JP2023521549A - マイクロ流体デバイスにおけるイムノアッセイを介した総タンパク質含量の測定及びタンパク質の検出のための方法 - Google Patents

Abstract

本明細書中に記載する一部の実施形態は、イムノアッセイ及び総タンパク質技術を単一のサンプル実行において組み合わせるように操作可能なシステム及び方法に関する。本明細書中に記載する一部の実施形態によって、複数の連続イムノアッセイを同じマイクロ流体デバイスにおいて実施することが可能になる。本明細書中に記載する一部の実施形態は、イムノアッセイに関連付けられる一次抗体を除去するように操作可能なストリッピング試薬に関する。そのようなストリッピング試薬によって、追加のイムノアッセイ及び／又は総タンパク質アッセイを同じサンプルで実施することが可能になる。【選択図】図２Ｆ

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／０１０，４３６号、並びに２０２０年７月１７日にそれぞれ出願された米国仮特許出願第１６／９３２，４４１号及び１６／９３２，４４５号の優先権及び利益を主張する。前述の特許出願の各々の開示全体が、参照によりその全体において本明細書により組み込まれる。

本明細書中に記載する実施形態は、一般的に、サンプルでイムノアッセイ及び／又はタンパク質量アッセイを実施するためのキャピラリー電気泳動方法に関する。ストリッピング試薬が開示されており、イムノアッセイに関連付けられる抗体を除去するために操作可能であり、追加のアッセイを同じサンプル上で実施できるようにする。

タンパク質研究の重要な部分は、不均一なサンプル、例えば数千のタンパク質を含みうる細胞可溶化物などの内のタンパク質の特徴付けることを含む。ウェスタンブロットは、目的のタンパク質を特定するために抗体の特異性を使用し、これらの複雑なサンプル内の特定のタンパク質を分析するために使用される、一般に使用されるイムノアッセイベースの方法である。ウェスタンブロットフォーマットにおいてイムノアッセイを実施する場合、結果として得られたイムノアッセイシグナルを定量化することがますます重要になってきている。定量化のための一つの方法は、イムノアッセイシグナルをサンプル中の総タンパク質含量に対して標準化することである。これは、ウェスタンブロットの結果を公表する際に、データの正確性及び精度を保証するために、ジャーナルによりますます要求されている。

既存のシステムは、完全に自動化されたマイクロ流体ベースの（例、キャピラリーベースの）イムノアッセイ、例えばＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ’ｓ（登録商標）Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（登録商標）機器などを提供するよう操作可能である。一部のそのようなシステムは、キャピラリーにおいて、従来のゲルベースのウェスタンブロットと類似したサイズ分離を伴うイムノアッセイを組み合わせることが可能である。サンプル、分離マトリクス、スタッキングマトリクス、抗体、及び試薬は、自動的に充填することができる。機器は、分離マトリクス、次にスタッキングマトリクスを各々のキャピラリー中に吸引するように操作可能でありうる。次に、不均一なタンパク質混合物を含みうるサンプルを充填し、キャピラリーを泳動緩衝液と接触させることができる。電圧を適用し、分子量又は他の適切な特性による分離を可能にすることができる。一度、分離が完了すると、ＵＶ光によってタンパク質をキャピラリー壁に固定化することができる。タンパク質のイムノプロービングを行い、例えば、タンパク質を固定化し、マトリクスをキャピラリーから除去することができる。加えて、一部の既存のシステムは、「総タンパク質」アッセイを提供するように操作可能であり、それは、キャピラリーの内表面に固定化されたタンパク質のビオチン化、それに続く、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートストレプトアビジン及び化学発光反応の検出を通じて行うことができる。

しかし、同じキャピラリー又は他のマイクロ流体デバイスにおけるイムノアッセイ及び総タンパク質の読み出しの両方についての化学発光検出を可能にする方法についてのニーズが存在する。また、検出モダリティ／チャネルの数を上回ってマルチプレックス能力を増加させることが望ましい。

本明細書中に記載する一部の実施形態は、イムノアッセイ及び総タンパク質技術を単一のサンプル実行において組み合わせるように操作可能なシステム及び方法に関する。化学発光検出能力及び蛍光検出能力の両方を有する機器、例えばＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ（登録商標）によるＪｅｓｓ（登録商標）などは、「タンパク質標準化」方法を提供することができ、それにより、蛍光色素が、例えば、ＮＨＳエステルアミンカップリングを介して、全ての分離及び固定化されたタンパク質分子に共有結合的に付着される。この方法では、特定の標的を、例えば、イムノアッセイに関連付けられる化学発光を使用して測定することができる一方で、充填された総タンパク質の測定値を蛍光シグナルから決定する。タンパク質標準化のための公知の技術は、典型的には、典型的なウェスタンブロットスタイルのイムノアッセイと類似のダイナミックレンジを有し、イムノアッセイを、化学発光検出を使用して実行されたのと同じキャピラリーにおいてマルチプレックス化することはできない。対照的に、本明細書中に記載するタンパク質標準化の実施形態は、化学発光イムノアッセイを用いて同じキャピラリー中でマルチプレックス化することができ、イムノアッセイシグナルと比較し、減少した又は異なるダイナミックレンジを有しうる。

同じキャピラリー又は他のマイクロ流体デバイスにおいて総タンパク質及びイムノアッセイを実施することに加えて、本明細書中に記載する一部の実施形態によって、複数の連続イムノアッセイを同じキャピラリーにおいて実施することが可能になる。化学発光検出能力及び蛍光検出能力の両方を有する機器（例、ＰｒｏｔｅｉｎＥａｓｙ’ｓ（登録商標）Ｊｅｓｓ（登録商標））によって、「マルチプレックス」検出、即ち、化学発光検出又は蛍光検出のいずれかのための部分とコンジュゲートされた抗体の単一の混合物を使用したキャピラリー内での複数の標的の検出が可能になる。しかし、単一の混合物中で抗体を組み合わせることによって、例えば、イムノアッセイのために使用される抗体の交差反応性の結果としての非特異的シグナル、又は同じキャピラリーにおいて使用された場合での抗体についての不適合なダイナミックレンジ（例、化学発光に対する蛍光についての異なるダイナミックレンジ）に起因して、いずれの抗体を混合することができるかが制約される。

本明細書中に記載する実施形態は、ウェスタンブロットスタイルのイムノアッセイと同じキャピラリーにおける総タンパク質アッセイ及び／又は第二のイムノアッセイの使用に関し、単純ウェスタン技術で以前に実証された低いサンプル要件及び高いスループット能力と組み合わされた、高い感度の総タンパク質測定及びイムノアッセイを可能にする。

図１Ａ～１Ｈは、一実施形態による、ストリッピング及びイムノアッセイ再プロービング方法において生じる事象を例証する。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。

図２Ａ～２Ｈは、一実施形態による、ストリッピング及び総タンパク質再プロービング方法において生じる事象を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。

図３は、三つの異なる標的についてのストリッピング効率ｖｓ．ｐＨを例証する。

図４は、ストリッピング効率ｖｓ．より広いｐＨ範囲を例証し、ｐＨ＞４．５でのストリッピング効率における有意な低下を実証している。

図５Ａ及び５Ｂは、ストリッピング試薬を導入した後のプロービング分析物の再現性を例証する実験データを示す。 同上。

本明細書中に記載する一部の実施形態は、キャピラリー又は他の適切なマイクロ流体デバイスにおいて行われる電気泳動を介して分離されたサンプル上で複数のイムノアッセイを実施するために適切な方法に関する。サンプルは、少なくとも第一の分析物及び第二の分析物が、異なるバンド中に分離されるように分離することができる。第一の分析物及び第二の分析物は、キャピラリー内で固定化することができる。第一の分析物に選択的に結合する（及び、場合により、第二の分析物に結合しない）ように構成された第一の一次抗体を、キャピラリー中に導入することができる。第一の一次抗体に選択的に結合するように構成された第一の二次抗体を、キャピラリー中に導入することができる。第一の分析物は、第一の二次抗体に関連付けられる光学特性に基づいて検出することができる。例えば、第一の二次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートすることができ、第一の分析物は、ＨＲＰに関連付けられる化学発光反応に基づいて検出することができる。第一の分析物から第一の一次抗体を除去するように構成されたストリッピング試薬を、キャピラリー中に導入することができる。第一の分析物及び第二の分析物は、ストリッピング試薬が導入され、第一の一次抗体（第一の二次抗体及び／又はＨＲＰと共に）が除去された後、キャピラリー中で固定化されたままにすることができる。第二の分析物に結合するように構成された第二の一次抗体を次に、例えば、ストリッピング試薬の導入後に導入することができる。第二の一次抗体に結合するように構成された第二の二次抗体を導入することができ、第二の分析物を、第二の二次抗体（例、化学発光反応及び／又は蛍光タグ）に関連付けられる光学特性に基づいて検出することができる。

本明細書中に記載する一部の実施形態は、キャピラリー又は他の適切なマイクロ流体デバイス中で行われる電気泳動を介して分離されたサンプル上でイムノアッセイ及び総タンパク質アッセイを実施するために適切な方法に関する。サンプルからの分析物を分離し、キャピラリーにおいて固定化することができる。タンパク質、例えばビオチンなどに非特異的に結合するように構成された反応性部分を有する分子を、キャピラリー中に導入することができる。同様に記述され、例えば、タンパク質はビオチン化されることができる。少なくとも分析物のサブセットに結合するように構成された一次抗体を、キャピラリーに導入することができる。一次抗体に結合するように構成された二次抗体を導入することができる。分析物のサブセットを、二次抗体に関連付けられる光学特性に基づいて検出することができる。分析物のサブセットから一次抗体を除去するように構成されたストリッピング試薬を導入することができる。固定化された分析物は、ストリッピング試薬が導入され、一次抗体（二次抗体と共に）が除去された後、キャピラリー中に残りうる。分子に結合するように構成された光学的に検出可能な薬剤を、キャピラリー中に導入することができる。分子がビオチンである例では、ストレプトアビジンを導入することができる。ストレプトアビジンは、ＨＲＰにコンジュゲートすることができる、又は、そうでなければ、光学的に検出可能にすることができる。キャピラリー中の全てのビオチン化分析物（例、全てのタンパク質）を、光学的に検出可能な薬剤に関連付けられる光学シグナルに基づいて検出することができる。二次抗体（例、イムノアッセイシグナル）に関連付けられる光学特性は、光学的に検出可能な薬剤（例、総タンパク質シグナル）に関連付けられる光学シグナルに基づいて標準化することができる。一部の実施形態では、この段落の事象が、それらが記載される順序で実施されることが重要でありうる。

イムノアッセイシグナル（又は他の適切なシグナル）を標準化することによって、試験の対象ではないサンプルの間での特定の制御されない差の影響を排除することにより、異なるサンプルからの測定量を正確に比較するための機器及び／又は分析者の能力を向上させることができる。イムノアッセイについては、各々のサンプル中の総タンパク質含量に対して標準化することによって、サンプル組成（例、細胞数、可溶化物希釈）又はピペッティングエラーに起因する変動の影響を排除することができる。加えて、総タンパク質含量に対して標準化することが、特定のハウスキーピングタンパク質（例、ベータアクチン又はベータチューブリン）に対する標準化に有利である。なぜなら、ハウスキーピングタンパク質の発現レベルが、実験的処置により影響を及ぼされうる、又はそれらのイムノアッセイシグナルが、標的タンパク質のそれと同じ線形ダイナミックレンジ中にはないことがあるからである。一実施形態では、標準化は、キャピラリー中のイムノアッセイにより決定された特定のタンパク質の量を、キャピラリー中の総タンパク質と参照キャピラリー中の総タンパク質との比率により割ることにより実施される。

本明細書中に記載する一部の実施形態は、ストリッピング試薬の製剤に関する。ストリッピング試薬は、緩衝液、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、及び界面活性剤を含みうる。ストリッピング試薬は、５を下回るｐＨを有しうる。

本明細書中に記載する一部の実施形態は、ＴＥＣＰを含み、３．０～４．５の間のｐＨを有する、ストリッピング試薬を使用するための方法に関する。ストリッピング試薬を使用し、イムノアッセイに関連付けられる第一の一次抗体を、分析物から除去することができる。分析物は、電気泳動的に分離され、キャピラリーにおいて固定化することができる。イムノアッセイに関連付けられる第一の一次抗体及び第一の二次抗体を、キャピラリー中に導入することができる。第一の一次抗体を、ストリッピング試薬を使用してキャピラリーから除去した後、ストレプトアビジンもしくはビオチン化タンパク質に結合するよう構成された別の適切な試薬、及び／又はサンプル中の分析物に結合するよう構成された第二の一次抗体をキャピラリー中に導入してもよい。

ストリッピング及び再プロービング方法
ストリッピング及び再プロービングによって、ユーザーは、同じキャピラリー（又は他のマイクロ流体デバイス）中で同じ固定化タンパク質を同じ実行で分析することができ、それにより、時間、お金、及び貴重なサンプルを節約することができる。

図 １Ａ－１Ｈは、一実施形態による、ストリッピング及び再プロービング方法において生じる事象を例証する。ストリッピング及び再プロービングを使用し、単一のサンプルで二つ又はそれ以上のイムノアッセイを連続で実施することができる（例、分離及び固定化されたサンプルを再使用する、並びに／或いは各々のイムノアッセイについて追加のサンプルを（再）充填及び／又は（再）分離することを要求することなく）。図 １Ａは、分離され、キャピラリー１１０の表面に固定化されたサンプルの略図である。例えば、分析物は、例えば、米国特許第７，８４６，６７６号及び／又は米国特許公開第２００８／００１７５１２号に示され、記載されているデバイス及び／又は方法を使用して、キャピラリー１１０の表面に共有結合的に結合させることができ、それらの各々の開示全体が、参照によりその全体において本明細書により組み込まれる。示すように、サンプルは二つのバンド１１２及び１１４中に分離されている。各々のバンドは別個の分析物種を表し、キャピラリー１１０の別個の部分において存在している。サンプルが、任意の数の分析物種を含むことができる、及び／又は任意の数のバンド中に分離されることができることが理解されるはずである。

本明細書中で使用するように、用語「分析物」は、電気泳動技術を介して分離される、並びに／或いは本明細書中に提供する方法、装置、及びシステムで検出される任意の分子又は化合物を指す。適切な分析物は、小さな化学分子、例えば、環境分子、臨床分子、化学物質、汚染物質、及び／又は生体分子などを含むが、それらに限定しない。より具体的には、そのような化学分子は、 駆除剤、殺虫剤、毒素、治療的薬物及び／又は乱用薬物、抗生物質、有機材料、ホルモン、抗体、抗体フラグメント、抗体－分子コンジュゲート（例、抗体－薬物コンジュゲート）、抗原、細胞膜抗原、タンパク質（例、酵素、イムノグロブリン、及び／又は糖タンパク質）、核酸（例、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）、脂質、レクチン、炭水化物、全細胞（例、原核細胞、例えば病原性細菌及び／又は真核細胞、例えば哺乳類腫瘍細胞など）、ウイルス、胞子、多糖類、糖タンパク質、代謝物、補助因子、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド（リボ核酸及び／又はデオキシリボ核酸を含む）、遷移状態アナログ、阻害剤、受容体、受容体リガンド（例、神経受容体又はそれらのリガンド、ホルモン受容体又はそれらのリガンド、栄養受容体又はそれらのリガンド、並びに／或いは細胞表面受容体又はそれらのリガンド）、受容体－リガンド複合体、栄養剤、電解質、成長因子及び他の生体分子及び／又は非生体分子、並びにフラグメント及びそれらの組み合わせを含むが、それらに限定しない。一部の実施形態では、分析物はタンパク質又はタンパク質複合体であり、サンプルは細胞可溶化物又は精製タンパク質である。他の適切な分析物は、凝集体、集塊物、ｆｌｏｃ、及び／又は分散相液滴、或いはコロイド及び／又はエマルションの粒子を含むことができる。一度分離されると、分析物の「バンド」は、本明細書中では「分析物種」として言及される。

本明細書中で使用するように、用語「サンプル」は、検出される分析物又は分析物を含む組成物を指す。サンプルは、一部の実施形態では、均一であり、多様な成分（例、異なるタンパク質）を含み、又は不均一であり、一つの成分（例、一つのタンパク質の集団）を含む。一部の例では、サンプルは、天然に生じる、生物学的材料、及び／又は製造された材料でありうる。さらに、サンプルは、天然形態（例、細胞懸濁液）又は変性形態（例、可溶化物）でありうる。一部の例では、サンプルは、単一細胞（又は単一細胞の内容物、例えば、単一細胞からの細胞溶解物、又は精製タンパク質として）もしくは複数の細胞（又は複数の細胞の内容物、例えば、複数の細胞からの細胞溶解物、又は複数の細胞からの精製タンパク質として）、血液サンプル、組織サンプル、皮膚サンプル、尿サンプル、水サンプル、及び／又は土壌サンプルでありうる。一部の例では、サンプルは、生物、例えば真核生物、原核生物、哺乳動物、ヒト、酵母、及び／又は細菌などからでありうる、或いはサンプルはウイルスからでありうる。

サンプルは、任意の適切な移動度パラメータ、例えば電荷、分子量、電気泳動移動度（例、分子量、特徴的な長さ、面積、又は容積、オリゴヌクレオチド長、又は他の適切な特性により影響される）、等電点及び／又は類似のものなどにより分離することができる。例えば、一部の実施形態では、サンプルを、移動度パラメータ、例えば分子量などに基づき、分離マトリクスを含むキャピラリーチューブ中の電気泳動分離に供する。キャピラリーチューブは分離マトリクスを含みうるが、それは、自動化様式で加えることができる。分離マトリクスは、一部の実施形態では、等電点分離マトリクスであり、従来の電気泳動実験において使用されるポリマーゲルの類似の又は実質的に同じ特性、例えばｐＨ勾配などを有する。分離マトリクス中でのキャピラリー電気泳動は、ポリマーゲル、例えばポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲルなどの中での分離に類似しており、そこで、分子は、分子が移動することができる多孔性通路を提供することにより、サンプル中の分子の可動性パラメータに基づいて分離される。

図 １Ｂにおいて示すように、第一の一次抗体１２０は、例えば、分析物の分離及び固定化の後に、キャピラリー１１０中に導入することができる。一部の例では、分析が開始された後、機器は、任意のさらなるユーザーの介入を伴うことなく、第一の一次抗体１２０を自動的に分離し、固定化し、及び／又は導入するように操作可能でありうる。第一の一次抗体１２０は、キャピラリー１２０内の一つ又は複数の分析物種に選択的に結合するように構成することができる。すなわち、一部の例では、第一の一次抗体１２０は、他の（例、非標的）分析物には結合せずに、サンプル／キャピラリー１２０内の特定の標的分析物に結合するように構成することができる。一部の例では、非結合の第一の一次抗体は、例えば、インキュベーション期間後、洗浄工程において除去することができる。

第一の二次抗体１２２は、図１Ｃにおいて示すように、キャピラリー１１０中に導入することができる。第一の二次抗体１２２は、第一の一次抗体１２０に結合するように構成することができる。一部の例では、非結合の第一の二次抗体１２２は、例えば、インキュベーション期間後、洗浄工程において除去することができる。図 １Ｃ及び１Ｄにおいて示すように、二次抗体１２２を、キャピラリー１１０中に導入する前にＨＲＰとコンジュゲートする。図 １Ｄにおいて示すように、化学発光基質１２４、例えば３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＡＢ）、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ルミノール、過酸化物、又は任意の他の適切な発色性基質及び／又は（増強）化学発光基質をキャピラリー中に導入する。二次抗体１２２にコンジュゲートされたＨＲＰは、化学発光基質１２４を触媒し、光学シグナルを生成することができる。

第一の一次抗体１２０で標識された第一の分析物１１２／分析物種を、第一の二次抗体１２２に関連付けられる光学特性に基づいて検出することができる。例えば、第一の二次抗体１２２にコンジュゲートされたＨＲＰに関連付けられる化学発光反応を、経時的に撮られた画像又は一連の画像においてＣＣＤカメラ又は別の適切な検出器により検出及び／又は記録することができる。第一の一次抗体１２０で標識された分析物／分析物種を検出した後、ストリッピング試薬を、図１Ｅにおいて示すように、キャピラリー１１０中に導入することができる。ストリッピング試薬は、第一の一次抗体１２０、第一の二次抗体１２２、及び／又は光学的に検出可能な薬剤１２４を除去するように操作可能でありうる一方で、固定化されたサンプルを別のラウンドのイムノアッセイのために保持する。

図１Ｆ－１Ｈは次に、第二の一次抗体１３０、第二の二次抗体（ＨＲＰで標識）１３２を用いた上記の工程及びその後の第二の検出工程を繰り返す。第二の一次抗体１３０を、第二の分析物１１４に選択的に結合するように構成し、第二の二次抗体１３２を、第二の一次抗体１３０に結合するように構成する。典型的には、第二の一次抗体１３０を、第一の一次抗体１２０とは異なる分析物に選択的に結合するように構成するが、しかし、一部の例では、第二の一次抗体１３０は、例えば、アッセイの再現性、安定性、又は特性を評価するために、第一の一次抗体１２０と同一であることができる。第二の二次抗体１３２は、第一の二次抗体１２２と同じ抗体であることができる、又は異なる二次抗体であることができる。場合により、第二の一次抗体１３０及び／又は第二の二次抗体１３２を、ストリッピング薬剤によって第一の一次抗体１１０が除去された後に導入することができ、それによって、連続的で別個のイムノアッセイを単一のサンプル上で実施することが可能になる。例えば、第一の二次抗体及び第二の二次抗体は、ＨＲＰ標識することができ、及び化学発光基質の存在において光学的に識別不能なシグナルを生成するように構成することができる。第一の分析物１１２を検出した後、及び第二の二次抗体１３２を導入する前に、第一の一次抗体１２０及び第一の二次抗体１２２をストリッピングすることにより、異なる分析物を、同じ光学的に検出可能な薬剤を使用して検出することができる。

図１Ａ－１Ｈは、異なる（分離された）分析物種に選択的に結合する第一の一次抗体１２０及び第二の一次抗体１３０を描写するが、他の実施形態では、第一の一次抗体１２０及び第二の一次抗体１３０は、電気泳動的に区別されていない分析物種の異なるエピトープに選択的に結合するように構成することができる。

化学発光基質１３４は、ＨＲＰ標識二次抗体１３２、及び、従って、第二の分析物１１４／分析物種が、ＨＲＰ／化学発光基質の相互作用に関連付けられる光学シグナルに基づいて検出することができるように、キャピラリー１１０中に導入することができる。

当業者に容易に明らかであろうように、追加のストリッピング工程及び再プロービング工程が可能であり、代替的な検出モダリティ（色検出、蛍光検出など）を、化学発光検出に加えて、又はその代わりに使用することができる。図１Ａ－１Ｈによって、化学発光を介して二つの別個のタンパク質種を検出する二つの連続的なイムノアッセイが記載されている一方で、当業者は、代替的な実施形態によって、同じ標的又は同じタンパク質の二つの異なるエピトープについて二つの異なる抗体が用いられうることを容易に理解するであろう。また、蛍光検出、吸光度、又は任意の他の適切な検出方法を用いてもよく、複数の検出モードの組み合わせを含む。

また、図１Ａ－１Ｈは、特定の標的分析物に選択的に結合するように構成された一次抗体、一次抗体に結合するように構成されたＨＲＰ標識二次抗体、及び化学発光基質の使用を描写している一方で、当業者は、他の検出技術が可能であることを理解するであろう。例えば、図２Ｄを参照して以下で考察するように、二次抗体は、ＨＲＰ標識よりむしろ、蛍光標識することができる。そのような実施形態では、別々の化学発光基質は必要ではないことがある。そのような実施形態では、蛍光標識された二次抗体は、機器により励起され、その発光を検出することができる。さらに他の実施形態では、一次抗体は、ＨＲＰ、蛍光タグで標識することができ、又は他には光学的に検出可能である（例、天然蛍光技術又は吸光度技術を介する）。そのような実施形態では、別々の二次抗体は必要ではないことがある。さらに他の実施形態では、第三、第四などの薬剤を用いてもよい。例えば、二次抗体はビオチン化することができ、光学的に検出可能な薬剤（例、ＨＲＰ又は蛍光タグ）とコンジュゲートされた第三のストレプトアビジンは、分析物に関連付けられる、検出可能なシグナルを増加させることができる。当業者は、異なる検出技術を使用し、異なる分析物種を評価することができることをさらに理解するであろう。例えば、第一の分析種１１２は、図１Ｂ－１Ｄを参照して示し、記載するように検出することができる一方で（例、一次抗体、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体、及び化学発光基質の使用を通じて）、第二の分析種１１４は、ＨＲＰ又は二次抗体の使用を伴わずに、蛍光標識された一次抗体の導入を通じて検出することができる。

一部の実施形態では、図１Ａ－１Ｈを参照して示し、記載する事象の一部又は全てを、イムノアッセイを開始するための指示以外に、自動的に及び／又は追加のユーザーの介入を伴わずに実施することができる。加えて、他の順序も可能であり、本開示の範囲内である一方で、図１Ａ－１Ｈを参照して記載する事象は、記載した順序で実施することができる。

図２Ａ－２Ｈは、一実施形態による、ストリッピング及び再プロービング方法において生じる事象を例証する。図２Ａ－２Ｈにおいて例証する実施形態は、一つ又は複数のイムノアッセイを総タンパク質アッセイと組み合わせるために使用することができる。示すように、総タンパク質アッセイは、ウェスタンブロットスタイルのイムノアッセイと同じキャピラリー及び／又は同じサンプルにおいて実施することができる。他の順序が可能であり、本開示の範囲内であるが、一部の例では、図２Ａ－２Ｈにおいて例証し、以下に記載する事象を、示す順序において実施することが好ましいことがあり、それによって、試薬の劣化が低下する。

図２Ａは、分離され、キャピラリー２１０の表面に固定化されたサンプルの略図である。例えば、分析物は、キャピラリー２１０の表面に共有結合的に結合することができる。示すように、サンプルは、三つのバンド２１２、２１４、及び２１６中に分離されている。各々のバンドは、別個の分析物種を表す。サンプルが、任意の数の分析物種を含むことができる、及び／又は任意の数のバンド中に分離されることができることが理解されるはずである。例えば、一部の例では、サンプルは、単一の分析物種の均質な混合物であることができる。

サンプルが分離及び／又は固定化された後、ビオチン化試薬２２０を、図２Ｂに示すように、キャピラリー２１０中に導入することができる。ビオチン化試薬２２０は、総タンパク質アッセイが（以下でさらに詳細に考察するように）実施することができるように、すなわち、サンプル／キャピラリー２１０中のタンパク質の総量を決定することができるように、全てのタンパク質に結合するように構成することができる。ビオチン化試薬２２０を、任意のイムノアッセイを実施する前に、キャピラリー２１０に加えることが好ましいことがある。なぜなら、ビオチン化試薬は、イムノアッセイ後のキャピラリーに導入されるほど十分に安定ではないためである。例えば、一部の例では、ユーザーは、泳動を開始する直前に（例、サンプルをキャピラリー中に導入する２０分未満前に）ビオチン化試薬を（例、サンプルプレート上に）充填することができる。なぜなら、一部の状況では、ビオチン化試薬は、一度充填されると分解し始めることがあるからである。一部の例では、ビオチン化試薬を、サンプルが分離及び／又は固定化された直後に（例、固定化の５分以内及び／又はサンプルをキャピラリー中に導入してから９０分以内に）キャピラリー中に導入する。場合により、過剰な（例、非結合）ビオチンを、それが導入された後にキャピラリーから洗浄することができる。本明細書中でさらに詳細に考察するように、機器は、平行なレーンにおいて参照サンプルを実行するように操作可能でありうる。同様に記載するように、機器は、同じ又は異なるサンプルを、キャピラリー２１０及び少なくとも一つの参照キャピラリー（示さず）を含む複数のキャピラリー中に充填するように操作可能でありうる。ビオチン化試薬２２０は、キャピラリー２１０中へのビオチン化試薬の導入と同時に、又は、例えば、キャピラリー２１０中へのビオチン化試薬の導入から５分以内に、参照キャピラリー中に導入することができる。典型的には、ビオチン化試薬の安定性プロファイルを考慮して、それを、任意のイムノアッセイをキャピラリー２１０中のサンプルで実施する前に、参照キャピラリー及びキャピラリー２１０中に導入する。

イムノアッセイは、一つ又は複数の一次抗体を導入することにより、キャピラリー２１０中に固定化されたサンプルで実施することができる。図２Ｃにおいて示すように、第一の分析物種２１２に選択的に結合するように構成された第一の一次抗体２２２及び第二の分析物種２１４に選択的に結合するように構成された第二の一次抗体２２４を導入する。しかし、任意の適切な選択的結合特性を伴う任意の数の一次抗体を導入することができることを理解すべきである。加えて、第一の一次抗体２２２、第二の一次抗体２２４、及び／又は任意の他の一次抗体を、連続的に又は実質的に同時に導入する（例、一緒に混合される及び／又は共通試薬リザーバから採取される）ことができる。場合により、過剰な（例、非結合）一次抗体を、キャピラリー２１０から洗浄することができる。

図２Ｄは、キャピラリー２１０への第一の二次抗体２２６及び第二の二次抗体２２８の導入を例証する。第一の二次抗体２２６は、第一の一次抗体２２２に選択的に結合するように構成され、第二の二次抗体２２８は、第二の一次抗体２２４に選択的に結合するように構成される。第一の二次抗体２２６及び／又は第二の二次抗体２２８は、光学的に検出可能な特性を有することができる、又は有するように改変することができる。例えば、二次抗体は、キャピラリー中に導入される前又は後に、光学的に検出可能な薬剤で標識することができる。一部の例では、特定の一次抗体及び、従って、特定の分析物種に関連付けられるよう構成される、異なる二次抗体が、異なる光学特性を有することが望ましいことがある。例えば、図２Ｄは、キャピラリー２１０への導入前に、光学的に検出可能なマーカー（例、蛍光色素）で標識された第一の二次抗体２２６を例証する。場合により、非結合二次抗体及び／又は光学的に検出可能な薬剤を、キャピラリー２１０から洗浄することができる。第二の二次抗体２２８は、例えば、キャピラリー２１０中に導入される前に、ＨＲＰで標識することができる。図２Ｅは、ＨＲＰ標識された第二の二次抗体２２８と相互作用し、光学的に検出可能なシグナルを生成するように構成された化学発光基質の導入を例証する。二次抗体、例えば、化学発光シグナル及び蛍光シグナルに関連付けられる光学特性を、ＣＣＤカメラ又は別の適した検出器により、即時的に及び／又は経時的に収集することができる。そのような光学シグナルを使用し、サンプル中に存在する一部の又は全ての分析物種を同定することができる。例えば、図２Ｅにおいて示すように、分析物種２１２及び２１４がイムノアッセイの間に検出可能であろう。一つの分析物種がＨＲＰに関連付けられ、及び別の分析物種が蛍光色素に関連付けられる例では（例、図２Ｃ～２Ｅにおいて示されるように）、化学発光シグナル及び蛍光シグナルを同時に又は連続的に検出することができる。例えば、蛍光標識された第一の二次抗体２２６を、化学発光基質の導入の前、その間、又は後に励起させることができる。

図２Ｆにおいて示すように、一度、二次抗体の光学特性が検出されると、分析物から一次抗体及び／又は二次抗体を除去するように構成されたストリッピング試薬を、キャピラリー２１０中に導入することができる。ストリッピング試薬は、ビオチン２２０を分析物に結合したままにするように構成される。図２Ｇは、ストレプトアビジン２３２、アビジン、及び／又はビオチンに特異的に結合するように構成された他の適切な試薬のキャピラリーへの導入を例証する。ストレプトアビジンは、ＨＲＰコンジュゲートすることができる（キャピラリー２１０中への導入前又は後）、及び／又は他の方法で標識することができる、もしくは、場合により、光学的に検出可能でありうる。総タンパク質の検出は、例えば、図２Ｈにおいて示すように、化学発光基質を充填し、化学発光シグナルを検出することにより起こりうる（例、ビオチンで標識された各々のタンパク質の量を決定することができる）。一部の例では、各々のバンド中のタンパク質の量を、別々に決定することができる。

タンパク質の総量を決定することによって、総タンパク質含量に対するイムノアッセイシグナルの標準化を可能にすることができる。同様に記載するように、イムノアッセイに関連付けられる光学シグナル（例、一次抗体を通じて分析物種に結合された二次抗体に関連付けられるシグナル）は、タンパク質の量を示している光学シグナル（例、ビオチンを通じてタンパク質に結合されたストレプトアビジンに関連付けられる光学シグナル）に基づいて、補正又は標準化することができる。一部の例では、参照キャピラリー（示さず）を、イムノアッセイシグナルを補正するために適切である参照サンプルで充填することができる。例えば、複数のキャピラリー（例、キャピラリー２１０及び参照キャピラリー）を含むカートリッジを、連続的に又は並列においてサンプルで充填することができる。各々のキャピラリー中のタンパク質を（連続的に又は並列において）ビオチン化することができる。ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン又は別の適切な試薬を、キャピラリー中に（連続的に又は並列において）に導入することができる。化学発光基質はまた、各々のキャピラリー中の総タンパク質量を決定することができるように、キャピラリー中に（連続的に又は並列において）導入することができる。一部の実施形態では、キャピラリー２１０におけるイムノアッセイを介して検出された分析物は、参照キャピラリー中の総タンパク質含量に基づいて標準化することができる。例えば、キャピラリー２１０中の総タンパク質に対する、参照キャピラリー中の総タンパク質の比率を決定することができる。この比率を使用し、個々のタンパク質種のイムノアッセイに関連付けられるシグナルを補正することができる。そのような技術を使用し、イムノアッセイシグナルを補正し、充填の不均一性を考慮することができる。同様に記載するように、強いイムノアッセイシグナルは、サンプル中の他のタンパク質と比べて、高濃度の目的のタンパク質に関連付けられる「真の」シグナルの結果でありうる、又は、それは、例えば、予想よりも多くの細胞の内容物がキャピラリー中に充填された場合、タンパク質の大きな総量に関連付けられうる。

典型的には、分析者は、イムノアッセイ及び／又は総タンパク質測定を開始する前に、サンプル及び／又は適切な試薬を調製し、試薬／サンプルプレートを充填する。一部の実施形態では、イムノアッセイ及び／又は総タンパク質測定を開始した後、一部又は全ての事象（例、サンプル充填、分離、イムノアッセイ及び／又は総タンパク質、検出）を、自動的に及び／又は分析者によるさらなる相互作用を伴うことなく実施することができる。当業者により容易に明らかであるように、追加のストリッピング工程及び再プロービング工程が可能であり、追加の中間洗浄工程を実施して、非結合試薬をキャピラリーから流してもよく、検出モードの異なる組み合わせを使用してもよく、及び／又は代替的な検出モダリティ（色検出、蛍光検出など）を、上の実施形態において記載される正確な組み合わせの代わりに使用することができる。図２Ａ～２Ｈによって、化学発光及び蛍光を介して二つの別個のタンパク質種を検出し、その後に総タンパク質測定が続くことが記載されている一方で、当業者は、代替的な実施形態が、同じ標的又は同じタンパク質の二つの異なるエピトープについて二つの異なる抗体を用いることができうると容易に理解するであろう。また、蛍光検出、吸光度、又は任意の適切な周知の検出方法を用いてもよく、複数の検出モードの組み合わせを含む。

図２Ｃ及び２Ｄは、複数の一次抗体２２２、２２４を実質的に同時に（例、混合物として）、及び複数の二次抗体２２６、２２８を実質的に同時に導入することを例証する。対照的に、図１Ｂ～１Ｇは、異なる一次抗体及び二次抗体を連続的に導入することを例証し、第一の二次抗体１２２の導入と第二の一次抗体１３０の導入の間に生じたストリッピング事象を伴う。しかし、図１Ａ～Ｈに関して示し、記載する方法が、一次抗体及び／又は二次抗体の混合物の導入を含むことができることを理解すべきである。同様に、図２Ａ～２Ｈに関して示し、記載する方法は、例えば、イムノアッセイ間での追加のストライピング事象を伴う、連続イムノアッセイを含むことができる。

一部の実施形態によれば、本明細書中に記載する方法は、タンパク質含量の測定を行う、並びに／或いは同じキャピラリー中で、及び／又は自動化された様式、例えばＰｒｏｔｅｉｎＥａｓｙ（登録商標）によるＳｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（登録商標）プラットフォームなどでイムノアッセイを実施するために適切な機器上で実施することができる。他の公知の機器及び技術とは異なり、本明細書中に記載する実施形態は、従来のウェスタンブロットについての総タンパク質測定のために使用される従来の方法よりも一般的に単純である。イムノアッセイ及び総タンパク質測定は、化学発光方法又は蛍光方法、或いは当技術分野において公知の他の方法を使用して実施することができる。また、イムノアッセイから抗体を除去するために使用されるストリッピング試薬によって、キャピラリーに固定化された総タンパク質含量の検出の精度が改善される。

図１Ａ～１Ｈを参照して上で考察するように、当業者は、図２Ａ～２Ｈを参照して示し、記載する実施形態が、一例としてのものであり、限定ではないことを理解するであろう。具体的には、当業者は、分析物種を、化学発光技術、蛍光技術、及び／又は吸光度技術の任意の組み合わせを通じて検出することができることを理解するであろう。当業者は、追加の又はより少ない一次抗体及び二次抗体を使用することができることを理解するであろう。当業者は、抗体を、光学的に検出可能な薬剤で予め標識することができること、光学的に検出可能な薬剤を、抗体及び／又は分析物種に選択的に結合するようにキャピラリー中に導入することができること、並びに／或いは分析物種及び／又は抗体が本質的に検出可能である（例、非標識抗体を、例えば、それらの吸光度特性に基づいて検出することができる）ことを理解するであろう。

操作の順序
以前に記載したように、試薬添加の特定の順序が、総タンパク質及びイムノアッセイシグナルをキャピラリー中で測定する場合での改善した性能のために好ましい。実験的エビデンスによって、イムノアッセイが完了した後でのビオチン化試薬の添加によって、イムノアッセイ前にビオチン化試薬を加えた場合に得られたシグナルよりも７０％低いシグナルがもたらされたことが実証される。アッセイについての好ましい検出レベルを得るために、このアッセイにおいてより高いシグナル及び、このように、感度を維持することが重要である。イムノアッセイ前に完全な総タンパク質検出（例、ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンとルミノール／ペルオキシドを使用したビオチン化及び検出）を実施するように試みることができうるが、しかし、これは、恐らくはビオチンへの結合についての極度に高い親和性を有するＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンを除去する際での困難に起因して、望ましくないアッセイ構成である。ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンの不完全な除去は、例えば、標的タンパク質への抗体結合を防止するビオチン化タンパク質に結合した残留ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンを通じて、イムノアッセイ性能にネガティブな影響を及ぼしうる。

ストリッピング試薬製剤
当技術分野において公知であるウェスタンブロット膜からの抗体の除去のために使用される多種多様な製剤がある。これらの製剤は、典型的には、緩衝成分、界面活性剤、変性剤、酸性又は塩基性ｐＨ、及び／又は還元剤を含む。当技術分野において公知の大半のストリッピング緩衝液は、還元剤としてβ－メルカプトエタノールを使用するが、しかし、β－メルカプトエタノールは毒性であり、溶液中で安定でなく、不快な臭気を有し、その使用は、一部の国々において現在制限又は禁止されている。したがって、キャピラリーから、分析物に結合された抗体を除去するためのストリッピング試薬の必要性が存在する。

β－メルカプトエタノールの代わりにＴｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）をホスフィン還元剤として使用したストリッピング試薬製剤が開発されており、表１に示している。テストした表１の製剤の大半が、抗体を除去する際にある程度は機能した一方で、例えば、 Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（登録商標）機器を使用して実施されるように、イムノアッセイの残留シグナルの少なくとも９５％を一貫して除去することが望ましい。好ましくは、ストリッピング試薬はまた、溶液中で安定的であるべきであり、即ち、沈殿又は分解は、一定期間（例、１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、又は任意の他の適切な時間枠）にわたり、保存の間に生じてはならない。表１において見ることができるように、単にβ－メルカプトエタノールをＴＣＥＰで置換することによって、沈殿を伴わずに、一貫して＞９５％のストリッピング効率を達成することはできなかった。多くの抗体にわたり高いストリッピング効率を達成することが重要である。なぜなら、保持された抗体はノイズを生じて、その後のイムノアッセイ工程についての検出限界を下げうるためである。

さらなる最適化を、より広範な滴定及び表１の構成要素と追加の構成要素（例えば異なる界面活性剤及び還元剤など）との新たな組み合わせを通して実施した。ストリッピング効率に対する重要な影響が、Ｔｒｉｚｍａ （トリス塩基；ＣＡＳ：７７－８６－１）濃度、ＴＣＥＰ濃度、及びｐＨを含む一方で、ストリッピング効率は、ＳＤＳ濃度に対して比較的非感受性であることが決定されている。製剤を、表２において示すように、様々なイムノアッセイ（異なる抗体、異なる標的タンパク質）との組み合わせにおいて、Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（登録商標）での抗体除去効率について分析した。製剤を、さらに、沈殿、分解、及び複数の抗体についての≧９５％の抗体除去効率についてテストした。表２におけるいくつかの候補が、これらの基準を満たす。中性又は塩基性ｐＨを伴う製剤は、酸性ｐＨを伴う製剤よりも有意に悪い性能を示した。この観察は驚くべきことであった。なぜなら、ＴＣＥＰが好ましい製剤中の還元剤であり、ＴＣＥＰは、従来の知恵によれば、１．５～８．５の広範なｐＨ範囲にわたり効果的であると考えられ、中性ｐＨ近く（即ち、ｐＨ７近く）で最良の還元性能を伴うからである（Ｈａｎ，Ｊ．Ｃ．ａｎｄ Ｈａｎ，Ｙ．Ｈ．，Ａ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｉｓ（２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ，ａｎ Ｏｄｏｒｌｅｓｓ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ Ｍｏｒｅ Ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｔｈａｎ Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４ Ｊｕｌ；２２０（１）：５－１０を参照のこと。それは参照によりその全体において本明細書により組み込まれる）。また、好ましい製剤は、図３において示すように、狭いｐＨ範囲において最も高い抗体除去効率で作動するように決定され、それによって、＞９７％のストリッピング効率を生成することが可能な好ましい製剤が、４．０５±０．３のｐＨを有することが例証される。図３は、三つの異なる標的、ｐａｒｋ７、ベータアクチン、及びＨＳＰ６０に対するストリッピング効率を例証する。

表１及び表２のストリッピング試薬を、特定された成分を、特定されたモル濃度又はパーセンテージ（重量による）で水と混合することにより調製した。緩衝液種又はＴＣＥＰストックについてのｐＨが報告される場合、これらのｐＨは、組み合わされてストリッピング試薬を形成する前に、その成分のｐＨを示す。ストリッピング試薬を次に、全ての成分が混合された後（例、塩酸、水酸化ナトリウム、又は他の適切な酸もしくは塩基を加えることにより）、示した最終ｐＨに調整する。一部の例では、ｐＨ調整は実施せず、最終ｐＨは、単に、構成要素を組み合わせた後の測定ｐＨである。アスタリスクで示す最終ｐＨ値は、推定最終ｐＨである（即ち、測定は行わなかった）。成分の濃度は１％、５％、又は１０％だけ変動しうるが、依然として発明者らにより企図されるストリッピング緩衝液試薬の組成物の範囲内であることを理解すべきである。緩衝液種、ＴＣＥＰストック、又は最終ｐＨの示されるｐＨは、０．１、０．３、０．５、又は１だけ変動してもよく、依然として発明者らにより企図されるストリッピング緩衝液組成物の範囲内である。報告されたストリッピング効率情報を実験的に観察した。示すように製剤化された緩衝液は、観察されたストリッピング効率を正確に再現しないことがあることが理解すべきである。

図４は、表３において示す製剤の性能を例証し、ｐＨが４．５より大きい場合でのストリッピング効率におけるさらに大きな減少を示す。ｐＨが３未満であった場合での、ストリッピング効率におけるより低い重度の、しかし、顕著な減少（データは図４において示していないが、しかし、表２の個々の行から明らかである）。狭く特異的なｐＨ範囲が、Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（登録商標）キャピラリーにおける最適な抗体除去（≧９５％）のために要求されることを発見したのは驚くべきことであった。これは、Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎキャピラリー対ウェスタンブロット膜の固有の特性及び／又は内部環境に起因しうる。また、キャピラリー中でのストリッピング試薬の複数のインキュベーションによって、抗体除去効率が改善されることが決定された。

図５Ａ及び５Ｂは、ストリッピング試薬を導入した後でのプロービング分析物（ＡＴＫ１及びＡＴＫ２）の再現性を例証する実験データを示すチャートである。同様に記載するように、図５Ａ及び５Ｂにおいて示す結果は、図１Ａ～１Ｈを参照して示し、記載する方法と同様の方法に従って生成された。図５Ｂは、再プロービングの前及び後でのピーク面積変化を例証する（例、ストリッピング試薬の導入を含む）。ＡＴＫ１及びＡＴＫ２を複数のキャピラリー中でプロービング及び再プロービングしたが、分析物がプロービングされた順序を変動させた。この例では、ＡＴＫ１を六つのキャピラリー中で最初にプロービングし、ＡＴＫ２を六つのキャピラリー中で最初にプロービングした。ストリッピング試薬を最初のプロービング後に全ての１２のキャピラリー中に導入し、第一の標的分析物から一次抗体及び二次抗体を除去し、次に、他の標的分析物をプロービングした。図５Ｂにおいて示すように、標的分析物のピーク面積は、ストリッピング試薬又は分析物がプロービングされる順序により有意に影響されない。これは、ストリッピング試薬によって、有意な量の分析物が除去されないことを例証する。

種々の実施形態を上に記載してきた一方で、それらが、例としてだけ提示され、限定ではないことを理解すべきである。例えば、本明細書中に記載する実施形態によって、一般的に、キャピラリーベースの技術が記載されている一方で、任意の適切なマイクロ流体デバイス又は他の電気泳動技術を使用することができることを理解すべきである。例えば、Ｙａｏ，Ｓ．Ａｎｅｘ，Ｄ．Ｓ．，Ｖａｌｄｗｅｌｌ，Ｗ．Ｂ．，Ａｒｎｏｌｄ Ｄ．Ｗ．，Ｓｍｉｔｈ Ｋ．Ｂ，＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．，ＳＤＳ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ Ｃｈａｎｎｅｌｓ，９６（１０） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ５３７２－７７ （Ｍａｙ １１，１９９９）（その開示全体が参照により本明細書により組み込まれる）によって、タンパク質サイジング分離を実施するのに適切なマイクロチャネル及び他のマイクロ流体構造を含むように製作されたチップが記載される。そのようなチップは、本明細書中に記載する方法及び／又はアッセイを実施するように適応させることができる。別の例として、総タンパク質標識に関する、本明細書中に記載する実施形態によって、一般的にビオチン化が記載される。しかし、非特異的タンパク質標識及び検出のための他の適切な技術、例えばｈｉｓ－タグ／抗ｈｉｓ、グルタチオン／グルタチオンｓ－トランスフェラーゼ、マルトース／マルトース結合タンパク質、キチン／キチン結合タンパク質なども可能であることを理解すべきである。当業者は、タンパク質（例、アミノ酸、例えばリジンなど、タンパク質骨格、例えば窒素など、グリカンなどの翻訳後修飾など）と化学的に反応するためのＮＨＳエステル又は他の部分を有する任意の適切な分子が、総タンパク質標識のために適切でありうることを理解するであろう。また、タンパク質の総量を特定し、タンパク質量に基づいて標準化するための技術が記載されてきた一方で、類似の技術が多くの他の分析物について存在することを理解すべきである。例えば、核酸、脂質、及び／又は糖タンパク質の総量の測定を実施することが可能であり、それを次に、キャピラリー間で測定を標準化するために使用することができる。例えば、アミノオキシ反応基を有する分子は、糖、例えば多糖類又はグリカン基などと化学的に反応することができる。同様に、ソラレン基を有する分子は、ソラレン基とチミン及び他のピリミジン含有塩基とのＵＶ光活性化インターカレーションを介してＤＮＡ又はＲＮＡに結合することができる。核酸結合化学は、カルボジイミド架橋剤ＥＤＣ／イミダゾール並びに当技術分野において公知の他の化学的及び酵素的付着方法を含む。同様に、脂質をビオチン化するための方法が、当技術分野において公知である。例えば、Ｈｅｎｒｙ，Ｓｔｅｐｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．‘Ｒａｐｉｄ ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｎｏｎ－ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｒｆａｃｅｓ．’Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ ８．１（２０１８）：１－６，”を参照のこと。その開示全体が、参照により本明細書により組み込まれる。

上に記載する模式図及び／又は実施形態が、特定の配向又は位置において配置された特定の構成要素を示す場合、構成要素の配置は変更してもよい。実施形態が特に示されて、記載されている一方で、形態及び詳細における種々の変化がなされうることが理解されるであろう。種々の実施形態が、特定の特色及び／又は構成要素の組合せを有するものとして記載されてきたが、上で考察するように、実施形態のいずれかからの任意の特色及び／又は構成要素の組合せを有する他の実施形態が可能である。

上に記載する方法及び／又は事象が、特定の順序において生じる特定の事象及び／又は手順を示す場合、特定の事象及び／又は手順の順序は改変されうる。加えて、特定の事象及び／又は手順を、可能である場合に並行プロセスにおいて同時に実施する、並びに上に記載するように連続的に実施してもよい。

Claims (44)

1. マイクロ流体デバイス中の第一の分析物及び第二の分析物を含むサンプルを電気泳動的に分離すること；
   前記マイクロ流体デバイス中の前記第一の分析物及び前記第二の分析物を固定化すること；
   前記第一の分析物に結合するように構成された第一の一次抗体を導入すること；
   前記第一の一次抗体に結合するように構成された第一の二次抗体を導入すること；
   前記第一の二次抗体に関連付けられる光学特性に基づいて前記第一の分析物を検出すること；
   前記第一の分析物及び前記第二の分析物が前記マイクロ流体デバイス中で固定化されたままである一方で、前記第一の一次抗体を前記第一の分析物から除去するように構成されたストリッピング試薬を導入すること；
   前記第二の分析物に結合するように構成された第二の一次抗体を導入すること；
   前記第二の一次抗体に結合するように構成された第二の二次抗体を導入すること；及び
   前記第二の二次抗体に関連付けられる光学特性に基づいて前記第二の分析物を検出することを含む、方法。
2. 前記第一の一次抗体が、前記ストリッピング薬剤が導入される前に導入され；及び
   前記第二の一次抗体が、前記ストリッピング薬剤が導入された後に導入される、請求項１に記載の方法。
3. 前記第一の二次抗体及び前記第二の二次抗体が同じ二次抗体である、請求項１に記載の方法。
4. 前記第一の二次抗体及び前記第二の二次抗体が、区別不能な光学特性を生成するように構成され；及び
   前記ストリッピング試薬が、前記第一の分析物を検出した後、及び前記第二の二次抗体を導入する前に導入される、請求項１に記載の方法。
5. 前記第一の二次抗体が、前記第一の二次抗体に関連付けられる前記光学特性が、西洋ワサビペルオキシダーゼに関連付けられる化学発光反応であるように、前記西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされる、請求項１に記載の方法。
6. 前記第一の二次抗体が、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされ、前記方法が、
   キャピラリー中に化学発光基質を導入することをさらに含み、前記第一の二次抗体に関連付けられる前記光学特性が、化学発光基質と、前記第一の二次抗体にコンジュゲートされたＨＲＰとの相互作用に関連付けられる化学発光シグナルである、請求項１に記載の方法。
7. 前記第一の二次抗体が、前記第一の二次抗体に関連付けられる前記光学特性が化学発光シグナルであるように、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされ；及び
   前記第二の二次抗体が、前記第二の二次抗体に関連付けられる前記光学特性が蛍光シグナルであるように、蛍光色素にコンジュゲートされる、請求項１に記載の方法。
8. 前記第一の分析物及び前記第二の分析物が、前記ストリッピング試薬を導入する前に検出される、請求項７に記載の方法。
9. 前記第一の分析物を検出する前に、非結合の第一の二次抗体を洗浄することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記ストリッピング試薬を導入した後、前記第二の一次抗体を導入する前に、及び前記第一の分析物と前記第二の分析物が前記マイクロ流体デバイス中で固定化されたままである間に、前記第一の一次抗体及び前記第二の一次抗体を前記マイクロ流体デバイスから洗浄することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
11. 前記ストリッピング薬剤が、前記第一の二次抗体を除去するように構成される、請求項１に記載の方法。
12. 前記サンプルを電気泳動的に分離することによって、前記第一の分析物が、前記マイクロ流体デバイスの第一の部分に移動し、及び前記第二の分析物が、前記マイクロ流体デバイスの第二の部分に移動し、前記第一の分析物及び前記第二の分析物が、前記マイクロ流体デバイスの前記第一の部分及び前記マイクロ流体デバイスの前記第二の部分でそれぞれ固定化される、請求項１に記載の方法。
13. 前記第一の一次抗体を導入すること、前記第一の二次抗体を導入すること、前記第一の分析物を検出すること、及び前記ストリッピング試薬を導入することが、前記第二の一次抗体を導入し、及び前記第二の二次抗体を導入する前に起こる、請求項１に記載の方法。
14. 前記第一の一次抗体を導入すること、前記第一の二次抗体を導入すること、前記第一の分析物を検出すること、及び前記ストリッピング試薬を導入すること、前記第二の一次抗体を導入すること、及び前記第二の二次抗体を導入することが、その順序において、及びユーザーの介入を伴わずに起こる、請求項１に記載の方法。
15. 前記ストリッピング試薬が、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を含み、３～４．５のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
16. 前記ストリッピング試薬が、表２から選択される組成物を有し、９５％を上回るストリッピング効率を有し、及び沈殿を示さない、請求項１に記載の方法。
17. マイクロ流体デバイス中の複数のタンパク質を含むサンプルを電気泳動的に分離することと；
    電気泳動分離後に前記マイクロ流体デバイス中で前記複数のタンパク質を固定化すること；
    タンパク質に非特異的に結合するように構成された反応性部分を伴う分子を導入すること；
    前記複数のタンパク質からタンパク質の少なくともサブセットに結合するように構成された一次抗体を導入すること；
    前記一次抗体に結合するように構成された二次抗体を導入すること；
    前記二次抗体に関連付けられる光学特性に基づいて、タンパク質の前記サブセットを検出すること；
    タンパク質の前記サブセットから前記一次抗体を除去するように構成されたストリッピング試薬を導入すること；
    前記分子に結合するように構成された光学的に検出可能な薬剤を導入すること；
    前記光学的に検出可能な薬剤に関連付けられる光学シグナルを検出すること；及び
    前記光学的に検出可能な薬剤に関連付けられる前記光学シグナルに基づいて、前記二次抗体に関連付けられる前記光学特性を標準化することを含む、方法。
18. 前記分子が、前記分子を導入することが、前記複数のタンパク質をビオチン化することを含むようにビオチンであり；及び
    前記光学的に検出可能な薬剤が、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートストレプトアビジンであり、前記方法が、
    前記ＨＲＰと相互作用し、前記光学的に検出可能な薬剤に関連付けられる前記光学シグナルを生成するよう構成された化学発光基質を導入することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記光学的に検出可能な薬剤が、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であり、前記方法が、
    前記ＨＲＰと相互作用し、前記光学的に検出可能な薬剤に関連付けられる前記光学シグナルを生成するように構成された化学発光基質を導入することとをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
20. 前記光学的に検出可能な薬剤に関連付けられる前記光学シグナルに基づく、前記複数のタンパク質の総量、
    前記複数のタンパク質の前記総量に基づいて標準化された前記二次抗体に関連付けられる前記光学特性を決定することさらに含む、請求項１７に記載の方法。
21. タンパク質の前記サブセットが第一のタンパク質であり、前記一次抗体が第一の一次抗体であり、及び前記二次抗体が第一の二次抗体であり、前記方法が、
    前記複数のタンパク質から第二のタンパク質に結合するように構成された第二の一次抗体を導入すること；
    前記第二の一次抗体に結合するように構成された第二の二次抗体を導入すること；
    前記第二の二次抗体に関連付けられる光学特性に基づいて前記第二のタンパク質を検出すること；及び
    前記光学的に検出可能な薬剤に関連付けられる前記光学シグナルに基づいて、前記第二の二次抗体に関連付けられる前記光学特性を標準化することを含む、請求項１７に記載の方法。
22. 前記第一の二次抗体が、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識され、及び前記第二の二次抗体が、蛍光色素で標識される、請求項２１に記載の方法。
23. 前記分子を導入すること、前記第一の一次抗体を導入すること、前記第一の二次抗体を導入すること、前記第一のタンパク質を検出すること、前記第二の一次抗体を導入すること、前記第二の二次抗体を導入すること、前記第二のタンパク質を検出すること、前記ストリッピング試薬を導入すること、前記光学的に検出可能な薬剤を導入すること、及び前記タンパク質に関連付けられる前記光学シグナルを検出することが全て、前記複数のタンパク質が前記マイクロ流体デバイス中で固定化されている間に起こる、請求項２１に記載の方法。
24. 前記分子を導入すること、前記第一の一次抗体を導入すること、前記第一のタンパク質を検出すること、前記ストリッピング試薬を導入すること、前記光学的に検出可能な薬剤を導入すること、及び前記タンパク質に関連付けられる前記光学シグナルを検出することが、その順序で起こる、請求項２１に記載の方法。
25. 前記第二の一次抗体が、前記第一の一次抗体を導入するのと実質的に同時に導入され；及び
    前記第二の二次抗体が、前記第二の二次抗体を導入するのと実質的に同時に導入される、請求項２４に記載の方法。
26. 前記分子を導入すること、前記一次抗体を導入すること、前記二次抗体を導入すること、タンパク質の前記サブセットを検出すること、前記ストリッピング試薬を導入すること、前記光学的に検出可能な薬剤を導入すること、及び前記タンパク質に関連付けられる前記光学シグナルを検出することが全て、前記複数のタンパク質が前記マイクロ流体デバイス中で固定化されている間に起こる、請求項１７に記載の方法。
27. 前記分子を導入すること、前記一次抗体を導入すること、タンパク質の前記サブセットを検出すること、前記ストリッピング試薬を導入すること、前記光学的に検出可能な薬剤を導入すること、及び前記タンパク質に関連付けられる前記光学シグナルを検出することが、ユーザー介入を伴うことなく、その順序で起こる、請求項１７に記載の方法。
28. 前記ストリッピング試薬がトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を含み、３～４．５のｐＨを有する、請求項１７に記載の方法。
29. 前記ストリッピング試薬が、表２から選択される組成物を有し、９５％を上回るストリッピング効率を有し、及び沈殿を示さない、請求項１７に記載の方法。
30. 前記複数のタンパク質からの各々のタンパク質が、共通タンパク質種の分子である、請求項１７に記載の方法。
31. 前記複数のタンパク質が、複数のタンパク質種を含む、請求項１７に記載の方法。
32. 前記ストリッピング試薬を導入した後、前記光学的に検出可能な薬剤を導入する前に、及び前記複数のタンパク質が前記マイクロ流体デバイス中で固定化されたままである間に、前記マイクロ流体デバイスから前記一次抗体及び前記二次抗体を洗浄することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
33. 前記マイクロ流体デバイスが第一のキャピラリーであり；
    前記サンプルが第一のサンプルであり；及び
    前記光学的に検出可能な薬剤に関連付けられる前記光学シグナルが、第一の光学シグナルであり、前記方法が、
    第二のサンプルを第二のキャピラリー中に導入すること；
    タンパク質に非特異的に結合するよう構成された前記反応性部分を伴う前記分子を、前記第二のキャピラリー中に導入すること；
    前記分子に結合するように構成された前記光学的に検出可能な薬剤を、前記第二のキャピラリー中に導入すること；及び
    第二の光学シグナルを検出することであって、前記第二の光学シグナルが前記光学的に検出可能な薬剤及び前記第二のキャピラリーに関連付けられる、検出すること、
    前記第一の光学シグナルと前記第二の光学シグナルとの比率に基づいて、前記二次抗体に関連付けられる前記光学特性を補正することを含む、前記二次抗体に関連付けられる前記光学特性を標準化することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
34. ストリッピング試薬であって、
    緩衝液；
    トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）；及び
    界面活性剤を含み、
    ５を下回るｐＨを有する、ストリッピング試薬。
35. 前記ｐＨが３～４．５である、請求項３４に記載のストリッピング試薬。
36. 前記緩衝液が、
    ８より大きいｐＨを有するＴｒｉｚｍａ；
    ５より小さいｐＨを有するグリシンＨＣｌ；
    ４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）；及び
    ビシンからなる群から選択される、請求項３４に記載のストリッピング試薬。
37. 緩衝液種の濃度が１００～２００ミリモルである、請求項３５に記載のストリッピング薬剤。
38. 前記ストリッピング試薬が、表２から選択される組成物を有し、９５％を上回るストリッピング効率を有する、請求項３４に記載のストリッピング薬剤。
39. 前記ストリッピング試薬が、表２から選択される組成物を有し、９５％を上回るストリッピング効率を有し、及び沈殿を示さない、請求項３４に記載のストリッピング薬剤。
40. マイクロ流体デバイス中の複数の分析物を含むサンプルを電気泳動的に分離すること；
    前記マイクロ流体デバイス中で前記複数の分析物を固定化すること；
    前記複数の分析物からの第一の分析物に結合するように構成された第一の一次抗体を導入すること；
    前記第一の一次抗体に結合するように構成された二次抗体を導入すること；
    前記第一の分析物から前記第一の一次抗体を除去するように構成されたストリッピング試薬を導入することであって、前記ストリッピング試薬が３～４．５のｐＨを有し、及びトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）を含む、導入すること；及び
    前記複数の分析物からの第二の分析物に結合するように構成された第二の一次抗体又は前記複数の分析物と複合体化したビオチンに結合するように構成されたストレプトアビジンの少なくとも一つを、前記ストリッピング試薬を導入した後に導入することを含む、方法。
41. 前記ストリッピング試薬が、
    ８より大きいｐＨを有するＴｒｉｚｍａ；
    ５より小さいｐＨを有するグリシンＨＣｌ；
    ４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）；及び
    ビシンからなる群から選択される緩衝液を含む、請求項４０に記載の方法。
42. 前記ストリッピング試薬が、表２から選択される組成物を有し、及び９５％を上回るストリッピング効率を有する、請求項４０に記載の方法。
43. 前記複数の分析物を固定化した後に、及び前記第一の一次抗体を導入する前に、前記複数の分析物をビオチン化すること；及び
    前記ストリッピング試薬を導入した後にストレプトアビジンを導入することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
44. 前記複数の分析物を固定化した後に、及び前記第一の一次抗体を導入する前に、前記複数の分析物をビオチン化すること；
    前記二次抗体に関連付けられる光学シグナルに基づいて前記第一の分析物を検出すること；
    前記ストリッピング試薬を導入した後にストレプトアビジンを導入することであって、前記ストレプトアビジンがビオチンに結合するように構成された発光剤にコンジュゲートされている、導入すること；
    前記発光剤に関連付けられる光学シグナルを検出すること；
    前記発光剤に関連付けられる前記光学シグナルに基づいて、前記複数の分析物の量を決定すること；及び
    前記複数の分析物の前記量に基づいて、前記二次抗体に関連付けられる前記光学シグナルを標準化することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。

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