BRPI0707937A2

BRPI0707937A2 - uso de bifidobacterium longum para a prevenÇço e tratamento de inflamaÇço

Info

Publication number: BRPI0707937A2
Application number: BRPI0707937-0A
Authority: BR
Inventors: Annick Mercenier; Stephanie Blum-Sperisen; Florence Rochat
Original assignee: Nestec Sa
Priority date: 2006-02-15
Filing date: 2007-02-14
Publication date: 2011-05-10
Also published as: CN101420965A; ATE551063T1; ES2381211T3; MX2008010422A; AU2007216461A1; CN101420965B; PT1986669E; EP1986669A1; RU2008136876A; CA2642431A1; WO2007093619A1; US20120201785A1; PL1986669T3; RU2445362C2; US9456630B2; ZA200807879B; US20090274661A1; AU2007216461B2; MY148872A; EP1986669B1

Abstract

USO DE BIFIDOBACTERIUM LONGUM PARA A PREVENÇçO E TRATAMENTO DE INFLAMAÇçO. A presente invenção refere-se ao uso na produção de um medicamento ou uma composição nutricional terapêutica para prevenção ou redução de uma inflamação em um mamífero, Bifídobacterium longum ATCO BAA-999.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE Bl-FIDOBACTERIUM LONGUM PARA A PREVENÇÃO E TRATAMENTO DEINFLAMAÇÃO".

A presente invenção refere-se a um método para a prevenção eo tratamento de inflamações.

Nos últimos anos, certas cepas de bactérias chamaram consi-derável atenção pelo fato de se ter descoberto que elas apresentam propri-edades valiosas para o homem se ingeridas. Em particular, cepas específi-cas dos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium mostraram que são capa-zes de se estabelecer no trato intestinal e colonizar temporariamente o intes-tino, reduzindo a aderência de bactérias patogênicas ao epitélio intestinal,tendo efeitos imunomoduladores e ajudando a manter o bem-estar. Taisbactérias são comumente chamadas de probióticos.

Foram realizados longos estudos para identificar novas cepasde probióticos. Por exemplo, os documentos EP 0 199 535, EP 0 768 375,WO 97/00078, EP 0 577 903 e WO 00/53200 descrevem cepas específicasde Iactobacilos e bifidobactérias e seus efeitos benéficos.

Inflamação é uma reação complexa do sistema imunológico ina-to que envolve o acúmulo e a ativação de leucócitos e proteínas plasmáticasnos locais de infecção, exposição a toxinas ou danos celulares. Embora ainflamação funcione como uma função protetora no controle de infecções ena promoção de restauração de tecidos, ela também pode causar danos aostecidos e doenças. Doenças gastrointestinais tais como doença do intestinoinflamado (por exemplo doença de Crohn, colite ulcerativa, e bolsite), alergi-as alimentares e dermatite atópica resultante de alergias alimentares vêmsempre acompanhadas de respostas inflamatórias intestinais aberrantes emdiferentes níveis. O alívio desta inflamação através do equilíbrio de citoqui-nas pró-inflamatórias e antiinflamatórias ou através da indução de citoquinasreguladoras já foi sugerido como um possível tratamento para essas doen-ças crônicas. Existem inúmeras destas citoquinas das quais IFN-γ, ILI, IL8,IL12 and TNF-α por exemplo são consideradas pró-inflamatórias e IL10 eTGF-β por exemplo são consideradas antiinflamatórias.Macrófagos são células fagocitárias teciduais derivadas de mo-nócitos que desempenham um papel importante na resposta imune inata.Eles são ativados por componentes microbianos e, uma vez ativados, po-dem secretar tanto citoquinas pró-inflamatórias quanto citoquinas antiinfla-matórias. Em "Stimulation of the Secretion of Pro-Inflammatory Cytokines byBifidobacterium Strains" (Microbiol. Immunol., 46(11), 781 - 785, 2002) Heet ai. investigaram a capacidade de diferentes cepas de bifidobactérias deafetar a produção de citoquinas derivadas de macrófagos. Eles descobriramque bifidobactérias do "tipo adulto" tais como Bifidobacterium adoiescentis eBifidobacterium Iongum induziam uma secreção de citoquinas pró-inflamatórias significativamente maior do que bifidobactérias do "tipo bebê"tais como Bifidobacterium bifidum, Bifidobaeterium breve e Bifidobaeteriuminfantis. Além disso eles notaram que a B. adoiescentis em particular nãoestimulava a produção da citoquina antiinflamatória IL-10. Eles concluíramque bifidobactérias do tipo adulto podem ser mais potentes para amplificar,porém menos capazes de infra-regular, a resposta inflamatória.

Mais recentemente, tentativas de identificar as cepas probióti-cas antiinflamatórias mais promissoras para uso humano indicaram que asgeneralizações feitas por He et al. possivelmente não são confiáveis umaque foi agora demonstrado que as propriedades de uma cepa específica -por exemplo suas propriedades antiinflamatórias - não podem ser previstascom exatidão com relação a sua classificação taxonômica.

Sumário da Invenção

Os presentes inventores descobriram surpreendentemente queuma cepa probiótica específica de B. longum, a saber, Bifidobaeterium Ion-gum ATCC BAA-999, possui propriedades antiinflamatórias excepcionais.

Por conseguinte, a presente invenção fornece o uso de Bifido-baeterium longum ATCC BAA-999 na produção de um medicamento oucomposição nutricional terapêutica para prevenir ou reduzir uma inflamaçãoem um mamífero.

A invenção refere-se ainda a um método de prevenção ou redu-ção de inflamação em um paciente mamífero com necessidade do mesmoque compreende administrar ao paciente uma quantidade terapêutica deBifidobacterium Iongum ATCC BAA-999.

A presente invenção pode ser usada em circunstâncias em quese deseja prevenir ou reduzir uma inflamação intestinal independente dacondição básica que pode ser, por exemplo, uma reação a um alérgeno ali-mentar, uma inflamação intestinal crônica ou aguda causada por uma doen-ça do trato gastrointestinal tal como doença do intestino inflamado ou colite,inflamação pós-infecciosa ou inflamação subclínica crônica em idosos assimcomo em circunstâncias em que se deseja prevenir uma inflamação no sen-tido de profilaxia, isto é, em que não há qualquer condição básica dandoorigem à inflamação.

Constitui uma vantagem da presente invenção o fato de que elapode ser usada para reduzir ou prevenir inflamações em um mamífero pelaadministração oral de uma composição nutricional terapêutica ou de ummedicamento incorporando o probiótico. Será observado que tal administra-ção oral é mais aceitável e conveniente para o paciente do que uma compo-sição que requer a administração intravenosa ou subcutânea que não sórequer pessoal especialmente treinado como também não é segura nemconveniente.

Descrição Detalhada da Invenção

No presente relatório, as palavras a seguir têm uma definiçãoque devem ser levadas em conta durante a leitura e interpretação da descri-ção, dos exemplos e das reivindicações.

- "bebê": crianças com menos de 12 meses de idade;

- "fórmula para bebês": papinha destinada à nutrição completade bebês durante os quatro a seis primeiros meses de vida e como com-plemento de outros alimentos até os 12 meses de idade;

- "probiótico": preparações de células microbianas ou compo-nentes de células microbianas com um efeito benéfico na saúde ou bem-estar do hospedeiro. (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. et al. "Probiotics:how should they be defined" Trend Food Sei. Technol. 1999:10 107-10).

O mamífero pode ser um ser humano ou um animal de estima-ção tal como cachorro ou gato.

A Bifidobacterium Iongum ATCC BAA-999 ("BL999") pode seradministrada isolada, por exemplo encerrada em cápsulas contendo cadauma, por exemplo, 108 unidades formadoras de colônia (cfu) ou incorporadaem uma composição nutricional tal como uma fórmula nutricionalmentecompleta (por exemplo uma fórmula para bebês ou um produto de nutriçãoclínica), um laticínio, um pó para bebida, uma sopa desidratada, um suple-mento dietético, um substituto de refeição, uma barra nutritiva, um cereal,um confeito ou uma ração seca. Quando incorporada em uma composiçãonutricional, a BL999 pode estar presente na composição em uma quantida-de equivalente a entre 104 e 1012 cfu/g (peso seco). Estas expressões dequantidade incluem as possibilidades de as bactérias estarem vivas, inativasou mortas ou ainda presentes como fragmentos tais como DNA ou materiaisde parede celular ou como metabólitos. Em outras palavras, as quantidadesde bactérias são expressas em termos da capacidade de formação de colô-nia daquela quantidade de bactérias como se todas as bactérias estivessemvivas independente do fato de estarem, na verdade, vivas, inativas ou mor-tas, fragmentadas ou em uma mistura de todos ou qualquer desses estados.De preferência a BL999 está presente em uma quantidade equivalente aentre 105 e 1010 mais preferivelmente 107 e 1010 cfu/ g de composição seca.

A BL999 pode ser adquirida na Morinaga Milk Industry Co. Ltd.of Japan sob a marca comercial BB536. Ela pode ser cultivada de acordocom qualquer método adequado e preparada para encapsulação ou adiçãoa uma composição nutricional secada por congelamento ou por atomizaçãopor exemplo. Alternativamente, ela pode ser adquirida já preparada em umaforma adequada para adição a gêneros alimentícios.

Uma fórmula nutricionalmente completa para uso na presenteinvenção pode compreender uma fonte de proteína, de preferência uma pro-teína dietética tal como uma proteína animal (por exemplo proteína do leite,da carne ou de ovo), uma proteína vegetal (por exemplo proteína de soja,trigo, arroz ou ervilha); misturas de aminoácidos livres; ou combinações dasmesmas. Proteínas do leite tais como caseína e proteína do soro de leitesão particularmente preferidas. A composição também pode conter uma fon-te de carboidratos e uma fonte de gordura.

Se a fórmula incluir uma fonte de gordura, ela de preferênciafornece 5% a 55% da energia da fórmula; por exemplo 20% a 50% da ener-gia. Os lipídios que constituem a fonte de gordura podem ser qualquer gor-dura ou mistura de gorduras adequada. Gorduras vegetais tais como óleo desoja, óleo de palma, óleo de coco, óleo de açafrão, óleo de girassol, óleo demilho, óleo de canola, e Iecitinas são particularmente adequados. Gordurasanimais tais como gordura de leite também podem ser adicionadas, se de-sejado.

Se a fórmula incluir uma fonte de carboidratos, ela de preferên-cia fornece 40% a 80% da energia da fórmula. Qualquer carboidrato ade-quado pode ser usado, por exemplo sacarose, lactose, glicose, frutose, sóli-dos de xarope de milho, maltodextrina, e misturas dos mesmos. Fibras die-téticas também podem ser adicionadas, se desejado. A fibra dietética podeser de qualquer origem adequada, incluindo por exemplo soja, ervilha, aveia,pectina, goma guar, goma arábica, fructooligossacarídeos, gaiacto-oligossacarídeos, sialil-lactose e oligossacarídeos derivados de leites ani-mais. Vitaminas e minerais adequados podem ser incluídos na fórmula nu-tricional em uma quantidade que obedeça as diretrizes apropriadas.

Um ou mais emulsificantes de grau alimentício podem ser in-corporados na fórmula nutricional se desejado; por exemplo ésteres de áci-do diacetil tartárico de mono- e diglicerídeos, Iectina de mono- e diglicerí-deos. Da mesma forma sais e estabilizantes adequados também podem serincluídos.

A fórmula nutricionalmente completa pode ser preparada dequalquer maneira adequada. Por exemplo, a fonte de proteínas, a fonte decarboidratos, e a fonte de gordura podem ser misturadas em proporçõesapropriadas. Se usados, os emulsificantes podem ser incluídos na mistura.As vitaminas e os minerais podem ser adicionados nesse ponto, mas geral-mente são adicionados mais tarde para evitar degradação térmica. Quais-quer vitaminas Iipofílicas, emulsificantes e outros podem ser dissolvidos nafonte de gordura antes da misturação. Água, de preferência água que forasubmetida à osmose reversa, pode ser então misturada para formar umamistura líquida.

A mistura líquida pode ser então termicamente tratada para re-duzir as cargas bacterianas. Por exemplo, a mistura térmica pode ser rapi-damente aquecida até uma temperatura na faixa de cerca de 80°C a cercade 110°C por cerca de 5 segundos a cerca de 5 minutos. Isto pode ser efe-tuado por injeção de vapor d'água ou por um trocador de calor; por exemploum trocador de calor a placas.

A mistura líquida pode ser então resfriada para uma temperatu-ra na faixa de cerca de 60°C a cerca de 85°C; por exemplo por resfriamentoinstantâneo. A mistura líquida pode ser então homogeneizada; por exemploem dois estágios a uma pressão de cerca de 10 MPa a cerca de 30 MPa noprimeiro estágio e de cerca de 2 MPa a cerca de 10 MPa no segundo está-gio. A mistura homogeneizada pode ser então ainda resfriada para a adiçãode quaisquer componentes sensíveis ao calor; tais como vitaminas e mine-rais. O pH e o teor de sólidos da mistura homogeneizada é convenientemen-te padronizado neste ponto.

A mistura homogeneizada pode ser então transferida para umaparelho de secagem adequado tal como uma secadora por atomização oucongelamento e convertida em pó. O pó deve ter um teor de umidade menorque cerca de 5% em peso. A BL999 pode ser adicionada ao pó na quanti-dade desejada por misturação a seco.

Uma ração animal seca para uso na presente invenção pode in-cluir qualquer uma ou mais de uma fonte de carboidratos, uma fonte de pro-teínas e uma fonte de lipídios.

Pode-se usar qualquer fonte de carboidratos adequada. De pre-ferência a fonte de carboidratos é oferecida na forma de grãos, farinhas ouamidos. Por exemplo, a fonte de carboidratos pode ser arroz, cevada, sorgo,milhete, aveia, farinha de milho ou farinha de trigo. Açúcares simples taiscomo sacarose, glicose e xaropes de milho também podem ser usados. Aquantidade de carboidratos fornecida pela fonte de carboidratos pode serselecionada conforme desejado. Por exemplo, a ração animal pode conteraté cerca de 60% em peso de carboidratos.

Fontes de proteínas adequadas podem ser selecionadas dequalquer fonte de proteína animal ou vegetal adequada; por exemplo farinhade carne de músculo ou esqueleto, de carne bovina e de osso, farinha deaves, farinha de peixe, proteínas do leite, glúten de milho, glúten de trigo,farinha de soja, concentrados de proteína de soja, isolados de proteína desoja, proteínas do ovo, soro de leite, caseína, glúten e outros. Para animaisidosos, é preferível que a fonte de proteínas contenha uma proteína animalde alta qualidade. A quantidade de proteína fornecida pela fonte de proteí-nas deve ser selecionada conforme desejado. Por exemplo, a ração animalpode conter cerca de 12% a cerca de 70% em peso de proteína em umabase seca.

A ração animal pode conter uma fonte de gordura. Pode-se usarqualquer fonte de gordura adequada. De preferência a fonte de gordura éuma fonte de gordura animal tal como sebo. Óleos vegetais tais como óleode milho, óleo de girassol, óleo de açafrão, óleo de colza, óleo de soja, óleode oliva e outros óleos ricos em ácidos graxos monoinsaturados e poliinsatu-rados também podem ser usados. Além de ácidos graxos essenciais (ácidolinoléico e alfa-linoléico) a fonte de gordura pode incluir ácidos graxos decadeia longa. Ácidos graxos de cadeia longa adequados incluem ácido ga-ma-linoléico, ácido estearidônico, ácido araquidônico, ácido eiosapentanói-co, e ácido docosahexanóico. Óleos de peixe constituem uma fonte ade-quada de ácido eicosapentanóico e ácido docosahexanóico. Óleo de borra-gem, óleo de groselha e óleo de enotera são fontes adequadas de ácidogama-linoléico. Óleo de colza, óleo de soja, óleo de linhaça e óleo de nozsão fontes adequadas de ácido alfa-linolênico. Óleo de açafrão, óleo de gi-rassol, óleo de milho e óleo de soja constituem fontes adequadas de ácidolinoléico. Óleo de oliva, óleo de colza (canola), óleo de girassol de alto teoroléico, óleo de açafrão, óleo de amendoim, e óleo de farelo de arroz consti-tuem fontes adequadas de ácidos graxos monoinsaturados. A quantidade degordura fornecida pela fonte de gordura pode ser selecionada conforme de-sejado. Por exemplo, a ração animal pode conter cerca de 5% a cerca de40% em peso de gordura em uma base seca. De preferência, a ração ani-mal tem uma quantidade relativamente reduzida de gordura.

A escolha das fontes de carboidratos, proteínas e lipídios não écrítica e vai ser selecionada com base nas necessidades nutricionais do a-nimal, considerações de palatabilidade, e no tipo de produto produzido. A-lém disso, vários outros ingredientes, por exemplo, açúcar, sal, especiarias,temperos, vitaminas, minerais, agentes flavorizantes, gomas, e microorga-nismos probióticos também podem ser incorporados na ração animal con-forme desejado.

Para animais idosos, a ração animal de preferência contémproporcionalmente menos gordura que as rações animais para animais maisjovens. Além disso, as fontes de amido podem incluir um ou mais de aveia,arroz, cevada, trigo e milho.

A ração animal pode ser produzida por cozimento por extrusão,embora possam ser usados assamento e outros processos adequados.Quando cozida por extrusão, a ração animal geralmente é oferecida na for-ma de pelotas. A BL999 é de preferência aplicada como revestimento ouintroduzida na ração animal desidratada. Um processo adequado está des-crito no Pedido de Patente Européia N0 0862863.

A invenção será agora descrita ainda com referência aos exem-plos a seguir. Nas figuras:

a figura 1 compara a percentagem de atividade de NFkB depoisda estimulação de células intestinais in vitro com LPS na presença de quatrobifidobactérias diferentes (ensaio de gene-repórter de NFkB baseado emcélulas);

a figura 2 compara o escore fecal observado em um modelo decolite de camundongo imitando patologias de IBD (colite induzida por DSS)com e sem intervenção de BL999;

a figura 3 compara escores de inflamação macroscópica obser-vados em um modelo de colite de camundongo imitando patologias de IBD(colite induzida por DSS) com e sem intervenção de BL999;as figuras 4A a E comparam os escores de Wallace individuais(A), os escores de Wallace médios (B)1 a percentagem de proteção (C)1 aatividade de mieloperoxidase (D) e a perda de peso em dois dias (E) obser-vados em um modelo de colite induzida por TNBS onde dois grupos recebe-ram intervenção de BL999 em níveis de dosagem diferentes e o grupo decontrole não recebeu nenhuma batéria; e

a figura 5 compara a capacidade protetora de BL999 no mesmomodelo de colite de camundongo com a capacidade de B. IongumNCC2705, L. rhamnosus ATCC 53103, L johnsoniiCNCM 1-1225, L planta-rum NCIMB8826, L. Iactis NZ9000 e MG1363; e com o efeito protetor domedicamento prednisolona.Exemplo 1

Abaixo está dado um exemplo da composição de uma fórmulapara bebês para uso na presente invenção. Esta composição é dado a títuloilustrativo apenas.

<table>table see original document page 10</column></row><table>B. Iongum BB 536 108 cfu/g de bactérias vivas, em pó

Exemplo 2

Este exemplo compara atividade inibitória da BL999 com os e-feitos inibitórios de outras cepas bacterianas probióticas em um ensaio degene-repórter baseado em células capa B do fator nuclear (NFkB).

Já foi publicada uma extensa literatura sobre o papel centralque o fator de transcrição NFkB desempenha na indução e perpetuação deeventos inflamatórios. O NFkB é ativado em resposta a bactérias patogêni-cas enteroinvasivas e outros estímulos inflamatórios que levam à produçãode moléculas inflamatórias, tais como fator de necrose tumoral α (TNF-α),interleucina-8 (IL-8), molécula de adesão intracelular-1 (ICAM-1), e ciclooxi-genase induzível (COX-2).

Uma linhagem de células epiteliais intestinais humanas (HT29NFkB) expressando estavelmente uma construção de gene-repórter (fosfa-tase alcalina secretada) sob o controle do promotor de NFkB endógeno foiusada neste estudo (Blum S et al.; Riedel C. et al. World J Gastroenterol.2006 no prelo). A capacidade de quatro cepas de bifidobactérias para inibira atividade de NFkB induzida por lipopolissacarídeos (LPS) nessas célulasfoi medida. As células foram incubadas com B. bifidum (NCC 189 , CNCM I-2333), B. infantis (NCC 200, CNCM I-2334), B. pseudocatenulatum (NCC291), e B. Iongum (NCC 3001, ATCC ΒΑΑ-999) recém-preparadas a umaproporção de células para bactérias de 1:100. Depois de 1 hora de pré-incubação das células com as bactérias, LPS a 10 ng/ml foi adicionado pormais 4 horas e os sobrenadantes da cultura exaurida foram recolhidos paramedir a atividade repórter mediada por NFkB. O ensaio foi feito em duplicatae repetido pelo menos 3 vezes com cada repetição normalizada para esti-mulação com LPS sem bactérias, sem controle de bactérias. Os dados es-tão mostrados na figura 1 como a percentagem média de atividade de NFkBestimulada por LPS ± SEM.

Pode-se ver que as células tratadas com LPS apresentaramuma indução 10 vezes maior na atividade de NFkB depois de 4 horas deincubação. Todas as quatro cepas de bifidobactérias infra-regularam a ativi-dade de NFkB, no entanto, a BL999 apresentou a atividade inibitória maisalta neste ensaio. Concluindo, a BL999 é uma cepa-candidata excelentepara aplicações em que inibição de atividade inflamatória é de grande valia.

Exemplo 3

Este exemplo demonstra a capacidade da BL999 e seus meta-bólitos para prevenir inflamação em um modelo de IBD de camundongo.

Um modelo de colite induzida por dextrano sulfato de sódio(DSS) em camundongo reconhecido como um modelo relevante para pato-logias de IBD foi usado nesta experiência (Blumberg RS et al., Current Opin.Immunol. 1999; 11(6):648-56). A administração de DSS induz danos histo-patológicos no intestino grosso semelhantes aqueles observados em pacien-tes com colite ulcerativa. O tratamento com DSS foi administrado para indu-zir inflamação intestinal aguda.Grupos e dietas experimentais:

• "Controle-MRS": camundongos alimentados com a dieta decontrole (Tabela 1) ad libitum, com acesso livre à água doce durante toda aexperiência, e recebendo uma gavagem intragástrica diária de MRS do dia 1ao dia 14

• "DSS-MRS": camundongos alimentados com a dieta de con-trole ad libitum durante toda a experiência, com acesso livre à água docecontendo 1% de DSS do dia 7 ao dia 14, e recebendo uma gavagem intra-gástrica diária de MRS do dia 1 ao dia 14

· "DSS-BL": camundongos alimentados com a dieta de con-trole durante toda a experiência, do dia 1 ao dia 14, com acesso livre à águadoce contendo 1% de DSS do dia 7 ao dia 14, e recebendo uma gavagemintragástrica diária de BL999 (NCC3001) (109 cfu/camundongo/dia) do dia 1ao dia 14

Tabela 1: Dieta de controle

<table>table see original document page 13</column></row><table>

A experiência com animais foi conduzida da seguinte maneira:Camundongos BALBc/J machos (8 semanas, Janvier, França) foram ran-domizados em 4 grupos experimentais (n = 10 camundongos por grupo).Durante um período de aclimatação de 7 dias, os camundongos tiveram livreacesso à água doce e receberam a dieta de controle. Em seguida, os ca-mundongos no grupo DSS-BL receberam uma gavagem intragástrica diáriade BL999 (109 cfu/camundongo/dia) com o sobrenadante da cultura por 14dias enquanto que os camundongos nos outros dois grupos receberam umagavagem intragástrica diária de MRS. Além disso, do dia 7 ao dia 14, oscamundongos tanto no grupo DSS-MRS como no grupo DSS-BL receberam1 % de DSS em sua água potável enquanto que o grupo de controle recebeuágua doce normal.

A cada 2 dias durante a experiência, amostras fecais de cadacamundongo foram examinadas e a consistência, a presença ou ausênciade sangue foi registrada (Hemoccult II, SKD, Roissy, França). Um escorefecal foi calculado da maneira indicada na Tabela 2 e os resultados estãomostrados na figura 2.

Tabela 2. Escala seguida para classificar os sintomas clínicosdos camundongos.

<table>table see original document page 14</column></row><table>

No final do período de 14 dias, os camundongos foram sacrifi-cados por deslocamento cervical. Os segmentos ceco-cólicos foram rapida-mente retirados do animal, delicadamente lavados com um tampão soluçãosalina fisiológica, e classificados quanto aos sinais inflamatórios macroscó-picos segundo uma adaptação da escala já publicada por Appleyard & Wal-lace (Appleyard C.B & Wallace J.L. "Reactivation of hapten-induced colitisand its prevention by anti-inflammatory drugs" Am J. Physiol 269, G119 -125) (Tabela 3). Os resultados estão mostrados na figura 3.

Tabela 3. Critérios para classificação macroscópica de danosceco-colônicos (Appleyard & Wallace)<table>table see original document page 15</column></row><table>

Pelas figuras 2 e 3, pode-se observar que a BL999 normaliza e-ficazmente as características das fezes e reduz significativamente a inflama-ção no ceco e no cólon proximal e distai em relação ao que é visto no grupoDSS-MRS. Portanto pode-se ver que a BL999 é eficaz na prevenção de in-flamação induzida por DSS visto que os camundongos do grupo DSS-BLreceberam bactérias tanto antes quanto durante a administração de DSS.

Exemplo 4

Neste exemplo, o potencial antiinflamatório das bactérias BL999foi investigado e comparado com aquele de outras cepas de bactérias doácido láctico assim como prednisolona, uma droga antiinflamatória comu-mente usada, usando um modelo de colite aguda induzida por TNBS emcamundongo.

Foram investigadas as seguintes cepas bacterianas:NCC N° Cepa_Depósito Oficial N°

<table>table see original document page 15</column></row><table><table>table see original document page 16</column></row><table>

Cepas de Iactobacilos foram cultivadas aerobicamente a 37°Cem meio MRS (Difco). Bifidobactérias foram cultivadas anaerobicamente a37°C em MRS suplementado com 0,05% de cloridrato de L-cisteína (Sigma).Laetococeus Iactis MG1363 e Lactoeoceus Iaetis NZ9000 foram cultivadas a30°C em meio M17 suplementado com 0,5% de glicose. O número de bacté-rias (cfu) foi estimado na fase de crescimento estacionário medindo-se aabsorvência a 600 nm (A6oo). com a respectiva curva de calibração para ca-da cepa. Para experiências de rotina in vivo, as bactérias foram cultivadaspor 18 horas, lavadas duas vezes em PBS estéril pH 7,2 e ressuspendidas a108 e 2. 109cfu/mI em tampão NaHCO3 a 0,2 M contendo 2% de glicose.

Camundongos BALB/c fêmeas adultas com 7 a 8 semanas deidade foram adquiridos no Charles River. Os camundongos foram randomi-zados em grupos experimentais com 10 camundongos por grupo. Os ca-mundongos foram alojados em grupo (8 a 10 por gaiola) e tiveram livre a-cesso à água e ração padrão para roedores. Eles passaram por pelo menos1 semana de aclimatação antes de sofrerem qualquer intervenção. Os ca-mundongos nos grupos tratados com bactérias receberam suspensões bac-terianas (correspondendo a 108 cfu/camundongo/dia) por gavagem intragás-trica em tampão NaHCO3 a 0,2 M pH 8,5 com 2% de glicose do quarto diaantes da indução de colite até o dia da indução de colite. Os camundongosno grupo tratado com prednisolona receberam 10 mg/kg de peso corpo-ral/dia. Os camundongos no grupo de controle não receberam bactériasnem prednisolona. Além disso, o efeito do nível de dosagem foi investigadotratando-se um grupo com BL999 a 2.109cfu/camundongo/dia.

Antes da indução de colite, todos os camundongos foram anes-tesiados por injeção intraperitoneal de 3 mg de quetamina (Imalgene 1000,Mérial, Lyon, França), 46,7 μg de diazepam (Valium, Roche Diagnostics,França) e 15 μς de atropina (Aguettant Laboratory, Lyon1 França) dissolvidaem 0,9% de cloreto de sódio. Em seguida a colite foi induzida por adminis-tração intra-retal de 50 μΙ de ácido trinitrobenzenossulfônico (TNBS, Fluka,França) dissolvido em 0,9% de NaCI/etanol (50/50 v/v) a uma dose de 100-120 mg/kg de peso corporal. O índice de mortalidade e os escores de infla-mação foram avaliados 48 horas depois da administração de TNBS. Os ca-mundongos foram pesados antes da administração de TNBS e quando sa-crificados por deslocamento cervical.

O cólon foi removido, dissecado livre de gordura e o mesentériofoi cuidadosamente aberto e lavado com PBS. Os danos colônicos e a in-flamação foram avaliados segundo os critérios de Wallace (Wallace J.L. etal., Inhibition of Ieukotriene synthesis markedly accelerates healing in a ratmodel of inflammatory bowel disease" Gastroenterology 96:29 - 36, 1989).

Estes critérios para classificação macroscópica já foram bem consolidadosem estudos com camundongos e refletem a intensidade da inflamação, oespessamento da mucosa colônica e a extensão da ulceração. Os danoscolônicos e a inflamação foram classificados em um estudo cego por doispesquisadores.

Além disso, a atividade de mieloperoxidase (MPO), um marca-dor de grânulos primários de neutrófilos polimorfonucleares, foi determinadasegundo um método modificado de Bradley et al. ("Measurement of cutane-ous inflammation: estimation of neutrophil content with an enzyme marker" JInvest Dermatol. 60(3):618-22). A concentração de proteínas foi determina-da pelo método de Lowry, e a atividade de MPO foi expressa como UMPO/cm de intestino.

A atividade de MPO foi determinada no tecido do cólon proxi-mal, imediatamente depois do sacrifício. Uma amostra colônica (1 cm decomprimento) foi retirada a 3 cm da junção ceco-colônica, suspendida emtampão fosfato de potássio (50 mmol/l, pH 6,0) e homogeneizada em gelousando um polytron. Foram efetuados três ciclos de congelamento e des-congelamento e as suspensões foram centrifugadas a 10.000 g por 15 minu-tos a 4°C. Os sobrenadantes foram descartados e os péletes foram ressus-pendidos no tampão detersivo brometo de hexadecil trimetilamônio (HTAB0,5 %, p/v, em 50 mmol/l de tampão fosfato de potássio, pH 6,0), induzindoa liberação de MPO dos grânulos primários de neutrófilos polimorfonuclea-res. As suspensões obtidas foram sonicadas em gelo, e mais uma vez cen-trifugadas por 15 minutos a 4°C. Os sobrenadantes foram diluídos em tam-pão fosfato de potássio (pH 6,0) contendo 0,167 mg/ml de dicloridrato de O-dianisidina e 0,0005% de peróxido de hidrogênio (H202). MPO de neutrófi-los humanos (0,1 U/100 ml, Sigma) foi usado como referência. As alteraçõesna absorvência a 450 nm, durante 5 e 10 minutos, foram registradas comum espectrofotômetro de microplaca (ELX808, Bio-Tek Instrument, CA).

Uma unidade de atividade de MPO foi definida como a quantidade de MPOque degrada 1 mmol de peróxido de hidrogênio/min/ml a 25°C.

Os resultados foram analisados pela análise unilateral não-paramétrica da variância, teste U de Mann-Whitney. As diferenças foramconsideradas estatisticamente significativas quando o valor ρ foi < 0,05.

Os resultados estão mostrados nas figuras 4, A a E e na figura5. As figuras 4 A e B comparam os escores de Waiiace individuais e os es-cores de Wallace médios dos camundongos tratados com BL999 nos doisníveis de dosagem, 108 cfu/camundongo/dia e 2.109Cfu/camundongo/diacom o grupo de controle que não recebeu bactérias. Pode-se ver que oscamundongos dos dois grupos que receberam BL999 apresentaram escoresde Wallace substancialmente mais baixos que os camundongos do grupo decontrole.

A figura 4C mostra a percentagem de proteção oferecida pelaBL999. Esta corresponde à redução da inflamação macroscópica média doscamundongos tratados com bactérias (n = 10) em relação ao escore médiodos camundongos de controle tratados com TNBS (camundongos tratadoscom o tampão Na0HC03, η = 10).

A figura 4D compara a atividade de MPO média dos camundon-gos tratados com BL999 nos dois níveis de dosagem com o grupo de contro-le. Pode-se ver que os camundongos dos dois grupos que receberam BL999apresentaram atividade de MPO substancialmente mais baixa que os ca-mundongos do grupo de controle.

A figura 4E compara a perda de peso em 2 dias dos camun-dongos tratados com BL999 nos dois níveis de dosagem com o grupo decontrole. Pode-se ver que os camundongos dos dois grupos que receberamBL999 apresentaram perda de peso substancialmente mais baixa que oscamundongos do grupo de controle.

A figura 5 compara a percentagem em peso oferecida pelas vá-rias cepas de bactérias do ácido láctico testadas e pela administração deprednisolona. Pode-se ver que a BL999 oferece um grau de proteção acen-tuadamente maior que as outras cepas bacterianas e um nível de proteçãoequiparável ao medicamento.

Claims

1. Uso de Bifidobacterium Iongum ATCC BAA-999 na produçãode um medicamento ou composição nutricional terapêutica para prevenir oureduzir uma inflamação em um mamífero.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, onde a composição nu-tricional terapêutica é uma fórmula para bebês.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1, onde a composição nu-tricional terapêutica é uma ração animal.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações prece-dentes, onde a inflamação é uma inflamação intestinal.

5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações prece-dentes, onde a composição nutricional terapêutica contém de 104 a 1012cfu/g de Bifidobacterium Iongum ATCC BAA-999 com base no peso seco.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações prece-dentes onde a composição nutricional terapêutica contém de 105a 1010 cfu/gde Bifidobacterium Iongum ATCC BAA-999 com base no peso seco.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações prece-dentes onde a composição nutricional terapêutica contém de 107 to 1010cfu/g de Bifidobacterium Iongum ATCC BAA-999 com base no peso seco.

8. Uso de Bifidobaeterium Iongum ATCC BAA-999 na produçãode um medicamento ou composição nutricional terapêutica para tratamentoda doença do intestino inflamado.

9. Uso de Bifidobaeterium Iongum ATCC BAA-999 na produçãode um medicamento ou composição nutricional terapêutica para reduzir umainflamação intestinal associada a alergias alimentares.