BR112020015521A2 - Membrana de nitrocelulose compre¬endendo molé-cula orgânica nanoestruturada acopla¬da não co-valentemente - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a um método melhorado de análise quantitativa e/ou qualitativa, de uma molécula alvo, usando membrana de nitrocelulose (ncm). em particular, a presente invenção fornece uma membrana de nitrocelulose porosa, que inclui uma superfície, e uma molécula orgânica nanoestruturada, que é acoplada não covalentemente à superfície de ncm. a molécula orgânica nanoestruturada tem uma região ramificada, que inclui uma pluralidade de porções de regiões de terminais (por exemplo, extremidade de terminal), que não são acopladas covalentemente, ou ligadas a uma superfície da ncm porosa. a molécula orgânica nanoestruturada também compreende uma região linear, que inclui uma molécula de captura acoplada covalentemente, que é adaptada para seletivamente se ligar a uma molécula alvo. a ncm da invenção fornece uma reprodutibilidade, confiabilidade e seletividade melhoradas, em comparação com uma ncm, na ausência da molécula orgânica nanoestruturada.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MEMBRA- NA DE NITROCELULOSE COMPREENDENDO MOLÉCULA ORGÂNI- CA NANOESTRUTURADA ACOPLADA NÃO COVALENTEMENTE".

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se à uma membrana de nitroce- lulose porosa, que inclui uma superfície e uma molécula orgânica na- noestruturada, e um método para produzir e usar a mesma. Em parti- cular, a NOM porosa da invenção inclui uma molécula orgânica na- noestruturada ligada à superfície. A molécula orgânica nanoestrutura- da tem uma região ramiíficada, que inclui uma pluralidade de porções de regiões terminais (por exemplo, extremidade de terminal), que são acopladas não-covalentemente, ou ligadas a uma superfície de NOM poroso. A molécula orgânica nanoestruturada também compreende uma região linear, que inclui uma molécula de captura covalentemente acoplada, que é adaptada para seletivamente se ligar à uma molécula alvo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A membrana de nitrocelulose é uma membrana porosa composta de nitrocelulose. Membranas de nitrocelulose porosas, tipi- camente têm um diâmetro médio de tamanho de poro, de cerca de 0,2 um a cerca de 15 um. Embora as membranas de nitrocelulose sejam neutras em geral, elas têm sido usadas nas proteínas de imobilização, através de um momento dipolo forte, entre o grupo nitro de NOM, e um momento dipolo que está presente na proteína. Em alguns casos, ca- deias laterais iônicas da proteína, também têm sido usadas para imo- bilizar proteínas na NOM. A capacidade de NCMs na imobilização de proteínas, varia com o pH da solução usada. Sem estar limitado por qualquer teoria, acredita-se que o pH afeta a eficiência de imobilização de uma proteína em particular, alterando as propriedades da proteína na solução.

[0003] Membranas de nitrocelulose também têm sido usadas para eletrostaticamente imobilizar ácidos nucleicos. Em relação ao DNA de filamentado duplo, a nitrocelulose tem particularmente uma alta afini- dade com DNA filamentado único e DNA-RNA híbridos. Tipicamente, NCM;s não imobilizam RNA. Essas diferenças nas propriedades de |i- gação de nucleotídeo, têm sido usadas para separar ou quantificar uma cadeia de nucleotídeo de filamento único, e um ácido nucleico de cadeia única, em uma reação de formação de híbrido de fase líquida, e para separar ou quantificar um ácido nucleico, que forma um complexo com uma proteína.

[0004] Para uma análise quantitativa de materiais ou substâncias alvos (por exemplo, proteína, ácido nucleico, etc.), usando uma mem- brana de nitrocelulose, a proteína que é usada como uma molécula de captura (por exemplo, uma que seletivamente se liga a um material alvo de interesse), é muitas vezes impresso sobre uma membrana de nitrocelulose, e secando a membrana de nitrocelulose resultante. Des- sa maneira, a molécula de captura é imobilizada sobre a membrana de nitrocelulose, sem produzir uma ligação covalente entre a molécula de captura e a superfície da membrana de nitrocelulose (FIGURA 1). Sem estar limitado por qualquer teoria, tal como uma imobilização não co- valente, ou fixação da molécula de captura na superfície da membrana de nitrocelulose, pode ser realizada através de uma variedade de mei- os químicos e/ou físicos, tais como, mas não limitados a interação iô- nica, ligação de hidrogênio, interação hidrofóbica, interação de van der Waals, etc. Além do mais, e novamente sem estar limitado por qual- quer teoria, em uma fixação não covalentemente, uma combinação de um ou mais de tais interações químicas e/ou físicas, pode estar envol- vida na imobilização de uma molécula de captura na superfície da membrana de nitrocelulose. Acredita-se que a fixação não covalente de material cativo (ou molécula de captura) à superfície da membrana de nitrocelulose, é um fenômeno termodinâmico, com as interações de momento dipolo e/ou interações hidrofóbicas, acreditando ser um dos principais fatores ou elementos do fenômeno.

[0005] As membranas de nitrocelulose são polímeros estruturados porosos, que podem funcionar como uma matriz de cromatografia, que tem um fluxo de soluções substancialmente unidirecional. Esse fluxo substancialmente unidirecional, possibilita a membrana de nitrocelulo- se ser usada em conjuntos (kits) de teste de fluxo contínuo, em uma variedade de análises (ensaios) de diagnóstico. Como com qualquer teste de fluxo contínuo ou kit de diagnóstico, se o material alvo passa através da região fixada, que contém a molécula de captura, sem for- mar um complexo de molécula de captura-material alvo, a presença da molécula alvo em uma amostra, não pode ser corretamente determi- nada. Além do mais, se a taxa de fluxo é diferente de um teste para outro, o teste ou o kit de diagnóstico não será confiável. Para este fim, um teste ou kit de diagnóstico preciso e confiável, necessita fornecer um tempo suficiente para um complexo de molécula de captura- material alvo se formar. O método convencional para produzir uma ta- xa de fluxo constante em uma membrana de nitrocelulose, é para ajus- tar o tamanho de poro da membrana.

[0006] Infelizmente, a taxa de fluxo e o tamanho do poro não são os únicos fatores requeridos para a precisão e a confiabilidade, de um teste de fluxo contínuo ou kits de diagnóstico. Por exemplo, mesmo se o material alvo passa através da molécula de captura, ligada à superfí- cie da membrana, com um tempo suficiente para formar um complexo, entre a molécula de captura e o material alvo, muitas vezes o comple- xo desejado não é formado, porque os sítios de reação requeridos pa- ra formar um complexo de molécula de captura-material alvo, podem estar obscurecidos ou inacessíveis devido à orientação imprópria, ou à presença de múltiplas camadas de moléculas de captura, sobre a su-

perfície da membrana de nitrocelulose. Estes fatores também resultam em uma baixa reprodutibilidade e confiabilidade do teste de fluxo con- tínuo ou kits de diagnóstico, que usam membranas de nitrocelulose.

[0007] Para esse fim, existe uma necessidade contínua por um teste baseado em membrana de nitrocelulose e/ou kits de diagnóstico altamente reproduzíveis e confiáveis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0008] Um aspecto da invenção fornece um teste e/ou kit de diag- nóstico, altamente reproduzível e confiável, usando uma membrana de nitrocelulose. A membrana de nitrocelulose da presente invenção, in- clui uma nanoestrutura orgânica ligada não covalentemente (isto é, molécula orgânica nanoestruturada). Em algumas modalidades, a mo- lécula orgânica nanoestruturada compreende uma molécula de captu- ra, ou um material de captura covalentemente acoplados (isto é, cova- lentemente ligados), que é capaz de seletivamente se ligar a um mate- rial alvo ou a uma substância alvo. Sem ser limitado por qualquer teo- ria, acredita-se que o uso de molécula nanoestruturada orgânica, pos- sibilita uma apresentação mais eficiente e favorável da molécula de captura para o material alvo, dessa maneira resultando em um teste/kit de diagnóstico mais preciso e confiável.

[0009] Acredita-se que o uso de moléculas orgânicas nanoestrutu- radas da invenção, resulta em reação ou sítios de ligação, que são mais acessíveis e mais estruturados (isto é, não aglomerados ou em múltiplas camadas), resultando em uma redução significativa em blo- queio estérico, para a ligação entre e molécula de captura e o material alvo. O mesmo efeito pode ser obtido, quando a molécula de captura é acoplada ou impressa para a molécula de nanoestrutura orgânica, de- pois de acoplar a nanostrutura orgânica ao suporte da membrana. O uso de moléculas de nanoestrutura orgânica para acoplar a molécula de captura, modifica o ambiente espacial da molécula de captura, na superfície da membrana de nitrocelulose, criando um ambiente em que o material alvo e a molécula de captura são deixados para mais pron- tamente formar um complexo. A membrana de nitrocelulose resultante fornece uma análise quantitativa e qualitativa dos materiais alvos, al- tamente reproduzível e altamente confiável.

[0010] Outro aspecto da invenção fornece um método de análise quantitativa, altamente reproduzível de um material alvo. O material alvo seletivamente se liga à uma molécula de captura, que é covalen- temente acoplada à uma molécula de nanoestrutura orgânica da in- venção. Por sua vez, a molécula de nanoestrutura orgânica é não co- valentemente acoplada a uma membrana de nitrocelulose, que é usa- da como um apoio.

[0011] Ainda outro aspecto da invenção fornece um kit de ensaio quantitativo e/ou qualitativo. Em algumas modalidades, o kit de ensaio possibilita a determinação quantitativa de um material alvo um alta re- produtibilidade.

[0012] Em algumas modalidades, a molécula de nanoestrutura or- gânica compreende uma pluralidade de regiões ramificadas e uma re- gião linear. A extremidade terminal da região linear compreende um grupo funcional, que pode ser usado para covalentemente acoplar uma molécula de captura. Alternativamente, a molécula de captura pode ser acoplada à extremidade do terminal da região linear, antes de não covalentemente acoplar a molécula orgânica nanoestruturada à membrana de nitrocelulose. Em algumas modalidades, a molécula or- gânica nanoestruturada compreende uma pluralidade de (por exemplo, pelo menos duas, tipicamente pelo menos três, e mais frequentemente três, nove ou vinte e sete), grupos funcionais de extremidade final da região ramificada, que são capazes de formar um acoplamento não covalente para a membrana de nitrocelulose. O grupo funcional da ex- tremidade da região ramificada terminal, pode ser positivamente car-

regado ou negativamente carregado.

[0013] Ainda outro aspecto da invenção fornece um método de análise quantitativa e/ou qualitativa de um material alvo, usando a membrana de nitrocelulose descrita no presente documento no pre- sente.

[0014] Todavia, outro aspecto da invenção fornece um kit de en- saio quantitativo e/ou qualitativo, que inclui uma membrana de nitroce- lulose (NOM) da presente invenção.

[0015] A invenção também fornece uma molécula de nanoestrutu- ra orgânica, que é útil inter alia para análise quantitativa e/ou qualitati- va de um material alvo. A molécula orgânica nanoestruturada da in- venção, inclui uma pluralidade de grupos funcionais de extremidade terminal funcional da região ramificada, e o grupo funcional de terminal de região linear, que pode ser usado para covalentemente acoplar uma molécula de captura.

[0016] Em algumas modalidades, o uso da membrana de nitroce- lulose da invenção, fornece pelo menos 10%, tipicamente pelo menos 25%, e muitas vezes pelo menos 50% de melhoramento na seletivida- de e/ou especificidade, em comparação com um teste de ensaio base- ado em nitrocelulose convencional, tal como aqueles com ligantes ba- seados em polietileno glicol ("(PEG"). Ainda em outras modalidades, o uso da membrana de nitrocelulose da invenção fornece reprodutibili- dade melhorada de pelo menos 100%, tipicamente pelo menos 200%, muitas vezes pelo menos 300%, mais vezes pelo menos 400%, e com mais frequência pelo menos 500%, como ilustrado na Figura 4.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0017] A Figura 1 é um desenho esquemático em que o material de captura do método convencional, está imobilizada na superfície de uma membrana de nitrocelulose (NCM).

[0018] A Figura 2-1 é um diagrama esquemático mostrando o aco-

plamento de uma molécula de captura na membrana de nitrocelulose, usando uma molécula orgânica nanoestruturada, de acordo com uma modalidade da presente invenção.

[0019] A Figura 2-2 é um diagrama esquemático, mostrando o acoplamento de uma molécula de captura na membrana de nitrocelu- lose, usando uma molécula orgânica nanoestruturada, de acordo com outra modalidade da presente invenção.

[0020] A Figura 3 é o gráfico mostrando os resultados da reprodu- tibilidade da proporção molar, entre o material de captura do exemplo 1 e a nanoestrutura orgânica, com uma concentração vs. gráfico de CV (%), uma linha de tendência e uma equação padrão, e a concen- tração de 10% em CV.

[0021] A Figura 4 é um gráfico mostrando os resultados de repro- dutibilidade, quando a nanostrutura orgânica foi aplicada para cada membrana de nitrocelulose do fabricante, de acordo com o exemplo comparativo 1 em uma CV de 10%, e uma ampliação da intensificação de reprodutibilidade.

[0022] A Figura 5 é um gráfico mostrando os resultados da repro- dutibilidade dos grupos funcionais de epóxido e aldeído da nanoestru- tura orgânica, de acordo com o exemplo 2, na concentração de 10% em CV, e a ampliação da intensificação de reprodutibilidade.

[0023] A Figura 6 é um gráfico mostrando a reprodutibilidade da nanoestrutura orgânica, com extremidades ramificadas como carga negativa ou carga positiva, de acordo com o exemplo 3, em concen- tração de 10% em CV, e a ampliação da intensificação da reprodutibi- lidade.

[0024] A Figura 7 mostra os resultados da reprodutibilidade, quan- do o número de moléculas de ramificação da nanoestrutura orgânica é 3 e 9, de acordo com o exemplo 4, em concentração de 10% em CV e a ampliação da intensificação de reprodutibilidade.

[0025] A Figura 8 é a reprodutibilidade em concentração de 10% em CV, e a intensificação da reprodutibilidade, usando método se- quencial e o método de misturar, quando combinando a nanoestrutura orgânica e o material de capturar, como mostrado no exemplo 5.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0026] A discussão da invenção a seguir, é apresentada meramen- te para fins de ilustração de alguns aspectos da presente invenção, e não é destinada a limitar o escopo da presente invenção. Embora a descrição da invenção inclua a descrição de uma ou mais modalida- des, e certas variações e modificações, outras variações e modifica- ções estão dentro do escopo da invenção, por exemplo, como pode estar dentro da habilidade e conhecimento daqueles na técnica, depois de compreender a presente descrição. É destinado que o escopo da presente invenção inclua modalidades alternativas, até o ponto permi- tido, incluindo estruturas alternativas, intercambiáveis e/ou equivalen- tes, funções, proporções ou etapas para aquelas reivindicadas, inde- pendente da resposta para tais alternadas, intercambiáveis e/ou equi- valentes estruturas, funções, proporções ou etapas descritas no pre- sente documento no presente, e sem pretender publicamente dedicar qualquer matéria patenteável. Todas as referências mencionadas no presente documento no presente, estão incorporadas por referência em sua totalidade.

[0027] A terminologia usada no presente documento no presente é com a finalidade de descrever uma aplicação em particular somente, e não é destinada a limitar a invenção. As formas no singular "um", "uma" e "o", "a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente de outra maneira.

[0028] Um aspecto particular da invenção fornece uma membrana de nitrocelulose (NOM), que é útil para análise quantitativa e/ou quali- tativa de um material alvo. Em uma modalidade, a NCM compreende uma molécula de nanoestrutura orgânica, que é acoplada não covalen- temente à NOM. A molécula orgânica nanoestruturada da invenção, inclui uma pluralidade de regiões ramificadas, cada uma das quais po- de incluir um grupo funcional de extremidade terminal, que pode ser usado para acoplar não covalentemente à NOM. Os grupos funcionais terminais de região ramificada, podem ser positivamente ou negativa- mente carregados. A molécula orgânica nanoestruturada também in- clui uma região linear, que inclui um grupo funcional, capaz de cova- lentemente se acoplar ou se ligar a uma molécula de captura. Deverá ser evidente que o escopo da invenção inclui molécula orgânica na- noestruturada, em que a molécula de captura já está covalentemente acoplada à molécula orgânica nanoestruturada.

[0029] A molécula de nanoestrutura orgânica da invenção com- preende um átomo central; uma região ramificada que tem uma plura- lidade de porções de extremidade terminal; e uma região linear, que tem um grupo funcional de extremidade terminal. O grupo funcional de extremidade terminal da região linear, é usado para covalentemente acoplar uma molécula de captura, como descrito em detalhes no pre- sente documento no presente. Uma pluralidade de porções da extre- midade do terminal da região ramificada (isto é, uma pluralidade de grupos de função da extremidade terminal da região ramificada) é usada para acoplar não covalentemente um composto de nanoestrutu- ra orgânica a uma membrana de nitrocelulose porosa. Tipicamente, a membrana de nitrocelulose usada na invenção tem um tamanho de diâmetro médio de poros de cerca de 0,05 um, cerca de 30 um, tipi- camente de cerca de 1 um a cerca de 30 um, muitas vezes cerca de 5 Um a cerca de 20 um, e com mais frequência cerca de 10 um a cerca de 15 um. A menos que o contexto exija de outra maneira, como usa- do no presente documento no presente, o termo "cerca de" quando se referindo à valor numérico médio + 20%, tipicamente + 10%, muitas vezes + 5%, e mais frequente + 1% do valor numérico. Em algumas modalidades, o grupo funcional de extremidade terminal da região |i- near, inclui uma molécula de captura covalentemente ligada.

[0030] Embora uma ampla variedade de métodos pode ser usada para não covalentemente acoplar a molécula orgânica nanoestrutura- da à membrana de nitrocelulose, uma modalidade da invenção em particular, inclui imobilizar uma molécula de nanoestrutura orgânica em uma superfície, ou a matriz de uma membrana de nitrocelulose poro- sa, através de uma pluralidade de acoplamentos não covalentes. À nanoestrutura orgânica compreende: (i) um átomo central; (ii) uma re- gião ramíificada, que tem uma pluralidade de porções de extremidade terminal, que são não covalentemente acopladas à superfície da dita membrana de nitrocelulose porosa; e (ili) uma região linear que tem uma molécula de captura covalentemente ligada em uma extremidade do terminal da dita região linear, em que no presente a dita molécula de captura é adaptada para seletivamente ligar ao material alvo, quan- do o material alvo está presente na amostra. A molécula orgânica na- noestruturada pode ser acoplada à membrana de nitrocelulose, atra- vés de qualquer um dos métodos conhecidos, incluindo, mas não limi- tado à um processo de impressão. O processo de impressão inclui, por exemplo, o uso de uma tecnologia de impressão a jato, em que uma solução de molécula orgânica nanoestruturada é impressa, em uma membrana de nitrocelulose e possibilitando a solução impressa secar. Esta tecnologia de impressão possibilita a fixação da molécula orgâni- ca nanoestruturada à membrana de nitrocelulose, através de uma plu- ralidade de ligações não covalentes.

[0031] Alternativamente, a molécula orgânica nanoestruturada é imobilizada na membrana de nitrocelulose (por exemplo, através de um processo de impressão), e reagindo uma molécula de captura com o grupo funcional da extremidade terminal da região linear da molécula orgânica nanoestruturada, sob condições suficientes para produzir uma região linear da nanoestrutura orgânica, que é covalentemente acoplada à molécula de captura. Em algumas modalidades, a molécu- la de captura é impressa sobre a mesma área da membrana de nitro- celulose, que é não covalentemente acoplada à molécula orgânica na- noestruturada, e a área resultante é permitida reagir e secar antes, a fim de usar a membrana de nitrocelulose em um ensaio quantitativo e/ou qualitativo. Sem estar limitado por qualquer teoria, acredita-se que o uso da molécula orgânica nanoestruturada, para acoplar a mo- lécula de captura à membrana de nitrocelulose, controla a distância entre o complexo da molécula de captura-material alvo, como ilustrado na Figura 2, desse modo reduzindo significativamente o impedimento estérico.

[0032] Um método de ensaio, envolve usar a membrana de nitro- celulose descrita no presente documento no presente (por exemplo, como um kit de ensaio de fluxo contínuo, ou um Kkit de ensaio de fluxo lateral), e contatar uma amostra ou um espécime, à membrana de ni- trocelulose para determinar a presença de, e/ou a quantidade do mate- rial alvo, dentro da amostra ou do espécime. Como usados no presen- te documento no presente, os termos "amostra" e "espécime" são usa- dos intercambiavelmente no presente documento no presente, e se referem à um material que está sendo analisado. Tal amostra pode ser uma amostra de fluido corporal (por exemplo, sangue, saliva, fezes, urina, mucosa etc.), amostra biológica (por exemplo, célula, DNA, pro- teína, bactéria, vírus etc.), uma amostra química, uma amostra de va- lor nutritivo (alimento), uma amostra ambiental (por exemplo, solo, at- mosfera etc.), como também qualquer outra amostra que pode ser analisada. Tipicamente, o ensaio é conduzido usando um fluxo lateral, ou um processo de fluxo contínuo, para ligar o material alvo (se pre- sente) à molécula de captura.

[0033] O processo de ensaio pode também incluir adicionar um material de detecção, por exemplo, rastreador de sinal tal como um fluoróforo, uma enzima (peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina, etc.), um ouro coloidal etc., para a membrana de nitrocelulose deter- minar a presença de, ou uma quantidade de complexo de molécula de captura-material alvo. A análise pode incluir reagir o complexo de mo- lécula de captura-material alvo, com uma detecção de material similar àqueles usados em ELISA (ensaio de imuno-absorvente ligado à en- zima).

[0034] O material de detecção pode incluir uma porção que é adaptada para gerar sinais colorimétricos, de quimioluminescência, ou quimiofluorescência. Dessa maneira, o sinal que é gerado (por exem- plo, color, sinais de luminescência, ou fluorescência, respectivamente), pode ser analisado usando um sensor óptico. O sinal pode também ser analisado por seu nível de sinal, para possibilitar a quantificação do complexo da molécula de captura-material alvo, que é formado so- bre a membrana de nitrocelulose. Como um exemplo, se o material de detecção inclui um sinal fluorescente gerando porção, a membrana de nitrocelulose é irradiada com a luz do comprimento de onda de excita- ção, e a intensidade de fluorescência pode ser quantificada, a fim de determinar a quantidade de material alvo presente na amostra. Quan- do o material de detecção inclui ouro coloidal, o grau de desenvolvi- mento da cor é obtido no sistema óptico, usando o parâmetro de colo- rimetria do aparelho óptico, para quantificar a quantidade de material alvo presente na amostra.

[0035] Sinais obtidos usando, por exemplo, um equipamento ópti- co, podem ser quantificados ou semi-quantificados, usando um gráfico entre a concentração de material alvo e o valor de sinal, uma linha de tendência, uma equação padrão, e um coeficiente de determinação.

[0036] Em algumas modalidades, os métodos da invenção podem ser usados para confiavelmente analisar uma ampla variedade de ma- teriais alvos, tais como uma célula, um DNA, um RNA, um PNA, um aptâmero, um ligante, um esossoma, um lipídeo. A menos que o con- texto exija de outra maneira, o termo "analisar" ou "análise" significa análise qualitativa e/ou quantitativa.

[0037] A invenção também fornece um método de análise do ma- terial alvo, usando a membrana de nitrocelulose, compreendendo as etapas a seguir: (i) adicionar uma amostra à uma membrana de nitro- celulose da invenção, sob condições suficientes para formar um com- plexo de molécula de captura-material alvo, quando o material alvo está presente na amostra; (ii) contactar o complexo de nitrocelulose resultante com um material de detecção, para formar um complexo de detecção, quando o complexo de molécula de captura-material alvo está presente na membrana de nitrocelulose; e (iii) analisar o sinal ge- rado do complexo de detecção, a fim de determinar a presença de e/ou a quantidade do material alvo presente na amostra.

[0038] A amostra é tipicamente apresentada como uma solução. Amostras exemplares, que podem ser analisadas usando os métodos da invenção incluem, mas não são limitadas a, sangue, soro, plasma, saliva, urina, uma amostra biológica tal como fecal, escarro ou tecido, e amostras ambientais tais como um amostra de água, uma amostra de solo, uma amostra de ar, e uma amostra de alimento tal como car- ne, peixe, vegetal, bebida, alimento seco, alimento processado, etc.

[0039] O material alvo de câmara de combustão (vasilha metálica) pode ser qualquer substância que exija análise, tal como um antígeno, um anticorpo, uma proteína, um peptídeo, um DNA, um RNA, um PNA, um aptâmero, um ligante, um composto tóxico, lipídeos, hormônios, minerais, bactéria, vírus, macro-vesículas ou micro-vesículas, esos- somas, células, etc.

[0040] A molécula de captura pode ser qualquer molécula, que pode seletivamente se ligar ao material alvo. Moléculas de captura exemplares incluem, mas não estão limitadas à, um antígeno, um anti- corpo, DNA, RNA, PNA, aptâmero, um ligante, um lipídeo, um hormô- nio etc.

[0041] O material de detecção pode também incluir um corpo de sinal, ou uma porção de detecção tal como, mas não limitado a, um fluoróforo, uma partícula magnética, uma enzima, uma nanopartícula, uma nanofibra etc.

[0042] Na presente invenção, dependendo do peso molecular ou da estrutura da molécula orgânica nanoestruturada, a distância e a densidade entre as moléculas de captura, presentes na superfície da membrana de nitrocelulose, podem ser controladas. Em uma modali- dade particular, a distância entre os grupos funcionais da extremidade terminal da região linear (ou a molécula de captura acoplada para esse fim) da molécula orgânica nanoestruturada, pode ser controlada na proporção de cerca de 0,5 nm a cerca de 10 nm. Alternativamente, a densidade da molécula de captura na membrana de nitrocelulose, po- de ser ajustada na proporção de cerca de 0,01 a cerca de 0,1 de mo- léculas de captura por nm?.

[0043] O método de análise usando a membrana de nitrocelulose da invenção, compreende uma molécula orgânica nanoestruturada acoplada não covalentemente, que tem uma molécula de captura aco- plada covalentemente, pode ser usado na forma de um Kkit de ensaio, e pode também ser aplicado a um método de diagnóstico. Em uma mo- dalidade particular, o kit de ensaio da invenção é manufaturado em um tipo de fluxo lateral, ou um kit de ensaio do tipo fluxo contínuo. Entre- tanto, deve ser apreciado que o escopo da invenção não está limitado a esses kits de ensaio em particular.

[0044] A presente invenção também fornece uma molécula orgâni- ca nanoestruturada, que pode ser usada para covalentemente acoplar uma molécula de captura a uma membrana de nitrocelulose. A molé- cula orgânica nanoestruturada inclui uma região linear, que tem um grupo funcional de extremidade terminal, que é usado para covalente- mente acoplar uma molécula de captura. A molécula orgânica nanoes- truturada também inclui uma pluralidade de regiões ramiíficadas. A plu- ralidade de regiões ramificadas inclui um grupo funcional terminal, que pode ser usado para não covalentemente acoplar a molécula de na- noestrutura orgânica à membrana de nitrocelulose.

[0045] O grupo funcional de extremidade terminal da região linear, que pode ser usado para covalentemente acoplar uma molécula de captura, pode ser, por exemplo, um grupo hidroxila, um grupo formila, um grupo carbonila, um grupo carbóxi, um grupo éter, um grupo éster, um grupo nitro, um grupo amino, um grupo de ácido sulfônico, um gru- po fenila, um grupo alquila, um grupo fosfina, um grupo N- hidroxissuccinimida-éster, um grupo aldeído, um epóxido, uma azlac- tona, um carbonil diimidazol, uma maleimida, uma iodoacetila, um dis- sulfeto piridila, um dissulfeto piridila, um hidrato de hidrazida, ou EDC (1-Etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida) HCI). O grupo functional de extremidade terminal típico da região linear, é selecionado do grupo consistindo em um grupo aldeído e um grupo epóxido. Entretanto, de- verá ser evidenciado que o escopo da invenção não é limitado aos grupos funcionais de extremidade terminal acima, da região linear.

[0046] Em algumas modalidades, a região linear da molécula or- gânica nanoestruturada, inclui pelo menos um grupo éter. A presença do grupo éter, melhora a propriedade hidrofílica da molécula orgânica nanoestruturada.

[0047] Ainda em outras modalidades, cada um dos grupo funcio- nais de extremidade terminal, da região ramíificada da molécula orgâ- nica nanoestruturada, é selecionado do grupo consistindo em um gru- po amino, um grupo de ácido sulfônico, um grupo fenila, um grupo al-

quila, um grupo fosfina, um grupo aldeído, um grupo hidroxila, grupo formila, grupo carbonila, grupo carbóxi, grupo éter, grupo éster, grupo nitro e um grupo epóxido. Entretanto, deverá ser apreciado que os grupos funcionais de extremidade terminal da região ramíificada, não são limitados a estes grupos funcionais. Em geral, quaisquer grupos funcionais apropriados, que possibilitam o acoplamento não covalen- temente da molécula orgânica nanoestruturada à membrana de nitro- celulose, podem ser usados.

[0048] Todavia, em outras modalidades, as regiões ramificadas da molécula orgânica nanoestruturada, incluem pelo menos dois, muitas vezes pelo menos três, e tipicamente três, nove ou vinte sete grupos funcionais de extremidade terminal, adaptados para não covalente- mente acoplar a molécula de nanoestrutura orgânica à membrana de nitrocelulose.

[0049] Em algumas modalidades, a molécula orgânica nanoestru- turada compreende uma porção de triazol na sua região linear. Sur- preendentemente e inesperadamente, os presentes inventores desco- briram que a presença de uma porção de triazol, na região linear da molécula orgânica nanoestruturada, fornece um kit de ensaio de mem- brana de nitrocelulose altamente reproduzível e confiável. Além disso, a presença de uma porção de triazol na região linear, também possibi- lita uma estrutura relativamente rígida e fácil de síntese, quando com- parada à outras porções de região linear. Em uma modalidade particu- lar, a molécula orgânica nanoestruturada é de fórmula: L-Q (Tai Fórmula A em que

[0050] L é uma porção de região linear da molécula orgânica na- noestruturada, compreendendo uma porção de triazol, em que L ainda compreende:

[0051] (i) um grupo funcional de terminal da região linear, adapta- do para covalentemente acoplar uma molécula de captura, que é adaptada para seletivamente se ligar à uma molécula alvo, ou

[0052] (2) uma molécula de captura covalentemente acoplada, que é adaptada para seletivamente se ligar a uma molécula alvo;

[0053] Q' é um átomo central da dita molécula orgânica nanoes- truturada, tendo um estado de oxidação de pelo menos 3;

[0054] a' é um número inteiro de 2 para o estado de oxidação de Q-1;e

[0055] cada T é independentemente uma porção da região termi- nal ramificada, da dita molécula orgânica nanoestruturada, compreen- dendo um grupo funcional da região terminal ramificada, que é adap- tado para não covalentemente acoplar a dita molécula orgânica na- noestruturada à dita membrana de nitrocelulose porosa;

[0056] e em que a dita molécula orgânica nanoestruturada é não covalentemente acoplada à dita membrana de nitrocelulose porosa, através de uma pluralidade dos ditos grupo funcionais da região termi- nal ramificada.

[0057] Em algumas modalidades, L compreende uma porção de trialzolila. Todavia, em outras modalidades, L compreende uma porção de 1,2,3-triazolila. Ainda em outras modalidades, L compreende uma porção de 1, ,4-substituída e 1,2,3-triazolila.

[0058] Em uma modalidade particular, L compreende uma porção da fórmula: pe NON ss em que Rº é como definido no presente documento no presente, e Rº é um ligante acoplado à Q'. Em algumas modalidades, Rº é um ligante que tem de cerca de 2 a cerca de 10, tipicamente de cerca de 2 a cer- ca de 8, muitas vezes cerca de 2 a cerca de 6, e mais frequente de 2 a

4 cadeias de átomos. Em uma modalidade particular, Rº é uma porção da fórmula -(CH2)—C(=O)—NRº-, em que Rº é hidrogênio, C1-« alquila ou um grupo de proteção nitrogênio. O termo "alquila" se refere à uma porção de hidrocarboneto monovalente linear saturado de um a doze, tipicamente um a seis átomos de carbono, ou uma porção de hidrocar- boneto monovalente ramificado saturado de três a doze, tipicamente três a seis átomos de carbono. Grupo alquila exemplar inclui, mas não é limitado a metila, etila, n-propila, 2-propila, terc-butila, pentila e simi- lares.

[0059] Deverá ser apreciado que, quando a* é um número inteiro menos do que o estado de oxidação de Q'-1, então Q' pode ser aco- plado a um hidrogênio ou a um grupo alquila, por exemplo, quando Q' é Ce a! é 2, então o composto de Fórmula A pode ser reapresentado como: L-CH(T)2 ou L-CR'(T)2, em que R' é alquila tal como metila, etila, etc.

[0060] Ainda em outra modalidade, a molécula orgânica nanoes- truturada é de fórmula: L-QA[R2=Q2]JaA(R2=Q),[(R=Q) ARY )dylzhn

IA em que

[0061] cada um de a, b, e c é independentemente O ou 1;

[0062] x é 1 quando c é O ou quando c é 1, x é um número inteiro de 1 para o estado de oxidação de Q*-1;

[0063] y é 1 quando b é O ou quando b é 1, y é um número inteiro de 1 para o estado de oxidação de Q1;

[0064] z é 1 quando a é O ou quando a é 1, z é um número inteiro de 1 para o estado de oxidação de Q2—1;

[0065] n é um número inteiro de 1 para o estado de oxidação de Q1;

[0066] L e Q' são como definidos no presente documento no pre-

sente;

[0067] cada um de Q?, O? e Qº é independentemente um átomo ramificado, que tem o estado de oxidação de pelo menos 3;

[0068] cada um de R?, Rô, Rº, e Rº é independentemente um ligan- te; e

[0069] Yéo dito grupo funcional da região terminal ramificada,

[0070] desde que o produto de n, x, y, e z é pelo menos 3. Os |i- gantes R?, Rº, Rº e Rº podem ser alquileno (por exemplo, metileno, etileno, propileno etc.) tendo opcionalmente um heteroátomo tal como O, S ou NR (em que R pode ser H ou C1-Cs alquila). O termo "alquile- no" se refere a uma porção de hidrocarboneto divalente saturado linear saturado, de um a doze, preferivelmente um a seis átomos de carbo- no, ou uma porção de hidrocarboneto divalente saturado ramificado de três a doze, preferivelmente três a seis átomos de carbono. Grupos alquileno exemplares incluem, mas não são limitados a metileno, etile- no, propileno, butileno, pentileno e similares. Em algumas modalida- des, cada um de R?, Rô, Rº e Rº é independentemente selecionado do grupo que consiste em CH; —CH2-O-; -CH2—CH2—; —CH2—CH2-O-; -O-CH2—CH2a—; -CH2— CH CH2O-; -O-CH2—CH2—CH2-; e similares.

[0071] Todavia em outra modalidade, a molécula orgânica nanoes- truturada é da fórmula: N=N ANA matt aaa 9a R aa o

IB em que

[0072] QI, 2, 03, 4, R?, Rà, R4, R5, Y, a, b, Cc, x, y, 2, e n são co- mo definidos no presente documento no presente;

[0073] R? é selecionado do grupo que consiste em:

-O-CHICHIOCH2CHZOCHCHO $ (Fórmula L1); <º -e-CHICH20 CHICHOCH2CH2OCHa . $ (Fórmula L2); -2-CH,CH,OCH,CH,OCH,CH=—=2Z/, $ CH CHÇOCHÇCHZOCHa (Fórmula L3); oR' “$-CHZCHZOCH;CHZOCHZCRZOCHa Z(Fórmula L4); e uma combinação das mesmas, em que

[0074] uma linha pontilhada representa ligação dupla opcional;

[0075] Z é a molécula de captura que é adaptada para seletiva- mente se ligar a uma molécula alvo, e em que no presente o dito Z é covalentemente acoplado, usando o grupo funcional de aldeído do composto de Fórmula L1, ou o grupo funcional de epóxido do compos- to de Fórmula L2.

[0076] Ainda em outra modalidade, a molécula orgânica nanoes- truturada é de fórmula: N=N Rº—-N H DD No CICH20CH2CH2CO2H 3 o

IC em que Rº é como definido no presente documento no presente.

[0077] Algumas moléculas orgânicas nanoestruturadas exempla- res são de fórmula: No Re-NÚ >N = H No CICHOCH,CH,CO,HI; Oo Oo Rº= -3-CHCHOCH,CHzOCHZCHO Rº= -8-CH2CH2O CH3CHZOCH3EHZOCHa< | Fórmula 1 Fórmula 2

[0078] Em geral, a menos que definido de outra maneira, os ter- mos usados no presente documento no presente são bem conhecidos daqueles versados na técnica de química orgânica e bioquímica. Al- guns dos termos específicos, usados no presente documento no pre- sente, são definidos como a seguir.

[0079] O termo "amostra" se refere à um líquido ou à uma solução de amostra incluindo, mas não limitado a uma emulsão, uma disper- são, uma solução homogênea e uma suspensão.

[0080] O termo "fluido biológico" sem refere à todas as amostras clínicas. Fluidos biolóigicos exemplares incluem, mas não são limita- dos a sangue, plasma, soro, urina, mucosa, fluido espinhal, saliva, e qualquer outro fluido biológico que é excretado, secretado, ou transfe- rido internamente a partir do organismo.

[0081] A menos que o contexto exija de outra maneira, os termos "molécula capturando", "molécula de captura", "material capturando", e "material de captura" são usados intercambiavelmente no presente documento no presente, e se referem à uma substância capaz de dire- ta ou indiretamente se ligar a um material alvo. Moléculas de captura exemplares incluem, mas não são limitadas à ácidos nucleicos (por exemplo, DNA, RNA, PNA e os oligonucleotídeos correspondentes), um receptor, um ligante, uma enzima, uma proteína, aptâmero, como também qualquer outro substrato, que pode seletivamente se ligar a um material alvo. Em um exemplo específico, a molécula de captura é um anticorpo que tem uma forte capacidade de ligação a um antígeno desejado.

[0082] Os termos "molécula de detecção", "material de detecção", "substância de detecção", e "porção de detecção" são usados inter- cambiavelmente no presente documento no presente, e se referem à uma substância que possibilita a detecção ou observação de um com- plexo, que é formado entre a molécula de captura e o material alvo. À molécula de detecção pode ser parte da molécula de captura e/ou do material alvo. Desse modo, a necessidade da molécula de detecção não é necessariamente uma molécula separada.

[0083] A molécula de captura pode ser qualquer substância, que pode especificamente reconhecer o material alvo com diferentes sítios de reconhecimento, alvejados pela molécula de captura. Por exemplo, a molécula de captura pode ser (i) um anticorpo incluindo um anticorpo policlonal purificado a partir de um antissoro, obtido pela imunização de um mamífero com uma substância alvo, (ii) um anticorpo produzin- do célula extraída de um mamífero imunizado com a substância alvo, e (iii) um anticorpo monoclonal produzido de um hibridoma, obtido pela fusão com células de mieloma, podem ser usados. O anticorpo poli- clonal para a substância alvo, pode ser obtido através do método de purificação, conhecido da pessoa versada na técnica, tal como (i) sal- gando um antissoro, (ii) cromatografia de troca de íon, (iii) cromatogra- fia de afinidade etc. O anticorpo monoclonal para o material pode ser obtido por uma pessoa versada na técnica, tal como: imunizando um animal apropriado tal como um rato, com uma substância alvo, fundin- do o esplenócito com células de mieloma, e usando método tal como ELISA (ensaio de imuno-absorvente ligado à enzima), selecionando um clone produzindo um anticorpo, que especificamente liga à um ma- terial alvo, e depois usando ascite, obtido inoculando uma sobrenadan- te ou hibridoma adequado, em um animal apropriado. Anticorpos con- tra o material alvo, desse modo obtidos, podem ser usados como mo- lécula de capturas, imobilizando o anticorpo em um suporte tal como membrana de nitrocelulose, como descrito no presente documento no presente.

[0084] Em geral, na produção de um anticorpo, um animal experi- mental adequado, tal como, por exemplo, mas não limitado a, um coe- lho, um carneiro, um hamster, um porquinho da Índia, um camundon- go, um rato ou uma galinha, é exposto a um antígeno, contra o qual um anticorpo é desejado. Tipicamente, um animal é imunizado com uma quantidade eficaz de antígeno, que é injetado no animal. Uma quantidade eficaz de antígeno se refere à uma quantidade necessária para induzir a produção de anticorpo pelo animal. O sistema imune do animal é depois deixado para responder durante um período de tempo pré-determinado. O processo de imunização pode ser repetido até o sistema imune ser descoberto, para produzir anticorpos para o antíge- no. A fim de obter anticorpos policlonais específicos para o antígeno, o soro é coletado do animal que contém os anticorpos desejados (ou no caso de uma galinha, o anticorpo pode ser coletado dos ovos). Tal so- ro é útil como um reagente. Anticorpos policlonais podem ser ainda purificados a partir do soro (ou ovos) através de, por exemplo, tratar o soro com sulfato de amônio.

[0085] Anticorpos monoclonais podem ser produzidos, por exem- plo, de acordo com a metodologia de Kohler e Milstein (Nature, 1975, 256, 495-497). Por exemplo, linfócitos B são recuperados a partir do baço (ou qualquer tecido adequado) de um animal imunizado, e depois fundidos com células de mieloma, para obter uma população de célu- las de hibridoma, capazes de crescimento contínuo no meio de cultura apropriado. Hibridomas produzindo o anticorpo desejado, são selecio- nados testando a capacidade do anticorpo produzido pelo hibridoma, para ligar ao antígeno desejado.

[0086] Anticorpos podem também ser usados como um material de detecção, para reconhecer um material alvo complexado com uma molécula de captura, rotulando uma porção de sinal tal como uma en- zima, uma substância fluorescente, ou um ouro coloidal no anticorpo. Quando um anticorpo que tem uma porção de sinal de material de de- tecção rotulado, tipicamente um anticorpo monoclonal é usado, a fim de obter uma alta seletividade para a substância alvo. Entretanto, quando a molécula de captura é um anticorpo monoclonal, o anticorpo policlonal pode ser usado como um material de detecção.

[0087] O termo "incubação" na presente invenção, significa que a reação entre o anticorpo de antígeno, ou o DNA ou RNA complemen- tares, são preservados em uma temperatura constante (por exemplo, dentro de + 5ºC, tipicamente dentro de + 3ºC e muitas vezes dentro de + 1ºC). Uma reação de anticorpo de antígeno é uma ligação seletiva de um anticorpo para um antígeno, tendo uma estrutura complemen- tar. Como usada no presente documento no presente, uma reação de DNA ou RNA complementar, é uma reação em que o DNA ou RNA de cada filamento, que tem 100% de sequência de base complementar para hibridização. Desse modo, a composição e o método da inven- ção, podem ser usados para distinguir um único polimorfismo de nu- cleotídeo ("SNP")l.

[0088] O termo "lavando" é usado de uma maneira largamente aceitável. Tipicamente, o termo "lavando" significa lavar ou remover o material remanescente, usando um solvente ou uma solução sem rea- gir com uma molécula de captura, ou o material alvo (por exemplo, an- ticorpo ou uma hibridização de ácido nucleico) no processo de incuba- ção. Não existe limitação particular, enquanto ela não afeta a formação da molécula do complexo do material alvo de captura (por exemplo, anticorpo de antígeno ou hibridização de ácido nucleico). Um tensoati- vo pode ser adicionado para intensificar a limpeza ou o efeito da lava- gem. Em adição, o método de lavagem ou limpeza não é particular- mente limitado, uma vez que ele é eficaz para o processo de formação de complexo total. Lavar ou limpar é uma etapa opcional, que pode ser realizada para aumentar a sensibilidade da análise removendo um si- nal que potencialmente interfere na substância.

[0089] Na presente invenção, a temperatura da reação na etapa de incubação, e a geração de sinal do corpo de sinal, não é particu- larmente limitada. Entretanto, a fim de prevenir a perda da atividade do sinal de enzima, ou a solução da reação de congelamento ou evapo-

ração, a ligação da molécula de captura a um material alvo, é conduzi- da em uma faixa de temperatura de cerca de 4ºC a cerca de 40ºC. Quando uma rápida terminação do sinal é desejada em uma comple- xação de enzima-ligante, a faixa de temperatura de formação do com- plexo tipicamente varia de cerca de 15ºC a cerca de 40ºC.

[0090] Durante um processo de incubação, para formar um com- plexo entre uma molécula de captura e uma molécula alvo, um tempo de incubação mais longo, geralmente leva a uma quantidade maior de formação do complexo molécula de captura-material alvo. Entretanto, a reação da ligação (isto é, a formação do complexo) pode se tornar saturada, depois de um certo período de tempo. A fim de fornecer uma rápida análise, é desejável reduzir o tempo de formação do complexo (isto é, a incubação). Quanto maior a quantidade de molécula de cap- tura carregada (isto é, não covalentemente imobilizada) no suporte de NCM, maior a sensibilidade, e o tempo de reação ou incubação pode ser diminuído, como mais material alvo pode ser complexado para a molécula de captura. Por outro lado, uma porção em que o material alvo faz impedimento estérico, por bloquear o sítio da reação (isto é, a formação do complexo), a eficiência é diminuída; dessa maneira, é ne- cessário otimizar a quantidade de molécula de captura carregada (isto é, imobilizada) sobre a membrana de nitrocelulose. Como usado no presente documento no presente, o termo "imobilizada", quando se referindo ao acoplamento da molécula orgânica nanoestruturada à uma membrana de nitrocelulose, se refere a ter substancialmente tudo (tipicamente > 90%, muitas vezes > 95% e mais frequente > 99%) da molécula orgânica nanoestruturada, em uma membrana de nitrocelu- lose seca, permanecendo acoplada à membrana de nitrocelulose du- rante o processo de ensaio.

[0091] Uma vez que a molécula de captura está imobilizada sobre a superfície da membrana de nitrocelulose, através de uma molécula orgânica nanoestruturada, a distância entre cada moléculas de captura pode ser relativamente controlada, através da molécula orgânica na- noestruturada. Isto elimina ou reduz significativamente o problema de reprodutibilidade insatisfatória na análise quantitativa, devido ao impe- dimento estérico.

[0092] Os termos "fluorescência", "quimioluminescência", "quimio- fluorescência" e "colorimétrico" são bem reconhecidos para uma pes- Soa versada na técnica. Tipicamente, estes termos se referem ao fato de que uma cor ou luz (fluorescência, luminescência) é emitida, ou po- de ser detectada usando qualquer um dos métodos analíticos conhe- cidos da pessoa versada na técnica.

[0093] Durante uma etapa de análise dos métodos divulgados no presente documento no presente, o sinal pode ser medido ou determi- nado semi-quantitativamente ou qualitativamente usando o olho nu. Tipicamente, entretanto, o sinal é medido por um instrumento (por exemplo, um instrumento colorimétrico, espectrômetro UV/Vis etc.) a fim de quantitativamente ou qualitativamente analisar o sinal. Como bem conhecido pela pessoa versada na técnica, "quimioluminescên- cia", "fluorescência química", e "fluorescência" são tipicamente medi- das da intensidade de fluorescência ou quimioluminescência, emitidas pelo sensor de imagem do sistema de aparelho óptico. Tal sinal pode ser quantitativamente ou qualitativamente analisado.

[0094] A menos que o contexto exija de outra maneira, os termos "detecção" e "análise" se referem às etapas para confirmar a presença de um material alvo. Os termos incluem determinação qualitativa, a fim de confirmar a presença ou ausência do material alvo, como também uma determinação quantitativa ou semi-quantitativa de concentração da substância alvo.

[0095] Tipicamente, a amostra é um fluido ou uma solução que tem uma fluidez, a fim de facilitar a ligação seletiva ou específica, entre o material alvo (se presente na amostra) e a molécula de captura, que é imobilizada no suporte de NOM. Entretanto, deverá ser apreciado que a amostra não é limitada a um fluido. Por exemplo, se a amostra é um sólido, ela pode ser dissolvida ou dispersada em uma solução usando um solvente apropriado.

[0096] Em relação à quantidade de amostra requerida para a me- dição (isto é, ensaio), não existe requisito em particular para a quanti- dade de amostra requerida, desde que a quantidade de amostra seja bastante suficiente para permitir a detecção/quantificação do material alvo, se presente na amostra, através da molécula de captura afixada no suporte de NOM. A amostra pode ser diluída antes do ensaio. En- tretanto, a diluição da amostra vai diminuir a concentração do material alvo. Desta maneira, existe uma possibilidade de que a detecção ou quantificação do material alvo pode se tornar difícil, devido à concen- tração diminuída do material alvo na amostra. Em tal caso, o tempo de incubação pode ser aumentado, afim de possibilitar um tempo suficien- te para a formação do complexo da molécula de captura-material alvo, se o material alvo está presente na amostra. Alternativamente, a quan- tidade de molécula de captura pode ser aumentada, a fim de compen- sar a concentração reduzida do material alvo. A quantidade típica da amostra usada em um método analítico da invenção, varia de cerca de uL a cerca de 200 uL. Entretanto, deverá ser apreciado que a quan- tidade de amostra usada na análise não está limitada a essas propor- ções. De fato, qualquer quantidade de amostra que seja suficiente pa- ra possibilitar a formação de um complexo, entre a molécula de captu- ra e o material alvo, pode ser usada em métodos da invenção.

[0097] A molécula de captura que é imobilizada no suporte de NCM, é covalentemente acoplada ao grupo funcional da extremidade terminal da região linear da molécula orgânica nanoestruturada. Gru- pos funcionais apropriados da extremidade terminal da região linear terminal da molécula orgânica nanoestruturada incluem, mas não são limitados a, uma hidroxila, uma formila, uma carbonila, uma carboxila, um grupo éter, um grupo éster, um grupo nitro, um grupo amino, um grupo de ácido sulfônico, um grupo fenila, um grupo alquila, um grupo fosfina, N-hidroxissuccinimida-éster, aldeído, epóxido, azlactona, car- bonil diimidazol, maleimida, iodoacetila, dissulfito de piridila, hidrazida e EDC (1-Etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida) HCI).

[0098] Em algumas modalidades, a fim de evitar, ou para significa- tivamente reduzir a interação entre o material alvo desejado, e a por- ção da não molécula de captura da membrana de nitrocelulose, desse modo gerando um sinal positivo falso, a pessoa pode bloquear ou ex- tinguir a porção de não molécula de captura da membrana de nitroce- lulose. Por exemplo, quando a molécula de captura é uma proteína, tratando a membrana de nitrocelulose com uma solução que contém caseína, albumina bovina, ou gelatina, reduz significativamente ou evi- ta a interação não seletiva, entre a porção de não molécula de captura da membrana de nitrocelulose e o material alvo.

[0099] Métodos da invenção podem ser usados para detectar/ analisar qualquer material alvo desejado. Materiais alvos desejados, que podem ser detectados/analisados pelas membranas de nitrocelu- lose e métodos da invenção incluem, mas não são limitados a, bioma- teriais (tais como antígenos, anticorpos, proteínas, lipídeos, peptídeos, DNA, e RNA), compostos tóxicos, minerais, bactérias, vírus, vesículas macro e micro, esossoma e células, e não-biomateriais tais como dro- gas, pigmentos, metais pesados.

[00100] Métodos da invenção podem também incluir a captura de um material alvo, com dois anticorpos (por exemplo, um como uma molécula de captura e o outro como um material de detecção). Tal mé- todo é similar a um ensaio de imunossorvente ligado à enzima ("ELI- SA"), mas oferece uma confiabilidade e reprodutibilidade substancial-

mente mais elevadas. Além do mais, os métodos da invenção são sig- nificativamente mais precisos, e requerem uma quantidade significati- vamente menor de material alvo para detecção/análise. Tais métodos são particularmente úteis para materiais alvos, que têm um peso mo- lecular de um peptídeo contendo 12 a 15 amino ácidos.

[00101] “Quando o material alvo é uma substância inorgânica tal como uma vitamina, ou uma substância de peso molecular baixo tal como glucose, o anticorpo como uma molécula de captura não é apro- priado. Em tais casos, a competição mútua entre materiais, similar ao material alvo e um rastreador de sinal particular, podem ser usados.

[00102] Objetivos, vantagens, e novas características adicionais desta invenção, se tornarão evidentes para aqueles versados na técni- ca, mediante exame dos exemplos a seguir dos mesmos, que não são destinados a ser limitantes. Nos Exemplos, os procedimentos que são construtivamente reduzidos para praticar, são descritos no tempo pre- sente, e os procedimentos que foram realizados em laboratório, são relatados no tempo passado.

EXEMPLOS Exemplo 1

[00103] Neste exemplo, uma molécula de captura que é adaptada para detectar um biomarcador de infarto do miocárdio agudo (isto é, troponina cardíaca Il(cTnl)), foi usada para determinar a quantidade apropriada de molécula orgânica nanoestruturada, requerida para uma análise quantitativa altamente reproduzível.

[00104] Soluções aquosas de sal de potássio da molécula orgânica nanoestruturada (MW 762.93, Ca7H41K3N4O14), foram preparadas em uma proporção molar de 0.4, 1.0, 4.1, e 5.1, em relação ao número de mols da molécula de captura, anticorpo específico para cTnl. As solu- ções de molécula de nanoestrutura orgânica preparadas, foram distri- buídas em uma membrana de nitrocelulose (CNPC, Advanced Micro-

devices, India), em uma proporção de 0,35 uL/cm para formar uma |i- nha, e secas em um secador a 40ºC, e uma umidade relativa de 10% por cerca de 10 minutos. Depois disso, quatro tipos de membranas de nitrocelulose, tendo diferentes quantidades de moléculas orgânicas nanoestruturadas, foram preparadas por um processo similar com se- cagem em um secador de 60ºC, e uma umidade relativa de 10% ou menos, por 24 horas. A fim de comparar o efeito da quantidade de mo- lécula orgânica nanoestruturada, uma membrana de nitrocelulose su- prida sem nenhuma molécula orgânica nanoestruturada e água, foi preparada somente como um controle. O anticorpo de captura especí- fica cTnl (0,027 mM, 0,35 uL/cm de taxa de distribuição) foi distribuído na mesma posição para regenerar a linha, e seco em um secador a 40ºC e 10% de umidade relativa, por cerca de 10 minutos, depois ele foi seco em um secador a 60ºC e uma umidade relativa de 10% ou menos, por 24 horas.

[00105] Um kit do tipo de fluxo lateral, foi preparado usando essas membranas. Várias concentrações de antígeno cTnl (8T62, HyTest, Finlândia) diluídas com soro humano (Sigma-Aldrich, Louis, MO) (FSDTM 647, excitação máxima a 650 nm), foram colocadas no kit de ensaio, seguidas por uma ligação immunoblot com 100 ul de cada grupo de teste e de cada grupo de controle. Uma porção de emissão máxima de 665 nm (BioActs, Corea) foi sanduichada com um anticor- po polimerizado cTnl de ligação específica (4121 clone 19C7, HyTest, Finlândia). O sinal de fluorescência foi detectado usando luz de excita- ção de um diodo a laser (650 nm), e um fotodiodo equipado com um filtro óptico, com um corte de comprimento de onda abaixo de 660 nm. A fluorecência de 665 nm emitida foi medida, usando um leitor fluores- cente sensível à luz. Os valores de sinais de fluorescência medidos, foram obtidos integrando as áreas da linha de controle e a área da li- nha de teste, e convertendo o valor da integração da área linha de tes-

te na proporção de T / C, dividida pelo valor de integração da área da linha de controle. Uma curva padrão foi plotada para a concentração da substância alvo (cTnl) (Figura 3).

[00106] As emissões de cada amostra foram medidas 16 vezes e convertidas, usando uma equação padrão, obtida através da curva pa- drão, e o gráfico de CV (%) foi obtido usando o coeficiente de variação (CV), calculado com o valor médio e o desvio padrão das concentra- ções convertidas. (Figura 3).

[00107] Os valores da concentração a 10% de CV de cada quanti- dade de suprimento das nanoestruturas orgânicas, foram comparadas usando as equações obtidas da linha de tendência, na forma de uma linha de energia no gráfico de CV, contra a concentração de amostra.

[00108] A concentração de 2,03 ng/mL a 10% de CV, foi obtida da membrana de nitrocelulose de controle, tendo uma molécula de captu- ra imobilizada na ausência de uma molécula orgânica nanoestrutura- da, e a concentração de 1,95 ng/mL a 10% de CV, foi obtida a partir da membrana de nitrocelulose de controle, com a molécula de captura imobilizada, na ausência de uma molécula orgânica nanoestruturada, depois do tratamento com água.

[00109] No grupo de teste, incluindo as moléculas orgânicas na- noestruturadas de 0,4, 1,0, 4,1, e 5,1 vezes o número de mols relativos da molécula de captura, as concentrações a 10% de CV foram 6,70 ng / mL, 8,380 ng / mL, 0,40 ng / mL, e 2,55 ng / mL, respectivamente. Das quatro concentrações diferentes, os kits imobilizados em uma mem- brana de nitrocelulose, com tratamento de 4,1 vezes o número de mols da molécula orgânica nanoestruturada, em comparação com a molé- cula de captura, deram os melhores resultados reproduzíveis (Figu- ra3). Neste fluxo lateral e tipo rápido de plataforma de inspeção, a mo- lécula orgânica nanoestruturada, tratada com 4,1 vezes o número mo- lar relativo da molécula de captura, mostrou o desempenho de 10% de

CV de cerca de 5 vezes menor do que aquele da análise quantitativa imobilizada, indicando que a capacidade padrão tinha melhorado em termos de reprodutibilidade. Exemplo comparativo 1

[00110] Neste exemplo comparativo, foram examinados os efeitos das membranas de nitrocelulose a partir de diferentes fabricantes. Re- sumidamente, kits de fluxo lateral foram preparados usando 4,1 vezes o excesso molar da molécula orgânica nanoestruturada, em compara- ção com a molécula de captura, e ensaiada por marcadores de infarto do miocárdio agudo no soro de ser humano. A detecção da substância alvo cTnl como um biomarcador, foi realizada a 10% de CV, a fim de comparar o efeito do melhoramento quantitativo. Membranas de nitro- celulose de três fabricantes diferentes (HF-135 de Millipore, Imuno- pore RP de GE healthcare, e CNPC de Advanced Microdevices) foram imobilizados com a molécula de captura, usando uma molécula orgâ- nica nanoestruturada. Através de um controle, uma membrana foi também imobilizada com a molécula de captura, sem o uso de qual- quer molécula orgânica nanoestruturada.

[00111] Diferentes concentrações ((0, 0,15, 0,3, 0,6, 1,25, e 2,5 ng/mL) de antígeno cTnl (8T62, HyTest, Finlândia) em soro humano (Sigma-Aldrich, Louis, MO) foram preparadas. Um 100 uL de amostras foram colocadas em cada teste e kit de controle, e sanduichadas com anticorpo de detecção de ligação específica de cTnlI (4T21 clone 19C7, HyTest, Finlândia), polimerizadas com fluorescente (FSD'Y 647, 650 nm de excitação máxima, 665 nm de emissão máxima, BioActs, Co- rea). O sinal de fluorescência foi detectado pela luz de excitação com um diodo a laser (650 nm), e uma leitora que detecta 665 nm de fluo- rescência de emissão, usando fotodiodo equipado com um filtro óptico, que corta o comprimento de onda para abaixo de 660 nm, foi usada.

[00112] Os testes foram repetidos oito vezes cada um. A curva pa-

drão para a concentração do material alvo (cTnl), foi obtida integrando a área da linha de controle e o teste, e convertendo o valor de integra- ção da linha de teste na proporção de T/C. Usando a equação padrão obtida a partir da curva padrão, o valor médio e o desvio padrão foram determinados. Estes valores foram depois usados para calcular o CV (%), e o gráfico de CV de concentração foi plotado. Ver a Figura 4. Uma linha de tendência no gráfico CV da concentração da amostra, foi feita na forma de exponenciação, e a concentração a 10% de CV foi calculada. O efeito de melhoramento quantitativo, foi determinado para a membrana de nitrocelulose a partir de cada fabricante.

[00113] Para membranas de nitrocelulose de controle, em que a molécula de captura foi imobilizada sem usar uma molécula orgânica nanoestruturada, 10% de CV de concentração de HF-135, Immuno- pore RP, e concentração de CNPC, foram 2,81 ng/mL, 5,94 ng/mL, e 1,73 ng/mL, respectivamente. Ver a Figura 4. Para o grupo de teste a membrana imobilizada com a molécula orgânica nanoestruturada, a concentração de 10% de CV de HF-135, Immuno-pore RP, e CNPC foram 0,96 ng/mL, 0,73 ng/mL, e 0,24 ng/mL, respectivamente. Ver a Figura 4.

[00114] “Como mostrado na Figura 4, usando uma molécula orgâni- ca nanoestruturada para imobilizar uma molécula de captura, leva a uma reprodutibilidade melhorada da análise quantitativa, variando de 2,93 a 8,14 vezes em comparação com as membranas de nitrocelulo- se de controle. Ver a Figura 4. Exemplo 2

[00115] Este exemplo demonstra a melhoria em reprodutibilidade do ensaio quantitativo, para um material alvo usando uma membrana de nitrocelulose da presente invenção.

[00116] Neste exemplo, um Kkit de ensaio de teste foi feito por pri- meiro covalentemente acoplar uma molécula de captura à molécula orgânica nanoestruturada, usando um grupo funcional de extremidade terminal da região linear da molécula orgânica nanoestruturada. O grupo funcional de extremidade terminal da região linear da molécula orgânica nanoestruturada, usado em covalentemente acoplar a molé- cula de captura, foi um aldeído ou um grupo funcional de epóxido. À molécula orgânica nanoestruturada foi depois não covalentemente imobilizada na membrana de nitrocelulose, usando o procedimento do Exemplo 1. Testes de ensaio foram realizados de maneira similar àquelas descritas nos Exemplos acima, para determinar a melhoria em reprodutibilidade do ensaio quantitativo.

[00117] Uma molécula orgânica nanoestruturada, que tem um gru- po de função da extremidade terminal da região linear de aldeído, foi covalentemente ligada com uma molécula de captura. Resumidamen- te, a quantidade de molécula orgânica nanoestruturada usada, foi 4,1 vezes a quantidade de molécula de captura. Similarmente, uma molé- cula orgânica nanoestruturada tendo um grupo de função da extremi- dade terminal da região linear de epóxido, foi covalentemente ligada com uma molécula de captura. Membranas de nitrocelulose de teste foram preparadas por imobilização não covalentemente da molécula orgânica nanoestruturada para uma membrana de nitrocelulose. As membranas de controle foram também preparadas, por diretamente acoplar a molécula de captura à membrana de nitrocelulose, na au- sência da molécula orgânica nanoestruturada.

[00118] Um kit do tipo de fluxo lateral foi preparado, usando estas membranas. Várias concentrações de antígeno cTnl no soro de ser humano, foram preparadas como descrito acima. Para cada kit de tes- te, 100 ul da amostra foram colocados e sanduichados com anticorpo cTnl de detecção de ligação especifica (4121 clone 19C7, HyTest, Fin- lândia), polimerizado com fluorescente (FSD'Y 647, 650 nm de excita- ção máxima, 665 nm de emissão máxima, BioActs, Corea). O sinal de fluorescência foi detectado usando um diodo a laser (650 nm), e detec- tando 665 nm de fluorescência de emissão, usando fotodiodo equipa- do com um filtro óptico, com corte do comprimento de onda abaixo de 660 nm. Este procedimento foi repetido oito vezes por membrana de nitrocelulose.

[00119] A curva padrão para a concentração do material alvo (cTnil), foi obtida integrando a área da linha de controle e a área da linha de teste, e convertendo o valor de integração da área da linha de teste em proporção de T/C. CV (%) foi calculado usando os valores médios e os desvios padrão das concentrações convertidas. Ver a Figura 5. Uma linha de tendência no gráfico de CV da concentração da amostra, foi feito na forma de exponenciação, e a concentração a 10% de CV foi calculada. Quando a molécula orgânica nanoestruturada, com um al- deído e um grupo de função da extremidade terminal da região linear de epóxido foram usados, os resultados mostraram melhoramento na confiabilidade do ensaio quantitativo.

[00120] Os 10% de CV para a membrana de nitrocelulose de con- trole, a membrana de nitrocelulose com uma molécula orgânica na- noestruturada, tendo um grupo funcional da extremidade terminal da região linear de epóxido, e a membrana de nitrocelulose com uma mo- lécula orgânica nanoestruturada, tendo um grupo de função da extre- midade terminal da região linear de aldeído foi 1,90 ng/mL, 0,28 ng/mL, e 0,27 ng/mL, respectivamente. Figura 5. Isto indica que uma membrana de nitrocellulose, com uma molécula orgânica nanoestrutu- rada, tem a análise quantitativa melhorada, independentemente do tipo de grupo funcional da extremidade terminal da região linear da molé- cula orgânica nanoestruturada. Figura 5. Exemplo 3

[00121] Este exemplo determina o melhoramento em reprodutibilida- de dos kits de ensaio de fluxo lateral, que têm compostos de nanoestru-

tura orgânica com uma carga positiva (MW 657.07, CasHs2CIaN;7O7), ou uma carga negativa (MW 762.93, Ca7Ha1K3N4O 14).

[00122] Uma molécula orgânica nanoestruturada (MW 762.93, C27H41K3N4O14) que tem uma carga negativa na extremidade terminal da região ramificada, e uma molécula orgânica nanoestruturada, que tem uma carga positiva (MR 657.07, CoaHs2CI3N;7O7), foram covalen- temente acopladas a uma molécula de captura. Resumidamente, 4,1 molares equivalentes das moléculas orgânicas nanoestruturadas, ten- do um grupo funcional da extremidade terminal da região linear de epóxido, foram preparados com anticorpo de cTnl como descrito aci- ma. As membranas de controle de nitrocelulose foram também prepa- radas, em que a molécula de captura foi acoplada direcionada para a membrana de nitrocelulose, sem o uso de uma molécula orgânica na- noestruturada.

[00123] Um kit do tipo de fluxo lateral foi preparado usando estas membranas. Várias concentrações de antígeno cTnl no soro de ser humano, foram preparadas como descrito acima. Para cada kit de tes- te de ensaio, 100 ul da amostra foi colocado e sanduichado com o anticorpo cTnl de detecção de ligação específica (4121 clone 19C7, HyTest, Finlândia), polimerizado com fluorescente (FSDTM 647, 650 nm de excitação máxima, 665 nm de emissão máxima, BioActs, Co- rea). O sinal de fluorescência foi detectado usando um diodo a laser (650 nm), e detectando 665 nm em fluorescência de emissão, usando fotodiodo equipado com um filtro óptico, com um corte do comprimento de onda abaixo de 660 nm. Este procedimento foi repetido oito vezes por membrana de nitrocelulose.

[00124] A curva padrão para a concentração de material alvo (cTnl) foi obtida integrando a área de controle e a área da linha de teste, convertendo o valor de integração da área da linha de teste na razão (relação) de T/C. CV (%) foi calculada usando os valores médios e os desvios padrão das concentrações convertidas. Ver a Figura 6. Uma linha de tendência no gráfico de CV da concentração de amostra, foi feita na forma de exponenciação, e a concentração a 10% de CV foi calculada. Quando a molécula orgânica nanoestruturada, com uma extremidade do terminal da região ramificada positiva, e uma extremi- dade do terminal da região ramificada negativa foi usada, os resulta- dos mostraram melhoramento na confiabilidade do ensaio quantitativo.

[00125] Os 10% de CV para a membrana de nitrocelulose de con- trole, membrana de nitrocelulose com uma molécula orgânica nanoes- truturada, que tem uma extremidade do terminal da região ramificada negativa, e a membrana de nitrocelulose com uma molécula orgânica nanoestruturada, que tem uma extremidade do terminal da região ra- mificada positiva, foi 1,82 ng/mL, 0,29 ng/mL, e 0,42 ng/mL, respeciti- vamente. Figura 6. Isto é equivalente à melhoria da confiabilidade do ensaio quantitativo de 6,26 vezes e 4,33 vezes, respectivamente, para uma molécula orgânica nanoestruturada, da extremidade do terminal negativa do terminal da região ramíificada, e uma molécula orgânica nanoestruturada de extremidade do terminal da região ramificada posi- tiva, respectivamente. Como pode ser visto, parece que um aperfeiço- amento quantitativo melhor foi obtido, quando a molécula orgânica na- noestruturada da extremidade do terminal da região ramificada é nega- tivamente carregada. Ver a Figura 6. Exemplo 4

[00126] Neste exemplo, os kits do tipo de fluxo lateral, que têm três (MW 762.93, Co7Ha1K3N4O14) e nove grupos funcionais do terminal da região ramificada (MW 1949.41, CesHosKoN7O38), foram preparados e testados.

[00127] Os kitsde teste de ensaio correspondentes e os testes de ensaio, foram conduzidos como descrito acima. A concentração de 10% de CV para o controle, a molécula orgânica nanoestruturada, ten-

do três grupos funcionais do terminal da região ramificada, e a molécu- la orgânica nanoestruturada, tendo nove grupos funcionais do terminal da região ramificada, foi 1,97 ng/mL, 0,30 ng/mL, e 0,36 ng/mL, res- pectivamente. Ver a Figura 7. Isto é equivalente ao melhoramento em confiabilidade do ensaio quantitativo de 6,57 vezes e 5,47 vezes, res- pectivamente, em comparação ao grupo de controle. Figura 7. Exemplo 5

[00128] Neste exemplo, kits de teste foram preparados por dois mé- todos diferentes. O primeiro método foi um método sequencial, em que uma molécula orgânica nanoestruturada foi acoplada primeiro a uma membrana de nitrocelulose, e uma molécula de captura foi acoplada à molécula orgânica nanoestruturada. O segundo método envolveu ligar covalentemente uma molécula de captura a uma molécula orgânica nanoestruturada, antes da imobilização da molécula orgânica nanoes- truturada à uma membrana de nitrocelulose.

[00129] No primeiro método, 0,111mM (4,1 equivalentes relativos à molécula de captura) da molécula orgânica nanoestruturada (MW

762.93, Ca7Ha1K3N4O 14), foi distribuído para uma membrana de nitroce- lulose (CNPC, Advanced Microdevices, Inc.), em uma taxa de distri- buição de 0,35 ulL/cm para formar uma linha. A membrana de nitroce- lulose resultante foi seca a 40ºC, em uma umidade relativa de 10% ou menos, por cerca de 10 minutos, e depois ainda seca a 60ºC sob uma umidade relativa de 10% ou menos, por 24 horas. O anticorpo de cap- tura específico cTnl (0,027 mM, 0,35 uL/cm de taxa de distribuição), foi distribuído na mesma posição, e seco a 40ºC em 10% de umidade re- lativa por cerca de 10 minutos, e ainda seca a 60ºC sob uma umidade relativa de 10% ou menos, por 24 horas.

[00130] Para o segundo método, 0,111 mol da molécula orgânica nanoestruturada (FW 762.93, Co7H41K3N4O 14, 4,1 equivalentes em mol relativos à molécula de captura), foi misturado com a molécula de cap-

tura, isto é, anticorpo cTnl, (0,027 mM). A mistura foi reagida por 3 ho- ras com agitação a 37ºC. A mistura de reação resultante foi distribuída sobre uma membrana de nitrocelulose (CNPC, Advanced Microdevi- ces, Índia), em uma taxa de distribuição de 0,35 uL/cm, a fim de formar uma linha e seca a 40ºC em 10% de umidade relativa, por cerca de 10 minutos. A membrana de nitrocelulose foi ainda seca a 60ºC, sob uma umidade relativa de 10% ou menos por 24 horas.

[00131] Kits de ensaio do tipo fluxo lateral foram preparados, usan- do as membranas preparadas pelos dois métodos acima. E o ensaio foi conduzido como descrito acima. A concentração de 10% de CV do controle, a membrana de nitrocelulose preparada pelo primeiro méto- do, e a membrana de nitrocelulose preparada pelo segundo método foi 1,75 ng/mL, 0,31 ng/mL e 0,29 ng/mL, respectivamente. Ver a Figura

8. Isto é equivalente à melhoria em confiabilidade do ensaio quantitati- vo de 5,65 vezes e 6,03 vezes, respectivamente, em comparação ao grupo de controle. Figura 8.

[00132] A discussão anterior da invenção foi apresentada para fins de ilustração e descrição. O anterior não é destinado a limitar a inven- ção, para a forma ou formas divulgadas no presente documento no presente. Embora a descrição da invenção tenha incluído a descrição de uma ou mais modalidades, e certas variações e modificações, ou- tras variações e modificações estão dentro do escopo da invenção, por exemplo, como pode estar dentro da habilidade e conhecimento da- queles versados na técnica, depois de compreender a presente divul- gação. É pretendido obter direitos que incluem modalidades alternati- vas até o ponto permitido, incluindo estruturas alternadas, intercambi- áveis e/ou equivalentes, funções, faixas ou etapas para aquelas rei- vindicadas, sejam ou não tais estruturas alternadas, intercambiáves e/ou equivalentes, funções, faixas ou etapas são divulgadas no pre- sente documento no presente, e sem pretender publicamente dedicar qualquer matéria patenteável.

Todas as referências citadas no presen- te documento no presente, estão incorporadas por referência em sua totalidade.

Claims (18)

UT REIVINDICAÇÕES

1. Membrana de nitrocelulose porosa, caracterizada pelo fa- to de que compreende um composto de nanoestrutura orgânica, com- preendendo uma pluralidade de porções da extremidade de terminal, que são não covalentemente acopladas a uma superfície da dita membrana de nitrocelulose, e em que a dita nanoestrutura orgânica ainda compreende uma molécula de captura covalentemente ligada, em que no presente a dita nanoestrutura orgânica compreende: um átomo central; uma região ramiíficada, que tem a dita pluralidade de por- ções de extremidade de terminal, que não são covalentemente aco- pladas à superfície da dita membrana de nitrocelulose porosa; e uma região linear, que tem uma molécula de captura cova- lentemente ligada na extremidade do terminal da dita região linear, em que no presente a dita molécula de captura é adaptada para seletiva- mente se ligar a um material alvo.

2. Membrana de nitrocelulose porosa de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizada pelo fato de que, no presente, a dita região ramiíficada da dita nanoestrutura orgânica, compreende pelo menos três porções de extremidade do terminal, que não são covalentemente acopladas à superfície da dita membrana de nitrocelulose.

3. Método para produzir uma membrana de nitrocelulose porosa, caracterizado pelo fato de que é adaptado para detectar a pre- sença de uma molécula alvo em uma amostra, o dito método compre- endendo: (A) imobilizar uma nanoestrutura orgânica em uma superfí- cie da dita membrana de nitrocelulose, através de uma pluralidade de acoplamentos não covalentes, em que a dita nanoestrutura orgânica compreende: (i) um átomo central;

(ii) uma região ramificada que tem uma pluralidade de porções da extremidade do terminal, que não são covalentemente acopladas à superfície da dita membrana de nitrocelulose porosa; e (iii) uma região linear que tem uma molécula de captu- ra covalentemente ligada, em uma extremidade terminal da dita região linear, em que a dita molécula de captura é adaptada para seletiva- mente se ligar ao material alvo, quando o material alvo está presente na amostra; ou (B) (i) imobilizar uma nanoestrutura orgânica em uma su- perfície da dita membrana de nitrocelulose, através de uma pluralidade de acoplamentos não covalentes, em que a dita nanoestrutura orgâni- ca compreende: (a) um átomo central; (b) uma região ramificada, que tem uma pluralidade de por- ções da extremidade do terminal, que não são covalentemente aco- pladas à superfície da dita membrana de nitrocelulose porosa; e (c) uma região linear compreendendo uma extremidade do terminal, que tem um grupo funcional adaptado para covalentemente acoplar uma molécula de captura, que é adaptada para seletivamente se ligar ao material alvo, quando o material alvo está presente na amostra; e (ii) reagir a molécula de captura com o grupo funcional da extremidade terminal da dita região linear, sob condições suficien- tes para produzir uma região linear da dita nanoestrutura orgânica, que compreende uma molécula de captura covalentemente acoplada.

4. Método parar detectar uma presença de uma molécula alvo em uma amostra, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende: (a) contatar uma membrana de nitrocelulose porosa de acordo com a reivindicação 1, com uma amostra sob condições sutfici-

entes, para possibilitar a ligação do material alvo à molécula de captu- ra, que está presente em uma extremidade do terminal linear da dita nanoestrutura orgânica, quando o material alvo está presente na amostra, dessa maneira formando uma molécula do complexo de cap- tura-material alvo; (b) contatar um material de detecção para a membrana de nitrocelulose porosa da dita etapa (a) , em que o dito material de de- tecção compreende uma molécula de detecção, que seletivamente se liga ao complexo de molécula de captura-material alvo, quando o complexo de molécula de captura-material alvo está presente; e (c) analisar a membrana de nitrocellulose porosa da dita etapa (b) , a fim de determinar a presença do material alvo na amostra.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de análise (c) , compreende análise quantitativa, análise qualitativa ou uma combinação das mesmas.

6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que cada uma da pluralidade de extremidades do terminal da região ramificada da dita nanoestrutura orgânica, independente- mente compreende uma carga positiva ou uma carga negativa, desse modo possibilitando o acoplamento não covalente da região ramificada da dita nanoestrutura orgânica, à superfície da dita membrana de ni- trocelulose porosa.

7. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a dita molécula de detecção compreende uma enzi- ma, um fluoróforo, uma partícula magnética, uma nanopartícula, uma partícula de metal, uma partícula de nanofibra, ou uma combinação das mesmas.

8. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a dita molécula de captura, é selecionada do grupo consistindo em um antígeno, um anticorpo, DNA, RNA, PNA, aptâme-

ro, lipídeo, um hormônio, uma substância inorgânica, uma célula, um ligante, e uma combinação dos mesmos.

9. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a amostra é selecionada do grupo consistindo em uma amostra biológica, uma amostra química, uma amostra ambiental, e uma amostra de valor nutritivo.

10. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o material alvo é selecionado do grupo consistindo em antígeno, um anticorpo, um peptídeo, um DNA, um RNA, um PNA, um aptâmero, um ligante, um metabólito, um composto tóxico, um lipídeo, um hormônio, bactéria, vírus, uma esossoma, uma macro-vesícula, uma micro-vesícula, uma célula, e uma combinação dos mesmos.

11. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a dita nanoestrutura orgânica é um composto de fór- mula 1 ou 2: Reno = H A enocnencos, (o) Rº= -3-CHZCHZOCHZCHZOCHZCHO Rº= “$-CHZOHZO CHZCHzOCHzCHzOCHa < | Fórmula 1Fórmula 2

12. Kit de ensaio para analisar a presença de um material alvo em uma amostra, caracterizado pelo fato de que o dito kit de en- saio compreende uma membrana de nitrocelulose porosa como defini- da na reivindicação 1.

13. Kit de ensaio de acordo com a reivindicação 12, carac- terizado pelo fato de que a dita molécula de captura é selecionada do grupo consistindo em um antígeno, um anticorpo, um DNA, um RNA, um PNA, um aptâmero, um lipídeo, um hormônio, uma substância inorgânica, uma célula, um ligante, um peptídeo, e uma combinação dos mesmos.

14. Kit de ensaio de acordo com a reivindicação 12, carac- terizado pelo fato de que o dito kit de ensaio é um tipo de fluxo contí- nuo, um tipo de fluxo lateral, ou uma mistura de microfluídicos e mem- branas de nitrocelulose.

15. Membrana de nitrocelulose porosa, caracterizada pelo fato de que compreende uma superfície, e uma não covalentemente imobilizada molécula orgânica nanoestruturada da fórmula: L-Q AT) a1 Fórmula A em que L é uma porção da região linear da dita molécula orgânica nanoestruturada, compreendendo uma porção de triazol, em que L ainda compreende: (i) um grupo funcional de terminal da região linear, adaptado para covalentemente acoplar uma molécula de captura, que é adaptada para seletivamente se ligar a uma molécula alvo, ou (2) uma molécula de captura covalentemente acoplada, que é adaptada para seletivamente se ligar à molécula alvo; Q' é um átomo central da dita molécula orgânica nanoes- truturada, que tem um estado de oxidação de pelo menos 3; a' é um número inteiro de 2 para o estado de oxidação de Q-1;e cada T é independentemente uma porção da região de ter- minal ramificada, da dita molécula orgânica nanoestruturada, compre- endendo um grupo funcional da região de terminal ramificada, que é adaptada para não covalentemente acoplar a dita molécula orgânica nanoestruturada, à dita membrana de nitrocelulose porosa; e em que a dita molécula orgânica nanoestruturada, é não covalentemente acoplada à dita membrana de nitrocelulose porosa, através de uma pluralidade dos ditos grupos funcionais de terminal da região ramificada.

16. Membrana de nitrocelulose porosa de acordo com a rei- vindicação 15, caracterizada pelo fato de que a dita molécula orgânica nanoestruturada é de fórmula: LQAHIR-Q2JA(R-Q%) p[(R=Q) ARY) Jykzh

IA em que cada um de a, b, e c é independentemente O ou 1; x é 1 quando c é O ou quando c é 1, x é um número inteiro de 1 para o estado de oxidação de Q*-1; y é 1 quando b é O ou quando b é 1, y é um número inteiro de 1 para o estado de oxidação de Q1; z é 1 quando a é O, ou quando a é 1, z é um número inteiro de 1 para o estado de oxidação de Q21; n é um número inteiro de 1 para o estado de oxidação de QI; L e Q' são como definidos na reivindicação 15; cada um de Q?, Qº? e Qº é independentemente um átomo de ramo, que tem o estado de oxidação de pelo menos 3; cada um de R?, Rô, Rº, e Rº é independentemente um ligan- te; e Yéo dito grupo funcional da região do terminal ramificado, desde que o produto de n, x, y, e z seja pelo menos 3.

17. Membrana de nitrocelulose porosa de acordo com a rei- vindicação 16, caracterizada pelo fato de que a dita molécula orgânica nanoestruturada é de fórmula: ANsn AA A ÇÃ ra Ra AR- Ra Ra o

IB em que QI, Q2, Q3, 4, R?, Rà, R4, R5, Y, a, b, Cc, X, y, z, e n são co- mo definidos na reivindicação 16; Rº é selecionado do grupo que consiste em: -$-CHzCHZOCHZCHZOCH2CHO , (Fórmula 1) ; o 87 CH3CHzO CH LCHOCHZCH20CHo < | (Fórmula 2) ; [grEHZCHZOCHZOHZOCHZCH=AZ Es mula 3): oR' “3-CHZCHZOCH;CHZOCHZE ROCHA Z(Fórmula 4) ; e uma combinação dos mesmos, em que uma linha pontilhada representa uma ligação dupla opcio- nal; Z é a molécula de captura, que é adaptada para seletiva- mente se ligar a uma molécula alvo, e em que o dito Z é covalente- mente acoplado, usando o grupo funcional aldeído do composto de Fórmula 1, ou um grupo funcional epóxido do composto de Fórmula 2.

18. Membrana de nitrocelulose porosa de acordo com a rei- vindicação 17, caracterizada pelo fato de que a dita molécula orgânica nanoestruturada é de fórmula: N=n Rº—N H A YCICH2OCH2CH2CO2H]; o

IC em que Rº é como definido na reivindicação 17.