CN116261448A - 用于治疗il-6相关疾病的包含高浓度人源化抗体的液体制剂 - Google Patents

用于治疗il-6相关疾病的包含高浓度人源化抗体的液体制剂 Download PDF

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Abstract

提供了包含高浓度人源化抗体的用于治疗IL‑6相关疾病的液体制剂。在一些实施方案中，所述液体制剂包含120‑300mg/mL的抗体、5‑30mM的组氨酸盐缓冲液或5‑30mM醋酸钠缓冲液、0.1‑1.0mg/mL的表面活性剂、70‑200mM的稳定剂和注射用水，且不含抗氧化剂。该抗体制剂提供良好的抗体稳定性、皮下注射可接受的粘度、防止单克隆抗体的聚集和降解以及酸性异构体增加。该制剂适用于稳定人源化抗体的结构和功能。

Description

用于治疗IL-6相关疾病的包含高浓度人源化抗体的液体制剂
技术领域
本发明涉及用于治疗白介素6(IL-6)相关疾病的高浓度抗白介素6受体(IL-6R)人源化抗体的液体制剂。
背景技术
抗白介素6受体人源化抗体可用于治疗类风湿性关节炎(RA)[Josef S Smolen,etal.EULAR recommendations for the management ofrheumatoid arthritis withsynthetic andbiological disease-modifying antirheumatic drugs:2013update,AnnRheum Dis,2014；73(3):492–509]，其机制是结合可溶性及膜结合的IL-6受体(sIL-6R和mIL-6R)并抑制sIL-6R和mIL-6R介导的信号传导。
药物抗体通常通过注射给药。与静脉内注射相比，皮下注射可以更快速地给药，且患者也可以自行注射。然而，对于需要高剂量(例如，每剂超过100mg)的抗体，由于每次皮下注射可以施用的体积有限，因此皮下制剂中的抗体浓度需要很高，这给制剂带来了挑战。例如，由于高浓度，抗体倾向于聚集，从而导致稳定性降低和更短的保质期。高浓度还增加了制剂的粘度，从而使生产和通过针头注射变得困难。为了增加保质期，可以通过冻干将制剂制备成粉末。然而，冻干粉需要在水中复溶，使给药更加复杂。因此，需要具有长期稳定性、适合皮下注射且不需要重构的高浓度抗体液体制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种适于皮下注射的稳定的液体制剂，其包含高浓度单克隆抗体。
本发明的目的是通过以下技术手段实现的：
在一个方面，本发明提供了一种抗体制剂，其包含高浓度的抗白介素6受体人源化抗体、缓冲体系、稳定剂和表面活性剂。所述制剂不包含抗氧化剂，例如甲硫氨酸。具体地，本发明的抗体制剂包含、基本上由以下成分组成或由以下成分组成：
(1)120-300mg/mL抗IL-6受体人源化抗体；
(2)缓冲体系，包含5-30mM组氨酸及其盐或5-30mM醋酸及其盐；
(3)0.1-1.0mg/mL表面活性剂；
(4)70-200mM稳定剂；
(5)注射用水。
所述抗体制剂的pH为5.0-7.0。
在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO.1所示的重链和SEQ ID NO.2所示的轻链。在一些实施方案中，所述抗体包含两条SEQ ID NO.1所示的重链和两条SEQ ID NO.2所示的轻链，标记为BAT1806。在一些实施方案中，所述抗体是托珠单抗或其生物类似物，例如BAT1806。在一些实施方案中，抗白介素6受体人源化抗体通过基因工程方法在CHO细胞中表达并通过一系列标准层析步骤纯化。在制备抗体后，制备药物制剂。
在一些实施方案中，所述抗IL-6受体人源化抗体在制剂中的浓度为130-280mg/mL。在一些实施方案中，所述抗IL-6受体人源化抗体在制剂中的浓度为140-250mg/mL。在一些实施方案中，所述抗IL-6受体人源化抗体在制剂中的浓度为160-200mg/mL。在一些实施方案中，所述抗IL-6受体人源化抗体在制剂中的浓度为180mg/mL。
在一些实施方案中，所述稳定剂选自精氨酸或其盐(例如，盐酸精氨酸)，或精氨酸或其盐与蔗糖或海藻糖(可作为水合物添加)的组合。在一些实施方案中，所述稳定剂为70-200mM精氨酸和/或其盐(例如，14.746-42.132mg/mL的盐酸精氨酸)和29-87mM(10-30mg/mL)蔗糖的组合；或所述稳定剂为70-200mM精氨酸和/或其盐(例如，14.746-42.132mg/mL的盐酸精氨酸)和26-79mM海藻糖(例如，10-30mg/mL的海藻糖二水合物)的组合；或所述稳定剂为70-200mM的精氨酸和/或其盐(例如，14.746-42.132mg/mL盐酸精氨酸)。在一些实施方案中，所述稳定剂为80-100mM的精氨酸和/或其盐(例如，16.853-21.066mg/mL的盐酸精氨酸)和44-73mM(15-25mg/mL)的蔗糖的组合；或所述稳定剂为80-100mM精氨酸和/或其盐(例如，16.853-21.066mg/mL的盐酸精氨酸)和40-66mM海藻糖(例如，15-25mg/mL的海藻糖二水合物)的组合；或所述稳定剂为110-130mM精氨酸和/或其盐(例如，23.173-27.386mg/mL的盐酸精氨酸)。在一些实施方案中，所述稳定剂为约90mM精氨酸和/或其盐(例如，约18.959mg/mL的盐酸精氨酸)和约58.4mM(约20mg/mL)蔗糖的组合；或所述稳定剂为约90mM精氨酸和/或其盐(例如，约18.959mg/mL的盐酸精氨酸)和约52.9mM的海藻糖(例如，约20mg/mL的海藻糖二水合物)的组合；或所述稳定剂为约120mM精氨酸和/或其盐(例如，约25.279mg/mL的盐酸精氨酸)。
在一些实施方案中，所述表面活性剂为聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，所述表面活性剂为0.1-0.7mg/mL的聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，所述表面活性剂为0.45-0.55mg/mL的聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，所述表面活性剂为约0.5mg/mL的聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述缓冲体系包含5-20mM组氨酸及其盐或5-20mM醋酸及其盐。在一些实施方案中，所述缓冲体系包含8-15mM组氨酸及其盐或8-15mM醋酸及其盐。在一些实施方案中，所述缓冲体系包含10mM组氨酸及其盐。在一些实施方案中，所述缓冲体系包含10mM醋酸及其盐。
在一些实施方案中，所述抗体制剂的pH为5.5-6.5；或者，所述抗体制剂的pH在5.6和6.4之间；或者，所述抗体制剂的pH在5.8和6.2之间；或者，所述抗体制剂的pH在5.8和6.0之间；或者，所述抗体制剂的pH在6.0和6.2之间；或者，所述抗体制剂的pH约为5.8。
在一些实施方案中，所述抗体制剂的粘度为0至20cP。在一些实施方案中，所述抗体制剂的粘度为5cP至15cP。在一些实施方案中，所述抗体制剂的粘度为8cP至12cP。在一些实施方案中，所述抗体制剂的粘度为约10cP。
在一些实施方案中，所述抗体制剂包含、基本上由以下组成或由以下组成：
(1)160-200mg/mL抗IL-6受体人源化抗体；
(2)8-15mM组氨酸盐缓冲液；
(3)0.45mg/mL至0.65mg/mL聚山梨醇酯80；
(4)80-100mM盐酸精氨酸；
(5)15-25mg/mL蔗糖；
(6)注射用水；
pH为5.6-6.4。
在一些实施方案中，所述制剂包含、基本上由以下组成或由以下组成：
(1)160-200mg/mL抗IL-6受体人源化抗体；
(2)8-15mM醋酸钠缓冲液；
(3)0.45-0.65mg/mL聚山梨醇酯80；
(4)80-100mM盐酸精氨酸；
(5)40-66mM海藻糖(例如，15-25mg/mL海藻糖二水合物)；
(6)注射用水；
pH为5.6-6.4。
在一些实施方案中，所述制剂包含、基本上由以下组成或由以下组成：
(1)160-200mg/mL抗IL-6受体人源化抗体；
(2)8-15mM醋酸钠缓冲液；
(3)0.45-0.65mg/mL聚山梨醇酯80；
(4)110-130mM盐酸精氨酸；
(5)注射用水；
pH为5.6-6.4。
在一些实施方案中，所述制剂包含、基本上由以下组成或由以下组成：
(1)180mg/mL抗IL-6受体人源化抗体；
(2)10mM组氨酸盐缓冲液；
(3)0.5mg/mL聚山梨醇酯80；
(4)90mM盐酸精氨酸；
(5)20mg/mL蔗糖；
(6)注射用水；
pH为约5.6-6.4。
在一些实施方案中，所述制剂包含、基本上由以下组成或由以下组成：
(1)180mg/mL抗IL-6受体人源化抗体；
(2)10mM醋酸钠缓冲液；
(3)0.5mg/mL聚山梨醇酯80；
(4)90mM盐酸精氨酸；
(5)52.9mM海藻糖(例如，20mg/mL海藻糖二水合物)；
(6)注射用水；
pH为约5.6-6.4。
在一些实施方案中，所述制剂包含、基本上由以下组成或由以下组成：
(1)180mg/mL抗IL-6受体人源化抗体；
(2)10mM醋酸钠缓冲液；
(3)0.5mg/mL聚山梨醇酯80；
(4)120mM盐酸精氨酸；
(5)注射用水；
pH为约5.6-6.4。
在一些实施方案中，所述抗体制剂的pH为约5.8。在一些实施方案中，所述抗体制剂的pH为约6。
在一些实施方案中，所述抗体制剂的粘度为5cP至15cP。在一些实施方案中，所述抗体制剂的粘度为8cP至12cP。在一些实施方案中，所述抗体制剂的粘度为约10cP。
在一些实施方案中，将碱添加到抗体制剂中以调节pH。在一个示例性实施方案中，所述碱为NaOH。
抗体制剂是用于注射的水性制剂。该制剂适用于皮下注射。
另一方面，本发明还提供了一种制备抗体制剂的方法，包括以下步骤：
(1)将缓冲液、稳定剂和表面活性剂溶解在注射用水中，形成具有所需浓度的缓冲液和表面活性剂以及高浓度稳定剂的高浓度稳定剂溶液；
(2)将表面活性剂加入到包含高浓度抗体和所需浓度缓冲液的缓冲抗体溶液中，形成抗体表面活性剂溶液；
(3)将步骤(1)制备的高浓度稳定剂溶液与步骤(2)制备的抗体表面活性剂溶液混合，得到制剂。
在一些实施例中，步骤(1)中制备的溶液的pH是用氢氧化钠水溶液调节的。
在一些实施方案中，该方法还包括在添加到抗体溶液中之前，将步骤(1)中制备的溶液通过滤膜过滤到无菌容器中。在一些实施例中，滤膜的孔径为0.22μm，用于过滤细菌和真菌。在一些实施方案中，在步骤(2)中，将表面活性剂作为表面活性剂溶液添加到缓冲抗体溶液中。
本发明公开的制剂是在没有冻干的情况下制备的。
该抗体制剂是用于治疗IL-6相关疾病的药物制剂。在一些实施方案中，提供了一种治疗IL-6相关疾病的方法，包括向有需要的患者施用有效量的本发明所述的制剂。在一些实施方案中，IL-6相关疾病包括：成人类风湿性关节炎、全身型幼年特发性关节炎、多关节型幼年特发性关节炎、巨细胞动脉炎、巨淋巴结增生症、免疫治疗引起的细胞因子风暴、细胞因子释放综合征、成人斯蒂尔病、复发性多软骨炎、II型糖尿病、强直性脊柱炎、甲状腺相关性眼病、类风湿关节炎引起的心血管疾病、风湿性多肌痛、急性移植物抗宿主病、非ST段抬高型心肌梗死、系统性红斑狼疮、精神分裂症、葡萄膜炎、卵巢癌、抗中性粒细胞胞浆抗体相关的血管炎、视神经脊髓炎、慢性肾小球肾炎、结直肠癌等。在一些实施方案中，IL-6相关疾病选自类风湿性关节炎、细胞因子释放综合征、全身型幼年特发性关节炎、多关节型幼年特发性关节炎、巨细胞动脉炎和巨淋巴结增生症。在一些实施方案中，制剂的有效量是每1至3周一次，每剂抗体包含120-300mg的量。
本发明提供的抗体制剂包含高浓度的抗体，具有可接受的粘度、低浊度和高稳定性，适用于通过皮下注射给予高剂量的抗体。本文开发的抗体制剂，可在冷冻/解冻循环、长期储存和温度变化过程中显着抑制酸性峰、二聚体、聚集体、降解物和不溶性微粒的形成。特别地，抗白介素6受体人源化抗体在上述制剂中经过至少3次冻融循环后保持稳定，在室温下稳定至少3个月。因此，本发明的抗体制剂可用于稳定储存抗白介素6受体人源化抗体，通过皮下注射治疗所需的高剂量抗体以治疗IL-6相关疾病。
附图简述
图1.抗体浓度与溶液粘度的关系。
发明详述
本发明通过选择缓冲溶液和稳定剂提供抗体制剂，以增强高浓度抗白介素6受体人源化抗体制剂的稳定性，防止单克隆抗体聚集、降解和酸性异构体增加，同时具有皮下注射可接受的低浊度和粘度。
在数值前使用的术语“约”表示该数值可以在合理范围内变化，例如在所述数值的±10％、±5％或±1％之内，并包括所述数值。
如本文所用，术语“包括”旨在表示组合物或方法等包括所列举的元素，但不排除其他元素。当“基本上由...组成”用于定义组合物或方法时，指排除对用于预期用途的组合有任何本质意义的其他元素，但不排除不会实质性影响组合物或方法的特征的元素。“由……组成”是指排除未特别列举的元素。由这些过渡术语中的每一个定义的实施例都在本发明的范围内。
本文使用的术语“稳定性”和“稳定”是指在包含抗体的液体制剂中，抗体在给定的生产、制剂、运输和/或贮存条件下不发生或仅极少地发生聚集、降解或片段化。“稳定”制剂在给定的生产、制剂、运输和/或贮存条件下保持生物活性。可以通过SEC-HPLC、IEC-HPLC、CE-SDS等技术测量所述制剂中的聚集、降解或片段化程度等，从而评估抗体的稳定性。在一些实施例中，所述稳定的制剂中的抗体主峰在室温下贮存至少3个月后下降不超过5％。
需要说明的是，在本发明中，如涉及到制剂中含有缓冲液或者缓冲体系，也是指制剂中含有缓冲剂，而通过缓冲剂在所述的制剂中形成缓冲体系。缓冲剂通常是弱酸或弱碱及其盐的组合。例如，组氨酸缓冲液(也称为组氨酸盐缓冲液)通常由组氨酸及其一种或多种盐形成，例如盐酸组氨酸，醋酸盐缓冲液通常由醋酸及其一种或多种盐形成，例如醋酸钠。除非另有说明，无论缓冲液是酸和/或盐的形式，缓冲液的摩尔浓度都包括游离酸/碱和盐。
在本发明的一个实施方案中，所述单克隆抗体在抗体制剂中的浓度为约120-300mg/mL。在一些实施方案中，所述单克隆抗体在抗体制剂中的浓度为约130-280mg/mL。在一些实施方案中，所述单克隆抗体在抗体制剂中的浓度为约140-250mg/mL。在一些实施方案中，所述单克隆抗体在抗体制剂中的浓度为约160-200mg/mL。在一些实施方案中，，所述单克隆抗体在抗体制剂中的浓度为约180mg/mL。在一些实施方案中，所述缓冲体系选自组氨酸(His)缓冲液、柠檬酸盐(CB)缓冲液、醋酸钠(NaAC)缓冲液和琥珀酸(Sua)缓冲液。在一些实施方案中，所述缓冲体系是组氨酸缓冲液。在一些实施方案中，所述缓冲体系是醋酸钠缓冲液。
在一些实施方案中，所述稳定剂包括盐酸精氨酸、脯氨酸、盐酸赖氨酸、甘氨酸、组氨酸或谷氨酸钠。稳定剂的加入进一步降低了制剂的粘度。在一些实施方案中，所述稳定剂是盐酸精氨酸。
在一些实施例中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯80。
通过筛选缓冲剂和粘度降低剂来选择优选的配方。在一些实施方案中，所述制剂基本上由以下组成：约180mg/mL抗IL-6受体人源化抗体、约10mM组氨酸盐缓冲液、约0.5mg/mL聚山梨醇酯80、约90mM盐酸精氨酸、约20mg/mL蔗糖，注射用水，pH 5.8-6.0，粘度8-12cP。在一些实施方案中，所述制剂基本上由以下组成：约180mg/mL抗IL-6受体人源化抗体、约10mM醋酸钠缓冲溶液、约0.5mg/mL聚山梨醇酯80、约90mM盐酸精氨酸、约20mg/mL海藻糖二水合物，注射用水，pH 5.8-6.0，粘度8-12cP。在一些实施方案中，所述制剂基本上由以下组成：约180mg/mL人源化抗IL-6受体抗体、约10mM醋酸钠缓冲溶液、约0.5mg/mL聚山梨醇酯80、约120mM盐酸精氨酸、注射用水，pH 5.8-6.0，粘度8-12cP。
在一些实施方案中，所述制剂是制剂1。在一些实施方案中，所述制剂是制剂2。在一些实施方案中，所述制剂是制剂3。
根据对上述制剂稳定性的评价，本发明的抗体制剂在室温下可稳定保存至少3个月，在至少3次冻融循环后仍可保持稳定。
本发明提供的含有单克隆抗体的液体制剂提供了能够稳定储存活性成分的制剂组合。
表1显示了制剂1、2、3和4的成分：
表1.制剂成分表
Figure BDA0004084086030000081
Figure BDA0004084086030000091
本发明提供保护单克隆抗体的包含高浓度抗体的制剂，其可包含约120-300mg/mL抗体、约5-20mM组氨酸盐缓冲液、约0.25-1mg/mL聚山梨醇酯80和选自约70-200mM盐酸精氨酸与/不与约10-50mg/mL蔗糖或约10-50mg/mL海藻糖二水合物的组合的稳定剂，pH为约5.0-7.0。在一些实施方案中，制剂包含约180mg/mL抗体、约10mM组氨酸盐缓冲液、约0.5mg/mL聚山梨醇酯80、约90mM盐酸精氨酸、约20mg/mL蔗糖，pH为5.6-6.4。在一些实施方案中，所述制剂包含约180mg/mL抗体、约10mM醋酸钠缓冲液、约0.5mg/mL聚山梨醇酯80、约90mM盐酸精氨酸、约20mg/mL海藻糖二水合物，pH为5.6-6.4。在一些实施方案中，所述制剂包含约180mg/mL抗体、约10mM醋酸钠缓冲液、约0.5mg/mL聚山梨醇酯80、约120mM盐酸精氨酸，pH5.6-6.4。
下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但并不用于限制本发明的保护范围。根据本发明构思对其他非必要的修改和调整都在本发明的范围内。
需要说明的是，在本发明中，“质量体积比”是指组分的质量与制剂的体积比。
抗体样品
BAT1806抗体是通过抗体制备技术制备的抗白介素6受体人源化抗体。构建能稳定表达BAT1806的CHO细胞系，收集上清液并通过PROTEINA纯化。
实施例1.制剂制备
可以通过包括以下步骤的方法制备抗体制剂：
作为示例性实施例，制剂3制备如下：
(a)称量下列量的成分：0.31g组氨酸、1.68g盐酸组氨酸、189.6g盐酸精氨酸、200g蔗糖、0.5g聚山梨醇酯80。
将上述称量的成分溶解在注射用水中，得到1L包含10mM组氨酸缓冲液、900mM盐酸精氨酸、200mg/mL蔗糖、0.5mg/mL聚山梨醇酯80的溶液，制剂成分添加顺序不影响制剂质量，可灵活选用。然后将(a)中制备的溶液通过0.22μm孔径的亲水性聚偏二氟乙烯滤膜过滤到无菌容器中。
(b)将所需量的组氨酸、盐酸组氨酸或聚山梨醇酯80溶解在注射用水中，制备具有10mM组氨酸缓冲液的缓冲液和具有100mg/mL聚山梨醇酯80的表面活性剂溶液。
(c)将含有总共1800g抗体的抗体浓缩物在水浴(室温)中解冻，然后与(b)中制备的缓冲液交换，通过30KD聚醚砜超滤膜(Millipore,C9MA73422)超滤浓缩，得到9L含有组氨酸缓冲液(10mM)的高浓度抗体溶液(200mg/mL)。
(d)向(c)中获得的抗体溶液中加入(b)中制备的表面活性剂溶液(100mg/mL聚山梨醇酯80)，使得表面活性剂浓度为0.5mg/mL。
(e)向(d)中获得的9L抗体溶液中加入1L(a)中获得的溶液，搅拌，得到液体制剂3，将其包装在小瓶或预填充注射器中使用。
本领域技术人员将理解，本文所指的重量、重量与体积比、体积与体积比可使用成分的公知分子量转化为摩尔和/或摩尔浓度。本领域技术人员还将理解，当需要不同的制剂体积时，可以按比例调整成分的重量。例如，16L、14L、12L、10L、5L的制剂分别占所列举重量的1.6、1.4、1.2、1.0、0.5倍。
其他制剂的制备方法同制剂3的制备方法，相应调整各成分的用量。
实施例2.分析方法
以下方法用于分析本文公开的制剂。
SEC-HPLC分析方法：
将待测制剂样品用水稀释至抗体浓度为5mg/mL，并通过SEC-HPLC进行测试。色谱柱是TSK-GEL G3000SWXL 7.8×300mM,5μm(TOSOH)。流动相是200mM K3PO4和250mM KCl(pH7.0)。紫外检测波长为280nm，柱温为30℃，上样量为40μL(200μg蛋白质)，以0.5mL/min的流速保持35分钟。记录色谱图，积分后通过面积归一化法计算样品溶液中单体和多聚体的百分含量。
IEC-HPLC分析方法：
将待测制剂样品用水稀释至抗体浓度为5mg/mL，并通过IEC-HPLC进行测试。色谱条件：色谱柱，TSK-GEL CM-
Figure BDA0004084086030000112
4.6×100mm，7μm(TOSOH)；流动相，流动相A(20mM ACES，pH 8.0)和流动相B(20mMACES+200mM NaCl，pH 8.0)；上样量为50μg；紫外检测波长为280nm；根据下面给出的洗脱梯度进行梯度洗脱45分钟。记录色谱图，积分后采用峰面积归一化法分别计算主峰、酸区和碱区的百分含量。(色谱图进行手动积分，在基线比较平的地方绘制基线，积分起始时间和积分终止时间为主峰保留时间前后8分钟左右，在主峰周围的两个峰谷处绘制垂直线，主峰前为酸区，主峰后为碱区(主峰之后依次是碱峰1、碱峰2和碱峰3)，在碱区的每个峰谷处画垂直线。)/>
洗脱梯度
Figure BDA0004084086030000111
粘度测定：
将样品恢复到25℃常温，然后用粘度计(Brookfield，DV2T)测量。将大约1.2-1.5mL的样品缓慢注入锥体中(避免产生气泡)，均匀铺开，然后于25±2℃的温度下在粘度计上进行测试。扭矩在40％-70％之间，旋转7-9次左右进行数据记录。
浊度测定：
将样品恢复至室温并使用紫外分光光度计(Eppendorf，BioPhotometerplus)进行检测。将紫外分光光度计调至340nm，用水校准，校准结果为0时才进行样品检测。测试时用300μl样品冲洗一次性比色皿，然后将300μl样品慢慢倒入一次性比色皿中，过程中避免产生气泡，将比色皿放入紫外分光光度计进行数据记录。
实施例3.缓冲液筛选
使用多种缓冲体系进行抗体稳定性研究。
基于抗体的性质，发明人已经根据经验确定了一些缓冲系统：
组氨酸盐缓冲液(His)
柠檬酸盐缓冲液(CB)
醋酸钠缓冲液(NaAc)
琥珀酸缓冲液(Sua)
表2显示了含有180mg/mL BAT1806、90mMArg-HCl、20mg/mL蔗糖、0.5mg/mL聚山梨醇酯80和10mM缓冲液的制剂的缓冲液类型和pH值。
表2.缓冲液类型和pH值
Figure BDA0004084086030000121
在40℃高温4周(W)或光照条件(4500±500Lx)下10天(d)对制剂的单体纯度(SEC-HPLC，简称SEC)和电荷异构体(IEC-HPLC，简称IEC)进行了考察。结果如表3和表4所示。
表3.高温(40℃)下的制剂缓冲液筛选
Figure BDA0004084086030000122
Figure BDA0004084086030000131
表4.光照条件(4500±500Lx)下的制剂缓冲液筛选
Figure BDA0004084086030000132
实施例4.pH筛选
使用各种pH值进行抗体稳定性研究。
在本研究中，高浓度抗体制剂中含有180mg/mL抗体(BAT1806)、90mMArg-HCl、20mg/mL蔗糖、0.5mg/mL聚山梨醇酯80和10mM组氨酸盐缓冲液，用HCl或NaOH将pH调节至5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4或6.6。
考察了在高温40℃4周或光照试验(4500±500Lx)10天下制剂的单体纯度(SEC-HPLC，简称SEC)和电荷异构体(IEC-HPLC，简称IEC)。结果如表5和表6所示。
表5.高温(40℃)下的制剂缓冲液筛选
Figure BDA0004084086030000133
Figure BDA0004084086030000141
表6.光照条件(4500±500Lx)下的制剂缓冲液筛选
Figure BDA0004084086030000142
/>
Figure BDA0004084086030000151
在高温或光照条件下的SEC和IEC结果表明，随着时间的推移，pH在5.4-6.4范围内可以起到良好的缓冲保护作用。最适pH范围为5.6-6.4。样品在光照下，缓冲液的pH值越低，抗体的稳定性越好。考虑到产品可避光保存的实际情况，选择样品pH在5.4-6.4范围内以保护抗体。接下来的实验在pH值5.8下进行。
实施例5.粘度降低剂的筛选
测定了含有一系列浓度抗体(102mg/mL、158.9mg/mL、181mg/mL、189.7mg/mL和215mg/mL)和10mM醋酸钠缓冲液(pH 5.8)的溶液的粘度。抗体浓度与溶液粘度的关系如图1所示。从结果可以看出，粘度随着抗体浓度的增加而增加。在约180mg/mL的浓度下，粘度约为15cP。
在该研究中，该制剂包含高浓度抗体(BAT1806)、粘度降低剂、0.5mg/mL聚山梨醇酯80和20mM组氨酸盐缓冲液，pH 5.87。抗体浓度、粘度降低剂和粘度如表7所示。
表7.不同制剂溶液的粘度结果
Figure BDA0004084086030000152
/>
Figure BDA0004084086030000161
由表7数据可知，在25℃时，盐酸精氨酸和盐酸精氨酸与甲硫氨酸的组合对溶液粘度的降低幅度最大，其次是脯氨酸、盐酸赖氨酸和甘氨酸。同时，粘度降低剂盐酸精氨酸在保护抗体稳定性方面发挥了重要作用，也可以说是稳定剂。
实施例6.制剂特性
根据实施例1的方法配制药物制剂1、2、3和4。
Figure BDA0004084086030000163
(制剂5)由Genentech(B1095B01)制造。
蛋白质的Tm(半变性温度)采用多功能蛋白稳定性分析系统(UNcle，UnchainedLabs)通过全光谱荧光、静态光散射和动态光散射的检测方法测定。根据实施例2的方法在340nm的光密度(OD)下测定制剂的浊度。并测定制剂的粘度。结果如表8所示。
表8.制剂特性
Figure BDA0004084086030000162
Tm结果表明，制剂3的Tm值最高，说明制剂3中的蛋白质会更稳定。与制剂4相比，即使制剂3含有一定量的蔗糖且不含甲硫氨酸，但制剂3的粘度最低且低于制剂4。与制剂4相比，制剂1、2和3的浊度较低。所有制剂的大小、浊度和粘度都是可接受的。
实施例7.冻融研究
如实施例1所述制备抗体浓度为约180mg/mL的BAT1806抗体制剂1、制剂2、制剂3、制剂4。对于制剂1、2、3、4，在-60℃至25℃条件下重复三个冻融循环，观察透明度、浊度、SEC、IEC。
在光下观察到透明度。在0、1或3次冻融循环后，所有制剂均清澈透明，略带乳光。
浊度的测定如实施例4所述，结果见表9。随着冻融循环次数的增加，制剂4的浊度有增加的趋势，而其他制剂的浊度没有增加。
表9.冻融后的浊度
Figure BDA0004084086030000171
SEC和IEC如实施例2所述进行测量。结果如表10所示。
表10.冻融后的SEC和IEC
Figure BDA0004084086030000172
Figure BDA0004084086030000181
结果表明，虽然抗体制剂从-60℃开始解冻并经过3次冻融循环，SEC和IEC均无明显变化，说明样品在反复冻融试验中稳定，无沉淀产生，蛋白质没有粘附在冻融容器上。
实施例8.加速条件下的稳定性研究
根据实施例1的方法配制药物制剂1、2、3和4。
Figure BDA0004084086030000183
(制剂5)由Genentech(B1095B01)制造。将五种制剂分别置于(25±2)℃条件下的生化培养箱中孵育3个月，分别在0th(0M)，1st(1M)，2nd(2M)，3rd(3M)和6th(6M)月结束时取样，检查样品的单体纯度(SEC-HPLC)和电荷异构体。
单体纯度(SEC-HPLC)和电荷异构体(IEC-HPLC)的测定如实施例2所述。结果如表11所示，从表11可以看出，在加速条件下，超过6个月，单体纯度随时间降低，说明在加速条件下产生片段，但抗体的SEC主峰下降不超过3.22％；对于IEC-HPLC，在25℃条件下，抗体IEC主峰含量下降，降解趋势基本一致，IEC主峰下降不超过11.38％；CE-SDS-NR主峰下降不超过3.16％。虽然制剂3的精氨酸浓度较低且不含甲硫氨酸，但SEC-HPLC和IEC-HPLC的稳定性与制剂5相似，而CE-SDS的稳定性则高于制剂5。
表11.加速条件下的稳定性
Figure BDA0004084086030000182
Figure BDA0004084086030000191
实施例9.高温和光照条件下的稳定性研究
对制剂1、2、3和4进行高温和光照研究，考察制剂在高温(40℃，4周)和光照条件(4500±500Lx)下的稳定性。测试方法在其他实施例中进行了描述。
高温条件下的结果如表12所示。从SEC可以看出，40℃下4周单体纯度下降，表明在高温下产生了聚集体和碎片。制剂3和4的主峰下降最少。同样，IEC或CE-SDS检测到的制剂3和4的主峰下降也最少。
表12.高温条件下的测试结果
Figure BDA0004084086030000192
Figure BDA0004084086030000201
光照条件下的结果如表13所示。从SEC可以看出，在8天的光照条件下单体纯度下降，产生少量聚集和碎片。根据IEC的结果，酸峰增加而碱峰减少。各制剂的主峰基本不变。
表13.光照条件下的测试结果
Figure BDA0004084086030000202
实验表明，抗体制剂1-4在高温和光照条件下均具有一定的稳定性。
实施例10.振荡条件下的稳定性研究
实验条件：将制剂1、2、3、4平放，室温200rpm振荡48h。定期测量溶液透明度、浊度、SEC、IEC。测试方法参照其他实施例的描述。
在光照下观察透明度。振荡48h后，所有制剂均清澈透明，略带乳光，未见明显可见异物。
浊度的测定如实施例4所示。结果如表14所示。
表14.振荡48小时后的浊度
Figure BDA0004084086030000211
如实施例2所述测定SEC和IEC。结果如表15所示。
表15.振荡48小时后的SEC和IEC
Figure BDA0004084086030000212
从上表的数据可以看出，振荡48小时后，SEC-HPLC纯度、IEC-HPLC主峰含量等测试项目与0小时的数据相比也没有明显变化，且活性在可接受的范围内。与冻融试验结果相似，制剂1、2、3的浊度保持较低，而制剂4的浊度因振荡而增大，说明制剂1、2、3在振荡试验中的稳定性优于制剂4。
实施例11.抗白介素6受体人源化抗体BAT1806的氨基酸序列
治疗IL-6相关疾病的抗白介素6受体人源化抗体BAT1806采用已知基因工程技术在CHO细胞中表达，经一系列标准层析步骤纯化获得。BAT1806是一种由两条重链和两条轻链组成的IgG抗体，分子量为145kDa；每条重链含有449个氨基酸，如表16所示，分子量为53kDa；每条轻链含有214个氨基酸，如表17所示，分子量为24kDa。
表16.BAT1806的重链氨基酸序列
Figure BDA0004084086030000213
/>
Figure BDA0004084086030000221
表17.BAT1806的轻链氨基酸序列
Figure BDA0004084086030000222
实施例12.BAT1806的表达纯化
参考Woodet al.,JImmunol.145:3011(1990)等给出的方法，抗白介素6受体人源化抗体BAT1806在CHO细胞中表达。采用常规分子生物学方法(分子克隆)构建含抗体基因的表达载体，以CHO-K1细胞(ATCC CCL61)的一种衍生细胞系作为宿主细胞表达。高产稳定细胞系的构建简要介绍如下：宿主细胞在CD-CHO培养基(Gibco，CA)中悬浮培养，将对数生长期的宿主细胞离心，重悬于新鲜的CD-CHO培养基中，计数细胞，并调整细胞密度为1.43×107cells/mL，将600ul上述细胞悬液加入电击杯中，加入40ug线性化质粒，采用移液法使细胞与质粒混合均匀。使用Bio-rad电转仪进行电击转换，仪器参数设置如下：电容：960uFD，电压：300V。通常电击持续15-20毫秒。电击后的细胞立即重悬于37℃预热的CD-CHO培养基中，以每孔100ul接种于96孔板中，2-3天后加入等量的筛选培养基(CD-CHO培养基+50μMMSX)。分析96孔板细胞培养上清液，以测定抗体表达量。将表达量较高的克隆从96孔板转移到24孔板上，待细胞生长到一定数量后，将细胞转移到6孔板上，使每孔3mL培养基中含有2×105细胞，并测量细胞的抗体产量和产率。将20-30个克隆转移到摇瓶中进行进一步评估。最后将5-8个表达量最高的克隆进行亚克隆并进一步检测表达量。收集培养液，通过低速离心将细胞从培养基中分离，高速离心进一步澄清离心的上清。进行蛋白A亲和纯化和离子交换纯化。
序列表
<110> 百奥泰生物制药股份有限公司
<120> 用于治疗IL-6相关疾病的包含高浓度人源化抗体的液体制剂
<150> PCT/CN2020/109965
<151> 2020-08-19
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 3
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (21)

1.一种抗体制剂，其特征在于，包含：
(1)抗体：120-300mg/mL抗IL-6受体人源化抗体；
(2)包含5-30mM组氨酸盐或5-30mM醋酸钠的缓冲体系；
(3)表面活性剂：0.1-1.0mg/mL；
(4)稳定剂：70-200mM；
(5)注射用水；
抗体制剂的pH为5.0-7.0。
2.根据权利要求1所述的抗体制剂，其中抗IL-6受体人源化抗体浓度为160-200mg/mL。
3.根据权利要求1所述的抗体制剂，其中抗IL-6受体人源化抗体浓度为180mg/mL。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体制剂，其中抗体制剂的pH为5.5-6.5。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体制剂，其中抗体制剂的pH为5.6-6.4。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体制剂，其中所述抗体包含两条重链和两条轻链，其中所述重链包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，轻链包含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体制剂，其具有0至20cP的粘度。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体制剂，其具有5至15cP的粘度。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体制剂，其特征在于，所述稳定剂选自盐酸精氨酸，或盐酸精氨酸与蔗糖的组合，或盐酸精氨酸与海藻糖二水合物的组合。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体制剂，其中所述稳定剂选自70-200mM盐酸精氨酸和10-30mg/mL蔗糖的组合；70-200mM盐酸精氨酸和10-30mg/mL海藻糖二水合物的组合；和70-200mM盐酸精氨酸。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体制剂，其中所述表面活性剂为聚山梨醇酯80。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体制剂，其中所述表面活性剂为0.1-0.7mg/mL聚山梨醇酯80。
13.一种抗体制剂，包含：
(1)160-200mg/mL抗IL-6受体人源化抗体；
(2)8-15mM组氨酸盐缓冲溶液；
(3)0.45-0.65mg/mL聚山梨醇酯80；
(4)80-100mM盐酸精氨酸；
(5)15-25mg/mL蔗糖；
(6)注射用水；
pH为5.6-6.4；
或者，包含：
(1)160-200mg/mL抗IL-6受体人源化抗体；
(2)8-15mM醋酸钠缓冲溶液；
(3)0.45-0.65mg/mL聚山梨醇酯80；
(4)80-100mM盐酸精氨酸；
(5)15-25mg/mL海藻糖二水合物；
(6)注射用水；
pH为5.6-6.4；
或者，包含：
(1)160-200mg/mL抗IL-6受体人源化抗体；
(2)8-15mM醋酸钠缓冲溶液；
(3)0.45-0.65mg/mL聚山梨醇酯80；
(4)110-130mM盐酸精氨酸；
(5)注射用水；
pH为5.6-6.4。
14.一种抗体制剂，包含：
(1)180mg/mL抗IL-6受体人源化抗体；
(2)10mM组氨酸盐缓冲液；
(3)0.5mg/mL聚山梨醇酯80；
(4)90mM盐酸精氨酸；
(5)20mg/mL蔗糖；
(6)注射用水；
pH为5.6-6.4；
或者，包含：
(1)180mg/mL抗IL-6受体人源化抗体；
(2)10mM醋酸钠缓冲液；
(3)0.5mg/mL聚山梨醇酯80；
(4)90mM盐酸精氨酸；
(5)20mg/mL海藻糖二水合物；
(6)注射用水；
pH为5.6-6.4；
或者，包含：
(1)180mg/mL抗IL-6受体人源化抗体；
(2)10mM醋酸钠缓冲液；
(3)0.5mg/mL聚山梨醇酯80；
(4)120mM盐酸精氨酸；
(5)注射用水；
pH为5.6-6.4。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的抗体制剂，其特征在于，所述抗体制剂是皮下注射制剂。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的抗体制剂，其特征在于，所述制剂在室温下保持稳定至少3个月。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的抗体制剂，其中所述制剂在至少3次冻融循环后保持稳定。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的抗体制剂，其中所述抗体制剂是用于治疗IL-6相关疾病的药物制剂。
19.根据权利要求18所述的抗体制剂，其中所述IL-6相关疾病选自类风湿性关节炎、全身型幼年特发性关节炎、多关节型幼年特发性关节炎、巨细胞动脉炎、巨淋巴结增生症、免疫治疗引起的细胞因子风暴、细胞因子释放综合征、成人斯蒂尔病、复发性多软骨炎、II型糖尿病、强直性脊柱炎、甲状腺相关眼病、类风湿关节炎引起的心血管疾病、风湿性多肌痛、急性移植物抗宿主病、非ST段抬高型心肌梗死、系统性红斑狼疮、精神分裂症、葡萄膜炎、卵巢癌、抗中性粒细胞胞浆抗体相关的血管炎、视神经脊髓炎、慢性肾小球肾炎和结直肠癌。
20.根据权利要求18所述的抗体制剂，其中所述IL-6相关疾病选自类风湿性关节炎、全身型幼年特发性关节炎、多关节型幼年特发性关节炎、巨细胞动脉炎、细胞因子释放综合征和巨淋巴结增生症。
21.一种制备权利要求1至17中任一项所述的抗体制剂的方法，包括以下步骤：
(1)将缓冲剂、稳定剂和表面活性剂溶解在注射用水中形成溶液；
(2)在抗体溶液中加入表面活性剂；和
(3)将步骤(1)中制备的溶液与步骤(2)中制备的抗体表面活性剂溶液混合，得到制剂。
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