BR112019018410A2

BR112019018410A2 - processo para cristalizar 2'-fucosil-lactose e composições relacionadas

Info

Publication number: BR112019018410A2
Application number: BR112019018410A
Authority: BR
Inventors: Martikainen Heidi; Siitonen Jani; Nurmi Juha; Backman Pentti
Original assignee: Dupont Nutrition Biosci Aps
Priority date: 2017-03-06
Filing date: 2018-03-01
Publication date: 2020-04-07
Also published as: SG11201907911PA; JP2020509073A; CN110621685A; EP3596095A4; AU2018230564A1; KR20190126350A; EP3596095A1

Abstract

a presente invenção refere-se a um processo para cristalizar um oligossacarídeo, particularmente um oligossacarídeo de leite humano, e, mais particularmente, 2'-fucosil-lactose ("2'-fl"). este relatório descritivo também se refere a composições (por exemplo, produtos cristalinos) produzidas com o uso de tal processo.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS [001] Este relatório descritivo reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisório N^Q U.S. 62/467.571 depositado em 6 de março de 2017; Pedido de Patente Europeu 17167564.8 depositado em 21 de abril de 2017; e Pedido de Patente Provisório N^Q U.S. 62/632.180 depositado em 19 de fevereiro de 2018. O texto inteiro de cada um dos pedidos de patente referenciados acima é incorporado a título de referência a este relatório descritivo.

CAMPO [002] Este relatório descritivo refere-se a um processo para cristalizar um oligossacarídeo, particularmente um oligossacarídeo de leite humano, e, mais particularmente, 2'-fucosil-lactose (2'-FL). Este relatório descritivo também se refere a composições (por exemplo, produtos cristalinos) produzidas com o uso de tal processo.

ANTECEDENTES [003] Os oligossacarídeos de leite humano são importantes para nutrição e produtos terapêuticos. Um dos oligossacarídeos de leite humano mais importantes é 2'-fucosil-lactose (também conhecida como 2'-O-fucosil-lactose ou 2'-FL). Este oligossacarídeo é o oligossacarídeo mais abundante encontrado em leite de mama de ser humano, e acredita-se que tenha diversas funções biológicas benéficas, incluindo efeitos de intensificação de sistema imune, antiviral, antibacteriano, prebiótico e efeitos de intensificação de desenvolvimento cerebral. Tais benefícios tornam 2'-FL um ingrediente potencialmente atrativo a ser incluído em alimentos, suplementos dietéticos e medicamentos, e particularmente fórmula infantil.

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Entretanto, o desenvolvimento de processos economicamente praticáveis para produção em grande escala de 2'-FL continua a ser um desafio.

[004] Muitas abordagens recentes para síntese de 2'-FL envolvem processos de fermentação microbiana, os quais produzem 2'-FL a partir da lactose. Embora exista sucesso em relação a essa abordagem, tais processos produzem geralmente uma mistura de produto complexo, a qual inclui frequentemente outros ingredientes, como lactose, oligossacarídeos além do 2'-FL desejável (por exemplo, difucosillactose (DiFL)), monossacarídeos, aminoácidos, polipeptídeos, proteínas, sais monovalentes e divalentes, ácidos orgânicos, ácidos nucleicos, etc. Desse modo, ainda há uma necessidade por processos de purificação confiáveis e economicamente praticáveis a jusante que fornecem um produto de 2'-FL usável.

[005] Uma técnica para purificação de 2'-FL é a cristalização. Entretanto, as técnicas de cristalização de resfriamento comumente usadas geralmente falham em funcionamento com 2'-FL devido às suas propriedades de cristalização únicas. Embora os xaropes de água saturados de 2'-FL exibam baixa viscosidade em baixas temperaturas (o que normalmente sugere que a cristalização será direta), até mesmo xaropes de 2'-FL aquosos altamente supersaturados são geralmente estáveis em baixas temperaturas.

[006] Para superar esse problema, alguns versados na técnica relataram técnicas que envolvem a adição de solventes orgânicos para forçar a cristalização. Consultar, por exemplo, Kuhn, R., et al., Chemische Berichte, volume 88(8), páginas 1,135 a 1,146 (1955); Kuhn, R., et al., Chemische Berichte, volume 89(11), página 2,513 (1956); documentos n^Q WO2011/150939; WO2015/188834; e WO201695924. Há, entretanto, muitas desvantagens potenciais em usar um solvente orgânico para cristalizar 2'-FL. As mesmas incluem, por exemplo, o

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3/57 custo do solvente orgânico em si. Os solventes orgânicos também criam emissões nocivas, resíduos e/ou poluição. O equipamento especial é frequentemente necessário para recuperar o solvente após a cristalização. Em alguns casos, há perdas de solvente associadas à tal recuperação de solvente. Para alguns solventes, o equipamento especial também é necessário devido à explosão ou outras razões de segurança. E o uso de solventes também pode ser um problema se o solvente residual permanece no produto cristalino. Até mesmo níveis residuais de alguns solventes orgânicos podem ter um efeito adverso em sabor, odor, cor e/ou segurança alimentar.

[007] Consequentemente, existe uma necessidade contínua de um processo a jusante eficaz, confiável e economicamente praticável para purificar 2'-FL, particularmente uma cristalização aquosa que evita a necessidade de um solvente orgânico.

SUMÁRIO [008] Brevemente, este relatório descritivo divulga, em geral, um processo para cristalizar 2'-FL, assim como composições produzidas com o uso de tal processo.

[009] Em particular, este relatório descritivo divulga, em parte, um processo para produzir 2'-FL cristalina de uma solução inicial aquosa que compreende 2'-FL e pelo menos um outro carboidrato.

[010] Em algumas modalidades, o processo compreende concentrar a solução inicial a um estado supersaturado em relação a 2'FL, e, então, precipitar um cristal de 2'-FL da solução supersaturada enquanto submete a solução supersaturada a uma temperatura maior do que 60 °C. Nesse processo, a solução supersaturada compreende no máximo 1% (em peso) de solvente orgânico durante a precipitação do cristal de 2'-FL.

[011] Em algumas modalidades, o processo compreende concentrar a solução inicial a um estado supersaturado em relação a 2'Petição 870190087008, de 05/09/2019, pág. 33/107

4/57 fucosil-lactose, e, então, precipitar um cristal de 2'-fucosil-lactose da solução supersaturada enquanto submete a solução supersaturada a uma temperatura de pelo menos 40 °C. Nesse processo, a solução inicial tem um teor de sólidos secos com uma concentração de 2'-fucosiIlactose de 70 a 95% (em que a porcentagem corresponde a uma concentração de área de pico normalizada obtida com o uso de cromatografia líquida de alto desempenho). Ademais, a solução supersaturada compreende no máximo 1% (em peso) de solvente orgânico durante a precipitação do cristal de 2'-fucosil-lactose.

[012] Em algumas modalidades, o processo compreende concentrar a solução inicial a um estado supersaturado em relação a 2'fucosil-lactose, e, então, precipitar um cristal de 2'-fucosil-lactose da solução supersaturada enquanto submete a solução supersaturada a uma temperatura de pelo menos 40 °C. Nesse processo, a solução inicial tem um teor de sólidos secos com uma concentração de 2'-fucosiIlactose menor do que cerca de 98% (em que a porcentagem corresponde a uma concentração de área de pico normalizada obtida com o uso de cromatografia líquida de alto desempenho). Ademais, a solução supersaturada compreende no máximo 1% (em peso) de solvente orgânico durante a precipitação do cristal de 2'-fucosil-lactose. [013] Em algumas modalidades, o processo compreende concentrar a solução inicial a um estado supersaturado em relação a 2'fucosil-lactose, e, então, precipitar um cristal de 2'-fucosil-lactose da solução supersaturada enquanto submete a solução supersaturada a uma temperatura de pelo menos 40 °C. Nesse processo, a solução inicial tem um teor de sólidos secos com uma concentração de 2'-fucosiIlactose menor do que cerca de 95% (em que a porcentagem corresponde a uma concentração de área de pico normalizada obtida com o uso de cromatografia líquida de alto desempenho). Ademais, a solução supersaturada compreende no máximo 1% (em peso) de

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5/57 solvente orgânico durante a precipitação do cristal de 2'-fucosil-lactose. [014] Em algumas modalidades, o processo compreende concentrar a solução inicial a um estado supersaturado em relação a 2'fucosil-lactose, e, então, precipitar um cristal de 2'-fucosil-lactose da solução supersaturada enquanto submete a solução supersaturada a uma temperatura de pelo menos 40 °C. Nesse processo, a solução supersaturada compreende no máximo 1% (em peso) de solvente orgânico durante a precipitação do cristal de 2'-fucosil-lactose. Ademais, o produto de 2'-fucosil-lactose cristalina tem um ponto de fusão de cerca de 230 a cerca de 239 °C (conforme determinado com uma taxa de aquecimento de 1 °C/min com o uso do método de ponto de fusão capilar da Farmacopeia Européia).

[015] Em algumas modalidades, o processo compreende concentrar a solução inicial a um estado supersaturado em relação a 2'fucosil-lactose, e, então, precipitar um cristal de 2'-fucosil-lactose da solução supersaturada enquanto submete a solução supersaturada a uma temperatura de pelo menos 40 °C. Nesse processo, a solução supersaturada compreende no máximo 1% (em peso) de solvente orgânico durante a precipitação do cristal de 2'-fucosil-lactose. Ademais, o produto de 2'-fucosil-lactose cristalina exibe uma reflexão de difração de raios X por pó, com base em uma medição com o uso de radiação de CuKa, a 16,98±0,20, 13,65±0,20 e 18,32±0,20 ângulos 2Θ.

[016] Este relatório descritivo também divulga, em parte, um processo para produzir 2'-FL amorfo. O processo compreende produzir 2'-FL cristalina de acordo com o processo de cristalização descrito acima (ou em outra parte neste relatório descritivo), dissolver a 2'-FL cristalina em um solvente (por exemplo, água) para formar uma solução de 2'-FL purificada, e precipitar 2'-FL amorfa a partir da solução de 2'FL purificada.

[017] Este relatório descritivo também divulga, em parte,

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6/57 processos para produzir um alimento, suplemento dietético ou medicamento.

[018] Em algumas modalidades, o processo para produzir o alimento, suplemento dietético ou medicamento compreende produzir 2'-FL cristalina de acordo com o processo de cristalização descrito acima (ou em outra parte neste relatório descritivo), e, então, misturar a 2'-FL cristalina com um ou mais ingredientes adequados para o alimento, suplemento dietético ou medicamento.

[019] Em algumas modalidades, o processo para produzir o alimento, suplemento dietético ou medicamento compreende produzir 2'-FL cristalina de acordo com o processo de cristalização descrito acima (ou em outra parte neste relatório descritivo), dissolver a 2'-FL cristalina em um solvente (por exemplo, água), e misturar a 2'-FL dissolvida com um ou mais ingredientes adequados para o alimento, suplemento dietético ou medicamento.

[020] Em algumas modalidades, o processo para produzir o alimento, suplemento dietético ou medicamento compreende produzir 2'-FL amorfa, conforme descrito acima (ou em outra parte neste relatório descritivo), e, então, misturar a 2'-FL amorfa com um ou mais ingredientes adequados para o alimento, suplemento dietético ou medicamento.

[021] Em algumas modalidades, o processo para produzir o alimento, suplemento dietético ou medicamento compreende produzir a 2'-FL amorfa conforme descrito acima (ou em outra parte neste relatório descritivo), dissolver a 2'-FL amorfa em um solvente (por exemplo, água), e misturar a 2'-FL dissolvida com um ou mais ingredientes adequados para o alimento, suplemento dietético ou medicamento.

[022] Este relatório descritivo também divulga, em parte, processos para produzir fórmula infantil.

[023] Em algumas modalidades, o processo para produzir fórmula

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7/57 infantil compreende produzir 2'-FL cristalina de acordo com o processo de cristalização descrito acima (ou em outra parte neste relatório descritivo), e, então, misturar a 2'-FL cristalina com um ou mais ingredientes de fórmula infantil.

[024] Em algumas modalidades, o processo para produzir fórmula infantil compreende produzir 2'-FL cristalina de acordo com o processo de cristalização descrito acima (ou em outra parte neste relatório descritivo), dissolver a 2'-FL cristalina em um solvente (por exemplo, água), e misturar a 2'-FL dissolvida com um ou mais ingredientes de fórmula infantil.

[025] Em algumas modalidades, o processo para produzir uma fórmula infantil compreende produzir 2'-FL amorfa conforme descrito acima (ou em outra parte neste relatório descritivo), e, então, misturar a 2'-FL amorfa com um ou mais ingredientes de fórmula infantil.

[026] Em algumas modalidades, o processo para produzir uma fórmula infantil compreende produzir a 2'-FL amorfa conforme descrito acima (ou em outra parte neste relatório descritivo), dissolver a 2'-FL amorfa em um solvente (por exemplo, água), e misturar a 2'-FL dissolvida com um ou mais ingredientes de fórmula infantil.

[027] Este relatório descritivo também divulga, em parte, um produto de 2'-FL cristalina obtida a partir de um processo de cristalização descrito acima (ou em outra parte neste relatório descritivo).

[028] Este relatório descritivo também divulga, em parte, 2'-FL amorfa obtida a partir de um processo descrito acima (ou em outra parte neste relatório descritivo) para produzir 2'-FL amorfa.

[029] Este relatório descritivo também divulga, em parte, um alimento, suplemento dietético ou medicamento preparado por um processo para produzir um alimento, suplemento dietético ou medicamento descrito acima (ou em outra parte neste relatório

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8/57 descritivo).

[030] Este relatório descritivo também divulga, em parte, uma formulação infantil obtida a partir de um processo para produzir uma fórmula infantil descrita acima (ou em outra parte neste relatório descritivo).

[031] Os benefícios adicionais dos ensinamentos deste relatório descritivo serão evidentes para uma pessoa versada na técnica a partir da leitura deste relatório descritivo.

DESCRIÇÃO DETALHADA [032] A descrição detalhada é destinada a reconhecer outros versados na técnica com a invenção do Requerente, seus princípios, e sua aplicação prática para que outros versados na técnica possam se adaptar e aplicar a invenção em suas várias formas, visto que podem ser mais bem adequadas às necessidades de um uso particular. A descrição detalhada e seus exemplos específicos, enquanto indicam certas modalidades, são destinados apenas a propósitos de ilustração. Este relatório descritivo, portanto, não é limitado às modalidades descritas, e pode ser modificado de vários modos.

[033] Este relatório descritivo se refere a um processo para cristalizar 2'-FL a partir de uma solução que contém 2'-FL. Em geral, esse processo compreende levar uma solução que contém 2'-FL a um estado supersaturado em relação a 2'-FL, e, então, cristalizar a 2'-FL a partir da solução por evaporação até uma massa de cristalização ser obtida, a qual tem um rendimento de cristal de pelo menos cerca de 1% em relação a 2'-FL.

[034] Em algumas modalidades, a solução a partir da qual 2'-FL é cristalizada compreende uma fonte natural de 2'-FL, como, por exemplo, um leite animal (por exemplo, leite humano) ou uma composição derivada de leite animal. Em algumas modalidades, a solução a partir da qual a 2'-FL é cristalizada é produzida por uma síntese química. Em

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9/57 ainda outras modalidades, a solução que contém 2'-FL é obtida a partir de um processo de fermentação microbiana. Por exemplo, a fonte de 2'FL pode ser um caldo de fermentação obtido por fermentação microbiana com o uso de um micro-organismo recombinante, como bactérias ou levedura. Em algumas tais modalidades, o microorganismo é uma levedura. Em outras modalidades, o micro-organismo é uma bactéria. Em algumas modalidades, o micro-organismo é Escherichia coli. Em algumas modalidades, a fermentação ocorre em um meio quimicamente definido.

[035] Antes da cristalização, a fonte de 2'-FL (por exemplo, caldo de fermentação) pode ser submetida a um ou mais processos de purificação. Em algumas modalidades, por exemplo, a fonte de 2'-FL (por exemplo, caldo de fermentação) é submetida a uma centrifugação, sedimentação ou um ou mais outros processos para remover a biomassa de célula. Em algumas modalidades, a fonte de 2'-FL (por exemplo, caldo de fermentação) é submetida à ultrafiltração. Isso pode ser útil, por exemplo, para remover células e biomoléculas grandes, como proteínas, ácidos nucleicos e lipopolissacarídeos. Em algumas modalidades, a fonte de 2'-FL (por exemplo, caldo de fermentação) é submetida à nanofiltração. Isso pode ser útil, por exemplo, para concentrar a 2'-FL reduzindo-se a água enquanto remove minerais e várias biomoléculas pequenas. Em algumas modalidades, a fonte de 2'FL (por exemplo, caldo de fermentação) é submetida a uma separação cromatográfica, como cromatografia de filtração de gel. Em algumas modalidades, a fonte de 2'-FL (por exemplo, caldo de fermentação) é submetida à microfiltração. Isso pode ser útil, por exemplo, para remover a contaminação microbiológica. Em algumas modalidades, a fonte de 2'-FL (por exemplo, caldo de fermentação) é submetida à troca catiônica, troca aniônica, resina de troca iônica, troca iônica de leito misturado e/ou eletrodiálise. Os mesmos podem ser úteis, por exemplo,

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10/57 para remover moléculas carregadas pequenas, sais e metais-traço. Em algumas modalidades, a fonte de 2'-FL (por exemplo, caldo de fermentação) é submetida à descoloração, por contato, por exemplo, da mesma com carbono ativado em pó ou filtração de carvão. Em algumas modalidades, a fonte de 2'-FL (por exemplo, caldo de fermentação) é submetida à evaporação. Isso pode ser útil, por exemplo, para concentrar a 2'-FL removendo-se a água. Em algumas modalidades, a fonte de 2'-FL (por exemplo, caldo de fermentação) é submetida a uma combinação de duas ou mais das etapas de purificação acima antes da cristalização. Tais modalidades podem incluir o uso das etapas em várias ordens, assim como repetir várias etapas em pontos diferentes no processo.

[036] Em algumas modalidades, por exemplo, a fonte de 2'-FL é um caldo de fermentação, o qual é submetido à ultrafiltração, troca catiônica, troca aniônica, troca iônica de leito misturado e carbono ativado em pó antes da solução ser levada a um estado supersaturado para a cristalização. Em algumas modalidades, a fonte de 2'-FL é um caldo de fermentação, o qual é submetido à centrifugação, ultrafiltração, troca catiônica, troca aniônica, troca iônica de leito misturado e carbono ativado em pó antes da solução ser levada a um estado supersaturado para a cristalização. Em algumas modalidades, a fonte de 2'-FL é um caldo de fermentação, o qual é submetido à ultrafiltração, nanofiltração, troca catiônica, troca aniônica, troca iônica de leito misturado e carbono ativado em pó antes da solução ser levada a um estado supersaturado para a cristalização. Em algumas modalidades, a fonte de 2'-FL é um caldo de fermentação, o qual é submetido à centrifugação, ultrafiltração, nanofiltração, troca catiônica, troca aniônica, troca iônica de leito misturado e carbono ativado em pó antes da solução ser levada a um estado supersaturado para a cristalização. Em algumas modalidades, a fonte de 2'-FL é um caldo de fermentação, o qual é submetido à

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11/57 ultrafiltração, nanofiltração, microfiltração opcional, remoção iônica opcional (por exemplo, resina de troca iônica e/ou eletrodiálise), préconcentração opcional (por exemplo, evaporação ou nanofiltração), descoloração (por exemplo, filtração de carvão), microfiltração, e nanofiltração opcional antes da solução ser levada a um estado supersaturado para a cristalização.

[037] Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL (ou pureza) no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de pré-cristalização é menos do que 99%. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de pré-cristalização é menos do que 98%. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de pré-cristalização é menos do que cerca de 95%. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de pré-cristalização é menos do que cerca de 91 %. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de pré-cristalização é menos do que cerca de 90%. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de pré-cristalização é menos do que cerca de 85%. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de pré-cristalização é menos do que cerca de 80%. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de pré-cristalização é menos do que cerca de 75%.

[038] Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de précristalização é pelo menos cerca de 50%. Em algumas modalidades, a

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12/57 concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de pré-cristalização é pelo menos cerca de 55%. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de précristalização é pelo menos cerca de 60%. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de pré-cristalização é pelo menos cerca de 65%. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de précristalização é pelo menos cerca de 70%. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de pré-cristalização é pelo menos cerca de 75%. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de précristalização é pelo menos cerca de 80%. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de pré-cristalização é pelo menos cerca de 85%. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de précristalização é pelo menos cerca de 90%. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de pré-cristalização é pelo menos cerca de 95%. [039] Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de précristalização é de cerca de 60 a cerca de 95%. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de pré-cristalização é de cerca de 60 a cerca de 90%. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de pré-cristalização é de cerca de 65 a cerca de 95%. Em

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13/57 algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de pré-cristalização é de cerca de 65 a cerca de 90%. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de pré-cristalização é de cerca de 70 a cerca de 95%. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de pré-cristalização é de cerca de 70 a cerca de 90%. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de pré-cristalização é de cerca de 70 a cerca de 85%. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de pré-cristalização é de cerca de 70 a cerca de 80%. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de pré-cristalização é de cerca de 70 a cerca de 75%. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de pré-cristalização é de cerca de 75 a cerca de 95%. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de pré-cristalização é de cerca de 80 a cerca de 95%. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de pré-cristalização é de cerca de 85 a cerca de 95%. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL no teor de sólidos secos do xarope resultante das etapas de purificação de pré-cristalização é de cerca de 90 a cerca de 95%.

[040] As porcentagens de concentração de 2'-FL acima correspondem às concentrações de área de pico normalizadas (ou purezas) obtidas com o uso de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).

[041] Em algumas modalidades, a 2'-FL é cristalizada a partir de

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14/57 uma solução que compreende 2'-FL e pelo menos um outro carboidrato. Por exemplo, quando a solução de 2'-FL é derivada de um método enzimático ou abordagem fermentativa, a solução pode conter, por exemplo, uma mistura de complexo de lactose, oligossacarídeos além da 2'-FL (por exemplo, difucosil-lactose (DiFL)), monossacarídeos, aminoácidos, polipeptídeos, proteínas, sais monovalentes e divalentes, ácidos orgânicos, ácidos nucleicos, etc. Em algumas modalidades, a concentração total de carboidratos diferentes de 2'-FL na solução é pelo menos cerca de 1%. Em algumas modalidades, a concentração total de carboidratos diferentes de 2'-FL na solução é pelo menos cerca de 2%. Em algumas modalidades, por exemplo, a concentração total de carboidratos diferentes de 2'-FL na solução é pelo menos cerca de 5%. Em algumas modalidades, a concentração de DiFL na solução é pelo menos cerca de 1%. Em algumas modalidades, a concentração de DiFL na solução é pelo menos cerca de 2%. Em algumas modalidades, a concentração de DiFL na solução é pelo menos cerca de 5%. Em algumas modalidades, a concentração de DiFL na solução é pelo menos cerca de 7%. Em algumas modalidades, a concentração de DiFL na solução é de cerca de 1 a cerca de 20%. Em algumas modalidades, a concentração de DiFL na solução é de cerca de 2 a cerca de 20%. Em algumas modalidades, a concentração de DiFL na solução é de cerca de 2 a cerca de 18%. Em algumas modalidades, a concentração de DiFL na solução é de cerca de 5 a cerca de 18%. Em algumas modalidades, a concentração de DiFL na solução é de cerca de 2 a cerca de 10%. Em algumas modalidades, a concentração de DiFL na solução é de cerca de 5 a cerca de 10%. Em algumas modalidades, a concentração de DiFL na solução é de cerca de 10 a cerca de 18%. Em algumas modalidades, a concentração de lactose na solução é no máximo cerca de 0,1%. Em algumas modalidades, a concentração de lactose na solução é pelo menos cerca de 0,1%. Em algumas modalidades, a concentração de

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15/57 lactose na solução é pelo menos cerca de 2%. Em algumas modalidades, a concentração de lactose na solução é pelo menos cerca de 5%. Em algumas modalidades, a concentração de lactose na solução é de cerca de 0,1 a cerca de 15%. Em algumas modalidades, a concentração de lactose na solução é de cerca de 0,1 a cerca de 0,5%. Em algumas modalidades, a concentração de lactose na solução é de cerca de 1 a cerca de 12%. Em algumas modalidades, a concentração de lactose na solução é de cerca de 2 a cerca de 12%. Em algumas modalidades, a concentração de lactose na solução é de cerca de 5 a cerca de 12%. Em algumas modalidades, a concentração de lactose na solução é de cerca de 2 a cerca de 15%. Em algumas modalidades, a concentração de lactose na solução é de cerca de 5 a cerca de 15%. Estas porcentagens correspondem a concentrações de área de pico normalizada (ou purezas) obtidas com o uso de HPLC.

[042] Em geral, a solução é levada a um estado supersaturado antes da cristalização. Em algumas modalidades, a solução é levada a uma supersaturação de 2'-FL maior do que cerca de 1,0. Em algumas modalidades, a solução é levada a uma supersaturação de 2'-FL de cerca de 1,05 a cerca de 1,8. Em algumas modalidades, a solução é levada a uma supersaturação de 2'-FL de cerca de 1,1 a cerca de 1,7. Em algumas modalidades, a solução é levada a uma supersaturação de 2'-FL de cerca de 1,1 a cerca de 1,5. Em algumas modalidades, a solução é levada a uma supersaturação de 2'-FL de cerca de 1,2 a cerca de 1,7. Em algumas modalidades, a solução é levada a uma supersaturação de 2'-FL de cerca de 1,3 a cerca de 1,7. Em algumas modalidades, a solução é levada a uma supersaturação de 2'-FL de cerca de 1,3 a cerca de 1,5. Neste relatório descritivo, a menos que declarado de outro modo, os termos supersaturação e supersaturado correspondem a uma razão sem dimensão do teor de 2'-FL medido da solubilidade de 2'-FL, em que a razão é calculada a partir da equação a

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16/57 seguir:

teor de 2'-FL em solução s = solubilidade de 2'-FL na mesma temperatura [043] Aqui, s é supersaturação, e a unidade de medição para o teor de 2'-FL e 2'-FL a solubilidade é g /100 g de água. A solubilidade de 2'FL em temperaturas diferentes é fornecida no Exemplo 15.

[044] Em algumas modalidades, a solução é levada a um estado supersaturado aumentando-se o teor de sólidos secos a pelo menos cerca de 50% (em peso). Em algumas tais modalidades, o teor de sólidos secos é aumentado para pelo menos cerca de 55% (em peso). Em algumas tais modalidades, o teor de sólidos secos é aumentado para pelo menos cerca de 60% (em peso). Em algumas tais modalidades, o teor de sólidos secos é aumentado para pelo menos cerca de 65% (em peso). Em algumas tais modalidades, o teor de sólidos secos é aumentado para no máximo cerca de 80% (em peso). Em algumas tais modalidades, o teor de sólidos secos é aumentado para no máximo cerca de 78% (em peso). Em algumas tais modalidades, o teor de sólidos secos é aumentado para no máximo cerca de 75% (em peso). Em algumas tais modalidades, o teor de sólidos secos é aumentado de cerca de 50 a cerca de 80% (em peso). Em algumas modalidades, o teor de sólidos secos é aumentado de cerca de 55 a cerca de 78% (em peso). Em algumas modalidades, o teor de sólidos secos é aumentado de cerca de 60 a cerca de 75% (em peso). Em algumas modalidades, o teor de sólidos secos é aumentado de cerca de 65 a cerca de 75% (em peso). Em algumas tais modalidades, o teor de sólidos secos é aumentado a cerca de 60% (em peso).

[045] Em algumas modalidades, a solução é levada a um estado supersaturado em relação a 2'-FL por evaporação. Em algumas tais

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17/57 modalidades, a evaporação (ou pelo menos uma porção da mesma) é executada em pressão atmosférica. Em algumas modalidades, a evaporação (ou pelo menos uma porção da mesma) é executada a uma pressão mais baixa. Em algumas modalidades, a evaporação (ou pelo menos uma porção da mesma) é executada a uma pressão de no máximo cerca de 2,5 x 10⁴ Pa (250 mbar). Em algumas modalidades, a evaporação (ou pelo menos uma porção da mesma) é executada a uma pressão de cerca de 1,2 x 10⁴ (120) a cerca de 2,5 x 10⁴ Pa (250 mbar). Em algumas modalidades, a evaporação (ou pelo menos uma porção da mesma) é executada a uma pressão de cerca de 1,3 x 10⁴ Pa (130) a cerca de 2,2 x 10⁴ Pa (220 mbar). Em algumas modalidades, a evaporação (ou pelo menos uma porção da mesma) é executada a uma pressão de cerca de 1,5 x 10⁴ Pa (150) a cerca de 2,1 x 10⁴ Pa (210 mbar) [046] Em geral, a temperatura na qual a evaporação é executada dependerá, por exemplo, da pressão. Em algumas modalidades, a temperatura da evaporação é a temperatura de ebulição da solução na pressão. Em algumas modalidades, a temperatura de evaporação é pelo menos cerca de 40 °C. Em algumas modalidades, a temperatura de evaporação é pelo menos cerca de 45 °C. Em algumas modalidades, a temperatura de evaporação é pelo menos cerca de 50 °C. Em algumas modalidades, a temperatura de evaporação é pelo menos cerca de 55°C. Em algumas modalidades, a temperatura de evaporação é pelo menos cerca de 60 °C. Em algumas modalidades, a temperatura de evaporação é maior do que 60 °C. Em algumas modalidades, a temperatura de evaporação é no máximo cerca de 100 °C. Em algumas modalidades, a temperatura de evaporação é no máximo cerca de 90°C. Em algumas modalidades, a temperatura de evaporação é no máximo cerca de 80 °C. Em algumas modalidades, a temperatura de evaporação é no máximo cerca de 75 °C. Em algumas modalidades, a

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18/57 temperatura de evaporação é no máximo cerca de 70 °C (enquanto temperaturas maiores do que cerca de 70 °C podem ser vantajosas para a evaporação, o uso de tais temperaturas pode causar degradação de produto e/ou formação de cor indesejáveis). Em algumas modalidades, a temperatura de evaporação é de cerca de 45 a cerca de 80 °C. Em algumas modalidades, a temperatura de evaporação é de cerca de 50 a cerca de 80 °C. Em algumas modalidades, a temperatura de evaporação é de cerca de 55 a cerca de 80 °C. Em algumas modalidades, a temperatura de evaporação é de cerca de 60 a cerca de 80 °C. Em algumas modalidades, a temperatura de evaporação é maior do que 60 a no máximo cerca de 80 °C. Em algumas modalidades, a temperatura de evaporação é de cerca de 60 a cerca de 75 °C. Em algumas modalidades, a temperatura de evaporação é maior do que 60 a no máximo cerca de 75 °C. Em algumas modalidades, a temperatura de evaporação é de cerca de 65 a cerca de 75 °C. Em algumas modalidades, a temperatura de evaporação é de cerca de 40 a cerca de 70 °C. Em algumas modalidades, a temperatura de evaporação é de cerca de 45 a cerca de 70 °C. Em algumas modalidades, a temperatura de evaporação é de cerca de 50 a cerca de 70 °C. Em algumas modalidades, a temperatura de evaporação é de cerca de 55 a cerca de 70 °C. Em algumas modalidades, a temperatura de evaporação é de cerca de 60 a cerca de 70 °C. Em algumas modalidades, a temperatura de evaporação é maior do que 60 a no máximo cerca de 70 °C.

[047] Em algumas modalidades, a semeadura é usada para iniciar a formação de cristais de 2'-FL da solução supersaturada. Em algumas tais modalidades, a semeadura é efetuada adicionando-se cristais de semente à solução supersaturada. Em algumas tais modalidades, os cristais de semente compreendem um pó de 2'-FL particulado. Em algumas modalidades, os cristais de semente compreendem cristais de semente de 2'-FL anidros.

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19/57 [048] Os cristais de semente podem ser feitos por vários processos, incluindo, por exemplo, aqueles discutidos neste relatório descritivo. Em algumas modalidades, as sementes secas são moídas para obter tamanho de partícula menor. Os cristais de semente também podem ser usados em forma de suspensão.

[049] A quantidade desejável de cristais de semente pode depender, por exemplo, do tamanho dos cristais de semente.

[050] Em algumas modalidades, a quantidade de cristais de semente secos usada é de cerca de 0,001 a cerca de 1% (em peso) de 2'-FL particulada, com base na 2'-FL da massa de cristalização.

[051] Em algumas modalidades, uma suspensão de cristais de semente é usada, e a quantidade de cristais de semente de suspensão é de cerca de 1 a cerca de 30% (em peso) de 2'-FL particulada, com base na 2'-FL da massa de cristalização.

[052] Em algumas modalidades, a cristalização é iniciada sem adicionar cristais de semente de 2'-FL à solução supersaturada. Em algumas tais modalidades, por exemplo, a semeadura é efetuada com o uso de semeadura espontânea ou semeadura de ultraondas.

[053] Em geral, a iniciação de cristalização (por exemplo, a adição de cristais de semente) é executada quando uma supersaturação adequada for alcançada. Em algumas modalidades, a iniciação de cristalização (por exemplo, a adição de cristais de semente) é executada quando a supersaturação de 2'-FL é maior do que cerca de 1,0. Em algumas modalidades, a iniciação de cristalização (por exemplo, adição de cristais de semente) é executada quando a supersaturação de 2'-FL é de cerca de 1,05 a cerca de 1,8. Em algumas modalidades, a iniciação de cristalização (por exemplo, adição de cristais de semente) é executada quando a supersaturação de 2'-FL é de cerca de 1,1 a cerca de 1,7. Em algumas modalidades, a iniciação de cristalização (por exemplo, adição de cristais de semente) é executada quando a

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20/57 supersaturação de 2'-FL é de cerca de 1,1 a cerca de 1,5. Em algumas modalidades, a iniciação de cristalização (por exemplo, adição de cristais de semente) é executada quando a supersaturação de 2'-FL é de cerca de 1,2 a cerca de 1,7. Em algumas modalidades, a iniciação de cristalização (por exemplo, adição de cristais de semente) é executada quando a supersaturação de 2'-FL é de 1,3 a cerca de 1,7. Em algumas modalidades, a iniciação de cristalização (por exemplo, adição de cristais de semente) é executada quando a supersaturação de 2'-FL é de cerca de 1,3 a cerca de 1,5.

[054] Em algumas modalidades, a iniciação de cristalização (por exemplo, a adição de cristais de semente) é executada quando o teor de sólidos secos do xarope é pelo menos cerca de 60% (em peso). Em algumas modalidades, a iniciação de cristalização (por exemplo, a adição de cristais de semente) é executada quando o teor de sólidos secos do xarope é pelo menos cerca de 65% (em peso). Em algumas modalidades, a iniciação de cristalização (por exemplo, a adição de cristais de semente) é executada quando o teor de sólidos secos do xarope é no máximo cerca de 80% (em peso). Em algumas modalidades, a iniciação de cristalização (por exemplo, a adição de cristais de semente) é executada quando o teor de sólidos secos do xarope é no máximo cerca de 75% (em peso). Em algumas modalidades, a iniciação de cristalização (por exemplo, adição de cristais de semente) é executada quando o teor de sólidos secos do xarope é de cerca de 60 a cerca de 80% (em peso). Em algumas modalidades, a iniciação de cristalização (por exemplo, adição de cristais de semente) é executada quando o teor de sólidos secos do xarope é de cerca de 65 a cerca de 80% (em peso). Em algumas modalidades, a iniciação de cristalização (por exemplo, adição de cristais de semente) é executada quando o teor de sólidos secos do xarope é de cerca de 65 a cerca de 77% (em peso). Em algumas

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21/57 modalidades, a iniciação de cristalização (por exemplo, adição de cristais de semente) é executada quando o teor de sólidos secos do xarope é de cerca de 65 a cerca de 75% (em peso). Em algumas modalidades, a iniciação de cristalização (por exemplo, adição de cristais de semente) é executada quando o teor de sólidos secos do xarope é de cerca de 65 a cerca de 70% (em peso). Em algumas modalidades, a iniciação de cristalização (por exemplo, adição de cristais de semente) é executada quando o teor de sólidos secos do xarope é de cerca de 70 a cerca de 76% (em peso).

[055] Uma vez que a cristalização é iniciada, a cristalização pode ser geralmente executada no ponto de ebulição da solução.

[056] Em algumas modalidades, a pelo menos uma porção (ou toda) a cristalização é executada em pressão atmosférica.

[057] Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da cristalização é executada a uma pressão que é menor do que a pressão atmosférica. Em algumas tais modalidades, a cristalização (ou pelo menos uma porção da mesma) é executada a uma pressão de no máximo cerca de 2,5 x 10⁴ Pa (250 mbar). Em algumas modalidades, a cristalização (ou pelo menos uma porção da mesma) é executada a uma pressão de cerca de 50 a cerca de 2,5 x 10⁴ Pa (250 mbar). Em algumas modalidades, a cristalização (ou pelo menos uma porção da mesma) é executada a uma pressão de cerca de 5,0 x 10³ (50) a cerca de 1,2 x 10⁴ Pa (120 mbar). Em algumas modalidades, a cristalização (ou pelo menos uma porção da mesma) é executada a uma pressão de cerca de 1,2 x 10⁴ (120) a cerca de 2,5 x 10⁴ Pa (250 mbar). Em algumas modalidades, a cristalização (ou pelo menos uma porção da mesma) é executada a uma pressão de cerca de 1,3 x 10⁴ (130) a cerca de 2,2 x 10⁴ Pa (220 mbar). Em algumas modalidades, a cristalização (ou pelo menos uma porção da mesma) é executada a uma pressão de cerca de 1,5 x 10⁴ (150) a cerca de 2,1 x 10⁴ Pa (210 mbar). Em algumas

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22/57 modalidades, a cristalização (ou pelo menos uma porção da mesma) é executada a uma pressão de cerca de 1,7 x 10⁴ (170) a cerca de 2,05 x 10⁴ Pa (205 mbar).

[058] Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 50% da cristalização são executados a uma faixa de pressão subatmosférica discutida acima. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 75% da cristalização são executados a uma faixa de pressão subatmosférica discutida acima. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 90% da cristalização são executados a uma faixa de pressão subatmosférica discutida acima. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 95% da cristalização são executados a uma faixa de pressão subatmosférica discutida acima. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 98% da cristalização são executados a uma faixa de pressão subatmosférica discutida acima. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 99% da cristalização são executados a uma faixa de pressão subatmosférica discutida acima. Em algumas modalidades, a cristalização inteira é executada a uma faixa de pressão subatmosférica discutida acima.

[059] Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da cristalização é executada na temperatura de ebulição da solução na pressão. Em algumas modalidades, a temperatura durante a cristalização não diminui para abaixo de 20 °C. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da cristalização é executada a uma temperatura de pelo menos cerca de 40 °C. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da cristalização é executada a uma temperatura de pelo menos cerca de 45 °C. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da cristalização é executada a uma temperatura de pelo menos cerca de 50 °C. Em algumas modalidades pelo menos uma porção da cristalização é executada a uma temperatura de pelo menos cerca de 55 °C. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da cristalização é executada a

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23/57 uma temperatura de pelo menos cerca de 60 °C. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da cristalização é executada a uma temperatura maior do que 60 °C. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da cristalização é executada a uma temperatura de no máximo cerca de 100 °C. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da cristalização é executada a uma temperatura de no máximo cerca de 90 °C. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da cristalização é executada a uma temperatura de no máximo cerca de 80°C. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da cristalização é executada a uma temperatura de no máximo cerca de 75°C. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da cristalização é executada a uma temperatura de no máximo cerca de 70°C (enquanto as temperaturas maiores do que cerca de 70 °C podem ser vantajosas para cristalização, o uso de tais temperaturas pode causar a degradação de produto e/ou formação de cor indesejáveis). Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da cristalização é executada a uma temperatura de cerca de 45 a cerca de 80 °C. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da cristalização é executada a uma temperatura de cerca de 50 a cerca de 80 °C. Em algumas modalidades pelo menos uma porção da cristalização é executada a uma temperatura de cerca de 55 a cerca de 80 °C. Em algumas modalidades pelo menos uma porção da cristalização é executada a uma temperatura de cerca de 60 a cerca de 80 °C. Em algumas modalidades pelo menos uma porção da cristalização é executada a uma temperatura maior do que 60 e no máximo cerca de 80 °C. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da cristalização é executada a uma temperatura de cerca de 60 a cerca de 75 °C. Em algumas modalidades pelo menos uma porção da cristalização é executada a uma temperatura maior do que 60 e no máximo cerca de 75 °C. Em algumas modalidades, pelo menos uma

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24/57 porção da cristalização é executada a uma temperatura de cerca de 65 a cerca de 75 °C. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da cristalização é executada a uma temperatura de cerca de 40 a cerca de 70 °C. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da cristalização é executada a uma temperatura de cerca de 45 a cerca de 70 °C. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da cristalização é executada a uma temperatura de cerca de 50 a cerca de 70 °C. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da cristalização é executada a uma temperatura de cerca de 55 a cerca de 70 °C. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da cristalização é executada a uma temperatura de cerca de 60 a cerca de 70 °C. Em algumas modalidades pelo menos uma porção da cristalização é executada a uma temperatura maior do que 60 e no máximo cerca de 70 °C.

[060] Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 50% da cristalização é executada a uma faixa de temperatura discutida acima. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 75% da cristalização é executada a uma faixa de temperatura discutida acima. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 90% da cristalização é executada a uma faixa de temperatura discutida acima. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 95% da cristalização é executada a uma faixa de temperatura discutida acima. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 98% da cristalização é executada a uma faixa de temperatura discutida acima. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 99% da cristalização é executada a uma faixa de temperatura discutida acima. Em algumas modalidades, a cristalização inteira é executada a uma faixa de temperatura discutida acima.

[061] Em algumas modalidades, o pH da cristalização é de cerca de 4 a cerca de 11. Em algumas modalidades, o pH durante pelo menos uma porção da cristalização é de cerca de 4 a cerca de 8. Em algumas

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25/57 modalidades, o pH durante pelo menos uma porção da cristalização é de cerca de 5 a cerca de 7. Em algumas modalidades, o pH durante pelo menos uma porção da cristalização é de cerca de 5 a cerca de 6. Em algumas modalidades, o pH durante toda a cristalização é no máximo cerca de 7. Em algumas modalidades, o pH durante toda a cristalização é de cerca de 5 a cerca de 7. Em algumas modalidades, o pH durante toda a cristalização é de cerca de 5 a cerca de 6.

[062] Durante a cristalização, a massa de cristal é tipicamente misturada de modo mecânico. Em algumas modalidades, a mistura é disposta de modo otimizado para maximizar a homogeneidade ao longo do volume inteiro da massa de cristalização. Isso geralmente fornece a transferência de calor e massa e gradientes de supersaturação pequenos por todo o volume de cristalização. Em algumas modalidades, isso é alcançado com o uso de pás de misturador giratórias tradicionais. Em geral, a intensidade da mistura é moderada para impedir o excesso de formação de partículas finas.

[063] Durante a cristalização, a suspensão de cristal é geralmente submetida à ebulição e evaporação até um grau suficiente de cristalização (rendimento, redução em pureza de 2'-FL do licor mãe e/ou tamanho de cristal) ter sido alcançado. Em algumas modalidades, a cristalização por evaporação é continuada por cerca de 1 a cerca de 50 h. Em algumas modalidades, a cristalização por evaporação é continuada por cerca de 2 a cerca de 40 h. Em algumas modalidades, a cristalização por evaporação é continuada por cerca de 2 a cerca de 30 h. Em algumas modalidades, a cristalização por evaporação é continuada por cerca de 2 a cerca de 20 h. Em algumas modalidades, a cristalização por evaporação é continuada por cerca de 2 a cerca de 15 h. Em algumas modalidades, a cristalização por evaporação é continuada por cerca de 2 a cerca de 5 h.

[064] É tipicamente desejável alcançar um rendimento de cristal

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26/57 de 2'-FL de cerca de 1 a cerca de 80% (em que esse rendimento é ο rendimento de cristal de 2'-FL imediatamente após a ebulição). Em algumas modalidades, o rendimento alvo é o rendimento de cristalização máximo que permite a separação de cristal eficaz, lavagem e secagem. Mais especificamente, os rendimentos de cristal baixos são tipicamente indesejáveis devido ao fato de que criam perdas na capacidade e eficácia de fabricação. Entretanto, os aumentos no rendimento de cristal fazem com que a viscosidade da suspensão de produto aumente. Uma alta viscosidade, por sua vez, pode criar dificuldade (e, em alguns casos, até mesmo impedir) a separação de cristal. Desse modo, em algumas modalidades, o rendimento alvo é o rendimento máximo correspondente a uma viscosidade que permite a separação eficaz em termos de custos.

[065] Em algumas modalidades, uma massa de cristalização é obtida, a qual tem um rendimento de cristal de cerca de 1 a cerca de 80% em relação a 2'-FL. Em algumas modalidades, uma massa de cristalização é obtida, a qual tem um rendimento de cristal de cerca de 30 a cerca de 80% em relação a 2'-FL. Em algumas modalidades, a massa de cristalização é obtida a qual tem um rendimento de cristal de cerca de 50 a cerca de 80% em relação a 2'-FL. Em algumas modalidades, a massa de cristalização é obtida a qual tem um rendimento de cristal de cerca de 55 a cerca de 75% em relação a 2'FL. Em algumas modalidades, a massa de cristalização é obtida, a qual tem um rendimento de cristal de cerca de 60 a cerca de 75% em relação a 2'-FL. Os rendimentos de cristal acima se referem a rendimentos imediatamente após a ebulição.

[066] Em algumas modalidades, o tamanho de cristal (isto é., a maior dimensão de um cristal) da população de cristal principal é pelo menos cerca de 1 pm. Em algumas modalidades, o tamanho de cristal da população de cristal principal é pelo menos cerca de 5 pm. Em

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27/57 algumas modalidades, o tamanho de cristal da população de cristal principal é pelo menos cerca de 10 pm. Em algumas modalidades, o tamanho de cristal da população de cristal principal é pelo menos cerca de 20 pm. Em algumas modalidades, o tamanho de cristal da população de cristal principal é pelo menos cerca de 30 pm. Em algumas modalidades, o tamanho de cristal da população de cristal principal no máximo cerca de 10,000 pm. Em algumas modalidades, o tamanho de cristal da população de cristal principal no máximo cerca de 5,000 pm. Em algumas modalidades, o tamanho de cristal da população de cristal principal no máximo cerca de 1,000 pm. Em algumas modalidades, o tamanho de cristal da população de cristal principal no máximo cerca de 500 pm. Em algumas modalidades, o tamanho de cristal da população de cristal principal no máximo cerca de 300 pm. Em algumas modalidades, o tamanho de cristal da população de cristal principal no máximo cerca de 200 pm. Em algumas modalidades, o tamanho de cristal da população de cristal principal está na faixa de cerca de 1 a cerca de 10,000 pm. Em algumas modalidades, o tamanho de cristal da população de cristal principal está na faixa de cerca de 10 a cerca de 500 pm. Em algumas modalidades, o tamanho de cristal da população de cristal principal está na faixa de cerca de 30 a cerca de 200 pm. Em algumas modalidades, o tamanho de cristal da população de cristal principal está na faixa de cerca de 30 a cerca de 100 pm. Em algumas modalidades, o tamanho de cristal da população de cristal principal está na faixa de cerca de 100 a cerca de 200 pm. Conforme usado neste relatório descritivo, o termo população de cristal principal é um julgamento visual de uma imagem microscópica de uma massa de cristalização. Os cristais mais externos que são anormalmente pequenos ou anormalmente grandes são ignorados.

[067] Em algumas modalidades, o líquido de alimentação adicional é adicionado à solução de 2'-FL simultaneamente com a cristalização

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28/57 por evaporação para aumentar o nível da solução de 2'-FL no cristalizador e/ou para aumentar o teor de substância seca da solução de 2'-FL. Em algumas modalidades, o líquido de alimentação adicional é adicionado continuamente. Em algumas modalidades, o líquido de alimentação adicional é adicionado por bateladas.

[068] Em algumas modalidades, a solução que contém 2'-FL é resfriada simultaneamente com a cristalização. Em algumas modalidades, a cristalização compreende um processo de ebulição e resfriamento combinados. Em tal processo, a temperatura pode ser, por exemplo, diminuída a uma temperatura de cerca de 10 a cerca de 20Ό menor do que a temperatura de ponto de semeadura. Em algumas tais modalidades, a taxa de resfriamento é de cerca de 10/h a cerca de õO/h.

[069] Em algumas modalidades, quando a cristalização por evaporação é terminada, a massa de cristal é mistura antes de permitir que a massa resfrie. Em algumas tais modalidades, a mistura é executada sob, por exemplo, pressão atmosférica, a uma temperatura de cerca de 40 a cerca de 75Ό. Em algumas tais modalidades, a mistura é executada sob, por exemplo, pressão atmosférica, a uma temperatura de cerca de 40 a cerca de 70Ό. Em algu mas modalidades, a mistura é executada sob, por exemplo, pressão atmosférica, a uma temperatura de cerca de 45 a cerca de 70Ό. Em algu mas modalidades, a mistura é executada sob, por exemplo, pressão atmosférica, a uma temperatura de cerca de 50 a cerca de 70Ό. Em algu mas modalidades, a mistura é executada sob, por exemplo, pressão atmosférica, a uma temperatura de cerca de 55 a cerca de 70Ό. Em algu mas modalidades, a mistura é executada sob, por exemplo, pressão atmosférica, a uma temperatura de cerca de 60 a cerca de 70Ό. Em algu mas modalidades, a mistura é executada sob, por exemplo, pressão atmosférica, a uma temperatura maior do que 60 e no máximo cerca de 70Ό. Em algumas

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29/57 modalidades, a mistura é continuada por cerca de 0,5 a cerca de 30 h. [070] Em algumas modalidades, quando a cristalização por evaporação é terminada, a temperatura da massa de cristalização é diminuída à temperatura ambiente. Em algumas modalidades, quando a cristalização por evaporação é terminada, a temperatura da massa de cristalização é diminuída a cerca de 20Ό. Em algumas modalidades, um período de resfriamento mais longo é usado quando o teor de 2'-FL é baixo.

[071] Em algumas modalidades, o resfriamento é conduzido por um período de cerca de 3 dias. Em algumas modalidades, o resfriamento é conduzido por um período de cerca de 1 a cerca de 3 dias. Em algumas modalidades, o resfriamento é conduzido por um período de cerca de 1 a cerca de 30 h.

[072] Em algumas modalidades, a taxa de resfriamento é de cerca de 10/h a cerca de õO/h.

[073] Em algumas modalidades, a viscosidade aparente da massa de cristalização durante a cristalização por evaporação é de cerca de 3 a cerca de 200 Pa-s. Em algumas modalidades, a viscosidade aparente da massa de cristalização durante a cristalização por evaporação é de cerca de 5 a cerca de 200 Pa-s. Em algumas modalidades, a viscosidade aparente da massa de cristalização durante a cristalização por evaporação é de cerca de 5 a cerca de 100 Pa-s. Em algumas modalidades, a viscosidade aparente da massa de cristalização durante a cristalização por evaporação é de cerca de 50 a cerca de 100 Pa-s. Em algumas modalidades, a viscosidade aparente da massa de cristalização durante a cristalização por evaporação é de cerca de 5 a cerca de 50 Pa-s. Em algumas modalidades, a viscosidade aparente da massa de cristalização durante a cristalização por evaporação é de cerca de 5 a cerca de 30 Pa-s. Uma viscosidade nestas faixas é geralmente adequada para separação eficaz do material cristalizado. Se

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30/57 a massa de cristalização se torna muito viscosa para separação eficaz, a viscosidade da massa de cristalização pode ser diminuída, por exemplo, diminuindo-se a supersaturação da massa de cristalização. A supersaturação da massa de cristalização pode ser diminuída, por exemplo, elevando a temperatura e/ou diluindo-se a massa de cristalização com água ou uma solução que contém 2'-FL.

[074] Os cristais podem ser separados por, por exemplo, centrifugação, filtração, decantação, etc. Em algumas modalidades, a separação dos cristais compreende centrifugação.

[075] Após a separação, os cristais são tipicamente secados por, por exemplo, contato dos mesmos com ar quente. Em algumas modalidades, os cristais são lavados após a separação. Em algumas modalidades, os cristais são lavados com água e, então, secados por, por exemplo, contato dos mesmos com ar quente. Em algumas modalidades, o teor de água da fração de cristal resultante é menor do que cerca de 1% (em peso). Em algumas modalidades, o teor de água da fração de cristal resultante é menor do que cerca de 0,5% (em peso). O teor de água pode ser medido por perda de peso por secura ou por titulação de Karl Fisher.

[076] Em algumas modalidades, a separação de sólido e líquido (SLS) é realizada no produto cristalino para remover microimpurezas, como traços de proteína e DNA, aminoácidos, impurezas de carboidrato, elementos-traço, etc.

[077] Em algumas modalidades, o teor de 2'-FL da fração de cristal resultante desse processo é pelo menos cerca de 85%. Em algumas modalidades, o teor de 2'-FL da fração de cristal resultante é pelo menos cerca de 90%. Em algumas modalidades, o teor de 2'-FL da fração de cristal resultante é pelo menos cerca de 91 %. Em algumas modalidades, o teor de 2'-FL da fração de cristal resultante é pelo menos cerca de 92%. Em algumas modalidades, o teor de 2'-FL da fração de cristal

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31/57 resultante é pelo menos cerca de 93%. Em algumas modalidades, o teor de 2'-FL da fração de cristal resultante é pelo menos cerca de 94%. Em algumas modalidades, o teor de 2'-FL da fração de cristal resultante é pelo menos cerca de 95%. Em algumas modalidades, o teor de 2'-FL da fração de cristal resultante é pelo menos cerca de 96%. Em algumas modalidades, o teor de 2'-FL da fração de cristal resultante é pelo menos cerca de 97%. Em algumas modalidades, o teor de 2'-FL da fração de cristal resultante é pelo menos cerca de 98%. Em algumas modalidades, o teor de 2'-FL da fração de cristal resultante é pelo menos cerca de 99%. Em algumas modalidades, o teor de 2'-FL da fração de cristal resultante é pelo menos cerca de 99,5%. Em algumas modalidades, o teor de 2'-FL da fração de cristal resultante é pelo menos cerca de 99,9%. Estas porcentagens correspondem a concentrações de área de pico normalizada ou purezas obtidas com o uso de HPLC.

[078] Em algumas modalidades, o ponto de fusão dos cristais resultantes desse processo é de cerca de cerca de 230 a cerca de 239°C. Em algumas modalidades, o ponto de fusão dos cristais resultantes desse processo é de cerca de cerca de 230 a cerca de 232°C. Em algumas modalidades, o ponto de fusão dos cristais resultantes desse processo é de cerca de cerca de 230 a cerca de 231 °C. Em algumas modalidades, o ponto de fusão dos cristais resultantes desse processo é de cerca de cerca de 232 a cerca de 239°C. Em algumas modalidades, o ponto de fusão dos cristais resultantes desse processo é de cerca de cerca de 232 a cerca de 238°C. Em algumas modalidades, o ponto de fusão dos cristais resultantes desse processo é de cerca de cerca de 233 a cerca de 238°C. Em algumas modalidades, o ponto de fusão dos cristais resultantes desse processo é de cerca de cerca de 234 a cerca de 237°C. Em algumas modalidades, o ponto de fusão dos cristais resultantes desse processo é menor do que 236 °C Em algumas

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32/57 modalidades, o ponto de fusão dos cristais resultantes desse processo é pelo menos cerca de 233 °C e menor do que 236 °C. Em algumas modalidades, o ponto de fusão dos cristais resultantes desse processo é pelo menos cerca de 234 °C e menor do que 236 °C. Em algumas modalidades, o ponto de fusão dos cristais resultantes desse processo é de cerca de 233 °C a 235 °C. Os pontos de fusão acima correspondem a um ponto de fusão determinado com uma taxa de aquecimento de 1°C/min com o uso do método de ponto de fusão de capilar da Farmacopeia Européia.

[079] Em algumas modalidades, os cristais resultantes exibem um espectro de difração de raios X por pó discutido na Publicação de Pedido de Patente Internacional. N^Q WO2011/150939 para a forma cristalina citada no documento n^Q WO2011/150939 como polimorfo de 2'-O-fucosil-lactose cristalina II.

[080] Em algumas modalidades, os cristais resultantes exibem uma reflexão de difração de raios X por pó, com base em uma medição com o uso de radiação de CuKa, a 16,98±0,20,13,65±0,20 e 18,32±0,20 ângulos 2Θ. Em algumas modalidades, os cristais resultantes exibem uma reflexão de difração de raios X por pó, com base em uma medição com o uso de radiação de CuKa, a 16,98±0,20, 13,65±0,20, 18,32±0,20 e 21,70±0,20 ângulos 2Θ. Em algumas modalidades, os cristais resultantes exibem uma reflexão de difração de raios X por pó, com base em uma medição com o uso de radiação de CuKa, a 16,98±0,20, 13,65±0,20, 18,32±0,20, 21,70±0,20 e 15,22±0,20 ângulos 2Θ. Em algumas modalidades, os cristais resultantes exibem uma reflexão de difração de raios X por pó, com base em uma medição com o uso de radiação de CuKa, a 16,98±0,20, 13,65±0,20, 18,32±0,20, 21,70±0,20, 15,22±0,20 e 20,63±0,20 ângulos 2Θ. Em algumas modalidades, os cristais resultantes exibem uma reflexão de difração de raios X por pó, com base em uma medição com o uso de radiação de CuKa, a

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16,98±0,20, 13,65±0,20, 18,32±0,20, 21,70±0,20, 15,22±0,20, 20,63±0,20 e 11,94±0,20 ângulos 2Θ.

[081] Em algumas modalidades, a recristalização é realizada uma ou mais vezes para aumentar a pureza de 2'-FL. A recristalização pode ser executada, por exemplo, dissolvendo os cristais de 2'-FL em água (tipicamente água deionizada), levando a solução resultante a um estado supersaturado em relação a 2'-FL (por meio de, por exemplo, evaporação) e cristalizando-se com o uso da metodologia de cristalização por evaporação descrita acima.

[082] Em algumas modalidades, o rendimento é aumentado realizando-se a cristalização do licor-mãe produzido pela cristalização inicial. Tal cristalização pode ser executada, por exemplo, levando o licor-mãe a um estado supersaturado em relação a 2'-FL (por meio de, por exemplo, evaporação), e cristalizando-se com o uso da metodologia de cristalização por evaporação descrita acima.

[083] Em algumas modalidades, o produto cristalino de 2'-FL do processo descrito neste relatório descritivo é incorporado a um alimento (por exemplo, humano ou alimento de animal doméstico), suplemento dietético ou medicamento. Em algumas modalidades, o produto cristalino é incorporado a um alimento de bebê humano (por exemplo, fórmula infantil). Em algumas tais modalidades, a 2'-FL é misturada com outros ingredientes do alimento, suplemento dietético ou medicamento. Quando incorporada a uma fórmula infantil, por exemplo, a 2'-FL pode ser misturada com outros ingredientes de fórmula infantil como, por exemplo, leite desnatado, uma fonte de carboidrato (por exemplo, lactose), uma fonte de proteína (por exemplo, proteína de soro concentrado), uma fonte de gordura (por exemplo, óleo de cártamo oleico superior), vitaminas, minerais, etc. Em algumas modalidades, a concentração de 2'-FL na fórmula infantil é aproximadamente a mesma concentração que a concentração de 2'-FL geralmente presente em leite

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34/57 de mama humana.

[084] Em geral, este processo pode ser usado para produzir um produto cristalino anidro. Em algumas modalidades, o teor de umidificação do produto de cristal de 2'-FL secado, conforme medido por titulação de Karl Fischer, é menor do que 1,0% (em peso). Em algumas tais modalidades, o teor de umidificação do produto de cristal de 2'-FL secado é menor do que 0,9% (em peso). Em algumas modalidades, o teor de umidificação do produto de cristal de 2'-FL secado é menor do que 0,8% (em peso). Em algumas modalidades, o teor de umidificação do produto de cristal de 2'-FL secado é menor do que 0,7% (em peso). Em algumas modalidades, o teor de umidificação do produto de cristal de 2'-FL secado é menor do que 0,6% (em peso). Em algumas modalidades, o teor de umidificação do produto de cristal de 2'-FL secado é menor do que 0,5% (em peso). Em algumas modalidades, o teor de umidificação do produto de cristal de 2'-FL secado é menor do que 0,4% (em peso). Em algumas modalidades, o teor de umidificação do produto de cristal de 2'-FL secado é menor do que 0,3% (em peso). Em algumas modalidades, o teor de umidificação do produto de cristal de 2'-FL secado é menor do que 0,2% (em peso). Em algumas modalidades, o teor de umidificação do produto de cristal de 2'-FL secado é menor do que 0,1% (em peso). Em algumas modalidades, nenhuma umidificação é detectada no produto de cristal de 2'-FL secado, conforme medido por titulação de Karl Fischer.

[085] Em algumas modalidades, o produto cristalino de 2'-FL do processo descrito neste relatório descritivo é convertido em uma forma física diferente para uma aplicação pretendida. Por exemplo, em algumas modalidades, o produto cristalino é dissolvido ou suspenso em água ou outro solvente para formar uma solução ou suspensão, que, por sua vez, é incorporada A (ou usada de outro modo na fabricação de) um alimento (por exemplo, fórmula infantil), dietético ou

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35/57 medicamento. Em outras modalidades, o produto cristalino é dissolvido em água ou outro solvente para formar uma solução, a qual é subsequentemente secada por aspersão para formar uma composição de 2'-FL amorfa, que, por sua vez, é incorporada a (ou, de outro modo, usada na fabricação de) um alimento (por exemplo, fórmula infantil), dietético ou medicamento.

[086] Em algumas modalidades, quando o produto de 2'-FL é incorporado a um alimento, suplemento dietético ou medicamento, a quantidade da 2'-FL é uma quantidade que é eficaz para portar um benefício, como um efeito prebiótico, antibacteriano, antiviral, de intensificação de sistema imunológico e/ou de intensificação de desenvolvimento cerebral.

[087] A cristalização descrita neste relatório descritivo não necessita que um solvente orgânico esteja presente na solução.

[088] Em algumas modalidades, nenhum álcool (por exemplo, metanol, etanol, etc.) é adicionado à solução a partir da qual a 2'-FL é cristalizada. Em algumas modalidades, nenhum álcool é adicionado enquanto a solução é levada à supersaturação em relação a 2'-FL. Em algumas modalidades, nenhum álcool é adicionado enquanto a evaporação é usada para levar a solução à supersaturação em relação a 2'-FL. Em algumas modalidades, nenhum álcool é adicionado enquanto a cristalização de 2'-FL ocorre. Em algumas modalidades, a concentração total de qualquer álcool presente na solução enquanto a solução é levada à supersaturação em relação a 2'-FL é no máximo cerca de 1% (em peso). Em algumas modalidades, a concentração total de qualquer álcool presente na solução enquanto a evaporação é usada para levar a solução à supersaturação em relação a 2'-FL é no máximo 1% (em peso). Em algumas modalidades, a concentração total de qualquer álcool presente na solução enquanto a cristalização de 2'-FL ocorre é no máximo cerca de 1% (em peso). Em algumas modalidades,

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36/57 a concentração total de qualquer álcool presente na solução enquanto a solução é levada à supersaturação em relação a 2'-FL é no máximo cerca de 0,1% (em peso). Em algumas modalidades, a concentração total de qualquer álcool presente na solução enquanto a evaporação é usada para levar a solução à supersaturação em relação a 2'-FL é no máximo 0,1% (em peso). Em algumas modalidades, a concentração total de qualquer álcool presente na solução enquanto a cristalização de 2'-FL ocorre é no máximo cerca de 0,1% (em peso). Em algumas modalidades, a solução consiste essencialmente em nenhum álcool enquanto a solução é levada à supersaturação em relação a 2'-FL. Em algumas modalidades, a solução consiste essencialmente em nenhum álcool enquanto a evaporação é usada para levar a solução à supersaturação em relação a 2'-FL. Em algumas modalidades, a solução consiste essencialmente em nenhum álcool enquanto a cristalização de 2'-FL ocorre. Aqui, a expressão consiste essencialmente em nenhum álcool significa que a quantidade de álcool presente na solução (se estiver presente) é insuficiente para afetar materialmente a cristalização.

[089] Em algumas modalidades, nenhum solvente de ácido orgânico (por exemplo, ácido acético) é adicionado à solução a partir da qual a 2'-FL é cristalizada. Em algumas modalidades, nenhum solvente de ácido orgânico é adicionado enquanto a solução é levada à supersaturação em relação a 2'-FL. Em algumas modalidades, nenhum solvente de ácido orgânico é adicionado enquanto a evaporação é usada para levar a solução à supersaturação em relação a 2'-FL. Em algumas modalidades, nenhum solvente de ácido orgânico é adicionado enquanto a cristalização de 2'-FL ocorre. Em algumas modalidades, a concentração total de qualquer solvente de ácido orgânico presente na solução enquanto a solução é levada à supersaturação em relação a 2'FL é no máximo cerca de 1% (em peso). Em algumas modalidades, a

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37/57 concentração total de qualquer solvente de ácido orgânico presente na solução enquanto a evaporação é usada para levar a solução à supersaturação em relação a 2'-FL é no máximo 1% (em peso). Em algumas modalidades, a concentração total de qualquer solvente de ácido orgânico presente na solução enquanto a cristalização de 2'-FL ocorre é no máximo cerca de 1% (em peso). Em algumas modalidades, a concentração total de qualquer solvente de ácido orgânico presente na solução enquanto a solução é levada à supersaturação em relação a 2'-FL é no máximo cerca de 0,1% (em peso). Em algumas modalidades, a concentração total de qualquer solvente de ácido orgânico presente na solução enquanto a evaporação é usada para levar a solução à supersaturação em relação a 2'-FL é no máximo 0,1% (em peso). Em algumas modalidades, a concentração total de qualquer solvente de ácido orgânico presente na solução enquanto a cristalização de 2'-FL ocorre é no máximo cerca de 0,1% (em peso). Em algumas modalidades, a solução consiste essencialmente em nenhum solvente de ácido orgânico enquanto a solução é levada à supersaturação em relação a 2'-FL. Em algumas modalidades, a solução consiste essencialmente em nenhum solvente de ácido orgânico enquanto a evaporação é usada para levar a solução à supersaturação em relação a 2'-FL. Em algumas modalidades, a solução consiste essencialmente em nenhum solvente de ácido orgânico enquanto a cristalização 2'-FL ocorre. Aqui, a expressão consiste essencialmente em nenhum solvente de ácido orgânico significa que a quantidade de solvente de ácido orgânico presente na solução (se estiver presente) é insuficiente para afetar material mente a cristalização.

[090] Em algumas modalidades, nenhum solvente orgânico é adicionado à solução a partir da qual 2'-FL é cristalizada. Em algumas modalidades, nenhum solvente orgânico é adicionado enquanto a solução é levada à supersaturação em relação a 2'-FL. Em algumas

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38/57 modalidades, nenhum solvente orgânico é adicionado enquanto a evaporação é usada para levar a solução à supersaturação em relação à 2'-FL. Em algumas modalidades, nenhum solvente orgânico é adicionado enquanto a cristalização de 2'-FL ocorre. Em algumas modalidades, a concentração total de qualquer solvente orgânico presente na solução enquanto a solução é levada à supersaturação em relação a 2'-FL é no máximo cerca de 1% (em peso). Em algumas modalidades, a concentração total de qualquer solvente orgânico presente na solução enquanto a evaporação é usada para levar a solução à supersaturação em relação a 2'-FL é no máximo 1% (em peso). Em algumas modalidades, a concentração total de qualquer solvente orgânico presente na solução enquanto a cristalização de 2'FL ocorre é no máximo cerca de 1% (em peso). Em algumas modalidades, a concentração total de qualquer solvente orgânico presente na solução enquanto a solução é levada à supersaturação em relação a 2'-FL é no máximo cerca de 0,1% (em peso). Em algumas modalidades, a concentração total de qualquer solvente orgânico presente na solução enquanto a evaporação é usada para levar a solução à supersaturação em relação a 2'-FL é no máximo 0,1% (em peso). Em algumas modalidades, a concentração total de qualquer solvente orgânico presente na solução enquanto a cristalização de 2'FL ocorre é no máximo cerca de 0,1% (em peso). Em algumas modalidades, a solução consiste essencialmente em nenhum solvente orgânico enquanto a solução é levada à supersaturação em relação a 2'-FL. Em algumas modalidades, a solução consiste essencialmente em nenhum solvente orgânico enquanto a evaporação é usada para levar a solução à supersaturação em relação a 2'-FL. Em algumas modalidades, a solução consiste essencialmente em nenhum solvente orgânico enquanto a cristalização 2'-FL ocorre. Aqui, a expressão consiste essencialmente em nenhum solvente orgânico significa que

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39/57 a quantidade de solvente orgânico presente na solução (se estiver presente) é insuficiente para afetar materialmente a cristalização.

EXEMPLOS [091] Os exemplos a seguir são meramente ilustrativos, e não limitantes ao restante deste relatório descritivo em qualquer maneira.

[092] Nos exemplos abaixo, as definições a seguir são usadas:

[093] Um valor identificado por [1] se refere à pureza de área de pico normalizada ou concentração obtida com o uso de HPLC (CarboPac PA100, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA). Isso é uma porcentagem de área de pico em relação à área total de picos.

[094] Um valor identificado por [2] se refere ao rendimento de 2'FL calculado a partir dos valores de pureza.

[095] Um valor identificado por [3] se refere ao teor de sólidos secos (DS) conforme medido por titulação de Karl Fischer.

[096] Um valor identificado por [4] se refere ao teor de sólidos secos calculado a partir de um equilíbrio de massa com base no teor de sólidos secos iniciais medidos usando-se a titulação de Karl Fischer e a quantidade de água evaporada ou adicionada.

[097] Um valor identificado por [5] se refere ao teor de umidificação medido em perda de peso por secagem.

[098] Um valor identificado por [6] se refere a uma medição de tamanho de cristal (isto é, medição da maior dimensão de um cristal) feita a partir de uma imagem microscópica. Os cristais mais externos que são anormalmente pequenos ou anormalmente grandes são ignorados.

[099] Um valor identificado por [7] se refere a uma cor de açúcar sob o sistema de classificação de cor de açúcar da Comissão

Internacional para Métodos Uniformes de Análise de Açúcar (ICUMSA).

[100] Um valor identificado por [8] se refere a uma

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40/57 supersaturação em relação a 2'-FL definida como uma razão entre a concentração de 2'-FL em solução (g /100 g de água) e solubilidade de 2'-FL em água (g /100 g de água) na mesma temperatura.

[101] Um valor identificado por [9] é o ponto de fusão medido com uma taxa de aquecimento de 1 °C/min com o uso do método de ponto de fusão de capilar da Farmacopeia Européia.

[102] Um valor identificado por [10] se refere à pureza de área de pico normalizada ou concentração obtida com o uso de HPLC (coluna de X-Bridge Amide HILIC, Waters, Milford, MA USA). Isso é uma porcentagem de área de pico em relação à área total de picos.

[103] A abreviação HPLC se refere à cromatografia líquida de alto desempenho.

[104] A abreviação DiFL se refere à difucosil-lactose.

Exemplo 1: Ilustração de Preparação de Cristal de Semente de 2'FL [105] Uma solução de alimentação aquosa, a qual teve uma concentração de 2'-FL de 90,4% [1 ], uma concentração de DiFL de 8,9% [1], e uma concentração de lactose de 0,2% [1], foi evaporada a um DS de 84,4% [3] (evaporador Rotavapor R-151). Etanol (279 g) foi, então, adicionado ao xarope (415 g) misturando-se a solução manualmente com um agitador de âncora. A solução resultante foi mantida em uma garrafa Rotavapor giratória a 600 por 2,3 h. Duran te esse tempo, água (10 g) foi adicionada duas vezes (20 g no total) para diluir a solução. A primeira adição de água ocorreu 1,0 h após a adição de etanol, e a segunda adição de água ocorreu 1,6 h após a adição de etanol.

[106] Uma porção do xarope resultante (306 g) foi movida para um reator de vidro. O etanol (71 g) foi adicionado a 600. Os cristais começaram a se formar. A solução de cristalização foi agitada a 600 por 1,2 h, resfriada a 550 em 1 h, e adicionalmente a 150 em 15 h sob agitação contínua. Após o resfriamento, a massa de cristal obtida

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41/57 continuou a ser agitada a 15Ό por 3,9 h.

[107] A massa de cristal foi centrifugada com uma centrífuga em bateladas que tem 22,5 cm de diâmetro de cesto. Para essa centrifugação, 343 g de massa de cristal foram carregados na centrífuga no estágio de aceleração a uma velocidade de rotação de 500 rpm. A água de lavagem (75 ml) foi adicionada a uma velocidade de rotação de 2.000 rpm e, então, a centrifugação foi continuada por 5 min a uma velocidade de rotação de 3500 rpm. Os cristais centrifugados resultantes (85 g) foram secados em uma câmara de aquecimento a 500 por 3,4 h. O teor de umidificação após a secag em foi 0,8% [3].

[108] Os cristais preparados de acordo com o processo ilustrado aqui foram usados no Exemplo 2. Antes de serem usados, os cristais foram lavados com etanol, secados e, então, triturados em um moinho de porcelana para quebrar a estrutura de cristal e fornecer partículas de formato irregular para iniciar a nuclear secundário. Os cristais lavados tiveram uma pureza de 2'-FL de 94,0% [1].

Exemplo 2: Preparação de Cristais de Semente

Usar Cristais de Semente Preparados de Acordo com o Exemplo 1 [109] Uma solução de alimentação aquosa, a qual teve uma concentração de 2'-FL de 90,7% [1 ], uma concentração de DiFL de 9,3% [1], e uma concentração de lactose de 0,1% [1], foi evaporada a um DS de 82,9% [3] (evaporador Rotavapor R-151). O xarope resultante (683 g) foi movido para um reator de vidro, e semeado com 0,29 g de cristais de semente secos de 2'-FL (preparados de acordo com o Exemplo 1) a uma temperatura de 55Ό.

[110] O xarope semeado foi agitado enquanto mantido a 55Ό. Etanol foi adicionado em duas porções: a primeira porção (610 g) foi adicionada 0,9 h após a semeadura em 0,3 h, e a segunda porção (221 g) foi adicionada 2,3 h após a semeadura. A solução de cristalização foi, então, resfriada de 55Ό a 15Ό em 17 h durante a a gitação. Após o

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42/57 resfriamento a 150, a agitação foi continuada a 15 0 por 0,9 h. A massa de cristal resultante (1,416 g) foi centrifugada com 100 ml de água de lavagem (centrífuga em bateladas, diâmetro de cesto 22,5 cm,

3,500 rpm, 5 min). Um total de 557 g de bolo de cristal foi obtido. Disso, 241 g foram secados em uma câmara de aquecimento a 60 °C por 2,3 h. O teor de umidificação após a secagem ter sido 0,8 % [3].

[111] Os cristais preparados de acordo com esse processo foram, por sua vez, usados como cristais de semente no Exemplo 3 abaixo. Antes de serem usados, os cristais foram lavados com etanol, secados e, então, moídos em um moinho de porcelana. Os cristais lavados tiveram uma pureza de 2'-FL de 91,6% [1].

Exemplo 3: Ilustração de Cristalização de 2'-FL [112] Uma solução de alimentação aquosa, a qual teve uma concentração de 2'-FL de 89,3% [1 ], uma concentração de DiFL de 9,5% [1], e uma concentração de lactose de <0,1% [1], foi evaporada a um DS de 61,0% [4] (evaporador Rotavapor R-151). O xarope (1,540 g) foi, então, semeado com 0,5 g de cristais de semente secos de 2'-FL (preparação descrita no Exemplo 2) a uma temperatura de 570 (supersaturação de 1,01 [8]). Isso resultou em formação de cristal muito pequena. Consequentemente, o xarope semeado foi mantido em ebulição a uma temperatura de 640 e pressão de 1,3 x 10⁴ a 1,8 x 10⁴Pa (130 a 180 mbar) por 2,8 h. O xarope foi, então, semeado uma segunda vez com 0,5 g de cristais de semente secos de 2'-FL a um DS de 67,2% [4] a uma temperatura de 650 (supersaturação de 1,27 [8]). Após a segunda semeadura, a cristalização ocorreu. A cristalização de ebulição foi continuada a uma temperatura de 650 e pressão de 1,75 x 10⁴ Pa (175 mbar) por 3,3 h.

[113] Permitiu-se que a massa de cristal obtida, a qual teve um DS de 72,8% [3], resfriasse à temperatura ambiente (21,50) e, então, fosse mantida em uma garrafa Rotavapor giratória de um dia para o outro (18

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h). Após 21,5 h da primeira semeadura, uma pequena amostra da massa foi centrifugada sem lavagem (centrífuga Hettich Rotanta 460R,

2.500 rpm, 10 min) para determinar o teor de cristal. A pureza de 2'-FL de bolo de cristal foi 96,7% [1 ] e a pureza de 2'-FL de licor-mãe foi 85,6% [1]. Isso corresponde a 36% de rendimento de 2'-FL [2]. A viscosidade da massa foi 3,2 Pa-s.

[114] A massa de cristal foi aquecida a 65Ό, e a c ristalização de ebulição foi continuada sob vácuo a uma pressão de 1,7 x 10⁴ Pa (170 mbar) por 4,4 h até o DS da massa de cristal foi 81,5% [3]. Uma amostra pequena da massa foi centrifugada sem lavagem. Isso resultou em uma pureza de 2'-FL de bolo de cristal de 97,2% [1 ], pureza de 2'-FL de licormãe de 73,5% [1], rendimento de 2'-FL de centrifugação de 72% [2], e DS de licor-mãe de 67,9% [3]. O tamanho de cristal da população de cristal principal foi 30 a 60 pm [6].

[115] A massa de cristal foi diluída a um DS de 79,5% [4] adicionando-se água deionizada, e, então, centrifugada com uma centrífuga em bateladas que tem 22,5 cm diâmetro de cesto. Aqui, 693 g de massa de cristal foram carregados na centrífuga. A água de lavagem (50 ml) foi, então, adicionada durante o estágio de aceleração na velocidade de rotação de 2,000 rpm. O tempo de centrifugação foi continuado por 5 min a uma velocidade de rotação de 3,500 rpm. O rendimento de centrifugação de 2'-FL foi 54% [2]. A pureza de 2'-FL de licor-mãe foi 79,5% [1], e o teor de umidificação do bolo não secado 5,7% [5].

[116] O bolo de cristal da centrifugação (274 g) foi secado em uma câmara de aquecimento a 60Ό por 2 h e, então, resfriado em um dessecador. Os cristais secados tiveram uma pureza de 2'-FL de 100,0% [1], ponto de fusão de 236,8 a 237,5 °C [9], cor correspondente a 22 ICUMSA [7] e teor de umidificação de 0,3% [3].

[117] O bolo de cristal não secado da centrifugação (30 g) foi

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44/57 lavado com etanol, secado e, então, triturado em um moinho de porcelana para preparar cristais de semente para os Exemplos 5, 7, 8, 10,12e 13.

Exemplo 4: Cristalização de 2'-FL a partir do Licor-Mãe de Centrifugação do Exemplo 3 [118] O licor-mãe de centrifugação do Exemplo 3, o qual teve uma concentração de 2'-FL de 79,5% [1], uma concentração de DiFL de 17,9% [1], e concentração de lactose de <0,1% [1], foi evaporado a uma temperatura de 73Ό e pressão de 2,0 x 10⁴ Pa (200 mbar) (evaporador Rotavapor R-151). Quando o DS foi 74,9% [4], os cristais formados por nucleação espontânea (supersaturação 1,55 [8]). O xarope foi diluído a um DS de 72,6% [4] e mantido a 73Ό sem vácuo por 1 ,2 h. A ebulição do xarope foi, então, continuada a uma temperatura de 73Ό e pressão de 1,75 x 10⁴ a 1,8 x 10⁴ Pa (175 a 180 mbar) por 4,8 h. A massa de cristal obtida, que teve um DS de 83,2% [3], foi movida para uma garrafa de vidro e mantida em uma câmara de aquecimento a uma temperatura de 60Ό por 69 h. Após 74 h do começo da nucleação espontânea, a centrifugação de uma amostra pequena da massa sem lavagem (centrífuga Hettich Rotanta 460R, 2,500 rpm, 10 min) forneceu um bolo cristalino que tem uma pureza de 2'-FLde 95,7% [1] e um licor-mãe que tem uma pureza de 2'-FL de 51,5% [1]. Isso corresponde a um rendimento de 2'-FL de 76 % [2]. O tamanho de cristal da população de cristal principal foi 40 a 100 pm [6].

[119] A massa de cristal (165 g) foi centrifugada com uma centrífuga em bateladas sem lavagem (diâmetro de cesto 22,5 cm,

3,500 rpm, 3 min). O rendimento de 2'-FL de centrifugação foi 76% [2]. Os cristais centrifugados e secados (60Ό, 2,4 h) t iveram uma pureza de 2'-FL de 93,2% [1] com uma cor de 157 ICUMSA [7] e teor de umidificação de 0,5% [3]. A pureza de 2'-FL de licor-mãe foi 53,9% [1] com uma cor de 609 ICUMSA [7].

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Exemplo 5: Uso de Alimentação Fresca Simultânea com Precipitação de Cristal [120] Um xarope de alimentação aquosa, o qual teve uma concentração de 2'-FL de 87,3% [1], uma concentração de DiFL de 10,1% [1], e uma concentração de lactose de 0,2% [1], foi evaporado a um DS de 67,7% [4] (evaporador de filme fino Luwa NL3-210/1600/10). Nesse ponto, 1,149 g do xarope foram movidos para um evaporador Rotavapor R-153 e semeados com 0,83 g de semente seca de 2'-FL (cristais do Exemplo 3) a uma temperatura de 61Ό (supersaturação de 1,30 [8]). O xarope semeado foi submetido à ebulição a uma temperatura de 65Ό e pressão de 1,5 x 10⁴ Pa a 1,65 x 10⁴ Pa (150 a 165 mbar) por 5,1 h enquanto adiciona simultaneamente líquido de alimentação fresco (DS de 58,3% [4], 1,443 g no total) à massa de cristal em porções pequenas (aproximadamente 30 a 120 g) em intervalos de tempo de 5 a 40 min. Após isso, o DS da massa de cristal foi 80,3% [3]. A centrifugação de uma amostra pequena da massa sem lavagem (centrífuga de Hettich Rotanta 460R, 2,500 rpm, 10 min) forneceu um bolo cristalino que tem uma pureza de 2'-FL de 96,1% [1] e pureza de 2'-FL de licor-mãe de 75,2% [1], que corresponde a um rendimento de 2'-FL de 64% [2]. O tamanho de cristal da população de cristal principal foi 30 a 60 pm [6].

[121] A massa de cristal (1,332 g) foi centrifugada com 75 ml de água de lavagem (centrífuga em bateladas, diâmetro de cesto 22,5 cm,

3,500 rpm, 5 min). O rendimento de centrifugação de 2'-FL foi 53% [2]. A pureza de 2'-FL dos cristais centrifugados e secados (60Ό, 8-1 7 h) foi 97,8% [1]. A cor foi 67 ICUMSA [7] e o teor de umidificação foi 0,1% [3]. A pureza de 2'-FL de licor-mãe foi 78,1% [1] e a cor foi 93 ICUMSA [7]·

Exemplo 6: Cristalização de 2'-FL de Licor-Mãe de Centrifugação do Exemplo 5

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Usar Adição de Água Simultaneamente com Precipitação de Cristal [122] O licor-mãe de centrifugação do Exemplo 5, o qual teve uma concentração de 2'-FL de 78,1% [1], uma concentração de DiFL de 17,6% [1], e concentração de lactose de 0,3% [1], foi evaporado a uma temperatura de 67Ό e pressão de 2,0 x 10⁴ Pa (200 mbar) (evaporador Rotavapor R-151). Quando o DS foi 75,5% [4], os cristais formados por nucleação espontânea (supersaturação 1,65 [8]). O xarope foi diluído a um DS de 72,6% [4] e mantido a 67Ό sem vácuo por 1 h. A ebulição do xarope foi, então, continuada a uma temperatura de 65 a 67Ό e a pressão de 2,0 x 10⁴ Pa (200 mbar) por 5,2 h enquanto adiciona simultaneamente porções pequenas de água deionizada (em torno de 500 g no total) para a massa.

[123] Após 6,2 h do começo de nucleação espontânea, o DS da massa de cristal foi 81,8% [3]. A centrifugação de uma amostra pequena da massa sem lavagem (centrífuga Hettich Rotanta 460R, 2,500 rpm, 10 min) forneceu um bolo cristalino que tem uma pureza de 2'-FL de 91,9% [1] e um licor-mãe que tem uma pureza de 2'-FL de 59,0% [1]. Isso corresponde a um rendimento de 2'-FL de 68% [2]. O tamanho de cristal da população de cristal principal foi 30 a 80 pm [6].

[124] A massa de cristal (371 g) foi centrifugada com 30 ml de água de lavagem (centrífuga em bateladas, diâmetro de cesto 22,5 cm, 3,500 rpm, 5 min). O rendimento de centrifugação de 2'-FL foi 54% [2]. A pureza de 2'-FL dos cristais centrifugados e secados (60Ό, 2 h) foi 93,4% [1]. A cor foi 100 ICUMSA [7] e o teor de umidificação foi 0,9% [3]. A pureza de 2'-FL de licor-mãe foi 65,4% [1] e a cor foi 287 ICUMSA [7]·

Exemplo 7: Ilustração de Cristalização de 2'-FL [125] Um xarope de alimentação aquosa, o qual teve uma concentração de 2'-FL de 89,9% [1 ], uma concentração de DiFL de 8,5% [1], e uma concentração de lactose de <0,1% [1], foi evaporado a um

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DS de 65,6% [3] (evaporador de filme fino Luwa NL3-210/1600/10). O xarope resultante (8141 g) foi movido para um evaporador Rotavapor R153 e semeado com 2,7 g de semente seca de 2'-FL (cristais do Exemplo 3) a uma temperatura de 68Ό (supersaturação de 1,17 [8]). A mistura foi continuada nessa temperatura por 1,2 h. Após isso, o xarope semeado foi evaporado a um DS de 80,4% [3] em 5,3 h em três etapas de modo que, em cada etapa, o xarope fosse primeiro submetido à ebulição sob vácuo por 0,9 a 1,2 h (67 a 72Ό e 1 ,9 x 10⁴ a 2,0 x 10⁴Pa (190 a 200 mbar)), seguido por mistura à pressão atmosférica por 0,6 a 0,9 h (67 a 72Ό). A massa de cristal resultante foi movida para um tanque de mistura de 6 L e mantida a 69Ό de um dia para o outro (19 h). A progressão de cristalização foi monitorada centrifugando-se (centrífuga Hettich Rotanta 460R, 2,500 rpm, 10 min) amostras pequenas da massa sem lavagem. Os resultados são resumidos na Tabela 1.

[126] A massa de cristal resultante foi centrifugada em 3 bateladas com o uso de uma quantidade de água de lavagem igual a 62 a 82 ml/kg de DS de massa (centrífuga em bateladas, diâmetro de cesto 22,5 cm,

3,500 rpm, 5 min). O teor de umidificação do bolo não secado combinado foi 4,4% [5]. A pureza de 2'-FL dos cristais centrifugados e secados (600, 2 h) foi 100,0% [1]. A cor foi 462 I CUMSA [7] e o teor de umidificação foi 0,9% [3]. O tamanho de cristal da população de cristal principal foi 30 a 100 pm [6].

Tabela 1

Cristalização em termos de DS [3] ou *[4], pureza de 2'-FL [1] e rendimento de centrifugação [2]

tempo de semeadura h	massa de cristal	licor-mãe	bolo de cristal	rendimento de centrifugação 2’-FL %
DS %	2’-FL %	DS %	2’-FL %	DS %	2’-FL %
2,7	71,1·	89,9	72,0	90,6
4,8	76,1·	89,9	70,7	86,0	95,8	98,7	34
6,5	80,4	89,9	69,8	80,2	95,6	98,1	59
25,0	80,4	89,9	66,0	75,8	95,1	97,2	71

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Exemplo 8: Ilustração de Cristalização de 2'-FL

De Licor-Mãe e Lavagem de Equipamento do Exemplo 7 [127] O licor-mãe de centrifugação combinado com massa de cristal diluída recuperada da lavagem do equipamento do Exemplo 7, que teve uma concentração de 2'-FL de 87,4% [1], uma concentração de DiFL de 11,1% [1], e uma concentração de lactose de <0,1% [1], foi evaporado para um DS de 65,1% [4] (evaporador Rotavapor R-153). O xarope (4,812 g) foi semeado com 1,75 g de semente seca de 2'-FL (cristais do Exemplo 3) a uma temperatura de 65Ό (supersaturação de 1,13 [8]). O xarope semeado foi, então, submetido à ebulição a uma temperatura de 68 a 70Ό e pressão de 1,9 x 10⁴ a 1,95 x 10⁴ Pa (190 a 195 mbar) por 6,1 h. O DS da massa de cristal resultante foi 80,8% [3]. A centrifugação de uma amostra pequena da massa sem lavagem (centrífuga Hettich Rotanta 460R, 2,500 rpm, 10 min) forneceu uma 2’FL de bolo cristalino que tem uma pureza de 96,5% [1] e uma 2'-FL de licor-mãe que tem uma pureza de 76,7% [1]. Isso corresponde a um rendimento de 2'-FL de 60% [2].

[128] A massa de cristal foi mantida na garrafa Rotavapor giratória a uma temperatura de 68Ό de um dia para o outro (1 8 h). Após 23 h da semeadura, a centrifugação de uma amostra pequena da massa sem lavagem (centrífuga Hettich Rotanta 460R, 2,500 rpm, 10 min) forneceu um bolo cristalino que tem uma pureza de 2'-FL de 97,3% [1] e uma pureza de 2'-FL de licor-mãe de 69,7% [1]. Isso corresponde a um rendimento de 2'-FL de 71% [2]. O tamanho de cristal da população de cristal principal foi 30 a 80 pm [6].

[129] A massa de cristal resultante foi centrifugada em duas bateladas com água de lavagem a uma quantidade que se iguala a 61 a 75 ml/kg de DS de massa (centrífuga em bateladas, diâmetro de cesto de 22,5 cm, 3,500 rpm, 5 min). O teor de umidificação do bolo não secado combinado foi 3,7% [5]. A pureza de 2'-FL dos cristais

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49/57 centrifugados e secados (60Ό, 2,2 h) foi 97,1% [1]. A cor foi 389 ICUMSA [7] e o teor de umidificação foi 0,5% [3].

Exemplo 9: Ilustração de Cristalização de 2'-FL

Usar Semeadura com uma Massa Cristalina [130] O licor-mãe de centrifugação combinado com massa de cristal diluída recuperada da lavagem do equipamento do Exemplo 8, que teve uma concentração de 2'-FL de 82,5% [1], uma concentração de DiFL de 15,9% [1], e uma concentração de lactose de <0,1% [1], foi evaporado para um DS de 74,7% [4] (evaporador Rotavapor R-153). O xarope (2,455 g) foi semeado com 83 g de licor-mãe do Exemplo 8 (que conteve cristais pequenos) a uma temperatura de 67°C (supersaturação de 1,67 [8]). O xarope semeado foi submetido à ebulição a uma temperatura de 66 a 68Ό e pressão de 1,9 x 10⁴ a 2,0 x 10⁴ Pa (190 a 200 mbar) por 4,1 h. O DS da massa de cristal resultante foi 85,5% [3]. A centrifugação de uma amostra pequena da massa sem lavagem (centrífuga Hettich Rotanta 460R, 2,500 rpm, 10 min) forneceu um bolo cristalino que tem uma pureza de 2'-FL de 95,7% [1] e uma pureza de 2'-FL de licor-mãe de 61,8% [1]. Isso corresponde a 71% de rendimento de 2'-FL [2], [131] A massa de cristal resultante foi mantida em uma garrafa Rotavapor giratória a uma temperatura de 66Ό de um dia para o outro (17 h). Após 21 h da semeadura, a centrifugação de uma amostra pequena da massa sem lavagem (centrífuga Hettich Rotanta 460R,

2,500 rpm, 10 min) forneceu um bolo cristalino que tem uma pureza de 2'-FL de 94,0% [1] e uma pureza de 2'-FL de licor-mãe de 54,0% [1]. Isso corresponde a um rendimento de 2'-FL de 81% [2]. O tamanho de cristal da população de cristal principal foi 80 a 200 pm [6].

[132] A massa de cristal resultante foi centrifugada com água de lavagem em uma quantidade igual a 71 ml/kg de DS de massa (centrífuga em bateladas, diâmetro de cesto de 22,5 cm, 3,500 rpm, 5

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50/57 min). O teor de umidificação do bolo não secado combinado foi 3,4% [5]. A pureza de 2'-FL dos cristais centrifugados e secados (600, 2 h) foi 100,0% [1]. A cor foi 35 ICUMSA [7] e o teor de umidificação foi 0,2% [3]·

Exemplo 10 Ilustração de Cristalização de 2'-FL de uma Solução de Alto Teor de Lactose e Com o Uso de Semeadura com uma Massa Cristalina [133] Uma solução de alimentação aquosa, a qual teve uma concentração de 2'-FL de 84,5% [1 ], uma concentração de DiFL de 7,9% [1], e uma concentração de lactose de 6,0% [1], foi evaporada a um DS de 69,6% [3] (evaporador Rotavapor R-153). A solução foi dividida em duas partes: uma (1,394 g) foi usada para produzir massa de semeadura, e a outra foi usada como uma solução de alimentação real (10,640 g).

[134] O xarope para massa de semeadura foi semeado com 0,5 g de semente seca de 2'-FL (cristais do Exemplo 3) a uma temperatura de 68Ό (supersaturação de 1,32 [8]). O xarope semeado foi submetido à ebulição a uma temperatura de 65 a 68Ό e pressão de 1,9 x 10⁴ Pa (190 mbar) por 5 h. A massa de semeadura obtida, que teve um DS de 84,5% [3], foi mantida em uma garrafa Rotavapor giratória a uma temperatura de 55Ό de um dia para o outro (19 h).

[135] Após 24 h da semeadura da massa de semeadura, a solução de alimentação real foi misturada com a massa de semeadura a 65Ό (supersaturação de 1,32 [8]). O xarope foi submetido à ebulição a uma temperatura de 68Ό e pressão de 190 a 200 mbar por 9,6 h. A massa de semeadura resultante, que teve um DS de 80,7% [3], foi mantida em uma garrafa Rotavapor giratória a 68Ό de um dia pa ra o outro (16 h).

[136] Após 24 h da semeadura de solução de alimentação real, a centrifugação de uma amostra pequena da massa sem lavagem (centrífuga Hettich Rotanta 460R, 2,500 rpm, 10 min) forneceu um bolo

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51/57 cristalino que tem uma pureza de 2'-FLde 97,5% [1] e um licor-mãeque tem uma pureza de 2'-FL de 65,3% [1]. Isso corresponde a um rendimento de 2'-FL de 69% [2]. O tamanho de cristal da população de cristal principal foi 100 a 200 pm [6].

[137] A massa de cristal foi centrifugada em 6 bateladas com água de lavagem a uma quantidade que se iguala a 68 a 83 ml/kg de DS de massa (centrífuga em bateladas, diâmetro de cesto 22,5 cm, 3,500 rpm, 5 min). O rendimento de centrifugação de 2'-FL médio pelas 6 bateladas foi 56% [2]. A pureza de 2'-FL média dos cristais centrifugados e secados (18 h a 40Ό e 1 h a 60Ό) foi 99,0% [1], o ponto de fusão foi 234,4 a 235,9 °C [9], a cor média foi 63 ICUMSA [7], e o teor de umidificação foi 0,6% [3]. A pureza de 2'-FL de licor-mãe foi 71,0% [1] e A cor foi 850 ICUMSA [7],

Exemplo 11: Ilustração de Cristalização de 2'-FL

De Licor-Mãe e Lavagem de Equipamento do Exemplo 10 [138] O licor-mãe de centrifugação combinado com massa de cristal diluída recuperada da lavagem do equipamento do Exemplo 10, que teve uma concentração de 2'-FL de 72,4% [1], uma concentração de DiFL de 14,0% [1], e uma concentração de lactose de 10,6% [1], foi evaporado para um DS de 70,3% [3] (evaporador Rotavapor R-153). O xarope (6,119 g) foi semeado com 1,767 g de massa de cristal do Exemplo 10 a uma temperatura de 65Ό (supersaturação de 1,19 [8]). O xarope semeado foi submetido à ebulição a uma temperatura de 67 a 71Ό e à pressão de 1,8 x 10⁴ a 1,9 x 10⁴ Pa (180 a 190 mbar) por 5,4 h. O DS da massa de cristal resultante foi 85,1% [3].

[139] A massa de cristal resultante foi mantida em uma garrafa Rotavapor giratória a uma temperatura de 68Ό de um dia para o outro (18 h). Após 24 h da semeadura, a centrifugação de uma amostra pequena da massa sem lavagem (centrífuga Hettich Rotanta 460R,

2,500 rpm, 10 min) forneceu um bolo cristalino que tem uma pureza de

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2'-FL de 94,1% [1] e uma pureza de 2'-FL de licor-mãe de 46,5% [1]. Isso corresponde a 76% de rendimento de 2'-FL [2]. O tamanho de cristal da população de cristal principal foi 100 a 200 pm [6].

[140] A massa de cristal foi centrifugada em 4 bateladas com água de lavagem em uma quantidade igual a 70 a 87 ml/kg de DS de massa (centrífuga em bateladas, diâmetro de cesto de 22,5 cm, 3,500 rpm, 10 min). O rendimento de centrifugação de 2'-FL médio foi 55% [2]. A pureza de 2'-FL média dos cristais centrifugados e secados (18 h a 40Ό e 1 h a 60Ό) foi 97,9% [1]. A cor foi 204 ICUMSA [7] e o teor de umidificação foi 0,8% [3]. A pureza de 2'-FL de licor-mãe foi 59,4% [1] e a cor foi 1409 ICUMSA [7],

Exemplo 12: Ilustração de Recristalização de 2'-FL [141] Os cristais de 2'-FL (1,842 g) do Exemplo 11, que tiveram uma concentração de 2'-FLde 97,9% [1], uma concentração de DiFL de 0,9% [1], e uma concentração de lactose de 1,3% [1], foram dissolvidos em água deionizada. A solução resultante foi evaporada a um DS de 65,1% [3] (evaporador Rotavapor R-153), e semeada com 0,88 g de semente seca de 2'-FL (cristais do Exemplo 3) a uma temperatura de 600 (supersaturação de 1,30 [8]). O xarope semeado foi submetido à ebulição a uma temperatura de 64 a 650 e pressão de 1,8 x 10⁴ Pa (180 mbar) por 4,7 h. O DS da massa de cristal resultante foi 77,8% [3].

[142] A massa de cristal resultante foi mantida em uma garrafa Rotavapor giratória a uma temperatura de 640 de um dia para o outro (19 h). Após 24 h da semeadura, a centrifugação de uma amostra pequena da massa sem lavagem (centrífuga Hettich Rotanta 460R,

2,500 rpm, 10 min) forneceu um bolo cristalino que tem uma pureza de 2'-FL de 99,7% [1] e uma pureza de 2'-FL de licor-mãe de 95,5% [1]. Isso corresponde a 55% de rendimento de 2'-FL [2]. O tamanho de cristal da população de cristal principal foi 30 a 100 pm [6].

[143] A massa de cristal foi centrifugada com água de lavagem em

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53/57 uma quantidade igual a 71 ml/kg de DS de massa (centrífuga em bateladas, diâmetro de cesto de 22,5 cm, 3,500 rpm, 5 min). O teor de umidificação do bolo não secado combinado foi 5,8% [5]. A pureza de 2'-FL dos cristais centrifugados e secados (21 h a 40Ό e 1 h a 60Ό) foi 100,0% [1]. A cor foi 142 ICUMSA [7] e o teor de umidificação foi 0,1% [3]·

Exemplo 13: Ilustração de Cristalização de 2'-FL [144] Um xarope de alimentação aquoso, o qual teve uma concentração de 2'-FL de 89,6% [1 ], uma concentração de DiFL de 8,8% [1], e uma concentração de lactose de <0,1% [1], foi evaporado a um DS de 67,5% [3] (evaporador Rotavapor R-153). O xarope resultante (1,343 g) foi semeado com 0,44 g de semente seca de 2'-FL (cristais do Exemplo 3) a uma temperatura de 61Ό (supersaturação de 1,32 [8]). O xarope semeado foi submetido à ebulição a uma temperatura de 64 a 65Ό e pressão de 1,8 x 10⁴ Pa (180 mbar) por 5,5 h. O DS da massa de cristal resultante foi 81,4% [3].

[145] A massa de cristal resultante foi mantida em uma garrafa Rotavapor giratória a uma temperatura de 66Ό de um dia para o outro (23 h). Após 26 h da semeadura, a centrifugação de uma amostra pequena da massa sem lavagem (centrífuga Hettich Rotanta 460R,

2,500 rpm, 10 min) forneceu um bolo cristalino que tem uma pureza de 2'-FL de 98,1% [1] e uma pureza de 2'-FL de licor-mãe de 76,1% [1]. Isso corresponde a 67% de rendimento de 2'-FL [2]. O tamanho de cristal da população de cristal principal foi 30 a 100 pm [6].

[146] A massa de cristal foi centrifugada com água de lavagem em uma quantidade igual a 75 ml/kg de DS de massa (centrífuga em bateladas, diâmetro de cesto de 22,5 cm, 3,500 rpm, 5 min). O teor de umidificação do bolo não secado combinado foi 4,6% [5]. A pureza de 2'-FL dos cristais centrifugados e secados (19 h a 40Ό e 1 h a 60Ό) foi 100,0% [1]. O ponto de fusão foi 233,2 a 234,1 °C [9], a cor foi 47

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ICUMSA [7], e o teor de umidificação foi 0,1% [3].

Exemplo 14: Ilustração de Cristalização de 2'-FL de uma Solução de 2'-FL Inferior [147] Uma solução de alimentação aquosa, a qual teve uma concentração de 2'-FL de 60,5% [10], uma concentração de DiFL de 20,7% [10], e uma concentração de lactose de 15,1% [10], foi evaporada a um DS de cerca de 75%. O xarope foi, então, semeado com cristais de semente secos de 2'-FL em uma quantidade igual a cerca de 0,18 g/kg de DS de xarope a uma temperatura de cerca de 65Ό (supersaturação de cerca de 1,3 [8]). A mistura foi continuada nessa temperatura por cerca de 0,5 h. Após isso, o xarope semeado foi evaporado a um DS de cerca de 81,5% em cerca de 20 h a uma temperatura de 65 a 70Ό.

[148] A massa de cristal resultante foi mantida em mistura a 75 Ό por cerca de 6 h, e, então, centrifugada com água de lavagem em uma quantidade igual a cerca de 60 ml/kg de DS de massa. O rendimento de centrifugação de 2'-FL médio foi 17,2%, e a pureza de 2'-FL média dos cristais centrifugados foi 97,4% [10].

Exemplo 15: Solubilidade de 2'-FL em Água [149] Os cristais de 2'-FL secos do Exemplo 9 e água deionizada foram pesados em uma garrafa de laboratório de 100 ml. O recipiente foi temperado a uma temperatura específica (25, 40, 50, 60, ou 700) com o uso de a banho de água com termostato. O conteúdo foi agitado continuamente com um agitador magnético por pelo menos 16 h para alcançar o equilíbrio de solubilidade. Os cristais de 2'-FL foram adicionados durante o experimento, de modo que o teor de cristal no equilíbrio tenha sido em torno de 10 a 20% em volume.

[150] Após o sistema ter alcançado o equilíbrio, o licor-mãe foi separado dos cristais por sedimentação. A concentração de 2'-FL do licor-mãe foi determinada por titulação de Karl Fischer. Os resultados

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Tabela 2

Solubilidade de 2'-FL em água

temperatura	solubilidade
Ό	g de 2'-FL /100 g de água
25	141
40	133

137

139

149

Exemplo 16: Preparação de 2'-FL Amorfa a partir de 2'-FL Cristalina [151] Uma solução de 2'-FL cristalina dissolvida em água foi secada por aspersão para obter 2'-FL amorfa em forma de pó. A solução de 2'-FL teve as características mostradas na Tabela 3.

Tabela 3

Parâmetro	Valor
Quantidade total	826 kg
Brix	47,48% de Brix
% calculada de sólidos	45,5%
pH	8,15
Condutividade	2 pS/cm
Concentração de proteína	2,69 mg/L
Temperatura	-30Ό

[152] Um secador de aspersão de cocorrente SPX Anhydro CSD Tipo 70 (vol. = ~43 m³) (Soeborg, Dinamarca) equipado com uma roda de atomizador foi usada para secar por aspersão a solução de 2'-FL. A solução de 2'-FL foi alimentada no secador de aspersão em uma taxa inicial de 79 kg/h, que foi aumentada para 115 kg/h ao longo do curso das primeiras 3 horas de secagem por aspersão. As definições de secador por aspersão foram conforme mostrado na Tabela 4.

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Tabela 4

Parâmetro	Valor
Velocidade de atomizador	25,136 rpm
Fluxo de entrada de ar	3,000 m³/h
Temperatura de entrada de ar	135 G
Temperatura de saída de ar	104 <C

O processo de secagem durou por 457 minutos.

[153] O pó de 2'-FL secado obtido teve as características mostradas na Tabela 5.

Tabela 5

Parâmetro	Valor
Quantidade total	340,1 kg
Rendimento de produto	90,5%
Densidade aparente de produto solto	601 g/l
100x densidade aparente compactada	772 g/l
625x densidade aparente compactada	832 g/l
Teor de umidificação (em peso)	2,12 a 2,21%

[154] A densidade aparente dos 70 g de pó foi medida com o uso de um Volúmetro Jolting Stampf (STAV 203, J. Engelsmann AG), um cilindro de medição de 250 ml e uma balança técnica. O teor de umidificação do pó foi medido com o uso de titulação de Karl-Fischer.

[155] As palavras compreende, compreender e que compreende devem ser interpretadas inclusivamente em vez de exclusivamente. Esta interpretação é destinada a ser a mesma que a interpretação que essas palavras recebem sob a lei de patentes dos Estados Unidos no momento desse depósito.

[156] As formas singulares um e uma são destinados a incluir referentes no plural a menos que o contexto dite de outro modo. Desse modo, por exemplo, uma referência à presença de um microorganismo não exclui a presença de múltiplos micro-organismos a

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57/57 menos que o contexto dite de outro modo.

[157] Qualquer referência citada nesse relatório descritivo é incorporada a título de referência neste relatório descritivo.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para produzir 2'-fucosil-lactose cristalina a partir de uma solução inicial aquosa que compreende 2'-fucosil-lactose e pelo menos um outro carboidrato, caracterizado pelo fato de que:

o processo compreende:

concentrar a solução inicial a um estado supersaturado em relação a 2'-fucosil-lactose, e precipitar um cristal de 2'-fucosil-lactose a partir da solução supersaturada enquanto submete-se a solução supersaturada a uma temperatura maior do que 60Ό; e a solução supersaturada compreende no máximo 1% (em peso) de solvente orgânico durante a precipitação do cristal de 2'fucosil-lactose.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que:

o pelo menos um outro carboidrato compreende difucosillactose, e a solução inicial tem um teor de sólidos secos com uma concentração de difucosil-lactose de pelo menos 1% (em que a porcentagem corresponde a uma concentração de área de pico normalizada obtida com o uso de cromatografia líquida de alto desempenho).
3. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que:

o pelo menos um outro carboidrato compreende lactose, e a solução inicial tem um teor de sólidos secos com uma concentração de lactose de pelo menos 0,1% (em que a porcentagem corresponde a uma concentração de área de pico normalizada obtida com o uso de cromatografia líquida de alto desempenho).
4. Processo, de acordo com qualquer uma das

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2/6 reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que nenhum solvente orgânico é adicionado à solução supersaturada enquanto a solução supersaturada é submetida a uma temperatura maior do que 60Ό.
5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a solução inicial é derivada de uma fermentação.
6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que nenhum solvente orgânico é adicionado à solução inicial antes ou durante a concentração da solução inicial a um estado supersaturado.
7. Processo para produzir 2'-fucosil-lactose cristalina a partir de uma solução inicial aquosa que compreende 2'-fucosil-lactose e pelo menos um outro carboidrato, caracterizado pelo fato de que:

o processo compreende:

concentrar a solução inicial a um estado supersaturado em relação a 2'-fucosil-lactose, e precipitar um cristal de 2'-fucosil-lactose da solução supersaturada enquanto submete-se a solução supersaturada a uma temperatura de pelo menos 40Ό;

a solução inicial tem um teor de sólidos secos com uma concentração de 2'-fucosil-lactose de 70 a 95% (em que a porcentagem corresponde a uma concentração de área de pico normalizada obtida com o uso de cromatografia líquida de alto desempenho); e a solução supersaturada compreende no máximo 1% (em peso) de solvente orgânico durante a precipitação do cristal de 2'fucosil-lactose.
8. Processo para produzir 2'-fucosil-lactose cristalina a partir de uma solução inicial aquosa que compreende 2'-fucosil-lactose e pelo menos um outro carboidrato, caracterizado pelo fato de que:

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3/6 o processo compreende:

concentrar a solução inicial a um estado supersaturado em relação a 2'-fucosil-lactose, e precipitar um cristal de 2'-fucosil-lactose da solução supersaturada enquanto submete-se a solução supersaturada a uma temperatura de pelo menos 40Ό;

a solução inicial tem um teor de sólidos secos com uma concentração de 2'-fucosil-lactose de menos do que 98% (em que a porcentagem corresponde a uma concentração de área de pico normalizada obtida com o uso de cromatografia líquida de alto desempenho); e a solução supersaturada compreende no máximo 1% (em peso) de solvente orgânico durante a precipitação do cristal de 2'fucosil-lactose.
9. Processo para produzir 2'-fucosil-lactose cristalina a partir de uma solução inicial aquosa que compreende 2'-fucosil-lactose e pelo menos um outro carboidrato, caracterizado pelo fato de que:

o processo compreende:

concentrar a solução inicial a um estado supersaturado em relação a 2'-fucosil-lactose, e precipitar um cristal de 2'-fucosil-lactose da solução supersaturada enquanto submete-se a solução supersaturada a uma temperatura de pelo menos 40Ό;

a solução supersaturada compreende no máximo 1% (em peso) de solvente orgânico durante a precipitação do cristal de 2'fucosil-lactose, e a 2'-fucosil-lactose cristalina tem um ponto de fusão de cerca de 230 a cerca de 239 Ό (conforme determinado com uma taxa de aquecimento de 1 Ό/min com o uso do método de ponto de fusão capilar da Farmacopeia Européia).

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10. Processo para produzir 2'-fucosil-lactose cristalina a partir de uma solução inicial aquosa que compreende 2'-fucosil-lactose e pelo menos um outro carboidrato, caracterizado pelo fato de que:

o processo compreende:

concentrar a solução inicial a um estado supersaturado em relação a 2'-fucosil-lactose, e precipitar um cristal de 2'-fucosil-lactose da solução supersaturada enquanto submete-se a solução supersaturada a uma temperatura de pelo menos 40 Ό;

a solução supersaturada compreende no máximo 1% (em peso) de solvente orgânico durante a precipitação do cristal de 2'fucosil-lactose, e a 2'-fucosil-lactose cristalina exibe uma reflexão de difração de raio-X por pó, com base em uma medição com o uso de radiação de CuKa, a 16,98±0,20, 13,65±0,20 e 18,32±0,20 ângulos 2Θ.
11. Processo para produzir 2'-fucosil-lactose amorfa, caracterizado pelo fato de que o processo compreende:

produzir 2'-fucosil-lactose cristalina conforme o processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, dissolver a 2'-fucosil-lactose cristalina em um solvente para formar uma solução de 2'-fucosil-lactose purificada, e precipitar 2'-fucosil-lactose amorfa da solução purificada de 2'-fucosil-lactose.
12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a precipitação de 2'-fucosil-lactose amorfa da solução de 2'-fucosil-lactose purificada compreende secagem por aspersão.
13. Processo para produzir um alimento, suplemento dietético ou medicamento, caracterizado pelo fato de que o processo compreende:

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5/6 produzir 2'-fucosil-lactose cristalina conforme o processo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, e ambos:

misturar a 2'-fucosil-lactose cristalina com um ou mais ingredientes adequados para o alimento, suplemento dietético ou medicamento; ou dissolver a 2’-fucosil-lactose cristalina em um solvente e misturar a 2’-fucosil-lactose dissolvida com um ou mais ingredientes adequados para o alimento, suplemento dietético ou medicamento.
14. Processo para produzir um alimento, suplemento dietético ou medicamento, caracterizado pelo fato de que o processo compreende:

produzir 2'-fucosil-lactose amorfa conforme o processo, como definido na reivindicação 11 ou 12, e ambos:

misturar a 2'-fucosil-lactose amorfa com um ou mais ingredientes adequados para o alimento, suplemento dietético ou medicamento; ou dissolver a 2’-fucosil-lactose amorfa em um solvente e misturar a 2’-fucosil-lactose dissolvida com um ou mais ingredientes adequados para o alimento, suplemento dietético ou medicamento.
15. Processo para produzir fórmula infantil, caracterizado pelo fato de que o processo compreende:

produzir 2'-fucosil-lactose cristalina conforme o processo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, e ambos:

misturar a 2'-fucosil-lactose cristalina com um ou mais ingredientes de fórmula infantil, ou dissolver a 2’-fucosil-lactose cristalina em um solvente e misturar a 2’-fucosil-lactose dissolvida com um ou mais ingredientes de

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6/6 fórmula infantil.
16. Processo para produzir uma fórmula infantil, caracterizado pelo fato de que o processo compreende:

produzir 2'-fucosil-lactose amorfa conforme o processo, como definido na reivindicação 11 ou 12, e ambos:

misturar a 2'-fucosil-lactose amorfa com um ou mais ingredientes de fórmula infantil, ou dissolver a 2’-fucosil-lactose amorfa em um solvente e misturar a 2’-fucosil-lactose dissolvida com um ou mais ingredientes de fórmula infantil.
17. Produto de 2'-fucosil-lactose cristalina, caracterizado pelo fato de que é obtido a partir de um processo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
18. 2'-fucosil-lactose amorfa, caracterizada pelo fato de que é obtida a partir de um processo, como definido na reivindicação 11 ou 12.
19. Alimento, suplemento dietético ou medicamento, caracterizado pelo fato de que é obtido a partir de um processo, como definido na reivindicação 13 ou 14.
20. Formulação infantil, caracterizada pelo fato de que é obtida a partir de um processo, como definido na reivindicação 15 ou

16.