KR20200021982A - 체크포인트 억제제 이중특이적 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이종이량체이고, 인간 PD-L1 및 인간 PD-1에 결합하며, 단독으로 및 화학요법 및 다른 암 요법과 조합되어 암을 치료하는데 유용할 수 있는 항체에 관한 것이다.

Description

체크포인트 억제제 이중특이적 항체
본 발명은 의약 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 인간 프로그램화된 세포 사멸 1 (PD-1) 및 인간 PD-1 리간드 1 (PD-L1)에 결합하는 이중특이적 항체에 관한 것이고, 이는 단독으로 및 화학요법 및 다른 암 요법과 조합되어 고형 및 혈액 종양을 치료하는데 유용할 수 있다.
면역 체크포인트 경로는 자기-관용의 유지 및 T 세포 활성화의 제어에 사용되지만, 암 세포가 상기 경로를 사용하여 항종양 반응을 억제하고 그의 파괴를 방지할 수 있다. PD-1/PD-L1 경로는 하나의 이러한 면역 체크포인트이다. 인간 PD-1은 T 세포 상에서 발견되고, 인간 PD-L1은 다양한 종양 유형에 의해 비정상적으로 발현되며; PD-L1의 PD-1에 대한 결합은 T 세포 증식 및 시토카인 생산을 억제한다. PD-1/PD-L1 억제 축은 항종양 면역 반응과 관련하여 종양 진화를 구현하는 자연 선택 과정의 일부로서 종양에 예속되어 왔다.
PD-1/PD-L1 경로를 표적화하는 치료제가 임상적으로 검증되고 암의 치료를 위한 유의한 임상 진보로 이어졌지만, 일부의 환자만이 이러한 치료로부터 이익을 얻었다 (예를 들어, 문헌 [Sharma, P. and Allison, J.P., Immune checkpoint targeting in cancer therapy: toward combination strategies with curative potential. Cell. 2015; 161:2015-14] 참조). 예를 들어, 비소세포 폐암 (NSCLC)을 갖는 환자의 ~20%만이 PD-1 항체 치료에 반응하였다.
PD-L1 항체와 PD-1 항체의 공-투여를 수반하는 임상 시험이 현재 진행 중이지만 (예를 들어, 유럽 종양 학회 (ESMO) 초록 #2130; 2016년 10월 참조), 이들 치료 요법은 상기 2종의 개별 항체 제품을 각각의 항체에 대해 비교적 높은 투여량으로 주입하는 것을 수반한다. 추가로, 이러한 조합 요법이 단독요법과 비교하여 유해 사건 프로파일을 악화시키지 않으면서 효능의 개선을 제공할 것인지 여부도 아직 알려져 있지 않다.
WO2017/087547은 항-PD-L1 항체를 구체적으로 개시하고 그 안에 기재된 PD-L1-결합 작용제 및 "제2 면역요법제"를 포함하는 이종이량체 분자 (예를 들어, 이중특이적 작용제)를 일반적으로 개시한다. 일부 실시양태에서 제2 면역요법제는 "면역억제 기능을 차단하는 항체", 예컨대 "항-PD-항체"를 포함할 수 있다. 그러나, 이 공보에는 구체적인 PD-L1/PD-1 이중특이적 작용제가 개시되지 않았다. 따라서, PD-L1 및 PD-1에 고친화도로 결합하고/거나, 모든 PDx 패밀리 리간드에 의한 PD-L1 및 PD-1 활성화를 효과적으로 중화시키고/거나, PD-1/PD-L1 경로를 표적화하는 공지된 치료제에 비해 우수한 활성을 제공하거나, 또는 심지어 이들 경우의 조합을 나타내는 이중특이적 항체가 특정 암을 위한 보다 효과적인 약리학적 개입으로서 필요하다. 특히, i) 중간 또는 높은 PD-L1 또는 PD-1 발현 수준을 갖는 것을 특징으로 하는 암을 보다 효과적으로 치료할 수 있고, ii) 열 안정성, 용해도, 낮은 자기-회합 및 암의 치료에서의 개발 및/또는 사용에 허용되는 약동학적 특징을 포함하나 이에 제한되지는 않는 생체내 안정성, 물리적 및 화학적 안정성을 나타내는 상기 항-PD-L1/PD-1 이중특이적 항체가 바람직하다.
따라서, 본 발명은 2개의 상이한 중쇄 및 2개의 상이한 경쇄의 쌍형성을 통해 단일 IgG-유사 항체가 되는, PD-L1 및 PD-1을 동시에 표적화할 수 있는 신규 이종이량체 이중특이적 항체를 제공한다. 추가로, 본 발명은 하기 특색 중 하나 이상을 보유하는 항-인간 PD-L1 및 항-인간 PD-1 이종이량체 이중특이적 항체를 제공한다: PD 축의 모든 3가지 상호작용 (PD-1에 대한 PD-L1 결합, PD-1에 대한 PD-L2 결합 및 CD80에 대한 PD-L1 결합)을 차단함, PD-L1 및 PD-1 과다-발현 세포를 가교시킴, 결합된 T 세포 및 종양 세포의 근접성으로 인해 T 세포 활성화 및 종양 세포 사멸을 증가시킴, 중간 내지 높은 PD 리간드 발현 수준을 갖는 종양 세포에서 놀랍게도 낮은 투여량으로 유의한 항종양 활성을 나타냄, 및 생체내 안정성, 열 안정성, 용해도, 낮은 자기-회합 및 약동학적 특징을 포함하나 이에 제한되지는 않는 예상외의 물리적 및 화학적 안정성을 나타냄.
따라서, 본 발명은 인간 PD-L1 (서열식별번호(SEQ ID NO): 1) 및 인간 PD-1 (서열식별번호: 2)에 결합하고,
a) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하는 제1 중쇄 (HC1);
b) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하는 제1 경쇄 (LC1);
c) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 제2 중쇄 (HC2); 및
d) 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2 경쇄 (LC2)
를 포함하는 항체를 제공한다.
본 발명은 인간 PD-L1 (서열식별번호: 1) 및 인간 PD-1 (서열식별번호: 2)에 결합하고, HC1, LC1, HC2 및 LC2를 포함하며, 여기서
a) 상기 HC1은 HCVR에 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하고;
b) 상기 LC1은 LCVR에 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열식별번호: 21의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하고;
c) 상기 HC2는 HCVR에 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열식별번호: 23 또는 서열식별번호: 24의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하고;
d) 상기 LC2는 LCVR에 서열식별번호: 26의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열식별번호: 27의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하고;
e) HC1의 CH1 도메인은 S183K의 아미노산 치환을 포함하고;
f) LC1의 불변 영역은 S176E 및 Y178E의 아미노산 치환을 포함하는 인간 람다 변이체이고;
g) HC2의 CH1 도메인은 L128E, K147T 및 Q175E의 아미노산 치환을 포함하고;
h) LC2의 불변 영역은 S131R, V133G 및 S176R의 아미노산 치환을 포함하는 인간 카파 변이체이고;
i) HC1의 CH3 도메인은 T350V, L351Y, F405A 및 Y407V의 아미노산 치환을 포함하고 HC2의 CH3 도메인은 T350V, T366L, K392L 및 T394W의 아미노산 치환을 포함하거나; 또는 HC1의 CH3 도메인은 T350V, T366L, K392L 및 T394W의 아미노산 치환을 포함하고 HC2의 CH3 도메인은 T350V, L351Y, F405A 및 Y407V의 아미노산 치환을 포함하고;
j) 여기서 HC1 및 HC2는 면역 이펙터 기능 널 인간 IgG1 Fc 변이체이고, 여기서 넘버링은 EU 인덱스에 따른 것인
항체를 제공한다. 바람직하게는, HC1 및 HC2는 L234A, L235A 및 D265S의 아미노산 치환을 포함한다.
본 발명은 인간 PD-L1 (서열식별번호: 1) 및 인간 PD-1 (서열식별번호: 2)에 결합하고,
a) N-말단에서 C-말단의 순서로, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR, CH1 도메인에 서열식별번호: 9의 아미노산 서열, CH2 도메인에 서열식별번호: 10의 아미노산 서열, 및 CH3 도메인에 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HC1;
b) N-말단에서 C-말단의 순서로, 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR, 및 불변 영역에 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 LC1;
c) N-말단에서 C-말단의 순서로, 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR, CH1 도메인에 서열식별번호: 13의 아미노산 서열, CH2 도메인에 서열식별번호: 10의 아미노산 서열, 및 CH3 도메인에 서열식별번호: 12의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HC2; 및
d) N-말단에서 순서대로, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR, 및 불변 영역에 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 LC2
를 포함하며, 단 서열식별번호: 11의 아미노산 서열이 상기 HC1의 CH3 도메인에 존재하는 경우, 서열식별번호: 12의 아미노산 서열은 상기 HC2의 CH3 도메인에 존재하거나; 또는 서열식별번호: 12의 아미노산 서열이 상기 HC1의 CH3 도메인에 존재하는 경우, 서열식별번호: 11의 아미노산 서열은 상기 HC2의 CH3 도메인에 존재하는 것인
항체를 제공한다.
본 발명은 추가로 HC1, LC1, HC2 및 LC2를 포함하며, 여기서
a) 상기 HC1은 N-말단에서 C-말단의 순서로, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR, CH1 도메인에 서열식별번호: 9의 아미노산 서열, CH2 도메인에 서열식별번호: 10의 아미노산 서열, 및 CH3 도메인에 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하고;
b) 상기 LC1은 N-말단에서 C-말단의 순서로, 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR, 및 불변 영역에 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하고;
c) 상기 HC2는 N-말단에서 C-말단의 순서로, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR, CH1 도메인에 서열식별번호: 13의 아미노산 서열, CH2 도메인의 영역에 서열식별번호: 10의 아미노산 서열, 및 CH3 도메인에 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하고;
d) 상기 LC2는 N-말단에서 순서대로, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR, 및 불변 영역에 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 것인
항체를 제공한다.
본 발명은 인간 PD-L1 (서열식별번호: 1) 및 인간 PD-1 (서열식별번호: 2)에 결합하고,
a) 서열식별번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 HC1;
b) 서열식별번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 LC1;
c) 서열식별번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 HC2; 및
d) 서열식별번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 LC2
를 포함하는 항체를 제공한다.
본 발명은 인간 PD-L1 (서열식별번호: 1) 및 인간 PD-1 (서열식별번호: 2)에 결합하고,
a) 서열식별번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 HC1;
b) 서열식별번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 LC1;
c) 서열식별번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 HC2; 및
d) 서열식별번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 LC2
를 포함하는 항체를 제공한다.
본 발명은 인간 PD-L1 (서열식별번호: 1) 및 인간 PD-1 (서열식별번호: 2)에 결합하고,
a) 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HC1;
b) 서열식별번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 LC1;
c) 서열식별번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 HC2; 및
d) 서열식별번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 LC2
를 포함하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31 및 서열식별번호: 34의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하는 포유동물 세포이며, 여기서 세포는 본 발명의 항체를 발현할 수 있는 것인, 포유동물 세포를 제공한다.
본 발명은 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 33 및 서열식별번호: 34의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하는 포유동물 세포이며, 여기서 세포는 본 발명의 항체를 발현할 수 있는 것인, 포유동물 세포를 제공한다.
본 발명은 서열식별번호: 29, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 33 및 서열식별번호: 34의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하는 포유동물 세포이며, 여기서 세포는 본 발명의 항체를 발현할 수 있는 것인, 포유동물 세포를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 포유동물 세포를 본 발명의 항체가 발현되도록 하는 조건 하에 배양하고, 발현된 항체를 회수하는 것을 포함하는, 본 발명의 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산된 항체를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 항체 및 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 항체를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 암은 호지킨 또는 비-호지킨 림프종, 흑색종, 신세포암, 신장암, 폐암, 방광암, 위암 및 식도암, 결장직장암, 간암, 간세포성암, 담관암종, 췌장암, 유방암, 삼중-음성 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 소세포 폐암 (SCLC), 비소세포 폐암 (NSCLC), 중피종, 두경부암의 편평세포암 (SCCHN), 연부 조직 육종, 또는 다형성 교모세포종인, 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 흑색종인 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 폐암인 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 폐암이 NSCLC (편평 및 비-편평), 소세포 폐암 또는 중피종인 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 두경부암인 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 간암인 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 결장직장암인 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 췌장암인 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 위암인 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 신장암인 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 방광암인 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 전립선암인 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 유방암인 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 난소암인 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 자궁내막암인 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 식도암인 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 연부 조직 육종인 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 담관암종인 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 간세포성 암종인 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 유효량의 본 발명의 항체를 시스플라틴, 카르보플라틴, 다카르바진, 리포솜 독소루비신, 도세탁셀, 시클로포스파미드 및 독소루비신, 나벨빈, 에리불린, 파클리탁셀, 주사가능한 현탁액을 위한 파클리탁셀 단백질-결합 입자, 익사베필론, 카페시타빈, 폴폭스 (류코보린, 플루오로우라실 및 옥살리플라틴), 폴피리 (류코보린, 플루오로우라실 및 이리노테칸), 겜시타빈, 토포테칸, 리포솜 이리노테칸, 페메트렉세드, 세툭시맙, 니볼루맙, 이필리무맙, 피딜리주맙, 펨브롤리주맙, 트레멜리무맙, 우렐루맙, 리릴루맙, 아테졸리주맙, 에파카도스타트 및 두르발루맙으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 항종양제와 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 조합하여 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 유효량의 본 발명의 항체를 이온화 방사선과 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 조합하여 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 요법에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 본 발명은 암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 본 발명은 호지킨 또는 비-호지킨 림프종, 흑색종, 신세포암, 신장암, 폐암, 방광암, 위암 및 식도암, 결장직장암, 간암, 간세포성암, 담관암종, 췌장암, 유방암, 삼중-음성 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 소세포 폐암 (SCLC), 비소세포 폐암 (NSCLC), 중피종, 두경부암의 편평세포암 (SCCHN), 연부 조직 육종, 또는 다형성 교모세포종인 암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다.
본 발명은 흑색종의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 본 발명은 폐암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 본 발명은 추가로 폐암이 NSCLC (편평 및 비-편평), 소세포 폐암 또는 중피종인 본 발명의 항체를 제공한다. 본 발명은 두경부암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 본 발명은 간암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 본 발명은 결장직장암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 본 발명은 췌장암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 본 발명은 위암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 본 발명은 신장암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 본 발명은 방광암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 본 발명은 전립선암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 본 발명은 유방암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 본 발명은 난소암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 본 발명은 자궁내막암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 본 발명은 식도암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 본 발명은 연부 조직 육종의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 본 발명은 담관암종의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 본 발명은 간세포성 암종의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다.
본 발명은 암의 치료에서 시스플라틴, 카르보플라틴, 다카르바진, 리포솜 독소루비신, 도세탁셀, 시클로포스파미드 및 독소루비신, 나벨빈, 에리불린, 파클리탁셀, 주사가능한 현탁액을 위한 파클리탁셀 단백질-결합 입자, 익사베필론, 카페시타빈, 폴폭스 (류코보린, 플루오로우라실 및 옥살리플라틴), 폴피리 (류코보린, 플루오로우라실 및 이리노테칸), 겜시타빈, 토포테칸, 리포솜 이리노테칸, 페메트렉세드, 세툭시맙, 니볼루맙, 이필리무맙, 피딜리주맙, 펨브롤리주맙, 트레멜리무맙, 우렐루맙, 리릴루맙, 아테졸리주맙, 에파카도스타트 및 두르발루맙으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 항종양제와 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 조합하여 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다.
본 발명은 암의 치료에서 이온화 방사선과 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 조합하여 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다.
본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는, 암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 추가로 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는, 호지킨 또는 비-호지킨 림프종, 흑색종, 신세포암, 신장암, 폐암, 방광암, 위암 및 식도암, 결장직장암, 간암, 간세포성암, 담관암종, 췌장암, 유방암, 삼중-음성 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 소세포 폐암 (SCLC), 비소세포 폐암 (NSCLC), 중피종, 두경부암의 편평세포암 (SCCHN), 연부 조직 육종, 또는 다형성 교모세포종인 암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 추가로 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는, 폐암이 NSCLC (편평 및 비-편평), 소세포 폐암 또는 중피종인 암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는, 흑색종을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는, NSCLC (편평 및 비-편평), 소세포 폐암 또는 중피종을 포함하나 이에 제한되지는 않는 폐암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는, 두경부암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는, 간암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는, 결장직장암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는, 췌장암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는, 위암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는, 신장암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는, 방광암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는, 전립선암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는, 유방암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는, 난소암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는, 자궁내막암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는, 식도암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는, 연부 조직 육종을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는, 담관암종을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는, 간세포성 암종을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 추가로 시스플라틴, 카르보플라틴, 다카르바진, 리포솜 독소루비신, 도세탁셀, 시클로포스파미드 및 독소루비신, 나벨빈, 에리불린, 파클리탁셀, 주사가능한 현탁액을 위한 파클리탁셀 단백질-결합 입자, 익사베필론, 카페시타빈, 폴폭스 (류코보린, 플루오로우라실 및 옥살리플라틴), 폴피리 (류코보린, 플루오로우라실 및 이리노테칸), 겜시타빈, 토포테칸, 리포솜 이리노테칸, 페메트렉세드, 세툭시맙, 니볼루맙, 이필리무맙, 피딜리주맙, 펨브롤리주맙, 트레멜리무맙, 우렐루맙, 리릴루맙, 아테졸리주맙, 에파카도스타트 및 두르발루맙으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 항종양제와 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 조합되어 투여되는, 암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 추가로 이온화 방사선과 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 조합되어 투여되는, 암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 암의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 항체의 용도를 제공한다. 본 발명은 추가로 호지킨 또는 비-호지킨 림프종, 흑색종, 신세포암, 신장암, 폐암, 방광암, 위암 및 식도암, 결장직장암, 간암, 간세포성암, 담관암종, 췌장암, 유방암, 삼중-음성 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 소세포 폐암 (SCLC), 비소세포 폐암 (NSCLC), 중피종, 두경부암의 편평세포암 (SCCHN), 연부 조직 육종, 또는 다형성 교모세포종인 암의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 항체의 용도를 제공한다. 본 발명은 추가로 폐암이 NSCLC (편평 및 비-편평), 소세포 폐암 또는 중피종인 암의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 항체의 용도를 제공한다.
본 발명은 추가로 암의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 항체의 용도를 제공하며, 여기서 상기 의약은 시스플라틴, 카르보플라틴, 다카르바진, 리포솜 독소루비신, 도세탁셀, 시클로포스파미드 및 독소루비신, 나벨빈, 에리불린, 파클리탁셀, 주사가능한 현탁액을 위한 파클리탁셀 단백질-결합 입자, 익사베필론, 카페시타빈, 폴폭스 (류코보린, 플루오로우라실 및 옥살리플라틴), 폴피리 (류코보린, 플루오로우라실 및 이리노테칸), 겜시타빈, 토포테칸, 리포솜 이리노테칸, 페메트렉세드, 세툭시맙, 니볼루맙, 이필리무맙, 피딜리주맙, 펨브롤리주맙, 트레멜리무맙, 우렐루맙, 리릴루맙, 아테졸리주맙, 에파카도스타트 및 두르발루맙으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 항종양제와 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여된다.
본 발명은 암의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 항체의 용도를 제공하며, 여기서 상기 의약은 이온화 방사선과 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여된다.
본 발명의 항체는 조작된 비-자연 발생 폴리펩티드 복합체이다. 본 발명의 DNA 분자는 본 발명의 항체에서의 폴리펩티드 중 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 비-자연 발생 DNA 분자이다.
본 발명의 항체는 IgG 유형 항체이고 쇄내 및 쇄간 디술피드 결합을 통해 가교되는 "중"쇄 및 "경"쇄를 갖는다. 각각의 중쇄는 N-말단 HCVR 및 중쇄 불변 영역 ("HCCR")으로 구성된다. 각각의 경쇄는 N-말단 LCVR 및 경쇄 불변 영역 ("LCCR")으로 구성된다. 경쇄는 각각 중쇄와 디술피드 결합을 형성하고, 2개의 중쇄는 서로간에 2개의 디술피드 결합을 형성한다.
중쇄의 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3 도메인을 함유한다. CH1은 HCVR 뒤에 나오고; CH1 및 HCVR은 Fab의 중쇄 부분을 형성한다. CH2는 힌지 영역 뒤에 및 CH3 앞에 나온다. CH3은 CH2 뒤에 나오고, 중쇄의 카르복시-말단에 존재한다.
경쇄의 불변 영역은 1개의 도메인, CL을 함유한다. CL은 LCVR 뒤에 나오고, CL 및 LCVR은 Fab의 경쇄 부분을 형성한다.
본 발명의 항체는 항체의 각각의 아암이 항체를 형성하는 2개의 상이한 중쇄 및 2개의 상이한 경쇄로 인해 그의 동족 항원에 대한 선택적 1가 결합을 나타낸다는 점에서 이종이량체이다. 본 발명에서, 항체의 한 아암은 인간 PD-L1 (서열식별번호: 1)에 결합하고, 다른 아암은 인간 PD-1 (서열식별번호: 2)에 결합한다. 이러한 폴리펩티드 쇄의 CH2 및/또는 CH3 도메인은 서열이 동일할 필요는 없고, 유리하게는 2개의 폴리펩티드 쇄 사이의 복합체화를 촉진하도록 변형된다. 예를 들어, 아미노산 치환 (바람직하게는, "노브"를 형성하는 벌키 측기를 포함하는 아미노산, 예를 들어 트립토판으로의 치환)이 CH2 또는 CH3 도메인 내로 도입될 수 있고, 이에 따라 입체 간섭은 유사하게 돌연변이된 도메인과의 상호작용을 방지할 것이고 상기 돌연변이된 도메인이 상보적 또는 수용 돌연변이를 조작한, 즉 "홀" (예를 들어, 글리신으로의 치환)을 조작한 도메인과 쌍을 이루게 할 것이다. 이러한 돌연변이 세트는 Fc 영역을 형성하는 CH2-CH3 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩티드 쌍 내로 조작될 수 있다. 동종이량체화에 비해 이종이량체화를 선호하기 위한 단백질 조작 방법은, 특히 이뮤노글로불린-유사 분자의 조작에 관하여, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291, EP 1 870 459A1, 뿐만 아니라 문헌 [Ridgway et al. (1996) " 'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization, " Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) "Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library, " J. Mol. Biol. 270: 26-35, and Xie et al. (2005) "A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis, " J. Immunol. Methods 296:95-101] 참조). 전형적으로, 관련 기술분야에 공지된 접근법에서, 제1 중쇄의 CH3 도메인 및 제2 중쇄의 CH3 도메인은 둘 다 상보적 방식으로 조작되어 하나의 조작된 CH3 도메인을 포함하는 중쇄가 동일한 구조의 또 다른 중쇄와 더 이상 동종이량체화될 수 없게 된다 (예를 들어, CH3-조작된 제1 중쇄는 또 다른 CH3-조작된 제1 중쇄와 더 이상 동종이량체화될 수 없고; CH3-조작된 제2 중쇄는 또 다른 CH3-조작된 제2 중쇄와 더 이상 동종이량체화될 수 없음). 이에 의해 하나의 조작된 CH3 도메인을 포함하는 중쇄는 상보적 방식으로 조작된 CH3 도메인을 포함하는 또 다른 중쇄와 이종이량체화되도록 강제된다. 본 발명의 이러한 실시양태의 경우, 제1 중쇄의 CH3 도메인 및 제2 중쇄의 CH3 도메인은 아미노산 치환에 의해 상보적 방식으로 조작되고, 이에 따라 제1 중쇄 및 제2 중쇄는 이종이량체화되도록 강제되는 한편 제1 중쇄 및 제2 중쇄는 더 이상 동종이량체화될 수 없다 (예를 들어 입체적 이유로).
관련 기술분야에 공지된 중쇄 이종이량체화를 지지하기 위한 여러 접근법은 본 발명에 따른 이중특이적 항체에 사용되는 여러 대안으로서 고려된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 돌연변이는 CH1 및 CH3 영역 내의 중쇄의 서열 내로 및 경쇄 불변 영역 내의 경쇄의 서열 내로 혼입된다. CH1 및 LC 돌연변이는 필수적인 경쇄 및 중쇄 쌍의 천연 쌍형성을 선호하고 경쇄 쌍형성오류를 배제하도록 이루어진다. CH3 돌연변이는 2개의 별개 중쇄의 이종이량체 쌍형성을 선호하고 동종이량체의 형성을 배제하도록 이루어진다.
바람직하게는, 항체의 항-PD-L1 부분의 CH3 영역 내의 돌연변이가 EU 넘버링으로 위치 350, 351, 405 및 407을 포함하는 경우에, 항체의 항-PD-1 부분의 CH3 영역 내의 돌연변이는 EU 넘버링으로 위치 350, 366, 392 및 394를 포함하고; 항체의 항-PD-L1 부분의 CH3 영역 내의 돌연변이가 EU 넘버링으로 위치 350, 366, 392 및 394를 포함하는 경우에, 항체의 항-PD-1 부분의 CH3 영역 내의 돌연변이는 EU 넘버링으로 위치 350, 351, 356, 405 및 407을 포함한다 (바로 아래에 제시된 서열 정렬에 제시된 바와 같음).
야생형 인간 IgG1의 아미노산 서열과 항체 v3.2 및 v13884의 중쇄의 불변 영역의 정렬 (바람직한 변형은 밑줄표시됨):
Figure pct00001
바람직하게는, 바로 위의 정렬에서 밑줄표시로 제시된 바와 같이, 항체의 항-PD-L1 부분의 CH1 영역 내의 돌연변이는 바람직하게는 EU 넘버링으로 위치 183을 포함하는 한편 항체의 항-PD-1 부분의 CH1 영역 내의 돌연변이는 바람직하게는 EU 넘버링으로 위치 128, 147 및 175를 포함한다.
항체의 항-PD-L1 부분의 CL 영역은 바람직하게는 인간 람다 하위유형이다. 보다 바람직하게는, 항체의 항-PD-L1 부분의 CL 영역은 EU 넘버링으로 위치 176 및 178의 아미노산 치환을 포함하는 인간 람다 변이체이다 (하기 정렬 참조).
야생형 인간 람다의 아미노산 서열과 v3.2, v3.0 및 v13844 항체의 PD-L1 경쇄의 불변 영역 또는 PD-1의 정렬 (바람직한 변형은 밑줄표시됨).
Figure pct00002
항체의 항-PD-1 부분의 CL 영역은 바람직하게는 인간 카파 하위유형이다. 본 발명의 항체의 항-PD-1 부분의 CL 영역은 바람직하게는 EU 넘버링으로 위치 131, 133 및 176에서 아미노산 치환을 포함하는 인간 카파 변이체이다.
야생형 인간 카파의 아미노산 서열과 PD-1에 대한 항체의 경쇄의 불변 영역의 정렬 (바람직한 변형은 밑줄표시됨).
Figure pct00003
본 발명의 특정 항체에서, 중쇄 이종이량체 쌍형성 돌연변이는 78℃ 초과의 CH3 열 안정성을 생성한다.
특정 생물학적 시스템에서 발현되는 경우에, Fc 서열을 갖는 항체는 Fc 영역에서 글리코실화된다. 전형적으로, 글리코실화는 항체의 Fc 영역에서의 고도로 보존된 N-글리코실화 부위에서 발생한다. N-글리칸은 전형적으로 아스파라긴에 부착된다. 항체는 또한 다른 위치에서도 글리코실화될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 항체는 인간 IgG1로부터 유래된 Fc 부분 변이체를 함유한다. IgG1은 Fc-감마 수용체 패밀리 (FcγR) 뿐만 아니라 C1q에 결합하는 것으로 널리 공지되어 있다. 이들 수용체와의 상호작용은 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC) 및 보체-의존성 세포독성 (CDC)을 유도할 수 있다. 따라서, 면역 이펙터 기능을 제거하기 위해 본 발명의 항체에 대해 인간 IgG1 Fc 영역 내로 특정 아미노산 치환이 도입된다. 항체 중쇄의 CH2 영역 내의 돌연변이는 도 1에 제시된 바와 같이 면역 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하기 위해 EU 넘버링으로 위치 234, 235 및 265를 포함할 수 있다.
HCVR 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 HCVR-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역 또는 그의 변이체를 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간뿐만 아니라 다른 포유동물의 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은, 예를 들어 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체에 대해, 중쇄의 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1의 변이체이다.
LCVR 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 LCVR-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역 또는 그의 변이체를 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 전장 경쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간뿐만 아니라 다른 포유동물의 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 항체에 대해, 항체의 항-PD-L1 부분의 경쇄 불변 영역은 람다 경쇄의 변이체이고, 항체의 항-PD-1 부분의 경쇄 불변 영역은 카파 경쇄의 변이체이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 그 서열이 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 후에 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 발현 벡터는 전형적으로 숙주 유기체에서 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 필수 부분으로서 복제가능하다. 통상적으로, 발현 벡터는 목적하는 DNA 서열로 형질전환된 세포의 검출을 허용하기 위한 선택 마커, 예를 들어 테트라시클린, 네오마이신, 글루타민 신테타제 및 디히드로폴레이트 리덕타제를 함유할 것이다.
본 발명의 항체는 포유동물 세포, 예컨대 CHO, NS0, HEK293 또는 COS 세포에서 용이하게 생산될 수 있다. 숙주 세포는 관련 기술분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 배양된다.
관심 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 항체의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 발현 제어 서열)을 함유하는 벡터는 세포 숙주의 유형에 따라 달라지는 널리 공지된 방법에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.
다양한 단백질 정제 방법이 사용될 수 있고, 이러한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990) 및 Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Edition, Springer, NY (1994)]에 기재되어 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이를 코딩하는 핵산은 단리된 형태로 제공된다. 본원에 사용된 용어 "단리된"은 세포 환경에서 발견되는 임의의 다른 거대분자 종이 없는 또는 실질적으로 없는 단백질, 펩티드 또는 핵산을 지칭한다. 본원에 사용된 "실질적으로 없는"은 관심 단백질, 펩티드 또는 핵산이 존재하는 거대분자 종의 80% 초과 (몰 기준), 바람직하게는 90% 초과, 보다 바람직하게는 95% 초과를 차지한다는 것을 의미한다.
본 발명의 항체 또는 이를 포함하는 제약 조성물은 비경구 경로 (예를 들어, 피하 및 정맥내)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 항체는 단일 또는 다중 용량으로 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 환자에게 단독으로 투여될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 관련 기술분야에 널리 공지된 방법 (예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd ed. (2012), A. Loyd et al. Pharmaceutical Press])에 의해 제조될 수 있고, 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다.
용어 "치료하는" (또는 "치료하다" 또는 "치료")은 기존 증상, 장애, 상태 또는 질환의 진행 또는 중증도를 둔화, 차단, 저지, 완화, 정지, 감소 또는 역전시키는 것을 지칭한다.
인간 PD-L1 (서열식별번호: 1), 인간 PD-1 (서열식별번호: 2), 또는 둘 다에 대한 항체의 친화도와 관련하여 본원에 사용된 "결합하다"는, 달리 나타내지 않는 한, 본질적으로 본원에 기재된 바와 같은 37℃에서의 표면 플라스몬 공명 (SPR) 바이오센서의 사용을 포함한 관련 기술분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 결정시, 약 1 x10-6 M 미만, 바람직하게는 약 1 x 10-9 M 미만의 KD를 의미하는 것으로 의도된다.
"유효량"은 연구원, 의사 또는 다른 임상의가 추구하는 조직, 시스템, 동물, 포유동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응 또는 그들에 대한 목적하는 치료 효과를 도출할, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 항체를 포함하는 제약 조성물의 양을 의미한다. 항체의 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 도출하는 항체의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 유효량은 또한 치료상 유익한 효과가 항체의 임의의 독성 또는 유해한 효과를 능가하는 양이다.
본 발명은 하기 비제한적 실시예에 의해 추가로 예시된다.
실시예 1: 항체 발현 및 정제
항체 v3.2, v3.0 및 v13844의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 폴리펩티드, 완전한 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열, 및 이들을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 하기 "아미노산 및 뉴클레오티드 서열"이라는 표제의 섹션에 열거된다. 추가로, 항체 v3.2, v3.0 및 v13844의 경쇄, 중쇄, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열에 대한 서열식별번호가 하기 표 1(a)에 제시된다. 추가로, 항체 v3.2, v3.0 및 v13844의 PD-L1 및 PD-1 결합 가변 영역의 CDR의 아미노산 서열에 대한 서열식별번호가 각각 표 1(b) 및 표 1(c)에 제시된다.
항체 v3.2, v3.0 및 v13844를 포함하나 이에 제한되지는 않는 본 발명의 항체는 본질적으로 하기와 같이 제조 및 정제할 수 있다. 적절한 숙주 세포, 예컨대 CHO를, 사중 벡터 (즉, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄의 발현을 코딩하는 단일 벡터), 이중 벡터 (즉, 2개의 상이한 경쇄 및 2개의 상이한 중쇄를 함께 코딩하는 2개의 벡터), 또는 4개의 단일 벡터 (이 중 2개는 상이한 경쇄를 코딩하고 2개는 상이한 중쇄를 코딩함)를 사용하여 항체를 분비시키기 위한 발현 시스템으로 일시적으로 또는 안정적으로 형질감염시킬 수 있다. 항체가 분비된 배지는 많은 통상적으로 사용되는 기술 중 임의의 것을 사용하여 정제할 수 있다. 예를 들어, 상용 완충제, 예컨대 포스페이트 완충 염수 (pH 7.4)로 평형화된 맙셀렉트 칼럼 (지이 헬스케어(GE Healthcare)), 또는 Fab 단편을 위한 카파셀렉트 칼럼 (지이 헬스케어)에 배지를 적용할 수 있다. 비특이적 결합 성분을 제거하기 위해 칼럼을 세척할 수 있다. 결합된 항체를, 예를 들어 pH 구배 (예컨대 20 mM 트리스 완충제 pH 7에서 10 mM 시트르산나트륨 완충제 pH 3.0, 또는 포스페이트 완충 염수 pH 7.4에서 100 mM 글리신 완충제 pH 3.0)에 의해 용리시킬 수 있다. 항체 분획을, 예컨대 SDS-PAGE에 의해 검출할 수 있고, 이어서 풀링할 수 있다. 가용성 응집체 및 다량체를 크기 배제, 소수성 상호작용, 이온 교환, 다중모드 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 포함한 통상적인 기술에 의해 효과적으로 제거할 수 있다. 통상적인 기술을 사용하여 항체를 농축 및/또는 멸균 여과할 수 있다. 생성물을 -70℃에서 즉시 동결시킬 수 있거나 또는 동결건조시킬 수 있다.
표 1(a)-(c): 체크포인트 억제제 이중특이적 항체 (BsAb)에 대한 서열식별번호
1(a)
Figure pct00004
1(b)
Figure pct00005
1(c)
Figure pct00006
실시예 2: ELISA에 의해 측정된 인간 PD-L1 및 PD-1 둘 다에 대한 결합
인간 PD-L1 및 인간 PD-1 둘 다에 결합하는 본 발명의 항체의 능력은 샌드위치 ELISA 검정으로 측정할 수 있다. PD-1 결합 검정을 위해, 96-웰 플레이트 (눈크(Nunc))를 4℃에서 밤새 인간 PD-1-Fc (알앤디 시스템즈(R&D Systems), cat. #1086-PD)로 코팅할 수 있다. 웰을 차단 완충제 (5% 탈지 분유를 함유하는 PBS)로 2시간 동안 차단할 수 있다. 웰을 0.1% 트윈-20을 함유하는 PBS로 3회 세척할 수 있다. 이어서 항-PD-1 항체 또는 대조군 IgG (100 μl)를 첨가할 수 있고, 이어서 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션할 수 있다. 세척 후, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 100 μl의 염소 항-인간 IgG F(ab')2-HRP 접합체 (잭슨 이뮤노 리서치(Jackson Immuno Resaerch), cat. #109-035-097)와 함께 인큐베이션할 수 있다. 플레이트를 세척할 수 있고, 이어서 100 μl의 3,3',5,5'-테트라-메틸벤지딘과 함께 인큐베이션할 수 있다. 마이크로플레이트 판독기 상에서 450 nm에서의 흡광도를 판독할 수 있다. 그래프패드 프리즘 6 소프트웨어를 사용하여 절반 최대 유효 농도 (EC50)를 계산할 수 있다.
PD-L1 결합 검정을 위해, 96-웰 플레이트 (눈크)를 4℃에서 밤새 인간 PD-L1-Fc (알앤디 시스템즈, cat#156-B7)로 코팅할 수 있다는 것을 제외하고, 유사한 절차를 적용할 수 있다.
본 실시예 2에서 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행된 실험에서, 항체 v3.2는 0.0802 nM의 EC50으로 인간 PD-1에 결합한다. 비교하여, 모 PD-1 항체 (IgG4-PAA 동종이량체로서)의 결합 친화도는 0.1318 nM이다. 항체 v3.2는 0.4554 nM의 EC50으로 인간 PD-L1에 결합한다. 비교하여, 모 PD-L1 항체 (IgG1-EN 동종이량체로서)의 결합 친화도는 0.4702 nM이다.
실시예 3: PD-1 발현 세포와 PD-L1 발현 세포의 가교
PD-1 또는 PD-L1을 발현하는 형질감염된 CHO 세포를 사용하여 유동 세포측정 분석에 의해 PD-1 및 PD-L1 발현 세포를 가교시키는 본 발명의 항체의 능력을 결정하였다. 간략하게 언급하면, CHO-PD1 및 CHOK1-PDL1 과다발현 세포를 CFSE (카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르) (비디 호리즌(BD Horizon)) 또는 셀 트래커 딥 레드(Cell Tracker Deep Red) (CTDR/써모)로 차등 표지할 수 있다. CHO-PD1 및 CHOK1-PDL1 세포를 2시간 동안 시험 항체, 예컨대 항체 v3.2 (얼음 상에서 PBS + 1% BSA + 0.09% 아지드화나트륨 중)와 함께 개별적으로 인큐베이션한다. 비결합 항체는 세척 (200 μl PBS + 1% BSA + 0.09% 아지드화나트륨으로 2X)에 의해 제거할 수 있다. CHOK1-PDL1 세포를 2시간 동안 얼음 상에서 PBS + 1% BSA + 0.09% 아지드화나트륨 중 45 μg/ml의 모 PD-L1 항체 또는 hIgG1 대조군과 함께 인큐베이션한다. CHO-PD1 세포를 2시간 동안 얼음 상에서 PBS + 1%BSA + 0.09% 아지드화나트륨 중 45 μg/ml의 모 PD-1 항체 또는 huIgG4-PAA와 함께 인큐베이션한다. CHO-PD1/항체 v3.2 세포를 22.5ug/ml의 최종 농도로 CHOK1-PDL1 + 모 PD-L1 항체 또는 hIgG1과 혼합한다. CHOK1-PDL1/항체 v3.2 세포를 22.5 μg/ml의 최종 농도로 CHO-PD1 + 모 PD-1 항체 또는 huIgG4-PAA와 혼합할 수 있다. 대략 72시간 인큐베이션 (4℃에서) 후, 세포를 포르테사 X20 (HTS 샘플러 구비) 상에서 CFSE 및 CTDR에 적합한 채널에서 측정할 수 있다. 플로우조(flowJo)® 소프트웨어 (플로우조, 엘엘씨, 오레곤주 앳슈랜드)를 사용하여, 이중 양성 사건 (CFSE+/CTDR+)을 게이팅할 수 있고, 총 사건의 %를 계산하여 보고할 수 있다 (2개의 반복실험 웰에 대해). 그래프패드 프리즘에 의해 비선형 회귀 (가변 기울기, 4 파라미터)를 사용하여 피팅 및 통계를 생성할 수 있다.
본 실시예 3에서 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행된 실험에서, PD-1/PD-L1 이중특이적 항체는 세포 가교를 매개하며 이는 유동 세포측정법에 의해 이중 양성 사건으로서 검출될 수 있다. 항체 v3.2를 CHO-PD1 또는 CHOK1-PDL1 세포에 결합시키고 (후속적으로 비결합 항체를 제거함), 이어서 각각 CHOK1-PDL1 또는 CHO-PD1 세포와 혼합시키는 것은, 배경에 비해 이중 양성 사건의 용량 의존성 증가를 유발하였다 (완충제 단독과 비교하여 최대 4배의 증가). 이러한 이중 양성 사건의 증가는 고농도의 과량의 경쟁 PD-L1 및/또는 PD-1 mAb를 첨가하여 차단되지만 매칭되는 비-특이적 IgG 대조군에 의해서는 차단되지 않으며, 이는 표적 항원 발현에 대한 특이성 및 의존성을 입증한다.
실시예 4: PD-L1과 PD-L2, PD-L1과 CD80, 및 PD-L2와 PD-1의 상호작용의 차단
PD-L1/PD-1 차단 검정은 다양한 양의 항-PD-1 항체 또는 대조군 IgG를 고정된 양의 비오티닐화 PD-1-Fc 융합 단백질 (100 ng/mL)과 혼합하고 실온에서 약 1시간 동안 인큐베이션함으로써 수행할 수 있다. 그 후, 혼합물을 PD-L1-Fc (100 ng/웰) 또는 PD-L2-Fc (100 ng/웰)로 사전-코팅된 96-웰 플레이트에 옮긴 다음, 실온에서 대략 추가 1시간 동안 인큐베이션할 수 있다. 세척 후, 스트렙타비딘 HRP 접합체를 첨가할 수 있고, 450 nm에서의 흡광도를 판독할 수 있다. IC50은 PD-1의 PD-L1에 대한 결합 또는 PD-L2에 대한 결합의 50% 억제에 요구되는 항체 농도를 나타낸다.
유사하게, 1 μg/ml B7-1-Fc (알앤디 시스템즈, cat#140-B1-100)로 코팅된 플레이트를 사용함으로써 PD-L1/B7-1 차단 검정을 수행할 수 있다. 그래프패드 프리즘 6 소프트웨어를 사용하여 PD-L1의 B7-1에 대한 결합의 50% 억제에 요구되는 항체 농도 (IC50)를 계산한다.
본 실시예 4에서 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행된 실험에서, 항체 v3.2는 중간 농도 및 보다 높은 농도에서 PD-1 수용체와 PD-L1 리간드 사이의 상호작용을 차단하는 것으로 보였고, 보다 낮은 농도 및 중간 농도에서 천연 리간드-수용체 상호작용보다 더 강한 친화도로 수용체 및 리간드를 이중 결합으로 가교시키는 것으로 보인다. 추가로, 항체 v3.2는 PD-L1과 B7-1의 상호작용을 0.75 nM의 IC50으로 차단하고 PD-L2와 PD-1의 상호작용을 2.27 nM의 IC50으로 차단하는 것으로 보였다.
실시예 5: 혼합 백혈구 반응 (MLR)에서의 항체의 시험관내 기능 분석
건강한 공여자로부터 수득된 동결 인간 PBMC (올셀즈(AllCells) cat. #PB005F)로부터 MACS 비드 (밀테니(Miltenyi), cat. #130-091-153)를 사용하여 CD14+ 단핵구를 단리할 수 있다. 이들 단핵구를 12 ml 완전 RPMI-1640 배지에서1000 IU/ml hGM-CSF 및 500 IU/ml hIL-4의 존재 하에 4일 동안 배양함으로써 미성숙 수지상 세포 (DC)를 생성할 수 있다. 상이한 건강한 공여자의 신선한 인간 PBMC (올셀즈 cat. #PB002)로부터 음성 선택 (밀테니 130-096-533)에 의해 CD4+ T 세포를 정제할 수 있다. 이어서, 2가지 유형의 세포를 96-웰 플레이트의 개별 웰에서 웰당 5 x 104개의 CD4+ T 세포 및 4 x 103개의 미성숙 DC (E:T = 12.5:1)를 함유하는 100 μl 완전 AIM-V 배지와 혼합할 수 있다. 인간 IgG1-EN, 모 항-PD-1 항체, 모 항-PD-1 항체, 모 항체의 조합물, 또는 항체 v3.2의 8개의 복제물 (각각 32nM로부터 3:1로 연속 희석됨)을 함유하는 100 μl 완전 AIM-V 배지를 첨가할 수 있다. 37℃에서 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션한 후, 상청액을 수거한 다음, 인간 IFN-γ 및 IL-2에 대해 ELISA 키트 (알앤디 cat# SIF50) 및 (알앤디 cat# S2050)를 사용하여 측정할 수 있다.
본 실시예 5에서 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행된 실험에서, 동종 CD4+ T 세포 및 DC의 공동-배양물에 항체 v3.2를 첨가한 것은, 각각 모 PD-L1 Ab, 모 PD-1 Ab 및 이 둘의 조합의 경우 0.026 nM, 0.029 nM 및 0.115 nM과 비교하여 0.005 nM의 EC50으로 CD4 T 세포 림프구에 반응함으로써 IFN-γ의 증가된 생산을 유발하였다. 유사하게, 항체 v3.2는 또한 PD-L1 Ab, PD-1 Ab 및 PD-L1 Ab + PD-1 Ab 조합물 (각각 0.034 nM, 0.023 nM 및 0.046 nM)과 비교하여 0.011 nM의 EC50으로 공동-배양물에서 IL-2의 생산을 증가시켰다. 결과는 항체 v3.2가 모 PD-L1 Ab 단독, 모 PD-1 Ab 단독 또는 그의 조합물보다 시험관내에서 T 세포 활성화를 증진시키는 능력이 우수하다는 것을 나타낸다.
실시예 6: T 세포의 재활성화
PD-L1 양성 인간 T-활성화제 CHOK1 세포 (프로메가(Promega) 파트 #CS187108) 및 PD-L1 음성 인간 T-활성화제 CHOK1 세포 (프로메가 파트 #CS187110)를 프로메가로부터 입수할 수 있다. PD-L1 양성 인간 T-활성화제 CHOK1 세포를 전장 PD-L2를 코딩하는 벡터로 형질감염시킴으로써 PD-L1/PD-L2 이중 양성 인간 T-활성화제 CHOK1 세포를 확립할 수 있다. 이들 세포를 96-웰 백색 불투명 조직 배양 플레이트 내 웰당 40,000개의 세포로 100 μL 배지 (10% FBS F-12, 0.2 mg/ml 히그로마이신-B 및 0.2 mg/ml G418) 중에 플레이팅할 수 있고, 37℃에서 5% CO2 하에 밤새 인큐베이션할 수 있다. 다음 날 검정 플레이트로부터 배지를 제거할 수 있고, 검정 완충제 (2% FBS RPMI) 중 연속 희석된 시험 및 대조군 항체를 웰당 40 μl로 첨가할 수 있다. 글로리스판스 NFAT-luc2/PD1 Jurkat 세포 (프로메가 파트 #CS187102)를 검정 완충제 중에 1.25 x 106개/mL의 농도로 재현탁시키고, 플레이트에 웰당 40 μl로 첨가할 수 있다. 6시간의 유도 후, 검정 플레이트를 인큐베이터로부터 제거하고, 실온에서 5 내지 10분 동안 평형화시킬 수 있다. 바이오-글로(Bio-Glo)™ 시약 (프로메가 G7941)을 제조업체의 지침에 따라 제조하고, 웰당 80 μl로 첨가할 수 있다. 이어서 플레이트를 실온에서 5 내지 10분 동안 인큐베이션할 수 있다. 플레이트 판독기에서 발광을 측정할 수 있고, 그래프패드 프리즘 7을 사용하여 데이터를 분석할 수 있다.
본 실시예 6에서 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행된 PD-1/NFAT 리포터 Jurkat T 세포 검정에서, PD-L1 양성 인간 T 세포 활성화제 CHO 세포는 T 세포 활성화를 억제하는 것으로 관찰되었다. PD-1 Ab 또는 PD-L1 Ab는 PD-L1 - PD-1 매개 억제를 역전시킴으로써 T 세포를 재활성화시켰다. 그러나, 항체 v3.2는 T 세포를 재활성화시키는 능력에 있어서 모 PD-L1 Ab 단독 (1.92 nM), 모 PD-1 Ab 단독 (1.01 nM), 또는 모 PD-1 Ab와 모 PD-L1 Ab의 조합물 (0.796 nM)보다 우수한 것으로 보였다 (EC50 0.12nM). PD-L1/PD-L2 이중 양성 인간 T 세포 활성화제 CHO 세포를 이러한 시스템에서 사용하였을 때, PD-1 양성 리포터 T 세포의 활성화가 또한 억제되었다. 모 PD-1 Ab는 T 세포를 재활성화시킬 수 있었지만 모 PD-L1 Ab는 그렇지 않았다. 그러나, 항체 v3.2는 T 세포를 재활성화시키는 능력에 있어서 모 PD-1 Ab 단독 (0.946 nM) 또는 모 PD-1 Ab와 모 PD-L1 Ab의 조합물 (1.251 nM)보다 더 우수하다 (EC50 0.181 nM).
실시예 7: 생체내 효능 검정
본 발명의 항체의 효능을 인간 면역 세포로 재구성된 면역결핍 마우스에서의 이종이식 모델에서 시험하여 동종-항원에 대한 T 세포 반응 증진을 통해 상기 모델에서 확립된 종양을 지연시키거나 파괴하는 능력을 평가할 수 있다. 연구에서의 모든 동물은 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인되어 있고, 미국 농무부 및 국립 보건원의 현행 규정 및 표준에 따라 수행된다.
파트 A: NCI-H292 인간 NSCLC 이종이식 모델
잭슨 래보러토리즈(Jackson Laboratories)로부터의 NOD scid 감마 (NSG) 마우스 (7주령, 암컷, 7-8마리 마우스의 군)에게 측복부에 HBSS (0.2 ml 총 부피) 중 2 x 106개의 NCI-H292 세포, 또는 2 x 106개의 NCI-H292 세포와 1 x 106개의 새로 단리된 인간 PBMC의 혼합물을 피하로 이식한다. 제1일에 시작하여, 마우스에게 인간 IgG1-EN (대조군), 모 항-PD-L1 항체 (0.25 mg/kg), 또는 모 항-PD-1 항체 (0.25 mg/kg), 또는 모 항체의 조합물 (각각 0.25 mg/kg), 또는 항체 v3.0, v3.2 또는 v13844 (0.5 mg/kg)를 3회 용량에 대해 매주 1회 복강내 주사하여 처리한다. 털손질 및 보행을 포함한 동물 웰빙 및 행동을 1주에 적어도 2회 모니터링한다. 체중 및 종양 부피를 1주 2회 측정한다.
실시예 7의 파트 A에서 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행된 실험에서, 10 mg/kg으로 투여된 항체 v3.0, v3.2 및 v13844는 내약성이 우수하였고, 체중 및 임상 관찰에 의해 모니터링된 바와 같이 안전하였다. NCI-H292 종양 세포와 PBMC의 혼합물을 이식한 마우스에서, 항-PD-L1 또는 항-PD-1 항체, 또는 항-PD-L1과 항-PD-1 항체의 조합물을 각각 10 mg/kg으로 사용한 처리는 모두 대조군 분자인 인간 IgG1-EN을 사용한 처리와 비교하여 종양 성장을 지연시켰다. NCI-H292 종양 세포와 PBMC의 혼합물을 이식한 마우스에서, PD-1/PD-L1 이중특이적 Ab (v13844, v3.0 또는 v3.2)를 10 mg/kg qw로 사용한 처리는 각각 7/8, 5/8 및 5/8마리에서의 완전 퇴행 (CR)으로 모두 조합 요법 (모 PD-L1 항체 + 모 PD-1 항체) (2/8마리에서의 CR)보다 더 효과적이었다.
파트 B: HCC827 인간 NSCLC 이종이식 모델
잭슨 래보러토리즈로부터의 NSG 마우스 (7주령, 암컷, 8마리 마우스의 군)에게 측복부에 HBSS (0.2 ml 총 부피) 중 10 x 106개의 HCC827 세포를 피하로 이식한다. 전혈로부터 단리된 벌크 인간 T 세포 (뉴욕 혈액 센터)를 인간 T-활성화제 CD3/CD28 디나비즈(Dynabeads)®를 사용하여 10일 동안 확장시키고 동결보존시킨다. 이식으로부터 제44일에 T 세포를 해동시키고, 세척하고, 계수하고, HCC827 종양-보유 마우스 내에 정맥내로 주입한다 (마우스당 0.2 ml PBS 중 3.5 x 106개의 T 세포). 다음 날에 시작하여, 마우스에게 인간 IgG1-EN (대조군), 모 항-PD-L1 항체, 모 항-PD-1 항체, 또는 모 항-PD-L1 항체와 모 항-PD-1 항체의 조합물을 각각 2 mg/kg으로, 또는 항체 v3.2를 3가지 용량 수준 (0.02, 0.2 또는 2 mg/kg)으로, 4주 동안 매주 1회 복강내 주사하여 처리한다. 마우스에게 제56일에 확장된 T 세포 (마우스당 0.2 ml PBS 중 2.5 x 106개의 T 세포)의 제2 주입을 제공한다. 털손질 및 보행을 포함한 동물 웰빙 및 행동을 1주에 적어도 2회 모니터링한다. 체중 및 종양 부피를 1주 2회 측정한다. IM-종양 성장 측정이라는 표제의 SOP에 기재된 바와 같이 전자 캘리퍼를 사용하여 1주에 1회 종양 부피를 측정한다. 다음 식을 사용하여 종양 부피를 계산한다: 종양 부피 (mm3) = π/6 * 길이 * 너비2.
실시예 7의 파트 B에서 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행된 실험에서, 모든 3가지 용량 수준 (0.02, 0.2 또는 2 mg/kg)의 항체 v3.2는 확립된 HCC827 종양 모델에서 확장된 T 세포의 존재 하에 유사한 항종양 반응을 공유하였다. 또한, 0.02 mg/kg의 항체 v3.2는 종양 세포 이식 후 제69일에 항-PD-L1 항체 (2 mg/kg, p=0.05), 항-PD-1 항체 (2 mg/kg, p<0.001) 및 두 작용제의 조합물 (각각 2 mg/kg, p<0.001)보다 더 유의하게 종양 성장을 지연시켰다 (표 2 참조).
표 2: HCC827 인간 NSCLC 확립 종양 모델에서의 제69일 종양 억제
Figure pct00007
SEM: 평균의 표준 추정치
아미노산 및 뉴클레오티드 서열
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company Zymeworks Inc. <120> CHECKPOINT INHIBITOR BISPECIFIC ANTIBODIES <130> X21099 <150> 62/530436 <151> 2017-07-10 <160> 51 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 290 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu 1 5 10 15 Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr 20 25 30 Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile 50 55 60 Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val 115 120 125 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val 130 135 140 Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Pro 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PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 48 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 48 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Arg Val Gly Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 49 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 49 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Pro Asp Tyr Ser Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Lys Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 225 230 235 240 Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ser Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Gln Val Tyr Val Tyr Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 355 360 365 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ala Leu Val Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 50 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 50 cagtctgtgc tgactcagcc accttccgcc tctggaaccc caggacagag ggtcacaatc 60 agttgctcag ggagctcctc taacattgga agcaacactg tgaattggta ccagcagctg 120 cctgggaccg ctccaaagct gctgatctat ggcaactcca atcgaccatc tggagtgcct 180 gaccggttca gcggctccaa atctggcacc agtgcttcac tggcaattag tggcctgcag 240 tccgaggacg aagccgatta ctattgccag agctacgata gttcactgag cggctccgtg 300 ttcggcgggg gaatcaagct gacagtcctg ggacagccaa aagcggcgcc cagcgtgact 360 ctgtttccac ccagctccga ggaactgcag gccaataagg ctaccctggt ctgtctgatt 420 tccgacttct accccggggc tgtgacagtc gcatggaagg ccgattctag tcctgtgaaa 480 gcaggagtcg agaccacaac tccatcaaag cagagcaaca acaagtacgc agccgagagc 540 gagctgtctc tgacacctga acagtggaaa agccaccggt cttatagttg tcaggtgact 600 cacgagggct caacagtgga aaagacagtc gcacccgcag aatgctca 648 <210> 51 <211> 1359 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 51 caggtccagc tggtgcagag cggagccgaa gtgaagaaac caggcagctc cgtcaaggtg 60 tcatgcaaag ccagcggcgg gactttctct agttacgcta tctcctgggt gagacaggca 120 ccaggacagg gactggagtg gatgggagga atcattccta tcttcgggac agctaactac 180 gcacagaagt ttcagggaag ggtgactatt accgccgaca aatctacaag tactgcttat 240 atggagctgt caagcctgag gagcgaagat accgcagtgt actattgcgc ccgctccccc 300 gactactctc cttactatta ctatggcatg gacgtgtggg ggcagggaac cacagtcaca 360 gtgtcctctg ccagcactaa ggggccttca gtgtttccac tggcacccag ttcaaaatca 420 acaagcggag gaactgccgc tctgggatgt ctggtgaagg actatttccc agagccagtc 480 accgtgagct ggaactccgg cgcactgact tccggagtcc acacctttcc agccgtgctg 540 cagagctccg gactgtactc tctgaagagt gtggtcacag tgccttcaag ctccctgggc 600 acccagacat atatctgcaa cgtgaatcac aagcctagta atactaaggt tgacaaacgt 660 gtggaaccaa agagctgtga taaaactcat acctgccccc cttgtccggc gccagaggca 720 gcaggaggac caagcgtgtt cctgtttcca cccaagccca aagacaccct gatgattagc 780 cgaacccctg aagtcacatg cgtggtcgtg tccgtgtctc acgaggaccc agaagtcaag 840 ttcaactggt acgtggatgg cgtcgaggtg cataatgcca agacaaaacc ccgggaggaa 900 cagtacaaca gcacctatag agtcgtgtcc gtcctgacag tgctgcacca ggattggctg 960 aacggcaagg aatataagtg caaagtgtcc aataaggccc tgcccgctcc tatcgagaaa 1020 accatttcta aggcaaaagg ccagcctcgc gaaccacagg tctacgtgta tcctccaagc 1080 cgggacgagc tgacaaagaa ccaggtctcc ctgacttgtc tggtgaaagg gttttaccct 1140 agtgatatcg ctgtggagtg ggaatcaaat ggacagccag agaacaatta taagactacc 1200 ccccctgtgc tggacagtga tgggtcattc gcactggtct ccaagctgac agtggacaaa 1260 tctcggtggc agcagggaaa tgtcttttca tgtagcgtga tgcatgaagc actgcacaac 1320 cattacaccc agaagtcact gtcactgtca ccaggaaaa 1359

Claims (22)

  1. 인간 PD-L1 (서열식별번호: 1) 및 인간 PD-1 (서열식별번호: 2)에 결합하고,
    e) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하는 제1 중쇄 (HC1);
    f) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하는 제1 경쇄 (LC1);
    g) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 제2 중쇄 (HC2); 및
    h) 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2 경쇄 (LC2)
    를 포함하는 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    a) N-말단에서 C-말단의 순서로, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR, CH1 도메인에 서열식별번호: 9의 아미노산 서열, CH2 도메인에 서열식별번호: 10의 아미노산 서열, 및 CH3 도메인에 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HC1;
    b) N-말단에서 C-말단의 순서로, 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR, 및 불변 영역에 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 LC1;
    c) N-말단에서 C-말단의 순서로, 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR, CH1 도메인에 서열식별번호: 13의 아미노산 서열, CH2 도메인에 서열식별번호: 10의 아미노산 서열, 및 CH3 도메인에 서열식별번호: 12의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HC2; 및
    d) N-말단에서 순서대로, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR, 및 불변 영역에 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 LC2
    를 포함하며, 단 서열식별번호: 11의 아미노산 서열이 상기 HC1의 CH3 도메인에 존재하는 경우, 서열식별번호: 12의 아미노산 서열은 상기 HC2의 CH3 도메인에 존재하거나; 또는 서열식별번호: 12의 아미노산 서열이 상기 HC1의 CH3 도메인에 존재하는 경우, 서열식별번호: 11의 아미노산 서열은 상기 HC2의 CH3 도메인에 존재하는 것인
    항체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 HC1이 CH3 도메인에 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HC2가 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR을 포함하고, 상기 HC2가 CH3 도메인에 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 HC1, LC1, HC2 및 LC2가 각각 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31 및 서열식별번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  5. 제3항에 있어서, 상기 HC1, LC1, HC2 및 LC2가 각각 서열식별번호: 29, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 33 및 서열식별번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  6. 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31 및 서열식별번호: 34의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하는 포유동물 세포이며, 여기서 세포는 제4항의 항체를 발현할 수 있는 것인, 포유동물 세포.
  7. 서열식별번호: 29, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 33 및 서열식별번호: 34의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하는 포유동물 세포이며, 여기서 세포는 제5항의 항체를 발현할 수 있는 것인, 포유동물 세포.
  8. 제6항 또는 제7항의 포유동물 세포를 항체가 발현되도록 하는 조건 하에 배양하고, 발현된 항체를 회수하는 것을 포함하는, 항체를 생산하는 방법.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 및 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  10. 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 암이 호지킨 또는 비-호지킨 림프종, 흑색종, 신세포암, 신장암, 폐암, 방광암, 위암 및 식도암, 결장직장암, 간암, 간세포성암, 담관암종, 췌장암, 유방암, 삼중-음성 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 소세포 폐암 (SCLC), 비소세포 폐암 (NSCLC), 중피종, 두경부암의 편평세포암 (SCCHN), 연부 조직 육종, 또는 다형성 교모세포종인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 폐암이 NSCLC, 소세포 폐암 또는 중피종인 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 시스플라틴, 카르보플라틴, 다카르바진, 리포솜 독소루비신, 도세탁셀, 시클로포스파미드 및 독소루비신, 나벨빈, 에리불린, 파클리탁셀, 주사가능한 현탁액을 위한 파클리탁셀 단백질-결합 입자, 익사베필론, 카페시타빈, 폴폭스 (류코보린, 플루오로우라실 및 옥살리플라틴), 폴피리 (류코보린, 플루오로우라실 및 이리노테칸), 겜시타빈, 토포테칸, 리포솜 이리노테칸, 페메트렉세드, 세툭시맙, 니볼루맙, 이필리무맙, 피딜리주맙, 펨브롤리주맙, 트레멜리무맙, 우렐루맙, 리릴루맙, 아테졸리주맙, 에파카도스타트 및 두르발루맙으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 항종양제를 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  14. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 항체.
  15. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료에 사용하기 위한 항체.
  16. 제15항에 있어서, 암이 호지킨 또는 비-호지킨 림프종, 흑색종, 신세포암, 신장암, 폐암, 방광암, 위암 및 식도암, 결장직장암, 간암, 간세포성암, 담관암종, 췌장암, 유방암, 삼중-음성 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 소세포 폐암 (SCLC), 비소세포 폐암 (NSCLC), 중피종, 두경부암의 편평세포암 (SCCHN), 연부 조직 육종, 또는 다형성 교모세포종인 항체.
  17. 제16항에 있어서, 암이 비소세포 폐암, 소세포 폐암 또는 중피종인 항체.
  18. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료에서 시스플라틴, 카르보플라틴, 다카르바진, 리포솜 독소루비신, 도세탁셀, 시클로포스파미드 및 독소루비신, 나벨빈, 에리불린, 파클리탁셀, 주사가능한 현탁액을 위한 파클리탁셀 단백질-결합 입자, 익사베필론, 카페시타빈, 폴폭스 (류코보린, 플루오로우라실 및 옥살리플라틴), 폴피리 (류코보린, 플루오로우라실 및 이리노테칸), 겜시타빈, 토포테칸, 리포솜 이리노테칸, 페메트렉세드, 세툭시맙, 니볼루맙, 이필리무맙, 피딜리주맙, 펨브롤리주맙, 트레멜리무맙, 우렐루맙, 리릴루맙, 아테졸리주맙, 에파카도스타트 및 두르발루맙으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 항종양제와 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 조합하여 사용하기 위한 항체.
  19. 유효량의 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 암이 호지킨 또는 비-호지킨 림프종, 흑색종, 신세포암, 신장암, 폐암, 방광암, 위암 및 식도암, 결장직장암, 간암, 간세포성암, 담관암종, 췌장암, 유방암, 삼중-음성 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 소세포 폐암 (SCLC), 비소세포 폐암 (NSCLC), 중피종, 두경부암의 편평세포암 (SCCHN), 연부 조직 육종, 또는 다형성 교모세포종인 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 암이 NSCLC, 소세포 폐암 또는 중피종인 조성물.
  22. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 시스플라틴, 카르보플라틴, 다카르바진, 리포솜 독소루비신, 도세탁셀, 시클로포스파미드 및 독소루비신, 나벨빈, 에리불린, 파클리탁셀, 주사가능한 현탁액을 위한 파클리탁셀 단백질-결합 입자, 익사베필론, 카페시타빈, 폴폭스 (류코보린, 플루오로우라실 및 옥살리플라틴), 폴피리 (류코보린, 플루오로우라실 및 이리노테칸), 겜시타빈, 토포테칸, 리포솜 이리노테칸, 페메트렉세드, 세툭시맙, 니볼루맙, 이필리무맙, 피딜리주맙, 펨브롤리주맙, 트레멜리무맙, 우렐루맙, 리릴루맙, 아테졸리주맙, 에파카도스타트 및 두르발루맙으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 항종양제와 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 조합되어 투여되는 조성물.
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