BR112019017940A2 - bifidobacterium longum capaz de modular beneficamente resposta imune para infecção respiratória por vírus - Google Patents

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O'mahony Liam
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Abstract

uma cepa isolada de bifidobacterium longum ncimb 42020 é útil para o tratamento de infecções virais, especialmente infecções respiratórias virais, tais como, influenza, rinovírus e rsv. bifidobacterium longum ncimb 42020 também é útil para depurar infecções bacterianas secundárias.

Description

BIFIDOBACTERIUM LONGUM CAPAZ DE MODULAR BENEFICAMENTE RESPOSTA IMUNE PARA INFECÇÃO RESPIRATÓRIA POR VÍRUS
Campo da invenção
[0001] A invenção refere-se a Bifidobactérias que são uma das várias bactérias cultiváveis predominantes presentes na microflora do cólon humano.
Fundamentos da Invenção
[0002] As bifidobactérias são consideradas probióticas, pois são organismos vivos que exercem efeitos saudáveis além da nutrição básica quando ingeridos em quantidade suficiente. Um alto nivel de bifidobactérias ingeridas deve atingir seu local de ação para exercer um efeito probiótico. Foi sugerido um nivel minimo de aproximadamente 106-107 bifidobactérias viáveis por grama de conteúdo intestinal (Bouhnik, Y., Lait 1993). Há relatos na literatura que mostram que estudos in vivo realizados em adultos e em lactentes indicam que algumas cepas de bifidobactérias são capazes de sobreviver à passagem pelo trato gastrointestinal. Diferenças significativas foram observadas entre as habilidades de diferentes cepas de bifidobactérias em tolerar ácidos e sais biliares, indicando que a sobrevivência é um critério importante para a seleção de potenciais cepas probióticas.
[0003] A ingestão de bifidobactérias pode melhorar o trânsito gastrointestinal e pode prevenir ou auxiliar no tratamento de doenças que podem ser causadas por microflora deficiente ou comprometida, tais como, infecções do trato gastrointestinal (TGI), constipação, sindrome do intestino irritável (IBS), doença inflamatória intestinal (DII) Doença de Crohn e colite ulcerativa, alergias alimentares,
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2/61 diarréia induzida por antibióticos, doença cardiovascular e certos tipos de câncer (por exemplo, câncer colorretal).
[0004] As infecções virais são uma das principais causas de morbidade e mortalidade. O virus da influenza, o rinovirus (resfriado comum) e o virus sincicial respiratório (VSR) são virus altamente infecciosos que geralmente são depurados com sucesso por uma resposta imune do hospedeiro apropriada em individuos saudáveis. No entanto, grande parte do problema com estas infecções não é o virus inicial, mas sim as infecções secundárias que frequentemente o acompanham, por exemplo, infecções bacterianas que causam pneumonia, infecção de tecido sinusal etc. Individuos suscetíveis, como aqueles que sofrem de DPOC ou Asma ou Obesidade, respondem muito mal a infecções virais e infecções secundárias subsequentes são graves e podem ser fatais para tais individuos.
[0005] Essas exacerbações induzidas por virus dessas condições estão associadas a custos substanciais com a saúde e significativo sofrimento. O desenvolvimento de novas e eficazes terapias para estas exacerbações seria benéfico, uma vez que existe uma grande necessidade clinica não satisfeita. A administração de corticosteroides a pacientes afetados pelo virus da influenza, especialmente o virus da influenza aviária pandêmica, embora relativamente comum, permanece controversa. O uso rotineiro de esteroides não é ideal para a infecção pelo virus influenza, pois não reduz a carga viral e também inibe a depuração de infecções bacterianas secundárias depois (Yang et al, 2015) .
[0006] Nos estágios iniciais da infecção, a replicação do virus influenza, rinovirus e RSV ocorre em células
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3/61 epiteliais pulmonares, levando à ativação de sensores virais e à liberação de interferons antivirais Tipo I e Tipo III (IFNs), bem como quimiocinas e citocinas. Esses mediadores pró-inflamatórios ajudam a eliminar a infecção primária, mas os IFN's Tipo I também podem causar danos subsequentes (imunopatologia) . As respostas de IFN Tipo I, tal como o aumento das moléculas de IFN-OC e IFN-β, mostraram correlacionar-se diretamente com o aumento da morbidade e mortalidade em modelos de infecção por influenza (Davidson et al, 2014) . A produção excessiva de IFNs Tipo I antivirais e a quimiocina IP-10 relacionada inibem a resposta imune apropriada para eliminar infecções secundárias (Nakamura et al, 2011; Shahangian et al, 2009; Li et al, 2012), tais como causadas por agentes bacterianos, tais como, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis, e Haemophilus influenzae e até mesmo Staphylococcus aureus (Hewitt et al, 2016). Essas infecções secundárias causam morte celular excessiva nos pulmões. Em individuos suscetiveis, isto conduz à lesão do tecido pulmonar e à função pulmonar reduzida que causam sérias complicações e mortalidade em alguns casos, por exemplo, em pacientes com DPOC. É importante ressaltar que a ativação pró-inflamatória ocorre apenas para as respostas de IFN Tipo I, que causam o recrutamento de neutrófilos e não para as respostas de IFN Tipo III (Galani et al, 2017) .
[0007] No entanto, os IFNs Tipo III, tal como IFN lambda (IFN-λ), podem limitar a replicação viral sem induzir respostas pró-inflamatórias ou imunopatologia (Davidson et al, 2016; Galani et al, 2017) .
[0008] Portanto, agentes terapêuticos que podem
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4/61 limitar as respostas de IFN Tipo I e acompanhar a resposta pró-inflamatória e de dano tecidual à infecção viral, enquanto mantêm respostas apropriadas tipo III e defesa antiviral, seriam um avanço significativo no controle de infecções virais respiratórias. Esta redução da imunopatologia é critica para a sobrevivência do hospedeiro e a resolução da doença.
[0009] Outros sensores inatos ou mediadores imunológicos também podem desempenhar um papel importante na defesa antiviral precoce. A proteina associada a tensoativo D (SP-D) pode impedir que o virus da influenza entre nas células epiteliais, que é parte da fase inicial da infecção. (Thiel et al., 1989; Sastry et al., 1993) . Novamente, agentes terapêuticos que podem induzir este sensor inato que se pode se ligar a virus e impedi-lo de infectar as células epiteliais brônquicas seriam um avanço significativo no tratamento de virus, tais como, influenza, rinovirus e RSV. Além disso, a inibição do fator de necrose tumoral alfa (TNF-OC) , uma importante citocina inflamatória, tem um efeito significativo na extensão da imunopatologia pulmonar e inibe a infiltração celular inflamatória e as respostas das citocinas. Demonstrou-se que o TNF-ct está correlacionado com a morbilidade e a mortalidade em macacos Macaca e humanos infectados com virus influenza altamente virulentos. Uma diminuição na replicação do virus influenza e um aumento na sobrevivência de camundongos infectados pelo virus influenza, foi observada quando o TNF-CC foi suprimido (Shi et al, 2013) . A inibição desta citocina inflamatória com o etanercepte provê proteção contra a infecção letal por influenza H1N1
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5/61 em camundongos (Shi et al, 2013) .
[00010] Agentes terapêuticos que podem induzir o IFN-λ Tipo III e/ou SP-D teriam um papel a desempenhar na eliminação precoce da infecção viral primária, enquanto reduzem a probabilidade de infecções bacterianas secundárias e seriam um avanço significativo no controle e SDRA, asma, obesidade e DPOC.
Sumário da invenção
[00011] De acordo com a invenção, é provida uma cepa de
Bifidobacterium longum tendo o número de acesso NCIMB
42020. A cepa pode estar na forma de uma cultura
biologicamente pura.
[00012] É também provida uma i cepa isolada de
Bifidobacterium longum NCIMB 42020 •
[00013] A cepa pode estar na forma de células viáveis e/ou na forma de células não viáveis.
[00014] A cepa pode ser isolada das fezes ou do trato gastrointestinal de indivíduos humanos saudáveis.
[00015] A cepa pode estar na forma de um caldo bacteriano. Alternativamente, a cepa está na forma de um pó liofilizado.
[00016] A tensão atenua a resposta IP-10 a um virus. Isso é importante porque a IP-10 é secretada por vários tipos de células em resposta a IFN-γ. Estes tipos de células incluem monócitos e células endoteliais. A IP-10 tem sido atribuída a vários papéis, incluindo quimioatração para monócitos/macrófagos, células T, células NK e células dendriticas, e promoção da adesão de células T a células endoteliais e é um marcador de ativação do sistema hospedeiro induzido por virus.
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6/61
[00017] A cepa pode intensificar a resposta do interferon tipo III a um virus, tal como a resposta do interferon lambda a um virus.
[00018] A cepa pode suprimir a resposta do interferon tipo I a um virus tal como a resposta do interferon alfa a um virus e/ou a resposta do interferon beta a um virus.
[00019] A cepa pode intensificar a resposta da proteina associada a tensoativo D a um virus.
[00020] A invenção também provê uma formulação que compreende uma cepa de Bifidobacterium da invenção.
[00021] A formulação pode compreender adicionalmente outro material probiótico e/ou um material prebiótico.
[00022] A formulação pode compreender adicionalmente um carreador ingerivel. O carreador ingerivel pode ser um carreador farmaceuticamente aceitável, tal como uma cápsula, um comprimido ou um pó. O carreador ingerivel pode ser um produto alimentício, tal como, leite acidificado, iogurte, iogurte congelado, sorvete, leite em pó, concentrado de leite, gelado, pasta de queijo, molho ou bebida.
[00023] A formulação pode compreender adicionalmente uma proteina e/ou um peptideo, em particular, proteínas e/ou peptideos que são rica(o)s em glutamina/glutamato, um lipideo, um carboidrato, uma vitamina, um mineral e/ou um elemento traço.
[00024] A cepa de Bifidobacterium pode estar presente em uma quantidade maior que 106 cfu por grama da formulação.
[00025] A formulação pode compreender adicionalmente um adjuvante, uma entidade de fármaco e/ou um composto
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7/61 biológico .
[00026] A formulação pode ser adaptada para administração ao pulmão ou ao nariz. Por exemplo, a formulação pode estar na forma de um pulverizador nasal. A viscosidade da formulação pode ser de 1 cp a 2.000 cp (1 mP a.s a 2.000 mP a.s) .
[00027] A cepa de Bifidobacterium ou uma formulação da mesma pode ser usada em artigos alimenticios ou para uso como fármaco.
[00028] A cepa de Bifidobacterium ou uma formulação da mesma pode ser usada na profilaxia e/ou no tratamento de atividade inflamatória indesejável.
[00029] A cepa de Bifidobacterium ou um derivado ativo ou fragmento ou mutante ou variante da mesma pode ser para uso na profilaxia e/ou no tratamento de atividade inflamatória indesejável.
[00030] A cepa de Bifidobacterium ou uma formulação da mesma pode ser usada na preparação de um fármaco para tratar asma e/ou alergia, o fármaco pode estar em uma forma adequada para inalação.
[00031] A cepa de Bifidobacterium ou uma formulação da mesma pode ser usada na profilaxia ou no tratamento de uma infecção viral em um individuo.
[00032] A cepa de Bifidobacterium ou uma formulação da mesma pode ser usada na profilaxia de uma infecção bacteriana secundária associada com uma infecção viral respiratória em um individuo.
[00033] O virus, em alguns casos, é um virus respiratório que pode ser selecionado do virus influenza, rinovirus e virus sincicial respiratório.
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8/61
[00034] O indivíduo pode ter sido diagnosticado com uma doença pulmonar inflamatória.
[00035] Em alguns casos, o indivíduo aumentou a suscetibilidade a uma infecção respiratória.
[00036] O indivíduo pode ser um ou mais de obesos, um paciente com sindrome do desconforto respiratório agudo (SDRA), um paciente com asma, ou um paciente com doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC).
[00037] Em um caso, o indivíduo é uma criança com menos de 5 anos de idade.
[00038] Em outro caso, o indivíduo é uma pessoa idosa com mais de 60 anos de idade.
[00039] A invenção também provê um método para profilaxia ou tratamento de uma infecção viral em um indivíduo compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma cepa de Bifidobacterium longum NCIMB 42020 ou derivado, ou fragmento ou mutante ou variante ativo da mesma.
[00040] A cepa Bifidobacterium longum NCIMB 42020 ou derivado, ou fragmento ou mutante ou variante ativo da mesma, pode:
atenuar a resposta IP-10 a um virus;
intensificar a resposta do interferon tipo III ao virus, tal como a resposta do interferon lambda ao virus;
suprimir a resposta do interferon tipo I ao virus, tal como a resposta do interferon alfa ao virus e/ou a resposta do interferon beta ao virus; e/ou intensificar a resposta da proteina associada a tensoativo D ao virus.
[00041] É também provida uma fração de parede celular
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9/61 isolada da cepa Bifidobacterium longum NCIMB 42020.
[00042] A fração da parede celular pode:
atenuar a resposta IP-10 a um virus;
intensificar a resposta do interferon tipo III ao virus, tal como a resposta do interferon lambda ao virus;
suprimir a resposta do interferon tipo I ao virus, tal como a resposta do interferon alfa ao virus e/ou a resposta do interferon beta ao virus; e/ou intensificar a resposta da proteina associada a tensoativo D ao virus.
[00043] O virus, em alguns casos, é um virus respiratório que pode ser selecionado do virus influenza, rinovirus e virus sincicial respiratório.
[00044] O indivíduo pode ter sido diagnosticado com uma doença pulmonar inflamatória.
[00045] Em alguns casos, o indivíduo aumentou a suscetibilidade a uma infecção respiratória.
[0004 6] O indivíduo pode ser um ou mais de paciente obeso, com sindrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) , um paciente com asma ou um paciente com doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC).
[00047] Em um caso, o indivíduo é uma criança com menos de 5 anos de idade.
[00048] Em outro caso, o indivíduo é uma pessoa idosa com mais de 60 anos de idade.
[00049] A fração da parede celular pode ter um peso molecular maior que 100 kDa. A fração da parede celular pode ter menos de 0,45 μπι de tamanho.
[00050] Em uma modalidade, a fração é isolada abrindo o Bifidobacterium longum e separando a fração da parede
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10/61 celular de uma fração citoplasmática.
[00051] É também provida uma fração da parede celular isolada da cepa de Bifidobacterium longum para uso na profilaxia ou no tratamento de uma infecção viral respiratória em um indivíduo.
[00052] A invenção também provê uma fração da parede celular isolada da cepa de Bifidobacterium longum para uso na profilaxia de uma infecção bacteriana secundária associada a uma infecção viral respiratória em um indivíduo.
[00053] Também é provido um processo para isolar uma fração da parede celular do Bifidobacterium longum compreendendo as etapas de:
abrir o Bifidobacterium longum para formar uma fração
da parede celular e uma fração citoplasmática; e
separar a fração da parede celular da fração
citoplasmática.
[00054] A abertura do Bifidobacterium longum pode
incluir pelo menos um de:
tratar com um agente quelante;
tratar com uma enzima; e aplicar força de cisalhamento.
[00055] O agente quelante pode ser um agente quelante de cálcio, tal como, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). A enzima pode ser uma glicosideo hidrolase, tal como lisozima. Alternativamente ou adicionalmente, a enzima é uma enzima muralitica, tal como mutanolisina.
[00056] A força de cisalhamento pode ser aplicada por sonicação e/ou por pressão, tal como, por uma prensa francesa.
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11/61
[00057] A separação pode compreender centrifugação.
[00058] Em alguns casos, após a separação, a fração da parede celular é filtrada para prover uma fração com um tamanho menor que 0,45 pm.
[00059] Também é provida uma formulação que compreende a fração da parede celular.
[00060] A formulação pode compreender adicionalmente outro material probiótico e/ou um material prebiótico.
[00061] A formulação pode compreender adicionalmente um carreador ingerivel. O carreador ingerivel pode ser um carreador farmaceuticamente aceitável, tal como uma cápsula, um comprimido ou um pó. O carreador ingerivel pode ser um produto alimenticio, tais como, leite acidificado, iogurte, iogurte congelado, sorvete, leite em pó, concentrado de leite, gelado, pasta de queijo, molho ou bebida.
[00062] A formulação pode compreender adicionalmente uma proteina e/ou um peptideo, em particular, proteínas e/ou peptídeos que são rica(o)s em glutamina/glutamato, um lipídeo, um carboidrato, uma vitamina, um mineral e/ou um elemento traço.
[00063] A formulação pode compreender adicionalmente um adjuvante, uma entidade de fármaco e/ou um composto biológico.
[00064] A formulação pode ser adaptada para administração ao pulmão ou ao nariz. Por exemplo, a formulação pode estar na forma de um pulverizador nasal. A viscosidade da formulação pode ser de 1 cp a 2.000 cp (1 mPa.s a 2.000 mPa.s).
[00065] A invenção provê uma cepa isolada de
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Bifidobacterium longum NCIMB 42020 (AH0106).
[00066] A invenção também provê um mutante ou variante de uma cepa isolada de Bifidobacterium longum NCIMB 42020.
[00067] A cepa isolada pode estar na forma de células
viáveis.
[00068] A cepa isolada pode estar na forma de células
não viáveis •
[00069] A invenção também provê uma formulação
compreendendo uma cepa isolada de Bifidobacterium longum
NCIMB 42020.
[00070] A formulação pode compreender um carreador ingerivel. O carreador ingerivel pode ser um carreador farmaceuticamente aceitável, tal como, uma cápsula, um comprimido ou um pó. O carreador ingerivel pode ser um produto alimenticio, tal como, leite acidificado, iogurte, iogurte congelado, leite em pó, concentrado de leite, pastas de queijo, molhos ou bebidas.
[00071] Em uma modalidade, a cepa atenua a resposta IP10 a um virus.
[00072] Em uma modalidade, a cepa intensifica a resposta do interferon tipo III ao virus.
[00073] Em uma modalidade, a cepa suprime a resposta do interferon alfa ao virus.
[00074] Em uma modalidade, a cepa suprime a resposta do interferon beta ao virus.
[00075] Em um caso, a cepa:
atenua a resposta IP-10 ao virus;
intensifica a resposta do interferon tipo III ao virus; suprime a resposta do interferon alfa ao virus; e suprime a resposta do interferon beta ao virus.
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[00076] A cepa pode estar presente em mais de 106 cfu por grama de carreador ingerível.
[00077] A invenção provê adicionalmente uma composição compreendendo uma cepa isolada de Bifidobacterium longum NCIMB 42020 e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[00078] A invenção também provê o uso de uma cepa de Bifidobacterium longum NCIFB 42020 como uma cepa probiótica.
[00079] Em uma modalidade, a formulação é adaptada para administração ao pulmão ou ao nariz.
[00080] Entender-se-á que a cepa especifica da invenção pode ser administrada a animais (incluindo humanos) em uma forma oralmente ingerivel em uma preparação convencional, tais como, cápsulas, microcápsulas, comprimidos, grânulos, pó, cápsulas, pílulas, supositórios, suspensões e xaropes. Formulações adequadas podem ser preparadas por métodos comumente empregados usando aditivos orgânicos e inorgânicos convencionais. A quantidade de ingrediente ativo na composição médica pode estar em um nível que irá exercer o efeito terapêutico desejado.
[00081] A formulação também pode incluir um componente bacteriano, uma entidade de fármaco ou um composto biológico.
[00082] Além disso, uma vacina compreendendo as cepas da invenção pode ser preparada usando qualquer método conhecido adequado e pode incluir um carreador ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.
[00083] A invenção também provê uma cepa de Bifidobacterium da invenção ou uma formulação da invenção para uso na profilaxia ou no tratamento de uma infecção
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14/61 viral em um individuo.
[00084] Em um caso, o individuo é um paciente com sindrome do desconforto respiratório agudo (SDRA).
[00085] Em outro caso, o individuo é um paciente com asma.
[00086] Em um outro caso, o individuo é um paciente com doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC).
[00087] A invenção também provê uma fração da parede celular isolada de Bifidobacterium longum NCIMB 42020, em que a fração da parede celular atenua a resposta IP-10 a um virus.
[00088] Em um caso, a fração intensifica a resposta do interferon tipo III ao virus.
[00089] Em um caso, a fração suprime a resposta do
interferon alfa ao virus.
[00090] Em um caso, a fração suprime a resposta do
interferon beta ao virus.
[00091] A invenção provê adicionalmente uma fração da parede celular isolada de Bifidobacterium longum NCIMB 42020, em que a fração da parede celular:
atenua a resposta IP-10 ao virus;
intensifica a resposta do interferon tipo III ao virus;
suprime a resposta do interferon alfa ao virus; e suprime a resposta do interferon beta ao virus.
[00092] Em um caso, o peso molecular da fração da parede celular é maior que 100 kDa.
[00093] Em um caso, a fração da parede celular é menor que 0,45 μπι de tamanho.
[00094] Em um caso, a fração da parede celular tem um peso molecular maior que 100 kDa e menor que 0,45 μπι.
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[00095] A invenção provê adicionalmente um modo para a profilaxia ou o tratamento de uma infecção viral em um indivíduo compreendendo a etapa de administrar uma fração da parede celular isolada de Bifidobacterium longum NCIMB 42020 .
[00096] Em um caso, a fração da parede celular atenua a resposta IP-10 a um virus.
[00097] Em um caso, a fração intensifica a resposta do interferon tipo III ao virus.
[00098] Em um caso, a fração suprime a resposta do
interferon alfa ao virus.
[00099] Em um caso, a fração suprime a resposta do
interferon beta ao virus.
[000100] Também é provido um método para a profilaxia ou o tratamento de uma infecção viral em um indivíduo compreendendo a administração de uma fração da parede celular isolada de Bifidobacterium longum NCIMB 42020, em que a fração:
atenua a resposta IP-10 ao virus;
intensifica a resposta do interferon tipo III ao virus; suprime a resposta do interferon alfa ao virus; e suprime a resposta do interferon beta ao virus.
[000101] Em um caso, o peso molecular da fração da
parede celular é maior que 100 kDa.
[000102] Em um caso, a fração da parede celular é
menor que 0,45 μπι de tamanho.
[000103] Em um caso, a fração da parede celular é
administrada em uma formulação que é adequada para administração ao pulmão ou ao nariz.
[000104] Em um caso, o indivíduo é um paciente com
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16/61 síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA).
[000105] Em um caso, o individuo é um paciente com asma.
[000106] Em um caso, o individuo é um paciente com doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC).
[000107] A invenção também inclui mutantes e variantes das cepas depositadas. Ao longo do relatório descritivo, os termos mutante, mutante variante e geneticamente modificado incluem uma cepa cujas propriedades genéticas e/ou fenotipicas são alteradas em comparação com a cepa precursora. Variante que ocorre naturalmente inclui as alterações espontâneas de propriedades alvo seletivamente isoladas. A alteração deliberada das propriedades da cepa precursora é realizada por tecnologias de manipulação genética convencionais (in vitro), tal como, ruptura de gene, transferência conjugativa etc. A modificação genética inclui a introdução de sequências de DNA exógenas e/ou endógenas no genoma de uma cepa, por exemplo, por inserção no genoma da cepa bacteriana por vetores, incluindo DNA plasmidico ou bacteriófagos.
[000108] Mutações naturais ou induzidas incluem pelo menos alterações de base única, tais como, eliminação, inserção, transversão ou outras modificações de DNA que podem resultar na alteração da sequência de aminoácidos codificada pela sequência de DNA.
[000109] Os termos mutante, variante e mutante geneticamente modificado também incluem uma cepa que sofreu alterações genéticas que se acumulam em um genoma a uma taxa que é consistente na natureza para todo(a)s os
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17/61 microrganismos e/ou as alterações genéticas que ocorrem através de mutação e/ou aquisição espontânea de genes e/ou perda de genes que não é conseguida por manipulação deliberada (in vitro) do genoma, mas é conseguida através da seleção natural de variantes e/ou mutantes que provêm uma vantagem seletiva para suportar a sobrevivência da bactéria quando exposta a pressões ambientais, tais como antibióticos. Um mutante pode ser criado pela inserção deliberada (in vitro) de genes específicos no genoma que não alteram fundamentalmente a funcionalidade bioquímica do organismo, mas cujos produtos podem ser usados para identificação ou seleção da bactéria, por exemplo, resistência a antibióticos.
[000110] Um técnico no assunto apreciará que as cepas mutantes ou variantes podem ser identificadas por análise de homologia de sequência de DNA com a cepa precursora. As cepas de possuir uma identidade de sequência próxima com a cepa precursora sem diferenças funcionais fenotipicas ou mensuráveis demonstráveis são consideradas como cepas mutantes ou variantes. Uma cepa com uma identidade de sequência (homologia) de 99,5% ou mais com a sequência de DNA precursora pode ser considerada como sendo um mutante ou variante. A homologia de sequências pode ser determinada usando o algoritmo de homologia on line BLAST, disponível publicamente em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.
Breve Descrição dos Desenhos
[000111] A invenção será mais claramente entendida a partir da descrição a seguir dada apenas a titulo de exemplo, com referência aos desenhos em anexo, nos quais:
a Fig. 1 são gráficos de barras mostrando o perfil de
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18/61 indução de IL-10 em PBMC e em MDDCs após estimulação in vitro com concentrações crescentes (média e alta) de cepas de B. longum 35624, AH1206, AH1362, 1714, BL1207 e AH0106;
a Fig. 2 são gráficos de barras mostrando o perfil de indução de IL-12p40 em PBMC e em MDDCs após estimulação in vitro com concentrações crescentes (média e alta) de cepas de B. longum 35624, AH1206, AH1362, 1714, BL1207 e AH0106;
a Fig. 3 são gráficos de barras mostrando o perfil de indução de TNF-ct em PBMC e em MDDCs após estimulação in vitro com concentrações crescentes (média e alta) de cepas de B. longum 35624, AH1206, AH1362, 1714, BL1207 e AH0106;
a Fig. 4 são gráficos de barras que mostram o perfil de indução de IL-ΐβ em PBMC e em MDDCs após estimulação in vitro com concentrações crescentes (média e alta) de cepas de B. longum 35624, AH1206, AH1362, 1714, BL1207 e AH0106;
a Fig. 5 é um gráfico de barras da resposta IP-10 a rinovirus na presença de B. longum AH0106;
as Figs. 6 (a) a 6 (c) são uma série de gráficos de barras de respostas de interferon lambda (interferon tipo III), interferon alfa e interferon beta (interferon tipo 1) a rinovirus na presença de B. longum AH0106;
a Fig. 7 é um gráfico de barras que compara a resposta IP-10 a rinovirus 16 na presença de B. longum AH0106 ou uma cepa de Staphylococcus aureus;
a Fig. 8 é um gráfico de barras da resposta IP-10 ao LPS na presença de cepas de B. longum AH0106 e 35624;
a Fig. 9 é um gráfico de barras da resposta do TNF-ct a LPS na presença de cepas de B. longum AH0106 e 35624;
a Fig. 10 é um gráfico da replicação viral no pulmão em resposta às cepas B. longum AH0106, B. longum 35624 e
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19/61 placebo após infecção viral;
a Fig. 11 é um gráfico da sobrevivência ao longo de um periodo de tempo após infecção com as cepas de B. longum AH0106, 35624 e placebo;
a Fig. 12 é uma série de gráficos de respostas de citocinas no fluido de lavagem broncoalveolar (BAL) e respostas de proteina associada a tensoativo D no soro a cepas de B. longum, cepas AH0106, 35624 e placebo após infecção viral;
a Fig. 13 mostra um mapa de calor de diferentes biomarcadores medidos na BAL em resposta a cepas de B. longum, cepas AH0106, 35624 e placebo após infecção viral; quanto maior a intensidade da banda, maior a indução;
a Fig. 14 é um gráfico da contagem de BAL de Macrófagos em resposta às cepas de B. longum, cepas AH0106, 35624 e placebo, após infecção viral;
a Fig. 15 é um fluxograma de um processo usado para
isolar uma fração da parede celular de Bifidobacterium
longum AH0106;
a Fig. 16 (a) é um gráfico da re sposta IP-10 a
rinovirus humano (HRV16) na presença de uma fração de
parede celular (grânulo Bif AH0106) da cepa AH0106 em
células Dendriticas Derivadas de Monócitos;
a Fig. 16 (b) é um gráfico da resposta de IFN-CC ao
rinovirus humano (HRV16) na presença de uma fração da
parede celular (grânulo Bif AH0106) da cepa AH0106 em
células Dendriticas Derivadas de Monócitos;
a Fig. 16 (c) é um gráfico da resposta de IFN-β ao
rinovirus humano (HRV16) na presença de uma fração da
parede celular (grânulo Bif AH0106) da cepa AH0106 em
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20/61 células Dendríticas Derivadas de Monócitos;
a Fig. 17 (a) é um gráfico de barras da resposta IP-10 ao rinovirus humano (HRV16) na presença de uma fração da parede celular da cepa UCC2003 em comparação com uma fração da parede celular da cepa AH0106 em células Dendriticas Derivadas de Monócitos;
a Fig. 17 (b) um gráfico de barras da resposta IP-10 ao interferon beta (IFN-β) na presença de uma fração da parede celular da cepa UCC2003 em comparação com uma fração da parede celular da cepa AH0106 em células Dendriticas Derivadas de Monócitos;
a Fig. 18 (a) é um gráfico de barras da resposta do TNF-ct ao LPS na presença de uma fração da parede celular da cepa UCC2003 em comparação com uma fração da parede celular das cepas AH0106 e 35624 de B. longum em células Dendriticas Derivadas de Monócitos;
a Fig. 18 (b) é um gráfico de barras da resposta do TNF-ct ao Poli:IC na presença de uma fração da parede celular da cepa UCC2003 em comparação com uma fração da parede celular das cepas de B. longum AH0106 e 35624 em células Dendriticas Derivadas de Monócitos;
a Fig. 19 (a) é uma ilustração da resposta em cascata anormal a uma infecção viral; e a Fig. 19 (b) é uma ilustração da resposta em cascata a uma infecção viral mediada pela cepa ou pela fração da parede celular de B. longum AH106.
Descrição Detalhada da Invenção
[000112] Um depósito de cepa de Bifidobacterium longum AH0106 foi feito no National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) Ferguson
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Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Escócia, Reino Unido a 2 de agosto de 2012 e concedeu o número de acesso NCIMB 42020.
[000113] A especificação também se refere a Bifidobacterium longum NCIMB 41003 (cepa 35624®). Esta cepa é descrita em WOOO/42168, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência. A cepa foi depositada na National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Ferguson Building, Craibstone Estate Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Escócia, Reino Unido, em 13 de janeiro de 1999.
[000114] Verificou-se que uma determinada cepa bacteriana promove defesa antiviral e inibe respostas próinflamatórias prejudiciais e é particularmente útil na prevenção e/ou no tratamento de SDRA induzida por virus, ou exacerbações induzidas por virus em pacientes com asma e DPOC.
Exemplos
[000115] Os seguintes exemplos descrevem adicionalmente e demonstram modalidades dentro do escopo da invenção. Os exemplos são dados apenas para fins de ilustração e não devem ser considerados como limitações da presente invenção, uma vez que muitas variações são possiveis sem se afastar do espirito e do escopo da invenção.
Exemplo 1 Isolamento de Bifidobacterium longum NCIMB 42020
[000116] A cepa de Bifidobacterium longum NCIMB 42020 foi isolada a partir de amostras fecais de individuos humanos saudáveis.
[000117] Amostras fecais foram triadas para cepas bacterianas probióticas. As amostras foram transferidas
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22/61 para um tubo de coleta contendo solução salina tamponada de fosfato (PBS) , suplementada com 0,05% de cisteina-HCl) . As soluções foram então incubadas durante 10 min. As amostras foram submetidas a vórtice e divididas em placas em ágar seletivo (ágar De Man, Rogosa e Sharpe (MRS) + sacarose a 10% + Mupirocina e Vermelho do Congo + cisteina + Mupirocina). Uma triagem com ágar vermelho do Congo foi usada para triar fenotipicamente as cepas bacterianas que expressam EPS. Resumidamente, 10 ml de meio de caldo Rogosa Modificado (+ 0,05% de cisteina) foram inoculados assepticamente com uma colônia de crescimento recente da cepa bacteriana e incubados anaerobicamente a 37 °C até ficarem turvos (cerca de 16 a cerca de 24 horas) . As culturas de caldo foram assepticamente aplicadas em placas de ágar-Vermelho Congo e incubadas anaerobicamente a 37 °C durante 48 horas. Acredita-se que o EPS produzido como um subproduto do crescimento e/ou metabolismo de certas cepas evita a absorção da mancha Vermelho Congo, resultando em uma morfologia da colônia creme/branca. As manchas que produzem menos EPS absorvem facilmente a mancha Vermelho Congo, resultando em uma morfologia da colônia rosa/vermelha. As cepas que não produzem uma mancha EPS vermelha e parecem quase transparente no fundo de ágar vermelho.
[000118] Colônias isoladas foram retiradas das placas e re-raiadas três vezes para garantir a pureza. Exame ao microscópio, coloração de Gram, teste de Catalase, avaliação da Frutose-6-Fosfato-Fosfocetolase foram usados para determinar espécies de Bifidobactérias presumíveis e os isolados foram estocados em glicerol a 40% e armazenados
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23/61 a -80°C. O sequenciamento da região espaçadora intergênica 16S (IGS) foi usado para confirmar a identidade das cepas recém-isoladas .
[000119] Após o isolamento de uma cepa de bifidobactérias puras, atribuida à designação AH0106, foi subsequentemente depositada no NCIMB e dada a designação 42020. As caracteristicas microbiológicas foram avaliadas e estão resumidas na Tabela 1 abaixo. B. longum NCIMB 42020 é uma bactéria em forma pleomórfica Gram-positiva de catalase negativa que é positiva para Frutose-6-Fosfato Fosfocetolase, confirmando sua identidade como bifidobacterium.
Tabela 1 - Características físico-guímicas de B. longum NCIMB 42020
Características da Cepa B. longum NCIMB 42020
Mancha Gram +
Catalase —
Motilidade —
F6PPK* +
[000120] O sequenciamento intergênico do espaçador (IGS) de 16s-23s foi realizado para identificar as espécies de Bifidobactérias isoladas. Resumidamente, o DNA foi isolado a partir de NCIMB 42020 usando 100 μΐ de Solução de extração e 25 μΐ de solução de Preparação de Tecidos (Sigma, Kit XNAT2). As amostras foram incubadas durante 2 horas em temperatura ambiente, seguidas de 2 horas a 95°C e depois foram adicionados 100 μΐ de Solução de Neutralização (Sigma, kit XNAT2) . A solução de DNA genômico foi quantificada usando um espectrofotômetro Nanodrop e
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24/61 armazenada a 4°C. A PCR foi realizada usando os iniciadores
de IGS. Os pares de iniciadores usados foram IGS R 5' -
CTGGTGCCAAGGCATCCA-3' (SEQ ID No. D e IGS L 5'-
GCTGGATCACCTCCTTTCT-3' (SEQ ID No. 2) . As condições de
ciclização foram de 94 °C durante 4 min (1 ciclo), 94°C
durante 45 s, 53°C durante 45 s, 72°C durante 45 s (28 ciclos) . A reação PCR continha 2 μΐ (100 ng) de DNA, mistura de PCR (Sigma, Red Tag) , iniciador L e R IGS a 0, 025 nM (MWG Biotech, Alemanha) . As reações PCR foram realizadas em um termociclador Biotherma. Os produtos de PCR (10μ1) foram colocados ao lado de um marcador de peso molecular (100 bp Ladder, Roche) em um gel de agarose corado com EtBr a 2% em TAE, para determinar o perfil de IGS. Os produtos de PCR de Bifidobacterium (banda simples) foram purificados usando o kit de purificação de PCR Promega Wizard. Os produtos de PCR purificados foram sequenciados usando as sequências iniciadoras (acima) para a região espaçadora intergênica. Os dados da sequência foram então pesquisados contra a base de dados de nucleotídeos NCBI para determinar a identidade da cepa por homologia de nucleotídeos. Os dados resultantes da sequência de DNA foram submetidos ao mecanismo de pesquisa BLAST de homologia de nucleotídeo para nucleotídeo padrão NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). A correspondência mais próxima à sequência foi identificada e, em seguida, as sequências foram alinhadas para comparação usando o software DNASTAR MegAlign. As sequências podem ser visualizadas na listagem de sequências (Tabela 2). Pesquisando no banco de dados NCIMB revelou que NCIMB 42020 tem uma única sequência IGS (Tabela 2) com a
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25/61 sua homologia de sequência mais próxima a um Bifidobacterium longwi.
Tabela 2 Sequência de IGS B. longum NCIMB 42020 (SEQ ID No. 3)
TTGCTGGGATCACCTCCTTTTTACGGAGAATTCAGTCGGATGTTCGTCCGACGGTGTGC GCCCCGCGCGTCGCATGGTGCGATGGCGGCGGGGTTGCTGGTGTGGAAAACGTCGTTGG CTTTGCCCTGCCGGTCGTGCGGTGGGTGCGGGGTGGTATGGATGCGCTTTTGGGCTCCC GGATCGCCACCCCAGGCTTTTTGCCTGGCGCGATTCGATGCCCGTCGTGCCTGGGGGCC GGCCGTGTGCCGGCGCGATGGCGTGGCGGTGCGTGGTGGCTTGAGAACTGGATAGTGGA CGCGAGCAAAACAAGGGTTTTTGAATCTTTGTTTTGCTGTTGATTTCGAATCGAACTCT ATTGTTCGTTTCGATCGTTTTGTGATCATTTTTAGTGTGATGATTTGTCGTCCTGGGAA TTTGCTAGAGGAATACTTGCGGGCCATGCACTTTCGTGGTGTGTGTTGCTTGCAAGGGC GTATGGTGGAGGCCTTGGCACCAGAA
Exemplo 2 - Perfil de citocina de AH106 e comparação com o perfil de outras cepas de Bifidobacteria longum com potenciais benefícios para a saúde [000121] As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de doadores saudáveis usando centrifugação em gradiente de densidade. As PBMCs foram lavadas e recolocadas em suspensão em Meio Eagle modificado de Dulbecco- Glutamax (DMEM) TM (Glutamax (substituto de Glutamina) + piruvato + 4,5 g/1 de glicose (catálogo Gibco 10569-010) soro bovino fetal a 10% (catálogo Sigma F4135), e 1 % de penicilina/estreptomicina (catálogo Sigma P0781). As PBMCs foram estimuladas com diferentes doses de Bifidobacteria longum ( (Bactérias totais:PBMC) alta (100: 1) e média (50:1)) por 24h em DMEM suplementado a 37 °C, CO2 a 5%.
[000122] Para geração de células dendríticas derivadas de monócitos: Células mononucleares de sangue
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26/61 periférico (PBMCs) foram isoladas de doadores saudáveis usando centrifugação por gradiente de densidade. Monócitos de sangue periférico humano foram isolados usando isolamento positivo para CD14 com o sistema MACS (Miltenyi Biotec, 130-050-201). As células foram cultivadas em meio cRPMI (Life Technologies, 21875-091) com 1.000 U/ml de interleucina 4 (Novartis) e 1.000 U/ml de fator estimulador de colônias de macrófagos e granulócitos (PeproTech, SOOOS) por 6 dias para diferenciá-las em células dendriticas derivadas de monócitos (MDDCs). As MDDCs foram estimuladas com doses diferentes de B. longum ((Bactéria total: MDDC) alta (100: 1) e média (50:1)) por 24h em cRPMI a 37°C, CO2 a 5%. A secreção de citocinas foi medida usando uma plataforma comercial de kits de citocinas (MesoScale Discovery) seguindo as instruções dos fabricantes.
[000123] AH0106 induziu mais IL-10, IL-12p40, TNF-CC, IL-ΐβ em PBMCs e MDDCs do que todas as outras cepas bacterianas (35624, AH1206, AH1362, 1714, BL1207) que deram perfis semelhantes entre si (Figs. 1 a 4) . AH106 é um estimulador muito mais potente de citocinas do que outras cepas antiinflamatórias especialmente conhecidas de B. longum, tais como 35624 e 1714, e demonstra que AH0106 se envolve com o sistema imunológico humano de um modo diferente das outras cepas de B. longum de uma maneira que é mais imunestimulatória.
Exemplo 3: Cepa AH0106 (bloqueia beneficamente os
interferons Tipo 1 e a indução IP-10 resultante (uma
quimiocina pré-inflamatória) e aumenta o interferon IFN-λ
tipo 3 em células dendriticas derivadas de monócitos)
[000124] A resposta imune excessiva das células
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27/61 dendriticas à infecção viral causa respostas próinflamatórias no pulmão. IFNs tipo 1 podem estimular a produção de IP-10, uma quimiocina que se liga é um quimioatrativo para células Thl. Para determinar se um B. longum AH0106 pode ter um efeito antiviral benéfico, em células dendriticas derivadas de monócitos humanas, as MDDCs foram estimuladas com B. longum AH0106 antes de serem expostos ao rinovirus 16 Humano (HRV16) e os interferons e a resposta IP-10 ao HRV16 foi monitorada. As MDDCs foram estimuladas com HRV16 (MOI) 25: 1) por 24h em cRPMI a 37°C, CO2 a 5% após o pré-tratamento (lh) com doses múltiplas de B. longum AH0106 (100:1, 50:1, 25:1, 10:1, 1:1) ou apenas HRV16 sozinho. A secreção de citocina foi examinada pelo arranjo de suspensão multiplex Bio-Plex (Bio-Rad Laboratories) medindo IFN-OC, IFN-β, IFN-λ e IP-10. Surpreendentemente, a resposta IP-10 ao RV foi atenuada
pela cepa B. longum AH0106 de uma maneira dependente da
dose (Fig. 5) . Igualmente surpreendente, foi que a co-
incubação com a cepa B. longum AH0106, em doses mais
baixas, resultou na intensificação das respostas do
interferon tipo III (Interferon lambda) enquanto as
respostas alfa e beta do Interferon foram suprimidas em
doses mais elevadas, semelhantes à resposta IP-10 (Fig. 6).
Os dados mostram que o B. longum AH0106 altera a resposta imune a RV, apoiando uma resposta imune protetora e, ao mesmo tempo, atenuando as respostas prejudiciais.
Exemplo 4: Nem todas as cepas bacterianas gram-positivas têm o mesmo efeito
[000125] Para determinar se outra cepa bacteriana gram positiva poderia ter um efeito antiviral benéfico, em
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28/61 células dendríticas derivadas de monócitos humanos, MDDCs estimuladas com Staphylococcus aureus foram expostas a rinovirus humano 16 (HRV16) e a resposta IP-10 monitorada. Resumidamente, MDDCs foram estimuladas com HRV16 (MOI) 25: 1) por 24h em cRPMI a 37°C, CO2 a 5% após pré-tratamento (lh) com doses múltiplas de Staphylococcus aureus (100:1, 50:1) em comparação com B. longum AH0106 (100:1) ou apenas HRV16 sozinho. A cepa de Staphylococcus aureus não reduziu a secreção de IP-10 DC em resposta a HRV16 (Fig. 7).
Exemplo 5: A cepa AH010 6 bloqueia beneficamente TNF-oc bem como IP-10 em células dendríticas derivadas de monócitos mas nem todas as cepas de Bifidobacteria longum têm o mesmo efeito
[000126] Dentro da mucosa inflamada, não é apenas o próprio virus que induz a secreção de IP-10 e TNF-OC, mas também outros ligantes de TLR (receptores tipo Toll) podem induzir sua produção. Portanto, as MDDCs foram pré-tratadas com B. longum AH0106 ou B. longum 35624 antes de serem expostas a LPS. A resposta IP-10 e TNF para LPS, um agonista TLR-4 foi monitorado. Resumidamente, as MDDCs foram estimuladas com LPS (50 ng/ml) por 24h em cRPMI a 37°C, CO2 a 5% após pré-tratamento (1 h) com B. longum AH0106 ou 35624 na dose de (100:1) ou apenas LPS sozinho. Surpreendentemente, a resposta IP-10 e TNF-CC a LPS foi atenuada por B. longum AH106, enquanto houve apenas uma ligeira redução na resposta IP-10 a LPS após a exposição a B. longum 35624 (Fig. 8) e B. longum 35624 aumenta o TNF-CC na mesma dose (Fig. 9) . Este é um resultado muito surpreendente como B. longum 35624 é uma cepa antiinflamatória bem conhecida e foi o principal candidato à
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29/61 hipótese. Alguns dos dados de citocinas sobre B. longum AH0106 sugeriram que causaria uma reação imunoestimulatória generalizada, mas na prática o B. longum AH0106 apresentou uma resposta imune superior e especifica nesse sistema celular.
Exemplo 6 - Comparação de B. longum AH106 e B. longum 35624 em um modelo pré-clínico in vivo de infecção respiratória
[000127] Foi testada a eficácia da cepa B. longum AH0106 em modelos pré-clinicos projetados para mostrar beneficio terapêutico. Os modelos de murinos de rinovirus não são considerados bons substitutos da infecção humana, pois os camundongos não têm ICAM, o receptor dos rinovirus dos grupos principais que entram na célula. Portanto, utilizamos um modelo letal de influenza em camundongos, que é considerado um modelo melhor (Bartlett et al, 2015) . A cepa de influenza H1N1 A/PR8/34 (100 PFU/50 ul) foi usada para infectar camundongos.
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[000128] A cepa B. longum AH0106, cepa B. longum 35624 ou placebo foi administrada(o) intranasalmente a -2 horas, +1 dia e +3 dias após infecção viral. Essas cepas foram administradas na dose de 1 x 109 células totais.
[000129] 2h, dia 1, e 3 de administração de veiculo controle (Grupo 1),
B. longum AH0106 (Grupo 2 e fração da
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30/61 parede celular de B. longum 35624 (Grupo 3) por nasal (em 50μ1 de volume).
[000130] Dia 0 da Administração de uma dose de influenza letal (PR8) por nasal (Grupo 1 - 3).
[000131] Dia 0-10 do Monitoramento de animais para morbidade (peso, temperatura e pontuação clinica, Grupo 1 3) .
[000132] Dia 5: 5 animais por grupo são sacrificados por sangramento terminal, remoção de órgãos e análise em cada dia. Dia 5 (Grupo 1-3).
[000133] Dia 5: Isolamento do fluido de BAL para a medição de citocinas e infiltrados celulares. Coleta do tecido pulmonar para a quantificação do titulo viral no pulmão por PCR quantitativo (metade de todos os lobos pulmonares).
Medição do titulo viral no tecido pulmonar
[000134] Lobos pulmonares isolados foram preparados para a quantificação da carga viral no tecido pulmonar por PCR quantitativo. O RNA foi preparado com Reagente TRI (Molecular Research Center) e depois tratado com DNAase (Invitrogen) para evitar a contaminação do DNA genômico antes de o RNA ser convertido em cDNA por transcrição reversa usando Superscript III (Invitrogen). O cDNA foi quantificado por PCR em tempo real (iCycler; Bio-Rad) usando SYBR Green (Stratagene) e as amostras foram normalizadas com os niveis de expressão de GAPDH. As sequências iniciadoras (diretas e reversas, respectivamente) usadas foram proteina PR8 M de influenza, 5'-GGACTGCAGCGTAGACGCTT-3' (SEQ ID No. 4) e 5'CATCCTGTATATGAGGCCCAT-3' (SEQ ID No. 5).
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31/61
[000135] Grupos (1-3):
1. Tratamento com Placebo - Crioprotetor recolocado em suspensão em PBS.
2 . Tratamento com células totais de B. longum AH0106
10' '9.
3. Tratamento com células totais de B. longum 35624
10' x9
Número de camundongos por grupo (Grupo 1 - 3) = 5
Medidas de Citocinas e Quimiocina
[000136] As concentrações de IL-ΐβ, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-12/IL-23p40, IL-13, IL-13 15, IL-16, IL-17A, IL-17A/F, IL-17C, IL-17E, IL- 17F, IL21, IL-22, IL-23, IL-30, IL-31, IL- 33, IP-10, MIP3CC, MIP2, MIP-ΐβ, MIP-1CC, MCP-1, KC/GRO, TNF-CC, VEGF, EPO, GM-CSF, IFN-γ no soro e fluido de BAL foram medidos usando uma plataforma comercial U-PLEX de camundongo 35-Plex Biomarcadora do Grupo 1, (MesoScale Discovery) seguindo as instruções do fabricante; IL-28 de camundongo (IFN-λ 2/3), G-CSF de camundongo, TRAIL de camundongo, AREG de camundongo foram detectados usando kits de ELISA (RayBiotech, Inc,); Oncostatina M e proteina associada a tensoativo D de camundongo (SPD) foram medidas usando kits Quantikine da R & D Systems seguindo as instruções do fabricante. O IFN-OC do camundongo foi medido no soro e fluido de BAL por IFN alpha platina ELISA (ThermoFisher scientific) e os níveis de fluido de BAL de interferon-β de camundongo (IFN-β) foram medidos usando os kits ELISA HS de Interferon Beta de Camundongo VeriKine (PBL Assay Science). Medição de infiltrados celulares na BAL
[000137] As células foram isoladas do fluido de BAL e
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32/61 o número total de células no fluido de lavagem broncoalveolar (BAL) foi determinado usando um contador Coulter (IG Instrumenten-Gesellschaft AG, Basel, Suíça). Foram realizadas contagens celulares diferenciais (contagem de 200 células/amostras) com base em critérios morfológicos e citoquímicos padrão em citospinas coradas com solução Diff-Quik (Dade Behring, Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL).
[000138] Surpreendentemente, a administração do B. longum AH0106 protegeu os camundongos melhor do que a cepa de B. longum 35624. O título viral foi reduzido em níveis semelhantes em ambas as cepas (Fig. 10), mas a mortalidade foi reduzida mais nos camundongos tratados com B. longum AH0106 (Fig. 11). Esta sobrevivência intensificada foi associada com uma resposta reduzida de interferon alfa e interferon beta e uma resposta intensificada de proteína associada a tensoativo D (Fig. 12) . Além disso, houve uma indução potente de citocinas e quimiocinas em animais tratados com AH0106 (Fig. 13) associada ao aumento de macrófagos na BAL no dia 5 (Fig. 14). Esta resposta imunológica contribuiu para a depuração viral intensificada observada nos animais tratados com B. longum AH0106 e o início do processo de cicatrização trouxe o influxo de macrófagos para o pulmão.
Exemplo 7 - Geração de Grânulos na Parede Celular Colheita/Lavagem Bacteriana
Método:
1. O equivalente a 250 ml de biomassa bacteriana original (contagem total de células = 1,5 X 1011) é colhido por centrifugação (14.000 rpm, 4°C, 20 min; rotor JA-20
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33/61 (Avanti J-2 6 x P Beckman Coulter) . o grânulo bacteriano é lavado com PBS estéril e o sobrenadante é descartado e lavado novamente (repetir mais duas vezes).
2. Para bactérias liofilizadas viáveis e não viáveis (0,5 g de 3,0 X 1011 de pó ou contagem total de células = 1,5 x 1011) foi recolocadas em suspensão em 50 mL e colhidas por centrifugação (14.000 rpm, 4°C, 20 min; rotor JA-20 (Avanti J-26 x P Beckman Coulter) O grânulo bacteriano é lavado com PBS estéril e o sobrenadante é descartado e lavado novamente (repetir mais duas vezes).
3. Finalmente, o grânulo é recolocado em suspensão em 50ml de PBS estéril e a solução bacteriana é dividida em duas aliquotas de 25ml.
Ruptura Celular
[000139] O objetivo deste procedimento foi a geração de uma fração da parede celular de toda a bactéria e a eliminação da fração citoplasmática e de outros componentes. Isso envolve uma ou mais etapas selecionadas de:
• Tratamento com um agente quelante opcionalmente em
conjunto com o procedimento de congelamento e
descongelamento para prevenir a atividade de DNAse ou
protease ao usar o tratamento enzimático para auxiliar a lise • Tratamento enzimático com um glicosideo hidrolase e/ou N-acetilmuramidase • Aplicação de força de cisalhamento, tal como ultrasonicação ou aplicação de alta pressão, tal como uso de uma prensa francesa.
• Separação da fração da parede celular da fração
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34/61 citoplasmática por uso de centrifugação • Filtração da fração da parede celular
Materiais:
• EDTA (0,5M Fluka) é quelante para remoção de ions metálicos (cálcio ou magnésio) para prevenir a atividade de DNAse ou protease ao usar enzimas para lise da parede celular • Lisozima (Sigma 10mg/ml) *livre de endotoxina é uma glicosideo hidrolase que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta entre o ácido N-acetilmurâmico e residues de Nacetil-D-glucosamina. Esta hidrólise compromete a integridade das paredes celulares bacterianas causando lise das bactérias.
• A mutanolisina (10KU Sigma diluida em 1 ml de H2O) é uma N-acetilmuramidase, que é uma enzima muralitica que cliva a ligação β-Ν-acetilmuramil-(1^4)-N-acetilglucosamina da parede celular bacteriana. Essa divagem compromete a integridade das paredes celulares bacterianas causando lise das bactérias.
• Grânulos de vidro com tamanho de particula de 90-150 qm (VWR) usados em conjunto com a sonicação para ajudar a lise
Método:
[000140] 1. Adicionar 250 μΐ de EDTA (carga a 0,5 M Fluka) a cada uma das aliquotas de 25 ml, tendo assim uma concentração final de 5 mM de EDTA.
[000141] 2. Congelar as aliquotas colocando as 2 aliquotas em nitrogênio liquido até congelar e descongelar as aliquotas em água; repetir este procedimento duas vezes.
[000142] 3. Cada 25ml de aliquota bacteriana é
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35/61 incubada com 250 μΐ de Lisozima (10mg/ml) e 250μ1 de Mutanolisina (2,5KU) por 1 hora a 37°C com um vórtice suave ocasional. A partir desta etapa, a força de cisalhamento é usada por um sonicador ou por uma prensa francesa para romper a célula bacteriana.
Sonicação • Uma meia colher de chá de grânulos de vidro autoclavados com 90-150 μπι de tamanho de partícula (VMR) foram adicionadas às alíquotas bacterianas antes da sonicação.
• Sonicar 25 ml de material bacteriano recolocado em suspensão de cada vez, em seguida, colocar em gelo e sonicar a outra aliquota usando o Sonicator (VibraCell SONICS) com a sonda de 50ml. (Ajustes de Sintonia = 50, Frequência = 60). Este procedimento é repetido quatro vezes por 10 minutos no gelo. Após a sonicação, os grânulos de vidro, as células não quebradas e os residues celulares são removidos por centrifugação a 1.000 rpm durante 10 minutos a 4°C.
Alta pressão com Prensa Francesa • Alternativamente, as células bacterianas são rompidas por pressão de 1.500 psi (10,34 Mpa) no ajuste alto (equivalente a 20.000 psi (137,89 MPa)) usando uma prensa francesa (Thermo Electron Corporation FA-078A). Este procedimento é repetido três vezes no gelo.
• A aplicação de uma força de cisalhamento usando a prensa francesa resulta em uma depuração das células bacterianas turvas após o terceiro ciclo. Após a ruptura em prensa francesa, as células não quebradas e os detritos celulares são removidos por centrifugação a 1.000 rpm
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36/61 durante 10 minutos a 4 °C e o sobrenadante contendo o material da parede celular e as frações citoplásmicas é retido .
4. Após a aplicação de uma força de cisalhamento (sonicação ou alta pressão), um sobrenadante contendo o material da parede celular e frações citoplasmáticas foi retido. Este sobrenadante é centrifugado durante 20 min a 14.000 rpm a 4 °C para separar o material da parede celular do material citoplasmático. O sobrenadante é descartado.
5. O grânulo contendo o material da parede celular é recolocado em suspensão em 5ml de PBS por 250ml de biomassa bacteriana original. O grânulo do material da parede celular foi centrifugado a 1.000 rpm durante 10 minutos para remover o residue preto no grânulo. O grânulo contendo o material da parede celular foi armazenado a -80°C. Centrífugas e rotores
Centrífuga Avanti J-E Beckman Coulter
Rotores: JA-20
Sonicador
VibraCell SONICS, Sonics e Materiais
Sonda 435-09
Prensa francesa
Prensa francesa FA-078A
Célula FA-032 (Padrão 40K) (Pressão FRENCH padrão de 40.000 psi (275, 79 KPa) de Célula com capacidade de 35ml, pressão de até 40.000 psi (275,79 KPa))
Filtração por tamanho seguida por ultrafiltração
Materiais:
• Filtros de membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (tamanho de poro de 0,45 μπι, Millipore, Bedford, MA)
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37/61 • Dispositivo UF MWCO de lOOkDa (Millipore).
1. O material da parede celular contendo Grânulo bacteriano recolocado em suspensão (5 mL) é descongelado e filtrado através de filtros de membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (tamanho de poro 0,45 μπι, Millipore, Bedford, MA; rinsados completamente com PBS antes do uso) . O material que vem através do filtro de membrana é livre de bactérias intactas e é um material da parede celular tendo um tamanho <0,45 μπι. Quatro ml de material da parede celular é produzido por este degrau de filtro de 0,45 μπι. Dos 250 ml originais de cultura bacteriana, 4ml do material da parede celular em suspensão.
2. O material da parede celular <0,45 μπι é então ultrafiltrado.
a. Rinsar o dispositivo UF primeiro com 15 ml de PBS, centrifugar a 3.500 x g a 4°C.
b. Colocar os extratos de grânulos bacterianos <0,45 μπι, carregar ~4 ml no dispositivo UF MWCO de lOOkDa.
c. Quando a solução superior >100kDa ficar menor em volume, diafiltrar com PBS.
d. O material que passa pelo filtro de lOOkDa será retido e armazenado a -80°C.
e. O retido deve ser recolocado em suspensão no mesmo volume de PBS que foi adicionado ao dispositivo de ultrafiltração (4 mL) . Este material é denominado >100kDa de Grânulo bacteriano. O peso seco final da fração da parede celular assim produzido é de 120 mg em 4 mL de retido, o que equivale a uma concentração final de 30 mg de fração da parede celular por 1 mL.
f. Esta fração da parede celular foi concentrada para
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38/61 testes in vitro e in vivo para maior solubilidade. Para preparar um material mais concentrado do que 30 mg/ml, tai como 300 mg/ml (10X) ou 150 mg/ml (5X) >100 kDa de soluções de Grânulo bacteriano, a fração da parede celular é apenas recolocada em suspensão em 10 vezes ou 5 vezes menos volume do que o material de partida.
Exemplo 8: A fração da parede celular do AH0106 (bloqueia beneficamente os interferons tipo 1 e a indução resultante de IP-10 (uma quimiocina pró-inflamatória) nas MDDCS
[000143] Para determinar se uma fração da parede celular de B. longum AH0106, como produzida no exemplo 7, poderia ter um efeito antiviral benéfico, a fração foi incubada em MDDCs humanos expostos a HRV16 e interferon tipo 1 e a resposta IP-10 celular foi monitorada. Para geração de células dendriticas derivadas de monócitos: Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de doadores saudáveis usando centrifugação por gradiente de densidade. Monócitos de sangue periférico humano foram isolados usando isolamento positivo para CD14 com o sistema MACS (Miltenyi Biotec, 130-050-201) . As células foram cultivadas em meio cRPMI (Life Technologies, 21875-091) com 1.000 U/ml de interleucina 4 (Novartis) e 1.000 U/ml de fator estimulante de colônias de macrófagos e granulócitos (PeproTech, 300-03) durante 6 dias para as diferenciar em MDDCs. As células foram cultivadas em meio cRPMI (RPMI (Life Technologies, 21875-091) + soro bovino fetal a 10% (catálogo Sigma F4135) e 1% de penicilina/estreptomicina (catálogo Sigma P0781).
[000144] As MDDCs foram estimuladas com HRV16 (MOI) 25:1) por 24h em cRPMI a 37 °C, CO2 a 5% após pré-tratamento
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39/61 (lh) com uma fração da parede celular de B. longum AH0106 (30mg/ml) ou apenas HRV16 sozinho. A secreção de citocina foi examinada pelo arranjo de suspensão multiplex Bio-Plex (Bio-Rad Laboratories) (IFN-OC, IFN-β, IP-10) .
[000145] De acordo com a MDDC estimulada por HRV16 pré-tratada com os resultados da cepa de B. longum AH0106 acima, a resposta IP-10 (Fig. 16(a)), IFN-CC (Fig. 16(b)) e IFN-β (Fig. 16 (c)) a HRV16 foi atenuada por uma fração da parede celular da cepa B. longum AH0106.
Exemplo 9: Nem todas as frações da parede celular das espécies de Bifidobactérias têm o mesmo efeito
[000146] A fração da parede celular de outra Bifidobactéria, Bifidobacteria breve (BifUCC2003) foi também testada usando a metodologia descrita no exemplo 4 e não apresentou efeitos significativos semelhantes. A fração Bif UCC2003 reduziu a produção de IP-10 após a estimulação viral, mas não na mesma extensão que a fração da parede celular de B. longum AH0106 durante um ensaio de 24 horas (Fig. 17 (a)).
[000147] Adicionalmente, dentro da mucosa inflamada, não é apenas o próprio virus que induz a secreção de IP-10; outras citocinas também podem induzir a produção de IP-10. As citocinas, tal como IFN-β, são produzidas como parte da resposta primária do hospedeiro antiviral. O IFN-β, em particular, é um potente indutor de IP-10. Portanto, examinamos o efeito da fração da parede celular na secreção de IP-10 em resposta a IFN-β (Fig. 17 (b) ) . As MDDCs foram estimuladas com IFN-β (200 ng/ml) por 24h em cRPMI a 37 °C, CO2 a 5% após pré-tratamento (lh) com frações da parede celular (30mg/ml) ou IFN-β sozinho. A fração de grânulo da
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40/61 parede celular de B. longum AH0106 suprimiu a secreção de IP-10 a esses estímulos, enquanto a fração de grânulo da parede celular Bif UCC2003 não reduziu a secreção de IP-10.
Exemplo 10: A fração da parede celular da cepa B. longum
AH0106 tem um efeito benéfico adicional (bloqueia TNF-ct)
em células dendriticas derivadas de monócitos que
contribuem para a redução da inflamação e nem todas as
cepas de Bifidobactérias têm o mesmo efeito
[000148] Dentro da mucosa inflamada, não é apenas o
próprio vírus que induz a secreção pró-inflamatória de TNFCt, mas também outros ligandos de TLR (receptores tipo toll) podem induzir a sua produção. Portanto, foi examinada a secreção de TNF-ct em resposta aos ligandos de TLR Poly:IC (TLR-3) e LPS (TLR-4). As MDDCs foram pré-tratadas com células da parede de B. longum AH0106, B. longum 35624 e Bif UCC2003 antes de serem expostas a LPS, um agonista de TLR-4, e a resposta IP-10 e TNF foi monitorada. As MDDCs foram estimuladas com o agonista TLR-4 LPS (50 ng/ml) ou o agonista TLR-3 Poly:IC (5 qg/ml) por 24h em cRPMI a 37°C, CO2 a 5% após pré-tratamento (lh) com frações da parede celular de Bif idobactérias a uma dose de (30 mg/ml) ou apenas o agonista de TLR sozinho. A secreção de TNF-ct foi examinada por Quantikine ELISA (R & D systems). De acordo com os resultados de toda a cepa d B. longum AH0106, a resposta do TNF-ct a LPS e Poly:IC foi atenuada pela fração da parede celular de B. longum AH106, enquanto ambas as frações da parede celular de B. longum 35624 e Bif UCC2003 aumenta TNF-ct na mesma dose (Figs. 18a e 18b) . Este é um resultado surpreendente dado que B. longum 35624 é uma cepa anti-inflamatória bem conhecida e B. longum AH0106 teve uma
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41/61 resposta superior neste sistema.
Discussão
[000149] Em resumo, como ilustrado nos exemplos 2-10, foi mostrado que existe uma resposta de interferon Tipo III intensificada que é benéfica, e a adição da fração da parede celular de AH0106 causa esta resposta desejada. Nas células que fazem parte da última resposta do sistema imunológico do hospedeiro (DC's), a fração da parede celular bloqueia a resposta excessiva do interferon Tipo 1, que pode levar a danos celulares e infecção secundária. Este efeito alvo tem benefício em infecções causadas por influenza, o resfriado comum (rinovírus) e RSV, exacerbação viral de doenças respiratórias crônicas, tais como, asma, DPOC e DRAs em crianças e adultos e em indivíduos obesos. Resposta em cascata
[000150] A resposta em cascata anormal à infecção viral é ilustrada na Fig. 19 (a).
[000151] A cascata da resposta mediada pela fração da parede celular de AH0106 a infecção viral é ilustrada na Fig. 19 (b) .
[000152] A principal resposta antiviral é controlada pelos IFNs. Os IFNs tipo I mais bem definidos são IFN-OC e IFN-β. A maioria dos tipos de células produz IFN-β, enquanto as células hematopoiéticas, particularmente células dendríticas plasmocitoides, são as produtoras predominantes de IFN-OC (Ivashkiv e Donlin 2014) . Como mencionado anteriormente, as respostas do Interferon tipo I, tais como, IFN-OC e IFN-β, mostraram correlacionar-se diretamente com o aumento da morbidade e mortalidade em modelos de infecção por influenza (Davidson et al, 2014).
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IFNs tipo 1 podem estimular a produção de IP-10 (também chamada CXCL-10) uma quimiocina que se liga a CXCR3, onde sua função primária é um quimioatrativo para células Thl . Os IFNs lambda (IFNls, IFNs tipo III ou IL-28 e IL-29) constituem uma nova classe de interferons que compartilham homologia, padrões de expressão e funções antivirais com IFN tipo I (Lazear et al., 2015b; Wack et al., 2015). Eles induzem a sinalização a jusante que parece notavelmente semelhante à dos IFNs tipo I, conduzindo a expressão de ISGs e a indução de respostas antivirais (Durbin et al, 2013; Mendoza et al, 2017) . No entanto, os interferons tipo III desempenham um papel importante na limitação de respostas pró-inflamatórias ou imunopatologia.
[000153] A IP-10 é elevada nos pulmões na infecção pelo virus influenza (Ichikawa et al, 2013) . De fato, o bloqueio de IP-10 usando anticorpos monoclonais melhora a lesão pulmonar induzida por virus (Wang et al, 2013). A IP10 é elevada nos pulmões de pacientes com SDRA e tem demonstrado ser um fator importante na patologia da SDRA (Ichikawa et al, 2013) .
[000154] A SP-D tem um papel importante na defesa inata do hospedeiro contra a influenza por ligação a glicanos ricos em manose nas glicoproteinas HA/NA do virus (Hartshorn et al, 1997; Reading et al, 1997; Hartshorn et al., 2000) . A SP-D medeia uma faixa de atividades antivirais in vitro, incluindo neutralização da infectividade do virus e da inibição da atividade enzimática do NA viral, e camundongos deficientes em SP-D eram mais susceptíveis à infecção com virus influenza altamente glicosilados. (Hartshorn et al, 1997; Reading et
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43/61 al, 1997; Tecle et al, 2007; LeVine et al, 2001; Vigerust et al, 2007; Hawgood et al, 2004) . SP-D enhances phagocytosis and pulmonary clearance of RSV (LeVine et al, 2004) .
[000155] Infecções bacterianas secundárias são um grande problema após a infecção viral. A coinfecção virusbactéria é bem reconhecida pela influenza, rinovirus e RSV. As principais infecções bacterianas no trato respiratório incluem Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis e Haemophilus influenzae, mas o Staphylococcus aureus também mostrou causar infecções graves após a infecção viral (Hewitt et al, 2016). As infecções bacterianas secundárias ocorrem com mais frequência entre 5 a 10 dias após as infecções virais primárias, sugerindo assim que uma imunossupressão transitória (a resposta primária) talvez seja responsável pelo crescimento bacteriano. Um mecanismo proposto para um sinergismo entre influenza e S. pneumoniae sugere que a resposta antiviral de IFN tipo 1 (IFN-Ot/β) provocada pela infecção primária pelo virus da influenza intensifica a suscetibilidade do hospedeiro ao desafio bacteriano secundário através da supressão da imunidade antibacteriana (Nakamura et al, 2011; Shahangian et al, 2009; Li et al, 2012) . Em contraste, os interferons tipo III, tais como o IFN-λ, podem limitar a replicação viral sem inibir a depuração das infecções bacterianas secundárias que ocorrem após a indução do IFN-Ot/β. Foi demonstrado que o impacto da atenuação da sinalização de IFN-λ diretamente antes do desafio bacteriano com uma proteina Fc de IFNLR1 aumentou significativamente a carga bacteriana no pulmão em comparação com os controles em
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44/61 animais (Rich et al, 2017) . Além disso, a deficiência de SP-D foi associada com a colonização intensificada e a infecção por S. pneumoniae do trato respiratório superior e inferior e inicio mais precoce e maior persistência da bacteremia. Demonstrou-se que a SP-D se liga e aglutina Streptococcus pneumoniae in vitro (um agente secundário de infecção bacteriana que é um problema fundamental nas exacerbações secundárias em pacientes com asma e DPOC) (Jounblat et al., 2005) .
[000156] As diferentes condições que são agudamente afetadas pela resposta imune desregulada ou aberrante à infecção viral são resumidas a seguir; Sindrome do desconforto respiratório agudo (SDRA), Asma incluindo asma infantil, DPOC, Obesidade.
[000157] A sindrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) afeta um grande número de pessoas em todo o mundo e está associada com uma taxa de mortalidade muito alta (30 a 50%) . Infecções virais respiratórias (por exemplo, influenza) estão associadas à SDRA.
[000158] A asma é um distúrbio inflamatório crônico das vias aéreas, geralmente associado à hiperresponsividade das vias aéreas e ao fluxo aéreo variável.
[000159] A asma é um distúrbio inflamatório crônico das vias aéreas, usualmente associado a hiperresponsividade das vias aéreas e obstrução variável ao fluxo aéreo que é frequentemente reversível espontaneamente ou durante o tratamento (WHO, 20 07) . Aproximadamente 8 0 a 85% das exacerbações da asma em crianças, adolescentes e com menor frequência adultos estão associadas a infecções virais do trato respiratório superior, e o rinovirus (RV) é
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45/61 responsável por -60-70% dessas exacerbações associadas ao virus. Infecções virais estão intimamente ligadas a doenças sibilantes em crianças de todas as idades. O VSR é o principal agente causador de bronquiolite ou crupe, enquanto o rinovírus (RV) é mais comumente detectado em crianças com sibilância após esse periodo. A doença respiratória grave induzida por um desses virus está associada ao desenvolvimento subsequente de asma, e o risco é maior para crianças pequenas que apresentam sibilância com infecções por RV (Jartti e Gern, 2017) .
[000160] A obesidade está associada a respostas imunológicas e inflamatórias desreguladas. O efeito da obesidade na ocorrência de asma parece ser mais proeminente em mulheres e indivíduos não alérgicos, enquanto há um efeito dose-resposta de aumento do índice de massa corporal (IMC) na incidência de asma. Está se tornando cada vez mais evidente que a obesidade está associada a um fenótipo único de asma que é caracterizado por uma doença mais grave, com resposta variável às terapias convencionais da asma. Além disso, a obesidade foi identificada como um fator de risco para influenza severa durante a pandemia de influenza A (H1N1) em 2009 e indivíduos obesos têm uma defesa antiviral prejudicada contra vírus respiratórios (Almond et al, 2013) . Evidências sugerem que não é o vírus em si, mas a natureza da resposta imune ao RV que conduz essa resposta prejudicial (Steinke et al, 2016).
[000161] A DPOC é a terceira principal causa de morte nos EUA. De fato, a DPOC é a única principal causa de morte cuja incidência está aumentando e espera-se que seja a terceira principal causa de morte no mundo desenvolvido até
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2030 (superada apenas por doença cardíaca e acidente vascular cerebral). Resulta de dano induzido por inflamação das vias aéreas causando bronquite crônica e/ou enfisema. Um espectro mais amplo de vírus pode induzir exacerbações em pacientes com DPOC, mas novamente parece que não é o vírus, mas a resposta imune ao vírus que resulta em piora dos sintomas (Zhou et al, 2015) .
[000162] Será apreciado que a cepa da invenção pode ser administrada a animais (incluindo seres humanos) em uma forma oralmente ingerível em uma preparação convencional, tais como, cápsulas, microcápsulas, comprimidos, grânulos, pó, cápsulas, pílulas, supositórios, suspensões e xaropes. Formulações adequadas podem ser preparadas por métodos comumente empregados usando aditivos orgânicos e inorgânicos convencionais. A quantidade de ingrediente ativo na composição médica pode estar em um nível que irá exercer o efeito terapêutico desejado.
[000163] A formulação também pode incluir um componente bacteriano, uma entidade de fármaco ou um composto biológico.
[000164] Além disso, uma vacina compreendendo as cepas da invenção pode ser preparada usando qualquer método conhecido adequado e pode incluir um carreador ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.
[000165] O sistema imunológico humano desempenha um papel significativo na etiologia e na patologia de uma vasta faixa de doenças humanas. A responsividade hiper e hipoimune resulta em, ou é um componente da maioria dos estados de doença. Uma família de entidades biológicas, denominada citocinas, é particularmente importante para o
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47/61 controle de processos imunológicos. Perturbações dessas delicadas redes de citocinas estão sendo cada vez mais associadas a muitas doenças. Estas doenças incluem, mas não se limitam a, distúrbios inflamatórios, imunodeficiência, doença inflamatória do intestino, sindrome do intestino irritável, câncer (particularmente as do sistema gastrointestinal e imunológico), doença diarreica, diarréia associada a antibiótico, diarréia pediátrica, apendicite, distúrbios autoimunes, esclerose múltipla, Doença de Alzheimer, artrite reumatoide, doença celiaca, diabetes mellitus, transplante de órgãos, infecções bacterianas, infecções virais, infecções fúngicas, doença periodontal, doença urogenital, doença sexualmente transmissível, infecção por HIV, replicação do HIV, diarréia associada ao HIV, trauma cirúrgico associado, doença metastática induzida por cirurgia, sepse, perda de peso, anorexia, controle da febre, caquexia, cicatrização de feridas, úlceras, função de barreira intestinal, alergia, asma, distúrbios respiratórios, distúrbios circulatórios, doença cardíaca coronária, anemia, distúrbios do sistema de coagulação sanguínea, doença renal, distúrbios do sistema nervoso central, doença hepática, isquemia, distúrbios nutricionais, osteoporose, distúrbios endócrinos, distúrbios epidérmicos, psoríase e acne vulgaris. Os efeitos sobre a produção de citocinas são específicos para a cepa probiótica examinada. Assim, cepas probióticas específicas podem ser selecionadas para normalizar um desequilíbrio exclusivo de citocinas, específico para um tipo específico de doença. A personalização de terapias específicas de doenças pode ser realizada usando uma única
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48/61 cepa de AN1206 ou mutantes ou variantes da mesma ou uma seleção destas cepas.
[000166] A flora entérica é importante para o desenvolvimento e bom funcionamento do sistema imunológico intestinal. Na ausência de uma flora entérica, o sistema imunológico intestinal é subdesenvolvido, como demonstrado em modelos animais livres de germes, e certos parâmetros funcionais são diminuidos, tais como, capacidade fagocitária de macrófagos e produção de imunoglobulinas. A importância da flora intestinal na estimulação de respostas imunológicas não prejudiciais está se tornando mais evidente. O aumento da incidência e da gravidade das alergias no mundo ocidental tem sido associado a um aumento na higiene e saneamento, concomitante com uma diminuição no número e na variedade de desafios infecciosos encontrados pelo hospedeiro. Esta falta de estimulação imunológica pode permitir que o hospedeiro reaja a agentes não patogênicos, mas antigênicos, resultando em alergia ou autoimunidade. O consumo deliberado de uma série de bactérias imunomoduladoras não patogênicas proveria ao hospedeiro os estimulos educacionais necessários e apropriados para o desenvolvimento e o controle adequados da função imunológica.
[000167] A inflamação é o termo usado para descrever o acúmulo local de fluidos, proteínas plasmáticas e leucócitos em um local que sofreu danos físicos, infecção ou onde há uma resposta imune contínua. O controle da resposta inflamatória é exercido em vários níveis. Os fatores de controle incluem citocinas, hormônios (por exemplo, hidrocortisona), prostaglandinas, intermediários
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49/61 reativos e leucotrienos. As citocinas são proteínas biologicamente ativas de baixo peso molecular que estão envolvidas na geração e no controle de respostas imunológicas e inflamatórias, ao mesmo tempo em que regulam o desenvolvimento, o reparo tecidual e a hematopoiese. Eles provêm um meio de comunicação entre os próprios leucócitos, e também com outros tipos de células. A maioria das citocinas é pleiotrópica e expressa múltiplas atividades biologicamente sobrepostas. As cascatas e redes de citocinas controlam a resposta inflamatória em vez da ação de uma determinada citocina em um tipo de célula particular. A diminuição da resposta inflamatória resulta em concentrações mais baixas dos sinais de ativação apropriados e outros mediadores inflamatórios, levando à cessação da resposta inflamatória. 0 TNFCC é uma citocina proinflamatória fundamental, pois inicia uma cascata de citocinas e efeitos biológicos, resultando no estado inf lamatório. Portanto, agentes que inibem o TNFCC estão sendo usados atualmente para o tratamento de doenças inflamatórias, por exemplo, infliximab.
[000168] Acredita-se que as citocinas próinflamatórias desempenham um papel importante na patogênese de muitas doenças inflamatórias, incluindo a doença inflamatória intestinal (DII). As terapias atuais para o tratamento da DII visam reduzir os níveis dessas citocinas pró-inf lamatórias, incluindo IL-8 e TNFCC. Estas terapias podem também desempenhar um papel significativo no tratamento de doenças inflamatórias sistêmicas, tal como artrite reumatoide.
[000169] A cepa da presente invenção pode ter
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50/61 aplicação potencial no tratamento de uma faixa de doenças inflamatórias, particularmente se usado em combinação com outras terapias anti-inflamatórias, tais como, fármacos anti-inflamatórios não esteroides (AINEs) ou Infliximab.
[000170] A produção de citocinas multifuncionais em um amplo espectro de tipos de tumores sugere que respostas inflamatórias significativas estão em andamento em pacientes com câncer. Atualmente não está claro qual efeito protetor essa resposta tem contra o crescimento e o desenvolvimento de células tumorais in vivo. No entanto, essas respostas inflamatórias podem afetar adversamente o hospedeiro portador de tumor. Interações complexas de citocinas estão envolvidas na regulação da produção de citocinas e na proliferação celular em tecidos normais e tumorais. Há muito tempo se reconhece que a perda de peso (caquexia) é a causa mais comum de morte em pacientes com câncer e que a desnutrição inicial indica um mau prognóstico. Para um tumor crescer e se disseminar, deve induzir a formação de novos vasos sanguíneos e degradar a matriz extracelular. A resposta inflamatória pode ter papéis significativos nos mecanismos acima, contribuindo assim para o declínio do hospedeiro e progressão do tumor. Devido às propriedades anti-inflamatórias de Bifidobacterium longum, estas cepas bacterianas podem reduzir a taxa de transformação de células malignas. Além disso, as bactérias intestinais podem produzir, a partir de compostos da dieta, substâncias com atividade genotóxica, carcinogênica e promotora de tumor, e as bactérias intestinais podem ativar pró-carcinogênicos para agentes reativos a DNA. Em geral, as espécies de Bifidobacterium
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51/61 têm baixa atividade de enzimas que metabolizam xenobióticos em comparação com outras populações dentro do intestino, tais como, bacteroides, eubactérias e clostridios. Portanto, o aumento do número de bactérias Bifidobacterium no intestino pode modificar beneficamente os niveis dessas enzimas.
[000171] A maioria dos organismos patogênicos obtém entrada através de superficies mucosas. A vacinação eficaz destes locais protege contra a invasão por um agente infeccioso particular. As estratégias de vacinação oral concentraram-se, até o momento, no uso de organismos patogênicos vivos atenuados ou antigenos encapsulados purificados. Bactérias probióticas, projetadas para produzir antigenos a partir de um agente infeccioso, in vivo, podem prover uma alternativa atrativa, uma vez que essas bactérias são consideradas seguras para o consumo humano (status GRAS).
[000172] Estudos em murinos demonstraram que o consumo de bactérias probióticas que expressam antigenos estranhos pode desencadear respostas imunológicas protetoras. O gene que codifica o fragmento C da toxina do tétano (TTFC) foi expressado em Lactococcus lactis e os camundongos foram imunizados por via oral. Este sistema foi capaz de induzir titulos de anticorpos significativamente altos o suficiente para proteger os camundongos do desafio letal da toxina. Além da apresentação de antigeno, os vetores bacterianos vivos podem produzir compostos bioativos, tais como, citocinas imunoestimuladoras, in vivo. L. lactis secretoras de IL-2 ou IL-6 e TTFC humana bioativa induzem titulos de IgG sérica 10-15 vezes mais
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52/61 elevados em camundongos imunizados intranasalmente. No entanto, com esta cepa bacteriana particular, o nível de IgA total não foi aumentado por coexpressão com estas citocinas. Outras cepas bacterianas, tal como Streptococcus gordonii, também estão sendo examinadas quanto à sua utilidade como vacinas mucosas. 0 S. gordonii recombinante que coloniza as cavidades oral e vaginal de murino induziu respostas de anticorpos mucosais e sistêmicos a antígenos expressados por esta bactéria. Assim, a imunização oral usando bactérias probióticas como vetores não apenas protegeria o hospedeiro da infecção, mas podería substituir os estímulos imunológicos que o patógeno normalmente provocaria, contribuindo assim para a educação imunológica do hospedeiro.
Prebióticos
[000173] A introdução de organismos probióticos é realizada pela ingestão do microrganismo em um carreador adequado. Seria vantajoso prover um meio que promova o crescimento dessas cepas probióticas no intestino grosso. A adição de um ou mais oligossacarídeos, polissacarídeos ou outros prebióticos intensifica o crescimento de bactérias do ácido láctico no trato gastrointestinal. Prebióticos refere-se a qualquer componente alimentar não viável que é especificamente fermentado no cólon por bactérias nativas consideradas como sendo de valor positivo, por exemplo, bifidobactérias, lactobacilos. Tipos de prebióticos podem incluir aqueles que contêm frutose, xilose, soja, galactose, glicose e manose. A administração combinada de uma cepa probiótica com um ou mais compostos prebióticos pode aumentar o crescimento do probiótico administrado in
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53/61 vivo, resultando em um benefício de saúde mais pronunciado e é denominado sinbiótico.
Outros ingredientes ativos
[000174] Entender-se-á que as cepas probióticas podem ser administradas profilaticamente ou como um método de tratamento sozinho ou com outros materiais probióticos e/ou prebióticos como descrito acima. Além disso, as bactérias podem ser usadas como parte de um regime profilático ou de tratamento usando outros materiais ativos, tais como os usados para o tratamento de inflamação ou outros distúrbios, especialmente aqueles com um envolvimento imunológico. Tais combinações podem ser administradas em uma formulação única ou como formulações separadas administradas na mesma ou em diferentes ocasiões e usando as mesmas ou diferentes vias de administração.
Composições farmacêuticas
[000175] Uma composição farmacêutica é uma composição que compreende ou consiste em uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente farmaceuticamente ativo. De um modo preferido, inclui um carreador, diluente ou excipientes farmaceuticamente aceitável(eis) (incluindo combinações do(s) mesmo(s)). Os carreadores ou diluentes aceitáveis para uso terapêutico são bem conhecidos na técnica farmacêutica, e são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences. A escolha do carreador, excipiente ou diluente farmacêutico pode ser selecionada em relação à via de administração pretendida e à prática farmacêutica padrão. As composições farmacêuticas podem compreender como - ou além do - carreador, excipiente ou diluente qual(is)quer ligante(s) adequado(s),
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54/61 lubrificante (s), agente(s) de suspensão, agente(s) de revestimento, agente(s) solubilizante(s), propelente(s).
[000176] Exemplos de carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, água, soluções salinas, álcool, silicone, ceras, vaselina, óleos vegetais, polietileno glicóis, propileno glicol, lipossomas, açúcares, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, tensoativos, ácido silicico, parafina viscosa, óleo perfumado, monoglicerideos e diglicerideos de ácidos graxos, ésteres de ácidos graxos petroetrais, hidroximetil celulose, polivinilpirrolidona e semelhantes.
[000177] Quando apropriado, as composições farmacêuticas podem ser administradas por qualquer um ou mais de: inalação, na forma de um supositório ou pessário, topicamente na forma de uma loção, solução, creme, unguento ou pó fino, pelo uso de um adesivo para a pele, oralmente na forma de comprimidos contendo excipientes, tal como amido ou lactose, ou em cápsulas ou óvulos, isoladamente ou em mistura com excipientes, ou na forma de elixires, soluções ou suspensões contendo agentes aromatizantes ou colorantes, ou podem ser injetados parentericamente, por exemplo, intracavernalmente, intravenosamente, intramuscularmente ou subcutaneamente. Para administração parentérica, as composições podem ser mais bem usadas na forma de uma solução aquosa estéril que pode conter outras substâncias, por exemplo, sais ou monossacarideos suficientes para tornar a solução isotônica com o sangue. Para administração bucal ou sublingual, as composições podem ser administradas na forma de comprimidos ou pastilhas que podem ser formuladas de uma maneira
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55/61 convencional.
[000178] A administração intranasal pode ser realizada usando um pulverizador nasal, solução de lavagem nasal ou aplicação direta no nariz.
[000179] A administração ao pulmão pode ser na forma de um pó seco, inalado usando um dispositivo inalador. Em alguns casos, a formulação está na forma de um aerossol. O aerossol pode ser uma solução, suspensão, pulverização, névoa, vaporização, goticulas, particulas ou um pó seco, por exemplo, usando um método inalador de dose incluindo propelente HFA, um inalador de dose calibrada com propelente não HFA, um nebulizador, uma lata pressurizada, de um pulverizador continuo.
[000180] A formulação pode ser projetada para encapsular, remover e/ou inativar um virus. A formulação, alternativa ou adicionalmente, pode impedir que um virus infecte ainda mais o trato respiratório.
[000181] Para auxiliar na distribuição e manutenção no trato respiratório, tal como na cavidade nasal, a formulação pode ter uma viscosidade desejada de 1 centipoise a 2.000 centipoise (1 mPa.s a 2.000 mPa.s), por exemplo, 5 cp a 500 cp, ou 5 cp a 300 cp (5 mPa.s a 500 mPa.s, ou 5 mPa.s a 300 mPa.s). Qualquer agente modificador de viscosidade adequado pode ser usado para atingir a viscosidade desejada. Tais agentes podem ser materiais poliméricos naturais ou sintéticos adequados, tal como hidroxipropil metilcelulose.
[000182] Pode haver diferentes requisitos de composição/formulação dependendo dos diferentes sistemas de dispensação. A titulo de exemplo, a composição farmacêutica
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56/61 da presente invenção pode ser formulada para ser dispensada usando uma minibomba ou por uma via mucosa, por exemplo, como um pulverizador nasal ou aerossol para inalação ou solução ingerivel, ou parentericamente em que a composição é formulada por uma forma injetável, para dispensação, por exemplo, por uma via intravenosa, intramuscular ou subcutânea. Alternativamente, a formulação pode ser projetada para ser dispensada por ambas as vias.
[000183] A invenção não está limitada às modalidades anteriormente descritas que podem ser variadas em detalhes. Referências
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Claims (20)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Cepa de Bifidobacterium longum, caracterizada pelo fato de que tem o número de acesso NCIMB 42020.
  2. 2. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa está na forma de uma cultura biologicamente pura.
  3. 3. Cepa isolada, caracterizada pelo fato de ser de Bifidobacterium longum NCIMB 42020.
  4. 4. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de ser na forma de células viáveis.
  5. 5. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de ser na forma de células não viáveis.
  6. 6. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a Bifidobacterium é isolada das fezes.
  7. 7. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a cepa está na forma de um caldo bacteriano.
  8. 8. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a cepa está na forma de um pó liofilizado.
  9. 9. Cepa, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a cepa atenua a resposta IP-10 a um virus.
  10. 10. Cepa, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a cepa intensifica a resposta do interferon tipo III a um virus.
  11. 11. Cepa, de acordo com as reivindicações 1 a 10,
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    2/9 caracterizada pelo fato de que a cepa intensifica a resposta do interferon lambda a um virus.
  12. 12. Cepa, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a cepa suprime a resposta tipo I do interferon a um virus.
  13. 13. Cepa, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que a cepa suprime a resposta do interferon alfa a um virus.
  14. 14. Cepa, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que a cepa suprime a resposta do interferon beta a um virus.
  15. 15. Cepa, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que a cepa intensifica a resposta da proteina associada a tensoativo D a um virus.
  16. 16. Formulação, caracterizada pelo fato de que compreende uma cepa de Bifidobacterium conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.
  17. 17. Formulação, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente outro material probiótico.
  18. 18. Formulação, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um material prebiótico.
  19. 19. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 17, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um carreador ingerivel.
  20. 20. Formulação, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o carreador ingerido é um carreador farmaceuticamente aceitável, tal como uma cápsula, um comprimido ou um pó.
    Petição 870190084188, de 28/08/2019, pág. 80/120
    3/9
    21. Formulação, de acordo com a reivindicação 19,
    caracterizada pelo fato de que o carreador ingerível é um
    produto alimentício, tais como, leite acidificado, iogurte,
    iogurte congelado, sorvete, leite em pó, concentrado de
    leite, gelado, pasta de queijo, molho ou bebida. 22 . Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 21, caracterizada pelo fato de que
    compreende adicionalmente uma proteína e/ou um peptídeo, em particular, proteínas e/ou peptídeos que são rica(o)s em
    glutamina/glutamato, um lipídeo, um carboidrato, uma vitamina, um mineral e/ou elemento traço. 23. Formulação, de acordo com as reivindicações 16 a 22, caracterizada pelo fato de que a cepa de
    Bifidobacterium está presente em uma quantidade maior que
    106 cfu por grama da formulação. 24. Formulação, de acordo com as reivindicações 16 a 23, caracterizada pelo fato de que compreende
    adicionalmente um adjuvante.
    25. Formulação, de acordo com as reivindicações 16 a 24, caracterizada pelo fato de que compreende
    adicionalmente uma entidade de fármaco.
    26. Formulação, de acordo com as reivindicações 16 a 25, caracterizada pelo fato de que compreende
    adicionalmente um composto biológico.
    27. Formulação, caracterizada pelo fato de que compreende uma cepa conforme definida em qualquer uma das
    reivindicações 1 a 15, em que a formulação é adaptada para administração ao pulmão ou ao nariz.
    28. Formulação, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de estar na forma de um
    Petição 870190084188, de 28/08/2019, pág. 81/120
    4/9 pulverizador nasal.
    29. Formulação, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizada pelo fato de que a viscosidade da formulação é de 1 cp a 2.000 cp (1 mPa.s a 2.000 mPa.s).
    30. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 ou formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 26, caracterizada pelo fato de ser para uso em alimentos.
    31. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 ou formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 26, caracterizada pelo fato de ser para uso como um medicamento.
    32. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 ou formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 29, caracterizada pelo fato de ser para uso na profilaxia e/ou no tratamento de atividade inflamatória indesejável.
    33. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, ou derivado ou fragmento ativo ou mutante ou variante da mesma, caracterizada(o) pelo fato de ser para uso na profilaxia e/ou no tratamento de atividade inflamatória indesejável.
    34. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, ou formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 29, caracterizada pelo fato de ser para uso na preparação de um fármaco para tratamento de asma e/ou alergia, o medicamento pode estar em uma forma adequada para inalação.
    35. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, ou formulação de acordo com
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    5/9 qualquer uma das reivindicações 16 a 29, caracterizada pelo fato de ser para uso na profilaxia ou no tratamento de uma infecção viral em um indivíduo.
    36. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 ou formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 29, caracterizada pelo fato de ser para uso na profilaxia de uma infecção bacteriana secundária associada a uma infecção viral respiratória em um indivíduo.
    37. Cepa de Bifidobacterium para uso, de acordo com a reivindicação 35 ou 36, caracterizada pelo fato de que o virus é um virus respiratório.
    38. Cepa de Bifidobacterium para uso, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que o virus respiratório é selecionado de virus influenza, rinovirus e virus sincicial respiratório.
    39. Cepa de Bifidobacterium longum para uso,de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 38, caracterizada pelo fato de que o indivíduo foi diagnosticado com uma doença pulmonar inflamatória.
    40. Cepa de Bifidobacterium longum para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 39, caracterizada pelo fato de que o indivíduo tem suscetibilidade aumentada a uma infecção respiratória.
    41. Cepa de Bifidobacterium longum para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 40, caracterizada pelo fato de que o indivíduo é obeso.
    42. Cepa de Bifidobacterium longum para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 41, caracterizada pelo fato de que o indivíduo é um paciente com sindrome do
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    6/9 desconforto respiratório agudo (SDRA).
    43. Cepa de Bifidobacterium longum para uso,de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 42, caracterizada pelo fato de que o individuo é um paciente com asma.
    44. Cepa de Bifidobacterium longum para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 43, caracterizada pelo fato de que o individuo é um paciente com doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC).
    45. Cepa de Bifidobacterium longum para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 44, caracterizada pelo fato de que o individuo é uma criança com menos de 5 anos de idade.
    46. Cepa de Bifidobacterium longum para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 44, caracterizada pelo fato de que o individuo é uma pessoa idosa com mais de 60 anos de idade.
    47. Método para profilaxia ou tratamento de uma infecção viral em um individuo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um individuo em necessidade do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma cepa de Bifidobacterium longum NCIMB 42020 ou derivado, ou fragmento ou mutante ou variante ativo da mesma.
    48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a cepa NCIFB 42020 de Bifidobacterium longum ou derivado, ou fragmento ou mutante ou variante ativo da mesma, atenua a resposta IP-10 a um virus.
    49. Método, de acordo com a reivindicação 47 ou 48, caracterizado pelo fato de que a cepa NCIFB 42020 de Bifidobacterium longum ou derivado, ou fragmento ou mutante
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    Ί/9
    ou variante ativo da mesma, intensifica a resposta do interferon tipo III ao virus. 50. Método, de acordo com as reivindicações 47 a 49, caracterizado pelo fato de que a cepa NCIFB 42020 de
    Bifidobacterium longum ou derivado, ou fragmento ou mutante ou variante ativo da mesma, intensifica a resposta do interferon lambda ao virus.
    51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 50, caracterizado pelo fato de que a cepa NCIFB 42020 de Bifidobacterium longum ou derivado, ou fragmento ou mutante ou variante ativo da mesma, suprime a resposta do interferon tipo I ao virus.
    52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 51, caracterizado pelo fato de que a cepa NCIFB 42020 de Bifidobacterium longum ou derivado, ou fragmento ou mutante ou variante ativo da mesma, suprime a resposta do interferon alfa ao virus.
    53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 52, caracterizado pelo fato de que a cepa NCIFB 42020 de Bifidobacterium longum ou derivado, ou fragmento ou mutante ou variante ativo da mesma, suprime a resposta do interferon beta ao virus.
    54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 53, caracterizado pelo fato de que a cepa NCIFB 42020 de Bifidobacterium longum ou derivado, ou fragmento ou mutante ou variante ativo da mesma, intensifica a resposta da proteina associada a tensoativo D ao virus .
    55. Método para profilaxia ou tratamento de uma infecção bacteriana secundária em um indivíduo,
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    8/9 caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de administrar uma fração da parede celular isolada de Bifidobacterium longum NCIMB 42020 ou derivado, ou fragmento ou mutante ou variante ativo da mesma.
    56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 55, caracterizado pelo fato de que o virus é um virus respiratório.
    57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 56, caracterizado pelo fato de que o virus é selecionado de virus influenza, rinovirus e virus sincicial respiratório.
    58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 57, caracterizado pelo fato de que o individuo foi diagnosticado com uma doença pulmonar inflamatória.
    59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 58, caracterizado pelo fato de que o individuo tem susceptibilidade aumentada a uma infecção respiratória. 60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 59, caracterizado pelo fato de que o individuo é obeso. 61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 60, caracterizado pelo fato de que o individuo é um paciente com sindrome de desconforto respiratório agudo (SDRA). 62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 61, caracterizado pelo fato de que o individuo é um paciente com asma • 63. Método, de acordo com qualquer uma das
    Petição 870190084188, de 28/08/2019, pág. 86/120
    9/9 reivindicações 47 a 62, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um paciente com doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC).
    64. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 63, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é uma criança com menos de 5 anos de idade.
    65. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 64, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é uma pessoa idosa com mais de 60 anos de idade.
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