KR20210125976A - 비-공유적으로 부착된 유기 나노구조화된 분자를 포함하는 니트로셀룰로스 막 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 니트로셀룰로스(NCM)을 사용하는 표적 분자의 정량적 및/또는 정성적 분석의 개선된 방법을 제공한다. 특히 본 발명은 NCM의 표면에 비-공유적으로 부착되는 유기 나노구조화된 분자 및 표면을 포함하는 다공성 니트로셀룰로스 막을 제공한다. 상기 유기 나노구조화된 분자는 상기 다공성 NCM의 표면에 비-공유적으로 부착되거나 또는 결합되는 복수의 말단 영역(예를 들어 말단 단부) 모이어티를 포함하는 분지된 영역을 가지는다. 상기 유기 나노구조화된 분자는 또한 표적 분자에 선택적으로 결합하도록 조정되는 공유적으로 부착된 포획 분자를 포함한다. 본 발명의 상기 NCM은 상기 유기 나노구조화된 분자 부재하의 NCM에 비해서 개선된 재현성, 신뢰성, 및 선택성을 제공한다.

Description

비-공유적으로 부착된 유기 나노구조화된 분자를 포함하는 니트로셀룰로스 막
본 발명은 표면 및 유기 나노구조화된 분자를 포함하는 다공성 니트로셀룰로스 막(NCM), 및 그의 제조방법 및 사용방법에 관한 것이다. 특히 본 발명의 다공성 NCM는 표면 결합된 유기 나노구조화된 분자를 포함한다. 상기 유기 나노구조화된 분자는 상기 NCM의 표면에 비-공유적으로 부착되거나 또는 결합되는 복수의 말단 영역(terminal region)(예를 들어 말단 단부(terminal end)) 모이어티(moiety)를 포함하는 분지된 영역을 가지는다. 상기 유기 나노구조화된 분자는 또한 표적 분자에 선택적으로 부착되는 공유적으로 부착된 포획 분자를 포함하는 선형 영역을 포함한다.
상기 니트로셀룰로스 막은 셀룰로스로 구성된 다공성 막이다. 다공성 니트로셀룰로스 막은 보통 약 0.2㎛ 내지 약 15㎛ 범위의 중앙값 포어 크기 직경(median pore size diameter)을 가지는다. 니트로셀룰로스는 전체적으로는 중성이지만 상기 NCM의 니트로기와 단백질에 존재하는 쌍극자 모멘트 사이의 강력한 쌍극자 모멘트를 통해서 단백질을 고정시키는데 사용되었다. 일부 경우에서, 상기 단백질의 이온측 사슬은 상기 NCM 위에 단백질을 고정시키는데도 사용되었다. NCM의 단백질을 고정시키는 능력은 사용된 용액의 pH에 따라 변한다. 이론에 근거하지는 않지만, 상기 pH는 용액 중에서 단백질의 특성을 변화시킴으로써 특정 단백질의 고정 효율에 영향을 주는 것으로 여겨진다.
니트로셀룰로스 막은 핵산을 정전기적으로 고정시키는데도 사용되었다. 이중 가닥 DNA에 비해, 니트로셀룰로스는 단일 가닥 DNA 및 DNA-RNA 하이브리드(hybrid)에 대해 특히 높은 친화도를 가지는다. 보통 NCM은 RNA를 고정시키지 않는다. 뉴클레오티드 결합 특성들에서 이러한 차이는 액상 하이브리드 형성 반응에서 단일 가닥 뉴클레오타이드 사슬과 단일 사슬 핵산을 분리하거나 정량화하고, 단백질과 복합체를 형성하는 핵산을 분리하거나 정량화하는데 사용되었다.
니트로셀룰로스 막을 사용하여 표적 재료 또는 물질(예를 들어 단백질, 핵산 등)의 정량 분석에 있어서, 포획 분자(예를 들어 관심 표적 물질에 선택적으로 결합하는 것)로서 사용되는 단백질은 종종 니트로셀룰로스 막에 인쇄되고 생성된 니트로셀룰로스 막을 건조시킨다. 이러한 방식으로, 상기 포획 분자와 상기 니트로셀룰로스 막 표면 사이에 공유결합을 생성하지 않으면서 상기 포획 분자를 상기 니트로셀룰로스 막 위에 고정시킨다(도 1). 이론에 근거하지는 않지만, 니트로셀룰로스 막의 표면 위로의 포획 분자의 상기 비-공유적 고정 또는 부착은 다양한 화학적 및/또는 물리적 수단에 의해서, 예를 들어 제한되지는 않지만 이온성 상호작용, 수소결합, 소수성 상호작용, 반데르 발스 상호작용 등에 의해서 성취될 수 있다. 더욱이, 그리고 다시 이론에 근거하지는 않지만, 비-공유적 부착에서, 하나 이상의 상기 화학적 및/또는 물리적 상호작용의 조합이 니트로셀룰로스 막의 표면 위로의 포획 분자의 상기 비-공유적 고정에 관여될 수 있다. 니트로셀룰로스 막의 표면에 대한 포획성 재료(captive material)(또는 포획 분자)의 비-공유적 부착은 열역학적 현상인 것으로 여겨지며, 쌍극자 모멘트 상호작용 및/또는 소수성 상호작용이 상기 현상의 주요 인자 또는 요소 중의 하나인 것으로 여겨진다.
니트로셀룰로스 막은 실질적으로 단일 방향성 흐름의 용액을 가지는 크로마토그래피 매트릭스로서 작용할 수 있는 다공성 구조의 중합체이다. 이러한 실질적으로 단일 방향성 흐름은 니트로셀룰로스 막이 각종 진단 평가에서 흐름-통과 시험 기타에 사용될 수 있게 한다. 다른 흐름 시험 또는 진단 키트와 마찬가지로, 표적 물질이 포획 분자-표적 물질 복합체를 형성하지 않고 포획 분자가 포함된 고정 영역을 통과하면 샘플 중 표적 분자의 존재를 정확하게 결정할 수 없다. 또한, 유속이 시험마다 서로 다르면 그 시험 또는 진단 키트를 신뢰할 수 없다. 따라서 정확하고 신뢰할 수 있는 시험 또는 진단 키트는 포획 분자-표적 물질 복합체가 형성하기 충분한 시간을 제공할 필요가 있다. 니트로셀룰로스 막에서 일정한 유속을 생성하는 종래의 방법은 막의 기공 크기를 조절하는 것이다.
불행하게도, 유속 및 포어 크기는 흐름-통과 시험 또는 진단 키트의 정확성 및 신뢰성에 요구되는 유일한 인자가 아니다. 예를 들어 표적 물질이 포획 분자와 표적 물질 사이에 복합체를 형성하기 충분한 시간으로 막의 표면에 결합된 포획 분자를 통과하는 경우에도, 포획-표적 물질 복합체를 형성하는데 필요한 반응 부위가 부적절한 배향 또는 니트로셀룰로스 막의 표면 상의 다층의 포획 분자의 존재로 인하여 포획 분자-표적 물질 복합체가 가려지거나(obscured) 또는 접근할 수 없기 때문에 종종 원하는 복합체가 형성되지 않는다. 이러한 요인들은 또한 니트로셀룰로스 막을 사용하는 흐름-통과 시험 또는 진단 키트의 낮은 재현성 및 신뢰성을 초래한다.
따라서 재현성이 높고 신뢰할 수 있는 니트로셀룰로스 막-기반 시험 및 진단 키트에 대한 지속적인 요구가 존재한다.
본 발명의 한 양상은 니트로셀룰로스 막을 사용하는 재현성이 높고 신뢰할 수 있는 시험 및 진단 키트를 제공한다. 본 발명의 니트로셀룰로스 막은 비-공유적으로 결합된 유기 나노구조물(즉, 유기 나노구조화된 분자)을 포함한다. 일부 구현예에서, 유기 나노구조화된 분자는 , 표적 재료 또는 표적 물질에 선택적으로 결합할 수 있는, 공유적으로 부착된(즉, 공유적으로 결합된) 포획 분자 또는 포획 물질을 포함한다. 이론에 근거하는 것은 아니지만, 유기 나노구조화된 분자를 사용하는 경우 표적 물질에 보다 효율적이고 유리하게 포획 분제를 제공하고, 그에 의해서 보다 정확하고 신뢰할 만한 시험/진단 키트를 생성하는 것으로 여겨진다.
본 발명의 유기 나노구조화된 분자의 사용은 더 접근 가능하고 더 구조화된 (즉, 뭉치지 않거나 다층으로 되지 않는) 반응 또는 결합 부위를 초래하여 포획 분자와 표적 물질 사이의 결합에 대한 입체 장애를 상당히 감소시키는 것으로 여겨진다. 포획하는 분자(capturing molecule)가 유기 나노구조물을 막 지지체에 부착시킨 후 유기 나조구조 분자에 부착되거나 인쇄될 때 동일한 효과가 얻어질 수 있다. 포획 분자를 부착하기 위해 유기 나노 구조 분자를 사용하면 니트로셀룰로스 막 표면 위의 포획 분자의 공간 환경이 변경되어 표적 물질과 포획 분자가 더 쉽게 복합체를 형성할 수 있는 환경이 만들어진다. 생성되는 니트로셀룰로스 막은 재현성이 높고 신뢰할만한 표적 물질의 정량적 및 정성적 분석을 제공한다.
본 발명의 또다른 양상은 재현성이 높은 표적 물질의 정량 분석을 제공한다. 상기 표적 물질은 본 발명의 유기 나노구조 분자에 공유적으로 부착되는 포획 분자에 선택적으로 결합한다. 차례로, 상기 유기 나노구조 분자는 지지체로서 사용되는 니트로셀룰로스에 비-공유적으로 부착된다.
본 발명의 또다른 양상은 정량적 및/또는 정성적 분석 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 분석 키트는 높은 재현성으로 표적 물질의 정량적 측정을 가능하게 한다.
일부 구현예에서, 상기 유기 나노구조 분자는 복수의 분지된 영역 및 선형 영역을 포함한다. 상기 선형 영역의 말단 단부는 포획 분자를 공유적으로 부착하는데 사용할 수 있는 작용기를 포함한다. 대안적으로, 상기 포획 분자는 유기 나노구조화된 분자를 니트로셀룰로스 막에 비-공유적으로 부착하기 전에 선형 영역의 말단 단부에 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 유기 나노구조화된 분자는 상기 니트로셀룰로스 막에 대한 비-공유적 부착을 형성할 수 있는 복수의 (예를 들어 적어도 2개, 보통 적어도 3개, 가장 흔하게는 3개, 9개 또는 17개의) 분지된 영역 말단 단부 작용기(branched region terminal end functional group)를 포함한다. 상기 분지된 영역 말단 단부 작용기는 양으로 하전되거나 또는 음으로 하전될 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 본원에서 기술된 니트로셀룰로스 막을 사용한 표적 물질의 정량적 및/또는 정성적 분석방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 양상은 본 발명의 니트로셀룰로스 막(NCM)을 포함하는 정량적 및/또는 정성적 분석 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 표적 물질의 정량적 및/또는 정성적 분석에 특히 유용한 유기 나노구조 분자를 제공한다. 본 발명의 유기 나노구조화된 분자는 복수의 분지된 영역 말단 단부 작용기 및, 포획 분자를 공유적으로 부착하는데 사용할 수 있는 선형 영역 말단 단부 작용기를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 니트로셀룰로스 막의 사용은, 통상적인 니트로셀룰로스 기반 분석시험, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜("PEG") 기반 링커를 사용한 시험과 비교하여 적어도 10%, 보통 적어도 25%, 종종 적어도 50%의 선택성 및/또는 특이성의 개선을 제공한다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 니트로셀룰로스 막의 사용은 도 4에 나타낸 바와 같이 적어도 100%, 보통 적어도 200%, 종종 적어도 300%, 보다 종종 적어도 400%, 가장 종종 적어도 500%의 개선된 재현성을 제공한다.
도 1은, 통상적인 방법의 포획하는 물질(capturing material)이 니트로셀룰로스 막(NCM)의 표면 위에 고정되어 있는 개략도이다.
도 2a는 본 발명의 한 구현예에 따른 유기 나노구조화된 분자를 사용한 니트로셀룰로스 막 위의 포획 분자의 부착을 도시한 개략도이다.
도 2b는 본 발명의 또다른 구현예에 따른 유기 나노구조화된 분자를 사용한 니트로셀룰로스 막 위의 포획 분자의 부착을 도시한 개략도이다.
도 3은 농도 대 CV(%) 그래프, 추세선 및 표준 방정식, 및 CV 10%의 농도를 사용하여 실시예 1로부터의 포획하는 물질과 유기 나노구조물 사이의 몰비의 재현성 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는, 10%의 CV에서 비교예 1에 따른 유기 나노구조물이 각 제조사의 니트로셀룰로스 막에 적용될 때의 재현성 결과 및 재현성 향상 배율를 나타낸 그래프이다.
도 5는 CV 10%의 농도에서의 실시예 2에 따른 유기 나노 구조체의 에폭사이드 및 알데하이드 작용기의 재현성 결과 및 재현성 향상 배율를 나타낸 그래프이다.
도 6은 CV 10%의 농도에서의 실시예 3에 따른 음전하 또는 양전하로서의 분지된 말단을 가지는 유기 나노구조물의 재현성 및 재현성 향상 배율을 나타낸 그래프이다.
도 7은, CV 10%의 농도에서 실시예 4에 따라 유기 나노구조물의 분지 분자가 3개 및 9개일 때의 재현성 및 재현성 향상 배율을 나타낸 그래프이다.
도 8은, 유기 구조물을 실시예 5에서 나타낸 포획하는 물질과 결합시킬 때 순차적 방법 및 혼합 방법을 사용한, CV 10%의 농도에서의 재현성 및 재현성 향상을 도시한 것이다.
본 발명의 하기 개시는 단순히 본 발명의 일부 양상을 설명할 목적으로 제시되며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도된 것은 아니다. 본 발명의 설명은 하나 이상의 구현예의 기술, 특정 변형 및 개질을 포함하지만, 다른 변형 및 개질은, 본 개시 내용을 이해한 후 당업자의 기술 및 지식 내에 있을 수 있는 바와 같이, 본 발명의 범위 내에 있다. 본 발명의 범위는 대안물, 호환가능 및/또는 등가의 구조물, 기능, 범위 또는 단계를 청구된 것까지 포함하여 대안 구현예를, 그러한 대안물, 호환가능 및/또는 등가의 구조물, 기능, 범위 또는 단계가 본원에 개시되어 있는지와 무관하게,허용된 정도까지 포함하는 것으로 의도되며, 임의의 특허가능한 보호대상을 공적으로 제공할 의도는 없다. 본원에서 인용된 모든 문헌은 그 전체가 참조로 인용된다.
본원에서 사용된 기술은 오로시 특정 응용을 기술하기 위한 것이며 본 발명을 제한하려는 의도는 없다. 단수 형태 "a," "an," 및 "the"는 문맥상 달리 표시하지 않는한 그의 복수 형태를 포함한다.
본 발명의 하나의 특정 양상은 표적 물질의 정량적 및/또는 정성적 분석에 유용한 니트로셀룰로스 막(NCM)을 제공한다. 한 구현예에서, 상기 NCM은 상기 NCM에 비-공유적으로 부착되는 유기 나노구조 분자를 포함한다. 본 발명의 유기 나노구조화된 분자는, 각각의 영역이 상기 NCM에 비-공유적으로 부착하는데 사용될 수 있는 말단 단부 작용기를 포함할 수 있는 복수의 분지된 영역을 포함한다. 상기 분지된 영역 말단 작용기는 양으로 또는 음으로 하전될 수 있다. 상기 유기 나노구조화된 분자는 또한 포획 분자에 공유적으로 부착하거나 결합할 수 있는 작용기를 포함하는 선형 영역을 포함한다. 본 발명의 범위는, 상기 포획 분자가 상기 유기 나노구조화된 분자에 이미 공유적으로 부착되는 유기 나노구조화된 분자를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 유기 나노구조 분자는 중심 원자; 복수의 말단 단부 모이어티(moiety)를 가지는 분지된 영역; 및 말단 단부 작용기를 가지는 선형 영역을 포함한다. 상기 선형 영역 말단 단부 작용기는 본원에서 상세히 기술되는 포획 분자를 공유적으로 부착하는데 사용된다. 복수의 분지된 영역 말단 단부 모이어티(즉, 복수의 분지된 영역 말단 단부 작용기)는 상기 유기 나노구조화된 화합물을 다공성 니트로셀룰로스 막에 비-공유적으로 부착하는데 사용된다. 보통, 본 발명에 사용된 니트로셀룰로스 막은 약 0.05㎛ 내지 약 30㎛, 보통 약 1㎛ 내지 약 30㎛, 종종 약 5㎛ 내지 약 20㎛, 보다 종종 약 10㎛ 내지 약 15㎛의 중앙값 포어 직경 크기를 가지는다. 문맥상 달리 요구하지 않는한, 본원에서 수치값을 언급할 때 사용되는 용어 "약"은 상기 수치값의 ±20%, 보통 ±10%, 종종 ±5%, 가장 종종 ±1%를 의미한다. 일부 구현예에서, 상기 선형 영역의 말단 단부 작용기는 공유적으로 결합된 포획 분자를 포함한다.
유기 나노구조화된 분자를 니트로셀룰로스 막에 비-공유적으로 부착하기 위해서 매우 다양한 방법이 사용될 수 있지만, 본 발명의 하나의 특정 구현예는 복수의 비-공유적 부착에 의해서 유기 나노구조 분자를 다공성 니트로셀룰로스 막의 표면 또는 매트릭스에 고정시키는 것을 포함한다. 상기 유기 나노구조물은, (i) 중심원자; (ii) 상기 다공성 니트로셀룰로스 막의 표면에 비-공유적으로 부착된 복수의 말단 단부 모이어티를 가지는 분지된 영역; 및 (iii) 상기 선형 영역의 말단 단부에 공유적으로 결합된 포획 분자를 가지는 선형 영역을 포함하되, 상기 포획 분자는 표적 물질이 샘플에 존재할 때 상기 표적 물질에 선택적으로 결합하도록 조정된다. 상기 유기 나노구조화된 분자는 제한되지는 않지만 인쇄 공정(printing process)을 비롯한 공지 방법들 중의 임의의 것에 의해서 상기 니트로셀룰로스 막에 부착될 수 있다. 상기 인쇄 공정은 예를 들어 유기 나노구조화된 분자의 용액을 니트로셀룰로스 막 위에 인쇄하고 인쇄된 용액을 건조시키는 제트-인쇄 기술(jet-print technology)의 사용을 포함한다. 이러한 인쇄 기술은 복수의 비-공유적 결합에 의한 니트로셀룰로스 막으로의 유기 나노구조화된 분자의 고정을 허용한다.
대안으로, 상기 유기 나노구조화된 분자를 상기 니트로셀룰로스 막 위에 (예를 들어 인쇄 공정을 통해서) 고정시키고 포획 분자를, 상기 포획 분자에 공유적으로 부착되는 상기 유기 나노구조의 선형 영역을 생성하기에 충분한 조건하에서 상기 유기 나노구조화된 분자의 선형 영역의 말단 단부의 작용기와 반응시킨다. 일부 구현예에서, 상기 포획 분자는, 상기 유기 나노구조화된 분자에 비-공유적으로 부착되는 니트로셀룰로스 막의 동일한 구역 위에 인쇄되고 생성되는 구역은 정량적 및/또는 정성적 분석에서 상기 니트로셀룰로스 막을 사용하기 전에 반응하고 건조된다. 이론에 근거하지는 않지만, 상기 니트로셀룰로스에 상기 포획 분자를 부착시킬때 상기 유기 나노구조화된 분자를 사용하는 것은 도 2에 도시된 바와 같은 포획 분자-표적 물질 사이의 거리를 조절함으로써 그의 입체 장애를 현저히 감소시킨다.
분석 방법은 본원에서 기술된 (예를 들어 흐름-통과 분석 키트(flow-through assay kit) 또는 측부 흐름 분석 키트(lateral flow assay kit)로서) 니트로셀룰로스 막을 사용하고, 샘플 또는 시료를 상기 니트로셀룰로스 막에 접촉시켜서 상기 샘플 또는 상기 시료 내의 상기 표적 물질의 존재 및/또는 양을 계측하는 것을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "샘플" 및 "시료"는 본원에서 호환가능하게 사용되며 분석되는 물질을 지칭한다. 상기 샘플은 체액 샘플(예를 들어 혈액, 타액, 대변, 소변, 점액 등), 생물학적 샘플(예를 들어 세포, DNA, 단백질, 박테리아, 바이러스 등), 화학 샘플, 식품 샘플, 환경 샘플(예를 들어 토양, 대기 등) 뿐만 아니라 분석될 수 있는 임의의 다른 샘플일 수 있다. 보통, 상기 분석은 상기 포획 분자에 (존재하는 경우) 상기 표적 물질을 결합시키는 측부 흐름 또는 흐롬-통과 공정을 이용하여 수행된다.
상기 분석 방법은 또한 검출 물질, 예를 들어 형광단(fluorophore), 효소(호스래디시 퍼옥시다제(horseradish peroxidase), 알칼리성 포스페타제(alkaline phosphatase) 등), 콜로이드성 금(colloidal gold)과 같은 신호 추적자(signal tracer)를 상기 니트로셀룰로스 막에 부가하여 포획 분자-표적 물질 복합체의 존재 또는 양을 계측하는 것을 포함할 수 있다. 분석은 상기 포획 분자-표적 물질 복합체를 ELISA에 사용된 것과 유사한 검출 물질과 반응시키는 것을 포함할 수 있다.
상기 검출 물질은 비색계(colorimetric), 화학발광(chemiluminescence), 또는 화학형광(chemifluorescence) 신호를 발생시키도록 조정된 모이어티를 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 발생되는 신호(예를 들어 색상, 발광, 또는 형광 신호, 각각)를 광학 감지기를 이용하여 분석할 수 있다. 상기 신호는 또한 그의 신호 수준을 분석하여 상기 니트로셀룰로스 막 위에 형성되는 상기 포획 분자-표적 물질 복합체의 정량화할 수 있다. 예로서, 상기 검출 물질이 형광 신호 발생 모이어티를 포함하는 경우, 상기 니트로셀룰로스 막에 여기 파장(excitation wavelength)의 광을 조사하고 그 형광 강도를 정량화하여 상기 샘플 중에 존재하는 표적 물질의 양을 결정할 수 있다. 상기 검출 물질이 콜로이드성 금을 포함하는 경우, 상기 샘플 중에 존재하는 표적 물질의 양을 정량화하기 위해 광학 장치의 색도계 매개 변수를 사용하여 광학 시스템에서 발색 정도를 얻는다.
예를 들어 광학 장비를 이용하여 얻은 신호는 표적 물질 농도와, 신호값, 추세선, 표준 방정식 및 측정계수 사이의 그래프를 이용하여 정량화되거나 또는 반(半)-정량화될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 다양한 표적 물질 예를 들어 세포, DNA, RNA, PNA, 압타머(aptamer), 리간드, 엑소좀(exosome), 지질을 안정적으로 분석하는데 사용될 수 있다. 문맥상 달리 요구하지 않는한, 상기 용어 "분석(들)"은 정량적 및/또는 정성적 분석을 의미한다.
본 발명은 또한 니트로셀룰로스 막을 사용한 표적 물질의 분석 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은, (i) 상기 표적 물질이 샘플 중에 존재할 때, 포획 분자-표적 물질 복합체(capture molecule-target material complex)를 형성하기에 충분한 조건하에서 상기 샘플을 본 발명의 니트로셀룰로스 막에 부가하는 단계; (ii) 생성되는 니트로셀룰로스 복합체를 검출 물질과 접촉시켜서 상기 포획 분자-표적 물질 복합체가 상기 니트로셀룰로스 막 위에 존재할 때 검출 복합체(detecting complex)를 형성하는 단계; 및 (iii) 상기 검출 복합체로부터 발생된 신호를 분석하여 상기 샘플 중에 존재하는 표적 물질의 존재 및/또는 양을 계측하는 단계를 포함한다.
상기 샘플은 보통 용액으로 제공된다. 본 발명의 방법을 사용하여 분석될 수 있는 예시적 샘플은 제한되지는 않지만 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 대변, 가래 또는 조직과 같은 생물학적 샘플, 및 물 샘플, 토양 샘플, 공기 샘플과 같은 환경 샘플, 및 육류, 생선, 야채, 음료, 건조 식품, 가공 식품과 같은 식품 샘플 등을 포함한다.
본 발명의 표적 물질은 분석을 요하는 임의의 물질 예를 들어 항원, 항체, 단백질, 펩티드, DNA, RNA, PNA, 압타머, 리간드, 독성 화합물, 지질, 호르몬, 미네랄, 박테리아, 바이러스, 거대-수포( macro-vesicles) 또는 미세-수포(micro-vesicles), 엑소좀, 세포 등일 수 있다.
상기 포획 분자는 상기 표적 물질에 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 분자일 수 있다. 예시적인 포획 분자는 제한되지는 않지만 항원, 항체, DNA, RNA, PNA, 압타머, 리간드, 지질, 호르몬 등을 포함한다.
상기 검출 물질은 시그널 버디(signal body) 또는 검출 모이어티(detection moiety) 예를 들어 제한되지는 않지만 형광단, 자성 입자, 효소, 나노입자, 나노섬유 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 유기 나노구조화된 분자의 분자량 또는 구조에 따라 상기 니트로셀룰로스 막 표면 위에 존재하는 포획 분자들 사이의 거리 및 밀도가 제어될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 유기 나노구조화된 분자의 선형 영역 말단 단부 작용기(또는 그에 부착된 포획 분자)는 약 0.5nm 내지 약 10nm의 범위에서 조절될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 니트로셀룰로스 막 상의 포획 분자의 밀도는 약 0.01 내지 약 0.1개의 분자/nm2의 범위로 조정될 수 있다.
공유적으로 부착된 포획 분자를 가지는 비-공유적으로 부착된 유기 나노구조화된 분자를 포함하는 본 발명의 니트로셀룰로스 막을 사용하는 분석 방법은 분석 키트의 형태로 사용될 수 있으며 또한 진단 방법에 적용될 수 있다. 하나의 특정 구현예에서, 본 발명의 진단 키트는 측부 흐름 유형 또는 흐름-통과 유형 분석 키트로 제작된다. 그러나 본 발명의 범주는 이들 특정 분석 키트로 제한되지 않는 것으로 이해된다.
본 발명은 또한 니트로셀룰로스 막에 포획 분자를 공유적으로 부착하는데 사용될 수 있는 유기 나노구조화된 분자를 제공한다. 상기 유기 나노구조화된 분자는 포획 분자를 공유적으로 부착하는데 사용되는 말단 단부 작용기를 가지는 선형 영역을 포함한다. 상기 유기 나노구조화된 분자는 또한 복수의 분지된 영역을 포함한다. 상기 복수의 분지된 영역은 상기 유기 나노구조화된 분자를 상기 니트로셀룰로스 막에 비-공유적으로 부착하는데 사용될 수 있다.
포획 분자를 공유적으로 부착하는데 사용될 수 있는 선형 영역의 말단 단부 작용기는 예를 들어 하이드록기, 포르밀기, 카보닐기, 카복시기, 에테르기, 에스테르기, 니트로기, 아미노기, 설폰산기, 페닐기, 알킬기, 포스핀기, N-하이드록시석신이미드-에스테르기, 알데하이드기, 에폭사이드, 아즈락톤(azlactone), 카보닐 디이미다졸, 말레이미드, 요오도아세틸, 피리딜 디설파이드, 피리딜 디설파이드, 하이드라자이드 수화물 또는 EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드) HCl)일 수 있다. 상기 선형 영역의 전형적인 말단 단부 작용기는 알데하이드기 및 오폭사이드기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 그러나 본 발명의 범주는 상기 선형 영역의 상기 말단 단부 작용기로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
일부 구현예에서, 상기 유기 나노구조화된 분자의 선형 영역은 적어도 하나의 에테르기를 포함한다. 에테르기의 존재는 상기 유기 나노구조화된 분자의 친수 특성을 개선시킨다.
또다른 구현예에서, 상기 유기 나노구조화된 분자의 분지된 영역의 각각의 말단 단부 작용기는 아미노기, 설폰산기, 페닐기, 알킬기, 포스핀기, 알데하이드기, 하이드록실기, 포르밀기, 카보닐기, 카복시기, 에테르기, 에스테르기, 니트로기 및 에폭사이드기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 그러나 상기 분지된 영역의 상기 말단 단부 작용기는 이들 작용기로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 일반적으로, 상기 니트로셀룰로스 막에 대한 상기 유기 나노구조화된 분자의 비-공유적 부착을 허용하는 임의의 적절한 작용기가 사용될 수 있다.
또다른 구현예에서, 상기 유기 나노구조화된 분자의 분지된 영역은 상기 유기 나노구조 분자를 상기 니트로셀룰로스 막에 비-공유적으로 부착하도록 구성된 적어도 2개, 종종 적어도 3개, 보통 3개, 9개 또는 27개의 말단 단부 작용기를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 유기 나노구조화된 분자는 그의 선형 영역 위에 트리아졸 모이어티를 포함한다. 놀랍게도 그리고 예기치 않게도, 본 발명의 발명자들은 상기 유기 나노구조화된 분자의 선형 영역 위의 트리아졸 모이어티의 존재가 재현성이 높고 신뢰할만한 니트로셀룰로스 막 분석 키트를 제공한다는 것을 밝혀냈다. 또한, 상기 선형 영역 위의 트리아졸 모이어티의 존재는 다른 선형 영역 모이어티와 비교하여 비교적 경질의 구조물 및 합성의 용이성을 허용한다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 유기 나노구조화된 분자는 하기 일반식 A를 가지는다:
[일반식 A]
Figure pct00001
상기 식에서,
L은 트리아졸 모이어티를 포함하는 상기 유기 나노구조화된 분자의 선형 영역 모이어티이되, 상기 L은
(i) 표적 분자에 선택적으로 결합하도록 조정되는 포획 분자를 공유적으로 부착하도록 조정된 선형 영역 말단 작용기, 또는
(ii) 표적 분자에 선택적으로 결합하도록 조정되는 공유적으로 부착된 포획 분자
를 더 포함하고;
Q1은 적어도 3의 산화상태를 가지는 상기 유기 나노구조화된 분자의 중심원자이며;
a1은 2 내지 상기 Q1의 산화상태 -1의 정수이고;
각각의 T는 독립적으로 상기 유기 나노구조화된 분자를 상기 다공성 니트로셀룰로스 막에 비-공유적으로 부착하도록 구성되는 분지된 말단 영역 작용기를 포함하는 상기 유기 나노구조화된 분자의 분지된 말단 영역 모이어티이며;
상기 유기 나노구조화된 분자는 복수의 상기 분지된 말단 영역 작용기에 의해서 상기 다공성 니트로셀룰로스 막에 비-공유적으로 부착된다.
일부 구현예에서, L은 트리아졸릴 모이어티를 포함한다. 또다른 구현예에서, L은 1,2,3-트리아졸릴 모이어티를 포함한다. 또다른 구현예에서, L은 1,4-치환된 1,2,3-트리아졸릴 모이어티를 포함한다.
하나의 특정 구현예에서, L은 하기 일반식의 모이어티를 포함한다:
Figure pct00002
상기 식에서, Ra는 본원에서 정의된 바와 같으며 Rb는 Q1에 부착된 링커(linker)이다. 일부 구현예에서, Rb는 약 2 내지 약 10, 보통 약 2 내지 약 8, 종종 약 2 내지 약 6, 보다 종종 약 2 내지 4의 원자 사슬을 가지는 링커이다. 하나의 특정 구현예에서, Rb는 일반식 -(CH2)2-C(=O)-NRc-의 모이어티이며, 상기 Rc는 수소, C1-4 알킬 또는 질소 보호기이다. 상기 용어 "알킬"은 1 내지 12개, 보통 1 내지 6개의 탄소원자의 포화된 선형 1가 탄화수소 모이어티 또는 3 내지 12개, 보통 3 내지 6개의 탄소원자의 포화된 분지된 1가 탄화수소 모이어티를 지칭한다. 예시적인 알킬기는 제한되지는 않지만 메틸, 에틸, n-프로필, 2-프로필, tert-부틸, 펜틸 등을 포함한다.
a1이 상기 Q1의 산화상태 -1 보다 적은 정수일때, Q1은 수소 또는 알킬기에 부착될 수 있고, Q1이 C이고 a1이 2일때 일반식 A의 화합물은 L-CH(T)2 또는 L-CR1(T)2로서 나타낼 수 있으며, 여기서 R1은 알킬 예를 들어 메틸, 에틸 등이다.
또다른 구현예에서, 상기 유기 나노구조화된 분자는 하기 일반식 IA이다:
[일반식 IA]
Figure pct00003
상기 식에서,
각각의 a, b 및 c는 독립적으로 0 또는 1이고;
x는 c가 0이거나 또는 c가 1일때 1이고, x는 1 내지 상기 Q4의 산화상태 -1의 정수이며;
y는 b가 0이거나 또는 b가 1일때 1이고, y는 1 내지 상기 Q3의 산화상태 -1의 정수이고;
z는 a가 0이거나 또는 a가 1일때 1이고, z는 1 내지 상기 Q2의 산화상태 -1의 정수이며;
n은 1 내지 상기 Q1의 산화상태 -1의 정수이고;
L 및 Q1은 본원에서 정의된 바와 같으며;
각각의 Q2, Q3 및 Q4는 독립적으로 적어도 3의 산화상태를 가지는 분지 원자이고;
각각의 R2, R3, R4, 및 R5는 독립적으로 링커이며;
Y는 상기 분지된 말단 영역 작용기이되,
n, x, y, 및 z의 곱은 적어도 3이다.
상기 링커 R2, R3, R4, 및 R5는 헤테로원자 예를 들어 O, S, 또는 NR(여기서 R은 H 또는 C1-C6 알킬일 수 있다)을 선택적으로 갖는 알킬렌(예를 들어 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 등)일 수 있다. 상기 용어 "알킬렌"은 1 내지 12개, 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소원자의 포화된 선형 포화된 2가 탄화수소 모이어티 또는 3 내지 12개, 바람직하게는 3 내지 6개의 탄화수소의 분지된 포화된 2가 탄화수소 모이어티를 지칭한다. 예시적인 알킬렌기는 제한되지는 않지만, 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 펜틸렌 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 R2, R3, R4, 및 R5는 -CH2-; -CH2-O-; -CH2-CH2-; -CH2-CH2-O-; -O-CH2-CH2-; -CH2-CH2-CH2-O-; -O-CH2-CH2-CH2- 등으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
또다른 구현예에서, 상기 유기 구조화된 분자는 하기 일반식 IB이다.
[일반식 IB]
Figure pct00004
상기 식에서,
Q1, Q2, Q3, Q4, R2, R3, R4, R5, Y, a, b, c, x, y, z, 및 n은 본원에서 정의된 바와 같으며;
Ra는
[일반식 L1]
Figure pct00005
;
[일반식 L2]
Figure pct00006
;
[일반식 L3]
Figure pct00007
;
[일반식 L4]
Figure pct00008
; 및
그들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되고;
여기서,
점선은 선택적인 이중결합을 나타내며;
Z는 표적 분자에 선택적으로 결합하도록 조정되는 포획 분자이고, 상기 Z는 일반식 L1의 화합물의 알데하이드 작용기 또는 일반식 L2의 에폭사이드 작용기를 사용하여 공유적으로 부착된다.
또다른 구현예에서, 상기 유기 나노구조화된 분자는 하기 일반식 IC의 것이다:
[일반식 IC]
Figure pct00009
상기 식에서, Ra는 본원에서 정의된 바와 같다.
일부 예시적인 유기 나노구조화된 분자는,
Figure pct00010
의 것이다.
일반적으로, 달리 정의되지 않는한, 본원에서 사용되는 용어들은 유기화학 및 생화학 분야의 숙련가들에게 널리 알려진 의미를 가지는다. 본원에 사용된 특정 용어들은 하기와 같이 정의된다.
상기 용어 "샘플"은 제한되지는 않지만 유탁액, 분산액, 균일 용액, 및 현탁액을 포함한 액체 또는 용액 샘플이다.
상기 용어 "생물학적 유체"는 모든 임상 샘플(clinical sample)을 의미한다. 예시적인 생물학적 유체는 제한되지는 않지만 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 점액, 척수액, 타액 및 기타 유기체에서 배설, 분비 또는 안으로 전달되는 기타 생물학적 유체를 포함한다.
문맥상 달리 요구하지 않는한, 상기 용어 "포획하는 분자(capturing molecule)", "포획 분자(capture molecule)", "포획하는 물질(capturing material)", 및 "포획 물질(capture material)"은 본원에서 호환가능하게 사용되며, 표적 물질에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있는 물질을 의미한다. 예시적인 포획 분자는 제한되지는 않지만 핵산(예를 들어 DNA, RNA, PNA 및 상응하는 올리고뉴클레오티드), 수용체, 리간드, 효소, 단백질 압타머 뿐만 아니라 표적 물질에 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 기타 기질을 포함한다. 하나의 특정 구체예에서, 상기 포획 분자는 원하는 항원에 대한 강력한 결합 능력을 가지는 항체이다.
상기 용어 "검출 분자", "검출 물질(detecting material)", "검출 물질(detecting substance)", 및 "검출 모이어티(detecting moiety)"는 본원에서 호환가능하게 사용되며 상기 포획 분자와 상기 포획 물질 사이에서 형성되는 복합체의 검출 또는 관측을 허용하는 물질을 지칭한다. 상기 검출 분자는 상기 포획 분자 및/또는 포획 물질의 일부일 수 있다. 따라서, 상기 검출 분자는 별도의 분자일 필요는 없다.
상기 포획 분자는 상기 포획 분자에 의해서 표적화된 상이한 인식 부위로 상기 표적 물질을 특이적으로 인식할 수 있다. 예를 들어 상기 포획 분자는 (i) 포유동물을 표적 물질로 면역화하여 얻은 항혈청으로부터 정제된 폴리클론성 항체(polyclonal antibody)를 포함하는 항체, (ii) 상기 표적 물질로 면역화된 포유동물로부터 추출된 항체-생성 세포, 및 (iii) 골수종 세포와 융합하여 얻은 하이브리도마(hybridoma)로부터 생성된 모노클론성 항체(monoclonal antibody)일 수 있다. 상기 표적 물질에 대한 폴리클론성 항체는 당해 분야의 숙련가에게 알려진 정제방법, 예를 들어 (i) 항혈청 염분 제거법(salting-out an antiserum), (ii) 이온교환 크로마토그래피, (iii) 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 등으로 얻을 수 있다. 상기 표적 물질에 대한 모노클론성 항체는 예를 들어 (i) 마우스와 같은 적당한 동물을 표적 물질로 면역화하고, (ii) 비장세포(splenocyte)를 골수종 세포와 융합하며, ELISA와 같은 방법을 사용하여 표적 물질에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 클론을 선택한 다음, 적절한 상청액 또는 하이브리도마를 적절한 동물에 접종하여 얻은 복수(ascite)를 사용하는 것과 같은 당해 분야의 숙련가에 의해서 얻어질 수 있다. 이와 같이 얻어진 표적 물질에 대한 항체는 상기 항체를 지지체 예를 들어 본원에서 기술된 니트로셀룰로스 막 위에 고정시킴으로써 포획 분자로서 사용될 수 있다.
일반적으로, 항체의 생산에서, 적당한 실험 동물 예를 들어 제한되지는 않지만 래비트, 양, 햄스터, 기니아 피그, 마우스, 래트, 또는 닭이 바람직하다. 보통, 동물은 상기 동물에 주입될 수 있는 유효한 양의 항원으로 면역화된다. 유효한 양의 항원은 상기 동물에 의해 항체 생성을 유도하는데 필요한 양을 지칭한다. 이어서, 상기 동물의 면역 시스템은 예비 결정된 기간동안 반응하도록 허용된다. 상기 면역 공정은 면역 시스템이 항원에 대한 항체를 생산하는 것으로 밝혀질 때까지 반복될 수 있다. 상기 항원에 특이적인 폴리클론성 항체를 얻기 위해서, 혈청은 원하는 항체를 함유하는 동물로부터 수집된다(또는 닭의 경우 항체가 달걀로부터 수집될 수 있다). 이러한 혈청은 시약으로서 유용하다. 폴리클론성 항체는 예를 들어 상기 혈청을 황산암모늄으로 처리하여 혈청(또는 달걀)로부터 추가 정제될 수 있다.
모노클론성 항체는 예를 들어 코흘러(Kohler) 및 밀슈타인(Milstein)의 방법(Nature, 1975, 256, 495-497)에 따라 생성될 수 있다. 예를 들어 B 림프구는 면역화된 동물의 비장(또는 임의의 적절한 조직)에서 회수된 다음, 골수종 세포와 융합되어 적절한 배양 배지에서 지속적으로 성장할 수 있는 하이브리도마 세포 집단을 얻는다. 원하는 항체를 생성하는 하이브리도마는 원하는 항원에 결합하는 하이브리도마에 의해 생성된 항체의 능력을 테스트하여 선택된다.
단일 모이어티-라벨된 검출 물질을 가지는 항체, 보통 단일 클론성 항체가 표적 물질에 대한 높은 선택성을 얻기 위해서 사용된다. 그러나, 상기 포획 분자는 모노클론성 항체일때, 상기 폴리클론성 항체가 검출 물질로서 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어 "인큐베이션은 상기 항원-항체 또는 상보적 DNA 또는 RNA 사이의 반응은 일정한 온도(예를 들어 ±5℃ 내에서, 보통 ±3℃ 내에서, 종종 ±1℃ 내에서)에서 보존된다. 항원-항체 반응은 상보적 구조를 가지는 항원에 대한 항체의 선택적 결합이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 상보적 DNA 또는 RNA 반응은 각각의 가닥의 DNA 또는 RNA가 하이브리드화를 위한 100% 상보적 염기 서열을 가지는 반응이다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 방법은 단일 뉴클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphism; "SNP")을 식별하는데 사용될 수 있다.
용어 "세척"은 널리 허용가능한 방식으로 사용된다. 보통, 상기 용어 "세척"은 인큐베이션 공정에서 포획 분자 또는 표적 물질(예를 들어 항체 또는 핵산 하이브리드화)와 반응시키지 않으면서 용매 또는 용액을 사용하여 잔여 물질을 세척하거나 또는 제거하는 것을 의미한다. 포획 분자-표적 물질 복합체의 형성(예를 들어 항원-항체 또는 핵산 하이브리드화)에 영향을 주지 않는한 특별한 제한은 없다. 세정 또는 세척 효과를 증진시키는 계면활성제가 첨가될 수 있다. 또한, 상기 세척 또는 세정 방법은 그것이 전체적인 복합체 형성 공정에 효과적인 한 특별히 제한되지 않는다. 세척 또는 세정은 잠재적인 신호 간섭 물질을 제거하여 분석의 감도(sensitivity)를 높이기 위해 수행할 수 있는 선택적 단계이다.
본 발명에서, 인큐베이션 및 신호 버디 신호 생성 단계에서의 반응 온도는 특별히 제한되지 않는다. 그러나, 효소 신호 활성 또는 반응 용액의 동결 또는 증발을 방지하기 위해서 표적 물질에 대한 포획 분자의 결합은 약 4℃ 내지 약 40℃의 온도범위에서 수행된다. 효소-리간드 복합체에서 빠른 신호 종료가 필요한 경우 복합체 형성의 온도 범위는 보통 약 15℃ 내지 약 40℃이다.
포획 분자와 표적 분자 사이에서 복합체를 형성하는 인큐베이션 공정동안, 보다 긴 인큐베이션 시간은 일반적으로 보다 많은 양의 포획 분자-표적 물질 복합체 형성을 유도한다. 그러나 결합(즉, 복합체 형성) 반응은 일정 시간 후에 포화될 수 있다. 신속한 분석을 제공하기 위해서, 상기 복합체 형성(즉 인큐베이션) 시간을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. NCM 지지체 상에 보다 많은 포획 분자의 양이 로딩(즉, 비-공유적으로 고정)될수록 감도가 높아지고 더 많은 표적 물질이 포획 분자에 착화될 수 있으므로 반응 또는 인큐베이션 시간이 단축될 수 있다. 한편, 표적 물질이 반응(즉 복합체 형성) 부위를 차단하여 입체 장애를 일으키는 부분에서 효율이 저하되고; 따라서 상기 니트로셀룰로스 막 위로 로딩된(즉, 고정된) 포획 분자의 양을 최적화하는 것이 필요하다. 니트로셀룰로스 막에 대한 유기 나노구조화된 분자의 부착을 언급할 때 본원에서 사용되는 용어 "고정된"은 건조 된 니트로셀룰로스 막에 있는 실질적으로 모든(보통 ≥90%, 종종 ≥95%, 가장 종종 ≥99%) 유기 나노구조화된 분자가 분석 과정동안 니트로셀룰로스 막에 부착된 채로 남아 있는 것을 의미한다.
상기 포획 분자는 유기 나노구조화된 분자를 통해서 상기 니트로셀룰로스 막의 표면에 고정되므로, 각각의 포획 분자들 사이의 거리는 상기 유기 나노구조화된 분자에 의해서 상대적으로 제어될 수 있다. 이것은 입체 장애로 인한 정량 분석에서 만족스럽지 못한 재현성 문제를 없애거나 크게 감소시킨다.
용어 "형광", "화학 발광", "화학 형광" 및 "비색계"는 당업자에게 잘 알려져 있다. 보통, 이들 용어는 색상 또는 광(형광, 발광)이 방출되거나 당업자에게 공지된 임의의 분석 방법을 사용하여 검출될 수 있다는 사실을 지칭한다.
본원에 개시된 방법의 분석 단계동안, 신호를 육안으로 반(半)-정량적으로 또는 정성적으로 측정하거나 결정할 수 있다. 그러나 보통, 신호는 기기 (예를 들어 비색계 기기, UV/Vis 분광계 등)로 측정하여 그 신호를 정량적 또는 정 성적으로 분석한다. 당해 분야의 숙련가에에 익히 알려진 바와 같이, "화학 발광", "화학 형광", 및 "형광"은 보통 광학 소자 시스템의 이미지 센서에 의해서 방출된 형광 또는 화학 발광의 강도를 측정한다. 이러한 신호는 정량적으로 또는 정성적으로 분석될 수 있다.
문맥상 달리 요구하지 않는한, 상기 용어 "검출" 및 "분석"은 표적 물질의 존재를 확인하는 단계를 지칭한다. 상기 용어는 표적 물질의 존재 또는 부재를 확인하기 위한 정성적 측정 뿐만 아니라 표적 물질 농도의 정량적 또는 반(半)-정량적 측정을 포함한다.
보통, 상기 샘플은 표적 물질(샘플에 존재하는 경우)과, NCM 지지체 위에 고정되는 포획 분자 사이의 선택적 또는 특이적 결합을 촉진하도록 유동성(fluidity)을 가지는 유체 또는 용액이다. 그러나, 상기 샘플이 유체로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어 상기 샘플이 고체인 경우, 적당한 용매를 사용하는 용액 속에 용해 또는 분산될 수 있다.
상기 측정(즉, 분석)에 필요한 샘플의 양과 관련하여, 시료에 포함된 경우 NCM 지지체에 부착된 포획 분자에 의해 표적 물질을 검출/정량화할 수 있을 만큼의 시료의 양이 충분하다면 필요한 시료의 양에 대한 특별한 요구 사항이 없다. 상기 샘플은 분석 이전에 희석될 수 있다. 따라서 시료 내 표적 물질의 농도 감소로 인해 표적 물질의 검출 또는 정량화가 어려울 가능성이 있다. 이 경우에, 표적 물질이 샘플에 존재하는 경우 포획 분자-표적 물질 복합체의 형성에 충분한 시간을 허용하기 위해 인큐베이션 시간을 늘릴 수 있다. 대안으로, 표적 물질의 감소된 농도를 보충하기 위해서 포획 분자의 양이 증가될 수 있다. 본 발명의 분석 방법에 사용된 샘플의 전형적인 양은 약 10 μL 내지 약 200 μL이다. 그러나 분석에 사용된 샘플의 양은 이러한 범위로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 실제로, 상기 포획 분자와 상기 표적 물질 사이의 복합체의 형성을 허용하기에 충분한 임의의 양의 샘플이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
상기 NCM 지지체 위에 고정되는 포획 분자는 상기 유기 나노구조화된 분자의 선형 영역 말단 단부 작용기에 공유적으로 부착된다. 상기 유기 나노구조화된 분자의 적당한 선형 영역 말단 단부 작용기는 제한되지는 않지만 하이드록실, 포르밀, 카보닐, 카복실, 에테르기, 에스테르기, 니트로기, 아미노기, 설폰산기, 페닐기, 알킬기, 포스핀기, N-하이드록시석신이미드-에스테르, 알데하이드, 에폭사이드, 아즐락톤(azlactone), 카보닐 디이미다졸, 말레이미드, 요오도아세틸, 피리딜 디설파이드, 하이드라자이드, EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드) HCl)을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 니트로셀룰로스 막의 원하는 표적 물질과 비-포획 분자 부분 사이의 상호작용을 피하거나 현저히 감소시켜서 거짓 양성 신호(false positive signal)를 생성하기 위해서, 니트로셀룰로스 막의 비-포획 분자 부분을 차단하거나 소멸시킬 수 있다. 예를 들어 상기 포획 분자가 단백질인 경우, 카제인(casein), 보빈 알부민(bovine albumin) 또는 젤라틴을 함유하는 용액으로 니트로셀룰로스 막을 처리하면 니트로셀룰로스 막의 비-포획 분자 부분과 표적 물질 사이의 비-선택적 상호작용이 크게 감소하거나 방지된다.
본 발명의 방법은 원하는 임의의 표적 물질을 검출/분석하는데 사용될 수 있다. 니트로셀룰로스 막 및 본 발명의 방법에 의해서 검출/분석될 수 있는 예시적인 표적 물질은 제한되지는 않지만 바이오물질(biomaterial)(예를 들어 항원, 항체, 단백질, 지질, 펩티드, DNA, 및 RNA), 독성 화합물, 미네랄, 박테리아, 바이러스, 거대-수포 또는 미세-수포, 엑소좀 및 세포, 및 비-바이오물질 예를 들어 약물, 안료, 중금속를 포함한다.
본 발명의 방법은 또한 2개의 항체로 표적 물질을 포획하는 것을 포함할 수있다(예를 들어 하나는 포획 분자로, 다른 하나는 검출 물질로). 이러한 방법은 효소-결합 면역 분석("ELISA")과 유사하지만 상당히 높은 신뢰성과 재현성을 제공한다. 더욱이, 본 발명의 방법은 상당히 더 정확하고 검출/분석을 위해 상당히 더 적은 양의 표적 물질을 필요로 한다. 이러한 방법은 12 내지 15개의 아미노산을 함유하는 펩티드의 분자량을 가지는 표적 물질에 특히 유용하다.
상기 표적 물질이 무기 물질 예를 들어 비타민 또는 저분자량 물질 예를 들어 글루코스인 경우, 포획 분자로서 항체는 적당하지 않다. 이 경우, 표적 물질과 유사한 물질과 하나의 특정 신호 추적자 사이의 상호 경쟁을 이용할 수 있다.
본 발명의 부가 목적, 이점 및 신규한 특징들은 하기 실시예를 검토하면 당업자에게 명백할 것이며, 이들 실시에는 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 하기 실시예에서, 실시하기 위해 건설적으로 축소된 절차가 현재 시제로 기술되고 실험실에서 수행된 절차는 과거 시제로 설명된다.
실시예
실시예 1
본 실시예에서, 급성 심근 경색 바이오 마커(즉, 심장 트로포닌 I(cTnI))를 검출하도록 구성된 포획 분자를 사용하여 재현성이 높은 정량 분석에 필요한 유기 나노구조된 분자의 적절한 양을 결정하였다.
cTnI에 특이적인 항체인 포획 분자의 몰 수에 대해 0.4, 1.0, 4.1 및 5.1의 몰비로 유기 나노구조화된 분자(MW 762.93, C27H41K3N4O14)의 칼륨 염의 수용액을 제조하였다. 상기 유기 나노구조화된 분자 용액을 0.35 μL/cm의 속도로 니트로셀룰로스 막(CNPC, Advanced Microdevices, India) 위로 분배하여(dispensing) 라인을 형성하고, 40℃ 및 10%의 상대습도에서 약 10분동안 건조기에서 건조시켰다. 이어서, 60℃ 및 10% 이하의 상대습도에서 24시간동안 건조기에서 건조시키면서 유사한 공정으로 상이한 양의 유기 나노구조화된 분자를 가지는 4가지 유형의 니트로셀룰로스 막을 제조하였다. 유기 나노구조화된 분자의 양의 효과를 비교하기 위해, 대조군으로 유기 나노구조화된 분자가 없고 물만 공급되는 니트로셀룰로스 막을 준비하였다. cTnI-특이적 포획 항체(0.027 mM, 0.35 μL/cm의 분배 속도)를 동일한 위치에서 분배하여 상기 라인을 재성성하고, 40℃ 및 10%의 상대습도에서 약 10분동안 건조기에서 건조시킨 다음, 그것을 60℃ 및 10% 이하의 상대습도에서 약 24시간동안 건조기에서 건조시켰다.
이러한 막을 사용하여 측부 흐름 유형 키트를 제조하였다. 인간 혈청(Sigma-Aldrich, Louis, MO)(FSDTM 647, 650 nm에서 최대 여기)으로 희석된 다양한 농도의 cTnI 항원(8T62, 핀란드, HyTest)을 분석 키트에 배치하고, 이어서 100 μL의 각각의 시험군 및 각각의 대조군과 면역블롯 결합(immunoblot binding)을 행하였다. 665 nm의 최대 방출 모이어티(BioActs, 한국)를 중합된 cTnI 특이적 결합 검출 항체(4T21 클론 19C7, HyTest, 핀란드)로 샌드위치칭하였다. 레이저 다이오드(650nm)의 여기 광 및 660nm 미만인 파장 컷-오프(wavelength cut-off)를 가지는 광학 필터를 장착한 포토다이오드(photodiode)를 사용하여 형광 신호를 검출하였다. 감광성 형광 판독기를 사용하여 방출된 665 nm 형광을 측정하였다. 측정된 형광 신호 값은 제어 라인 영역(control line area) 및 테스트 라인 영역(test line area)의 영역을 인테그레이팅하고 테스트 라인 인테그레이션 적분 값을 제어 라인 영역 인테그레이션 값으로 나눈 T/C 비율로 환산하여 구하였다. 표적 물질(cTnI)의 농도에 대한 표준 곡선을 플롯(plot)하였다(도 3).
각 시료의 방출량을 16회 측정하고 표준 곡선을 통해 얻은 표준 방정식을 이용하여 환산하였으며, CV(%) 그래프는 변환된 농도의 평균값과 표준 편차로 계산한 변동 계수(CV)를 이용하여 CV(%) 그래프를 얻었다(도 3).
유기 나노구조물의 각 공급량의 10% CV 농도값을 상기 샘플 농도에 대한 CV 그래프의 전력선 형태의 추세선에서 얻은 방정식을 이용하여 비교하였다.
유기 나노구조화된 분자의 부재하에 고정된 포획 분자를 가지는 대조군 니트로셀룰로스 막으로부터 10% CV에서 2.03 ng/mL의 농도를 얻었고, 수처리 후 유기 나노구조화된 분자의 부재하에서 고정된 포획 분자를 가지는 대조군 니트로셀룰로스 막으로부터 10% CV에서 1.95 ng/mL의 농도를 얻었다.
0.4, 1.0, 4.1, 및 5.1배의 유기 나노구조화된 분자를 포함한 시험군에서, 포획 분자의 상대적 몰수, CV 10%에서의 농도는 각각 6.70ng/mL, 8.30ng/mL, 0.40ng/mL 및 2.55ng/mL이었다. 4개의 상이한 농도 중에서, 포획 분자에 비해 4.1 배의 유기 나노구조화된 분자의 몰수를 처리하여 니트로셀룰로스 막에 고정시킨 키트가 최상의 재현성 결과를 제공하였다(도 3). 이러한 측부 흐름 및 급속 유형 검사 플랫폼에서, 포획 분자의 상대 몰수 4.1배로 처리한 유기 나노구조화된 분자는 고정된 정량 분석보다 약 5배 낮은 CV 10% 성능을 보여주었으며 이는 재현성 측면에서 표준 용량이 향상되었음을 나타낸다.
비교 실시예 1
본 비교 실시예에서는, 다른 제조업체에서 생산된 니트로셀룰로스 막의 효과를 조사하였다. 요약하면, 포획 분자와 비교하여 4.1배 몰 과량의 유기 나노구조화된 분자를 이용하여 측부 흐름 키트를 준비하고 인간 혈청의 급성 심근 경색 마커에 대해 분석하였다. 정량적 개선 효과를 비교하기 위해 10% CV에서 바이오마커로서 cTnI 표적 물질의 검출을 수행하였다. 3개사의 상이한 제조업체로부터 생산된 니트로셀룰로스 막(Millipore사의 HF-135, GE healthcare사의 Immuno-pore RP, 및 Advanced Microdevices사의 CNPC)을 유기 나노구조화된 분자를 이용하여 포획 분자로 고정시켰다. 또한, 제어를 위해, 어떠한 유기 나노구조화된 분자도 이용하지 않고 막을 포획 분자로 고정시켰다.
인간 혈청(Sigma-Aldrich, Louis, MO) 중의 상이한 농도(0, 0.15, 0.3, 0.6, 1.25 및 2.5 ng/mL)의 cTnI 항원(8T62, HyTest, 핀란드)을 준비하였다. 100 μL의 샘플을 각각의 시험 및 대조 키트에 배치하고 형광(FSDTM 647, 650nm의 최대 여기, 665nm의 최대 방출, BioActs, 한국)으로 중합시킨 cTnI 특이 적 결합 검출 항체(4T21 클론 19C7, 핀란드, HyTest)로 샌드위칭하였다. 레이저 다이오드(650nm)를 사용하여 여기 광으로 형광 신호를 검출하고 660nm 미만의 파장 컷-오프를 가지는 광학 필터가 장착된 포토다이오드를 사용하여 665nm의 방출 형광을 검출하는 리더(reader)가 사용되었다.
시험은 각각 8회 반복하였다. 대조군의 면적과 시험 라인 면적을 적분하고 시험 라인 면적 적분값을 T/C 비로 환산하여 표적 물질(cTnI) 농도에 대한 표준 곡선을 얻었다. 표준 곡선에서 얻은 표준 방정식을 사용하여 평균값과 표준 편차를 결정하였다. 이들 값을 사용하여 CV(%)를 계산하고 농도의 CV 그래프를 플롯하였다(도 3 참조). 샘플 농도의 CV 그래프에서 추세선을 지수화 형태로 만들고 CV 10%에서의 농도를 계산하였다. 각 제조업체에서 니트로셀룰로스 막에 대한 정량적 개선 효과를 확인하였다.
유기 나노구조화된 분자를 사용하지 않고 포획 분자가 고정된 대조군 니트로셀룰로스 막의 경우 HF-135의 CV 10% 농도, Immuno-pore RP 및 CNPC의 농도는 각각 2.81 ng/mL, 5.94 ng/mL 및 1.73 ng/mL이었다(참조 도 4). 유기 나노구조화된 분자로 고정된 시험군 막의 경우 HF-135, Immuno-pore RP 및 CNPC의 CV 10% 농도는 각각 0.96 ng/mL, 0.73 ng/mL 및 0.24 ng/mL이었다(참조 도 4).
도 4에 나타낸 바와 같이, 포획 분자를 고정시키기 위해서 유기 나노구조화된 분자를 사용하는 것은 대조군 니트로셀룰로스 막과 비교하여 2.93배 내지 8.14배 범위의 정량 분석의 향상된 재현성을 유도하였다(도 4 참조).
실시예 2
본 실시예는 본 발명의 니트로셀룰로스 막을 사용하여 표적 물질에 대한 정량 분석의 재현성 개선을 입증한다.
본 실시예에서는, 먼저 유기 나노구조화된 분자의 선형 영역 말단 단부 작용기를 사용하여 유기 나노구조화된 분자에 포획 분자를 공유적으로 부착시킴으로써 시험 분석 키트를 제조하였다. 상기 포획 분자를 공유적으로 부착시키는데 사용된 유기 나노구조화된 분자의 선형 영역 말단 작용기는 알데하이드 또는 에폭사이드 작용기였다. 이어서 상기 유기 나노구조화된 분자를 실시예 1의 과정을 이용하여 니트로셀룰로스 막 위에 비-공유적으로 고정시켰다. 분석 시험을 실시예들에서 기술된 것과 유사하게 수행하여 정량적 분석 재현성에서 개선을 측정하였다.
알데하이드 선형 영역 말단 단부 작용기를 가지는 유기 나노구조화된 분자를 포획 분자와 공유적으로 결합시켰다. 요약하면, 유기 나노구조화된 분자는 포획 분자의 양의 4.1배였다. 유사하게, 에폭사이드 선형 영역 말단 단부 작용기를 가지는 유기 나노구조화된 분자를 포획 분자와 공유적으로 결합시켰다. 상기 유기 나노구조화된 분자를 니트로셀룰로스 막에 비-공유적으로 고정시킴으로써 시험 니트로셀룰로스 막을 제조하였다. 또한 상기 유기 나노구조화된 분자의 부재하에서 상기 포획 분자를 상기 니트로셀룰로스 막에 직접 부착시킴으로써 대조 막을 제조하였다.
이들 막을 사용하여 측부 흐름 유형 키트를 제조하였다. 인간 혈청 중의 다양한 농도의 cTnI 항원을 전술한 바와 같이 제조하였다. 각 시험 키트에 100 μL의 샘플을 위치시키고 형광(FSDTM 647, 650 nm의 최대 여기, 665 nm의 최대 방출, BioActs, 한국)으로 중합시킨 cTnI 특이적 결합 검출 항체(4T21 클론 19C7, HyTest, 핀란드)로 샌드위칭하였다. 레이저 다이오드(650nm)를 사용하고 660nm 미만인 파장 컷-오프를 가지는 광학 필터를 장착한 포토다이오드를 사용하는 665 nm의 방출 형광을 검출하여 형광 신호를 검출하였다. 이러한 과정을 니트로셀룰로스 막 당 8회 반복하였다.
대조군의 면적과 시험 라인 면적을 적분하고 시험 라인 면적의 적분값을 T/C 비로 환산하여 표적 물질(cTnI)의 농도에 대한 표준 곡선을 얻었다. 환산된 농도의 평균값과 표준 편차를 이용하여 CV(%)를 계산하였다(표 5 참조). 샘플 농도의 CV 그래프에서 추세선을 지수화 형태로 만들고 CV 10%에서의 농도를 계산하였다. 알데하이드 및 에폭사이드 선형 영역 말단 단부 작용기를 가지는 유기 나노구조화된 분자를 사용했을 때, 그 결과 정량적 분석 신뢰도가 향상되는 것으로 나타났다.
대조군 니트로 셀룰로스 막, 에폭사이드 선형 영역 말단 단부 작용기를 가지는 유기 나노구조화된 분자를 가지는 니트로셀룰로스 막 및 알데히드 선형 영역 말단 단부 작용기를 가지는 유기 나노구조화된 분자를 가지는 니트로셀룰로스 막에 대한 CV 10%는 각각 1.90 ng/mL, 0.28 ng/mL 및 0.27 ng/mL이었다(도 5). 이것은 유기 나노구조화된 분자를 가지는 니트로셀룰로스 막이 상기 유기 나노구조화된 분자의 선형 영역 말단 단부 작용기의 유형과 무관하게 정량적 분석을 개선시키는 것으로 나타난다(도 5).
실시예 3
이러한 샘플은 양전하(MW 657.07, C24H52Cl3N7O7) 또는 음전하(MW 762.93, C27H41K3N4O14)로 유기 나노구조화된 화합물을 가지는 측부 흐름 분석의 재현정의 개선을 결정한다.
분지된 영역 말단 단부에서 음전하를 가지는 유기 나노구조화된 분자(MW 762.93, C27H41K3N4O14) 및 양전하를 가지는 유기 나노구조화된 분자(MR 657.07, C24H52Cl3N7O7)를 포획 분자에 공유적으로 부착시켰다. 요약하면, 전술한 cTnI 항체로 에폭사이드 선형 영역 말단 단부 작용기를 가지는 4.1 몰 당량의 유기 나노구조화된 분자를 제조하였다. 또한 유기 나노구조화된 분자의 사용없이 포획 분자가 니트로셀룰로스 막에 부착되는 대조 니트로셀룰로스 막을 제조하였다.
이들 막을 이용하여 측부 흐름 유형 키트를 제조하였다. 인간 혈청 중의 다양한 농도의 cTnI 항원을 위에서 기술한 바와 같이 제조하였다. 각각의 분석 시험 키트에, 100 μL의 샘플을 위치시키고 형광(FSDTM 647, 650 nm의 최대 여기, 665 nm의 최대 방출, BioActs, 한국)으로 중합시킨 cTnI 특이적 결합 검출 항체(4T21 클론 19C7, HyTest, 핀란드)로 샌드위칭하였다. 레이저 다이오드(650 nm)를 사용하여 형광 신호를 검출하였고 660nm 미만 파장 컷-오프를 가지는 광학 필터가 장착된 포토다이오드를 사용하여 665nm의 방출 형광을 검출하였다. 이러한 과정을 니트로셀룰로스 막 당 8회 반복하였다.
대조군의 면적과 시험 라인 면적을 적분하고 시험 라인 면적의 적분값을 T/C 비로 환산하여 표적 물질(cTnI)의 농도에 대한 표준 곡선을 얻었다. 환산된 농도의 평균값과 표준 편차를 이용하여 CV(%)를 계산하였다(표 6 참조). 샘플 농도의 CV 그래프에서 추세선을 지수화 형태로 만들고 CV 10%에서의 농도를 계산하였다. 양의 분지된 선형 영역 말단 및 음의 분지된 선형 영역 말단을 가지는 유기 나노구조화된 분자를 사용했을 때, 그 결과 정량적 분석 신뢰도가 향상되는 것으로 나타났다.
대조 니트로셀룰로스 막, 음의 분지된 영역 말단을 가지는 유기 나노구조화된 분자를 니트로셀룰로스 막, 및 양의 분지된 영역 말단을 가지는 유기 나노구조화된 분자에 대한 CV 10%는 각각 1.82 ng/mL, 0.29 ng/mL, 및 0.42 ng/mL이었다(도 6). 이것은 음의 분지된 영역 말단 유기 나노구조화된 분자 및 양의 분지된 영역 말단 유기 나노구조화된 분자 각각에 대해 각각 6.26배 및 4.33배의 정량적 분석 신뢰도의 개선과 동일하다. 알 수 있는 바와 같이, 유기 나노구조화된 분자의 분지된 영역 말단이 음으로 하전될 때 보다 양호한 정량적 개선이 얻어진 것으로 나타난다(도 6).
실시예 4
본 실시예에서는, 3개의 분지된 영역 말단 작용기(MW 762.93, C27H41K3N4O14) 및 9개의 분지된 영역 말단 작용기(MW 1949.41, C66H98K9N7O38)를 가지는 측부 흐름 키트를 제조하여 시험하였다.
상응하는 분석 시험 키트 및 분석 시험을 전술한 바와 같이 수행하였다. 대조군, 3개의 분지된 영역 말단 작용기를 가지는 유기 나노구조화된 분자, 및 9개의 분지된 영역 말단 작용기를 가지는 유기 나노구조화된 분자에 대한 CV 10%는 각각 1.97 ng/mL, 0.30 ng/mL, 및 0.36 ng/mL이었다(도 7). 이것은 대조군과 비교하여 각각 6.57배 및 5.47배의 정량적 분석 신뢰도의 개선과 동등하였다(도 7).
본 실시예에서는, 2가지 상이한 방법에 의해서 시험 키트를 제조하였다. 제 1 방법은 먼저 유기 나노구조화된 분자를 니트로셀룰로스 막에 부착하고 포획 분자를 유기 나노구조화된 분자에 부착하는 순차적 방법이었다. 제 2 방법은 유기 나노구조화된 분자를 니트로셀룰로스 막에 고정시키기 전에 포획 분자를 유기 나노구조화된 분자를 공유적으로 결합시키는 것과 관련된다.
제 1 방법에서, 0.111mM(포획 분자 대비 4.1 당량)의 유기 나노구조화된 분자(MW 762.93, C27H41K3N4O14)를 0.35 μL/cm의 분배 속도로 니트로셀룰로스 막(CNPC, Advanced Microdevices, Inc.)에 분배하여 라인을 형성하였다. 생성되는 니트로셀룰로스 막을 40℃ 및 10% 이하의 상대습도에서 약 10분동안 건조시킨 다음, 10% 이하의 상대습도하에 60℃에서 24시간동안 더 건조시켰다. cTnI-특이적 포획 항체(0.027 mM, 0.35 μL/cm의 분배속도)를 동일 위치에서 분배하고 40℃ 및 10% 이하의 상대습도에서 10분동안 건조시키고, 10% 이하의 상대습도하에 60℃에서 24시간동안 더 건조시켰다.
제 2 방법에 있어서, 0.111 mol의 유기 나노구조화된 분자(FW 762.93, C27H41K3N4O14, 포획 분자 대비 4.1 몰 당량)을 포획 분자, 즉 cTnI 항체(0.027 mM)와 혼합하였다. 상기 혼합물을 37℃에서 교반하면서 3시간동안 반응시켰다. 생성되는 반응 혼합물을 0.35 μL/cm의 분배 속도로 니트로셀룰로스 막(CNPC, Advanced Microdevices, 인디아) 위에 분배하여 라인을 형성하고 40℃ 및 10% 이하의 상대습도에서 10분동안 건조시켰다. 니트로셀룰로스 막을 10% 이하의 상대습도하에 60℃에서 24시간동안 더 건조시켰다.
상기 2가지 방법으로 제조된 막을 이용하여 측부 흐룸 유형 분석 키트를 제조하였다. 그리고 전술한 바와 같이 분석을 수행하였다. 상기 대조군, 상기 제 1 방법에 의해서 제조된 니트로셀룰로스 막, 및 상기 제 2 방법에 의해서 제조된 니트로셀룰로스 막에 대한 CV 10%는 각각 1.75 ng/mL, 0.31 ng/mL 및 0.29 ng/mL이었다(도 8). 이것은 대조군과 비교하여 5.65배 및 6.03배의 정량적 분석 신뢰도의 개선과 동등하다(도 8).
본 발명의 상기 논의는 설명 및 기술의 목적으로 제시되었다. 전술한 것들은 본 발명을 본원에 개시된 형태(들)로 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명의 기술은 하나 이상의 구현예 및 특정 변이 및 변형의 기술을 포함하지만 다른 변이 및 변형은 본 개시를 이해한 후 당해 분야의 숙련가의 기술 및 지식 내에 있을 수 있는 본 발명의 범주에 속한다. 대안, 호환가능한 및/또는 등가 구조물, 기능, 범위 또는 단계들을 청구된 것들까지, 그러한 대안, 호환가능한 및/또는 등가 구조물, 기능, 범위 또는 단계들이 본원에 개시되어 있든 그러지 않든 임의의 특허가능한 보호대상을 공적으로 제공하는 것으로 의도됨이 없이 포함하여 허용되는 정도로 대안적 구현예를 포함하는 권리를 얻는 것으로 의도된다. 본원에서 인용된 모든 문헌은 그 전체가 참조로 인용된다.

Claims (18)

  1. 다공성 니트로셀룰로스 막(porous nitrocellulose membrane)으로서,
    상기 다공성 니트로셀룰로스 막은, 상기 니트로셀룰로스 막의 표면에 비-공유적으로 부착된 복수의 말단 단부 모이어티(terminal end moiety)를 포함하는 유기 나노구조 화합물(organic nanostructure compound)을 포함하고, 상기 유기 나노구조물은 공유적으로 결합된 포획 분자(covalently bound capture molecule)를 더 포함하고, 상기 유기 나노구조물은,
    중심원자;
    상기 다공성 니트로셀룰로스 막의 상기 표면에 비-공유적으로 부착되는 상기 복수의 말단 단부 모이어티(terminal end moiety)를 가지는 분지된 영역(branched region); 및
    선형 영역(linear region)으로서, 상기 선형 영역의 말단 단부에 공유적으로 결합된 포획 분자를 가지는 선형 영역
    을 포함하되,
    상기 포획 분자는 표적 물질(target material)에 선택적으로 결합하도록 조정되는 것인,
    다공성 니트로셀룰로스 막.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 유기 나노구조물의 상기 분지된 영역은 상기 니트로셀룰로스 막의 상기 표면에 비-공유적으로 부착되는 적어도 3개의 말단 단부 모이어티를 포함하는 것인, 다공성 니트로셀룰로스 막.
  3. 샘플 중 표적 분자의 존재를 검출하도록 조정된 다공성 니트로셀룰로스 막의 제조방법으로서, 상기 제조방법은;
    (A) 복수의 비-공유적 부착에 의해서 상기 니트로셀룰로스 막의 표면 위에 유기 나노구조물을 고정시키는 단계, 여기서 상기 유기 나노구조물은;
    (i) 중심원자;
    (ii) 상기 다공성 니트로셀룰로스 막의 상기 표면에 비-공유적으로 부착된 복수의 말단 단부 모이어티를 가지는 분지된 영역; 및
    (iii) 선형 영역의 말단 단부에 공유적으로 결합된 포획 분자를 가지는 선형 영역
    을 포함하되, 상기 표적 물질이 상기 샘플 중에 존재할 때, 상기 포획 분자는 상기 표적 물질에 선택적으로 결합하도록 조정되는 것인 단계; 또는
    (B) (i) 복수의 비-공유적 부착에 의해서 상기 니트로셀룰로스 막의 표면 위에 유기 나노구조물을 고정시키는 단계, 여기서 상기 유기 나노구조물은,
    (a) 중심원자;
    (b) 상기 다공성 니트로셀룰로스 막의 상기 표면에 비-공유적으로 부착된 복수의 말단 단부 모이어티를 가지는 분지된 영역; 및
    (c) 상기 표적 물질이 상기 샘플 중에 존재할 때, 상기 표적 물질에 선택적으로 결합하도록 조정된 포획 분자를 공유적으로 결합하도록 조정된 작용기를 가지는 말단 단부를 포함하는 선형 영역
    을 포함하는 것인 단계; 및
    (ii) 상기 포획 분자를, 공유적으로 부착된 포획 분자를 포함하는 상기 유기 나노구조물의 선형 영역을 생성하기에 충분한 조건하에 상기 선형 영역의 상기 말단 단부의 상기 작용기와 반응시키는 단계
    를 포함하는 것인, 다공성 니트로셀룰로스 막의 제조방법.
  4. 샘플 중 표적 분자의 존재를 검출하는 방법으로서,
    상기 방법은;
    (a) 제 1 항의 다공성 니트로셀룰로스 막을, 표적 물질이 상기 샘플 중에 존재할 때 상기 유기 나노구조물의 선형 말단 단부 위에 존재하는 포획 분자에 상기 표적 물질의 결합을 허용하기에 충분한 조건하에 상기 샘플과 접촉시킴으로써 포획 분자-표적 물질 복합체(capture molecule-target material complex)를 형성하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)의 상기 다공성 니트로셀룰로스 막에 검출 물질을 접촉시키는 단계로서, 상기 검출 물질은 상기 포획 분자-표적 물질 복합체가 존재할 때 상기 포획 분자-표적 물질 복합체에 선택적으로 결합하는 검출 분자(detection molecule)를 포함하는 것인 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)의 상기 다공성 니트로셀룰로스 막을 분석하여 상기 샘플 중의 상기 표적 물질의 존재를 결정하는 단계
    를 포함하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 분석 단계 (c)는 정량적 분석, 정성적 분석 또는 그들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 유기 나노구조물의 상기 분지된 영역의 상기 복수의 말단 단부 각각은 양전하 또는 음전하를 포함하여 상기 다공성 니트로셀룰로스 막의 상기 표면에 상기 유기 나노구조물의 상기 분지된 영역의 비-공유적 부착을 허용하는 것인 방법.
  7. 제 4 항에 있어서,
    상기 검출 분자는 효소, 형광단(fluorophore), 자성 입자(magnetic particle), 나노입자, 금속입자, 나노섬유 입자(nanofiber particle), 또는 그들의 조합물을 포함하는 것인 방법.
  8. 제 4 항에 있어서,
    상기 포획 분자는 항원, 항체, DNA, RNA, PNA, 압타머(aptamer), 지질, 호르몬, 무기 물질, 세포, 리간드, 및 그들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제 4 항에 있어서,
    상기 샘플은 생물학적 샘플, 화학적 샘플, 환경적 샘플, 및 식품 샘플로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 제 4 항에 있어서,
    상기 표적 물질은 항원, 항체, 펩티드, DNA, RNA, PNA, 압타머, 리간드, 대사물질(metabolite), 독성 화합물, 지질, 호르몬, 박테리아, 바이러스, 엑소좀(exosome), 거대-수포(macro-vesicles), 미세-수포(micro-vesicles), 세포, 및 그들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 제 4 항에 있어서,
    상기 유기 나노구조물이 하기 일반식 1 또는 2의 화합물인 것인 방법;
    Figure pct00011
  12. 샘플 중 표적 물질의 존재를 분석하기 위한 분석 키트로서, 상기 분석 키트는 제 1 항의 다공성 니트로셀룰로스 막을 포함하는 것인 분석 키트.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 포획 분자는 항원, 항체, DNA, RNA, PNA, 압타머, 지질, 호르몬, 무기 물질, 세포, 리간드, 펩티드 및 그들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 분석 키트.
  14. 제 12 항에 있어서,
    상기 분석 키트는 미세 유체와 니트로셀룰로스 막의 흐름 통과 유형(flow through type), 측부 흐름 유형(lateral flow type), 또는 혼합물인 것인 분석 키트.
  15. 표면 및 하기 일반식 A의 비-공유적으로 고정된 유기 나노구조화된 분자를 포함하는 다공성 니트로셀룰로스 막:
    [일반식 A]
    Figure pct00012

    상기 식에서,
    L은 트리아졸 모이어티를 포함하는 상기 유기 나노구조화된 분자의 선형 영역 모이어티이되, 상기 L은;
    (i) 표적 분자에 선택적으로 결합하도록 조정되는 포획 분자를 공유적으로 부착하도록 조정된 선형 영역 말단 작용기, 또는
    (ii) 표적 분자에 선택적으로 결합하도록 조정되는 공유적으로 부착된 포획 분자
    를 더 포함하고;
    Q1은 적어도 3의 산화상태를 가지는 상기 유기 나노구조화된 분자의 중심원자이며;
    a1은 2 내지 상기 Q1의 산화상태 -1의 정수이고;
    각각의 T는 독립적으로, 상기 유기 나노구조화된 분자를 상기 다공성 니트로셀룰로스 막에 비-공유적으로 부착하도록 구성되는 분지된 말단 영역 작용기를 포함하는 상기 유기 나노구조화된 분자의 분지된 말단 영역 모이어티이며;
    상기 유기 나노구조화된 분자는 복수의 상기 분지된 말단 영역 작용기에 의해서 상기 다공성 니트로셀룰로스 막에 비-공유적으로 부착됨.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 유기 나노구조화된 분자는 하기 일반식 IA의 것인 다공성 니트로셀룰로스 막:
    [일반식 IA]
    Figure pct00013

    상기 식에서,
    각각의 a, b 및 c는 독립적으로 0 또는 1이고;
    x는 c가 0이거나 또는 c가 1일때 1이고, x는 1 내지 상기 Q4의 산화상태 -1의 정수이며;
    y는 b가 0이거나 또는 b가 1일때 1이고, y는 1 내지 상기 Q3의 산화상태 -1의 정수이고;
    z는 a가 0이거나 또는 a가 1일때 1이고, z는 1 내지 상기 Q2의 산화상태 -1의 정수이며;
    n은 1 내지 상기 Q1의 산화상태 -1의 정수이고;
    L 및 Q1은 제 15 항에서 정의된 바와 같으며;
    각각의 Q2, Q3 및 Q4는 독립적으로 적어도 3의 산화상태를 가지는 분지 원자이고;
    각각의 R2, R3, R4, 및 R5는 독립적으로 링커(linker)이며;
    Y는 상기 분지된 말단 영역 작용기이되,
    n, x, y, 및 z의 곱은 적어도 3임.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 유기 나노구조화된 분자는 하기 일반식 IB의 것인 다공성 니트로셀룰로스 막:
    [일반식 IB]
    Figure pct00014

    상기 식에서,
    Q1, Q2, Q3, Q4, R2, R3, R4, R5, Y, a, b, c, x, y, z, 및 n은 제 16 항에서 정의된 바와 같으며;
    Ra는,
    [일반식 1]
    Figure pct00015
    ;
    [일반식 2]
    Figure pct00016
    ;
    [일반식 3]
    Figure pct00017
    ;
    [일반식 4]
    Figure pct00018
    ; 및
    그들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    여기서,
    점선은 선택적인 이중결합을 나타내며;
    Z는 표적 분자에 선택적으로 결합하도록 조정되는 포획 분자이되, 상기 Z는 일반식 1의 화합물의 알데하이드 작용기 또는 일반식 2의 에폭사이드 작용기를 이용하여 공유적으로 부착됨.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 유기 나노구조화된 분자는 하기 일반식 IC의 것인 다공성 니트로셀룰로스 막:
    [일반식 IC]
    Figure pct00019

    상기 식에서, Ra는 제 17 항에서 정의된 바와 같음.
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