PT1986669E - Utilização de bifidobacterium longum para a prevenção e tratamento de inflamação - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"UTILIZAÇÃO DE BIFIDOBACTERIUM LONGUM PARA A PREVENÇÃO E TRATAMENTO DE INFLAMAÇÃO"

Esta invenção refere-se a um método para a prevenção e tratamento de inflamação.

No passado recente, certas estirpes de bactérias atraíram atenção considerável porque se verificou exibirem propriedades valiosas para o homem, se ingeridas. Em particular, verificou-se que estirpes específicas do género Lactobacillus e Bifidobacterium eram capazes de se estabelecerem, elas próprias, no tracto intestinal e transientemente colonizarem o intestino, para reduzir a aderência de bactérias patogénicas ao epitélio intestinal, para ter efeitos imunomodulatórios e auxiliar na manutenção do bem-estar. Estas bactérias são normalmente denominadas probióticas.

Foram efectuados estudos extensivos para identificar novas estirpes probióticas. Por exemplo, os documentos EP 0199535, EP 0768375, WO 97/00078, EP 0577903 e WO 00/53200 divulgam estirpes específicas de lactobacilli e bifidobacteria e seus efeitos benéficos. A inflamação é uma reacção complexa do sistema imunitário inato que envolve a acumulação e activação de leucócitos e proteína plasmática nos sítios de infecção, exposição a toxina ou lesão celular. Embora a inflamação tenha uma função 1 protectora no controlo de infecções e promotora da reparação de tecidos, pode também causar lesões de tecido e doença. As doenças gastrointestinais, tal como doença inflamatória intestinal (por exemplo, doença de Crohn, colite ulcerosa, e pouchite), alergias alimentares e dermatite atópica resultante de alergias alimentares são sempre acompanhadas por respostas inflamatórias intestinais aberrantes a diferentes níveis. 0 alívio nesta inflamação intestinal através do equilíbrio de citocinas pro- e anti-inflamatórias ou indução de citocinas regulatórias foram sugeridas como um possível tratamento para estas doenças crónicas. Existem várias destas citocinas, das quais IFN—γ, IL1, IL8, IL12 e TNF-oí, por exemplo, são vistas como pro-inflamatórias e IL10 e TGF-β, por exemplo, são vistas como anti-inflamatórias.

Os macrófagos são células fagocíticas de base tecidular derivadas de monócitos que desempenham um importante papel na resposta imunitária inata. Estes são activados por componentes microbianos e, uma vez activados, podem, eles mesmos, segregar citocinas pro- e anti-inflamatórias. Em "Stimulation of the Secretion of Pro-inflammatory Cytokines by Bifidobacterium Strains" (Microbiol. Immunol., 46(11), 781 - 785, 2002) He et al. investigaram a capacidade de diferentes estirpes de bifidobactérias para afectar a produção de citocinas derivadas de macrófagos. Estes verificaram que as bifidobactérias "de tipo adulto", tais como Bifidobacterium adolescentis e Bi f idobacterium longum, induziam significativamente mais secreção de citocina pro-inflamatória do que as bifidobactérias "de tipo criança", tais como Bifidobacterium bifidum,

Bifidobacterium breve e Bifidobacterium infantis. Adicionalmente, notaram que B. adolescentis, em particular, não estimulava a 2 produção da citocina anti-inflamatória IL-10. Estes concluíram que bifidobactérias de tipo adulto podem ser mais potentes para amplificar, mas menos capazes de regular negativamente, a resposta inflamatória.

Mais recentemente, as tentativas para identificar as estirpes probióticas anti-inflamatórias mais promissoras para utilização em humanos indicaram que as generalizações feitas por He et al. são provavelmente pouco fiáveis uma vez que foi agora demonstrado que as propriedades de uma estirpe específica - por exemplo, as suas propriedades anti-inflamatórias - não podem ser previstas com precisão por referência à sua classificação taxonómica.

Sumário da Invenção A presente requerente verificou surpreendentemente que uma estirpe probiótica específica de B. longum, nomeadamente Bifidobacterium longum ATCC BAA-999, possui propriedades anti-inflamatórias excepcionais.

Do mesmo modo, a presente invenção proporciona a utilização de Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 na preparação de um medicamento ou composição nutricional terapêutica para prevenção ou redução de inflamação num mamífero. A invenção tem utilização num método de prevenção ou redução da inflamação num doente mamífero em necessidade deste que compreende a administração ao doente de uma quantidade terapêutica de Bifidobacterium longum ATCC BAA-999. 3 A presente invenção pode ser utilizada em circunstâncias em que se deseja a prevenção ou redução da inflamação intestinal, independentemente do estado subjacente que pode ser, por exemplo, uma reacção a um alergénio alimentar, inflamação intestinal crónica ou aguda causada por uma doença do tracto gastrointestinal, tais como doença intestinal inflamatória ou colite, inflamação pós-infecciosa ou inflamação crónica sub-clinica nos mais idosos, assim como em circunstâncias em que se deseja prevenir inflamação no sentido profiláctico, i. e., em que não existe um estado subjacente que dá origem a inflamação.

Uma vantagem da presente invenção é que pode ser utilizada para reduzir ou prevenir a inflamação num mamífero através da administração oral de uma composição nutricional terapêutica ou medicamento que incorpora o probiótico. Deve ser entendido que esta administração oral é mais aceitável e conveniente para o doente do que uma composição que requer a administração intravenosa ou subcutânea, a qual não requer apenas pessoal especialmente treinado, mas também não é tão segura nem tão conveniente.

Descrição Detalhada da Invenção

Na presente descrição, as palavras que se seguem têm uma definição que deve ser tida em conta durante a leitura e interpretação da descrição, exemplos e reivindicações. "Criança": criança com menos de 12 meses de idade; 4 "Fórmula de criança": alimento que se pretende para a nutrição completa de crianças durante os primeiros quatro a seis meses de vida e como um complemento para outros alimentos até à idade de 12 meses. "Probiótico": preparações de células microbianas ou componentes de células microbianas com um efeito benéfico na saúde ou bem-estar do hospedeiro. (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. et al. "Probiotics: how should they be defined" Trend Food Sei. Technol. 1999:10 107-10). O mamífero pode ser um humano ou um animal de companhia, tal como um cão ou gato. O Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 ("BL999") pode ser administrado por si, por exemplo, incluído em cápsulas contendo cada uma, por exemplo, 108 unidades formadoras de colónias (efu) ou incorporadas numa composição nutricional, tal como uma fórmula nutricionalmente completa (por exemplo, uma fórmula para criança ou um produto nutricional clínico), um produto lacticínio, uma bebida energética, uma sopa desidratada, um suplemento dietético, um substituto alimentar, uma barra nutricional, um cereal, um produto confeccionado ou um alimento seco para animais. Quando incorporado numa composição nutricional, BL999 pode estar presente na composição numa quantidade equivalente entre 104 e 1012 efu/g (peso seco) . Estas expressões de quantidade incluem as possibilidades de as bactérias estarem vivas, inactivadas ou mortas, ou mesmo presentes como fragmentos, tais como o ADN ou materiais da parede celular ou como metabolitos. Por outras palavras, as quantidades de bactérias são expressas em termos de capacidade 5 formação de colónias dessa quantidade de bactérias, como se todas as bactérias estivessem vivas independentemente de estarem, de facto, vivas, inactivadas ou mortas, fragmentadas ou uma mistura de qualquer ou de todos estes estados. De um modo preferido, a BL999 está presente numa quantidade equivalente a entre 105 a IO10, de um modo mais preferido, 107 a IO10 cfu/g de composição seca. A BL999 pode ser obtida da Morinaga Milk Industry Co. Ltd. do Japão, sob o nome comercial de BB536. Pode ser cultivada de acordo com qualquer método adequado e preparada para encapsulação ou adição a uma composição nutricional por liofilização ou secagem por aspersão, por exemplo. Alternativamente, pode ser adquirida já preparado numa forma adequada para adição a produtos alimentares.

Uma fórmula nutricionalmente completa para utilização na presente invenção pode compreender uma fonte de proteína, de um modo preferido, uma proteína dietética, tais como uma proteína animal (por exemplo, proteína de leite, carne ou ovo), uma proteína vegetal (por exemplo, proteína de soja, trigo, arroz ou ervilha); misturas de aminoácidos livres; ou suas combinações. As proteínas de leite, tal como caseína, e proteína de cevada e proteínas de soja são particularmente preferidas. A composição pode também conter uma fonte de hidratos de carbono e uma fonte de gordura.

Se a fórmula incluir uma fonte de gordura, de um modo preferido, proporciona 5% a 55% da energia da fórmula; por exemplo, 20% a 50% da energia. Os lípidos que constituem a fonte de gordura podem ser qualquer gordura adequada ou mistura gorda. 6

As gorduras vegetais, tais como óleo de soja, óleo de palma, óleo de côco, óleo de açafrão, óleo de girassol, óleo de milho, óleo de canola e lecitinas são particularmente adequadas. As gorduras animais, tal como gordura de leite, podem também ser adicionadas, se desejado.

Se a fórmula incluir uma fonte de hidratos de carbono, de um modo preferido, proporciona 40% a 80% da energia da fórmula.

Qualquer hidrato de carbono adequado pode ser utilizado, por exemplo, sacarose, lactose, glucose, frutose, sólidos de xarope de milho, maltodextrinas e suas misturas. As fibras dietéticas podem ser também adicionadas, se desejado. A fibra dietética pode ser de qualquer origem adequada, incluindo, por exemplo, soja, ervilha, aveia, pectina, goma de guar, goma-arábica, fruto-oligosacáridos, galacto-oligossacáridos, sialil-lactose e oligossacáridos derivados de leites animais. Vitaminas e minerais adequados podem ser incluídos na forma nutricional numa quantidade que preencha as linhas de orientação apropriadas.

Um ou mais emulsificantes de grau alimentar podem ser incorporados na forma nutricional, se desejado; por exemplo, ésteres de ácido diacetiltartárico de mono- e di- glicéridos, lecitina e mono- e di-glicéridos. De modo semelhante, sais e estabilizantes adequados podem ser incluídos. A fórmula nutricionalmente completa pode ser preparada de qualquer modo adequado. Por exemplo, a fonte de proteína, a fonte de hidrato de carbono e a fonte de gordura podem ser misturadas em conjunto em proporções adequadas. Se utilizados, os emulsificantes pode ser incluídos na mistura. As vitaminas e minerais podem ser adicionados neste ponto mas são normalmente 7 adicionados mais tarde para evitar degradação térmica. Quaisquer vitaminas lipofílicas, emulsificantes e semelhantes podem ser dissolvidos na fonte de gordura antes da mistura. A água, de um modo preferido, a água que foi submetida a osmose reversa, pode então ser misturada na forma de uma mistura liquida. A mistura liquida pode então ser termicamente tratada para reduzir cargas bacterianas. Por exemplo, a mistura liquida pode ser rapidamente aquecida a uma temperatura no intervalo de cerca de 80 °C a cerca de 110 °C, durante cerca de 5 segundos a cerca de 5 minutos. Isto pode ser efectuado por injecção de vapor ou por trocador de calor; por exemplo, um prato trocador de calor. A mistura líquida pode então ser arrefecida a uma temperatura num intervalo de cerca de 60 °C a cerca de 85 °C; por exemplo, por arrefecimento rápido. A mistura líquida pode ser então homogeneizada; por exemplo, em dois estádios de cerca de 10 MPa a cerca de 30 MPa no primeiro estádio e cerca de 2 MPa a cerca de 10 MPa no segundo estádio. A mistura homogeneizada pode então ser, ainda, arrefecida para adicionar alguns componentes sensíveis ao calor; tais como vitaminas e minerais. 0 pH e conteúdo em sólidos da mistura homogeneizada é convenientemente padronizado neste ponto. A mistura homogeneizada pode então ser transferida para um aparelho de secagem adequado, tais como um secador por aspersão ou liofilizador e convertido em pó. O pó deve ter um conteúdo em humidade inferior a cerca de 5% em peso. A BL999 pode ser adicionada ao pó na quantidade desejada por mistura a seco.

Um alimento seco para animais para utilização na presente invenção pode incluir qualquer um ou mais de uma fonte de hidrato de carbono, uma fonte de proteína e fonte de lípido.

Qualquer fonte de hidrato de carbono adequada pode ser utilizada. De um modo preferido, a fonte de hidrato de carbono é proporcionada na forma de grãos, farinhas ou amidos. Por exemplo, a fonte de hidratos de carbono pode ser arroz, cevada, sorgo, milho, aveia, farelo de milho ou farinha de trigo. Os açúcares simples, tais como sacarose, glucose e xaropes de milho podem também ser utilizados. A quantidade de hidratos de carbono proporcionada pela fonte de hidratos de carbono pode ser selecionada como desejado. Por exemplo, o alimento para animais pode conter até cerca de 60% em peso de hidratos de carbono.

As fontes de proteína adequadas podem ser seleccionadas de qualquer fonte de proteína animal ou vegetal adequada; por exemplo, carne muscular ou esquelética, carne e ossos moídos, aves moídas, peixe moído, proteínas do leite, glúten de amido, glúten de trigo, farinha de soja, concentrados de proteína de soja, isolados de proteína de soja, proteínas do ovo, soro de leite, caseína, glúten e semelhantes. Para animais idosos, é preferido que a fonte de proteína contenha uma proteína animal com qualidade elevada. A quantidade de proteína proporcionada pela fonte de proteína pode ser seleccionada como desejado. Por exemplo, o alimento para animais pode conter cerca de 12% a cerca de 70% em peso de proteína numa base seca. O alimento para animais pode conter uma fonte de gordura. Qualquer fonte de gordura adequada pode ser utilizada. De um modo preferido, a fonte de gordura é uma fonte de gordura animal, tal como sebo. Os óleos vegetais, tais como óleo de milho, óleo de girassol, óleo de açafrão, óleo de colza, óleo de soja, azeite e outros óleos em ácidos gordos monoinsaturados e poli-insaturados, podem também ser utilizados. Para além dos ácidos gordos essenciais (ácido linoleico e alfa-linoleico) , a fonte de gordura pode incluir ácidos gordos de cadeia longa. Os ácidos gordos de cadeia longa adequados incluem, ácido gama-linoleico, ácido estearidónico, ácido araquidónico, ácido eicosaperitanóico e ácido docosa-hexanóico. Os óleos de peixe são uma fonte adequada de ácidos eicosapentanóicos e ácido docosa-hexanóicos. 0 óleo de borragem, o óleo de sementes de groselha e óleo de prímula são fontes adequadas de ácido gama-linoleico. 0 óleo de colza, óleo de soja, óleo de linhaça e óleo de noz são fontes adequadas de ácido alfa-linolénico. Os óleos de açafrão, óleos de girassol, óleos de milho e os óleos de semente de soja são fontes adequadas de ácido linoleico. Azeite, óleo de colza (canola), óleo de girassol com oleico elevado, óleo de açafrão, óleo de amendoim e o óleo de farelo de arroz são fontes adequadas de ácidos gordos monoinsaturados. A quantidade de gordura proporcionada pela fonte de gordura pode ser seleccionada como desejado. Por exemplo, o alimento para animais pode conter cerca de 5% a cerca de 40% em peso de gordura numa base seca. De um modo preferido, o alimento para animais tem uma quantidade relativamente reduzida de gordura. A escolha das fontes de hidrato de carbono, proteína e lípido não é crítica e será seleccionada com base nas necessidades nutricionais do animal, considerações de palatabilidade e o tipo de produto produzido. Além disso, vários outros ingredientes, por exemplo, açúcar, sal, especiarias, condimentos, vitaminas, minerais, agentes de aromatização, gomas 10 e microrganismos probióticos podem ser também incorporados no alimento para animais, como desejado.

Para animais idosos, o alimento para animais contém, de um modo preferido, proporcionalmente menos gordura do que o alimento para animais de estimação mais jovens. Além disso, as fontes de amido podem incluir um ou mais de aveia, arroz, cevada, trigo e milho. 0 alimento para animais pode ser produzido por extrusão ao cozinhar, embora a cozedura e outros processos adequados possam ser utilizados. Quando sujeito a extrusão ao cozinhar, o alimento para animais é normalmente proporcionado na forma de um croquete. A BL999 é, de um modo preferido, revestida ou um enchimento no alimento seco para animais. 0 processo adequado é descrito no Pedido de Patente Europeia N° 0862863. A invenção será a seguir descrita em mais detalhe por referência aos exemplos que se seguem. Nas Figuras:

Figura 1 compara a percentagem de actividade de NFkB após estimulação das células intestinais in vitro com LPS na presença de quatro diferentes bifidobactérias (ensaio de gene repórter NFkB à base de células);

Figura 2 compara a classificação fecal observada num modelo de colite de murganho que mima as patologias IBD (colite induzida por DSS) com e sem a intervenção de BL999;

Figura 3 compara as classificações de inflamação macroscópica observadas num modelo de colite de murganho que 11 mima as patologias IBD (Colite induzida por DSS) com e sem intervenção de BL999;

Figura 4A a E compara as classificações individuais de Wallace (A) , as classificações medias de Wallace (B) , a percentagem de protecção (C) , a actividade de mieloperoxidase (D) e a perda de peso em dois dias (E) observada num Modelo de colite induzida por TNBS quando dois grupos receberam uma intervenção com BL999 em diferentes niveis de dosagem e o grupo de controlo não recebeu bactérias; e

Figura 5 compara a capacidade protectora de BL999 no mesmo modelo de colite de murganho com a de B. longum NCC2705, L. rhammosus ATCC 53103, L. johnsonii CNCM 1-1225, L. plantarum NCIMB8826, L. lactis NZ9000 e MG1363; e com o efeito protector do medicamento prednisolona.

Exemplo 1

Um exemplo da composição de uma fórmula para crianças para utilização na presente invenção é dada a seguir. Esta composição é dada apenas para ilustração.

Nutriente por 100 kcal por litro Energia (kcal) 100 670 Proteína (g) 1,83 12,3 Gordura (g) 5,3 35, 7 Ácido Linoleico (g) 0, 79 5,3 Ácido oí-Linolénico (mg) 101 675 Lactose (g) 11,2 74, 7 12 (continuação)

Minerais (g) 0,37 2,5 Na (mg) 23 150 K (mg) 89 590 Cl (mg) 64 430 Ca (mg) 62 410 P (mg) 31 210 Mg (mg) 7 50 Mn (pg) 8 50 Se (pg) 2 13 Vitamina A (pg RE) 105 700 Vitamina D (pg) 1,5 10 Vitamina E (mg TE) 0,8 5,4 Vitamina Kl (pg) 8 54 Vitamina C (mg) 10 67 Vitamina BI (mg) 0,07 0, 47 Vitamina B2 (mg) 0,15 1,0 Niacina (mg) 1 6, 7 Vitamina B6 (mg) 0,075 0,50 Ácido fólico (pg) 9 60 Ácido pantoténico (mg) 0,45 3 Vitamina B12 (Pg) 0,3 2 Biotina (pg) 2,2 15 Colina (mg) 10 67 Fc (mg) 1,2 8 i (pg) 15 100 Cu (mg) 0,06 0,4 Zn (mg) 0, 75 5 B. longum BB 536 10y cfu/g de bactérias vivas em pó 13

Exemplo 2

Este exemplo compara a actividade inibidora de BL999 com os efeitos inibidores de outras estirpes bacterianas probióticas num ensaio do gene repórter à base de células para o factor nuclear kapa B (NFkB).

Foi publicada bastante literatura sobre o papel central que o factor de transcrição NFkB desempenha na indução e perpetuação de eventos inflamatórios. 0 NFkB é activado em resposta a bactérias patogénicas entero-invasivas e outros estímulos inflamatórios que levam à produção de moléculas inflamatórias, tal como factor-ot de necrose de tumor (TNF-α) , interleuquina-8 (IL-8), molécula-1 de adesão intracelular (ICAM-1) e ciclo-oxigenase indutível (COX-2).

Uma linha de células epiteliais intestinal humana (HT29 NFkB) que expressa de forma estável uma construção de gene repórter (fosfatase alcalina segregada) sob o controlo do promotor endógeno NFkB foi utilizada neste estudo (Blum S et al. ; Riedel C. et al. World J Gastroenterol. 2006 em impressão). Foi medida a capacidade de quatro estirpes de bifidobactérias para inibirem a actividade de NFkB induzida por lipopolissacárido (LPS) nestas células. As células foram incubadas com B. bifidum preparado de fresco (NCC 189, CNCM 1-2333), B. infantis (NCC 200, CNCM 1-2334), B. pseudocatenulatum (NCC 291) e B. longum (NCC 3001, ATCC BAA-999) para uma proporção de célula para bactéria de 1:100. Após 1 h de pré-incubação de células com bactérias, foi adicionado LPS a 10 ng/mL por mais 4 h e os sobrenadantes de cultura foram recolhidos para medição da actividade repórter 14 mediada por NFkB. 0 ensaio foi efectuado em duplicado e repetido, pelo menos, 3 vezes com cada repetição normalizada para estimulação com LPS sem bactérias, sem controlo de bactérias. Os dados são apresentados na Figura 1 como a percentagem média de actividade de NFkB estimulada por LPS ± SEM.

Pode ser observado que as células tratadas com LPS tinham uma indução de 10 vezes na actividade de NFkB após 4 h de incubação. Todas as estirpes de bifidobactérias modularam negativamente a actividade de NFkB, no entanto, BL999 tinha a maior actividade inibidora neste ensaio. Em conclusão, a BL999 é uma excelente estirpe candidate para aplicações em que a inibição de actividade inflamatória é de grande valor.

Exemplo 3

Este exemplo demonstra a capacidade de BL999 e seus metabolitos para prevenir a inflamação num modelo de murganho de IBD.

Um modelo de colite de murganho induzida por sulfato de dextrano de sódio (DSS) reconhecido como modelo relevante para as patologias IBD foi utilizado nesta experiência (Blumberg RS et ai., Current Opin. Immunol. 1999; 11(6):648-56). A administração de DSS induz lesões histopatológicas no intestino grosso do mesmo modo ao observado nos doentes com colite ulcerosa. O tratamento com DSS foi administrado de modo a induzir inflamação intestinal aguda. 15

Grupos experimentais e dietas: • "Controlo-MRS": murganho alimentado com a dieta de controlo (Tabela 1) ad libitum, com livre acesso a água da torneira durante toda a experiência e recebendo uma sonda intra-gástrica diária de MRS desde o dia 1 ao dia 14 • "DSS-MRS": murganho alimentado com a dieta de controlo ad libitum durante toda a experiência, com livre acesso a água da torneira contendo 1% de DSS desde o dia 7 ao dia 14 e recebendo uma sonda intra-gástrica diária de MRS desde o dia 1 ao dia 14 • "DSS-BL": murganho alimentado com a dieta de controlo durante toda a experiência, desde o dia 1 ao dia 14, com livre acesso a água da torneira contendo 1% de DSS desde o dia 7 ao dia 14 e recebendo uma sonda intra-gástrica diária de BL999 (NCC3001) (109 cfu/murganho/dia) desde o dia 1 ao dia 14 16

Tabela 1: Dieta de controlo

Componentes Percentagem na dieta (peso %) Amido resistente (Cerestar SF 12018) 40,0 Caseína solúvel 20,0 Sacarose 27,3 DL-metionina 0,3 Óleo de milho 5, 0 Celulose 2, 0 Mineral premix AIN 93 4,4 Vitamina premix AIN 93 1,0 A experiência animal foi conduzida como se segue. Murganhos machos BALBc/J (8 semanas, Janvier, França) foram aleatoriamnete distribuídos em 4 grupos experimentais (n=10 murganhos por grupo). Durante um período de aclimatização de 7 dias, os murganhos tinham livre acesso a água da torneira e receberam a dieta de controlo. Depois, os murganhos no Grupo DSS-BL receberam uma sonda intra-gástrica diária de BL999 (109 cfu/murganho/dia) com o sobrenadante da cultura durante 14 dias enquanto os murganhos nos outros dois grupos receberam uma sonda intra-gástrica diária de MRS. Adicionalmente, desde o dia 7 ao dia 14, os murganhos em ambos os grupos DSS-MRS e DSS-BL receberam 1% de DSS na sua água de beber enquanto o grupo de Controlo recebeu água da torneira normal.

Em cada 2 dias, durante a experiência, as amostras fecais de cada murganho foram examinadas e a consistência, e presença ou ausência de sangue foi registada (Hemoccult II, SKD, Roissy, França). Foi calculada uma classificação fecal como indicado na Tabela 2 e os resultados são apresentados na Figura 2. 17

Tabela 2. Escala seguida para classificar os sintomas clinicos dos murganhos

Intensidade da classificação Observações Classificação de fezes 0 Normal, dura 1 Macia, bem formada, adesiva 2 Não formada 3 Líquida, diarreia

No final do período de 14 dias, os murganhos foram sacrificados por deslocamento cervical. Os segmentos ceco-colónicos foram rapidamente removidos do animal, suavemente lavados com um tampão fisiológico salino e avaliados quanto a sinais inflamatórios macroscópicos após a adaptação da escala previamente publicada por Appleyard e Wallace (Appleyard C.B e Wallace J.L. "Reactivation of hapten-induced colitis and its prevention by anti-inflammatory drugs" Am J. Physiol 269, G119 -125) (Tabela 3). Os resultados são apresentados na Figura 3. 18

Tabela 3. Critério para classificação macroscópica de lesões ceco-colónicas (Appleyard e Wallace)

Classificação Aparência Espessamento 0 Mucosa normal 1 Espessamento moderado 2 Espessamento grave

Ulcerações 0 Nenhuma 1 Vermelhidão 2 Ulcerações ligeiras 3 Ulcerações fortes Conteúdo ceco-colónico 0 Sem sangue 1 Algum sangue 2 Muito sangue

Das figuras 2 e 3, pode ser observado que a BL999 normaliza eficazmente as características das fezes e reduz significativamente a inflamação no ceco e cólon proximal e distai em comparação com a observada no grupo DSSMRS. Deste modo, pode ser observado que BL999 é eficaz na prevenção de inflamação induzida por DSS uma vez que os murganhos no grupo DSS-BL receberam bactérias antes e durante a administração de DSS. 19

Exemplo 4

Neste exemplo, o potencial anti-inflamatório das bactérias BL999 foi investigado e comparado com o de outras estirpes de bactérias do ácido láctico, assim como com prednisolona, um fármaco anti-inflamatório normalmente utilizado, utilizando um modelo de murganho de colite aguda induzida por TNBS.

Foram investigadas as seguintes estirpes bacterianas: N° NCC Estirpe N° de depósito oficial NCC 3001 Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 NCC 2705 Bifidobacterium longum CNCM 1-2618 NCC 3003 Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103 NCC 533 Lactobacillus johnsonii CNCM 1-1225 Lactobacillus plantarum NCIMB8826 Lactococcus lactis NZ9000 Lactococcus lactis MG 1363

As estirpes de Lactobacillus foram cultivadas aerobicamente a 37 °C, em meio MRS (Difco) . As bifidobactérias foram cultivadas anaerobicamente a 37 °C, em MRS suplementado com 0,05% de cloridrato de L-cisteina (Sigma). Lactococcus lactis MG 1363 e Lactococcus lactis NZ9000 foram cultivados a 30 °C, em meio M 17 suplementado com 0,5% de glucose. O número de bactérias (cfu) foi estimado na fase estacionária de crescimento através da medição da absorvência a 600 nm (A6oo) r com a respectiva curva de calibração para cada estirpe. Para experiências in vivo, as bactérias foram cultivadas durante 18 h, 20 g lavadas duas vezes em PBS estéril a pH 7,2 e ressuspensas a 10 e 2xl09 cfu/mL em tampão 0,2 M de NaHC03 contendo 2% de glucose.

Os murganhos adultos fêmeas BALB/C de 7 a 8 semanas de idade foram adquiridos a Charles River. Os murganhos foram aleatoriamente distribuídos em grupos experimentais com 10 murganhos por grupo. Os murganhos foram agrupados por gaiolas (8 a 10 por gaiola) e tiveram livre acesso a água e ração convencional de roedores. Estes foram submetidos a, pelo menos, 1 semana de aclimatização antes de qualquer intervenção. Os murganhos nos grupos tratados com bactérias receberam suspensões bacterianas (correspondendo a 108 cfu/murganho/dia) através de sonda intra-gástrica em tampão 0,2 M de NaHC03 a pH 8,5 com 2% de glucose, desde o quarto dia antes da indução de colite até ao dia da indução de colite. Os murganhos no grupo tratado com prednisolona receberam 10 mg/kg de peso corporal/dia. Os murganhos no grupo de controlo não receberam bactérias ou prednisolona. Além disso, o efeito do nível de dosagem foi investigado por tratamento de um grupo com BL999 a 2,109 cfu/murganho/dia.

Antes da indução de colite, todos os murganhos foram anestesiados através de injecção intraperitoneal de 3 mg de cetamina (Imalgene 1000, Merial, Lyon, França), 46, 7 pg de diazepam (Valium, Roche Diagnostics, França) e 15 pg de atropina (Aguettant Laboratory, Lyon, França) dissolvidos em 0,9% de cloreto de sódio. Depois, a colite foi induzida por administração intra-rectal de 50 pL de ácido trinitrobenzenossulfónico (TNBS, Fluka, França) dissolvido em 0,9% de NaCl/etanol (50/50 v/v) a uma dose de 100-120 mg/kg de peso corporal. A taxa de mortalidade e classificações de 21 inflamação foram avaliadas 48 horas após a administração de TNBS. Os murganhos foram pesados antes da administração de TNBS e do sacrifício, o qual foi efectuado por deslocamento da cervical. 0 cólon foi removido, dissecado sem gordura e mesentério, cuidadosamente aberto e limpo com PBS. As lesões do cólon e a inflamação foram avaliadas de acordo com o critério de Wallace (Wallace J.L. et ai., Inhibition of leukotriene synthesis markedly accelerates healing in a rat model of inflammatory bowell disease" Gastroenterology 96:29-36, 1989). Estes critérios para classificação macroscópica foram bem estabelecidos em estudos de murganhos e reflectem a intensidade de inflamação, o espessamento da mucosa colónica e a extensão da ulceração. A lesão do cólon e inflamação foram classificadas de forma cega por dois investigadores.

Adicionalmente, a actividade da mieloperoxidase (MPO), um marcador de grânulos primários de neutrófilos polimorfonucleares, foi determinada de acordo com um método modificado de Bradley et al.("Measurement of cutaneous inflammation: estimation of neutrophil content with an enzyme marker" J Invest Dermatol. 60(3):618-22). A concentração de proteínas foi determinada pelo método de Lowry e a actividade de MPO expressa como U MPO/cm de intestino. A actividade de MPO foi determinada no tecido do cólon proximal, imediatamente após o sacrifício. Uma amostra colónica (1 cm de comprimento) foi retirada a 3 cm da junção ceco-colónica, suspensa em tampão de fosfato de potássio (50 mmol/L, pH 6,0) e homogeneizada em gelo utilizando um politrão. Foram efectuados três ciclos de congelamento e 22 descongelamento e as suspensões foram centrifugadas a 10000 g durante 15 min a 4 °C. Os sobrenadantes foram rejeitados e os sedimentos foram ressuspensos em tampão detergente de brometo de hexadeciltrimetilamónio (HTAB a 0,5%, p/v, em tampão a 50 mmol/L de fosfato de potássio, pH 6,0), induzindo a libertação de MPO a partir de grânulos primários de neutrófilos polimorfonucleares. As suspensões obtidas foram sonicadas em gelo e de novo centrifugadas durante 15 min a 4 °C. Os sobrenadantes foram diluídos em tampão de fosfato de potássio (pH 6,0) contendo 0,167 mg/mL de cloridrato de O-dianisidina e 0,0005% de peróxido de hidrogénio (H2O2) . O MPO de neutrófilos humanos (0,1 U/100 mL, Sigma) foi utilizado como padrão. As alterações na absorvência a 450 nm, durante 5 e 10 min, foram registadas com um espectrofotómetro de microplacas (ELX808, Bio-Tek Instrument, CA). Uma unidade de actividade de MPO foi definida como a quantidade de MPO que degrada 1 mmol de peróxido de hidrogénio/min/mL a 25 °C.

Os resultados foram analisados pela análise de variância não-paramétrica de uma via, teste U de Mann-Whitney. As diferenças foram julgadas como sendo estatisticamente significativas quando o valor de p foi <0,05.

Os resultados são apresentados na Figura 4, A a E e Figura 5. A Figura 4A e B compara as classificações individuais de Wallace e as classificações médias de Wallace de murganhos tratados com BL999 aos dois níveis de dosagem, 108 cfu/murganho/dia e 2,109 cfu/ murganho/dia com o grupo de controlo que não recebeu bactérias. Pode ser observado que murganhos de ambos os grupos que receberam BL999 tinham classificações de Wallace 23 substancialmente inferiores às dos murganhos no grupo de controlo. A Figura 4C mostra a percentagem de protecção proporcionada pela BL999. Isto corresponde à redução da inflamação macroscópica média de murganhos tratados com bactérias (n=10) em relação à classificação dos murganhos controlo tratados com TNBS (murganhos tratados com tampão NaOHCCb, n=10). A Figura 4D compara a actividade média de MPO dos murganhos tratados com BL999 aos dois níveis de dosagem com o grupo de controlo. Pode ser observado que os murganhos de ambos os grupos que receberam BL999 tinham uma actividade de MPO substancialmente inferior à dos murganhos no grupo de controlo. A Figura 4E compara a perda de peso em 2 dias de murganhos tratados com BL999 aos dois níveis de dosagem com o grupo de controlo. Pode ser observado que os murganhos de ambos os grupos que receberam BL999 tinham perdas de peso substancialmente inferiores à dos murganhos no grupo de controlo. A Figura 5 compara a percentagem de protecção proporcionada pelas várias estirpes de ácido láctico testadas e pela administração de prednisolona. Pode ser observado que BL999 proporciona um grau de protecção marcadamente maior ao de outras estirpes bacterianas testadas e um nível comparável de protecção ao medicamento.

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Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 na preparação de um medicamento ou composição nutricional terapêutica para prevenção ou redução de inflamação num mamifero.
2. 2.
3. 3. Utilização da Reivindicação 1, em que a composição nutricional terapêutica é uma fórmula para crianças. a composição para animais Utilização da Reivindicação 1, em que nutricional terapêutica é um alimento domésticos.
4. 4. Utilização de qualquer reivindicação anterior, em que a inflamação é inflamação intestinal.
5. 5. Utilização de qualquer reivindicação anterior, em que a composição nutricional terapêutica contém de 104 a 1012 cfu/g de Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 numa base de peso seco.
6. 6. Utilização de qualquer reivindicação anterior, em que a composição nutricional terapêutica contém de 105 a IO10 cfu/g de Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 numa base de peso seco. /· Utilização de qualquer reivindicação anterior, em que a composição nutricional terapêutica contém de 107 a IO10 cfu/g 1 de Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 numa base de peso seco.
7. BAA-999 na nutricional inflamatória BAA-999 na nutricional al associada longum ATCC ou composição da doença
8. 8. Utilização de Bifidobacterium preparação de um medicamento terapêutica para tratamento intestinal.
9. 9. Utilização de Bifidobacterium longum ATCC preparação de um medicamento ou composição terapêutica para redução da inflamação intestii com alergias alimentares. Lisboa, 2 de Maio de 2012 2