente, uma quantidade adequada de um peptídeo de mi- elina alternativo (por exemplo, proteína proteolípidica (PLP)) é usada para induzir EAE. Alguns animais servem como controles ingênuos. A gravidade de EAE é avaliada, e uma pontuação de incapacidade é atri- buída diariamente começando no dia 4 de acordo com os métodos co- nhecidos na técnica (Mangalam et al. 2012).
[0253] O tratamento com Cepa A de Veillonella, Cepa B de Veillo- nella, cepa C de Veillonella e/ou outra cepa de Veillonella é iniciado em algum momento, quer perto do momento da imunização ou após a imu- nização com EAE. Por exemplo, a composição bacteriana contendo uma cepa bacteriana pode ser administradas ao mesmo tempo que a imunização (dia 1), ou podem ser administradas após os primeiros si- nais de incapacidade (por exemplo, cauda mole), ou durante EAE grave. As composições bacterianas contendo uma cepa bacteriana são admi- nistradas em doses variadas e em intervalos definidos. Por exemplo, alguns camundongos são injetados por via intravenosa com doses efi- cazes da cepa bacteriana. Por exemplo, os camundongos podem rece- ber entre 1x104 e 5x109 células bacterianas por camundongo. Embora alguns camundongos recebam a cepa bacteriana através de injeção i.v., outros camundongos podem receber a cepa bacteriana através de inje- ção intraperitoneal (i.p.), injeção subcutânea (s.c.), administração por via nasal, gavagem oral ou outros meios de administração. Alguns ca- mundongos podem receber a cepa bacteriana todos os dia (por exem- plo, começando no dia 1), enquanto outros podem receber a cepa bac- teriana em intervalos alternados (por exemplo, a cada dois dias ou uma vez a cada três dias) Grupos adicionais de camundongos podem rece- ber alguma razão entre células bacterianas e cepa bacteriana. As célu- las bacterianas podem estar vivas, mortas ou enfraquecidas. As células bacterianas podem ser coletadas frescas (ou congeladas) e administra- das, ou podem ser irradiadas ou exterminadas por calor antes da admi- nistração.
[0254] Por exemplo, alguns grupos de camundongos podem rece- ber entre 1x104 e 5x109 células bacterianas em uma administração se- parada de, ou misturada com, a administração da cepa bacteriana. Tal como com a cepa bacteriana (por exemplo, uma cepa de bactérias lis- tada na Tabela 1), a administração de células bacterianas pode variar com a via de administração, dose e cronograma. Isto pode incluir gava- gem oral, injeção i.v., injeção i.p., injeção subcutânea (s.c.) ou adminis- tração por via nasal.
[0255] Alguns grupos de camundongos podem ser tratados com agente(s) anti-inflamatório(s) adicional(is) ou terapêutico(s) para EAE (por exemplo, anti-CD154, bloqueio de membros da família TNF, vita- mina D ou outro tratamento), e/ou um controle adequado (por exemplo, veículo ou anticorpo de controle) em vários pontos temporais e em do- ses eficazes.
[0256] Além disso, alguns camundongos são tratados com antibió- ticos antes do tratamento. Por exemplo, vancomicina (0,5 g/L), ampici- lina (1,0 g/L), gentamicina (1,0 g/L) e anfotericina B (0,2 g/L) são adici- onadas à água para abeberamento e o tratamento com antibiótico é sus- penso no momento do tratamento ou poucos dias antes do tratamento. Alguns camundongos imunizados são tratados sem receber antibióti- cos.
[0257] Em vários pontos temporais, os camundongos são sacrifica- dos, e os sítios de inflamação (por exemplo, cérebro e medula espinhal),
linfonodos ou outros tecidos podem ser removidos por análise histoló- gica, de citocinas e/ou citométrica de fluxo ex vivo usando métodos co- nhecidos na técnica. Por exemplo, os tecidos são dissociados usando enzimas de dissociação de acordo com as instruções do fabricante. As células são tingidas para análise por citometria de fluxo usando métodos conhecidos na técnica. Os anticorpos de tingimento podem incluir anti- CD11c (células dendríticas), anti-CD80, anti-CD86, anti-CD40, anti- MHCII, anti-CD8a, anti-CD4 e anti-CD103. Outros marcadores que po- dem ser analisados incluem marcador de células imunológicas pan CD45, marcadores de células T (CD3, CD4, CD8, CD25, Foxp3, T-bet, Gata3, Roryt, Granzima B, CD69, PD-1, CTLA-4) e marcadores de ma- crófagos/mieloides (CD11b, MHCII, CD206, CD40, CSF1R, PD-L1, Gr- 1, F4/80). Além da imunofenotipagem, citocinas séricas são analisadas, incluindo, mas não se limitando a, TNFa, IL-17, IL-13, IL-12p70, IL12p40, IL-10, IL-6, IL-5, IL-4, IL-2, IL-1b, IFNy, GM-CSF, G-CSF, M- CSF, MIG, IP10, MIP1b, RANTES e MCP-1. A análise de citocinas pode ser realizada em células imunológicas obtidas a partir de linfonodos ou outro tecido, e/ou em células imunológicas infiltradas no sistema ner- voso central (CNS) CD45+ purificadas obtidas ex vivo. Finalmente, a imuno-histoquímica é realizada em várias seções de tecido para medir células T, macrófagos, células dendríticas e expressão proteica da mo- lécula de ponto de controle.
[0258] A fim de examinar o impacto e a longevidade da proteção contra a doença, em vez de serem sacrificados, alguns camundongos podem ser novamente desafiados com um ativador de doença (por exemplo, células T encefalitogênicas ativadas ou reinjeção de peptídeos indutores de EAE). Os camundongos são analisados quanto à susceti- bilidade à doença e gravidade de EAE após novo desafio. Exemplo 4: Um modelo de camundongo de artrite induzida por co- lágeno (CIA)
[0259] A artrite induzida por colágeno (CIA) é um modelo animal co- mumente usado para estudar artrite reumatoide (RA), como descrito por Caplazi et al. (Mouse models of rheumatoid arthritis. Veterinary Patho- logy. 1 de setembro de 2015. 52(5): 819 a 826) (ver também Brand et al. Collagen-induced arthritis. Nature Protocols. 2.007. 2: 1.269 a 1.275; Pietrosimone et al. Collagen-induced arthritis: a model for murine autoi- mmune arthritis. Bio Protoc. 20 de outubro de 2015; 5(20): e1626).
[0260] Entre outras versões do modelo de roedor com CIA, um mo- delo envolve a imunização de camundongos HLA-DQ8 Tg com colá- geno tipo II de galinha como descrito por Taneja et al. (J. Immunology.
2.007. 56: 69 a 78; ver também Taneja et al. J. Immunology 2008. 181:
2.869 a 2.877; e Taneja et al. Arthritis Rheum., 2007. 56: 69 a 78). A purificação de CII de galinha foi descrita por Taneja et al. (Arthritis Rheum., 2007. 56: 69 a 78). Os camundongos são monitorados para início e progressão da doença CIA após imunização, e a gravidade da doença é avaliada e "classificada" como descrito por Wooley, J. Exp. Med. 1981. 154: 688 a 700.
[0261] Os camundongos são imunizados para indução de CIA e se- parados em vários grupos de tratamento. As composições bacterianas contendo uma cepa bacteriana são testadas quanto à sua eficácia em CIA, quer isoladamente ou em combinação com células bacterianas in- teiras, com ou sem a adição de outros tratamentos anti-inflamatórios.
[0262] O tratamento com a composição bacteriana contendo Veillo- nella é iniciado quer perto do momento da imunização com colágeno ou após a imunização. Por exemplo, em alguns grupos, a cepa bacteriana pode ser administrada ao mesmo tempo que a imunização (dia 1), ou a cepa bacteriana pode ser administrada após os primeiros sinais de do- ença, ou após o início dos sintomas graves. A cepa bacteriana é admi- nistrada em doses variadas e em intervalos definidos.
[0263] Por exemplo, alguns camundongos são injetados por via in- travenosa com Veillonella a uma dose entre 1x104 e 5x109 células bac- terianas por camundongo. Embora alguns camundongos recebam a cepa bacteriana através de injeção i.v., outros camundongos podem re- ceber a cepa bacteriana através de injeção intraperitoneal (i.p.), injeção subcutânea (s.c.), administração por via nasal, gavagem oral ou outros meios de administração. Alguns camundongos podem receber a cepa bacteriana todos os dia (por exemplo, começando no dia 1), enquanto outros podem receber a cepa bacteriana em intervalos alternados (por exemplo, a cada dois dias ou uma vez a cada três dias) Grupos adicio- nais de camundongos podem receber alguma proporção entre células bacterianas e cepa bacteriana. As células bacterianas podem estar vi- vas, mortas ou enfraquecidas. As células bacterianas podem ser cole- tadas frescas (ou congeladas) e administradas, ou podem ser irradiadas ou mortas por calor antes da administração.
[0264] Por exemplo, alguns grupos de camundongos podem rece- ber entre 1x104 e 5x109 células bacterianas em uma administração se- parada de, ou misturada com, a administração da cepa bacteriana. Tal como com a cepa bacteriana, a administração de células bacterianas pode variar com a via de administração, dose e cronograma. Isso pode incluir gavagem oral, injeção i.v., injeção i.p., injeção subcutânea (s.c.), injeção intradérmica (i.d.) ou administração por via nasal.
[0265] Alguns grupos de camundongos podem ser tratados com agente(s) anti-inflamatório(s) adicional(is) ou terapêutico(s) para CIA (por exemplo, anti-CD154, bloqueio de membros da família TNF, vita- mina D ou outro tratamento), e/ou um controle adequado (por exemplo, veículo ou anticorpo de controle) em vários pontos temporais e em do- ses eficazes.
[0266] Além disso, alguns camundongos são tratados com antibió-
ticos antes do tratamento. Por exemplo, vancomicina (0,5 g/L), ampici- lina (1,0 g/L), gentamicina (1,0 g/L) e anfotericina B (0,2 g/L) são adici- onadas à água para abeberamento e o tratamento com antibiótico é sus- penso no momento do tratamento ou poucos dias antes do tratamento. Alguns camundongos imunizados são tratados sem receber antibióti- cos.
[0267] Em vários pontos temporais, amostras séricas são obtidas para avaliar níveis de anticorpo IgG de CII antigalinha e anticamun- dongo usando um ELISA padrão (Batsalova et al. Comparative analysis of collagen type II-specific immune responses during development of collagen-induced arthritis in two B10 mouse strains. Arthritis Res Ther.
2.012. 14(6): R237). Além disso, alguns camundongos são sacrificados e os sítios de inflamação (por exemplo, sinóvia), linfonodos ou outros tecidos podem ser removidos para análise histológica, de citocinas e/ou citométrica de fluxo ex vivo usando os métodos conhecidos na técnica. A sinóvia e o fluido sinovial são analisados quanto à infiltração de célu- las plasmáticas e à presença de anticorpos usando métodos conhecidos na técnica. Além disso, os tecidos são dissociados usando enzimas de dissociação de acordo com as instruções do fabricante para examinar os perfis dos infiltrados celulares. As células são tingidas para análise por citometria de fluxo usando métodos conhecidos na técnica. Os anti- corpos de tingimento podem incluir anti-CD11c (células dendríticas), anti-CD80, anti-CD86, anti-CD40, anti-MHCII, anti-CD8a, anti-CD4 e anti-CD103. Outros marcadores que podem ser analisados incluem marcador de células imunológicas pan CD45, marcadores de células T (CD3, CD4, CD8, CD25, Foxp3, T-bet, Gata3, Roryt, Granzima B, CD69, PD-1, CTLA-4) e marcadores de macrófagos/mieloides (CD11b, MHCII, CD206, CD40, CSF1R, PD-L1, Gr-1, F4/80). Além da imunofenotipa- gem, citocinas séricas são analisadas, incluindo, mas não se limitando a, TNFa, IL-17, IL-13, IL-12p70, IL12p40, IL-10, IL-6, IL-5, IL-4, IL-2, IL-
1b, IFNy, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, MIG, IP10, MIP1b, RANTES e MCP-1. A análise de citocinas pode ser realizada em células imunológi- cas obtidas a partir de linfonodos ou outro tecido e/ou em células imu- nológicas infiltradas na sinóvia CD45+ purificadas obtidas ex vivo. Final- mente, a imuno-histoquímica é realizada em várias seções de tecido para medir células T, macrófagos, células dendríticas e expressão pro- teica da molécula de ponto de controle.
[0268] A fim de examinar o impacto e a longevidade da proteção contra a doença, em vez de serem sacrificados, alguns camundongos podem ser novamente desafiados com um ativador de doença (por exemplo, reinjeção ativada com peptídeos indutores de CIA). Os camun- dongos são analisados quanto à suscetibilidade à doença e gravidade de CIA após novo desafio. Exemplo 5: Um modelo de camundongo de Diabetes Tipo 1 (T1D)
[0269] A diabetes tipo 1 (T1D) é uma doença autoimune na qual o sistema imunológico atinge as ilhotas de Langerhans do pâncreas, des- truindo, dessa maneira, a capacidade do corpo para produzir insulina.
[0270] Existem diversos modelos de modelos animais de T1D, como revisado por Belle et al. (Mouse models for type 1 diabetes. Drug Discov Today Dis Models. 2009; 6(2): 41 a 45; ver também Aileen JF King. The use de modelos de animal in diabetes research. Br J Pharma- col. junho de 2012; 166(3): 877 a 894. Existem modelos para T1D qui- micamente induzido, T1D induzido por patógeno, bem como modelos nos quais os camundongos desenvolvem espontaneamente T1D.
[0271] Uma cepa de Veillonella no presente documento descrita é testada quanto à sua eficácia no modelo de roedor de T1D, quer isola- damente ou em combinação com outras cepas, com ou sem a adição de outros tratamentos anti-inflamatórios.
[0272] Dependendo do método de indução de T1D e/ou se o desen- volvimento de T1D é espontâneo, o tratamento com a cepa bacteriana é iniciado em algum momento, quer perto do momento da indução ou após a indução, ou antes do início (ou mediante o início) de T1D de ocorrência espontânea. A cepa bacteriana é administrada em doses va- riadas e em intervalos definidos. Por exemplo, alguns camundongos são injetados por via intravenosa com Veillonella a uma dose entre 1x104 e 5x109 células bacterianas por camundongo. Outros camundongos po- dem receber 25, 50 ou 100 mg da cepa bacteriana por camundongo. Embora alguns camundongos recebam a cepa bacteriana através de injeção i.v., outros camundongos podem receber a cepa bacteriana atra- vés de injeção intraperitoneal (i.p.), injeção subcutânea (s.c.), adminis- tração por via nasal, gavagem oral ou outros meios de administração. Alguns camundongos podem receber a cepa bacteriana todos os dia, enquanto outros podem receber a cepa bacteriana em intervalos alter- nados (por exemplo, a cada dois dias ou uma vez a cada três dias) Gru- pos adicionais de camundongos podem receber alguma proporção en- tre células bacterianas e cepa bacteriana. As células bacterianas podem estar vivas, mortas ou enfraquecidas. As células bacterianas podem ser coletadas frescas (ou congeladas) e administradas, ou podem ser irra- diadas ou mortas por calor antes da administração.
[0273] Por exemplo, alguns grupos de camundongos podem rece- ber entre 1x104 e 5x109 células bacterianas em uma administração se- parada de, ou misturada com, a administração da cepa bacteriana. Tal como com a cepa bacteriana, a administração de células bacterianas pode variar com a via de administração, dose e cronograma. Isso pode incluir gavagem oral, injeção i.v., injeção i.p. ou administração por via nasal.
[0274] Alguns grupos de camundongos podem ser tratados com tra- tamentos adicionais e/ou um controle apropriado (por exemplo, veículo ou anticorpo de controle) em diversos pontos temporais e em doses efi- cazes.
[0275] Além disso, alguns camundongos são tratados com antibió- ticos antes do tratamento. Por exemplo, vancomicina (0,5 g/L), ampici- lina (1,0 g/L), gentamicina (1,0 g/L) e anfotericina B (0,2 g/L) são adici- onadas à água para abeberamento e o tratamento com antibiótico é sus- penso no momento do tratamento ou poucos dias antes do tratamento. Alguns camundongos imunizados são tratados sem receber antibióti- cos.
[0276] A glicose no sangue é monitorada a cada duas semanas an- tes do começo do experimento. Em diversos pontos temporais, posteri- ormente, é medida a glicose no sangue sem jejum. Em diversos pontos temporais, camundongos são sacrificados e sítio do pâncreas, linfono- dos, ou outros tecidos podem ser removidos para análise histológica, de citocinas e/ou citometria de fluxo ex vivo, usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, os tecidos são dissociados usando enzimas de dissociação de acordo com as instruções do fabricante. As células são tingidas para análise por citometria de fluxo usando métodos co- nhecidos na técnica. Os anticorpos de tingimento podem incluir anti- CD11c (células dendríticas), anti-CD80, anti-CD86, anti-CD40, anti- MHCII, anti-CD8a, anti-CD4 e anti-CD103. Outros marcadores que po- dem ser analisados incluem marcador de células imunológicas pan CD45, marcadores de células T (CD3, CD4, CD8, CD25, Foxp3, T-bet, Gata3, Roryt, Granzima B, CD69, PD-1, CTLA-4) e marcadores de ma- crófagos/mieloides (CD11b, MHCII, CD206, CD40, CSF1R, PD-L1, Gr- 1, F4/80). Além da imunofenotipagem, citocinas séricas são analisadas, incluindo, mas não se limitando a, TNFa, IL-17, IL-13, IL-12p70, IL12p40, IL-10, IL-6, IL-5, IL-4, IL-2, IL-1b, IFNy, GM-CSF, G-CSF, M- CSF, MIG, IP10, MIP1b, RANTES e MCP-1. A análise de citocinas pode ser realizada em células imunológicas obtidas a partir de linfonodos ou outro tecido, e/ou em células imunológicas de filtragem de tecido purifi- cadas obtidas ex vivo. Finalmente, a imuno-histoquímica é realizada em várias seções de tecido para medir células T, macrófagos, células den- dríticas e expressão proteica da molécula de ponto de controle. A pro- dução de anticorpo também pode ser avaliada por ELISA.
[0277] A fim de examinar o impacto e longevidade de proteção con- tra a doença, em vez de serem sacrificados, alguns camundongos po- dem ser novamente desafiados com um desencadeador de doença, ou avaliados para susceptibilidade a relapso. Os camundongos são anali- sados para susceptibilidade a início de diabetes e gravidade após novo desafio (ou relapso de ocorrência espontânea). Exemplo 6: Um modelo de camundongo de Colangite Esclerosante Primária (PSC)
[0278] A Colangite Esclerosante Primária (PSC) é uma doença crô- nica do fígado que danifica lentamente os dutos biliares e leva a cirrose de fase terminal. A mesma é associada a doença inflamatória intestinal (IBD).
[0279] Há diversos modelos de animal para PSC, como revisado por Fickert et al. (Characterization of models of animals for primary scle- rosing cholangitis (PSC). J Hepatol. junho de 2014. 60(6): 1.290 a 1.303; ver também Pollheimer e Fickert. Animal models in primary biliary cir- rhosis e primary sclerosing cholangitis. Clin Rev Allergy Immunol. junho de 2015. 48(2-3): 207-17). A indução de doença em modelos PSC inclui indução química (por exemplo, colangite induzida por 3,5-dietoxicarbo- nil-1,4-di-hidrocolidina (DDC)), induzida por patógeno (por exemplo, Cryptosporidium parvum), obstrução biliar experimental (por exemplo, ligação de duto biliar comum (CBDL)) e modelo transgênico de camun- dongo de lesão biliar ocasionada por antígeno (por exemplo, camun- dongos transgênicos Ova-Bil). Por exemplo, a ligação de duto biliar é realizada como descrito por Georgiev et al. (Characterization of time-
related changes after experimental bile duct ligation. Br J Surg. 2.008. 95(5): 646 a 656), ou a doença é induzida por exposição a DCC, como descrito por Fickert et al. (A new xenobiotic-induced mouse model of sclerosing cholangitis and biliary fibrosis. Am J Path. Volume 171(2): 525 a 536.
[0280] Uma cepa de Veillonella no presente documento descrita é testada quanto à sua eficácia em um modelo de camundongo de TPSC, quer isoladamente ou em combinação com outras cepas, com ou sem a adição de alguns outros agentes terapêuticos.
[0281] Colangite induzida por DCC
[0282] Por exemplo, camundongos C57bl/6 com 6 a 8 semanas são obtidos da Taconic ou outro vendedor. Os camundongos são alimenta- dos com uma dieta suplementada com 0,1% de DCC por diversas dura- ções. Alguns grupos recebem ração suplementada com DCC durante 1 semana, outros durante 4 semanas, outros durante 8 semanas. Alguns grupos de camundongos podem receber uma dieta suplementada com DCC durante um tempo e depois se permitir que recuperem após rece- ber uma dieta normal. Esses camundongos podem ser estudados por sua capacidade de se recuperar de doença e/ou sua susceptibilidade a relapso mediante exposição subsequente a DCC. O tratamento com Cepa A de Veillonella, Cepa B de Veillonella, Cepa C de Veillonella e/ou outra cepa de Veillonella é iniciado em algum momento, quer perto do momento da alimentação com DCC ou posteriormente à exposição ini- cial ao DCC. Por exemplo, a cepa bacteriana pode ser administrados no dia 1, ou pode ser administrada posteriormente em outro momento. A cepa bacteriana é administrada em doses variadas e em intervalos de- finidos. Por exemplo, alguns camundongos são injetados por via intra- venosa com cepas bacterianas a um intervalo entre 1x104 e 5x109 cé- lulas bacterianas por camundongo. Outros camundongos podem rece- ber 25, 50 ou 100 mg da cepa bacteriana por camundongo. Embora alguns camundongos recebam a cepa bacteriana através de injeção i.v., outros camundongos podem receber a cepa bacteriana através de inje- ção i.p.), injeção subcutânea (s.c.), administração por via nasal, gava- gem oral ou outros meios de administração. Alguns camundongos po- dem receber a cepa bacteriana todos os dia (por exemplo, começando no dia 1), enquanto outros podem receber a cepa bacteriana em inter- valos alternados (por exemplo, a cada dois dias ou uma vez a cada três dias) Grupos adicionais de camundongos podem receber alguma pro- porção entre células bacterianas e cepa bacteriana. As células bacteri- anas podem estar vivas, mortas ou enfraquecidas. As células bacteria- nas podem ser coletadas frescas (ou congeladas) e administradas, ou as mesmas podem ser irradiadas ou mortas por calor antes da adminis- tração. Por exemplo, alguns grupos de camundongos podem receber entre 1x104 e 5x109 células bacterianas em uma administração sepa- rada de, ou misturada com, a administração da cepa bacteriana. A ad- ministração de Veillonella pode variar com a via de administração, dose e cronograma. Isso pode incluir gavagem oral, injeção i.v., injeção i.p. ou administração por via nasal. Alguns grupos de camundongos podem ser tratados com agentes adicionais e/ou um controle apropriado (por exemplo, veículo ou anticorpo) em diversos pontos temporais e em do- ses eficazes.
[0283] Além disso, alguns camundongos são tratados com antibió- ticos antes do tratamento. Por exemplo, vancomicina (0,5 g/L), ampici- lina (1,0 g/L), gentamicina (1,0 g/L) e anfotericina B (0,2 g/L) são adici- onadas à água para abeberamento e o tratamento com antibiótico é sus- penso no momento do tratamento ou poucos dias antes do tratamento. Alguns camundongos imunizados são tratados sem receber antibióti- cos. Em diversos pontos temporais, amostras de soro são analisadas para ALT, AP, bilirrubina e níveis de ácido de bile no soro (BA).
[0284] Em diversos pontos temporais os camundongos são sacrifi- cados, o peso corporal e do fígado são registrados e sítios de inflama- ção (por exemplo, fígado, intestino grosso e delgado, baço), linfonodos, ou outros tecidos, podem ser removidos para caracterização histomor- fológica, de citocinas e/ou análise de citometria de fluxo ex vivo usando métodos conhecidos na técnica (ver Fickert et al. Characterization of models of animal for primary sclerosing cholangitis (PSC)). J Hepatol.
2.014. 60(6): 1.290-1.303). Por exemplo, dutos biliares são tingidos para expressão de ICAM-1, VCAM-1, MadCAM-1. Alguns tecidos são tingi- dos para examinação histológica, enquanto outros são dissociados usando enzimas de dissociação de acordo com as instruções do fabri- cante. As células são tingidas para análise por citometria de fluxo usando métodos conhecidos na técnica. Os anticorpos de tingimento podem incluir anti-CD11c (células dendríticas), anti-CD80, anti-CD86, anti-CD40, anti-MHCII, anti-CD8a, anti-CD4 e anti-CD103. Outros mar- cadores que podem ser analisados incluem marcador de células imuno- lógicas pan CD45, marcadores de célula T (CD3, CD4, CD8, CD25, Foxp3, T-bet, Gata3, Roryt, Granzima B, CD69, PD-1, CTLA-4), e mar- cadores de macrófago/mieloide (CD11b, MHCII, CD206, CD40, CSF1R, PD-L1, Gr-1, F4/80), bem como expressão de molécula de adesão (ICAM-1, VCAM-1, MadCAM-1). Além da imunofenotipagem, citocinas séricas são analisadas, incluindo, mas não se limitando a, TNFa, IL-17, IL-13, IL-12p70, IL12p40, IL-10, IL-6, IL-5, IL-4, IL-2, IL-1b, IFNy, GM- CSF, G-CSF, M-CSF, MIG, IP10, MIP1b, RANTES e MCP-1. A análise de citocinas pode ser realizada em células imunológicas obtidas a partir de linfonodos ou outro tecido, e/ou em células imunológicas filtradas por duto biliar CD45+ purificadas obtidas ex vivo.
[0285] O tecido de fígado é preparado para análise histológica, por exemplo, usando tingimento com vermelho Sirius seguido por quantifi- cação da área fibrótica. No final do tratamento, o sangue é coletado para análise plasmática de enzimas do fígado, por exemplo, AST ou ALT, e para determinar níveis de Bilirrubina. O teor hepático de Hidroxiprolina pode ser medido usando protocolos estabelecidos. A análise de expres- são gênica hepática de inflamação e marcadores de fibrose pode ser realizado por qRT-PCR usando iniciadores validados. Estes marcado- res podem incluir, mas não se limitam a, MCP-1, alfa-SMA, Coll1a1, e TIMP-. Medições de metabólito podem ser realizadas em plasma, tecido e amostras fecais usando métodos metabolômicos estabelecidos. Final- mente, imuno-histoquímica é realizada em seções de fígado para medir neutrófilos, células T, macrófagos, células dendríticas ou outros infiltra- dos de célula imune.
[0286] A fim de examinar o impacto e longevidade de proteção con- tra doença, em vez de serem sacrificados, alguns camundongos podem ser novamente desafiados com DCC em um momento posterior. Os ca- mundongos são analisados para susceptibilidade a colangite e gravi- dade de colangite após novo desafio.
[0287] Colangite induzida por BDL
[0288] Alternativamente, as composições bacterianas contendo Veillonella são testadas quanto à sua eficácia em colangite induzida por BDL. Por exemplo, camundongos C57Bl/6J com 6 a 8 semanas são ob- tidos a partir da Taconic ou outro vendedor. Após um período de acli- mação, os camundongos são submetidos a um procedimento cirúrgico para realizar uma ligação de duto biliar (BDL). Alguns animais de con- trole recebem uma cirurgia simulada. O procedimento de BDL leva a lesão no fígado, inflamação e fibrose dentro de 7-21 dias.
[0289] O tratamento com Veillonella é iniciado em algum momento, quer perto do momento da cirurgia ou algum momento após a cirurgia. As Veillonella são administradas em doses variadas e em intervalos de- finidos. Por exemplo, alguns camundongos são injetados por via intra- venosa com cepas bacterianas a um intervalo entre 1x104 e 5x109 de células bacterianas por camundongo. Outros camundongos podem re- ceber 25, 50 ou 100 mg da cepa bacteriana por camundongo. Embora alguns camundongos recebam as Veillonella através de injeção i.v., ou- tros camundongos podem receber a cepa bacteriana através de injeção i.p.), injeção subcutânea (s.c.), administração por via nasal, gavagem oral ou outros meios de administração. Alguns camundongos recebem a cepa bacteriana todos os dia (por exemplo, começando no dia 1), en- quanto outros podem receber a cepa bacteriana em intervalos alterna- dos (por exemplo, a cada dois dias ou uma vez a cada três dias) Grupos adicionais de camundongos podem receber alguma razão entre células bacterianas e cepa bacteriana. As células bacterianas podem estar vi- vas, mortas ou enfraquecidas. As mesmas células bacterianas podem ser coletadas frescas (ou congeladas) e administradas, ou as mesmas podem ser irradiadas ou mortas por calor antes da administração. Por exemplo, alguns grupos de camundongos podem receber entre 1x104 e 5x109 células bacterianas em uma administração separada de, ou misturada com, a administração da cepa bacteriana. Tal como com a cepa bacteriana, a administração de células bacterianas pode variar com a via de administração, dose e cronograma. Isso pode incluir gava- gem oral, injeção i.v., injeção i.p. ou administração por via nasal. Alguns grupos de camundongos podem ser tratados com agentes adicionais e/ou um controle apropriado (por exemplo, veículo ou anticorpo) em di- versos pontos temporais e em doses eficazes.
[0290] Além disso, alguns camundongos são tratados com antibió- ticos antes do tratamento. Por exemplo, vancomicina (0,5 g/L), ampici- lina (1,0 g/L), gentamicina (1,0 g/L) e anfotericina B (0,2 g/L) são adici- onadas à água para abeberamento e o tratamento com antibiótico é sus- penso no momento do tratamento ou poucos dias antes do tratamento. Alguns camundongos imunizados são tratados sem receber antibióti- cos. Em diversos pontos temporais, amostras de soro são analisadas para ALT, AP, bilirubina e níveis de ácido de bile de soro (BA).
[0291] Em diversos pontos temporais os camundongos são sacrifi- cados, o peso corporal e do fígado são registrados e sítios de inflama- ção (por exemplo, fígado, intestino grosso e delgado, baço), linfonodos, ou outros tecidos, podem ser removidos para caracterização histomor- fológica, de citocinas e/ou análise de citometria de fluxo ex vivo usando métodos conhecidos na técnica (consulte Fickert et al. Characterization of models of animal for primary sclerosing cholangitis (PSC)). J Hepatol.
2.014. 60(6): 1.290-1.303). Por exemplo, dutos biliares são tingidos para expressão de ICAM-1, VCAM-1, MadCAM-1. Alguns tecidos são tingi- dos para examinação histológica, enquanto outros são dissociados usando enzimas de dissociação de acordo com as instruções do fabri- cante. As células são tingidas para análise por citometria de fluxo usando métodos conhecidos na técnica. Os anticorpos de tingimento podem incluir anti-CD11c (células dendríticas), anti-CD80, anti-CD86, anti-CD40, anti-MHCII, anti-CD8a, anti-CD4 e anti-CD103. Outros mar- cadores que podem ser analisados incluem marcador de células imuno- lógicas pan CD45, marcadores de célula T (CD3, CD4, CD8, CD25, Foxp3, T-bet, Gata3, Roryt, Granzima B, CD69, PD-1, CTLA-4), e mar- cadores de macrófago/mieloide (CD11b, MHCII, CD206, CD40, CSF1R, PD-L1, Gr-1, F4/80), bem como expressão de molécula de adesão (ICAM-1, VCAM-1, MadCAM-1). Além da imunofenotipagem, citocinas séricas são analisadas, incluindo, mas não se limitando a, TNFa, IL-17, IL-13, IL-12p70, IL12p40, IL-10, IL-6, IL-5, IL-4, IL-2, IL-1b, IFNy, GM- CSF, G-CSF, M-CSF, MIG, IP10, MIP1b, RANTES e MCP-1. A análise de citocinas pode ser realizada em células imunológicas obtidas a partir de linfonodos ou outro tecido, e/ou em células imunológicas filtradas por duto biliar CD45+ purificadas obtidas ex vivo.
[0292] O tecido de fígado é preparado para análise histológica, por exemplo, usando tingimento com vermelho Sirius seguido por quantifi- cação da área fibrótica. No final do tratamento, o sangue é coletado para análise plasmática de enzimas do fígado, por exemplo, AST ou ALT, e para determinar níveis de Bilirrubina. O teor hepático de Hidroxiprolina pode ser medido usando protocolos estabelecidos. A análise de expres- são gênica hepática de inflamação e marcadores de fibrose pode ser realizada por qRT-PCR usando iniciadores validados. Esses marcado- res podem incluir, mas não se limitam a, MCP-1, alfa-SMA, Coll1a1, e TIMP-. Medições de metabólito podem ser realizadas em plasma, tecido e amostras fecais usando métodos metabolômicos estabelecidos. Final- mente, imuno-histoquímica é realizada em seções de fígado para medir neutrófilos, células T, macrófagos, células dendríticas, ou outros infiltra- dos de célula imune.
[0293] A fim de examinar o impacto e longevidade de proteção con- tra doença, em vez de serem sacrificados, alguns camundongos podem ser analisados para recuperação. Exemplo 7: Um modelo de camundongo de Esteato-Hepatite Não Alcoólica (NASH)
[0294] A Esteato-Hepatite Não Alcoólica (NASH) é uma forma grave de Doença Gordurosa Não Alcoólica do Fígado (NAFLD), em que acú- mulo de gordura hepática (esteatose) e inflamação levam a lesão do fígado e morte de células de hepatócito (balonamento).
[0295] Há vários modelos animais de NASH, como revisado por Ibrahim et al. (Animal models of nonalcoholic steatohepatitis: Eat, De- lete, and Inflame. Dig Dis Sci. Maio de 2016. 61(5): 1.325 a 1.336; ver também Lau et al. Animal models of non-alcoholic fatty liver disease: current perspectives and recent advances, janeiro de 2017. 241(1): 36- 44).
[0296] As Veillonella são testadas quanto à sua eficácia em um mo- delo de camundongo de NASH, quer isoladamente ou em combinação com as células bacterianas inteiras, com ou sem a adição de algum ou- tro agente terapêutico. Por exemplo, camundongos C57Bl/6J com 8 a 10 semanas de idade, obtidos da Taconic (Germantown, NY) ou outro fornecedor, são colocados em uma dieta com deficiência de metionina colina (MCD) durante um período de 4 a 8 semanas, durante o qual as características de NASH serão desenvolvidas, incluindo esteatose, in- flamação, balonização e fibrose.
[0297] O tratamento com Cepa A de Veillonella, Cepa B de Veillo- nella, Cepa C de Veillonella e/ou outra cepa de Veillonella é iniciado em algum momento, quer no início da dieta ou em algum momento após a iniciação da dieta (por exemplo, uma semana depois). Por exemplo, a cepa bacteriana pode ser administradas começando no mesmo dia que a iniciação da dieta MCD. A cepa bacteriana é administrada em doses variadas e em intervalos definidos. Por exemplo, alguns camundongos são injetados por via intravenosa com cepas bacterianas em doses en- tre 1x104 e 5x109 células bacterianas por camundongo. Outros camun- dongos podem receber 25, 50 ou 100 mg da cepa bacteriana por ca- mundongo. Embora alguns camundongos recebam a cepa bacteriana através de injeção i.v., outros camundongos podem receber a cepa bac- teriana através de injeção (i.p.), injeção subcutânea (s.c.), administra- ção por via nasal, gavagem oral ou outros meios de administração. Al- guns camundongos podem receber a cepa bacteriana todos os dia (por exemplo, começando no dia 1), enquanto outros podem receber a cepa bacteriana em intervalos alternados (por exemplo, a cada dois dias ou uma vez a cada três dias) Grupos adicionais de camundongos podem receber alguma razão entre células bacterianas e cepa bacteriana. As células bacterianas podem estar vivas, mortas ou enfraquecidas. As cé- lulas bacterianas podem ser coletadas frescas (ou congeladas) e admi- nistradas, ou podem ser irradiadas ou mortas por calor antes da admi- nistração.
[0298] Por exemplo, alguns grupos de camundongos podem rece- ber entre 1x104 e 5x109 células bacterianas em uma administração se- parada de, ou misturada com, a administração da cepa bacteriana. Tal como com a cepa bacteriana, a administração de células bacterianas pode variar com a via de administração, dose e cronograma. Isso pode incluir gavagem oral, injeção i.v., injeção i.p. ou administração por via nasal. Alguns grupos de camundongos podem ser tratados com tera- pêutico(s) NASH adicional(is) (por exemplo, agonistas de FXR, agonis- tas de PPAR, antagonistas de CCR2/5 ou outro tratamento) e/ou con- trole apropriado em diversos pontos temporais e doses eficazes.
[0299] Em diversos pontos temporais e/ou no final do tratamento, os camundongos são sacrificados e o fígado, intestino, sangue, fezes ou outros tecidos podem ser removidos para análise histológica, bioquí- mica, molecular ou de citocinas e/ou citometria de fluxo ex vivo usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, tecidos de fígado são pe- sados e preparados para análise histológica, que pode compreender tin- gimento com H&E, Vermelho Sirius e determinação de pontuação de atividade NASH (NAS). Em diversos pontos temporais, o sangue é co- letado para análise plasmática de enzimas do fígado, por exemplo, AST ou ALT, usando ensaios padrão. Além disso, o teor hepático de coles- terol, triglicerídeos, ou ácidos de ácido graxo podem ser medidos usando protocolos estabelecidos. A análise de expressão gênica hepá- tica de inflamação, fibrose, esteatose, estresse por ER, ou marcadores de estresse oxidativos pode ser realizada por qRT-PCR usando inicia- dores validados. Os marcadores podem incluir, mas não se limitam a, IL-6, MCP-1, alfa-SMA, Coll1a1, CHOP, e NRF2. Medições de metabó- lito podem ser realizadas em plasma, tecido e amostras fecais usando métodos metabolômicos à base de espectrometria de massa e bioquí- mica estabelecidos. As citocinas de soro são analisadas, incluindo, mas não se limitando a, TNFa, IL-17, IL-13, IL-12p70, IL12p40, IL-10, IL-6,
IL-5, IL-4, IL-2, IL-1b, IFNy, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, MIG, IP10, MIP1b, RANTES, e MCP-1. A análise de citocinas pode ser realizada em células imunológicas obtidas a partir de linfonodos ou outro tecido, e/ou em células imunológicas filtradas por duto biliar CD45+ purificadas obtidas ex vivo. Finalmente, imuno-histoquímica é realizada em seções de fígado ou intestino para medir neutrófilos, células T, macrófagos, cé- lulas dendríticas, ou outros infiltrados de célula imune.
[0300] A fim de examinar o impacto e longevidade de proteção con- tra doença, em vez de serem sacrificados, alguns camundongos podem ser analisados para recuperação. Exemplo 8: Um modelo de camundongo de psoríase
[0301] Psoríase é uma doença de pele inflamatória crônica mediada por célula T. A chamada psoríase do “tipo placa” é a forma mais comum de psoríase e é tipificada por escamas secas, placas vermelhas e es- pessamento da pele devido à infiltração de células imunológicas na derme e epiderme. Diversos modelos de animal contribuíram para o en- tendimento desta doença, como revisado por Gudjonsson et al. (Mouse models of psoriasis. J Invest Derm. 2.007. 127: 1.292 a 1.308; ver tam- bém van der Fits et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflamma- tion in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J. Immunol. 1 de maio de 2009. 182(9): 5.836-45).
[0302] A psoríase pode ser induzida em uma variedade de modelos de camundongo, incluindo aqueles que usam modelos transgênicos, knockout, ou xenoenxerto, bem como aplicação tópica de imiquimod (IMQ), um ligante TLR7/8.
[0303] As Veillonella são testadas quanto à sua eficácia no modelo de camundongo de psoríase, quer isoladamente ou em combinação com células bacterianas inteiras, com ou sem a adição de outros trata- mentos anti-inflamatórios. Por exemplo, camundongos C57Bl/6 ou Balb/c com 6 a 8 semanas são obtidos da Taconic (Germantown, NY),
ou outro vendedor. Os camundongos são raspados nas costas e na ore- lha direita. Grupos de camundongos recebem uma dose tópica diária de 62,5 mg de creme IMQ comercialmente disponível (5%) (Aldara; 3M Pharmaceuticals). A dose é aplicada às áreas raspadas durante 5 ou 6 dias consecutivos. Em intervalos regulares, camundongos são pontua- dos para eritema, escamamento e espessamento em uma escala de 0 a 4, como descrito por van der Fits et al. (2009). Os camundongos são monitorados para espessura da orelha usando um micrômetro Mitutoyo.
[0304] O tratamento com a cepa bacteriana é iniciado em algum momento, quer perto do momento da primeira aplicação de IMQ ou al- gum momento depois. Por exemplo, as Veillonella podem ser adminis- tradas ao mesmo tempo que as injeções subcutâneas (dia 0), ou as mesmas podem ser administradas antes de, ou mediante, a aplicação. A cepa bacteriana é administrada em doses variadas e em intervalos definidos. Por exemplo, alguns camundongos são injetados por via in- travenosa com a cepa bacteriana em doses entre 1x104 e 5x109 células bacterianas por camundongo. Outros camundongos podem receber 25, 50 ou 100 mg da cepa bacteriana por camundongo. Enquanto alguns camundongos recebem a cepa através de injeção i.v., outros camun- dongos podem receber a cepa bacteriana através de injeção intraperi- toneal (i.p.), administração por via nasal, gavagem oral, administração tópica, injeção intradérmica (i.d.), injeção subcutânea (s.c.) ou outros meios de administração. Alguns camundongos podem receber a cepa bacteriana todos os dia (por exemplo, começando no dia 0), enquanto outros podem receber a cepa bacteriana em intervalos alternados (por exemplo, a cada dois dias ou uma vez a cada três dias) Grupos adicio- nais de camundongos podem receber alguma proporção entre células bacterianas e cepa bacteriana. As células bacterianas podem estar vi- vas, mortas ou enfraquecidas. As células bacterianas podem ser cole- tadas frescas (ou congeladas) e administradas, ou podem ser irradiadas ou mortas por calor antes da administração.
[0305] Por exemplo, alguns grupos de camundongos podem rece- ber entre 1x104 e 5x109 células bacterianas em uma administração se- parada de, ou misturada com, a administração da cepa bacteriana. Tal como com a cepa bacteriana, a administração de células bacterianas pode variar com a via de administração, dose e cronograma. Isso pode incluir gavagem oral, injeção i.v., injeção i.p., injeção i.d., injeção s.c., administração tópica, ou administração por via nasal.
[0306] Alguns grupos de camundongos podem ser tratados com agente(s) anti-inflamatório(s) adicional(is) (por exemplo, anti-CD154, bloqueio de membros da família TNF ou outro tratamento) e/ou um con- trole adequado (por exemplo, veículo ou anticorpo de controle) em vá- rios pontos temporais e em doses eficazes.
[0307] Além disso, alguns camundongos são tratados com antibió- ticos antes do tratamento. Por exemplo, vancomicina (0,5 g/L), ampici- lina (1,0 g/L), gentamicina (1,0 g/L) e anfotericina B (0,2 g/L) são adici- onadas à água para abeberamento e o tratamento com antibiótico é sus- penso no momento do tratamento ou poucos dias antes do tratamento. Alguns camundongos imunizados são tratados sem receber antibióti- cos.
[0308] Em diversos pontos temporais, amostras da pele das costas e orelha são tomadas para análise de tingimento de criosecção usando métodos conhecidos na técnica. Outros grupos de camundongos são sacrificados e linfonodos, baço, linfonodos mesentéricos (MLN), o intes- tino delgado, cólon e outros tecidos podem ser removidos para estudos histológicos, análise histológica, de citocinas e/ou citométrica de fluxo ex vivo usando métodos conhecidos na técnica. Alguns tecidos podem ser dissociados usando enzimas de dissociação de acordo com as ins- truções do fabricante. As amostras de criosecção, amostras de tecido ou células obtidas ex vivo, são tingidas para análise por citometria de fluxo usando métodos conhecidas na técnica. Os anticorpos de tingi- mento podem incluir anti-CD11c (células dendríticas), anti-CD80, anti- CD86, anti-CD40, anti-MHCII, anti-CD8a, anti-CD4 e anti-CD103. Ou- tros marcadores que podem ser analisados incluem marcador de célu- las imunológicas pan CD45, marcadores de células T (CD3, CD4, CD8, CD25, Foxp3, T-bet, Gata3, Roryt, Granzima B, CD69, PD-1, CTLA-4) e marcadores de macrófagos/mieloides (CD11b, MHCII, CD206, CD40, CSF1R, PD-L1, Gr-1, F4/80). Além da imunofenotipagem, citocinas sé- ricas são analisadas, incluindo, mas não se limitando a, TNFa, IL-17, IL- 13, IL-12p70, IL12p40, IL-10, IL-6, IL-5, IL-4, IL-2, IL-1b, IFNy, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, MIG, IP10, MIP1b, RANTES e MCP-1. A análise de ci- tocinas pode ser realizada em células imunológicas obtidas a partir de linfonodos ou outro tecido, e/ou em células imunológicas filtradas na pele CD45+ purificadas obtidas ex vivo. Finalmente, a imuno-histoquí- mica é realizada em várias seções de tecido para medir células T, ma- crófagos, células dendríticas e expressão proteica da molécula de ponto de controle.
[0309] A fim de examinar o impacto e longevidade da proteção con- tra psoríase, em vez de serem sacrificados, alguns camundongos po- dem ser estudados para avaliar a recuperação, ou os mesmos podem ser novamente desafiados com IMQ. Os grupos de camundongos nova- mente desafiados são analisados quanto à suscetibilidade à psoríase e gravidade da resposta. Exemplo 9: Um modelo de camundongo de melanoma
[0310] Camundongos C57Bl/6 fêmeas com 6 a 8 semanas de idade são obtidas da Taconic (Germantown, NY). 100.000 células tumorais B16-F10 (ATCC CRL-6475) são ressuspensas em PBS estéril contendo 50% de Matrigel e inoculadas em um volume final de 100 μL em um flanco traseiro (o primeiro flanco) de cada camundongo. Tratamento com Cepa A de Veillonella, Cepa B de Veillonella, Cepa C de Veillonella e/ou outra cepa de Veillonella é iniciado em algum momento após a ino- culação de células tumorais em doses variadas e intervalos definidos. Por exemplo, alguns camundongos recebem entre 1 - 5x109 UFC (vo- lume final de 100 μL) por dose. As vias possíveis de administração in- cluem gavagem oral (p.o.), injeção intravenosa, injeção intratumoral (IT) ou injeção peritumoral, ou subtumoral ou subcutânea. Para avaliar os efeitos antitumorais sistêmicos do tratamento com Veillonella, camun- dongos adicionais podem ser inoculados com células tumorais no flanco contralateral (não tratado, segundo) antes do tratamento IT, peritumoral ou subtumoral com Veillonella no primeiro flanco.
[0311] Alguns camundongos podem receber Veillonella (p.o.) no dia 1 (o dia seguinte à injeção de célula tumorais). Outros camundongos podem receber sete (7) doses consecutivas de uma cepa bacteriana (uma dose por dia nos dias 14-21). Outros camundongos recebem do- sagem diária ou, alternativamente, alguns camundongos recebem do- sagem em dias intercalados. Alternativamente, os camundongos são randomizados em vários grupos de tratamento em um ponto temporal definido (por exemplo, no dia 13) ou quando os tumores alcançam um certo tamanho (por exemplo, 100 mm3) e o tratamento é, então, iniciado em conformidade. Por exemplo, quando os volumes de tumor alcançam uma média de 100 mm3 (aproximadamente 10-12 dias após a inocula- ção de célula tumorais), os animais são distribuídos em grupos e trata- dos quer com veículo ou uma cepa bacteriana (p.o. ou IT). Alguns gru- pos adicionais de camundongos podem ser tratados com um terapêu- tico de câncer adicional ou anticorpo de controle adequado. Um exem- plo de um terapêutico de câncer que pode ser administrado é um inibidor de um ponto de controle imunológico, por exemplo, anti-PD-1, anti-PD- L1 ou outro tratamento que bloqueie a ligação de um ponto de controle imunológico ao seu ligante (ou ligantes). Os inibidores de ponto de con-
trole anti-PD-1 e anti-PD-L1 podem ser formulados em PBS e adminis- trados de modo intraperitoneal (i.p.) em doses eficazes. Por exemplo, os camundongos recebem 100 μg de anti-PD-1 (i.p.) a cada quatro dias, começando no dia 1, e continuando pela duração do estudo.
[0312] Além disso, alguns camundongos são tratados com antibió- ticos antes do tratamento. Por exemplo, vancomicina (0,5 g/L), ampici- lina (1,0 g/L), gentamicina (1,0 g/L) e anfotericina B (0,2 g/L) são adici- onadas à água para abeberamento e o tratamento com antibiótico é sus- penso no momento do tratamento ou poucos dias antes do tratamento. Alguns camundongos são inoculados com células tumorais sem receber tratamento precedente com antibióticos.
[0313] Em vários pontos temporais, os camundongos são sacrifica- dos e os tumores, linfonodos ou outros tecidos podem ser removidos para análise citométrica de fluxo ex vivo usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, os tumores são dissociados usando um co- quetel de enzima de dissociação de tumor da Miltenyi de acordo com as instruções do fabricante. Os pesos dos tumores são registrados e os tumores são cortados e depois colocados em tubos de 15 mL contendo o coquetel de enzima e colocados em gelo. As amostras são, então, colocadas em um agitador suave a 37°C durante 45 minutos e extingui- das com até 15 mL de RPMI completo. Cada suspensão celular é pas- sada através de um filtro de 70 μm para um tubo Falcon de 50 mL e centrifugada a 1.000 rpm durante 10 minutos. As células são ressus- pensas em tampão FACS e lavadas para remover detritos restantes. Se for necessário, as amostras são passadas novamente através de um segundo filtro de 70 μm para um novo tubo. As células são tingidas para análise por citometria de fluxo usando métodos conhecidos na técnica. Os anticorpos de tingimento podem incluir anti-CD11c (células dendríti- cas), anti-CD80, anti-CD86, anti-CD40, anti-MHCII, anti-CD8a, anti-CD4 e anti-CD103. Outros marcadores que podem ser analisados incluem marcador de células imunológicas pan CD45, marcadores de célula T (CD3, CD4, CD8, CD25, Foxp3, T-bet, Gata3, Rorγt, Granzima B, CD69, PD-1, CTLA-4) e marcadores de macrófago/mieloide (CD11b, MHCII, CD206, CD40, CSF1R, PD-L1, Gr-1). Além da imunofenotipagem, cito- cinas séricas são analisadas, incluindo, mas não se limitando a, TNFa, IL-17, IL-13, IL-12p70, IL12p40, IL-10, IL-6, IL-5, IL-4, IL-2, IL-1b, IFNy, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, MIG, IP10, MIP1b, RANTES e MCP-1. A aná- lise de citocinas pode ser realizada em células imunológicas obtidas a partir de linfonodos ou outro tecido e/ou em células imunológicas infil- tradas na tumor CD45+ purificadas obtidas ex vivo. Finalmente, a imuno-histoquímica é realizada em várias seções de tecido para medir células T, macrófagos, células dendríticas e expressão proteica da mo- lécula de ponto de controle.
[0314] Em vez de serem sacrificados, alguns camundongos podem ser novamente desafiados com injeção de célula tumorais no flanco con- tralateral (ou outra área) para determinar o impacto da resposta de me- mória do sistema imunológico sobre o crescimento tumoral.
[0315] Em camundongos que receberam a dieta MCD (que induz NASH), a Cepa C de Veillonella administrada por via oral foi eficaz na redução da pontuação NAS em comparação com os grupos de veículo e sem tratamento (controles negativos) (Fig. 10). A Cepa C de Veillo- nella reduziu a pontuação de fibrose em camundongos tratados (Fig. 11). A Cepa C de Veillonella reduziu o colesterol total hepático (Fig. 12) e Triglicerídeos hepáticos (Fig. 13). Exemplo 10: Um modelo de camundongo de câncer do pulmão
[0316] As Veillonella são testadas quanto à sua eficácia no modelo de camundongo de câncer do pulmão, quer isoladamente como em combinação com outras terapias contra câncer, incluindo inibidor(es) de ponto de controle. Os camundongos são divididos em grupos que rece-
bem a Cepa A de Veillonella, Cepa B de Veillonella, Cepa C de Veillo- nella e/ou outra cepa de Veillonella, com ou sem tratamento inibidor de ponto de controle. Como descrito no Exemplo 9, as Veillonellas são ad- ministradas em doses variadas em intervalos definidos. Por exemplo, alguns camundongos recebem a cepa bacteriana (p.o.) no dia seguinte à injeção de célula tumorais (dia 1). Outros camundongos recebem sete (7) doses consecutivas de uma cepa bacteriana (uma dose por dia nos dias 14-21). Outros camundongos recebem dosagem diária ou, alterna- tivamente, alguns camundongos recebem dosagem em dias intercala- dos. Alternativamente, os camundongos são randomizados em vários grupos de tratamento em um ponto temporal definido (por exemplo, no dia 13) ou quando os tumores alcançam um certo tamanho (por exem- plo, 100 mm3) e o tratamento é, depois, iniciado em conformidade.
[0317] 1x106 células de LLC1, ou um número adequado de células de câncer do pulmão a partir de outra linhagem celular de câncer do pulmão, são injetadas no flanco traseiro de camundongos singênicos. Os tumores dos vários grupos de tratamento são medidos com paquí- metros em intervalos regulares. Como descrito no Exemplo 9, alguns camundongos são sacrificados para análise tumoral ex vivo usando ci- tometria de fluxo. Outros camundongos podem ser novamente desafia- dos com injeção de células tumorais no flanco contralateral para deter- minar o impacto da resposta de memória do sistema imunológico sobre o crescimento tumoral. Exemplo 11: Um modelo de camundongo de câncer da mama
[0318] Uma cepa de Veillonella é testada quanto à sua eficácia no modelo de camundongo de câncer da mama, quer isoladamente ou em combinação com outras terapias de câncer, incluindo inibidor(es) de ponto de controle. Os camundongos são divididos em grupos que rece- bem a Cepa A de Veillonella, Cepa B de Veillonella, Cepa C de Veillo- nella e/ou outra cepa de Veillonella, com ou sem tratamento inibidor de ponto de controle. Como descrito no Exemplo 9, uma cepa bacteriana é administrada em doses variadas em intervalos definidos. Por exemplo, alguns camundongos recebem a cepa bacteriana (p.o.) no dia seguinte à injeção de célula tumorais (dia 1). Outros camundongos recebem sete (7) doses consecutivas de uma cepa bacteriana (uma dose por dia nos dias 14-21). Outros camundongos recebem dosagem diária ou, alterna- tivamente, alguns camundongos recebem dosagem em dias intercala- dos. Alternativamente, os camundongos são randomizados em vários grupos de tratamento em um ponto temporal definido (por exemplo, no dia 13) ou quando os tumores alcançam um certo tamanho (por exem- plo, 100 mm3) e o tratamento é, depois, iniciado em conformidade.
[0319] As células de carcinoma da mama de camundongo 4T1 são obtidas da ATCC e 1x106 células em 50 μL de PBS são injetadas por via subcutânea em um ou ambos os membros traseiros de camundon- gos fêmeas tipo Balb/c (como descrito por Wang et al. 2003, Systemic dissemination of viral vectors during intratumoral injection. Molecular Cancer Therapeutics; 2(11)). Alternativamente, as células de carcinoma da mama de camundongo EMT6 são obtidas da ATCC e 1x106 células em 50 μL de PBS são injetadas por via subcutânea em um ou ambos os membros traseiros de camundongos fêmeas tipo Balb/c com 6 a 8 semanas de idade (como descrito por Guo et al. 2014, Combinatorial Photothermal e Immuno Cancer Therapi Using Chitosan-Coated Hollow Copper Sulfide Nanoparticles. ASC Nano.; 8(6): 5670-5681). Além disso, outras linhagens celulares de mama de camundongo disponíveis podem ser usadas.
[0320] Os tumores dos vários grupos de tratamento são medidos com paquímetros em intervalos regulares. Como descrito no Exemplo 9, as Veillonellas são administradas em doses variadas em intervalos definidos. Por exemplo, alguns camundongos são sacrificados para análise tumoral ex vivo usando citometria de fluxo. Outros camundon- gos podem ser novamente desafiados com injeção de célula tumorais no flanco contralateral para determinar o impacto da resposta de memó- ria do sistema imunológico sobre o crescimento tumoral.
[0321] Alternativamente, as células de 4T1 podem ser usadas em um modelo murino ortotópico de câncer da mama como descrito por Tao et al. (Tao et al. 2008. Imagable 4T1 model for the study of late stage breast cancer. 8: 288). Os camundongos são sacrificados para a análise tumoral ex vivo. Os tumores são analisados por citometria de fluxo e imuno-histoquímica. Exemplo 12: Um modelo de camundongo de câncer pancreático
[0322] Uma cepa de Veillonella é testada quanto à sua eficácia no modelo de camundongo de câncer pancreático, quer isoladamente ou em combinação com outras terapias contra câncer, incluindo inibi- dor(es) de ponto de controle. Os camundongos são divididos em grupos que recebem uma cepa bacteriana, com ou sem tratamento inibidor de ponto de controle. Como descrito no Exemplo 9, alguns camundongos recebem as Veillonella (p.o.) no dia seguinte à injeção de célula tumo- rais (dia 1). Outros camundongos recebem sete (7) doses consecutivas de uma cepa bacteriana (uma dose por dia nos dias 14-21). Outros ca- mundongos recebem dosagem diária ou, alternativamente, alguns ca- mundongos recebem dosagem em dias intercalados. Alternativamente, os camundongos são randomizados em vários grupos de tratamento em um ponto temporal definido (por exemplo, no dia 13) ou quando os tu- mores alcançam um certo tamanho (por exemplo, 100 mm3) e o trata- mento é, depois, iniciado em conformidade.
[0323] As células de Panc02 são mantidas em DMEM, suplemen- tado com 10% de soro de bezerro fetal e 1% de penicilina/estreptomi- cina, e incubadas a 37°C a 5% de CO2. Camundongos tipo C57Bl/6 fêmeas com 8 a 10 semanas de idade são obtidos da Charles River, Inc.
ou outro comerciante certificado. Os camundongos tipo C57Bl/6 fêmeas são injetados por via subcutânea no flanco traseiro direito com 1x106 células de Panc02. Esse protocolo é baseado nos modelos tumorais de Panc02 padronizados (Maletzki et al. 2008. Pancreatic cancer regres- sion by intratumoral injection of live streptococcus pyogenes in a synge- neic mouse model. Gut. 57:483 a 491). Os tumores dos vários grupos de tratamento são medidos com paquímetros em intervalos regulares. Como descrito no Exemplo 9, alguns camundongos são sacrificados para análise tumoral ex vivo usando citometria de fluxo, enquanto outros camundongos são novamente desafiados para determinar o impacto da resposta de memória no crescimento tumoral.
[0324] Alternativamente, as linhagens celulares de Panc02, 6606PDA ou Capan-1 podem ser usadas em um modelo murino ortotó- pico de câncer pancreático como descrito por Partecke et al. (Partecke et al. 2011. A syngeneic orthotopic murine model of pancreatic adeno- carcinoma in the C57/Bl6 mouse using the Panc02 and 6606PDA cell lines. Eur. Surg. Res. 47(2):98 a 107) ou Chai et al. (Chai et al. 2013. Bioluminescent orthotopic model of pancreatic cancer progression. J. Vis. Exp. 76: 50.395). Os camundongos são sacrificados para a análise tumoral ex vivo. Os tumores são analisados por citometria de fluxo e imuno-histoquímica. Exemplo 13: Um modelo de camundongo de carcinoma hepatoce- lular
[0325] Uma cepa de Veillonella é testada quanto à sua eficácia no modelo de camundongo de carcinoma hepatocelular, quer isoladamente ou em combinação com outras terapias contra câncer, incluindo inibi- dor(es) de ponto de controle. Os camundongos são divididos em grupos que recebem uma cepa bacteriana, com ou sem tratamento inibidor de ponto de controle. Como descrito no Exemplo 9, as Veillonellas são ad- ministradas em doses variadas em intervalos definidos. Por exemplo,
alguns camundongos recebem as Veillonella (p.o.) no dia seguinte à in- jeção de célula tumorais (dia 1). Outros camundongos recebem sete (7) doses consecutivas de uma cepa bacteriana (uma dose por dia nos dias 14-21). Outros camundongos recebem dosagem diária ou, alternativa- mente, alguns camundongos recebem dosagem em dias intercalados. Alternativamente, os camundongos são randomizados em vários grupos de tratamento em um ponto temporal definido (por exemplo, no dia 13) ou quando os tumores alcançam um certo tamanho (por exemplo, 100 mm3) e o tratamento é, depois, iniciado em conformidade.
[0326] O carcinoma hepatocelular é induzido em camundongos por inoculação subcutânea de 1x106 células Hepa129 (obtidas da NCI ou outra fonte), ou um número adequado de células de outra linhagem ce- lular de carcinoma hepatocelular (como descrito por Gonzalez-Carmona et al. 2008. CD40 ligand-expressing dendritic cells induce regression of hepatocellular carcinoma by activating innate and acquired immunity in vivo. Hepatology. 48(1):157 a 168). As células tumorais são inoculadas em um ou ambos os flancos. Os tumores dos vários grupos de trata- mento são medidos com paquímetros em intervalos regulares. Como descrito no Exemplo 9, alguns camundongos são sacrificados para aná- lise tumoral ex vivo usando citometria de fluxo, enquanto outros camun- dongos são novamente desafiados para determinar o impacto da res- posta de memória no crescimento tumoral. Exemplo 14: Um modelo de camundongo de linfoma
[0327] Uma cepa de Veillonella é testada quanto à sua eficácia no modelo de camundongo de linfoma, quer isoladamente ou em combina- ção com outras terapias contra câncer, incluindo inibidor(es) de ponto de controle. Por exemplo, os camundongos são divididos em grupos que recebem a Cepa A de Veillonella, Cepa B de Veillonella, Cepa C de Veillonella e/ou outra cepa de Veillonella, com ou sem tratamento inibi-
dor de ponto de controle. Como descrito no Exemplo 9, uma cepa bac- teriana é administrada em doses variadas em intervalos definidos. Por exemplo, alguns camundongos recebem uma cepa bacteriana (p.o.) no dia seguinte à injeção de célula tumorais (dia 1). Outros camundongos recebem sete (7) doses consecutivas de uma cepa bacteriana (uma dose por dia nos dias 14-21). Outros camundongos recebem dosagem diária ou, alternativamente, alguns camundongos recebem dosagem em dias intercalados. Alternativamente, os camundongos são randomiza- dos em vários grupos de tratamento em um ponto temporal definido (por exemplo, no dia 13) ou quando os tumores alcançam um certo tamanho (por exemplo, 100 mm3) e o tratamento é, depois, iniciado em confor- midade.
[0328] Uma linhagem celular de linfoma é o linfoma A20, embora outras linhagens celulares de linfoma possam ser usadas com camun- dongos singênicos. As células A20 de linfoma são obtidas da ATCC e 5x106 células em 50 μL de PBS são injetadas por via subcutânea em um ou ambos os membros traseiros dos camundongos fêmeas tipo Balb/c (como descrito por Houot et al. 2009. T-cell modulation combined with intratumoral CpG cures lymphoma in a mouse model without the need for chemotherapy. Blood. 113(15): 3.546-3.552). Os tumores dos vários grupos de tratamento são medidos com paquímetros em interva- los regulares. Como descrito no Exemplo 9, alguns camundongos são sacrificados para análise tumoral ex vivo usando citometria de fluxo, en- quanto outros camundongos são novamente desafiados para determi- nar o impacto da resposta de memória no crescimento tumoral. Exemplo 15: Um modelo de camundongo de câncer da próstata
[0329] Uma cepa de Veillonella é testada quanto à sua eficácia no modelo de camundongo de câncer da próstata, quer isoladamente ou em combinação com outras terapias contra câncer, incluindo inibi- dor(es) de ponto de controle. Os camundongos são divididos em grupos que recebem a Cepa A de Veillonella, Cepa B de Veillonella, Cepa C de Veillonella e/ou outra cepa de Veillonella, com ou sem tratamento inibi- dor de ponto de controle. Como descrito no Exemplo 9, as Veillonellas são administradas em doses variadas em intervalos definidos. Por exemplo, alguns camundongos recebem uma cepa bacteriana (p.o.) no dia seguinte à injeção de célula tumorais (dia 1). Alguns camundongos recebem sete (7) doses consecutivas de Veillonella (uma dose por dia nos dias 14-21). Outros camundongos recebem dosagem diária ou, al- ternativamente, alguns camundongos recebem dosagem em dias inter- calados. Alternativamente, os camundongos são randomizados em vá- rios grupos de tratamento em um ponto temporal definido (por exemplo, no dia 13) ou quando os tumores alcançam um certo tamanho (por exemplo, 100 mm3) e o tratamento é, depois, iniciado em conformidade.
[0330] As células de câncer da próstata de camundongo (1x105 RM-1 células ou um número adequado de células de outra linhagem celular de câncer da próstata) são injetadas em camundongos singêni- cos. Os tumores dos vários grupos de tratamento são medidos com pa- químetros em intervalos regulares. Como descrito no Exemplo 9, alguns camundongos são sacrificados para análise tumoral ex vivo usando ci- tometria de fluxo, enquanto outros camundongos são novamente desa- fiados para determinar o impacto da resposta de memória no cresci- mento tumoral. Exemplo 16: Um modelo de camundongo de plasmacitoma
[0331] Uma cepa bacteriana é testada quanto à sua eficácia no mo- delo de camundongo de plasmacitoma, quer isoladamente ou em com- binação com outras terapias contra câncer, incluindo inibidor(es) de ponto de controle. Os camundongos são divididos em grupos que rece- bem a Cepa A de Veillonella, Cepa B de Veillonella, Cepa C de Veillo- nella e/ou outra cepa de Veillonella, com ou sem tratamento inibidor de ponto de controle. Como descrito no Exemplo 9, uma cepa bacteriana é administrada em doses variadas em intervalos definidos. Por exemplo, alguns camundongos recebem uma cepa bacteriana (p.o.) no dia se- guinte à injeção de célula tumorais (dia 1). Alguns camundongos rece- bem sete (7) doses consecutivas de Veillonella (uma dose por dia nos dias 14-21). Outros camundongos recebem dosagem diária ou, alterna- tivamente, alguns camundongos recebem dosagem em dias intercala- dos. Alternativamente, os camundongos são randomizados em vários grupos de tratamento em um ponto temporal definido (por exemplo, no dia 13) ou quando os tumores alcançam um certo tamanho (por exem- plo, 100 mm3) e o tratamento é, depois, iniciado em conformidade.
[0332] Modelo de plasmacitoma induzido por óleo mineral
[0333] Para examinar a eficácia das Veillonella em um modelo de plasmacitoma ou mieloma múltiplo, os camundongos são injetados por via intraperitoneal três vezes com 500 μL de 2,6,10,12-tetrametilpenta- decano (“óleo pristano”) em vários pontos temporais entre 0 e 60 dias, como descrito por Potter et al. 1983. Peritoneal plasmacytomagenesis in mice: comparison of different pristane dose regimens. J. Natl. Cancer Inst. 71(2):391-5 (ver também Lattanzio et al. 1997. Defective Develop- ment of Pristane-Oil Induced Plasmacytomas in Interleukin-6-Deficient BALB/C Mice. Am. J. Pathology: 151(3):689696). A progressão da do- ença é medida pelo grau de inchaço abdominal e células imunológicas e partículas na ascite. O fluido de ascite é analisado quanto ao fenótipo de célula imunológica por citometria de fluxo.
[0334] Modelo de plasmacitoma induzido por linhagem celular
[0335] Para examinar a eficácia das Veillonella em um modelo de plasmacitoma ou mieloma múltiplo, células de MOPC-104E ou células de plasmacitoma de J558 (TIB-6 ATCC) são injetadas por via subcutâ- nea em um ou mais flancos traseiros de camundongos tipo Balb/c (5x106 células), com base no modelo descrito por Bhoopalam et al.
1980. Effect of dextran-S (alpha, 1-3 dextran) on the growth of plasmacy- tomas MOPC-104E and J558. J. Immunol. 125(4):1454-8 (ver também Wang et al. 2015. IL-10 enhances CTL-mediated tumor rejection by in- hibiting highly suppressive CD4+ T cells and promoting CTL persistence in a murine model of plasmacytoma. OncoImmunology. 4(7): e1014232- 1-9). Os camundongos são divididos em grupos que recebem as Veillo- nella por gavagem oral e com ou sem tratamento inibidor de ponto de controle. Os tumores dos vários grupos de tratamento são medidos com paquímetros em intervalos regulares. Como descrito no Exemplo 9, al- guns camundongos são sacrificados para análise tumoral ex vivo usando citometria de fluxo, enquanto outros camundongos são nova- mente desafiados para determinar o impacto da resposta de memória no crescimento tumoral. Exemplo 17: Um modelo de camundongo SCID de mieloma de ca- mundongo
[0336] As Veillonella são testadas quanto à sua eficácia no modelo de camundongo SCID de mieloma, quer isoladamente ou em combina- ção com outras terapias contra câncer, incluindo inibidor(es) de ponto de controle. Os camundongos são divididos em grupos que recebem a Cepa A de Veillonella, Cepa B de Veillonella, Cepa C de Veillonella e/ou outra cepa de Veillonella, com ou sem tratamento inibidor de ponto de controle. Como descrito no Exemplo 9, as Veillonellas são administra- das em doses variadas em intervalos definidos. Por exemplo, alguns camundongos recebem uma cepa bacteriana (p.o.) no dia seguinte à injeção de célula tumorais (dia 1). Alguns camundongos recebem sete (7) doses consecutivas de Veillonella (uma dose por dia nos dias 14- 21). Outros camundongos recebem dosagem diária ou, alternativa- mente, alguns camundongos recebem dosagem em dias intercalados. Alternativamente, os camundongos são randomizados em vários grupos de tratamento em um ponto temporal definido (por exemplo, no dia 13)
ou quando os tumores alcançam um certo tamanho (por exemplo, 100 mm3) e o tratamento é, depois, iniciado em conformidade.
[0337] Para examinar a eficácia das Veillonella usando uma leuce- mia de células plasmáticas humana, 1x107 linhagens celulares de mi- eloma humano, células ARH77 (ARH77-ATCC CRL-1621, ou um nú- mero adequado de células de outra linhagem celular de mieloma como KPMM2) são usadas. As células de mieloma são injetadas por via sub- cutânea em um ou ambos os flancos traseiros de camundongos SCID (Ver Caers et al. 2004. Of mice and men: disease models of multiple myeloma. Drug Discovery Today: Disease Models. 1(4):373-380. Os tu- mores dos vários grupos de tratamento são medidos com paquímetros em intervalos regulares. Como descrito no Exemplo 9, alguns camun- dongos são sacrificados para análise tumoral ex vivo usando citometria de fluxo, enquanto outros camundongos são novamente desafiados para determinar o impacto da resposta de memória no crescimento tu- moral. Exemplo 18: Um modelo de camundongo de carcinoma de células renais
[0338] Uma cepa bacteriana é testada quanto à sua eficácia no mo- delo de camundongo de carcinoma de células renais, quer isoladamente ou em combinação com outras terapias contra câncer, incluindo inibi- dor(es) de ponto de controle. Os camundongos são divididos em grupos que recebem a Cepa A de Veillonella, Cepa B de Veillonella, Cepa C de Veillonella e/ou outra cepa de Veillonella, com ou sem tratamento inibi- dor de ponto de controle. Como descrito no Exemplo 9, as Veillonellas podem ser administradas em doses variadas em intervalos definidos. Por exemplo, alguns camundongos recebem uma cepa bacteriana (p.o.) no dia seguinte à injeção de célula tumorais (dia 1). Alguns camundon- gos recebem sete (7) doses consecutivas de uma cepa bacteriana de
Veillonella (uma dose por dia nos dias 14-21). Outros camundongos re- cebem dosagem diária ou, alternativamente, alguns camundongos re- cebem dosagem em dias intercalados. Alternativamente, os camundon- gos são randomizados em vários grupos de tratamento em um ponto temporal definido (por exemplo, no dia 13) ou quando os tumores alcan- çam um certo tamanho (por exemplo, 100 mm3) e o tratamento é, de- pois, iniciado em conformidade.
[0339] Para examinar a eficácia das Veillonella em um modelo de camundongo de carcinoma de células renais, células Renca (ATCC CRL-2947) ou outras células de carcinoma de células renais são injeta- das por via subcutânea em um ou ambos os flancos de camundongos singênicos Balb/c com 7 a 8 semanas de idade (5x106 em 0,1 mL de PBS). Os tumores dos vários grupos de tratamento são medidos com paquímetros em intervalos regulares. Como descrito no Exemplo 9, al- guns camundongos são sacrificados para análise tumoral ex vivo usando citometria de fluxo, enquanto outros camundongos são nova- mente desafiados para determinar o impacto da resposta de memória no crescimento tumoral. Exemplo 19: Um modelo de camundongo de câncer da bexiga
[0340] Uma cepa bacteriana é testada quanto à sua eficácia no mo- delo de camundongo de câncer da bexiga, quer isoladamente ou em combinação com outras terapias contra câncer, incluindo inibidor(es) de ponto de controle. Os camundongos são divididos em grupos que rece- bem a Cepa A de Veillonella, Cepa B de Veillonella, Cepa C de Veillo- nella e/ou outra cepa de Veillonella, com ou sem tratamento inibidor de ponto de controle. Como descrito no Exemplo 9, as Veillonellas são ad- ministradas em doses variadas em intervalos definidos. Por exemplo, alguns camundongos recebem uma cepa bacteriana (p.o.) no dia se- guinte à injeção de célula tumorais (dia 1). Alguns camundongos rece- bem sete (7) doses consecutivas de uma cepa bacteriana (uma dose por dia nos dias 14-21). Outros camundongos recebem dosagem diária ou, alternativamente, alguns camundongos recebem dosagem em dias intercalados. Alternativamente, os camundongos são randomizados em vários grupos de tratamento em um ponto temporal definido (por exem- plo, no dia 13) ou quando os tumores alcançam um certo tamanho (por exemplo, 100 mm3) e o tratamento é, depois, iniciado em conformidade.
[0341] No dia da inoculação, as células de MBT-2 (ou outra linha- gem celular de câncer da bexiga) são colhidas e ressuspensas em 1:1 de mistura de PBS/Matrigel. 2x105 células MBT-2 são suspensas em 100 μL de mistura e injetadas por via subcutânea em um ou ambos os flancos traseiros de camundongos singênicos. Os tumores são medidos com paquímetros em intervalos regulares.
[0342] Como descrito no Exemplo 9, alguns camundongos são sa- crificados para análise tumoral ex vivo usando citometria de fluxo, en- quanto outros camundongos são novamente desafiados para determi- nar o impacto da resposta de memória no crescimento tumoral. Exemplo 20: Um modelo de camundongo para carcinoma colorretal
[0343] Uma cepa bacteriana é testada quanto à sua eficácia no mo- delo de camundongo para carcinoma colorretal, quer isoladamente ou em combinação com outras terapias contra câncer, incluindo inibi- dor(es) de ponto de controle. Os camundongos são divididos em grupos que recebem a Cepa A de Veillonella, Cepa B de Veillonella, Cepa C de Veillonella e/ou outra cepa de Veillonella, com ou sem tratamento inibi- dor de ponto de controle. Como descrito no Exemplo 9, as Veillonellas podem ser administradas em doses variadas em intervalos definidos. Por exemplo, alguns camundongos recebem uma cepa bacteriana (p.o.) no dia seguinte à injeção de célula tumorais (dia 1). Outros camundon- gos recebem sete (7) doses consecutivas de uma cepa bacteriana (uma dose por dia nos dias 14-21). Outros camundongos recebem dosagem diária ou, alternativamente, alguns camundongos recebem dosagem em dias intercalados. Alternativamente, os camundongos são randomiza- dos em vários grupos de tratamento em um ponto temporal definido (por exemplo, no dia 13) ou quando os tumores alcançam um certo tamanho (por exemplo, 100 mm3) e o tratamento é, depois, iniciado em confor- midade.
[0344] Camundongos Balb/c fêmeas com 6 a 8 semanas de idade foram obtidos da Taconic (Germantown, NY). 100.000 células de tumor colorretal de CT-26 (ATCC CRL-2638) foram ressuspensas em PBS es- téril e inoculadas na presença de 50% de Matrigel. As células tumorais CT-26 foram injetadas por via subcutânea em um flanco traseiro de cada camundongo. O tratamento com uma cepa de Veillonella é iniciado em algum momento após a inoculação de célula tumorais em doses varia- das e em intervalos definidos. Por exemplo, alguns camundongos rece- bem entre 1 - 5x109 UFC (volume final de 100 μL) por dose. As vias possíveis de administração incluem gavagem oral (p.o.), injeção intra- venosa, injeção intratumoral (IT) ou injeção peritumoral, ou subtumoral ou subcutânea. Para avaliar os efeitos antitumorais sistêmicos do trata- mento com Veillonella, camundongos adicionais podem ser inoculados com células tumorais no flanco contralateral (não tratado, segundo) an- tes do tratamento IT, peritumoral ou subtumoral com Veillonella no pri- meiro flanco.
[0345] Os tumores dos vários grupos de tratamento são medidos com paquímetros em intervalos regulares. Como descrito no Exemplo 9, alguns camundongos são sacrificados para análise tumoral ex vivo usando citometria de fluxo, enquanto outros camundongos são nova- mente desafiados para determinar o impacto da resposta de memória no crescimento tumoral. Exemplo 21: Condições de fabricação
[0346] Meios enriquecidos são usados para cultivar e preparar a bactéria para uso in vitro e in vivo. Por exemplo, os meios podem conter açúcar, extratos de levedura, peptonas à base de planta, tampões, sais, elementos vestigiais, tensoativos, agentes antiespumantes e vitaminas. A composição de componentes complexos, como extratos de levedura e peptonas pode ser indefinida ou parcialmente definida (incluindo con- centrações aproximadas de aminoácidos, açúcares etc.). O metabo- lismo microbiano pode ser dependente da disponibilidade de recursos, como carbono e nitrogênio. Diversos açúcares ou outras fontes de car- bono podem ser testados. Alternativamente, os meios podem ser pre- parados e as bactéria selecionadas cultivadas como mostrado por Saa- rela et al., J. Applied Microbiology. 2.005. 99: 1330 a 1339, que é no presente documento incorporado a título de referência. A influência do tempo de fermentação, crioprotetor e neutralização de concentrado ce- lular sobre a sobrevida de secagem por congelamento, estabilidade de armazenamento e exposição a ácido e bile da bactéria selecionada pro- duzida sem ingredientes à base de leite.
[0347] Em grande escala, o meio é esterilizado. A esterilização pode ser processamento em Temperatura Ultra Alta (UHT). O proces- samento UHT é realizado em temperatura muito alta durante períodos de tempo curtos. O intervalo de UHT pode ser de 135-180 °C. Por exem- plo, o meio pode ser esterilizado entre 10 a 30 segundos a 135 °C.
[0348] O inóculo pode ser preparado em frascos ou em biorreatores menores e o crescimento é monitorado. Por exemplo, o tamanho de inó- culo pode estar entre, aproximadamente, 0,5 e 3% do volume total do biorreator. Dependendo da aplicação e necessidade de material, o vo- lume do biorreator pode ter pelo menos 2 L, 10 L, 80 L, 100 L, 250 L,
1.000 L, 2.500 L, 5.000 L, 10.000 L.
[0349] Antes da inoculação, o biorreator é preparado com meio a pH, temperatura e concentração de oxigênio desejados. O pH inicial do meio de cultura pode ser diferente do ponto de ajuste do processo. O estresse por pH pode ser prejudicial em baixa concentração celular; o pH inicial poderia estar entre pH 7,5 e o ponto do ajuste de processo. Por exemplo, o pH pode ser ajustado entre 4,5 e 8,0. Durante a fermen- tação, o pH pode ser controlado através do uso de hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou hidróxido de amônio. A temperatura pode ser controlada de 25°C a 45°C, por exemplo, a 37°C. As condições anaeró- bicas são criadas pela redução do nível de oxigênio no caldo de cultura de cerca de 8 mg/L a 0 mg/L. Por exemplo, nitrogênio ou misturas de gás (N2, CO2 e H2) podem ser usados a fim de estabelecer condições anaeróbicas. Alternativamente, nenhum gás é usado e condições ana- eróbicas são estabelecidas por células que consomem o oxigênio res- tante do meio. Dependendo da cepa e do tamanho do inóculo, o tempo de fermentação em biorreator pode variar. Por exemplo, o tempo de fer- mentação pode variar de aproximadamente 5 horas a 48 horas.
[0350] Por exemplo, um frasco congelado é diluído para 0,1% em um meio de 1 L a 37 °C durante 12-16 horas. O meio é PM11 com 1 g/L de L-lactato de sódio (sem FeSO4, sem NH4Cl, sem malato). O meio de 1 L é diluído a 1% em um biorreator de 15 L a 37, 150 rpm, gás de CO2 a 5% e N2 a 95%, pH não controlado durante 16 a 18 horas. A alimentação é 10X YEP, 33 g/L de L-lactato de sódio (sem G2) (alimen- tação constante: 11 mL/Lh). É então centrifugado a 10.000 g, 10 °C, durante 10 minutos para coletar 90 g de sedimento/15 L. Em seguida, é colocado em um novo estabilizador: sacarose-dextrano-citocina a 0,18 g stab/g de sedimento.
[0351] Reavivar micróbios de um estado congelado pode exigir con- siderações especiais. O meio de produção pode estressar as células após um descongelamento; um meio de descongelamento específico pode ser necessário para iniciar consistentemente uma sucessão inicial de material descongelado. A cinética de transferência ou passagem de material inicial para meio fresco, para os propósitos de aumentar o vo- lume inicial ou manter o estado de crescimento microbiano, pode ser influenciada pelo estado atual dos micróbios (por exemplo, crescimento exponencial, crescimento estacionário, sem estresse, com estresse).
[0352] A inoculação do(s) fermentador(es) de produção pode im- pactar a cinética de crescimento e a atividade celular. O estado inicial do sistema de biorreator precisa ser otimizado para facilitar a produção bem-sucedida e consistente. A fração entre cultura inicial e o meio total (por exemplo, uma porcentagem) tem um impacto drástico sobre a ci- nética de crescimento. O intervalo pode ser de 1 a 5% do volume de trabalho do fermentador. O pH inicial do meio de cultura pode ser dife- rente do ponto de ajuste do processo. O estresse por pH pode ser pre- judicial em baixa concentração celular; o pH inicial pode estar entre pH 7,5 e o ponto de ajuste do processo. A agitação e o fluxo de gás no sistema durante a inoculação podem ser diferentes dos pontos de ajuste do processo. Estresses físicos e químicos devido a ambas as condições podem ser prejudiciais em concentração celular baixa.
[0353] As condições de processo e configurações de controle po- dem influenciar a cinética de crescimento microbiano e atividade celular. Os deslocamentos em condições de processo podem alterar a compo- sição da membrana, a produção de metabólitos, taxa de crescimento, estresse celular, etc. O intervalo ótimo de temperatura para crescimento pode variar com a cepa. O intervalo pode ser de 20 a 40 C. O pH ótimo para crescimento e desempenho de atividade a jusante pode variar com a cepa. O intervalo pode ser pH 5-8. Os gases dissolvidos no meio po- dem ser usados pelas células para o metabolismo. Pode ser necessário ajustar as concentrações de O2, CO2 e N2 por todo o processo. A dis- ponibilidade de nutrientes pode deslocar o crescimento celular. Os mi- cróbios podem ter cinética alternativa quando nutrientes em excesso es- tão disponíveis.
[0354] O estado de micróbios na extremidade de uma fermentação e durante a coleta pode impactar a sobrevida e a atividade celulares. Os micróbios podem ser pré-condicionados brevemente antes da coleta para preparar melhor os mesmos para os estresses físicos e químicos envolvidos na separação e processamento a jusante. Uma alteração na temperatura (frequentemente reduzindo para 20-5 C) pode reduzir o metabolismo celular, retardando o crescimento (e/ou morte) e alteração fisiológica quando removida do fermentador. A efetividade de concen- tração centrífuga pode ser influenciada pelo pH da cultura. Elevar o pH em 1 a 2 pontos pode aprimorar a eficácia de concentração, mas pode ser também prejudicial às células. Os micróbios podem ser estressados brevemente antes da coleta por aumento da concentração de sais e/ou açúcares no meio. As células estressadas dessa forma podem sobrevi- ver melhor ao congelamento e liofilização durante a jusante.
[0355] Os métodos e tecnologia de separação podem impactar em quão eficientemente os micróbios são separados do meio de cultura. Os sólidos podem ser removidos usando técnicas de centrifugação. A efe- tividade de concentração centrífuga pode ser influenciada pelo pH de cultura ou com o uso de agentes de floculação. Elevar o pH em 1 a 2 pontos pode aprimorar a eficácia de concentração, mas pode ser tam- bém prejudicial às células. Os micróbios podem ser estressados breve- mente antes da coleta por aumento da concentração de sais e/ou açú- cares no meio. As células estressadas dessa forma podem sobreviver melhor ao congelamento e liofilização durante a jusante. Adicional- mente, micróbios podem ser também separados por meio de filtração. A filtração é superior às técnicas de centrifugação para purificação se as células exigirem excessivos g-minutos para centrifugação bem-suce- dida. Os excipientes podem ser adicionados antes da separação. Os excipientes podem ser adicionados para crioproteção ou para proteção durante a liofilização. Os excipientes podem incluir, mas não se limitam a, sacarose, trealose ou lactose, e os mesmos podem ser alternativa-
mente misturados com tampão e antioxidantes. Antes da liofilização, go- tículas de sedimentos celulares misturados com excipientes são sub- mersas em nitrogênio líquido.
[0356] A coleta pode ser realizada por centrifugação contínua. O produto pode ser ressuspenso com vários excipientes até uma concen- tração final desejada. Os excipientes podem ser adicionados para crio- proteção ou para proteção durante a liofilização. Os excipientes podem incluir, mas não se limitam a, sacarose, trealose ou lactose, e os mes- mos podem ser alternativamente misturados com tampão e antioxidan- tes. Antes da liofilização, gotículas de sedimentos celulares misturados com excipientes são submersas em nitrogênio líquido.
[0357] A liofilização de material, incluindo bactérias vivas, começa com a secagem primária. Durante a fase de secagem primária, o gelo é removido. No presente documento, um vácuo é gerado e uma quanti- dade adequada de calor é fornecida ao material para o gelo sublimar. Durante a fase de secagem secundária, as moléculas de água ligadas a produto são removidas. No presente documento, a temperatura é ele- vada até ser mais alta que na fase de secagem primária para quebrar quaisquer interações físico-químicas que se formaram entre as molécu- las de água e o material de produto. A pressão pode ser também redu- zida, adicionalmente, para aumentar a dessorção durante esse estágio. Após o processo de secagem por congelamento ser concluído, a câ- mara pode ser preenchida com um gás inerte, tal como nitrogênio. O produto pode ser vedado dentro do secador por congelamento sob con- dições secas, impedindo a exposição à água atmosférica e contaminan- tes. Exemplo 22: Veillonella Administrada Intravenosamente inibe o crescimento tumoral de carcinoma colorretal
[0358] Camundongos tipo Balb/c fêmeas com 6 a 8 semanas de idade foram obtidos da Taconic (Germantown, NY). 100.000 células de tumor colorretal de CT-26 (ATCC CRL-2638) foram ressuspensas em PBS estéril e inoculadas na presença de 50% de Matrigel. As células tumorais CT-26 foram injetadas por via subcutânea em um flanco tra- seiro de cada camundongo. Quando os volumes de tumor alcançaram uma média de 100 mm3 (aproximadamente 10 a 12 dias após a inocu- lação de célula tumorais), os animais foram distribuídos nos seguintes grupos: 1) veículo; 2) Cepa A de Veillonella; 3) Cepa B de Veillonella e 4) anticorpo anti-PD-1. Os anticorpos foram administrados por via intra- peritoneal (i.p.) a 200 µg/camundongo (100 µL de volume final) a cada quatro dias, começando no dia 1, por um total de 3 vezes (Q4Dx3) e as EV de Veillonella (5 µg) foram injetadas por via intravenosa (i.v) a cada terceiro dia, começando no dia 1, por um total de 4 vezes (Q3Dx4). Am- bos os grupos Veillonella mostraram inibição do crescimento do tumor maior do que a observada no grupo anti-PD-1 (Figs. 4 e 5). As EV foram preparados e quantificados pelo Exemplo 27. Exemplo 23: A eficácia das EV varia com base no micróbio-fonte, dose e via de administração
[0359] Camundongos tipo Balb/c fêmeas com 6 a 8 semanas de idade foram obtidos da Taconic (Germantown, NY). 100.000 células de tumor colorretal de CT-26 (ATCC CRL-2638) foram ressuspensas em PBS estéril e inoculadas na presença de 50% de Matrigel. As células tumorais CT-26 foram injetadas por via subcutânea em um flanco tra- seiro de cada camundongo. Quando os volumes de tumor alcançaram uma média de 100 mm3 (aproximadamente 10 a 12 dias após a inocu- lação de célula tumorais), os animais foram distribuídos nos seguintes grupos destacados na Tabela 2. Tabela 2: Grupos de Tratamento Grupo Tratamento Dose/Via/Cronograma 1 Veículo IV (PBS) N/A / IV / Q3Dx4 2 Veículo PA (sacarose) N/A / PO / QD 3 Anti-PD-1 200 µg / IP / Q4Dx3
4 EV da Cepa B de Veillonella parvula 10 µg / IV / Q3Dx4 5 EV da Cepa B de Veillonella parvula 5 µg / IV / Q3Dx4 6 EV da Cepa B de Veillonella parvula 2 µg / IV / Q3Dx4 7 EV da Cepa A de Veillonella tobetsuensis 75 µg / PO. QD 8 EV da Cepa A de Veillonella tobetsuensis 5 µg / IV / Q3Dx4 Como observado na tabela, os anticorpos foram administrados por via intraperitoneal (i.p.) a 200 µg/camundongo (100 µL de volume final) a cada quatro dias, começando no dia 1, por um total de 3 vezes (Q4Dx3) e as EV foram injetadas por via intravenosa (i.v) a cada terceiro dia, começando no dia 1, por um total de 4 vezes (Q3Dx4). Os grupos de tratamento administrados pela boca (p.o.) foram administrados diaria- mente (QD). A eficácia das EV de Veillonella varia com base no micró- bio-fonte, dose e via de administração Exemplo 24: Imunomodulação de bactérias comensais humanas em um modelo de hipersensibilidade do tipo retardado baseado em
KLH
[0360] De forma similar ao Exemplo 1, os camundongos foram sen- sibilizados para KLH como descrito acima, e os grupos receberam Veil- lonella viva ou irradiada (25 kGy). Os camundongos receberam veículo, Dexametasona, Cepa D de Veillonella irradiada (8,32 x 10^9, 25 kGy), Cepa E de Veillonella irradiada (3,28 x 10^9, 25 kGy), Cepa F de Veillo- nella irradiada (5,38 x 10^9, 25 kGy), ou cepa G de Veillonella irradiada (2,01 x 10^9, 25 kGy). Os camundongos foram dosados nos dias 1-9 e desafiados no dia 8 com medições de orelha realizadas no dia 9 (24 horas) e no dia 10 (48 horas).
[0361] Como mostrado na Fig. 8, as Cepas de Veillonella irradiadas são eficazes na redução do inchaço da orelha em 24 horas em compa- ração com o veículo (controle negativo). Como mostrado na Fig. 9, os resultados das Cepas B, E, F e G de Veillonella na redução da inflama- ção antígeno-específica da orelha em 24 horas, em comparação com o veículo (controle negativo) e Dexametasona anti-inflamatória (controle positivo) após o desafio com antígeno em um modelo de hipersensibili- dade do tipo retardado baseado em KLH. Ambas as Cepas B e E de Veillonella vivas e irradiadas foram eficazes na inibição da inflamação da orelha, mas a Cepa E de Veillonella irradiada foi ainda mais eficaz que a cepa E viva. Para a Cepa F de Veillonella, a irradiação gama levou a uma cepa de Veillonella, que não apresentava desempenho, a se tor- nar eficaz. Todos os grupos receberam 10 mg do pó por dose. Exemplo 25: Geração do mutante de Veillonella LPS
[0362] A resistência aos antibióticos pode ser classificada como in- trínseca, adquirida ou adaptativa. A resistência adaptativa é definida como morte antimicrobiana reduzida em populações de bactérias que eram, originalmente, suscetíveis a um particular agente antibiótico. A mesma envolve um aumento transitório na capacidade das bactérias sobreviverem ao antibiótico, principalmente devido a alterações nos ní- veis de expressão gênica e/ou proteica desencadeadas por condições ambientais, como estresse, condições nutricionais e níveis subinibido- res do antibiótico. Ao contrário dos mecanismos de resistência intrínse- cos e adquiridos, que são estáveis e podem ser transmitidos à progênie, a resistência adaptativa é transitória e é usualmente perdida após a re- moção do agente antibiótico. Esse tipo de resistência foi relatado para aminoglicosídeos e polimixinas (polimixina B e colistina) em bactérias, especialmente Gram-negativas.
[0363] A resistência adaptativa pode ser uma das razões do fenô- meno em que os resultados de suscetibilidade laboratorial não são con- gruentes com a eficácia clínica dos antibióticos. Sabe-se que a resistên- cia à polimixina nas bactérias é adaptativa, caracterizada pela indução de resistência na presença de fármaco e reversiva para o fenótipo sus- cetível na sua ausência. As polimixinas se ligam ao lipopolissacarídeo (LPS), o principal constituinte da membrana externa das bactérias Gram-negativas, por meio de interações com fosfatos e ácidos graxos do núcleo de LPS e das porções químicas lipídicas A. Essas interações resultam posteriormente em lise celular e morte.
[0364] A resistência à polimixina em bactérias Gram-negativas está associada à adição de 4-amino-L-arabinose (L-Ara4N) ou fosfoetanola- mina (pEtN) ao lipídio A e aos componentes principais do oligossacarí- deo. Isto resulta em uma redução da carga elétrica negativa da mem- brana externa. Os sistemas reguladores de dois componentes (TCSs) PhoP-PhoQ (PhoPQ) e PmrA-PmrB (PmrAB) desempenham papéis im- portantes na modificação do lipídio A, que posteriormente resulta em bactérias resistentes às polimixinas. Além disso, as taxas de sobrevi- vência de bactérias compreendendo mutantes de deleção (lpxC e/ou pmrB), que estão envolvidos na biossíntese e modificação de LPS, di- minuíram > 4 vezes quando a colistina estava presente em concentra- ções subinibitórias, em comparação com as dos seus progenitores WT.
[0365] A evolução da resistência à colistina é devida à modificação do lipídio A no LPS. Isto resulta em uma redução da carga elétrica da membrana externa. Sabe-se que esta modificação é regulada por vários sistemas de dois componentes (TCSs), incluindo PhoPQ, PmrAB, ParRS e CprRS. Foi reportada a perda de LPS devida a mutações ou disrupções de genes envolvidos na biossíntese de lipídios A, tais como lpxA, lpxC e lpxD.
[0366] Os mutantes LPS de Veillonella são gerados por passagens seriais na presença de colistina, usando métodos conhecidos dos peri- tos na técnica (JY Lee et al. Sci Rep. 2016 6 de maio de 2016; 6: 25543).
[0367] Por exemplo, culturas de Veillonella são rotineiramente culti- vadas em placas de ágar BRU (Anaerobic Systems) a 37 °C durante 2- 4 dias. As culturas de Veillonella são crescidas em meio líquido na pre- sença de um intervalo de concentração de colistina (0,1 a 16 mg/L) du- rante 1 a 3 dias, a fim de determinar a concentração inibitória mínima de colistina. As culturas de Veillonella são crescidas em meio líquido na presença de concentração subinibitória de colistina (isto é, concentra- ção inibitória menor que a mínima) por 1 a 3 dias para permitir o cresci- mento bacteriano. As culturas crescidas são diluídas 25 a 50 vezes em meio fresco contendo uma concentração 2 vezes maior de colistina. Cada meio de cultura bacteriano continha 0,13, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 ou 256 mg/L de colistina como culturas bacterianas passa- das em série por 10-14 gerações. Quando as culturas bacterianas não conseguem crescer em meio líquido com uma concentração 2 vezes maior de colistina, as culturas são plaqueadas em placas de ágar BRU e deixadas crescer durante 2-4 dias. As colônias bacterianas são retira- das das placas para iniciar as culturas em meio líquido contendo colis- tina a uma concentração que permitiu o crescimento bacteriano. As pas- sagens seriais são repetidas até que as bactérias sejam resistentes à colistina na concentração > 250mg/L. Após a última passagem, as colô- nias bacterianas são cultivadas em placas BRU contendo 100 mg/L de colistina e várias colônias individuais são selecionadas para análise de lipopolissacarídeo (LPS).
[0368] Os clones de Veillonella resistentes à colistina são selecio- nados para análise de LPS. Os métodos analíticos incluem a análise por SDS-PAGE seguida de tingimento ProQ LPS (Invitrogen), ensaio cro- mogênico de endotoxina LAL (GeneScript), análise lipídica A por análise MALDI-TOF MS (Bruker). Exemplo 26: Preparação e purificação de EV de bactérias
[0369] Vesículas extracelulares (EV) são preparados a partir de cul- turas de bactérias usando métodos conhecidos pelos peritos na técnica (S. Bin Park, et al. PLoS ONE. 6(3):e17629 (2011)).
[0370] Por exemplo, as culturas bacterianas são centrifugadas a
11.000 x g durante 20-40 min a 4°C para sedimentar as bactérias. Os sobrenadantes de cultura são, então, passados através de um filtro de 0,22 µm para excluir as células bacterianas intactas. Os sobrenadantes filtrados são concentrados usando métodos que podem incluir, mas que não se limitam a, precipitação com sulfato de amônio, ultracentrifugação ou filtração. Sucintamente, para a precipitação com sulfato de amônio, sulfato de amônio a 1,5-3 M é adicionado lentamente ao sobrenadante filtrado, com agitação a 4°C. As precipitações são incubadas a 4°C du- rante 8-48 horas e, então, centrifugadas a 11.000 x g durante 20-40 min a 4°C. Os sedimentos contêm EV bacterianas e outros detritos. Sucin- tamente, usando ultracentrifugação, os sobrenadantes filtrados são cen- trifugados a 100.000-200.000 x g durante 1 - 16 horas a 4°C. O sedi- mento desta centrifugação contém EV bacterianas e outros detritos. Su- cintamente, usando uma técnica de filtração, usando um filtro rotatório Amicon Ultra ou por filtração de fluxo tangencial, os sobrenadantes são filtrados de modo a reter espécies de peso molecular > 50 ou 100 kDa.
[0371] Alternativamente, as EV são obtidas a partir de culturas bac- terianas continuamente durante o crescimento ou em pontos temporais selecionados durante o crescimento, conectando-se um biorreator a um sistema de fluxo tangencial alternado (ATF) (por exemplo, XCell ATF da Repligen) de acordo com as instruções do fabricante. O sistema ATF retém as células intactas (>0,22 μm) no biorreator e permite que os com- ponentes menores (por exemplo, EV, proteínas livres) passem através de um filtro para coleta. Por exemplo, o sistema pode ser configurado de modo que o filtrado <0,22 μm seja, então, passado através de um segundo filtro de 100 kDa, permitindo que espécies, tais como EV entre 0,22 μm e 100 kDa, sejam coletadas e espécies menores que 100 kDa sejam bombeadas de volta para o biorreator. Alternativamente, o sis- tema pode ser configurado para permitir que o meio no biorreator seja reabastecido e/ou modificado durante o desenvolvimento da cultura. As EV coletadas por este método podem ser, ainda, purificadas e/ou con- centradas por ultracentrifugação ou filtração como descrito acima para sobrenadantes filtrados.
[0372] As EV obtidas pelos métodos descritos acima podem ser, ainda, purificadas por ultracentrifugação em gradiente, usando métodos que podem incluir o, mas não se limitam a, uso de um gradiente de sa- carose ou gradiente Optiprep. Sucintamente, usando um método com gradiente de sacarose, se a precipitação com sulfato de amônio ou a ultracentrifugação foram usadas para concentrar os sobrenadantes fil- trados, os sedimentos são ressuspensos em sacarose a 60%, Tris 30 mM, pH 8,0. Se filtração foi usada para concentrar o sobrenadante fil- trado, o concentrado é trocado de tampão para sacarose a 60%, Tris 30 mM, pH 8,0, usando uma coluna Amicon Ultra. As amostras são aplica- das a um gradiente de sacarose descontínuo a 35-60% e centrifugadas a 200.000 x g durante 3-24 horas a 4°C. Sucintamente, usando um mé- todo de gradiente Optiprep, se a precipitação com sulfato de amônio ou ultracentrifugação for usada para concentrar os sobrenadantes filtrados, os sedimentos são ressuspensos em Optiprep a 35% em PBS. Se a filtração foi usada para concentrar o sobrenadante filtrado, o concen- trado é diluído usando Optiprep a 60% até uma concentração final de Optiprep a 35%. As amostras são aplicadas a um gradiente de sacarose descontínuo a 35-60% e centrifugadas a 200.000 x g durante 3-24 horas a 4°C.
[0373] Para confirmar a esterilidade e o isolamento das prepara- ções de EV, as EV são diluídas em série em meio de ágar usado para cultura de rotina das bactérias a ser testadas e incubadas usando con- dições de rotina. Preparações não estéreis são passadas através de um filtro de 0,22 μm para excluir as células intactas. Para aumentar ainda mais a pureza, EV isoladas podem ser tratadas com DNase ou protei- nase K.
[0374] Alternativamente, para a preparação de EV usadas para in- jeções in vivo, as EV purificadas são processadas como descrito prece- dentemente (G. Norheim, et al. PLoS ONE. 10(9): e0134353 (2015)).
Sucintamente, após a centrifugação em gradiente de sacarose, as ban- das contendo EV são ressuspensas até uma concentração final de 50 µg/mL em uma solução contendo sacarose a 3% ou outra solução ade- quada para injeção in vivo conhecida por um perito na técnica. Esta so- lução pode também conter adjuvante, por exemplo, hidróxido de alumí- nio a uma concentração de 0-0,5% (p/v).
[0375] Para tornar as amostras compatíveis com testes adicionais (por exemplo, para remover a sacarose antes do imageamento TEM ou ensaios in vitro), as amostras são trocadas de tampão para PBS ou Tris 30 mM, pH 8,0 usando filtração (por exemplo, colunas Amicon Ultra), diálise, ou ultracentrifugação (200.000 x g, ≥ 3 horas, 4 °C) e ressus- pensão. Exemplo 27: Preparação e purificação de EV de Veillonella de bac- térias Método de prep:
[0376] As culturas bacterianas foram centrifugadas a 10.000 -
16.000 x g durante 10-15 minutos a 4°C, 10°C ou temperatura ambiente para sedimentar as bactérias. Os sobrenadantes de cultura foram, en- tão, filtrados para ≤ 0,22 µm para excluir as células bacterianas intactas. Os sobrenadantes filtrados foram concentrados e trocados para tampão PBS por filtração de fluxo tangencial, retendo espécies > 100 kDa. Os sobrenadantes foram então filtrados novamente para ≤ 0,22 µm e as EV foram sedimentadas por ultracentrifugação a 200.000 x g durante1 h a 4ºC. Os sedimentos foram ressuspensos em PBS e posteriormente pu- rificados por ultracentrifugação em gradiente. As amostras foram diluí- das para 45% de Optiprep com 3 volumes de 60% de Optiprep e aplica- das no fundo de um gradiente Optiprep descontínuo de 0-45%. Os gra- dientes foram centrifugados a 200.000 x g durante 4-24 horas a 4°C. As frações contendo EV acima do nível da amostra original foram removi-
das, diluídas pelo menos 15 vezes com PBS e sedimentadas por ultra- centrifugação a 200.000 x g durante 1 h a 4ºC. Os sedimentos foram ressuspensos em PBS. Antes da administração in vivo, as amostras fo- ram esterilizadas por filtração para ≤ 0,22 µm. Quantificação:
[0377] A dosagem das EV foi baseada na contagem de partículas, como avaliada por Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA), usando um NanoSight NS300 (Malvern Panalytical), de acordo com as instruções do fabricante. As contagens para cada amostra foram base- adas em pelo menos três vídeos com duração de 30 segundos cada, contando 40-140 partículas por fotograma, com uma velocidade de bomba de seringa de 75. As quantidades de proteína foram também rastreadas e quantificadas por dose para cada preparação de EV. A proteína total foi quantificada por ensaios de Bradford usando o rea- gente corante Quick Start Bradford 1x (Bio-Rad) de acordo com as ins- truções do fabricante. Exemplo 28: Preparação de Bactérias Veillonella Preparação de alimento para processo descontínuo alimentado (Fed- batch) Componentes Por 3 L (g) Extrato de Levedura 19512 Organotechnie S.A.S. 300 Peptona de Soja E110 19425 Organotechnie S.A.S. 300 Peptona de Batata E210 19425 Organotechnie S.A.S. 150 Peptona de Soja A3 SC 19685 Organotechnie S.A.S. 300
[0378] 3 L de água DI são aquecidos em micro-ondas durante cerca de 6 min (a 50-60ºC). Os níveis de 2L e 3L no copo de 5L são marcados. 2L de água DI é adicionada ao copo com o magneto maior. O aquecedor e o agitador (200 rpm) são ligados. A temperatura da solução é mantida entre 50-60 °C durante a mistura. Os componentes na tabela acima são adicionados um a um. 100 g, no máximo, são adicionados a cada vez,
até que sejam completamente dissolvidos antes de adicionar o seguinte componente. Depois de adicionar o último componente, dissolva-o com- pletamente por pelo menos 30 min. O volume final é de cerca de 2800 mL. A solução é esterilizada por filtração. São usados frascos estéreis de 1L (945 mL da solução em frascos de 1L x3). São adicionados 55 mL de L-lactato de sódio a 60% (para obter 33 g/L de lactato na alimenta- ção) a cada frasco assepticamente.
[0379] Os estoques de L-lactato de sódio são preparados e esterili- zados previamente. Preparação de inóculo a partir de estoque congelado:
[0380] O PM11 (com 5 g/L de L-lactato de sódio) é preparado com antecedência, seguindo o protocolo de preparação do meio PM11. O meio é transferido para a câmara anaeróbica coy e desgaseificado du- rante a noite antes da inoculação. O frasco congelado é transferido para a câmara anaeróbica coy. Sua tampa é limpa com etanol. Após o des- congelamento, o frasco é submetido a vórtex suavemente e 1 mL do material é transferido para o meio PM11 de 1L imediatamente (inóculo a 0,1%). O meio é incubado a 37°C durante a noite. A qualidade do inóculo determina o tempo de incubação. Portanto, pelo menos nas pri- meiras execuções, é recomendado o acompanhamento do crescimento para ter uma ideia do estágio do inóculo. O ponto de colheita é muito crucial para o inóculo. O inóculo deve estar na fase exponencial média ou tardia.
[0381] Meio PM11 (esterilização por filtração) PM11 g/L L-Lactato de Sódio 5 Extrato de Levedura 19512 Organotechnie S.A.S. 10 Peptona de Soja E110 19425 Organotechnie S.A.S. 10 Peptona de Batata E210 19425 Organotechnie S.A.S. 5 Peptona de Soja A3 SC 19685 Organotechnie S.A.S. 10
Fosfato dipotássico K2HPO4 5,03 Fosfato monopotássico KH2PO4 2,87 L-cisteína-HCl 0,5 Citrato trissódico 5 Cloreto de magnésio 0,5 Cloreto de manganês 0,1 Componentes do grupo 1 G por L Extrato de Levedura 19512 Organotechnie S.A.S. 10 Peptona de Soja E110 19885 Organotechnie S.A.S 10 Peptona de Soja A3 SC 19685 Organotechnie S.A.S 10 Peptona de Batata E210 19425 Organotechnie S.A.S 5 Fosfato dipotássico K2HPO4 5,03 Fosfato monopotássico KH2PO4 2,87 Citrato trissódico 5 L-Lactato de Sódio 5 Preparação do meio:
[0382] O copo 2L é colocado em uma balança e tarado e cheio com 800 g de água. Um magneto é colocado e a agitação começa. Cada um dos componentes do Grupo 1, exceto o L-Lactato de Sódio, está pe- sado. Cada componente, exceto o L-lactato de Sódio, é adicionado um a um ao recipiente de mistura, certificando de que cada componente esteja totalmente dissolvido antes de adicionar o próximo componente. Uma vez que todos os sólidos se dissolvam completamente, a agitação é parada. QS para uma massa de 1 kg com água desionizada. A mistura é esterilizada por filtração com um filtro de grau de esterilização de 0,2 μm. 500 mL de ácido L-Lactato de Sódio são esterilizados por autocla- vagem a 121°C durante 30 minutos. 10 mL da solução do Grupo 2 são adicionados ao grupo e misturados assepticamente. 8,3 mL de L-lactato de Sódio esterilizado são adicionados à mistura assepticamente. O meio é rotulado e transferido para a câmara anaeróbica coy. A tampa é solta e deixa-se desgaseificar durante a noite. Componentes do grupo 2 G por 1 L L-Cisteína-HCl 50 Cloreto de magnésio 50 Cloreto de manganês 10 Preparação do grupo 2:
[0383] Cerca de 700 mL são adicionados ao copo de 1 L e coloca- dos na placa quente e aquecidos a 50°C. Cada um dos componentes do Grupo 2 está pesado. Os componentes são adicionados um por um, certificando de que cada componente esteja totalmente dissolvido antes de adicionar o componente a seguinte. Depois que tudo estiver dissol- vido, usando um cilindro de vidro de 1L, QS para 1 L e esterilizar por filtração com filtro de 0,2 µm. Etiquetar com nome e data de preparação. O frasco médio é embrulhado em papel alumínio e transferido para uma câmara anaeróbica COY, deixar por, no máximo, 2 meses. Exemplo 29: EV de Veillonella Administradas por via Intravenosa inibem o crescimento tumoral de carcinoma colorretal
[0384] Camundongos tipo Balb/c fêmeas com 6 a 8 semanas de idade foram obtidos da Taconic (Germantown, NY). 100.000 células de tumor colorretal de CT-26 (ATCC CRL-2638) foram ressuspensas em PBS estéril e inoculadas na presença de 50% de Matrigel. As células tumorais CT-26 foram injetadas por via subcutânea em um flanco tra- seiro de cada camundongo. Quando os volumes de tumor alcançaram uma média de 100 mm3 (aproximadamente 10 a 12 dias após a inocu- lação de célula tumorais), os animais foram distribuídos nos seguintes grupos: 1) veículo; 2) anticorpo anti-PD-1; 3) EV da Cepa A de V. par- vula, 7,0e+10 partículas, 4) EV da Cepa A de V. atypica, 2,0e+11 partí- culas, 5) EV da Cepa A de V. atypica, 7,0e+10 partículas e 5) EV da
Cepa B de V. atypica, 1,5e+10 partículas. Os anticorpos foram adminis- trados por via intraperitoneal (i.p.) a 200 μg/camundongo (volume final de 100 μL) a cada quatro dias, começando no dia 1 (IP Q4Dx3), e as EV de Veillonella (7,0e+10, 2,0e+11 ou 1,5e+10 partículas) foram admi- nistradas por via intravenosa (IV) diariamente (IV Q3Dx4), começando no dia 1 até à conclusão do estudo. Os grupos de Veillonella mostraram inibição do crescimento tumoral comparável ou mais significativa à ob- servada no grupo anti-PD-1 (Figs. 14 e 15). As EV foram preparadas e quantificadas pelo Exemplo 27. Tingi- Dose (Contagem Dose (μg de Via, Crono- Grupo mento de de partículas) proteína) grama Tratamento Gram 1(n=10) Veículo (PBS) N.A. N.A. - IV Q3Dx4 2(n=10) Anti-PD-1 N.A. 200 μg - IP Q4Dx3 3(n=10) EEV V. parvula Cepa A 7,0e+10PC - 7,0E+10 partículas 1,41 IV Q3Dx4 (com menor prote- ína total) 4(n=8) EEV V. atypica Cepa A 2,0e+11PC - 2,0e+11 partículas 9,94 IV Q3Dx4 5(n=8) EEV V. atypica Cepa A 7,0e+10PC - 7,0E+10 partículas 3,48 IV Q3Dx4 6(n=10) EEV V. atypica Cepa B 1,5e+10PC - 1,5e+10 partículas 5,00 IV Q3Dx4 Incorporação a Título de Referência
[0385] Todas as publicações e pedidos de patente no presente do- cumento mencionados são incorporados no presente documento a título de referência na sua totalidade, como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse especifica e individualmente indicado como es- tando incorporado a título de referência. Em caso de conflito, prevale- cerá o presente pedido, incluindo quaisquer definições no presente do- cumento presentes. Equivalentes
[0386] Os peritos na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar usando não mais do que a experimentação de rotina, muitos equivalentes das modalidades específicas da invenção no presente do- cumento descritas. Tais equivalentes são destinados a serem abrangi- dos pelas reivindicações a seguir.

Claims (133)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para tratar uma doença em um sujeito, caracteri- zado pelo fato de que compreende a administração, ao sujeito, de uma composição bacteriana compreendendo uma bactéria Veillonella.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a bactéria é uma cepa compreendendo pelo menos 90% de identidade de sequência genômica, de 16S e/ou de CRISPR com a sequência nucleotídica de uma cepa bacteriana listada na Tabela
1.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a bactéria é uma cepa compreendendo pelo menos 99% de identidade de sequência genômica, de 16S e/ou de CRISPR com a sequência nucleotídica de uma cepa bacteriana listada na Tabela
1.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a bactéria é uma cepa bacteriana listada na Tabela 1.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição bacteriana compreende vesículas extra- celulares (EV) de Veillonella isoladas.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a composição bacteriana compreende vesículas extra- celulares (EV) de Veillonella e bactérias Veillonella.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que pelo menos cerca de, ou não mais do que, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%,
77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% do total de partículas de EV de Veillonella e de bactérias Veillonella na compo- sição farmacêutica são EV de Veillonella.
8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que pelo menos cerca de, ou não mais do que, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% do total de partículas de EV e de bactérias Veillonella na composição farmacêu- tica são bactérias Veillonella.
9. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que pelo menos cerca de, ou não mais do que, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% do total de proteína de EV de Veillonella e de bactérias Veillonella imunomodu- ladoras na composição farmacêutica é proteína de EV de Veillonella.
10. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que pelo menos cerca de, ou não mais do que, 1%, 2%,
3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% do total de proteína de EV de Veillonella e de bactérias Veillonella na composi- ção farmacêutica é proteína de bactérias Veillonella.
11. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que pelo menos cerca de, ou não mais do que, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% dos lipídios de EV e de bactérias Veillonella na composição farmacêutica são lipídios de EV de Veillonella.
12. Método, de acordo com a reivindicação 6, a composição bacteriana da reivindicação 103, caracterizado pelo fato de que pelo menos cerca de, ou não mais do que, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%,
69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% do total de lipídios de EV de Veillonella e de bactérias Veillonella na composição farmacêutica são lipídios de bactérias Veillonella.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição bacteriana compreende bactérias Veillo- nella isoladas de EV.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a doença é um distúrbio imunoló- gico.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o distúrbio imunológico é selecionado de uma reação alérgica, uma doença inflamatória, doença inflamatória intestinal, do- ença de Crohn, colite ulcerativa, hipersensibilidade do tipo retardado, miocardite autoimune, granulomas, neuropatias periféricas, tireoidite de Hashimoto, inflamação do cólon, colite, colite microscópica, colite cola- genosa, colite por derivação, colite química, colite isquêmica, colite in- determinada, colite atípica, esclerose múltipla, doença de Hashimoto, uma doença alérgica, uma alergia alimentar, polenose, asma, uma do- ença infecciosa, uma infeção com Clostridium difficile, uma doença in- flamatória, uma doença inflamatória mediada por TNF, uma doença in- flamatória do trato gastrointestinal, pouchite, uma condição inflamatória cardiovascular, aterosclerose, uma doença inflamatória pulmonar, do- ença pulmonar obstrutiva crônica, artrite, osteoartrite, artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite anquilosante, artrite infecciosa aguda e crô- nica, artrite associada à gota e pseudogota, artrite idiopática juvenil, ten- dinite, sinovite, tenossinovite, bursite, fibrosite, fibromialgia, epicondilite, miosite e osteíte, doença de Paget, osteíte pubiana, osteíte fibrosa cís-
tica, distúrbios imunológicos oculares, blefarite, blefarocalase, conjunti- vite, dacrioadenite, queratite, ceratoconjuntivite sicca (olho seco), escle- rite, triciquíase, uveíte, sistema nervoso imunológico, encefalite, sín- drome de Guillain-Barre, meningite, neuromiotonia, narcolepsia, escle- rose múltipla, mielite, esquizofrenia, inflamação da vasculatura ou sis- tema linfático, arteriosclerose, artrite, flebite, vasculite, linfangite, distúr- bios imunológicos do sistema digestivo, colangite, colecistite, enterite, enterocolite, gastrite, gastroenterite, ileíte, proctite, síndrome do intes- tino irritável, colite microscópica, enterite linfocítico-plasmocítica, do- ença celíaca, colite colagenosa, colite linfocítica, enterocolite eosinofí- lica, colite indeterminada, colite pseudomembranosa (colite necro- sante), doença inflamatória intestinal isquêmica, doença de Behcet, sar- coidose, esclerodermia, displasia associada a IBD, massas ou lesões associadas a displasia, colangite esclerosante primária, distúrbios imu- nológicos do sistema reprodutor, cervicite, corioamnionite, endometrite, epididimite, onfalite, ooforite, orquite, salpingite, abscesso ovariano, ure- trite, vaginite, vulvite, vulvodínia, condições autoimunes, alopecia disse- minada aguda universal, doença de Behcet, doença de Chagas, sín- drome de fadiga crônica, disautonomia, encefalomielite, espondilite an- quilosante, anemia aplástica, hidradenite supurativa, hepatite autoi- mune, ooforite autoimune, doença celíaca, diabetes mellitus tipo 1, ar- terite de células gigantes, síndrome de Goodpasture, doença de Grave, síndrome de Guillain-Barre, púrpura de Henoch-Schonlein, Doença de Kawasaki, lúpus eritematoso, colite microscópica, poliarterite microscó- pica, doença mista do tecido conjuntivo, síndrome de Muckle-Wells, es- clerose múltipla, miastenia grave, síndrome de opsoclonus-mioclonus, neurite óptica, tireoidite de Ord, pênfigo, poliarterite nodosa, polimialgia, síndrome reumatoide, artrite reumatoide, síndrome de Reiter, síndrome de Sjogren, arterite temporal, granulomatose de Wegener, anemia he-
molítica autoimune tipo quente, cistite intersticial, doença de Lyme, mor- feia, psoríase, sarcoidose, esclerodermia, colite ulcerosa, vitiligo, doen- ças de hipersensibilidade mediada por células T, hipersensibilidade de contato, dermatite de contato, urticária, alergias de pele, alergias respi- ratórias, febre do feno, rinite alérgica, alergia a ácaros residenciais, en- teropatia sensível ao glúten, doença celíaca, apendicite, dermatite, der- matomiosite, endocardite, fibrosite, gengivite, glossite, hepatite, hidra- denite supurativa, irite, laringite, mastite, miocardite, nefrite, otite, pan- creatite, parotite, pericardite, peritonoite, faringite, pleurite, pneumonite, prostatite, pielonefrite, estomatismo, rejeição de transplante, pancreatite aguda, pancreatite crônica, síndrome do desconforto respiratório agudo, síndrome de Sexary, hiperplasia adrenal congênita, tireoidite não supu- rativa, hipercalcemia associada a câncer, pênfigo, dermatite bolhosa herpetiforme, eritema multiforme grave, dermatite esfoliativa, dermatite seborreica, rinite alérgica sazonal ou perene, asma brônquica, dermatite de contato, dermatite atópica, reações de hipersensibilidade a fárma- cos, conjuntivite alérgica, queratite, herpes zoster oftálmico, irite e oiri- dociclite, coriorretinite, neurite óptica, sarcoidose sintomática, quimiote- rapia em tuberculose pulmonar fulminante ou disseminada, púrpura trombocitopenica idiopática em adultos, trombocitopenia secundária em adultos, anemia hemolítica adquirida (autoimune), leucemia e linfomas em adultos, leucemia aguda da infância, enterite regional, vasculite au- toimune, esclerose múltipla, doença pulmonar obstrutiva crônica, rejei- ção de transplante de órgãos sólidos, sepse, artrite reumatoide, artrite psoriática, esclerose múltipla, diabetes tipo 1, asma, doença inflamató- ria do intestino, lúpus eritematoso sistêmico, psoríase, doença pulmonar obstrutiva crônica, inflamação que acompanha condições infecciosas e sepse.
16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o distúrbio imunológico é hipersensibilidade do tipo re- tardado, dermatite alérgica de contato, miocardite autoimune, diabetes mellitus tipo 1, granulomas, neuropatias periféricas, tireoidite de Hashi- moto, esclerose múltipla, artrite reumatoide, inflamação do cólon, colite, colite ulcerativa, colite microscópica, colite colagenosa, colite por deri- vação, colite química, colite isquêmica, colite indeterminada, colite atí- pica, doenças digestivas, doença de Crohn ou doença inflamatória in- testinal.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a doença é câncer.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo consistindo em malig- nidade hematológica, leucemia não linfocítica aguda, leucemia linfocí- tica crônica, leucemia granulócita aguda, leucemia granulócita crônica, leucemia pró-mielocítica aguda, leucemia de célula T adulta, leucemia aleucêmica, uma leucemia leucocitêmica, leucemia basofílica, leucemia de blastócitos, leucemia bovina, leucemia mielocítica crônica, leucemia cutânea, leucemia embrionária, leucemia eosinofílica, leucemia de Gross, leucemia de célula de Rieder, leucemia de Schilling, leucemia de células estaminais, leucemia subleucêmica, leucemia de célula não di- ferenciada, leucemia de célula pilosa, leucemia hemoblástica, leucemia hemocitoblástica, leucemia histiocítica, leucemia de células estaminais, leucemia monocítica aguda, leucemia leucopênica, leucemia linfática, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, leucemia linfogênica, leuce- mia linfoide, leucemia de célula de linfossarcoma, leucemia de mastó- cito, leucemia megacariocítica, leucemia micromieloblástica, leucemia monocítica, leucemia mieloblástica, leucemia mielocítica, leucemia gra- nulocítica mieloide, leucemia mielomonocítica, leucemia de Naegeli, leucemia de célula plasmática, leucemia plasmocítica, leucemia pró-mi-
elocítica, carcinoma acinar, carcinoma acinoso, carcinoma adenocís- tico, carcinoma cístico adenoide, carcinoma adenomatoso, carcinoma do córtex adrenal, carcinoma alveolar, carcinoma de célula alveolar, car- cinoma de célula basal, carcinoma basocelular, carcinoma basaloide, carcinoma de célula basoescamosa, carcinoma bronquioalveolar, carci- noma bronquiolar, carcinoma broncogênico, carcinoma cerebriforme, carcinoma colangiocelular, carcinoma coriônico, carcinoma coloide, co- medocarcinoma, carcinoma do corpo, carcinoma cribriforme, carcinoma en cuirasse, carcinoma cutâneo, carcinoma cilíndrico, carcinoma de cé- lula cilíndrica, carcinoma do duto, carcinoma duro, carcinoma embrioná- rio, carcinoma encefaloide, carcinoma epienoide, carcinomas epiteliais adenoides, carcinoma exofítico, carcinoma ex úlcera, carcinoma fibroso, carcinoma gelatiniforme, carcinoma gelatinoso, carcinoma de célula gi- gante, carcinoma de células em anel de sinete, carcinoma simples, car- cinoma de célula pequena, carcinoma solanoide, carcinoma de célula esferoide, carcinoma de célula fusiforme, carcinoma espongioso, carci- noma escamoso, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de corda, carcinoma telangiectásico, telangiectódios de carcinoma, carcinoma de célula transicional, carcinoma tuberosum, carcinoma tuberoso, carci- noma verrucoso, carcinoma viloso, carcinoma gigantocelular, carcinoma glandular, carcinoma de célula granulosa, carcinoma da matriz capilar, carcinoma hematoide, carcinoma hepatocelular, carcinoma de célula de Hurthle, carcinoma hialina, carcinoma hipernefroide, carcinoma embrio- nário infantil, carcinoma in situ, carcinoma intraepidérmico, carcinoma intraepitelial, carcinoma de Krompecher, carcinoma de célula de Kul- chitzky, carcinoma de célula grande, carcinoma lenticular, carcinoma lenticular, carcinoma lipomatoso, carcinoma linfoepitelial, carcinoma medular, carcinoma medular, carcinoma melanótico, carcinoma mole, carcinoma mucinoso, carcinoma muciparum, carcinoma mucocelular, carcinoma mucoepidermoide, carcinoma mucoso, carcinoma mucoso,
carcinoma mixomatoso, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de células tipo grão de aveia, carcinoma ossificante, carcinoma osteoide, carci- noma papilar, carcinoma periportal, carcinoma pré-invasivo, carcinoma de célula espinhosa, carcinoma pultáceo, carcinoma de células renais dos rins, carcinoma de células de reserva, carcinoma sarcomatoso, car- cinoma schneideriano, carcinoma cirrótico, carcinoma escrotal, con- drossarcoma, fibrossarcoma, linfossarcoma, melanossarcoma, mixos- sarcoma, osteossarcoma, sarcoma endometrial, sarcoma estromal, sar- coma de Ewing, sarcoma da fáscia, sarcoma fibroblástico, sarcoma de célula gigante, sarcoma de Abemethy, sarcoma adiposo, lipossarcoma, sarcoma da parte mole alveolar, sarcoma ameloblástico, sarcoma botri- oide, sarcoma cloroma, coriocarcinoma, sarcoma embrionário, sarcoma de tumor de Wilms, sarcoma granulócito, sarcoma de Hodgkin, sarcoma hemorrágico pigmentado múltiplo idiopático, sarcoma imunoblástico de células B, linfoma, sarcoma imunoblástico de células T, sarcoma de Jen- sen, sarcoma de Kaposi, sarcoma de célula de Kupffer, angiossarcoma, leucossarcoma, sarcoma mesenquimoma maligno, sarcoma parosteal, sarcoma reticulócito, sarcoma de Rous, sarcoma serocístico, sarcoma sinovial, sarcoma telangiectáltico, doença de Hodgkin, linfoma não Ho- dgkin, mieloma múltiplo, neuroblastoma, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pulmão, rabdomiossarcoma, trombocitose primária, macroglobulinemia primária, tumores de pulmão de células pequenas, tumores cerebrais primários, câncer de estômago, câncer de cólon, in- sulanoma pancreático maligno, carcinoide maligno, lesões de pele pré- malignas, câncer testicular, linfomas, câncer da tireoide, neuroblastoma, câncer esofágico, câncer do trato genitourinário, hipercalcemia maligna, câncer cervical, câncer endometrial, câncer adrenal cortical, melanoma de Harding-Passey, melanoma juvenil, melanoma lentigo maligno, me- lanoma maligno, melanoma acral-lentiginoso, melanoma amelanótico, melanoma juvenil benigno, melanoma de Cloudman, melanoma S91,
melanoma nodular, melanoma subungueal e melanoma de espalha- mento superficial.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a composição bacteriana é administrada por via oral, retal, intravenosa, intratumoral ou subcutânea.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 6 a 19, caracterizado pelo fato de que pelo menos 50% das bactérias na composição bacteriana são uma cepa bacteriana listada na Tabela 1.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 6 a 19, caracterizado pelo fato de que pelo menos 90% das bactérias na composição bacteriana são uma cepa bacteriana listada na Tabela 1.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 6 a 19, caracterizado pelo fato de que substancialmente todas as bactérias na composição bacteriana são uma cepa bacteriana listada na Tabela 1.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 6 a 22, caracterizado pelo fato de que a composição bacteriana compreende pelo menos 1 x 106 unidades formadoras de colônias (UFC) de uma cepa bacteriana listada na Tabela 1.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a composição bacteriana compreende pelo menos 1 x 107 UFC de uma cepa bacteriana listada na Tabela 1.
25. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a composição bacteriana compreende pelo menos 1 x 108 UFC de uma cepa bacteriana listada na Tabela 1.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que a composição bacteriana é admi- nistrada em duas ou mais doses.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a administração ao sujeito das duas ou mais doses é separada por pelo menos 1 dia.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a administração das duas ou mais doses é separada por pelo menos 1 semana.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 6 a 28, caracterizado pelo fato de que a composição bacteriana compreende bactérias vivas.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 6 a 28, caracterizado pelo fato de que a composição bacteriana compreende bactérias atenuadas.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 6 a 30, caracterizado pelo fato de que a composição bacteriana compreende bactérias mortas.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a composição bacteriana compreende bactérias irradi- adas.
33. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a composição bacteriana compreende bactérias sub- metidas a irradiação gama.
34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que a bactéria Veillonella é resistente à polimixina.
35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a polimixina é polimixina B ou colistina.
36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, caracterizado pelo fato de que a bactéria Veillonella compreende mutantes de LPS.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o mutante de LPS é uma mutação ou disrupção em um gene envolvido na biossíntese de lipídio A.
38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o gene é lpxA, lpxC ou lpxD.
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 e 19 a 38, caracterizado pelo fato de que a administração da composição bacteriana trata o distúrbio imunológico.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 e 19 a 40, caracterizado pelo fato de que administração da com- posição bacteriana induz uma resposta imunológica.
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a administração de um terapêutico adicional ao sujeito.
42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o terapêutico adicional é selecionado do grupo consis- tindo em um agente imunossupressor, um DMARD, um fármaco de con- trole de dor, um esteroide, um fármaco anti-inflamatório não esteroide (NSAID), um antagonista de citocina, ciclosporina, retinoides, corticos- teroides, derivado de ácido propiônico, derivado de ácido acético, deri- vados de ácido enólico, derivados de ácido fenâmico, inibidores de Cox- 2, lumiracoxibe, ibuprofeno, magnésio salicilato de colina, fenoprofeno, salsalato, difunisal, tolmetina, cetoprofeno, flurbiprofeno, oxaprozina, in- dometacina, sulindac, etodolac, cetorolac, nabumetona, naproxeno, val- decoxibe, etoricoxibe, MK0966; rofecoxibe, acetominofeno, celecoxibe, diclofenaco, tramadol, piroxicam, meloxicam, tenoxicam, droxicam, lor- noxicam, isoxicam, ácido mefenâmico, ácido meclofenâmico, ácido flu- fenâmico, tolfenâmico, valdecoxibe, parecoxibe, etodolac, indometa- cina, aspirina, ibuprofeno, firocoxibe, metotrexato (MTX), fármacos an- timaláricos, hidroxicloroquina, cloroquina, sulfassalazina, leflunomida, azatioprina, ciclosporina, sais de ouro, minociclina, ciclofosfamida, D-
penicilamina, minociclina, auranofina, tacrolimos, miocrisina, clorambu- cila, antagonistas de TNF alfa, antagonistas de TNF alfa, antagonistas do receptor de TNF alfa, ADALIMUMABE (Humira®), ETANERCEPT (Enbrel®), INFLIXIMABE (Remicade®; TA-650), CERTOLIZUMABE PEGOL (Cimzia®; CDP870), GOLIMUMABE (Simpom®; CNTO 148), ANAKINRA (Kineret®), RITUXIMABE (Rituxan®; MabThera®), ABATA- CEPT (Orencia®), TOCILIZUMABE (RoActemra /Actemra®), antago- nistas de integrina, TYSABRI® (natalizumabe), antagonistas de IL-1, ACZ885 (Ilaris), Anakinra (Kineret®), antagonistas de CD4, antagonis- tas de IL-23, antagonistas de IL-20, antagonistas de IL-6, antagonistas de BLyS, Atacicept, Benlysta®/ LymphoStat-B® (belimumabe), inibido- res de p38, antagonistas de CD20, Ocrelizumabe, Ofatumumabe (Ar- zerra®), antagonistas de interferon gama, Fontolizumabe, prednisolona, Prednisona, dexametasona, Cortisol, cortisona, hidrocortisona, metil- prednisolona, betametasona, triancinolona, beclometasoma, fludrocorti- sona, desoxicorticosterona, aldosterona, Doxiciclina, vancomicina, pio- glitazona, SBI-087, SCIO-469, Cura-100, Oncoxina + Viusida, TwHF, Metoxsaleno, Vitamina D - ergocalciferol, Milnaciprano, Paclitaxel, rosig tazona, Tacrolimus, Prograf®, RADOOl, rapamune, rapamicina, fosta- matinibe, Fentanila, XOMA 052, Fostamatinibe dissódico, rosigtazona, Curcumina, Longvida™, Rosuvastatina, Maraviroc, ramipnl, Milnaci- prano, Cobiprostona, somatropina, vetor de terapia do gene tgAAC94, MK0359, GW856553, esomeprazol, everolimus, trastuzumabe, inibido- res de JAKl e JAK2, inibidores de pan JAK, por exemplo, piridona tetra- cíclica 6 (P6), 325, PF-956980, denosumabe, antagonistas de IL-6, an- tagonistas de CD20, antagonistas de CTLA4, antagonistas de IL-8, an- tagonistas de IL-21, antagonistas de IL-22, antagonistas de integrina, Tysarbri® (natalizumabe), antagonistas de VGEF, antagonistas de CXCL, antagonistas de MMP, antagonistas de defensina, antagonistas de IL-1, antagonistas de IL-1 beta, antagonistas de IL-23, engodo de receptores, anticorpos antagonísticos, corticosteroides, mesalazina, mesalamina, sulfasalazina, derivados de sulfasalazina, fármacos imu- nossupressores, ciclosporina A, mercaptopurina, azatiopurina, predni- sona, metotrexato, anti-histamínicos, glicocorticoides, epinefrina, teofi- lina, cromolina sódica, antileucotrienos, fármacos anticolinérgicos para rinite, antagonistas de TLR, inibidores do inflamassoma, descongestio- nantes anticolinérgicos, estabilizantes de mastócitos, anticorpos mono- clonais anti-IgE, vacinas, inibidores de citocinas, anticorpos anti-IL-6, inibidores de TNF, infliximabe, adalimumabe, certolizumabe pegol, go- limumabe e etanercept.
43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, caracterizado pelo fato de que o terapêutico adicional é um antibiótico.
44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o antibiótico é selecionado do grupo consistindo em aminoglicosídeos, ansamicinas, carbacefemas, carbapenemas, cefa- losporinas, glicopeptídeos, lincosamidas, lipopeptídeos, macrólidos, monobactamas, nitrofuranos, oxazolidononas, penicilinas, antibióticos polipeptídicos, quinolonas, fluoroquinolona, sulfonamidas, tetraciclinas, compostos antimicobacterianos e combinações destes.
45. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o terapêutico adicional é um terapêutico contra câncer.
46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o terapêutico contra câncer compreende um agente quimioterápico.
47. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o agente quimioterápico é selecionado do grupo con- sistindo em tiotepa, ciclofosfamida, bussulfano, improssulfano, pipossul- fano, benzodopa, carboquona, meturedopa, uredopa, altretamina, trieti-
lenomelamina, trietilenofosforamida, trietiilenotiofosforamida, trimetilolo- melamina, bulatacina, bulatacinona, camptotecina, topotecano, briosta- tina, calistatina, CC-1065, criptoficina 1, criptoficina 8, dolastatina, duo- carmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictiina, espongistatina, clorambucila, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, me- cloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembi- quina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimnus- tina, caliqueamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina; cromóforo de neocarzinostatina, aclacinomisinas, actinomicina, autrarnicina, aza- serina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofi- lina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6- diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicina, mitomicina C, ácido micofenó- lico, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina, metotrexato, 5-fluorouracila (5-FU), denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mer- captopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauri- dina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona, aminoglutetimida, mitotano, trilostano, ácido frolínico, aceglatona, aldofosfamida glicosídeo, ácido aminolevulínico, eniluracila, amsacrina, bestrabucila, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diaziquona, elformitina, acetato de eliptínio, epotilona, eto- glucid, nitrato de gálio, hidroxiureia, lentinano, lonidainina, maitansina, ansamitocinas, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarrubicina, losoxantrona, ácido podofilínico, 2- etil-hidrazida, procarbazina, complexo de polissacarídeo PSK, ra-
zoxana, rizoxina, sizofurano, espirogermânio, ácido tenuazônico, triazi- quona; 2,2',2''-triclorotrietilamina, tricoteceno, toxina T-2, verracurina A, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina, manomustina, mitobronitol, mitolactol, pipobromano, gacitosina, arabinosídeo, ciclofos- famida, tiotepa, paclitaxel, doxetaxel, clorambucil, gencitabina, 6-tiogua- nina, mercaptopurina, metotrexato, cisplatina, oxaliplatina, carboplatina, vinblastina, platina, etoposídeo, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vi- norelbina, novantrona, teniposídeo, edatrexato, daunomicina, aminop- terina, xeloda, ibandronato, irinotecano, RFS 2000, difluorometilomitina, ácido retinoico e capecitabina.
48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 47, caracterizado pelo fato de que o terapêutico contra câncer com- preende um agente de imunoterapia contra câncer.
49. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o agente de imunoterapia contra câncer compreende um inibidor de ponto de controle imunológico.
50. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o inibidor de ponto de controle imunológico é um anti- corpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especifica- mente a uma proteína de ponto de controle imunológico.
51. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a proteína de ponto de controle imunológico é selecio- nada do grupo consistindo em CTLA4, PD-1, PD-L1, PD-L2, A2AR, B7- H3, B7-H4, BTLA, KIR, LAG3, TIM-3 ou VISTA.
52. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o inibidor de ponto de controle imunológico é selecio- nado do grupo consistindo em nivolumabe, pembrolizumabe, pidilizu- mabe, AMP-224, AMP-514, STI-A1110, TSR-042, RG-7446, BMS- 936559, MEDI-4736, MSB-0020718C, AUR-012 e STI-A1010.
53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações
48 a 52, caracterizado pelo fato de que o agente de imunoterapia contra câncer compreende um anticorpo específico para câncer ou seu frag- mento de ligação ao antígeno.
54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o anticorpo específico para câncer, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, se liga a um antígeno associado a câncer.
55. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o antígeno associado ao câncer é selecionado do grupo consistindo em adipofilina, AIM-2, ALDH1A1, alfa-actinina-4, alfa-feto- proteína (“AFP”), ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX (L), proteína de fusão BCR-ABL b3a2, beta-catenina, BING-4, CA-125, CALCA, antígeno car- cinoembrionário (“CEA”), CASP-5, CASP-8, CD274, CD45, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, ciclina D1, Ciclina-A1, proteína de fusão dek-can, DKK1, EFTUD2, fator de alongamento 2, ENAH (hMena), Ep-CAM, EpCAM, EphA3, antígeno de tumor epitelial (“ETA”), proteína de fusão ETV6-AML1, EZH2, FGF5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIX, GAGE- 1,2,8, GAGE-3,4,5,6,7, GAS7, glipicano-3, GnTV, gp100/Pmel17, GPNMB, HAUS3, Hepsina, HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA- A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13Ralfa2, esterase carboxí- lica intestinal, K-ras, calicreína 4, KIF20A, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, KMHN1 também conhecido como CCDC110, LAGE-1, proteína de fu- são LDLR-fucosiltransferase AS, Lengsina, M-CSF, MAGE-A1, MAGE- A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE- A9, MAGE-C1, MAGE-C2, enzima málica, mamaglobina-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, Melan-A/MART-1, Meloe, Mid- quina, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, mucina, MUM-1, MUM-2, MUM-3, Miosina, Miosina de classe I, N-raw, NA88-A, neo-PAP, NFYC, NY-BR-1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, polipeptídeo P, p53,
PAP, PAX5, PBF, proteína de fusão pml-RARalfa, mucina epitelial poli- mórfica (“PEM”), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1, RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, SAGE, secernina 1, SIRT2, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP1, survivina, proteína de fusão SYT-SSX1 ou SYT-SSX2, TAG-1, TAG-2, Telomerase, TGF-betaRII, TPBG, TRAG-3, Triosefos- fato isomerase, TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, tirosinase, tirosinase (“TYR”), VEGF, WT1 e XAGE-1b/GAGED2a.
56. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o antígeno associado a câncer é um neoantígeno.
57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 56, caracterizado pelo fato de que o agente de imunoterapia contra câncer compreende uma vacina contra câncer.
58. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a vacina contra câncer compreende um polipeptídeo compreendendo um epitopo de um antígeno associado a câncer.
59. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o antígeno associado ao câncer é selecionado dentre o grupo consistindo em adipofilina, AIM-2, ALDH1A1, alfa-actinina-4, alfa-fetoproteína (“AFP”), ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX (L), proteína de fusão BCR-ABL b3a2, beta-catenina, BING-4, CA-125, CALCA, an- tígeno carcinoembrionário (“CEA”), CASP-5, CASP-8, CD274, CD45, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, ciclina D1, Ciclina-A1, proteína de fusão dek-can, DKK1, EFTUD2, fator de alongamento 2, ENAH (hMena), Ep- CAM, EpCAM, EphA3, antígeno de tumor epitelial (“ETA”), proteína de fusão ETV6-AML1, EZH2, FGF5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIX, GAGE-1,2,8, GAGE-3,4,5,6,7, GAS7, glipicano-3, GnTV, gp100/Pmel17, GPNMB, HAUS3, Hepsina, HER-2/neu, HERV-K-MEL,
HLA-A11, HLA-A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13Ralfa2, es- terase carboxílica intestinal, K-ras, calicreína 4, KIF20A, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, KMHN1 também conhecido como CCDC110, LAGE- 1, proteína de fusão LDLR-fucosiltransferase AS, Lengsina, M-CSF, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-C1, MAGE-C2, enzima málica, mamaglo- bina-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, Melan-A/MART-1, Meloe, Midquina, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, mucina, MUM-1, MUM-2, MUM-3, Miosina, Miosina de classe I, N-raw, NA88-A, neo- PAP, NFYC, NY-BR-1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, polipeptí- deo P, p53, PAP, PAX5, PBF, proteína de fusão pml-RARalfa, mucina epitelial polimórfica (“PEM”), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1, RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, SAGE, secernina 1, SIRT2, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP1, survivina, proteína de fusão SYT-SSX1 ou SYT-SSX2, TAG-1, TAG-2, Telomerase, TGF-betaRII, TPBG, TRAG-3, Triosefosfato isomerase, TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, tirosinase, ti- rosinase (“TYR”), VEGF, WT1 e XAGE-1b/GAGED2a.
60. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o antígeno associado a câncer é um neoantígeno.
61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 60, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é uma proteína de fusão.
62. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a vacina contra câncer compreende um ácido nucleico que codifica um epitopo de um antígeno associado a câncer.
63. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o antígeno associado ao câncer é selecionado dentre o grupo consistindo em adipofilina, AIM-2, ALDH1A1, alfa-actinina-4, alfa-fetoproteína (“AFP”), ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX (L), proteína de fusão BCR-ABL b3a2, beta-catenina, BING-4, CA-125, CALCA, an- tígeno carcinoembrionário (“CEA”), CASP-5, CASP-8, CD274, CD45, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, ciclina D1, Ciclina-A1, proteína de fusão dek-can, DKK1, EFTUD2, fator de alongamento 2, ENAH (hMena), Ep- CAM, EpCAM, EphA3, antígeno de tumor epitelial (“ETA”), proteína de fusão ETV6-AML1, EZH2, FGF5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIX, GAGE-1,2,8, GAGE-3,4,5,6,7, GAS7, glipicano-3, GnTV, gp100/Pmel17, GPNMB, HAUS3, Hepsina, HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA-A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13Ralfa2, es- terase carboxílica intestinal, K-ras, calicreína 4, KIF20A, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, KMHN1 também conhecido como CCDC110, LAGE- 1, proteína de fusão LDLR-fucosiltransferase AS, Lengsina, M-CSF, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-C1, MAGE-C2, enzima málica, mamaglo- bina-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, Melan-A/MART-1, Meloe, Midquina, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, mucina, MUM-1, MUM-2, MUM-3, Miosina, Miosina de classe I, N-raw, NA88-A, neo- PAP, NFYC, NY-BR-1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, polipeptí- deo P, p53, PAP, PAX5, PBF, proteína de fusão pml-RARalfa, mucina epitelial polimórfica (“PEM”), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1, RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, SAGE, secernina 1, SIRT2, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP1, survivina, proteína de fusão SYT-SSX1 ou SYT-SSX2, TAG-1, TAG-2, Telomerase, TGF-betaRII, TPBG, TRAG-3, Triosefosfato isomerase, TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, tirosinase, ti- rosinase (“TYR”), VEGF, WT1 e XAGE-1b/GAGED2a.
64. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o antígeno associado a câncer é um neoantígeno.
65. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações
62 a 64, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é DNA.
66. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 64, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é RNA.
67. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o RNA é mRNA.
68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 65 a 67, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico está em um vetor.
69. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor bacteriano.
70. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o vetor bacteriano é selecionado do grupo consistindo em Mycobacterium bovis (BCG), Salmonella Typhimurium ssp., Salmo- nella Typhi ssp., esporos de Clostridium sp., Escherichia coli Nissle 1917, Escherichia coli K-12/LLO, Listeria monocytogenes e Shigella fle- xneri.
71. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor viral.
72. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é selecionado do grupo consistindo em vaccinia, adenovírus, vírus de RNA e avipox com deficiência de replica- ção, bouba aviária com deficiência de replicação, varíola de canário com deficiência de replicação, MVA com deficiência de replicação e adeno- vírus com deficiência de replicação.
73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 72, caracterizado pelo fato de que o agente de imunoterapia com- preende uma célula apresentadora de antígeno (APC) iniciada com um antígeno específico para câncer.
74. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que a APC é uma célula dendrítica, um macrófago ou uma célula B.
75. Método, de acordo com a reivindicação 73 ou 74, carac- terizado pelo fato de que o antígeno associado a câncer é selecionado do grupo consistindo em adipofilina, AIM-2, ALDH1A1, alfa-actinina-4, alfa-fetoproteína (“AFP”), ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX (L), proteína de fusão de BCR-ABL b3a2, beta-catenina, BING-4, CA-125, CALCA, antígeno carcinoembrionário (“CEA”), CASP-5, CASP-8, CD274, CD45, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, ciclina D1, Ciclina-A1, proteína de fusão dek-can, DKK1, EFTUD2, Fator de alongamento 2, ENAH (hMena), Ep- CAM, EpCAM, EphA3, antígeno de tumor epitelial (“ETA”), proteína de fusão ETV6-AML1, EZH2, FGF5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIX, GAGE-1,2,8, GAGE-3,4,5,6,7, GAS7, glipicano-3, GnTV, gp100/Pmel17, GPNMB, HAUS3, Hepsina, HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA-A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13Ralfa2, es- terase carboxílica intestinal, K-ras, Calicreína 4, KIF20A, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, KMHN1 também conhecido como CCDC110, LAGE- 1, proteína de fusão LDLR-fucosiltransferase AS, Lengsina, M-CSF, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-C1, MAGE-C2, enzima málica, mamaglo- bina-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, Melan-A/MART-1, Meloe, Midkina, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, mucina, MUM-1, MUM-2, MUM-3, Miosina, Miosina classe I, N-raw, NA88-A, neo-PAP, NFYC, NY-BR-1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, polipeptídeo P, p53, PAP, PAX5, PBF, proteína de fusão pml-RARalfa, mucina epitelial polimórfica ("PEM"), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1, RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, SAGE, secernina 1, SIRT2, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP1, survivina, proteína de fusão SYT-SSX1 ou SYT-SSX2,
TAG-1, TAG-2, Telomerase, TGF-betaRII, TPBG, TRAG-3, Triosefos- fato isomerase, TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, tirosinase, tirosinase (“TYR”), VEGF, WT1 e XAGE-1b/GAGED2a.
76. Método, de acordo com a reivindicação 73 ou 74, carac- terizado pelo fato de que o antígeno associado a câncer é um neoantí- geno.
77. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 76, caracterizado pelo fato de que o agente de imunoterapia com- preende um receptor de antígeno quimérico específico para câncer (CAR).
78. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo fato de que o CAR é administrado na superfície de uma célula T.
79. Método, de acordo com a reivindicação 77 ou 78, carac- terizado pelo fato de que o CAR se liga especificamente a um antígeno associado a câncer.
80. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que o antígeno associado ao câncer é selecionado dentre o grupo consistindo em adipofilina, AIM-2, ALDH1A1, alfa-actinina-4, alfa-fetoproteína (“AFP”), ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX (L), proteína de fusão BCR-ABL b3a2, beta-catenina, BING-4, CA-125, CALCA, an- tígeno carcinoembrionário (“CEA”), CASP-5, CASP-8, CD274, CD45, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, ciclina D1, Ciclina-A1, proteína de fusão dek-can, DKK1, EFTUD2, fator de alongamento 2, ENAH (hMena), Ep- CAM, EpCAM, EphA3, antígeno de tumor epitelial (“ETA”), proteína de fusão ETV6-AML1, EZH2, FGF5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIX, GAGE-1,2,8, GAGE-3,4,5,6,7, GAS7, glipicano-3, GnTV, gp100/Pmel17, GPNMB, HAUS3, Hepsina, HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA-A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13Ralfa2, es- terase carboxílica intestinal, K-ras, calicreína 4, KIF20A, KK-LC-1,
KKLC1, KM-HN-1, KMHN1 também conhecido como CCDC110, LAGE- 1, proteína de fusão LDLR-fucosiltransferase AS, Lengsina, M-CSF, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-C1, MAGE-C2, enzima málica, mamaglo- bina-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, Melan-A/MART-1, Meloe, Midquina, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, mucina, MUM-1, MUM-2, MUM-3, Miosina, Miosina de classe I, N-raw, NA88-A, neo- PAP, NFYC, NY-BR-1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, polipeptí- deo P, p53, PAP, PAX5, PBF, proteína de fusão pml-RARalfa, mucina epitelial polimórfica (“PEM”), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1, RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, SAGE, secernina 1, SIRT2, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP1, survivina, proteína de fusão SYT-SSX1 ou SYT-SSX2, TAG-1, TAG-2, Telomerase, TGF-betaRII, TPBG, TRAG-3, Triosefosfato isomerase, TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, tirosinase, ti- rosinase (“TYR”), VEGF, WT1 e XAGE-1b/GAGED2a.
81. Método, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que o antígeno associado a câncer é um neoantígeno.
82. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 81, caracterizado pelo fato de que o agente de imunoterapia com- preende uma célula T específica para câncer.
83. Método, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que a célula T é uma célula T CD4+.
84. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que a célula T CD4+ é uma célula T TH1, uma célula T TH2 ou uma célula T TH17.
85. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 82 a 84, caracterizado pelo fato de que a célula T expressa um receptor de célula T específico para um antígeno associado a câncer.
86. Método, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que o antígeno associado ao câncer é selecionado dentre o grupo consistindo em adipofilina, AIM-2, ALDH1A1, alfa-actinina-4, alfa-fetoproteína (“AFP”), ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX (L), proteína de fusão BCR-ABL b3a2, beta-catenina, BING-4, CA-125, CALCA, an- tígeno carcinoembrionário (“CEA”), CASP-5, CASP-8, CD274, CD45, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, ciclina D1, Ciclina-A1, proteína de fusão dek-can, DKK1, EFTUD2, fator de alongamento 2, ENAH (hMena), Ep- CAM, EpCAM, EphA3, antígeno de tumor epitelial (“ETA”), proteína de fusão ETV6-AML1, EZH2, FGF5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIX, GAGE-1,2,8, GAGE-3,4,5,6,7, GAS7, glipicano-3, GnTV, gp100/Pmel17, GPNMB, HAUS3, Hepsina, HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA-A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13Ralfa2, es- terase carboxílica intestinal, K-ras, calicreína 4, KIF20A, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, KMHN1 também conhecido como CCDC110, LAGE- 1, proteína de fusão LDLR-fucosiltransferase AS, Lengsina, M-CSF, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-C1, MAGE-C2, enzima málica, mamaglo- bina-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, Melan-A/MART-1, Meloe, Midquina, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, mucina, MUM-1, MUM-2, MUM-3, Miosina, Miosina de classe I, N-raw, NA88-A, neo- PAP, NFYC, NY-BR-1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, polipeptí- deo P, p53, PAP, PAX5, PBF, proteína de fusão pml-RARalfa, mucina epitelial polimórfica (“PEM”), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1, RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, SAGE, secernina 1, SIRT2, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP1, survivina, proteína de fusão SYT-SSX1 ou SYT-SSX2, TAG-1, TAG-2, Telomerase, TGF-betaRII, TPBG, TRAG-3, Triosefosfato isomerase, TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, tirosinase, ti- rosinase (“TYR”), VEGF, WT1 e XAGE-1b/GAGED2a.
87. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 86, caracterizado pelo fato de que o agente de imunoterapia com- preende uma proteína de ativação imunológica.
88. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que a proteína de ativação imunológica é uma citocina ou quimiocina.
89. Método, de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que a proteína de ativação imunológica é selecionada do grupo consistindo em quimioatrativo de linfócitos B (“BLC”), quimiocina 11 com motivo C-C (“Eotaxina-1”), proteína quimiotática de eosinófilos 2 (“Eotaxina-2”), fator estimulador de colônias de granulócitos (“G- CSF”), fator estimulador de colônias de granulócitos de macrófagos (“GM-CSF”), 1-309, Molécula de Adesão Intercelular 1 (“ICAM-1”), inter- feron alfa (“IFN-alfa”), interferon beta (“IFN-beta”), interferon gama ("IFN-gama"), interleucina-1 alfa (“IL-1 alfa”), interleucina-1 beta (“IL-1 beta”), antagonista do receptor de interleucina 1 (“IL-1 ra”), interleucina- 2 (“IL-2”), interleucina-4 (“IL-4”), interleucina-5 (“IL-5”), interleucina-6 (“IL-6”), receptor solúvel de interleucina-6 (“IL-6 sR”), interleucina-7 (“IL- 7”), interleucina-8 (“IL-8”), interleucina-10 (“IL-10”), interleucina- 11 (“IL- 11”), subunidade beta da interleucina-12 (“IL-12 p40” ou “IL-12 p70”), interleucina-13 (“IL-13”), interleucina-15 (“IL-15”), Interleucina-16 (“IL- 16”), interleucina-17A-F (“IL-17A-F”), interleucina-18 (“IL-18”), interleu- cina-21 (“IL-21”), interleucina-22 (“IL-22”), interleucina-23 (“IL-23”), in- terleucina-33 (“IL-33”), ligante 2 da quimiocina (motivo C-C) (“MCP-1”), fator estimulador de colônias de macrófagos (“M-CSF”), monocina indu- zida por interferon gama (“MIG”), ligante 2 da quimiocina (motivo C-C) (“MIP-1 alfa”), ligante 4 da quimiocina (motivo C-C) (“MIP-1 beta”), pro- teína-1-delta inflamatória de Macrófago (“MIP-1 delta”), subunidade B do fator de crescimento derivado de plaquetas (“PDGF-BB”), ligante 5 da quimiocina (motivo C-C), Regulado na Ativação, célula T normal ex- pressa e secretada (“RANTES”), inibidor da TIMP metalopeptidase 1 (“TIMP-1”), inibidor da TIMP metalopeptidase 2 (“TIMP-2”), fator de ne- crose tumoral, linfotoxina alfa (“TNF alfa”), fator de necrose tumoral, lin- fotoxina beta (“TNF beta”), receptor solúvel de TNF tipo 1 (“sTNFRI”), sTNFRIIAR, fator neurotrófico derivado do cérebro (“BDNF”), fator de crescimento básico de fibroblastos (“bFGF”), proteína morfogenética ós- sea 4 (“BMP-4”), proteína morfogenética óssea 5 (“BMP-5”), proteína morfogenética óssea 7 (“BMP-7”), fator de crescimento neural (“b- NGF”), fator de crescimento epidérmico (“EGF”), receptor do fator de crescimento epidérmico (“EGFR”), fator de crescimento endotelial vas- cular derivado da glândula endócrina (“EG-VEGF”), fator de crescimento de fibroblastos 4 (“FGF-4”), fator de crescimento de queratinócitos (“FGF-7”), fator de diferenciação de crescimento 15 (“GDF-15”), fator neurotrófico derivado de célula glial (“GDNF”), hormônio de cresci- mento, fator de crescimento semelhante a EGF de ligação à heparina (“HB-EGF”), fator de crescimento de hepatócitos (“HGF”), proteína 1 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina (“IGFBP-1”), pro- teína 2 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina (“IG- FBP-2”), proteína 3 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina (“IGFBP-3”), proteína 4 de ligação ao fator de crescimento se- melhante à insulina (“IGFBP-4”), proteína 6 de ligação ao fator de cres- cimento semelhante à insulina (“IGFBP-6”), fator de crescimento 1 se- melhante à insulina (“IGF-1”), insulina, fator estimulador de colônias de macrófagos (“M-CSF R”), receptor do fator de crescimento neural (“NGF R”), Neurotrofina-3 (“NT-3”), Neurotrofina-4 (“NT-4”), fator inibidor da os- teoclastogênese (“Osteoprotegerina”), receptores do fator de cresci- mento derivado de plaquetas (“PDGF-AA”), biossíntese de fosfatidilino- sitol-glicano (“PIGF”), Skp, Culina, amostras contendo F-box (“SCF”), receptor de fator de célula estaminal (“SCF R”), fator de crescimento transformador alfa (“TGFalfa”), fator de crescimento transformador beta- 1 (“TGF beta 1”), fator de crescimento transformador beta-3 (“TGF beta 3”), fator de crescimento endotelial vascular (“VEGF”), receptor do fator de crescimento endotelial vascular 2 (“VEGFR2”), receptor do fator de crescimento endotelial vascular 3 (“VEGFR3”), VEGF-D 6Ckina, recep- tor de proteína tirosina cinase UFO (“Axl”), betacelulina (“BTC”), quimi- ocina epitelial associada a mucosas (“CCL28”), ligante 27 da quimiocina (Motivo C-C) (“CTACK”), ligante 16 da quimiocina (motivo C-X-C) 16 (“CXCL16”), quimiocina 5 de motivo C-X-C (“ENA-78”), ligante 26 da quimiocina (motivo C-C) (“Eotaxina-3”), proteína quimiotática granulocí- tica 2 (“GCP-2”), GRO, ligante 14 da quimiocina (motivo C-C) (“HCC-l”), ligante 16 de quimiocina (motivo C-C) (“HCC-4”), interleucina-9 (“IL-9”), interleucina-17 F (“IL-17F”), proteína de ligação à interleucina-18 (“IL-18 BPa”), interleucina-28 A (“IL-28A”), interleucina 29 (“IL-29”), interleucina 31 (“IL-31”), quimiocina 10 de motivo C-X-C (“IP-10”), receptor CXCR3 de quimiocina (“I-TAC”), fator inibidor de leucemia (“LIF”), ligante da qui- miocina leve (motivo C) (“Linfotactina”), proteína quimioatrativa de mo- nócitos 2 (“MCP-2”), proteína quimioatrativa de monócitos 3 (“MCP-3”), proteína quimioatrativa de monócitos 4 (“MCP-4”), quimiocina derivada de macrófagos (“MDC”), fator inibidor da migração de macrófagos (“MIF”), ligante 20 da quimiocina (motivo C-C) (“MIP-3 alfa”), quimiocina 19 de motivo C-C (“MIP-3 beta”), ligante 23 da quimiocina (motivo C-C) (“MPIF-1”), cadeia alfa da proteína estimuladora de macrófagos (“MSPalfa”), proteína 4 semelhante à 1 de montagem do nucleossomo (“NAP-2”), fosfoproteína secretada 1 (“Osteopontina”), citocina pulmo- nar e regulada por ativação (“PARC”), fator plaquetário 4 (“PF4”), fator 1 alfa derivado de célula estromais (“SDF-1 alfa”), ligante 17 da quimio- cina (motivo C-C) (“TARC”), quimiocina expressa no timo (“TECK”), lin- fopoietina estromal tímica (“TSLP 4-IBB”), antígeno CD 166 (“ALCAM”),
Cluster de Diferenciação 80 ("B7-1"), membro 17 da superfamília de re- ceptores do fator de necrose tumoral (“BCMA”), Cluster de Diferencia- ção 14 (“CD14”), Cluster de Diferenciação 30 (“CD30”), Cluster de Dife- renciação 40 (“Ligante CD40”), molécula 1 de adesão a células relacio- nadas ao antígeno carcinoembrionário (glicoproteína biliar) (“CEACAM- 1”), Receptor de Morte 6 (“DR6”), Desoxitimidina cinase (“Dtk”), glico- proteína membranar tipo 1 (“Endoglina”), receptor da proteína tirosina cinase erbB-3 (“ErbB3”), molécula de adesão a leucócito endotelial 1 (“E-Selectina”), antígeno 1 de apoptose (“Faz”), tirosina cinase 3 seme- lhante a Fms (“Flt-3L”), membro 1 da superfamília de receptores do fator de necrose tumoral (“GITR”), membro 14 da superfamília de receptores do fator de necrose tumoral (“HVEM”), Molécula de adesão intercelular 3 (“ICAM-3”), IL-1 R4, IL-1 RI, IL-10 Rbeta, IL-17R, IL-2Rgama, IL-21R, proteína membranar do lisossomo 2 (“LIMPII”), lipocalina associada à gelatinase de neutrófilo (“Lipocalina-2”), CD62L (“L-Selectina”), endoté- lio linfático (“LYVE-1”), sequência A relacionada ao polipeptídeo de MHC classe I (“MICA”), sequência B relacionada ao polipeptídeo MHC de classe I (“MICB”), NRGl-betal, receptor do fator de crescimento deri- vado de plaquetas do tipo beta (“PDGF Rbeta”), molécula de adesão a células endoteliais de plaquetas (“PECAM-1”), RAGE, receptor celular 1 do vírus da hepatite A (“TIM-1”), membro IOC da superfamília de recep- tores do fator de necrose tumoral (“TRAIL R3”), domínio de ligação à transglutaminase da proteína trapina (“trapina-2”), receptor da urocinase (“uPAR”), proteína 1 de adesão celular vascular (“VCAM-1”), XEDARAc- tivina A, proteína relacionada à Agouti (“AgRP”), Ribonuclease 5 (“Angi- ogenina”), angiopoietina 1, angiostatina, cateprina S, CD40, proteína IB da família críptica (“Cripto-1”), DAN, proteína 1 relacionada a Dickkopf (“DKK-1”), caderina-E, molécula de adesão celular epitelial (“EpCAM”), ligante Fas (FasL ou CD95L), Fcg RIIB/C, FoUistatin, Galectina-7, mo- lécula de adesão intercelular 2 (“ICAM-2”), IL-13 R1, IL-13R2, IL-17B,
IL-2 Ra, IL-2 Rb, IL-23, LAP, molécula de adesão a células neuronais (“NrCAM”), inibidor do ativador de plasminogênio 1 (“PAI-1”), receptores de fator de crescimento derivados de plaquetas (“PDGF-AB”), resistina, fator 1 derivado de células estromais (“SDF-1 beta”), sgpl30, proteína 2 secretada relacionada a frizzled (“ShhN”), lectinas do tipo imunoglobu- lina de ligação ao ácido siálico (“Siglec-5”), ST2, fator de crescimento transformador beta 2 (“TGF beta 2”), Tie-2, trombopoietina (“TPO”), membro 10D da superfamília de receptores do fator de necrose tumoral (“TRAIL R4”), receptor de ativação expresso em células mieloides 1 (“TREM-1”), fator de crescimento endotelial vascular C (“VEGF-C”), VEGFRlAdiponectina, adipsina (“AND”), alfa-fetoproteína (“AFP”), se- melhante à angiopoietina 4 (“ANGPTL4”), microglobulina beta-2 (“B2M”), molécula de adesão celular basal (“BCAM”), antígeno de car- boidrato 125 (“CA125”), antígeno de câncer 15-3 (“CA15-3”), antígeno carcinoembrionário (“CEA”), proteína receptora cAMP (“CRP”), receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (“ErbB2”), folistatina, hor- mônio folículo-estimulante (“FSH”), ligante 1 da quimiocina (motivo C-X- C) (“GRO alfa”), gonadotrofina coriônica humana (“beta HCG”), receptor de fator de crescimento 1 semelhante à insulina (“IGF-1 sR”), IL-1 sRII, IL-3, IL-18 Rb, IL-21, leptina, metaloproteinase-1 de matriz (“MMP-1”), metaloproteinase-2 de matriz (“MMP-2”), metaloproteinase-3 de matriz (“MMP-3”), metaloproteinase-8 de matriz (“MMP-8”), metaloproteinase- 9 de matriz (“MMP-9”), metaloproteinase-10 de matriz (“MMP-10”), Me- taloproteinase de matriz 13 (“MMP-13”), Molécula de adesão a células neurais (“NCAM-1”), Entactina (“Nidogênio-1”), enolase específica de neurônio (“NSE”), Oncostatina M (“OSM”), Procalcitonina, Prolactina, antígeno específico da próstata (“PSA”), lectina 9 semelhante a Ig de ligação ao ácido siálico (“Siglec-9”), endopeptidase ADAM 17 (“TACE”), tireoglobulina, inibidor 4 da metaloproteinase (“TIMP-4”), TSH2B4, pro- teína 9 contendo domínio de desintegrina e metaloproteinase (“ADAM-
9”), angiopoietina 2, membro 13 da superfamília de ligantes do fator de necrose tumoral/ membro B da família da fosfoproteína nuclear rica em leucina acídica (“APRIL”), proteína 2 morfogenética óssea (“BMP-2”), proteína 9 morfogenética óssea (“BMP-9”), componente 5a do comple- mento (“C5a”), catepsina L, CD200, CD97, quemerina, membro 6B da superfamília de receptores do fator de necrose tumoral, proteína 2 de ligação a ácidos graxos (“FABP2”), proteína de ativação de fibroblastos alfa (“FAP”), fator de crescimento de fibroblastos 19 (“FGF-19”), galec- tina-3, receptor do fator de crescimento de hepatócitos (“HGF R”), IFN- gama/alfa/beta R2, fator de crescimento 2 semelhante a insulina (“IGF- 2”), receptor do fator de crescimento 2 semelhante a insulina (“IGF-2 R”), receptor 6 da interleucina-1 (“IL-1R6”), interleucina 24 (“IL-24”), in- terleucina 33 (“IL-33”), calicreína 14, asparaginil endopeptidase (“legu- maína”), receptor de lipoproteína de baixa densidade oxidado 1 (“LOX- 1”), lectina de ligação à manose (“MBL”), neprilisina (“NEP”), homólogo 1 de Notch associado à translocação (Drosófila) (“Notch-1”), Nefroblas- toma superexpressado (“NOV”), Osteoactivina, proteína 1 de morte ce- lular programada (“PD-1”), N-acetilmuramoil-L-alanina amidase (“PGRP-5”), serpina A4, proteína 3 relacionada com frizzled secretada (“sFRP-3”), trombomodulina, receptor 2 semelhante a Toll (“TLR2”), membro 10A da superfamília de receptores do fator de necrose tumoral (“TRAIL Rl”), transferrina (“TRF”), WIF- lACE-2, albumina, AMICA, angi- opoietina 4, fator de ativação de células B (“BAFF”), antígeno de carboi- drato 19-9 (“CA19-9”), CD 163, Clusterina, CRT AM, ligante 14 de qui- miocina (motivo C-X-C) (“CXCL14”), cistatina C, decorina (“DCN”), pro- teína 3 relacionada a Dickkopf (“Dkk-3”), proteína 1 semelhante a delta 1 (“DLL1”), fetuína A, fator de crescimento 1 de ligação à heparina (“aFGF”), receptor alfa de folato (“FOLR1”), furina, proteína 1 de sepa- ração associada a GPCR (“GASP-1”), proteína 2 de separação associ- ada a GPCR (“GASP-2”), receptor do fator estimulador de colônias de granulócitos (“GCSF R”), hepsina de serina protease (“HAI-2”), receptor de interleucina-17B (“IL-17B R”), interleucina 27 (“IL-27”), gene 3 de ati- vação de linfócitos (“LAG-3”), apolipoproteína A-V (“LDL R”), pepsino- gênio I, proteína 4 de ligação ao retinol (“RBP4”), SOST, proteoglicano de sulfato de heparano (“Sindecano-1”), membro 13B da superfamília de receptores do fator de necrose tumoral (“TACI”), inibidor da via do fator tecidual (“TFPI”), TSP-1, membro 10b da superfamília de recepto- res do fator de necrose tumoral (“TRAIL R2”), TRANCE, Troponina I, Urocinase Ativadora de Plasminogênio (“uPA”), Caderina 5, tipo 2 ou VE-caderina (endotelial vascular) também conhecido como CD144 (“VE-Caderina”), proteína 1 da via de sinalização induzível por WNTl (“WISP-1”) e ativador de receptor do fator nuclear κ B (“RANK”).
90. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 89, caracterizado pelo fato de que o agente de imunoterapia com- preende um adjuvante.
91. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que o adjuvante é selecionado do grupo consistindo em uma proteína imunomoduladora, Adjuvante 65, α-GalCer, fosfato de alu- mínio, hidróxido de alumínio, fosfato de cálcio, Peptídeo β-Glucano, CpG DNA, GPI-0100, lipídio A, lipopolissacarídeo, Lipovant, Montanide, N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutamina, Pam3CSK4, quil A e dimico- lato de trealose.
92. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 91, caracterizado pelo fato de que o terapêutico contra câncer com- preende um inibidor de angiogênese.
93. Método, de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que o inibidor de angiogênese é selecionado do grupo con- sistindo em Bevacizumabe (Avastin®), Ziv-aflibercepte (Zaltrap®), So- rafenibe (Nexavar®), Sunitinibe (Sutent®), Pazopanibe (Votrient®), Re- gorafenibe (Stivarga®) e Cabozantinibe (Cometriq™).
94. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 93, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a administração de uma segunda bactéria terapêutica ao sujeito.
95. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 94, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a administração de um prebiótico ao sujeito.
96. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pelo fato de que o prebiótico é um fruto-oligossacarídeo, um galacto- oligossacarídeo, um trans-galacto-oligossacarídeo, um xilo-oligossaca- rídeo, um quito-oligossacarídeo, um oligossacarídeo de soja, um gentio- oligossacarídeo, um isomalto-oligossacarídeo, um mano-oligossacarí- deo, um malto-oligossacarídeo, um mananoligossacarídeo, lactulose, lactossacarose, palatinose, glicosil sacarose, goma de guar, goma ará- bica, tagalose, amilose, amilopectina, pectina, xilano ou uma ciclodex- trina.
97. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 96, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um ser humano.
98. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 96, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um mamífero não hu- mano.
99. Método, de acordo com a reivindicação 98, caracterizado pelo fato de que o mamífero é selecionado do grupo consistindo em um cachorro, um gato, uma vaca, um cavalo, um porco, um jumento, uma cabra, um camelo, um camundongo, um rato, um porquinho da índia, uma ovelha, uma lhama, um macaco, um gorila ou um chimpanzé.
100. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 99, caracterizado pelo fato de que uma segunda bactéria é administrada como parte de um consórcio ecológico.
101. Composição bacteriana, caracterizada pelo fato de que compreende uma bactéria Veillonella e um transportador farmaceutica- mente aceitável.
102. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de que a bactéria é uma cepa compreen- dendo pelo menos 99% de identidade de sequência genômica, de 16S e/ou de CRISPR com a sequência nucleotídica de uma cepa bacteriana listada na Tabela 1.
103. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de que a bactéria é uma cepa compreen- dendo pelo menos 99,9% de identidade de sequência genômica, de 16S e/ou de CRISPR com a sequência nucleotídica de uma cepa bacteriana listada na Tabela 1.
104. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de que a bactéria é uma cepa bacteriana listada na Tabela 1.
105. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 a 104, caracterizada pelo fato de que a compo- sição bacteriana é formulada para administração oral, retal, intravenosa, intratumoral ou subcutânea.
106. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 a 104, caracterizada pelo fato de que pelo me- nos 50% das bactérias na composição bacteriana são uma cepa bacte- riana listada na Tabela 1.
107. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 a 104, caracterizada pelo fato de que pelo me- nos 90% das bactérias na composição bacteriana são uma cepa bacte- riana listada na Tabela 1.
108. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 a 107, caracterizada pelo fato de que substanci- almente todas as bactérias na composição bacteriana são uma cepa bacteriana listada na Tabela 1.
109. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 a 108, caracterizada pelo fato de que a compo- sição bacteriana compreende pelo menos 1 x 106 unidades formadoras de colônias (UFC) de uma cepa bacteriana listada na Tabela 1.
110. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 109, caracterizada pelo fato de que a composição bacteriana compre- ende pelo menos 1 x 107 UFC de uma cepa bacteriana listada na Tabela
1.
111. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 109, caracterizada pelo fato de que a composição bacteriana compre- ende pelo menos 1 x 108 UFC de uma cepa bacteriana listada na Tabela
1.
112. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 a 111, caracterizada pelo fato de que a compo- sição bacteriana compreende bactérias vivas.
113. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 a 111, caracterizada pelo fato de que a compo- sição bacteriana compreende bactérias atenuadas.
114. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 a 111, caracterizada pelo fato de que a compo- sição bacteriana compreende bactérias mortas.
115. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 a 114, caracterizada pelo fato de que a adminis- tração da composição bacteriana trata o distúrbio imunológico.
116. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 a 115, caracterizada pelo fato de que a adminis- tração da composição bacteriana induz uma resposta imunológica.
117. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 a 115, caracterizada pelo fato de que a bactéria é formulada com um revestimento entérico ou microencapsulação.
118. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 a 117, caracterizada pelo fato de que a compo- sição bacteriana compreende bactérias irradiadas.
119. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 118, caracterizada pelo fato de que a composição bacteriana compre- ende bactérias submetidas a irradiação gama.
120. Composição bacteriana caracterizada pelo fato de que compreende vesículas extracelulares (EV) de Veillonella isoladas.
121. Composição bacteriana caracterizada pelo fato de que compreende vesículas extracelulares (EV) de Veillonella e bactérias Veillonella.
122. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 121, caracterizada pelo fato de que pelo menos cerca de, ou não mais do que, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% do total de partículas de EV de Veillonella e de bactérias Veillonella na composição farmacêutica são EV de Veillonella.
123. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 121, caracterizada pelo fato de que pelo menos cerca de, ou não mais do que, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%,
50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% do total de partículas de EV e de bactérias Veillonella na composição farmacêutica são bactérias Veillonella.
124. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 121, caracterizada pelo fato de que pelo menos cerca de, ou não mais do que, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% do total de proteína de EV de Veillonella e de bactérias Veillonella imunomoduladoras na composição farmacêutica é proteína de EV de Veillonella.
125. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 121, caracterizada pelo fato de que pelo menos cerca de, ou não mais do que, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% do total de proteína de EV de Veillonella e de bactérias
Veillonella na composição farmacêutica é proteína de bactérias Veillo- nella.
126. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 121, caracterizada pelo fato de que pelo menos cerca de, ou não mais do que, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% dos lipídios de EV e de bactérias Veillonella na composição farmacêutica são lipídios de EV de Veillonella.
127. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 121, caracterizada pelo fato de que pelo menos cerca de, ou não mais do que, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% do total de lipídios de EV de Veillonella e de bactérias Veil- lonella na composição farmacêutica são lipídios de bactérias Veillonella.
128. Composição bacteriana, caracterizada pelo fato de que compreende bactérias Veillonella isoladas de EV.
129. Biorreator, caracterizado pelo fato de que compreende bactérias Veillonella.
130. Biorreator, de acordo com a reivindicação 129, caracte- rizado pelo fato de que as bactérias são uma cepa compreendendo pelo menos 90% de identidade de sequência genômica, de 16S e/ou de CRISPR com a sequência nucleotídica de uma cepa bacteriana listada na Tabela 1.
131. Biorreator, de acordo com a reivindicação 129, caracte- rizado pelo fato de que as bactérias são uma cepa compreendendo pelo menos 99% de identidade de sequência genômica, de 16S e/ou de CRISPR com a sequência nucleotídica de uma cepa bacteriana listada na Tabela 1.
132. Biorreator, de acordo com a reivindicação 129, caracte- rizado pelo fato de que as bactérias são uma cepa bacteriana listada na Tabela 1.
133. Método de crescimento de bactérias em um biorreator, caracterizado pelo fato de que compreende proporcionar um biorreator, como definido em qualquer uma das reivindicações 129 a 132; e fermentar as bactérias durante um período de tempo.
BR112020015639-6A 2018-02-06 2019-02-06 Composições e métodos para o tratamento de câncer e distúrbios imunológicos usando bactérias veillonella BR112020015639A2 (pt)

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