BR112020012394A2 - método de identificação e isolamento de compostos bioativos a partir de extratos de algas marinhas - Google Patents
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Abstract
Trata-se de um método de isolamento e purificação de compostos bioativos em um extrato obtido a partir de algas marinhas. O método envolve as etapas de: (a) circular o extrato através de uma membrana ultrafiltrante que tem um peso molecular de corte adequado; (b) coletar filtrado a partir do extrato para obter uma primeira fração de filtrado e um retentado; e (c) enxaguar o retentado para obter uma ou mais frações de filtrado adicionais. A bioatividade da primeira fração de filtrado e as frações de filtrado adicionais podem, então, ser avaliadas para determinar sua eficácia em crescimento vegetal. Uma ou mais moléculas bioativas isoladas de uma espécie algácea também são descritas em que a uma ou mais moléculas bioativas têm um peso molecular na faixa de cerca de 0,15 kDa a cerca de 1,0 kDa e têm capacidade para acentuar ou melhorar o crescimento vegetal.
Description
“MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO E ISOLAMENTO DE COMPOSTOS BIOATIVOS A PARTIR DE EXTRATOS DE ALGAS MARINHAS” Campo da invenção
[001] A presente invenção refere-se geralmente a um método de purificação e isolamento de compostos bioativos responsáveis por estimulação de crescimento vegetal a partir de extratos de algas marinhas. Antecedentes da invenção
[002] Um dos desafios da agricultura moderna é atender à demanda social por sustentabilidade, qualidade e segurança na produção agrícola e adaptar-se ao aumento da população mundial, melhorando-se o rendimento e a tolerância das culturas a um ambiente em mudança.
[003] Os bioestimulantes podem ser usados para melhorar a nutrição de plantas, o que afeta os parâmetros de rendimento e qualidade. Os bioestimulantes vegetais geralmente se enquadram em uma dessas categorias, isto é, produtos que contêm hormônios, produtos à base de extrato vegetal, produtos à base de micronutrientes, produtos que contêm aminoácidos e produtos que contêm ácido húmico, mas não podem ser estritamente restritos apenas a essas categorias. Os bioestimulantes vegetais são usados para tratar culturas em um ambiente comercial, em vista de sua capacidade de aumentar as taxas de crescimento, aumentar a tolerância à tensão, aumentar a taxa fotossintética e aumentar a tolerância a doenças. Acredita-se que os bioestimulantes vegetais operem através de genes-chave de via biológica de regulação positiva ou regulação negativa.
[004] Conforme definido pelo Conselho Europeu da Indústria de Bioestimulantes (EBIC), os bioestimulantes DOCS - 7666882v1 vegetais contêm substância (ou substâncias) e/ou microrganismos cuja função quando aplicada às plantas ou à rizosfera é estimular processos naturais para melhorar/beneficiar a captação de nutrientes, a eficiência nutritiva, a tolerância a tensão abiótica e qualidade da cultura. Os bioestimulantes não têm ação direta contra pragas e, portanto, não se enquadram na estrutura regulatória de pesticidas.
[005] Os bioestimulantes estão disponíveis em uma variedade de formulações e com ingredientes variados, mas geralmente são classificados com base em sua fonte e teor. Esses grupos incluem substâncias húmicas (HS) e produtos que contêm aminoácidos (AACP).
[006] Os bioestimulantes estão disponíveis em uma variedade de formulações e com ingredientes variados, mas geralmente são classificados em sete grupos principais com base em sua fonte e teor. Esses grupos incluem substâncias húmicas (ácidos húmicos e flúvicos), hidrolisados de proteínas e outros compostos que contêm N, extratos de algas marinhas e componentes botânicos, quitosana e outros biopolímeros, compostos inorgânicos, fungos benéficos e bactérias benéficas.
[007] Apesar da disponibilidade comercial de inúmeros fertilizantes e bioestimulantes vegetais, continua a haver uma demanda por produtos aprimorados com capacidade para atender a uma variedade de necessidades. Portanto, são necessários novos produtos e métodos para melhorar as respostas e o desenvolvimento do crescimento vegetal.
[008] As algas marinhas e produtos derivados de algas marinhas têm sido amplamente utilizados em sistemas de DOCS - 7666882v1 produção agrícola devido à presença de vários compostos estimulantes do crescimento vegetal dentro desses produtos. Assim, o potencial de bioestimulação de muitos desses produtos não foi totalmente explorado devido à falta de dados científicos sobre fatores de crescimento presentes nas algas marinhas e seus vários modos de ação para afetar o crescimento vegetal.
[009] Embora os efeitos fisiológicos dos extratos de algas marinhas sobre as defesas e o crescimento vegetal tenham sido examinados, pouco se sabe sobre os compostos bioativos específicos nos extratos de algas marinhas que são responsáveispor esses estimulantes de plantas. Seria desejável acelerar a identificação desses componentes bioativos em algáceas, incluindo, por exemplo, extratos de algáceas marrons.
[010] Phaeophyceae ou algácea marrom são um grande grupo de algas multicelulares marinhas, principalmente, incluindo muitos tipos de algas marinhas localizadas nas duas águas do Hemisfério. Desempenham um papel importante em ambientes marinhos, tanto como alimento quanto como habitat. Muitas algáceas marrons, como membros da ordem Fucales, geralmente crescem ao longo de praias rochosas. Em todo o mundo, são conhecidas mais de 1.500 espécies de algáceas marrons. Algumas espécies, como Ascophyllum nodosum, são importantes no uso comercial e também têm impacto ambiental.
[011] Patente no U.S. 7.611.716 de Michailovna et al descreve um método de processamento de algas marinhas para obter, em um único processo, extratos que compreendem polissacarídeos ácidos e neutros e um extrato que compreende compostos biologicamente ativos de baixo peso molecular que DOCS - 7666882v1 podem ser utilizados em medicina, alimentos, perfumaria e indústria de cosméticos. No entanto, a referência descreve apenas um método de processamento de algas marinhas e não fornece nenhuma maneira de identificar possíveis compostos bioestimulantes de plantas contidos no mesmo.
[012] Patente no U.S. 3.856.569 de Strong, descreve um método de purificação e concentração do polissacarídeo desejável, como carragenina ou alginato, de soluções aquosas derivadas de algas marinhas (Rhodophyceae e Phaeophyceae) submetendo-se as soluções a ultrafiltração. No entanto, novamente, esta referência fornece apenas um método de processamento de algas marinhas e não fornece nenhuma maneira de identificar compostos bioestimulantes contidos nos mesmos.
[013] Devido à crescente demanda por produtos orgânicos, ecológicos e inofensivos à saúde humana, a necessidade de bioestimulantes naturais aumentou. Além disso, há a necessidade de bioestimulantes semelhantes ou mais eficazes do que os bioestimulantes tradicionais que foram utilizados. Além disso, continua a haver uma necessidade na arte de um processo melhorado de isolamento e purificação de compostos bioestimulantes, inclusive a partir de extratos derivados de algas marinhas. Sumário da invenção
[014] É um objetivo da presente invenção identificar e purificar substâncias que podem ser usadas como bioestimulantes vegetais.
[015] É outro objetivo da presente invenção identificar e purificar compostos bioativos em vários extratos de algas marinhas que são responsáveis pela estimulação do crescimento vegetal.
DOCS - 7666882v1
[016] Para esse fim, em uma modalidade, a presente invenção se refere geralmente a uma ou mais moléculas bioativas isoladas de uma espécie de alga, a uma ou mais moléculas bioativas que tem um peso molecular na faixa de cerca de 0,15 kDa a cerca de 1,0 kDa.
[017] Em outra modalidade, a presente invenção se refere geralmente a um método de isolamento e purificação de compostos bioativos em um extrato obtido a partir de algas marinhas, sendo que o método compreende as etapas de: a) circular o extrato através de uma membrana ultrafiltrante que tem um peso molecular de corte adequado; b) coletar filtrado a partir do extrato de algas marinhas para obter uma primeira fração de filtrado e um retentado; e c) enxaguar o retentado para obter uma ou mais frações de filtrado adicionais. Breve descrição das figuras
[018] Para uma compreensão mais completa da invenção, é feita referência à seguinte descrição, tomada em conexão com as figuras anexas, nas quais:
[019] As Figuras 1a e 1b representam o fracionamento por Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC) realizado no extrato RM-3496 filtrado e um cromatograma de padrões injetados no SEC para avaliar os pesos moleculares médios das moléculas apresentadas nas diferentes frações.
[020] A Figura 2 representa diagramas de caixas que mostram a eficácia de fracionamento de SEC de RM-3496 em alfaces.
[021] As Figuras 3a e 3b representam diagramas de caixas que mostram os pesos de broto fresco e os pesos de raízes DOCS - 7666882v1 frescas de culturas in vitro de Arabidopsis thaliana tratadas com a fração F3 em comparação com o controle não tratado, o extrato RM-3496 e oextrato RM-3496 reconstruído.
[022] A Figura 4 representa uma vista do processo de ultrafiltração de acordo com um aspecto da presente invenção.
[023] A Figura 5 mostra diagramas de caixas que mostram os pesos de broto fresco das alfaces tratadas com várias frações ultrafiltradas, retentados e extratos.
[024] A Figura 6 mostra diagramas de caixas que mostram os pesos de broto fresco dos trigos tratados com várias frações ultrafiltradas, retentados e extratos. Descrição detalhada das modalidades preferenciais
[025] Por "bioestimulante" da planta, entende-se um material orgânico que contém substância (ou substâncias) e/ou microrganismos cuja função quando aplicada às plantas ou à rizosfera é estimular processos naturais para melhorar/beneficiar a captação de nutrientes, a eficiência nutritiva, a tolerância a tensão abiótica e qualidade da cultura.
[026] Ao introduzir elementos da presente invenção ou suas modalidades preferidas da mesma, os artigos "um", "uma", "o" e "a" se destinam a significar que existem um ou mais dos elementos. Os termos “que compreende”, “que inclui” e “que tem” são destinados a serem inclusivos e significam que podem existir elementos adicionais além dos elementos listados.
[027] Conforme usado no presente documento, o termo "cerca de" se refere a um valor mensurável, como um parâmetro, uma quantidade, uma duração temporal e similares e deve incluir variações de +/- 15% ou menos, de preferência, variações de +/- 10% ou menos, mais preferencialmente DOCS - 7666882v1 variações de +/- 5% ou menos, ainda mais preferencialmente variações de +/- 1% ou menos, e com a máxima preferência variações de +/- 0,1% ou menos e do valor particularmente recitado, na medida em que tais variações sejam apropriadas para realizar na invenção descrita no presente documento. Além disso, também deve ser entendido que o valor ao qual o modificador "cerca de" se refere é o mesmo especificamente revelado no presente documento.
[028] A presente invenção descreve um método de purificação e isolamento de compostos bioestimulantes a partir de extratos derivados de algas marinhas que têm capacidade para aumentar as taxas de crescimento e os rendimentos de uma ampla faixa de culturas.
[029] Conforme descrito no presente documento, em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para purificar os compostos bioativos responsáveis pela estimulação do crescimento vegetal em extratos de algas marinhas pela determinação metabolômica dos extratos de algas marinhas.
[030] Assim, em uma modalidade, a presente invenção se refere geralmente a uma ou mais moléculas bioativas isoladas de uma espécie de alga, a uma ou mais moléculas bioativas que tem um peso molecular na faixa de cerca de 0,15 kDa a cerca de 1,0 kDa. As uma ou mais moléculas bioativas são aquelas que têm capacidade de melhorar o crescimento vegetal. Em uma modalidade, a espécie algácea é uma espécie algácea marrom. A algácea marrom podem compreender uma espécie de algácea selecionada a partir do grupo que compreende Ascophyllum nodosum, Fucus vesiculosus, Sargassum sp. e combinações de um ou mais dos supracitados. Em uma modalidade, as uma ou mais DOCS - 7666882v1 moléculas bioativas não compreendem um polissacarídeo sulfatado ou laminarina.
[031] A presente invenção também se refere geralmente a um método de melhoramento de crescimento vegetal, sendo que o método compreende a etapa de aplicação de uma composição que compreende a uma ou mais moléculas bioativas isoladas em pelo menos um solo, planta ou semente. Melhorar o crescimento vegetal inclui pelo menos um dentre o seguinte: promover germinação de semente, estimular desenvolvimento de raiz, prolongar um período vegetativo, aumentar um período de produção ou aumentar um período de colheita.
[032] A presente invenção também se refere geralmente a um método de isolamento e purificação de compostos bioativos em um extrato obtido a partir de algas marinhas, sendo que o método compreende as etapas de: a) circular o extrato através de uma membrana ultrafiltrante que tem um peso molecular de corte adequado; b) coletar filtrado a partir do extrato para obter uma primeira fração de filtrado e um retentado; e c) enxaguar o retentado para obter uma ou mais frações de filtrado adicionais.
[033] O método compreende ainda a etapa de avaliar a bioatividade da primeira fração de filtrado e das frações de filtrado adicionais para determinar sua eficácia no crescimento vegetal. A eficácia no crescimento vegetal pode incluir pelo menos um dentre o seguinte: promover germinação de semente, estimular desenvolvimento de raiz, prolongar um período vegetativo, aumentar um período de produção ou aumentar um período de colheita. De acordo com a modalidade, o extrato é produzido a partir de uma espécie algácea marrom.
DOCS - 7666882v1
O extrato pode ser obtido de Ascophyllum nodosum, Fucus vesiculosus ou Sargassum sp. algae.
[034] Em uma modalidade preferida, o retentado compreende moléculas ativas selecionadas a partir do grupo que consiste em polissacarídeos sulfatados e laminarina, que são moléculas ativas com capacidade para aliviar a tensão abiótica, como excesso de sal, nas culturas. O primeiro filtrado compreende moléculas bioativas que tem um peso molecular na faixa de cerca de 0,15 kDa a cerca de 1,0 kDa.
[035] A membrana ultrafiltrante pode ter um limite de peso molecular (MWCO) menor que 3 kDa, de preferência um MWCO menor que 2 kDa e mais preferencialmente um MWCO menor que 1 kDa.
[036] Ascophyllum nodosum (erva-da-rocha) é uma espécie de fucoide de alga marrom encontrada no Oceano Atlântico Norte e tem sido usada como fonte de bioestimulante para culturas agrícolas, para melhorar o crescimento vegetal, a produtividade das plantas e a qualidade dos alimentos.
[037] Várias técnicas de purificação foram testadas para dessalinizar e purificar esses extratos de algas marinhas de acordo com a polaridade e o tamanho de moléculas. Para cada procedimento de purificação, as frações foram analisadas em alfaces para garantir que a bioatividade fosse mantida na fração dessalinizada diferente ou permanecesse associada aos sais. Esta etapa de purificação foi aplicada em um extrato de algas marinhas (RM-2705, um extrato fucoide disponível em Goëmar) e as frações purificadas não polares apresentaram um alto nível de pureza. A maioria das biomoléculas (cerca de 69%) foi coeluída com sais para mostrar que as moléculas bioativas estavam localizadas em uma das frações purificadas DOCS - 7666882v1 não polares. Posteriormente, as diferentes frações foram testadas em alface em comparação com o extrato completo. No entanto, os resultados mostraram que as moléculas bioativas responsáveis pela estimulação do crescimento vegetal estavam presentes na fração polar que também continha sais. Foi determinado que o fracionamento de acordo com a polaridade das moléculas contidas nos extratos RM-2705 e RM-3496 não era adequado para dessalinizar e purificar os extratos de algas marinhas. De fato, para todas as técnicas de fracionamento usadas, as moléculas bioativas permaneceram associadas aos sais.
[038] Assim, surgiu o desafio de encontrar outro método de dessalinização dos extratos de algas marinhas, enquanto mantém a atividade bioestimulante do crescimento vegetal. Várias técnicas de purificação foram investigadas, incluindo Extração Líquida Líquida (LLE) com acetato de etila, Extração De Fase Sólida (SPE) com diferentes sorventes (uma fase normal: cianopropil-sílica e uma fase reversa” Amberlite® XAD2), Extração Líquida Sólida (SLE) com butanol e Cromatografia de Exclusão Por Tamanho (SEC).
[039] Além disso, para obter informações sobre a estabilidade das moléculas bioativas, a estabilidade térmica da atividade do extrato RM-2705 foi avaliada em alfaces. Os resultados mostraram uma estabilidade térmica das moléculas bioativas, e a autoclave ou a ebulição dos extratos tratados aumentaram o peso de broto livre de alfaces.
[040] O fracionamento de acordo com a polaridade parecia ser ineficiente na purificação das moléculas bioativas; portanto, o extrato de algas marinhas foi fracionado de acordo com o tamanho de partícula de suas moléculas para DOCS - 7666882v1 tentar dessalinizar.
[041] Foi determinado que todas essas técnicas pareciam ineficientes para a finalidade, com exceção da Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC) com resina Superdex®30, também conhecida como Cromatografia de Filtragem em Gel (GF). O SEC foi considerado o único método eficaz para dessalinizar e purificar o filtrado de algas marinhas.
[042] Com base nisso, o extrato de alga marinha (RM-3496) foi fracionado pelo processo de fracionamento da SEC e as moléculas foram eluídas de acordo com seu tamanho (ou pesos moleculares), conforme mostrado na Figura 1.a. A resina ASuperdex30® (GE Healthcare, Bjorkgatan, Suécia) foi usada para garantir uma boa separação de moléculas com um peso molecular abaixo de 10 kDa. Quanto menores as moléculas (isto é, pesos moleculares mais baixos), mais ficam presas nas esferas porosas do gel e são eluídas posteriormente. Assim, os pesos moleculares das moléculas diminuem da primeira fração (isto é, F1) para a última fração (isto é, F6). As frações F1 e F2 foram constituídas pelas moléculas maiores que fluem através da coluna mais rapidamente que os sais e as moléculas de muito baixo peso molecular são eluídas nas frações F5 e F6.
[043] Para avaliar as faixas de peso molecular das moléculas contidas nas diferentes frações, uma mistura de padrões (0,5% p/v) foi injetada no sistema SEC. O cromatograma dos padrões está representado na Figura 1.b. a) Laminarina (de cerca de 3 a cerca de 5kDa), b) Raffinose (594Da), c) Sacarose (343.3Da), d) Sal citrato (343.3Da), e) Manitol (182.2Da) e f) Glicina (75.1Da). De acordo com esses resultados, a fração F1 continha moléculas com altos pesos DOCS - 7666882v1 moleculares (superiores a 4 kDa), a fração F2 continha Laminarina (de cerca de 3 a cerca de 4kDa) que foi eluída entre as frações F1 e F2.
[044] Um ultrafiltrado, obtido após a ultrafiltração do extrato RM-2705 em um sistema de ultrafiltração com uma membrana de corte de 1kDa, foi injetado no sistema SEC. O perfil cromatográfico do ultrafiltrado mostrou apenas os picos cromatográficos correspondentes aos das frações F3, F4, F5 e F6 do fracionamento SEC do extrato RM-2705. Assim, a fração F3 continha moléculas com pesos moleculares menores que 1 kDa a cerca de 0,18 kDa, a fração F4 continha moléculas com pesos moleculares menores que cerca de 0,2 kDa, como o manitol (182,2 Da) e as frações F5 e F6 continham sais e moléculas com pesos moleculares muito baixos, como glicina (75 Da). Os espectros de RMN das diferentes frações confirmaram a presença de polissacarídeos sulfatados (polímeros de fucano) na primeira fração F1, enquanto a segunda fração F2 contém laminarina (de cerca de 3 a cerca de 4 kDa) e a fração quatro F4 contém manitol (182,2 Da). As duas últimas frações F5 e F6 continham moléculas e sais de peso molecular muito baixo.
[045] As diferentes frações obtidas pelo fracionamento SEC foram testadas quanto à atividade de estimulação do crescimento vegetal em alfaces, em comparação com o extrato de algas marinhas RM-3496. Antes da injeção na Cromatografia, o extrato de algas marinhas foi filtrado e este extrato filtrado também foi testado em alface para verificar sua eficácia. Os resultados mostraram que moléculas bioativas foram encontradas na fração F3, conforme ilustrado na Figura
2. Foi encontrada uma atividade significativa na fração F3 DOCS - 7666882v1 que continha moléculas que varia de cerca de 0,15 kDa a cerca de 1 kDa.
[046] A combinação das diferentes técnicas usadas para dessalinizar o extrato RM-2705 forneceu informações sobre as propriedades físico-químicas da molécula bioativa (ou moléculas bioativas). Em particular, foi determinado que as moléculas bioativas são polares e seus pesos moleculares variam de cerca de 0,15 a cerca de 1 kDa. Assim, essas informações excluem, dos polímeros bioativos promotores de crescimento, os polímeros de fucano, que são os principais polissacarídeos sulfatados do extrato ácido de Ascophyllum nodosum, a laminarina (de cerca de 3 a cerca de 4bkDa), um elicitor de beta-1,3-glucana e manitol (182 Da), um poliol que pode representar até 8 a 10% do extrato em peso seco.
[047] Para confirmar a bioatividade da fração F3 purificada, uma cultura in vitro com uso da planta modelo Arabidopsis thaliana foi desenvolvida e reproduzida várias vezes. Esses testes ilustrados na Figura 3.a. confirmaram a bioatividade da fração F3, enquanto a presença de sais no extrato RM-3496 perturbou o crescimento de Arabidopsis thaliana nessas condições de cultura. No entanto, o RM-3496 reconstruído, correspondente à reconstituição do extrato de algas marinhas com as frações SEC, apresentou atividade promotora de crescimento. Além disso, neste bioensaio in vitro, a fração F3 e o RM-3496 reconstruído também pareceram melhorar o crescimento radicular, como mostra a Figura 3.b.
[048] A fração F3 apresentou forte atividade estimuladora do crescimento, enquanto as frações F1 e F2 estavam inativas. No entanto, durante o desenvolvimento deste último bioensaio, foi demonstrado que na presença de sal (NaCl 100 mM), a DOCS - 7666882v1 fração F3 não estava mais ativa para estimular o crescimento, enquanto F1 e F2 exibiam efeitos semelhantes e que todo o extrato RM-2705 confere tolerância ao sal. Esses resultados indicam que o extrato RM-2705 contém diferentes compostos ativos com diferentes modos de ação, que inclui (1) a fração de baixo peso molecular (LMW) responsável pela estimulação do crescimento e (2) frações que contém laminarina e fucanos que conferem tolerância ao estresse (sal, bem como biótico, resistência à tensão).
[049] Tomados em conjunto, esses resultados indicam que o fracionamento do extrato RM-2705 pode fornecer pelo menos dois tipos de produtos com modos de ação distintos e, portanto, aplicações diferentes com uso das mesmas matérias- primas.
[050] Como a SEC não é transferível em escala industrial, era desejável também desenvolver outro método com capacidade para produzir produtos fracionados de extratos de algas marinhas que possam fornecer atividade estimulante do crescimento vegetal em maior escala.
[051] Uma alternativa ao SEC é a ultrafiltração (UF), um processo de fracionamento no qual o extrato de algas marinhas é filtrado através de membranas de ultrafiltração com pontos de corte de peso molecular adequados (MWCO), que em uma modalidade pode ser um MWCO de 1 kDa para produzir uma fração com moléculas bioativas no intervalo desejado de cerca de 0,15 kDa a 1,0 kDa. Assim, em uma modalidade, um extrato de algas marinhas pode ser ultrafiltrado com uso de uma membrana MWCO de 1 kDa.
[052] Em uma modalidade e no sentido mais amplo, a presente invenção fornece um método de purificação de uma DOCS - 7666882v1 composição bioestimulante derivada de um extrato de algas marinhas, que compreende uma etapa de ultrafiltração com uso de uma membrana ultrafiltrante semipermeável para separar as moléculas de interesse do restante da mistura de acordo com ao seu peso molecular, tamanho e formato.
[053] A etapa de ultrafiltração pode ser realizado com uso de equipamento de ultrafiltração no qual uma solução de extrato de algas marinhas que compreende entre cerca de 1% em peso e cerca de 15% em peso de matéria seca, mais preferencialmente entre cerca de 2% em peso e cerca de 7% em peso de matéria seca, é submetida a ultrafiltração com uso de uma membrana com um limite de peso molecular adequado (MWCO). Em uma modalidade, o processo de ultrafiltração envolve ultrafiltração tangencial.
[054] O filtrado é coletado por suas propriedades bioestimulantes enquanto recircula o retentado (ou concentrado), que é deixado de lado para outras aplicações no final do processo. Embora geralmente não seja necessário ou exigido, se desejado, uma purificação adicional do retentado (ou concentrado) pode ser alcançada pela adição de água fresca a uma taxa correspondente àquela em que a água, juntamente com moléculas com peso molecular menor que ou igual a 1 kDa é removido do ultrafiltrado.
[055] Conforme visto na Figura 4, a ultrafiltração pode ser realizada por um processo no qual o reservatório da solução (1) é carregado com um lote de extrato de algas marinhas. A solução é circulada pela linha (2) e bomba (3) para um coletor de entrada (4) de uma unidade de ultrafiltração (5). A unidade de ultrafiltração (5) compreende um ou mais cartuchos dispostos em paralelo para DOCS - 7666882v1 fornecer a área apropriada da membrana ultrafiltrante. O ultrafiltrado sai da unidade de ultrafiltração (5) via linha de saída (6) e é coletado no tanque (7). O concentrado de ultrafiltração sai da unidade de ultrafiltração (5) através do coletor de saída (8) e é retornado via linha (9) ao reservatório da solução (1).
[056] A membrana contida na unidade de ultrafiltração (5) pode ser membrana do tipo polimérica ou cerâmica. Em uma modalidade, a membrana compreende uma membrana tubular de cerâmica que compreende uma pluralidade de canais. Por exemplo, a membrana pode conter entre cerca de 15 e cerca de 50 canais, mais preferencialmente entre cerca de 19 e cerca de 39 canais e pode ter um comprimento entre cerca de 50 e cerca de 150 cm. Em outras modalidades, membranas espirais e membranas de fluxo cruzado também podem ser usadas na prática da invenção. A área da membrana está geralmente entre cerca de 0,20 e cerca de 0,6 m2, mais preferencialmente entre cerca de 0,30 e 0,40 m2.
[057] O retentado é enxaguado várias vezes para remover a maior parte das moléculas com um peso molecular menor que o ponto de corte da membrana. Os ultrafiltrados contêm moléculas com um peso molecular menor que o da membrana de corte. Em um caso, o ponto de corte é de 3 kDa, mais preferencialmente 2 kDa, e ainda mais preferencialmente 1 kDa. As moléculas que estão contidas nos ultrafiltrados exibem pesos moleculares baixos menores que o MWCO, por exemplo, 1 kDa e são comumente chamados de metabólitos. Os retentados contêm moléculas com pesos moleculares maiores que as membranas de corte, por exemplo, 1 kDa. As moléculas que estão contidas no retentado exibem altos pesos moleculares DOCS - 7666882v1
(por exemplo, laminarina de cerca de 3 a cerca de 4 kDa ou fucoidanos maiores que cerca de 30 kDa e outros biopolímeros de alto peso molecular de algas marrons).
[058] Foi verificado que todas as espécies de algas da ordem de Fucales exibem uma atividade promissora e podem ser submetidas aos métodos descritos no presente documento. Essas espécies de algas incluem, entre outras, espécies das famílias de Fucaceae, Sargassaceae e Durveilleaceae. Outras espécies das ordens de Fucales e Laminariales incluem, mas não estão limitadas a, Ascoseirales, Asterocladales, Desmarestiales, Dictyotales, Dictyotophycidae, Discosporangiales, Discosporangiophycidae, Ectocarpales, Fucales, Fucophycidae, Ishigeales, Ishigeophycidae, Laminariales, Nemodermatales, Onslowiales, Phaeophyceae ordo incertae sedis, Phaeosiphoniellales, Ralfsiales, Scytothamnales, Sphacelariales, Sporochnales, Stschapoviales, Syringodermatales, Tilopteridales, entre outras.
[059] Além disso, embora a presente invenção seja descrita e demonstre resultados positivos em espécies de algas da ordem Fucales, o método não se limita a essas espécies de algas e também pode ser usado para isolar e analisar filtrados de qualquer alga ou outra espécie que possa atuar como bioestimulantes para determinar a bioatividade de tais filtrados.
[060] Conforme usado nas Figuras no presente documento, o termo "filtrado" se refere ao filtrado e ultrafiltrados obtidos após uma ou mais ultrafiltrações através da unidade de ultrafiltração.
[061] Conforme usado nas Figuras no presente documento, o termo "retentado" se refere ao retentado sem lavagem e DOCS - 7666882v1 retentados obtidos após uma ou mais lavagens. Exemplos: Exemplo 1:
[062] Um extrato RM-3496 foi ultrafiltrado em escala laboratorial com uma membrana de 1 kDa MWCO e o retentado foi lavado três vezes com água. O ultrafiltrado, que contém moléculas com pesos moleculares menores que 1 kDa, e o retentado, que contém moléculas com pesos moleculares maiores que 1 kDa, foram testados em alfaces e trigo. Assim, os diferentes filtrados e retentados foram aplicados em alfaces e trigos. Os extratos GF142 e GS142 (disponíveis no Laboratórios Goëmar) foram fabricados com o mesmo processo de Fucus vesiculosus e Sargassum natans respectivamente. Os resultados são mostrados nas Figuras 5 e 6, que mostram diagramas de caixas que mostram os pesos de broto fresco das plantas de controle, plantas tratadas com quatro extratos diferentes de algas marinhas (RM-2705, RM-3496, GF142 e GS142), plantas tratadas com alto teor molecular, as moléculas de peso correspondem aos retentados denominados: RM-3496.retentado, GF142.retentado e GS142.retentado, e as plantas tratadas com moléculas de baixo peso molecular correspondem aos filtrados denominados: RM-3496.filtrado, GF142.filtrado e GS142.filtrado. Estes resultados confirmam a eficácia dos extratos de algas marinhas e mostram uma atividade promotora de crescimento nos filtrados, em que os retentados parecem ineficientes na promoção de crescimento vegetal. Exemplo 2:
[063] Dez litros de um extrato aquoso de Ascophyllum nodosum (pH 2,76) foram colocados em um reservatório de DOCS - 7666882v1 solução de uma unidade de ultrafiltração em escala piloto equipada com um tubular de 58 cm de comprimento (diâmetro: Membrana ultrafiltrante de cerâmica de 25 mm, 23 canais, 1 kDa de corte) (fornecida pela Tami Industries). A solução foi bombeada através do tubo de ultrafiltração com recirculação completa do concentrado de volta ao reservatório. Seis litros de filtrado foram coletados e identificados como F1. O retentado (4 l) foi enxaguado duas vezes com 5 litros de água para produzir 2 filtrados (F2 = 5 l; F3 = 5 l). Os diferentes filtrados (F1, F2, F3) foram posteriormente avaliados quanto às suas propriedades bioestimulantes. Exemplo 3:
[064] Cinco litros de um extrato aquoso de Fucus vesiculosus (pH 2,42) foram colocados em um reservatório de solução de uma unidade de ultrafiltração em escala piloto equipada com um tubular de 58 cm de comprimento (diâmetro: Membrana ultrafiltrante de cerâmica de 25 mm, 23 canais, 1 kDa de corte (fornecida pela Tami Industries). A solução foi bombeada através do tubo de ultrafiltração com recirculação completa do concentrado de volta ao reservatório. O filtrado foi coletado e identificado como F1. O retentado (2,5 l) foi enxaguado uma vez com 2,5 l de água para produzir 2,5 litros de filtrado (F2 = 2,5 l). Os diferentes filtrados (F1, F2) foram posteriormente avaliados quanto às suas propriedades bioestimulantes. Exemplo 4:
[065] Cinco litros de um extrato aquoso de Sargassum natans (pH 2,92) foram colocados em um reservatório de solução de uma unidade de ultrafiltração em escala piloto equipada com um tubular de 58 cm de comprimento (diâmetro: DOCS - 7666882v1
Membrana ultrafiltrante de cerâmica de 25 mm, 23 canais, 1 kDa de corte) (fornecida pela Tami Industries). A solução foi bombeada através do tubo de ultrafiltração com recirculação completa do concentrado de volta ao reservatório. O filtrado foi coletado e identificado como F1. O retentado (2,5 l) foi enxaguado uma vez com 2,5 l de água para produzir 1 litro de filtrado (F2 = 2,5 l). Os diferentes filtrados (F1, F2) foram posteriormente avaliados quanto às suas propriedades bioestimulantes. Exemplo 5:
[066] RM-3496, fabricado pelo Laboratório Goëmar a partir de extrato de Ascophyllum nodosum e dois outros extratos de algas marinhas (GF142 e GS142, fabricados pelo Laboratório Goëmar de Fucus vesiculosus e Sargasssum natans respectivamente) foram submetidos a ultrafiltração e avaliados por suas propriedades bioestimulantes.
[067] Estes três extratos fucoides foram ultrafiltrados em uma membrana cerâmica (disponível na TAMI Industries) com um MWCO adequado (isto é, 1 kDa). Dez litros de RM-3496 foram ultrafiltrados e cinco litros do ultrafiltrado foram coletados e constituíram o filtrado 1 usado em experiências adicionais em alface e trigo. O retentado (5 l) foi lavado duas vezes com 5 litros de água, enquanto os retentados GF142 e GS142 (2,5 l) foram enxaguados apenas uma vez com 2,5 litros de água. Os pesos secos dos filtrados, ultrafiltrados e retentados foram medidos. De acordo com o processo de fracionamento do extrato RM-3496, os pesos secos totais dos filtrados (que contém moléculas com pesos moleculares menores que 1 kDa) eram cerca de 80% do extrato RM-3496 e oretentado era cerca de 20% do extrato RM-3496.
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[068] Os detalhes dos experimentos de crescimento vegetal são descritos abaixo.
[069] Os tratamentos foram realizados com diferentes extratos de Goëmar (RM-2705, RM-3496, GF142 e GS142) e um fator de diluição de 250 (equivalente a 4 mililitros de extrato líquido por litro de solução nutritiva) foi usado em todos os experimentos. As diferentes frações resultantes do fracionamento SEC e do fracionamento por Ultrafiltração foram aplicadas nas plantas de acordo com seus rendimentos de purificação que foram calculados com pesos secos. Várias repetições biológicas independentes foram realizadas com as diferentes frações com n plantas por tratamentos
[070] Os experimentos de crescimento de alface foram realizados com sementes dos ecótipos de Lactuca sativa Fabietto ou Janero (disponível em Voltz, Colmar, França). As alfaces foram cultivadas em uma câmara de crescimento, em uma mesa rotativa para obter o fenótipo da planta o mais homogêneo possível para qualquer condição de tratamento. As plantas foram cultivadas sob lâmpadas de iodeto-sódio de alta pressão, com uma radiação fotossinteticamente ativa de 150 ± 10 µmol de fótons.m-2.s-1, um período térmico de 20/18 °C (dia/noite) e um longo fotoperíodo diurno de 16h de luz. Para controlar a entrada de nutrientes às plantas e facilitar a coleta das raízes, sementes de alfaces foram cultivadas em vasos de areia. As plantas foram regadas três vezes por semana com uma solução nutritiva comercial (disponível em Puteaux, Les Clayes-sous-Bois, França) com concentrações de nitrogênio, fosfato e potássio na proporção de N/P/K 20:20:20 (1 g/l)
[071] As alfaces foram tratadas duas vezes (uma DOCS - 7666882v1 vez/semana nos dias 21 e 28) com os diferentes extratos de algas marinhas e frações foram adicionadas à solução nutritiva e as bases dos vasos foram imersas em solução nutritiva até a absorção total.
[072] As plantas foram colhidas 16 dias após o primeiro tratamento, e os brotos e raízes foram colhidos separadamente. Três repetições biológicas independentes foram realizadas com os diferentes extratos e frações de algas marinhas. Doze alfaces (n=12) foram usadas pelos tratamentos para os experimentos de fracionamento com SEC, enquanto dezoito alfaces (n=18) foram utilizadas pelos tratamentos para os experimentos de ultrafiltração.
[073] Sementes de Arabidopsis thaliana ecotype Columbia (Col-0 obtidas do centro de armazenamento de sementes ABRC) foram cultivadas em culturas in vitro. As sementes foram primeiro esterilizadas na superfície e foram semeadas em placas quadradas de Petri que contém meio basal Murashige e Skoog (MS) suplementado com 1% (p/v) de sacarose (30 mM) e 0,6% (p/v) de PhytagelTM. As placas de Petri foram cultivadas sob uma luz fluorescente fria com uma intensidade de 225 ± 10 µmol fótons.m-2.s-1, com um fotoperíodo de um dia longo de 16 horas de luz a 21 °C ± 0,5 °C. A localização das placas de Petri sob as lâmpadas de néon era alterada todos os dias e isso acontecia o tempo todo para randomizar o experimento.
[074] Plântulas com crescimento uniforme foram selecionadas e transferidas 6 dias após a germinação no meio de tratamento. Para cada condição, foram preparadas 6 placas de Petri que contêm 6 plântulas cada
[075] As plantas foram coletadas 9 dias após a transferência no meio de tratamento. Quatro bioensaios DOCS - 7666882v1 independentes foram realizados e seis repetições (n=6) foram utilizadas pelos tratamentos para os experimentos de fracionamento de SEC.
[076] As experiências de crescimento do trigo foram realizadas com sementes de trigo de inverno (Triticum aestivum l.) da variedade Altigo (disponível em Limagrain, Saint-Beauzire, França). Trigos foram cultivados em uma câmara de crescimento em uma mesa rotativa para obter para cada condição o fenótipo da planta o mais homogêneo possível. Para controlar a entrada de nutrientes às plantas, sementes de trigo foram cultivadas em vasos de vermiculita. As plantas foram cultivadas na câmara de crescimento sob lâmpadas de iodeto de sódio de alta pressão com uma radiação fotossinteticamente ativa de 150 +/- 10 µmol de fótons.m-2.s-1 e um período térmico de 22/18 °C com um longo dia de fotoperíodo de 16 horas. Dez dias após a semeadura, plantas homogêneas foram distribuídas em diferentes bandejas; 6 plantas por bandeja e duas bandejas por condição. As plantas foram regadas três vezes por semana com a mesma solução nutritiva comercial usada para experimentos com alface.
[077] Duas semanas após a semeadura, os trigos foram tratados cinco vezes (a cada 2 ou 3 dias) com as diferentes frações e extratos e foram colhidos 13 dias após o primeiro tratamento. A eficácia das diferentes frações foi avaliada através da comparação de pesos de brotos frescos. Três repetições biológicas independentes foram realizadas com os diferentes extratos e frações de algas marinhas. Doze trigos (n=12) foram utilizados pelos tratamentos para os experimentos de ultrafiltração.
[078] Na presente invenção, a eficácia das diferentes DOCS - 7666882v1 frações e extratos na estimulação do crescimento das plantas foi avaliada por uma abordagem estatística. De fato, para cada bioensaio mostrado, a normalidade dos dados foi verificada primeiro com os testes de normalidade Shapiro- Wilk, com as plotagens Q-Q e com os histogramas de densidade. A Homocedasticidade desses dados também foi verificada com o teste de Barlett, antes da realização de testes paramétricos nesses dados. Vários bioensaios (três a quatro repetições independentes no tempo) foram realizados para avaliar os diferentes tratamentos na estimulação do crescimento vegetal com um número N de plantas por Tratamento. Uma análise paramétrica de variância bidirecional (Anova bidirecional) foi então realizada nos dados para determinar se havia uma diferença significativa (com um erro alfa de 5%) entre as médias dos diferentes tratamentos para cada bioensaio e entre os meios de cada tratamento para os diferentes bioensaios realizados. De acordo com os resultados da Anova, um teste post-hoc paramétrico de HSD Tukey ou uma comparação múltipla por pares foi realizado nos dados para variar e definir quais médias eram significativamente diferentes umas das outras. Os resultados do teste de Tukey são mostrados nos diagramas de caixas com letras em negrito. Os meios de tratamentos que são significativamente diferentes entre si exibem letras em negrito diferentes. Esses meios são representados em cada diagrama de caixa por um ponto.
[079] Os compostos descritos no presente documento podem ser usados em várias culturas, incluindo, por exemplo, soja, milho, cereais (isto é, trigo, cevada, centeio e aveia), colza, canola, girassol, beterraba, batatas, leguminosas secas (isto é, lentilhas, feijão seco etc.), cana-de-açúcar, DOCS - 7666882v1 vegetais frutíferos, incluindo tomate, berinjela, pimentão, cucurbitácea etc., vegetais de bulbo, incluindo cebolas e alhos-porós, legumes principais e folhosos, incluindo alface, espinafre e aipo, brássica, frutas com caroço, frutas pomo, cítricas, café, cacau, nogueiras, bagas, uvas (de mesas e videiras), entre outros.
[080] Finalmente, também deve ser entendido que as reivindicações a seguir destinam-se a cobrir todas as características genéricas e específicas da invenção descritas no presente documento e todas as declarações do escopo da invenção que, por uma questão de linguagem, podem estar entre as mesmas.
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Claims (17)
1. Uma ou mais moléculas bioativas isoladas de uma espécie algácea, sendo que a uma ou mais moléculas bioativas são caracterizadas pelo fato de que têm um peso molecular na faixa de cerca de 0,15 kDa a cerca de 1,0 kDa.
2. Uma ou mais moléculas bioativas, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizadas pelo fato de que a uma ou mais moléculas bioativas têm capacidade para melhorar o crescimento vegetal.
3. Uma ou mais moléculas bioativas, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizadas pelo fato de que a espécie algácea é uma espécie algácea marrom.
4. Uma ou mais moléculas bioativas, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizadas pelo fato de que a algácea marrom compreende uma espécie algácea selecionada a partir do grupo que compreende Ascophyllum nodosum, Fucus vesiculosus, Sargassum sp., e combinações de uma ou mais dentre o supracitado.
5. Uma ou mais moléculas bioativas, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizadas pelo fato de que a uma ou mais moléculas bioativas não compreendem um polissacarídeo sulfatado ou laminarina.
6. Método de melhoramento de crescimento vegetal, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de aplicar uma composição que compreende a uma ou mais moléculas bioativas isoladas, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, a pelo menos um dentre solo, uma planta ou uma semente.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que melhorar o crescimento vegetal inclui pelo DOCS - 7666904v1 menos um dentre o seguinte: promover germinação de semente, estimular desenvolvimento de raiz, prolongar um período vegetativo, aumentar um período de produção ou aumentar um período de colheita.
8. Método de isolamento e purificação de compostos bioativos em um extrato obtido a partir de algas marinhas, sendo que método é caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) circular o extrato através de uma membrana ultrafiltrante que tem um peso molecular de corte adequado; b) coletar filtrado a partir do extrato para obter uma primeira fração de filtrado e um retentado; e c) enxaguar o retentado para obter uma ou mais frações de filtrado adicionais.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de avaliar a bioatividade da primeira fração de filtrado e das frações de filtrado adicionais para determinar sua eficácia no crescimento vegetal.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a eficácia no crescimento vegetal inclui pelo menos um dentre o seguinte: promover germinação de semente, estimular desenvolvimento de raiz, prolongar um período vegetativo, aumentar um período de produção ou aumentar um período de colheita.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que o extrato é produzido a partir de uma espécie algácea marrom.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a DOCS - 7666904v1
11, caracterizado pelo fato de que o extrato é obtido a partir de Ascophyllum nodosum, Fucus vesiculosus, ou Sargassum sp. algae.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizado pelo fato de que o retentado compreende moléculas ativas selecionadas a partir do grupo que consiste em polissacarídeos sulfatados e laminarina, e em que as moléculas ativas têm capacidade para aliviar tensão abiótica nas culturas.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 13, caracterizado pelo fato de que o primeiro filtrado compreende moléculas bioativas que têm um peso molecular na faixa de cerca de 0,15 kDa a cerca de 1,0 kDa.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 14, caracterizado pelo fato de que a membrana ultrafiltrante tem um peso molecular de corte menor que 3 kDa.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 15, caracterizado pelo fato de que a membrana ultrafiltrante tem um peso molecular de corte menor que 2 kDa.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 16, caracterizado pelo fato de que a membrana ultrafiltrante tem um peso molecular de corte menor que 1 kDa.
DOCS - 7666904v1
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