RO128888A0

RO128888A0 - Compoziţie pentru tratamentul culturilor agricole şi procedeu de obţinere

Info

Publication number: RO128888A0
Application number: ROA201200888A
Authority: RO
Inventors: Sanda Velea; Florin Oancea; Constantin Marius Vlădulescu
Original assignee: Soctech S.A.
Priority date: 2012-11-27
Filing date: 2012-11-27
Publication date: 2013-10-30
Also published as: EP2735232A1

Abstract

Invenţia se referă la o compoziţie pentru tratamentul culturilor agricole, care stimulează creşterea plantelor, ameliorează rezistenţa plantelor la stres, în special la stresul hidric, şi, în cazul adăugării de seleniu, chelatat în aminoacizi, îmbunătăţeşte răspunsul plantelor la stresurile abiotice şi/sau biofortifiază recolta, şi la un procedeu de obţinere a acestei compoziţii din biomasă de microalge, cu adăugarea unui compus cu seleniu. Compoziţia conform invenţiei este alcătuită din 79,3...83,4 părţi hidrolizat de proteine algale, conţinând 5,9...6,3 părţi prolină, sau, respectiv, 55,8...58,7 părţi hidrolizat proteic din alge, conţinând 4,2...4,4 părţi prolină şi 23,5...24,7 părţi hidrolizat de proteine algale în care este chelatat seleniu, conţinând 1,2...1,25 părţi seleniu, în cazul suplimentării cu seleniu chelatat, 2...2,1 părţi betaine totale, 0,1...0,11 părţi citochinine, echivalent activitate kinetină, 8,2...8,7 părţi carbohidraţi, apă până la 100 de părţi. Procedeul conform invenţiei constă în liza biomasei microalgale printr-un tratament combinat, cu amestec de hidrolaze microbiene şi ultrasonare, concentrarea osmoprotectanţilor şi fitohormonilor din extract prin ultrafiltrare tangenţială, hidroliza proteinelor din retentat cu proteaze, chelatarea seleniului într-o parte din hidrolizatul proteic în cazul suplimentării cu seleniu, amestecarea concentratului de la osmoprotectanţi şi fitohormoni cu hidrolizatul proteic, eventual şi cu cel suplimentat cu seleniu, şi uscarea prin pulverizare a amestecului.

Description

Prezenta invenție se referă la o compoziție pentru tratamentul culturilor agricole, care stimulează creșterea plantelor, ameliorează rezistența plantelor la stres, în special la stresul hidric, și, în cazul adăugării de seleniu, chelatat în aminoacizi, îmbunătățește răspunsul plantelor la stresurile abiotice și/sau biofortifiază recolta, ca și la un procedeu de obținere a acestei compoziții din biomasă de micro-alge, cu adăugarea unui compus cu seleniu atunci când este cazul.

Sunt cunoscute compoziții care stimulează creșterea plantelor și/sau îmbunătățesc absorbția unor elemente nutritive pentru plante și/sau ameliorează rezistența plantelor la stres, obținute din biomasă de alge. Multe dintre compozițiile disponibile comercial de mai bine de 60 ani utilizează extracte de macro-alge marine, în care biotestele au relevat concentrații semnificative de fitohormoni, și în special citochinine (a se vedea de ex. trecerea în revistă realizată de Craig, 2011, J. Appl. Phycol., 23:371-393). Cererea de brevet WO2009129596 (A1) descrie un procedeu de obținere a unui extract alcalin de Ascophyllum nodosum, o algă brună din familia Fucaceae, comună în Atlanticul de Nord. Extractele în solvenți organici, respectiv metanol, cloroform și acetat de etil, s-au dovedit a fi eficiente în reducerea stresului salin în plantele cultivate, datorită modificărilor tiparului de expresie a genelor implicate în rezistența la stresul salin sub acțiunea compușilor prezenți în extractul obținut din A. nodosum. Cererea de brevet W02005094581 (A1), se referă la folosirea ulvanilor, extrași din macroalge verzi, aparținând genurilor Ulva sau Enteromorpha, sau la oligozaharide derivate din ulvani, ca activatori ai mecanismelor de absorbție a azotului și de sinteză a proteinelor. Invenția include și un fertilizant care conține ulvani și un procedeu de tratare a plantelor.

Biomasa de micro-alge a fost și ea folosită ca sursă de compuși biologic active pentru plante. Brevetul JP5021883 (B) dezvăluie un inhibitor de coacere care inhibă evoluția etilenei în organismul plantei, întârziind coacerea și senescența, obținut prin extracția cu un solvent apos, la 5O...15O°C, pentru 0,5 ..120 min, a biomasei de microalge de preferat din genurile Scenedesmus, Dunaliela sau Spirulina. Extractul în apă fierbinte este separat de resturile celulare prin centrifugare și conține o gamă de compuși, zaharide, proteine, polizaharide, <Α- 2 O 1 2 - O O 9 8 8 - 2 7 -11- 2012

acizi nucleici, care au o masă moleculară cuprinsă între 1 KDa și 1OOO KDa. Brevetul US2012094831 revendică un procedeu prin care sunt folosite celule de Chlorella, și/sau fragmente din biomasă de Chlorella obținute prin orice mijloace, pentru a modifica sau îmbunătăți calitatea, starea de sănătate, fertilitatea, aspectul estetic sau culoarea plantelor. Procedeul este exemplificat prin pulverizarea gazonului cu celule de Chlorella, și deși sunt revendicate și compoziții conținând cantități efective de pigmenți, coloranți, componenți ai coloranților, fragmente sau particule de biomasă de Chlorella, sau orice parte de materie din Chlorella obținută prin mijloace cunoscute, nu este prezentată o compoziție în care să fie precizate respectivele cantități considerate efective, din compuși bio-activi precizați, care să asigure efecte reproductibile ale tratamentelor asupra culturilor agricole și/sau ornamentale.

Biomasa de micro-alge conține cantități semnificative de fitohormoni, inclusiv citochinine (Ordog et al., 2004, J. Phycol. 40:88-95), ca și de osmoprotectanți, ca de ex. glicinbetaină (Spielmayer et al., 2011, Mar. Chem., 124:48-56). Aplicarea de tratamente cu glicinbetaină crește rezistența plantelor la stresul abiotic, în special la stresul hidric (Chen și Murata, 2008, Trends Plant Sci. 13:499-505). In biomasa de alge se acumulează și proteine, care conțin prolină, un aminoacid care are și el acțiune osmoprotectantă, manifestată și în cazul aplicării ca tratament al culturilor agricole (Ashrat și Foola, 2007, Environ. Exp. Bot, 59:206-216), astfel încât hidrolizatele proteinelor din microalge, inclusiv datorită prezenței prolinei, au o acțiune complementară celorlalți osmoprotectanți existenți în extractele de biomasă de alge. Hidrolizatele proteice reprezintă ele însele un biostiostimulant pentru culturile agricole (a se vedea de ex. trecerea în revistă Mâini 2006, Fertilitas agrorum, 1:29-43), nu numai datorită prolinei, ci și altor aminoacizi, precursori pentru auxine și poliamine (poliaminele fiind și ele implicate în rezistența plantelor la stresurile abiotice - a se vedea de ex. trecerea în revistă Alcazar, 2010, Planta, 231:127-1249). Studiile din ultimii 15 ani au dovedit că seleniul, deși nu este larg recunoscut ca un micro-element esențial pentru plante, stimulează creșterea plantelor (Hartikainen și Xue, 1999, J. Environ. Qual. 28:1372-1375) și are un rol semnificativ în protecția plantelor față de stresul oxidativ (Xue et al., 2001, Plant Soil 237:55-61) și în reducerea stresului hidric (Wang, 2011, J. Plant Nutr. Soil Sci., 174: 276-282; Wang et al., 2011, J. Plant Growth Regul., 30:436-444), deci adăugarea unor mici cantități de seleniu ar potența acțiunea de stimulare a creșterii plantelor și de ameliorare a rezistenței

C\- 2 O 1 2 - O O a 8 8 - 2 7 -11- 2012

plantelor la stres, în special la stresul hidric combinat cu cel oxidativ (care apare inclusiv în cazul secetei asociate temperaturilor ridicate). Pentru manifestarea optimă a interacțiilor pozitive dintre compușii bioactivi prezenți în extractele de micro-alge, fitohormorii și osmoprotectanți, și hidrolizatele proteice din alge conținând prolină, și eventual și seleniu ca microelement anti-oxidant, este necesară definirea unor compoziții în care diferitele ingrediente active să se regăsească în rapoarte și limite precizate, care la aplicare să asigure realizarea dozelor care determină efecte reproductibile în culturile agricole tratate.

Problema tehnică pe o rezolvă invenția constă în obținerea unei compoziții bine caracterizate din biomasă de micro-alge, cu efecte reproductibile atunci când sunt utilizate pentru tratamentul culturilor agricole, pentru a stimula creșterea plantelor, a ameliora rezistența plantelor la stres, în special la stresul hidric, și, în cazul suplimentării cu seleniu, și pentru a biofortifia recolta prin tratamente în timpul vegetației.

Este un alt obiect al soluției tehnice de a dezvălui un procedeu prin care să se obțină respectivele compoziții din biomasă de micro-alge, asigurând regăsirea ingredientelor bioactive în concentrații bine precizate. Este un obiect derivat al soluției tehnice de obținere de a descrie un procedeu prin care să se asigure, atunci când se suplimentează compoziția cu seleniu, formarea unor chelați ai seleniului în care acesta să fie prezent exclusiv în formă chelatată.

Compoziția conform invenției este alcătuită din 79,3...83,4 părți hidrolizat de proteine algale, conținând 5,9... 6,3 părți prolină, sau respectiv 55,8...58,7 părți hidrolizat proteic din alge conținând 4,2 ... 4,4 părți prolină, și 23,5 ... 24,7 părți hidrolizat de proteine algale în care este chelatat seleniu, conținând 1,2 ...1,25 părți seleniu, în cazul suplimentării cu seleniu chelatat, 2,0...2,1 părți betaine totale, 0,1...0,11 părți citochinine, echivalent activitate kinetină, 8,2 .. 8,7 părți carbohidrați, apă până la 100 părți.

Procedeul conform invenției este alcătuit din următoarele etape:

Separarea biomasei de mediul de cultură prin filtrare și lizarea celulelor printr-un tratament combinat, cu amestec de hidrolaze microbiene și ultrasonare, și eliminarea debriurilor celulare prin centrifugare;

Absorbția pigmenților clorofilieni din supernatant cu cărbune activat și separarea prin centrifugare a adaosului de cărbune activ;

Concentrarea osmoprotectanților și a fitohormonilor din extract prin ultrafiltrare pe o membrană cu limită de excludere de 1 KDa, până la atingerea ύ ¢^- 2 0 1 2 - 0 0 9 8 8 -2 7 -11- 2012 unei concentrații de circa 1% betaine totale în permeat, controlată prin dozarea prin cromatografie de înaltă presiune a glicinbetainei, și verificarea ulterioară a activității citochininelor cu ajutorul unui biotest;

Hidroliza enzimatică a proteinelor reținute în retentat, cu un amestec de proteaze microbiene, endo-proteaze și amidopeptidaze, până la atingerea unui randament maxim în aminoacizi liberi și di/tri-peptide și separarea prin ultrafiltrare a aminoacizilor liberi și a oligopeptidelor;

Concentrarea prin evaporare la presiune redusă a hidrolizatului proteic din permeat, până la 10% substanță uscată, adăugarea acestui concentrat de hidrolizat peste concentratul de osmoprotectanți și fitohormoni, și uscarea prin pulverizare a amestecului;

în cazul suplimentării compoziției cu seleniu chelatat în aminoacizi, prelevarea a 30% din concentratul de hidrolizat proteic, complexarea aminoacizilor din hidrolizat cu seleniu eliberat treptat dintr-un compus insolubil, într-o reacție accelerată prin ultrasonicare, centrifugarea excesului de compus insolubil al seleniului și adăugarea soluției de seleniu chelatat în hidrolizat proteic, împreună cu restul de 70% din concentratul de hidrolizat proteic, peste concentratul de osmoprotectanți și fitohormoni, și uscarea prin pulverizare a amestecului

Aspectele preferate pentru realizarea procedeului de mai sus sunt:

Obținerea unei biomase umede care conține 10% substanță uscată prin filtrare din mediul de cultură și liza biomasei umede cu amestec de enzime litice din Trichoderma harzianum, care include β-glucanază, celulaze și proteaze, aplicate în doză de 0,1 g de enzimă, cu activitatea de 200 unități β-glucan Botrytis per g, pentru 1 kg de biomasă umedă și ultrasonarea amestecului cu 400 W timp de 45 min la 45°C, urmată de eliminarea debriurilor prin centrifugare la 7000 x g;

Adăugarea peste supernatant de cărbune activ, în proporție de 4%, pentru absorbția pigmenților clorofilieni și separarea prin centrifugare la 5000 x g a adaosului de cărbune activat;

Hidroliza materialului proteic din retentat, cu un amestec de proteaze microbiene, 0,1 g endo-proteaze având activitatea specifică de 2,4 unități Anson (AU) per gram și 0,1 g amidopeptidaze, cu o activitate de 500 LAPU/g adăugate la 1000 ml de retentat, la pH neutru și temperatură de 55 ... 60°C, timp de 16...20 ore, urmată de ultrafiltrarea hidrolizatului cu îndepărtarea moleculelor cu o masă moleculară mai mare de 1 kDa;

^-2012-00388-2 7 -Η- 2012

Concentrarea prin evaporare la presiune redusă a hidrolizatului enzimatic până la 10% substanță uscată, adăugarea acestui concentrat de hidrolizat peste concentratul de osmoprotectanți și fitohormoni, în raport de 8 părți concentrat de hidrolizat proteic la 2 părți concentrat de osmoprotectanți și fitohormoni, și uscarea prin pulverizare a amestecului, la o temperatură de intrare de 140... 145°C și o temperatură de ieșire de 80 ... 85°C.

In cazul suplimentării cu seleniu a compoziției procedeul include următoarele completări, cu următoarele aspecte preferate de realizare:

Din concentratul de hidrolizat proteic se prelevează 30%, care se aduce peste selenit de magneziu hexahidrat, în raport de 100 ml hidrolizat la 1,37 g de selenit de magneziu hexahidrat, se ultrasonează amestecul cu 400 W timp de 30 min la 55°C, se centrifughează excesul de compus insolubil al seleniului, supernatantul de seleniu chelatat în hidrolizat proteic se adaugă împreună cu restul de 70% din concentratul de hidrolizat, peste concentratul de osmoprotectanți și fitohormoni, în raport de 24 părți soluție seleniu hidratat la 56 părți concentrat de aminoacizi și 20 părți concentrat de osmoprotectanți și fitohormoni, amestecul rezultat fiind uscat prin pulverizare a amestecului la o temperatură de intrare de 140... 145°C și o temperatură de ieșire de 80 ... 85°C.

Invenția prezintă următoarele avantaje:

Asigură reproductibilitatea efectelor asupra plantelor de cultură datorită unei compoziții definite, cu rapoarte precizate între ingredientele active, fitohormoni, și în special citochine, osmoprotectantanți, betaine și prolină din hidrolizatul de proteine algale, aminoacizi precurori de auxine și poliamine din hidrolizatul de proteine algale, eventual seleniu chelatat în aminoacizi, adăugat în cazul suplimentării cu seleniu;

Stimulează creșterea plantelor, datorită conținutului de fitohormoni și a aminoacizilor precursori de fitohormoni;

Ameliorează rezistența plantelor la stres, în special la stresul hidric, datorită compușilor osmoprotectanți, betaine și prolină din hidrolizatul de proteine algale, și a aminoacizilor precursori de poliamine, din hidrolizatul de proteine algale;

Valorifică potențialul de compuși osmoprotectanți din alge prin hidroliză enzimatică a proteinelor algale, din care se eliberează prolină, compus cu acțiune osmoprotectantă complementară glicin-betainei;

In cazul suplimentării cu seleniu ameliorează răspunsul plantelor la stresul hidric combinat cu cel oxidativ și biofortifică recolta;

c\- 2 Ο 1 2 - O O a 8 8 - 2 7 -11- 2012 1/7

Suplimentarea cu seleniu se realizează cu seleniu chelatat în aminoacizi, care prezintă o biodisponibilitate crescută și o toxicitate mai redusă;

Procedeul de chelatare, care utilizează seleniu eliberat treptat dintr-un compus insolubil, asigură regăsirea ulterioară a seleniului exclusiv sub formă chelatată;

In unele situații oligozaharidele formate în cursul procesului de liză celulară sub acțiunea enzimelor litice din T. harzianum, concentrate împreună cu fitohormonii și osmoprotectanții în prima etapă de ultrafiltrare, activează sistemele de apărare din plante.

In continuare invenția va fi descrisă prin prezentarea unor exemple de realizare.

Exemplu 1. Biomasa de micro-alge este separată de mediul de cultură prin filtrare. In sedimentul rezultat substanța uscată este determinată după uscare la 105°C pentru 4 ore și cântărire la o balanță electronică. Biomasa umedă se aduce la 10% (masă/volum) substanță uscată prin adăugare de apă. Un volum de biomasa de alge de 1 litru, corespunzând la 100 g de substanță uscată algală este adăugat într-un balon de 2500 ml cu fund plat, echipat cu condensatori de reflux, pâlnie de adăugare și termorezistență pentru monitorizarea temperaturii. pH-ul este corectat la 4,5 cu soluție 6 M HCI . Se adaugă Glucanex 200 G (Novozyme A/S, Bagvaerd, Danemarca), un amestec de enzime litice din Trichoderma harzianum, care include β-glucanază, celulaze și proteaze, în doză de 100 mg enzimă, cu activitatea de 200 unități β-glucan Botrytis per g. O unitate β-glucan Botrytis este definită ca fiind acea cantitate de enzimă care, în condiții standard, la 30,0°C, pH 4,4, timp de 10 min, eliberează 1 mmol de grupări reducătoare carbohidrați (calculate ca glucoza) per min. Suspensia este amestecată energic cu un agitator magnetic, și încălzită până la 45°C. Se scoate pâlnia de adăugare și se introduce o sondă ultrasonică. Suspensia de alge cu enzimă este sonicată timp de 45 min cu 400 W timp la 45°C. După finalizarea ciclului de sonicare, se trece cantitativ biomasa în tuburi de centrifugă și se separă lizatul de debriurile celulare prin centrifugare la 7000 x g. Supernatul se reia, se măsoară, se trece într-un flacon erlenmeyer de 2000 ml și se adaugă cărbune activat (Darco® G-60, Norit Americas, Marshall, TX, SUA), în proporție de 4%, masă / volum, pentru absorbția pigmenților clorofilieni. Se agită timp de 30 min cu agitator magnetic la temperatura camerei și apoi se trece în cupe de centrifugă și se separă prin centrifugare la 5000 x g cărbunele activat.

(k- 2 Ο 1 2 - O O fl 8 8 - 2 7 -11- 2012

Supernatantul se reia și este ultrafiltrat tangențial pe un sistem de ultrafiltrare tangențială Prostak (Merck Millipore, Billerica, MA, SUA) prevăzut cu o membrană Ultracel PLAC (Merck Millipore) din celuloză regenerată, cu limită de excludere de 1 KDa. Concentrarea osmoprotectanților și a fitohormonilor în permeat este continuată până la atingerea unei concentrații de 1% (masă / volum) betaine totale în permeat, controlată prin dozarea prin cromatografie de înaltă presiune a betainelor. Din permeat se prelevează probe în care se analizează periodic pentru conținutul de betaine folosind metoda descrisă de MacKinnon et al., 2010, J. Appl. Phycol., 22:489-494, pe un sistem Agilent 6224 Accurate Mass TOF LC/MS-MS (Agilent, Santa Clara, CA, SUA). Ultrafiltrarea se oprește la atingerea nivelului de concentrație de 1% betaine totale în permeat. In permeat se verifică conținutul în citochinine, prin folosirea biotestului pe cotiledoane de Amaranthus caudatus propus de Kubota et al., 1999, J. Plant Physiol., 155:133155, folosind kinetina (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO, SUA) ca standard, și se obține o valoare de 50 mg%(masă / volum) echivalent kinetina în concentrat.

Retentatul de la ultrafiltrare se trece într-un balon de 2500 ml cu fund plat, echipat cu condensatori de reflux, pâlnie de adăugare și termorezistență pentru monitorizarea temperaturii. pH-ul este corectat la 7 cu soluție 6 M NaOH. La 1000 ml retentat se adaugă 0,1 g Alcalase AF 2.4 L (Novozyme), endopeptidază bacteriană din Bacillus licheniformis, cu subtilizină/serin endo-peptidază ca principal component enzimatic, având activitatea specifică de 2,4 unități Anson (AU) per gram și 0,1 g de Flavourzyme 500 MG (Novozyme), un complex de amidopeptidaze / exopeptidaze și endo-proteaze, obținut din Aspergillus oryzae, cu o activitate de 500 LAPU/g. O unitate Anson este definită ca fiind acea cantitate de enzimă care, în condiții standard, digeră hemoglobina cu o viteză inițială care produce într-un minut o cantitate de compuși solubili în acid tricloracetic care dau aceeași culoare cu reactivul Folin-Ciocâlteu ca și 1 miliechivalent de tirozină. O unitate LAPU, unitate leucină aminopeptidazică, este cantitatea de enzimă care hidrolizează 1 pmol de leucin-p-nitroanilid/min. Orice tip de combinație de endoproteaze și amidopeptidaze/exo-proteaze poate fi folosită, cu condiția de a asigura o activitate enzimatică similară în amestec. Amestecul suspensie de proteine algale - enzime este menținut timp de 16 ore, la 60°C, este răcit la 40°C și apoi este ultrafiltrat printr-o membrană de 1 kDa, Prostak (Merck Millipore) prevăzut cu o membrană Ultracel PLAC (Merck Millipore) din celuloză regenerată.

c\- 2 Ο 1 2 - Q ο β 8 8 - 2 2 -11- 2012

La 1 ml de permeat/ultrafiltrat sunt adăugați 3 ml de soluție 5% acid tricloracetic acid (TCA). Nu rezultă un precipitat, iar aceasta demonstrează că în permeat sunt numai aminoacizi liberi și di/ tri-peptide. Permeatul este concentrat prin evaporare sub vid până la 10% substanță uscată (determinată refractometric). Acest concentrat de hidrolizat se adaugă peste concentratul de osmoprotectanți și fitohormoni, în raport de 8 părți concentrat de hidrolizat proteic la 2 părți concentrat de osmoprotectanți și fitohormoni, și se usucă prin pulverizare amestecul, la o temperatură de intrare de 140... 145°C și o temperatură de ieșire de 80 ... 85°C.

In produsul uscat final se determină aminoacizii totali cu ninhidrină (Lee și Takahashi, 1966, Anal Biochem. 14:71-77), prolina (Abraham et al., 2010, în R. Sunkar ed., Plant Stress Tolerance, Methods in Molecular Biology 639:317-331, Spinger, Berlin) și carbohidrații totali cu antronă (Hedge și Hofreiter, 1962 în: Whistler R.L. și Be Miller J. N. eds, Carbohydrate Chemistry 17, Academic Press New York), ca și betainele totale și activitatea citochininelor folosind metodele deja prezentate. Rezultatul aplicării invenției conform acestui exemplu este o compoziție alcătuită din 79,3...83,4 părți hidrolizat de proteine algale, conținând

5,9... 6,3 părți prolină, 2,0...2,1 părți betaine totale, 0,1...0,11 părți citochinine, echivalent activitate kinetină, 8,2 .. 8,7 părți carbohidrați, apă până la 100 părți.

Exemplu 2. Se procedează la fel ca în exemplul 1 până la obținerea concentratului de hidrolizat proteic. Din acest concentrat de hidrolizat proteic se prelevează 30%, care se aduce peste selenit de magneziu hexahidrat, în raport de 100 ml hidrolizat la 1,37 g de selenit de magneziu hexahidrat. Cristalele cubice de MgSeO₃.6 H₂O, insolubile în apă, se prepară prin adăugare lentă și treptată, sub agitare, a 44 ml acid selenios, H₂SeO₃, puritate 98%, densitate 3,004 g/ml, și a 204 ml soluție 10% MgCI₂.6H₂O peste 95 ml soluție 10% Na₂CO₃. Precipitatul format se filtrează, se spală pe filtru cu apă bidistilată până când conductivitatea apei este de sub 2 mS/cm și se usucă la etuvă sub vid la 45°C timp de 72 ore. Din compusul insolubil astfel obținut se cântăresc cu precizie 4,11 g care se transferă cantitativ într-un balon cu trei gâturi de 1000 ml. Peste cele 4,11 g se adaugă 300 ml suspensie, care este amestecată energic cu un agitator magnetic și încălzită până la 45°C. Se scoate pâlnia și se introduce o sonda ultrasonică. Hidrolizatul și selenitul de magneziu hexahidrat sunt sonicate pentru 60 min la 400 W. Datorită folosirii unui compus insolubil riscul ca Se⁺⁴ să fie redus la seleniu elementar Se⁰, insolubil și fără biodisponibilitate, este foarte redus. Lipsa apariției culorii roșii o

CVÎ Ο 1 2 - Ο Ο θ 8 8 - 2 7 *11” 2012 specifice seleniului Se° în timpul reacției de complexare reprezintă dovada neformării seleniu elementar. După finalizarea reacției se separă prin centrifugare la 5000 x g excesul de compus insolubil al seleniului. Supernatantul de seleniu chelatat în hidrolizat proteic se adaugă împreună cu restul de 70% din concentratul de hidrolizat, peste concentratul de osmoprotectanți și fitohormoni, în raport de 24 părți soluție seleniu hidratat la 56 părți concentrat de aminoacizi și 20 părți concentrat de osmoprotectanți și fitohormoni, amestecul rezultat fiind uscat prin pulverizare a amestecului la o temperatură de intrare de 140... 145°C și o temperatură de ieșire de 80 ... 85°C.

In produsul uscat final se determină aminoacizii totali, prolina, carbohidrații betainele și activitatea citochininelor folosind metodele deja prezentate. In plus se determină și seleniul, prin spectrofotometrie de absorbție atomică cu generare de hidruri (Tinggi et al., J. Food Comp. Anal. 5, 269-280). Compoziția care rezultă este alcătuită din 55,8...58,7 părți hidrolizat proteine din alge conținând 4,2 ... 4,4 părți prolină, și 23,5 ... 24,7 părți hidrolizat de proteine algale în care este chelatat seleniu, conținând 1,2 ...1,25 părți seleniu, 2,0...2,1 părți betaine totale, 0,1...0,11 părți citochinine, echivalent activitate kinetină, 8,2 .. 8,7 părți carbohidrați, apă până la 100 părți.

Exemplu 3. Compozițiile realizate conform ex. 1 și ex.2 au fost testate în condiții de seră, pe plante de tomate. Plantele de tomate (Lycopersicum esculentum cv. Cristal F1), răsaduri de 60 zile, au fost transplantate în vase de vegetație de 25 cm și 50 cm înălțime, în care s-au introdus câte 5 litri de substrat de creștere îmbogățit cu nutrienți pentru primele săptămâni de creștere (Canna Terra Professional Plus, Canna Internațional BV, Oosterhout, Olanda). Vasele de vegetație au fost menținute în condiții de seră, la 22±2°C în timpul zilei și 17±2°C în timpul nopții, cu o fotoperioadă de 12 ore, suplimentată cu lumină cu intensitatea de 160 mcE/m²/s, provenită din lămpi cu halogen, atunci când intensitatea luminoasă scădea sub 500 mcE/m²/s. Experimentul a durat 56 zile. Substratul conținea rezerve de nutrienți inițiale, astfel încât plantele au fost fertilizate numai o singură dată, după 28 zile de la transplantare, prin aplicarea a 100 ml de soluție nutritivă 1 g/l de îngrășământ 20-8-20 (N-P2O5-K2O, Eurofertil, TimacAgro Romariia). Experimentul a fost organizat în bloc randomizat cu câte 4 repetiții pentru fiecare variantă, fiecare repetiție incluzând câte 5 plante. Variantele testate experimental au inclus și martori stropiți cu apă, stresat hidric și nestresat, și un produs de referință, Maxicrop Original (MaxiCrop, Corby, Marea Britanie),

^-2012-00588-2 7 -11- 2012 care conține 8% substanță uscată extrasă din Ascophyllum nodosum. Aceste variante experimentale au fost:

Vi - martor nestresat hidric, tratat cu apă; 2 tratamente x 2 ml per plantă echivalent 100 l/ha;

V₂ - martor stresat hidric, tratat cu apă, 2 tratamente x 2 ml per plantă echivalent 100 l/ha;

V3 - nestresat hidric, tratat cu Maxicrop Original, 2 tratamente x 2 ml soluție 0,48% per plantă, echivalent 6 litri cu 8% s.u. în 100 l/ha

V₄ - stresat hidric, tratat cu Maxicrop Original, 2 tratamente x 2 ml soluție 0,48% per plantă, echivalent 6 litri cu 8% s.u. în 100 l/ha;

V₅ - nestresat hidric, tratat cu produs cf. ex.1, 2 tratamente x 2 ml soluție 0,5% per plantă, echivalent 0,5 kg în 100 l/ha

V₆ - stresat hidric, tratat cu produs cf. ex.1, 2 tratamente x 2 ml soluție 0,5% per plantă, echivalent 0,5 kg în 100 l/ha;

V₇ - nestresat hidric, tratat cu tratat cu produs cf. ex.2, 2 tratamente x 2 ml soluție 0,5% per plantă, echivalent 0,5 kg în 100 l/ha

V₈ - stresat hidric, tratat cu produs cf. ex.2, 2 tratamente x 2 ml soluție 0,5% per plantă, echivalent 0,5 kg în 100 l/ha.

Tratamentele s-au aplicat în a 2-a și a 29-a zi după transplantare, prin stropirea fiecărei plante cu ajutorul un atomizor de sticlă cu dop metalic și pară de cauciuc (model 15-RD, DeVilbiss Healthcare, Somerset, PA, SUA). Martorul nestresat hidric a fost udat o dată la cinci zile la 100% capacitate de câmp, iar variantele stresate hidric au fost udate la două săptămâni la 100% capacitate de câmp. La sfârșitul celor 8 săptămâni de la transplantare s-a desființat experiența, determinându-se parametri morfologici ai plantelor, respectiv înălțimea plantelor, lungimea rădăcinii, numărul de frunze și suprafața frunzelor, ca și masa de fructe coapte per plantă. In recolta de roșii s-a determinat seleniul, prin spectrofotometrie de absorbție atomică cu generare de hidruri (Tinggi et al., J. Food Comp. Anal. 5, 269-280). Datele s-au prelucrat prin analiza variantei (Statistica 10, StatSoft, Tulsa, OK, SUA).

Rezultatele sunt prezentate în tabelul 1 de mai jos. Compozițiile realizate conform invenției stimulează creșterea plantelor și ameliorează rezistența plantelor de tomate la stresul hidric.

^“2012-00888-2 7 -11- 2012

Tab. 1. Influența tratamentelor cu compoziții realizate conform invenției asupra plantelor de tomate, stresate și nestresate hidric*.

Variantă experimentală	înălțime plante (cm)	Lungime rădăcini (cm)	Număr frunze	Suprafață frunze (mm²)	Producție medie** (g fructe coapte / plantă)	Conținut mediu seleniu fructe (mcg/kg s.p.)
Vi martor nestresat hidric, tratat cu apă	58.1511.74b	56.4210.84b	32.0015.2b	679.4716.12b	325142,4b	0,2910,06c
V2 martor stresat hidric, tratat cu apă	44.0213.64c	38.7513.12c	25.5012.2c	537.5012.92c	192132,6c	0,4410,06b
V₃ nestresat hidric, Maxicrop Original, 2x 0,48% echiv. 6 litri 8% s.u. în 100 l/ha	64.3013.42a	55.5012.39b	34.0012.1b	687.5812.92ab	383128,2a	0,37+0,07b
V₄ stresat hidric, Maxicrop Original, 2x 0,48% echiv. 6 litri cu 8% s.u. în 100 l/ha	56.5012,89b	54.2011.93b	33.2013.8b	673.16i5.84ab	312138,6b	0,3810,04b
V5 nestresat hidric, tratat cu produs cf. ex.1,2x 0,5% echiv. 0,5 kg în 100 l/ha	65.2511.49a	59.2511.22a	47.5014.4a	719.2114.59a	374122,4a	0,3210,05bc
V₆ stresat hidric, tratat cu produs cf. ex.1,2 x 0,5% echiv. 0,5 kg în 100 l/ha;	54.5014.64b	55.2011,82b	34.0112.6b	672.1618.24b	309135,6b	0,3610,06b
V7 nestresat hidric, tratat cu tratat cu produs cf. ex.2, 2 x 0,5% per plantă, echivalent 0,5 kg în 100 l/ha	67.5213.49a	58.8511.34a	47.5014.6a	719.2114.59a	394130,9a	0,5510,04a
V₃ stresat hidric, tratat cu produs cf. ex.2, 2 x 0,5% echivalent 0,5 kg în 100 l/ha	54.5014.64b	54.6012.12b	35.2012.4b	681.1617.42b	318125,6b	0,5910,06b

‘Valorile urmate de aceeași literă nu diferă semnificativ pentru P>0,05; “Producția pe 30 zile ciclu de înflorire - fructificare

Compoziția conform ex.1 are o activitate la nivelul produsului comercial utilizat ca referință, iar adaosul de seleniu îmbunătățește răspunsul la stresul hidric, probabil datorită unei mai bune protecții anti-oxidante. Nivelul de seleniu din producția utilă a plantele tratate prin aplicarea unei soluții de 0,5% compoziție cu seleniu, echivalent cu o doză de 0,5 kg de compoziție cu adaos de seleniu, respectiv la 6,0 ... 6,75 g Se/ha, aplicată într-o normă de stropire de 100 l/ha, crește semnificativ, dar nu influențează în mod semnificativ contribuția adusă de consumul de roșii în necesarul zilnic de seleniu, care este de 50 mcg/zi pentru femei și de 70 mcg/zi pentru bărbați.

Claims

REVENDICĂRI

1. Compoziție conform invenției caracterizată prin aceea că este alcătuită din

79,3...83,4 părți hidrolizat de proteine algale, conținând 5,9... 6,3 părți prolină, sau respectiv 55,8...58,7 părți hidrolizat proteic din alge conținând 4,2 ... 4,4 părți prolină, și 23,5 ... 24,7 părți hidrolizat de proteine algale în care este chelatat seleniu, conținând 1,2 ...1,25 părți seleniu, în cazul suplimentării cu seleniu chelatat, 2,0...2,1 părți betaine totale, 0,1...0,11 părți citochinine, echivalent activitate kinetină, 8,2 .. 8,7 părți carbohidrați, apă până la 100 părți.
2. Procedeu conform invenției caracterizat prin aceea că este alcătuit din următoarele etape: separarea biomasei de mediul de cultură prin filtrare și lizarea celulelor printr-un tratament combinat, cu amestec de hidrolaze microbiene și ultrasonare, și eliminarea debriurilor celulare prin centrifugare; absorbția pigmenților clorofilieni din supernatant cu cărbune activat și separarea prin centrifugare a adaosului de cărbune activ; concentrarea osmoprotectanților și a fitohormonilor din extract prin ultrafiltrare pe o membrană cu limita de excludere de 1 kDa, până la atingerea unei concentrații de circa 1% betaine totale în permeat, controlată prin dozarea prin cromatografie de înaltă presiune a glicinbetainei, și verificarea ulterioară a activității citochininelor cu ajutorul unui biotest; hidroliza enzimatică a proteinelor reținute în retentat, cu un amestec de proteaze microbiene, endo-proteaze și amidopeptidaze, până la atingerea unui randament maxim în aminoacizi liberi și di/tri-peptide și separarea prin ultrafiltrare a aminoacizilor liberi și a oligopeptidelor; concentrarea prin evaporare la presiune redusă a hidrolizatului proteic din permeat, până la 10% substanță uscată, adăugarea acestui concentrat de hidrolizat peste concentratul de osmoprotectanți și fitohormoni, și uscarea prin pulverizare a amestecului; în cazul suplimentării compoziției cu seleniu chelatat în aminoacizi prelevarea a 30% din concentratul de hidrolizat proteic, complexarea aminoacizilor din hidrolizat cu seleniu eliberat treptat dintr-un compus insolubil, într-o reacție accelerată prin ultrasonicare, centrifugarea excesului de compus insolubil al seleniului și adăugarea soluției de seleniu chelatat în hidrolizat proteic, împreună cu restul de 70% din concentratul de hidrolizat proteic, peste concentratul de osmoprotectanți și fitohormoni, și uscarea prin pulverizare a amestecului.

(λ, -1 Ο 1 2 - Ο Ο 0 8 8 - 2 7 -11- 2012
3. Etapa de liză a biomasei umede conform procedeului din revendicarea 2, caracterizată prin aceea că este realizată cu un amestec de enzime litice din Trichoderma harzianum, care include β-glucanază, celulaze și proteaze, aplicate în doză de 0,1 g de enzimă, cu activitatea de 200 unități β-glucan Botrytis per g, pentru 1 kg de biomasă umedă și ultrasonarea amestecului cu 400 W timp de 45 min la 45°C, urmată de eliminarea debriurilor celulare prin centrifugare la 7000 x g.
4. Etapă de hidroliză materialului proteic din retentat conform procedeului din revendicarea 2, caracterizată prin aceea că este realizată cu un amestec de proteaze microbiene, 0,1 g endo-proteaze având activitatea specifică de 2,4 unități Anson (AU) per gram și 0,1 g amidopeptidaze, cu o activitate de 500 LAPU/g adăugate la 1000 ml de retentat, la pH neutru și temperatură de 55 ... 60°C, timp de 16...20 ore, urmată de ultrafiltrarea hidrolizatului cu îndepărtarea moleculelor cu o masă moleculară mai mare de 1 kDa.
5. Etapă de adăugare a concentratului de hidrolizat peste concentratul de osmoprotectanți și fitohormoni, conform procedeului din revendicarea 2, caracterizată prin aceea că este realizată în raport de 8 părți concentrat de hidrolizat proteic la 2 părți concentrat de osmoprotectanți și fitohormoni, și este urmată de uscarea prin pulverizare a amestecului, la o temperatură de intrare de

140... 145°C și o temperatură de ieșire de 80 ... 85°C.
6. Etapă eventuală de suplimentare cu seleniu a compoziției conform procedeului din revendicarea 2, caracterizată prin aceea că este realizată prin prelevarea a 30% din concentratul de hidrolizat proteic, care se aduce peste selenit de magneziu hexahidrat, în raport de 100 ml hidrolizat la 1,37 g de selenit de magneziu hexahidrat, ultrasonarea amestecului cu 400 W timp de 30 min la 55°C, centrifugarea excesului de compus insolubil al seleniului, fiind urmată de adăugarea supernatantului conținând seleniu chelatat în hidrolizat proteic împreună cu restul de 70% din concentratul de hidrolizat, peste concentratul de osmoprotectanți și fitohormoni, în raport de 24 părți soluție seleniu hidratat la 56 părți concentrat de aminoacizi și 20 părți concentrat de osmoprotectanți și fitohormoni, și de uscarea prin pulverizare a amestecului format la o temperatură de intrare de 140... 145°C și o temperatură de ieșire de 80 ... 85°C.