BR112020000162A2 - anticorpos biespecíficos inibidores de checkpoint - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a anticorpos que são heterodiméricos e se ligam a PD-L1 humana e PD-1 humana, e pode ser útil no tratamento do câncer sozinho ou em combinação com quimioterapia e outras terapêuticas para o câncer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTI- CORPOS BIESPECÍFICOS INIBIDORES DE CHECKPOINT".

[001] A presente invenção refere-se ao campo da medicina. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a anticorpos humanos biespecíficos que ligam a morte celular programada humana 1 (PD-1) e ligante PD-1 humano 1 (PD-L1), e pode ser útil no tratamento de tu- mores sólidos e hematológicos sozinhos ou em combinação com qui- mioterapia e outras terapêuticas para o câncer.

[002] As vias de checkpoint imune são usadas na manutenção da autotolerância e controle da ativação de células T, mas as células can- cerosas podem usar as vias para suprimir a resposta antitumoral e evi- tar a sua destruição. A via PD-1/PD-L1 é um desses checkpoint imune. O PD-1 humano é encontrado em células T e o PD-L1 humano é anormalmente expressado por uma variedade de tipos de tumor; liga- ção de PD-L1 para PD-1 inibe a proliferação de células T e a produção de citocinas. O eixo inibitório PD-1/PD-L1 tem sido subjugado por tu- mores, como parte do processo seletivo natural que modela a evolu- ção tumoral no contexto de uma resposta imune antitumoral.

[003] Enquanto a terapêutica visando a via PD-1/PD-L1 é clini- camente validada e levaram a significativos avanços clínicos para o tratamento de câncer, apenas uma fração dos pacientes têm se bene- ficiado de tal tratamento (ver, por exemplo, Sharma, P. and Allison, J.P., Immune checkpoint targeting in cancer therapy: toward combina- tion strategies with curative potential. Cell. 2015; 161:2015-14). Por exemplo, apenas cerca de 20% dos pacientes com câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC) responderam ao tratamento com anticorpo PD-1.

[004] Embora estudos clínicos envolvendo a coadministração de um PD-L1 e um anticorpo e um anticorpo PD-1 estejam atualmente em curso (ver, por exemplo, Sociedade Europeia de Oncologia Médica

(ESMO) Resumo #2130; Outubro de 2016), estes regimes de trata- mento envolvem infusões de dois produtos de anticorpos separados em doses relativamente altas para cada anticorpo. Além disso, ainda não se sabe se tais terapias de combinação irão proporcionar melhori- as na eficácia sem agravar o perfil de eventos adversos, em compara- ção com a monoterapia.

[005] WO2017/087547 revela especificamente anticorpos anti- PD-L1 e geralmente revela moléculas heterodiméricas (por exemplo, um agente biespecífico) compreendendo um agente de ligação de PD- L1 nele descritos e "um segundo agente imunoterapêutico". Em algu- mas modalidades, o segundo agente imunoterapêutico pode incluir "um anticorpo que bloqueia as funções imunossupressoras" como um "anticorpo anti-PD". No entanto, nenhum agente biespecífico PD- L1/PD-1 específico foram revelados nesta publicação. Assim, um anti- corpo biespecífico que liga o PD-L1 e o PD-1 com alta afinidade, efeti- vamente neutraliza o PD-L1 e a ativação de PD-1 por todos os ligantes da família PDx, e/ou fornece atividade superior em relação às terapêu- ticas conhecidas para a via de PD-1/PD-L1, ou mesmo combinações destas, é necessária uma intervenção farmacológica mais eficaz para alguns tipos de cânceres. Particularmente, são desejáveis tais anticor- pos anti-PD-L1/PD-1 biespecíficos que i) podem mais efetivamente tratar cânceres caracterizados como tendo níveis de expressão mode- rados ou altos de PD-L1 ou PD-1 e ii) demonstram estabilidade in vivo, estabilidade física e química, incluindo, mas não limitado a, estabilida- de térmica, solubilidade, baixa auto associação e características far- macocinéticas que são aceitáveis para o desenvolvimento e/ou uso no tratamento do câncer.

[006] Consequentemente, a presente invenção fornece novos anticorpos biespecíficos heterodiméricos que podem direcionar PD-L1 e PD-1, simultaneamente, através do emparelhamento de duas dife-

rentes cadeias pesadas e duas diferentes cadeias leves em um único anticorpo similar a IgG. Além disso, a presente invenção fornece anti- corpos biespecíficos heterodiméricos PD-L1 anti-humano e PD-1 anti- humano que possuem uma ou mais das seguintes características: blo- quear todas as três interações do eixo PD (PD-L1 se ligando a PD-1, PD-L2 se ligando a PD-1 e PD-L1 se ligando a CD80), células sobre- expressando a ponte PD-L1 e PD-1, aumentar a ativação de células T e matar células tumorais devido à proximidade de células T ligadas e células tumorais, demonstrar atividade antitumoral significante em do- ses surpreendentemente baixas nas células tumorais com níveis de expressão moderados a altos do ligante PD, e demonstrar a estabili- dade física e química inesperada, incluindo, mas não limitada a, esta- bilidade in vivo, estabilidade térmica, solubilidade, baixa autoassocia- ção e características farmacocinéticas.

[007] Consequentemente, a presente invenção fornece um anti- corpo que se liga a PD-L1 humana (SEQ ID NO: 1) e PD-1 humana (SEQ ID NO: 2), compreendendo: a) uma primeira cadeia pesada (HC1) compreendendo uma região variável da cadeia pesada (HCVR) compreendendo a sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 3; b) uma primeira cadeia leve (LC1) compreendendo uma re- gião variável de cadeia leve (LCVR) compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4; c) uma segunda cadeia pesada (HC2) compreendendo a região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5; e d) uma segunda cadeia leve (LC2) compreendendo uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de amino- ácidos da SEQ ID NO: 8.

[008] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga a

PD-L1 humana (SEQ ID NO: 1) e PD-1 humana (SEQ ID NO: 2), com- preendendo uma HC1, uma LC1, uma HC2, e uma LC2, em que: a) a dita HC1 compreendendo uma CDR1 tendo a sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 16, uma CDR2 tendo uma se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; uma CDR3 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 na HCVR; b) a dita LC1 compreendendo uma CDR1 tendo a sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 19, uma CDR2 tendo uma se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; uma CDR3 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21 na LCVR; c) a dita HC2 compreendendo uma CDR1 tendo a sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, uma CDR2 tendo uma se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 24; uma CDR3 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25 na HCVR; d) a dita LC2 compreendendo uma CDR1 tendo a sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, uma CDR2 tendo uma se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27; uma CDR3 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 na LCVR; e) o domínio CH1 da HC1 compreende uma substituição de aminoácidos de S183K; f) a região constante da LC1 é uma variante de lambda hu- mana, compreendendo substituições de aminoácidos de S176E e Y178E; g) o domínio CH1 da HC2 compreende substituições de aminoácidos de L128E, K147T e Q175E; h) a região constante da LC2 é uma variante de capa hu- mana, compreendendo substituições de aminoácidos de S131R, V133G e S176R; e i) o domínio CH3 da HC1 compreende substituições de aminoácidos de T350V, L351Y, F405A e Y407V e o domínio CH3 da HC2 compreende substituições de aminoácidos de T350V, T366L, K392L e T394W; ou o domínio CH3 da HC1 compreende substituições de aminoácidos de T350V, T366L, K392L e T394W e o domínio CH3 da HC2 compreende substituições de aminoácidos de T350V, L351Y, F405A e Y407V; j) em que HC1 e HC2 são variantes Fc de IgG1 humana de função efetora imune nula, onde a numeração é de acordo com o índi- ce da UE. De preferência, HC1 e HC2 compreende substituições de aminoácidos de L234A, L235A e D265S.

[009] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga a PD-L1 humana (SEQ ID NO: 1) e PD-1 humana (SEQ ID NO: 2), com- preendendo: a) uma HC1 compreendendo, em ordem do N-terminal ao C-terminal, a HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 no do- mínio CH1, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 no domí- nio CH2, e a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12 no domínio CH3; b) uma LC1 compreendendo, em ordem do N-terminal ao C-terminal, a LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 e a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 na região constante; c) uma HC2 compreendendo, em ordem do N-terminal ao C-terminal, a HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 no domínio CH1, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 no do- mínio CH2, e a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 ou a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 no domínio CH3; e d) a LC2 compreendendo, em ordem do N-terminal, a

LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 e a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 na região constante, desde que a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 esteja pre- sente no domínio CH3 da dita HC1, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 está presente no domínio CH3 da dita HC2, ou quando a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 esteja presente no domínio CH3 da dita HC1, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 está presente no domínio de CH3 da dita HC2.

[0010] A presente invenção fornece ainda um anticorpo compre- endendo uma HC1, LC1, HC2 e LC2 em que: a) a dita HC1 compreende, em ordem do N-terminal ao C- terminal, a HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 no do- mínio CH1, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 no domí- nio CH2, e a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 no domínio CH3; b) a dita LC1 compreendendo, em ordem do N-terminal ao C-terminal, uma LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, e a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 na região constante; e c) a dita HC2 compreendendo, em ordem do N-terminal ao C-terminal, uma HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 no domínio CH1, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 na regi- ão do domínio CH2, e a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 no domínio CH3; e d) a dita LC2 compreendendo, em ordem do N-terminal, uma LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, e a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 na região constante.

[0011] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga a PD-L1 humana (SEQ ID NO: 1) e PD-1 humana (SEQ ID NO: 2), com- preendendo: a) uma HC1 compreendendo uma sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 49; b) uma LC1 compreendendo uma sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 30; c) uma HC2 compreendendo uma sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 31; e d) uma LC2 compreendendo uma sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 34.

[0012] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga a PD-L1 humana (SEQ ID NO: 1) e PD-1 humana (SEQ ID NO: 2), com- preendendo: a) uma HC1 compreendendo uma sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 49; b) uma LC1 compreendendo uma sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 30; c) uma HC2 compreendendo uma sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 33; e d) uma LC2 compreendendo uma sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 34.

[0013] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga a PD-L1 humana (SEQ ID NO: 1) e PD-1 humana (SEQ ID NO: 2), com- preendendo: a) uma HC1 compreendendo uma sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 29; b) uma LC1 compreendendo uma sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 30; c) uma HC2 compreendendo uma sequência de aminoáci-

dos da SEQ ID NO: 33; e d) uma LC2 compreendendo uma sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 34.

[0014] A presente invenção fornece uma célula de mamíferos compreendendo uma molécula de DNA compreendendo uma sequên- cia de polinucleotídeo codificando polipeptídeos tendo as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 34, em que a célula é capaz de expressar um anticorpo da presente invenção.

[0015] A presente invenção fornece uma célula de mamíferos compreendendo uma molécula de DNA compreendendo uma sequên- cia de polinucleotídeo codificando polipeptídeos tendo as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 34, em que a célula é capaz de expressar um anticorpo da presente invenção.

[0016] A presente invenção fornece uma célula de mamíferos compreendendo uma molécula de DNA compreendendo uma sequên- cia de polinucleotídeo codificando polipeptídeos tendo as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 34, em que a célula é capaz de expressar um anticorpo da presente invenção.

[0017] A presente invenção fornece um processo para a produção de um anticorpo da presente invenção compreendendo um cultivo de células de mamíferos da presente invenção sob condições tais que o anticorpo é expressado, e recuperando o anticorpo expressado.

[0018] A presente invenção fornece um anticorpo produzido por um processo da presente invenção.

[0019] A presente invenção fornece uma composição farmacêuti- ca, compreendendo um anticorpo da presente invenção e um carrea- dor aceitável, diluente ou excipiente.

[0020] A presente invenção fornece um método de tratamento de câncer, compreendendo a administração a um paciente em necessi- dade da mesma, uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção. A presente invenção fornece ainda um método de tratamen- to de câncer em que o dito método compreende administrar ao pacien- te em necessidade do mesmo, uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção, em que o câncer é linfomas de Hodgkin e de não Hodgkin, melanoma, câncer de células renais, câncer de rim, cân- cer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de esôfago e gástrico, câncer colorretal, câncer de fígado, câncer hepatocelular, colangiocarcinoma, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de mama triplo-negativo, câncer de ovário, câncer de endométrio, câncer de próstata, câncer de pulmão de pequenas células (CPPC), câncer de pulmão de não pe- quenas células (CPNPC), mesotelioma, câncer escamoso de câncer de cabeça pescoço (SCCHN), sarcoma de tecidos moles, ou glioblas- toma multiforme.

[0021] A presente invenção fornece um método de tratamento de câncer, onde o câncer é o melanoma. A presente invenção fornece ainda um método de tratamento de câncer, onde o câncer é o câncer de pulmão. A presente invenção fornece ainda um método de trata- mento de câncer, onde o câncer de pulmão é CPNPC (escamoso e não escamoso), câncer de pulmão de pequenas células ou mesotelio- ma. A presente invenção fornece um método de tratamento de câncer, onde o câncer é o câncer de cabeça e pescoço. A presente invenção fornece ainda um método de tratamento de câncer, onde o câncer é o câncer de fígado. A presente invenção fornece ainda um método de tratamento de câncer, onde o câncer é o câncer colorretal. A presente invenção fornece ainda um método de tratamento de câncer, onde o câncer é o câncer de pancreático. A presente invenção fornece ainda um método de tratamento de câncer, onde o câncer é o câncer gástri-

co. A presente invenção fornece ainda um método de tratamento de câncer, onde o câncer é o câncer de rim. A presente invenção fornece ainda um método de tratamento de câncer, onde o câncer é o câncer de bexiga. A presente invenção fornece ainda um método de tratamen- to de câncer, onde o câncer é o câncer de próstata. A presente inven- ção fornece ainda um método de tratamento de câncer, onde o câncer é o câncer de mama. A presente invenção fornece ainda um método de tratamento de câncer, onde o câncer é o câncer de ovário. A pre- sente invenção fornece ainda um método de tratamento de câncer, onde o câncer é o câncer endometrial. A presente invenção fornece ainda um método de tratamento de câncer, onde o câncer é o câncer de esôfago. A presente invenção fornece ainda um método de trata- mento de câncer, onde o câncer é o sarcoma de tecidos moles. A pre- sente invenção fornece ainda um método de tratamento de câncer, onde o câncer é o colangiocarcinoma. A presente invenção fornece ainda um método de tratamento de câncer, onde o câncer é o carci- noma hepatocelular.

[0022] A presente invenção fornece métodos adicionais compre- endendo a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo da presente invenção em combinação simultânea, separada ou sequen- cial, com um ou mais agentes antitumoral selecionados do grupo con- sistindo em cisplatina, carboplatina, dacarbazina, doxorrubicina lipos- somal, docetaxel, ciclofosfamida e doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel , partículas ligadas à proteína paclitaxel para suspensão inje- tável, ixabepilona, capecitabina, FOLFOX (leucovorina, fluorouracil e oxaliplatina), FOLFIRI (leucovorina, fluorouracil e irinotecano), gemci- tabina, topotecano, irinotecano lipossomal, pemetrexedo, cetuximabe, nivolumabe, ipilimumabe, pidilizumabe, pembrolizumabe, tremelimu- mabe, urelumabe, lirilumabe, atezolizumabe, epacadostat e durvalu- mabe.

[0023] A presente invenção fornece métodos adicionais compre- endendo a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo da presente invenção compreendendo combinação simultânea, separada ou sequencial, com radiação ionizante.

[0024] A presente invenção fornece um anticorpo da presente in- venção, para uso em terapia. A presente invenção fornece um anticor- po da presente invenção, para uso no tratamento do câncer. A presen- te invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento de câncer, em que o câncer é linfomas de Hodgkin e de não Hodgkin, melanoma, câncer de células renais, câncer de rim, cân- cer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de esôfago e gástrico, câncer colorretal, câncer de fígado, câncer hepatocelular, colangiocarcinoma, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de mama triplo-negativo, câncer de ovário, câncer de endométrio, câncer de próstata, câncer de pulmão de pequenas células (CPPC), câncer de pulmão de não pe- quenas células (CPNPC), mesotelioma, câncer escamoso de câncer de cabeça pescoço (SCCHN), sarcoma de tecidos moles, ou glioblas- toma multiforme.

[0025] A presente invenção fornece um anticorpo da presente in- venção, para uso no tratamento de melanoma. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento do câncer de pulmão. A presente invenção fornece ainda um anticorpo da presente invenção, onde o câncer de pulmão é CPNPC (escamoso e não escamoso), câncer de pulmão de pequenas células ou mesotelio- ma. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento do câncer de cabeça e pescoço. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tra- tamento do câncer de fígado. A presente invenção fornece um anticor- po da presente invenção, para uso no tratamento do câncer colorretal. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento do câncer pancreático. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento do câncer gástrico. A presente invenção fornece um anticorpo da presente inven- ção, para uso no tratamento do câncer de rim. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento do câncer de bexiga. A presente invenção fornece um anticorpo da pre- sente invenção, para uso no tratamento do câncer de próstata. A pre- sente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento do câncer de mama. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento do câncer de ovário. A presente invenção fornece um anticorpo da presente inven- ção, para uso no tratamento do câncer endometrial. A presente inven- ção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamen- to do câncer de esôfago. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento do sarcoma de tecidos mo- les. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento do colangiocarcinoma. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento do câncer hepatocelular.

[0026] A presente invenção fornece o anticorpo da presente inven- ção para uso em combinação simultânea, separada ou sequencial com um ou mais agentes antitumoral selecionados do grupo consistindo em cisplatina, carboplatina, dacarbazina, doxorrubicina lipossomal, doce- taxel, ciclofosfamida e doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, partículas ligadas à proteína paclitaxel para suspensão injetável, ixa- bepilona, capecitabina, FOLFOX (leucovorina, fluorouracil e oxaliplati- na), FOLFIRI (leucovorina, fluorouracil e irinotecano), gemcitabina, to- potecano, irinotecano lipossomal, pemetrexedo, cetuximabe, nivolu- mabe, ipilimumabe, pidilizumabe, pembrolizumabe, tremelimumabe, urelumabe, lirilumabe, atezolizumabe, epacadostat e durvalumabe, no tratamento de câncer.

[0027] A presente invenção fornece o anticorpo da presente inven- ção para uso em combinação simultânea, separada, ou sequencial com radiação ionizante no tratamento do câncer.

[0028] A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção. A presente invenção for- nece ainda uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção, em que o câncer é linfomas de Hodgkin e de não Hodgkin, melanoma, câncer de células renais, câncer de rim, câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de esôfago e gástrico, câncer colorretal, câncer de fígado, câncer hepatocelular, colangiocarcinoma, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de mama triplo-negativo, câncer de ovário, câncer de endométrio, câncer de próstata, câncer de pulmão de pequenas células (CPPC), câncer de pulmão de não pe- quenas células (CPNPC), mesotelioma, câncer escamoso de câncer de cabeça pescoço (SCCHN), sarcoma de tecidos moles, ou glioblas- toma multiforme. A presente invenção fornece ainda uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção, onde o cân- cer de pulmão é CPNPC (escamoso e não escamoso), câncer de pul- mão de pequenas células ou mesotelioma.

[0029] A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de melanoma, compreendendo uma quantida- de eficaz de um anticorpo da presente invenção. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento do cân- cer de pulmão, incluindo, mas não limitado a, CPNPC (escamoso e não escamoso), câncer de pulmão de pequenas células ou mesotelio- ma compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da pre-

sente invenção.

A presente invenção fornece uma composição farma- cêutica para uso no tratamento de câncer de cabeça e pescoço, com- preendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente in- venção.

A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer de fígado, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção.

A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamen- to de câncer colorretal, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção.

A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer pancreáti- co, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da pre- sente invenção.

A presente invenção fornece uma composição farma- cêutica para uso no tratamento de câncer gástrico, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção.

A pre- sente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer de rim, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção.

A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer de bexiga, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção.

A presente invenção fornece uma composição far- macêutica para uso no tratamento de câncer de próstata, compreen- dendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção.

A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer de mama, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção.

A presente invenção for- nece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer de ovário, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção.

A presente invenção fornece uma composição far- macêutica para uso no tratamento de câncer endometrial, compreen- dendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção.

A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer de esôfago, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção. A presente invenção for- nece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de sarco- ma de tecidos moles, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de colangiocarcino- ma, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da pre- sente invenção. A presente invenção fornece uma composição farma- cêutica para uso no tratamento de câncer hepatocelular, compreen- dendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção.

[0030] A presente invenção fornece ainda uma composição farma- cêutica para uso no tratamento de câncer, em que a dita composição farmacêutica é administrada em combinação simultânea, separada ou sequencial, com um ou mais agentes antitumoral selecionados do gru- po consistindo em cisplatina, carboplatina, dacarbazina, doxorrubicina lipossomal, docetaxel, ciclofosfamida e doxorrubicina, navelbina, eribu- lina, paclitaxel , partículas ligadas à proteína paclitaxel para suspensão injetável, ixabepilona, capecitabina, FOLFOX (leucovorina, fluorouracil e oxaliplatina), FOLFIRI (leucovorina, fluorouracil e irinotecano), gemcitabina, topotecano, irinotecano lipossomal, pemetrexedo, cetu- ximabe, nivolumabe, ipilimumabe, pidilizumabe, pembrolizumabe, tre- melimumabe, urelumabe, lirilumabe, atezolizumabe, epacadostat e durvalumabe.

[0031] A presente invenção fornece ainda uma composição farma- cêutica para uso no tratamento de câncer, em que a dita composição farmacêutica é administrada em combinação simultânea, separada ou sequencial com radiação ionizante.

[0032] A presente invenção fornece o uso de um anticorpo da pre- sente invenção, para a fabricação de um medicamento para o trata-

mento do câncer. A presente invenção fornece ainda o uso de um an- ticorpo da presente invenção, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer, em que o câncer é linfomas de Hodgkin e de não Hodgkin, melanoma, câncer de células renais, câncer de rim, câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de esôfago e gástrico, câncer colorretal, câncer de fígado, câncer hepatocelular, colangiocar- cinoma, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de mama triplo- negativo, câncer de ovário, câncer de endométrio, câncer de próstata, câncer de pulmão de pequenas células (CPPC), câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC), mesotelioma, câncer escamoso de câncer de cabeça pescoço (SCCHN), sarcoma de tecidos moles, ou glioblastoma multiforme. A presente invenção fornece ainda o uso de um anticorpo da presente invenção para a fabricação de um medica- mento para o tratamento de câncer, onde o câncer de pulmão é CPNPC (escamoso e não escamoso), câncer de pulmão de pequenas células ou mesotelioma.

[0033] A presente invenção fornece ainda o uso de um anticorpo da presente invenção na fabricação de um medicamento para o trata- mento de câncer, em que o dito medicamento é para ser administrado em combinação simultânea, separada ou sequencial, com um ou mais agentes antitumoral selecionados do grupo consistindo em cisplatina, carboplatina, dacarbazina, doxorrubicina lipossomal, docetaxel, ciclo- fosfamida e doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel , partículas ligadas à proteína paclitaxel para suspensão injetável, ixabepilona, ca- pecitabina, FOLFOX (leucovorina, fluorouracil e oxaliplatina), FOLFIRI (leucovorina, fluorouracil e irinotecano), gemcitabina, topotecano, irino- tecano lipossomal, pemetrexedo, cetuximabe, nivolumabe, ipilimuma- be, pidilizumabe, pembrolizumabe, tremelimumabe, urelumabe, lirilu- mabe, atezolizumabe, epacadostat e durvalumabe.

[0034] A presente invenção fornece o uso de um anticorpo da pre-

sente invenção, para a fabricação de um medicamento para o trata- mento do câncer, em que o medicamento é para ser administrado si- multaneamente, separadamente ou sequencialmente com a radiação ionizante.

[0035] Um anticorpo da presente invenção é um complexo de poli- peptídeo modificado que ocorre não naturalmente. Uma molécula de DNA da presente invenção é uma molécula de DNA que não ocorre naturalmente que compreende uma sequência de polinucleotídeo codi- ficando um polipeptídeo tendo sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos em um anticorpo da presente invenção.

[0036] Um anticorpo da presente invenção é um anticorpo do tipo IgG e tem cadeias "pesadas" e "leves" que são ligadas através de liga- ções dissulfeto intra- e intercadeias. Cada cadeia pesada é composta de uma HCVR N-terminal e uma região variável da cadeia pesada ("HCCR"). Cada cadeia leve é composta de uma LCVR N-terminal e uma região constante de cadeia leve ("LCCR"). Cada cadeia leve for- ma pontes dissulfeto com uma cadeia pesada, e as duas cadeias pe- sadas formam duas pontes dissulfeto entre si.

[0037] A região constante das cadeias pesadas contém domínios CH1, CH2 e CH3. CH1 vem depois da HCVR; a CH1 e HCVR formam a porção da cadeia pesada de um Fab. CH2 vem depois da região da dobradiça e antes da CH3. CH3 vem depois de CH2 e está na extre- midade carbóxi-terminal da cadeia pesada.

[0038] A região constante das cadeias leves contém um domínio, a CL. CL vem depois da LCVR; a CL e LCVR formam a porção da ca- deia leve de um Fab.

[0039] Os anticorpos da presente invenção são heterodiméricos em que cada braço do anticorpo exibe ligação monovalente seletiva para o seu antígeno cognato devido a duas cadeias pesadas e duas cadeias leves diferentes formando o anticorpo. Na presente invenção um braço do anticorpo se liga a PD-L1 humana (SEQ ID NO: 1) e o outro braço se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 2). Os domínios CH2 e/ou CH3 de tais cadeias polipeptídicas não precisam ser idênticos em sequência, e vantajosamente são modificados para promover os com- plexantes entre as duas cadeias polipeptídicas.

Por exemplo, uma substituição de um aminoácido (de preferência uma substituição com um aminoácido compreendendo por um grupo lateral volumoso for- mando um "knob", por exemplo, triptofano) pode ser introduzida no domínio CH2 ou CH3, de modo que a interferência estérica impedirá que a interação com um domínio mutante similar e obrigará o domínio mutante para emparelhar com um domínio no qual uma mutação com- plementar ou acomodadora tem sido modificada, ou seja, "o hole" (por exemplo, uma substituição com glicina). Tais conjuntos de mutações podem ser projetados em qualquer par de polipeptídeos com domínios CH2-CH3 que constituem uma região Fc.

Métodos de engenharia de proteínas para favorecer a heterodimerização sobre a homodimeriza- ção são bem conhecidos na técnica, em especial no que diz respeito à engenharia de moléculas do tipo imunoglobulinas (ver, por exemplo, WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291, EP 1 870 459A1, bem como, Padilha et al. (1996) " 'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization, " Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) "Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library, " J.

Mol.

Biol. 270: 26- 35, e Xie et al. (2005) "A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis, " J.

Immunol.

Methods 296:95-101). Normalmente, nas abordagens co- nhecidas na técnica, o domínio CH3 da primeira cadeia pesada e o domínio CH3 da segunda cadeia pesada são modificados de modo complementar, de modo a que a cadeia pesada compreendendo um domínio CH3 modificado não pode mais se homodimerizar com outra cadeia pesada da mesma estrutura (por exemplo, uma primeira cadeia pesada CH3 modificada não pode mais se homodimerizar com outra primeira cadeira pesada CH3 modificada; e uma segunda cadeia pe- sada CH3 modificada não pode mais se homodimerizar com outra se- gunda cadeia pesada CH3 modificada). Assim, a cadeia pesada com- preendendo um domínio CH3 modificado é forçada a se heterodimeri- zar com outra cadeia pesada compreendendo o domínio CH3, que é modificado de maneira complementar. Para esta modalidade da inven- ção, o domínio CH3 da primeira cadeia pesada e o domínio CH3 da segunda cadeia pesada são modificados de modo complementar pelas substituições de aminoácidos, de tal forma que a primeira cadeia pe- sada e a segunda cadeia pesada são forçadas a heterodimerizar, con- siderando que a primeira cadeia pesada e a segunda cadeia pesada não podem mais se homodimerizar (por exemplo, por razões estéri- cas).

[0040] As diferentes abordagens para apoiar a heterodimerização da cadeia pesada conhecidas na técnica são contempladas como al- ternativas diferentes usadas em um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção. Em algumas modalidades da presente invenção, as mutações são incorporadas na sequência das cadeias pesadas dentro da região CH1 e CH3 e na sequência das cadeias leves na região constante da cadeia leve. As mutações CH1 e LC são feitas a favor de emparelhamento nativo dos pares necessários da cadeia leve e pesa- da cadeia e desfavorece o desemparelhamento da cadeia leve. As mu- tações CH3 são feitas a favor do emparelhamento heterodimérico das duas cadeias pesadas distintas e desfavorece a formação de homodí- meros.

[0041] De preferência, quando as mutações na região CH3 da porção anti-PD-L1 do anticorpo inclui posições 350, 351, 405 e 407 da numeração da UE, as mutações na região CH3 da porção anti-PD-1 do anticorpo inclui posições 350, 366, 392 e 394 da numeração da UE; quando as mutações na região CH3 da porção anti-PD-L1 do anticorpo inclui posições 350, 366, 392 e 394 da numeração da UE, as muta- ções na região CH3 da porção anti-PD-1 do anticorpo inclui posições 350, 351, 356, 405 e 407 na numeração da UE (como mostrado no alinhamento da sequência mostrado imediatamente abaixo). Alinhamento das sequências de aminoácidos da IgG1 humanado tipo selvagem (wt) e as regiões constante da cadeia pesada de anticorpos v3.2 e v13884 (as modificações preferidas estão subli- nhadas): IgG1-wt ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW

NSGALTSGV

3.2PD-L1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS

WNSGALTSGV 844PD-1 ASTKGPSVFPEAPSSKSTSGGTAALGCLVTDYFPEPVTV

SWNSGALTSGV

3.2PD-1 ASTKGPSVFPEAPSSKSTSGGTAALGCLVTDYFPEPVTVS

WNSGALTSGV 844PD-L1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS

WNSGALTSGV IgG1-wt HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT

KVDKKVEP

3.2PD-L1 HTFPAVLQSSGLYSLKSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS

NTKVDKRVEP 844PD-1 HTFPAVLESSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS

NTKVDKRVEP

3.2PD-1 HTFPAVLESSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS

NTKVDKRVEP 844PD-L1 HTFPAVLQSSGLYSLKSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS

NTKVDKRVEP IgG1-wt KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE

VTCVVVDVS

3.2PD-L1 KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT

PEVTCVVVSVS 844PD-1 KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT

PEVTCVVVSVS

3.2PD-1 KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT

PEVTCVVVSVS 844PD-L1 KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT

PEVTCVVVSVS IgG1-wt HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT

VLHQDWLNGK

3.2PD-L1 HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV

LTVLHQDWLNGK 844PD-1 HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV

LTVLHQDWLNGK

3.2PD-1 HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV

LTVLHQDWLNGK 844PD-L1 HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV

LTVLHQDWLNGK IgG1-wt EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTK

NQVSLTC

3.2PD-L1 EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSRD

ELTKNQVSLTC 844PD-1 EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSRD

ELTKNQVSLTC

3.2PD-1 EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVLPPSRD

ELTKNQVSLLC 844PD-L1 EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVLPPSRDE

LTKNQVSLLC IgG1-wt LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK

LTVDKSRW

3.2PD-L1 LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFAL

VSKLTVDKSRW 844PD-1 LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFAL

VSKLTVDKSRW

3.2PD-1 LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYLTWPPVLDSDGSFF

LYSKLTVDKSRW 844PD-L1 LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYLTWPPVLDSDGSFFL

YSKLTVDKSRW IgG1-wt QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 40)

3.2PD-L1 QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 41) 844PD-1 QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 42)

3.2PD-1 QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 43) 844PD-L1 QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 44)

[0042] De preferência, como mostrado sublinhado no alinhamento imediatamente acima, as mutações na região CH1 da porção anti-PD- L1 do anticorpo de preferência inclui a posição 183 na numeração da UE enquanto mutações na região CH1 da porção anti-PD-1 do anti- corpo de preferência inclui posições 128, 147 e 175 da numeração da UE.

[0043] A região CL da porção anti-PD-L1 do anticorpo é preferen-

cialmente um subtipo lambda humano. Com mais preferência, a região CL da porção anti-PD-L1 do anticorpo é uma variante de lambda hu- mano, compreendendo substituições de aminoácidos das posições 176 e 178 na numeração da UE (ver alinhamento abaixo) Alinhamento da sequência de aminoácidos da lambda humano do tipo selvagem (wt) com a região constante da cadeia leve PD-L1 de anticorpos v3.2, v3.0 e v13844 ou PD-1 (as modificações prefe- ridas estão sublinhadas): Lambda-wt QPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAV

TVAWKADGSPVK PD-L1 QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWK

ADSSPVK Lambda-wt AGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYS

CQVTHEGSTVEKTV PD-L1 AGVETTTPSKQSNNKYAAESELSLTPEQWKSHRSYSCQVT

HEGSTVEKTV Lambda APTECS (SEQ ID NO: 45) PD-L1 APAECS (SEQ ID NO: 46)

[0044] A região CL da porção anti-PD-1 do anticorpo é preferenci- almente um subtipo capa humano. A região CL da porção anti-PD-1 dos anticorpos da presente invenção é, de preferência, uma variante capa humana, compreendendo substituições de aminoácidos das po- sições 131, 133 e 176 na numeração da UE. Alinhamento das sequências de aminoácidos da capa humana do tipo selvagem (wt) e as regiões constantes da cadeia leve de anti- corpos contra PD-1 (as modificações preferidas estão sublinha- das): Kappa-wt RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK VQ

WKVDNALQSG PD-1 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTARVGCLLNNFYPREAKVQ

WKVDNALQSG Kappa-wt NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT

HQGLSSPVTK PD-1 NSQESVTEQDSKDSTYSLRSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH

QGLSSPVTK Kappa-wt SFNRGEC (SEQ ID NO: 47) PD-1 SFNRGEC (SEQ ID NO: 48)

[0045] Em determinados anticorpos da presente invenção, as mu- tações de emparelhamento heterodiméricas da cadeia pesada rende- ram uma estabilidade térmica CH3 superior a 78°C.

[0046] Quando expressados em certos sistemas biológicos, os an- ticorpos tendo sequências Fc são glicosilados na região Fc. Normal- mente, a glicosilação ocorre na região Fc do anticorpo em um sítio de N-glicosilação altamente conservado. N-glicanos normalmente se fi- xam à asparagina. Os anticorpos podem ser glicosilados também em outras posições.

[0047] De preferência, os anticorpos da presente invenção contêm uma porção Fc variante que é derivada da IgG1 humana. A IgG1 é bem conhecida por se ligar a família do receptor Fc-gama (FcϒR), bem como ao C1q. A interação com esses receptores pode induzir ci- totoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Por isso, certas substituições de aminoácidos são introduzidas na região Fc da IgG1 humana para os anticorpos da presente invenção para extirpar as funções efetoras imunes. Mutações na região CH2 das cadeias pesadas do anticorpo podem incluir posições 234, 235 e 265 na numeração da UE para re- duzir ou eliminar as funções efetoras imunes, como mostrado.

[0048] Um DNA isolado codificando uma região HCVR pode ser convertido para um gene da cadeia pesada de comprimento completo ao ligar de maneira funcional o DNA que codifica a HCVR a outra mo-

lécula de DNA codificando uma região constante da cadeia pesada ou uma variante desta. As sequências de genes da região constante da cadeia pesada de humanos, assim como de outros mamíferos, são conhecidas na técnica. Os fragmentos de DNA abrangendo essas re- giões podem ser obtidos, por exemplo, por uma amplificação da PCR padrão. De preferência, para os anticorpos da presente invenção, as regiões constantes de cadeia pesada das cadeias pesadas são varian- tes da IgG1 humana.

[0049] Um DNA isolado codificando uma região LCVR pode ser convertido para um gene da cadeia leve de comprimento completo ao ligar de maneira funcional o DNA que codifica a LCVR a outra molécu- la de DNA codificando uma região constante da cadeia leve ou uma variante desta. As sequências de genes da região constante da cadeia leve de humanos, assim como de outros mamíferos, são conhecidas na técnica. Os fragmentos de DNA abrangendo essas regiões podem ser obtidos por uma amplificação da PCR padrão. A região constante da cadeia leve pode ser uma região constante capa ou lambda. De preferência, para anticorpos da presente invenção, a região constante da cadeia leve da porção anti-PD-L1 do anticorpo é uma variante de cadeia leve lambda e a região constante de cadeia leve da porção an- ti-PD-1 do anticorpo é uma variante de cadeia leve capa .

[0050] Os polinucleotídeos da presente invenção podem ser ex- pressados em uma célula hospedeira depois que as sequências tive- rem sido ligadas de maneira funcional a uma sequência de controle de expressão. Os vetores de expressão são tipicamente replicáveis nos organismos hospedeiros, quer como epissomas ou como parte inte- grante do DNA cromossômico hospedeiro. Comumente, vetores de expressão irão conter marcadores de seleção, por exemplo, tetracicli- na, neomicina, glutamina sintetase e dihidrofolato redutase, para per- mitir a detecção dessas células transformadas com as sequências de

DNA desejadas.

[0051] O anticorpo da presente invenção pode ser facilmente pro- duzido em células de mamíferos como células CHO, NS0, HEK293 ou COS. As células hospedeiras são cultivadas usando métodos bem co- nhecidos na técnica.

[0052] Os vetores contendo as sequências polinucleotídicas de interesse (por exemplo, os polinucleotídeos codificando os polipeptí- deos de anticorpo e as sequências de controle de expressão) podem ser transferidos para a célula hospedeira por métodos bem conheci- dos, que podem variar dependendo do tipo do hospedeiro celular.

[0053] Vários métodos de purificação de proteínas podem ser em- pregados e esses métodos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990) and Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3a Edição, Springer, NY (1994).

[0054] Em outra modalidade da presente invenção, o anticorpo, ou os ácidos nucleicos codificando o mesmo, é fornecido em forma isola- da. Como usado aqui, o termo "isolado" refere-se a uma proteína, um peptídeo ou ácido nucleico que é livre ou substancialmente livre de quaisquer outras espécies macromoleculares encontradas em um am- biente celular. “Substancialmente livre", conforme usado aqui, significa a proteína, o peptídeo ou ácidos nucléicos de interesse compreenden- do mais de 80% (em termos molares) das espécies macromoleculares presentes, de preferência, mais de 90%, e mais, de preferência, mais de 95%.

[0055] O anticorpo da presente invenção, ou composições farma- cêuticas compreendendo o mesmo, pode ser administrado por vias parenterais (por exemplo, subcutânea e intravenosa). Um anticorpo da presente invenção pode ser administrado a um paciente sozinho com carreadores farmaceuticamente aceitáveis, diluentes ou excipientes em doses únicas ou múltiplas. Composições farmacêuticas da presen- te invenção podem ser preparadas por métodos bem conhecidos na técnica (por exemplo, Remington: The Science and Practice of Phar- macy, 22ª ed. (2012), A. Loyd et al., Pharmaceutical Press) e compre- endem um anticorpo conforme revelado aqui, e um ou mais carreado- res farmaceuticamente aceitáveis, diluentes ou excipientes.

[0056] O termo "tratando" (ou "tratar" ou "tratamento") refere-se a retardar, interromper, conter, aliviar, parar, reduzir, ou reverter a pro- gressão ou a gravidade de um sintoma, desordem, condição ou doen- ça existente.

[0057] “Se liga", como usado aqui em referência à afinidade de um anticorpo para PD-L1 humana (SEQ ID NO: 1), PD-1 humana (SEQ ID NO: 2), ou ambas se destinam a significar, salvo indicação em contrá- rio, uma KD menor que cerca de 1 x10-6 M, preferencialmente, menor que cerca de 1 x 10-9 M, conforme determinado pelos métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo o uso de um biossensor de ressonân- cia de plásmon de superfície (SPR) a 37oC, essencialmente, como descrito aqui.

[0058] “Quantidade eficaz” significa a quantidade de um anticorpo da presente invenção ou composição farmacêutica compreendendo um anticorpo da presente invenção que vai eliciar a resposta biológica ou médica do efeito terapêutico desejado ou sobre um tecido, sistema, mamífero, animal ou humano, que está sendo procurado pelo pesqui- sador, médico ou outro clínico. Uma quantidade eficaz do anticorpo pode variar de acordo com fatores como o estado de doença, idade, sexo e peso do indivíduo e a capacidade do anticorpo para eliciar uma resposta desejada do indivíduo. Uma quantidade eficaz é também aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou efeitos prejudiciais do anti- corpo são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos.

[0059] Essa invenção é ilustrada ainda pelos seguintes Exemplos não limitadores. Exemplo 1: Expressão e purificação do anticorpo

[0060] Os polipeptídeos das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve, as sequências completas de cadeia pesada e de ca- deia leve de aminoácidos de anticorpos v3.2, v3.0 e v13844, e a se- quências de nucleotídeos codificando o mesmo, estão listadas abaixo, na seção intitulada "Sequências de nucleotídeos e de aminoácidos". Além disso, as SEQ ID NOs das sequências de aminoácidos de cadeia leve, cadeia pesada, região variável da cadeia leve e região variável de cadeia pesada dos Anticorpos v3.2, v3.0 e v13844 são mostradas na Tabela 1(a) abaixo. Além disso, as SEQ ID NOs para as sequên- cias de aminoácidos das CDRs das regiões variáveis de ligação de PD-L1 e PD-1 dos Anticorpos v3.2, v3.0 e v13844 são mostradas na Tabela 1(b) e 1(c), respectivamente.

[0061] Os anticorpos da presente invenção, incluindo, mas não limitado a, Anticorpos v3.2, v3.0 e v13844, podem ser feitos e purifica- dos, essencialmente, como segue. Uma célula hospedeira apropriada, como CHO, pode ser transitoriamente ou estavelmente transfectada com um sistema de expressão de anticorpos secretores utilizando um vetor quad (ou seja, um único vetor codificando para a expressão das duas cadeias leves e duas cadeias pesadas), vetores duplos (ou seja, dois vetores, que, juntos, codificam a duas cadeias leves diferentes e duas cadeias pesadas diferentes), ou quatro vetores únicos (dois dos quais codificam uma cadeia leve e dois dos quais codificam uma ca- deia pesada diferente). O meio, em que o anticorpo foi secretado, po- de ser purificado usando qualquer uma das muitas técnicas comumen- te usadas. Por exemplo, o meio pode ser aplicado a uma coluna Mab- Select (GE Healthcare) ou coluna KappaSelect (GE Healthcare) para o fragmento Fab, que foi equilibrado com um tampão compatível, como, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4). A coluna pode ser lavada para remover componentes de ligação não específi- cos. O anticorpo ligado pode ser eluído, por exemplo, por gradiente de pH (como 20 mM de tampão Tris pH 7 a 10 mM de tampão de citrato de sódio pH 3,0, ou solução salina tamponada com fosfato pH 7,4 a 100 mM de tampão glicina pH 3,0). Frações de anticorpos podem ser detectadas, como por SDS-PAGE e, em seguida, podem ser agrupa- das. Agregados e multímeros solúveis podem ser efetivamente remo- vidos por técnicas comuns, incluindo exclusão de tamanho, interação hidrofóbica, troca iônica, cromatografia multimodal ou hidroxiapatita. O anticorpo pode ser filtrado concentrado e/ou estéril usando técnicas comuns. O produto pode ser imediatamente congelado a -70°C ou po- de ser liofilizado. Tabelas 1(a)-(c): SEQ ID Nos para sequências de anticorpo bies- pecífico inibidor de checkpoint (BsAb) 1(a) Anticorpo Anticorpo Anticorpo v3.2 v3.0 v13844 HCVR – anti-PD-L1 3 3 3 HCVR – anti-PD-1 6 7 7 LCVR – anti-PD-L1 4 4 4 LCVR – anti-PD-1 8 8 8 Cadeia pesada 1 – anti-PD-L1 49 49 29 Cadeia pesada 2 – anti-PD-1 31 32 33 Cadeia leve 1 – anti-PD-L1 30 30 30 Cadeia leve 2 – anti-PD-1 34 34 34 1(b) Anti-PD-L1 CDR1 CDR2 CDR3

HC KASGGTFSSYAIS GIIPIFGTANYAQKFQG ARSPDYSPYYYYGMDV (SEQ ID NO: 16) (SEQ ID NO: 17) (SEQ ID NO: 18)

LC SGSSSNIGSNTVN YGNSNRPS QSYDSSLSGSV (SEQ ID NO: 19) (SEQ ID NO: 20) (SEQ ID NO: 21) 1(c) Anti-PD1 CDR1 CDR2 CDR3 HC KASGGTFSSYAIS LIIPSFDTAGYAQKFQG (SEQ ID ARAEHSSTGTFDY (SEQ ID NO: 22) NO: 23) ou LIIPMFDTAGYAQKF (SEQ ID NO: 25) QG (SEQ ID NO: 24) LC RASQGISSWLA (SEQ SAASSLQS (SEQ ID NO: 27) QQANHLPFT (SEQ ID NO: 26) ID NO: 28)

Exemplo 2: Ligação para ambas PD-L1 e PD-1 humanas como medida para ELISA

[0062] A capacidade para anticorpos da presente invenção para ligar ambas PD-L1 humana e PD-1 humana pode ser medida em um teste ELISA intercalado. Para o ensaio de ligação a PD-1, uma placa de 96 poços (Nunc) pode ser revestida com PD-1-Fc humana (R&D Systems, cat. #1086-PD) durante a noite a 4oC. Poços podem ser blo- queadas por 2 horas com tampão de bloqueio (PBS contendo 5% de leite seco desnatado). Poços podem ser lavados três vezes com PBS contendo 0,1% de Tween-20. O anticorpo anti-PD-1 ou IgG controle (100 μl) podem então ser adicionados e, em seguida, a placa pode ser incubada à temperatura ambiente por 1 hora. Após a lavagem, a placa pode ser incubada com 100 μl de conjugado de cabra anti-IgG humana F(ab')2-HRP (Jackson Immuno Resaerch, cat. #109-035-097) em tem- peratura ambiente por 1 hora. A placa pode ser lavada e, então, pode ser incubada com 100 μl de 3,3',5,5'-tetra-metilbenzidina. Absorvância a 450 nm pode ser lida em um leitor de microplacas. A metade da con- centração máxima eficaz (EC50) pode ser calculada usando o softwa- re GraphPad Prism 6.

[0063] Para o ensaio de ligação de PD-L1, um procedimento simi- lar pode ser aplicado, exceto que a placa de 96 poços (Nunc) pode ser revestida com PD-L1-Fc humana (R&D Systems, cat#156-B7) durante a noite, a 4oC.

[0064] Em experimentos realizados essencialmente como descri- tos acima nesse Exemplo 2, o Anticorpo v3.2 se liga a PD-1 humana com uma EC50 de 0,0802 nM. Em comparação, a afinidade de ligação do anticorpo PD-1 original (com o homodímero IgG4-PAA) é 0,1318 nM. O anticorpo v3.2 se liga a PD-L1 humana com uma EC50 de 0,4554 nM. Em comparação, a afinidade de ligação do anticorpo PD- L1 original (como homodímero IgG1-EN) é 0,4702 nM.

Exemplo 3: Células expressando a ponte PD-1 com células ex- pressando PD-L1

[0065] A capacidade de os anticorpos da presente invenção faze- rem ponte entre as células expressando PD-1 e PD-L1 foi determinada por citometria de fluxo, usando células CHO transfectadas expressan- do uma PD-1 ou PD-L1. Resumidamente, células de sobre-expressão CHO-PD1 e CHOK1-PDL1 podem ser rotuladas com diferencialmente com CFSE (diacetato de carboxifluoresceína éster sucinimidil) (BD Ho- rizon) ou Profundo vermelho rastreador de célula (CTDR/Thermo). As células CHO-PD1 e CHOK1-PDL1 são separadamente incubadas por 2 horas com um anticorpo de teste, como o Anticorpo v3.2 (no gelo em PBS + 1% BSA + 0,09% azida de sódio). Anticorpos não ligados po- dem ser removidos por lavagem (2X com 200 µl PBS + 1% BSA + 0,09% azida de sódio). As células CHOK1-PDL1 são incubadas 2 ho- ras com 45 µg/ml do anticorpo PD-L1 original ou hIgG1 controle no ge- lo em PBS + 1% BSA + 0,09% azida de sódio. As células CHO-PD1 são incubadas 2 horas com 45 µg/ml do anticorpo PD-1 original ou huIgG4-PAA no gelo em PBS + 1%BSA + 0,09% azida de sódio. As células CHO-PD1/ Anticorpo v3.2 são misturadas com CHOK1-PDL1+ o anticorpo PD-L1 original ou hIgG1 em concentração final de 22,5µg/ml. As células CHOK1-PDL1/ Anticorpo v3.2 podem ser mistu- radas com CHO-PD1 + o original do anticorpo da PD-1 ou huIgG4- PAA a uma concentração final de 22,5 µg/ml. Depois de aproximada- mente 72 horas de incubação (a 4°C) as células podem ser medidas em Fortessa X20 (com amostrador HTS) nos canais adequados para CFSE e CTDR. Usando software flowJo® (FlowJo, LLC, Ashland, OR), eventos duplos positivos (CFSE+/CTDR +) podem ser fechados e % do total de eventos pode ser calculada e comunicada (para poços 2 de replicação). Ajustes e estatísticas podem ser gerados com o software Graphpad Prism usando regressão não linear (inclinação variável, 4 parâmetros).

[0066] Em experimentos realizados essencialmente como descrito acima no Exemplo 3, os anticorpos biespecíficos PD-1/PD-L1 mediam a ponte de células que podem ser detectadas como de eventos duplos positivos por citometria de fluxo. Ligação do Anticorpo v3.2 às células CHO-PD1 ou CHOK1-PDL1 (com posterior remoção de não ligados) e, em seguida, a mistura com células CHOK1-PDL1 ou CHO-PD1, res- pectivamente, causou um aumento dependente da dose em eventos duplos positivos em relação ao fundo (aumento de até 4 vezes compa- rado com apenas tampão). Este aumento nos eventos duplos positivos é bloqueado pela adição de excesso de mAbs PD-L1 e/ou PD-1 con- correntes em concentração elevada, mas não pela correspondência de IgG controle não específico, demonstrando a especificidade e a de- pendência da expressão do antígeno-alvo. Exemplo 4: Bloqueio das interações de PD-L1 com PD-L2, PD-L1 com CD80 e PD-L2 com a PD-1

[0067] Um ensaio de bloqueio de PD-L1/PD-1 pode ser realizado por mistura de quantidades variáveis de anticorpos anti-PD-1 ou de IgG controle com uma quantidade fixa de proteína de fusão biotinilada PD-1-Fc (100 ng/mL) e incubação à temperatura ambiente durante cerca de 1 hora. Posteriormente, a mistura pode ser transferida para placas de 96 poços pré-revestidas com PD-L1-Fc (100 ng/poço) ou PD-L2-Fc (100 ng/poço) e, em seguida, incubada à temperatura ambi- ente por cerca de mais 1 hora. Após a lavagem, o conjugado HRP es- treptavidina pôde ser adicionado, e a absorvância a 450 nm pôde ser lida. IC50 representa a concentração de anticorpo necessário para ini- bição de 50% de PD-1 de ligação a PD-L1 ou ligação a PD-L2.

[0068] Da mesma forma, um ensaio de bloqueio de PD-L1/B7-1 pode ser realizado usando placas revestidas com 1 µg/ml B7-1-Fc (R&D Systems, cat#140-B1-100). A concentração de anticorpos ne-

cessária para 50% de inibição de PD-L1 de ligação a B7-1 (IC50) é calculada usando o software GraphPad Prism 6.

[0069] Em experimentos realizados essencialmente como descrito acima no Exemplo 4, o Anticorpo v3.2 apareceu para bloquear a inte- ração entre o receptor PD-1 e o ligante PD-L1 na concentração inter- mediária e maior e pareceu ser a ponte entre o receptor e o ligante com a ligação dupla na concentração menor e intermediária, com afi- nidades mais fortes do que a interação natural ligante-receptor. Além disso, o Anticorpo v3.2 apareceu para bloquear a interação de PD-L1 com B7-1 com um IC50 de 0,75 nM e a interação de PD-L2 com PD-1 com um IC50 de 2,27 nM. Exemplo 5: Análise funcional in vitro de anticorpos em reação leucocitária mista (MLR)

[0070] Os monócitos CD14+ podem ser isolados a partir de PBMC humano congelado obtido de um doador saudável (AllCells cat. #PB005F) com microesferas MACS (Miltenyi, cat. #130-091-153). Cé- lulas dendríticas imaturas (DC) podem ser geradas por cultivar estes monócitos em 12 ml de meio RPMI-1640 completo na presença de 1000 UI/ml hGM-CSF e 500 UI/ml hIL-4 por 4 dias. As células CD4+ podem ser purificadas a partir de PBMC humano congelado obtido de um diferente doador saudável (AllCells cat. #PB002) por seleção nega- tiva (Miltenyi 130-096-533). Então, os dois tipos de células podem ser misturados em poços individuais de uma placa de 96 poços com 100 µl de meio AIM-V completo contendo 5 x 104 células CD4+ T e 4 x 103 DC imaturos por poço (E:T = 12,5:1). 100 µl de meio AIM-V completo pode ser adicionado contendo IgG1-EN humana, o anticorpo anti-PD-1 original, o anticorpo anti-PD-1 original, combinações de anticorpos ori- ginais, ou Anticorpo v3.2 em 8 repetições (serialmente diluído apor 3:1 a partir de 32nM), respectivamente). Após incubação por 72 horas a 37°C, a 5% CO2, os sobrenadantes podem ser colhidos e, em segui-

da, medidos para a IFN-γ e IL-2 humana com kits ELISA (R&D cat# SIF50) e (R&D cat# S2050).

[0071] Em experimentos realizados essencialmente como descrito acima no Exemplo 5, a adição do Anticorpo v3.2 para coculturas de células T CD4+ e DC alogênicas resultou em aumento da produção de IFN-β, através da resposta de linfócitos de células T CD4 com uma EC50 de 0,005 nM, em comparação com 0,026 nM, 0,029 nM e 0,115 nM para o Ab PD-L1 original, o Ab PD-1 original e uma combinação dos dois, respectivamente. Da mesma forma, o Anticorpo v3.2 também aumentou a produção de IL-2 em cocultura com uma EC50 de 0,011 nM, em comparação com a combinação de Ab PD-L1, Ab PD-1 e Ab PD-L1 + Ab PD-1 (0,034 nM, 0,023 nM e 0,046 nM, respectivamente). Os resultados indicam que o Anticorpo v3.2 é superior em sua capaci- dade para aumentar a ativação de células T in vitro para o Ab PD-L1 original sozinho, o Ab PD-1 original sozinho ou uma combinação dos mesmos. Exemplo 6: Células T revigorante

[0072] As células CHOK1 T-ativadoras humanas positivas PD-L1 (Promega parte #CS187108) e células CHOK1 T-ativadoras PD-L1- humanas negativas (Promega parte #CS187110) podem ser obtidas a partir de Promega. As células CHOK1 T-ativadoras humanas duplas positivas PD-L1/PD-L2 podem ser estabelecidas ao transfectar as cé- lulas CHOK1 T-ativadoras humanas positivas PD-L1 com um vetor co- dificando a PD-L2 de comprimento completo. Estas células podem ser em plaqueadas em uma placa branca opaca de 96 poços para cultura de tecido em 40.000 células por poço em 100 µL de meio (10% SFB F- 12, 0,2 mg/ml Hygromycin-B e 0,2 mg/ml G418) e incubadas a 37°C com 5% CO2. O meio pode ser removido de placas de ensaio no dia seguinte e anticorpos de controle e teste diluídos em série no tampão de ensaio (2% FBS RPMI) podem ser adicionados a 40 µl por poço. As células GloResponse NFAT-luc2/PD1Jurkat (Promega parte #CS187102) podem ser ressuspensas em tampão de ensaio na con- centração de 1,25 x 106 /mL e adicionadas à placa a 40 µl por poço. Após 6 horas de indução, as placas de ensaio podem ser removidas da incubadora e equilibradas em temperatura ambiente por 5 a 10 mi- nutos. O reagente Bio-Glo™ (Promega G7941) pode ser preparado de acordo com as instruções do fabricante e adicionado a 80 µl por poço. E, em seguida, as placas podem ser incubadas por 5 a 10 minutos em temperatura ambiente. Luminescência pode ser medida em um leitor de placa e os dados podem ser analisados usando o software Gra- phPad Prism 7.

[0073] Em um ensaio de células T Jurkat Repórter PD-1/NFAT realizada essencialmente como descrito acima no Exemplo 6, as célu- las CHO ativadoras de células T humanas positivas PD-L1 foram ob- servadas para suprimir a ativação de células T. As células T reativadas de Ab PD-1 ou Ab PD-L1 por reversão da supressão mediada por PD- L1 - PD-1. No entanto, o Anticorpo v3.2 pareceu superior (EC50 0,12 nM) para o Ab PD-L1 original sozinho (1,92 nM), o Ab PD-1 original sozinho (1,01 nM), ou combinação de Ab PD-1 original e o Ab PD-L1 original (0,796 nM) na sua capacidade para revigorar as células T. Quando as células CHO T-ativadoras humanas duplas positivas PD- L1/PD-L2 foram usadas neste sistema, a ativação de células T repórter positivas PD-1 também foi suprimida. O Ab PD-1 original, mas não o Ab PD-L1 original foi capaz de reativar as células T. No entanto, o An- ticorpo v3.2 é superior (EC50 0,181 nM) para o Ab PD-1 original sozi- nho (0,946 nM) ou uma combinação de Ab PD-1 original e o Ab PD-L1 original (1,251 nM) na sua capacidade para revigorar as células T. Exemplo 7: Ensaios de eficácia in vivo

[0074] A eficácia dos anticorpos da presente invenção pode ser testada em modelos de xenoenxerto em camundongos imunodeficien-

tes reconstituídos com células imunes humanas, para avaliar a capa- cidade de retardar ou destruir tumores estabelecidos no modelo por meio de reforço da resposta de células T para alo-antígenos. Todos os animais nos estudos são aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee e realizados em conformidade com os regulamentos em vigor e as normas do Departamento dos Estados Unidos de Agri- cultura e o Instituto Nacional de Saúde. Parte A: Modelo de xenoenxerto de CPNPC humana NCI-H292

[0075] Os camundongos NOD scid gama (NSG) de Laboratórios de Jackson (7 semanas de idade, fêmeas, em grupos de 7-8 camun- dongos) são implantados no flanco, por via subcutânea, com 2 x 106 células NCI-H292, ou de uma mistura de 2 x 106 células NCI-H292 e 1 x 106 PBMCs humano isolado na hora em HBSS (0,2 ml de volume total). A começar no Dia 1, os camundongos são tratados com uma injeção intraperitoneal de IgG1-EN humana (controle), o anticorpo anti- PD-L1 original (0,25 mg/kg) ou o anticorpo anti-PD-1 original (0,25 mg/kg), ou uma combinação de anticorpos originais (0,25 mg/kg cada), ou Anticorpo v3.0, v3.2 ou v13844 (0,5 mg/kg) uma vez por semana por três doses. O bem-estar animal e o comportamento, incluindo a arrumação e a deambulação, são monitorados pelo menos duas vezes por semana. O peso corporal e o volume do tumor são medidos duas vezes por semana.

[0076] Nos experimentos realizados, essencialmente, como des- crito na Parte A do Exemplo 7, Anticorpos v3.0, v3.2 e v13844 dosea- do a 10 mg/kg foram bem tolerados e seguros como monitorado pelo peso corporal e observações clínicas. Em camundongos implantados com mistura de células tumorais NCI-H292 e PBMC, tratamento com anticorpo anti-PD-L1 ou anti-PD-1, ou uma combinação de anticorpos anti-PD-L1 e anti-PD-1 a 10 mg/kg, todos atrasaram o crescimento do tumor em relação ao tratamento com a molécula controle, IgG1-EN humana. Em camundongos implantados com mistura de células do tumor NCI-H292 e PBMC, o tratamento com Ab biespecífico PD-1/PD- L1 (v13844, v3.0 ou v3.2) a 10 mg/kg uma vez por semana foram mais eficazes com uma regressão completa (CR) em 7/8, 5/8 e 5/8, respec- tivamente, do que a terapia combinada (anticorpo PD-L1 original + an- ticorpo PD-1 original) (CR em 2/8). Parte B: Modelo de xenoenxerto de CPNPC humana HCC827

[0077] Os camundongos NSG de Laboratórios de Jackson (7 se- manas de idade, fêmeas, em grupos de 8 camundongos) são implan- tados no flanco, por via subcutânea, com 2 x 106 células HCC827 em HBSS (0,2 ml de volume total). Células T humanas a granel isoladas de sangue total (Centro de sangue de Nova York) são expandidas usando o ativador T humano CD3/CD28 Dynabeads® por 10 dias e criopreservadas. As células T são descongeladas, lavadas, contadas e infundidas por via intravenosa (3,5 x 106 células T em 0,2 ml de PBS por camundongo) em camundongo carregando tumor HCC827 no dia 44 de implante. A partir do dia seguinte, os camundongos são tratados com uma injeção intraperitoneal de IgG1-EN humana (controle), anti- corpo anti-PD-L1 original, anticorpo anti-PD-1 original, ou a combina- ção de anticorpo anti-PD-L1 original e o anticorpo anti-PD-1 original, em 2 mg/kg cada, ou Anticorpo v3.2 em três níveis de doses (0,02, 0,2 ou 2 mg/kg), uma vez por semana durante 4 semanas. Os camundon- gos recebem uma segunda infusão de células T expandidas (2,5 x 106 células T em 0,2 ml de PBS por camundongo) no Dia 56. O bem-estar animal e o comportamento, incluindo a arrumação e a deambulação, são monitorados pelo menos duas vezes por semana. O peso corporal e o volume do tumor são medidos duas vezes por semana. Os volu- mes tumorais são medidos uma vez por semana usando pinças ele- trônicas como descrito em SOP, intitulado: IM - Medição do crescimen- to do tumor. O volume tumoral é calculado através de uma fórmula:

Volume tumoral (mm3) = π/6 * comprimento * largura2.

[0078] Nos experimentos realizados, essencialmente, como des- crito na Parte B do Exemplo 7, o Anticorpo v3.2 em todos os três ní- veis de doses (0,02, 0,2 ou 2 mg/kg) compartilharam de resposta anti- tumoral semelhante no modelo de tumor HCC827 na presença de cé- lulas T expandidas. Além disso, o Anticorpo v3.2 em 0,02 mg/kg atra- sou o crescimento do tumor de forma mais significativa do que o anti- corpo anti-PD-L1 (2 mg/kg, p=0,05), anticorpo anti-PD-1 (2 mg/kg, p<0,001) e a combinação de ambos os agentes (2 mg/kg cada, p<0,001) no Dia 69 pós-implante de células tumorais (ver Tabela 2). Tabela 2: Inibição do tumor no Dia 69 no modelo de tumor de CPNPC humana HCC827 estabelecido Volume do tumor (em mm3) Valor de p (vs. 0,02 mg/kg Grupo de tratamento no Dia 69 (média ± EPM) BsAb v3.2/células T) 2 mg/kg de IgG1-EN humana 1572,4 ± 87,8 <0,001 2 mg/kg de IgG1-EN humana/células T 1062,2 ± 81,7 <0,001 2 mg/kg Anti PD-L1 mAb/células T 968,7 ± 58,7 0,005 2 mg/kg Anti PD-1 mAb/células T 1275,0 ± 67,2 <0,001 2 mg/kg Anti PD-L1 mAb + 1021,0 ± 58,9 <0,001 2 mg/kg Anti PD-1 mAb /células T 0,02 mg/kg de anticorpo v3.2 /células T 761,8 ± 33,3 NA 0,2 mg/kg de anticorpo v3.2 /células T 759,8 ± 43,3 0,975 2 mg/kg de anticorpo v3.2 /células T 721,3 ± 49,2 0,516 EPM: Estimativa padrão da média

SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS E NUCLEOTÍDEOS SEQ ID NO: 1 (PD-L1 humana)

MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDL AALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQ ITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSE HELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRIN TTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCL

GVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET SEQ ID NO: 2 (PD-1 humana)

MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNAT FTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPN GRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPT AHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARR TGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPS

GMGTSSPARRG SADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL SEQ ID NO: 3 (HCVR de PD-L1 Ab)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGII PIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSPDYSP

YYYYGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 4 (LCVR de PD-L1 Ab)

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYG NSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCQSYDSSLSGSVFG

GGIKLTVLG SEQ ID NO: 5 (HCVR de PD-1 Ab-Xaa)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGLI IPXaaFDTAGYAQKFQGRVAITVDESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAE

HSSTGTFDYWGQGTLVTVSS Xaa: M ou S. SEQ ID NO: 6 (HCVR de PD-1 Xaa-S)

QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS SYAISWVRQA PGQGLEWMGL IIPSFDTAGY

AQKFQGRVAI TVDESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARAE HSSTGTFDYW GQGTLVTVSS SEQ ID NO: 7 (HCVR de PD-1 Xaa-M)

QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS SYAISWVRQA PGQGLEWMGL IIPMFDTAGY

AQKFQGRVAI TVDESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARAE HSSTGTFDYW GQGTLVTVSS SEQ ID NO: 8 (LCVR de PD-1 Ab)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLISAA SSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANHLPFTFGGGT

KVEIK SEQ ID NO: 9 (região do domínio CH1 de PD-L1 Ab v3.2 e v13844 HC)

SLKSV SEQ ID NO: 10 (região do domínio CH2 de PD-L1 Ab HC)

AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVS SEQ ID NO: 11 (região do domínio CH3 de HC para PD-1 v13844 e PD-L1 v3.)

VYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP

VLDSDGSFALV SEQ ID NO: 12 (região do domínio CH3 de HC para PD-1 v3.2 e PD- L1 v13844)

VLPPSRDELTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYLTW SEQ ID NO: 13 (região do domínio CH1 de PD-1 Ab v3.2 e PD-1 v13844 HC)

EAPSSKSTSGGTAALGCLVTDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLE SEQ ID NO: 14 (região da região constante LC de PD-L1 v3.2 e v13844 Abs)

AAESELS SEQ ID NO: 15 (região da região constante LC de PD-1 v3.2 e v13844 Ab)

RVGCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLR SEQ ID NO: 16 (HCDR1 de PD-L1 Ab)

KASGGTFSSYAIS SEQ ID NO: 17 (HCDR2 de PD-L1 Ab)

GIIPIFGTANYAQKFQG SEQ ID NO: 18 (HCDR3 de PD-L1 Ab)

ARSPDYSPYYYYGMDV SEQ ID NO: 19 (LCDR1 de PD-L1 Ab)

SGSSSNIGSNTVN SEQ ID NO: 20 (LCDR2 de PD-L1 Ab)

YGNSNRPS SEQ ID NO: 21 (LCDR3 de PD-L1 Ab)

QSYDSSLSGSV SEQ ID NO: 22 (HCDR1 de PD-1 Ab)

KASGGTFSSYAIS SEQ ID NO: 23 (HCDR2 de PD-1 Ab; v3.2)

LIIPSFDTAGYAQKFQG SEQ ID NO: 24 (HCDR2 de PD-1 Ab; v3.0)

LIIPMFDTAGYAQKFQG SEQ ID NO: 25 (HCDR3 de PD-1 Ab)

ARAEHSSTGTFDY SEQ ID NO: 26 (LCDR1 de PD-1 Ab)

RASQGISSWLA SEQ ID NO: 27 (LCDR2 de PD-1 Ab)

SAASSLQS SEQ ID NO: 28 (LCDR3 de PD-1 Ab)

QQANHLPFT SEQ ID NO: 29 (HC de PD-L1 Ab v13844)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGI IPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSPDY SPYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLKSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYV LPPSRDELTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYLTWPPVLDS

DGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 30 (LC de PD-L1 Ab v3.2, v3.0 e v13844)

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIY GNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCQSYDSSLSGSVF GGGIKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAW KADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAAESELSLTPEQWKSHRSYSCQVTH

EGSTVEKTVAPAECS SEQ ID NO: 31 (HC de PD-1 Ab v3.2)

QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS SYAISWVRQA PGQGLEWMGL IIPSFDTAGY AQKFQGRVAI TVDESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARAE HSSTGTFDYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP EAPSSKSTSG GTAALGCLVT DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLESS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVSVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYVLPPSRDE LTKNQVSLLC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYLTWPPV

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK SEQ ID NO: 32 (HC de PD-1 v3.0)

QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS SYAISWVRQA PGQGLEWMGL IIPMFDTAGY AQKFQGRVAI TVDESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARAE HSSTGTFDYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP EAPSSKSTSG GTAALGCLVT DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLESS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVSVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYVLPPSRDE LTKNQVSLLC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYLTWPPV

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK SEQ ID NO: 33 (HC de PD-1 Ab v13844)

QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS SYAISWVRQA PGQGLEWMGL IIPMFDTAGY AQKFQGRVAI TVDESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARAE HSSTGTFDYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP EAPSSKSTSG GTAALGCLVT DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLESS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVSVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYVYPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV

LDSDGSFALV SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK SEQ ID NO: 34 (LC de PD-1 Ab v3.2, v3.0 e v13844)

DIQMTQSPSS VSASVGDRVT ITCRASQGIS SWLAWYQQKP GKAPKLLISA ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ ANHLPFTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA RVGCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLRSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG

LSSPVTKSFN RGEC SEQ ID NO: 35 Sequência de DNA de PD-L1 LC

CAGTCCGTCC TGACTCAGCC ACCTTCCGCT AGCGGTACCC CCGGCCAGAG AGTGACAATC TCATGCTCCG GTTCCAGCTC TAACATTGGC TCTAACACTG TCAATTGGTA CCAGCAGCTG CCAGGAACCG CACCAAAGCT GCTGATCTAT GGAAACTCAA ATAGGCCTAG CGGGGTGCCA GACCGGTTTA GCGGATCTAA AAGTGGGACT TCAGCTTCCC TGGCAATTTC TGGACTGCAG AGTGAGGACG AAGCTGATTA CTATTGCCAG TCCTACGATA GTTCACTGAG CGGTTCCGTG TTCGGCGGAG GGATCAAGCT GACAGTCCTG GGCCAGCCCA AGGTGAGTTC TAGAGGATCC ATCTGGGATA AGCATGCTGT TTTCTGTCTG TCCCTAACAT GCCCTGTGAT TATCCGCAAA CAACACACCC AAGGGCAGAA CTTTGTTACT TAAACACCAT CCTGTTTGCT TCTTTCCTCA GGCCGCTCCT TCCGTGACTC TGTTTCCCCC TTCCAGCGAG GAACTGCAGG CCAATAAGGC CACCCTGGTG TGCCTGATTA GCGACTTCTA TCCTGGAGCT GTGACAGTCG CATGGAAGGC CGATTCTAGT CCAGTGAAAG CAGGGGTCGA GACCACAACT CCCTCCAAGC AGAGCAACAA CAAGTACGCA GCCGAGTCTG AACTGAGTCT GACCCCAGAA CAGTGGAAGT CCCACAGGAG TTATTCATGC CAGGTGACCC ATGAGGGCTC

CACAGTGGAG AAGACCGTGG CCCCTGCTGA GTGTAGC SEQ ID NO: 36 Sequência de DNA de PD-1 LC

GACATTCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCGTGAGCGCCAGCGTCGGGGA CCGAGTGACCATCACATGCAGGGCCAGCCAGGGTATTTCTAGTTGGCTGG CTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAAGCACCCAAGCTGCTGATCTCCGCC GCTTCAAGCCTGCAGTCCGGAGTGCCCTCTCGATTCTCTGGTAGTGGCTC AGGAACAGACTTTACTCTGACCATTTCCTCTCTGCAGCCTGAGGATTTCG CTACTTACTATTGCCAGCAGGCAAACCACCTGCCATTCACCTTTGGCGGA GGGACAAAAGTGGAGATCAAGAGAACCGTCGCGGCGCCCAGTGTCTTCAT TTTTCCCCCTAGCGACGAACAGCTGAAGTCTGGGACAGCCAGAGTGGGCT GTCTGCTGAACAACTTCTACCCTAGAGAGGCTAAAGTGCAGTGGAAGGTC GATAACGCACTGCAGTCCGGAAATTCTCAGGAGAGTGTGACTGAACAGGA CTCAAAAGATAGCACCTATTCCCTGAGAAGCACACTGACTCTGAGCAAGG CCGACTACGA GAAGCATAAAGTGTATGCTTGTGAAGTCACCCACCAGGGG

CTGAGTTCACCAGTCACAAAATCATTCAACAGAGGGGAGTGC SEQ ID NO: 37 Sequência de DNA de PD-L1 HC

CAGGTCCAGC TGGTGCAGAG CGGAGCCGAA GTGAAGAAAC CCGGTAGCAG CGTCAAAGTG TCATGTAAAG CCTCAGGGGG AACATTCTCC AGCTACGCCA TCTCCTGGGT GAGACAGGCT CCAGGACAGG GACTGGAGTG GATGGGAGGA ATCATCCCTA TCTTCGGCAC CGCCAACTAC GCTCAGAAGT TTCAGGGCCG CGTGACCATC ACAGCCGACA AGAGCACCTC TACAGCTTAT ATGGAGCTGT CTTCCCTGAG AAGCGAGGAT ACAGCCGTGT ACTATTGCGC TCGCTCCCCC GACTACAGCC CTTACTATTA CTATGGCATG GACGTGTGGG GCCAGGGCAC CACAGTGACC GTGAGCTCTG CTAGCACAAA GGGCCCATCC GTGTTCCCAC TGGCTCCATC CAGCAAGTCC ACCAGCGGAG GAACAGCCGC TCTGGGCTGT CTGGTGAAGG ACTATTTCCC AGAGCCAGTG ACCGTGTCCT GGAACAGCGG CGCCCTGACC TCTGGAGTGC ACACATTTCC CGCTGTGCTG CAGTCTTCCG GCCTGTACTC TCTGAAGTCC GTGGTGACCG TGCCTAGCTC TTCCCTGGGC ACCCAGACAT ATATCTGCAA CGTGAATCAC AAGCCTTCCA ATACAAAGGT GGACAAGAGG GTGGAGCCAA AGAGCTGTGA TAAGACCCAT ACATGCCCCC CTTGTCCTGC TCCAGAGGCT GCTGGAGGAC CAAGCGTGTT CCTGTTTCCA CCCAAGCCCA AGGACACCCT GATGATCTCT AGGACCCCTG AGGTGACATG CGTGGTGGTG TCCGTGTCCC ACGAGGACCC AGAGGTGAAG TTTAACTGGT ACGTGGATGG CGTGGAGGTG CATAATGCTA AGACCAAGCC TAGGGAGGAG CAGTACAACA GCACCTATCG GGTGGTGTCT GTGCTGACAG TGCTGCATCA GGATTGGCTG AACGGCAAGG AGTATAAGTG CAAGGTGTCT AATAAGGCCC TGCCCGCTCC TATCGAGAAG ACCATCTCCA AGGCCAAGGG CCAGCCTAGG GAGCCACAGG TGTACGTGCT GCCTCCAAGC CGGGACGAGC TGACAAAGAA CCAGGTGTCT CTGCTGTGCC TGGTGAAGGG CTTCTATCCA TCTGATATCG CTGTGGAGTG GGAGTCCAAT GGCCAGCCCG AGAACAATTA CCTGACCTGG CCCCCTGTGC TGGACAGCGA TGGCTCTTTC TTTCTGTATT CCAAGCTGAC AGTGGATAAG AGCCGGTGGC AGCAGGGCAA CGTGTTCTCC TGTTCTGTGA TGCACGAGGC ACTGCACAAT CATTACACCC AGAAATCCCT GTCACTGAGC

CCCGGCAAG SEQ ID NO: 38 Sequência de DNA de PD-1 HC (v3.2)

CAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGGGCAGAGGTCAAGAAACCCGGTAGCTC CGTGAAGGTCAGCTGCAAGGCTTCCGGCGGAACCTTCTCTAGTTACGCCA TCAGCTGGGTGAGACAGGCTCCTGGCCAGGGACTGGAATGGATGGGCCTG ATCATTCCATCTTTTGATACCGCTGGCTACGCACAGAAGTTTCAGGGACG GGTGGCAATTACAGTCGATGAGTCAACCAGCACAGCCTATATGGAGCTGT CAAGCCTGCGGTCCGAAGACACTGCCGTGTACTATTGCGCAAGGGCCGAA CACTCCTCTACTGGAACCTTCGATTACTGGGGGCAGGGTACCCTGGTGAC AGTCAGTTCAGCCAGCACTAAGGGACCCAGCGTGTTTCCAGAGGCCCCCT CTAGTAAATCCACTTCTGGAGGCACCGCTGCACTGGGCTGTCTGGTGACC GATTACTTCCCAGAGCCCGTCACAGTGAGCTGGAACTCCGGGGCCCTGAC CAGCGGAGTCCATACATTTCCTGCTGTGCTGGAGTCAAGCGGGCTGTACT CCCTGTCCTCTGTGGTCACCGTGCCAAGTTCAAGCCTGGGAACTCAGACC TATATCTGCAACGTGAATCACAAGCCTTCAAATACAAAAGTTGACAAACG TGTGGAACCCAAGAGTTGTGATAAAACCCATACATGCCCCCCTTGTCCGG CGCCAGAGGCTGCAGGAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCT AAAGACACACTGATGATTTCCCGAACCCCCGAAGTCACATGCGTGGTCGT GTCTGTGAGTCACGAGGACCCTGAAGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGATG GCGTCGAGGTGCATAATGCCAAGACTAAACCTAGGGAGGAACAGTACAAC TCAACCTATCGCGTCGTGAGCGTCCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCT GAACGGCAAAGAATATAAGTGCAAAGTGAGCAATAAGGCCCTGCCCGCTC CTATCGAGAAAACCATTTCCAAGGCTAAAGGGCAGCCTCGCGAACCACAG GTCTACGTGCTGCCTCCATCCCGGGACGAGCTGACAAAGAACCAGGTCTC TCTGCTGTGCCTGGTGAAAGGCTTCTATCCATCAGATATTGCTGTGGAGT GGGAAAGCAATGG GCAGCCCGAGAACAATTACCTGACTTGGCCCCCTGTG CTGGACTCTGATGGGAGTTTCTTTCTGTATTCTAAGCTGACCGTGGATAA AAGTAGGTGGCAGCAGGGAAATGTCTTTAGTTGTTCAGTGATGCATGAAG

CCCTGCATAACCACTACACCCAGAAAAGCCTGTCCCTGTCCCCCGGAAAA SEQ ID NO: 39 Sequência de DNA de PD-1 HC (v13844)

CAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGGGCAGAGGTCAAGAAACCCGGTAGCTC CGTGAAGGTCAGCTGCAAGGCTTCCGGCGGAACCTTCTCTAGTTACGCCA TCAGCTGGGTGAGACAGGCTCCTGGCCAGGGACTGGAATGGATGGGCCTG ATCATTCCAATGTTCGACACCGCTGGCTACGCACAGAAGTTTCAGGGACG GGTGGCAATTACAGTCGATGAGTCAACCAGCACAGCCTATATGGAGCTGT CAAGCCTGCGGTCCGAAGACACTGCCGTGTACTATTGCGCAAGGGCCGAA CACTCCTCTACTGGAACCTTCGATTACTGGGGGCAGGGTACCCTGGTGAC AGTCAGTTCAGCCAGCACTAAGGGACCCAGCGTGTTTCCAGAGGCCCCCT CTAGTAAATCCACTTCTGGAGGCACCGCTGCACTGGGCTGTCTGGTGACC GATTACTTCCCAGAGCCCGTCACAGTGAGCTGGAACTCCGGGGCCCTGAC CAGCGGAGTCCATACATTTCCTGCTGTGCTGGAGTCAAGCGGGCTGTACT CCCTGTCCTC TGTGGTCACCGTGCCAAGTTCAAGCCTGGGAACTCAGACC TATATCTGCAACGTGAATCACAAGCCTTCAAATACAAAAGTTGACAAACG TGTGGAACCCAAGAGTTGTGATAAAACCCATACATGCCCCCCTTGTCCGG CGCCAGAGGCTGCAGGAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCT AAAGACACACTGATGATTTCCCGAACCCCCGAAGTCACATGCGTGGTCGT GTCTGTGAGTCACGAGGACCCTGAAGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGATG GCGTCGAGGTGCATAATGCCAAGACTAAACCTAGGGAGGAACAGTACAAC TCAACCTATCGCGTCGTGAGCGTCCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCT GAACGGCAAAGAATATAAGTGCAAAGTGAGCAATAAGGCCCTGCCCGCTC CTATCGAGAAAACCATTTCCAAGGCTAAAGGGCAGCCTCGCGAACCACAG GTCTACGTGTATCCTCCAAGCCGGGACGAGCTGACAAAGAACCAGGTCTC CCTGACTTGTCTGGTGAAAGGGTTTTACCCTAGTGATATCGCTGTGGAGT GGGAATCAAATGGACAGCCAGAGAACAATTATAAGACTACCCCCCCTGTG CTGGACAGTGATGGGTCATTCGCACTGGTCTCCAAGCTGACAGTGGACAA ATCTCGGTGGCAGCAGGGAAATGTCTTTTCATGTAGCGTGATGCATGAAG

CACTGCACAACCATTACACCCAGAAGTCACTGTCACTGTCACCAGGAAAA SEQ ID NO: 40 IgG1 CH do tipo selvagem

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW

QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 41 v3.2 PD-L1 CH

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLKSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSRDELTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRW

QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 42 v13844 PD-1 CH

ASTKGPSVFPEAPSSKSTSGGTAALGCLVTDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLESSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSRDELTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRW

QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 43 v3.2 PD-1 CH

ASTKGPSVFPEAPSSKSTSGGTAALGCLVTDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLESSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVLPPSRDELTKNQVSLLC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYLTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW

QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 44 v13844 PD-L1 CH

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLKSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVLPPSRDELTKNQVSLLC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYLTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW

QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 45 CL Lambda-tipo selvagem

QPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSP VKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGS

TVEKTVAPTECS SEQ ID NO: 46 CL PD-L1

QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSP VKAGVETTTPSKQSNNKYAAESELSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGS

TVEKTVAPAECS SEQ ID NO: 47 CL Kapa-tipo selvagem

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH

QGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 48 CL Kapa-PD-1

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTARVGCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLRSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ

GLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 49 (HC de PD-L1 Ab v3.2)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGI IPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSPDYS PYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLKSVVTVPSSSLGTQTY ICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYP PSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG

SFALVS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 50 Sequência de DNA de PD-L1 LC (variante 1 do códon)

CAGTCTGTGC TGACTCAGCC ACCTTCCGCC TCTGGAACCC CAGGACAGAG GGTCACAATC AGTTGCTCAG GGAGCTCCTC TAACATTGGA AGCAACACTG TGAATTGGTA CCAGCAGCTG CCTGGGACCG CTCCAAAGCT GCTGATCTAT GGCAACTCCA ATCGACCATC TGGAGTGCCT GACCGGTTCA GCGGCTCCAA ATCTGGCACC AGTGCTTCAC TGGCAATTAG TGGCCTGCAG TCCGAGGACG AAGCCGATTA CTATTGCCAG AGCTACGATA GTTCACTGAG CGGCTCCGTG TTCGGCGGGG GAATCAAGCT GACAGTCCTG GGACAGCCAA AAGCGGCGCC CAGCGTGACT CTGTTTCCAC CCAGCTCCGA GGAACTGCAG GCCAATAAGG CTACCCTGGT CTGTCTGATT TCCGACTTCT ACCCCGGGGC TGTGACAGTC GCATGGAAGG CCGATTCTAG TCCTGTGAAA GCAGGAGTCG AGACCACAAC TCCATCAAAG CAGAGCAACA ACAAGTACGC AGCCGAGAGC GAGCTGTCTC TGACACCTGA ACAGTGGAAA AGCCACCGGT CTTATAGTTG TCAGGTGACT

CACGAGGGCT CAACAGTGGA AAAGACAGTC GCACCCGCAG AATGCTCA SEQ ID NO: 51 Sequência de DNA de PD-L1 HC (variante 1 do códon)

CAGGTCCAGC TGGTGCAGAG CGGAGCCGAA GTGAAGAAAC CAGGCAGCTC CGTCAAGGTG TCATGCAAAG CCAGCGGCGG GACTTTCTCT AGTTACGCTA TCTCCTGGGT GAGACAGGCA CCAGGACAGG GACTGGAGTG GATGGGAGGA ATCATTCCTA TCTTCGGGAC AGCTAACTAC GCACAGAAGT TTCAGGGAAG GGTGACTATT ACCGCCGACA AATCTACAAG TACTGCTTAT ATGGAGCTGT CAAGCCTGAG GAGCGAAGAT ACCGCAGTGT ACTATTGCGC CCGCTCCCCC GACTACTCTC CTTACTATTA CTATGGCATG GACGTGTGGG GGCAGGGAAC CACAGTCACA GTGTCCTCTG CCAGCACTAA GGGGCCTTCA GTGTTTCCAC TGGCACCCAG TTCAAAATCA ACAAGCGGAG GAACTGCCGC TCTGGGATGT CTGGTGAAGG ACTATTTCCC AGAGCCAGTC ACCGTGAGCT GGAACTCCGG CGCACTGACT TCCGGAGTCC ACACCTTTCC AGCCGTGCTG CAGAGCTCCG GACTGTACTC TCTGAAGAGT GTGGTCACAG TGCCTTCAAG CTCCCTGGGC ACCCAGACAT ATATCTGCAA CGTGAATCAC AAGCCTAGTA ATACTAAGGT TGACAAACGT GTGGAACCAA AGAGCTGTGA TAAAACTCAT ACCTGCCCCC CTTGTCCGGC GCCAGAGGCA GCAGGAGGAC CAAGCGTGTT CCTGTTTCCA CCCAAGCCCA AAGACACCCT GATGATTAGC CGAACCCCTG AAGTCACATG CGTGGTCGTG TCCGTGTCTC ACGAGGACCC AGAAGTCAAG TTCAACTGGT ACGTGGATGG CGTCGAGGTG CATAATGCCA AGACAAAACC CCGGGAGGAA CAGTACAACA GCACCTATAG AGTCGTGTCC GTCCTGACAG TGCTGCACCA GGATTGGCTG AACGGCAAGG AATATAAGTG CAAAGTGTCC AATAAGGCCC TGCCCGCTCC TATCGAGAAA ACCATTTCTA AGGCAAAAGG CCAGCCTCGC GAACCACAGG TCTACGTGTA TCCTCCAAGC CGGGACGAGC TGACAAAGAA CCAGGTCTCC CTGACTTGTC TGGTGAAAGG GTTTTACCCT AGTGATATCG CTGTGGAGTG GGAATCAAAT GGACAGCCAG AGAACAATTA TAAGACTACC CCCCCTGTGC TGGACAGTGA TGGGTCATTC GCACTGGTCT CCAAGCTGAC AGTGGACAAA TCTCGGTGGC AGCAGGGAAA TGTCTTTTCA TGTAGCGTGA TGCATGAAGC ACTGCACAAC CATTACACCC AGAAGTCACT GTCACTGTCA CCAGGAAAA

Claims (22)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo que se liga a PD-L1 humana (SEQ ID NO: 1) e PD-1 humana (SEQ ID NO: 2), caracterizado pelo fato de que compre- ende: e) uma primeira cadeia pesada (HC1) compreendendo uma região variável da cadeia pesada (HCVR) compreendendo a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3; f) uma primeira cadeia leve (LC1) compreendendo uma região variável de cadeia leve (LCVR) compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4; g) uma segunda cadeia pesada (HC2) compreendendo a região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5; e h) uma segunda cadeia leve (LC2) compreendendo uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de amino- ácidos da SEQ ID NO: 8.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo fato de que compreende: a) a HC1 compreendendo, em ordem do N-terminal ao C- terminal, a HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 no do- mínio CH1, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 no domí- nio CH2, e a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12 no domínio CH3; b) a LC1 compreendendo, em ordem do N-terminal ao C- terminal, a LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 e a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 na região constante; c) a HC2 compreendendo, em ordem do N-terminal ao C- terminal, a HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO: 5, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 no domínio CH1, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 no do- mínio CH2, e a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 ou a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 no domínio CH3; e d) a LC2 compreendendo, em ordem do N-terminal, a LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 e a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 na região constante, desde que a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 esteja pre- sente no domínio CH3 da dita HC1, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 está presente no domínio CH3 da dita HC2, ou quando a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 esteja presente no domínio CH3 da dita HC1, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 está presente no domínio de CH3 da dita HC2.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracteriza- do pelo fato de que a HC1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 no domínio, e em que a dita HC2 compreende a HCVR, compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 e a dita HC2 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 no domínio CH3.

4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 3, caracteriza- do pelo fato de que a dita HC1, LC1, HC2 e LC2 compreende as se- quências de aminoácidos da SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO 31 e SEQ ID NO: 34, respectivamente.

5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 3, caracteriza- do pelo fato de que a dita HC1, LC1, HC2 e LC2 compreende as se- quências de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 34, respectivamente.

6. Célula de mamíferos, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de DNA compreendendo uma sequência de polinucleotídeo codificando polipeptídeos tendo as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 34, em que a célula é capaz de expressar o anticorpo da Reivindicação 4.

7. Célula de mamíferos, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de DNA compreendendo uma sequência de polinucleotídeo codificando polipeptídeos tendo as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 34, em que a célula é capaz de expressar o anticorpo da Reivindicação 5.

8. Processo para a produção de um anticorpo, caracteriza- do pelo fato de que compreende o cultivo de células de mamíferos, como definidas na reivindicação 6 ou 7, sob condições tais que o anti- corpo é expressado, e recuperando o anticorpo expressado.

9. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 5, e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

10. Método para tratar um câncer, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um paciente que precisa do mesmo, uma quantidade eficaz do anticorpo, como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 5.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracteriza- do pelo fato de que o câncer é linfomas de Hodgkin e de não Hodgkin, melanoma, câncer de células renais, câncer de rim, câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de esôfago e gástrico, câncer colorretal, câncer de fígado, câncer hepatocelular, colangiocarcinoma, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de mama triplo-negativo, câncer de ovário, câncer de endométrio, câncer de próstata, câncer de pul- mão de pequenas células (CPPC), câncer de pulmão de não peque- nas células (CPNPC), mesotelioma, câncer escamoso de câncer de cabeça pescoço (SCCHN), sarcoma de tecidos moles, ou glioblastoma multiforme.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracteriza- do pelo fato de que o câncer de pulmão é CPNPC, câncer de pulmão de células pequenas ou mesotelioma.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 10 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda de forma simultânea, separada ou sequencial, um ou mais agentes anti- tumoral selecionados do grupo consistindo em cisplatina, carboplatina, dacarbazina, doxorrubicina lipossomal, docetaxel, ciclofosfamida e do- xorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel , partículas ligadas à prote- ína paclitaxel para suspensão injetável, ixabepilona, capecitabina, FOLFOX (leucovorina, fluorouracil e oxaliplatina), FOLFIRI (leucovori- na, fluorouracil e irinotecano), gemcitabina, topotecano, irinotecano lipossomal, pemetrexedo, cetuximabe, nivolumabe, ipilimumabe, pidili- zumabe, pembrolizumabe, tremelimumabe, urelumabe, lirilumabe, ate- zolizumabe, epacadostat e durvalumabe.

14. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para uso na terapia.

15. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de um câncer.

16. Anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o câncer é linfomas de Hodgkin e de não Hodgkin, melanoma, câncer de células renais, câncer de rim, cân- cer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de esôfago e gástrico, câncer colorretal, câncer de fígado, câncer hepatocelular, colangiocarcinoma, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de mama triplo-negativo, câncer de ovário, câncer de endométrio, câncer de próstata, câncer de pulmão de pequenas células (CPPC), câncer de pulmão de não pe-

quenas células (CPNPC), mesotelioma, câncer escamoso de câncer de cabeça pescoço (SCCHN), sarcoma de tecidos moles, ou glioblas- toma multiforme.

17. Anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o câncer é o câncer de pulmão de célu- las não pequenas, câncer de pulmão de células pequenas ou mesote- lioma.

18. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para uso em combinação simultânea, separada ou sequencial com um ou mais agentes antitu- morais selecionados do grupo consistindo em cisplatina, carboplatina, dacarbazina, doxorrubicina lipossomal, docetaxel, ciclofosfamida e do- xorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, partículas ligadas à proteí- na paclitaxel para suspensão injetável, ixabepilona, capecitabina, FOLFOX (leucovorina, fluorouracil e oxaliplatina), FOLFIRI (leucovori- na, fluorouracil e irinotecano), gemcitabina, topotecano, irinotecano lipossomal, pemetrexedo, cetuximabe, nivolumabe, ipilimumabe, pidili- zumabe, pembrolizumabe, tremelimumabe, urelumabe, lirilumabe, ate- zolizumabe, epacadostat e durvalumabe, no tratamento de câncer.

19. Composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz do anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5.

20. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o câncer é linfomas de Hodgkin e de não Hodgkin, melanoma, câncer de células renais, câncer de rim, câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de esôfago e gástrico, câncer colorretal, câncer de fígado, câncer hepatocelular, colangiocar- cinoma, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de mama triplo- negativo, câncer de ovário, câncer de endométrio, câncer de próstata,

câncer de pulmão de pequenas células (CPPC), câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC), mesotelioma, câncer escamoso de câncer de cabeça pescoço (SCCHN), sarcoma de tecidos moles, ou glioblastoma multiforme.

21. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o câncer é CPNPC, câncer de pul- mão de células pequenas ou mesotelioma.

22. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 19 a 22, caracterizada pelo fato de que é administrada com combinação simultânea, separada ou sequencial, com um ou mais agentes antitumoral selecionados do grupo consistindo em cisplatina, carboplatina, dacarbazina, doxorrubicina lipossomal, docetaxel, ciclo- fosfamida e doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel , partículas ligadas à proteína paclitaxel para suspensão injetável, ixabepilona, ca- pecitabina, FOLFOX (leucovorina, fluorouracil e oxaliplatina), FOLFIRI (leucovorina, fluorouracil e irinotecano), gemcitabina, topotecano, irino- tecano lipossomal, pemetrexedo, cetuximabe, nivolumabe, ipilimuma- be, pidilizumabe, pembrolizumabe, tremelimumabe, urelumabe, lirilu- mabe, atezolizumabe, epacadostat e durvalumabe.