KR20100016012A - 프로바이오틱 비피도박테리움 스트레인 - Google Patents

프로바이오틱 비피도박테리움 스트레인 Download PDF

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KR20100016012A
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bifidobacterium
bifidobacterium strain
disease
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KR1020097022575A
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존 맥샤리
리암 오매호니
다비드 오술리반
바리 키엘리
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앨러멘터리 헬스 리미티드
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Abstract

비피도박테리움 스트레인 AH1206 또는 그것의 돌연변이 또는 변이체는 다음 구강 컨섬션(consumption) 후에 면역 조절성을 가지고, 예를 들어 염증성 장 질환 같은 의도하지 않은 장 염증 활동, 염증 활동의 예방 및/또는 치료에 유용하다.
비피도박테리움 스트레인(Bifidobacterium strains), 스트레인(strains), 프로바이오틱 박테리아(probiotic bacteria), 프리바이오틱 박테리아(prebiotic bacteria), 염증(inflammation)

Description

프로바이오틱 비피도박테리움 스트레인{Probiotic Bifidobacterium strains}
본 발명은 비피도박테리움 스트레인 및 프로바이오틱 박테리아로서 특히, 면역조절 바이오치료제로서 그것의 사용에 관한 것이다.
장 내의 박테리아에 의해 인간의 위장관을 이식으로부터 보호하기 위한 방어 메카니즘은 매우 복잡하고 면역학적 및 비 면역학적 특성들 모두를 필요로 한다(1). 내재적인 방어 메카니즘은 라이소자임과 같은 위, 담즙산염, 연동운동, 무친 층 및 항-세균의 합성물의 낮은 pH를 포함한다(2). 면역학적 메카니즘은 분화한 림프의 집합체들, 근원적인 M 세포들, 소장 및 대장의 전체에 걸쳐 분포된 페이어스 패치(peyers patches)라 불리는 것을 포함한다(3). 이들 사이트에서 제공된 루미날 항원들은 위장관 내로 사이토카인 네트워크의 정착 및 항체의 분비물과 함께 특유의 T 및 B 세포 부분 집합들의 시뮬레이션 결과이다(4). 게다가, 항원 제시는 상피 세포들을 통해 상피 내 림프구 및 근원적인 고유판 면역 세포들에 나타날 수 있다(5). 따라서, 숙주는 실제로 위장관의 면역학적 방어에 소비한다. 그러나, 위장의 점막은 숙주가 외부의 환경과 상호활동하는 매우 넓은 표면임에 따라, 특정한 제어 메카니즘은 평균 수명 이상의 위장관에 의해 처리된 100톤의 음식에 면역 반응을 규정하는 데에 위치되어야 한다. 더욱이, 장(gut)은 대장(colon)에서 1011-1012/g 박테리아 수의 500종을 넘을 때까지 이식된다. 따라서, 이들 제어 메카니즘은 침입 병원체로부터 비병원성 접착성 박테리아를 구별할 수 있으므로, 숙주에 중요한 손상의 원인이 된다. 사실, 장내의 플로라(intestinal flora)는 새로 섭취된 병원성 미생물과 잠재적으로 경쟁함으로써 숙주의 방어에 기여한다.
인간의 위장관에 존재하는 박테리아는 염증을 조장할 수 있다. 토착 마이크로 플로라(microflora)에 대한 변종 면역은, 염증성 장 질환과 같이, 일정한 질병 상태에 관련되어 진다. 일반적 플로라(normal flora)에 관련된 항원은 일반적으로 면역학적 내성의 원인이 되고 이 내성을 이루는데 결핍은 점막 염증의 주요 메카니즘이다(6). 내성에서의 이 쇠약(breakdown)에 대한 증거는 염증성 장 증후군(IBD)과 함께 환자의 장 플로라(gut flora)에 대비하여 향해진 항체 레벨의 증가를 포함한다.
본 발명은, 위장관으로부터 사이토카인 레벨을 조정 또는 전구염증성 미생물(pro-inflammatory micro-organisms)을 중화하고 방출함으로써, 면역조절 효과들을 가지도록 나타내진 비피도박테리움 스트레인을 위한 것이다.
본 발명에 따르면, 비피도박테리움 스트레인 AH1206(NCIMB 41382) 또는 그것의 돌연변이체 또는 변이체가 제공된다.
돌연변이체는 유전적으로 변경된 돌연변이체일 수 있다. 변이체는 비피도박테리움의 자연적으로 일어나는 변이체일 수 있다.
스트레인은 프로바이오틱일 수 있다. 생물학적으로 퓨어 컬쳐(pure culture)의 형태일 수 있다.
본 발명은 또한 비피도박테리움 NCIMB 41382의 분리된 스트레인을 제공한다.
본 발명의 한 실시형태에서, 비피도박테리움 스트레인은 생육할 수 있는 세포들의 형태이다. 대안적으로, 비피도박테리움 스트레인은 비생육 세포들의 형태이다.
본 발명의 한 실시형태에서, 비피도박테리움 스트레인은 유아 배설물로부터 분리되고, 비피도박테리움 스트레인은 구강 컨섬션 다음 인간의 면역조절을 암시적으로 나타낸다.
또한 본 발명은 본 발명의 비피도박테리움 스트레인을 포함하는 제형(formulation)을 제공한다.
본 발명의 한 실시형태에서, 제형은 다른 프로바이오틱 물질들을 포함한다.
본 발명의 한 실시형태에서, 제형은 프리바이오틱물질들을 포함한다.
보다 바람직하게, 제형은 인제스터블 운반체(ingestable carrier)를 포함한다. 인제스터블 운반체는 캡슐, 정제 또는 파우더와 같은 약학적으로 혀용된 운반체일 수 있다. 보다 바람직하게, 인제스터블 운반체는 산성화된 우유, 요구르트, 프로즌(frozen) 요구르트, 우유 파우더, 우유 농축물, 치즈 스프레드, 드레싱 또는 음료수와 같은 음식물이다.
본 발명의 한 실시형태에서, 본 발명의 제형은 단백질 및/또는 펩티드, 특히, 글루타민/글루타메이트, 지질, 탄수화물, 비타민, 미네랄 및/또는 미량원소가 풍부한 단백질 및/또는 펩티드를 더 포함한다.
본 발명의 한 실시형태에서 비피도박테리움 스트레인은 전달 시스템의 106 cfu/g 이상에서 제형으로 존재한다. 바람직하게, 제형은 보조제, 박테리아 구성요소, 약품 엔티티(drug entity) 또는 생물학적 화합물 중 어느 하나 또는 이상을 포함한다.
본 발명의 제형의 한 실시형태에서, 제형은 면역화(immunisation) 및 예방 접종 프로토콜(vaccination protocols)을 위한 것이다.
본 발명은 비피도박테리움 스트레인 또는, 바람직하지 못한 염증성 활동의 예방 및/또는 치료에서 사용을 위해, 천식과 같은 바람직하지 못한 호흡기 염증성 활동의 예방 및/또는 치료에서 사용을 위해, 염증성 장 질환과 같은 바람직하지 못한 장 염증성 활동의 예방 및/또는 치료에서 사용을 위해, 약물처럼, 예를 들면, 설사(diarrhoea)와 관련된 클로스트리듐 디피실리균(Clostridium difficile), 설사 또는 사후 감염 설사와 관련된 로타바이러스(Rotavirus)와 같이, 위장 암의 예방 및/또는 치료에서 사용을 위해, 류머트 관절염와 같은 조직의 질병의 예방 및/또는 치료에서 사용을 위해, 바람직하지 못한 염증성 활동에 의한 자기 면역의 장애의 예방 및/또는 치료에서 사용을 위해, 바람직하지 못한 염증성 활동에 의한 암의 예방 및/또는 치료에서 사용을 위해, 암의 예방에서 사용을 위해, 바람직하지 못한 염증성 활동에 의한 설사병의 예방 및/또는 치료에서 사용을 위해, E.coli와 같이, 전염성 병원체에 의한 설사병의 예방 및/또는 치료에서 사용을 위해, 식료품으로써 사용을 위한 본 발명의 제형을 더 포함한다.
또한, 본 발명은 비피도박테리움 스트레인 또는 바람직하지 못한 염증성 활동의 예방 및/또는 치료를 위한 항-염증성 바이오치료제의 준비에서의 사용을 위해 또는 바람직하지 못한 염증성 활동의 예방 및/또는 치료를 위한 항-염증성 바이오 치료제의 준비에서의 사용을 위한 본 발명의 제형을 포함한다.
본 발명의 한 실시형태에서, 본 발명의 스트레인은 위장관로부터 전구염증성 미생물을 중화하고 배척함으로써 활동한다.
또한, 본 발명은 비피도박테리움 스트레인 또는 전구-염증성 사이토카인의 레벨을 감소시키는 항-염증성 바이오치료제의 준비에 사용하기 위한 본 발명의 제형을 제공한다.
본 발명은 IL-10의 레벨을 조절하는 항-염증성 바이오치료제의 준비에서 사용하기 위한 비피도박테리움 스트레인을 더 제공한다.
또한 본 발명은 병원성 종의 성장을 중화(antagonise)하도록 그들의 능력에 기인하는 항-전염성 프로바이오틱로써 비피도박테리움 스트레인의 사용을 위해 제공한다.
또한 본 발명은 천식 및/또는 앨러지를 치료하는 약물의 준비로 비피도박테리움 스트레인의 사용을 위해 제공한다. 약물은 흡입제의 적당한 형태일 수 있다.
본 발명은 IgE 의 레벨을 감소시키는 항-염증성 바이오치료제의 준비에서 비피도박테리움 스트레인의 사용을 위해 더 제공된다.
비피도박테리움의 특정 스트레인이 시험관 내(in vitro)에서 면역조절 효과를 유도한다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 바람직하지 못한 염증성 반응 예를 들면, 천식 및/또는 앨러지와 같은, 조절이 곤란한 면역성 반응(dysregulated immune responses)의 예방 또는 치료에서 포텐셜 치료 값을 가질 수 있다.
비피도박테리움은 공생하는 미생물(commensal microorganisms)이다. 그것들은 인간의 위장관 내에 미생물의 플로라로부터 분리되어 있다. 위장관 내의 면역 시스템은, 만들어진 염증성 활동가 숙주 세포 및 조직 기능을 파괴하는 것처럼, 이 플로라의 원소에 대한 선언된 반응을 가질 수 없다. 따라서, 몇몇 메커니즘은 병원성 유기체와는 다른 위장의 플로라의 공생하는 비-병원성 원소를 인식할 수 있는 것이 존재한다. 이것은 숙주 조직에 대한 위험이 제한되고 방어의 장애가 여전히 유지되는 것을 확보한다.
비피도박테리움 롱굼 스트레인 AH1206의 기탁(deposit)은 2006년 3월 15일자 NCIMB에 되어지고 수탁 번호 NCIMB 41382로 수탁되었다.
비피도박테리움 롱굼은 유전적으로 변이된 돌연변이체이거나 그것의 자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다.
바람직하게 비피도박테리움 롱굼은 생육 가능한 세포의 형태이다.
대안적으로 비피도박테리움 롱굼은 비-생육 세포들의 형태일 수 있다.
본 발명의 특정한비피도박테리움 스트레인은 캡슐, 마이크로 캡슐, 정제, 과립, 파우더, 알약, 환약, 좌약, 현탁액 및 시럽과 같은 보통의 조제로서 경구적 섭취 형태로 동물(인간 포함)에 투약될 수 있다. 적절한 제형은, 보통의 유기물 및 비유기물 혼합제를 사용하여 일반적으로 채용된 방법에 의해 조제될 수 있다. 의약 합성물에서 활동적인 성분의 양은 소망의 치료 효과를 실행하는 레벨일 수 있다.
또한 제형은 세균성 성분, 약품 엔티티(drug entity) 또는 생물학적 합성물을 포함할 수 있다.
게다가, 본 발명의 스트레인을 포함하는 백신은 적절히 알려진 방법을 사용하여 조제될 수 있고 약학적으로 허용가능한 운반체 또는 보조제를 포함할 수 있다.
명세서에 걸쳐서, 돌연변이체, 변이체 및 유전적으로 변이된 돌연변이체의 용어는 환자 스트레인에 비해 유전 및/또는 표현형 성질이 변경된 피비도박테리아의 스트레인을 포함한다. 비피도박테리움 롱굼의 자연적으로 발생하는 변이체는 선택적으로 분리된 목표 성질의 자동적인 변경을 포함한다. 환자 스트레인 성질의 유도 변경은, 유전자 분열, 접합성 전이 등과 같이, 보통의(시험관 내의) 유전적 촉진 기술에 의해 이루어진다. 유전적 변이는 플라스미드 DNA 혹은 세균 분해 바이러스를 포함하는, 예를 들면, 담체에 의해 세균성 스트레인의 게놈(genome)으로 삽입에 의해, 비피도박테리아 스트레인의 게놈으로 외인성 및/또는 내인성 DNA 시퀀스의 이입을 포함한다.
자연의 혹은 야기된 돌연변이는 DNA 시퀀스에 의해 인코드된 아미노산 시퀀스의 변경의 결과로, 삭제, 삽입, 전위 또는 다른 DNA 변위와 같은 적어도 단일 염기 변경을 포함한다.
또한, 돌연변이, 변이체 및 유전적으로 변이된 돌연변이체의 용어는, 게놈의 계획적인(시험관 내의) 촉진에 의해 이루어지지는 않았지만 항생물질과 같은 환경의 압력에 노출될 때 박테리아의 생존을 지원하도록 선택의 이익을 제공하는 변이체 및/또는 돌연변이체의 자연적 선택을 통해 획득되어진 자연의 돌연변이 및/또는 유전자의 획득 및/또는 유전자의 손실을 통해 발생하는 모든 마이크로-유기체 및/또는 유전적 변경에 대해 사실상 일치하는 비율로 게놈에 축적하는 유전적 변경을 겪었던 비피도박테리아의 스트레인을 포함한다. 돌연변이체는 유기체의 생화학 기능을 본질적으로 바꾸지는 않았지만 생성물이 박테리아의 확인 또는 선택, 예를 들면 항생물질에 대한 내성을 위해 사용될 수 있는, 게놈으로 특정한 유전자의 계획적인(시험관의) 삽입에 의해 만들어질 수 있다.
비피도박테리아의 돌연변이체 또는 변이체 스트레인이 근원(parent) 스트레인으로 DNA 시퀀스 상동 분석에 의해 확인될 수 있는 것을 당업자는 이해할 수 있다. 근원 스트레인으로 근접한 시퀀스 동일성을 가지는 비피도박테리아의 스트레인은 돌연변이체 또는 변이체 스트레인이 되는 것이 고려된다. 근원 DNA시퀀스로 97%이상 혹은 98%이상 혹은 99%이상과 같이, 96%이상의 시퀀스 동일성(상동)으로 비피도박테리아 스트레인은 돌연변이체 또는 변이체 스트레인이 되는 것이 고려된다. 시퀀스 상동은, http://www.ncbi.nlm.nih,gov/BLAST/에서 공공연히 이용할 수 있는, 온-라인 상동 알고리즘 "BLAST" 프로그램을 사용하여 결정되어 진다.
또한, 근원 스트레인의 돌연변이체는 근원 스트레인의 16s - 23s 유전자간 간격(spacer) 폴리뉴클레오티드 시퀀스에 대해 적어도 95% 시퀀스 상동의 적어도 90% 시퀀스 상동과 같이 적어도 85% 시퀀스 상동을 가지는 유도된 비피도박테리아 스트레인을 포함한다. 이들 돌연변이체는 세균성 게놈에서 다른 DNA시퀀스로 DNA 돌연변이를 더 포함한다.
위장관으로부터 사이토카인 레벨을 조절하거나 전구-염증성 혹은 면역조절 마이크로-유기체를 중화하고 배척함으로써, 비피도박테리움 롱굼 스트레인 AH1206이 산 및 담즙 내성(tolerant)이고 위장관을 이동시킬 뿐만 아니라, 면역조절 효과를 놀랄 정도로 갖는 것을 발견하였다. 게다가, B. 롱굼 AH1206의 소모는 쥐과의 천식 모델의 폐에 대해 질병을 일으키는 세포의 모집을 중요하게 감소시킨다.
프로바이오틱 박테리아의 일반적인 사용은 생육할 수 있는 세포의 형태이다. 그러나, 죽은 배양균 혹은 프로바이오틱 박테리아에 의해 표현된 유익한 요소를 포함하는 조직과 같이 비-생육할 수 있는 세포들로 확장될 수 있다. 이것은 열에 의해 죽은 마이크로-유기체 혹은 변경된 pH에 노출 혹은 압력의 종속에 의해 죽은 마이크로-유기체를 포함한다. 비-생육할 수 있는 세포 생성물 조제는 간단하기 때문에, 세포들은 약물로 쉽게 혼합되어지고, 저장 필요물은 생육할 수 있는 세포들보다 훨씬 더 적게 제한된다. 락토바실러스 케이스아이(Lactobacillus casei) YIT 9018은, 미국특허 번호 US4347240에 기재된 바와 같이, 종양 성장의 치료 및/또는 예방을 위한 방법으로써 열로 죽이는 효과적인 방법의 예를 제공한다.
발명의 개개의 활동적인 구성요소는 단독으로 활용될 수 있지만 본래의 박테리아면역조절 효과를 발휘하도록 요구되는지는 알려지지 않았다. 일정한 박테리아 스트레인의 전구염증성 요소는 확인되었다. 그람 음성 박테리아의 전구염증성 효과는 리포폴리사카라이드(LPS)에 의해 전달된다. 단독으로 LPS는, 특히 단핵세포에서 CD14 수용체와 결합하는 LPS에 부분적으로 기인하는, 전구염증성 네트워크를 촉진한다. 프로바이오틱 박테리아의 성분은, 모든 세포의 효과에 기인하는 면역조절 활동성을 가지는 것으로 추측된다. 이들 구성성분의 분리에서, 약물 등급 조작이 예상된다.
IL-10은 T세포, B 세포, 단핵세포 및 대식세포에 의해 생산된다. 이 사이토카인은 증식(proliferation) 및 항체 분비 세포로의 B세포의 분화를 증대시킨다. IL-10은 주로 항-염증성 활동성을 나타낸다. 그것은 단핵세포에 의해 IL-1RA 과정을 상향 조정하고 단핵세포 염증성 활동성의 대부분을 억제한다. IL-10은 사이토카인, 반응성 산소 및 질소 중간물의 모노서티(monocity) 생성물, MHC 클래스 II과정, 기생충 죽음 및 피드백 메커니즘을 통한 IL-10 생성물을 저해한다(7). 또한, 이 사이토카인은 PGE2-cAMP 종속물 경로와 간섭함으로써 장의 교원질분해효소 및 타입 Ⅳ 교원질 분해효소의 단핵세포 생성물을 차단하도록 나타냈고 따라서 만성 염증성 질병에서 보인 연결하는 조직 파괴의 중요한 조정자일 수 있다.
전염에 대한 숙주는 선천척 및 후천적인 세포질과 체액의 면역 반응에 의해 특징화되고, 거스르는 유기의 확장을 제한하고 기관지의 항상성을 복원하도록 요구된다. 그러나, 숙주 조직에 대한 부수적인 위험의 공격성을 제한하기 위하여, 조절 규제의 범위는 활성화된다. 조절 T 세포(Tregs)는 하나의 이러한 메커니즘을 제공한다. 이것들은 창자 점막을 포함하는, 흉선으로부터 획득되지만 또한 말초의 기관지에서 촉진될 수 있다. 조절 T 세포들의 계획적인 관리는 실험용 자기 면역의 뇌척수염을 포함하는 쥐과 모델의 넓은 범위에서 염증성 질병, 염증성 장 질병, 박테리아-유도 대장염(bacterial-induced clitis), 콜라겐-유도 관절염, 타입 Ⅰ 당뇨병, 기관 호산구 염증, 이식 조직-대-숙주 질병 및 기관지 이식을 억제한다. 포크헤드(Forkhead) 전사 인자 Foxp3(forkhead box P3)은 조절 T 세포들에서 선택적으로 표현되고, 조절 T 세포 발생 및 기능에 대해 요구되고, 형식적인 CD4 세포들에서 조절 T 세포 표현형을 일으키는데 충분하다(19). Foxp3에서 돌연변이는 인간 및 생쥐 양쪽에서 위중한 멀티-기관지 자가면역을 일으킨다.시험관에서 CD25 양성/Foxp3 양성 T 조절 세포들을 생성하는 비피도박테리움 스트레인을 기술하였다.
도 1은, B. 롱굼 AH1206에 대한 BOX PCR (bioanalyser) 바코드 프로필이다. 염기쌍 크기는 에질런트(Agilent) 2100 소프트웨어를 사용하여 결정된다.
도 2는, 8일의 공급기간에 걸쳐 B. 롱굼 AH1206의 배설물 회수를 나타내는 그래프이고 AH1206이 쥐과의 위장관에서 생존할 수 있는 것을 증명한다.
도 3은, 인간의 PBMCs에 의해 IL-10 사이토카인 생성에 B. 롱굼 AH1206의 효과를 나타내는 바 그래프이다. 결과들은 평균 +/- SE(n=6)로서 표현된다.
도 4는, 항원에 민감해진 생쥐들의 폐에 대한 호산구 모집을 공급하는 B. 롱굼 AH1206의 효과를 나타내는 바 그래프이다. (a) 기관지폐포 세척(BAL)에서 제공된 세포의 총 수는 AH1206 페드(fed)된 쥐에서 감소되고, (b) 다른 세포는 세포 수에서 감소가 호산구 개체수에서 최초인 것이 알려진 BAL에 기대한다.(세포 수는 y-축(x104)에 표현된다; 위약(placebo) 대 *p<0.05)
도 5a 및 5b는, 항원에 민감해진 동물에서 난백알부민(OVA) 공격을 따르는 기관지 폐포 세척액 내의 총 세포에서 프로바이오틱 박테리아 스트레인 AH1206(A) 및 위약(placebo)(B)의 효과를 나타내는 그래프이다(n=10/그룹, OVA 단독 공격에 비교하여 *=p<0.05)
도 6a 및 6b는, OVA 혹은 염수(saline)로 비강 챌린지 후에 24시간 동안 난백 알부민(ovalbumin, OVA)-항원에 민감해진 생쥐의 향상된 휴지(Penh)에서 변경에 의해 평가된 바와 같이, 메타콜린(methacholine)에 대한 기관 내 튜브 응답에서 프로바이오틱 박테리아 스트레인 AH1206 (A) 및 플라시보 (B) 치료의 효과를 나타내는 그래프이다. 각각의 데이터 포인트는 평균 ±SEM을 나타낸다.(n=10/그룹, 단독 OVA와 비교하여 *p=<0.05)
도 7은, 난백 알부민(OVA)-항원에 민감해진 생쥐로부터 기관지폐포 세척(BAL)액에서 TNF 사이토카인 레벨을 나타내는 그래프이다. 각각의 열은 평균 ±SEM을 나타낸다.(n=10, 공격받은 OVA와 비교하여 *p<0.05, MRS broth 처리된 제어)
도 8a 및 8b는, OVA-항원에 민감해진 생쥐로부터 분리된 활성화된 스프레노사이트(splenocytes)로부터 프로바이오틱 스트레인 AH1206 TNF (A) 및 IFN (B) 사이토카인 생성물로 구강 치료의 효과를 나타내는 그래프이다. 각각의 열은 평균 ±SEM을 나타낸다.(n=10, 공격받은 OVA와 비교하여 *p<0.05, MRS broth 처리된 제어)
도 9는, 쥐 페드(fed) AH1206 프로바이오틱 박테리아로부터 분리된 혈청에서 OVA-특정한 lgE의 레벨이 비- 프로바이오틱 페드(fed) 콘트롤보다 낮은 것을 나타내는 그래프이다.(**p=<0.01)
도 10은, OVA-항원에 민감해진 생쥐로부터 분리된 활성화된 splenocytes로부터TNF α 생성물에서 프로바이오틱 스트레인 AH1206의 구강 치료의 효과를 나타내는 그래프이다(스프레노사이트가 자극된 CD3/CD28). 평균은 각각의 그룹에 대해 설명된다.( *p=<0.05, OVA 및 CT 공격과 비교하여 **p=<0.01, MRS broth 처리된 제어)
도 11은, AH1206 fed 동물로부터 CD4 + CD25 + 세포가 실질적으로 증식을 감소시킨 것을 설명하는 그래프이다(n=20에서, 제어를 제외한 모든 그룹에 대해서 n=10)
도 12a 및 12b는, 다음의 세포계산에 의해 평가된 바와 같이(페드되지 아니한(unfed) 그룹에 대한 n=11, 위약 그룹에 대한 n=20, 그리고 AH1206 페드(fed) 그룹에 대한 n=10), CD4+ 개체수 또한 CD25+에서 세포의 퍼센트를 나타내는 그래프이다.
도 13에서, 전사 요인(transcription factor) Foxp3을 나타내는 CD4/CD25+ 세포의 퍼센트는 AH1206을 소비하는 무균 쥐에서 중요하게 증가된다. *p<0.05 대 placebo
도 14는, 3개월에 걸쳐 프로바이오틱 스트레인 AH1206의 안정성을 설명하는 그래프이다.
본 발명은 이하의 예들로부터 더욱 명확하게 이해될 것이다.
예 1 : 유아 배설물( infant faces )로부터 분리된( isolated ) 박테리아의 특성화( characterisation ). 프로바이오틱 특성( traits )의 증명.
프로바이오틱 박테리아의 분리( Isolation of probiotic bacteria )
신선한 배설물(fresh faeces)이 생후 2일째의 모유수유 남아(male breast fed infant)로부터 얻어지고 연속적으로 희석액은 TPY(프립티케이즈(trypticase), 펩톤(peptone) 및 효모 추출물) 및 0.05% 시스테인(cystein) 및 뮤피로신(mupirocin)이 부가된 MRS(deMann, Rogosa 및 Sharpe) 미디아(media)에 이식되었다. 플레이트는 CO2 발생키트(Anaerocult A, Merck)를 이용하여 37℃에서 2-5일간 혐기성 용기(anaerobic jar)(BBL, Oxoid) 내에서 배양되었다. 그람 양성(gram positive), 카탈라아제 음성(catalase negative) 막대형(rod-shape) 또는 분기된/다형태성(bifurcated/pleomorphic) 박테리아 분리체가 순도를 위하여 복합 비선택성 중막(complex non-selective media)(MRS 및 TPY) 상에 스트릭되었 다(streaked). 분리체는 혐기성 조건하에서 37℃의 상태에서만 MRS 또는 TPY 중막에서 일정하게 배양된다. 추정에 의한 비피도박테리움는 40% 글리세롤 내에 스톡(stock)되고 -20℃ - -80℃에서 저장(store)된다.
명칭 AH1206이 할당된, 순수 비피도박테리아 스트레인(pure bifidobacteria strain)의 분리에 이어서, 미생물학적 특징(microbiologicl characteristics)이 이하의 표 1에 평가 및 요약되어 있다. AH1206은 비피도박테리아로서 그 동일성(identity)을 확인하는 프럭토오스-6-포스페이트 포스포케토레티즈(Fructose-6-Phoshate Phosphoketolase) 양성(positive)의, 그람 양성, 카탈라아제 음성 다형태형 박테리아(pleomorphic shape bacterium)이다. 단일 탄소 공급원이 삽입된 최소 미디움(minimal medium)을 이용하여, AH1206은 시험된 모든 탄소 공급원에서 성장할 수 있다(글루코오스, 락토오스,리보오스,아라비노오스, 갈락토오스,라피노오스, 프럭토오스, 맬트 추출물, 만노오스, 말토오스, 수크로오스).
Figure 112009066129209-PCT00001
종의 확인( Species identification )
16s 유전자간 간격(spacer) (IGS) 시퀀싱은 분리된 비피도박테리아의 종을 확인하기 위해 수행된다. 간단하게는, 100㎕의 추출액(Extraction Solution) 및 25㎕의 조직 조합액(Tissue Preparation solution)(Sigma, XNAT2 Kit)을 이용하여 AH1206으로부터 DNA가 분리된다. 샘플들은 95℃에서 5분 동안 배양되었고 그 후 100㎕의 중화액(Neutralization Solution)(XNAT2 Kit)이 첨가되었다. 게노믹 DNA 용액은 나노드롭 스펙트로포토미터(Nanodrop spectrophotometer)를 이용하여 계량되고(quantified) 4℃에서 저장되었다. PCR은 IGS primer, SEQ ID NO. 1에 근거하는 IGS L: 5'-GCTGGATCACCTCCTTTC-3' (SEQ ID NO. 3) 및 SEQ ID NO. 2에 근거하는 IGS R: 5'-CTGGTGCCAAGGCATCCA-3' (SEQ ID NO. 4)를 이용하여 수행되었다.순환 조건(cycling conditions)은 94℃에서 3분간(1 cycle), 94℃에서 30초간(1 cycle), 53℃에서 30초간, 72℃에서 30초간(28 cycle)이었다. PCR 반응(PCR reaction)은 4㎕(50ng)의 DNA, PCR 믹스(mix)(XMAT2 kit), 0.4uM IGS L 및 R 프라이머(primer)(MWG Biotech, 독일)를 포함한다. PCR 반응은 에펜도르프 (Eppendorf) 반응기에서 수행되었다. PCR 생성물(10㎕)은, IGS 프로파일(profile)을 결정하기 위해 TAE 내의 2% 아가로오스(agarose) EtBr 스트레인된 젤 상에 몰 질량 마커(molecular weight marker)를 인접하여 실행되었다. 비피도박테리움(단일 결합)의 PCR 생성물은 프로메가 위자드 PCR 정화 키트(Promega Wizard PCR purification kit)를 이용하여 정제되었다. 정제된 PCR 생성물은 유전자간 간격 지역(intergenic spacer region)에 대하여 프라이머 시퀀스(상기)를 이용하여 배열되었다. 시퀀스 데이터는 그 후 뉴클레오티드 상동관계(neucleotide homology)에 의해 스트레인의 동일성(identity of the strain)을 결정하기 위해 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스(NCBI neucleotide database)에 대하여 검색되었다. 결과로서의 DNA 시퀀스 데이터는 NCBI 표준 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 상동관계 BLAST 검색엔진(NCBI standard nucleotide-to-nucleotide homology BLAST search engine) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)에 제출되었다. 시퀀스에 가장 근접한 쌍(match)이 확인되었고 그 후 시퀀스는 DNASTAR MegAlign 소프트웨어를 이용한 비교를 위해 정렬되었다. 얻어진 시퀀스는 SEQ ID NO. 1이 IGS 포워드 시퀀스이고 SEQ ID NO. 2가 IGS 리버스 시퀀스인 시퀀스 리스트에서 확인할 수 있다. NCIMB 데이터베이스를 검색은 AH1206이 비피도박테리움 롱굼에 그것의 가장 근접한 시퀀스 상동관계(closest sequence homology)와 함께 유일한 IGS 시퀀스를 가진다는 것을 드러낸다.
AH1206에 대한 바코드 PCR 프로파일(barcode PCR profile)을 개발하기 위해, PCR은 BOX primers(8)를 이용하여 수행된다. 순환조건(cycling condition)은 94℃에서 7분간(1 cycle), 94℃에서 1분간; 65℃에서 8분간, 94℃에서 1분간,(30 cycles) 및 65℃에서 16분간이었다. PCR 반응은 50ng의 DNA, PCR 믹스(XNAT2 kit) 및 0.3μM BOXAIR 프라이머(5'-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3')(SEQ ID No. 5)(MWG Biotech, 독일)를 포함한다. PCR 반응은 에펜도르프 반응기에서 수행되었다. PCR 생성물(1㎕)은 DNA 7500 LabChip® on the Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent, 독일)를 이용하여 몰질량 마커(molecular weight marker)(DNA 7500 ladder, Agilent, 독일)를 인접하여 실행되었다. 바코드(PCR 생성물 프로파일(PCR priduct profile))은 피크 넘버(PCR 생성물)와 사이즈가 확인된 에질런트 바이오애널라이저 소프트웨어를 이용하여 결정되었다. (도 1)
항생감도 프로파일( Antibiotic sensitivity profiles )
B. 롱굼 스트레인의 항 biotic sensitivity profiles은 '디스크 감수성' 평가('disc susceptibility' assay)를 이용하여 결정된다. 배양균(cultures)은 적절한 배양약 미디움 내에서 24시간 내지 48시간 동안 한천 중막(agar medium) 위에 살포되어(100㎕) 성장하였고 알려진 항생물질의 농도를 함유하는 디스크가 한천 위에 위치되었다. 스트레인은 혐기성 조건(anaerobic conditions) 하에서 37℃에서 1-2일간 배양 후에 항생감도에 대하여 검사되었다. 스트레인은 1mm 이상의 억제구역(zone of inhibition)이 관찰되면 민감성(sensitive)인 것으로 여겨진다. 각각의 항생물질에 대한 최소 억제제 농도(minimum inhibitory concentration)(MIC)는 독립적으로 평가되었다. 클라인더마이신(clindamycin), 반코마이신(vancomycin) 및 메트로니다졸(metronidazole)에 대한 MIC는 각각 0.32, 0.75 및 0.38이었다.
장내 통과( Intestinal transit )
비피도박테리움 롱굼이 위장 내에서 발견되는 것과 동등한 낮은 pH값에서 생존할 수 있는지를 결정하기 위해, 박테리아 세포(bacterial cells)가 새로운 오버나이트 배양균(fresh overnight cultures)으로부터 수확되었으며, 인산염 버퍼(phosphate buffer)(pH 6.5) 내에서 2번 세척되고 pH 2.5로(1M HCl로) 조정된 TPY 배양액에 다시 부유되었다. 세포들은 37℃에서 배양되었고 5, 30, 60 및 120분 간격으로 플레이트 계수법(plate count method)을 이용하여 생존이 측정되었다. AH1206은 pH 2.5에서 5분간 잘 생존한 반면 30분 후에는 생육가능한(viable) 세포는 발견되지 않았다.
위장(stomach)을 빠져나가자마자, 추정의 프로바이오틱물질은 장(intestine)에서 담즙염(bile salts)에 노출된다. B.롱굼의 담즙 노출에 대한 생존능력을 결정하기 위해, 배양균은 0.3%(w/v), 0.5%, 1%, 2%, 5%, 7.5% 또는 10% 돼지 담즙(porcine bile)이 첨가된 TPY 한천 플레이트(agar plate)에 스트릭되었다(streaked). B.롱굼 AH1206 성장은 1%까지(up to 1%) 담즙을 함유하는 플레이트 상에서 관찰되었다.
쥐과 모델(murine model)에서, B.롱굼 AH1206의 위장관(gastrointestinal tract)을 통과하는 능력이 평가되었다. 쥐들은 매일 1×109 AH1206을 소비하였고 배설물 덩어리(faecal pellet)는 공급된 미세유기물(fed micro-organism)의 존재에 대하여 검사되었다. AH1206의 검출은 공급된 리팜피신 내성 비피도박테리아(rifampicin resistant bifidobacteria)만이 배양된 것으로 보증된(ensured) 이동(transit)을 평가하기 위해 사용된 TPY 플레이트 내에 리팜피신의 비피도박테리아 혼성체(bifidobacteria incorporation of rifampicin)의 자발적 리팜피신 내성 변이체(spontaneous rifampicin resistant variant)를 분리함으로써 촉진된다. 배설물 샘플들(faecal samples)은 매일 수집되었고 위장관을 통한 B. 롱굼 이동이 확인되었다(도 2).
항미생물 활동( anti - microbial activity )
본 연구에서 사용된 지시자 병원성 미세유기물(indicator pathogenic micro-organisms) 다음의 성장조건(growth condition)하에서 이하의 중막에서 번식되었다(propagated): 0.6% 효모 추출물(TSAYE, Oxide)가 첨가된 Tryptone Soya broth/agar 내의 Salmonella typhimurium(37℃, 호기성(aerobic)), Campylobacter jejuni(37℃, 혐기성(anaerobic)) 및 Blood agar medium 상의 E. coli O157:H7(37℃, 혐기성(anaerobic)), 강화된 클로스트리디얼 미디움(RCM, Oxoid) 내의 Clostridium difficile(37℃, 혐기성). 모든 스트레인은 새로운 성장 미다움(fresh growth medium)에 주입되었고 실험에 사용되기 전에 하룻밤 동안(overnight) 성장되었다.
항미생물 활동은 다른 방법(9)을 이용하여 검출되었다. 간단하게는, B. 롱굼 AH1206은 36-48시간 동안 배양되었다. TPY 하한천 중막(argar medium) 상에 텐 폴드 시리얼 희석액(ten-fold serial dilutions)이 살포되었다(100㎕). 하룻밤 동안의 배양(overnight incubation) 후에, 별개의 군체(distinct colonies)를 가지는 플레이트가 지시자 박테리아에 덮어 씌워졌다. 지시자 론(indicator lawn)은 배양된 TPY 플레이트의 표면에 걸쳐 부어진 2%(v/v)의 오버나이트 지시자 배양균을 용해된 오버레이(molten overlay)에 주입함으로써 마련된다. 플레이트는 지시자 박테리아의 성장에 적합한 조건 하에서 하룻밤 동안 재배양된다. 1mm 이상의 억제구역(inhibition zone)을 가지는 지시자 배양균은 테스트 박테리아(test bacterium)에 대하여 민감성인 것으로 여겨진다. B. 롱굼 AH1206은 살모넬라 티피무리움(salmonella typhimurium), 캠피로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 대장균(E. coli) O157:H7 및 클로스트리듐 디피슬(Clostridium difficile)의 각각에 대하여 14, >80, 13.33 및 17mm를 측정하는 제거구역(zones of clearing)에서, 검사된 모든 병원성 유기물의 성장을 억제하였다.
예 2 : B. 롱굼에 대한 응답에서 PBMCs 에 의한 사이토카인 산출물
말초 혈액(peripheral blood) 모노뉴클리어 세포(mononuclear cells)(PBMCs)는 건강한 제공자로부터 밀도 경사 원심분리(density gradient centrifugation)에 의해 분리된다. PBMCs는 프로바이오틱 박테리아 스트레인으로 37℃에서 72시간 주기로 자극되었다. 이때 배양균 상청액(culture supernatants)이 수집되고, 원심분리되며, 시토메트릭 비드 배열(cytometric bead array)(BD BioScience)을 이용하여 IL-10 레벨에 대하여 평가될 때까지 -70℃에서 저장되었다. AH1206은 이러한 배열이 생체 내에서(in vivo) 항염인자(anti-inflammatory agent)로서 유용할 수 있음을 암시하는 인간 PBMCs(도 3)에 의해 항염 사이토카인 IL-10의 중요한 분비를 유도하였다.
예 3 : 천식의 쥐 모델에서 B. 롱굼 AH1206 은 호흡기 질병을 감쇠시킨다
본 연구는 알러지성 기관 염증(allergic airway inflammation)의 쥐 모델에 민감화된 Balb/c 난백알부민(OVA)를 활용하였다. 쥐들은 OVA의 i.p. 주입에 의해 민감화되었고 질병은 OVA의 비강내 주입(intranasal challenge)에 의해 개시되었다. 마지막 주입의 24시간 후(15일째) 쥐들은 BAL 절차에 의해 이어지는(followed) 기관 감응성(airway responsiveness)의 측정에 투입되었다. OVA 민감화된(OVA-sensitized), 염수 주입된(saline challedged) 쥐들은 대조군(controls)으로서 기능하였다. 1일째 개시시(즉, 첫 번째 OVA 민감화 시)에, 동물들은 위관 바늘(gavaging needle)을 통하여 연속으로 14일간 B. 롱굼 AH1206을 투여받았다. MRS 배양액으로 위관영양된 동물들은 대조군으로서 기능하였다.
기관 염증은 기관지폐포 세척(BAL) 유동체 내의 염증성 세포 계수(inflammatory cell counts)에 의해 평가되었다. 세포들은 원심분리에 의해 BAL 유동체로부터 제거되었고 세포들은 포스페이트-버퍼된 염수(phosphate-buffered saline)(1 ml) 내에 다시 부유되었다. BAL 세포들은 트립판 블루 (trypan blue)로 염색되었고, 생존가능한 세포들은 혈구계산기를 이용하여 계수되었다. BAL 세포들의 얼룩(smears)은 사이토스핀(Cytospin)(Thermo Shandon, Pittsburgh, PA)으로 마련되었고 차별적인 세포 계수(differential cell counts)에 대하여는 HEMA 3 시약(Biochemical Science, Swedesboro, NJ)으로 오염되었으며, 총 200개의 세포들이 각 세척(lavage)에 대하여 계수되었다. B. 롱굼 AH1206의 컨섬션(consumption)는 호산구 개체수(eosinophil population)에서 보여지는 이러한 차이의 대부분과 함께 위약으로 비유되는 총 BAL 수를 현저하게 감소하였다(도 4).
본 연구는 프로바이오틱 박테리아 스트레인 비피도박테리움 롱굼 AH 1206이 알러지성 기관 염증의 쥐 모델에 민감화된 OVA 내에서 알러지성 반응을 억제하는지에 대하여 더욱 조사하기 위해 반복되었다. 간단하게는, 성숙한 수컷 BALB/c쥐(성체 수컷 BALB/c 쥐)가 OVA 0일째 및 6일째의 i.p. 주입에 의해 민감화되었다. 12일째 및 14일째에, 쥐들은 OVA로 비강으로 투여되었다. 마지막 투여 24시간 후(15일째), 쥐들은 BAL 절차에 의해 이어지는 기관 반응성의 측정에 투입되었다. OVA/alum 민감화된(OVA/alum-sensitized), 염수 투여된(saline-challenged) 쥐들은 대조군으로서 기능하였다. 동물들은 시험(trial)을 통하여 프로바이오틱 또는 위약을 투여받았다. 기관 염증(사이토카인(cytokine) 및 세포 수(cell counts))은 기관지폐포 세척(BAL) 유동체 내의 염증성 세포 수에 의해 평가되었다. 기관 반응성은 또한 벅스코(Buxco) 전신 체적 변동 기록계를 이용하여 측정되었다. 스프레노사이트(splenocytes)는 또한 OVA 민감화된 쥐로부터 분리되었고 항-CD3 및 항-CD28 항체의 존재 내에서 사이토카인 레벨이 플로우 혈구계산에 의해 상청액(supernatants) 내에서 측정된 후에 배양되었다.
B. 롱굼 AH1206 치료는 배양액 페드(fed) 동물과 비교하면, OVA 투여에 이어지는 BAL 유동체로부터 회복되는 세포 내의 현저한 감소의 결과를 나타낸다(도 5). 기관 반응성은 측정되었고 OVA의 민감화된 쥐들에의 투여는 염수 투여 쥐들에 비하여 메타콜린(methacholine)에 대한 AHR의 향상(enhancement)의 결과를 나타낸다. 그러나 향상된 휴지(pause)의 변화에 의해 평가되는 바와 같은, 이러한 메타콜린(methacholine)에 대한 향상된 기관 반응성의 조절(modulation)은 발견되지 않았다(도 6).
BAL 사이토카인 레벨은 혈구계산 비드 어레이(bead array)에 의해 측정되고 IL-1O, IFN-γ IL-6 및 CCL2 레벨에 대한 현저한 차이는 나타나지 않았다. AH1206은 OVA 대조군에 비하여 TNF-α레벨을 현저하게 감소한다(도 7).
스프레노사이트 상청액(splenocyte supernatants) 내의 사이토카인 레벨은 생체 내 OVA 또는 항-CD3 항-CD28 자극에 이어지는 혈구계산 비드 어레이(bead array)에 의해 계량된다. OVA 자극 스프레노사이트로부터 방출되고 생체 내 OVA 민감화(in vivo sensitization)에 관련된 증가된 IL-10은 AH1206 급여 쥐들에서는 관찰되지 않았다. IL-6, TNF 및 MCP-1(CCL2) 레벨에서는 현저한 차이가 없었다. CD3/CD28 스프레노사이트로부터 방출되는 IL-10은 AH1206 급여 동물에서는 증가하지 않았다. 그러나 전구-염증성 사이토카인 TNF-α 및 IFN-γ의 분비는 AH1206 급여 동물의 스프레노사이트 배양 상청액(splenocytes culture supernatants)에서 현저하게 감소하였다(도 8). 측정된 다른 사이토카인에 대하여는 현저한 변화는 나타나지 않았다.
예 4 : OVA 피딩 모델
본 연구의 목적은 프로바이오틱 박테리아, 비피도박테리움 롱굼 AH1206이 난백알부민(OVA) 주입된 알러지 쥐 모델에서 알러지성 반응을 억제하는지를 조사하기 위한 것이었다. BALB/c 쥐들은 그룹으로 나누어지고(8/그룹) Placebo, 비피도박테리움 롱굼 AH1206 및 증류된 H2O가 4주간 페드(fed)되었다. 모든 쥐들은 오직 대조군으로서 300㎕의 PBS로 경구로 위관영양(gavaged)된 하나의 dH2O 그룹을 제외하고, 난백알부민 및 콜레라 톡신(Cholera Toxin)이 300㎕의 PBS로 경구로 주 1회 위관영양 되었다. 4주간의 치료 후에, 인접 정맥 천공(facial vein puncture)을 통하여 각 쥐로부터 혈액 샘플이 수집되었고 OVA-특이 IgE 레벨을 측정하기 위해 이후 ELISA가 수행되었다. 비장(spleens) 및 장간막 림프 결절세포들(mesenteric lymph node cells)은 분리되고 LPS와 CD3/CD28 및 면역우성 OVA 펩티드로 시험관 내에서 자극되었다. Th1 및 Th2 사이토카인은 혈구계산 CBA에 의해 측정되었다.
위약 및 양성(positive) 대조군 그룹에 비하여 프로바이오틱 페드(fed) 그룹에서 현저하게 적은 OVA-특이 IgE가 유도되었다(도 9). 음성(negative) 대조군 그룹 및 AH1206 페드(fed) 그룹은 AH1206 페드(fed)가 OVA-특이 IgE 반응의 유도를 완전하게 억제함을 암시하는 것에서 다르지 않았다. 통계는 언페어드 T 테스트(unpaired T test)를 이용하여 이루어졌다.
스프레노사이트는 프로바이오틱, 위약 및 dH2O 페드(fed) BALB/c 쥐들 및 자극되지 않았거나 LPS, 항CD3/CD28 및 면역우성 OVA 펩티드로 자극된 쥐들로부터 분리되고 그 후 Th1/Th2 혈구계산 비드 어레이(bead array)에 의해 TNF-α, IL-2, IFN-γ, IL-4 및 IL-5의 사이토카인 산출물에 대하여 분석된다. 사이토카인 결과는 표 2에 정리되어 있다.
Figure 112009066129209-PCT00002
자극받지 않은 스프레노사이트에 있어서, 대조군 동물들과 비교하여 교체은 관측되지 않았다. LPS 자극된 스프레노사이트로부터 방출된 TNF-α 및 IFN-γ는 음성 대조군에 비하여 AH1206 페드(fed) 동물들에 대하여 현저하게 크지만, 이러한 레벨은 OVA 민감화되고 콜레라 톡신(cholera toxin)이 투여된 양성 그룹으로 관측되는 것과 일치한다. CD3/CD28 자극은 프로바이오틱 페드(fed) 그룹에서 림프구 신호(lymphocyte signaling)의 의미깊은 교체(profound alternation)를 드러내었다. AH1206 페드(fed) 동물들은 양성 그룹에 비하여 현저하게 낮은 TNF-α를 분비하였으나 레벨은 음성 대조군에 비하여 높았다(도 10). AH1206 페드(fed) 동물들은 비-프로바이오틱 페드(fed) 양성 대조군에 비하여 현저하게 낮은 레벨의 IFN-γ, IL-2, Il-4 및 IL-5를 가졌다.
예 5 : 조절 T 세포( Treg ) 이펙터 모델
본 연구는 조절 T 세포 번호 및 건강한 쥐의 활동에서 프로바이오틱 소비의 효능을 조사하기 위한 것이다. BALB/c 쥐들(10/그룹)은 비피도박테리움 롱굼 AH1206 또는 placebo가 3주간 페드(fed)되었다. 이하의 프로바이오틱/위약 소비, CD4 + CD25 + T-조절 세포는 분리되고 그들의 시험관 내 억제 활동은 플로우 혈구 계산을 이용하여 항-CD2/CD28 자극된 CFSE-표시된 CD4 + 응답자(responder) T 세포의 증식을 측정함으로써 결정되었다. CD4 + 응답자 T 세포는 CD4 + CD25-T 세포와 함께 대조군으로서 공동배양되었다. 또한 FoxP3 양성인 쥐과의 스프레노사이트에서 CD4 + CD25 + 세포들(조절 T 세포)의 퍼센티지는 프로바이오틱 또는 위약 페드(fed) 쥐들의 비장(spleens)에서 결정되었다.
프로바이오틱/위약 페드(fed) 쥐들로부터 CD4 + CD25 + 세포들과 함께 공동배양되었을 때 증식된 CD4+ 세포들의 %가 동일한 시험쥐들로부터 CD4 + CD25 세포들과 공동배양되었을 때 증식된 CD4+ 세포들의 %와 비교되었다. 각각의 경우에서, 세포 증식은 CD4 세포들만 포함하고 방혈된(depleted) CD25+ 세포들을 포함하는 배양균에 비하여 CD4 + CD25 + 세포들을 포함하는 배양균에서 더 적었다.(도 11)
또한 CD25+이었던 CD4+ 개체군(population)의 세포들의 %가 결정되었다(도 12). 비피도박테리움 롱굼 AH1206 페드(fed) 그룹은 CD25+(즉, T-조절 세포)이었던 CD4+T 세포들을 위약 페드(fed) 대응군(counterparts)(p=0.0081)보다 현저하게 더 많이 가졌다. 이는 CD4+ 개체군 내의 T-조절 세포의 %가 AH1206을 페드(fed)함으로써 현저하게 증가되었음을 암시한다.
프로바이오틱 또는 위약 페드(fed) 쥐들의 스프레노사이트 개체군 전체에서 CD4 + CD25 + FoxP3 + 세포들이 수가 또한 결정되었다. FoxP3를 표현하는(expressing) CD4 + CD25 + T-조절 세포의 수는 위약 또는 비-페드(fed) 쥐들에 비하여 프로바이오틱 페드(fed) 쥐들의 비장(spleen)에서 변화되지 않았다.
예 6 : 무균 모델
생후 6주의 무균 쥐들이 구매되었고 UCC의 생물학 서비스부(biological service unit)의 무균 장치(germ-free unit)에 유지되었다. 동물들은 프로바이오틱 스트레인 비피도박테리움 롱굼 AH1206이 14일간 페드(fed)되거나 무균상태로 유지되었다. T 조절 세포의 주입은 플로우 혈구 계산에 의해 평가되었다.
AH1206 페드(fed) 무균 동물들의 비장 내의 CD4 + CD25 + Foxp3 + 세포들의 수는 피딩(feeding)을 따라 현저하게 증가되었다(도 13). 총 CD3/CD4 또는 CD3/CD8 수(counts)는 불변인 채로 유지되었다.
예 7 : 안정성 결과
프로바이오틱 스트레인-AH1206의 안정성은 30℃에서 3개월에 걸쳐 평가되었다(도 13).
이러한 결과는 락토바실러스 라모수스(Lactobacillus rahmosus) GG가 3개월의 기간에 걸쳐 2 대수 드롭으로 시험기간에 걸쳐 열등한 실행자(poor performer)였던 반면 AH1206은 기간에 걸쳐 생존능력(viability) 손실이 기록됨이 없이 매우 안정적이었다.
면역조절( Immunomodulation )
인간의 면역체계(human immune system)는 방대한 범위의 인간 질병의 병인학(aetiology) 및 병리학(pathology)에서 중요한 역할을 수행한다. 하이퍼(hyper) 및 하이포(hypo)- 면역(immune) 반응성은, 대부분의 질병 상태의 결과이거나, 또는 구성요소(component)이다. 사이토카인이라 칭해지는 생물학적 엔티티(biological entities)는, 면역 프로세스의 제어에 특히 중요하다. 이 민감한 사이토카인 네트워크의 퍼튜번스(pertubance)는 점점 많은 질병들과 관련되어지고 있다. 이 질병들은 염증성 장애, 면역결핍, 염증성 장 질환, 과민성 장 증후군, 암(특히 위장 및 면역계의 것), 설사병, 설사와 관련된 항생물질, 소아과의 설사(paediatric diarrhoea), 충수염, 자가면역 장애, 다발성 경화증, 알츠하이머 병, 류마티스 관절염, 복부 질병, 진성 당뇨병, 장기 이식, 박테리아성 감염, 바이러스성 감염, 균류성 감염, 치주 질환, 비뇨생식기 질환, 성 전염성 질환, HIV 감염, HIV복제, 설사와 관련된 HIV, 정신적 외상과 관련된 수술, 외적-유발 전이 질환(surgical-induced metastatic disease), 패혈증, 몸무게 감소, 거식증, 열 조절, 악액질, 상처치유, 궤양, 장 관문 기능, 알러지, 천식, 호흡 장애, 순환 장애, 관상동맥 심장 질환, 빈혈증, 혈액 응고계 장애, 신장병, 중추 신경계 장애, 간장 질환, 허혈, 영양 장애, 골다공증, 내분비 장애, 상피 장애, 건선 및/또는 좌창을 포함하나, 이에 한정되지는 아니한다. 사이토카인 생산에 대한 효과는 프로바이오틱 스트레인-검사된 에 특이적이다. 결국, 특정한 프로바이오틱 스트레인은 특정 질병 유형을 위한 배타적 사이토카인 불균형을 정상화시키기 위해 선택될 것이다. 질병 특이 치료법의 커스토미세이션(customisation)은 AH 1206의 단일 스트레인 또는 그것의 돌연변이 또는 변이체 또는 이 스트레인들의 선택 중 하나를 사용하여 성취될 수 있다.
면역 교육
장내 세균(enteric flora)은 장 면역계의 발달 및 적절한 기능에 중요하다. 장내 세균이 없는 상태에서는, 무균 동물 모델에서 설명되듯이, 장 면역계는 발달이 불충분하고, 대식세포 섭식(phagocytic) 능력 및 면역 글로불린 항체 생산(10) 같은 어떤 기능적 요인(parameters)이 줄어든다. 해롭지 않은 (non-damaging) 면역 반응을 자극하는 데에 있어 장 세균의 중요성은 더 분명해지고 있다. 서구에서 알러지의 발병률 및 중증도의 증가는 숙주에 의해 공격되는 전염성 공격의 범위 및 숫자의 감소와 동시에 일어나는, 위생법과 위생시설의 증가와 관련이 있다. 이러한 면역 자극의 결핍은 숙주를 알러지 또는 자가 면역을 초래하는, 비-병원성이지만 항원성의 시약에 반응하도록 한다. 비-병원성 면역조절 박테리아의 시리즈의 신중한 소비는 숙주에게 적절한 발달 및 면역 기능의 조절을 위한, 필요하고 적절한 교육적 자극을 제공한다.
염증.
염증은, 지속된 물리적 손상, 감염을 가진 부위 또는 진행되는 면역 반응이 있는 부위에 체액, 혈장 단백질 및 백혈구의 국부적 축적을 설명하는 데 사용되는 용어이다. 염증성 반응의 조절은 레벨의 수에 영향을 받는다(11). 통제 요인들은 사이토카인, 호르몬(예컨데 하이드로코르티손), 프로스타글란딘, 반응성 중간체 및 류코트리엔을 포함한다. 사이토카인은 면역적 및 염증성 반응의 조절과 생성, 뿐만 아니라, 또한 발달, 조직 회복 및 조혈(haematopoiesis)의 규제에 연관된 낮은 분자량인 생물학적으로 활성화된 단백질이다. 그들은 백혈구와 다른 세포 타입 사이의 커뮤니케이션의 수단을 제공한다. 대부분 사이토카인은 부가적이고, 복합적인 생물학적으로 겹쳐진 활동을 표현한다. 사이토카인 캐스케이드와 네트워크는 특정 세포 타입의 특정 사이토카인의 활동보다는 염증성 반응을 조절한다 (12). 염증성 반응의 소실(waning)은 적당한 활동 신호, 및 염증성 반응의 중지를 이끄는 다른 염증성 매개물질의 낮은 농도를 초래한다. TNFα 사이토카인의 캐스케이드 및 염증성 상태를 초래하는 생물학적 효과를 시작하는, 중추의 전구 염증성 사이토카인이다. 그러므로, TNFα를 억제하는 시약은 최근 염증성 질병의 치료(예컨대, 인플릭시맵(infliximab))에 사용되고 있다.
전구 염증성(Pro-inflammatory) 사이토카인은 염증성 창자 질병(IBD)을 포함하는 많은 염증성 질병의 발병원인에 주요 역할을 수행한다고 생각되어 진다. IBD를 치료하는 최근 치료방법은 IL-8과 TNFα를 포함하는 전구 염증성 사이토카인의 레벨을 줄이는 것을 목적으로 한다. 그러한 치료방법은 또한 류마티스 관절염 같은 전신의 염증성 질병의 치료에도 중요한 역할을 한다.
본 발명의 스트레인은 특히, 그러한 비-스테로이드 항염증성 제약(NSAIDs) 같은 다른 항염증성 치료방법과 조합되어 사용될 경우에 염증성 질병의 범위의 치료에 잠재적 목적을 가지고 있다.
사이토카인과 암
종양의 넓은 스펙트럼을 가로지르는 다능성 사이토카인의 생성은, 중요한 염증성 반응이 암 환자에서 진행되고 있음을 암시한다. 이 반응의 보호 효과가 세포 내에서 종양세포의 생장과 발달에 대항하는 것은 최근 불명확하다. 그러나, 이러한 염증성 반응은 종양-베어링(tumour-bearing) 숙주에 반대로 영향을 미친다. 복합적인 사이토카인 상호작용은 사이토카인 생산 및 종양과 일반 조직 내의 세포 분화의 조절과 연관되어 있다(13, 14). 중량 손실(악액질)은 암 환자의 죽음의 단일의 가장 일반적인 원인이고, 처음의 영양부족은 결핍된 예후를 가리킨다는 것이 오랫동안 인식되어 왔다. 종양이 성장하고 퍼지기 위해서는, 새로운 혈관의 형성이 유도되어야 하고, 세포 외의 매트릭스를 퇴화시켜야만 한다. 염증성 반응은 상기 메커니즘에서 중요한 역할을 하고, 따라서 숙주의 쇠퇴 및 종양의 발달에 공헌을 한다. 비피도박테리움 롱굼 인판티스(infantis) 박테리아 스트레인의 항-염증성 특성 때문에, 그들은 악성 세포변형의 속도를 감소시킨다. 더욱이, 장의 박테리아는, 음식의 화합물로부터, 유전자 독성, 발암성 및 종양-촉진 활동을 가진 물질을 생성할 수 있고, 장 박테리아는 DNA 반응성 시약에 발암성전구물질을 활성화 시킬 수 있다. 일반적으로, 비피도박테리움의 종은, 박테로이드, 유박테리아(eubacteria), 및 클로스트리디아(Clostridia) 같은 장 내의 다른 집단들에 비해 생체이물 물질대사 효소(xenobiotic metabolizing enzymes)의 낮은 활동을 가진다. 결국, 장 내에서 비피도박테리움 박테리아의 수의 증가는 유익하게 이런 효소들의 레벨을 변경할 수 있다.
백신/약물 전달
병원성 유기체의 대부분은 점막 표면을 통해 입구를 얻는다. 이러한 부위의 효과적인 백신접종은 특정 전염성 시약에 의한 침입을 보호한다. 경구 백신접종 전략은 살아있는 병원성 유기체를 약하게 하거나 또는 캡슐에 있는 항원을 정제하는 용도에 집중한다(16). 프로바이오틱 박테리아는, 이런 박테리아는 인간 컨섬션(consumption)(GRAS status)을 안전하게 하는 것을 고려하기 때문에, 매력적인 대안을 제공한다.
쥐 연구는, 외부 항원을 발현하는 프로바이오틱 박테리아의 컨섬션 (consumption)은 보호 면역반응을 도출할 수 있다는 것을 보여준다. 테타누스 톡신 프레그먼트 C(TTFC)를 인코딩하는 유전자는, 락토코쿠스 락티스 및 경구 루트를 통해 면역된 쥐에서 발현된다. 이 시스템은 치사성 독소 도전으로부터 쥐를 보호하기에 충분히 높은 항체 적정 농도를 유도할 수 있다. 항원 제시에 부가적으로, 살아있는 박테리아 벡터는, 비강 내로 면역된 쥐에서10-15 폴드 더 높은 세럼 IgG 타이트레스(titres)를 유도하는, 면역촉진 사이토카인, 실험실 내(in vivo) L. 바이오액티브 인간 IL-2 또는 IL-6를 분비하는 락티스 및 TTFC와 같은 바이오액티브 화합물을 생성할 수 있다(17). 그러나, 이런 특정 박테리아 스트레인과 함께, 전체 IgA 레벨은 이런 사이토카인들과 함께 코익스프레션(coexpression)에 의해 증가되지 않는다.스트렙토코쿠스 고르도니(Streptococcus gordonii)같은 다른 박테리아 스트레인은 또한 점막의 백신으로써 그들의 유용성이 조사되어 지고 있다. 쥐의 구강 및 질의 강(oral and vaginal cavities)을 콜로나이징 (colonizing) 하는 재조합형 S. 고르도니는 이 박테리아에 의해 발현되는 항원에 반응한다(18). 따라서, 벡터로써 프로바이오틱 박테리아를 사용하는 구강의 면역은 감염으로부터 숙주를 보호할 뿐만 아니라, 병원균이 보통 숙주의 면역학적 교육에 공헌함을 도출하는, 면역학적 자극을 대체한다.
프리바이오틱( Prebiotics )
프로바이오틱 유기체의 도입은 적당한 운반체에서 미생물의 섭취에 의해 이루어진다. 대장에서 이 프로바이오틱 스트레인의 성장을 촉진시킬 배지(medium)를 제공하는 것이 유리할 것이다. 하나 또는 그 이상의 올리고당, 다당류, 또는 다른 프리바이오틱들의 부가는 위장에서 젖산 박테리아의 성장을 촉진시킨다. 프리바이오틱은, 특히 예컨대 비피도박테리아, 락토바실라이와 같은, 양성 값(positive value)이 되리라 생각되는 토착 박테리아에 의해 대장에서 발효되는 어떤 생존 불가능한 음식 구성요소와 관련된다. 프리바이오틱의 타입은 과당, 크실로오스, 소야(soya), 갈락토오스, 글루코오스, 및 만노오스를 함유하는 것들을 포함한다. 하나 또는 그 이상의 프리바이오틱 화합물과 프로바이오틱 스트레인의 결합된 투여는, 더 많이 알려진 건강상 이점을 초래하는 투여된 생체 내 프로바이오틱의 성장을 촉진시키고, 신바이오틱(synbiotic)이라고 칭해진다.
다른 활성 성분들
프로바이오틱 스트레인은 예방적으로, 또는 치료하는 방법으로써, 상기에 기술한 바와 같이 그것 자신만 또는 다른 프로바이오틱 및/또는 프리바이오틱 물질과 함께 투여된다. 게다가, 박테리아는 염증치료 또는 다른 장애들, 특히 면역학적 곤란을 가진 것과 같은 다른 활성 물질들을 사용하여 예방 또는 치료의 형태의 일부로써 사용된다. 그런 조합은, 단일 제형 또는, 동시에 또는 다른 시간에 투여되고 같은 또는 다른 투여 경로를 사용한, 분리된 제형으로써 투여된다.
상기 발명은 여기의 전에 기술된 상세히 변화된 실시예에 한정되지 않는다.
전구 염증성(Pro-inflammatory) 사이토카인은 염증성 창자 질병(IBD)을 포함하는 많은 염증성 질병의 발병원인에 주요 역할을 수행한다고 생각되어 진다. IBD를 치료하는 최근 치료방법은 IL-8과 TNFα를 포함하는 전구 염증성 사이토카인의 레벨을 줄이는 것을 목적으로 한다. 그러한 치료방법은 또한 류마티스 관절염 같은 전신의 염증성 질병의 치료에도 중요한 역할을 한다.
본 발명의 스트레인은 특히, 그러한 비-스테로이드 항염증성 제약(NSAIDs) 같은 다른 항염증성 치료방법과 조합되어 사용될 경우에 염증성 질병의 범위의 치료에 잠재적 목적을 가지고 있다.
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Claims (42)

  1. 수탁 번호 NCIMB 41382를 가지는 비피도박테리움롱굼(Bifidobacterium longum) 스트레인 AH 1206 또는 그것의 돌연변이 또는 변이체.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 돌연변이는 유전적으로 변형된 돌연변이인 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 스트레인.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 변이체는 자연적으로 일어난 비피도박테리움의 변이체인 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 스트레인.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 비피도박테리움 스트레인은 프로바이오틱(probiotic)인 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 스트레인.
  5. 제 1항 또는 제 4항에 있어서,
    상기 스트레인은 생물학적으로 순수 배양의 형태인 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 스트레인.
  6. 비피도박테리움 NCIMB 41382의 분리된 스트레인.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 비피도박테리움 스트레인은 생존 가능한 세포의 형태인 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 스트레인.
  8. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 비피도박테리움 스트레인은 생존 불가능한 세포의 형태인 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 스트레인.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비피토박테리움은 유아의 배설물로부터 분리된 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 스트레인.
  10. 제 1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스트레인은 인간에서 구강 컨섬션(consumption) 후에 상당한 면역조절성을 가지는 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 스트레인.
  11. 제 1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비피도박테리움 스트레인을 포함하는 제형(formulation).
  12. 제11항에 있어서,
    상기 제형은 다른 프로바이오틱 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제형.
  13. 제 11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 제형은 프리바이오틱 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제형.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제형은 섭취가능(ingestable) 운반체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제형.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 섭취가능(ingestable) 운반체는 캡슐, 알약 또는 분말과 같은 약학적으로 허용 가능한 운반체인 것을 특징으로 하는 제형.
  16. 제 14항에 있어서,
    상기 섭취가능(ingestable) 운반체는 신맛이 나는 우유, 요거트, 얼린 요거트, 우유 분말, 우유 농축, 치즈 스프레드, 드레싱 또는 음료들 같은 것들인 것을 특징으로 하는 제형.
  17. 제 11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제형은 단백질 및/또는 펩타이드, 특히 글루타민/글루타메이트, 지질, 탄수화물, 비타민, 미네랄 및/또는 미량원소가 풍부한 단백질 및/또는 펩타이드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제형.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비피도박테리움 스트레인은 상기 제형의 g당 106 cfu보다 많은 양이 존재하는 것을 특징으로 하는 제형.
  19. 제 11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제형은 보조제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제형.
  20. 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제형은 박테리아 성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제형.
  21. 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제형은 약품 엔티티(drug entity)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제형.
  22. 제 11항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제형은 생물학적 화합물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제형.
  23. 제11항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제형은 예방접종(immunisation) 및 백신접종(vaccination) 프로토콜을 위한 것인 것을 특징으로 하는 제형.
  24. 식료품의 용도로 사용되는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비피도박테리움 스트레인 또는 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 제형.
  25. 약제로써 사용되는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비피도박테리움 스트레인 또는 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 제형.
  26. 바람직하지 않은 염증 활동의 예방 및/또는 치료에 사용되는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 비피도박테리움 스트레인 또는 제8항 내지 제20항 중 어느 한 항의 제형.
  27. 염증 창자 질병, 예컨대 크론병 또는 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군; 낭 염 또는 사후 감염 대장염, 같은 바람직하지 않은 위장 염증 활동의 예방 및/또는 치료에 사용되는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비피도박테리움 스트레인 또는 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 제형.
  28. 위장암의 예방 및/또는 치료에 사용되는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비피도박테리움 스트레인 또는 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 제형.
  29. 류마티스 관절염 같은 전신질환의 예방 및/또는 치료에 사용되는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비피도박테리움 스트레인 또는 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 제형.
  30. 바람직하지 않은 염증 활동에 의한 자가면역 장애의 예방 및/또는 치료에 사용되는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비피도박테리움 스트레인 또는 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 제형.
  31. 바람직하지 않은 염증 활동에 의한 암의 예방 및/또는 치료에 사용되는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비피도박테리움 스트레인 또는 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 제형.
  32. 암의 예방에 사용되는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비피도박테리움 스트레인 또는 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 제형.
  33. 설사(diarrhoea)와 연관된 클로스트리듐 디피실리균(Clostridium difficile), 설사(diarrhoea)와 연관된 로타바이러스(Rotavirus) 또는 사후 감염 설사 또는 대장균 같은 감염성 에이전트에 의한 설사병 같은 바람직하지 않은 염증 활동에 의한 설사병의 예방 및/또는 치료에 사용되는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비피도박테리움 스트레인 또는 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 제형.
  34. 바람직하지 않은 염증 활동의 예방 및/또는 치료를 위한 항 염증 바이오치료 (biotherapeutic) 시약의 제조에 사용되는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비피도박테리움 스트레인 또는 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 제형.
  35. IL-10의 레벨을 변경하기 위한 바이오치료 시약의 패널의 준비에 사용되는 것을 특징으로 하는 제34항의 비피도박테리움 스트레인.
  36. 염증성 장애, 면역결핍, 염증성 장 질환, 과민성 장 증후군, 암(특히 위장 및 면역계의 것), 설사병, 설사와 관련된 항생물질, 소아과의 설사(paediatric diarrhoea), 충수염, 자가면역 장애, 다발성 경화증, 알츠하이머 병, 류마티스 관절염, 복부 질병, 진성 당뇨병, 장기 이식, 박테리아성 감염, 바이러스성 감염, 균류성 감염, 치주 질환, 비뇨생식기 질환, 성 전염성 질환, HIV 감염, HIV복제, 설 사와 관련된 HIV, 정신적 외상과 관련된 수술, 외적-유발 전이 질환 (surgical-induced metastatic disease), 패혈증, 몸무게 감소, 거식증, 열 조절, 악액질, 상처치유, 궤양, 장 관문 기능, 알러지, 천식, 호흡 장애, 순환 장애, 관상동맥 심장 질환, 빈혈증, 혈액 응고계 장애, 신장병, 중추 신경계 장애, 간장 질환, 허혈, 영양 장애, 골다공증, 내분비 장애, 상피 장애, 건선 및/또는 좌창의 예방 및/또는 치료에서 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비피도박테리움 스트레인의 사용.
  37. 제 1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스트레인은 위장으로부터 전구염증성(proinflammatory) 미생물을 안타고나이징(antagonising) 및 배제함에 의해 작용하는 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 스트레인.
  38. 전구염증성 사이토카인의 레벨을 감소시키기 위한 항 염증성 바이오치료 시약의 제조에 사용되는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비피도박테리움 스트레인 또는 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 제형.
  39. 병원성 종의 성장을 중화(antagonise)하는 그들의 능력에 의해 항 전염성 프로바이오틱 스트레인으로써 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비피도박테리움 스트레인의 사용.
  40. 천식 및/또는 알러지를 치료하는 제약의 제조에 사용되는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비피도박테리움 스트레인 또는 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 제형.
  41. 상기 제40항의 제약은 흡입에 적당한 형태인 것을 특징으로 하는 사용.
  42. IgE의 레벨을 감소시키는 항 염증성 바이오 치료 시약의 제조에 사용되는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비피도박테리움 스트레인 또는 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 제형.
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