ES2610829T3

ES2610829T3 - Cepa de Bifidobacterium

Info

Publication number: ES2610829T3
Application number: ES14180970.7T
Authority: ES
Inventors: Liam O'mahony; Barry Kiely
Original assignee: Alimentary Health Ltd; Iams Europe BV
Current assignee: PrecisionBiotics Group Ltd; Iams Europe BV
Priority date: 2009-11-11
Filing date: 2010-11-11
Publication date: 2017-05-03
Anticipated expiration: 2030-11-11
Also published as: EP2823822A1; CN103037875B; BR112012010923A2; CA2779597C; RU2557310C2; JP2013509204A; MX2012005449A; EP2498790A1; WO2011058536A1; PL2823822T3; AU2010317423B2; BR112012010923B1; RU2012116029A; AU2010317423A1; AU2010317423C1; CN103037875A; CA2779597A1; EP2823822B1; JP5600179B2

Abstract

Una cepa aislada de Bifidobacterium NCIMB 41675.

Description

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Más aún, el mantenimiento o mejora de la salud de la piel y/o el sistema de revestimiento de los animales de compañía, incluyendo la enfermedad atópica de la piel, puede medirse utilizando las evaluaciones de la piel y el revestimiento llevadas a cabo por dos individuos entrenados. Los ejemplos de los criterios examinados durante dichas evaluacionesincluyen: a) Índice de desprendimiento: Se asigna un índice de protección a cada sujeto de ensayo recogiendo pelo durante un procedimiento de cepillado normalizado. Se recoge el pelo y se pesa, y se comparan los sujetos del control y del ensayo, b) Evaluaciones subjetivas de revestimiento de la piel: Panelistas entrenados evaluaron subjetivamente la piel y la condición de revestimiento evaluando el desprendimiento, la caspa, el brillo, la uniformidad, suavidad y densidad, c) Evaluación funcional de la piel: Se puede evaluar la función de barrera de la piel frotando la superficie de la piel con una gamuza humedecida en acetona. Esta técnica perturba, eficazmente la barrera de la piel eliminando las capas de células individuales y las fracciones lipídicas asociadas del estrato córneo. Se cuantificó la perturbación de la barrera midiendo el aumento en la pérdida de agua transepidérmica (TEWL) y el grado de enrojecimiento del sitio lesionado utilizando los procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Se obtuvieron puntuaciones del enrojecimiento (eritema) utilizando la cámara y el sistema de iluminación anteriormente descritos. Las lecturas TEWL y las puntuaciones del enrojecimiento se obtuvieron inmediatamente antes y después de la perturbación, y los criterios de valoración a las cinco y las 24 horas para evaluar las propiedades protectoras y de cicatrización de la piel.

Además, el tratamiento de la infección gastrointestinal en animales de compañía puede comprender mejorar la ecología microbiana de los animales de compañía. La mejora de la ecología microbiana de los animales de compañía comprende preferentemente la reducción de los niveles de bacterias patógenas en las heces de los animales de compañía. Los niveles de bacterias patógenas presentes en las heces de los animales de compañía se pueden enumerarse utilizando el procedimiento de recuento en placa convencional conocidos del experto en la técnica. Más preferentemente, las bacterias patógenas se seleccionan del grupo que consiste en Clostridia, Escherichia, Salmonella, bacteroides y mezclas de los mismos. Los ejemplos no limitantes de cepas adecuadas de bacterias patógenas incluyen C. perfringens, C. difficile, Eschericia coli, Salmonella typhimurium y mezclas de los mismos.

El procedimiento para usar las bacterias de la presente invención también puede incluir el tratamiento, tanto profiláctico como terapéutico del tracto urinario de mamíferos, preferentemente animales de compañía. Los ejemplos no limitantes de tratamientos del tracto urinario incluyen el tratamiento o la prevención de infecciones del tracto urinario, tratamiento y prevención de la enfermedad renal, incluidas las piedras del tracto urinario, el tratamiento o la prevención de infecciones de la vejiga y similares. Sin pretender quedar vinculado por teoría alguna, se cree que las bacterias de Bifidobacterium de la presente invención son de utilidad en la prevención de estas dolencias como resultado de su capacidad para degradar el ácido oxálico, como se demuestra in vitro. El ácido oxálico es un subproducto del metabolismo urinario que se puede formar precipitados insolubles que dan como resultado infecciones del riñón, vejiga y otras partes del tracto urinario. Al degradar el ácido oxálico, y por tanto evitar potencialmente su precipitación y acumulación en el tracto urinario, las bacterias de la presente invención pueden tratar y prevenir infecciones y otras dolencias del tracto urinario. La degradación del ácido oxálico se puede medir in vitro usando el kit de ensayo para ácido oxálico n.º de cat. 755699 comercializado por Boehringer Mannheirn/R-Biopharm.

Las Bifidobacterium de la presente invención se pueden usar en un procedimiento para mejorar o mantener la salud de los animales de compañía, que comprende mejorar la digestión de la fibra. La mejora de la digestión de la fibra es deseable, ya que estimula el crecimiento de dichas bacterias probióticas, así como la microflora endógena beneficiosa, que ayuda a suprimir algunas bacterias potencialmente patógenas. Además, se ha documentado en seres humanos una disminución en la cantidad de metabolitos y enzimas perjudiciales que resultan de la fermentación colónica (6). La digestión de la fibra se puede determinar con el procedimiento descrito en Vickers y col. (7), con la excepción de que, en lugar de la inoculación con muestras fecales diluidas, cada experimento utiliza cultivos puros de las cepas bacterianas de interés

Las cepas probióticas felinas de la presente invención se pueden utilizar para reducir el olor de las heces y, por tanto, del arenero, reduciendo la producción de compuestos en las heces y la orina productores de olor. Los ejemplos no limitantes de compuestos productores de olor incluyen amoniaco, indoles, fenoles, aminas, ácidos grasos de cadena ramificada, y compuestos volátiles que contienen azufre. Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que la reducción de los niveles de estos compuestos en las heces o la orina de un animal de compañía reduce el olor asociado con las heces o la orina. Además, para los animales de compañía que utilizan un arenero, existe una disminución paralela del olor del arenero.

El procedimiento de uso de las bacterias acidolácticas de la presente invención implica normalmente el consumo oral por parte del animal. El consumo oral puede tener lugar como parte de la ingesta dietética normal, como un suplemento de la misma. El consumo oral se suele producir al menos una vez al mes, preferentemente al menos una vez a la semana, más preferentemente al menos una vez al día. Las bacterias acidolácticas de la presente invención se pueden proporcionar al animal de compañía en una cantidad terapéuticamente eficaz para mantener o mejorar la salud del animal, preferentemente un animal de compañía. Como se usa en el presente documento, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" con referencia a las bacterias acidolácticas, significa la cantidad de las bacterias suficiente para proporcionar el efecto deseado o beneficioso a un animal hospedador que necesita el tratamiento, pero lo suficientemente baja para evitar efectos adversos tales como toxicidad, irritación, o respuesta alérgica, proporcionada a una relación beneficio/riesgo razonable cuando se utiliza en la forma de la presente invención. La "cantidad terapéuticamente eficaz" específica variará con factores tales como la dolencia concreta que se está

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para animales de compañía se proporciona generalmente en forma de una croqueta. Si se utiliza un prebiótico, el prebiótico se puede mezclar con el resto de ingredientes del pienso seco para animales de compañía antes del procesamiento. Un procedimiento adecuado se describe en la solicitud de patente europea n.º 0850569. Si se utiliza un microorganismo probiótico, el organismo se reviste por encima o rellena el interior del pienso seco para animales de compañía. Un procedimiento adecuado se describe en la publicación de patente europea n.º EP 0 862 863.

Para alimentos húmedos, se pueden usar los procedimientos descritos en las patentes de EE.UU. 4.781.939 y

5.132.137 para producir productos cárnicos simulados. También se pueden utilizar otros procedimientos para producir productos de tipo fragmentado; por ejemplo, cocción en un horno de vapor. Como alternativa, se pueden producir productos panificados emulsionando un material cárnico adecuado para producir una emulsión cárnica, adición de un agente gelificante adecuado, y calentando la emulsión cárnica antes de rellenar latas u otro tipo de recipientes. Las composiciones de alimento húmedo típicas pueden comprender de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 15 % de proteína, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 10 % de grasa, y de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 7 % de fibra. Los ingredientes no limitantes que se pueden usar en las composiciones para comida húmeda incluyen pollo, pavo, ternera, pescado blanco, caldo de pollo, caldo de pavo, caldo de ternera, hígado de pollo, arroz machacado, sémola de maíz, harina de pescado, huevo, pulpa de remolacha, cloruro, linaza de carne, subproductos de cordero y ternera, subproductos de pollo y mezclas de los mismos. En otra realización, composiciones de suplementos tales como galletas, gomas de mascar, y otras golosinas pueden comprender, en base de materia seca, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 60 % de proteína, o de aproximadamente un 22 % a aproximadamente un 40 % de proteína, en peso de la composición de suplemento. Como ejemplo adicional, las composiciones de suplemento pueden comprender, en base de materia seca, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 35 % de grasa, o de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 30 % de grasa, en peso de la composición de suplemento. Las composiciones de alimento y suplemento previstas para su uso por felino o félidos son bien conocidas en la técnica.

Los piensos para animales de compañía pueden incluir otros principios activos tales como ácidos grasos de cadena larga y cinc. Los ácidos grasos de cadena larga adecuados incluyen ácido alfa-linoleico, ácido gamma-linolénico, ácido linoleico, ácido eicosapentanoico, y ácido docohexanoico. Los aceites de pescado son una fuente adecuada de ácidos eicosapentanoico y docosahexanoico.

El aceite de borraja, el aceite de semillas de grosella y el aceite de onagra son fuentes adecuadas de ácido gamma linolénico. Los aceites de cártamo, aceites de girasol, aceites de maíz y aceites de soja son fuentes de ácido Iinoleico adecuadas. Estos aceites también se pueden utilizar para revestir los sustratos anteriormente citados. El cinc se puede proporcionar en varias formas adecuadas, por ejemplo, como sulfato de cinc u óxido de cinc. Adicionalmente, muchos ingredientes utilizados comúnmente en los alimentos en los piensos para animales de compañía son fuentes de ácidos grasos y cinc. Se ha observado que la combinación de achicoria, como fuente de prebiótico, con un aceite rico en ácido linoleico, como el aceite de soja, proporciona beneficios inesperados, que sugieren un efecto sinérgico.

Cuando la composición está en la forma de una salsa, la composición comprende preferentemente al menos un 10 % de caldo, o carne desmenuzada, cuyos ejemplos no limitantes incluyen carne desmenuzada de hortalizas, ternera, pollo o jamón. Las composiciones de salsa típicas pueden comprender de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 15 % de proteína, de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 5 % de grasa bruta, y de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 5 % de fibra.

Otros ejemplos no limitantes de suplementos adecuados para su uso en el presente documento incluyen polvo, suspensiones oleosas, suspensiones de base láctea, quesos, composiciones basadas en manteca de cacao y pastillas o cápsulas. Cuando la composición está en la forma de una pastilla, se necesitan agentes aglutinantes adecuados para mantener la pastilla en una forma sólida comprimida. Los ejemplos no limitantes de agentes aglutinantes adecuados incluyen las gomas naturales como la goma xantana, pectinas, lecitinas, y otras conocidas de los expertos en la materia. Cuando la composición está en la forma de una cápsula, la composición se encapsula preferentemente utilizando tecnologías conocidas del experto en la técnica. Los ejemplos no limitantes de materiales de encapsulación adecuados incluyen el poli(alcohol vinílico) (PVA), polivinilpirrolidona (PVP), alginatos, y gelatina. Las composiciones basadas en yogur pueden comprender de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 5 % de proteína, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 20 % de carbohidratos, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 5 % de fibra, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 5 % de grasa y de aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 90 % de un transportador líquido tal como leche.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la invención, y no se pretende que limiten el alcance de la misma de ninguna forma.

Ejemplo 1 -Aislamiento de Bifidobacterium longum AH121A

La cepa AF1121 de Bifidobacterium Iongum se aisló de tejido de intestino de felino.

Las muestras de tejido intestinal felino se obtuvieron de gatos sanos llevados al veterinario local por sus dueños, que iniciaron y autorizaron la eutanasia. Todos los animales estaban sanos y exentos de enfermedades. El colon, colon

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intermedio, ciego e íleon de cada gato se diseccionaron para exponer la mucosa.

Se eliminaron los sobrenadantes tras agitación del tejido mucoso (sometido a vortización durante 1 minuto) y tras la homogeneización mecánica del tejido. Cada sobrenadante se sembró en agar Mann Rogosa Sharpe (MRS). Se incubaron anaeróbicamente, usando el sistema Anerocult GasPak, durante 48 horas a 37°C. Las colonias aisladas de las placas se volvieron a sembrar sobre cualquier tipo de MRSy se dejaron crecer de nuevo anaeróbicamente en las mismas condiciones. Las colonias aisladas se volvieron a sembrar 4 veces para purificar una sola cepa. Se evaluaron la morfología y el aspecto al microscopio de las colonias. Los aislados adecuados se ensayaron para determinar la reacción de Grant y la actividad catalasa. La identificación de bacilos gram positivos, catalasa negativos, se llevó a cabo con una prueba API (API 5 OCHL, BioMerieux). Las células cosechadas se lavaron dos veces en tampón fosfato 0,05 M (pH 6,5) y cisteína-HCI (500 mg/l) seguido por sonicación. La centrifugación eliminó los residuos celulares. Los sobrenadantes se incubaron con NaF (6 mg/ml) y yodoacetato Na (10 mg/ml) durante 30 minutos a 37°C. La reacción se detuvo mediante incubación con hidroxilamina HCI (pH 6,5) durante 10 minutos a temperatura ambiente. El desarrollo del color se siguió después de la adición de HCI (4 M), FeCI3.6H2O (5 % (w/v) en HCI 0,1 M) y fructosa-6-fosfato (sal de Na). La formación de acetil fosfato a partir de fructosa-6-fosfato se evidenció por el color rojizo formado por el quelato férrico de su hidroximato.

Identificación de especies

Se llevó a cabo secuenciación con espaciador intergénico 16s (EIG) para identificar la especie de bifidobacteria aislada. En resumen, se aisló ADN de AH121A utilizando 100 μl de solución de extracción y 25 μl de solución de preparación de tejidos (Sigma, kit XNAT2). Las muestras se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente, seguido por 2 h a 95°C, a continuación, se añadieron 100 μl de solución de neutralización (kit XNAT2). La solución de ADN genómico se cuantificó usando un espectrofotómetro Nanodrop y se almacenó a 4°C. Se llevó a cabo la PCR usando los cebadores IGS, IGS L: 5’-GCTGGATCACCTCCTTTCT-3’ (SEQ ID NO. 3) que da como resultado la identificación de la SEQ ID NO. 1, e IGS R: 5’-CTGGTGCCAAGGCATCCA-3’ (SEQ ID NO. 4) que da como resultado la identificación de la SEQ ID NO. 2. Las condiciones de ciclación fueron 94°C durante 3 min (1 ciclo), 94°C durante 30 s, 53°C durante 30 s, 72°C durante 30 s (28 ciclos). La reacción de la PCR contenía 4 μl (50 ng) de ADN, mezcla PCR (kit XNAT2), cebadores IGS L y R 0,4 μM (MWG Biotech, Alemania). Las reacciones de la PCR se llevaron a cabo en un termociclador Eppendorf. Los productos de la PCR (10 μl) se analizaron junto con un marcador de peso molecular (escalera de 100 pb, Roche) en un gel de agarosa al 2 % teñido con EtBr en TAE, para determinar el perfil de IGS. Los productos de la PCR de Bifidobacterium (banda única) se purificaron utilizando el kit de purificación PCR Promega Wizard. Los productos de la PCR purificados se secuenciaron usando las secuencias del cebador (más arriba) para la región del espaciador intergénico. A continuación, se hizo una búsqueda de los datos de la secuencia en la base de datos de nucleótidos NCBI para determinar la identidad de la cepa mediante homología de nucleótidos. Los datos de la secuencia de ADN resultantes se sometieron al motor de búsqueda BLAST de homología nucleótido-nucleótido estándar de NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Se identificó la coincidencia más próxima con la secuencia y a continuación se alinearon las secuencias para comparación usando el programa informático DNASTAR MegAlign. Las secuencias (SEQ ID NO. 1 [secuencia IGS directa] y la SEQ ID NO. 2 [secuencia IGS inversa]) obtenidas se pueden ver en el listado de secuencias. Una búsqueda en la base de datos de NCIMB reveló que AH121A tiene una secuencia única IGS (SEQ ID NO. 1 [secuencia directa] y SEQ ID NO. 2 [secuencia inversa]) que es la homología más próxima con

Bifidobacterium longum.

Ejemplo 2 -Cribado con agar Rojo congo

Se usó un cribado en agar rojo Congo para seleccionar fenotípicamente las cepas bacterianas que expresan EPS. En resumen, se inocularon asépticamente 10 ml de medio de cultivo Rogosa modificado (+ 0,05 % de cisteína) con una colonia recién desarrollada de la cepa bacteriana y se incubó anaeróbicamente a 37°C hasta turbidez (de aproximadamente 16 a aproximadamente 24 horas). Los cultivos del caldo se extendieron asépticamente sobre placas de agar rojo Congo y se incubaron de forma anaerobia a 37 °C durante 48 horas. Se cree que el EPS producido como subproducto del crecimiento y/o el metabolismo de determinadas cepas evita la captación de la tinción rojo Congo dando como resultado una morfología de la colonia de color crema/blanco. Las cepas que producen menos EPS capturan la tinción rojo Congo fácilmente, dando como resultado una morfología de la colonia de color rosa/rojo. Las cepas que no producen EPS se tiñen de color rojo y tienen un aspecto casi transparente en el fondo de agar rojo.

En referencia a la Fig. 1, la morfología de la colonia de B. longum AH121A es una colonia convexa mucoide de color blanco brillante.

Ejemplo 3

Para determinar la resistencia del aislado bacteriano felino AHF121A a diferentes concentraciones de bilis porcina y para evaluar la supervivencia del aislado bacteriano felino AHF121A a pH 2,5 durante 6 horas y resistencia a la bilis posterior usando varias concentraciones de bilis.

Diseño experimental:

La cepa de ensayo fue Bifidobacterium longum AHF121A. La resistencia a la bilis se examinó utilizando placas de agar MRS/RCA suplementadas con bilis porcina (0,3, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 7,5 y 10 %). La supervivencia de las cepas a pH 2,5

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PBMC para obtener el número total de bacterias indicado para cada experimento.

Ensayo de inducción de citoquinas de PBMC (células mononucleares de sangre periférica)

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) procedentes de sangre periférica de ser humano sano utilizando tubos BD Vacutainer CPT (catálogo BD 362761), según las instrucciones del fabricante. Las PBMC se lavaron y se resuspendieron en medio Eagle modificado por Dulbecco Medium-Glutamax™ (Glutamax (sustituto de glutamina) + piruvato + 4,5 g/l de glucosa (catálogo Gibco 10569-010), suero de feto bovino al 10 % (catálogo Sigma F4135), y penicilina/estreptomicina al 1 % (catálogo Sigma P0781). Las PBMC se incubaron (2 x 105 células por pocillo) en placas de 96 pocillos de fondo plano y se añadieron 20 μl de una suspensión bacteriana (en intervalos de concentración de 1 x 106-8 UFC/ml). Se sometieron a ensayo hasta 6 cantidades diferentes de bacterias: 2,5E+08, 1,0E+08, 5,0E+07, 2,5E+07, 1,0E+07, y 1,0E+06. También se analizó un control no bacteriano. Todas las pruebas se realizaron por triplicado. Después de 2 días de incubación a 37°C, las placas se centrifugaron a 300 x g, y el sobrenadante se retiró y se almacenó congelado a -80°C hasta el análisis. Las PBMC se incubaron simultáneamente con bacterias durante 48 horas a 37 °C / CO2 al 5 % en una incubadora. Se analizaron las citoquinas de los sobrenadantes de los cultivos utilizando un kit de ensayo de 96 pocillos de Meso Scale Discovery (Gaithersburg, MD; catálogo K15008B-1). Interleuquina 1 beta (11-1 p) de Fluman, Interleuquina 6 (II-p) de Fluman, Interleuquina 8 (II-8) de Fluman Interleuquina 10 (II-10) de Fluman, Interleuquina 12p70 (1112p70) de Fluman, Interferón gamma (IFN-y) de Fluman, Factor alfa de necrosis tumoral (TNFα) de Fluman y G-CSF de Fluman se cuantificaron y se notificaron en picogramos por mililitro (pg/ml). Cada muestra se analizó en 3-5 replicados (A a E).

Resultados

Se someten a ensayo Bifidobacterium longum infantis cepa UCC35624 (B624) y Bifidobacterium longum cepa 121a se analizaron para determinar la inmunomodulación utilizando un ensayo de inducción de citoquinas de PBMC, para generar curvas de dosis-respuesta prolongadas con hasta 6 cantidades diferentes de bacterias analizadas: 2,5E+08, 1,0E+08, 5,0E+07, 2,5E+07, 1,0E+07, y 1,0E+06. Se analizaron los sobrenadantes para determinar un grupo de citoquinas, incluidas lL-ip, IL-6, IL-8, IL-10 y IL-12, TNF-α, IFN-γ y G-CSF. La medición de citoquinas se representa como promedio (+/-SEM) de un máximo de 5 individuos (A a E).

Por comparación con 35624, la cepa 121a mostró un modelo muy similar para la inducción de la m mayoría de las citoquinas, incluyendo IL-10, pero un modelo bastante diferente y una mayor producción de IL-6 e IL-8.

IL-10: La incubación con 121a induce un aumento sensible a la dosis de la citoquina antiinflamatoria IL-10 en PBMC tras estimulación in vitro (Fig. 7). La inducción de IL-10 es cualitativa y cuantitativamente similar a la incubación con 35624. La inducción máxima de IL-10 no parece cumplirse hasta 1,0 x 109 bacterias por pocillo.

IL-1β: La incubación con 121a induce un aumento sensible a la dosis de la citoquina proinflamatoria IL-1β en PBMC tras estimulación in vitro (Fig. 8). La inducción de IL-1β es cualitativa y cuantitativamente similar a la incubación con 35624. La inducción máxima de IL-1β no parece cumplirse hasta 1,0 x 109 bacterias por pocillo.

IL-6: La incubación con 121a induce un aumento sensible a la dosis de la citoquina IL-6 en PBMC tras estimulación in vitro (Fig. 9). Cuantitativamente, el modelo es diferentes de 121a comparado con 35624 con mayores niveles de IL-6 medido con 121a especialmente a bajas dosis de bacterias por pocillo.

IL-8: La incubación con 121a induce un aumento sensible a la dosis de la citoquina IL-8 en PBMC tras estimulación in vitro (Fig. 10). Cuantitativamente, el modelo es diferente de 121a comparado con 35624; con niveles más elevados de IL-8 medidos con 121a para todas las dosis de bacterias por pocillo.

IL-12: La incubación con 121a induce un aumento sensible a la dosis de la citoquina proinflamatoria IL-12 en PBMC tras estimulación in vitro (Fig. 11). El modelo de modulación de IL-12 tiene forma de campana con 121a y con 35624, aumentando a niveles punta y después disminuyendo para concentraciones bacterianas más elevadas. Cuantitativamente, el modelo es algo variable para IL-12, pero en conjunto similar con 121a en comparación con 35624.

TNF-α: La incubación con 121a induce un aumento sensible a la dosis de la citoquina proinflamatoria TNF-α en PBMC tras estimulación in vitro (Fig. 12). La inducción de TNF-α en es cualitativa y cuantitativamente similar a la incubación con 35624 para 3 de 5 réplicas, con elevados niveles de TNF-α encontrados en 2 de 5 réplicas (véanse C y E). Parece que la inducción máxima de IL-10 se cumple con hasta 1,0 x 108 bacterias por pocillo.

INF-γ La incubación con 121a induce un aumento sensible a la dosis de la citoquina proinflamatoria INF-γ en PBMC tras estimulación in vitro (Fig. 13). Cuantitativamente, el modelo es algo variable para INF-γ, pero en conjunto similar con 121a en comparación con 35624.

G-CSF: La incubación con 121a induce un aumento sensible a la dosis de la citoquina G-CSF en PBMC tras estimulación in vitro (Fig. 14). La inducción de G-CSF es cualitativa y cuantitativamente similar a la incubación con 35624.

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La diferencia en la producción de citoquinas refleja diferente capacidad de polarización de los linfocitos T

La liberación de citoquinas por las DC es importante para impulsar la polarización de linfocitos T hacia Th1, Th2, Th17

o linfocitos T reguladores. Dadas las diferencias observadas en la producción de citoquinas, los autores analizan adicionalmente si las MDDC generadas mediante AHF121A tienen la capacidad de inducir linfocitos T reguladores Foxp3+. Las DC se incubaron con AFIF121A durante 5 días y a continuación se cultivaron simultáneamente con linfocitos T CD4+ alogénicos muy purificados no expuestos anteriormente. La población de linfocitos T reguladores CD4+Foxp3+ se analizó a continuación mediante FACS. Los resultados muestran que las células dendríticas estimuladas con AFIF121A impulsan la polarización y/o la expansión del subconjunto de linfocitos T reguladores, que expresan CD25 y Foxp-3. (Fig. 16)

Los inventores postulan que AHF121A genera DC tolerogénicas, que, a su vez, inducen la generación de linfocitos T reguladores CD4+Foxp3+. De hecho, los inventores demostraron que las MDDC cultivadas con AHF121A podían convertir los linfocitos T CD4+CD25-en linfocitos T CD4+CD25-Foxp3+. En resumen, AFIF121A ejerce potentes efectos inmunomoduladores mediante la regulación en exceso o la potenciación de la generación de Tregs por las MDDC in vitro. Los resultados muestran evidencias de la generación de Tregs CD4+CD25-Foxp3+ en respuesta a AFIF121A in vitro, un efecto que puede ser terapéuticamente útil para modular trastornos inflamatorios inmunitarios in vivo. (Fig. 16)

Se había demostrado anteriormente que algunos probióticos (es decir, L. casei y reuteri) pueden inducir el desarrollo de linfocitos T reguladores (32, 41, 42). Se ha demostrado que Bifidobacterium AF11206 media la activación potente de los linfocitos T reguladores en 3 modelos animales diferentes. Además, el consumo de Bifidobacterium AFI1206 protege contra el alistamiento de eosinófilos hacia el pulmón y bloquea la inducción de IgE sérica. En este caso, se postula que los linfocitos T reguladores tienen un papel importante en la regulación de las respuestas inflamatorias específicas de alérgeno (39). Múltiples estudios en modelos animales indican que los linfocitos T CD4 CD25 Foxp3 se alistan hacia ambos pulmones y los ganglios linfáticos drenantes, y pueden suprimir la eosinofilia de las vías respiratorias inducida por alérgeno, la hipersecreción de moco y la hipersensibilidad de las vías respiratorias (43-48).

Numerosos estudios en seres humanos y animales indican ahora que IBD da como resultado una pérdida de tolerancia a las bacterias comensales; El estudio de Round y Mazmanian (49) muestra que PS dirige el desarrollo de los Tregs durante la protección y cura de la colitis experimental. Estos hallazgos son consistentes con estudios que muestran que la producción de IL-10 por linfocitos T Foxp3+ es importante para mediar la tolerancia en las superficies mucosas y para prevenir la inflamación intestinal (49, 50).

Ejemplo 8 -Composiciones ilustrativas

Se indican a continuación ejemplos de composiciones de croquetas secas que comprende las Bifidobacteria probióticas de la presente invención.

Ingrediente: Porcentaje en base peso

Ej. 1: Ej. 2 Ej. 3 Ej. 4

Granos de cereal: Hasta 100 Hasta 100 Hasta 100 Hasta 100

Subproducto cárnico avícola: 43,5 40 45 35

Grasa de ave: 1,28 1,02 1,16 1,35

Producto de huevo: 2,4 2,1 2,5 2,2

Carne de hígado de pollo: 1,0 1,0 1,0 1,0

Levadura de cerveza seca: 1,0 1,0 1,0 1,0

Fosfato monosódico: 1,0 1,0 1,0 1,0

Carbonato de calcio: 0,8 0,8 0,8 0,8

Cloruro de potasio: 0,6 0,6 0,6 0,6

Vitaminas: 0,4 0,4 0,4 0,4

Cloruro de colina: 0,3 0,3 0,3 0,3

Minerales: 0,3 0,3 0,3 0,3

DL-Metionina: 0,1 0,1 0,1 0,1

Cloruro de sodio: 0,03 0,03 0,03 0,03

(continuación)

Ingrediente: Porcentaje en base peso

Ej. 1: Ej. 2 Ej. 3 Ej. 4

Probiótico (1 x 1010 ufc/g NCIMB 41675 en aceite de girasol): 1 0,5 - 0,6

Probiótico (1 x 1010 ufc/g NCIMB 41675 en aceite de girasol): ufc/g 0,5 1 0,4

Se indican a continuación ejemplos de composiciones de pienso para animales de compañía que comprende las Bifidobacterium longum probióticas de la presente invención.

Ingrediente: Porcentaje en base peso

Ej. 5: Ej. 6 Ej. 7

Agua: Hasta 38 Hasta 47 Hasta 50

Hígado de ave de corral: Hasta 25 Hasta 20 Hasta 15

Productos avícolas: 25 20 20

Arroz machacado: 5 7 10

Producto de huevo: 3 2,5 1,5

Grasa de ave: 2,9 3,0 3,2

Carne de ave: 0,6 0,7 0,9

Taurina: 0,1 0,1 0,1

Vitaminas: 0,05 0,1 0,1

Minerales: 0,05 0,1 0,1

Probiótico (1 x 10 ufc/g NCIMB 41675): 4 5 6

Se indican a continuación ejemplos de composiciones de suplemento para yogurt que comprende las Bifidobacterium longum probióticas de la presente invención.

Ingrediente: Porcentaje en base peso

Ej. 8: Ej. 9 Ej. 10

Leche: 38 42 48

Azúcar: 12 12 10

Almidón modificado: 1,0 0,8 0,8

Materiales prebióticos: 0,25 0,3 0,5

Probiótico (1 x 1010 ufc/g NCIMB 41675): 4 5 6

Aunque se han ilustrado y descrito realizaciones determinadas de la presente invención, resulta evidente para el experto en la técnica que es posible realizar diferentes cambios y modificaciones sin abandonar por ello el ámbito de la invención. Por consiguiente, las reivindicaciones siguientes pretenden cubrir todos esos cambios y modificaciones

10 contemplados dentro del ámbito de esta invención.

Referencias

1. McCracken V.J. and Gaskins H.R. Probiotics and the immune system. In: Probiotics a critical review, Tannock, GW (ed), Horizon Scientific Press, UK. 1999, p.85-113.

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Claims

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