BR112020010761A2 - formulação líquida de anticorpo humanizado para o tratamento de doenças relacionadas à il-6 - Google Patents
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Abstract
A presente invenção refere-se a uma formulação líquida de anticorpo humanizado para o tratamento de doenças relacionadas à interleucina IL-6. A formulação líquida contém 2 a 100 mg/mL de anticorpo monoclonal humanizado recombinante contra o receptor humano da interleucina 6, 5 a 20 mM de tampão de sal de histidina (ou um tampão de uma combinação de 5 a 20 mM de sal de histidina e 5 a 20 mM de acetato de sódio), 0,025 a 0,075% (em volume) de tensoativo, e 3 a 5% de estabilizador (em massa para volume) e água para injeção. A formulação de anticorpo melhora a estabilidade do anticorpo monoclonal recombinante contra o receptor da interleucina 6, impede a agregação, degradação e aumentos de isômeros ácidos do anticorpo monoclonal. Essa formulação pode ser usada para estabilizar a estrutura e a função do anticorpo humanizado.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FORMULAÇÃO LÍQUIDA DE ANTICORPO HUMANIZADO PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS RELACIONADAS À IL-6", Campo Técnico
[001] A presente invenção refere-se a uma formulação líquida de anticorpo humanizado para o tratamento de doenças relacionadas à interleucina 6 (IL-6). Antecedentes da Invenção
[002] Anticorpos humanizados contra o receptor da interleucina 6 são fármacos úteis para o tratamento da artrite reumatoide (AR) [1], cujos mecanismos ligam receptores solúveis e ligados à membrana da IL-6 (SIL-6R e mIL-6R) e inibem a sinalização mediada por sIL-6R e mIL- 6R.
[003] A IL-6 desempenha um papel central E! no processo patogênico da AR. A IL-6 pode ativar a proliferação de células endoteliais e a geração de novos vasos sanguíneos que expressam a molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) e a molécula de adesão celular vascular-1 (VCAM-1) em células endoteliais vasculares, e promovem ainda a migração de linfócitos, neutrófilos e similares no sangue para as articulações; ela pode ativar os osteoclastos para causar danos à cartilagem e aos ossos; pode promover a diferenciação de células T maduras em Th17, e Th17, por sua vez, promove a diferenciação de células T em tipo Th1, o que agrava a resposta inflamatória da AR e inibe a diferenciação de Treg. Um Th17/Treg desequilibrado leva a um efeito inibidor enfraquecido e a uma tolerância imunológica reduzida do sistema imunológico à inflamação, que é o principal processo patológico de muitas doenças autoimunes e da inflamação crônica. Além disso, os anticorpos humanizados contra o receptor da interleucina 6 aumentam a disponibilidade de ferro, reduzindo a produção de hepcidina estimulada pela IL-6, aumentando assim o nível de hemoglobina e melhorando a anemia associada à AR; com a sinalização JAK/STAT da IL-6 inibida, os níveis de proteína C- reativa (PCR) e amilóide sérico A secretados pelas células hepáticas são rapidamente reduzidos, a taxa de sedimentação de eritrócitos é reduzida e a resposta inflamatória sistêmica é controlada. Os anticorpos humanizados contra o receptor interleucina-6 podem bloquear especificamente a ligação da IL-6 e o receptor da IL-6, reduzir a infiltração de células inflamatórias locais e a geração de fatores inflamatórios, reduzir dores e inchaço nas articulações, danos nas cartilagens e articulações ósseas causados pela inflamação das articulações, reduzir os sintomas sistêmicos como fadiga, anorexia e anemia, causados pela inflamação e têm um bom efeito de tratamento para pacientes com artrite reumatoide moderada e grave, em que os tratamentos tradicionais com medicamentos químicos antirreumáticos são ineficazes.
[004] Podem ser encontrados casos de AR em todo o mundo. Nos últimos anos, a maioria dos pesquisadores considera que a incidência de AR é de cerca de 1%, e os pacientes do sexo feminino representam um percentual cerca de 3 vezes maior que os pacientes do sexo masculino. A artrite reumática pode ocorrer em todas as idades e os pacientes adultos podem ser encontrados em sua maioria entre mulheres de meia idade, especialmente durante a menopausa. De acordo com uma pesquisa americana, a taxa de prevalência é de 0,9% no grupo de 35 a 44 anos, e esse número aumenta com a idade: 2,9% no grupo de 55 a 64 anos, e 4,90% no grupo com mais de 65 anos. P! De acordo com as estatísticas, a taxa de prevalência de AR na China é de cerca de 0,24% a 0,4% |, e, com o envelhecimento da população, a taxa de prevalência de AR também irá aumentar. A AR é uma das principais doenças que causam perda de mão de obra e invalidez na China. A maioria das condições de AR dos pacientes é progressiva e destrutiva. Dois anos após o aparecimento dos sintomas, 50% a 90% dos pacientes apresentaram alterações radiológicas dos danos nas articulações, cerca de 50% dos pacientes não tratados tornam-se inválidos dentro de dois anos, 70% dos pacientes não tratados tornam- se inválidos dentro de três anos e, uma vez que ocorre uma lesão óssea, ela é irreversível El. O tratamento positivo e correto pode aliviar as condições da doença de mais de 80% dos pacientes com artrite reumatoide.
[005] A formulação de anticorpos desenvolvida pela invenção compreende anticorpo humanizado contra o receptor da interleucina 6, que é um ingrediente ativo, e é usado para tratar doenças relevantes causadas pela IL-6. Para fornecer um produto de anticorpo com atividade estável, é necessário desenvolver uma formulação que facilite a preservação estável do anticorpo, de modo que a função e a estrutura do anticorpo possam ser mantidas por um longo tempo. Sumário da Invenção
[006] É um objetivo da presente invenção fornecer uma formulação líquida estável que compreende anticorpos monoclionais.
[007] O objetivo da presente invenção é atingido pelos seguintes recursos técnicos:
[008] Em um aspecto, a invenção fornece uma formulação de anticorpo, a formulação de anticorpo compreendendo um anticorpo humanizado contra o receptor da interleucina 6, um sistema de tampão, um estabilizador e um tensoativo. Especificamente, a formulação de anticorpo da presente invenção compreende os seguintes ingredientes:
[009] (1) o anticorpo: 2 a 100 mg/mL de anticorpo humanizado contra o receptor da IL-6;
[0010] (2) o sistema de tampão: o sistema de tampão sendo formado na formulação por um tampão, o sistema de tampão sendo um tampão de 5 a 20 mM de sal de histidina ou uma combinação de 5 a 20 mM de sal de histidina e 5 a 20 MM de acetato de sódio;
[0011] (3) o tensoativo: 0,1 a 1 g/L;
[0012] (4) o estabilizador: 30 a 400 mM;
[0013] (5) água para injeção.
[0014] O pH da formulação de anticorpo é de 5,0 a 7,0.
[0015] O anticorpo humanizado contra o receptor da interleucina 6 é expresso em células CHO por métodos de engenharia genética e purificado por uma série de etapas cromatográficas padrão. Após a preparação do anticorpo, é preparada uma formulação farmacêutica.
[0016] Como uma modalidade preferida, a concentração do anticorpo humanizado contra o receptor da IL-6 na formulação é de 10 a 90 mg/mL; como uma modalidade mais preferida, a concentração de anticorpo humanizado contra o receptor da IL-6 na formulação é de 15 a 50 mg/ml; como uma modalidade particularmente preferida, a concentração de anticorpo humanizado contra o receptor da IL-6 na formulação é de 18 a 25 mg/mL; como a modalidade ainda mais preferida, a concentração de anticorpo humanizado contra o receptor da IL-6 na formulação é de 20 mg/mL.
[0017] Como uma modalidade preferida, o anticorpo compreende uma cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO. 1 e uma cadeia leve mostrada em SEQ ID NO. 2; como uma modalidade mais preferida, o anticorpo é BAT1806; adicionalmente, BATI1806 compreende duas cadeias pesadas mostradas em SEQ ID NO. 1 e duas cadeias leves mostradas em SEQ ID NO. 2.
[0018] Em que o estabilizador é selecionado de uma combinação de cloridrato de arginina e sacarose ou manitol, ou cloreto de sódio; adicionalmente, o estabilizador é selecionado do grupo que consiste em 50 a 200 mM (10,533 a 42,132 g/L) de cloridrato de arginina e 58 a 205 mM (20 a 70 g/L) de sacarose; ou o estabilizador é selecionado de 167 a 388 mM (30 a 70 g/L) de manitol; ainda, ou o estabilizador é selecionado de 100 a 300 mM (5,85 a 17,55 g/L) de cloreto de sódio.
[0019] Em que o tensoativo é um ou mais selecionados de polissorbato-20, polissorbato-80 e poloxâmero 188. Como uma modalidade preferida, o tensoativo é selecionado de polissorbato-80; adicionalmente, o tensoativo é selecionado de 0,1 a 0,7 g/L de polissorbato-80.
[0020] Como uma modalidade preferida, o pH da formulação de anticorpo é de 5,5 a 6,5; como uma modalidade mais preferida, o pH da formulação de anticorpo é entre 6,0 e 6,4; como uma modalidade ainda mais preferida, o pH da formulação de anticorpo é 6,2.
[0021] Como uma modalidade preferida, a formulação de anticorpo da presente invenção compreende os seguintes ingredientes: (1) 18 a 22 mg/mL de anticorpo humanizado contra o receptor da IL-6; (2) 8 a 15 mM de solução de tampão de sal de histidina; (3) 0,45 g/L a 0,65 g/L de polissorbato-80; (4) 40 a 60 mM de cloridrato de arginina; (5) 15 a 25 g/L de sacarose; (6) água para injeção; opHé60as6a; ou, preferencialmente, compreende os seguintes ingredientes: (1) 18 a 22 mg/mL de anticorpo humanizado contra o receptor da IL-6; (2) 8 a 15 MM de solução de tampão de sal de histidina; (3) 0,45 a 0,65 g/L de polissorbato-80; (4) 30 a 45 g/L de manitol; (5) água para injeção; (6) o pH é 6,0a 6,4; ou, ainda preferencialmente, compreende os seguintes ingredientes: (1) 18 a 22 mg/mL de anticorpo humanizado contra o receptor da IL-6; (2) 8 a 15 mM de sal de histidina; (3) 0,45 a 0,65 g/L de polissorbato-80;
(4) 90 a 110 mM de cloreto de sódio; (5) água para injeção; opHé60a6a.
[0022] Como uma modalidade mais preferida, a formulação de anticorpo da presente invenção compreende os seguintes ingredientes: (1) 20 mg/mL de anticorpo humanizado contra o receptor da IL-6; (2) 10 MM de tampão de sal de histidina; (3) 0,5 g/L de polissorbato-80; (4) 50 mM de cloridrato de arginina; (5) 20 g/L de sacarose; (6) água para injeção; o pH é 6,2; ou, mais preferencialmente, compreende os seguintes ingredientes: (1) 20 mg/mL de anticorpo humanizado contra o receptor da IL-6; (2) 10 MM de tampão de sal de histidina; (3) 0,5 g/L de polissorbato-80; (4) 30 g/L de manitol; (5) água para injeção; o pH é 6,2; ou, mais preferencialmente, compreende os seguintes ingredientes: (1) 20 mg/mL de anticorpo humanizado contra o receptor da IL-6; (2) 10 mM de tampão de sal de histidina; (3) 0,5 g/L de polissorbato-80; (4) 42 g/L de manitol; (5) água para injeção; o pH é 6,2; ou, mais preferencialmente, compreende os seguintes ingredientes: (1) 20 mg/mL de anticorpo humanizado contra o receptor da IL-6; (2) 10 MM de tampão de histidina; (3) 0,5 g/L de polissorbato-80;
(4) 100 mM de cloreto de sódio; (5) água para injeção; o pH é 6,2.
[0023] A formulação de anticorpo da invenção também compreende uma base para ajustar o pH. Em uma modalidade exemplar da presente invenção, a base é NaOH.
[0024] A formulação de anticorpo é uma formulação aquosa para injeção. A formulação é adequada para injeção subcutânea ou injeção intravenosa.
[0025] Em outro aspecto, a invenção também fornece um método para preparar a formulação de anticorpo que compreende as etapas de: (1) dissolver um tampão pesado, um estabilizador e um tensoativo em água para injeção; (2) ajustar o líquido preparado na etapa (1) com hidróxido de sódio aquoso até o pH ser 5 a 7; preferencialmente, a concentração de hidróxido de sódio aquoso é de 1 M; (3) filtrar o líquido preparado na etapa (2) em um recipiente asséptico; preferencialmente, o tamanho dos poros da membrana do filtro sendo 0,22 um para filtragem de bactérias e fungos; e (4) adicionar o líquido preparado na etapa (3) a uma solução de anticorpo.
[0026] A formulação de anticorpo é uma formulação farmacêutica para o tratamento de doenças relacionadas à IL-6; especificamente, as doenças relacionadas à IL-6 incluem: artrite reumatoide em adultos, artrite idiopática juvenil sistêmica, artrite idiopática juvenil poliarticular, arterite de células gigantes, hiperplasia de linfonodo gigante, hipercitocinemia causada por imunoterapia, doença de Still em adultos, policondrite recorrente, diabetes tipo |l, espondilite anquilosante, oftalmopatias associadas à tireoide, doenças cardiovasculares causadas por artrite reumatoide, polimialgia reumática, doença do enxerto aguda contra o hospedeiro, infarto do miocárdio sem supradesnivelamento do segmento ST, lúpus eritematoso sistêmico, esquizofrenia, uveite, câncer de ovário, vasculite associada a anticorpo citoplasmático antineutrofílico, neuromielite óptica, glomerulonefrite crônica, câncer colorretal e similares; como uma modalidade preferida, as doenças relacionadas à IL-6 incluem: artrite reumatoide em adultos, artrite idiopática juvenil sistêmica, artrite idiopática juvenil poliarticular, arterite de células gigantes e hiperplasia de linfonodos gigantes.
[0027] Em uma modalidade preferida da invenção, o anticorpo é BAT1806, um anticorpo monoclonal humano que é produzido em CHO- K1 usando técnicas de DNA recombinante, precipitado para obter um sobrenadante da cultura e purificado. O mecanismo do BAT1806 deve ligar, especificamente, receptores da IL -6 solúveis e ligados à membrana (sIL-6R e mIL-6R) e inibir a sinalização mediada por sIL-6R e mIL-6R. O BAT1806 tem um bom efeito de tratamento sobre doenças relacionadas à IL-6, como artrite reumatoide em adultos, artrite idiopática juvenil sistêmica, artrite idiopática juvenil poliarticular, arterite de células gigantes, hiperplasia de linfonodo gigante e tempestade de citocinas causada por imunoterapia.
[0028] Nas formulações de anticorpo fornecidas pela invenção, a fim de manter a estabilidade do anticorpo humanizado contra o receptor da interleucina 6, um sistema de tampão apropriado foi selecionado, um estabilizador foi otimizado e um tensoativo foi adicionado, e por meio de uma grande quantidade de trabalhos de pesquisa, formulações de anticorpo foram desenvolvidas para inibir de modo acentuado a formação de picos ácidos, dímeros, agregados, degradantes e micropartículas insolúveis durante ciclos de congelamento/descongelamento, armazenamento em longo prazo e processos com variação de temperatura. Em particular, os anticorpos humanizados contra o receptor da interleucina 6 permanecem estáveis nas formulações anteriores após pelo menos 5 ciclos de congelamento- descongelamento, estáveis em temperatura ambiente por pelo menos 6 meses e estáveis a 4 ºC por 36 meses. Portanto, as formulações de anticorpo da presente invenção podem ser usadas para armazenar, de maneira estável, o anticorpo humanizado contra o receptor da interleucina 6 para tratamento clínico, que tem grande importância no tratamento de doenças relevantes causadas pela IL-6. Breve Descrição Dos Desenhos
[0029] Figura 1A: Análise de pico principal de IEC-HPLC (Cromatografia Ilônica)-(Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) da seleção de pH (alta temperatura de 40 ºC) para a formulação do anticorpo BAT1806 humanizado contra o receptor da interleucina 6;
[0030] Figura 1B: Análise de pico principal de SEC-HPLC (Cromatografia por Exclusão de Tamanho)-(Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) da seleção de pH (alta temperatura de 40 ºC) para a formulação do anticorpo BAT1806 humanizado contra o receptor da interleucina 6.
[0031] Figura 2A: Análise de pico principal de SEC da seleção de estabilizador (alta temperatura de 50 ºC) para a formulação do anticorpo BAT1806 humanizado contra o receptor da interleucina 6;
[0032] Figura 2B: Análise de agregado de SEC da seleção de estabilizador (alta temperatura de 50 ºC) para a formulação do anticorpo BAT1806 humanizado contra o receptor da interleucina 6;
[0033] Figura 2C: Análise de fragmento de SEC da seleção de estabilizador (alta temperatura de 50 ºC) para a formulação do anticorpo BAT1806 humanizado contra o receptor da interleucina 6;
[0034] Figura 2D: Análise de pico principal de IEC da seleção de estabilizador (alta temperatura de 50 ºC) para a formulação do anticorpo BAT1806 humanizado contra o receptor da interleucina 6;
[0035] Figura 2E: Análise de pico ácido de IEC da seleção de estabilizador (alta temperatura de 50 ºC) para a formulação do anticorpo BAT1806 humanizado contra o receptor da interleucina 6;
[0036] Ilustrações (Figuras 2A a 2E):
[0037] ZT (PB): 15 mM de tampão de PBS, 5% de sacarose, concentração de proteína a 20 mg/mL, pH=6,5;
[0038] ZT (His): 10 mM de tampão de His, 5% de sacarose, concentração de proteína a 20 mg/mL, pH=6,2;
[0039] Arg-HCl: 10 mM de tampão de His, 100 mM de cloridrato de arginina, concentração de proteína a 20 mg/mL, pH=6,2;
[0040] Pro: 10 mM de tampão de His, 100 mM de prolina, concentração de proteína a 20 mg/mL, pH=6,2;
[0041] NaCl: 10 mM de tampão de His, 100 mM de NaCl, concentração de proteína a 20 mg/mL, pH=6,2;
[0042] GLC: 10 mM de tampão de His, 4,2%6 de manitol, concentração de proteína a 20 mg/mL, pH=6,2;
[0043] Arg-HCI+ZT: 10 mM de tampão de His, 50 mM de cloridrato de arginina, 2% de sacarose, concentração de proteína a 20 mg/mL; pH=6,2;
[0044] Arg-HCI (NaAC): 10 mM de tampão de acetato de sódio, 100 mM de cloridrato de arginina, concentração de proteína a 20 mg/mL, pH=6,2;
[0045] Od: Dia 0; 4d: Dia 4; 8d: Dia 8; 12d: Dia 12.
[0046] Figura 3A: Análise de pico principal de SEC da seleção de estabilizador (alta temperatura de 40 ºC) para a formulação do anticorpo BAT1806 humanizado contra o receptor da interleucina 6;
[0047] Figura 3B: Análise de agregado de SEC da seleção de estabilizador (alta temperatura de 40 ºC) para a formulação do anticorpo BAT1806 humanizado contra o receptor da interleucina 6;
[0048] Figura 3C: Análise de fragmento de SEC da seleção de estabilizador (alta temperatura de 40 ºC) para a formulação do anticorpo
BAT1806 humanizado contra o receptor da interleucina 6;
[0049] Figura 3D: Análise de pico principal de IEC da seleção de estabilizador (alta temperatura de 40 ºC) para a formulação do anticorpo BAT1806 humanizado contra o receptor da interleucina 6;
[0050] Figura 3E: Análise de pico ácido de IEC da seleção de estabilizadores (alta temperatura de 40 ºC) para a formulação do anticorpo BAT1806 humanizado contra o receptor da interleucina 6;
[0051] Ilustrações (Figuras 3A a 3E):
[0052] ZT (PB): 15 mM de tampão de PBS, 5% de sacarose, concentração de proteína a 20 mg/mL, pH=6,5;
[0053] ZT (His): 10 mM de tampão de His, 5% de sacarose, concentração de proteína a 20 mg/mL, pH=6,2;
[0054] Arg-HCl: 10 mM de tampão de His, 100 mM de cloridrato de arginina, concentração de proteína a 20 mg/mL, pH=6,2;
[0055] Pro: 10 mM de tampão de His, 100 mM de prolina, concentração de proteína a 20 mg/mL, pH=6,2;
[0056] NaCl: 10 mM de tampão de His, 100 mM de NaCl, concentração de proteína a 20 mg/mL, pH=6,2;
[0057] GLC: 10 mM de tampão de His, 4,2%%º de manitol, concentração de proteína a 20 mg/mL, pH=6,2;
[0058] Arg-HCI+ZT: 10 mM de tampão de His, 50 mM de cloridrato de arginina, 5% de sacarose, concentração de proteína a 20 mg/mL; pH=6,2;
[0059] Arg-HCI (NaAC): 10 mM de tampão de acetato de sódio, 100 mM de cloridrato de arginina, concentração de proteína a 20 mg/mL, pH=6,2;
[0060] Od: Dia 0; 7d: Dia 7; 14d: Dia 14; 25d: Dia 25.
[0061] Figura 4A: Análise de pico principal de SEC da seleção de estabilizador (4000 Lx de luz) para a formulação do anticorpo BAT1806 humanizado contra o receptor da interleucina 6;
[0062] Figura 4B: Análise de pico principal de IEC da seleção de estabilizador (4000 Lx de luz) para a formulação do anticorpo BAT1806 humanizado contra o receptor da interleucina 6;
[0063] Ilustrações (Figuras 4A a 4B):
[0064] ZT (PB): 15 mM de tampão de PBS, 5% de sacarose, concentração de proteína a 20 mg/mL, pH=6,5;
[0065] ZT (His): 10 mM de tampão de His, 5% de sacarose, concentração de proteína a 20 mg/mL, pH=6,2;
[0066] Arg-HCl: 10 mM de tampão de His, 100 mM de cloridrato de arginina, concentração de proteína a 20 mg/mL, pH=6,2;
[0067] Pro: 10 mM de tampão de His, 100 mM de prolina, concentração de proteína a 20 mg/mL, pH=6,2;
[0068] NaCl: 10 mM de tampão de His, 100 mM de NaCl, concentração de proteína a 20 mg/mL, pH=6,2;
[0069] GLC: 10 mM de tampão de His, 4,2%6 de manitol, concentração de proteína a 20 mg/mL, pH=6,2;
[0070] Arg-HCI+ZT: 10 mM de tampão de His, 50 mM de cloridrato de arginina, 5% de sacarose, concentração de proteína a 20 mg/mL; pH=6,2;
[0071] Arg-HCI (NaAC): 10 mM de tampão de acetato de sódio, 100 mM de cloridrato de arginina, concentração de proteína a 20 mg/mL, pH=6,2;
[0072] Od: Dia 0; 7d: Dia 7; 14d: Dia 14.
[0073] A Figura 5A é um gráfico de tendências de SEC para as Formulações E e F em condições de aceleração;
[0074] A Figura 5B é um gráfico de tendências de IEC para as Formulações E e F em condições de aceleração;
[0075] A Figura 5C é um gráfico de tendências de CE (não reduzido) para as Formulações E e F em condições de aceleração.
[0076] A Figura 6A é um gráfico de tendências de SEC para a
Formulação E sob alta temperatura e luz;
[0077] A Figura 6B é um gráfico de tendências de IEC para a Formulação E sob alta temperatura e luz;
[0078] A Figura 6C é um gráfico de tendências de CE (não reduzido) para a Formulação E sob condições de alta temperatura e luz.
[0079] Figura 7A: avaliação do efeito terapêutico do anticorpo BAT1806 humanizado contra o receptor da interleucina 6 em um modelo CIA: ESR: taxa de sedimentação de eritrócitos; *P<0,05
[0080] Figura 7B: avaliação do efeito terapêutico do anticorpo BAT1806 humanizado contra o receptor da interleucina 6 no modelo CIA: IL-6: interleucina 6; *P<0,05
[0081] Figura 7C: avaliação do efeito terapêutico do anticorpo BAT1806 humanizado contra o receptor da interleucina 6 no modelo CIA; IL-6R: receptor da interleucina 6; *P<0,05
[0082] Ilustrações (Figuras 7A a 7C):
[0083] Od: antes da modelagem; 28d: após a modelagem bem sucedida/antes da dosagem; 40d: Dia 7 pós-dosagem.
[0084] Figura 8A: estudo farmacocinético de injeção intravenosa do anticorpo BAT1806 humanizado contra o receptor da interleucina 6;
[0085] Figura 8B: estudo farmacocinético de injeção subcutânea do anticorpo BAT1806 humanizado contra o receptor da interleucina 6.
Descrição Detalhada da Invenção
[0086] A presente invenção fornece fórmulas para a formulação de anticorpo mediante a seleção de soluções de tampão e estabilizadores para melhorar a estabilidade da formulação de anticorpo humanizado contra o receptor da interleucina 6 e impedir a agregação, degradação de anticorpos monoclonais e aumento de isômeros ácidos.
[0087] Os termos como "estabilidade" e "estável", usados no presente documento, referem-se à situação que, em uma formulação líquida compreendendo um anticorpo (incluindo seus fragmentos de anticorpo),
o anticorpo (incluindo seus fragmentos de anticorpo) não se agrega, degrada ou fragmenta, ou se agrega, degrada ou fragmenta apenas raramente, em certas condições de produção, formulação, transporte e/ou armazenamento. A formulação "estável" mantém a atividade biológica em certas condições de produção, formulação, transporte e/ou armazenamento. A estabilidade do anticorpo, incluindo seus fragmentos de anticorpo, pode ser avaliada medindo o grau de agregação, degradação ou fragmentação e similares da formulação por técnicas, como SEC-HPLC, IEC-HPLC, CE-SDS, etc.
[0088] Deve ser observado que, na presente invenção, onde um tampão ou sistema de tampão é incluído em uma formulação, também significa que o tampão está incluído na formulação e o sistema de tampão é formado na formulação pelo tampão.
[0089] Em uma modalidade da invenção, a concentração do anticorpo monoclonal na formulação de anticorpo é de cerca de 2 a 100 mg/mL; como uma modalidade preferida, a concentração do anticorpo monoclonal na formulação de anticorpo é de 10 a 90 mg/mL; como uma modalidade mais preferida, a concentração do anticorpo monoclonal na formulação de anticorpo é de 15 a 50 mg/mL; como uma modalidade ainda mais preferida, a concentração do anticorpo monoclional na formulação de anticorpo é de 18 a 25 mg/mL; como uma modalidade particularmente preferida, a concentração do anticorpo monocilonal na formulação de anticorpo é de 18 a 22 mg/mL; como a modalidade mais preferida, a concentração do anticorpo monoclonal na formulação de anticorpo é de 20 mg/mL. Nesta modalidade, foram avaliados os efeitos de um total de seis sistemas de tampão, como tampão de fosfato (PB), tampão de histidina (His), tampão de citrato CB (NMS), tampão de fosfato + ácido acético (HAC), tampão de citrato + ácido acético, tampão de histidina + acetato de sódio (NaAC) sobre a estabilidade do anticorpo. Dentre esses tampões, o tampão de histidina e o tampão de histidina + acetato de sódio tiveram o melhor efeito, seguidos por tampão de citrato e tampão de fosfato+ácido acético e tampão de PB isoladamente que tiveram o pior efeito.
[0090] Em outra modalidade da invenção, a concentração do anticorpo monoclonal na formulação de anticorpo é de cerca de 2 a 100 mg/mL; como uma modalidade preferida, a concentração do anticorpo monoclonal na formulação de anticorpo é de 10 a 90 mg/mL; como uma modalidade mais preferida, a concentração do anticorpo monoclonal na formulação de anticorpo é de 15 a 50 mg/mL; como uma modalidade ainda mais preferida, a concentração do anticorpo monoclional na formulação de anticorpo é de 18 a 25 mg/mL; como uma modalidade particularmente preferida, a concentração do anticorpo monoclonal na formulação de anticorpo é de 18 a 22 mg/mL; como a modalidade mais preferida, a concentração do anticorpo monoclonal na formulação de anticorpo é de 20 mg/mL. Nesta modalidade, foi avaliado o efeito da adição de estabilizadores adequados, como sacarose (ZT), manitol (GLC), cloridrato de arginina (Arg-Hcl), prolina (Pro), cloreto de sódio (NaCl) ao tampão, sobre a estabilidade do anticorpo. A adição dos estabilizadores aumenta, adicionalmente, a estabilidade da formulação, com tipos diferentes de estabilizadores não possuindo diferenças significativas em seus efeitos sobre a estabilidade do anticorpo.
[0091] Em outra modalidade da invenção, a concentração do anticorpo monoclonal na formulação de anticorpo é de cerca de 2 a 100 mg/mL; como uma modalidade preferida, a concentração do anticorpo monoclonal na formulação de anticorpo é de 10 a 90 mg/mL; como uma modalidade mais preferida, a concentração do anticorpo monoclonal na formulação de anticorpo é de 15 a 50 mg/mL; como uma modalidade ainda mais preferida, a concentração do anticorpo monoclional na formulação de anticorpo é de 18 a 25 mg/mL; como uma modalidade particularmente preferida, a concentração do anticorpo monoclonal na formulação de anticorpo é de 18 a 22 mg/mL; como a modalidade mais preferida, a concentração do anticorpo monoclonal na formulação de anticorpo é de 20 mg/mL. Nesta modalidade, foi avaliado o efeito da adição de tensoativos adequados (detergentes), como polissorbato-20, polissorbato-80 e poloxâmero 188 à formulação contendo tampões e estabilizadores — adequados nas micropartículas insolúveis na formulação após repetidos ciclos de congelamento-descongelamento. Os tipos diferentes dos tensoativos mencionados anteriormente podem reduzir a geração de partículas insolúveis na formulação após congelamentos-descongelamentos, com tipos diferentes de tensoativos não possuindo diferenças significativas em seus efeitos.
[0092] As formulações preferidas foram escolhidas mediante a seleção de tampões, estabilizadores e tensoativos. Uma das fórmulas pode ser a seguinte: Quantidade eficaz de 20 mg/mL de anticorpo humanizado contra o receptor da interleucina 6, 10 mM de tampão de sal de histidina, 0,5 g/L de polissorbato-80, 50 mM de cloridrato de arginina, 20 g/L de sacarose, água para injeção, pH 6,0 a 6,4; outra fórmula pode ser a seguinte: Quantidade eficaz de 20 mg/ml de anticorpo humanizado contra o receptor da IL-6, 10 mM de tampão de sal de histidina, 0,5 g/L de polissorbato-80, 30 g/L de manitol; água para injeção, pH 6,0 a 6,4; outra fórmula pode ser a seguinte: Quantidade eficaz de 20 mg/mL de anticorpo humanizado contra o receptor da IL-6, mM de tampão de sal de histidina, 0,5 g/L de polissorbato-80, 42 g/L de manitol, água para injeção, pH 6,0 a 6,4; outra fórmula também pode ser a seguinte: Quantidade eficaz de 20 mg/ml de anticorpo humanizado contra o receptor da IL-6, 10 mM de cloridrato de histidina, 0,5 g/L de polissorbato-80, 100 mM de cloreto de sódio, água para injeção, pH 6,0 a 6,4; outra fórmula pode ser a seguinte: Quantidade eficaz de 50 mg/mL de anticorpo humanizado contra o receptor da interleucina 6, 10 mM de tampão de sal de histidina, 0,5 g/L de polissorbato-80, 50 mM de cloridrato de arginina, 20 g/L de sacarose, água para injeção, pH 6,0 a 6,4.
[0093] Dentre os vários ingredientes das formulações de anticorpo humanizado contra o receptor da IL-6 da presente invenção, o sistema de tampão funciona como um dos elos de controle mais críticos e, para garantir uma boa estabilidade, o sistema de tampão é preferencialmente um sistema de tampão de sal de histidina. Além de fornecer uma faixa de pH ideal para o anticorpo, o tampão também pode funcionar como um estabilizador e é necessário selecionar os tipos do tampão. As extensões nas quais as estabilidades dos diferentes tipos de anticorpos são afetadas por diferentes fatores são diferentes e os resultados também são diferentes. O projeto do sistema da formulação da presente invenção é de vários candidatos que os inventores desenvolveram com base em experiências extensivas. Contudo, os resultados experimentais finais ainda foram imprevisíveis ou necessitavam de testes de armazenamento em longo prazo. O sistema de tampão exógeno não tem um efeito importante sobre a estabilidade de todos os tipos de formulações de anticorpos, por exemplo, para outro anticorpo, como o adalimumabe, de acordo com o que é conhecido sobre os resultados de seleção de estabilidade, o fator mais crítico é a escolha do estabilizador, em vez do sistema de tampão, porque o efeito de tamponamento da alta concentração da própria proteína pode manter o pH dentro da faixa ideal durante o período de armazenamento.
[0094] De acordo com a avaliação da estabilidade, eficácia in vitro e in vivo, farmacocinética das formulações preferenciais anteriores, as formulações de anticorpo da presente invenção podem permanecer estáveis por pelo menos 6 meses em temperatura ambiente, 36 meses a 4ºC e permanecem estáveis após pelo menos 5 ciclos de congelamento-descongelamento. As formulações preferenciais descritas anteriormente possuem características farmacodinâmicas e farmacocinéticas similares in vivo e in vitro.
[0095] As formulações líquidas que contêm o anticorpo monoclonal fornecido pela invenção oferecem combinações de formulação capazes de armazenar os ingredientes ativos de maneira estável, e as fórmulas de formulação das formulações preferenciais são as seguintes, mostradas, respectivamente, como Formulações A, B, C, D E eF: Tabela 1A. Lista de Ingredientes da Formulação A do Anticorpo BAT1806 Humanizado contra o Receptor da Interleucina 6 . Quantidade na | Teor em 4 mL Nome do Ingrediente Função Fórmula de materiais Anticorpo BAT1806 Humanizado contra o Substância mg/mL 80 mg Receptor da ativa Interleucina 6 Histidina 1,008 g/L 0,004032 g Tampão Sal de cloridrato de | 0,/349/L 0,002936 g Tampão histidina Sal de cloridrato de 10,533 g/L 0,042132 g a o Estabilizador arginina Sacarose 20 g/L 0,08 g Estabilizador Polissorbato-80 0,5 g/L (0,05%) | 0,002 g Detergente Tabela 1B. Lista de Ingredientes da Formulação B do Anticorpo BAT1806 Humanizado contra o Receptor da Interleucina 6 Nome do | Quantidadena | Teor em4 mL de Função Ingrediente Fórmula materiais Anticorpo BAT1806 Humanizado contra Substância 20 mg/mL 80 mg o Receptor da ativa Interleucina 6
Sal de cloridrato de 0,734 g/L 0,002936 g Tampão histidina Manitol 30 g/L (3%) 0,120 g Estabilizador Polissorbato-80 0,5 g/L (0,05%) 0,002 g
[0096] Tabela 1C. Lista de Ingredientes da Formulação C do Anticorpo BAT1806 Humanizado contra o Receptor da Interleucina 6 Nome do Ingrediente Quantidade na | Teor em 4 mb Função Fórmula de materiais Anticorpo — BAT1806 Humanizado contra o Substância Receptor da 20 ma/mL so mg ativa Interleucina 6 Sal de cloridrato de | 0,734 g/L 0,002936 g Tampão histidina Manitol 42 g/L (4,2%) 0,168 g Estabilizador Polissorbato-80 0,5 g/L (0,05%) | 0,002 g
[0097] Tabela 1D. Lista de Ingredientes da Formulação D do Anticorpo BAT1806 Humanizado contra o Receptor da Interleucina 6 Nome do Ingrediente Quantidade Teor em 4 mb de Função na Fórmula materiais Anticorpo BAT1806 An: Humanizado — contra o| 20mg/ml 80 mg Substância ; ativa Receptor da Interleucina 6 Histidina 1,008 g/L 0,004032 g Tampão Sal i de cloridrato de| 0,/7349/L 0,002936 g Tampão histidina Cloreto de sódio | 5,859L 0,02349g — | Estabilizador Polissorbato-80 0,5 g/L 0,002 g Porssemanto = (0,05%) |uaees Detergente
[0098] Tabela 1E. Lista de Ingredientes da Formulação E do
Anticorpo BAT1806 Humanizado contra o Receptor da Interleucina 6 Nome do Ingrediente Quantidade na | Teor em 4 mb Função Fórmula de materiais Anticorpo BAT1806 Humanizado contra o Substância Receptor da 20 mg/ml. 80 mg ativa Interleucina 6 Sal de cloridrato de z histidina 1,01 g/L 0,00404 g Sal de cloridrato de) 953390 0,042132g | Estabilizador arginina Sacarose 20 g/L 0,08 g Estabilizador Polissorbato-80 0,5 g/L (0,05%) /0,002g Detergente
[0099] Tabela 1F. Lista de Ingredientes da Formulação F do Anticorpo BAT1806 Humanizado contra o Receptor da Interleucina 6 Quantidade — na | Teor em 4 mL Nome do Ingrediente Função Fórmula de materiais Anticorpo BAT1806 Humanizado contra o Substância 50 mg/mL 200 mg . Receptor da ativa Interleucina 6 Sal de cloridrato de 1,01 g/L 0,00404 g Tampão histidina Sal de cloridrato de o 10,533 g/L 0,042132 g Estabilizador arginina g/L 0,08 g Estabilizador Polissorbato-80 0,5 g/L (0,05%) /0,002g Detergente
[00100] Em suma, a presente invenção fornece uma fórmula de formulação de um anticorpo para proteger anticorpos monoclonais, que pode compreender 2 a 100 mg/mL de anticorpo, 5 a 20 mM de tampão de sal de histidina, 0,25 a 1 g/L de polissorbato-80 e um estabilizador selecionado do grupo de 50 a 120 mM de cloridrato de arginina em combinação com 10 a 50 g/L de sacarose, ou 10 a 50 g/L de manitol, ou 50 a 120 mM de cloreto de sódio, com um pH de 5,0 a 7,0. Uma fórmula preferida é conforme se segue: 20 mg/mL de anticorpo, 10 mM de tampão de sal de histidina, 0,5 g/L de polissorbato-80, 50 mM de cloridrato de arginina, 20 g/L de sacarose, hidróxido de sódio para ajuste de pH e água para injeção, pH 5,0 a 7,0 (abreviada como a Formulação A). Outra fórmula preferida é conforme se segue: 20 mg/ml de anticorpo, 10 mM de tampão de sal de histidina, 0,5 g/L de polissorbato- 80, 30 g/L de manitol, hidróxido de sódio para ajuste de pH e água para injeção, pH 5,0 a 7,0 (abreviada como a Formulação B). Outra fórmula preferida é conforme se segue: 20 mg/mL de anticorpo, 10 mM de tampão de sal de histidina, 0,5 g/L de polissorbato-80, 42 g/L de manitol, hidróxido de sódio para ajuste de pH e água para injeção, pH 5,0 a 7,0 (abreviada como a Formulação C). Outra fórmula preferida pode também ser conforme se segue: 20 mg/mL de anticorpo, 10 mM de tampão de sal de histidina, 0,5 g/L de polissorbato-80, 100 mM de cloreto de sódio, hidróxido de sódio para ajuste de pH e água para injeção, pH 5,0 a 7,0 (abreviada como a Formulação D). Outra fórmula pode ser a seguinte: 50 mg/mL de anticorpo, 10 mM de tampão de sal de histidina, 0,5 g/L de polissorbato-80, 50 mM de cloridrato de arginina, g/L de sacarose, hidróxido de sódio para ajuste de pH e água para injeção, pH 6,0 a 6,4 (abreviada como a Formulação F). Em suma, na formulação do anticorpo fornecida pela invenção, mediante a seleção de um sistema de tampão adequado, otimização de um estabilizador e adição de um tensoativo, o aumento de picos ácidos, agregados, degradantes e de partículas insolíóveis em um ciclo de congelamento/descongelamento, armazenamento em longo prazo e processo com mudança de temperatura e de luz, pode ser inibido efetivamente, e os ingredientes ativos podem ser armazenados de maneira estável por um longo tempo. Em que a seleção do sistema de tampão desempenha o papel mais importante para a estabilização da formulação e, em comparação com o tampão de fosfato, o tampão de sal histidina pode inibir significativamente a formação de isômeros ácidos, agregados e degradantes no processo de armazenamento em longo prazo e mudança de temperatura.
[00101] A solução técnica da presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos específicos, que não se destinam a limitar o escopo da presente invenção. Outras modificações e adaptações não essenciais da invenção, de acordo com o conceito inventivo, estão dentro do escopo da invenção.
[00102] Deve ser observado que na presente invenção, a "razão entre massa e volume" é a razão da massa dos ingredientes para o volume da formulação.
[00103] Um "sistema de tampão de sal de histidina" é uma combinação de histidina e cloridrato de histidina. Como uma modalidade preferida, um tampão contendo 0,81 g/L de histidina e 1,01 g/L de cloridrato de histidina é preferido. Amostra de anticorpo
[00104] O anticorpo BAT1I806 é um anticorpo humanizado contra o receptor da interleucina 6 preparado através da tecnologia de preparação de anticorpos. Uma linha de células CHO capaz de expressar estavelmente BAT1806 foi construída, e o sobrenadante foi coletado e purificado através da PROTEÍNA A. Exemplo 1 Preparação da Formulação
[00105] As formulações líquidas da presente invenção compreendendo um anticorpo monoclonal fornecem uma combinação de composições capaz de preservar o ingrediente ativo de maneira estável, e as fórmulas da formulação das soluções preferidas são mostradas na Tabela 1A, Tabela 1B, Tabela 1C, Tabela 1D, Tabela 1E e Tabela 1F.
[00106] O método para preparar a formulação de anticorpo fornecido pela invenção compreende as etapas de: (1) dissolver um tampão pesado, um estabilizador e um tensoativo em água para injeção; (2) ajustar o líquido preparado na etapa (1) com hidróxido de sódio aquoso até o pH ser 5 a 7; preferencialmente, a concentração de hidróxido de sódio aquoso é de 1 M; (3) filtrar o líquido preparado na etapa (2) em um recipiente asséptico; preferencialmente, o tamanho dos poros da membrana do filtro é de 0,22 um; e (4) adicionar o líquido preparado na etapa (3) a uma solução de anticorpo.
[00107] Como exemplo, o método da presente invenção para preparar 10 L de tampão para a Formulação A (sem o anticorpo BAT1806) foi o seguinte:
[00108] As quantidades a seguir de ingredientes foram pesadas: 10,08 g de histidina, 7,34 g de cloridrato de histidina, 105,33 g de cloridrato de arginina, 200 g de sacarose, 5 mL de polissorbato-80. O hidróxido de sódio foi dissolvido em água para injeção para obter uma solução de concentração que é de 1 M.
[00109] Os ingredientes pesados anteriormente foram dissolvidos em cerca de 9 L de água para injeção, sendo que a sequência de adição dos ingredientes da formulação não afeta a qualidade da formulação, podendo ser selecionada de modo flexível.
[00110] Após a adição dos ingredientes da formulação anterior, o pH foi ajustado pela adição de 1 M de hidróxido de sódio e, finalmente, foi adicionada água para injeção para atingir um volume constante de 10
L, e então, a formulação foi filtrada por meio de uma membrana de filtro de poli (fluoreto de vinilideno) hidrofílico de 0,22 um de tamanho de poro, depois disso, os 10 L da formulação anterior foram filtrados em um recipiente asséptico.
[00111] O método para preparar 10 L da Formulação A (contendo o anticorpo BAT 1806) como se segue:
[00112] Após a preparação do tampão filtrado assepticamente anteriormente para a Formulação A (sem o anticorpo BAT1806), o tampão anterior para a Formulação A foi adicionado a um concentrado de anticorpo. O concentrado de anticorpo foi descongelado em banho- maria (temperatura ambiente) antes da preparação da formulação líquida que contém o anticorpo. Assepticamente, o tampão para a Formulação A foi adicionado ao concentrado de anticorpo contendo um total de 200 g de anticorpo juntamente com agitação para obter a Formulação líquida A contendo o anticorpo da presente invenção.
[00113] Após a preparação da formulação líquida contendo o anticorpo, a formulação foi embalada para uso em frascos ou seringas preenchidas.
[00114] Oversado na técnica também entenderá que o peso, a razão entre peso e volume, a razão entre volume e volume referidos neste documento podem ser convertidos em moles e/ou concentrações molares usando pesos moleculares bem conhecidos dos ingredientes. O peso mencionado neste documento corresponde ao volume. O versado na técnica entenderá que os pesos podem ser ajustados proporcionalmente quando forem necessários volumes diferentes da formulação. Por exemplo, 16 L, 14 L, 12 L, 10 L, 5 L da formulação compreende 1,6, 1,4, 1,2, 1,0, 0,5 vez os pesos citados, respectivamente.
[00115] Os métodos para preparar as outras cinco formulações (Formulação B, Formulação C, Formulação D, Formulação E e
Formulação F) são similares ao método para preparar a Formulação A, e os reagentes pesados e seus pesos são ajustados de acordo.
Exemplo 2 Seleção do Tampão
[00116] Estudos de estabilidade do anticorpo foram realizados usando uma variedade de sistemas de tampão.
[00117] Com base na natureza dos anticorpos, os inventores determinaram empiricamente vários sistemas de tampão:
[00118] PB, L-His, CB(NMS), PBHHAC, CB+HAC, L-His+*NaAC
[00119] O significado de cada uma das abreviações anteriores é o seguinte:
[00120] PB:15mM de tampão de fosfato, pH 6,0 a 6,5
[00121] L-His: 10 mM de tampão de sal de histidina, pH 6,0 a 6,4
[00122] CB:10mM de tampão de citrato, pH 6,0 a 6,4
[00123] —PB+HAC:Tampão misto de 5 mM de fosfato + 5 mM de acetato de sódio, pH 6,0 a 6,4
[00124] —“CB+HAC: Tampão misto de 5 mM de citrato + 5 mM de acetato de sódio, pH 6,0 a 6,4
[00125] L-His+NaAÃAC: Tampão misto de 5 mM de sal de histidina + 5 mM de acetato de sódio, pH 6,0 a 6,4
[00126] O sistema anticorpo-tampão usado para a análise de estabilidade continha 20 mg/mL de anticorpo (BAT1806), 10 a 15 mM de tampão (veja a Tabela 2), pH6,0 a 6,4.
[00127] A tendência das várias fórmulas para alterar a pureza do monômero (SEC-HPLC, abreviado como SEC) e o isômero de carga (IEC-HPLC, abreviado como IEC) em alta temperatura de 40 ºC por 21 dias foi investigada, veja a Tabela 2.
[00128] Método de análise SEC-HPLC:
[00129] O artigo de teste foi diluído com água em uma solução de artigo de teste a 5 mg/mL. A coluna cromatográfica foi TSK-GEL G3000SWXL 7,8x300 mM, 5 um (TOSOH). A fase móvel foi 200 mM de
K3PO4 com 250 mM de KCI (pH 7,0). O comprimento de onda de detecção por UV foi definido em 280 nm, a temperatura da coluna foi de ºC, a quantidade de carregamento da amostra foi de 40 uL (200 pg de proteína), e o fluxo foi mantido por 35 minutos a uma taxa de 0,5 mL/min. A cromatografia foi registrada e, após a integração, o percentual de monômero e agregado na solução de amostra foi calculado pelo método de normalização de área.
[00130] “Método de análise IEC-HPLC:
[00131] O artigo de teste foi diluído com água em uma solução de artigo de teste a 5 mg/mL. Condições cromatográficas: coluna, TSK- GEL CM-STATO 4,6x100 mM, 7 um (TOSOH); fase móvel, fase móvel A (20 mM de ACES, pH 8,0) e fase móvel B (20 mM de ACES+200 mM de NaCl, pH 8,0); a quantidade de carregamento da amostra foi de 50 ug; o comprimento de onda de detecção por UV foi de 280 nm; a eluição por gradiente foi realizada de acordo com o gradiente de eluição fornecido abaixo por 45 minutos. A cromatografia foi registrada. E, após a integração, o percentual do pico principal, a região ácida e a região básica foram calculadas, respectivamente, usando um método de normalização de área de pico. (A cromatografia foi integrada manualmente, uma linha de base foi traçada em um local onde a linha de base foi relativamente plana, o tempo de início da integração e o tempo de término da integração foram cerca de 8 minutos antes e após o tempo de retenção do pico principal, as linhas verticais foram traçadas em dois vales de pico ao redor do pico principal, a região ácida foi antes do pico principal que foi seguido pela região básica (o pico principal foi seguido pelo pico básico 1, pico básico 2 e pico básico 3 na sequência) e uma linha vertical foi traçada em cada vale de pico da região básica.)
[00132] Gradientes de eluição
0% 100% 1,0 a dm mo os
[00133] De acordo com os resultados do teste anterior, foi selecionada a melhor fórmula como segue: solução tampão histidina, solução tampão sal de histidina + acetato de sódio; considerando que a histidina atua basicamente na faixa de pH de 6,0 a 6,4, e a faixa de pH para a capacidade de tamponamento do acetato de sódio é em torno de 4,5 a 5,8, a combinação teve bons resultados, atribuídos principalmente à presença do sal de histidina, e não houve diferenças importantes entre os resultados do sal de histidina isoladamente e sal de histidina + acetato de sódio. Se os resultados do tampão simples e do tampão combinado não fossem significativamente diferentes, escolheríamos a fórmula mais simples. Dessa maneira, a solução tampão mais adequada foi escolhida como sendo o tampão de sal de histidina. Após experimentos em alta temperatura, a agregação de SEC ou picos ácidos de IEC foram significativamente menores que os de outros tampões ou tampões combinados.
[00134] Para selecionar a concentração de sal de histidina, o tampão de sal de histidina foi preparado em concentrações que variam de 5 a mM, com concentração de proteína de 20 mg/mL, pH 6,0 a 6,4. As tendências de SEC e IEC após 21 dias de exposição à alta temperatura de 40 ºC foram investigadas, veja a Tabela 3. Pode-se observar que o tampão de histidina pode desempenhar um bom papel de proteção de tampão na faixa de 5 a 20 mM.
[00135] Para selecionar o pH ideal da formulação de tampão, o tampão de sal de histidina foi preparado a uma concentração de 10 mM,
com uma concentração de proteína de 20 mg/mL na faixa de pH 5,4 a 6,9. As tendências de SEC e IEC após 21 dias de exposição à alta temperatura de 40 ºC foram investigadas, veja a Figura 1. Conforme pode ser observado a partir do mapeamento dos dados de pico principal dos testes de SEC-HPLC e IEC, o pH na faixa de 5,7 a 6,2 poderia desempenhar um bom papel de proteção de tampão com o passar do tempo.
O pH 6,2 é melhor que o pH 6,0 e melhor que outro pH.
Os resultados mostraram que a amostra tinha uma estabilidade maior com pH 6,2. Tabela 2. Seleção do tampão da formulação em alta temperatura (40 ºC) ; z : PB CB L-His Tipo de tampão | e Jun] CBINNS) +HAC Concentração do tampão 15 10 10 10 10 10 (mM) pH 6,0-6,4 | 6,0-6,4 | 6,0-6,4 6,0-6,4 | 6,0-6,4 | 6,0-6,4 Concentração de anticorpo 20 20 20 20 20 20 ( mg/mL) Pico principal de SEC Dia O 98,38 98,59 98,36 98,51 98,38 98,47 (%) Pico principal de SEC Dia 21 95,81 97,39 97,34 97,01 96,92 97,20 (%) Agregação de 0,36 0,26 0,47 0,37 0,46 0,35 SEC Dia O (%) Agregação de SEC Dia 21 1,42 0,20 0,63 0,44 0,73 0,32 (%) Pico principal de IEC Dia O 76,58 76,57 76,52 76,81 76,53 76,64 (%) Pico principal de IEC Dia 21 50,56 62,24 59,60 59,39 60,56 61,92 (%) Pico ácido de IEC 17,83 | 17,90 17,92 17,71 18,02 17,94 Dia O (%)
Pico ácido de IEC 43,71 30,81 33,50 33,93 32,82 31,05 Dia 21 (%)
[00136] Tabela 3. Seleção da concentração de tampão de sal de histidina em alta temperatura (40 ºC) Concentração de sal 6,0-64 | 6,0-6,4 6,0-6,4 6,0-6,4 Concentração de Pico principal de SEC% 99,66 99,71 99,66 99,63 Dia O (%) Pico principal! de SEC% 96,57 97,92 97,59 97,55 Dia 21 (%) Pico principal! de IEC% 76,43 76,52 76,49 76,51 Dia O (%) Pico principal! de IEC% 62,23 61,52 62,49 61,51 Dia 21 (%) Exemplo 3 Seleção do Estabilizador
[00137] No sistema para seleção do estabilizador, os anticorpos, tampões e estabilizadores incluídos são mostrados na Tabela 4.
[00138] Astendências de alterações de pureza do monômero (SEC- HPLC, abreviado como SEC) e isômeros de carga (IEC-HPLC, abreviado como IEC) das várias fórmulas foram investigadas nas condições de 25 ºC, 40 ºC, 50 ºC e luz por 3 meses, conforme mostrado na Tabela 4. A análise é descrita no Exemplo 2.
[00139] Os estabilizadores comuns nas formulações de anticorpo são álcoois de açúcar, aminoácidos, sais e similares. O estabilizador pode estabilizar a estrutura do anticorpo e reduzir a agregação, degradação de moléculas de proteína e a formação de isômeros de carga ácida sob a ação de força externa. O anticorpo é relativamente estável nas formulações da composição de sistemas de tampão diferentes, como PB, His e NaAC, e de estabilizadores diferentes, como sacarose (ZT), manitol (GLC), cloridrato de arginina (Arg-Hcl), prolina (Pro) e cloreto de sódio (NaCl). Os resultados sob condições de testes de alta temperatura de 40 graus, de alta temperatura de 50 graus e de iluminação são mostrados nas Figuras 2 a 4, respectivamente. Na condição de alta temperatura, a classificação de desempenho do estabilizador foi a seguinte: GLC = Arg-HCI+ZT, Arg-HCI, ZT, NaCl, Pro; em que o pico principal de SEC foi analisado na condição de luz, a classificação de desempenho do estabilizador foi a seguinte: Arg- HCI+ZT >= Pro >= Arg-HCl = ZT > GLC > NaCl; mediante a aná lise do pico principal de IEC na condição de luz, a classificação de desempenho do estabilizador foi a seguinte: Arg-HCIl >= Arg-HCI + ZT > Pro > ZT > GLC > NaCl. Após um teste de estabilidade acelerada a 25º C por 3 meses, em tampão de sal de histidina (His), a estabilidade de vários estabilizadores na agregação e degradação de proteína mostrou-se semelhante, mas quanto ao aspecto de redução da formação de isômeros ácidos, a classificação de desempenho do estabilizador foi a seguinte: Arg-HCI, NaCl, GLC, ZT e Pro na sequência de alto a baixo. Por meio de teste do efeito da temperatura e da luz sobre a estabilidade do anticorpo, a combinação ideal de tampão e estabilizador foi selecionada conforme se segue: Tampão com 10 mM de histidina, 50 mM de cloridrato de arginina, 2% de sacarose; outra combinação foi conforme segue: Tampão com 10 mM de sal de histidina, 3% de manitol; outra combinação foi conforme se segue: Tampão com 10 mM de sal de histidina, 4,2%» de manitol; outra combinação pode também ser conforme se segue: Tampão com 10 mM de sal de histidina, 100 mM de cloreto de sódio.
[00140] Além disso, após um teste de estabilidade acelerada a 25 ºC por 3 meses, comparando o grupo do sal de histidina (His) sem estabilizador com o grupo ZT (His) com estabilizador, os picos principais de SEC foram 97,06% e 97,76%, respectivamente, e os picos principais de IEC foram 61,94% e 63,17%, respectivamente, depois de transcorridos três meses; pode ser observado que no grupo His (sal de histidina), com situações com e sem estabilizadores comparados, o pico principal de SEC aumentou cerca de 0,7%, o pico principal de IEC aumentou cerca de 2%; comparando o grupo PB sem estabilizador e o grupo ZT (PB) com estabilizador, os picos principais de SEC foram 95,51% e 96,11%, respectivamente, e os picos principais de IEC foram 50,26% e 55,10%, respectivamente, depois de transcorridos três meses.
Dessa maneira, no grupo PB, com situações com e sem estabilizadores comparados, os picos principais de SEC aumentaram cerca de 0,6% e os picos principais de IEC aumentaram cerca de 5%, respectivamente; sem estabilizador e usando diferentes sistemas de tampão, os picos principais de SEC do grupo PB e do grupo His (sal de histidina) foram 95,51% e 97,06%, respectivamente, e os picos principais de IEC foram 50,26% e 61,94%, respectivamente, depois de transcorridos trêê meses.
Comparados ao tampão de PB, os picos principais de SEC do tampão de sal de histidina (His) aumentaram cerca de 1,5% e o pico principal de IEC aumentou cerca de 11%. Conforme pode ser observado, a seleção de um tampão adequado foi muito importante para manter a estabilidade do anticorpo, e o tampão desempenhou um papel importante na redução da alteração estrutural do anticorpo e no aumento da pureza do pico principal.
Veja a Tabela 4.
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Exemplo 4 Seleção de Tensoativo
[00141] Nosistema de seleção do tensoativo, o anticorpo, o tampão, o estabilizador, o tensoativo incluídos são mostrados na Tabela 5.
[00142] Onúmero de partículas insolúveis em cada fórmula após três ciclos de congelamento-descongelamento a -20ºC a 4ºC foi investigado.
[00143] O método para determinar a quantidade de partículas insolúveis foi implementado de acordo com a Regra Geral 0903 do Quarto Volume da Farmacopeia da República Popular da China 2015: Insoluble Microparticle Test. Depois que o instrumento foi limpo para atender ao padrão, foram levados 4 frascos de artigos de teste para uma bancada ultralimpa, a parede externa do recipiente foi limpa com água, o recipiente foi cuidadosamente invertido por 20 vezes, a mistura foi uniformemente misturada, a mistura foi deixada repousar por 2 minutos para desgaseificação, a amostra foi colocada em um analisador, cada frasco foi medido uma vez pelo instrumento e a quantidade de injeção da amostra de cada frasco foi de 3,0 mL. Após a medição sequencial de 4 frascos de amostras, foi obtida a média dos dados dos 3 últimos frascos para calcular o número total de partículas contidas em cada frasco de amostras.
[00144] Nas formulações de anticorpos, as partículas insolúveis são prontamente produzidas após um ciclo de congelamento/descongelamento e podem ser evitadas pela adição de uma certa quantidade de tensoativo. O tensoativo comum é o tensoativo não iônico, como: polissorbato-20, polissorbato-80 e poloxâmero 188. Neste exemplo, 0,1% de polissorbato-20, 0,05% de polissorbato-80 ou 0,1% de poloxâmero 188 foram adicionados à formulação contendo tampão e estabilizador, respectivamente, e foi observado o número de partículas insolúveis após três congelamentos-descongelamentos a -20 ºC a 4 ºC. Os resultados mostraram que todos os três tensoativos podem inibir a produção de partículas insolúíóveis por congelamento-
descongelamento, e os efeitos foram semelhantes, conforme mostrado na Tabela 5. Tabela 5. Seleção do Tensoativo para o Anticorpo Humanizado contra o Receptor da Interleucina 6 (-20ºC a 4ºC, 3 ciclos de congelamento- descongelamento) Polissorbato-20 | Polissorbato-80 Poloxâmero 188 Tampão com 10 | Tampão com 10 |/Tampão com 10 Tampão mM de sal de mM de sal deimM de sal de histidina histidina histidina Estabilizador 4,2% de manitol | 4,2% de manitol | 4,2% de manitol Tensoativo 0,1% de | 0,05% de | 0,1% de polissorbato-20 | polissorbato-80 poloxâmero 188 6,0-6,4 6,0-6,4 6,0-6,4 Concentração de anticorpo |/20 20 20 ( mg/mL) Partículas insol ú veis = 10um (partícula/mL) Partículas insol ú veis = 1 1 25um (partícula/mL) Exemplo 5 Estudos de Congelamento-Descongelamento
[00145] Formulação A, Formulação B, Formulação C, Formulação D do anticorpo BATI1806 com uma concentração de anticorpo de 20 mg/mL e Formulação F do anticorpo BAT1806 com uma concentração de 50 mg/mL foram preparadas conforme descrito no Exemplo 1. Para as Formulações A, B, C, D, cinco ciclos de congelamento- descongelamento foram repetidos a -20 ºC a 4 ºC, para a Formulação F, cinco ciclos de congelamento-descongelamento foram repetidos a - ºC até a temperatura ambiente, a concentração do anticorpo foi testada pelo método ELISA e foi investigada a estabilidade do teor de anticorpo na solução da formulação após cinco ciclos de congelamento- descongelamento. Além disso, as Formulações A, B, C, D foram submetidas a congelamentos-descongelamentos rápidos e lentos a -20 ºC a 4 ºC, -20 ºC a 37 ºC, -80 ºC a 4 ºC, -80 ºC a 37 “ºC durante cinco ciclos, respectivamente, e para a Formulação F, cinco ciclos de congelamento- descongelamento foram repetidos a -20 ºC até a temperatura ambiente, e foram observadas alterações na transparência, cor, pH, partículas insolúveis, SEC, IEC e atividade celular.
[00146] O método de teste ELISA é descrito conforme se segue: o receptor humano da interleucina 6 recombinante de antígeno (rhlL-6R) (1 ug/mL, 100 uL por poço) foi revestido; e foi bloqueado com PBS contendo 5% de BSA; as formulações A, B, C e D do anticorpo BAT1806 foram diluídas 1 x 10º vezes, respectivamente, 100 ul por poço e 5 poços foram carregadas respectivamente com anticorpos diluídos para cada grau; a concentração inicial do padrão foi de 1 ug/mL e o padrão foi submetido a 8 gradientes de diluição com PBS contendo 2% de BSA duas vezes; uma curva padrão foi traçada e uma IgG kapa-HRP anti- humana de camundongo foi usada como anticorpo secundário para o teste Elisa.
[00147] Ométodo de teste da atividade celular é brevemente descrito a seguir: o padrão do anticorpo BAT1806 humanizado contra o receptor da interleucina 6 foi usado como padrão, a concentração inicial foi de 20 upg/mL, que foi diluída por gradiente e adicionada a uma placa com 96 poços a 50 ul por poço. A amostra a ser testada também foi diluída de acordo com o método de diluição de amostra por curva padrão e adicionada a uma placa com 96 poços a 50 uL por poço. hiIL-6 foi diluído para 4 ng/mL e adicionado a uma placa com 96 poços a 50 uL por poço. As células TF-1 em fase de crescimento logarítmico foram inoculadas em uma placa com 96 poços a 100.000 células/poço/100 uL, e foram incubadas por 72 horas em uma incubadora com 5% de CO,» a 37 graus.
Foi adicionado o reagente Celltiter Glo a 50 yL por poço. Após repousar durante 2 horas na ausência de luz à temperatura ambiente, os dados das microplacas foram lidos pelo método CelltiterGlo em um leitor de microplacas (Molecular Devices SpectraMax). Foram utilizados quatro parâmetros para ajustar o valor da curva C (IC50) e de acordo com a equação: atividade específica relativa = [IC50 do padrão/IC50 da amostra de teste] x 100%, se os resultados calculados fossem de 80% a 125%, a atividade da amostra foi considerada normal.
[00148] Os resultados mostraram que a taxa de recuperação variou de 97,5% a 1024% após cinco ciclos de congelamento- descongelamento das formulações do anticorpo BAT1806. Isso indica que o teor de anticorpos ficou basicamente inalterado após cinco ciclos de congelamento-descongelamento em uma condição congelada, veja as Tabelas 6A, 6B, 6C, 6D e 6E. Embora a formulação do anticorpo tenha descongelado rápida ou lentamente de -20 ºC ou -80 ºC e tenha sido submetida a cinco ciclos de congelamento-descongelamento, a transparência, cor, pH, partículas insolúveis, SEC, IEC e atividade celular não foram obviamente alteradas, o que significa que a característica da amostra foi estável no teste repetido de congelamento-descongelamento, não foi gerado nenhum precipitado, a proteína basicamente não foi adsorvida e as características das amostras não foram afetadas. Além disso, a pureza de SEC-HPLC, o teor do pico principal de IEC-HPLC e outros itens de teste das amostras também não mostraram alterações óbvias, e a atividade dos cinco ciclos de congelamento- descongelamento estavam todas dentro de uma faixa aceitável.
[00149] Vejaas Tabelas7A, 7B,7C,7De7E. Tabela 6A. Teor de Anticorpo após Cinco Ciclos de Congelamento- Descongelamento da Formulação A (-20 ºC a 4ºC)
Teor de Teor de Teor de Teor de Teor de Anticorpo Anticorpo Anticorpo Anticorpo Anticorpo após Um após Dois após Três após Quatro | após Cinco Ciclo de Ciclos de Ciclos de Ciclos de Ciclos de Ciclos | Congela- | Congelamento) Congelamen- | Congelamen-| Congela- mento- - to- to- mento- Desconge- | Descongela- | Descongela- | Descongela- | Desconge- lamento mento da mento da mento lamento ( mg/mL) ( mg/mL) ( mg/mL) ( mg/mL) ( mg/mL) a | 20,12 20,28 21,23 20,28 18,72 20,96 19,23 19,12 21,09 19,33 18,97 18,67 20,56 18,72 20,19 19,05 21,03 18,98 19,03 19,78 20,07 20,12 20,02 20,06 20,56 | Média | 19,83 19,87 19,98 19,84 19,72 so [os To os [os [or | [Re | sz | sos Ts 2 1 ss |
[00150] Tabela 6B. Teor de Anticorpo após Cinco Ciclos de Congelamento-Descongelamento da Formulação B (-20 ºC a 4 ºC) Teor de Teor de Teor de Teor de Teor de Anticorpo Anticorpo Anticorpo Anti «dd Anticorpo A x ; x a nticorpo após se após Um após Dois após Três Quatro Ciclos após Cinco Ciclo de Ciclos de Ciclos de d Ciclos de : e Ciclos | Congelam | Congelamento| Congelament Congelame Congelamento ento- - o- - nto- Descongel | Descongelam| Descongela D Descongela escongelame amento ento da mento da nto ( mg/mL) mento ( mg/mL) ( mg/mL) ( mg/mL) 9 ( mg/mL) 1 21,28 18,78 19,78 20,39 19,71 20,37 19,98 20,54 18,12 19,83 3 19,23 20,75 21,75 21,32 20,79 4 20,03 21,56 18,23 19,53 19,98 18,97 20,34 19,67 20,36 20,56 | média | 19,98 20,28 19,99 19,94 20,17 so | om 129 1º [om
Tabela 6C.
Teor de Anticorpo após Cinco Ciclos de Congelamento- Descongelamento da Formulação C (-20 ºC a 4 ºC) Teor de Teor de Teor de Teor de Teor de Anticorpo Anticorpo Anticorpo Anticorpo Anticorpo após Um após Dois após Três após Quatro após Cinco Ciclo de Ciclos de Ciclos de Ciclos de Ciclos de Ciclos Congela- | Congelamen- | Congelamen- | Congelamen- | Congelamen- mento- to- to- to- to- Descongela | Descongela Descongela Descongela | Descongela mento mento da mento da mento mento ( mg/mL) ( mg/mL) ( mg/mL) ( mg/mL) ( mg/mL) Tabela 6D.
Teor de Anticorpo após Cinco Ciclos de Congelamento- Descongelamento da Formulação D (-20 ºC a 4 ºC) 22222 Anticorpo Anticorpo Anticorpo Anticorpo Anticorpo após Um após Dois após Três após Quatro após Cinco Ciclo de Ciclos de Ciclos de Ciclos de Ciclos de Ciclos Congela- | Congelamen- | Congelamen- | Congelamen- | Congelamen- mento- to- to- to- to- Desconge- Desconge- Desconge- Desconge- Desconge- lamento lamento da lamento da lamento lamento ( mg/mL) ( mg/mL) ( mg/mL) ( mg/mL) ( mg/mL)
[00151] Tabela 6E. Teor de Anticorpo após Cinco Ciclos de Congelamento-Descongelamento da Formulação F (-20 ºC até a temperatura ambiente) Teor de Teor de Teor de Teor de Teor de Anticorpo Anticorpo Anticorpo Anticorpo Anticorpo após Um após Dois após Três após Quatro após Cinco Ciclo de Ciclos de Ciclos de Ciclos de Ciclos de Ciclos Congela- | Congelamen- | Congelamen- | Congelamen- | Congelamen- mento- to- to- to- to- Descongel | Desconge- Desconge- Desconge- Desconge- amento lamento da lamento da lamento lamento
ESSE e | e | se es | ss Tabela 7A. Resultados dos Cinco Testes de Congelamento- Descongelamento Rápido/Lento para a Formulação A Sem ; ; Cinco Cinco Cinco teste descongela- 4º 20'C a 80"C a 80 a mento 37ºC 4º 37ºC
6,0-6,4 6,0-864 | 60-64 | 6,0-64 | 6,0-64 Partículas insolúveis = um n 13 10 1 (partícula/mL) Partículas O Amouas insoXgveis ? 1 2 1 3 1 (partícula/mL) Srncipaioo 99,15 98,64 98,55 98,77 98,42 prinelna 73,23 73,21 73,26 73,17 73,29 Celular 0) 98,2% 107,9% | 1043% | 97,2% 95,8% apeia BR esultados os inco estes e ongelamento- Tabel 7B.
R Itad d C Test: de Congel t Descongelamento Rápido/Lento para a Formulação B con en - Cinco Cinco Cinco Cinco Parâmetros do 9 ciclos de - | ciclos de - | ciclos de - | ciclos de - teste 20ºCa- | 20ºCa | 80ºCa | 80ºCa descongela- 4ºC 37 ºC 4ºC 37 ºC mento 6,0-6,4 6,0-864 | 60-64 | 6,0-64 | 6,0-64 Partículas insolveis ? 10 12 10 (partícula/mL) Partículas insolúveis = Bum 2 1 1 2 3 (partícula/mL) Sncipal o. 99,44 98,87 98,79 98,82 98,58 prinelna 72,16 72,09 | 72,19 72,17 72,10 Celular (2%) 110,2% 1049% | 946% | 1025% | 989%
Tabela 7C.
Resultados dos Cinco Testes de Congelamento- Descongelamento Rápido/Lento para a Formulação C Sem Cinco Cinco Cinco Cinco Parâmetros congelamento- ciclos de - | ciclos de - | ciclos de - | ciclos de - do teste descongelame 20ºCa 20ºCa 80ºCa 80ºCa nto 4ºC 37 ºC 4ºC 37 ºC 6,0-6,4 6,0-64 | 6,0-64 | 60-64 | 6,0-64 Partículas inso- láveis = 10um 10 12 10 n (partícula/mL) Partículas inso- lúveis =25uUum 1 2 1 1 1 (partícula/mL) SEC - pico 99,12 98,60 98,57 98,52 98,62 principal % IEC - pico 73,56 73,62 73,43 73,82 73,49 principal % Atividade 105,8% 99,7% 112,5% 108,3% 95,7% celular (%) Tabela 7D.
Resultados dos Cinco Testes de Congelamento- Descongelamento Rápido/Lento para a Formulação D Sem ; ; ; ; - Cinco Cinco Cinco Cinco Parâmetros congelamento ciclos de - | ciclos de - | ciclos de - | ciclos de - do teste 20ºCa- 20ºCa 80 Ca 80ºCa descongela- 4ºC 37 ºC 4ºC 37 ºC mento 6,0-6,4 6,0-6,4 6,0-6,4 6,0-6,4 6,0-6,4 Partículas insolíveis= 10um (partícula/ 13 10 mL)
Partículas insolíveis= 25um 1 2 2 1 2 (partícula/ mL) SEC - pico 98,21 97,60 98,35 98,92 97,62 principal % IEC - pico 73,78 73,25 73,33 73,62 73,94 principal % Atividade 103,1% 95,7% 102,8% | 983% 92,8% celular (%) Tabela 7E.
Resultados dos Cinco Testes de Congelamento- Descongelamento a - 20 ºC até a Temperatura Ambiente para a Formulação F Congelada de -20 ºC por 24 horas, descongelada à temperatura Condição do teste ambiente, deixada repousar por 24 horas (um ciclo de congelamento-descongelamento) Item do teste 0º ciclo 1º ciclo | 2º ciclo | 3º ciclo clara clara clara clara clara nenhum | nenhum | nenhum | nenhum clara Características da nenhuma a a a a nenhuma solução matéria matéria | matéria | matéria | matéria matéria estranha | estra- estra- estra- estra- | estranha nha nha nha nha agregado 0,24 0,26 0,25 0,25 SEC- pureza do . 99,66 99,63 99,65 99,65 99,64 99,64 HPLC (%) | monômero região o 25,40 25,99 25,70 25,63 25,78 25,14 ácida IEC- pico o 70,34 69,77 70,28 70,59 70,38 71,19 HPLC (%) principal picos 4,26 4,24 4,03 3,78 3,84 3,67 básicos Atividade celular (%) 118,2% 101,9% 87,5% 107,7% 85,7% 73,71%
CE-SDS insolúveis mL) Exemplo 6 Estudos Microbiológicos
[00152] São necessários estudos microbiológicos de formulações farmacêuticas (Formulações A, B, C, D) para determinar se as formulações estimulam o crescimento microbiológico. O crescimento microbiológico geral das formulações inoculadas foi examinado inoculando micro-organismos diretamente nas formulações assépticas (por exemplo, Staphylococcus aureus, ATDD-NO: 6538p, Candida albicans, ATDD-NO: 10231, Aspergillus niger, ATDD-NO: 16404, isolado ambiental) em baixos níveis (NMT100 cfu/mL). Os indicadores da avaliação incluíram principalmente a alteração de turbidez e o número de micro-organismos sob o microscópio, onde a falta de turbidez foi um indicador de nenhum crescimento geral, e foi testado nos recipientes inoculados após 14 dias. Além disso, os micro-organismos não puderam ser novamente isolados a partir desses frascos. A Tabela 8 mostrou que as formulações não estimularam o crescimento microbiológico se armazenadas por 14 dias em temperatura ambiente de 20 a 25"C. Tabela 8. Teste de Micro-organismos na Formulação do Anticorpo BAT1806 Humanizado contra o Receptor da Interleucina 6
Parâme- Número de micro- Turbidez/NTU tros do organismos teste cfu/ml Tipo de | Formu- | Formu- | Formu- | Formu- | Formu- | Formu- | Formu- | For- formula- [lação A | lação | lação | lação |laçãoA| lação [lação C| mula- ção B Cc D B ção
D Bactéria Staphylo coccus aureus Bactéria Candida albicans Aspergill - us niger Pseud- omonas aerugi- nosa "." significa que a turbidez não mudou Exemplo 7 Estudos de Estabilidade em Condições de Aceleração
[00153] As Formulações farmacêuticas A, B, C, D, E e F foram formuladas de acordo com o método do Exemplo 1. As seis formulações foram colocadas em incubadora bioquímica por 6 meses na condição de (25+2) “ºC e amostradas ao final de 0º, 1º, 2º, 3º e 6º meses, respectivamente. As amostras foram examinadas em relação à pureza do monômero (SEC-HPLC), isômero de carga (IEC-HPLC), eletroforese em gel capilar não redutora (CE-SDS-NR), micropartículas insolúveis e atividade celular de acordo com os principais itens do exame de estabilidade (veja a tabela 9). Além disso, para a Formulação F, a característica da solução, o pH e o teor de anticorpo nas condições de aceleração também foram investigados.
[00154] A pureza do monômero (SEC-HPLC), isômero de carga (IEC-HPLC) foram determinados como descrito no Exemplo 2. Método de análise de (CE-SDS-NR): a amostra recombinante foi diluída a 4 mg/mL com água, foram retirados 25 ul da solução da amostra diluída, 70 ul de tampão de amostra CE-SDS e 5 ul de solução aquosa de iodoacetamida a 0,25M foram adicionados, a solução foi misturada uniformemente e aquecida em banho-maria a 65 ºC por 4 minutos e transferida para um frasco de amostra para obter uma solução de trabalho de referência. A amostra foi introduzida com tensão de -5,0kV por 10s, depois separada e analisada com tensão de -15kV. A cromatografia foi registrada e integrada automaticamente dentro de 14 a 35 minutos. O pico principal foi o pico cromatográfico de toda a proteína do anticorpo, o pico de impureza antes do pico principal foi o pico cromatográfico da fração (incluindo pico L, pico H, picos HL, HH e HHL) e o teor percentual do pico monomérico foi calculado pelo método de normalização da área. O método de análise de micropartículas insolúveis é descrito no Exemplo 4. O método de análise da atividade celular é descrito no Exemplo 5.
[00155] Os resultados são mostrados na Tabela 9. Pode ser observado na Tabela 9 que, em condições de aceleração, a pureza do monômero diminuiu com o tempo ao longo de 6 meses, indicando que os agregados foram produzidos sob as condições de aceleração, mas o pico principal de SEC do anticorpo diminuiu não mais que 2,28%; no que diz respeito à IEC-HPLC, na condição de 25 ºC, o teor dos principais picos de IEC do anticorpo diminuiu e a tendência de degradação foi basicamente a mesma, e o pico principal de IEC não diminuiu mais que 16,54%; o pico principal de CE-SDS-NR diminuiu não mais que 2,1%, as partículas insolúveis foram muito inferiores aos padrões qualificados, as substâncias ativas das células não mudaram obviamente, o que indica que as formulações do anticorpo ainda podem manter a estabilidade dentro de 6 meses à temperatura ambiente.
[00156] As características da solução, o pH e os resultados da concentração de anticorpo para a Formulação E são mostrados na Tabela 10. A partir dos dados da tabela, pode-se observar que, em comparação com o dia O, após 6 meses na condição de 25 ºC, a amostra ainda foi um líquido claro e transparente, não apareceu matéria estranha visível, o pH e a concentração de anticorpo da amostra não mudaram significativamente, indicando que a amostra estava estável no teste de aceleração.
Tabela 9. Estudos de Estabilidade em Condições de Aceleração (25+2) ºC Pico principal de SEC-HPLC % o eme mes Tosos [Temos | meses |meses |meses Pico principal de IEC-HPLC % eme mes Tosa [Temos | meses |meses |meses Pico principal de CE-SDS-NR % o fem ms Eos [eso | meses |meses |meses
Partículas insolúveis 10um (partícula/mL) : meses |meses | meses n Partículas insolúveis =25um (partícula/mL) o fe 1 fm [oa |: meses |meses | meses [Fomuaçãoa do rr e [Fomuaçãoo — jo e [Formação E a a Atividade celular % Co ore me Tomas [rasas |) meses |meses | meses Tabela 10. Estudos de Estabilidade em Condições de Aceleração para a Formulação E (25+2) ºC ou clara clara clara clara clara Características da | nenhum | nenhum | nenhum | nenhum | nenhum solução a matéria | a matéria / a matéria | a matéria | a matéria E che estranha Concentração de
[00157] Apartir dos dados da tabela anterior, pode-se observar que, para a Formulação E, em comparação com o dia O, após 6 meses na condição de 25 ºC, a amostra ainda foi um líquido claro e transparente, não apareceu matéria estranha visível, o pH e a concentração de anticorpo da amostra não mudaram significativamente, indicando que a amostra foi estável no teste de aceleração.
[00158] Os perfis de tendênciaSEC, EC e CE (não reduzidos) para as Formulações E e F a 25ºC na condição de aceleração são mostrados em sequência nas Figuras 5A a 5C. Comparando as Formulações E e F (ambas são da mesma fórmula, com duas concentrações diferentes de anticorpo), as tendências de degradação dos principais picos de SEC, IEC e CE (não reduzidos) foram as mesmas após 6 meses a 25 ºC no teste de aceleração, a pureza do monômero do pico principal da SEC foi superior a 96,5%, o pico principal da CE (não reduzido) foi superior a 94%, e o pH, as partículas e a atividade biológica estavam todos de acordo com os padrões de qualidade, o que indicava que a fórmula foi estável em relação a diferentes concentrações de anticorpo.
Exemplo 8 Estudos de Estabilidade em Longo Prazo
[00159] As Formulações farmacêuticas A, B, C, D foram formuladas de acordo com o método do Exemplo 1. As quatro formulações anteriores foram colocadas a 4 ºC durante 36 meses e amostradas no final dos 0º, 3º, 6º, 9º, 12º, 24º, 30º e 36º meses, respectivamente.
As amostras foram examinadas em relação à pureza (SEC-HPLC), isômero de carga (IEC-HPLC), eletroforese em gel capilar não redutora (CE- SDS-NR), micropartículas insolúveis e atividade celular.
Os resultados são mostrados na Tabela 11. Conforme pode ser observado na Tabela 11, as formulações de anticorpo da presente invenção mantêm a estabilidade em longo prazo a 4 ºC e estavam estáveis no 36º mês.
Tabela 11. Estudos de Estabilidade em Longo Prazo a 4 ºC Pico principal de SEC-HPLC % | Jomes nãos [medos | mitos | mis | mês | mêêss | O mês meses meses meses meses meses meses | Formulação | 99,45 | 99,47 | 99,28 | 99,23 | 99,52 | 98,79 | 98,21 Formulação 99,23 | 99,34 | 99,29 | 99,41 | 99,19 | 98,72 | 98,11 Formulação 99,39 | 99,27 | 99,41 | 99,28 | 99,37 | 99,12 | 98,24 Formulação 99,21 | 99,25 | 99,18 | 99,15 | 99,05 | 98,53 | 98,23 Pico principal de IEC-HPLC%, mes meses meses meses meses meses meses Formulação 76,82 | 75,51 | 74,23 | 73,19 | 72,12 | 70,83 | 69,79 Form tação 76,75 | 75,51 | 74,28 | 74,12 | 72,97 | 71,12 | 70,29 Form tação 76,84 | 75,98 | 75,12 | 74,23 | 7311 | 71,98 | 70,12 Formulação | 76,79 | 75,62 | 74,32 | 73,57 | 72,19 | 70,52 | 68,91 Pico principal de CE-SDS-NR % PO [om] netos [miles | mitos mé&os | mês | nêêss | meses meses meses meses meses meses
Formulação | 95,9 | 972 | 971 | 965 | 968 Formulação | 974 | 971 | 972 | 967 | or | 950 | s51 | Partículas insolúveis >=10um (partícula/mL) meses meses meses meses meses meses Partículas insolúveis =25um (partícula/mL) Po [om neles [miles | mitos mé&s | mês | nê&ss | meses meses meses meses meses meses Formulação mp ? ? º ENENENEN
B Cc
D Atividade celular % O mês 3 6 9 12 24 36 meses | meses | meses | meses | meses | meses Formulação 1014 oo os o Formulação Formulação Cc 105,8 90,3 82,0 98,6 116,0 107,4 Formulação 102,4 17? Exemplo 9 Estudos de Estabilidade em Condições de Alta Temperatura e Luz
[00160] As Formulações E e F do Exemplo 1 foram submetidas a estudos de alta temperatura e luz para investigar a estabilidade das formulações em condições de alta temperatura e luz. O método de teste é descrito nos outros exemplos. Tabela 12. Resultados do Teste em Condições de Alta Temperatura para a Formulação E clara clara clara clara clara ne- nenhu- nenhu- nenhu- nenhuma nhuma ma ma ma matéria Características da solução matéria | matéria — matéria | matéria estranha estra- estra- estra- estranha nha nha nha Concentração de anticorpo 22,82 22,77 22,55 22,19 22,11 (mg/mL) 0,43 0,40 0,46 0,52 0,53 SEC-HPLC pureza do . 99,23 99,38 97,95 97,24 26,71 (Y%) monômero região ácida 22,21 | 26,23 31,32 | 36,83 | 40,70 IEC-HPLC —————— (%) pico principal 73,46 69,05 64,27 57,58 54,36 h Atividade celular (%) 98,4% 102,7% 90,9% |102,7% |95,7% CE-SDS (não reduzido, %) 95,5 | 95,2 93,76 | 93,82 | 92,58 insolúveis (partícula ml) [mem e e e Jo
[00161] A partirdos dados da tabela anterior, pode-se observar que, após 28 dias em condição de 40 ºC, em comparação com o Dia 0, a amostra ainda foi um líquido claro e transparente, não apareceu matéria estranha visível, e o pH e a concentração de anticorpo da amostra não tiveram nenhuma alteração óbvia, indicando que a amostra estava estável no teste de degradação forçada. No que diz respeito a SEC- HPLC, a pureza do monômero diminuiu com o tempo na condição de 40 “ºC por 28 dias, indicando a formação de agregado em alta temperatura; no que diz respeito a IEC-HPLC, na condição de 40 ºC, o teor dos principais picos de IEC do anticorpo diminuiu e as tendências de degradação foram basicamente as mesmas; como pode ser observado nos dados de partículas insolúveis, os resultados do teste mostraram alguma flutuação em dias diferentes, mas os dados não mostraram uma tendência gradualmente crescente e as atividades estavam em uma faixa qualificada. Tabela 13. Resultados do Teste na Condição de Luz para a Formulação
E Condição do teste 4000x! de luz clara clara clara Características da solução nenhuma nenhuma nenhuma matéria matéria matéria (partícula/mL)
[00162] A partir dos dados da tabela anterior, pode-se observar que após 14 dias em condição de luz de 4000x1, em comparação com o Dia O, a amostra ainda foi um líquido claro e transparente, não apareceu matéria estranha visível, e o pH e a concentração de anticorpo da amostra não mudaram significativamente, indicando que a amostra estava estável na condição de luz. Em termos de SEC-HPLC, a alteração da pureza do monômero foi menos óbvia; em termos de IEC- HPLC, na condição de 4000x1 de luz, os picos principais de IEC do anticorpo diminuíram e as tendências de degradação foram basicamente as mesmas; a partir dos dados de partículas insolúveis, pode ser observado que os resultados dos diferentes dias mostraram certa flutuação, mas os dados não mostraram uma tendência gradualmente crescente e a atividade estava em uma faixa qualificada, bem abaixo do padrão.
[00163] As tendências de SEC da Formulação E nas condições de alta temperatura e luz são mostradas na Figura 6A, as tendências de IEC são mostradas na Figura 6B, e as tendências de CE (não reduzido) são mostradas na Figura 6C. Com os resultados de SEC, IEC e CE (não reduzidos) combinados, os picos principais declinaram em uma tendência uniforme após 14 dias de alta temperatura e luz, e formaram- se agregados em cada caso nas condições de alta temperatura e luz, dessa maneira, supôs-se que a amostra estava preservada em uma temperatura baixa e contra a luz. Tabela 14. Resultados do Teste na Condição de Alta Temperatura e Luz para a Formulação F Condição do teste 40 ºC 4000 clara clara clara clara clara Características da | nenhuma | 9% nenhuma nenhuma nenhuma solução matéria nhuma matéria matéria matéria sm ce ErEr E estranha pH 6,26 6,26 6,25 6,22 6,21 agregado 0,24 0,30 0,35 1,47 1,73 SEC- (%) monoómero (%) picos básicos 4,26 4,78 4,82 4,37 4,45 | eduzido, dO) | 97,03 [96,94 | 95,64 | 97,16 | 95,83 CE-SDS (reduzido, %) 0,48 0,48 0,46 0,49 0,46 insolúveis FE fe e e
[00164] A partirdos dados da tabela anterior, pode-se observar, que após a formulação ser colocada por 14 dias em condição de 40 ºC ou 4000 Ix de luz, em comparação com o Dia O, as amostras ainda foram um líquido claro e transparente, não apareceu matéria estranha visível, o pH e a concentração de anticorpos da solução de estoque não tiveram nenhuma alteração óbvia, indicando que no teste de degradação forçada a amostra foi relativamente estável, não existia precipitado, a proteína não foi basicamente adsorvida e as características da amostra não foram afetadas. Em termos de SEC-HPLC, não houve alteração da pureza do monômero quando as amostras foram mantidas a 40 ºC por 14 dias, e a pureza do monômero diminuiu com o tempo na condição de luz, indicando que foi mais fácil que o anticorpo se agregasse na condição de luz do que em alta temperatura; em termos de IEC-HPLC, na condição de 40 ºC ou luz, os principais picos de IEC do anticorpo diminuíram e as tendências de degradação foram basicamente as mesmas; como pode ser observado a partir dos dados de partículas insolúveis, os resultados do teste de dias diferentes mostraram alguma flutuação, mas os dados não mostraram uma tendência gradualmente crescente e o fenômeno do aumento repentino de partículas não apareceu, bem abaixo do padrão de qualificação.
[00165] Os experimentos mostraram que todas as formulações de anticorpo com diferentes concentrações têm certa estabilidade sob as condições de alta temperatura e luz. Exemplo 10 Estudos de Estabilidade em Condição de Oscilação
[00166] Condições experimentais: A Formulação F foi colocada horizontalmente a 200 rpm e oscilada à temperatura ambiente por 48 h. As características da solução, o teor de anticorpo, SEC, I|IEC, a bioatividade, CE-SDS (reduzido e não reduzido) e as partículas insolúveis foram testadas em intervalos regulares. O método de teste é descrito com referência a outros exemplos. Tabela 15. Resultados do Teste na Condição de Oscilação [ensaia | PITA Condição do teste temperatura ambiente ne- nenhu- | nenhu- ne- ne- ne- Características da nhuma ma ma nhuma | nhuma | nhuma solução matéria | matéria | matéria | matéria | matéria | matéria estra- estra- estra- | estra- estr- estra- nha nha nha nha anha nha Sisotnano sm | sem BE TES ne joe [un [us fu [o HPLC ro 99,66 99,66 99,66 99,63 99,65 299,67 (%)
IEC- pico reduzido, %) insolúveis m
[00167] Apartir dos dados da tabela anterior, pode-se observar que, após 48 horas de oscilação, em comparação com os dados a 0 hora, a amostra ainda foi um líquido claro e transparente, não apareceu matéria estranha visível e o valor do pH e a concentração de anticorpo da amostra não mudaram significativamente, indicando que a estabilidade da amostra foi boa no teste de oscilação. Além disso, a pureza de SEC- HPLC, o teor de pico principal de IEC-HPLC e outros itens de teste também não mostraram alterações óbvias, e a atividade estava dentro de uma faixa aceitável.
Exemplo 11 Sequência de Proteínas do Anticorpo BAT1806 Humanizado contra o Receptor da Interleucina 6
[00168] O anticorpo BATI806 humanizado contra o receptor da interleucina 6 para o tratamento de doenças relacionadas à IL-6 foi expresso em células CHO por métodos de engenharia genética e obtido mediante purificação por uma série de etapas cromatográficas padrão. BAT1806 é um anticorpo IgG, com um peso molecular de 145 kDa; cada cadeia pesada contém 449 aminoácidos, com um peso molecular de 53 kDa, e a sequência de aminoácidos da cadeia pesada é mostrada na
Tabela 16; cada cadeia leve contém 214 aminoácidos, com um peso molecular de 24 kDa, e a sequência de aminoácidos da cadeia leve é mostrada na Tabela 17.
Tabela 16. Sequência de Aminoácidos de Cadeia Pesada do Anticorpo BAT1806 Humanizado contra o Receptor da Interleucina 6 5'>QVALQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWV
DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRdeltKNQ
SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK<3" Tabela 17. Sequência de Aminoácidos de Cadeia Leve do Anticorpo BAT1806 Humanizado contra o Receptor da Interleucina 6 5"”>DIQMTAQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQAQK
PGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPE SEQ ID NO .2 DIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE
TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSP VTKSFNRGEC <3' Exemplo 12 Expressão e Purificação do Anticorpo BAT1806 Humanizado contra o Receptor da Interleucina 6
[00169] Com referência ao método dado por Wood et al., J Immunol.
145:3011 (1990) et al., o anticorpo BAT1806 humanizado contra o receptor da interleucina 6 que liga especificamente a IL-6R foi expresso em células CHO. O vetor de expressão que contém o gene do anticorpo foi construído por um método de biologia molecular convencional (clonagem molecular) usando uma linha celular derivada de células CHO-KkI (ATCC CCL61) como célula hospedeira para a expressão.
À construção de uma linha celular estável de alto rendimento é descrita brevemente a seguir: células hospedeiras foram cultivadas em suspensão em meio CD-CHO (Gibco, CA), as células hospedeiras em fase de crescimento logarítmico foram centrifugadas, novamente suspensas em meio CD-CHO fresco, as células foram contadas e a densidade celular foi ajustada para 1,43x107 células/mL, foram adicionados 600 uL da suspensão de células anterior a uma cubeta de eletroporação e, em seguida, foram adicionados 40 ug de plasmídeo linearizado e foi usada pipetagem para misturar as células com o plasmídeo de maneira uniforme.
A conversão por eletrochoque foi realizada usando um eletrômetro Bio-rad com os seguintes parâmetros do instrumento definidos: capacitância: 980uFD e tensão: 300 V.
Normalmente, o choque elétrico foi realizado por 15 a 20 milissegundos, o que é normal.
As células que receberam o choque elétrico foram imediatamente suspensas novamente em meio CD-CHO pré-aquecido a 37 ºC, inoculadas em uma placa com 96 poços a 100 uL por poço, e 2 a 3 dias depois, foi adicionada uma quantidade igual de meio de triagem (meios CD-CHO + 50 uM MSX). O sobrenadante da cultura celular na placa com 96 poços foi analisado para determinar o nível de expressão do anticorpo.
Os clones com níveis mais altos de expressão foram transferidos de uma placa com 96 poços para uma de 24 poços, e depois que as células foram cultivadas até determinada quantidade, as células foram transferidas para uma placa de 6 poços de modo que 2x10º células estivessem contidas em 3 mL de meio de cultura por poço, e o rendimento do anticorpo e o rendimento das células foram medidos.
Tipicamente, foram transferidos 20 a 30 clones para frascos de agitação para avaliação adicional.
Os 5 a 8 clones finais com a expressão mais alta foram subclonados e posteriormente testados quanto à expressão. O líquido do material foi obtido, as células foram separadas do meio de cultura por centrifugação em baixa velocidade e o sobrenadante da centrifugação foi posteriormente precipitado por centrifugação em alta velocidade. Foram realizadas purificação por afinidade com proteína À e purificação por troca iônica. Exemplo 13 Estudo da Atividade Biológica do Anticorpo Humanizado contra o Receptor da Interleucina-6
[00170] As formulações A, B, C e D do anticorpo BAT1806 com uma concentração de anticorpo de 20 mg/mL foram preparadas e testadas quanto à atividade celular, conforme descrito no Exemplo 1. O método de teste é brevemente descrito a seguir: o padrão do anticorpo BAT1806 humanizado contra o receptor da interleucina 6 foi usado como padrão, a concentração inicial foi de 20 ug/mL, a qual foi diluída por gradiente e adicionada a uma placa com 96 poços a 50 uL por poço. A amostra a ser testada também foi diluída de acordo com o método de diluição de amostra por curva padrão e adicionada a uma placa com 96 poços a 50 uL por poço. As células TF-1 em fase de crescimento logarítmico foram inoculadas em uma placa com 96 poços a 100.000 células/poço/100 uL, e foram incubadas por 72 horas em uma incubadora com 5% de CO; a 37 graus. Foi adicionado o reagente Celltiter Glo a 50 uL por poço. Após repousar durante 2 horas na ausência de luz à temperatura ambiente, os dados das microplacas foram lidos pelo método CelltiterGlo em um leitor de microplacas (Molecular Devices SpectraMax). Foram utilizados quatro parâmetros para ajustar o valor da curva C (IC50) e de acordo com a equação: a atividade específica relativa = [[C50 do padrão/IC50 da amostra de teste] x 100%, se os resultados calculados fossem de 80% a 125%, a atividade da amostra seria considerada normal. Os resultados são mostrados na Tabela 18.
[00171] As formulações A, B, C e D do anticorpo BAT1806 foram preparadas com uma concentração de anticorpo de 20 mg/mL, conforme descrito no Exemplo 1, e submetidas a um teste ELISA competitivo. O método de teste é brevemente descrito a seguir: hIL -6 foi diluída a 10 ug/mlL em PBS, bem misturada e a 100 ul por poço, ou seja, 1 ug por poço, colocada a 4 ºC durante a noite. Foi usado PBS contendo 5% de leite desnatado para bloquear, 200 ul por poço, incubado por 2 horas a 37 ºC, e a placa foi lavada três vezes com PBST. HIL-6R foi diluída a 1 ug/mL, 50 ul por poço, ou seja, 50 ng por poço, com a solução de diluição e colocada em temperatura ambiente por 30 min. BAT1806 foi diluído para ter uma concentração inicial de 80 ug/mL e, em seguida, diluído em série a 40, 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125, 0,156, 0,08, 0,04 ug/mL, e turbilhonado até ficar uniforme. O soro anti- his de coelho foi diluído 10.000 vezes com solução de diluição, e adicionado a 100 uL por poço, incubado por 1 hora a 37 ºC, e a placa foi lavada 5 vezes com PBST. HRP de cabra anticoelho foi submetido a uma diluição de 10.000 vezes, adicionado a 100 ul por poço, incubado por 0,5 hora a 37 “ºC, e a placa foi lavada 8 vezes com PBST. Foi adicionada solução cromogênica TMB a 100 uL por poço, deixada repousar por 10 minutos em temperatura ambiente no escuro, e interrompida pela adição de 50 ul por poço de 1 M de H2SO;.a. Foi realizada uma análise de quatro parâmetros, avaliando leituras de ODA450nm com o software de análise de detector marcado com enzima SoftMax Pro. Foram utilizados quatro parâmetros para ajustar os valores da curva C (IC50) e de acordo com a equação: a atividade específica relativa = [[C50 padrão/amostra de teste IC50] x 100%, se os resultados calculados fossem de 80% a 125%, a atividade da amostra de teste seria considerada normal. Os resultados são mostrados na Tabela 19.
Tabela 18. Resultados do Teste de Atividade Celular do Anticorpo Humanizado contra o Receptor da Interleucina 6
1 108,5 94,5 105,3 98,5 Mesa ion ssa ssa esa Tabela 19. Resultados do Teste ELISA Competitivo do Anticorpo Humanizado contra o Receptor da Interleucina 6 1 8 a so Ts se Ts ss Exemplo 14 Eficácia In Vivo do Anticorpo Humanizado contra o Receptor da Interleucina-6
[00172] Aavaliaçãofarmacodinâmica in vivo de animais foi realizada para investigar o efeito terapêutico do anticorpo humanizado contra o receptor da IL-6 no modelo de artrite induzida por colágeno (CIA) em macacos cynomolgus. O procedimento experimental específico foi o seguinte: macacas do sexo feminino foram imunizadas duas vezes com colágeno tipo |l de bezerro para modelagem da CIA. Os animais modelados com êxito foram divididos em quatro grupos: grupo NS de controle negativo, grupo da Formulação A do BAT1806, grupo da Formulação B do BAT1806, grupo da Formulação C do BAT1806, grupo da Formulação D do BAT1806, com 9 macacos em cada grupo, e receberam uma dose intravenosa única de 30 mg/kg. O efeito terapêutico do anticorpo monoclonal recombinante contra o receptor da interleucina-6 no modelo de CIA para macacos cynomolgus foi avaliado após 4 semanas de observação contínua.
[00173] Após uma dose intravenosa única de 30 mg/Kkg/IV, utilizando o BAT1I806 em comparação com o grupo de controle negativo, os Índices bioquímicos no sangue, como ESR, IL-6, IL-6R e similares, dos animais em teste foram significativamente melhorados, e a diferença foi estatisticamente significativa (veja a Figura 7). Exemplo 15 Farmacocinética do Anticorpo Humanizado contra o Receptor da Interleucina-6
[00174] Os estudos farmacocinéticos foram realizados em ratos Wisteria. A injeção intravenosa foi realizada uma vez com uma dose de 12 mg/kg, quatro grupos foram definidos como segue: A Formulação A do BAT1I806, a Formulação B do BAT1I806, a Formulação C do BAT1806, a Formulação D do BAT1806, com 10 ratos em cada grupo, metade do sexo masculino e metade do sexo feminino, foram coletadas amostras de sangue antes e imediatamente após a dose, 1h, 2h, 5h, 24h, 48h, 96h, 7 dias, 10 dias, 14 dias, para testar a concentração no sangue; a injeção subcutânea foi feita uma vez com uma dose de 12 mg/kg, quatro grupos foram definidos como segue: A Formulação A do BAT1806, a Formulação B do BAT1806, a Formulação C do BAT1806, a Formulação D do BAT1806, com 10 ratos em cada grupo, metade do sexo masculino e metade do sexo feminino, e foram coletadas amostras de sangue venoso antes e imediatamente após a dose, 5h, 8h, 24h, 48h, 96h, 7 dias, 10 dias, 14 dias. Foram observados perfis farmacocinéticos similares para a dose intravenosa ou subcutânea em cada grupo; veja a Figura 8. Referências:
[1] Josef S Smolen, Robert Landewé, Ferdinand C Breedveld, et al. EULAR recommendations for the management of rneumatoid arthritis with synthetic and biological disease-modifying antirheumatic drugs: 2013 update [J]. Ann Rheum Dis, 2013, 0:1-18.
[2] Go Woon Kim, et al. IL-6 inhibitors for treatment of rneumatoid arthritis: past, present, and future [J]. Arch. Pharm. Res,2015, 38:575—-
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[3] Veale DJ, Fearon U. Inhibition of angiogenic pathways in rheumatoid arthritis: potential for therapeutic targeting [J]. Best Pract Res Clin Rheumato, 2006, (20): pp. 941-947.
[4] Xu SD, Tang FI, Shi L, etal. Anti-Saantibody in Chinese Rheumatoid arthritis []]. Chinese Med J, 1998, 111(3): 204-207.
[5] Ritchie DM, Boyle JA, Mcinnes JM, et al. Clinical studies with an articular index for the assessment of joint tenderness in patients with rheumatoid arthritis[J]. Q J Med, 1986, 37: 393-406.
Claims (10)
1. Formulação de anticorpo, caracterizada pelo fato de que compreende: (1) um anticorpo: 2 a 100 mg/ml de anticorpo humanizado contra o receptor da IL-6; (2) um tampão; (3) um tensoativo: 0,1 a 1,0 g/L; (4) um estabilizador: 30 a 400 mM; (5) água para injeção; o pH da formulação de anticorpo sendo 5,0 a 7,0; em que o sistema de tampão é formado na formulação por um tampão, o sistema de tampão sendo um tampão de 5 a 20 mM de sal de histidina ou uma combinação de 5 a 20 mM de sal de histidina e a 20 MM de acetato de sódio; preferencialmente, a concentração do anticorpo humanizado contra o receptor da IL-6 é de 10 a 90 mg/mL; mais preferencialmente, a concentração de anticorpo humanizado contra o receptor da IL-6 é de a 50 mg/mL; de modo particularmente preferencial, a concentração de anticorpo humanizado contra o receptor da IL-6 é de 18 a 25 mg/mL; preferencialmente, o pH da formulação de anticorpo é de 5,5 a 6,5; mais preferencialmente, o pH da formulação de anticorpo é de 6,0 a 6,4; ainda mais preferencialmente, o pH da formulação de anticorpo é 6,2.
2. Formulação de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado monoclonal recombinante contra o receptor humano da interleucina 6; preferencialmente, o anticorpo compreende uma cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO. 1 e uma cadeia leve mostrada em SEQ ID NO. 2; mais preferencialmente, o anticorpo compreende duas cadeias pesadas, como mostrado em SEQ ID NO. 1 e duas cadeias leves, como mostrado em SEQ ID NO. 2.
3. Formulação de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o estabilizador é selecionado de uma combinação de cloridrato de arginina e sacarose, ou manitol, ou cloreto de sódio; preferencialmente, o estabilizador é selecionado de uma combinação de 40 a 200 mM de cloridrato de arginina e 15 a 70 g/L de sacarose; ou, preferencialmente, o estabilizador é selecionado de 30 a 70 g/L de manitol; ou, ainda preferencialmente, o estabilizador é selecionado de 100 a 300 mM de cloreto de sódio; preferencialmente, o tensoativo é selecionado de um ou mais dentre polissorbato-20, polissorbato-80 e poloxâmero 188; mais preferencialmente, o tensoativo é selecionado de polissorbato-80; mais preferencialmente, o tensoativo é selecionado de 0,1 a 0,7 g/L de polissorbato-80.
4. Formulação de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreende os seguintes ingredientes: (1) 18 a 22 mg/ml de anticorpo humanizado contra o receptor da IL-6; (2) 8 a 15 mM de solução de tampão de sal de histidina; (3) 0,45 a 0,65 g/L de polissorbato-80; (4) 40 a 60 mM de cloridrato de arginina; (5) 15 a 25 g/L de sacarose; (6) água para injeção; o pH sendo 6,0 a 6,4; ou, preferencialmente, compreendendo os seguintes ingredientes: (1) 18 a 22 mg/ml de anticorpo humanizado contra o receptor da IL-6; (2) 8 a 15 mM de solução de tampão de sal de histidina;
(3) 0,45 a 0,65 g/L de polissorbato-80; (4) 30 a 45 g/L de manitol; (5) água para injeção; o pH sendo 6,0 a 6,4; ou, ainda preferencialmente, compreendendo os seguintes ingredientes: (1) 18 a 22 mg/ml de anticorpo humanizado contra o receptor da IL-6; (2) 8 a 15 mM de solução de tampão de sal de histidina; (3) 0,45 a 0,65 g/L de polissorbato-80; (4) 90 a 110 mM de cloreto de sódio; (5) água para injeção; o pH sendo 6,0 a 6,4.
5. Formulação de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende os seguintes ingredientes: (1) 20 mg/mL de anticorpo humanizado contra o receptor da 1-6; (2) 10 MM de tampão de sal de histidina; (3) 0,5 g/L de polissorbato-80; (4) 50 mM de cloridrato de arginina; (5) 20 g/L de sacarose; (6) água para injeção; o pH sendo 6,2; ou, preferencialmente, compreendendo os seguintes ingredientes: (1) 20 mg/mL de anticorpo humanizado contra o receptor da 1L-6; (2) 10 MM de tampão de sal de histidina; (3) 0,5 g/L de polissorbato-80;
(4) 30 g/L de manitol; (5) água para injeção; o pH sendo 6,2; ou, preferencialmente, compreendendo os seguintes ingredientes: (1) 20 mg/mL de anticorpo humanizado contra o receptor da IL-6; (2) 10 MM de tampão de sal de histidina; (3) 0,5 g/L de polissorbato-80; (4) 42 g/L de manitol; (5) água para injeção; o pH sendo 6,2; ou, ainda preferencialmente, compreendendo os seguintes ingredientes: (1) 20 mg/mL de anticorpo humanizado contra o receptor da IL-6; (2) 10 MM de tampão de sal de histidina; (3) 0,5 g/L de polissorbato-80; (4) 100 mM de cloreto de sódio; (5) água para injeção; um pH sendo 6,2.
6. Formulação de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que compreende também uma base; preferencialmente, a base é NaOH.
7. Formulação de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a forma de dosagem farmacêutica da formulação de anticorpo é uma formulação de injeção; preferencialmente, a formulação é uma formulação de injeção subcutânea ou uma formulação de injeção intravenosa.
8. Formulação de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a formulação permanece estável por pelo menos um mês à temperatura ambiente; preferencialmente, a formulação permanece estável por pelo menos 36 meses a 2 a 8ºC; preferencialmente, a formulação permanece estável após pelo menos 5 ciclos de congelamento-descongelamento.
9. Formulação de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a formulação de anticorpo é uma formulação farmacêutica para tratar doenças relacionadas à IL-6; preferencialmente, as doenças relacionadas à IL-6 incluem: artrite reumatoide em adultos, artrite idiopática juvenil sistêmica, artrite idiopática juvenil poliarticular, arterite de células gigantes, hiperplasia de linfonodos gigantes; tempestades de citocina causadas por imunoterapia, doença de Still em adultos, policondrite recorrente, diabetes tipo Il, espondilite anquilosante, oftalmopatias associadas à tireoide, doenças cardiovasculares causadas por artrite reumatoide, polimialgia reumática, doença aguda do enxerto contra o hospedeiro, infarto do miocárdio sem supradesnivelamento do segmento ST, lúpus eritematoso sistêmico, esquizofrenia, uveite, câncer de ovário, vasculite associada a anticorpo citoplasmático antineutrofílico, neuromielite óptica, glomerulonefrite crônica e câncer colorretal; mais preferencialmente, as doenças relacionadas à IL-6 incluem: artrite reumatoide em adultos, artrite idiopática juvenil sistêmica, artrite idiopática juvenil poliarticular, arterite de células gigantes e hiperplasia de linfonodos gigantes.
10. Método para preparar a formulação de anticorpo como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (1) dissolver um tampão pesado, um estabilizador e um tensoativo em água para injeção; (2) ajustar o líquido preparado na etapa (1) com hidróxido de sódio aquoso até o pH ser 5 a 7; preferencialmente, a concentração de hidróxido de sódio aquoso é de 1M;
(3) filtrar o líquido preparado na etapa (2) em um recipiente asséptico; preferencialmente, o tamanho dos poros da membrana do filtro é 0,22 um; e
(4) adicionar o líquido preparado na etapa (3) a uma solução de anticorpo.
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