CN110621685A - 用于使2’-岩藻糖基乳糖结晶的方法和相关组合物 - Google Patents
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Abstract
本说明书涉及一种用于使寡糖、特别是人乳寡糖、并且更特别是2’‑岩藻糖基乳糖(“2’‑FL”)结晶的方法。本说明书还涉及使用这种方法产生的组合物(例如,结晶产物)。
Description
相关专利申请的交叉引用
本说明书要求2017年3月6日提交的美国临时专利申请号62/467,571;2017年4月21日提交的欧洲专利申请17167564.8;以及2018年2月19日提交的美国临时专利申请号62/632,180的优先权。上述引用的专利申请中的每一个的全文通过引用结合到本说明书中。
技术领域
本说明书涉及一种用于使寡糖、特别是人乳寡糖、并且更特别是2’-岩藻糖基乳糖(“2’-FL”)结晶的方法。本说明书还涉及使用这种方法产生的组合物(例如,结晶产物)。
背景技术
人乳寡糖对营养和治疗是重要的。最重要的人乳寡糖之一是2’-岩藻糖基乳糖(也称为2’-O-岩藻糖基乳糖或“2’-FL”)。这种寡糖是在人母乳中发现的最丰富的寡糖,并且据信具有若干有益的生物学作用,包括益生元、抗细菌、抗病毒、免疫系统增强和脑发育增强作用。此类益处使得2’-FL成为包括在食品、膳食补充剂和药物中、且特别是婴儿配方食品中的潜在有吸引力的成分。然而,开发用于大规模生产2’-FL的经济上可行的方法仍然是一个挑战。
用于合成2’-FL的许多最近方法涉及微生物发酵过程,所述过程由乳糖产生2’-FL。尽管已经关于这种方法取得了成功,但此类方法通常产生复杂的产物混合物,所述产物混合物通常包含其他成分,如乳糖、除所希望的2’-FL以外的寡糖(例如,二岩藻糖基乳糖(“DiFL”))、单糖、氨基酸、多肽、蛋白质、单价和二价盐、有机酸、核酸等。因此,仍然需要提供可用的2’-FL产物的有效的、可靠的且经济上可行的下游纯化方法。
用于纯化2’-FL的一种技术是结晶。然而,由于其独特的结晶性质,常用的冷却结晶技术通常不能用于2’-FL。虽然2’-FL的饱和水糖浆在低温下具有低粘度(这通常表明结晶将是直接的),但即使高度过饱和的水性2’-FL糖浆在低温下也通常是稳定的。
为了克服这一问题,本领域的一些人报告了涉及添加有机溶剂以促使结晶的技术。参见,例如,Kuhn,R.,等人,Chemische Berichte[德国化学学报],第88(8)卷,第1135-1146页(1955);Kuhn,R.,等人,Chemische Berichte[德国化学学报],第89(11)卷,第2513页(1956);WO 2011/150939;WO 2015/188834;以及WO 201695924。然而,使用有机溶剂来使2’-FL结晶存在许多潜在的缺点。这些包括例如有机溶剂本身的成本。有机溶剂也可能产生有害的排放物、废物和/或污染。在结晶后通常需要特殊设备来回收溶剂。在一些情况下,存在与这种溶剂回收相关的溶剂损失。对于一些溶剂,由于爆炸或其他安全原因,也需要特殊设备。并且如果残余溶剂留在结晶产物中,则溶剂的使用也可能是问题。即使痕量水平的一些有机溶剂也可能对味道、气味、颜色和/或食品安全性产生不利影响。
因此,对于用于纯化2’-FL的有效的、可靠的且经济上可行的下游方法、特别是避免对有机溶剂的需要的水性结晶仍然存在需要。
发明内容
简言之,本说明书总体上披露了一种用于使2’-FL结晶的方法,以及使用这种方法产生的组合物。
具体地说,本说明书部分地披露了一种用于由包含2’-FL和至少一种其他碳水化合物的水性起始溶液制备结晶的2’-FL的方法。
在一些实施例中,所述方法包括将所述起始溶液浓缩至对于2’-FL而言的过饱和状态,并且然后在使所述过饱和溶液经受大于60℃的温度的同时从所述过饱和溶液中沉淀出2’-FL晶体。在这种方法中,在所述2’-FL晶体的沉淀过程中,所述过饱和溶液包含不大于1%(按重量计)的有机溶剂。
在一些实施例中,所述方法包括将所述起始溶液浓缩至对于2’-岩藻糖基乳糖而言的过饱和状态,并且然后在使所述过饱和溶液经受至少40℃的温度的同时从所述过饱和溶液中沉淀出2’-岩藻糖基乳糖晶体。在这种方法中,所述起始溶液具有的干燥固体含量中的2’-岩藻糖基乳糖浓度为从70%至95%(其中所述百分比对应于使用高效液相色谱法获得的归一化峰面积浓度)。此外,在所述2’-岩藻糖基乳糖晶体的沉淀过程中,所述过饱和溶液包含不大于1%(按重量计)的有机溶剂。
在一些实施例中,所述方法包括将所述起始溶液浓缩至对于2’-岩藻糖基乳糖而言的过饱和状态,并且然后在使所述过饱和溶液经受至少40℃的温度的同时从所述过饱和溶液中沉淀出2’-岩藻糖基乳糖晶体。在这种方法中,所述起始溶液具有的干燥固体含量中的2’-岩藻糖基乳糖浓度小于约98%(其中所述百分比对应于使用高效液相色谱法获得的归一化峰面积浓度)。此外,在所述2’-岩藻糖基乳糖晶体的沉淀过程中,所述过饱和溶液包含不大于1%(按重量计)的有机溶剂。
在一些实施例中,所述方法包括将所述起始溶液浓缩至对于2’-岩藻糖基乳糖而言的过饱和状态,并且然后在使所述过饱和溶液经受至少40℃的温度的同时从所述过饱和溶液中沉淀出2’-岩藻糖基乳糖晶体。在这种方法中,所述起始溶液具有的干燥固体含量中的2’-岩藻糖基乳糖浓度小于约95%(其中所述百分比对应于使用高效液相色谱法获得的归一化峰面积浓度)。此外,在所述2’-岩藻糖基乳糖晶体的沉淀过程中,所述过饱和溶液包含不大于1%(按重量计)的有机溶剂。
在一些实施例中,所述方法包括将所述起始溶液浓缩至对于2’-岩藻糖基乳糖而言的过饱和状态,并且然后在使所述过饱和溶液经受至少40℃的温度的同时从所述过饱和溶液中沉淀出2’-岩藻糖基乳糖晶体。在这种方法中,在所述2’-岩藻糖基乳糖晶体的沉淀过程中,所述过饱和溶液包含不大于1%(按重量计)的有机溶剂。此外,所述结晶的2’-岩藻糖基乳糖产物具有从约230℃至约239℃的熔点(如使用欧洲药典毛细管熔点法以1℃/分钟的加热额定值所测定)。
在一些实施例中,所述方法包括将所述起始溶液浓缩至对于2’-岩藻糖基乳糖而言的过饱和状态,并且然后在使所述过饱和溶液经受至少40℃的温度的同时从所述过饱和溶液中沉淀出2’-岩藻糖基乳糖晶体。在这种方法中,在所述2’-岩藻糖基乳糖晶体的沉淀过程中,所述过饱和溶液包含不大于1%(按重量计)的有机溶剂。此外,基于使用CuKa辐射的测量,所述结晶的2’-岩藻糖基乳糖产物具有在16.98±0.20、13.65±0.20和18.32±0.20 2θ角度处的X射线粉末衍射反射。
本说明书还部分地披露了一种用于制备无定形的2’-FL的方法。所述方法包括根据上文(或本说明书中其他地方)所述的结晶方法制备结晶的2’-FL,将所述结晶的2’-FL溶解于溶剂(例如,水)中以形成纯化的2’-FL溶液,并且从所述纯化的2’-FL溶液中沉淀出无定形的2’-FL。
本说明书还部分地披露了一种用于制备食品、膳食补充剂或药物的方法。
在一些实施例中,所述用于制备食品、膳食补充剂或药物的方法包括根据上文(或本说明书中其他地方)所述的结晶方法制备结晶的2’-FL,并且然后将所述结晶的2’-FL与适用于所述食品、膳食补充剂或药物的一种或多种成分混合。
在一些实施例中,所述用于制备食品、膳食补充剂或药物的方法包括根据上文(或本说明书中其他地方)所述的结晶方法制备结晶的2’-FL,将所述结晶的2’-FL溶解于溶剂(例如,水)中,并且将所述溶解的2’-FL与适用于所述食品、膳食补充剂或药物的一种或多种成分混合。
在一些实施例中,所述用于制备食品、膳食补充剂或药物的方法包括如上文(或本说明书中其他地方)所述制备无定形的2’-FL,并且然后将所述无定形的2’-FL与适用于所述食品、膳食补充剂或药物的一种或多种成分混合。
在一些实施例中,所述用于制备食品、膳食补充剂或药物的方法包括如上文(或本说明书中其他地方)所述制备无定形的2’-FL,将所述无定形的2’-FL溶解于溶剂(例如,水)中,并且将所述溶解的2’-FL与适用于所述食品、膳食补充剂或药物的一种或多种成分混合。
本说明书还部分地披露了一种用于制备婴儿配方食品的方法。
在一些实施例中,所述用于制备婴儿配方食品的方法包括根据上文(或本说明书中其他地方)所述的结晶方法制备结晶的2’-FL,并且然后将所述结晶的2’-FL与一种或多种婴儿配方食品成分混合。
在一些实施例中,所述用于制备婴儿配方食品的方法包括根据上文(或本说明书中其他地方)所述的结晶方法制备结晶的2’-FL,将所述结晶的2’-FL溶解于溶剂(例如,水)中,并且将所述溶解的2’-FL与一种或多种婴儿配方食品成分混合。
在一些实施例中,所述用于制备婴儿配方食品的方法包括如上文(或本说明书中其他地方)所述制备无定形的2’-FL,并且然后将所述无定形的2’-FL与一种或多种婴儿配方食品成分混合。
在一些实施例中,所述用于制备婴儿配方食品的方法包括如上文(或本说明书中其他地方)所述制备无定形的2’-FL,将所述无定形的2’-FL溶解于溶剂(例如,水)中,并且将所述溶解的2’-FL与一种或多种婴儿配方食品成分混合。
本说明书还部分地披露了一种由上文(或本说明书中其他地方)所述的结晶方法获得的结晶的2’-FL产物。
本说明书还部分地披露了一种由上文(或本说明书中其他地方)所述的用于制备无定形的2’-FL的方法获得的无定形的2’-FL。
本说明书还部分地披露了一种通过上文(或本说明书中其他地方)所述的用于制备食品、膳食补充剂或药物的方法制备的食品、膳食补充剂或药物。
本说明书还部分地披露了一种由上文(或本说明书中其他地方)所述的用于制备婴儿配方食品的方法获得的婴儿配方制品。
通过阅读本说明书,本说明书的传授内容的其他益处对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
具体实施方式
此详细描述仅旨在使本领域的其他技术人员熟悉申请人的发明、其原理以及其实际应用,以使得本领域的其他技术人员可以其多种形式来改编和应用本发明,因为它们可能最适合于特定用途的要求。此详细描述及其具体实例在指示某些实施例的同时仅旨在出于说明的目的。因此,本说明书不限于所描述的实施例,并且可进行各种修改。
本说明书涉及一种用于使2’-FL从含有2’-FL的溶液中结晶的方法。一般来说,这种方法包括使含有2’-FL的溶液达到对于2’-FL而言的过饱和状态,并且然后通过蒸发使所述2’-FL从所述溶液中结晶,直到获得对于2’-FL而言具有至少约1%的晶体产率的结晶物质。
在一些实施例中,使2’-FL从其中结晶的溶液包含天然来源的2’-FL,例如像动物乳(例如,人乳)或源自动物乳的组合物。在一些实施例中,使2’-FL从其中结晶的溶液是通过化学合成产生的。在仍然其他实施例中,含有2’-FL的溶液是从微生物发酵过程获得的。例如,2’-FL源可以是使用重组微生物(如细菌或酵母)通过微生物发酵获得的发酵液。在一些此类实施例中,微生物是酵母。在其他实施例中,微生物是细菌。在一些实施例中,微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)。在一些实施例中,发酵在化学成分确定的培养基中发生。
在结晶之前,可以使2’-FL源(例如,发酵液)经受一种或多种纯化过程。在一些实施例中,例如,使2’-FL源(例如,发酵液)经受离心、沉降或一种或多种其他过程以除去细胞生物质。在一些实施例中,使2’-FL源(例如,发酵液)经受超滤。这可以例如有助于除去细胞和大的生物分子,如蛋白质、核酸和脂多糖。在一些实施例中,使2’-FL源(例如,发酵液)经受纳滤。这可以例如有助于通过减少水来使2’-FL浓缩,同时还除去矿物质和各种小生物分子。在一些实施例中,使2’-FL源(例如,发酵液)经受色谱分离,如凝胶过滤色谱。在一些实施例中,使2’-FL源(例如,发酵液)经受微滤。这可以例如有助于除去微生物污染。在一些实施例中,使2’-FL源(例如,发酵液)经受阳离子交换、阴离子交换、离子交换树脂、混合床离子交换和/或电渗析。这些可以例如有助于除去小的带电分子、盐和痕量金属。在一些实施例中,通过例如使2’-FL源(例如,发酵液)与粉状活性炭或木炭过滤接触而使所述2’-FL源经受脱色。在一些实施例中,使2’-FL源(例如,发酵液)经受蒸发。这可以例如有助于通过除去水来使2’-FL浓缩。在一些实施例中,使2’-FL源(例如,发酵液)在结晶之前经受以上纯化步骤中的两个或更多个的组合。此类实施例可以包括以各种顺序使用所述步骤,以及在所述过程中的不同点重复各种步骤。
在一些实施例中,例如,2’-FL源是发酵液,在使溶液达到过饱和状态以进行结晶之前使所述发酵液经受超滤、阳离子交换、阴离子交换、混合床离子交换和粉状活性炭。在一些实施例中,2’-FL源是发酵液,在使溶液达到过饱和状态以进行结晶之前使所述发酵液经受离心、超滤、阳离子交换、阴离子交换、混合床离子交换和粉状活性炭。在一些实施例中,2’-FL源是发酵液,在使溶液达到过饱和状态以进行结晶之前使所述发酵液经受超滤、纳滤、阳离子交换、阴离子交换、混合床离子交换和粉状活性炭。在一些实施例中,2’-FL源是发酵液,在使溶液达到过饱和状态以进行结晶之前使所述发酵液经受离心、超滤、纳滤、阳离子交换、阴离子交换、混合床离子交换和粉状活性炭。在一些实施例中,2’-FL源是发酵液,在使溶液达到过饱和状态以进行结晶之前使所述发酵液经受经受超滤、纳滤、任选的微滤、任选的离子去除(例如,离子交换树脂和/或电渗析)、任选的预浓缩(例如,蒸发或纳滤)、脱色(例如,木炭过滤)、微滤和任选的纳滤。
在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度(或“纯度”)小于99%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度小于98%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度小于约95%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度小于约91%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度小于约90%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度小于约85%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度小于约80%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度小于约75%。
在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度是至少约50%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度是至少约55%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度是至少约60%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度是至少约65%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度是至少约70%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度是至少约75%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度是至少约80%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度是至少约85%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度是至少约90%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度是至少约95%。
在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度是从约60%至约95%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度是从约60%至约90%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度是从约65%至约95%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度是从约65%至约90%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度是从约70%至约95%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度是从约70%至约90%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度是从约70%至约85%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度是从约70%至约80%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度是从约70%至约75%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度是从约75%至约95%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度是从约80%至约95%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度是从约85%至约95%。在一些实施例中,由结晶前纯化步骤得到的糖浆的干燥固体含量中的2’-FL浓度是从约90%至约95%。
上述2’-FL浓度百分比对应于使用高效液相色谱法(“HPLC”)获得的归一化峰面积浓度(或“纯度”)。
在一些实施例中,使2’-FL从包含2’-FL和至少一种其他碳水化合物的溶液中结晶。例如,当2’-FL溶液源自酶法或发酵方法时,所述溶液可以含有例如乳糖、除2’-FL以外的寡糖(例如,二岩藻糖基乳糖(“DiFL”))、单糖、氨基酸、多肽、蛋白质、单价和二价盐、有机酸、核酸等的复杂混合物。在一些实施例中,所述溶液中除2’-FL以外的碳水化合物的总浓度是至少约1%。在一些实施例中,所述溶液中除2’-FL以外的碳水化合物的总浓度是至少约2%。在一些实施例中,例如,所述溶液中除2’-FL以外的碳水化合物的总浓度是至少约5%。在一些实施例中,所述溶液中DiFL的浓度是至少约1%。在一些实施例中,所述溶液中DiFL的浓度是至少约2%。在一些实施例中,所述溶液中DiFL的浓度是至少约5%。在一些实施例中,所述溶液中DiFL的浓度是至少约7%。在一些实施例中,所述溶液中DiFL的浓度是从约1%至约20%。在一些实施例中,所述溶液中DiFL的浓度是从约2%至约20%。在一些实施例中,所述溶液中DiFL的浓度是从约2%至约18%。在一些实施例中,所述溶液中DiFL的浓度是从约5%至约18%。在一些实施例中,所述溶液中DiFL的浓度是从约2%至约10%。在一些实施例中,所述溶液中DiFL的浓度是从约5%至约10%。在一些实施例中,所述溶液中DiFL的浓度是从约10%至约18%。在一些实施例中,所述溶液中乳糖的浓度不大于约0.1%。在一些实施例中,所述溶液中乳糖的浓度是至少约0.1%。在一些实施例中,所述溶液中乳糖的浓度是至少约2%。在一些实施例中,所述溶液中乳糖的浓度是至少约5%。在一些实施例中,所述溶液中乳糖的浓度是从约0.1%至约15%。在一些实施例中,所述溶液中乳糖的浓度是从约0.1%至约0.5%。在一些实施例中,所述溶液中乳糖的浓度是从约1%至约12%。在一些实施例中,所述溶液中乳糖的浓度是从约2%至约12%。在一些实施例中,所述溶液中乳糖的浓度是从约5%至约12%。在一些实施例中,所述溶液中乳糖的浓度是从约2%至约15%。在一些实施例中,所述溶液中乳糖的浓度是从约5%至约15%。这些百分比对应于使用HPLC获得的归一化峰面积浓度(或“纯度”)。
一般来说,在结晶之前使所述溶液达到过饱和状态。在一些实施例中,使所述溶液达到大于约1.0的2’-FL过饱和度。在一些实施例中,使所述溶液达到从约1.05至约1.8的2’-FL过饱和度。在一些实施例中,使所述溶液达到从约1.1至约1.7的2’-FL过饱和度。在一些实施例中,使所述溶液达到从约1.1至约1.5的2’-FL过饱和度。在一些实施例中,使所述溶液达到从约1.2至约1.7的2’-FL过饱和度。在一些实施例中,使所述溶液达到从约1.3至约1.7的2’-FL过饱和度。在一些实施例中,使所述溶液达到从约1.3至约1.5的2’-FL过饱和度。在本说明书中,除非另有说明,否则术语“过饱和度”和“过饱和的”对应于测量的2’-FL含量与2’-FL的溶解度的无量纲比,所述比率由以下等式计算:
在此,s是过饱和度,并且2’-FL含量和2’-FL溶解度的测量单位是g/100g的水。在实例15中提供了2’-FL在不同温度下的溶解度。
在一些实施例中,通过使干燥固体含量增加到至少约50%(按重量计)来使所述溶液达到过饱和状态。在一些此类实施例中,使干燥固体含量增加到至少约55%(按重量计)。在一些此类实施例中,使干燥固体含量增加到至少约60%(按重量计)。在一些此类实施例中,使干燥固体含量增加到至少约65%(按重量计)。在一些此类实施例中,使干燥固体含量增加到不大于约80%(按重量计)。在一些此类实施例中,使干燥固体含量增加到不大于约78%(按重量计)。在一些此类实施例中,使干燥固体含量增加到不大于约75%(按重量计)。在一些此类实施例中,使干燥固体含量增加到从约50%至约80%(按重量计)。在一些实施例中,使干燥固体含量增加到从约55%至约78%(按重量计)。在一些实施例中,使干燥固体含量增加到从约60%至约75%(按重量计)。在一些实施例中,使干燥固体含量增加到从约65%至约75%(按重量计)。在一些此类实施例中,使干燥固体含量增加到约60%(按重量计)。
在一些实施例中,通过蒸发使所述溶液达到对于2’-FL而言的过饱和状态。在一些此类实施例中,蒸发(或其至少一部分)在大气压下进行。在一些实施例中,蒸发(或其至少一部分)在较低压力下进行。在一些实施例中,蒸发(或其至少一部分)在不大于约250毫巴的压力下进行。在一些实施例中,蒸发(或其至少一部分)在从约120至约250毫巴的压力下进行。在一些实施例中,蒸发(或其至少一部分)在从约130至约220毫巴的压力下进行。在一些实施例中,蒸发(或其至少一部分)在从约150至约210毫巴的压力下进行。
一般来说,进行蒸发的温度将取决于例如压力。在一些实施例中,蒸发的温度是溶液在所述压力下的沸点。在一些实施例中,蒸发温度是至少约40℃。在一些实施例中,蒸发温度是至少约45℃。在一些实施例中,蒸发温度是至少约50℃。在一些实施例中,蒸发温度是至少约55℃。在一些实施例中,蒸发温度是至少约60℃。在一些实施例中,蒸发温度大于60℃。在一些实施例中,蒸发温度不大于约100℃。在一些实施例中,蒸发温度不大于约90℃。在一些实施例中,蒸发温度不大于约80℃。在一些实施例中,蒸发温度不大于约75℃。在一些实施例中,蒸发温度不大于约70℃(虽然大于约70℃的温度对于蒸发来说可能是有利的,但是使用此类温度可能引起不希望的产物降解和/或颜色形成)。在一些实施例中,蒸发温度是从约45℃至约80℃。在一些实施例中,蒸发温度是从约50℃至约80℃。在一些实施例中,蒸发温度是从约55℃至约80℃。在一些实施例中,蒸发温度是从约60℃至约80℃。在一些实施例中,蒸发温度是大于60℃至不大于约80℃。在一些实施例中,蒸发温度是从约60℃至约75℃。在一些实施例中,蒸发温度是大于60℃至不大于约75℃。在一些实施例中,蒸发温度是从约65℃至约75℃。在一些实施例中,蒸发温度是从约40℃至约70℃。在一些实施例中,蒸发温度是从约45℃至约70℃。在一些实施例中,蒸发温度是从约50℃至约70℃。在一些实施例中,蒸发温度是从约55℃至约70℃。在一些实施例中,蒸发温度是从约60℃至约70℃。在一些实施例中,蒸发温度是大于60℃至不大于约70℃。
在一些实施例中,引晶(seeding)用于引发由过饱和溶液形成2’-FL晶体。在一些此类实施例中,通过向过饱和溶液中添加晶种来实现引晶。在一些此类实施例中,晶种包含微粒2’-FL粉末。在一些实施例中,晶种包含无水2’-FL晶种。
晶种可以通过各种方法,包括例如本说明书中论述的那些方法来制备。在一些实施例中,碾磨干燥种子以获得更小的粒度。晶种也可以悬浮液形式使用。
晶种的所希望的量可以取决于例如晶种的大小。
在一些实施例中,基于结晶物质的2’-FL,所使用的干燥晶种的量是从约0.001%至约1%(按重量计)的微粒2’-FL。
在一些实施例中,使用晶种的悬浮液,并且基于结晶物质的2’-FL,悬浮液晶种的量是从约1%至约30%(按重量计)的微粒2’-FL。
在一些实施例中,在不向过饱和溶液中添加2’-FL晶种的情况下引发结晶。在一些此类实施例中,例如,使用自发引晶或超声波引晶实现引晶。
一般来说,当已经达到适合的过饱和度时,进行结晶的引发(例如,添加晶种)。在一些实施例中,当2’-FL过饱和度大于约1.0时,进行结晶的引发(例如,添加晶种)。在一些实施例中,当2’-FL过饱和度为从约1.05至约1.8时,进行结晶的引发(例如,添加晶种)。在一些实施例中,当2’-FL过饱和度为从约1.1至约1.7时,进行结晶的引发(例如,添加晶种)。在一些实施例中,当2’-FL过饱和度为从约1.1至约1.5时,进行结晶的引发(例如,添加晶种)。在一些实施例中,当2’-FL过饱和度为从约1.2至约1.7时,进行结晶的引发(例如,添加晶种)。在一些实施例中,当2’-FL过饱和度为从1.3至约1.7时,进行结晶的引发(例如,添加晶种)。在一些实施例中,当2’-FL过饱和度为从约1.3至约1.5时,进行结晶的引发(例如,添加晶种)。
在一些实施例中,当糖浆的干燥固体含量为至少约60%(按重量计)时,进行结晶的引发(例如,添加晶种)。在一些实施例中,当糖浆的干燥固体含量为至少约65%(按重量计)时,进行结晶的引发(例如,添加晶种)。在一些实施例中,当糖浆的干燥固体含量不大于约80%(按重量计)时,进行结晶的引发(例如,添加晶种)。在一些实施例中,当糖浆的干燥固体含量不大于约75%(按重量计)时,进行结晶的引发(例如,添加晶种)。在一些实施例中,当糖浆的干燥固体含量为从约60%至约80%(按重量计)时,进行结晶的引发(例如,添加晶种)。在一些实施例中,当糖浆的干燥固体含量为从约65%至约80%(按重量计)时,进行结晶的引发(例如,添加晶种)。在一些实施例中,当糖浆的干燥固体含量为从约65%至约77%(按重量计)时,进行结晶的引发(例如,添加晶种)。在一些实施例中,当糖浆的干燥固体含量为从约65%至约75%(按重量计)时,进行结晶的引发(例如,添加晶种)。在一些实施例中,当糖浆的干燥固体含量为从约65%至约70%(按重量计)时,进行结晶的引发(例如,添加晶种)。在一些实施例中,当糖浆的干燥固体含量为从约70%至约76%(按重量计)时,进行结晶的引发(例如,添加晶种)。
一旦引发结晶,结晶通常可以在溶液的沸点下进行。
在一些实施例中,结晶的至少一部分(或全部)在大气压下进行。
在一些实施例中,结晶的至少一部分在低于大气压的压力下进行。在一些此类实施例中,结晶(或其至少一部分)在不大于约250毫巴的压力下进行。在一些实施例中,结晶(或其至少一部分)在从约50至约250毫巴的压力下进行。在一些实施例中,结晶(或其至少一部分)在从约50至约120毫巴的压力下进行。在一些实施例中,结晶(或其至少一部分)在从约120至约250毫巴的压力下进行。在一些实施例中,结晶(或其至少一部分)在从约130至约220毫巴的压力下进行。在一些实施例中,结晶(或其至少一部分)在从约150至约210毫巴的压力下进行。在一些实施例中,结晶(或其至少一部分)在从约170至约205毫巴的压力下进行。
在一些实施例中,至少约50%的结晶在上述亚大气压范围内进行。在一些实施例中,至少约75%的结晶在上述亚大气压范围内进行。在一些实施例中,至少约90%的结晶在上述亚大气压范围内进行。在一些实施例中,至少约95%的结晶在上述亚大气压范围内进行。在一些实施例中,至少约98%的结晶在上述亚大气压范围内进行。在一些实施例中,至少约99%的结晶在上述亚大气压范围内进行。在一些实施例中,整个结晶在上述亚大气压范围内进行。
在一些实施例中,结晶的至少一部分在所述压力下在溶液的沸点温度下进行。在一些实施例中,在结晶过程中的温度不会下降至约20℃以下。在一些实施例中,结晶的至少一部分在至少约40℃的温度下进行。在一些实施例中,结晶的至少一部分在至少约45℃的温度下进行。在一些实施例中,结晶的至少一部分在至少约50℃的温度下进行。在一些实施例中,结晶的至少一部分在至少约55℃的温度下进行。在一些实施例中,结晶的至少一部分在至少约60℃的温度下进行。在一些实施例中,结晶的至少一部分在大于60℃的温度下进行。在一些实施例中,结晶的至少一部分在不大于约100℃的温度下进行。在一些实施例中,结晶的至少一部分在不大于约90℃的温度下进行。在一些实施例中,结晶的至少一部分在不大于约80℃的温度下进行。在一些实施例中,结晶的至少一部分在不大于约75℃的温度下进行。在一些实施例中,结晶的至少一部分在不大于约70℃的温度下进行(虽然大于约70℃的温度对于结晶来说可能是有利的,但是使用此类温度可能引起不希望的产物降解和/或颜色形成)。在一些实施例中,结晶的至少一部分在从约45℃至约80℃的温度下进行。在一些实施例中,结晶的至少一部分在从约50℃至约80℃的温度下进行。在一些实施例中,结晶的至少一部分在从约55℃至约80℃的温度下进行。在一些实施例中,结晶的至少一部分在从约60℃至约80℃的温度下进行。在一些实施例中,结晶的至少一部分在大于60℃且不大于约80℃的温度下进行。在一些实施例中,结晶的至少一部分在从约60℃至约75℃的温度下进行。在一些实施例中,结晶的至少一部分在大于60℃且不大于约75℃的温度下进行。在一些实施例中,结晶的至少一部分在从约65℃至约75℃的温度下进行。在一些实施例中,结晶的至少一部分在从约40℃至约70℃的温度下进行。在一些实施例中,结晶的至少一部分在从约45℃至约70℃的温度下进行。在一些实施例中,结晶的至少一部分在从约50℃至约70℃的温度下进行。在一些实施例中,结晶的至少一部分在从约55℃至约70℃的温度下进行。在一些实施例中,结晶的至少一部分在从约60℃至约70℃的温度下进行。在一些实施例中,结晶的至少一部分在大于60℃且不大于约70℃的温度下进行。
在一些实施例中,至少约50%的结晶在上述温度范围内进行。在一些实施例中,至少约75%的结晶在上述温度范围内进行。在一些实施例中,至少约90%的结晶在上述温度范围内进行。在一些实施例中,至少约95%的结晶在上述温度范围内进行。在一些实施例中,至少约98%的结晶在上述温度范围内进行。在一些实施例中,至少约99%的结晶在上述温度范围内进行。在一些实施例中,整个结晶在上述温度范围内进行。
在一些实施例中,结晶的pH是从约4至约11。在一些实施例中,在结晶的至少一部分过程中的pH是从约4至约8。在一些实施例中,在结晶的至少一部分过程中的pH是从约5至约7。在一些实施例中,在结晶的至少一部分过程中的pH是从约5至约6。在一些实施例中,在全部结晶过程中的pH不大于约7。在一些实施例中,在全部结晶过程中的pH是从约5至约7。在一些实施例中,在全部结晶过程中的pH是从约5至约6。
在结晶过程中,典型地对晶体物质进行机械混合。在一些实施例中,对混合进行最佳安排以使贯穿结晶物质的整个体积的均匀性最大化。这通常贯穿整个结晶体积提供令人希望的热量和质量传递以及小的过饱和度梯度。在一些实施例中,这是使用传统的旋转混合器叶片实现的。一般来说,使混合的强度缓和以防止过量的细粒形成。
在结晶过程中,通常使晶体悬浮液经受煮沸并蒸发,直到达到足够的结晶度(产率、母液的2’-FL纯度的降低和/或晶体大小)。在一些实施例中,通过蒸发结晶持续从约1至约50小时。在一些实施例中,通过蒸发结晶持续从约2至约40小时。在一些实施例中,通过蒸发结晶持续从约2至约30小时。在一些实施例中,通过蒸发结晶持续从约2至约20小时。在一些实施例中,通过蒸发结晶持续从约2至约15小时。在一些实施例中,通过蒸发结晶持续从约2至约5小时。
典型地希望实现从约1%至约80%的2’-FL晶体产率(这种产率是紧接在煮沸后2’-FL的晶体产率)。在一些实施例中,目标产率是允许有效的晶体分离、洗涤和干燥的最大结晶产率。更具体地说,低晶体产率典型地是不令人希望的,因为它们在制造能力和效率方面产生损失。然而,晶体产率的增加引起产物悬浮液的粘度增加。高粘度进而可能造成难以(并且在一些情况下甚至阻止)晶体分离。因此,在一些实施例中,目标产率是对应于允许成本有效分离的粘度的最大产率。
在一些实施例中,获得结晶物质,所述结晶物质对于2’-FL而言具有从约1%至约80%的晶体产率。在一些实施例中,获得结晶物质,所述结晶物质对于2’-FL而言具有从约30%至约80%的晶体产率。在一些实施例中,获得结晶物质,所述结晶物质对于2’-FL而言具有从约50%至约80%的晶体产率。在一些实施例中,获得结晶物质,所述结晶物质对于2’-FL而言具有从约55%至约75%的晶体产率。在一些实施例中,获得结晶物质,所述结晶物质对于2’-FL而言具有从约60%至约75%的晶体产率。上述晶体产率是指紧接在煮沸后的产率。
在一些实施例中,主晶体群体的晶体大小(即,晶体的最大尺寸)是至少约1μm。在一些实施例中,主晶体群体的晶体大小是至少约5μm。在一些实施例中,主晶体群体的晶体大小是至少约10μm。在一些实施例中,主晶体群体的晶体大小是至少约20μm。在一些实施例中,主晶体群体的晶体大小是至少约30μm。在一些实施例中,主晶体群体的晶体大小不大于约10000μm。在一些实施例中,主晶体群体的晶体大小不大于约5000μm。在一些实施例中,主晶体群体的晶体大小不大于约1000μm。在一些实施例中,主晶体群体的晶体大小不大于约500μm。在一些实施例中,主晶体群体的晶体大小不大于约300μm。在一些实施例中,主晶体群体的晶体大小不大于约200μm。在一些实施例中,主晶体群体的晶体大小在从约1至约10000μm的范围内。在一些实施例中,主晶体群体的晶体大小在从约10至约500μm的范围内。在一些实施例中,主晶体群体的晶体大小在从约30至约200μm的范围内。在一些实施例中,主晶体群体的晶体大小在从约30至约100μm的范围内。在一些实施例中,主晶体群体的晶体大小在从约100至约200μm的范围内。如本说明书中所用,术语“主晶体群体”是来自结晶物质的显微图像的视觉判断。异常小或异常大的异常晶体被忽略。
在一些实施例中,将额外的进料液体添加至2’-FL溶液中,同时通过蒸发结晶以提高结晶器中2’-FL溶液的水平和/或提高2’-FL溶液的干燥物质含量。在一些实施例中,连续添加额外的进料液体。在一些实施例中,分批添加另外的进料液体。
在一些实施例中,使含有2’-FL的溶液冷却,同时结晶。在一些实施例中,结晶包括组合的煮沸和冷却过程。在这种方法中,可以例如将温度降低至低于引晶点温度从约10℃至约20℃的温度。在一些此类实施例中,冷却速率是从约1℃/小时至约5℃/小时。
在一些实施例中,当终止通过蒸发结晶时,在使结晶物质冷却之前混合所述物质。在一些此类实施例中,混合在例如大气压下在从约40℃至约75℃的温度下进行。在一些此类实施例中,混合在例如大气压下在从约40℃至约70℃的温度下进行。在一些实施例中,混合在例如大气压下在从约45℃至约70℃的温度下进行。在一些实施例中,混合在例如大气压下在从约50℃至约70℃的温度下进行。在一些实施例中,混合在例如大气压下在从约55℃至约70℃的温度下进行。在一些实施例中,混合在例如大气压下在从约60℃至约70℃的温度下进行。在一些实施例中,混合在例如大气压下在大于60℃且不大于约70℃的温度下进行。在一些实施例中,混合持续从约0.5至约30小时。
在一些实施例中,当终止通过蒸发结晶时,使结晶物质的温度降低至室温。在一些实施例中,当终止通过蒸发结晶时,使结晶物质的温度降低至约20℃。在一些实施例中,当2’-FL含量低时,使用更长的冷却时间。
在一些实施例中,冷却在至多约3天的时期内进行。在一些实施例中,冷却在从约1至约3天的时期内进行。在一些实施例中,冷却在从约1至约30小时的时期内进行。
在一些实施例中,冷却速率是从约1℃/小时至约5℃/小时。
在一些实施例中,在通过蒸发结晶过程中结晶物质的表观粘度是从约3至约200Pa-s。在一些实施例中,在通过蒸发结晶过程中结晶物质的表观粘度是从约5至约200Pa-s。在一些实施例中,在通过蒸发结晶过程中结晶物质的表观粘度是从约5至约100Pa-s。在一些实施例中,在通过蒸发结晶过程中结晶物质的表观粘度是从约50至约100Pa-s。在一些实施例中,在通过蒸发结晶过程中结晶物质的表观粘度是从约5至约50Pa-s。在一些实施例中,在通过蒸发结晶过程中结晶物质的表观粘度是从约5至约30Pa-s。在这些范围内的粘度通常适合于结晶材料的有效分离。如果结晶物质变得太粘而不能有效分离,则结晶物质的粘度可以通过例如降低结晶物质的过饱和度而降低。结晶物质的过饱和度可以通过例如升高温度和/或用水或含2’-FL的溶液稀释所述结晶物质来降低。
可以通过例如离心、过滤、倾析等分离晶体。在一些实施例中,晶体的分离包括离心。
在分离后,典型地通过例如使晶体与热空气接触来干燥所述晶体。在一些实施例中,在分离后洗涤晶体。在一些实施例中,用水洗涤晶体,且然后通过例如使所述晶体与热空气接触来进行干燥。在一些实施例中,所得晶体级分的水含量小于约1%(按重量计)。在一些实施例中,所得晶体级分的水含量小于约0.5%(按重量计)。水含量可以通过干燥时的重量损失或通过卡尔费歇尔滴定来测量。
在一些实施例中,对结晶产物进行固-液分离(“SLS”)以除去微量杂质,如痕量的蛋白质和DNA、氨基酸、碳水化合物杂质、痕量元素等。
在一些实施例中,这种方法的所得晶体级分的2’-FL含量是至少约85%。在一些实施例中,所得晶体级分的2’-FL含量是至少约90%。在一些实施例中,所得晶体级分的2’-FL含量是至少约91%。在一些实施例中,所得晶体级分的2’-FL含量是至少约92%。在一些实施例中,所得晶体级分的2’-FL含量是至少约93%。在一些实施例中,所得晶体级分的2’-FL含量是至少约94%。在一些实施例中,所得晶体级分的2’-FL含量是至少约95%。在一些实施例中,所得晶体级分的2’-FL含量是至少约96%。在一些实施例中,所得晶体级分的2’-FL含量是至少约97%。在一些实施例中,所得晶体级分的2’-FL含量是至少约98%。在一些实施例中,所得晶体级分的2’-FL含量是至少约99%。在一些实施例中,所得晶体级分的2’-FL含量是至少约99.5%。在一些实施例中,所得晶体级分的2’-FL含量是至少约99.9%。这些百分比对应于使用HPLC获得的归一化峰面积浓度或纯度。
在一些实施例中,这种方法的所得晶体的熔点是从约230℃至约239℃。在一些实施例中,这种方法的所得晶体的熔点是从约230℃至约232℃。在一些实施例中,这种方法的所得晶体的熔点是从约230℃至约231℃。在一些实施例中,这种方法的所得晶体的熔点是从约232℃至约239℃。在一些实施例中,这种方法的所得晶体的熔点是从约232℃至约238℃。在一些实施例中,这种方法的所得晶体的熔点是从约233℃至约238℃。在一些实施例中,这种方法的所得晶体的熔点是从约234℃至约237℃。在一些实施例中,这种方法的所得晶体的熔点小于236℃。在一些实施例中,这种方法的所得晶体的熔点是至少约233℃且小于236℃。在一些实施例中,这种方法的所得晶体的熔点是至少约234℃且小于236℃。在一些实施例中,这种方法的所得晶体的熔点是从约233℃至235℃。上述熔点对应于使用欧洲药典毛细管熔点法以1℃/分钟的加热速率测定的熔点。
在一些实施例中,所得晶体具有在国际专利申请公开号WO 2011/150939中关于在WO 2011/150939中引用为“结晶的2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II”的结晶形式论述的X射线粉末衍射光谱。
在一些实施例中,基于使用CuKa辐射的测量,所得晶体具有在16.98±0.20、13.65±0.20和18.32±0.20 2θ角度处的X射线粉末衍射反射。在一些实施例中,基于使用CuKa辐射的测量,所得晶体具有在16.98±0.20、13.65±0.20、18.32±0.20和21.70±0.20 2θ角度处的X射线粉末衍射反射。在一些实施例中,基于使用CuKa辐射的测量,所得晶体具有在16.98±0.20、13.65±0.20、18.32±0.20、21.70±0.20和15.22±0.20 2θ角度处的X射线粉末衍射反射。在一些实施例中,基于使用CuKa辐射的测量,所得晶体具有在16.98±0.20、13.65±0.20、18.32±0.20、21.70±0.20、15.22±0.20和20.63±0.20 2θ角度处的X射线粉末衍射反射。在一些实施例中,基于使用CuKa辐射的测量,所得晶体具有在16.98±0.20、13.65±0.20、18.32±0.20、21.70±0.20、15.22±0.20、20.63±0.20和11.94±0.20 2θ角度处的X射线粉末衍射反射。
在一些实施例中,进行重结晶一次或多次以提高2’-FL纯度。重结晶可以通过例如以下方式来进行:将2’-FL晶体溶解于水(通常是去离子水)中,使所得溶液达到对于2’-FL而言(经由例如蒸发)的过饱和状态,并且使用上述通过蒸发结晶方法进行结晶。
在一些实施例中,通过进行通过初始结晶产生的母液的结晶来提高产率。这种结晶可以通过例如使母液达到对于2’-FL而言的过饱和状态(经由例如蒸发)并且使用上述通过蒸发结晶方法结晶来进行结晶。
在一些实施例中,将本说明书中描述的方法的2’-FL结晶产物掺入食品(例如人或宠物食品)、膳食补充剂或药物中。在一些实施例中,将结晶产物掺入人类婴儿食品(例如婴儿配方食品)中。在一些此类实施例中,将2’-FL与所述食品、膳食补充剂或药物的其他成分混合。当掺入婴儿配方食品中时,例如,2’-FL可以与其他婴儿配方食品成分,例如像脱脂乳、碳水化合物源(例如,乳糖)、蛋白质源(例如,乳清蛋白浓缩物)、脂肪源(例如,高油酸红花油)、维生素、矿物质等混合。在一些实施例中,婴儿配方食品中的2’-FL浓度是与通常存在于人母乳中的2’-FL浓度大约相同的浓度。
一般来说,这种方法可以用于生产无水结晶产物。在一些实施例中,如通过卡尔费歇尔滴定测量的干燥的2’-FL晶体产物的水分含量小于1.0%(按重量计)。在一些此类实施例中,干燥的2’-FL晶体产物的水分含量小于0.9%(按重量计)。在一些实施例中,干燥的2’-FL晶体产物的水分含量小于0.8%(按重量计)。在一些实施例中,干燥的2’-FL晶体产物的水分含量小于0.7%(按重量计)。在一些实施例中,干燥的2’-FL晶体产物的水分含量小于0.6%(按重量计)。在一些实施例中,干燥的2’-FL晶体产物的水分含量小于0.5%(按重量计)。在一些实施例中,干燥的2’-FL晶体产物的水分含量小于0.4%(按重量计)。在一些实施例中,干燥的2’-FL晶体产物的水分含量小于0.3%(按重量计)。在一些实施例中,干燥的2’-FL晶体产物的水分含量小于0.2%(按重量计)。在一些实施例中,干燥的2’-FL晶体产物的水分含量小于0.1%(按重量计)。在一些实施例中,如通过卡尔费歇尔滴定所测量,在干燥的2’-FL晶体产物中未检测到水分。
在一些实施例中,将本说明书中描述的方法的2’-FL结晶产物转化为用于预期应用的不同物理形式。例如,在一些实施例中,将结晶产物溶解或悬浮于水或其他溶剂中以形成溶液或悬浮液,所述溶液或悬浮液进而被掺入(或以其他方式用于制造)食品(例如,婴儿配方食品)、膳食或药物。在其他实施例中,将结晶产物溶解于水或其他溶剂中以形成溶液,随后将所述溶液喷雾干燥以形成无定形的2’-FL组合物,所述组合物进而被掺入(或以其他方式用于制造)食品(例如,婴儿配方食品)、膳食或药物。
在一些实施例中,当将2’-FL产物掺入食品、膳食补充剂或药物中时,2’-FL的量是有效传递益处,如益生元、抗细菌、抗病毒、免疫系统增强和/或大脑发育增强作用的量。
本说明书中描述的结晶不需要在溶液中存在有机溶剂。
在一些实施例中,不向使2’-FL从其中结晶的溶液添加醇(例如,甲醇、乙醇等)。在一些实施例中,当使溶液对于2’-FL而言达到过饱和时,不添加醇。在一些实施例中,在使用蒸发来使溶液对于2’-FL而言达到过饱和时不添加醇。在一些实施例中,在发生2’-FL结晶时不添加醇。在一些实施例中,当使溶液对于2’-FL而言达到过饱和时,所述溶液中存在的任何醇的总浓度不大于约1%(按重量计)。在一些实施例中,当使用蒸发来使溶液对于2’-FL而言达到过饱和时,所述溶液中存在的任何醇的总浓度不大于1%(按重量计)。在一些实施例中,当发生2’-FL结晶时,溶液中存在的任何醇的总浓度不大于约1%(按重量计)。在一些实施例中,当使溶液对于2’-FL而言达到过饱和时,所述溶液中存在的任何醇的总浓度不大于约0.1%(按重量计)。在一些实施例中,当使用蒸发来使溶液对于2’-FL而言达到过饱和时,所述溶液中存在的任何醇的总浓度不大于0.1%(按重量计)。在一些实施例中,当发生2’-FL结晶时,溶液中存在的任何醇的总浓度不大于约0.1%(按重量计)。在一些实施例中,在使溶液对于2’-FL而言达到过饱和时,所述溶液基本上不含醇。在一些实施例中,在使用蒸发来使溶液对于2’-FL而言达到过饱和时,所述溶液基本上不含醇。在一些实施例中,在发生2’-FL结晶时,所述溶液基本上不含醇。在此,短语“基本上不含醇”是指溶液中存在的醇的量(如果存在的话)不足以实质上影响结晶。
在一些实施例中,不向使2’-FL从其中结晶的溶液添加有机酸溶剂(例如,乙酸)。在一些实施例中,当使溶液对于2’-FL而言达到过饱和时,不添加有机酸溶剂。在一些实施例中,在使用蒸发来使溶液对于2’-FL而言达到过饱和时不添加有机酸溶剂。在一些实施例中,在发生2’-FL结晶时不添加有机酸溶剂。在一些实施例中,当使溶液对于2’-FL而言达到过饱和时,所述溶液中存在的任何有机酸溶剂的总浓度不大于约1%(按重量计)。在一些实施例中,当使用蒸发来使溶液对于2’-FL而言达到过饱和时,所述溶液中存在的任何有机酸溶剂的总浓度不大于1%(按重量计)。在一些实施例中,当发生2’-FL结晶时,所述溶液中存在的任何有机酸溶剂的总浓度不大于约1%(按重量计)。在一些实施例中,当使溶液对于2’-FL而言达到过饱和时,所述溶液中存在的任何有机酸溶剂的总浓度不大于约0.1%(按重量计)。在一些实施例中,当使用蒸发来使溶液对于2’-FL而言达到过饱和时,所述溶液中存在的任何有机酸溶剂的总浓度不大于0.1%(按重量计)。在一些实施例中,当发生2’-FL结晶时,所述溶液中存在的任何有机酸溶剂的总浓度不大于约0.1%(按重量计)。在一些实施例中,在使溶液对于2’-FL而言达到过饱和时,所述溶液基本上不含有机酸溶剂。在一些实施例中,在使用蒸发来使溶液对于2’-FL而言达到过饱和时,所述溶液基本上不含有机酸溶剂。在一些实施例中,在发生2’-FL结晶时,所述溶液基本上不含有机酸溶剂。在此,短语“基本上不含有机酸溶剂”是指溶液中存在的有机酸溶剂的量(如果存在的话)不足以实质上影响结晶。
在一些实施例中,不向使2’-FL从其中结晶的溶液添加有机溶剂。在一些实施例中,当使溶液对于2’-FL而言达到过饱和时,不添加有机溶剂。在一些实施例中,在使用蒸发来使溶液对于2’-FL而言达到过饱和时不添加有机溶剂。在一些实施例中,在发生2’-FL结晶时不添加有机溶剂。在一些实施例中,当使溶液对于2’-FL而言达到过饱和时,所述溶液中存在的任何有机溶剂的总浓度不大于约1%(按重量计)。在一些实施例中,当使用蒸发来使溶液对于2’-FL而言达到过饱和时,所述溶液中存在的任何有机溶剂的总浓度不大于1%(按重量计)。在一些实施例中,当发生2’-FL结晶时,所述溶液中存在的任何有机溶剂的总浓度不大于约1%(按重量计)。在一些实施例中,当使溶液对于2’-FL而言达到过饱和时,所述溶液中存在的任何有机溶剂的总浓度不大于约0.1%(按重量计)。在一些实施例中,当使用蒸发来使溶液对于2’-FL而言达到过饱和时,所述溶液中存在的任何有机溶剂的总浓度不大于0.1%(按重量计)。在一些实施例中,当发生2’-FL结晶时,所述溶液中存在的任何有机溶剂的总浓度不大于约0.1%(按重量计)。在一些实施例中,在使溶液对于2’-FL而言达到过饱和时,所述溶液基本上不含有机溶剂。在一些实施例中,在使用蒸发来使溶液对于2’-FL而言达到过饱和时,所述溶液基本上不含有机溶剂。在一些实施例中,在发生2’-FL结晶时,所述溶液基本上不含有机溶剂。在此,短语“基本上不含有机溶剂”是指溶液中存在的有机溶剂的量(如果存在的话)不足以实质上影响结晶。
实例
以下实例仅是说明性的,并且不以任何方式限制本说明书的其余部分。
在以下实例中,使用以下定义:
由“[1]”标识的值是指使用HPLC(CarboPac PA100,赛默飞世尔科学公司(ThermoFisher Scientific),美国马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA USA))获得的归一化峰面积纯度或浓度。这是峰面积相对于总的峰面积的百分比。
由“[2]”标识的值是指由纯度值计算的2’-FL产率。
由“[3]”标识的值是指通过卡尔费歇尔(Karl Fischer)滴定测量的干燥固体含量(“DS”)。
由“[4]”标识的值是指从基于通过使用卡尔费歇尔滴定测量的初始干燥固体含量和蒸发或添加的水的量的质量平衡计算的干燥固体含量。
由“[5]”标识的值是指通过干燥时的重量损失测量的水分含量。
由“[6]”标识的值是指由显微图像制成的晶体大小测量值(即,晶体的最大尺寸的测量值)。异常小或异常大的异常晶体被忽略。
由“[7]”标识的值是指根据国际糖分析统一方法委员会(“ICUMSA”)糖颜色分级系统的糖颜色。
由“[8]”标识的值是指对于2’-FL而言的过饱和度,其被定义为在相同温度下溶液中的2’-FL浓度(g/100g水)与2’-FL在水中的溶解度(g/100g水)之间的比率。
由“[9]”标识的值是使用欧洲药典毛细管熔点法以1℃/分钟的加热速率测量的熔点。
由“[10]”标识的值是指使用HPLC(X-Bridge Amide HILIC柱,沃特世公司(Waters),美国马塞诸塞州米尔福德(Waters,Milford,MA USA))获得的归一化峰面积纯度或浓度。这是峰面积相对于总的峰面积的百分比。
缩写“HPLC”是指高效液相色谱法。
缩写“DiFL”是指二岩藻糖基乳糖。
实例1:2’-FL晶种制备的说明
将具有90.4%[1]的2’-FL浓度、8.9%[1]的DiFL浓度和0.2%[1]的乳糖浓度的水性进料溶液蒸发至84.4%[3]的DS(Rotavapor R-151蒸发器)。然后通过用锚式搅拌器手动混合所述溶液来将乙醇(279g)添加至糖浆(415g)。将所得溶液在旋转Rotavapor瓶中在60℃保持2.3小时。在此期间,添加水(10g)两次(总计20g)以稀释溶液。在乙醇添加后1.0小时发生第一次水添加,并且在乙醇添加后1.6小时发生第二次水添加。
将所得糖浆的一部分(306g)移至玻璃反应器中。在60℃添加乙醇(71g)。晶体开始形成。将结晶溶液在60℃搅拌1.2小时,在1小时内冷却至55℃,并在连续搅拌下在15小时内进一步冷却至15℃。在冷却后,将获得的晶体物质继续在15℃搅拌3.9小时。
将晶体物质用具有22.5cm篮直径的分批离心机离心。对于这种离心,在加速阶段以500rpm的旋转速度将343g晶体物质负载到离心机上。在2000rpm的旋转速度下添加洗涤水(75mL),且然后以3500rpm的旋转速度继续离心5分钟。将所得离心的晶体(85g)在加热室中在50℃干燥3.4小时。干燥后的水分含量是0.8%[3]。
根据此处说明的方法制备的晶体用于实例2中。在使用之前,将晶体用乙醇洗涤,干燥且然后在瓷磨机中研磨以破坏晶体结构并提供不规则形状的颗粒以引发二次成核。经洗涤的晶体具有94.0%[1]的2’-FL纯度。
实例2:使用根据实例1制备的晶种进行晶种的制备
将具有90.7%[1]的2’-FL浓度、9.3%[1]的DiFL浓度和<0.1%[1]的乳糖浓度的水性进料溶液蒸发至82.9%[3]的DS(Rotavapor R-151蒸发器)。将所得糖浆(683g)移至玻璃反应器中,并在55℃的温度下用0.29g的2’-FL干燥晶种(根据实例1制备)引晶。
搅拌引晶的糖浆,同时保持在55℃。以两部分添加乙醇:在引晶后0.9小时在0.3小时内添加第一部分(610g),并且在引晶后2.3小时添加第二部分(221g)。然后在搅拌同时将结晶溶液在17小时内从55℃冷却至15℃。在冷却至15℃后,在15℃继续搅拌0.9小时。将所得晶体物质(1416g)用100mL洗涤水离心(分批离心,篮直径22.5cm,3500rpm,5分钟)。获得总计557g的晶体饼。其中,将241g在加热室中在60℃干燥2.3小时。干燥后的水分含量是0.8%[3]。
根据这种方法制备的晶体进而用作下文实例3中的晶种。在使用之前,将晶体用乙醇洗涤,干燥且然后在瓷磨机中研磨。经洗涤的晶体具有91.6%[1]的2’-FL纯度。
实例3:2’-FL结晶的说明
将具有89.3%[1]的2’-FL浓度、9.5%[1]的DiFL浓度和<0.1%[1]的乳糖浓度的水性进料溶液蒸发至61.0%[4]的DS(Rotavapor R-151蒸发器)。然后在57℃的温度(1.01[8]的过饱和度)下将糖浆(1540g)用0.5g的2’-FL干燥晶种(实例2中所述的制备)引晶。这导致非常少的晶体形成。因此,将引晶的糖浆在64℃的温度和130-180毫巴的压力下保持沸腾2.8小时。然后在65℃的温度(1.27[8]的过饱和度)下,将糖浆用0.5g的DS为67.2%[4]的2’-FL干燥晶种第二次引晶。在第二次引晶后,发生结晶。在65℃的温度和175毫巴的压力下继续沸腾结晶3.3小时。
使获得的晶体物质(其具有72.8%[3]的DS)冷却至室温(21.5℃),且然后在旋转Rotavapor瓶中保持过夜(18小时)。在第一次引晶21.5小时后,将物质的少量样品在不洗涤的情况下离心(Hettich Rotanta 460R离心机,2500rpm,10分钟)以测定晶体含量。结晶饼2’-FL纯度是96.7%[1],并且母液2’-FL纯度是85.6%[1]。这对应于36%2’-FL产率[2]。物质的粘度是3.2Pa-s。
将晶体物质加热至65℃,并在真空下在170毫巴的压力下继续沸腾结晶4.4小时,直到晶体物质的DS是81.5%[3]。将物质的少量样品在不洗涤的情况下离心。这产生97.2%[1]的结晶饼2’-FL纯度,73.5%[1]的母液2’-FL纯度,72%[2]的离心2’-FL产率,以及67.9%[3]的母液DS。主晶体群体的晶体大小是30-60μm[6]。
通过添加去离子水将晶体物质稀释至79.5%[4]的DS,且然后用具有22.5cm篮直径的分批离心机离心。在此,将693g的晶体物质负载到静置离心机上。然后在加速阶段期间以2000rpm的旋转速度添加洗涤水(50mL)。以3500rpm的旋转速度使离心时间持续5分钟。2’-FL离心产率是54%[2]。母液2’-FL纯度是79.5%[1],并且未干燥滤饼的水分含量是5.7%[5]。
将来自离心的晶体饼(274g)在加热室中在60℃干燥2小时,且然后在干燥器中冷却。干燥的晶体具有100.0%[1]的2’-FL纯度,236.8℃-237.5℃[9]的熔点,对应于22ICUMSA[7]的颜色以及0.3%[3]的水分含量。
将来自离心的未干燥的晶体饼(30g)用乙醇洗涤,干燥且然后在瓷磨机中研磨以制备用于实例5、7、8、10、12和13的晶种。
实例4:从实例3的离心母液进行的2’-FL结晶
将来自实例3的离心母液(其具有79.5%[1]的2’-FL浓度、17.9%[1]的DiFL浓度和<0.1%[1]的乳糖浓度)在73℃的温度和200毫巴的压力下蒸发(Rotavapor R-151蒸发器)。当DS是74.9%[4]时,晶体通过自发成核形成(过饱和度1.55[8])。将糖浆稀释至72.6%[4]的DS并在没有真空的情况下在73℃保持1.2小时。然后使糖浆的沸腾在73℃的温度和175-180毫巴的压力下继续4.8小时。将获得的晶体物质(其具有83.2%[3]的DS)移至玻璃瓶中,并且在60℃的温度下在加热室中保持69小时。从自发成核开始74小时后,在不洗涤的情况下离心物质的少量样品(Hettich Rotanta 460R离心机,2500rpm,10分钟)提供2’-FL纯度为95.7%[1]的结晶饼和2’-FL纯度为51.5%[1]的母液。这对应于76%2’-FL产率[2]。主晶体群体的晶体大小是40-100μm[6]。
将晶体物质(165g)用分批离心机离心而无洗涤(篮直径22.5cm,3500rpm,3分钟)。离心2’-FL产率是76%[2]。离心且干燥(60℃,2.4小时)的晶体具有93.2%[1]的2’-FL纯度,颜色为157ICUMSA[7],和0.5%[3]的水分含量。母液2’-FL纯度是53.9%[1],颜色为609ICUMSA[7]。
实例5:与晶体沉淀同时使用新鲜进料
将具有87.3%[1]的2’-FL浓度、10.1%[1]的DiFL浓度和0.2%[1]的乳糖浓度的水性进料糖浆蒸发至67.7%[4]的DS(Luwa薄膜式蒸发器NL3-210/1600/10)。此时,将1149g的糖浆移至Rotavapor R-153蒸发器中,并在61℃的温度(1.30[8]的过饱和度)下用0.83g的2’-FL干燥晶种(来自实例3的晶体)引晶。将引晶的糖浆在65℃的温度和150-165毫巴的压力下煮沸5.1小时,同时将新鲜进料液体(DS为58.3%[4],总计1443g)以5-40分钟时间间隔以小部分(大约30-120g)添加至晶体物质中。之后,晶体物质的DS是80.3%[3]。在不洗涤的情况下离心物质的少量样品(Hettich Rotanta 460R离心机,2500rpm,10分钟)提供2’-FL纯度为96.1%[1]的结晶饼和2’-FL纯度为75.2%[1]的母液,其对应于64%2’-FL产率[2]。主晶体群体的晶体大小是30-60μm[6]。
将晶体物质(1332g)用75mL洗涤水离心(分批离心,篮直径22.5cm,3500rpm,5分钟)。2’-FL离心产率是53%[2]。离心且干燥(60℃,8-17小时)的晶体的2’-FL纯度是97.8%[1]。颜色是67ICUMSA[7],并且水分含量是0.1%[3]。母液2’-FL纯度是78.1%[1],并且颜色是93ICUMSA[7]。
实例6:与晶体沉淀同时使用水添加从实例5的离心母液进行的2’-FL结晶
将来自实例5的离心母液(其具有78.1%[1]的2’-FL浓度、17.6%[1]的DiFL浓度和0.3%[1]的乳糖浓度)在67℃的温度和200毫巴的压力下蒸发(Rotavapor R-151蒸发器)。当DS是75.5%[4]时,晶体通过自发成核形成(过饱和度1.65[8])。将糖浆稀释至72.6%[4]的DS并在没有真空的情况下在67℃保持1小时。然后使糖浆的沸腾在65℃-67℃的温度和200毫巴的压力下继续5.2小时,同时向物质中添加小部分去离子水(总计约500g)。
从自发成核开始6.2小时后,晶体物质的DS是81.8%[3]。在不洗涤的情况下离心物质的少量样品(Hettich Rotanta 460R离心机,2500rpm,10分钟)提供2’-FL纯度为91.9%[1]的结晶饼和2’-FL纯度为59.0%[1]的母液。这对应于68%2’-FL产率[2]。主晶体群体的晶体大小是30-80μm[6]。
将晶体物质(371g)用30mL洗涤水离心(分批离心,篮直径22.5cm,3500rpm,5分钟)。2’-FL离心产率是54%[2]。离心且干燥(60℃,2小时)的晶体的2’-FL纯度是93.4%[1]。颜色是100ICUMSA[7],并且水分含量是0.9%[3]。母液2’-FL纯度是65.4%[1],并且颜色是287ICUMSA[7]。
实例7:2’-FL结晶的说明
将具有89.9%[1]的2’-FL浓度、8.5%[1]的DiFL浓度和<0.1%[1]的乳糖浓度的水性进料糖浆蒸发至65.6%[3]的DS(Luwa薄膜式蒸发器NL3-210/1600/10)。将所得糖浆(8141g)移至Rotavapor R-153蒸发器中,并在68℃的温度(1.17[8]的过饱和度)下用2.7g的2’-FL干燥晶种(来自实例3的晶体)引晶。在此温度下继续混合1.2小时。之后,将引晶的糖浆在5.3小时内在三个步骤中蒸发至80.4%[3]的DS,以使得在每个步骤中,首先将糖浆在真空下煮沸0.9-1.2小时(67℃-72℃和190-200毫巴),随后在大气压下混合0.6-0.9小时(67℃-72℃)。将所得晶体物质移至6L混合罐中并在69℃保持过夜(19小时)。通过在不洗涤的情况下离心(Hettich Rotanta 460R离心机,2500rpm,10分钟)物质的少量样品来监测结晶的进展。结果总结在表1中。
使用等于62-82mL/kg物质DS的量的洗涤水将所得晶体物质分3批离心(分批离心,篮直径22.5cm,3500rpm,5分钟)。合并的未干燥滤饼的水分含量是4.4%[5]。离心且干燥(60℃,2小时)的晶体的2’-FL纯度是100.0%[1]。颜色是462ICUMSA[7],并且水分含量是0.9%[3]。主晶体群体的晶体大小是30-100μm[6]。
表1
就DS[3]或*[4]、2’-FL纯度[1]和离心产率[2]而言的结晶
实例8:从来自实例7的母液和设备洗液进行的2’-FL结晶的说明
将与通过洗涤来自实例7的设备回收的稀释的晶体物质合并的离心母液(其具有87.4%[1]的2’-FL浓度、11.1%[1]的DiFL浓度和<0.1%[1]的乳糖浓度)蒸发至65.1%[4]的DS(Rotavapor R-153蒸发器)。在65℃的温度(1.13[8]的过饱和度)下将糖浆(4812g)用1.75g的2’-FL干燥晶种(来自实例3的晶体)引晶。然后将引晶的糖浆在68℃-70℃的温度和190-195毫巴的压力下煮沸6.1小时。所得晶体物质的DS是80.8%[3]。在不洗涤的情况下离心物质的少量样品(Hettich Rotanta 460R离心机,2500rpm,10分钟)提供纯度为96.5%[1]的结晶饼2’-FL和纯度为76.7%[1]的母液2’-FL。这对应于60%2’-FL产率[2]。
将晶体物质在旋转Rotavapor瓶中在68℃的温度下保持过夜(18小时)。距离引晶23小时后,在不洗涤的情况下离心物质的少量样品(Hettich Rotanta 460R离心机,2500rpm,10分钟)提供2’-FL纯度为97.3%[1]的结晶饼和2’-FL纯度为69.7%[1]的母液。这对应于71%2’-FL产率[2]。主晶体群体的晶体大小是30-80μm[6]。
将所得晶体物质分两批用等于61-75mL/kg物质DS的量的洗涤水离心(分批离心,篮直径22.5cm,3500rpm,5分钟)。合并的未干燥滤饼的水分含量是3.7%[5]。离心且干燥(60℃,2.2小时)的晶体的2’-FL纯度是97.1%[1]。颜色是389ICUMSA[7],并且水分含量是0.5%[3]。
实例9:使用结晶物质进行引晶的2’-FL结晶的说明
将与通过洗涤来自实例8的设备回收的稀释的晶体物质合并的离心母液(其具有82.5%[1]的2’-FL浓度、15.9%[1]的DiFL浓度和<0.1%[1]的乳糖浓度)蒸发至74.7%[4]的DS(Rotavapor R-153蒸发器)。在67℃的温度(1.67[8]的过饱和度)下将糖浆(2455g)用83g的来自实例8的母液(其含有小晶体)引晶。将引晶的糖浆在66℃-68℃的温度和190-200毫巴的压力下煮沸4.1小时。所得晶体物质的DS是85.5%[3]。在不洗涤的情况下离心物质的少量样品(Hettich Rotanta 460R离心机,2500rpm,10分钟)提供2’-FL纯度为95.7%[1]的结晶饼和2’-FL纯度为61.8%[1]的母液。这对应于71%2’-FL产率[2]。
将所得晶体物质在旋转Rotavapor瓶中在66℃的温度下保持过夜(17小时)。距离引晶21小时后,在不洗涤的情况下离心物质的少量样品(Hettich Rotanta 460R离心机,2500rpm,10分钟)提供2’-FL纯度为94.0%[1]的结晶饼和2’-FL纯度为54.0%[1]的母液。这对应于81%2’-FL产率[2]。主晶体群体的晶体大小是80-200μm[6]。
将所得晶体物质用等于71mL/kg物质DS的量的洗涤水离心(分批离心,篮直径22.5cm,3500rpm,5分钟)。合并的未干燥滤饼的水分含量是3.4%[5]。离心且干燥(60℃,2小时)的晶体的2’-FL纯度是100.0%[1]。颜色是35ICUMSA[7],并且水分含量是0.2%[3]。
实例10从高乳糖溶液并使用结晶物质进行引晶的2’-FL结晶的说明
将具有84.5%[1]的2’-FL浓度、7.9%[1]的DiFL浓度和6.0%[1]的乳糖浓度的水性进料溶液蒸发至69.6%[3]的DS(Rotavapor R-153蒸发器)。将溶液分为两部分:一部分(1394g)用于制备引晶物质,并且另一部分用作实际进料溶液(10640g)。
在68℃的温度(1.32[8]的过饱和度)下将用于引晶物质的糖浆用0.5g的2’-FL干燥晶种(来自实例3的晶体)引晶。将引晶的糖浆在65℃-68℃的温度和190毫巴的压力下煮沸5小时。将获得的引晶物质(其具有84.5%[3]的DS)在旋转Rotavapor瓶中在55℃的温度下保持过夜(19小时)。
距离引晶物质进行引晶24小时后,将实际进料溶液与引晶物质在65℃(1.32[8]的过饱和度)下混合。将糖浆在68℃的温度和190-200毫巴的压力下煮沸9.6小时。将所得引晶物质(其具有80.7%[3]的DS)在旋转Rotavapor瓶中在68℃下保持过夜(16小时)。
距离实际进料溶液进行引晶24小时后,在不洗涤的情况下离心物质的少量样品(Hettich Rotanta 460R离心机,2500rpm,10分钟)提供2’-FL纯度为97.5%[1]的结晶饼和2’-FL纯度为65.3%[1]的母液。这对应于69%2’-FL产率[2]。主晶体群体的晶体大小是100-200μm[6]。
将晶体物质分6批用等于68-83mL/kg物质DS的量的洗涤水离心(分批离心,篮直径22.5cm,3500rpm,5分钟)。在6个批次内的平均2’-FL离心产率是56%[2]。离心且干燥(40℃下18小时和60℃下1小时)的晶体的平均2’-FL纯度是99.0%[1],熔点是234.4℃-235.9℃[9],平均颜色是63ICUMSA[7],并且水分含量是0.6%[3]。母液2’-FL纯度是71.0%[1],并且颜色是850ICUMSA[7]。
实例11:从来自实例10的母液和设备洗液进行的2’-FL结晶的说明
将与通过洗涤来自实例10的设备回收的稀释的晶体物质合并的离心母液(其具有72.4%[1]的2’-FL浓度、14.0%[1]的DiFL浓度和10.6%[1]的乳糖浓度)蒸发至70.3%[3]的DS(Rotavapor R-153蒸发器)。在65℃的温度(1.19[8]的过饱和度)下将糖浆(6119g)用1767g来自实例10的晶体物质引晶。将引晶的糖浆在67℃-71℃的温度和180-190毫巴的压力下煮沸5.4小时。所得晶体物质的DS是85.1%[3]。
将所得晶体物质在旋转Rotavapor瓶中在68℃的温度下保持过夜(18小时)。距离引晶24小时后,在不洗涤的情况下离心物质的少量样品(Hettich Rotanta 460R离心机,2500rpm,10分钟)提供2’-FL纯度为94.1%[1]的结晶饼和2’-FL纯度为46.5%[1]的母液。这对应于76%2’-FL产率[2]。主晶体群体的晶体大小是100-200μm[6]。
将晶体物质分4批用等于70-87mL/kg物质DS的量的洗涤水离心(分批离心,篮直径22.5cm,3500rpm,10分钟)。平均2’-FL离心产率是55%[2]。离心且干燥(在40℃下18小时和在60℃下1小时)的晶体的平均2’-FL纯度是97.9%[1]。颜色是204ICUMSA[7],并且水分含量是0.8%[3]。母液2’-FL纯度是59.4%[1],并且颜色是1409ICUMSA[7]。
实例12:2’-FL重结晶的说明
将来自实例11的2’-FL晶体(1842g)(其具有97.9%[1]的2’-FL浓度、0.9%[1]的DiFL浓度和1.3%[1]额乳糖浓度)溶解于去离子水中。将所得溶液蒸发至65.1%[3]的DS(Rotavapor R-153蒸发器),并在60℃的温度(1.30[8]的过饱和度)下用0.88g的2’-FL干燥晶种(来自实例3的晶体)引晶。将引晶的糖浆在64℃-65℃的温度和180毫巴的压力下煮沸4.7小时。所得晶体物质的DS是77.8%[3]。
将所得晶体物质在旋转Rotavapor瓶中在64℃的温度下保持过夜(19小时)。距离引晶24小时后,在不洗涤的情况下离心物质的少量样品(Hettich Rotanta 460R离心机,2500rpm,10分钟)提供2’-FL纯度为99.7%[1]的结晶饼和2’-FL纯度为95.5%[1]的母液。这对应于55%2’-FL产率[2]。主晶体群体的晶体大小是30-100μm[6]。
将晶体物质用等于71mL/kg物质DS的量的洗涤水离心(分批离心,篮直径22.5cm,3500rpm,5分钟)。合并的未干燥滤饼的水分含量是5.8%[5]。离心且干燥(在40℃下21小时和在60℃下1小时)的晶体的2’-FL纯度是100.0%[1]。颜色是142ICUMSA[7],并且水分含量是0.1%[3]。
实例13:2’-FL结晶的说明
将具有89.6%[1]的2’-FL浓度、8.8%[1]的DiFL浓度和<0.1%[1]的乳糖浓度的水性进料糖浆蒸发至67.5%[3]的DS(Rotavapor R-153蒸发器)。在61℃的温度(1.32[8]的过饱和度)下将所得糖浆(1343g)用0.44g的2’-FL干燥晶种(来自实例3的晶体)引晶。将引晶的糖浆在64℃-65℃的温度和180毫巴的压力下煮沸5.5小时。所得晶体物质的DS是81.4%[3]。
将所得晶体物质在旋转Rotavapor瓶中在66℃的温度下保持过夜(23小时)。距离引晶26小时后,在不洗涤的情况下离心物质的少量样品(Hettich Rotanta 460R离心机,2500rpm,10分钟)提供2’-FL纯度为98.1%[1]的结晶饼和2’-FL纯度为76.1%[1]的母液。这对应于67%2’-FL产率[2]。主晶体群体的晶体大小是30-100μm[6]。
将晶体物质用等于75mL/kg物质DS的量的洗涤水离心(分批离心,篮直径22.5cm,3500rpm,5分钟)。合并的未干燥滤饼的水分含量是4.6%[5]。离心且干燥(在40℃下19小时和在60℃下1小时)的晶体的2’-FL纯度是100.0%[1]。熔点是233.2℃-234.1℃[9],颜色是47ICUMSA[7],并且水分含量是0.1%[3]。
实例14:从低2’-FL溶液进行的2’-FL结晶的说明
将具有60.5%[10]的2’-FL浓度、20.7%[10]的DiFL浓度和15.1%[10]的乳糖浓度的水性进料溶液蒸发至约75%的DS。然后在约65℃的温度(约1.3[8]的过饱和度)下将糖浆用等于约0.18g/kg糖浆DS的量的2’-FL干燥晶种引晶。在此温度下继续混合约0.5小时。之后,在65℃-70℃的温度下在约20小时内将引晶的糖浆蒸发至约81.5%的DS。
将所得晶体物质在75℃保持混合约6小时,且然后用等于约60mL/kg物质DS的量的洗涤水离心。平均2’-FL离心产率是17.2%,并且离心的晶体的平均2’-FL纯度是97.4%[10]。
实例15:2’-FL在水中的溶解度
将来自实例9的干燥的2’-FL晶体和去离子水在100mL实验室瓶中称重。使用恒温水浴将容器调整至特定温度(25℃、40℃、50℃、60℃或70℃)。用磁力搅拌器连续搅拌内容物至少16小时以达到溶解度平衡。在实验过程中添加2’-FL晶体,以使得平衡时的晶体含量是约10-20vol%。
在系统达到平衡后,通过沉降将母液与晶体分离。通过卡尔费歇尔滴定测定母液的2’-FL浓度。结果总结在表2中。
表2
2’-FL在水中的溶解度
实例16:由结晶的2’-FL制备无定形的2’-FL
将溶解于水中的结晶的2’-FL的溶液喷雾干燥以获得呈粉末形式的无定形的2’-FL。2’-FL溶液具有表3中所示的特征。
表3
参数 | 值 |
总量 | 826kg |
白利糖度 | 47.48%白利糖度 |
计算的固体% | 45.5% |
pH | 8.15 |
电导率 | 2μS/cm |
蛋白质浓度 | 2.69mg/L |
温度 | 约30℃ |
使用配备有雾化器轮的SPX Anhydro CSD 70型(体积=约43m3)(丹麦索伯格(Soeborg,Denmark))并流喷雾干燥器喷雾干燥2’-FL溶液。将2’-FL溶液以79kg/h的初始速率进料到喷雾干燥器中,在喷雾干燥的前3小时过程中将速率增加至115kg/h。喷雾干燥器设置如表4中所示。
表4
参数 | 值 |
雾化器速度 | 25,136rpm |
空气进口流量 | 3,000m<sup>3</sup>/h |
空气进口温度 | 135℃ |
空气出口温度 | 104℃ |
干燥过程持续457分钟。
所获得的干燥2’-FL粉末具有表5中所示的特征。
表5
参数 | 值 |
总量 | 340.1kg |
产物产率 | 90.5% |
松散堆积密度 | 601g/L |
100x拍实堆积密度 | 772g/L |
625x拍实堆积密度 | 832g/L |
水分含量(按重量计) | 2.12%-2.21% |
使用Jolting Stampf体积计(STAV 203,J.Engelsmann AG)、250mL量筒和技术计重秤测量70g粉末的堆积密度。使用卡尔费歇尔滴定测量粉末的水分含量。
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词语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应包含性而非排他性地解释。这种解释旨在与在本文提交时根据美国专利法给出的这些词语的解释相同。
除非上下文另外指示,否则单数形式“一个/种(a)”和“一个/种(an)”旨在包括复数指示物。因此,例如,除非上下文另外指示,否则提及存在“一种微生物”并不排除存在多种微生物。
本说明书中引用的任何参考文献都通过引用结合到本说明书中。
Claims (51)
1.一种用于由包含2’-岩藻糖基乳糖和至少一种其他碳水化合物的水性起始溶液制备结晶的2’-岩藻糖基乳糖的方法,其中:
所述方法包括:
将所述起始溶液浓缩至对于2’-岩藻糖基乳糖而言的过饱和状态,并且
在使所述过饱和溶液经受大于60℃的温度的同时从所述过饱和溶液中沉淀出2’-岩藻糖基乳糖晶体;并且
在所述2’-岩藻糖基乳糖晶体的沉淀过程中,所述过饱和溶液包含不大于1%(按重量计)的有机溶剂。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,在所述2’-岩藻糖基乳糖晶体的沉淀过程中,所述过饱和溶液包含少于0.1%(按重量计)的有机溶剂。
3.根据权利要求1所述的方法,其中,在所述2’-岩藻糖基乳糖晶体的沉淀过程中,所述过饱和溶液基本上不含有机溶剂。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述起始溶液具有的干燥固体含量中的2’-岩藻糖基乳糖浓度小于98%(其中所述百分比对应于使用高效液相色谱法获得的归一化峰面积浓度)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述起始溶液具有的干燥固体含量中的2’-岩藻糖基乳糖浓度为从60%至95%(其中所述百分比对应于使用高效液相色谱法获得的归一化峰面积浓度)。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述起始溶液具有的干燥固体含量中的2’-岩藻糖基乳糖浓度为从70%至95%(其中所述百分比对应于使用高效液相色谱法获得的归一化峰面积浓度)。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述起始溶液具有的干燥固体含量中的2’-岩藻糖基乳糖浓度小于91%(其中所述百分比对应于使用高效液相色谱法获得的归一化峰面积浓度)。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中:
所述至少一种其他碳水化合物包括二岩藻糖基乳糖,并且
所述起始溶液具有的干燥固体含量中的二岩藻糖基乳糖浓度为至少1%(其中所述百分比对应于使用高效液相色谱法获得的归一化峰面积浓度)。
9.根据权利要求8所述的方法,其中,所述起始溶液具有的干燥固体含量中的二岩藻糖基乳糖浓度为至少5%(其中所述百分比对应于使用高效液相色谱法获得的归一化峰面积浓度)。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中:
所述至少一种其他碳水化合物包括乳糖,并且
所述起始溶液具有的干燥固体含量中的乳糖浓度为至少0.1%(其中所述百分比对应于使用高效液相色谱法获得的归一化峰面积浓度)。
11.根据权利要求10所述的方法,其中,所述起始溶液具有的干燥固体含量中的乳糖浓度为至少5%(其中所述百分比对应于使用高效液相色谱法获得的归一化峰面积浓度)。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,在使所述过饱和溶液经受大于60℃的温度的同时不向所述过饱和溶液中添加有机溶剂。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,从所述过饱和溶液中沉淀出2’-岩藻糖基乳糖晶体包括向所述过饱和溶液中添加晶种。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述起始溶液源自发酵。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述起始溶液是通过包括从发酵产物中分离微生物的方法形成的。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法,其中,所述起始溶液包含少于0.1%(按重量计)的有机溶剂。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的方法,其中,所述起始溶液基本上不含有机溶剂。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,在将所述起始溶液浓缩至过饱和状态之前,不向所述起始溶液中添加有机溶剂。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,在将所述起始溶液浓缩至过饱和状态过程中,不向所述起始溶液中添加有机溶剂。
20.一种用于由包含2’-岩藻糖基乳糖和至少一种其他碳水化合物的水性起始溶液制备结晶的2’-岩藻糖基乳糖的方法,其中:
所述方法包括:
将所述起始溶液浓缩至对于2’-岩藻糖基乳糖而言的过饱和状态,并且
在使所述过饱和溶液经受至少40℃的温度的同时从所述过饱和溶液中沉淀出2’-岩藻糖基乳糖晶体;所述起始溶液具有的干燥固体含量中的2’-岩藻糖基乳糖浓度为从70%至95%(其中所述百分比对应于使用高效液相色谱法获得的归一化峰面积浓度);并且
在所述2’-岩藻糖基乳糖晶体的沉淀过程中,所述过饱和溶液包含不大于1%(按重量计)的有机溶剂。
21.一种用于由包含2’-岩藻糖基乳糖和至少一种其他碳水化合物的水性起始溶液制备结晶的2’-岩藻糖基乳糖的方法,其中:
所述方法包括:
将所述起始溶液浓缩至对于2’-岩藻糖基乳糖而言的过饱和状态,并且
在使所述过饱和溶液经受至少40℃的温度的同时从所述过饱和溶液中沉淀出2’-岩藻糖基乳糖晶体;所述起始溶液具有的干燥固体含量中的2’-岩藻糖基乳糖浓度小于98%(其中所述百分比对应于使用高效液相色谱法获得的归一化峰面积浓度);并且
在所述2’-岩藻糖基乳糖晶体的沉淀过程中,所述过饱和溶液包含不大于1%(按重量计)的有机溶剂。
22.根据权利要求21所述的方法,其中,所述起始溶液具有的干燥固体含量中的2’-岩藻糖基乳糖浓度小于95%(其中所述百分比对应于使用高效液相色谱法获得的归一化峰面积浓度)。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的方法,其中,所述起始溶液具有的干燥固体含量中的2’-岩藻糖基乳糖浓度小于91%(其中所述百分比对应于使用高效液相色谱法获得的归一化峰面积浓度)。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的方法,其中:
所述至少一种其他碳水化合物包括二岩藻糖基乳糖,并且
所述起始溶液具有的干燥固体含量中的二岩藻糖基乳糖浓度为至少1%(其中所述百分比对应于使用高效液相色谱法获得的归一化峰面积浓度)。
25.根据权利要求24所述的方法,其中,所述起始溶液具有的干燥固体含量中的二岩藻糖基乳糖浓度为至少5%(其中所述百分比对应于使用高效液相色谱法获得的归一化峰面积浓度)。
26.根据权利要求20-25中任一项所述的方法,其中:
所述至少一种其他碳水化合物包括乳糖,并且
所述起始溶液具有的干燥固体含量中的乳糖浓度为至少0.1%(其中所述百分比对应于使用高效液相色谱法获得的归一化峰面积浓度)。
27.根据权利要求26所述的方法,其中,所述起始溶液具有的干燥固体含量中的乳糖浓度为至少5%(其中所述百分比对应于使用高效液相色谱法获得的归一化峰面积浓度)。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述结晶的2’-岩藻糖基乳糖具有从约230℃至约239℃的熔点(如使用欧洲药典毛细管熔点法以1℃/分钟的加热额定值所测定)。
29.一种用于由包含2’-岩藻糖基乳糖和至少一种其他碳水化合物的水性起始溶液制备结晶的2’-岩藻糖基乳糖的方法,其中:
所述方法包括:
将所述起始溶液浓缩至对于2’-岩藻糖基乳糖而言的过饱和状态,并且
在使所述过饱和溶液经受至少40℃的温度的同时从所述过饱和溶液中沉淀出2’-岩藻糖基乳糖晶体;在所述2’-岩藻糖基乳糖晶体的沉淀过程中,所述过饱和溶液包含不大于1%(按重量计)的有机溶剂;并且
所述结晶的2’-岩藻糖基乳糖具有从约230℃至约239℃的熔点(如使用欧洲药典毛细管熔点法以1℃/分钟的加热额定值所测定)。
30.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述结晶的2’-岩藻糖基乳糖具有从约232℃至约239℃的熔点(如使用欧洲药典毛细管熔点法以1℃/分钟的加热额定值所测定)。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述结晶的2’-岩藻糖基乳糖具有从约233℃至约238℃的熔点(如使用欧洲药典毛细管熔点法以1℃/分钟的加热额定值所测定)。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,基于使用CuKa辐射的测量,所述结晶的2’-岩藻糖基乳糖具有在16.98±0.20、13.65±0.20和18.32±0.20 2θ角度处的X射线粉末衍射反射。
33.一种用于由包含2’-岩藻糖基乳糖和至少一种其他碳水化合物的水性起始溶液制备结晶的2’-岩藻糖基乳糖的方法,其中:
所述方法包括:
将所述起始溶液浓缩至对于2’-岩藻糖基乳糖而言的过饱和状态,并且
在使所述过饱和溶液经受至少40℃的温度的同时从所述过饱和溶液中沉淀出2’-岩藻糖基乳糖晶体;在所述2’-岩藻糖基乳糖晶体的沉淀过程中,所述过饱和溶液包含不大于1%(按重量计)的有机溶剂;并且
基于使用CuKa辐射的测量,所述结晶的2’-岩藻糖基乳糖具有在16.98±0.20、13.65±0.20和18.32±0.20 2θ角度处的X射线粉末衍射反射。
34.一种用于制备无定形的2’-岩藻糖基乳糖的方法,其中,所述方法包括:
根据权利要求1至33中任一项所述的方法制备结晶的2’-岩藻糖基乳糖,
将所述结晶的2’-岩藻糖基乳糖溶解于溶剂中以形成纯化的2’-岩藻糖基乳糖溶液,并且
从所述纯化的2’-岩藻糖基乳糖溶液中沉淀出无定形的2’-岩藻糖基乳糖。
35.根据权利要求34所述的方法,其中,从所述纯化的2’-岩藻糖基乳糖溶液中沉淀出无定形的2’-岩藻糖基乳糖包括喷雾干燥。
36.一种用于制备食品、膳食补充剂或药物的方法,其中,所述方法包括:
根据权利要求1至33中任一项所述的方法制备结晶的2’-岩藻糖基乳糖,并且
将所述结晶的2’-岩藻糖基乳糖与适用于所述食品、膳食补充剂或药物的一种或多种成分混合。
37.一种用于制备食品、膳食补充剂或药物的方法,其中,所述方法包括:
根据权利要求1至33中任一项所述的方法制备结晶的2’-岩藻糖基乳糖,
将所述结晶的2’-岩藻糖基乳糖溶解于溶剂中,并且
将所述溶解的2’-岩藻糖基乳糖与适用于所述食品、膳食补充剂或药物的一种或多种成分混合。
38.一种用于制备食品、膳食补充剂或药物的方法,其中,所述方法包括:
根据权利要求34或35所述的方法制备无定形的2’-岩藻糖基乳糖,并且
将所述无定形的2’-岩藻糖基乳糖与适用于所述食品、膳食补充剂或药物的一种或多种成分混合。
39.一种用于制备食品、膳食补充剂或药物的方法,其中,所述方法包括:
根据权利要求34或35所述的方法制备无定形的2’-岩藻糖基乳糖,
将所述无定形的2’-岩藻糖基乳糖溶解于溶剂中,并且
将所述溶解的2’-岩藻糖基乳糖与适用于所述食品、膳食补充剂或药物的一种或多种成分混合。
40.一种用于制备婴儿配方食品的方法,其中,所述方法包括:
根据权利要求1至33中任一项所述的方法制备结晶的2’-岩藻糖基乳糖,并且
将所述结晶的2’-岩藻糖基乳糖与一种或多种婴儿配方食品成分混合。
41.一种用于制备婴儿配方食品的方法,其中,所述方法包括:
根据权利要求1至33中任一项所述的方法制备结晶的2’-岩藻糖基乳糖,
将所述结晶的2’-岩藻糖基乳糖溶解于溶剂中,并且
将所述溶解的2’-岩藻糖基乳糖与一种或多种婴儿配方食品成分混合。
42.一种用于制备婴儿配方食品的方法,其中,所述方法包括:
根据权利要求34或35所述的方法制备无定形的2’-岩藻糖基乳糖,并且
将所述无定形的2’-岩藻糖基乳糖与一种或多种婴儿配方食品成分混合。
43.一种用于制备婴儿配方食品的方法,其中,所述方法包括:
根据权利要求34或35所述的方法制备无定形的2’-岩藻糖基乳糖,
将所述无定形的2’-岩藻糖基乳糖溶解于溶剂中,并且
将所述溶解的2’-岩藻糖基乳糖与一种或多种婴儿配方食品成分混合。
44.根据权利要求40至43中任一项所述的方法,其中,所述一种或多种婴儿配方食品成分包括脱脂乳、碳水化合物源、蛋白质源、脂肪源、维生素和/或矿物质。
45.根据权利要求40至43中任一项所述的方法,其中,所述一种或多种婴儿配方食品成分包括乳糖、乳清蛋白浓缩物和/或高油酸红花油。
46.一种由根据权利要求1至33中任一项所述的方法获得的结晶的2’-岩藻糖基乳糖产物。
47.根据权利要求46所述的结晶的2’-岩藻糖基乳糖产物,其中,所述结晶的2’-岩藻糖基乳糖产物具有至少93%的2’-岩藻糖基乳糖纯度(所述百分比是对应于使用HPLC分析的2’-岩藻糖基乳糖的峰面积相对于总的峰面积的百分比)。
48.根据权利要求46所述的结晶的2’-岩藻糖基乳糖产物,其中,所述结晶的2’-岩藻糖基乳糖产物具有至少98%的2’-岩藻糖基乳糖纯度(所述百分比是对应于使用HPLC分析的2’-岩藻糖基乳糖的峰面积相对于总的峰面积的百分比)。
49.一种由根据权利要求34或35所述的方法获得的无定形的2’-岩藻糖基乳糖。
50.一种由根据权利要求36至39中任一项所述的方法获得的食品、膳食补充剂或药物。
51.一种由根据权利要求40至45中任一项所述的方法获得的婴儿配方制品。
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