FR3074998A1 - Procede pour identifier et isoler des composes bioactifs a partir d'extraits d'algues - Google Patents
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Abstract
Procédé pour isoler et purifier des composés bioactifs dans un extrait obtenu à partir d'algues. Le procédé implique les étapes suivantes : (a) la circulation de l'extrait à travers une membrane d'ultrafiltration présentant un seuil de coupure de masse moléculaire approprié ; (b) le recueil du filtrat à partir de l'extrait d'algues pour obtenir une première fraction de filtrat et un rétentat ; et (c) le rinçage du rétentat pour obtenir une ou plusieurs fractions supplémentaires de filtrat. La bioactivité de la première fraction du filtrat et des fractions supplémentaires du filtrat peut ensuite être évaluée pour déterminer leur efficacité sur la croissance végétale. Il est également décrit une ou plusieurs molécules bioactives isolées à partir d'une espèce d'algues où la ou les plusieurs molécules bioactives ont une masse moléculaire située dans la plage d'environ 0,15 kDa à environ 1,0 kDa et sont capables d'amplifier ou d'améliorer la croissance des plantes.
Description
PROCÉDÉ POUR IDENTIFIER ET ISOLER DES COMPOSÉS BIOACTIFS A
PARTIR D'EXTRAITS D'ALGUES
Domaine de l'invention
La présente invention concerne de façon générale un procédé pour purifier et isoler des composés bioactifs responsables de la stimulation de la croissance végétale à partir d'extraits d'algues.
Contexte de l'invention
L'un des défis de l'agriculture moderne est de répondre à la demande sociétale de durabilité, de qualité et de faible impact dans la production agricole et de s'adapter à l'augmentation de la population mondiale par l'amélioration des rendements et de la tolérance des cultures à un environnement changeant.
Des bio stimulants peuvent être utilisés pour améliorer la nutrition des plantes, ce qui a un impact sur les paramètres de rendement et de qualité. Les bio stimulants de végétaux se classent de façon générale dans l'une de ces catégories, c'est-à-dire, les produits contenant des hormones, les produits à base d'extraits végétaux, les produits à base de micronutriments, les produits contenant des acides aminés et les produits contenant de l'acide humique mais ils peuvent ne pas être strictement restreints à ces catégories seules. Des biostimulants de végétaux sont utilisés pour traiter des cultures dans un contexte commercial au vu de leur capacité à augmenter les taux de croissance, à augmenter la tolérance aux stress, à augmenter le taux de photosynthèse et à augmenter la tolérance aux maladies. On pense de façon générale que les biostimulants de végétaux fonctionnent par induction ou répression des gènes de gènes de voies biologiques clés.
Tels que définis par l'European Biostimulant Industry Council (EBIC), les biostimulants de végétaux contiennent une ou plusieurs substance(s) et/ou des microorganismes dont la fonction lorsqu'ils sont appliqués sur des plantes ou la rhizosphère est de stimuler des processus naturels pour amplifier/favoriser l'absorption de nutriments, l'efficacité de nutriments, la tolérance à un stress abiotique, et la qualité des cultures. Les biostimulants n'ont aucune action directe contre les nuisibles et, par conséquent, n'entrent pas dans le cadre réglementaire des produits phytopharmaceutiques.
Des biostimulants sont disponibles dans diverses formulations et avec des composants variables mais ils sont généralement classés sur la base de leur source et de leur contenu. Ces groupes comprennent les substances humiques (HS), et les produits contenant des acides aminés (AACP).
Des biostimulants sont disponibles dans diverses formulations et avec des composants variables mais ils sont généralement classés en sept groupes principaux sur la base de leur source et de leur contenu. Ces groupes comprennent les substances humiques (acides humique et fluvique), les hydrolysats de protéines et d'autres composés contenant de l'azote, des extraits d'algues et des produits botaniques, le chitosan et autres biopolymères, des composés inorganiques, des champignons bénéfiques et des bactéries bénéfiques.
En dépit de la disponibilité dans le commerce de nombreux engrais et biostimulants de végétaux, il continue à y avoir une demande de produits améliorés capables de servir divers besoins. Par conséquent, de nouveaux produits et procédés pour améliorer les réponses de la plante et le développement de la croissance végétale sont nécessaires.
Les algues et des produits dérivés des algues ont été largement utilisés dans la production de cultures en raison de la présence d'un certain nombre de composés stimulant la croissance végétale au sein de ces produits. Ainsi, le potentiel de biostimulation d'un grand nombre de ces produits n'a pas été pleinement exploité à cause du manque de données scientifiques sur les facteurs de croissance présents dans les algues et leurs divers modes d'action touchant la croissance végétale.
Alors que les effets physiologiques des extraits d'algues sur les défenses des plantes et la croissance végétale ont été étudiés, on sait peu de choses quant aux composés bioactifs particuliers dans les extraits d'algues qui sont responsables de ces effets stimulants sur les végétaux. Il serait souhaitable d'accélérer l'identification de ces composants bioactifs dans les algues, y compris, par exemple, les extraits d'algues brunes.
Les Phéophycées ou algues brunes représentent un grand groupe d'algues multicellulaires pour la plupart marines, y compris de nombreux types d'algues localisées dans les eaux des deux hémisphères. Elles jouent un rôle important dans les environnements marins, à la fois en tant que ressources trophiques et en tant qu'habitats. De nombreuses algues brunes, telles que des membres de l'ordre des Fucales, se développent communément le long des rivages marins rocheux. Dans le monde entier, on connaît plus de 1500 espèces d'algues brunes. Certaines espèces, comme Ascophyllum nodosum, sont importantes pour un usage commercial et ont également un impact environnemental.
Le brevet US No. 7611 716 de Michailovna et al. décrit un procédé de traitement des algues pour obtenir, dans un unique procédé, des extraits comprenant des polysaccharides acides et neutres et un extrait comprenant des composés biologiquement actifs de masse moléculaire basse qui peuvent être utilisés en médecine, dans l'alimentation, en parfumerie et dans l'industrie cosmétique. Toutefois, la référence décrit uniquement un procédé de traitement d'algues et ne fournit aucun moyen pour identifier des composés biostimulants de végétaux potentiels contenus à l’intérieur.
Le brevet US No. 3 856 569 de Strong, décrit un procédé pour purifier et concentrer un polysaccharide souhaitable tel que le carraghénane ou l'alginate à partir de solutions aqueuses dérivées d'algues marines (Rhodophycées et Phéophycées) en soumettant les solutions à une ultrafiltration. Toutefois, à nouveau, cette référence fournit uniquement un procédé de traitement des algues et ne fournit aucun moyen pour identifier des composés biostimulants contenus dedans.
A cause de la demande croissante en produits biologiques, respectueux de l'environnement et sans danger pour la santé humaine, le besoin de biostimulants naturels a augmenté. En outre, il existe un besoin de biostimulants similaires ou plus efficaces que les biostimulants traditionnels qui ont été utilisés. En outre, il demeure un besoin, dans l'art, d'un procédé amélioré pour isoler et purifier des composés biostimulants, y compris à partir d'extraits dérivés d'algues.
Résumé de l'invention
Un objet de la présente invention est d'identifier et de purifier des substances qui peuvent être utilisées en tant que biostimulants de végétaux.
Un autre objet de la présente invention est d'identifier et de purifier des composés bioactifs dans divers extraits d'algues qui sont responsables de la stimulation de la croissance végétale.
Dans cet objectif, selon un mode de réalisation, la présente invention concerne de façon générale une ou plusieurs molécules bioactives isolées d'une espèce d'algues, la ou les plusieurs molécules bioactives ayant une masse moléculaire située dans la plage d'environ 0,15 kDa à environ 1,0 kDa.
Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne de façon générale un procédé pour isoler et purifier des composés bioactifs dans un extrait obtenu à partir d'algues, le procédé comprenant les étapes suivantes :
a) la circulation de l'extrait à travers une membrane d'ultrafiltration présentant un seuil de coupure de masse moléculaire approprié ;
b) le recueil du filtrat à partir de l'extrait d'algues pour obtenir une première fraction de filtrat et un rétentat ; et
c) le rinçage du rétentat pour obtenir une ou plusieurs fractions supplémentaires de filtrat.
Brève description des figures
Pour mieux comprendre l'invention, il est fait référence à la description suivante accompagnée de figures, parmi lesquelles :
Les figures la et lb illustrent le fractionnement par chromatographie d'exclusion stérique (SEC) effectué sur l'extrait RM-3496 filtré et un chromatogramme d'étalons injectés sur la SEC pour évaluer les masses moléculaires moyennes des molécules présenter dans les différentes fractions.
La figure 2 illustre des diagrammes en boîtes à moustaches (boxplot) montrant l'efficacité du fractionnement par SEC du RM-3496 sur des laitues.
Les figures 3a et 3b illustrent des diagrammes en boîtes à moustaches montrant les poids de rosettes fraîches et les poids de racines fraîches de cultures in vitro à'Arabidopsis thaliana traitées avec la fraction F3 comparativement au témoin non traité, à l'extrait RM3496 et à l'extrait RM-3496 reconstitué.
La figure 4 illustre une vue du procédé d'ultrafiltration conformément à un aspect de la présente invention.
La figure 5 illustre des diagrammes en boîtes montrant les poids de pousses fraîches de laitues traitées avec diverses fractions, divers rétentats et extraits ultrafiltrés.
La figure 6 illustre des diagrammes en boîtes montrant les poids de pousses fraîches de blés traités avec diverses fractions, divers rétentats et extraits ultrafiltrés.
Description détaillée des modes de réalisation préférés
Par « biostimulants » de végétaux, on entend un matériau organique qui contient une ou plusieurs substances et/ou micro-organismes dont la fonction lorsqu'ils sont appliqués sur des plantes ou la rhizosphère est de stimuler des processus naturels pour amplifier/favoriser l'absorption des nutriments, l'efficacité des nutriments, la tolérance à un stress abiotique, et la qualité des cultures.
Lors de l'introduction d'éléments de la présente invention ou de son/ses mode(s) de réalisation préféré(s), les articles « un », « une », « le », « la » et « ledit/ladite » sont censés signifier qu'il y a un ou plusieurs des éléments. Les termes « comprenant », « incluant » et « ayant » sont censés être inclusifs et signifient qu'il peut y avoir des éléments supplémentaires autres que les éléments énumérés.
Tel qu'utilisé ici, le terme « environ » se rapporte à une valeur mesurable telle qu'un paramètre, une quantité, une durée temporelle, et analogues et est censé inclure des variations de +/-15% ou inférieures, de préférence des variations de +/-10% ou inférieures, de façon davantage préférée des variations de +/- 5 % ou inférieures, de façon même davantage préférée des variations de +/- 1 % ou inférieures, et de façon encore davantage préférée des variations de +/-0,1 % ou inférieures de et à partir de la valeur citée en particulier, tant que de telles variations sont appropriées pour s'exercer dans l'invention décrite ici. En outre, il faut également comprendre que la valeur à laquelle la préposition « environ » se rapporte est elle-même spécifiquement divulguée ici.
La présente invention décrit un procédé pour purifier et isoler des composés biostimulants à partir d'extraits dérivés d'algues qui sont capables d'augmenter les taux de croissance et les rendements d'un large éventail de cultures.
Telle que décrite ici, selon un mode de réalisation, la présente invention fournit un procédé pour purifier des composés bioactifs responsables de la stimulation de la croissance végétale dans des extraits d'algues par le profilage métabolomique des extraits d'algues.
Ainsi, selon un mode de réalisation, la présente invention concerne de façon générale une ou plusieurs molécules bioactives isolées d'une espèce d'algues, la ou les plusieurs molécules bioactives ayant une masse moléculaire située dans la plage d'environ 0,15 kDa à environ 1,0 kDa. La ou les plusieurs molécules bioactives sont celles capables d'améliorer la croissance végétale. Dans un mode de réalisation, l'espèce d'algues est une espèce d'algues brunes. Les algues brunes peuvent comprendre une espèce d'algues choisie dans le groupe comprenant Ascophyllum nodosum, Fucus vesiculosus, Sargassum sp., et des combinaisons d'une ou de plusieurs des précédentes. Selon un mode de réalisation, la ou les plusieurs molécules bioactives ne comprennent pas de polysaccharide sulfaté ou de laminarine.
La présente invention concerne également de façon générale un procédé pour améliorer la croissance végétale, le procédé comprenant l'étape d'application d'une composition comprenant la ou les plusieurs molécules bioactives isolées à au moins un choisi parmi le sol, une plante, ou une graine. L'amélioration de la croissance végétale comprend au moins un choisi parmi : l'activation de la germination des graines, la stimulation du développement des racines, la prolongation d'une période végétative, le rallongement d'une période de production, ou le rallongement d'une période de récolte.
La présente invention concerne également de façon générale un procédé pour isoler et purifier des composés bioactifs dans un extrait obtenu à partir d'algues, le procédé comprenant les étapes suivantes :
a) la circulation de l'extrait à travers une membrane d'ultrafiltration présentant un seuil de coupure de masse moléculaire approprié ;
b) le recueil du filtrat à partir de l'extrait d'algues pour obtenir une première fraction de filtrat et un rétentat ; et
c) le rinçage du rétentat pour obtenir une ou plusieurs fractions supplémentaires de filtrat.
Le procédé comprend en outre l'étape d'évaluation de la bioactivité de la première fraction du filtrat et des fractions supplémentaires du filtrat pour déterminer leur efficacité sur la croissance végétale. L'efficacité sur la croissance végétale peut comprendre au moins un choisi parmi : l'activation de la germination des graines, la stimulation du développement des racines, la prolongation d'une période végétative, le rallongement d'une période de production, ou le rallongement d'une période de récolte. Selon un mode de réalisation, l'extrait est produit à partir d'une espèce d'algues brunes. L'extrait peut être obtenu à partir des algues Ascophyllum nodosum, Fucus vesiculosus, ou Sargassum sp.
Selon un mode de réalisation préféré, le rétentat comprend des molécules actives choisies dans le groupe consistant en des polysaccharides sulfatés et de la laminarine, qui sont des molécules actives capables de stimuler la tolérance à un stress abiotique, tel qu'un excès de sel, dans les cultures. Le premier filtrat comprend des molécules bioactives ayant une masse moléculaire située dans la plage d'environ 0,15 kDa à environ 1,0 kDa.
La membrane d'ultrafiltration peut présenter un seuil de coupure de masse moléculaire (MWCO) inférieur à 3 kDa, de préférence un MWCO inférieur à 2 kDa, et plus préférentiellement un MWCO inférieur à 1 kDa.
Ascophyllum nodosum (varech) est une espèce fucoïde d'algues brunes trouvées dans l'océan Atlantique Nord et elle a été utilisée comme source de biostimulants pour des cultures agricoles afin d'améliorer la croissance végétale, la productivité végétale et la qualité alimentaire.
Plusieurs techniques de purification ont été testées pour dessaler et purifier ces extraits d'algues selon la polarité et la taille des molécules. Pour chaque procédure de purification, les fractions ont été testées sur des laitues pour s'assurer que la bioactivité était conservée dans les différentes fractions dessalées ou si elle demeurait associée aux sels. Cette étape de purification a été appliquée sur un extrait d'algues (RM-2705, un extrait fucoïde disponible chez Goëmar) et les fractions non polaires purifiées ont montré un haut niveau de pureté. La majorité des biomolécules (environ 69 %) ont été co-éluées avec les sels afin de démontrer que les molécules bioactives étaient localisées dans l'une des fractions non polaires purifiées. Ensuite, les différentes fractions ont été testées sur des laitues comparativement à l'extrait total. Toutefois, les résultats ont montré que les molécules bioactives responsables de la stimulation de la croissance végétale étaient présentes dans la fraction polaire qui contenait également des sels. Il a été déterminé que le fractionnement selon la polarité des molécules contenues dans les extraits RM-2705 et RM-3496 n'était pas approprié pour le dessalage et la purification des extraits d'algues. En effet, pour toutes les techniques de fractionnement utilisées, les molécules bioactives sont restées associées aux sels.
Ainsi, le défi soulevé a été de trouver un autre procédé de dessalage des extraits d'algues, tout en maintenant l'activité biostimulante sur la croissance végétale. Diverses techniques de purification ont été étudiées, y compris l'extraction liquide-liquide (LLE) avec de l'acétate d'éthyle, l'extraction sur phase solide (SPE) avec différents matériaux absorbants (une phase normale : cyanopropyl-silice et une phase inverse : Amberlite® XAD2), l'extraction solide-liquide (SLE) avec du butanol et la chromatographie d'exclusion stérique (SEC).
En outre, afin d'obtenir des informations quant à la stabilité des molécules bioactives, la stabilité à la chaleur de l'activité de l'extrait RM-27055 a été analysée sur des laitues. Les résultats ont montré une stabilité à la chaleur des molécules bioactives, et l'autoclavage ou l'ébullition des extraits traités a amplifié les poids des pousses fraîches de laitues.
Le fractionnement selon la polarité est apparu inefficace dans la purification des molécules bioactives, si bien que l'extrait d'algues a été fractionné selon la taille des particules de ses molécules pour tenter son dessalage.
Il a été déterminé que toutes ces techniques sont apparues inefficaces pour l'objectif à l'exception de la chromatographie d'exclusion stérique (SEC) avec une matrice Superdex®30, également appelée ici chromatographie par filtration sur gel (GF). Il a été trouvé que la SEC est le seul procédé efficace pour dessaler etpurifier le filtrat d'algues.
Sur cette base, l'extrait d'algues (RM-3496) a été fractionné par le procédé de fractionnement par SEC et les molécules ont été éluées selon leur taille (ou masses moléculaires) comme il est représenté sur la figure l.a. Une matrice Superdex30® (GE Healthcare, Bjorkgatan, Suède) a été utilisée pour assurer une bonne séparation des molécules avec une masse moléculaire inférieure à 10 kDa. Plus les molécules étaient petites (c'est-à-dire, masses moléculaires inférieures), plus elles étaient emprisonnées dans les billes poreuses du gel et éluées ultérieurement. Ainsi, les masses moléculaires des molécules diminuent de la première fraction (c'est-à-dire, Fl) à la dernière fraction (c'està-dire, F6). Les fractions Fl et F2 étaient constituées des molécules plus grosses qui circulent à travers la colonne plus rapidement que les sels et les molécules de masse moléculaire très basse ont été éluées dans les fractions F5 et F6.
Afin d'évaluer les plages de masses moléculaires des molécules contenues dans les différentes fractions, un mélange d'étalons (0,5 % p/v) a été injecté sur le système de SEC. Le chromatogramme des étalons est illustré sur la figure 1 .b. a) Laminarine (environ 3 à environ 5 kDa), b) Raffinose (594 Da), c) Saccharose (343,3 Da), d) Sel citrate (343,3 Da), e) Mannitol (182,2 Da) et f) Glycine (75,1 Da). Selon ces résultats, la fraction Fl contenait des molécules avec des masses moléculaires élevées (supérieures à 4 kDa), la fraction F2 contenait la laminarine (d'environ 3 à environ 4 kDa) qui a été éluée entre les fractions Fl et F2.
Un ultrafiltrat, obtenu après l'ultrafiltration de l'extrait RM-2705 sur un système d'ultrafiltration avec un seuil de coupure de membrane de 1 kDa, a été injecté sur le système de SEC. Le profil chromatographique de l'ultrafiltrat a montré seulement les pics chromatographiques correspondant à ceux des fractions F3, F4, F5 et F6 provenant du fractionnement par SEC de l'extrait RM-2705. Ainsi, la fraction F3 contenait des molécules avec des masses moléculaires inférieures à 1 kDa jusqu'à environ 0,18 kDa, la fraction F4 contenait des molécules avec des masses moléculaires inférieures à environ 0,2 kDa comme le mannitol (182,2 Da) et les fractions F5 et F6 contenaient des sels et des molécules de masses moléculaires très basses comme la glycine (75 Da). Les spectres de RMN des différentes fractions ont confirmé la présence de polysaccharides sulfatés (polymères de fucane) dans la première fraction Fl alors que la seconde fraction F2 contient la laminarine (d'environ 3 à environ 4 kDa) et la fraction F4 contient le mannitol (182,2 Da). Les deux dernières fractions F5 et F6 contenaient des molécules de masses moléculaires très basses et des sels.
Les différentes fractions obtenues par fractionnement par SEC ont été testées pour leur activité de stimulation de la croissance végétale sur des laitues comparativement à l'extrait total d'algues RM-3496. Avant l'injection sur la chromatographie, l'extrait d'algues a été filtré et cet extrait filtré a été également testé sur des laitues pour vérifier son efficacité. Les résultats ont montré que les molécules bioactives ont été trouvées dans la fraction F3 comme il est illustré sur la figure 2. Une activité significative a été trouvée dans la fraction F3 qui contenait des molécules situées dans la plage d'environ 0,15 kDa à environ 1 kDa.
La combinaison des différentes techniques utilisées pour dessaler l'extrait RM2705 a fourni des informations quant aux propriétés physico-chimiques de la ou des molécules bioactives. En particulier, il a été déterminé que les molécules bioactives sont polaires et leurs masses moléculaires se situent dans la plage d'environ 0,15 à environ 1 kDa. Ainsi, d’après ces informations, les polymères de fucanes qui sont les polysaccharides sulfatés majeurs dans l'extrait acide à'Ascophyllum nodosum, la laminarine (d'environ 3 à environ 4 kDa), un éliciteur bêta-l,3-glucane, et le mannitol (182 Da), un polyol qui peut représenter jusqu'à environ 8 à 10 % de l'extrait en poids sec, sont exclus des polymères bioactifs favorisant la croissance.
Afin de confirmer la bioactivité de la fraction F3 purifiée, une culture in vitro utilisant la plante modèle Arabidopsis thaliana a été développée et reproduite plusieurs fois. Ces tests illustrés sur la figure 3.a. ont confirmé la bioactivité de la fraction F3 tandis que la présence de sels dans l'extrait RM-3496 a perturbé la croissance à'Arabidopsis thaliana dans ces conditions de culture. Toutefois, le RM-3496 reconstitué correspondant à la reconstitution de l'extrait d'algues avec les fractions de SEC, a montré une activité favorisant la croissance. En outre, dans cette analyse de bioactivité in vitro, la fraction F3 et le RM-3496 reconstitué ont également semblé amplifier la croissance des racines comme représenté sur la figure 3.b.
La fraction F3 a démontré une forte activité de stimulation de la croissance tandis que les fractions Fl et F2 ont été inactives. Toutefois, durant le développement du dernier essai biologique, il a été montré qu'en présence de sel (100 mM de NaCl), la fraction F3 n'a plus été active pour stimuler la croissance, tandis que Fl et F2 ont affiché des effets similaires, et que l'extrait total RM-2705 a conféré une tolérance aux sels. Ces résultats indiquent que l'extrait RM-2705 contient différents composés actifs avec différents modes d'action, y compris (1) la fraction de masse moléculaire basse (LMW) responsable de la stimulation de la croissance, et (2) des fractions contenant de la laminarine et des fucanes qui confèrent une tolérance aux stress (sel, ainsi que résistance à un stress biotique).
Pris ensemble, ces résultats indiquent que le fractionnement de l'extrait RM-2705 peut fournir au moins deux types de produits avec des modes d'action distincts et ainsi différentes applications en utilisant les mêmes matériaux bruts.
Puisque la SEC n'est pas transférable à une échelle industrielle, il a été souhaitable de développer également un autre procédé capable de produire des produits fractionnés d'extraits d'algues qui peuvent fournir une activité stimulante de la croissance végétale sur une plus grande échelle.
Une variante à la SEC est l'ultrafiltration (UF), un procédé de fractionnement dans lequel l'extrait d'algues est filtré à travers des membranes d'ultrafiltration avec des seuils de coupure de masse moléculaire (MWCO) appropriés, qui selon un mode de réalisation peuvent être un MWCO de 1 kDa pour produire une fraction ayant des molécules bioactives situées dans la plage souhaitée d'environ 0,15 kDa à 1,0 kDa. Ainsi, dans un mode de réalisation, un extrait d'algues peut être ultrafiltré en utilisant une membrane de MWCO de 1 kDa.
Selon un mode de réalisation et dans le sens le plus large, la présente invention fournit un procédé de purification d'une composition biostimulante dérivée d'un extrait d'algues comprenant une étape d'ultrafiltration utilisant une membrane d'ultrafiltration semi-perméable pour séparer les molécules d'intérêt du reste du mélange selon leur masse moléculaire, leur taille et leur forme.
L'étape d'ultrafiltration peut être réalisée en utilisant un équipement d'ultrafiltration dans lequel une solution d'extrait d'algues comprenant entre environ 1 % en poids et environ 15 % en poids de matière sèche, de préférence entre environ 2 % en poids et environ 7 % en poids de matière sèche, est soumise à une ultrafiltration en utilisant une membrane avec un seuil de coupure de masse moléculaire (MWCO) approprié. Selon un mode de réalisation, le procédé d'ultrafiltration implique une ultrafiltration tangentielle.
Le filtrat est recueilli pour ses propriétés biostimulantes tout en mettant en recirculation le rétentat (ou le concentré), qui est laissé de côté pour d'autres applications à la fin du procédé. Bien que cela ne soit généralement pas nécessaire ou requis, si c'est souhaité, une purification supplémentaire du rétentat (ou du concentré) peut être obtenue par l'addition d'eau fraîche à une vitesse correspondant à celle à laquelle l'eau, conjointement avec les molécules ayant une masse moléculaire inférieure ou égale à 1 kDa est éliminée de l'ultrafiltrat.
Comme il est observé sur la figure 4, l'ultrafiltration peut être réalisée par un procédé dans lequel le réservoir de la solution (1) est chargé avec un lot d'extrait d'algues. La solution est mise en circulation par le tuyau (2) et la pompe (3) dans un collecteur d'admission (4) d'une unité d'ultrafiltration (5). L'unité d'ultrafiltration (5) comprend une ou plusieurs cartouches disposées en parallèle pour fournir la surface de membrane d'ultrafiltration appropriée. L'ultrafiltrat sort ensuite de l'unité d'ultrafiltration (5) par le tuyau de sortie (6) et est récupéré dans la cuve (7). Le concentré d'ultrafiltration sort de l'unité d'ultrafiltration (5) par le collecteur de sortie (8) et retourne par le tuyau (9) vers le réservoir de la solution (1).
La membrane contenue dans l'unité d'ultrafiltration (5) peut être une membrane de type polymère ou céramique. Selon un mode de réalisation, la membrane comprend une membrane céramique tubulaire comprenant une pluralité de canaux. Par exemple, la membrane peut contenir entre environ 15 et environ 50 canaux, de préférence entre environ 19 et environ 39 canaux et peut avoir une longueur située entre environ 50 et environ 150 cm. Selon d'autres modes de réalisation, des membranes en spirale et des membranes de filtration tangentielle peuvent être également utilisées dans la pratique de l'invention. La surface de la membrane se situe généralement entre environ 0,20 et environ 0,6 m , de préférence entre environ 0,30 et 0,40 m .
Le rétentat est rincé plusieurs fois pour éliminer la majeure partie des molécules avec une masse moléculaire inférieure au seuil de coupure de la membrane. Les ultrafiltrats contiennent des molécules avec une masse moléculaire inférieure au seuil de coupure de la membrane. Dans un cas, le seuil de coupure est de 3 kDa, de préférence de 2 kDa, et plus préférentiellement de 1 kDa. Les molécules qui sont contenues dans les ultrafiltrats affichent des masses moléculaires basses inférieures au MWCO, par exemple, 1 kDa, et sont couramment appelées métabolites. Les rétentats contiennent des molécules avec des masses moléculaires supérieures au seuil de coupure des membranes, par exemple, 1 kDa. Les molécules qui sont contenues dans le rétentat affichent des masses moléculaires élevées (par exemple, la laminarine d'environ 3 à environ 4 kDa ou les fucoïdanes supérieurs à environ 30 kDa et d'autres biopolymères de masse moléculaire élevée des algues brunes).
Π a été trouvé que toutes les espèces d'algues de l'ordre des Fucales affichent une activité prometteuse et peuvent être soumises aux procédés, décrits ici. Ces espèces d'algues comprennent, mais n'y sont pas limitées, des espèces des familles des Fucacées, des Sargassacées et des Durvilleacées. D'autres espèces des ordres des Fucales et des
Laminariales comprennent, mais n'y sont pas limitées, les Ascoseirales, les Asterocladales, les Desmarestiales, les Dictyotales, les Dictyotophycidae, les Discosporangiales, les Discosporangiophycidae, les Ectocarpales, les Fucales, les Fucophycidae, les Ishigeales, les Ishigeophycidae, les Laminariales, les Nemodermatales, les Onslowiales, des Phéophycées ordo incertae sedis, les Phaeosiphoniellales, les Ralfsiales, les Scytothamnales, les Sphacelariales, les Sporochnales, les Stschapoviales, les Syringodermatales, les Tilopteridales, parmi d'autres.
En outre, alors que la présente invention est décrite et montrée comme démontrant des résultats positifs sur des espèces d'algues de l'ordre des Fucales, le procédé n'est pas limité à ces espèces d'algues et peut être également utilisé pour isoler et analyser des filtrats de toute algue ou d'autres espèces qui peuvent agir comme des biostimulants pour déterminer la bioactivité de tels filtrats.
Tel qu'utilisé sur les figures ici, le terme « filtrat » se rapporte au filtrat et aux ultrafiltrats obtenus après une ou plusieurs ultrafiltrations à travers l'unité d'ultrafiltration.
Tel qu'utilisé sur les figures ici, le terme « rétentat » se rapporte au rétentat sans rinçage et aux rétentats obtenus après un ou plusieurs rinçages.
EXEMPLES
Exemple 1
Un extrait RM-3496 a été ultrafiltré à l'échelle de laboratoire avec une membrane ayant un MWCO de 1 kDa et le rétentat a été rincé trois fois avec de l'eau. L'ultrafiltrat, contenant des molécules avec des masses moléculaires inférieures à 1 kDa, et le rétentat, contenant des molécules avec des masses moléculaires supérieures à 1 kDa ont été testés sur des laitues et du blé. Ainsi, les différents filtrats et rétentats ont été appliqués sur des laitues et des blés. Les extraits GF 142 et GSI42 (disponibles auprès des Laboratoires Goëmar) ont été fabriqués avec le même procédé à partir de Fucus vesiculosus et de Sargassum natans respectivement. Les résultats sont présentés sur les figures 5 et 6, qui illustrent des diagrammes en boîte à moustaches montrant les poids des pousses fraîches des plantes témoins, des plantes traitées avec quatre extraits d'algues différents (RM-2705, RM-3496, GF 142 et GS142), les plantes traitées avec des molécules avec des masses moléculaires élevées correspondent aux rétentats nommés : RM-3496.rétentat, GF142.rétentat et GSI42.rétentat, et les plantes traitées avec des molécules avec des masses moléculaires basses correspondent aux filtrats nommés : RM-3496.fîltrat, GF142.filtrat et GS142.filtrat. Ces résultats confirment l'efficacité des extraits d'algues et montrent une activité dans les filtrats favorisant la croissance, alors que les rétentats apparaissent inefficaces dans l'activation de la croissance végétale.
Exemple 2
Dix litres d'un extrait aqueux provenant à'Ascophyllum nodosum (pH 2,76) ont été placés dans un réservoir de solution d'une unité d'ultrafiltration à l'échelle pilote équipée d'une membrane d'ultrafiltration en céramique tubulaire, d'une longueur de 58 cm (diamètre : 25 mm, 23 canaux, seuil de coupure de 1 kDa) (fournie par Tami Industries). La solution a été pompée à travers le tuyau d'ultrafiltration avec une recirculation complète du concentré de retour vers le réservoir. Six litres de filtrat ont été prélevés et identifiés comme Fl. Le rétentat (41) a été rincé deux fois avec 5 litres d'eau pour produire 2 filtrats (F2 = 5 1 ; F3 = 5 1). Les différents filtrats (Fl, F2, F3) ont été en outre évalués pour leurs propriétés biostimulantes.
Exemple 3
Cinq litres d'un extrait aqueux provenant de Fucus vesiculosus (pH 2,42) ont été placés dans un réservoir de solution d'une unité d'ultrafiltration à l'échelle pilote équipée d'une membrane d'ultrafiltration en céramique tubulaire, d'une longueur de 58 cm (diamètre : 25 mm, 23 canaux, seuil de coupure de 1 kDa) (fournie par Tami Industries). La solution a été pompée à travers le tuyau d'ultrafiltration avec une recirculation complète du concentré de retour vers le réservoir. Le filtrat a été prélevé et identifié comme Fl. Le rétentat (2,5 1) a été rincé une fois avec 2,5 1 d'eau pour produire 2,5 litres de filtrat (F2 = 2,5 1). Les différents filtrats (Fl, F2) ont été en outre évalués pour leurs propriétés biostimulantes.
Exemple 4
Cinq litres d'un extrait aqueux provenant de Sargassum natans (pH 2,92) ont été placés dans un réservoir de solution d'une unité d'ultrafiltration à l'échelle pilote équipée d'une membrane d'ultrafiltration en céramique tubulaire, d'une longueur de 58 cm (diamètre : 25 mm, 23 canaux, seuil de coupure de 1 kDa) (fournie par Tami Industries). La solution a été pompée à travers le tuyau d'ultrafiltration avec une recirculation complète du concentré de retour vers le réservoir. Le filtrat a été prélevé et identifié comme Fl. Le rétentat (2,5 1) a été rincé une fois avec 2,5 1 d'eau pour produire 1 litre de filtrat (F2= 2,5 1). Les différents filtrats (Fl, F2) ont été en outre évalués pour leurs propriétés biostimulantes.
Exemple 5
RM-3496, fabriqué par les Laboratoires Goëmar à partir d'un extrait <XAscophyllum nodosum et deux autres extraits d'algues (GF 142 et GS142, fabriqués par les Laboratoires Goëmar à partir de Fucus vesiculosus et de Sargasssum natans respectivement) ont été soumis à une ultrafiltration et évalués pour leurs propriétés biostimulantes.
Ces trois extraits fucoïdes ont été ultrafiltrés sur une membrane en céramique (disponible auprès de TAMI Industries) ayant un MWCO approprié (c'est-à-dire, 1 kDa). Dix litres de RM-3496 ont été ultrafiltrés et cinq litres de l'ultrafiltrat ont été prélevés et ont constitué le filtrat 1 utilisé dans des expériences supplémentaires sur la laitue et le blé. Le rétentat (5 1) a été rincé deux fois avec 5 litres d'eau, alors que les rétentats de GF 142 et GS142 (2,5 1) ont été rincés seulement une fois avec 2,5 litres d'eau. Les poids secs des filtrats, des ultrafiltrats et des rétentats ont été mesurés. Selon le procédé de fractionnement de l'extrait RM-3496, les poids secs totaux des filtrats (contenant des molécules avec des masses moléculaires inférieures à 1 kDa) représentaient d'environ 80 % de l'extrait RM-3496 et le rétentat représentait d'environ 20 % de l'extrait RM-3496.
Les détails des expériences de croissance végétale sont décrits ci-dessous.
Les traitements ont été effectués avec différents extraits de Goëmar (RM-2705, RM-3496, GF142 et GS142) et un facteur de dilution de 250 (équivalent à 4 millilitres d'extrait liquide par litre de solution nutritive) a été utilisé pour toutes les expériences. Les différentes fractions résultant du fractionnement par SEC et du fractionnement par ultrafiltration ont été appliquées sur des plantes selon leurs rendements de purification qui ont été calculés à partir des poids secs. Plusieurs répétitions biologiques indépendantes ont été effectuées avec les différentes fractions avec n plantes par traitement.
Les expériences de croissance sur des laitues ont été effectuées avec des graines de laitue Lactuca sativa des écotypes Fabietto ou Janero (disponibles auprès de Voltz, Colmar, France). Les laitues ont été cultivées dans une chambre de croissance, sur une table rotative pour obtenir un phénotype végétal aussi homogène que possible pour toute condition de traitement. Les plantes ont été cultivées sous des lampes d'iodure de sodium à pression élevée avec un rayonnement photosynthétique actif de 150 ± 10 μ mol de photons.m-2.s-l, une thermopériode de 20/18 °C (jour/nuit) et une photopériode rallongée de 16 h de lumière. Afin de contrôler les apports nutritifs aux plantes et afin de faciliter la récolte des racines, les graines des laitues ont été cultivées dans des pots de sable. Les plantes ont été arrosées trois fois par semaine avec une solution nutritive commerciale (disponible auprès de Puteaux, Les Clayes-sous-Bois, France) ayant des concentrations en azote, phosphate, et potassium dans un rapport de N/P/K de 20/20/20 (1 g/1).
Les laitues ont été traitées deux fois (une fois/semaine aux jours 21 et 28) avec les différents extraits d'algues et les fractions ont été ajoutées à la solution nutritive et les bases des pots ont été immergées dans la solution nutritive jusqu'à observation de l'absorption totale.
Les plantes ont été récoltées 16 jours après le premier traitement, et les pousses et les racines ont été rassemblées séparément. Trois répétitions biologiques indépendantes ont été effectuées avec les différents extraits d'algues et les différentes fractions. Douze laitues (n= 12) ont été utilisées par traitement pour les expériences de fractionnement par SEC alors que dix-huit laitues (n = 18) ont été utilisées par traitement pour les expériences d'ultrafiltration.
Des graines à'Arabidopsis thaliana de l'écotype Columbia (Col-0 obtenues auprès du centre de stock de graines ABRC) ont été cultivées in vitro. Les graines ont été d'abord stérilisées à la surface et elles ont été semées sur des boîtes de Pétri carrées contenant du milieu basal de Murashige et Skoog (MS) dilué au demi complémenté avec 1 % (p/v) de saccharose (30 mM) et 0,6 % (p/v) de Phytagel®. Les boîtes de Pétri ont été incubées sous une lumière fluorescente froide avec une intensité de 225 ± 10 pmol de photons.m2.S-1, avec une photopériode rallongée de 16 h de lumière à 21 °C ± 0,5 °C. L'emplacement des boîtes de Pétri sous les lampes néon a été changé tous les jours et ceci tout le long de l’expérience pour randomiser l'expérience.
Les plantules présentant une croissance uniforme ont été choisies et transférées 6 jours après la germination sur le milieu de traitement. Pour chaque condition, 6 boîtes de Pétri contenant 6 plantules chacune ont été préparées.
Les plantes ont été récoltées 9 jours après le transfert sur le milieu de traitement. Quatre analyses indépendantes de bioactivité ont été effectuées et six réplicats (n = 6) ont été utilisés par traitement pour les expériences de fractionnement par SEC.
Les expériences de croissance sur des blés ont été effectuées avec des graines de blé d'hiver (Triticum aestivum L.) variété Altigo (disponible auprès de Limagrain, SaintBeauzire, France). Les blés ont été cultivés dans une chambre de croissance sur une table rotative afin d'obtenir pour chaque condition un phénotype végétal aussi homogène que possible. Afin de contrôler les apports nutritifs aux plantes, les graines de blé ont été cultivées dans des pots de vermiculite. Les plantes ont été cultivées dans la chambre de croissance sous des lampes d'iodure de sodium à haute pression avec un rayonnement photosynthétique actif de 150 +/- 10 μιηοΐ de photons.m'2.s_1 et une thermopériode de 22/18 °C avec une photopériode rallongée de 16 heures. Dix jours après le semis, des plantes homogènes ont été distribuées dans différents plateaux ; 6 plantes par plateau et deux plateaux par condition. Les plantes ont été arrosées trois fois par semaine avec la même solution nutritive commerciale que celle utilisée pour les expériences sur les laitues.
Deux semaines après le semis, les blés ont été traités cinq fois (tous les 2 ou 3 jours) avec les différentes fractions et les différents extraits et ont été récoltés 13 jours après le premier traitement. L’efficacité des différentes fractions a été estimée par comparaison des poids des pousses fraîches. Trois répétitions biologiques indépendantes ont été effectuées avec les différents extraits d’algues et les différentes fractions. Douze blés (n - 12) ont été utilisés par traitement pour les expériences d’ultrafiltration.
Dans la présente invention, l’efficacité des différentes fractions et des differents extraits sur la stimulation de la croissance végétale a été évaluée par une approche statistique. En effet, pour chaque analyse de bioactivité présentée, la normalité des données a été d’abord vérifiée avec les tests de normalité de Shapiro-Wilk, avec les diagrammes Quantiles-Quantiles et avec les histogrammes de densité. L’homoscédasticité de ces données a été également vérifiée avec le test de Barlett, avant d’effectuer les tests paramétriques sur ces données. Plusieurs analyses de bioactivité (trois à quatre répétitions indépendantes dans le temps) ont été réalisées pour estimer les différents traitements sur la stimulation de la croissance végétale avec un nombre N de plantes par traitement. Une analyse de variance à deux facteurs (Anova à deux facteurs) a été ensuite effectuée sur les données pour déterminer s’il y a eu une différence significative (avec une erreur alpha de 5 %) entre les moyennes des différents traitements pour chaque analyse de bioactivité et entre les moyennes de chaque traitement pour les différentes analyses de bioactivité réalisées. Selon les résultats de l’Anova, un test de Tukey HSD post-hoc paramétrique ou une comparaison multiple par paire a été effectué sur les données pour déterminer la plage et définir quelles moyennes étaient significativement différentes les unes des autres. Les résultats du test de Tukey sont présentés sur les diagrammes en boîtes à moustaches avec les lettres en gras. Les moyennes des traitements qui sont significativement différentes les unes des autres affichent des lettres en gras différentes. Ces moyennes sont illustrées sur chaque diagramme en boîte à moustaches par un point.
Les composés décrits ici peuvent être utilisés sur diverses cultures y compris, par exemple, le soja, le maïs, des céréales (c'est-à-dire, le blé, l'orge, le seigle, et l'avoine), le colza, le canola, le tournesol, la betterave à sucre, les pommes de terre, les légumes secs (c'est-à-dire, les lentilles, les haricots secs, etc.), la canne à sucre, les légumes-fruits, y compris les tomates, l'aubergine, les poivrons, les cucurbitacées, etc., les légumes à bulbes, y compris les oignons et les poireaux, les légumes à têtes et à feuilles, y compris la laitue, les épinards et le céleri, les brassicacées, les fruits à noyau, les fruits à pépins, 5 les agrumes, le café, le cacao, les fruits à coque, les baies, les raisins (de table et pour vinification), entre autres.
Enfin, il faudra également comprendre que les revendications suivantes sont prévues pour couvrir toutes les caractéristiques génériques et spécifiques de l'invention décrite ici et toutes les déclarations de l'étendue de l'invention qui, en matière de langage, 10 pourraient se situer entre celles-ci.
Claims (17)
- REVENDICATIONS1. Une ou plusieurs molécules bioactives isolées d'une espèce d'algues, la ou les plusieurs molécules bioactives ayant une masse moléculaire située dans la plage d'environ 0,15 kDa à environ 1,0 kDa.
- 2. Une ou plusieurs molécules bioactives selon la revendication 1, où la ou les plusieurs molécules bioactives sont capables d'améliorer la croissance végétale.
- 3. Une ou plusieurs molécules bioactives selon la revendication 1 ou 2, où l'espèce d'algues est une espèce d'algues brunes.
- 4. Une ou plusieurs molécules bioactives selon la revendication 3, où l'algue brune comprend une espèce d'algues choisie dans le groupe comprenant Ascophyllum nodosum, Fucus vesiculosus, Sargassum sp., et des combinaisons d'une ou de plusieurs des précédentes.
- 5. Une ou plusieurs molécules bioactives selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, où la ou les plusieurs molécules bioactives ne comprennent pas un polysaccharide sulfaté ou de la laminarine.
- 6. Procédé d'amélioration de la croissance végétale, le procédé comprenant l'étape d'application d'une composition comprenant la ou les plusieurs molécules bioactives isolées selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 sur au moins un choisi parmi le sol, une plante, ou une graine.
- 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel l'amélioration de la croissance végétale comprend au moins un choisi parmi : l'activation de la germination des graines, la stimulation du développement des racines, la prolongation d'une période végétative, le rallongement d’une période de production, ou le rallongement d’une période de récolte.
- 8. Procédé pour isoler et purifier des composés bioactifs dans un extrait obtenu à partir d'algues, le procédé comprenant les étapes suivantes :a) la circulation de l'extrait à travers une membrane d'ultrafiltration présentant un seuil de coupure de masse moléculaire approprié ;b) le recueil du filtrat à partir de l'extrait d'algues pour obtenir une première fraction de filtrat et un rétentat ; etc) le rinçage du retentât pour obtenir une ou plusieurs fractions supplémentaires de filtrat.
- 9. Procédé selon la revendication 8, comprenant en outre l'étape d'évaluation de la bioactivité de la première fraction du filtrat et des fractions supplémentaires du filtrat pour déterminer leur efficacité sur la croissance végétale.
- 10. Procédé selon la revendications ou 9, dans lequel l'efficacité sur la croissance végétale comprend au moins un choisi parmi : l'activation de la germination des graines, la stimulation du développement des racines, la prolongation d'une période végétative, le rallongement d'une période de production, ou le rallongement d'une période de récolte.
- 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, dans lequel l'extrait est produit à partir d'une espèce d'algues brunes.
- 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, dans lequel l'extrait est obtenu à partir d'algues Ascophyllum nodosum, Fucus vesiculosus, ou Sargassum sp.
- 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 12, dans lequel le rétentat comprend des molécules actives choisies dans le groupe consistant en des polysaccharides sulfatés et de la laminarine, et dans lequel les molécules actives sont capables de stimuler la tolérance à un stress abiotique dans des cultures.
- 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 13, dans lequel le premier filtrat comprend des molécules bioactives ayant une masse moléculaire située dans la plage d'environ 0,15 kDa à environ 1,0 kDa.
- 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 14, dans lequel la membrane d'ultrafiltration présente un seuil de coupure de masse moléculaire inférieur à 3 kDa.
- 16. Procédé selon la revendication 15, dans lequel la membrane d'ultrafiltration présente un seuil de coupure de masse moléculaire inférieur à 2 kDa.
- 17. Procédé selon la revendication 16, dans lequel la membrane d'ultrafiltration présente un seuil de coupure de masse moléculaire inférieur à 1 kDa.
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