BR112019012779A2 - Corpo de planta enriquecido com ácido oleico que tem fad2 geneticamente modificado e método de produção do mesmo - Google Patents

Corpo de planta enriquecido com ácido oleico que tem fad2 geneticamente modificado e método de produção do mesmo Download PDF

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Koo Okjae
Hee Jung Min
Kim Yeseul
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Abstract

a presente invenção refere-se a um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado e ao uso do mesmo para aumentar o teor de um ácido graxo insaturado específico de um corpo de planta. mais particularmente, a presente invenção refere-se a um sistema com capacidade para controlar artificialmente a biossíntese de ácidos graxos insaturados e um corpo de planta produzido pela mesma que inclui um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado para controlar a biossíntese de ácidos graxos insaturados e a uma composição com capacidade para manipular artificialmente o fator. em um aspecto específico, a presente invenção refere-se a fatores associados à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulados, tais como fad2, fad3, fad6, fad7 e fad8 e/ou a um sistema de controle da biossíntese de ácidos graxos insaturados por meio de um produto de expressão do mesmo.

Description

CORPO DE PLANTA ENRIQUECIDO COM ÁCIDO OLEICO QUE TEM FAD2 GENETICAMENTE MODIFICADO E MÉTODO DE PRODUÇÃO DO MESMO
RELATÓRIO DESCRITIVO [CAMPO DA TÉCNICA] [0001] A presente invenção refere-se à manipulação ou modificação de um gene FAD2 com o uso de um sistema CRISPR-Cas para aumentar o teor de ácido oleico em um corpo de planta e, mais particularmente, a um corpo de planta com aumento no teor de ácido oleico modificando-se um gene FAD2 com o uso de um sistema CR1SPR-Cas com capacidade para alvejar um gene correspondente, uma composição de manipulação com capacidade para manipular um gene FAD2 e um. método para uso da mesma.
[ANTECEDENTES DA TÉCNICA] [0002] Óleo de soja é o segundo óleo de soja comestível mais consumido no mundo devido ao fato de ser rico em ácidos graxos essenciais e à alta utilização de farelo de óleo de soja como um subproduto, e 45 milhões de toneladas do mesmo são produzidas anualmente. Cerca de 62% dos ácidos graxos que constituem, o óleo de soja são ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs), e 54% dos ácidos graxos são ácido linoleico, e 8% dos ácidos graxos são ácido linolênico. Visto que os ácidos graxos têm duas ou mais ligações duplas, a oxidação ocorre facilmente e o óleo torna-se rançoso com facilidade, de modo a ser difícil armazená-lo e distribuí-lo. (O mesmo tem um baixo armazenamento e dificuldade nas distribuições)
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 42/315 para fabricar óleo de soja corn uma qualidade estável para ser usado em processamento ou cozimento de alimentos, processos de pré-tratamento e purificação são necessários. A maior parte dos fabricantes de óleo de soja mantém um determinado nível de qualidade evitando-se a rancidez por meio de tratamento de hidrogenação parcial para adicionar um hidrogênio a uma ligação dupla insaturada onde a oxidação facilmente ocorrer durante um processo de f a b r i c a ç ã o .
[00031 Entretanto, a hidrogenação parcial tem uma desvantagem de produzir ácidos graxos trans que têm um risco em um processo de saturação da ligação dupla de ácidos graxos insaturados com hidrogênios. Embora, no estado natural, a produção de ácidos graxos cis seja dominante na oxidação, no entanto, uma vez que formas trans são termodinamicamente estáveis, os ácidos graxos trans, que são isômeros geométricos que não ocorrem naturalmente, são produzidos na hidrogenação ou no processamento.
[0004] Devido a controvérsias sobre o risco de gordura trans, em 2015, a FDA norte-americana decidiu eliminar esse óleo parcialmente hidrogenado que é amplamente usado no processo de fabricação de alimentos processados a partir da lista de Geralmente Reconhecidos como Seguros (GRAS). Consequentemente, os fabricantes norte-americanos de alimentos procuram por diferentes óleos comestíveis pelos quais podem substituí-lo e pararam de usar óleos parcialmente hidrogenados em 2018, e espera-se que a indústria relacionada gaste 6 bilhões de dólares
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 43/315
3/253 americanos para estabelecer um óleo comestível alternativo ou um novo processo de fabricação. Espera-se que o óleo de soja parcialmente hidrogenado tenha sua demanda diminuída em 9 milhões de toneladas anualmente apenas nos Estados Unidos, de acordo com a ação da EDA.
[0005] Além disso, muitos países, tais como os países europeus, a Coréia e o Japão, bem como os Estados Unidos, estão bem cientes do risco de ácidos graxos trans, e com a tendência em encorajar pessoas a não ingerir o máximo possivel, globalmente, regulamentações sobre óleo parcialmente hidrogenado parecem ficar mais fortalecidas no futuro. Portanto, há uma necessidade de desenvolver produtos de óleo comestível que não contenham ácidos graxos trans que possam, substituir o óleo de soja produzido por hidrogenação parcial.
[REVELAÇÃO] [PROBLEMAS DA TÉCNICA] [0006] Para solucionar os problemas descritos acima, a presente invenção refere-se a um. sistema de controle de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulados que tem um efeito de aumentar o teor de um. ácido graxo insaturado específico. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado e a um sistema para controlar um ácido graxo insaturado que modifica artificialmente o teor de um ácido graxo insaturado especifico.
[0007] A presente invenção é direcionada ao
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4/253 fornecimento de um corpo de planta com teor aumentado de um ácido graxo insaturado específico devido a um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado.
[0008] A presente invenção é direcionada ao fornecimento de um corpo de planta com teor diminuído de um ácido graxo insaturado específico por meio de um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado.
[0009] Como uma modalidade exemplificativa da presente invenção, a presente invenção fornece um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados a r t i f i c i a .1 m ente m a n i p u 1 a d o .
[0010] Como uma modalidade exemplificativa da presente invenção, a presente invenção fornece um sistema de controle de ácidos graxos insaturados artificialmente m a n i p u1ados.
[0011] Como uma modalidade exemplificativa da presente invenção, a presente invenção fornece um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado e um produto de expressão do mesmo.
[0012] Como uma modalidade exemplificativa da presente invenção, a presente invenção fornece uma composição para a manipulação de um gene de modo a manipular um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados e um método que utiliza a mesma.
[0013] Como uma modalidade exemplificativa da
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 45/315 presente invenção, a presente invenção fornece um método para controlar a biossíntese de um ácido graxo insaturado.
[0014] Como uma modalidade exemplificativa da presente invenção, a presente invenção fornece um método para controlar o tipo de um ácido graxo insaturado e o teor do mesmo.
[0015] Como uma modalidade exemplificativa da presente invenção, a presente invenção fornece uma composição para o controle de um ácido graxo insaturado de modo a controlar a biossíntese de um ácido graxo insaturado e/ou o teor do ácido graxo insaturado e vários usos da mesma.
[0016] Como uma modalidade exemplificativa da presente invenção, a presente invenção fornece um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado, tal como FAD2, FAD3, FAD4, FAD6, FAD7 ou FAD8 e/ou um. produto de expressão dos mesmos. [0017] Como uma modalidade exemplificativa da presente invenção, a presente invenção fornece uma composição para a manipulação de um gene de modo a manipular artificialmente um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados, tal como FAD2, FAD3, FAD4, FAD6, FAD7 ou FAD8.
[0018] Como uma modalidade exemplificativa da presente invenção, a presente invenção fornece um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado, tal como FAD2, FAD3, FAD4,
FAD6, FAD7 ou FAD8 e/ou vários usos da composição para a
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 46/315 manipulação de um gene para manipulação artificial.
[0019] Como uma modalidade exemplificativa da presente invenção, a presente invenção fornece um corpo de planta com teor aumentado ou diminuído de um ácido graxo insaturado específico e um produto processado com o uso do mesmo.
[SOLUÇÕES DA TÉCNICA] [0020] Para solucionar esses problemas, a presente invenção fornece um sistema com capacidade para controlar artificialmente a biossíntese de um ácido graxo insaturado e/ou o teor dos ácidos graxos que inclui um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado e/ou uma composição com capacidade para manipular artificialmente o fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados para controlar o teor de um ácido graxo insaturado específico.
[0021] Em uma modalidade exemplificativa, a presente invenção fornece um. corpo de planta com teor aumentado de um ácido graxo insaturado específico por meio de um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado.
[0022] Em uma outra modalidade exemplificativa, a presente invenção fornece um ácido graxo insaturado especifico obtido a partir de um corpo de planta com o uso de um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado.
[0023] O termo ácido graxo insaturado específico usado no presente documento refere-se a um ou mais ácidos
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 47/315 graxos insaturados selecionados dentre vários tipos de ácidos graxos insaturados conhecidos, o mesmo pode ser ura
ou mais ácidos graxos insaturados selecionados a partir do
sistema de classificação representado pelo número de
carbonos > (C) e pelo número de ligações duplas (D) que estão
incluídc is em um ácido graxo insaturado entre vários tipos
de ácidos graxos insaturados. 0 termo ácido graxo insaturado CN:DM usado no presente documento refere-se a
um ácid o graxo insaturado que consiste em N números de
carbonos > (C) e inclui M números de ligações duplas (D). No
presente i documento, N pode ser um número inteiro de 4 a 36,
e M pode ser um número inteiro de 1 a 35.
[0024] 0 ácido graxo insaturado específico pode
ser um. έ [00251 icido graxo insaturado C8~24:D1. 0 ácido graxo insaturado específico pode
ser um. έ icido graxo insaturado C16~22:D1.
[0026] 0 ácido graxo insaturado específico pode
ser um. έ icido graxo insaturado C18:D1.
[0027] 0 ácido graxo insaturado específico pode
ser um. έ icido oleico, ácido elaídico ou ácido vacênico.
[0028] Além disso, o ácido graxo insaturado especifico pode ser um ácido graxo insaturado C8~24:D2.
[0029] 0 ácido graxo insaturado es p 6 C11 í C O pode
ser um ácido graxo insaturado C 16-22:D2.
[0030] 0 ácido graxo insaturado es p 6 C11 í C O pode
ser um ácido graxo insaturado C 18:D2.
[0031] 0 ácido graxo insaturado es p 6 C11 í C O pode
.ser um ácido linoli eico ou ácido linoelaídi co.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 48/315
8/253 .ma modalidade exemplificativa da presente invenção, a presente invenção fornece um fator biossintese de ácid insaturac artificialmente manipulado.
termo fat iado à biossintese de ácidos graxos insaturados usado no presente documento refere-se a todos os fatores que participam diretamente ou afetam indiretamente a biossintese de um ácido graxo insaturado. No presente documento, o fator pode ser DNA, RNA, um gene, um peptídeo, um polipeptideo ou uma proteína. 0 fator inclui vários materiais com capacidade para controlar a biossintese de um ácido graxo insaturado, que não são naturais, isto é, artificialmente manipulados. Por exemplo, o fator pode ser um gene ou proteína geneticamente manipulado ou modificado, que é expresso em uma planta.
[0034] O fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados pode aumentar o teor de um ácido graxo insaturado específico incluído em uma planta.
[0035] O fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados pode diminuir o teor de um ácido graxo insaturado específico incluído em uma planta.
[0036] O fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados pode afetar um mecanismo direto/indireto para controlar o teor de um ácido graxo insaturado específico incluído em uma planta.
[0037] Em uma modalidade exemplificativa da presente invenção, o fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados pode ser, por exemplo, um gene
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 49/315
FAD2, ura gene FAD3, ura gene FAD4, ura gene FAD6, ura gene FAD7 ou ura gene FAD8 artificialmente manipulado, de preferência, um gene FAD2 ou um gene FAD3.
[0038] Em uma modalidade exemplificativa da presente invenção, o fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados pode incluir dois ou mais genes artificialmente manipulados. Por exemplo, dois ou mais genes selecionados dentre o grupo que consiste em ura gene FAD2, ura gene FAD3, ura gene FAD4, um gene FAD6, um gene FAD7 e um gene FAD8 podem ser artificialmente manipulados.
[0039]
Portanto, em urna modalidade exemplificativa da presente invenção, um ou mais fatores associados à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulados selecionados dentre o grupo que consiste em um. gene FAD2, um gene FAD.3, um gene FAD4, um gene FAD6, um
gene FAD7 e um gene FAD8, que sofreram modifica ção em uma
se quê πci.a. de ac idos nucleicos, são fornecidos.
[0040 Ί A m o d i f i c a ç ã o em uma sequência de ácidos
nucle icos pode ser artificialmente manipulada d< e modo não
limit ativo por u m c o mp 1 e x o d e proteínas editora; s e ácidos
nuc1e i cos-guia.
[0041] 0 termo complexo de proteínas editoras e
ácidos nucleicos-guia refere-se a um complexo formado
através da interação e ntre um ác ido nucleico—guia e uma
proteína editora, e o complexo de ácido nucleico e proteína inclui o ácido nucleico-guia e a proteína editora.
[0042] 0 complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia pode servir para modificar um indivíduo. O
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 50/315 indivíduo pode ser um ácido nucleico-alvo, um gene, um cromossomo ou uma proteína.
[0043] Por exemplo, o gene pode ser um fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado por um complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia, sendo que o fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado inclui uma ou mais modificações de ácidos nucleicos que são pelo menos uma dentre uma deleção ou inserção de um ou mais nucleotídeos, uma substituição por um ou mais nucleotídeos diferentes de um gene do tipo selvagem e uma inserção de um ou mais nucleotídeos estranhos em uma sequência motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) em uma sequência de ácidos nucleicos que constitui o fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados ou em. uma região de sequência de bases contínua de 1 bp a. 50 bp adjacente à extremidade 5' e/ou à extremidade 3' da mesma, ou uma modificação química de ou mais nucleotídeos em uma sequência de ácidos nucleicos que
constitui o fator ass ociado à bio; ssíntese de ácidos graxos
insaturados.
[0044] A mo·; iificação de ácidos nucleicos pode
ocorrer em u ma regi ão promotor a do gene.
[0045] A mo·; iificação de ácidos nucleicos pode
ocorrer em uma regii ão éxon d O gene. En i uma modalidade
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 51/315 exemplificativa, 50% das modificações podem ocorrer na seção a montante das regiões de codificação do gene.
[0046] A modificação de ácidos nucleicos pode ocorrer em uma região intron do gene.
[0047] A modificação de ácidos nucleicos pode ocorrer em uma região intensificadora do gene.
[0048]
A sequência PAM pode ser por exempl uma ou mais dentre as seguintes sequências (descritas na
Cl -Ί. 12 Θ Ç ci o 5 r
A, T, C ou G,
A, T, C ou G e
A, T, C ou G) ;
A, T, C ou G e [0049]
Streptococcus ütlVptOCOCCUS
NGG (em que N é 1
NNNNRYAC (em que é A ou G e Y é C NMAGAAW (em que
W é A ou T);
NNNNGATT (em que
NMGRR(T) (em que R é A ou G); e
TTN (em que N é 1
A proteína edit pyogenes, Sti:
sp. , Staphylococ \f T, C ou cada N é ou T) ;
cada N é cada N é cada N é
T, C ou ora pode ~eptococcuí '.eus aure i n d e p e n d e n t e m e n t e independentemente independentemente
G) .
ser derivada de ϊ thermophί1us, us, Nocardiopsis dassonvillei, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces vi ridochromo genes,
Streptomyces vi ridochromo genes
St rept osporangium roseum,
Streptosporangium oseum,
AlicyclobacHlus acidocaldarius,
Bacillus pseudomycoid.es,
Bacillus
Figure BR112019012779A2_D0001
Exiguobacterium sibiricum,
Lactobacillus delbrueck
Lactobacillus
Sãll V ã T'_L u S
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 52/315
Microscilla marina, Burkholderiales bacterium, Polaromonas naphthalenivorans, Polaromonas sp., Crocosphaera watsonii,
Microcystis aeruginosa, Synechococcus sp.,
Acetohalobium arabaticum, Ammonifex degensii,
Caldicelulosiruptor bescii, Candidates Desulforudis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Finegoldia magna, Natranaerobius thermophi1 us, Pelotomaculurn t h e rm op r op i ο n i c um, A c i d i t h i ob a. c i 11 u s c a. 1 d us,
Acidi thiobaci 11 us ferrooxidans, Al1ochromatium vinosum, Marinobacter sp . , Nitrosococcus halophilus, Nitrosococcus wa t s on i i, Pse udoa. 11 eromon a s ha 1 op 1 ank t i s, Kt edon oba ct er ra cemi fe r, Me t h a. n oh a. 1 ob i um e ve s t i ga t um, An a. b a en a variabilis, Nodularia spumigena, Nostoc sp. , Arthrospira maxima, Arthrospira platensis, Arthrospira sp. , Lyngbya sp. , Microcoleus chthonoplastes, Oscillatoria sp., Petrotoga, mobilis, Thermosipho africanus ou Acaryochloris marina .
[0050j Em uma modalidade exemplificativa, a proteína editora pode ser uma ou mais proteínas selecionados dentre o grupo que consiste em uma proteína Cas9 derivada de Streptococcus pyogenes, uma proteína Cas9 derivada de Campylobacter jejuni, uma proteína Cas9 derivada de Streptococcus thermophilus, uma proteína Cas9 derivada de Staphylococcus aureus, uma proteína Cas9 derivada de Neisseria meningitidis e uma proteína Cpfl.
Como um exemplo, a proteína editora pode ser uma proteína
Cas9 derivada de Streptococcus pyogenes ou uma proteína
Cas9 derivada de Campylobacter jejuni.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 53/315 [0051] Além disso, em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um ácido nucleico-guia que tem capacidade para formar uma ligação complementar em relação às sequências-alvo de SEQ ID NOs: 1 a 30, por exemplo, SEQ ID NOs:7 ou 3 0.
[0052] O ácido nucleico-guia pode formar uma ligação complementar com uma parte das sequências de ácidos nucleicos de um gene FAD2. O mesmo pode criar 0 a 5, 0 a 4, 0 a 3 ou 0 a 2 disparidades. Como um exemplo preferencial, o ácido nucleico-guia pode ser nucleotídeos que formam uma ligação complementar com uma ou mais das sequências-alvo de SEQ ID NOs: 1 a 30, por exemplo, SEQ ID NOs: 7 ou 30, respectivamente.
[0053] O ácido nucleico-guia pode ser, de modo não limitative, nucleotídeos de 18 a 25 bp, 18 a 24 bp, 18 a 23 bp, 19 a 23 bp ou 20 a 23 bp.
[0054] Além disso, a presente invenção fornece uma composição para manipulação de genes que pode ser empregue na manipulação artificial de um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados para um propósito especifico.
[0055] A composição para manipulação de genes pode incluir um complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o mesmo.
[0056] A composição para manipulação de genes pode incluir:
(a) um ácido nucleico-guia com capacidade
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14/253 para formar uma ligação complementar em relação a cada uma das sequências-alvo de um ou mais genes selecionados dentre o grupo que consiste em um gene FAD2, um gene FAD3, um gene FAD4, um gene FAD6, um gene FAD7 e um gene FAD8, respectivamente, ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o ácido nucleico-guia;
(b) uma proteína editora que inclui uma ou mais proteínas selecionadas dentre o grupo que consiste em uma proteína Cas9 derivada de Streptococcus pyogenes, uma proteína Cas9 derivada de Campylobacter jejuni, uma proteína Cas9 derivada de Streptococcus thermophilus, uma proteína Cas9 derivada de Staphylococcus aureus, uma proteína Cas9 derivada de Neisseria meningitidis e uma proteína Cpfl ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a mesma.
[0057] Em uma modalidade exemplificativa, o ácido nucleico-guia pode ser uma sequência de ácidos nucleicos que forma uma ligação complementar em relação a uma ou mais das sequências-alvo de SEQ ID NOs: 1 a 30, respectivamente. [0058] Por exemplo, o ácido nucleico-guia pode ser uma sequência de ácidos nucleicos que forma uma ligação complementar com a sequência-alvo de SEQ ID NOs: 7 ou 30.
[0059] Em uma modalidade exemplificativa, a composição para manipulação de genes pode ser um sistemavetor viral.
[0060] O vetor viral pode ser um sistema-vetor de agrobactérias que usa uma agrobactéria.
[0061] Em uma modalidade exemplificativa, a
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 55/315 composição para manipulaçao de genes pode ser um sistemavetor viral.
[0062] O vetor viral pode incluir um ou mais vírus selecionados dentre o grupo que consiste em um vírus do mosaico, um retrovirus, um lentivírus, um adenovirus, um vírus adenoassociado (AAV), um virus de vaccinia um poxvirus e um virus da herpes simplex.
[0063] Em uma modalidade exemplificativa, a presente invenção fornece um método para manipular artificialmente células que inclui: introduzir (a) um ácido nucleico-guia que tem capacidade para formar uma ligação complementar em relação às sequências-alvo de um. ou mais genes selecionados dentre o grupo que consiste em um. gene FAD2, um gene FAD.3, um gene FAD4, um gene FAD6, um gene FAD7 e um gene FAD8, respectivamente, ou uma sequência de ácidos nucleicos que c o d i f i c a o me s mo; e (b) uma proteína editora que inclui uma ou mais proteínas selecionadas dentre o grupo que consiste em. uma proteína Cas9 derivada, de Streptococcus pyogenes, uma proteína Cas9 derivada de Campylobacter jejuni, uma
proteína C a s 9 derivada de Streptococc: us thermopihilus, uma
proteína C a s 9 derivada de Staphylo coccus aureus, uma
proteína Cas9 derivada de Neisseria meningitidis e uma
proteína Cpf 1, respectivamente, ou uma sequência de ácidos
nucleicos que codifica a mesma para as células.
[0064] 0 ácido nucleico-guia < e a proteína editora
podem estar presentes em um ou mais vetores sob a forma de
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 56/315 uma sequência de ácidos nucleicos ou podem estar presentes em um complexo formado acoplando-se o ácido nucleico-guia à proteína editora.
[0065] A introdução pode ser realizada in vivo ou ex vivo de uma planta.
[0066] A introdução pode ser realizada por meio de um ou mais métodos selecionados a partir de uma biobalística, uma eletroporação, lipossomas, plasmídeos, s i s t e m a - v e t o r d e a g r o b a c t é r i a s, v e t o r e s v i r a i s, nanopartícuias e um método de proteína de fusão de domínio de translocação de proteínas (PTD).
[006'7] O vetor viral pode incluir um ou mais vírus selecionados dentre o grupo que consiste em um vírus do mosaico, um retrovirus, um lentivírus, um adenovirus, um vírus adenoassociado (AAV), um vírus de vaccinia um poxvirus e um vírus da herpes simplex.
[0068] Além disso, a presente invenção fornece uma composição para o controle de um ácido graxo insaturado de modo a controlar a biossíntese de um ácido graxo insaturado e/ou o teor do ácido graxo insaturado de uma planta.
[0069] A composição para controlar um ácido graxo insaturado pode incluir uma composição para manipulação de genes, que pode ser empregue na manipulação artificial de um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados.
[0070] A formulação da composição para manipulação de genes é a mesma descrita acima.
[0071] Em uma modalidade exemplificativa, a
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 57/315 presente invenção fornece um produto processado com o uso de um corpo de planta com teor aumentado ou diminuído de um ácido graxo insaturado específico.
[0072] O corpo de planta pode incluir um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado.
[0073] O produto processado pode ser um alimento que pode ser ingerido por seres humanos e/ou animais.
[0074] Em uma modalidade exemplificative, a
Figure BR112019012779A2_D0002
manipulação de genes, que pode ser empregue na manipulação artificial de um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados.
[0076] O gene de interesse pode ser artificialmente manipulado com. o uso de tal kit.
[EFEITOS VANTAJOSOS] [0077] Um corpo de planta com teor aumentado de um.
ácido graxo insaturado específico que é bom para, a saúde humana ou com teor diminuído de um ácido graxo insaturado especifico que é prejudicial para saúde humana e/ou um produto processado com o uso do mesmo pode ser fabricado com o uso de um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado e um sistema para controlar um ácido graxo insaturado, que é artificialmente modificado pelo mesmo.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 58/315 [0078]
Por exemple um ou mais genes selecionados a partir de um gene FAD2, um gene FAD3, um gene FAD4, um gene FAD6, um gene FAD7 e um gene FAD8 podem ser usados.
[BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS] [0079] A Figura 1 é um diagrama esquemático de vetores CRISPR-Cas9, pPZP~FAD2~7 e pPZP--FAD2~3 0 para modificar um gene FAD2 de grãos de soja.
[ 0080] A Figura 2 i 1 u s t r a os proce ssos de
c r e s c i m e n t o de corpos c l.e pranta trar 1S Q θ Πc o s d Θ SO ‘Ί s
preparados x Delo knockout c l.e um gene FAD2 com o uso de pPZP-
FAD2-7(a) e pPZP-FAD2-30(b).
[0081] A Figura 3 mostra transformantes To de pPZP~FAD2-7 e pPZP-FAD2-30.
[0082] A Figura 4 mostra os resultados de PCR para confirmar a inserção de genes dos transformantes To de pPZP-FAD2-7 e pPZP-FAD2-30. No presente documento, NT é Glycine max L. Kwangan (tipo selvagem), e n~- 1, n--- 2, n~ 3, n~ 5, n2 8, n~ 9, n~ 19 e n~ 21 são transformantes Τη.
[0083] A Figura 5 mostra o teor de ácido oleico em.
sementes T2 de pPZP~FAD2~7 e pPZP--FAD2~30 .
[0084] A Figura 6 mostra a frequência indel de um.
gene FAD2 alvejado por CRISPR-Cas9.
[0085] A Figura 7 mostra os resultados de sequenciamento para um gene FAD2 de grãos de soja transformados com o uso de CRISPR-Cas9 (uma sequência-alvo que inclui P21M mostrada com um sublinhado) .
[0086] A Figura 8 mostra os resultados da triagem de sítio-alvo e a frequência indel de um gene FAD2
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 59/315 manipulado nos transformantes Ti, mostra os resultados da triagem de sítio-alvo e a frequência indel de um gene FAD2 no (a) Cromossomo n~ 10 (chrlO) e (b) Cromossomo n- 2 0 (chr2 0) .
[0087] A Figura 9 mostra o resultados de sequencimento de sítio-alvo de um gene FAD2 manipulado nos transformantes Ti, mostra os resultados de sequencimento de sítio-alvo de um gene FAD2 no (a) Cromossomo n- 10 (chrlO) e (b) Cromossomo n- 20 (chr20).
[0088] A Figura 10 mostra transformantes Ti de pPZP~FAD2-7 e pPZP-FAD2-30 .
[0089] A Figura 11 mostra os resultados da análise da remoção de um gene dos transformantes Tj de pPZP-FAD2-7 e pPZP-FAD2-30 com o uso de PCR.
[MODOS DA INVENÇÃO] [0090] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que o comumente compreendido por aqueles versados na técnica à qual a presente invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou iguais aos descritos no relatório descritivo possam ser usados na implantação ou experimentos da presente invenção, métodos e materiais adequados serão descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências mencionadas no presente documento estão incorporadas a título de referência em sua totalidade. Além disso, os materiais, métodos e modalidades são meramente ilustrativos e não oretendem ser limitativos.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 60/315 [0091]
Um aspecto da presente invenção refere-se a ara corpo de planta transgênico cora teor aumentado de ura ácido graxo insaturado C8~24:D1.
[0092]
Especificamente, a presente invenção refere a ura corpo planta cora teor auraentado de um ácido graxo insaturado específico manipulando-se artificialmente ura fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados, sendo que a presente invenção inclui um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados no qual uma função é artificialmente alterada, uma composição de manipulação artificial para o mesmo, ura método para preparar o mesmo e um. corpo de planta que inclui o mesmo.
[0093] Um outro aspecto da presente invenção refere-se a ura corpo de planta transgênico cora teor diminuído de um ácido graxo insaturado C8~24:D2.
[0094] Especificamente, a presente invenção refere-se a um corpo de planta transgênico com teor diminuído de ura ácido graxo insaturado específico manipulando-se artificialmente ura fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados, sendo que a presente invenção inclui um tator associado à biossíntese ido insaturados qual uma função é artificialmente alterada, uma composição de manipulação artificial para o mesmo, um método para preparar o mesmo e um corpo de planta que inclui o mesmo.
[AGIDO GRAXO INSATURADO]
Um aspecto da presente invenção é um
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 61/315 sistema para alterar o teor de ácidos graxos [0096] Em um exemplo, um sistema para alterar o teor de um ácido graxo saturado específico em um corpo de planta pode ser fornecido.
[0097] Em um outro exemplo, um sistema para alterar o teor de um ácido graxo insaturado específico em um corpo de planta pode ser fornecido.
[0098] 0 termo ácido graxo usado no presente documento refere-se a um ácido carboxílico que tem uma cadeia alifática, e a maior parte dos ácidos graxos produzidos em um estado natural tem um número par de carbonos na faixa de cerca de 4 a 36, que forma uma cadeia de carbono. Ácidos graxos são amplamente classificados em. ácidos graxos saturados e ácidos graxos insaturados de acordo com o tipo de uma ligação de carbono.
[0099] 0 termo ácido graxo saturado usado no presente documento refere-se a. ácidos graxos formados com. uma ligação simples.
[0100] Ácidos graxos incluem ácido propiônico, ácido butírico, ácido valérico, ácido caproico, ácido enântico, ácido caprílico, ácido pelargônico, ácido cáprico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquídico, ácido beênico, ácido lignocérico, ácido cerótico e semelhantes.
[0101] O termo ácidos graxos insaturados usado no presente documento refere-se a ácidos graxos que têm uma ou mais ligações duplas carbono-carbono. Os ácidos graxos insaturados incluem todos os ácidos graxos cis insaturados
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 62/315 e ácidos graxos trans insaturados. Os ácidos graxos cis insaturados se referem a ácidos graxos insaturados nos quais dois hidrogênios que se ligam, respectivamente, a dois carbonos que participam de uma ligação dupla são estruturalmente colocados na mesma direção. Por outro lado, os ácidos graxos trans insaturados referem-se a ácidos graxos insaturados nos quais dois hidrogênios que se ligam, respectivamente, a dois carbonos que participam de uma ligação dupla são estruturalmente colocados em direções diferentes.
[01021 Os ácidos graxos insaturados podem ser classificados em Ômega 3, 6, 7 e 9 de acordo com a posição de um carbono que participa de uma ligação dupla.
[0103] Os ácidos graxos insaturados incluem ácidos graxos ômega 3 (ω-3).
[0104] No presente documento, os ácidos graxos
ômega-3 (ω - 3 ) r e f er em-s e a um ácid o graxo insaturado no
qual uma 1i g a ç ã o d up1a começa no terceiro carbono na
extremidade s da cadeia de carbono e : incluem ácido al z a. —
linolênico (ALA), ácido * eicosapenta .enoico (ΕΡΆ) e ác ido
docosa-hexaenoico (DHA).
[0105] Os ácidos graxos insaturados incluem ácidos graxos ômega 6 (ω-6).
[0106] No presente documento, os ácidos graxos ômega 6 (ω-6) referem-se a ácidos graxos insaturados nos quais uma ligação dupla começa no sexto carbono na extremidade de uma cadeia de carbono e incluem ácido linoleico (LA), ácido gama-linolênico (GLA), ácido di-homoPetição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 63/315 gama-linolênico (DGLA) e ácido araquidônico (AA).
[0107] Os ácidos graxos insaturados incluem ácidos graxos ômega 7 (ω-7).
[0108] No presente documento, os ácidos graxos ômega 7 (ω-7) referem-se a ácidos graxos insaturados nos quais uma ligação dupla começa no sétimo carbono na extremidade de uma cadeia de carbono e incluem ácido paulínico, ácido palmitoleico ou ácido vacênico.
[0109] Os ácidos graxos insaturados incluem ácidos graxos ômega 9 (ω-9).
[0110] No presente documento, os ácidos graxos ômega 9 (ω-9) referem-se a ácidos graxos insaturados nos quais uma ligação dupla começa no nono carbono na extremidade de uma cadeia de carbono e incluem ácido oleico, ácido elaídico, ácido eicosenoico, ácido erúcico e ácido nervônico.
[0111] Em uma modalidade exemplificativa, o ácido graxo insaturado pode ser um ácido graxo ômega 6 (ω-6).
[0112] Em uma outra modalidade exemplificativa, o ácido graxo insaturado pode ser um. ácido graxo ômega 9 (ω9) · [0113] Além disso, o ácido graxo insaturado pode ser classificado como um ácido graxo insaturado CN:DN representando-se o número de carbonos e o número de ligações duplas.
[0114] O termo ácido graxo insaturado CN: DM refere-se a um ácido graxo insaturado que consiste em N número de carbonos (C) e inclui M números de ligações
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 64/315 duplas (D) . No presente documento, N pode ser um número inteiro de 4 a 36, e M pode ser um número inteiro de 1 a 35 .
[0115] Por exemplo, o ácido graxo insaturado que consiste em 18 carbonos e inclui 2 ligações duplas pode ser classificado por ser representado como um ácido graxo insaturado C18:D2.
[0116] Em uma modalidade exemplificativa, o ácido graxo insaturado inclui um ácido graxo insaturado CN:D1.
[011'7] No presente documento, N pode ser um número inteiro de 4 a 36.
[0118] De preferência, o ácido graxo insaturado CN:D1 pode ser um. ácido graxo insaturado C8:D1, um ácido graxo insaturado C10:Dl, um ácido graxo insaturado C12:D1, um ácido graxo insaturado C14:D1, um ácido graxo insaturado C16:D1, um ácido graxo insaturado C18:D1, um. ácido graxo insaturado C2O:D1, um ácido graxo insaturado C22:D1 ou um. ácido graxo insaturado C24:D1.
[0119] Em uma outra modalidade exemplificativa, o ácido graxo insaturado inclui um ácido graxo insaturado CN:D2.
[0120] No presente documento, N pode ser um número inteiro de 4 a 36.
[0121] De preferência, o ácido graxo insaturado CN:D2 pode ser um ácido graxo insaturado C8:D2, um ácido graxo insaturado C10:D2, um ácido graxo insaturado C12:D2, um ácido graxo insaturado C14:D2, um ácido graxo insaturado C16:D2, um ácido graxo insaturado C18:D2, um ácido graxo
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 65/315 insaturado C20:D2, um ácido graxo insaturado C22:D2 ou um ácido graxo insaturado C24:D2.
[0122] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, o ácido graxo insaturado inclui um ácido graxo insaturado CN:D3.
[0123] No presente documento, N pode ser um número inteiro de 4 a 36.
[0124] De preferência, o ácido graxo insaturado CN:D3 pode ser um ácido graxo insaturado C8:D3, um ácido graxo insaturado C10:D3, um ácido graxo insaturado C12:D3, um ácido graxo insaturado C14:D3, um ácido graxo insaturado C16:D3, um ácido graxo insaturado C18:D3, um ácido graxo insaturado C20:D3, um ácido graxo insaturado C22:D3 ou um. ácido graxo insaturado C24:D3.
[0125] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, o ácido graxo insaturado inclui um ácido graxo insaturado CN:D4.
[0126] No presente documento, N pode ser um número inteiro de 4 a 36.
[0127] De preferência, o ácido graxo insaturado CN:D4 pode ser um ácido graxo insaturado C8:D4, um ácido graxo insaturado C10:D4, um ácido graxo insaturado 012:D4, um ácido graxo insaturado C14:D4, um ácido graxo insaturado 016:D4, um ácido graxo insaturado 018:D4, um ácido graxo insaturado 020:D4, um ácido graxo insaturado 022:D4 ou um ácido graxo insaturado 024:D4.
[0128] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, o ácido graxo insaturado inclui um ácido
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 66/315 graxo insaturado CN:D5.
[0129] No presente documento, N pode ser um número inteiro de 4 a 36.
[0130] De preferência, o ácido graxo insaturado CN:D5 pode ser um ácido graxo insaturado C8:D5, um ácido graxo insaturado C10:D5, um ácido graxo insaturado C12:D5, um ácido graxo insaturado C14:D5, um ácido graxo insaturado C16:D5, um ácido graxo insaturado C18:D5, um ácido graxo insaturado C20:D5, um ácido graxo insaturado C22:D5 ou um ácido graxo insaturado C24:D5.
[0131] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, o ácido graxo insaturado inclui um ácido graxo insaturado CN:D6.
[0132] No presente documento, N pode ser um número inteiro de 4 a 36.
[0133] De preferência, o ácido graxo insaturado CN:D6 pode ser um. ácido graxo insaturado C8:D6, um ácido graxo insaturado C10:D6, um ácido graxo insaturado C12:D6, um. ácido graxo insaturado C14:D6, um ácido graxo insaturado C16:D6, um ácido graxo insaturado C18:D6, um. ácido graxo insaturado C20:D6, um ácido graxo insaturado C22:D6 ou um. ácido graxo insaturado C24:D6.
[0134] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, o ácido graxo insaturado inclui um ácido graxo insaturado CN:DK.
[0135] No presente documento, N pode ser um número inteiro de 4 a 36, e K pode ser um número inteiro de 7 a
35.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 67/315 [0136] Em uma modalidade exemplificativa, o ácido graxo insaturado pode ser um ácido graxo insaturado C8 a 24:D1.
[0137] De preferência, o ácido graxo insaturado pode ser selecionado dentre o grupo que consiste em um ácido graxo insaturado C16:D1, um ácido graxo insaturado
Cl 8:D1, um ácido graxo insaturado C20:i )1 e um ácido graxo
j Π S d. L. 1-117 c ido C22:D1.
[0138] Com a m á x i m a p r e f e r ê n c ia, o ácido graxo
insature ado pode ser um ácido graxo insa t u r a d o C18:D1 ou um
ácido g.i a xo insaturado C20:D1.
[0139] Em uma outra modalidade e x e mp 1 i f i c a t :i .va, o
ácido graxo insaturado pode ser um ácido graxo insaturado C8 a 24:D2.
[0140] De preferência, o ácido graxo insaturado pode ser selecionado dentre o grupo que consiste em um. ácido graxo insaturado C16:D2, um ácido graxo insaturado C18:D2, um ácido graxo insaturado C20:D2 e um ácido graxo insaturado C22:D2.
[0141] Com a máxima preferência, o ácido graxo insaturado pode ser um ácido graxo insaturado C18:D2 ou um. ácido graxo insaturado C20:D2.
FATOR ASSOCIADO À BIOSSINTESE DE ÁCIDOS GRAXOS INSATURADOS [0142] Um outro aspecto da presente invenção é um fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado ou modificado.
[0143] O termo fator associado à biossintese de
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 68/315 ácidos graxos insaturados usado no presente documento refere-se a todos os fatores que participam diretamente ou afetam indiretamente a biossintese de um ácido graxo insaturado. No presente documento, o fator pode ser DNA, RNA, um gene, um peptídeo, um polipeptideo ou uma proteína.
[0144] Em uma modalidade exemplificativa, o fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados inclui vários materiais com capacidade para controlar a biossintese de um ácido graxo insaturado que não são naturais, isto é, artificialmente manipulados. Por exemplo, o fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados pode ser um gene ou proteína geneticamente manipulado ou modificado, que é expresso em uma planta.
[0145] O termo artificialmente manipulado significa um estado artificialmente modificado que não é um estado de ocorrência natural.
[0146] O termo geneticamente manipulado significa que uma modificação genética é artificialmente introduzida em substâncias derivadas de plantas citadas na presente invenção e pode ser, por exemplo, genes e produtos de genes (polipeptídeos, proteínas, etc.) em que seus genomas são artificialmente modificados para um propósito específico.
[0147] Como um exemplo preferencial, a presente invenção fornece um fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados que é geneticamente manipulado ou modificado para um propósito específico.
[0148] Genes ou proteínas que têm as funções
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 69/315 listadas abaixo podem ter múltiplos tipos de funções, nao apenas um tipo de função associada à biossíntese de ácidos graxos insaturados. Além disso, conforme necessário, duas ou mais funções e fatores associados à biossíntese de ácidos graxos insaturados podem ser fornecidas.
[0149] Um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados pode produzir um ácido graxo insaturado formando-se uma ou mais ligações duplas em um ácido graxo s a t u r a d o .
[0150] O fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados pode formar uma ou mais novas ligações duplas em um ácido graxo insaturado.
[0151] O fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados pode alterar uma posição de uma ou mais ligações duplas incluídas em um ácido graxo insaturado.
[0152] O fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados pode remover uma ou mais ligações duplas de um ácido graxo insaturado que tem duas ou mais ligações duplas.
[0153] O fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados pode mudar um ácido graxo cis insaturado para um ácido graxo trans insaturado.
[0154] O fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados pode mudar um ácido graxo trans insaturado para um ácido graxo cis insaturado.
[0155] O fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados pode controlar o teor de um ácido graxo insaturado incluído em uma planta.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 70/315 [0156] O fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados pode aumentar o teor de um ácido graxo insaturado específico incluído em uma planta.
[0157] 0 fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados pode diminuir o teor de um ácido graxo insaturado específico incluído em uma planta.
[0158] Em uma modalidade exemplificativa, o fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados pode ser um fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados de uma planta.
[0159] De preferência, o fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados pode ser um gene FAD ou uma proteína FAD.
[0160] Com a máxima preferência, o fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados pode ser um ou
mais selecionados FAD3, FAD6, FAD7 e dentre o grupo que FAD 8 . consiste em. FAD 2,
[0161] Em qualquer modalidade exemplificativa, o
fator associado à pode ser FAD2. biossintese de ácidos graxos insaturados
[0162] Um gene FAD2 (desatura; se de ácido graxo
ômega 6) refere-í >e a um gene (DNA, cDNA ou mRNA de
complemento total) que codifica a proteína FAD2 também denominada FAD2-1, FAD2-1B ou GMFAD2-1B. Em um exemplo, o gene FAD2 pode ser um ou mais genes selecionados dentre o grupo que consiste nos seguintes genes, mas a presente invenção não se limita aos mesmos: genes que codificam plantas, por exemplo, FAD2 de soja (Glycine max) (por
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 71/315 exemplo η™ registro
NCBI
NP....0 013 418 6b. 1,
XP....0 06 6058 83.1, XP....0 06 6058 82.1, XP....0 06 6058 85.1,
XP__006605884.1 ou XP....014627765.1) , por exemplo, genes FAD2 representados pelo n™ de registro NCBI NM__001354936.1, XM....006605820.2, XPI... 0 0 6 6 0 5 819.2 , XM....0 0 6 6 0 5 8 2 2.2 ,
XM....0066 05821.2 ou XM....014772279.1 .
[01631 Em qualquer modalidade exemplificativa, o fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados pode ser FAD3.
[0164] Um gene FAD3 (desaturase de ácido graxo ômega 3 microssômico) refere-se a um gene (DNA, cDNA ou mRNA de complemento total) que codifica uma proteína FAD3 também, denominada Fanx. Em um exemplo, o gene FAD3 pode ser um. ou mais genes selecionados dentre o grupo que consiste nos seguintes genes, mas a presente invenção não se limita aos mesmos: um. gene que codifica plantas, por exemplo, FAD3 de soja {Glycine max) (por exemplo n- de registro NCBI NP_001237507.1) , por exemplo, um gene FAD3 representada pelo n- de registro NCBI NM__001250578.1.
[0165] Em qualquer modalidade exemplificativa, o fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados pode ser FAD6.
[0166] Um gene FAD6 (desaturase de ácido graxo 6) refere-se a um gene (DNA, cDNA ou mRNA de complemento total) que codifica uma proteína FAD6 também denominada FADC ou SFD4. Em um exemplo, o gene FAD6 pode ser um ou mais genes selecionados dentre o grupo que consiste nos seguintes genes, mas a presente invenção não se limita aos
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 72/315 mesmos: um gene que codifica uma planta, por exemplo, FAD6 de Arabidopsis thaliana (por exemplo, n- de registro NCBI NP__194824.1) , por exemplo, um gene FAD6 representado pelo n- de registro NCBI NM...119243.4 .
[0167] Em qualquer modalidade exemplificativa, o fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados pode ser FAD7.
[0168] Um gene FAD7 (isoforma 2 da desaturase de ácido graxo ômega 3 no cloroplasto) refere-se a um gene (DNA, cDNA ou mRNA de complemento total) que codifica uma proteína FAD7. Em um exemplo, o gene FAD7 pode ser um ou mais genes selecionados dentre o grupo que consiste nos seguintes genes, mas a presente invenção não se limita aos mesmos: um gene que codifica uma planta, por exemplo, FAD7 de soja {Glycine max) (por exemplo, n- de registro NCBI NP_001237361.1) , por exemplo, um. gene FAD7 representado pelo n--- de registro NCBI NM__00 1250432.1 .
[0169] Em qualquer modalidade exemplificativa, o fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados pode ser FAD8.
[0170] Um. gene FAD8 (desaturase de ácido graxo ômega 3, semelhante a cloroplasto) refere-se a um gene (DNA, cDNA ou mRNA de complemento total) que codifica uma proteína FAD8. Em um exemplo, o gene FAD8 pode ser um ou mais genes selecionados dentre o grupo que consiste nos seguintes genes, mas a presente invenção não se limita aos mesmos: um gene que codifica uma planta, por exemplo, FAD8 de soja (Glycine max) (por exemplo, n£ de registro NCBI
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 73/315
33/253
NP....001239777.1) , por exemplo, um gene FAD8 representado pelo n- de registro NCBI NM....001252848.1 .
[0171] O fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados pode ser derivado de uma planta, tal como soja, Arabidopsis thaliana, gergelim, milho e semelhantes, etc.
[0172] Informações sobre os genes podem ser obtidas a partir de um banco de dados conhecido, tal como GeneBank do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia. (NCBI) .
[0173] Em uma modalidade exemplificativa da presente invenção, o fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados, por exemplo, FAD2, FAD3, FAD6, FAD7 ou FAD8, pode ser fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado.
[0174] Em uma determinada modalidade, o fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado pode ser geneticamente manipulado.
[0175] A manipulação ou modificação de genes pode ser alcançada pela inserção artificial, deleção, substituição ou inversão que ocorre em uma região parcial ou inteira da sequência genômica de um gene do tipo selvagem. Além disso, a manipulação ou modificação de genes pode ser alcançada por fusão de manipulação ou modificação de dois ou mais genes.
[0176] Por exemplo, o gene pode ser adicionalmente ativado por tal manipulação ou modificação de genes, de
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 74/315
34/253 modo que uma proteína codificada a partir do gene deva ser expressa na forma de uma proteína que tem uma função melhorada, em comparação à função inata. Em um exemplo, quando uma função da proteína codificada por um gene específico for A, uma função de uma proteína expressa por um gene manipulado pode ser totalmente diferente de A ou pode ter uma função adicional (A+B) que inclui A. Por exemplo, uma fusão de duas ou mais proteínas pode ser expressa com o uso de dois ou mais genes que têm funções diferentes ou complementares devido a tal manipulação ou modificação de genes.
[017'7] Por exemplo, duas ou mais proteínas podem ser expressas separada ou independentemente em células com. o uso de dois ou mais genes que têm funções diferentes ou complementares devido a tal manipulação ou modificação de genes.
[0178] O fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados manipulado pode produzir um ácido graxo insaturado formando-se uma ou mais ligações duplas em um. ácido graxo saturado.
[0179] O fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados manipulado pode formar uma ou mais novas ligações duplas em um ácido graxo insaturado.
[0180] O fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados manipulado pode alterar as posições de uma ou mais ligações duplas incluídas em um ácido graxo insaturado.
[0181] O fator associado à biossíntese de ácidos
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 75/315 graxos insaturados manipulado pode remover uma ou mais ligações duplas de um ácido graxo insaturado que tem duas ou mais ligações duplas.
[0182] O fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados manipulado pode mudar um ácido graxo cis insaturado para um ácido graxo trans insaturado.
[0183] O fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados manipulado pode mudar um ácido graxo trans insaturado para um ácido graxo cis insaturado.
[0184] O fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados manipulado pode controlar o teor de um ácido graxo insaturado incluído em uma planta.
[0185] O fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados manipulado pode aumentar o teor de um. ácido graxo insaturado específico incluído em uma planta.
[0186] O fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados manipulado pode diminuir o teor de um. ácido graxo insaturado específico incluído em uma planta.
[0187] A manipulação incluí todos os tipos de modificações estruturais ou funcionais do fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados.
[0188] A modificação estrutural do fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados inclui todos os tipos de modificações, que não são as mesmas que aquelas de um tipo selvagem existente em um estado natural.
[0189] Por exemplo, quando o fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados for DNA, RNA ou um gene, a modificação estrutural pode ser a perda de um ou
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 76/315 rnais nucleotideos.
[0190] A modificação estrutural pode ser a inserção de um ou mais nucleotideos.
[0191] No presente documento, os nucleotideos inseridos incluem todos os nucleotideos de um indivíduo, incluindo um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados e nucleotideos provenientes do lado externo do indivíduo.
[0192] A modif icação estrutural pode ser 3
substituição de um ou ma: i.s nucleotideos.
[0193] A modifi c a ç ã o e s t. r u t u r a 1 pode incluir 3
modificação química de um ou mais nucleotideos.
[0194] No presente documento, a modificação química inclui todas as adições, remoções e substituições de grupos químicos funcionais.
[0195] Como um outro exemplo, quando o fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados for um. peptídeo, um. polipeptídeo ou uma proteína, a modificação estrutural pode ser a perda de um ou mais aminoácidos.
[0196] A modificação estrutural pode ser a inserção de um. ou mais aminoácidos.
[0197] No presente documento, os aminoácidos inseridos incluem todos os aminoácidos de um indivíduo, incluindo um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados e aminoácidos provenientes do lado externo do indivíduo.
[0198] A modificação estrutural pode ser a substituição de um ou mais aminoácidos
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 77/315 [0199] A modificação estrutural pode incluir a modificação química de um ou mais aminoácidos.
[0200] No presente documento, a modificação química inclui todas as adições, remoções e substituições de grupos químicos funcionais.
[0201] A modificação estrutural pode ser a fixação parcial ou total de um peptídeo, polipeptídeo ou proteína diferente.
[0202] No presente documento, o peptídeo, polipeptídeo ou proteína diferente pode ser um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados ou um peptídeo, polipeptídeo ou proteína que tem uma função diferente.
[0203] A modificação funcional do fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados pode incluir todos os tipos que têm. uma função melhorada ou reduzida, em. comparação com aquela de um tipo selvagem existente em. um. estado natural, e que têm uma terceira função diferente.
[0204] Por exemplo, quando o fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados for um peptídeo, polipeptídeo ou proteína, a modificação funcional pode ser uma mutação do fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados.
[0205] No presente documento, a mutação pode ser uma mutação que intensifica ou suprime uma função do fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados.
[0206] A modificação funcional pode ter uma função adicional do fator associado à biossíntese de ácidos graxos
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 78/315 insaturados [0207] No presente documento, a função adicional pode ser a mesma função ou uma função diferente. Além disso, o fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados que tem a função adicional pode ser fundido a um peptideo, polipeptideo ou proteína diferente.
[0208] A modificação funcional pode ser a intensificação na funcionalidade devido à expressão aumentada do fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados.
[0209] A modificação funcional pode ser a degradação na funcionalidade devido à expressão diminuída do fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados.
[0210] Em uma modalidade exemplificativa, o fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados manipulado pode ser induzido por uma ou mais das seguintes mutações:
deleções totais ou parciais do fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados, isto é, um gene a ser manipulado (doravante, denominado genealvo), por exemplo, deleção de nucleotideos de 1 bp ou mais longos, por exemplo, 1 a 30, 1 a 27, 1 a 25, 1 a 23, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 3 ou 1 nucleotideo do genealvo, substituição de nucleotideos de 1 bp ou mais longos, por exemplo, 1 a 30, 1 a 27, 1 a 25, 1 a 23, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 3 ou 1 nucleotideo do
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 79/315 gene-alvo com um nucleotideo diferente de um tipo selvagem, inserção de um ou mais nucleotideos, por exemplo, la 30, la 27, la 25, la 23, la 20, la 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 3 ou 1 nucleotideo (cada um independentemente selecionado dentre A, T, C e G) em uma determinada posição do gene-alvo.
Uma parte do gene-alvo modificado (regiãoalvo) pode ser uma região contínua de 1 bp ou mais, 3 bp ou mais, 5 bp ou mais, 7 bp ou mais, 10 bp ou mais, 12 bp ou mais, 15 bp ou mais, 17 bp ou mais ou 20 bp ou mais, por exemplo, 1 bp a 30 bp, 3 bp a 30 bp, 5 bp a 30 bp, 7 bp a 3 0 bp, 10 bp a 3 0 bp, 12 bp a 3 0 bp, 15 bp a 30 bp, 17 bp a 30 bp, 20 bp a 3 0 bp, 1 bp a 2'1 bp, 3 bp a 27 bp, 5 bp a 27 bp, 7 bp a 2 7 bp, 10 bp a 2 7 bp, 12 bp a 2 7 bp, 15 bp a 2 7 bp, 17 bp a 2 7 bp, 2 0 bp a 2 7 bp, 1 bp a 2 5 bp, 3 bp a 2 5 bp, 5 bp a 2 5 bp, 7 bp a 2 5 bp, 10 bp a 2 5 bp, 12 bp a 2 5 bp, 15 bp a 2 5 bp, 17 bp a 2 5 bp, 2 0 bp a 2 5 bp, 1 bp a 2 3 bp, 3 bp a 23 bp, 5 bp a 2 3 bp, 7 bp a 23 bp, 10 bp a 2 3 bp, 12 bp a 2 3 bp, 15 bp a 2 3 bp, 17 bp a 2 3 bp, 2 0 bp a 2 3 bp, 1 bp a 2 0 bp, 3 bp a 2 0 bp, 5 bp a 2 0 bp, 7 bp a 2 0 bp, 10 bp a 2 0 bp, 12 bp a 2 0 bp, 15 bp a 2 0 bp, 17 bp a 2 0 bp, 21 bp a 25 bp, 18 bp a 22 bp ou 21 bp a 23 bp da sequência de bases do gene.
[SISTEMA PARA CONTROLAR ÁCIDOS GRAXOS INSATURADOS] [0212] Um aspecto da presente invenção refere-se a um sistema para controlar um ácido graxo insaturado que
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 80/315 controla a biossíntese de um ácido graxo insaturado manipulando-se artificialmente um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados.
[0213] O termo sistema para controlar um ácido graxo insaturado usado no presente documento inclui todos os fenômenos que afetam a promoção ou inibição da biossíntese de um ácido graxo insaturado e/ou o aumento ou a inibição da produção de ácidos graxos insaturados alterando-se as funções do fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado e inclui todos os materiais, composições, métodos e usado direta ou indiretamente envolvidos no sistema de controle da biossíntese de um ácido graxo insaturado.
[0214] Cada fator que constitui o sistema para controlar a biossíntese de um ácido graxo insaturado também
é denominado fator de controle de ácidos graxo
insaturados. 0 sistema, da presente invenção inclui um.
mecanismo modificado em um corpo de planta que é associado a um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado. Por meio do fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado, em qualquer modalidade exemplificativa, a biossíntese de um ácido graxo insaturado C8 a 24:Dl pode ser controlada, em qualquer modalidade exemplificativa, a biossíntese de um ácido graxo insaturado C8 a 24:D2 pode
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 81/315 ser controlada.
em qualquer modalidade exemplificativa, a quantidade de produção de um ácido graxo insaturado C8 a 24:Dl pode ser controlada, em qualquer modalidade exemplificativa, a quantidade de produção de um ácido graxo insaturado C8 a 24:D2 pode ser controlada, em qualquer modalidade exemplificativa, o teor de um ácido graxo insaturado C8 a 24:Dl em um corpo de planta pode ser controlado, em qualquer modalidade exemplificativa, o teor de um ácido graxo insaturado C8 a 24:D2 em um corpo de planta pode ser controlado, em qualquer modalidade exemplificativa, a razão de teor do ácido graxo insaturado C8 a 24: Dl e do ácido graxo insaturado C8 a 24:D2 em um corpo de planta pode ser controlada, em. qualquer modalidade exemplificativa, uma ligação dupla do ácido graxo insaturado C8 a 24:D1 pode ser adicionada ou removida e em. qualquer modalidade exemplificativa, uma ligação dupla do ácido graxo insaturado C8 a 24:D2 pode ser adicionada ou removida.
[0216] Em uma outra modalidade exemplificativa, o sistema para controlar um ácido graxo insaturado da presente invenção inclui uma composição para manipular um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados.
[0217] A composição para manipulação pode ser uma
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 82/315 composição com capacidade para manipular artificialmente um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados e, de preferência, uma composição para manipulação de genes.
[0218] Doravante, a composição para manipulação de genes será descrita.
[COMPOSIÇÃO PARA MANIPULAR FATOR ASSOCIADO Ã BIOSSÍNTESE DE ÁCIDOS GRAXOS INSATURADOS] [0219] A manipulação ou modificação de substâncias envolvidas no fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados e o sistema para controlar um ácido graxo insaturado da presente invenção são, de preferência, alcançados por manipulação genética.
[0220] Em um aspecto, a composição e o método para
π i a n i. p u 1 a ç a o de um gene alve j ando-se ui na região de não
codificação ou codifica. ção parcial ou i π r e i r a o ίο fator
3. s s o c i ado à. bios síntese de ácidos graxos insaturad' os podem.
ser fornecidos.
[0221] Em uma modalidade exemplificativa, a composição e o método podem ser uados na manipulação ou modificação de um ou mais genes associados à biossíntese de ácidos graxos insaturados envolvidos na formação de um sistema desejado para controlar um ácido graxo insaturado. A manipulação ou modificação pode ser realizada por modificação de ácidos nucleicos que constituem um gene. Como resultado da manipulação, todos dentre knockdown, knockout e knockin estão incluídos.
[0222] Em uma modalidade exemplificativa, a
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 83/315 manipulação pode ser realizada alvejando-se uma região promotora, ou uma sequência de transcrição, por exemplo, uma sequência de introns ou éxons. Um sequência de codificação, por exemplo, uma região de codificação, uma região de codificação inicial pode ser alvejada para a modificação da expressão e knockout.
[02231 Em uma modalidade exemplificativa, a modificação de ácidos nucleicos pode ser a substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais nucleot ídeos, por exemplo, nucleotídeos de 1 a 30 bp, 1 a 27 bp, 1 a 25 bp, 1 a 2 3 bp, 1 a 2 0 bp, 1 a 15 bp, 1 a 10 bp, 1 a 5 bp, 1 a 3 bp ou 1 bp.
[0224] Em uma modalidade exemplificativa, para o knockout de um ou mais genes associados à biossintese de ácidos graxos insaturados, a eliminação da expressão de um ou mais dos genes, ou um ou mais knockouts de um. ou dois alelos, a região mencionada acima pode ser alvejada de modo que um ou mais genes associados à biossintese de ácidos graxos insaturados contenham uma deleção ou mutação.
[0225] Em uma modalidade exemplificativa, o knockdown de um gene pode ser usado para diminuir a expressão de alelos ou transcriptomas indesejados.
[0226] Em uma modalidade exemplificativa, sequências não codificantes de um promotor, um intensif icador, um intron, uma UTR 3 ' e/ou um sinal de poliadenilação podem ser alvejadas de modo a serem usadas na modificação de um gene associado à biossintese de ácidos graxos insaturados que afeta uma função de biossintese de
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 84/315 ácidos graxos insaturados.
[0227] Em uma modalidade exemplificativa, a atividade de um gene associado à biossintese de ácidos graxos insaturados pode ser regulada, por exemplo, ativada ou inativada pela modificação de ácidos nucleicos do gene. [0228] Em uma modalidade exemplificativa, a modificação de ácidos nucleicos do gene pode catalisar a divagem de fita simples ou fitas duplas, isto é, rupturas de fitas de ácido nucleico em uma região específica do gene-alvo por meio de um complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia, resultando na inativação do genealvo .
[0229] Em uma modalidade exemplificativa, as rupturas das fitas de ácido nucleico podem ser reparadas através de um mecanismo, tal como recombinação homóloga ou união de extremidades não homólogas (NHEJ).
[0230] Nesse caso, quando o mecanismo NHEJ ocorre, uma alteração na sequência de DNA é induzida no sítio de clivagem, resultando na inativação do gene. O reparo por NHEJ pode induzir a substituição, inserção ou deleção de um. fragmento de gene curto e pode ser usado na. indução de um. knockout do gene correspondente .
[0231] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição para manipular um fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados.
[0232] A composição para a manipulação é uma composição que tem capacidade para manipular artificialmente um fator associado à biossintese de ácidos
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 85/315 graxos insaturados e, de uma composição para manipulaçao de genes [0233] A composição pode ser empregue na manipulação de genes para um ou mais fatores associados à biossintese de ácidos graxos insaturados envolvidos na formação de um sistema desejado para controlar um ácido g r a x o i n s a t u r a d o .
[ u 2 3 4 j A m a n i. ρ u 1 a ç a o de genes pocis ser r e a 1 r z a d, a em consideração de um processo de regulação de expressão de genes.
[0235] Em uma modalidade exemplificativa, a mesma pode ser realizada selecionando-se um meio de manipulação adequado para cada estágio de transcrição, processamento de RNA, transporte de RNA, degradação de RNA, tradução e estágios de regulação de modificação de proteínas.
[0236] Em uma modalidade exemplificativa, o RNA pequeno (sRNA) interfere com o mRNA ou reduz a estabilidade do mesmo com o uso de RNA de interferência (RNAi) ou RNA silenciador e, em alguns casos, rompe o mRNA para interromper a entrega de informações de síntese de proteínas, resultando na regulação da expressão de informações genéticas.
[0237] A manipulação de genes pode ser realizada por modificação de ácidos nucleicos que constituem um fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados. Como resultados de manipulação, todos dentre knockdown, knockout e knockin estão incluídos.
[0238] Em uma determinada modalidade, a
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 86/315 modificação de ácidos nucleicos pode ser a substituição,
deleção, e/ou inserção de um ou maií 3 nucleotí deos, por
exemplo, nuclei ctídeos de 1 έ a 30 bp, 1 a 27 bp, 1 a 25 bp, 1
a 2 3 bp, 1 a 2 0 bp, 1 a 15 bp, 1 a 10 bp, 1 a 5 bp, 1 a 3
bp ou 1 bp.
[0239] Em uma determinada modalidade, para knockout de um ou mais fatores associados à biossíntese de ácidos graxos insaturados, a eliminação da expressão de um ou mais fatores, ou um ou mais knockouts de um ou dois alelos, o gene pode ser manipulado de modo que um ou mais fatores associados à biossíntese de ácidos graxos insaturados contenham uma deleção ou mutação.
[0240] Em. uma determinada modalidade, o knockdown do fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados pode ser usado para diminuir a expressão de alelos ou transcr.iptom.as indesejados.
[0241] Em. uma determinada modalidade, a modificação de ácidos nucleicos pode ser a inserção de um. ou mais genes ou fragmentos de ácido nucleico. No presente documento, o fragmento de ácido nucleico pode ser uma sequência de ácidos nucleicos que consiste em um ou mais nucleotídeos, e um comprimento do fragmento de ácido nucleico pode ser 1 a 40 bp, 1 a 50 bp, 1 a 60 bp, 1 a 70 bp, 1 a 80 bp, 1 a 9 0 bp, 1 a 100 bp, 1 a 50 0 bp ou 1 a 1.000 bp. No presente documento, o gene inserido pode ser um dos fatores associados à biossíntese de ácidos graxos insaturados ou a gene que tem uma função diferente.
[0242] Em uma modalidade exemplificativa, a
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 87/315 modificação de ácidos nucleicos pode empregar uma enzima variante ou do tipo selvagem que tem capacidade para catalisar a hidrólise (divagem) de ligações entre ácidos nucleicos em uma molécula de DNA ou RNA, de preferência, uma molécula de DNA. A mesma também emprega um complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia.
[02431 Por exemplo, o gene pode ser manipulado com o uso de uma ou mais nucleases selecionadas dentre o grupo que consiste em uma meganuclease, uma nuclease de dedo de zinco, CRISPR/Cas9 (proteína Cas9), CRISPR-Cpfl (proteína Cpfl) e uma TALE-nuclease, regulando, assim, a expressão de informações genéticas.
[0244] Em uma determinada modalidade, de modo não limitativo, a manipulação de genes pode ser mediada por reparo por NHEJ ou direcionado por homologia (HDR) com o uso complexo proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia, por exemplo, um sistema CRISPRjCas.
[0245] Nesse caso, quando o mecanismo NHEJ ocorre, uma alteração na sequência de DNA pode ser induzida em. um. sítio de divagem, inativando, assim, o gene. O reparo por NHEJ pode induzir a substituição, inserção ou deleção de um. fragmento de gene curto e pode ser usado na indução do knockout: de um gene correspondente.
[0246] Em um outro aspecto, a presente invenção pode fornecer o sítio de manipulação de genes.
[0247] Em uma modalidade exemplificativa, quando o gene for modificado por modificação mediada por NHEJ, o sítio de manipulação de genes pode ser um sítio no gene que
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 88/315 desencadeia a diminuição ou eliminação de expressão de um produto de gene associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados.
[0248] Por exemplo, o sitio pode estar em uma região de codificação inicial, uma sequência promotora, u m a s e qu ê n c i a i n t e n s i f i c a d o r a, uma sequência de introns específica ou uma sequência de éxons específica.
Em uma modalidade exemplificativa, a composição para manipular um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados pode alvejar um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados que afeta a regulação da biossíntese de
ácido graxo insa turado, tal como um gene FAD, de
p r θ l θ r θ n c r a f um ger le FAD2, um gene FAD.3, um gene FAD6, um.
gene FAD'7 ou um gene FAD8, como ui τι. indivíduo de
manipulação. Com a máxima preferência, a composição para
manipular um f ator assoe .1. a o < o à biossíntese de ácidos graxos
insaturados pode alvejar um gene FAD2 como um indivíduo de manipulação.
[0249] Exemplos de regiões-alvo do gene FAD2, isto é, sequências-alvo para regiões nas quais a manipulação de genes ocorre ou que são reconhecidas para manipulação de genes são resumidos na Tabela 1.
[0250] A sequência-alvo pode alvejar um ou mais genes.
[0251]
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 89/315 simultaneamente dois ou mais genes. No presente documento, os dois ou mais genes podem ser genes homólogos ou genes [0252] 0 gene pode conter uma ou mais sequênciasalvo .
[0253] 0 gene pode ser simultaneamente alvejado em duas ou mais sequências-alvo.
[0254] 0 gene pode ser alterado no sitio e o número de manipulações do gene de acordo com o número de secruênci a s - a 1 vo [ 0255]
A manipulação de genes pode ser projetada de várias dependendo do número e das posiçoes das [0256] A manipulação simultaneamente em duas ou presente documento, as duas ou estar presentes no gene homólogo de genes pode ocorrer mais sequências-alvo. No mais sequências-alvo podem.
ou no gene heterólogo.
[025'7] A manipulação de genes pode ser realizada simultaneamente em relação aos dois ou mais genes. No presente documento, os dois ou mais genes podem ser genes homólogos ou genes heterólogos.
[0258] Doravante, exemplos de sequências-alvo que têm capacidade para ser usados em modalidades da presente invenção sao mostrados nas seguintes tabelas:
[0259]
Tabela 1. Sequências-alvo do gene VEGFA
TABELA 1
N- Sequência-alvo (incluindo PAM)
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 90/315
1 ATAGATTGGCCATGCAATGAGGG (SEQ ID NO: 1)
Π ΑΆΤAGATΤ GGCCAT GCΑΆΤ GAGG (SEQ ID NO : 2)
3 CC T TGGAGAACCCAATAGAT TGG (SEQ ID NO: 3)
4 TGGGTGATTGCTCACGAGTGTGG (SEQ ID NO: Δ.
5 T T T TAGT C CC T TAT T T C T CAT GG (SEQ ID NO : b )
6 AAACAC T T CAT CAC GGT CAAGGG (SEQ ID NO: 6)
Ί GT GT T T GGAAC C C T T GAGAGAGG (SEQ ID NO : 7)
8 GTGAATGGTGGCTTTGTGTTTGG (SEQ ID NO : 8)
9 ACAAAGCCACCATTCACTGTTGG (SEQ ID NO: 9)
10 AGTTGGCCAACAGTGAATGGTGG (SEQ ID NO : 10 )
11 T T GAGT T GGC CAACAGT GAAT GG (SEQ ID NO: 11)
12 TGAAAGGTCATAAACAACATAGG (SEQ ID NO: 12)
13 CAAACAC T T CAT CAC GG T CAAGG (SEQ ID NO : 13)
14 AACCAAAAT C CAAAGT T GCAT GG (SEQ ID NO: 14 )
15 TGGGAGCATAAGGGTGGTAGTGG (SEQ ID NO : 15 )
16 AATATATGGGAGCATAAGGGTGG (SEQ ID NO : 16)
17 GTTTGGCTGCTATGTGTTTATGG (SEQ ID NO: 17)
18 T T T GGC T GC TAT GT GT T TAT GGG (SEQ ID NO : 18)
19 T T GGC T GC TAT GT GT T TAT GGGG (SEQ ID NO: 19)
2 0 GCAACTATGGACAGAGATTATGG (SEQ ID NO: 2 0 )
21 CACCATTTTACAAGGCACTGTGG (SEQ ID NO : 21)
2 2 C T T CATC T GGC T CCACATAGAGG (SEQ ID NO: 22)
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 91/315
23 CTCTATGTGGAGCCAGATGAAGG (SEQ ID NO: 23)
2 4 TTCTCGGATGTTCCTTCATCTGG (SEQ ID NO: 24)
2 5 AGATGAAGGAACATCCGAGAAGG (SEQ ID NO: 25)
26 GATGAAGGAACATCCGAGAAGGG (SEQ ID NO: 2 6 )
27 CATCCGAGAAGGGCGTGTATTGG (SEQ ID NO: 27)
28 GTACCAATACACGCCCTTCTCGG (SEQ ID NO: 28)
2 9 AGAAGGGCGTGTATTGGTACAGG (SEQ ID NO: 29)
2 0 TTGGGACAAACACTTCATCACGG (SEQ ID NO: 30)
[COMPOSIÇÃO PARA SISTEMA DE TESOURAS DE PARA MANIPULAÇÃO DE GENE] [0260] O sistema para controlar um ácido graxo insaturado da presente invenção pode incluir um complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia como uma composição para manipular um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados.
COMPLEXO DE PROTEÍNAS EDITORAS E ÁCIDOS NUCLEICOS-GUIA [0261] O termo complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia refere-se a um complexo formado através da interação entre um ácido nucleico-guia e uma proteína editora, e o complexo de ácido nucleico e proteína inclui um ácido nucleico-guia e uma proteína editora.
[0262] O termo ácido nucleico-guia refere-se a um ácido nucleico com capacidade para reconhecer um ácido
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 92/315 nucleico, gene, cromossomo ou proteína alvo.
[0263] O ácido nucleico-guia pode estar presente sob a forma de DNA, RNA ou um híbrido de DNA/RNA e pode ter uma sequência de ácidos nucleicos de 5 a 150 bases.
[0264] O ácido nucleico-guia pode incluir um ou mais domínios.
[0265] Os domínios podem ser, porém sem limitação, um domínio-guia, um primeiro domínio complementar, um domínio ligante, um segundo domínio complementar, um domínio proximal ou um domínio de cauda.
[0266] O ácido nucleico-guia pode incluir dois ou mais domínios que podem ser as mesmas repetições de domínio ou domínios diferentes.
[0267] O ácido nucleico-guia pode ter uma sequência de ácidos nucleicos contínua.
[0268] Por exemplo, a uma sequência de ácidos nucleicos continua pode ser (N)^, em. que N representa A, T, C ou G, ou A, U, C ou G e m é um número inteiro de 1 a 150.
[0269] O ácido nucleico-guia pode ter duas ou mais sequências de ácidos nucleicos contínuas.
[0270] Por exemplo, as duas ou mais sequências de ácidos nucleicos contínuas podem ser (N)m e (N)o, em que N representa A, T, C ou G, ou A, U, C ou G, m e o são um número inteiro de 1 a 150 e m e o podem ser iguais ou diferentes um do outro.
[0271] O termo proteína editora refere-se a um peptídeo, polipeptídeo ou proteína que tem capacidade para se ligar diretamente ou interagir, sem ligação direta, com
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 93/315 um ácido nucleico.
[0272] A proteína editora pode ser uma enzima.
[0273] A proteína editora pode ser uma proteína de
[0274] No presente d< ocumento, a proteína de
fusão refer e - s e a uma proteína que é prodi jzida fundindc )-se
uma enzima com um domínio, peptídeo, p o 1.1 p e p t í d e o O lu
proteína adicional.
[0275] 0 termo enzima refere-se a uma proteína que contém um domínio com capacidade para clivar um ácido nucleico, gene, cromossomo ou proteína.
[0276] O domínio, peptídeo, polipeptídeo ou proteína adicional pode ser um. domínio, peptídeo, polipeptídeo ou proteína funcional que tem. uma função igual ou diferente da enzima.
[0277] A proteína. de fusão pode incluir um.
iomínií □, peptídeo, ρ o .1 i ρ e p t. í d. e o ou proteína. adicional em.
ama ou mais regiões ; da terminação aminoácido (terminação N)
da enzima ou das adjacências da. mesma; da terminação carboxila. (terminação C) ou das adjacências da mesma; da parte intermediária da enzima; e uma combinação das mesmas. [0278] A proteína de fusão pode incluir um domínio, peptídeo, polipeptídeo ou proteína funcional em uma ou mais regiões da terminação N da enzima ou das adjacências da mesma; da terminação C ou das adjacências da mesma; da parte intermediária da enzima; e uma combinação das mesmas.
[0279] O complexo de proteínas editoras e ácidos
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 94/315 nucleicos-guia pode servir para modificar um indivíduo.
[0280] indivíduo pode ser um ácido nucleico, gene, cromossomo ou proteína alvo.
[0281]
Por exemplo, complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia pode resultar na regulaçao final (por exemplo inibição, supressão, redução, aumento ou promoção) da expressão de uma proteína de interesse, remoção da proteína ou expressão de uma nova proteína.
[0282] No presente documento, o complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia pode atuar em um nível de DNA, RNA, gene ou cromossomo.
[0283] 0 complexo de proteínas editoras e ácidos
nu c1e i cos-guia pode atuar na transcrição do gene e nos
estági OS CIO tI3.dUÇ3.O.
η O Q Λ Ί !_ v d. 0 tr j 0 complexo de proteínas editoras e ácidos
nu c1e i cos-guia pode atuar em um nível de proteína. 1. ÁCIDOS NUCLEICOS-GUIA
[0285] 0 ácido nucleico-cfuia é um ácido nucleico
que tem capacidade para reconhecer um ácido nucleico, gene, cromossomo ou proteína alvo, e forma um. complexo de ácido
nuclei co-guia. e proteína.
[0286] No presente documento, o ácido nucleico-
guia í ϊ configurado para reconhecer ou alvejar um ácido
nucleico, gene, cromossomo ou proteína alvejado pelo complexo de ácido nucleico-guia e proteína.
[0287] 0 ácido nucleico-guia pode estar presente
sob a forma de DNA, RNA ou uma mistura de DNA/RNA, e ter
uma se auência de 5 a 150 ácidos nucleicos.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 95/315 [0288] O ácido nucleico-guia pode estar presente em um formato linear ou circular.
[0289] 0 ácido nucleico-guia pode ser uma sequência de ácidos nucleicos contínua.
[0290] Por exemplo, a uma sequência de ácidos nucleicos contínua pode ser (N)m, em que N é A, T, C ou G, ou A, U, C ou G, e m é um número inteiro de 1 a 150.
[0291] O ácido nucleico-guia pode ser duas ou mais sequências de ácidos nucleicos continuas.
[0292] Por exemplo, as duas ou mais sequências de ácidos nucleicos contínuas podem ser (N)m e (N)o, em que N representa A, T, C ou G, ou A, U, C ou G, m e o são um número inteiro de 1 a 150 e podem ser iguais ou diferentes um do outro.
Figure BR112019012779A2_D0003
[0294] No presente documento, os domínios podem, ser, porém sem limitação, um dom.inio-guia, um primeiro domínio com.plem.ent ar, um domínio ligante, um segundo domínio complementar, um domínio proximal ou um domínio de CS.UÓ.3. .
[0295] 0 ácido nucleico-guia pode incluir dois ou mais domínios que podem ser as mesmas repetições de domínio ou domínios diferentes.
[0296] Os domínios serão descritos abaixo.
I) DOMÍNIO-GUIA [0297] 0 termo domínio-guia é um domínio que tem uma sequência-guia complementar que tem capacidade para
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 96/315 formar uma ligação complementar com uma sequência-alvo em um gene ou ácido nucleico alvo e serve para interagir especificamente com o gene ou ácido nucleico alvo.
[0298]
A sequência-guia é uma sequência de ácidos nucleicos complementar à sequência-alvo em um gene ou ácido nucleico alvo que tem, por exemplo, pelo menos 50%, 55%, 6 0%, 6 5%, '7 0%, 75%, 8 0%, 8 5%, 9 0%, 9 5% ou mais de complementaridade ou complementaridade completa.
[0299] O domínio-guia pode ser uma sequência de 5 a 50 bases.
[0300] Em um exemplo, o domínio-guia pode ser uma sequência, de 5 a 50, 10 a 50, 15 a 50, 2 0 a 50, 2 5 a 50, .3 0 a. 50, 3 5 a 50, 4 0 a 5 0 ou 45 a 5 0 bases.
[0301] Em um outro exemplo, o domínio-guia pode ser uma sequência de 1 a 5, 5 a 10, 10 a 15, 15 a 20, 20 a 25, 25 a 30, 30 a 35, 35 a 40, 40 a 45 ou 45 a 50 bases.
[0302] O domínio-guia pode ter uma sequência-guia.
[03 03] A sequência-guia. pode ser uma sequência de bases complementar que tem capacidade para formar uma ligação complementar com a sequência-alvo no gene ou ácido nucleico alvo.
[0304] A sequência-guia pode ser uma sequência de ácidos nucleicos complementar à sequência-alvo no gene ou ácido nucleico alvo que tem, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais de complementaridade ou complementaridade completa.
[0305] A sequência-guia pode ser uma sequência de
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 97/315 [0306] Em ura exemplo, o domínio-guia pode ser uma sequência de 5 a 50, 10 a 50,
50, 20 a 50, 25 a 50, 30 a 50, 35 a 50, 40 a 50 ou 45 a 50 bases [0307] Em um outro exemplo, a sequência-guia pode ser um sequência de 1 a 5, 5 a 10, 10 a 15, 15 a 20, 2 0 a 25, 25 a 30, 30 a 35, 35 a 40, 40 a 45 ou 45 a 50 bases.
[0308] Além disso, o domínio-guia pode incluir a
sequência-guia e uma sequênc ria de bases adicional.
[0309] A sequência de bases adicional pode ser
utilizada para melhorar ou CJU 1.a ♦ degradar a função do domínio-
[0310] A sequência de bases adicional pode ser
utilizada para melhorar ou degradar a : função da sequência-
gu i a.
[0311] A sequência de bases adicional pode ser uma sequência de 1 a 35 bases.
[0312] Em um exemplo, a sequência de bases
adiciona.’) L pode ser uma sequência de 5 a 3 5, 10 a 35, 15 a
3 5, 2 0 a 35, 25 a 35 ou 30 a 35 bases.
[0313] Em um outro exemplo, a S Θ Q u θ R C .1 .a de bases
adicional pode ser uma sequência de 1 a 5, 5 a 10, 10 a 15,
15 a 20, 20 a 25, 25 a 30 ou 30 a 35 bases.
[0314] A sequência de base s adicionai pode estar
localizada r 3 a extremidade 5 CicL sequ ência-guia.
[0315] A sequência de base s adicionai pode estar
localizada r 3 a extremidade 3' CicL sequ ência-guia.
II) PRIMEIRO DOM ÍNIO complementa: R
[0316] O termo primeiro domínio complementar
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 98/315 trata-se de uma sequência de ácidos nucleicos que inclui uma sequência de ácidos nucleicos complementar a um segundo domínio complementar e tem complementaridade suficiente para formar uma fita dupla com o segundo domínio complementar.
[0317] O primeiro domínio complementar pode ser uma sequência de 5 a 35 bases.
[0318] Em um exemplo, o primeiro domínio complementar pode ser uma sequência de 5 a 35, 10 a 35, 15 a 35, 20 a 35, 25 a 35 ou 30 a 35 bases.
[0319] Em um outro exemplo, o primeiro domínio complementar pode ser uma sequência de 1 a 5, 5 a 10, 10 a 15, 15 a 20, 20 a 25, 25 a 30 ou 30 a 35 bases.
III) DOMÍNIO LIGANTE [0320] O termo domínio ligante trata-se de uma sequência de ácidos nucleicos que conecta dois ou mais domínios que são dois ou mais domínios idênticos ou diferentes. O domínio ligante pode ser conectado a dois ou mais domínios por ligação covalente ou ligação não covalente ou pode conectar dois ou mais domínios por ligação covalente ou ligação não covalente.
[0321] O domínio ligante pode ser uma sequência de 1 a 3 u bases.
[0322] Em um exemplo, o domínio ligante pode ser um sequência de 1 a 5, 5 a 10, 10 a 15, 15 a 20, 20 a 25 ou 25 a 30 bases.
[0323] Em um outro exemplo, o domínio ligante pode ser uma sequência de 1 a 30, 5 a 30, 10 a 30, 15 a 30, 20 a
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 99/315 ou 25 a 30 bases
IV) SEGUNDO DOMÍNIO COMPLEMENTAR [0324] O termo segundo domínio complementar trata-se de uma sequência de ácidos nucleicos que inclui uma sequência de ácidos nucleicos complementar ao primeiro domínio complementar e tem complementaridade suficiente para formar uma fita dupla com o primeiro domínio c o mp 1 e m e n t a r .
[0325] O segundo domínio complementar pode ter uma sequência de bases complementar ao primeiro domínio complementar e uma sequência de bases que não tem complementaridade com o primeiro domínio complementar, por
exemplo, uma seqr lencia. Ο.Θ baSeS QUe ndO forma uma f i t a
dupla com. o prime ir o domí nio comp D ementar, e pode ter uma
sequência de : bas es mais longa q ue o p >r imeiro domí n 1 o
comp1ementar.
[0326] 0 segundo domínio cc implemen tar pode ter uma
sequência de 5 a 3 D JO d kO CÍ- u? v
[0327] ΕιϊΓι. um exemplo, o s< egundo domí n i o
comp1ementar pode ser uma S Θ Q u θ R C .1. a de 1 a 3 5, 5 a 35, 1 0 a
35, 15 a 35, 2 0 a 35z 25 a . 35 ou 30 a 35 bases.
[0328] Em um outro exemp 1 o, o segundo domí nio
complementar pode ser uma sequência de 1 a 5 / 5 a 10, 1 0 a
15, 15 a 20, 2 0 a 25, 25 a . 30 ou 30 a 3 5 bci ses .
V) DOMÍNIO PROXIMAL [0329] O termo domínio proximal trata-se de uma sequência de ácidos nucleicos localizada adjacente ao segundo domínio complementar.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 100/315 [0330] O domínio proximal pode ter uma sequência de bases complementar no mesmo e pode ser formado em uma fita dupla devido a uma sequência de bases complementar.
[0331] O domínio proximal pode ser uma sequência de 1 a 20 bases.
[0332] Em um exemplo, o domínio proximal pode ser uma sequência de 1 a 20, 5 a 20, 10 a 20 ou 15 a 20 bases.
[0333] Em um outro exemplo, o domínio proximal pode ser uma sequência de 1 a 5, 5 a 10, 10 a 15 ou 15 a 20 k) s s θ s «
VI) DOMÍNIO DE CAUDA [0334] O termo domínio de cauda trata-se de uma sequência de ácidos nucleicos localizada em uma ou mais extremidades de ambas as extremidades do ácido nucleicoguia.
[0335] O domínio de cauda pode ter uma sequência de bases complementar no mesmo e pode ser formado em uma fita dupla devido a uma sequência de bases complementar.
[0336] O domínio de cauda pode ser uma sequência de 1 a 50 bases.
[033'7] Em um. exemplo, o domínio de cauda pode ser uma sequência de 5 a 50, 10 a 50, 15 a 50, 2 0 a 50, 2 5 a 50, 30 a 50, 35 a 50, 40 a 50 ou 45 a 50 bases.
[0338] Em um outro exemplo, o domínio de cauda pode ser uma sequência de 1 a 5, 5 a 10, 10 a 15, 15 a 20, 20 a 25, 25 a 30, 30 a 35, 35 a 40, 40 a 45 ou 45 a 50 bases.
[0339] Entretanto, uma parte ou a totalidade das
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 101/315 sequências de ácidos nucleicos incluídas nos domínios, isto é, o domínio-guia, o primeiro domínio complementar, o domínio ligante, o segundo domínio complementar, o domínio proximal e o domínio de cauda, pode, seletiva ou adicionalmente, incluir uma modificação química.
[0340] A modificação química pode ser, porém sem limitação, metilação, acetilação, fosforilação, ligação fosforotioato, um ácido nucleico bloqueado (LNA), ' f osf orot ioato de 2 ’ -O-met ila (MS) ou 3'tioPACE de 2'-Ci met ila (MSP) .
[0341] O ácido nucleico-guia inclui um ou mais domínios.
[0342] 0 ácido nucl eico-guia pode incl t 2 i r um.
domí nio-gi. i i a.
[0343] 0 ácido nucl eico-guia pode incli 2 i r um
primeiro c lomínio et muplemen tar.
[0344] 0 a c i d o nucl eico-guia pode incl i 2 i r um.
domínio ligante.
[0345] 0 d u i g o nu u .1 8 bíco-guia pode incli 2 i r um.
segundo [0346] domínio complementar. 0 ácido nuch bíco-guia pode incli 2 i r um.
domínio [0347] proximal. 0 ácido nucleico-guia incl; 2Ír um
domínio de cauda.
[0348]
No presente documento, pode haver 1, 2, 3,
4, 5, 6 ou mais domínios.
[0349]
O ácido nucleico-guia pode incluir 1, 2, 3,
4, 5, 6 ou mais domínios-guia.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 102/315 [0350] O ácido nucleico-guia pode incluir 1, 2, 3,
4, 5, 6 ou mais primeiros domínios complementares.
[0351] O ácido nucleico-guia pode incluir 1, 2, 3,
4, 5, 6 ou mais domínios ligantes.
[0352] O ácido nucleico-guia pode incluir 1, 2, 3,
4, 5, 6 ou mais segundos domínios complementares.
[0353] O ácido nucleico-guia pode incluir 1, 2, 3,
4, 5, 6 ou mais domínios proximais.
[0354] O ácido nucleico-guia pode incluir 1, 2, 3,
4, 5, 6 ou mais domínios de cauda.
[0355] No presente documento, no ácido nucleicoguia, um tipo de domínio pode ser duplicado.
[0356] O ácido nucleico-guia pode incluir diversos domínios com ou sem duplicação.
[035'7] O ácido nucleico-guia pode incluir o mesmo tipo de domínio. No presente documento, o mesmo tipo de domínio pode ter a mesma sequência de ácidos nucleicos ou sequências de ácidos nucleicos diferentes.
[0358] O ácido nucleico-guia pode incluir dois tipos de domínios. No presente documento, os dois tipos diferentes de domínios podem ter sequências de ácidos nucleicos diferentes ou a mesma sequência de ácidos Ω u C161C O >S « [0359] O ácido nucleico-guia pode incluir três tipos de domínios. No presente documento, os três tipos diferentes de domínios podem ter sequências de ácidos nucleicos diferentes ou a mesma sequência de ácidos
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 103/315
63/253 [0360] O ácido nucleico-guia pode incluir quatro
ipos de domínios. No present e documento, os qi latro tip
iferente s de dominie is poden i ter sequências de ácid
ucleicos dif erente.s ou a mesma seauência de ácid
nucleicos.
[0361] O ácido nucleico-guia pode incluir cinco tipos de domínios. No presente documento, os cinco tipos diferentes de domínios podem ter sequências de ácidos nucleicos diferentes ou a mesma sequência de ácidos nucleicos.
[0362] O ácido nucleico-guia pode incluir seis
tipos de domínios. No j; jresente documento, os s e .1 s tipos
diferentes de domínios podem ter sequências de ácidos
nucleicos diferentes o' u a mesma sequência de ácidos
nucleicos.
[0363] Por exemplo, o ácido nucleico-guia pode consistir em [domínio-guia]-[primeiro domínio complementar]-[domínio 1igante]-[segundo domínio complementar]-[domínio ligante]-[domínio-guia]-[primeiro domínio complementar]-[domínio ligante]-[segundo domínio complementar]. No presente documento, os dois domínios-guia podem incluir sequências-guia para alvos diferentes ou iguais, os dois primeiros domínios complementares e os dois segundos domínios complementares podem ter sequências de ácidos nucleicos iguais ou diferentes. Quando os domíniosguia incluem sequências-guia para alvos diferentes, os ácidos nucleicos-guia podem se ligar especificamente a dois alvos diferentes e, no presente documento, as ligações
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 104/315
64/253 específicas podem ser realizadas simultânea ou sequencialmente. Além disso, os domínios ligantes podem ser clivados por enzimas específicas, e os ácidos nucleicosguia podem ser divididos em duas ou três partes na presença de enzimas específicas.
[0364] Como um exemplo específico do ácido nucleico-guia da presente invenção, gRNA será descrito abaixo.
gRNA [0365] O termo gRNA refere-se a um ácido nucleico com capacidade para alvejar especificamente um complexo de gRNA e enzima CRISPR, isto é, um complexo CRISPR, em relação a um gene ou ácido nucleico alvo. Além, disso, o gRNA é um RNA de ácido nucleico especifico que pode ser ligar a uma enzima CRISPR e orientar a enzima CRISPR para o gene ou ácido nucleico alvo.
[0366] O gRNA pode incluir múltiplos domínios.
Devido a cada domínio, interações podem ocorrer em uma estrutura tridimensional ou forma, ativa de uma fita, de gRNA, ou entre essas fitas.
[ 036'7] O gRNA pode ser chamado de gRNA de fita simples (molécula de RNA simples); ou gRNA de fita dupla (incluindo mais de uma, geralmente, duas moléculas de RNA distintas).
[0368] Em uma modalidade exemplificativa, o gRNA de fita simples pode incluir um domínio-guia, isto é, um domínio que inclui uma sequência-guia com capacidade para formar uma ligação complementar com um gene ou ácido
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 105/315 nucleico alvo; um primeiro domínio complementar; um domínio ligante; um segundo domínio complementar, um domínio que tem uma sequência complementar à sequência de primeiro domínio complementar, formando, assim, um ácido nucleico de fita dupla com o primeiro domínio complementar; um domínio proximal; e, opcionalmente, um domínio de cauda na direção 5' para 3'.
[03691 Em uma outra modalidade, o gRNA de fita dupla pode incluir uma primeira fita que inclui um domínioguia, isto é, um domínio que inclui uma sequência-guia com capacidade para formar uma ligação complementar com um gene ou ácido nucleico alvo e um primeiro domínio complementar; e uma segunda fita que inclui um segundo domínio complementar, um domínio que tem uma sequência complementar à sequência de primeiro domínio complementar, formando, assim, um ácido nucleico de fita dupla com o primeiro domínio complementar; um domínio proximal; e, opcionalmente, um domínio de cauda na direção 5' para 3'.
[0370] No presente documento, a primeira fita pode ser denominada crRNA, e a segunda fita pode ser denominada tracrRNA. O crRNA pode incluir um. domínio-guia e um. primeiro domínio complementar, e o tracrRNA pode incluir um segundo domínio complementar, um domínio proximal e, opcionalmente, um domínio de cauda.
[0371] Em ainda uma outra modalidade, o gRNA de fita simples pode incluir um domínio-guia, isto é, um domínio que inclui uma sequência-guia com capacidade para formar uma ligação complementar com um gene ou ácido
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 106/315 nucleico alvo; um primeiro domínio complementar; um segundo domínio complementar e um domínio que tem uma sequência complementar à sequência de primeiro domínio complementar, formando, assim, um ácido nucleico de fita dupla com o primeiro domínio complementar na direção 5' para 3'.
I) DOMÍNIO-GUIA [03721 O domínio-guia inclui uma sequência-guia complementar com capacidade para formar uma ligação complementar com uma sequência-alvo em um gene ou ácido nucleico alvo. A sequência-guia pode ser uma sequência de ácidos nucleicos que tem complementaridade com a sequênciaalvo no gene ou ácido nucleico alvo, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% ou mais de c o mp 1 e m e n t a r i d a d e o u c o mp 1 e m e n t a r i d a d e c o mp 1 e t a . C o n s i d e r a se que o domínio-guia permite um complexo de gRNA e Cas, isto é, um complexo CRISPR para interagir especificamente com o gene ou ácido nucleico alvo.
[0373] O domínio-guia pode ser uma sequência de 5 a 50 bases.
[0374] Como uma modalidade exemplificativa, o domínio-guia pode ser uma sequência de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 bases.
[0375] Como uma modalidade exemplificativa, o domínio-guia pode incluir uma sequência de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 bases.
[0376] No presente documento, o domínio-guia pode incluir uma sequência-guia.
[0377] A sequência-guia pode ser uma sequência de
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 107/315 bases complementar com capacidade para formar uma ligaçao complementar com uma sequência-alvo em um gene ou ácido nucleico alvo.
[0378] A sequência-guia pode ser uma sequência de ácidos nucleicos complementar à sequência-alvo no gene ou ácido nucleico alvo que tem, por exemplo, pelo menos 70%,
75%, 80%, 85%, 90% ou 95% ou mais de complementaridade ou complementaridade completa.
[0379] Em uma modalidade exemplificativa, a sequência-guia pode ser uma sequência de ácidos nucleicos complementar a um gene-alvo, isto é, uma sequência-alvo de um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados, tal como um gene FAD, de preferência, um gene FAD2, um gene FAD3, um gene FAD6, um FAD7 ou um. gene FAD8, que tem, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% ou mais de complementaridade ou complementaridade completa.
[0380] A sequência-guia. pode ser uma sequência de 5 a 50 bases.
[0381] Em uma modalidade exemplificativa, a sequência-guia pode ser uma sequência, de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 bases.
[0382] Em uma modalidade exemplificativa, a sequência-guia pode incluir uma sequência de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 bases.
[0383] Em uma modalidade exemplificativa, a sequência-guia pode ser uma sequência de ácidos nucleicos complementar a uma sequência-alvo do gene FAD2 que é uma
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 108/315
68/253 sequência de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 bases .
[0384] Em uma modalidade exemplificativa, a sequência-guia pode ser uma sequência de ácidos nucleicos complementar a uma sequência-alvo do gene FAD3 que é uma sequência de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25
k) s s θ s « [0385] Em uma modalidade exemplificativa, a sequência-guia pode ser uma sequência de ácidos nucleicos complementar a. uma sequência-alvo do gene FAD6 que é uma sequência, de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25
k) s s θ s « [0386] Em uma modalidade exemplificativa, a sequência-guia pode ser uma sequência de ácidos nucleicos complementar a. uma sequência-alvo do gene FAD7 que é uma sequência de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25
ÕaSêS.
[0387] Em uma modalidade exemplificativa, a sequência-guia pode ser uma sequência de ácidos nucleicos complementar a uma sequência-alvo do gene FAD8 que é uma sequência de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 bases.
[0388] No presente documento, as sequências-alvo dos genes-alvo, isto é, os fatores associados èi biossíntese de ácidos graxos insaturados, tais como o gene FAD2 para a sequência-guia, são listadas acima na Tabela 1, mas a presente invenção não se limita às mesmas.
[0389] No presente documento, o domínio-guia pode
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 109/315 incluir uma sequência-guia e uma sequência de bases adicional.
[0390] A sequência de bases adicional pode ser uma sequência de 1 a 35 bases.
[0391] Em uma modalidade exemplificativa, a sequência de bases adicional pode ser uma sequência de 1, 2, 3, 4, 5, 6, '7, 8, 9 ou 10 bases.
[0392] Por exemplo, a sequência de bases adicional pode ser uma sequência de base simples, guanina (G), ou uma
sequênc: La de duas bases, GG.
[0393] sequência de bases adici ο π a -L pode estar-
localize ada na. ext remidade 5' Q cl sequêr icia-g u j. a *
[0394] A sequência de oases adic.i ο n a .1. pode es tar
localize ada na ext remidade 3' Q cl seciuêr icia-q u j. a *
[0395] Seletivamente, uma parte ou a totalidade da sequência de bases do domínio~guia pode incluir uma modificação química. A modificação química pode ser metilação, acetilação, fosforilação, ligação fosforotioato, um. ácido nucleico bloqueado (LNA) , 2' -0-met il 3' fosforotioato (MS) ou 2'-0-metil 3' tioPACE (MSP), mas a presente invenção não se limita aos mesmos.
II) PRIMEIRO DOMÍNIO COMPLEMENTAR [0396] O primeiro domínio complementar inclui uma sequência de ácidos nucleicos complementar a um segundo domínio complementar e tem complementaridade suficiente de modo que tenha capacidade para formar uma fita dupla com o segundo domínio complementar.
[0397] No presente documento, o primeiro domínio
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 110/315 complementar pode ser uma sequência de 5 a 35 bases. 0 primeiro domínio complementar pode incluir uma sequência de 5 a 35 bases.
[0398] Em uma modalidade exemplificativa, o primeiro domínio complementar pode ser uma sequência de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 bases.
[0399] Em uma outra modalidade, o primeiro domínio complementar pode incluir uma sequência de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 bases.
[0400] O primeiro domínio complementar pode ter homologia com um primeiro domínio complementar natural ou pode ser derivado de um primeiro domínio complementar natural. Além disso, o primeiro domínio complementar pode ter uma diferença na sequência de bases de um primeiro domínio complementar dependendo das espécies existentes na natureza, pode ser derivado de um primeiro domínio complementar contido nas espécies existentes na natureza ou pode ter homologia parcial ou completa com. o primeiro domínio complementar contido nas espécies existentes na natureza.
[0401] Em uma modalidade exemplificativa, o primeiro domínio complementar pode ter homologia parcial, isto é, de pelo menos 50% ou mais, ou completa com um primeiro domínio complementar de Streptococcus pyogenes,
Campy1obact
Streptococcus thermop hilus,
Staphylococcus aureus ou Neisseria meningitid.es, ou urn
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 111/315 primeiro domínio complementar derivado dos mesmos.
[0402]
Por exemplo, quando o primeiro domínio complementar for o primeiro domínio complementar de
Streptococcus pyogenes ou um primeiro domínio complementar derivado do mesmo, o primeiro domínio complementar pode ser 5'-GUUUUAGAGCUA-3'(SEQ ID NO: 42) ou uma sequência de bases que tem homologia parcial, isto é, de pelo menos 50% ou mais, ou completa com 5'-GUUUUAGAGCUA-3'(SEQ ID NO: 42). No
resente document o, o primeiro d o m í. n .i o c o mp 1 e m e n t a r p o d e
ncluir, ainda, (X)n? resultanc io em 5'-GUUUUAGAGCUA(X)n-
'(SEQ ID ! NO: 42) . 0 X pode ser selecionado dentre o grupo
que consiste em bases A, T, U e G, e o n pode representar o número de bases, que é um. número inteiro de 5 a 15. No presente documento, ο (X) n pode ser n repetições da mesma base ou uma mistura de n bases de A, T, U e G.
[0403] Em uma outra modalidade, quando o primeiro domínio complementar é o primeiro domínio complementar de Campylobacter jejuni ou um primeiro domínio complementar derivado do mesmo, o primeiro domínio complementar pode ser 5'-GUUUUAGUCCCUUUUUAAAUUUCUU-3'(SEQ ID NO: 43) ou uma sequência de bases que tem. homologia parcial, isto é, de pelo menos 50% ou mais, ou completa com 5'GUUUUAGUCCCUUUUUAAAUUUCUU-3'(SEQ ID NO: 43). No presente documento, o primeiro domínio complementar pode incluir, ainda, (X)n, resultando em 5'GUUUUAGUCCCUUUUUAAAUUUCUU (X) ri-3 ' ( SEQ ID NO: 43). Ο X pode ser selecionado dentre o grupo que consiste em bases A, T, U e G, e o n pode representar o número de bases, que é um
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 112/315
72/253 número inteiro de 5 a 15. No presente documento, o (X)n pode representar n repetições da mesma base ou uma mistura de n bases de A,
U e G.
Em uma outra modalidade, o primeiro domínio complementar pode ter homologia parcial isto é, de pelo menos 50% ou mais, ou completa com um primeiro domínio c o mp 1 e m e n t a x eri {GWC 2 011__GWC 2__4 4__1
Butyrivibrio proteoclasiicus, Peregrinibacteria bacterium (GW2 011_GWA_33_10) , Acidaminococcus
Porphyromonas ma ca cae, hachnospiraceae bacterium (ND2006),
Porphyromenas crevioricanis, Prevote11a disiens, Moraxella bovoculi (237), Smiihella sp. (SC__KO8D17) , Leptospira inadaif Lachnospiraceae bacterium (MA2020), Francisella noviclda. (U112), Candi datus Methanoplasma termitum ou Eubacterium eligens, ou um primeiro domínio complementar derivado dos mesmos.
[0405] Por exemplo, quando o primeiro domínio complementar for o primeiro domínio complementar de
Parcubacteria. bacterium ou um primeiro domínio complementar derivado do mesmo, o primeiro domínio complementar pode ser b’-UUUGUAGAU-3' ou uma sequé parcial, isto é, de pelo UUUGUAGAU-3'. No presente complementar pode incluir, (X) nUUUGUAGAU-3'. Ο X pode que consiste em bases A, T, número de bases, aue é um ncia de bases que tem homologia menos 50% ou mais, com 5'documento, o primeiro domínio ainda, (X)nc resultando em 5'ser selecionado dentre o grupo U e G, e o n pode representar o número inteiro de 1 a 5. No
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 113/315 presente documento, o (X)n pode representar n repetições da mesma base ou uma mistura de n bases de A, T, U e G.
[0406] Seletivamente, uma parte ou a totalidade da sequência de bases do primeiro domínio complementar pode ter uma modificação química. A modificação química pode ser metilação, acetilação, fosforilação, ligação fosforotioato, um ácido nucleico bloqueado (LNA), 2'-0-metil 3' fosforotioato (MS) ou 2'-0-metil 3' tioPACE (MSP), mas a presente invenção não se limita aos mesmos.
Ill) DOMÍNIO LIGANTE [ 040'7] O domínio ligante é uma sequência de ácidos nucleicos que conecta dois ou mais domínios e conecta dois ou mais domínios idênticos ou diferentes. O domínio ligante pode ser conectado a dois ou mais domínios por ligação covalente ou ligação não covalente ou pode conectar dois ou mais domínios por ligação covalente ou não covalente.
[0408] O domínio ligante pode ser uma sequência de ácidos nucleicos que conecta um primeiro domínio complementar a um segundo domínio complementar para produzir gRNA de fita simples.
[0409] O domínio ligante pode ser conectado ao primeiro domínio complementar e ao segundo domínio complementar por ligação covalente ou não covalente.
[0410] O domínio ligante pode conectar o primeiro domínio complementar ao segundo domínio complementar por ligação covalente ou não covalente [0411] O domínio ligante pode ser uma sequência de a 30 bases. O domínio ligante pode incluir uma sequência
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 114/315 de 1 a 30 bases [0412] Em uma modalidade exemplificativa, o domínio ligante pode ser uma sequência de la 5, 5 a 10, 10 a 15, 15 a 20, 20 a 25 ou 25 a 30 bases.
[0413] Em uma modalidade exemplificativa, o domínio ligante pode incluir uma sequência de 1 a 5, 5 a
10, 10 a 15, a 20, 20 a 25 ou 25 a 30 bases.
[0414] O domínio ligante é adequado para ser usado em uma molécula de gRNA de fita simples e pode ser usado para produzir gRNA de fita simples por ser conectado a uma primeira fita e a uma segunda fita de gRNA de fita dupla ou conectar a primeira fita à segunda fita por ligação covalente ou não covalente. O domínio ligante pode ser usado para produzir gRNA de fita simples por ser conectado a crRNA e a tracrRNA de gRNA de fita dupla ou conectar o crRNA ao tracrRNA por ligação covalente ou não covalente. [0415] O domínio ligante pode ter homologia com.
uma sequência, natural, por exemplo, uma. sequência parcial de tracrRNA, ou pode ser derivado da mesma.
[0416] Seletivamente, uma. parte ou a totalidade da sequência. de bases do domínio ligante pode ter uma modificação química. A modificação química pode ser metilação, acetilação, fosforilação, ligação fosforotioato, um ácido nucleico bloqueado (LNA), í^-O-metil 3' fosforotioato (MS) ou I'-O-metil 3 tioPACE (MSP), mas a presente invenção não se limita aos mesmos.
IV) SEGUNDO DOMÍNIO COMPLEMENTAR [0417] O segundo domínio complementar inclui uma
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 115/315 sequência de ácidos nucleicos complementar ao primeiro
domínio complemen tar e tem complementaridade st if iciente
para formar uma fita dupla com o primeiro domínio
complementar. 0 s egundo domínio complementar pode incluir
uma sequência de bases complementar ao primeiro domínio
c o mp 1 e m e n t a r e ' LliTici. S equência de bases que não tem
complementaridade com o primeiro domínio complementar, por exemplo, uma sequência de bases que não forma uma fita dupla com o primeiro domínio complementar, e pode ter uma sequência de bases mais longa que o primeiro domínio c o mp 1 e m e n t a x [04181 No presente documento, o segundo domínio complementar pode ser uma sequência de 5 a 35 bases. O primeiro domínio complementar pode incluir uma sequência de a 35 bases.
[0419] Em uma modalidade exemplificativa, o segundo domínio complementar pode ser uma sequência de 5, i 1, 8 , 9 , 10, 11, J. 2 , J. 3 , J. 4, J. 5, J. 6 , J. 7, J. 8 , J. 9 , 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 bases.
[0420] Em uma modalidade exemplificativa, o segundo domínio complementar pode incluir uma sequência de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 bases.
[0421] Além disso, o segundo domínio complementar pode ter homologia com um segundo domínio complementar natural ou pode ser derivado do segundo domínio complementar natural. Além disso, o segundo domínio complementar pode ter uma diferença na sequência de bases
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 116/315 de um segundo domínio complementar de acordo com uma espécie existente na natureza e pode ser derivado de um segundo domínio complementar contido nas espécies existentes na natureza, ou pode ter homologia parcial ou completa com o segundo domínio complementar contido nas espécies existentes na natureza.
[04221 Em uma modalidade exemplificativa, o segundo domínio complementar pode ter homologia parcial, isto é, de pelo menos 50% ou mais, ou completa com um segundo domínio complementar de Streptococcus pyogenes,
Campy 1 oba. cter jejuni,
Streptococcus the rm. ophi1us,
Staphylococcus aureus
Neisseria meningitides, ou um segundo domínio complementar derivado dos mesmos.
[0423] Por exemplo, quando o segundo domínio complementar for um segundo domínio complementar de Streptococcus pyogenes ou um segundo domínio complementar derivado do mesmo, o segundo domínio complementar pode ser 5' -UAGCAAGUUAAÃAU-3 ' (SEQ ID NO: 44) ou uma sequência de bases que tem. homologia parcial, isto é, de pelo menos 50%
ou mais, com. 5 ' -UÃGC AÃGUUÃAAAU-3'(SEQ ID NO: 44) (uma
sequência i. de bases que forma i: ima fita dupla com o primeiro
domínio c o mp 1 e m e n t a r e s t cí sublinhada). No presente
documente ), o segundo domínio c o mp 1 e m e n t a r pode incluir,
ainda, (X)n e/ou (XU, resultando em 5'- (X)n
UAGCAAGUt !’AAAAU (X) m- 3 ' (S EQ ID NO: 44). 0 X pode ser
selecionado dentre o grupo que consiste em bases A, T, U e
G, e cada um dentre nem pode representar o número de bases, em que o n pode ser um número inteiro de 1 a 15 em
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 117/315 pode ser um número inteiro de 1 a
No presente documento, o (X)n pode representar n repetições da mesma base ou uma mistura de n bases de A, T, U e G. Além disso, (X)m pode representar m repetições da mesma base ou uma mistura de m bases de A, 1, U e G.
[0424] Em um outro exemplo, quando o segundo domínio complementar for o segundo domínio complementar de Campylobacter jejuni ou um segundo domínio complementar derivado do mesmo, o segundo domínio complementar pode ser 5' -AAGAAAUUUAAAAAGGGACUAAAAU-3 ' (SEQ ID NO: 45) ou uma sequência de bases que tem homologia parcial, isto é, de pelo menos 50% ou mais, com 5'-AAGAAAUUUAAAAAGGGACUAAAAU 3' (SEQ ID NO: 45) (uma sequência de bases que forma uma fita dupla com o primeiro domínio complementar está sublinhada). No presente documento, o segundo domínio complementar pode incluir, ainda, (X)n e/ou (X)^, resultando em. 5 (X) nAAGAAAUUUAAAAAGGGACUAAAAU (X) m-3 ’ ( SEQ ID NO: 45).
Ο X. pode ser selecionado dentre o grupo que consiste em.
Jo d L\. f T, U e - e cada. um dentre n e m pode representar
o número as bas es, em que o n pode ser um número inteiro de
1 a 15 e m pode ser um. núm .ero inter .ro de 1 a 6 . : No presente
dO cumenti O, (X)n po< ie repre sent ar n repetições da mesma base
OU ΠΓΓιά. ΓΠ. istura de n bases Q6 A, T, U e G. Além disso, (X)m
pode representar m repetições da mesma base ou uma mistura de m bases de A, T, U e G.
[0425] Em uma outra modalidade, o primeiro domínio complementar pode ter homologia parcial, isto é, de pelo menos 50% ou mais, ou completa com um primeiro domínio
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 118/315 como1emen t ar bacterium (GWC2 011__GWC2__44__17) , Lachnospiraceae bacterium (MC2017), Butyrivibrio proteoclasiicus, Peregrinibacteria bacterium (GW2 011_GWA_.33_.10) , Acidaminococcus sp. (BV3L6), Porphyromenas macacae, Lachnospiraceae bacterium (ND2006), Porphyromonas crevioricanis, Prevotella disiens, Moraxella bovoculi (237), Smiihella sp. (SC_KO8D17) , Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium (MA2020), Francisella novicida. (U112), Candi datus Methanoplasma termitum ou Eubacterium eligens, ou um primeiro domínio complementar derivado dos mesmos.
[04261 Por exemplo, quando o segundo domínio complementar for um segundo domínio complementar de Parcubacteria. bacterium ou um segundo domínio complementar derivado do mesmo o segundo domínio complementar pode ser
5'-AAAUUUCUACU(SEQ ID NO: 46)-3 ! ou uma sequ ência de bases
que tem homologia. parcia 1., isto é, de pelo menos 5 0% ou
mais, com 5'-AAAUUUCUACU- 3 ’ (SEQ ID NO: 46) (uma sequência
de bases que forma uma f 1 U >3. d Up la com o pr i m e i r o do m í n i o
complementar está sublin nada). No pres ;ente documento, o
segundo domínio complementar pode incluir, ainda, (X)n e/ou (X)m, resultando em 5 1 - (X) nAAAUUUCUACU (X) m-3 ' ( SEQ ID NO:
46) . 0 X pode ser selecionas ίο dentre o grupo que con: siste
em bases A, T, U e G, e cada um dentre n e m pode
representar o número de bas >es, em que o n pode se r um
número inteiro de 1 a 10 e m pode ser um número inteiro de ao. No presente documento, o (X)n pode representar n repetições da mesma base ou uma mistura de n bases de A, T,
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 119/315
U e G. Além disso, o (X)rn pode representar m repetições da mesma base ou uma mistura de m bases de A, T, U e G.
[0427] Seletivamente, uma parte ou a totalidade da sequência de bases do segundo domínio complementar pode ter uma modificação química. A modificação química pode ser metilação, acetilação, fosforilação, ligação fosforotioato, um ácido nucleico bloqueado (LNA), 3f-fosforotioato de 2' 0-metila (MS) ou 3'tioPACE de 2’-O-metila (MSP), mas a presente invenção não se limita aos mesmos.
V) DOMÍNIO PROXIMAL [0428] O domínio proximal é uma sequência de 1 a 20 bases localizada adjacente ao segundo domínio complementar, e um domínio localizado na direção da extremidade 3' do segundo domínio complementar. No presente documento, o domínio proximal pode ser usado para formar uma fita dupla entre sequências de bases complementares no mesmo.
[0429] Em uma modalidade exemplificativa, o domínio proximal pode ser uma sequência de 5, 6, 7, 8, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 bases.
[0430] Em uma outra modalidade, o domínio proximal pode incluir uma sequência de 5, 6, 7, 8, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 bases.
[0431] Além disso, o domínio proximal pode ter homologia com um domínio proximal natural ou pode ser derivado do domínio proximal natural. Além disso, o domínio proximal pode ter uma diferença na sequência de bases de acordo com uma espécie existente na natureza, pode ser
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 120/315 derivado de um domínio proximal contido nas espécies existentes na natureza ou podem ter homologia parcial ou completa com o domínio proximal contido nas espécies existentes na natureza.
[0432] Em uma modalidade exemplificativa, o domínio proximal pode ter homologia parcial, isto é, de pelo menos 50% ou mais, ou completa com um domínio proximal de Streptococcus pyogenes, Campylobacter je juni, S t rep t o c o c c u s t h e rm oph i 1 u s, S t aphyl o c o c c u s a. u re u s o u Neisseria, meningitides, ou um domínio proximal derivado dos mesmos .
[0433] Por exemplo, quando o domínio proximal for um. domínio proximal de Streptococcus pyogenes ou um domínio proximal derivado do mesmo, o domínio proximal pode ser 5fAAGGCUAGUCCG-3 ' (SEQ ID NO: 47) ou uma sequência de bases que tern homologia. parcial, isto é, de pelo menos 50% ou mais, com 5-AAGGCUAGUCCG-3 (SEQ ID NO: 47) . No presente documento, o domínio proximal pode incluir, ainda, (X) n, resultando em. 5 '-AAGGCUAGUCCG (X) n-3 ' (SEQ ID NO: 47) . Ο X pode ser selecionado dentre o grupo que consiste em bases A, T, U e G, e o n pode representar o número de bases, que é um número inteiro de 1 a 15. No presente documento, o (X)n pode representar n repetições da mesma base ou uma mistura de n bases de A, T, U e G.
[0434] Em ainda um outro exemplo, quando o domínio proximal for um domínio proximal de Campylobacter jejuni ou um domínio proximal derivado do mesmo, o domínio proximal pode ser 5’-AAAGAGUUUGC-3’(SEQ ID NO: 48) ou uma sequência
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 121/315 de bases que tem pelo menos 50% ou mais de homologia com 5'-AAAGAGUUUGC--3 ’ (SEQ ID NO: 48). No presente documento, o domínio proximal pode incluir, ainda, (X)R, resultando em 5'-AAAGAGUUUGC (X) n-3' (SEQ ID NO: 48). Ο X pode ser selecionado dentre o grupo que consiste em bases A, T, U e G, e o n pode representar o número de bases, que é um número inteiro de 1 a 40. No presente documento, o (X)R pode representar n repetições da mesma base ou uma mistura de n bases de A, T, U e G.
[04351 Seletivamente, uma parte ou a totalidade da sequência de bases do domínio proximal pode ter uma modificação química. A modificação química pode ser metilação, acetilação, fosforilação, ligação fosforotioato, um ácido nucleico bloqueado (LNA), 3f-fosforotioato de 2'O-metila (MS) ou 3'tioPACE de 2’-O-metila (MSP), mas a presente invenção não se limita aos mesmos.
VI) DOMÍNIO DE CAUDA [04361 O domínio de cauda é um domínio que tem. capacidade para, ser seletivamente adicionado à extremidade 3’ de gRNA. de fita simples ou gRNA de fita dupla. O domínio de cauda pode ser uma sequência, de 1 a 5 0 bases ou incluir uma sequência de 1 a 50 bases. No presente documento, o domínio de cauda pode ser usado para formar uma fita dupla entre sequências de bases complementares no mesmo.
[04371 Em uma modalidade exemplificaiiva, o domínio de cauda pode ser uma sequência de 1 a 5, 5 a 10, a 15, 15 a 20, 20 a 25, 25 a 30, 30 a 35, 35 a 40, 40 a ou 45 a 50 bases.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 122/315
82/253 [0438] Em uma modalidade exemplificativa, o domínio de cauda pode incluir uma sequência de 1 a 5, 5 a 10, 10 a 15, 15 a 20, 20 a 25, 25 a 30, 30 a 35, 35 a 40, 40 a 45 ou 45 a 50 bases.
[0439] Além disso, o domínio de cauda pode ter homologia com um domínio de cauda natural ou pode ser derivado do domínio de cauda natural. Além disso, o domínio de cauda pode ter uma diferença na sequência de bases de acordo com uma espécie existente na natureza, pode ser derivado de um domínio de cauda contido em uma espécie existente na natureza ou pode ter homologia parcial ou completa com um domínio de cauda contido em uma espécie existente na natureza.
[0440] Em uma modalidade exemplificativa, o domínio de cauda pode ter homologia parcial, isto é, de pelo menos 50% ou mais, ou completa com um domínio de cauda de Streptococcus pyogenes, Campylobacter jejuni, Streptococcus thermophilus, Staphylococcus aureus ou Neisseria, meningitides, ou um domínio de cauda derivado dos mesmos .
[0441] Por exemplo, quando o domínio de cauda for um domínio de cauda de Streptococcus pyogenes ou um domínio de cauda derivado do mesmo, o domínio de cauda pode ser 5'UUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3'(SEQ ID NO: 49) ou uma sequência de bases que tem homologia parcial, isto é, de pelo menos 50% ou mais, com 5'UUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3’ (SEQ ID NO: 49). No presente documento, o domínio de cauda pode incluir, ainda,
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 123/315 (X)
UUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(X)n-3 ' (SEQ ID NO: 49). 0
X pode ser selecionado dentre o grupo que consiste em bases
A, T, U e G, e o n pode representar o número de bases, que é um número inteiro de 1 a 15. No presente documento, o (X)n pode representar n repetições da mesma base ou uma mistura de n bases, tais como A, T, U e G.
[04421 Em um outro exemplo, quando o domínio de cauda for um domínio de cauda de Campylobacter jejuni ou um domínio de cauda derivado do mesmo, o domínio de cauda pode ser 5'-GGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU-3'(SEQ ID NO:
50) ou uma sequência de bases que tem homologia parcial, isto é, de pelo menos 50% ou mais, com 5fGGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU-3'(SEQ ID NO: 50). No presente documento, o domínio de cauda pode incluir, ainda, (X)n, resultando em 5fGGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU (X) ri-3 ' ( SEQ ID NO: 50) . Ο X pode ser selecionado dentre o grupo que consiste em. bases A, T, U e G, e o n pode representar o número de bases, que é um. número inteiro de 1 a 15. No presente documento, o (X)n pode representar n repetições da mesma base ou uma mistura de n bases de A, T, U e G.
[0443] Em uma outra modalidade, o domínio de cauda pode incluir uma sequência de 1 a 10 bases na extremidade 3’ envolvida em um método de transcrição in vitro ou in vi vo.
[0444] Por exemplo, quando um promotor T7 for usado na transcrição in vitro de gRNA, o domínio de cauda
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 124/315
84/253 pode ser uma sequência de bases arbitrária presente na extremidade 3' de um modelo de DNA. Além disso, quando um promotor U6 for usado na transcrição in vivo, o domínio de cauda pode ser UUUUUU, quando um promotor Hl for usado na transcrição, o domínio de cauda pode ser UUUU, e quando um promotor pol-III for usado, o domínio de cauda pode incluir diversas bases uracila ou bases alternativas.
Figure BR112019012779A2_D0004
um ácido nucleico bloqueado (LNA), 3f-fosforotioato de 2'O-metila (MS) ou 3'tioPACE de 2'-0-metila (MSP), mas a presente invenção não se limita aos mesmos.
[04461 O gRNA pode incluir uma pluralidade de domínios conforme descrito acima e, portanto, o comprimento da sequência de ácidos nucleicos pode ser regulado de acordo com um domínio contido no gRNA, e podem ocorrer interações nas fitas em uma estrutura tridimensional ou forma ativa de gRNA ou entre essas fitas devido a cada domínio.
[0447] O gRNA pode ser denominado gRNA de fita simples (molécula de RNA simples); ou gRNA de fita dupla (incluindo mais de uma, geralmente, duas moléculas de RNA distintas).
GRNA DE FITA dupla [0448] O gRNA de fita dupla consiste em uma primeira fita e uma segunda fita.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 125/315
85/253 [0449] No presente documento, a primeira fita pode consistir em
5'-[domínio-guia]-[primeiro domínio complementar]-3’ e a segunda fita pode consistir em
5'-[segundo domínio complementar]-[domínio proximal]-3' ou ' - [segundo domínio complementar]-[domínio proximal]-[domínio de cauda]-3'.
[0450] No presente documento, uma primeira fita pode ser denominada crRNA e uma segunda fita pode ser denominada tracrRNA.
PRIMEIRA FTTA
DOM í NIO-GUIA [0451] Na primeira fita, o domínio-guia inclui uma sequência-guia complementar que tem capacidade para formar uma ligação complementar com. uma sequência-alvo em. um gene ou ácido nucleico alvo. A sequência-guia é uma sequência de ácidos nucleicos complementar à sequência-alvo no gene ou ácido nucleico alvo que tem, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% ou mais de complementaridade ou complementaridade completa. Considera-se que o domínio-guia permite um complexo de gRNA e Cas, isto é, um complexo CRISPR para interagir especificamente com o gene ou ácido nucleico alvo.
[0452] No presente documento, o domínio-guia pode ser uma sequência de 5 a 50 bases ou incluir uma sequência de 5 a 50 bases. Por exemplo, o domínio-guia pode ser ou
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 126/315 incluir uma sequência de 16,
17, 18, 19, 20, 21, ou 25 bases
Além disso, o domínio-guia pode incluir uma sequência-guia.
[0454] No presente documento, a sequência-guia pode ser uma sequência de bases complementar que tem capacidade para formar uma ligação complementar com uma sequência-alvo em um gene ou ácido nucleico alvo que tem, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% ou mais de complementaridade ou complementaridade completa.
[0455 sequência-guia pode ser uma sequência de ácidos nucleicos complementar a um gene-alvo, isto é, uma sequência-alvo de um. fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados, tal como um gene FAD, de preferência, um gene FAD2, um. gene FAD3, um gene FAD6, um. gene FAD7 ou um gene FAD8, que tem., por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% ou mais de complementar idade ou complementaridade completa.
[0456] No presente documento, a sequência-guia pode ser uma sequência de 5 a 5 0 bases ou incluir uma sequência de 5 a 50 bases. Por exemplo, a sequência-guia pode ser ou incluir uma sequência de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 bases.
[0457] Em uma modalidade exemplificative, a sequência-guia é uma sequência de ácidos nucleicos complementar a uma sequência-alvo do gene FAD2. A sequência-guia pode ser ou incluir uma sequência de 5 a 50
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 127/315 bases. Por exemplo, sequência-guia pode ser ou incluir uma sequência de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 bases .
[0458] Em uma modalidade exemplificativa, a sequência-guia é uma sequência de ácidos nucleicos complementar a uma sequência-alvo do gene FAD3. A sequência-guia pode ser ou incluir uma sequência de 5 a 50 bases. Por exemplo, a sequência-guia pode ser ou incluir uma sequência de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 k) s s θ s * [0459] Em uma modalidade exemplificativa, a sequência-guia é uma sequência de ácidos nucleicos complementar a uma sequência-alvo do gene FAD6. A sequência-guia pode ser ou incluir uma sequência de 5 a 50 bases. Por exemplo, a sequência-guia pode ser ou incluir uma sequência de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 xô d kO Q *5 · [0460] Em uma modalidade exemplificativa, a sequência-guia é uma sequência de ácidos nucleicos complementar a uma sequência-alvo do gene FAD7. A sequência-guia pode ser ou incluir uma sequência de 5 a 50 bases. Por exemplo, a sequência-guia pode ser ou incluir uma sequência de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 bases.
[0461] Em uma modalidade exemplificativa, a sequência-guia é uma sequência de ácidos nucleicos complementar a uma sequência-alvo do gene FAD8. A sequência-guia pode ser ou incluir uma sequência de 5 a 50
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 128/315
88/253 bases. Por exemplo, a sequência-guia pode ser ou incluir uma sequência de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 bases .
[0462] No presente documento, para a sequênciaguia, sequências-alvo de um gene-alvo, isto é, fatores associados à biossintese de ácidos graxos insaturados, tal como um gene FAD2, são listadas acima na Tabela 1, mas a presente invenção não se limita às mesmas.
[0463] Seletivamente, o domínio-guia pode incluir uma sequência-guia e uma sequência de bases adicional.
[0464] No presente documento, a sequência de bases adicional pode ser uma sequência de 1 a 35 bases. Por
exemplo, a. sequên cia de bases adicional pode ser uma
sequência de 1., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 bases.
[0465] Em um a mo d a1i d ade e z emp1ifica t .iva, a
sequência de bases adicional pode incluir uma. base, guanina
(G) , OU dl. ias oases, GG.
[0466] No presente documento, a sequência de bases
adicional pode es star localizada na extremidade 5' do
domí nio-gi. ,iia ou na extremidade 5f da sequência-guia o
[0467] A sequência de bases adicional, pode estar localizada na extremidade 3' do dominio-guia ou na extremidade 3' da sequência-guia.
PRIMEIRO DOMÍNIO COMPLEMENTAR
[0468] 0 pr imeiro domínio compl emen tar in clui uma
sequencia cie ácidos nucleicos compleme: ntar a um seg· undo
domínio complementar da segunda fita e é um c iomí nio que tem
complementaridade su ficiente para formar uma fit a d .up 1 a com
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 129/315
89/253 o segundo domínio complementar.
[04691
No presente documento, o primeiro domínio complementar pode ser ou incluir uma .sequência de bases. Por exemplo, o primeiro domínio complementar pode ser ou incluir uma sequência de 5, 6, 7, 8,
9, 10, 11, 12,
3, 14, 15, 16,
17, 18, 19, 20, 21
22, 23, 24 ou 25 bases.
[0470] O primeiro domínio complementar pode ter homologia com um primeiro domínio complementar natural ou pode ser derivado de um primeiro domínio complementar natural. Além disso, o primeiro domínio complementar por ter uma diferença na sequência de bases de acordo com uma espécie existente na natureza, pode ser derivado do primeiro domínio complementar contido nas espécies existentes na natureza ou pode ter homologia parcial ou completa com o primeiro domínio complementar contido nas espécies existentes na natureza.
[0471] Em uma modalidade exemplificativa, o primeiro domínio com.plem.ent ar pode ter homologia parcial, isto é, de pelo menos 50-% ou mais, ou completa com um.
primeiro domínio com.plem.ent ar de Streptococcus pyogenes,
Campy1obacter
Streptococcus thermophi1us,
Staphylococcus ou Neisseria meningitides, ou um primeiro domínio complementar derivado dos mesmos.
[0472] Seletivamente, o primeiro domínio complementar pode incluir uma sequência de bases adicional que não sofre ligação complementar com o segundo domínio complementar da segunda fita.
[0473] No presente documento, a sequência de bases
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 130/315 adicional pode ser uma sequência de 1 a 15 bases. Por exemplo, a sequência de bases adicional pode ser uma sequência de 1 a 5, 5 a 10 ou 10 a 15 bases.
[0474] Seletivamente, uma parte ou a totalidade da sequência de bases do domínio-guia e/ou primeiro domínio complementar pode ter uma modificação química. A modificação química pode ser metilação, acetilação, fosforilação, ligação fosforotioato, um ácido nucleico bloqueado (LNA), 2'-0-metil 3' fosforotioato (MS) ou 2'-Ometil 3' tioPACE (MSP), mas a presente invenção não se limita aos mesmos.
[0475] Portanto, a primeira fita pode consistir em 5f —[domínio-guia]-[primeiro domínio complementar]-3' conforme descrito acima.
[0476] Além disso, a primeira fita pode, opcionalmente, incluir uma sequência de bases adicional.
[0477] Em um exemplo, a primeira fita pode ser ' “ (Naivo) “ (Q) m“3 ' ; ou ' ~ ( X ) a“ (ITalvo ) — ( X ) b” ( Q ) rn“ ( X ) c”2 ' · [0 478] No presente documento, o N3]vo é uma sequência de bases com capacidade para formar uma ligação complementar com uma sequência-alvo em um gene ou ácido nucleico alvo e uma região de sequência de bases que pode ser alterada de acordo com uma sequência-alvo em um gene ou ácido nucleico alvo.
[0479] Em uma modalidade exemplif icat iva, Nalvo pode ser uma sequência de bases com capacidade para formar uma ligação complementar com um gene-alvo, isto é, uma
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 131/315 sequência-alvo de ura fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados, tal como ura gene FAD, de preferência, ura gene FAD2, um gene FAD3, um gene FAD6, ura gene FAD7 ou um gene FAD8.
[0480] No presente documento, o (Q)m é uma sequência de bases que inclui o primeiro domínio complementar que tem capacidade para formar uma ligação complementar com o segundo dominio complementar da segunda fita. O (Q)m pode ser uma sequência que tem homologia parcial ou completa com o primeiro domínio complementar de uma espécie existente na natureza, e a sequência de bases do primeiro dominio complementar pode ser alterada de acordo com a espécie de origem. O Q pode ser, cada um, independentemente selecionado dentre o grupo que consiste em A, U, C e G, e o m pode ser o número de bases, que é ura número inteiro de 5 a 35.
[0481] Por exemplo, quando o primeiro domínio complementar tiver homologia parcial ou completa com um primeiro domínio complementar de Streptococcus pyogenes ou um. primeiro domínio complementar derivado de Streptococcus pyogenes, o (Q)m pode ser 5 '-GUUUUAGAGCUA--3 ' (SEQ ID NO: 42) ou uma sequência de bases que tem pelo menos 50% ou mais de homologia com 5'-GUUUUAGAGCUA-3'(SEQ ID NO: 42).
[0482] Em um outro exemplo, quando o primeiro domínio complementar tiver homologia parcial ou completa com um primeiro domínio complementar de Campy1obacter jejuni ou um primeiro domínio complementar derivado de
Campylobacter jejuni, o (Q)m pode ser 5'Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 132/315
GUUUUAGUCCCUUUUUAAAUUUCUU-3’(SEQ ID NO: 43) ou uma sequência de bases que tem pelo menos 50% ou mais de homologia com 5’-GUUUUAGUCCCUUUUUAAAUUUCUU-3'(SEQ ID NO: 43) .
[0483] Em ainda um outro exemplo, quando ο primeiro domínio complementar tiver homologia parcial ou completa com um primeiro domínio complementar de
S t rep t o c o c c u s thermophí1us primeiro domínio complementar derivado de Streptococcus thermophilus, o (Q)m pode ser 5'-GUUUUAGAGCUGUGUUGUUUCG-3’(SEQ ID NO: 51) ou uma sequência de bases que tem pelo menos 50% ou mais de homologia com 5’-GUUUUAGAGCUGUGUUGUUUCG-3'(SEQ ID NO: 51).
Além disso, cada um dentre (X)a, (X)b θ (X) é seletivamente uma sequência de bases adicional, em que o X pode ser, cada um, independentemente selecionado dentre o grupo que consiste em. A, U, C e G, e cada um dentre a, b e c pode ser o número de bases, que é 0 ou um número inteiro de 1 a 20.
SEGUNDA FITA [0485] A segunda fita pode consistir em um segundo domínio complementar e um domínio proximal. e inclui, seletivamente, um domínio de cauda.
SEGUNDO DOMÍNIO COMPLEMENTAR [0486] Na segunda fita, o segundo domínio complementar inclui uma sequência de ácidos nucleicos complementar ao primeiro domínio complementar da primeira fita e tem complementaridade suficiente para formar uma fita dupla com o primeiro domínio complementar. O segundo
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 133/315 domínio complementar pode incluir uma .sequência complementar ao primeiro domínio complementar e uma sequência de bases não complementar ao primeiro domínio complementar, por exemplo, uma sequência de bases que não forma uma fita dupla com o primeiro domínio complementar, e pode ter uma sequência de bases mais longa que o primeiro d o m í n .i o c o mp 1 e m e n t a r .
[0487] No presente documento, o segundo domínio complementar pode ser uma sequência de 5 a 3 5 bases ou incluir uma sequência de 5 a 35 bases. Por exemplo, o segundo domínio complementar pode ser ou incluir uma
sequência de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,
18, 19, 20, 21, 22, 23, 2 4 ou 2 5 > bd s θ s j m a. s a presente
.1 n v e n ç ao n a o se limita às mesmas.
[0488] 0 segunao ciomin.ro c o mp1eme n t a: r pode ter
homologia coi π um segundo domínio c o mp1eme n t a r natural ou
pode ser derivado de um segundo domín io complementar
na tu r a 1. Além disso, o segundo domínio cs implementar pode
ter uma d 1. Γ θ Γ θ Π Ç d Hd sequência de bases do mesmo de acordo
com uma espécie existente na natureza, pode ser derivado de um. segundo domínio complementar contido nas espécies existentes na natureza ou pode ter homologia parcial ou completa com o segundo domínio complementar contido nas espécies existentes na natureza.
[0489] Em uma modalidade exemplificativa, o segundo domínio complementar pode ter homologia parcial, isto é, de pelo menos 50% ou mais, ou completa com um segundo domínio complementar de Streptococcus pyogenes,
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 134/315
94/253
Campylobacter jejuni, Streptococcus thermophilus, Staphylococcus aureus ou Neisseria meningitides, ou um segundo domínio complementar derivado dos mesmos.
[0490] Seletivamente, o segundo domínio complementar pode incluir, ainda, uma sequência de bases adicional que não sofre ligação complementar com o primeiro domínio complementar da primeira fita.
[0491] No presente documento, a sequência de bases adicional pode ser uma sequência de 1 a 25 bases. Por exemplo, a sequência de bases adicional pode ser uma sequência de 1 a 5, 5 a 10, 10 a 15, 15 a 2 0 ou 2 0 a 2 5 bases.
DOMÍNIO PROXIMAL [0492] Na segunda fita, o domínio proximal é uma sequência de 1 a 20 bases e um domínio localizado na direção da extremidade 3' do segundo domínio complementar. Por exemplo, o domínio proximal pode ser ou incluir uma sequência de 5, 6, 7, 8, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 Jo G G C tS · [0493] No presente documento, o domínio proximal pode ter uma ligação em fita dupla entre sequências de bases complementares no mesmo.
[0494] Além disso, o domínio proximal pode ter homologia com um domínio proximal natural ou pode ser derivado de um domínio proximal natural. Além disso, o domínio proximal pode ter uma diferença na sequência de bases de acordo com uma espécie existente na natureza, pode ser derivado de um domínio proximal de uma espécie
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 135/315 existente na natureza ou pode ter homologia parcial ou completa com o domínio proximal de uma espécie existente na natureza.
[0495] Em uma modalidade exemplificativa, o domínio proximal pode ter homologia parcial, isto é, de pelo menos 50% ou mais, ou completa com um domínio proximal de Streptococcus pyogenes, Campylobacter je juni, S t rep t o c o c c u s t h e rm oph 1 1 u s, S t aphyl o c o c c u s a. u re u s o u Neisseria, rneningitides, ou um domínio proximal derivado dos mesmos .
DOMÍNIO DE CAUDA [0496] Seletivamente, na segunda fita, o domínio de cauda pode ser um. domínio seletivamente adicionado à extremidade 3' da segunda fita, e o domínio de cauda pode ser ou incluir uma sequência de 1 a 50 bases. Por exemplo, o domínio de cauda pode ser ou incluir uma sequência de 1 a 5, 5 a. 10, 10 a 15, 15 a 20, 20 a 25, 25 a 30, 30 a. 35, 35 a 40, 40 a 45 ou 45 a 50 bases.
[0497] No presente do< sumento, o domínio de cauda
pode ter uma ligação em fita bases complementares no mesmo. [0498] Além disso, o dupla entre sequí domínio de cauda èncias de pode ter
homologia com um domínio de cauda natural ou pode ser
derivado de uí τι domínio de ca uda natural. Além disso, o
domínio de cauda pode ter uma diferença na sequência de bases de acordo com uma espécie existente na natureza, pode ser derivado de um domínio de cauda contido nas espécies existentes na natureza ou pode ter homologia parcial ou
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 136/315 completa com o domínio de cauda contido nas espécies existentes na natureza.
[0499] Em uma modalidade exemplificativa, o domínio de cauda pode ter homologia parcial, isto é, de pelo menos 50% ou mais, ou completa com um domínio de cauda de Streptococcus pyogenes, Campylobacter jejuni, S t rep t o c o c c u s t h e rm oph i 1 u s, S t aphyl o c o c c u s a. u re u s o u Neisseria, meningitid.es, ou urn domínio de cauda derivado dos mesmos .
[0500] Em uma outra modalidade, o domínio de cauda pode incluir uma sequência de 1 a 10 bases na extremidade 3' envolvida em um método de transcrição in vitro ou in vi vo.
[0501] Por exemplo, quando um. promotor T7 for usado na transcrição in vitro de gRNA, o domínio de cauda pode ser uma sequência de bases arbitrária presente na extremidade 3' de um modelo de DNA. Além disso, quando um. promotor U6 for usado na transcrição in vivo, o domínio de cauda pode ser UUUUUU, quando um promotor Hl for usado na transcrição, o domínio de cauda pode ser UUUU e quando um. promotor pol-III for usado, o domínio de cauda pode incluir diversas bases uracila ou bases alternativas.
[0502] Seletivamente, uma parte ou a totalidade de cada uma dentre a sequência de bases do segundo domínio complementar, do domínio proximal e/ou do domínio de cauda pode ter uma modificação química. A modificação química pode ser metilação, acetilação, fosforilação, ligação fosforotioato, um ácido nucleico bloqueado (LNA), 3’~
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 137/315 fosforotioato de 2'-O-metila (MS) ou 3'tioPACE de 2'~0metila (MSP), mas a presente invenção não se limita aos mesmos.
[0503] Portanto, a segunda fita pode consistir em 5 ' - [ segundo domínio complementar]-[domínio proximal]-3' ou 5'-[segundo domínio complementar]~[domínio proximal][domínio de cauda]-3', conforme descrito acima.
[0504] Além disso, a segunda fita pode incluir seletivamente uma sequência de bases adicional.
[0505] Em uma modalidade exemplificativa, a segunda f i t a pode ser 5'-(Z)h~(P)k-3'; ou 5'- (X)d-(Z)fe-(X)e(P)k-(X)f-3'.
[0506] Em uma outra modalidade, a segunda fita pode ser 5'-(Z)h-(P)k-(F)±-3'; ou 5'-(X)d-(Z)h-(X)e-(P)k(X)f-(F)i-3'.
[050 7] No presente documento, o (Z)h é uma sequência de bases que inclui um segundo domínio complementar que tem capacidade para formar uma ligação complementar com o primeiro domínio complementar da primeira fita. O (Z)h pode ser uma sequência que tem. homologia. parcial ou completa. com o segundo domínio complementar de uma espécie existente na natureza, e a sequência de bases do segundo domínio complementar pode ser modificada de acordo com a espécie de origem. O Z pode ser, cada um, independentemente selecionado dentre o grupo que consiste em A, U, C e G, e o h pode ser o número de bases, que é um número inteiro de 5 a 50.
[0508] Por exemplo, quando o segundo domínio
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98/253 complementar tiver homologia parcial ou completa com um segundo domínio complementar de Streptococcus pyogenes ou um segundo domínio complementar derivado do mesmo, o (Z)h pode ser 51“UAGCAAGUUAAAAU~3'(SEQ ID NO: 44) ou uma sequência de bases que tem pelo menos 50% ou mais de homologia com 5'~UAGCAAGUUAAAAU~3'(SEQ ID NO: 44).
[05091 Em um outro exemplo, quando o segundo domínio complementar tiver homologia parcial ou completa com um segundo domínio complementar de Campylobacter jejuni ou um segundo domínio complementar derivado do mesmo, o (Z)h pode ser 5'-AAGAAAUUUAAAAAGGGACUAAAAU-3'(SEQ ID NO: 45) ou uma sequência de bases que tem pelo menos 50% ou mais de homologia com 5’-AAGA.AAUUUAAA.AAGGGACUAAAA.U-3' (SEQ ID NO: 45).
[0510] Em ainda um outro exemplo, quando o segundo domínio complementar tiver homologia parcial ou completa com um segundo domínio complementar de Streptococcus thermophilus ou um. segundo domínio complementar derivado do mesmo, o (Z)h pode ser 5 '-CGAAACAACACAGCGAGUUAAAAU-3 ' (SEQ ID NO: 52) ou uma. sequência de bases que tem pelo menos 50% ou mais de homologia com 5 '-CGAAACAACACAGCGAGUUAAAAU-3 ' (SEQ ID NO: 52).
[0511] O (P)k θ uma sequência de bases que inclui um domínio proximal que pode ter homologia parcial ou completa com um domínio proximal de uma espécie existente na natureza, e a sequência de bases do domínio proximal pode ser modificada de acordo com a espécie de origem. O P pode ser, cada um, independentemente selecionado dentre o
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 139/315 grupo que consiste em A, U, C e G, e o k pode ser o número de bases, que é um número inteiro de 1 a 20.
[0512] Por exemplo, quando o domínio proximal tiver homologia parcial ou completa com um domínio proximal Streptococcus pyogenes ou um domínio proximal derivado mesmo, o (P)k pode ser 5r-AAGGCUAGUCCG-3 r (SEQ ID NO: 47) uma sequência de bases que tem pelo menos 50% ou mais de homologia com 51-AAGGCUAGUCCG-31(SEQ ID NO: 47).
[05131 Em um outro exemplo, quando o domínio proximal tiver homologia parcial ou completa com um domínio proximal de Campylobacter jejuni ou um domínio proximal derivado do mesmo, o (P)k pode ser 5’-AAAGAGUUUGC-3'(SEQ ID NO: 48) ou uma sequência de bases que tem pelo menos 50% ou mais de homologia com 5'-AAAGAGUUUGC-3'{SEQ ID NO: 48).
[0514] Em ainda um outro exemplo, quando o domínio proximal tiver homologia parcial ou completa com um domínio proximal de Streptococcus thermophilus ou um domínio proximal derivado do mesmo, o (P)k pode ser 5 1-AAGGCUUAGUCCG-3'(SEQ ID NO: 53) ou uma sequência de bases que tem pelo menos 50% ou mais de homologia com. 51-AAGGCUUAGUCCG-3'(SEQ ID NO: 53).
[0515] O (F)i pode ser uma sequência de bases que inclui um domínio de cauda e que tem homologia parcial ou completa com um domínio de cauda de uma espécie existente na natureza, e a sequência de bases do domínio de cauda pode ser moditiçada de acordo com a espécie de origem. Ο L? pode ser, cada um, independentemente selecionado dentre o grupo que consiste em A, U, C e G, e o i pode ser o número
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 140/315 de bases, que é ura número inteiro de 1 a 50.
[0516] Por exemplo, quando o domínio de cauda tiver homologia parcial ou completa com um domínio de cauda de Streptococcus pyogenes ou um domínio de cauda derivado do mesmo, o (F)i pode ser 5'UUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3'(SEQ ID NO: 49) ou uma sequência, de bases que tem pelo menos 50% ou mais de homologia com 5'-UUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3'(SEQ ID NO: 49).
[0517] Em um outro exemplo, quando o domínio de cauda tiver homologia parcial ou completa com um domínio de cauda de Campylobacter jejuni ou um domínio de cauda derivado do mesmo, o (F)i pode ser 5'-GGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU-3'(SEQ ID NO: 50) ou uma sequência de bases que tem pelo menos 50% ou mais de homologia com.
-GGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU3 ' (SEQ ID NO: 50) .
[0518]
Em ainda um outro exemplo, quando o domínio de cauda tiver homologia parcial ou completa com um domínio de cauda de Streptococcus thermophilus ou ura domínio de cauda derivado do mesmo, o (F), pode ser 5f-UACUCAACUUGAAAAGGUGGCACCGAUUCGGUGUUUUU-3'(SEQ ID NO: 54) ou uma sequência de bases que tem pelo menos 50% ou mais de homologia com 5'-UACUCAACUUGAAAAGGUGGCACCGAUUCGGUGUUUUU3 ’ (SEQ ID NO: 54) .
[0519] Além disso, o (F)i pode incluir uma sequência de 1 a 10 bases na extremidade 3’ envolvida em um método de transcrição in vitro ou in vivo.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 141/315 [0520] Por exemplo, quando ura promotor T7 for usado na transcrição in vitro de gRNA, o domínio de cauda pode ser uma sequência de bases arbitrária presente na extremidade 3' de ura modelo de DNA. Além disso, quando ura promotor U6 for usado na transcrição in vivo, o domínio de cauda pode ser UUUUUU, quando um promotor Hl for usado na transcrição, o domínio de cauda pode ser UUUU e quando um promotor pol-III for usado, o domínio de cauda pode incluir diversas bases uracila ou bases alternativas.
[0521] Além disso, ο (X) d, (X)e e (X)f podem ser sequências de bases seletivamente adicionadas, em que ο X pode ser, cada um, independentemente selecionado dentre o grupo que consiste em. A, U, C e G, e cada um dentre d, e e f pode ser o número de bases, que é 0 ou um número inteiro de 1 a 20.
GRNA DE FITA simples [0522] O gRNA de fita simples pode ser classificado em dois tipos.
I) GRNA DE FITA simples [0523] Primeiro, há um gRNA de fita simples ao qual um.a primeira fita ou uma segunda fita do gRNA de fita dupla é liga por meio de um domínio ligante e, no presente documento, o gRNA de fita simples consiste em 5[primeira fita]-[domínio ligante]-[segunda fita]-3'.
[0524] Especificamente, o gRNA de fita simples pode consistir em ’ -[domínio-guia]-[primeiro domínio complementar]-[domínio ligante]-[segundo domínio
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2 / 2 5 3 complementar]-[domínio proximal]-3’
5'-[domínio-guia]-[primeiro domínio complementar]-[domínio ligante]-[segundo domínio complementar]-[domínio proximal]-[domínio de cauda]-3. [0525] Cada domínio, exceto o domínio ligante, é o mesmo da descrição de cada domínio da primeira e da segunda fitas do gRNA de fita dupla.
DOMÍNIO LIGANTE
[ 0526] No gRNA de f it a simples, o domínio ligante
é um domínio que conecta uma primeira f ita e uma segunda
fita e, esr 7 e ci fi came nt e, é uma. sequ ência de ácidos
nucleicos que conecta um prime iro domínio complement ar a um
segundo domír lio complementar para produ z i r gRNA ( j.e fita
simples. No presente documento, o domínio ligante pode ser conectado ao primeiro domínio complementar e ao segundo domínio complementar por meio de ligação covalente ou ligação não covalente ou conectar o primeiro domínio complementar ao segundo domínio complementar por meio de ligação covalente ou não covalente.
[0527] O domínio ligante pode ser ou incluir uma sequência de 1 a 30 bases. Por exemplo, o domínio ligante pode ser ou incluir uma sequência de 1 a 5, 5 a 10, 10 a 15, 15 a 20, 20 a 25 ou 25 a 30 bases.
[0528] O domínio ligante é adequado para ser usado em uma molécula de gRNA de fita simples e pode ser conectado à primeira fita e à segunda fita do gRNA de fita dupla ou conectar a primeira fita à segunda fita por meio de ligação covalente ou não covalente de modo a ser se
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3 / 2 5 3 usado na produção do gRNA de fita simples.
domínio ligante pode ser conectado ao crRNA e ao tracrRNA do gRNA de fita dupla ou conectar o crRNA ao tracrRNA por meio de ligação covalente ou não covalente de modo a ser usado na produção do gRNA de fita simples.
[0529] O domínio ligante pode ter homologia com uma sequência natural, por exemplo, uma sequência parcial de tracrRNA, ou pode ser derivado da mesma.
[0530] Seletivamente, uma parte ou a totalidade da sequência de bases do domínio ligante pode ter uma modificação química. A modificação química pode ser metilação, acetilação, fosforilação, ligação fosforotioato, um. ácido nucleico bloqueado (LNA), 3 '-f osf orotioato de 2’~ 0-metila (MS) ou 3'tioPACE de 2'-0-metila (MSP), mas a presente invenção não se limita aos mesmos.
[0531] Portanto, o gRNA de fita. simples pode consistir em 5[domínio-guia]-[primeiro domínio complementar]-[domínio 1igante]-[segundo domínio complementar]-[domínio proximal]-3' ou 5[domínio-guia][primeiro domínio complementar]-[domínio ligante]-[segundo domínio complementar]-[domínio proximal]-[domínio de cauda]-3', conforme descrito acima.
[0532] Além disso, o gRNA de fita simples pode incluir seletivamente uma sequência de bases adicional.
[0533] Em uma modalidade exemplificativa, o gRNA de fita simples pode ser ' - (Nalvo) - (Q)n - (L) j- (Z) h- (P)k-3 ' ; ou ' - (Nalvo) - (Q) (L) -j- ( Z ) h- (P) k- (F) j - 3 ' .
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 144/315 [Ob34 j Em uma outra modalidade, o gRNA de fita simples pode ser ' - (X) a-(Naivo) - (X) b-(Q) m-(X) c-(L) j-(X)d-(Z)h-(X)e-(P)k-(X)f3?; ou 5?-(X)a-lNalvo)-(X)b-(Q)K1-(X)c-(L)j-(X)d-(Z)h-(X)e-(P)k-(X)f[0535] No presente documento, o Naivo é uma sequência de bases com capacidade para formar uma ligação complementar com uma sequência-alvo em um gene ou ácido nucleico alvo e uma região de sequência de bases com capacidade para ser alterada de acordo com uma sequênciaalvo em um gene ou ácido nucleico alvo.
[0536] Em uma modalidade exemplif icativa, Naivo é uma sequência de bases com capacidade para formar uma ligação complementar com um gene-alvo, isto é, uma sequência-alvo de um. fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados, tal como um gene FAD, de preferência, um gene FAD2, um gene FAD.3, um. gene FAD6, um. gene FAD'7 ou um gene FAD8 .
[053'7] O (Q)m inclui uma sequência, de bases que inclui o primeiro domínio complementar que tem capacidade para formar uma ligação complementar com um segundo domínio complementar. O (Q)m pode ser uma sequência que tem homologia parcial ou completa com um primeiro domínio complementar de uma espécie existente na natureza, e a sequência de bases do primeiro domínio complementar pode ser alterada de acordo com a espécie de origem. O 0 pode ser, cada um, independentemente selecionado dentre o grupo
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 145/315 que consiste em A, U, C e G, e o m pode ser o número de bases, que é um número inteiro de 5 a 35.
[0538] Por exemplo, quando o primeiro domínio complementar tiver homologia parcial ou completa com um primeiro domínio complementar de Streptococcus pyogenes ou um primeiro domínio complementar derivado do mesmo, o (Q)m pode ser 5'-GUUUUAGAGCUA-3'(SEQ 1D NO: 42) ou uma sequência cie bases que tem pelo menos 50% ou mais de homologia com 5-GUUUUAGAGCUA-3'(SEQ ID NO: 42).
[0539] Em um outro exemplo, quando o primeiro domínio complementar tiver homologia parcial ou completa com um primeiro domínio complementar de Campylobacter jejuni ou um primeiro domín: mesmo, o (Q)m pode ser 5'-GUUi ID NO: 43) ou uma sequência de ou mais de homologia com 3' (SEQ ID NO: 43) .
[0540] Em a i nd a um primeiro domínio complementar completa com um primeiro complementar derivado do
UUAGUCCCUUUUUAAAUUUCUU-3'(SEQ bases que tem pelo menos 50% '-GUUUUAGUCCCUUUUUAAAUUUCUUoutro exemplo, quando o tiver homologia parcial ou domínio complementar de iptococcus thermophi1us primeiro domínio complementar derivado do mesmo, o (0) rr, pode ser 5'GUUUUAGAGCUGUGUUGUUUCG-3’(SEQ ID NO: 51) ou uma sequência de bases que tem pelo menos 50% ou mais de homologia com 5'-GUUUUAGAGCUGUGUUGUUUCG-3'(SEQ ID NO: 51).
[0541] Além disso, o (L)-j é uma sequência de bases que inclui o domínio ligante e que conecta o primeiro domínio complementar ao segundo domínio complementar,
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6/25 3 produzindo, assim, gRNA de fita simples. No presente documento, o L pode ser, cada um, independentemente selecionado dentre o grupo que consiste em A, U, C e G, e o j pode ser o número de bases, que é um número inteiro de 1 a 3 0 .
[0542] O (Z)h é uma sequência de bases que inclui o segundo domínio complementar que tem capacidade para ter uma ligação complementar com o primeiro domínio complementar. O (Z)h pode ser uma sequência que tem homologia parcial ou completa com o segundo domínio complementar de uma espécie existente na natureza, e a sequência de bases do segundo domínio complementar pode ser alterada de acordo com. a. espécie de origem.. O Z pode ser, cada um, independentemente selecionado dentre o grupo que consiste em A, U, C e G, e o h é o número de bases, que pode ser um número inteiro de 5 a. 50.
[0543] Por exemplo, quando o segundo domínio complementar tiver homologia parcial ou completa com um. segundo domínio complementar de Streptococcus pyogenes ou um. segundo domínio complementar derivado do mesmo, o (Z)h pode ser 5'-UAGCAAGUUAAAAU-3'(SEQ ID NO: 44) ou uma sequência de bases que tem pelo menos 50% ou mais de homologia com 5'-UAGCAAGUUAAAAU-3'(SEQ ID NO: 44).
[0544] Em um outro exemplo, quando o segundo domínio complementar tiver homologia parcial ou completa com um segundo domínio complementar de Campylobacter jejuni ou um segundo domínio complementar derivado do mesmo, o (Z)h pode ser 5'-AAGAAAUUUAAAAAGGGACUAAAAU-3 ' (SEQ ID NO:
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45) ou uma sequência de bases que tem pelo menos 50% ou mais de homologia com 5'-AAGAAAUUUAAAAAGGGACUAAAAU-3'(SEQ
ID NO: 45) .
[0545] Em ainda um outro exemplo, quando o segundo domínio complementar tiver homologia parcial ou completa com um segundo domínio complementar de Streptococcus thermophilus ou um segundo domínio complementar derivado do mesmo, o (Z)h pode ser 5'-CGAAACAACACAGCGAGUUAAAAU-3'(SEQ ID NO: 52) ou uma sequência de bases que tem pelo menos 50% ou mais de homologia com 5'-CGAAACAACACAGCGAGUUAAAAU-3'(SEQ ID NO: 52).
[0546] O (P)k é uma sequência de bases que inclui um. domínio proximal que pode ter homologia parcial ou completa com um domínio proximal de uma espécie existente na natureza, e a sequência de bases do domínio proximal pode ser modificada de acordo com. a espécie de origem. O P pode ser, cada um, independentemente selecionado dentre o grupo que consiste em. A, U, C e G, e o k pode ser o número de bases, que é um. número inteiro de 1. a 20.
[0547] Por exemplo, quando o domínio proximal tiver homologia parcial ou completa com um. domínio proximal de Streptococcus pyogenes ou um domínio proximal derivado do mesmo, o (P)k pode ser 5'-AAGGCUAGUCCG-3'(SEQ ID NO: 47) ou uma sequência de bases que tem pelo menos 50% ou mais de homologia com 5'-AAGGCUAGUCCG-3'(SEQ ID NO: 47).
[0548] Em um outro exemplo, quando o domínio proximal tiver homologia parcial ou completa com um domínio proximal de Campylobacter jejuni ou um domínio proximal
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8 / 2 5 3 derivado do mesmo, o (P)k pode ser 5’-AAAGAGUUUGC-3’(SEQ ID NO: 48) ou uma sequência de bases que tem pelo menos 50% ou mais de homologia com 5’-AAAGAGUUUGC-3’(SEQ ID NO: 48).
[0549] Em ainda um outro exemplo, quando o domínio proximal tiver homologia parcial ou completa com um domínio proximal de Streptococcus thermophilus ou um domínio proximal derivado do mesmo, o (P)k pode ser 5'AAGGCUUAGUCCG-3'(SEQ ID NO: 53) ou uma sequência de bases que tem pelo menos 50% ou mais de homologia com 5 ’ AAGGCUUAGUCCG-31(SEQ ID NO: 53).
[0550] O (F)i pode ser uma sequência de bases que inclui um domínio de cauda e que tem homologia parcial ou completa com um domínio de cauda de uma espécie existente na natureza, e a sequência de bases do domínio de cauda pode ser modificada de acordo com a espécie de origem. O F pode ser, cada um, independentemente selecionado dentre o grupo que consiste em. A, U, C e G, e o i pode ser o número de bases, que é um. número inteiro de 1 a 50.
[0551] Por exemplo, quando o domínio de cauda tiver homologia parcial ou completa com um. domínio de cauda de Streptococcus pyogenes ou um domínio de cauda derivado do mesmo, o (F), pode ser 5'UUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3'(SEQ ID NO: 49) ou uma sequência de bases que tem pelo menos 50% ou mais de homologia com 5'-UUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3'(SEQ ID NO: 49) .
[0552] Em um outro exemplo, quando o domínio de cauda tiver homologia parcial ou completa com um domínio de
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 149/315
9 / 2 5 3 cauda de Campylobacte jejuni ou urn domínio de cauda derivado mesmo, pode er
GGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU-3'(SEQ ID NO: 50) ou uma sequência de bases que tem pelo menos 50% ou mais de homologia com 5'-GGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU (SEQ ID NO: 50) .
[05531 Em ainda um outro exemplo, quando o domínio de cauda tiver homologia parcial ou completa com um domínio de cauda de Streptococcus thermophilus ou um domínio de cauda derivado do mesmo, o (F) , pode ser 5'UACUCAACUUGAAAAGGUGGCACCGAUUCGGUGUUUUU-3’(SEQ ID NO: 54) ou uma sequência de bases que tem pelo menos 50% ou mais de homologia com.
)'-UACUCAACUUGAAAAGGUGGCACCGAUUCGGUGUUUUU3 ' (SEQ ID NO: 54) .
[0554] Além disso, o (F)t pode incluir uma sequência de 3. a 10 bases na extremidade 3' envolvida em um. método de transcrição in vitro ou in vivo.
[0555] Por exemplo, quando um. promotor T7 for usado na transcrição in vitro de gRNA, o domínio de cauda pode ser uma sequência de bases arbitrária presente na extremidade 3' de um modelo de DNA. Além disso, quando um. promotor U6 for usado na transcrição in vivo, o domínio de cauda pode ser UUUUUU, quando um promotor Hl for usado na transcrição, o domínio de cauda pode ser UUUU e quando um promotor pol-III for usado, o domínio de cauda pode incluir diversas bases uracila ou bases alternativas.
Além disso, ο (X) a, (X)b, (X)c, (X)a, (X)e θ podem sequências seletivamente
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 150/315 adicionadas, em que ο X pode cada independentemente selecionado dentre o grupo que consiste em A, U, C e G, e cada um dentre a, b, c, d, e e f pode ser o número de bases, que é 0 ou um número inteiro de 1 a 20.
ii) gRNA DE FITA SIMPLES [0557] Segundo, o gRNA de fita simples pode ser gRNA de fita simples que consiste em um domínio-guia, um primeiro domínio complementar e um segundo domínio complementar e, no presente documento, o gRNA de fita simples pode consistir em:
5'-[segundo domínio complementar]-[primeiro domínio complementar] - [domínio-guia] -3 ' ; ou
5'-[segundo domínio complementar]-[domínio ligante]-[primeiro domínio complementar]-[domínio-guia]-3'.
DOM í NIO-GUIA [0558] No gRNA de fita simples, o domínio-guia inclui uma sequência-guia complementar com capacidade para formar uma ligação complementar com. uma sequência-alvo em. um. gene ou ácido nucleico alvo. A sequência-guia pode ser uma sequência de ácidos nucleicos que tem complementaridade com a sequência-alvo no gene ou ácido nucleico alvo que tem, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 9.5% ou mais de complementaridade ou complementaridade completa.
Considera-se que o domínio-guia permite um complexo de gRNA
Cas, isto é, um complexo
CRISPR para interagir especit icamente com o gene ou ácido nucleico alvo.
[0559] No presente documento, o domínio-guia pode er ou incluir uma sequência de 5 a 50 bases. Por exemplo,
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 151/315
o domínl Í.o-gi .1 i a pode ser ou incluir uma sequêncií a de 16, 17,
18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 bases.
[0560] Além di£ > S O r o domínio-guia pode incluir uma
sequência-guia.
[0561] No presente documento, a sequência-guia pode ser uma sequência de bases complementar com capacidade
p ci 1? a formar uma ligação complementar com uma sequêr icia-alvo
em um gene ou ácido nucleico alvo que tem, por exemplo,
pel o menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% ou mais de
com plementai /idade ou complementaridade completa.
[0562] Em uma modalidade exemplificativa, a sequência-guia pode ser uma sequência de ácidos nucleicos complementar a um gene-alvo, isto é, uma sequência-alvo de um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados, tal como um gene FAD, de preferência, um gene FAD2, um. gene FAD3, um gene FAD6, um. gene FAD7 ou um gene FAD8, que tem., por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% ou mais de complementar idade ou complementaridade completa.
[0563] No presente documento, a sequência-guia pode ser ou incluir uma sequência de 5 a 50 bases. Por exemplo, a sequência-guia pode ser ou incluir uma sequência de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 bases.
[0564] Em uma modalidade exemplificativa, a sequência-guia pode ser uma sequência de ácidos nucleicos complementar a uma sequência-alvo do gene FAD2. A sequência-guia pode ser ou incluir uma sequência de 5 a 50 bases. Por exemplo, a sequência-guia pode ser ou incluir
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112/253 uma .sequência
16,
18, 19, 20,
21, 22, 23, 24 ou 2 b [0565] Em uma modalidade exemplificativa, a sequência-guia pode ser uma sequência de ácidos nucleicos complementar a uma sequência-alvo do gene FAD3. A sequência-guia pode ser ou incluir uma sequência de 5 a 50 bases. Por exemplo, a sequência-guia pode ser ou incluir uma sequência de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 k) s s θ s « [0566] Em uma modalidade exemplificativa, a sequência-guia pode ser uma sequência de ácidos nucleicos complementar a uma sequência-alvo do gene FAD6. A sequência-guia pode ser ou incluir uma sequência de 5 a 50 bases. Por exemplo, a sequência-guia pode ser ou incluir uma sequência de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 d kD Q] v [0567] Em uma modalidade exemplificativa, a sequência-guia pode ser uma sequência de ácidos nucleicos complementar a uma sequência-alvo do gene FAD7. A sequência-guia pode ser ou incluir uma sequência de 5 a 50 bases. Por exemplo, a sequência-guia pode ser ou incluir uma sequência de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 bases.
[0568] Em uma modalidade exemplificativa, a sequência-guia pode ser uma sequência de ácidos nucleicos complementar a uma sequência-alvo do gene FAD8. A sequência-guia pode ser ou incluir uma sequência de 5 a 50 bases. Por exemplo, a sequência-guia pode ser ou incluir
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113 / 2 5 3 uma .sequência
16,
18, 19, 20,
21, 22, 23, 24 ou 2 b [0569]
No presente documento, as sequências-alvo dos genes-alvo, isto é, o fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados, tal como o gene FAD2 para a sequência-guia, são listadas acima na Tabela 1, mas a presente invenção não se limita às mesmas.
[05701 Seletivamente, o domínio-guia pode incluir uma sequência-guia e uma sequência de bases adicional.
[0571] No presente documento, a sequência de bases adicional pode ser uma sequência de 1 a 35 bases. Por exemplo, a sequência de bases adicional pode ser uma sequência de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 bases.
[0572] Em uma modalidade exemplificativa, a sequência de bases adicional pode ser uma sequência de base simples, guanina (G), ou uma sequência de duas bases, GG.
[0573] No presente documento, a sequência de bases adicional pode estar localizada na extremidade 5' do domínio-guia ou na extremidade 5f da sequência-guia.
[0574] A sequência de bases adicional, pode estar localizada na extremidade 3 ’ do dominio-guia ou na extremidade 3' da sequência-guia.
PRIMEIRO DOMÍNIO COMPLEMENTAR [0575] O primeiro domínio complementar é um domínio que inclui uma sequência de ácidos nucleicos complementar ao segundo domínio complementar e que tem complementaridade suficiente para formar uma fita dupla com o segundo domínio complementar.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 154/315 [0576] No presente documento, o primeiro domínio complementar pode ser ou incluir uma sequência de 5 a 3 5 bases. Por exemplo, o primeiro domínio complementar pode ser ou incluir uma sequência de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 bases. [0577] O primeiro domínio complementar pode ter homologia com um primeiro domínio complementar natural ou pode ser derivado de um primeiro domínio complementar natural. Além disso, o primeiro domínio complementar pode ter uma diferença na sequência de bases de um primeiro domínio complementar dependendo das espécies existentes na natureza, pode ser derivado de um primeiro domínio complementar contido nas espécies existentes na natureza ou pode ter homologia parcial ou completa com. o primeiro domínio complementar contido nas espécies existentes na natureza [0578] tm uma modalidade exemplif icat iva, o primeiro domínio complementar pode ter homologia parcial, isto é, de pelo menos mais, ou completa com um.
primeiro domínio complement ar de Parcubacteria. bacterium (GWC 2 011__GWC 2__4 4__17 ) ,
Lachnospiraceae bacterium (MC2017),
Butyrivibrio proteoclasiicus, Peregrinibacteria bacterium (GW2011__GWA__33__10) , Acidaminococcus sp. (BV3L6), Porphyromonas macacae, Lachnospiraceae bacterium (ND2006), Porphyromonas crevioricanis, Prevotella disiens, Moraxella bovoculi (237), Smiihella sp. ( SC....KO8D17 ) , Leptospira.
inadai,
Lachnospiraceae (MA 2 0 2 0) novicida (UI12),
Candidates Methanoplasma termitum
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Eubacteriuni eligens, ou um primeiro domínio complementar derivado dos mesmos.
[0579] Seletivamente, o primeiro domínio complementar pode incluir uma sequência de bases adicional que não sofre ligação complementar com o segundo domínio complementar.
[05801 No presente documento, a sequência de bases adicional pode ser uma sequência de 1 a 15 bases. Por exemplo, a sequência de bases adicional pode ser uma sequência de 1 a 5, 5a 10 ou 10 a 15 bases.
SEGUNDO DOMÍNIO COMPLEMENTAR [0581] O segundo domínio complementar inclui uma sequência de ácidos nucleicos complementar ao primeiro
d o m i n .i o c o mp 1 ementar e tem οοϊι ip 1 e m e n t a r i d a d e suficiente
para formar uma fita dupla com o primeir o domínio
comp1ementar. 0 segundo domínio complementar po de incluir
uma sequência de bases complementar ao primei' ro domínio
comp1ementar e uma s equência de bases que não tem.
complementaridade com o primeiro domínio complementar, por exemplo, uma sequência de bases que não forma uma fita dupla com. o primeiro domínio complementar, e pode ter uma sequência de bases mais longa que o primeiro domínio complementar.
[05821 No presente documento, o segundo domínio complementar pode ser ou incluir uma sequência de 5 a 35 bases. Por exemplo, o segundo domínio complementar pode ser uma sequência de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,
17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 bases.
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116/2 5 3
[ 0b83 j 0 segundo domínio complementar pode ter
homologia com um segundo domínio complementar natural ou
pode ser derivado o segundo domínio complementar natural.
Além disso, o segundo domínio complementar pode ter uma
diferença na sequência de bases do segundo domínio
c o mp 1 e m e n t a r de acordo com uma espécie existente na
natureza e pode ser derivado do segundo domínio
c o mp 1 e m e n t a r c contido nas espécies existentes na natureza,
ou pode ter 1 lomologia parcial ou completa com o segundo
domínio comp 1< ementar contido nas espécies existentes na
natureza.
i Q 5 8 'í tím uma modalidade exemplificativa, o
segundo domín: i.o complementar pode ter homologia parcial,
isto é, de pelo menos 50% ou mais, ou completa com um. segundo domínio complementar de Parcubacteria bacterium (GWC2011_GWC2_44_17), Lachnospiraceae bacterium (MC2017), Butyrivibrio proteoclasiicus, Peregrinibacteria bacterium {GW2011_GWA_33_10), Acidaminococcus sp. (BV3L6),
Porphyromonas macacae, Lachnospiraceae bacterium (ND2006),
P orphy romonas crevioricanis, Prevotella disiens, Moraxella
bovoculi (237), Smiihella sp. (SC__KO8D17) , Leptospira
inadai, Lachn lospiraceae bacterium (MA2020), Francisella
novicida (U112), Candidatus Methanoplasma termitum
Eubacterium e ligens, ou um segundo domínio complementar
erivado dos mesmos
[0585] Seletivamente, o segundo domínio
complementar p >ode incluir uma sequência de bases adicional
que não sofre ligação complementar com o primeiro domínio
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 157/315 comislement ar.
[0586] No presente documento, a sequência de bases adicional pode ser uma sequência de 1 a 15 bases. Por exemplo, a sequência de bases adicional pode ser uma sequência de 1 a 5, 5 a 10 ou 10 a 15 bases.
DOMÍNIO LIGANTE [ 058'7] Seletivamente, o domínio ligante é uma sequência, de ácidos nucleicos que conecta um primeiro domínio complementar a um segundo domínio complementar para produzir gRNA de fita simples. No presente documento, o domínio ligante pode ser conectado ao primeiro domínio complementar e ao segundo domínio complementar por meio de ligação covalente ou não covalente ou pode conectar o primeiro e o segundo domínios complementares por meio de ligação covalente ou não covalente.
[0588] O domínio ligante pode ser ou incluir uma sequência, de 1 a 30 bases. Por exemplo, o domínio ligante pode ser ou incluir uma sequência, de 1 a 5, 5 a 10, 10 a 15, 15 a 20, 2 0 a. 2 5 ou 2 5 a 3 0 bases.
[0589] Seletivamente, uma. parte ou a totalidade da sequência, de bases do dom.ínio-guia, o primeiro domínio complementar, o segundo domínio complementar e o domínio ligante podem ter uma modificação química. A modificação química pode ser metilação, acetilação, fosforilação, ligação fosforotioato, um ácido nucleico bloqueado (LNA), 3'-fosforotioato de S'-O-metila (MS) ou 3ftioPACE de 2f-Ometila (MSP), mas a presente invenção nao se limita aos mesmos.
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118/253 [0590] Portanto, o gRNA de fita simples pode consistir em 5[segundo domínio complementar]-[primeiro domínio complementar]-[domínio-guia] ~3! ou 5[segundo domínio complementar]-[domínio ligante]-[primeiro domínio complementar]-[domínio-guia]-3', conforme descrito acima.
[0591] Além disso, o gRNA de fita simples pode incluir seletivamente uma sequência de bases adicional.
[0592] Em uma modalidade exemplificativa, o gRNA de fita simples pode ser '- (Z) h-(Q) m-(Nalvo)-3 f; ou ' - (X) a- ( Z ) h- (X) b- (Q) r,- (X) c- (Nalvo) - 3 ' .
[0593] Em uma outra modalidade, o gRNA de fita simples pode ser ’ - ( Z ) h- ( L) j- (Q) m- (Naivo) -3 ' ; ou
5'- (X) a- (Z)h- (L) j- (Q)m- (X) c- (Nalvo) -3 ' .
[0594] No presente documento, o Najvo é uma sequência de bases com capacidade para formar uma ligação complementar com uma sequência-alvo em um gene ou ácido nucleico alvo e uma região de sequência de bases que pode ser alterada de acordo com. uma sequência-alvo em um gene ou ácido nucleico alvo.
[0595] Em uma modalidade exemplif icativa, Naivo pode ser uma sequência de bases com capacidade para formar uma ligação complementar com um gene-alvo, isto é, uma sequência-alvo de um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados, tal como um gene FAD, de preferência, um gene FAD2, um gene FAD3, um gene FAD6, um gene FAD7 ou um gene FAD8.
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119/253 [0596] 0 (Q)m é uma sequência de bases que inclui o primeiro domínio complementar que tem capacidade para formar uma ligação complementar com o segundo domínio complementar da segunda fita. O (Q)m pode ser uma sequência que tem homologia parcial ou completa com o primeiro domínio complementar de uma espécie existente na natureza, e a sequência de bases do primeiro domínio complementar pode ser alterada de acordo com a espécie de origem. O Q pode ser, cada um, independentemente selecionado dentre o grupo que consiste em A, U, C e G, e o m pode ser o número de bases, que é um número inteiro de 5 a 35.
[ 059'7] Por exemplo, quando o primeiro domínio complementar tiver homologia parcial ou completa com um. primeiro domínio complementar de Parcubactería bacterium ou um primeiro domínio complementar derivado do mesmo, o (Q)m pode ser 5' -UUUGUAGAU-3 ’ ou uma sequência de bases que tem. pelo menos 50% ou mais de homologia com 5'-UUUGUAGAU-3'.
[0598] O (Z)h é uma sequência de bases que inclui um. segundo domínio complementar que tem capacidade para formar uma ligação com.plem.ent ar com o primeiro domínio complementar da primeira. fita. 0 (Z)h pode ser uma sequência que tem homologia parcial ou completa com o
segundo domínio complementar de uma espécie existente na
natureza, e a sequência de I iases do seg· Lindo domínio
complementar pod .e ser modificada de acordo com a espécie de
origem. 0 Z pode ser, cada um, independentemente selecionado dentre o grupo que consiste em A, U, C e G, e o h pode ser o número de bases, que é um número inteiro de 5
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 160/315 [0599] Por exemplo, quando o segundo domínio complementar tiver homologia parcial ou completa com um segundo domínio complementar de Parcubacteria bacterium ou um segundo domínio complementar derivado de Parcubacteria bacterium, o (Z)h pode ser 5'-AAAUUUCUACU-3'(SEQ ID NO: 46) ou uma sequência de bases que tem pelo menos 50% ou mais de homologia com 5’-AAAUUUCUACU-3'{SEQ ID NO: 46).
[0600] Além disso, o (L)j é uma sequência de bases que inclui o domínio ligante que conecta o primeiro domínio complementar ao segundo domínio complementar. No presente documento, o L pode ser, cada um, independentemente selecionado dentre o grupo que consiste em A, U, C e G, e o j pode ser o número de bases, que é um número inteiro de 1 a 3 0.
[0601] Além disso, cada um dentre (X)a, (X)b e (X)o é seletivamente uma sequência de bases adicional, em que X pode ser, cada um, independentemente selecionado dentre o grupo que consiste em A, U, C e G, e a, b e c podem ser o número de bases, que é 0 ou um. número inteiro de 3. a 20.
2. PROTEÍNA EDITORA [0602] Uma proteína editora refere-se a um peptídeo, polipeptídeo ou proteína que tem capacidade para se ligar diretamente ou interagir, sem ligação direta, com um ácido nucleico.
[0603] O ácido nucleico pode ser um ácido nucleico contido em um ácido nucleico, gene ou cromossomo alvo.
[0604] O ácido nucleico pode ser um ácido
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 161/315 nucleico-guia.
A proteína editora pode ser uma enzima.
A proteína editora pode ser uma proteína de [0607] No presente documento, a proteína de fusão refere-se a uma proteína produzida fundindo-se uma enzima a
um dom in io, peptídeo, polipeptídeo ou p r o t e i n a a d i c i o n a 1.
[06 0 8 J A enzima refere-se a uma proteína que
i n c lui u m domínio que tem capacidade para clivar um á cido
nuc 1 e .1 c o , gene, cromossomo ou protein 3 *
[06 09] A enzima pode ser uma nucleaseF uma
pro t ease ou uma enzima de restrição.
[06 10 ] 0 domínio, peptide ío, polipeptídeo ou
pro teína adicional pode ser um domínio, peptí de o,
pol ipept ideo ou proteína funcional qu e tem uma função i gual
ou diferente da enzima.
[ 0 6 11 ] A proteína de fusão pode incluir um.
dominie j, peptídeo, ρ o 1 i ρ e p t í d e o ou proteína adicional em.
uma ou mais dentr* e uma terminaç ’.ão N de uma enzima ou na
proximidade da mesma; uma terminação C da enzima ou na proximidade da mesma; a região intermediária de uma enzima; e uma combinação das mesmas.
[0612] A proteína de fusão pode incluir um
domínio, peptídeo, polipeptídeo ou pr ot eína funcional em
uma ou m/ ais dentre uma terminação N c ie uma enzima ou na
proximida: de da mesma; uma terminação C da enzima ou na.
proximidade da mesma; a região intermediária de uma enzima;
e uma combinação das mesmas.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 162/315 [0613] No presente documento, o domínio, peptídeo, polipeptídeo ou proteína funcional pode ser um domínio, peptídeo, polipeptídeo ou proteína que tem atividade metilase, atividade demetilase, atividade de ativação de transcrição, atividade de repressão de transcrição, atividade de fator de liberação de transcrição, atividade de modificação de histona, atividade de divagem de RNA ou atividade de ligação ao ácido nucleico, ou uma etiqueta ou gene repórter para isolamento e purificação de uma proteína (incluindo um peptídeo), mas a presente invenção não se limita aos mesmos.
[0614] O domínio, peptídeo, polipeptídeo ou proteína funcional pode ser uma deaminase.
[0615] A etiqueta inclui uma etiqueta de histidina (His), uma etiqueta V5, uma etiqueta FLAG, uma etiqueta de hemaglutinina da gripe (HA), uma etiqueta Myc, uma etiqueta VSV-G e uma etiqueta tiorredoxina (Trx), e o gene repórter inclui glutationa-S-transferase (GST), peroxidase de raiz forte (HRP), cloranfenicol acetiltransferase (CAT) βgalactosidase, β-glucoronidase, luciferase, proteínas autofluorescent.es, incluindo a proteína verde fluorescente (GFP), HcRed, DsRed, proteína ciano fluorescente (CFP), proteína amarela fluorescente (YFP) e proteína azul fluorescente (BFP), mas a presente invenção não se limita às mesmas.
[0616] Além disso, o domínio, peptídeo, polipeptídeo ou proteína funcional pode ser uma sequência ou sinal de localização nuclear (NLS) ou uma sequência ou
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 163/315 sinal de exportação nuclear (NES).
[0617]
A NLS pode ser NLS do antígeno T grande do vírus
SV40 com uma sequência de aminoácidos PKKKRKV(SEQ ID
NO: 55); NLS derivada de nucleoplasmina (por exemplo, NLS de nucleoplasmina bipartida com uma sequência KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO: 56)); NLS de c-myc com uma sequência de aminoácidos PAAKRVKLD(SEQ ID NO: 57) ou RQRRNELKRSP (SEQ ID NO: 58) ; NLS de hRNPAl M9 com uma sequência NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(SEQ ID NO: 59); uma sequência de domínio IBB derivado de importina-a RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(SEQ ID NO: 60); sequências de proteína T de mioma VSRKRPRP(SEQ ID NO: 61) e PPKKARED (SEQ ID NO: 62); sequência de p53 humano PQPKKKPL(SEQ ID NO: 63) ; uma sequência de c-abl IV de camundongo SALIKKKKKMAP(SEQ ID NO: 64); sequências do vírus da gripe NS1 DRLRR(SEQ ID NO: 65) e PKQKKRK(SEQ ID NO: 66); uma sequência do antígeno do vírus da hepatite-δ RKLKKKIKKL(SEQ ID NO: 67); uma sequência da proteína Mxl de camundongo REKKKFLKRR(SEQ ID NO: 68); uma sequência de poli(ADP-ribose) polimerase humana KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(SEQ ID NO: 69); ou sequência de glicocorticoides do receptor do hormônio esteroide (humano) RKCLQAGMNLEARKTKK(SEQ ID NO:
/0), mas a presente invenção nao se limita aos mesmos.
[0618] A proteína editora pode incluir uma enzima ativa completa.
[0619] No presente documento, a enzima ativa completa refere-se a uma enzima que tem a mesma função que uma função de uma enzima do tipo selvagem e, por exemplo, a
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 164/315 enzima do tipo selvagem que diva a fita dupla de DNA tem atividade enzimática completa para clivar totalmente a fita dupla de DNA.
[0620] Além disso, a enzima ativa completa inclui uma enzima que tem uma função melhorada em comparação com a função da enzima do tipo selvagem e, por exemplo, um tipo especifico de modificação ou manipulação da enzima do tipo selvagem que cliva a fita dupla de DNA tem atividade enzimática total melhorada em comparação com a enzima do tipo selvagem, isto é, atividade de divagem da fita dupla de DNA.
[0621] A proteína editora pode incluir uma enzima incompleta ou parcialmente ativa.
[0622] No presente documento, a enzima incompleta ou pardalmente ativa refere-se a uma enzima que tem algumas das funções da enzima do tipo selvagem e, por exemplo, um tipo específico de modificação ou manipulação da enzima do tipo selvagem que diva a fita dupla de DNA tem atividade enzimática incompleta ou parcial para clivar uma parte da fita dupla, isto é, uma fita simples de DNA.
[0623] A proteína editora pode incluir uma enzima inativa.
[0624] No presente documento, a enzima inativa refere-se a uma enzima na qual a função de uma enzima do tipo selvagem está completamente inativada. Por exemplo, um tipo específico de modificação ou manipulação da enzima do tipo selvagem que cliva a fita dupla de DNA tem inatividade de modo a não clivar completamente a fita dupla de DNA.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 165/315 [0625] A proteína editora pode ser uma enzima natural ou uma proteína de fusão.
[0626] A proteína editora pode estar presente sob a forma de uma enzima natural ou uma proteína de fusão parcialmente modificadas.
[0627] A proteína editora pode ser uma enzima ou proteína de fusão artificialmente produzidas que não existe na natureza.
[0628] A proteína editora pode estar presente sob a forma de uma enzima artificial ou proteína de fusão parcialmente modificadas que não existe na natureza.
[0629] No presente documento, a modificação pode ser uma substituição, remoção, adição de aminoácidos contidos na proteína editora, ou uma combinação das mesmas.
[0630] Além disso, a modificação pode ser uma substituição, remoção, adição de algumas bases na sequência de bases que codifica a proteína editora, ou uma combinação das mesmas.
[0631] Como uma modalidade exemplificativa da proteína editora da presente invenção, uma enzima CRISPR será descrita abaixo.
ENZIMA CRISPR [0632] O termo enzima CRISPR é um componente principal da proteína de um sistema CRISPR-Cas e forma um complexo com gRN21, resultando no sistema CRISPR-Cas.
[0633] A enzima CRISPR é um ácido nucleico ou polipeptídeo (ou uma proteína) que tem uma sequência que codifica a enzima CRISPR e, representativamente, uma enzima
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 166/315
CRISPR Tipo II ou enzima CRISPR Tipo V é amplamente usada.
[0634] A enzima CRISPR Tipo II é Cas9 que pode ser derivada de vários micro-organismos, tais como Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Streptococcus sp. , Staphylococcus aureus, Nocardiopsis dassonvillei, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces vi ri do chromo gene s, St rept ornyces vi ri do chromo genes,
St rep t osporan gi um ros e um, St rept ospora n gi um rose um, AllcyclobacHlus acidocaldarius, Bacillus pseudomycoid.es, Baci11us se1enitireducens, Exiguobacterium sibiricum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus salivarius, Microsci11 a marina, Burkholderiales bacterium, Polaromonas naphthalenivorans, Polarom.on.as sp. , Crocosphaera watsonii, Cyanothece sp. , Microcystis aeruginosa, Synechococcus sp. , Acetohalobium arabaticum, Ammonifex degensii,
Caldicelulosiruptor bescii, Candidatus Desulforudis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Finegold!a magna, Natranaerobius thermophi1 us, Pelotomaculum the rm op r op 1 ο n i c um, A c i d. i t h i ob a. c 111 u s c a. 1 d u s,
Ac 1 di thi obaci 11 us f errooxi dans, A11 ochroma 1.1 um vinosum, Marinobacter sp. , Nitrosococcus halophilus, Nitrosococcus watsoni, Pseudoalt eromonas halop>lankt is, Ktedonobacter racemifer, Methanohalobium evestigatum, Anabaena variabilis, Nodularia spumigena, Nostoc sp. , Arthrospira maxima, Arthrospira platensis, Arthrospira sp., Lyngbya sp. , Microcoleus chthonoplastes, Oscillatoria sp. ,
Petrotoga mobilis, Thermosipho africanus e Acaryochloris marina .
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 167/315 [0635] O termo Cas9 é uma enzima que se liga ao gRNA de modo a clivar ou modificar uma sequência-alvo ou posição em um gene ou ácido nucleico alvo, e pode consistir em um domínio HNH com capacidade para clivar uma fita de ácido nucleico que forma uma ligação complementar com gRNA, um domínio RuvC com capacidade para clivar uma fita de ácido nucleico que forma uma ligação complementar com gRNA, um domínio REC que reconhece um alvo e um domínio PI que
reconh ece PI ÍM. Hiroshi Nis himasu et al. (2014 ) Cell 156:935
a 9 49 pode s e r m e n c i o n a d o p a r a c a r a c t e r i s t i c as estruturais
especí ficas de Cas9.
[0636] Além disso , a enzima CRISPR T ipo V pode ser
Cpfl, que pode ser derivada de Strep tococcus,
Campy1obacter, Ni tratifra ctor, Staphylococcus,
Pa rvi b a c u 1 um., R o s eb u ri a, Ne i s s e ri a, Gl u c on a ce t ob a. c t e r, A z o sp i ri 11 um, Sph aero ch a et. a, L act ob a c i 11 u s, E ubacte ri um, Corynebacter, Carnobacterium, Rhodobacter, Listeria, Paiudibacter, Clostridium, Lachnospiraceae,
Cl o s t ri di a ri di um, L ep tot ri ch i a, Fra. n c i s e 11 a., L e gi one 11 a., Al i cycl oba ci 11 us, Me than orne t.hyophi 1 us, Porphyromonas,
Prevotella, Bacteroidetes, Helcococcus, Letospira,
Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitut aceae,
Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacillus, Methylobacterium ou Acidaminococcus.
[0637] A Cpfl pode consistir em um domínio RuvC similar e correspondente ao domínio RuvC de Cas9, um domínio Nuc sem o domínio HNH de Cas9, um domínio REC que reconhece um alvo, um domínio WED e um domínio PI que
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 168/315 reconhece PAM. Para características estruturais específicas de Cpfl, Takashi Yamano et al. (2016) Cell 165:949 a 962 pode ser mencionado.
[0638] A enzima CRISPR da proteína Cas9 ou Cpfl pode ser isolada de um micro-organismo existente na natureza ou não naturalmente produzido por um método r e c o mb i nant e ou sint é t i co. ENZIMA CRISPR TIPO II [0639] A estrutura de cristal da enzima CRISPR tipo II foi determinada de acordo com estudos em dois ou mais tipos de moléculas naturais de enzima CRISPR tipo II microbiana (Jinek et al., Science, 343(61'76) :1247997, 2014) e estudos em. Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9) complexada com gRNA (Nishimasu et al., Cell, 156:935 a 949, 2014; e Anders et al ., Nature, 2014, doi: 10 . 1038/nature13 5 79) .
[0640] A enzima CRISPR tipo II inclui dois lóbulos, isto é, lóbulos de reconhecimento (REC) e nuclease (NUC), e cada lóbulo inclui diversos domínios.
[06 41] O lóbulo REC inclui um domínio de hélice em.
ponte (BH) rico em. arginina. , um domínio REC1 e um domínio REC2 .
[0642] No presente documento, o domínio BH é uma região longa de hélice oí e tica em arginina, e os domínios
RECI e REC2 desempenham um papel importante no reconhecimento de uma fita dupla formada no gRNA, por exemplo, gRNA de fita simples, gRNA de fita dupla ou tracrRNA.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 169/315 [0643]
O lóbulo NUC inclui urn domínio RuvC, um domínio HNH e um domínio de interação com PAM (PI) .
No presente documento, o domínio RuvC abrange domínios semelhantes a RuvC, ou o domínio HNH é usado para incluir domínios semelhantes a HNH.
[0644]
No presente documento, domínio RuvC compartilha similaridade estrutural com membros da família de micro-organismos existente na natureza que tem a enzima CRISPR tipo II, e cliva uma fita simples, por exemplo, uma fita não complementar de um gene ou ácido nucleico alvo, isto é, uma fita que não forma uma ligação complementar com gRNA. O domínio RuvC é, às vezes, denominado domínio RuvCI, domínio RuvCII ou domínio RuvCIII na técnica, e geralmente é chamado de RuvC I, RuvCII ou RuvCIII. Por exemplo, no caso de SpCas9, o domínio RuvC é montado a partir de cada um. dos três domínios RuvC divididos (RuvC I, RuvCII e RuvCIII) localizados nas sequências de aminoácidos 1 a 59, 718 a 769 e 909 a 1.098 de SpCas9, respectivamente.
[0645] O domínio HNH compartilha similaridade estrutural com. a HNH endonuclease e cliva. uma. fita simples, por exemplo, uma fita, complementar de uma. molécula de ácido nucleico-alvo, isto é, uma fita que forma uma ligação complementar com gRNA. O domínio HNH está localizado entre os motivos RuvC II e III. Por exemplo, no caso de SpCas9, o domínio HNH está localizado na sequência de aminoácidos 775 a 908 de SpCas9.
[0646] O domínio PI reconhece uma sequência de bases específica em um gene ou ácido nucleico alvo, isto é,
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 170/315 um motivo adjacente ao protoespaçador (PAM), ou interage com PAM. Por exemplo, no caso de SpCas9, o domínio PI está localizado na sequência de aminoácidos 1.099 a 1.368 de [0647] No presente documento, o PAM pode variar de acordo com a origem da enzima CRISPR tipo II. Por exemplo, quando a enzima CRISPR for SpCas9, PAM pode ser 5' -NGG-3', quando a enzima CRISPR for Cas9 de Streptococcus thermophilus (StCas9), PAM pode ser 5'-NNAGAAW-3'(W = A ou T) , quando a enzima CRISPR for Cas9 de Neisseria meningitid.es (NmCas9), PAM pode ser 5 ' -NNNNGATT-3 ' e quando a enzima CRISPR for Cas9 de Campylobacter jejuni (CjCas9), PAM pode ser 5'-NNNVRYAC-3' (V = G ou C ou A, R = A ou G, Y = C ou T) , em. que o N pode ser A, T, G ou C; ou A, U, G ou
ENZIMA CRISPR TIPO V [0648] A enzima CRISPR Tipo V inclui domínios RuvC similares que correspondem aos domínios RuvC da enzima CRISPR tipo II e pode consistir em um domínio Nuc, em vez do domínio HNH da enzima CRISPR tipo II, domínios REC e WED que reconhecem um alvo e um domínio PI que reconhece PAM. Para características estruturais específicas da enzima CRISPR tipo V, Takashi Yamano et al. (2016) Cell 165:949 a 962 pode ser mencionado.
[0649] A enzima CRISPR tipo V pode interagir com gRNA, formando, assim, um complexo de gRNA e enzima CRISPR, isto é, um complexo CRISPR, e pode permitir que uma sequência-guia se aproxime de uma sequência-alvo que inclui
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 171/315 uma sequência PAM em cooperação com gRNA. No presente documento, a capacidade da enzima CRISPR tipo V para interação com um gene ou ácido nucleico alvo depende da s eque n cia PAM.
[0650] A sequência PAM é uma sequência presente em um gene ou ácido nucleico alvo e pode ser reconhecida pelo domínio PI da enzima CRISPR tipo V. A sequência PAM pode variar de acordo com a origem da enzima CRISPR tipo V. Ou seja, há sequências PAM diferentes que têm capacidade para serem especificamente reconhecidas, dependendo de uma espécie.
[0651] Em um exemplo, a sequência PAM reconhecida por Cpfl pode ser 5,~TTN~3'’ (N é A, T, C ou G) .
ATIVIDADE ENZIMÁTICA CRISPR [0652] Uma enzima CRISPR cliva uma fita dupla ou simples de um gene ou ácido nucleico alvo e tem atividade nuclease que provoca a ruptura ou deleção da fita dupla ou simples. Em geral, a enzima CRISPR tipo II ou enzima CRISPR tipo V do tipo selvagem cliva a fita dupla do gene ou ácido nucleico alvo.
Para manipular ou modificar a atividade nuclease descrita acima da enzima CRISPR, a enzima CRISPR pode ser manipulada ou modificada, tal enzima CRISPR manipulada ou modificada pode ser modificada para uma enzima incompleta ou parcialmente ativa ou inativa.
ENZIMA INCOMPLETA OU PARCIALMENTE ATIVA [0654] Uma enzima CRISPR modificada de modo a alterar a atividade enzimática, formando, assim, atividade
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 172/315
2 / 2 5 3 incompleta ou parcial é chamada de nickase.
[0655]
O termo nickase refere-se uma
CRISPR manipulada ou modificada para clivar apenas uma fita da fita dupla do gene ou ácido nucleico alvo, e a nickase tem atividade nuclease para clivar uma fita simples, por exemplo, uma fita que é ou não complementar ao gRNA do gene ou ácido nucleico alvo. Portanto, para clivar a fita dupla, a atividade nuclease das duas nickases é necessária.
[0656] Por exemplo, a nickase pode ter atividade nuclease pelo domínio RuvC. Ou seja, a nickase pode incluir atividade nuclease do domínio HNH e, para essa finalidade, o domínio HNH pode ser manipulado ou modificado.
[06 57] Em um. exemplo, desde que a enzima CRISPR seja a enzima CRISPR tipo II, no caso de SpCas9, quando o resíduo 840 na sequência de aminoácidos de SpCas9 for mutado de histidina para, alanina, a atividade nuclease do domínio HNH é inativada para ser usada como um.a nickase. Visto que a. nickase produzida, assim., tem. atividade nuclease do domínio RuvC, a mesma tem capacidade para clivar uma fita que não forma um.a ligação complementar com. uma fita, não com.plem.entar do gene ou ácido nucleico alvo, isto é, gRNA.
[0658] Em uma outra modalidade exemplificativa, no caso de CjCas9, quando o resíduo 559 na sequência de aminoácidos de CjCas9 for mutado de histidina para alanina, a atividade nuclease do domínio HNH é inativada para ser usada como uma nickase. A nickase assim produzir tem atividade nuclease pelo domínio RuvC e, dessa forma, tem
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 173/315 capacidade para clivar uma fita não complementar do gene ou ácido nucleico alvo, isto é, uma fita que não forma uma ligação complementar com gRNA.
[0659] Por exemplo, a nickase pode ter atividade nuclease pelo domínio HNH. Ou seja, a nickase pode incluir a atividade nuclease do domínio RuvC e, para essa finalidade, o domínio RuvC pode ser manipulado ou modificado.
[0660] Em um exemplo, desde que a enzima CRISPR seja a enzima CRISPR tipo II, em uma modalidade exemplificativa, no caso de SpCas9, quando o resíduo 10 na sequência de aminoácidos de SpCas9 for mutado de ácido aspártico para alanina, a atividade nuclease do domínio RuvC é inativada para ser usada como uma nickase. A nickase produzida, assim, tem a atividade nuclease do domínio HNH e, dessa forma, tem. capacidade para clivar uma fita complementar do gene ou ácido nucleico alvo, isto é, uma fita que forma uma ligação complementar com gRNA.
[0661] Em uma. outra modalidade exemplificativa, no caso de CjCas9, quando o resíduo 8 na sequência de aminoácidos de CjCas9 for mutado de ácido aspártico para alanina, a atividade nuclease do domínio RuvC é inativada para ser usada como uma nickase. A nickase produzida, assim, tem a atividade nuclease do domínio HNH e, dessa forma, tem capacidade para clivar uma fita complementar do gene ou ácido nucleico alvo, isto é, uma fita que forma uma ligação complementar com gRN21.
ENZIMA INATIVA
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 174/315 [0662] Uma enzima CRISPR que é modificada para produzir atividade enzimática completamente inativa é chamada de enzima CRISPR inativa.
[0663] O termo enzima CRISPR inativa refere-se a
uma enzima CRISPR que é modificada para não clivar
completament« b a fita dupla do gene ou ác ;ido m i c 1 s i co alvo,
e a enzima CRISPR i n a t i v a t e m i n a t i v idade de nuclease
devido à mu .t aç ao n o dominio com ativ idade nuc J . e a. s e d. a
e n z i m a C RIS P Ή do ti po selvagem. A enzi .ma CRISPR inativa
pode ser uma em que as atividades nuclea se do domí nio RuvC
e do domínio HNH são inativadas.
[0664] Por exemplo, a enzima CRISPR inativa pode ser manipulada ou modificada no domínio RuvC e no domínio HNH de modo a inativar a atividade nuclease.
[0665] Em um exemplo, desde que a enzima CRISPR seja a enzima CRISPR tipo II, em uma modalidade exemplificativa, no caso de SpCas9, quando os resíduos 10 e 840 na sequência de aminoácidos de SpCas9 forem mutados de ácido aspártico e histidina para alanina, respectivamente, as atividades nuclease pelo domínio RuvC e pelo domínio HNH são inativadas, de modo que a fita dupla não possa clivar completamente a fita dupla do gene ou ácido nucleico alvo.
[0666] Em uma outra modalidade exemplificativa, no caso de CjCas9, quando os resíduos 8 e 559 na sequência de aminoácidos de CjCas9 forem mutadas de ácido aspártico e histidina para alanina, as atividades nuclease pelo domínio RuvC e pelo domínio HNH são inativadas, de modo que a fita dupla não possa clivar completamente a fita dupla do gene
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 175/315 ou ácido nucleico alvo.
OUTRAS ATIVIDADES [0667] A enzima CRISPR pode ter atividade endonuclease, atividade exonuclease ou atividade helicase, isto é, uma capacidade para anelar a estrutura em hélice do ácido nucleico de fita dupla, além da atividade nuclease d e s c r i t a a c i m a .
[0668] Além disso, a enzima CRISPR pode ser modificada para ativar completa, incompleta ou parcialmente a atividade at ividade exonuclease at ividade he1icase.
ALVEJAMENTO DE ENZIMA CRISPR [0669] A enzima CRISPR pode interagir com gRNIk, formando, assim, um complexo de gRNA e enzima CRISPR, isto é, um complexo CRISPR, e levar uma sequência-guia a se aproximar de uma sequência-alvo que inclui uma sequência
PAM em cooperação com gRNIk. No presente documento, a capacidade da enzima CRISPR para interagir com o gene ou ácido nucleico alvo depende da sequência PAM.
[0670] A sequência PAM é uma sequência presente no gene ou ácido nucleico alvo que pode ser reconhecida pelo domínio PI da enzima CRISPR. A sequência PAM pode variar, dependendo da origem da enzima CRISPR. Ou seja, há várias sequências PAM que têm capacidade para serem especificamente reconhecidas de acordo com uma espécie.
[0671] Em um exemplo, desde que a enzima CRISPR seja a enzima CRISPR tipo II, no caso de SpCas9, a sequência PAM pode ser
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 176/315
6/25 3
51-NAG-3! e/ou 5'-NGA-3' seauência PAM code dGGNG-3' e/ou 5’-NNAGAAW caso de NmCas9 seauência PAM code
WNNGATT-3' e/ou 5'-NNNGCTI caso de CjCas9 seauência PAM code
5'-NNNVRYAC-3 ' (V === G, C ou A; R === A ou G; Y === C ou T), no caso de Cas9 de Streptococcus mutans (SmCas9), a. sequência. PAM pode sen 5'-NGG-3' e/ou 5'-MAARS' (R === A ou G) , e aso de de Staphylococcus aur (SaCas9), a sequência PAM pode ser 5' -NNGRR-3 ’ 5'-NNGRRT3' e/ou 5'-NNGRRV-3' (R = A ou G; V = G, C ou A).
Em um outro exemplo, desde que a enzima CRISPR seja a. enzima CRISPR tipo V, no caso de Cpfl, a. sequência PAM pode ser 5'-TTN-3'.
[0672j No presente documento, o N pode ser A, T, G ou C; ou A, U, G ou C.
[0673] A enzima CRISPR com capacidade para reconhecer uma sequência PAM específica pode ser manipulada ou modificada com o uso da sequência PAM com capacidade para ser especificamente reconhecida de acordo com a espécie. Por exemplo, o domínio PI de SpCas9 pode ser substituído pelo domínio PI de CjCas9 de modo a ter a atividade nuclease de SpCas9 e reconhecer uma sequência PAM especifica de CjCas9, produzindo, assim, SpCas9 que reconhece a sequência PAM específica de CjCas9. Uma
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 177/315 sequência PAM especificamente reconhecida pode ser alterada por substituição ou recolocaçao do domínio PI.
MUTANTE DE ENZIMA CRISPR [0674] A enzima CRISPR pode ser modificada para melhorar ou inibir várias características, tais como atividade nuclease, atividade helicase, uma capacidade para interagir com gRNA e uma capacidade para se aproxima do gene ou ácido nucleico alvo, por exemplo, capacidade de reconhecimento de PAM da enzima CRISPR.
[0675] Além disso, o mutante de enzima CRISPR pode ser uma enzima CRISPR que interage com gRNA para formar um complexo de gRNA e enzima CRISPR, isto é, um complexo CRISPR, e é modificado ou manipulado para melhorar a especificidade de alvo, quando se aproxima ou está localizado no gene ou ácido nucleico alvo, de modo que apenas uma fita dupla ou simples do gene ou ácido nucleico alvo seja clivada sem a divagem de uma fita dupla ou simples de um gene ou ácido nucleico não alvo que forma parcialmente uma ligação complementar com gRNA e um gene ou ácido nucleico não alvo que não forma uma ligação complementar com o mesmo.
[0676] No presente documento, um efeito de clivar a fita dupla ou simples do gene ou ácido nucleico não alvo que forma parcialmente uma ligação complementar com gRNA e do gene ou ácido nucleico nao alvo que não forma ligação complementar com o mesmo é denominado um efeito fora do alvo, uma posição ou sequência de bases do gene ou ácido nucleico não alvo que forma parcialmente uma ligação
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 178/315
8 / 2 5 3 complementar com gRNA e do gene ou ácido nucleico não alvo que não forma uma ligação complementar com o mesmo é denominada fora do alvo. No presente documento, pode haver um ou mais foras do alvo. Por outro lado, o efeito de divagem da fita dupla ou simples do gene ou ácido nucleico alvo é denominado efeito no alvo, e uma localização ou sequência-alvo do gene ou ácido nucleico alvo é denominado no alvo.
[06 7'71 O mutante de enzima CRISPR é modificado em pelo menos um dos aminoácidos de uma enzima CRISPR de ocorrência natural e pode ser modificado, por exemplo, melhorado ou inibido em uma ou mais das várias características, tais como atividade nuclease, atividade helicase, uma capacidade para interagir com. gRNA, uma capacidade para se aproximar do gene ou ácido nucleico alvo e especificidade de alvo em comparação com a enzima CRISPR não modificada. No presente documento, a modificação pode ser substituição, remoção, adição de um aminoácido ou uma mistura das mesmas.
[0678] No mutante de enzima CRISPR,
a. modificação pode ser uma modificação de um ou dois ou mais aminoácidos localizados em uma região que consiste em aminoácidos que têm cargas positivas, presentes na enzima CRISPR de ocorrência natural.
[0679] Por exemplo, a modificação pode ser uma modificação de um ou dois ou mais aminoácidos dos aminoácidos positivamente carregados, tais como lisina (K), arginina (R) e histidina (H), presentes na enzima CRISPR de
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 179/315 ocorrência natural.
[0680] A modificação pode ser uma modificação de um ou dois ou mais aminoácidos localizados em uma região composta por aminoácidos não positivamente carregados presentes na enzima CRISPR de ocorrência natural.
[0681] Por exemplo, a modificação pode ser uma modificação de um ou dois ou mais aminoácidos dos aminoácidos não positivamente carregados, isto é, ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E) , serina (S), treonina (T), asparagina (N) , glutamina (Q) , cisteína (C) , prolina
(P) , glicina (G) , alanina u 1) , vaiina (V) , isoleucina (I),
leuc ina (L), metionina (M), fenilalani .na (F), tirosina (Y)
e tr iptofano (W), presentes na enzima CRISPR de ocorrência
n a r. u r a 1.
[0682] Em um outro exemplo, a modificação pode ser
uma modif. l· C '3. Ç α O de um. ou doi s ou mais aminoácidos de
aminoácido S Rei O carregados, ist o é, s e r i i ca (S), treonina
(T), aspar agina (N) , glut am. ina. (Q) , c i s t e ína (C) , pro 1 ina
(P) , glici η a (G) f a. .1. a π i π a (A) } \ zalin a (V) , isoleucina (I),
leucina (L), metionina (M), fenilalanina (F), tirosina. (Y) e triptofano (W), presentes na enzima CRISPR de ocorrência natural.
[0683] Além disso, a modifi cação pode ser uma
modificaç ao cie um ou . dois oi a mais dos am i η o á c i d o s qu e têm
resíduos nidrof óbic os pres :entes na enzima CRISPR de
ocorrênci a natural.
[0684] Por exemplo, a modifi .cação pode ser uiria.
modificação de um ou dois ou mais aminoácidos de glicina
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 180/315 (G) , alanina (A), valina (V) , isoleucina (I), leucina (L) , metionina (M) , fenilalanina (F) , tirosina (Y) e triptofano (W) presentes na enzima CRISPR de ocorrência natural.
[0685] A modificação pode ser uma modificação de um ou dois ou mais dos aminoácidos que têm resíduos polares presentes na enzima CRISPR de ocorrência natural.
[0686] Por exemplo, a modificação pode ser uma modificação de um ou dois ou mais aminoácidos de serina (S) , treonina (T), asparagina (N) , glutamina (Q), cisteína (C) , prolina (P) , lisina (K) , arginina (R) , histidina (H) , ácido aspártico (D) e ácido glutâmico (E) presentes na enzima CRISPR de ocorrência natural.
[0687] Além disso, a modificação pode ser uma modificação de um ou dois ou mais dos aminoácidos que incluem lisina (K) , arginina (R) e histidina (H) presentes na enzima CRISPR de ocorrência natural.
[0688] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou dois ou mais dos aminoácidos que incluem lisina (K), arginina (R) e histidina (H) presentes na enzima CRISPR de ocorrência natural.
[0689] A modificação pode ser uma modificação de um ou dois ou mais dos aminoácidos que incluem ácido aspártico (D) e ácido glutâmico (E) presentes na enzima CRISPR de ocorrência natural.
[0690] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou dois ou mais dos aminoácidos que incluem ácido aspártico (D) e ácido glutâmico (E) presentes na enzima CRISPR de ocorrência natural.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 181/315 [0691] A modificação pode ser uma modificação de ura ou dois ou mais dos aminoácidos que incluem serina (S),
treonina (1) , asparagina (N) Λ glt itamina (Q) , cisteína (C),
prolina (P[ } , glicina (G) f al ci R Ί R ci /a' \ ! f vaiina (V) ,
isoleucina •ί I) , leucina í T 1 \ / f me l. 1 O R Ί R ci / Μ \ χ 1 / r fenilalanina
(F) , tirosina (Y) e triptofano (W) presentes na enzima CRISPR de ocorrência natural.
[0692] zr exemplo, a modif! . C ciÇ <3.0 pO08 ser uma
substit ί iiição de um ou dois ou mais dos amino/ icido que
incluem serina (S ), treonina (T), aspai ragina (N), glut ar nina
(Q), ci steína (C) , prolina (P) , glici: na (G) , a 1 a nina (A) ,
v a 11 n a (V), isol eucina (I), leucina (L) , metio! nina (M) ,
fenilalanina (F) , tirosina (Y) e triptofano (W) presentes na enzima CRISPR de ocorrência natural.
[0692 5 J Além d. i s s o, a m o d η. f i c a ç ao p o de se r uniél
modif Z J. C >3. Ç a. C ' de um, dois , três, quatro, c i n c o, se i s, sete Ou
mais QOS ami noácidos 'PI? 6 S 6 H16 S R d. en z ima CRISPR de
ocorrência natural
[ 0 6 9 4 ] Além disso, no mutante de enzima CRISPR,
um. ou a modificação dois ou mais dos amine pode ser n zácidos pre ima modificação de mentes no domínio
RuvC da enzima CRISPR. No presente documento, o domínio
RuvC pode ser um domínio RuvCI, RuvCII ou RuvCIII.
[ 0 6 Q !-λ Ί A modificaç ão pode ser uma modificação de
um ou dois i ou mai s dos amin oácidos presentes no domínio HNH
da enzima CRISPR.
[ 0 6 96] A modificaç ão pode ser uma modificação de
um ou dois i ou mai s dos amin oácidos presentes no domínio REC
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 182/315
142/253 da enzima CRISPR.
[0697] A modificação pode ser um ou dois ou mais dos aminoácidos presentes no domínio PI da enzima CRISPR.
[0698] A modificação pode ser uma modificação de dois ou mais dos aminoácidos contidos em pelo menos dois ou mais domínios dentre os domínios REC, RuvC, HNH e PI da enzima CRISPR.
[0699] Em um exemplo, a modificação pode ser uma modificação de dois ou mais dos aminoácidos contidos nos domínios REC e RuvC da enzima CRISPR.
[0700] Em uma modalidade exemplificativa, no mutante de SpCas9, a modificação pode ser uma modificação de pelo menos dois ou mais dos aminoácidos A203, H277, G366, F539, 1601, M763, D965 e F1038 contidos nos domínios REC e RuvC de SpCas9.
[0701] Em um outro exemplo, a modificação pode ser uma modificação de dois ou mais dos aminoácidos contidos nos domínios REC e HNH da enzima CRISPR.
[0702] Em uma modalidade exemplificativa, no mutante de SpCas9, a modificação pode ser uma modificação de pelo menos dois ou mais dos aminoácidos A203, H277, G366, F539, 1601 e K890 contidos nos domínios REC e HNH de SpCas9.
[0703] Em um exemplo, a modificação pode ser uma modificação de dois ou mais dos aminoácidos contidos nos domínios REC e PI da enzima CRISPR.
[0704] Em uma modalidade exemplificativa, no mutante de SpCas9, a modificação pode ser uma modificação
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 183/315 l· 4 3 / 2 5 3 de pelo menos dois ou mais dos aminoácidos A203, H277, G366, F539, 1601, T1102 e D1127 contidos nos domínios REC e PI de SpCas9.
[0705] Em um outro exemplo, a modificação pode ser uma modificação de três ou mais dos aminoácidos contidos nos domínios REC, RuvC e HNH da enzima CRISPR.
[0706] Em uma modalidade exemplificativa, no mutante de SpCas9, a modificação pode ser uma modificação de pelo menos três ou mais dos aminoácidos A203, H277, G366, F539, 1601, M763, K890, D965 e F1038 contidos nos domínios REC, RuvC e HNH de SpCas9.
[0707] Em um exemplo, a modificação pode ser uma modificação de três ou mais dos aminoácidos contidos nos domínios REC, RuvC e PI contidos na enzima CRISPR.
[07 0 8 ] Em uma modalidade exemplif2 ..cativa, no
mu t.. ante de SpCas9, s i. mo< dificação pode ser uma modificação
de pelo menos três ou mais dos aminoácidos A203, H277,
G366, F539, 1601, M763, D965, F1038, TI102 e Dl127 contidos nos domínios REC, RuvC e PI de SpCas9.
[0709] Em. um outro exemplo, a modificação pode ser uma modificação de três ou mais dos aminoácidos contidos nos domínios REC, HNH e PI da enzima CRISPR.
[0710] Em uma modalidade exemplifícativa, no mutante de SpCas9, a modificação pode ser uma modificação
de pelo meno s três ou mais dos aminoácidos A203, H277,
G366, F539, I 601, K890, T1102 e D1127 contidos nos domínios
REC, HNH e PI de SpCas9.
[0711] Em um exemplo , a m 0 d i f i c a ç ã 0 pode ser uma
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 184/315 modificação de três ou mais dos aminoácidos contidos nos domínios RuvC, HNH e PI da enzima CRISPR.
Figure BR112019012779A2_D0005
D965, F1038, T1102 e D1127 contidos nos domínios RuvC, HNH e PI de SpCas9.
[07131 Em um outro exemplo, a modificação pode ser uma modificação de quatro ou mais dos aminoácidos contidos nos domínios REC, RuvC, HNH e PI da enzima CRISPR.
Figure BR112019012779A2_D0006
de pelo menos quatro ou mais dos aminoácidos Ά.203, H277, G366, F539, 1601, M763, K890, D965, F1038, T1102 e D1127 contidos nos domínios REC, RuvC, HNH e PI de SpCas9.
[0715] Além disso, no mutante de enzima CRISPR, a modificação pode ser uma modificação de um ou dois ou mais dos aminoácidos que participam da atividade nuclease da enzima CRISPR.
[0716] Por exemplo, no mutante de SpCas9, a modificação pode ser uma modificação de um ou dois ou mais do grupo que consiste nos aminoácidos DIO, E762, H840, N854, N8 6 3 e D9 8 6 ou um ou dois ou mais do grupo que consiste nos aminoácidos que correspondem a outros ortólogos de Cas9.
[0717] A modificação pode ser uma modificação para inativar parcialmente a atividade nuclease da enzima
CRISPR, e tal mutante de enzima CRISPR pode ser uma
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 185/315 nickase .
No presente documento, a modificação pode ser uma modificação para inativar a atividade nuclease do domínio RuvC da enzima CRISPR, e tal mutante de enzima
CRISPR pode não clivar uma fita não complementar de um gene ou ácido nucleico alvo, isto é, uma fita que não forma uma ligação complementar com gRNA.
[07191 Em uma modalidade exemplificativa, no caso de SpCas9, quando o resíduo 10 da sequência de aminoácidos de SpCas9 for mutado de ácido aspártico para alanina, isto é, quando mutado para D10A, a atividade nuclease do domínio RuvC é inativada e, dessa forma, a SpCas9 pode ser usada como uma nickase. A nickase produzida, assim, pode não clivar uma fita não complementar do gene ou ácido nucleico alvo, isto é, uma fita que não forma uma ligação complementar com gRN7\.
[0720] Em uma outra modalidade exemplificativa, no caso de CjCas9, quando o resíduo 8 da sequência de aminoácidos de CjCas9 for mutado de ácido aspártico para alanina, isto é, quando mutado para D8A, a atividade nuclease do domínio RuvC é inativada e, dessa forma, a CjCas9 pode ser usada como uma nickase. A nickase produzida, assim, pode não clivar uma fita não complementar do gene ou ácido nucleico alvo, isto é, uma fita que não forma uma ligação complementar com gRNA.
[0721] Além disso, no presente documento, a modificação pode ser uma modificação para inativar a atividade nuclease do domínio HNH da enzima CRISPR, e tal
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6/2 5 3 mutante de enzima CRISPR pode não clivar uma fita complementar do gene ou ácido nucleico alvo, isto é, uma fita que forma uma ligação complementar com gRNA.
[0722] Em uma modalidade exemplificativa, no caso de SpCas9, quando o resíduo 840 da sequência de aminoácidos de SpCas9 for mutado de histidina para alanina, isto é, quando mutado para H840A, a atividade nuclease do domínio HNH é inativada e, dessa forma, a SpCas9 pode ser usada como uma nickase. A nickase produzida, assim, pode não clivar uma fita complementar do gene ou ácido nucleico alvo, isto é, uma fita que forma uma ligação complementar com gRNA.
[0723] Em uma outra modalidade exemplificativa, no caso de CjCas9, quando o resíduo 559 da sequência de aminoácidos de CjCas9 for mutado de histidina para alanina, isto é, quando mutado para H559A, a atividade nuclease do domínio HNH é inativada e, dessa forma, a CjCas9 pode ser usada como uma nickase. A nickase produzida, assim., pode não clivar uma fita complementar do gene ou ácido nucleico alvo, isto é, uma fita que forma uma ligação complementar com gRNA.
[0724] Além disso, a modificação pode ser uma modificação para inativar completamente a atividade nuclease da enzima CRISPR, e tal mutante de enzima CRISPR pode ser uma enzima CRISPR inativa.
[0725] No presente documento, a modificação pode ser uma modificação para inativar as atividades nuclease dos domínios RuvC e HNH da enzima CRISPR, e tal mutante de
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 187/315 enzima CRISPR pode não clivar uma fita dupla do gene ou ácido nucleico alvo.
[0726] Em uma modalidade exemplificativa, no caso de SpCas9, quando os resíduos 10 e 840 na sequência de aminoácidos de SpCas9 forem mutados de ácido aspártico e histidina para alanina, isto é, mutados para D10A e H840A, respectivamente, as atividades nuclease do domínio RuvC e do domínio HNH são inativadas, a fita dupla do gene ou ácido nucleico alvo pode não ser completamente clivada.
[0727] Em uma outra modalidade exemplificativa, no caso de CjCas9, quando os resíduos 8 e 559 da sequência de aminoácidos de CjCas9 forem mutados de ácido aspártico e histidina para alanina, isto é, mutados para D8A e H559A, respectivamente, as atividades nuclease pelos domínios RuvC e HNH são inativadas e, dessa forma, a fita dupla do gene ou ácido nucleico alvo pode não ser completamente clivada.
[0728] Além disso, o mutante de enzima CRISPR pode incluir, ainda, um domínio opcionalmente funcional, além, das características inatas da enzima CRISPR, e tal mutante de enzima CRISPR pode ter uma. característica adicional além, das car a c t e r i s r. i. c a s i n a t a. s .
[0729] No presente documento, o domínio funcional pode ser um domínio que tem atividade metilase, atividade demetilase, atividade de ativação de transcrição, atividade de repressão de transcrição, atividade de fator de liberação de transcrição, atividade de modificação de histona, atividade de divagem de RNA ou atividade de ligação ao ácido nucleico ou uma etiqueta ou gene repórter
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8 / 2 5 3 para isolar e purificar uma proteína (incluindo um peptídeo), mas a presente invenção não se limita aos mesmos.
[0730] O domínio, peptídeo, polipeptídeo proteína funcional pode ser uma deaminase.
[0731] Por exemplo, uma enzima CRISPR incompleta
ou parcial pode adicional mente incluir uma citidina
deaminase como um domínio funcional. Em uma modalidade
exemplificativa, uma citidina deaminase, por exemplo, complexo de edição de apolipoproteins B 1 (APOBEC1), pode ser adicionada à SpCas9 nickase, produzindo, assim, uma proteína de fusão. O [SpCas9 nickase]-[APOBEC1] formado pode, assim, ser usado no reparo de bases ou na edição de C em. T ou U, ou G em. A.
[0732] A etiqueta inclui uma etiqueta de histidina (His), uma etiqueta V5, uma etiqueta FLAG, uma etiqueta de hemaglutinina da gripe (HA), uma etiqueta Myc, uma etiqueta VSV-G e uma etiqueta tiorredoxina (Trx), e o gene repórter inclui glutationa-S-transferase (GST), peroxidase de raiz forte (HRP), cloranfenicol acetiltransferase (CAT) βgalactosidase, β-glucoronidase, luciferase, proteínas autofluorescentes, incluindo a proteína verde fluorescente (GFP), HcRed, DsRed, proteína ciano fluorescente (CFP), proteína amarela fluorescente (YFP) e proteína azul fluorescente (BFP) , mas a presente invenção não se limita às mesmas.
o domínio funcional pode ser uma sequência ou sinal de localizaçao nuclear (NLS) ou uma
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149/253 sequência ou sinal de exportação nuclear (NES).
[0734] Em um exemplo, a enzima CRISPR pode incluir uma ou mais NLSs. No presente documento, uma ou mais NLSs podem ser incluídas em uma terminação N de uma enzima CRISPR ou na proximidade da mesma; uma terminação C da enzima ou na proximidade da mesma; ou uma combinação das mesmas. A NLS pode ser uma sequência NLS derivada das seguintes NLSs, mas a presente invenção não se limita às mesmas: NLS de um antígeno T grande do vírus SV40 que tem a sequência de airiinoácidos FKKRRKV(SEQ ID NO: 55) ; NLS proveniente de nucleoplasmina (por exemplo, NLS de nucleoplasmina bipartida que tem a sequência KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 56) ) ; NLS de c-myc que tem. a sequência de aminoácidos PAAKRVKLD(SEQ ID NO: 57) ou RQRRNELKRSP(SEQ ID NO: 58); NLS de hRNPAl M9 que tem a sequência NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(SEQ ID NO: 59); a sequência
RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(SEQ ID NO: 60) do domínio IBB proveniente da importina-cx; as sequências VSRKRPRP(SEQ ID NO: 61) e PPKKARED(SEQ ID NO: 62) de uma proteína T de mioma; a sequência PQPKKKPL(SEQ ID NO: 63) de p53 humano; a sequência SALIKKKKKMAP (SEQ ID NO: 64) de cabl IV de camundongo; as sequências DRLRR(SEQ ID NO: 65) e
PKQKKRK(SEQ ID NO: 66) de vírus da gripe NS1; a sequência RKLKKKIKKL (SEQ ID NO: 67) de um antígeno do vírus da hepatite delta; a sequência REKKKFLKRR(SEQ ID NO: 68) de uma proteína Mxl de camundongo; a sequência
KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(SEQ ID NO: 69) de uma poli(ADPPetição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 190/315 ribose)polimerase humana;
ou sequência
RKCLQAGMNLEARKTKK{SEQ ID NO: 70) derivada de ama sequência de glicorcoticoides do receptor do hormônio esteroide (humano).
[0735] Além disso, o mutante de enzima CRISPR pode incluir uma enzima CRISPR do tipo dividida preparada dividindo-se a enzima CRISPR em duas ou mais partes. O termo dividir refere-se à divisão funcional ou estrutural de uma proteína ou divisão aleatória de uma proteína em duas ou mais partes.
[0736] No presente documento, a enzima CRISPR do tipo dividida pode ser uma enzima completa, incompleta ou parcialmente ativa ou uma enzima inativa.
[0737] Por exemplo, a SpCas9 pode ser dividida em duas partes entre o resíduo 656, tirosina, e o resíduo 657, treonina, gerando, assim, SpCas9 dividida.
[0738] Além disso, a enzima CRISPR do tipo dividida pode seletivamente incluir um. domínio, peptídeo, polipeptídeo ou proteína adicional para reconstituição.
[0739] No presente documento, a reconstituição refere-se à formação da. enzima CRISPR do tipo dividida de modo a ser estruturalmente igual ou similar à enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0740] O domínio, peptídeo, polipeptídeo ou proteína adicional para reconstituição pode ser domínios de dimerização FRB e FKBP; inteína; domínios ERT e VPR; ou domínios que formam um heterodímero sob condições
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 191/315 [0741] Por exemplo, a SpCas9 pode ser dividida em duas partes entre o resíduo 713, serina, e o resíduo 714, glicina, gerando, assim, SpCas9 dividida. O domínio FRB pode ser conectado a uma das duas partes, e o domínio FKBP pode ser conectado à outra parte. Na SpCas9 dividida assim produzida, o domínio FRB e o domínio FKBP podem ser formados em um dímero em um ambiente no qual rapamicina está presente, produzindo, assim, uma enzima CRISPR reconstituída.
[0742] A enzima CRISPR ou o mutante de enzima CRISPR descrito na presente invenção pode ser um polipeptídeo, proteína ou ácido nucleico que tem uma sequência que codifica o mesmo, e pode ser otimizado por códon para um. indivíduo para introduzir a enzima CRISPR ou mutante de enzima CRISPR.
[0743] O termo otimização por códon refere-se a um. processo para modificar uma. sequência de ácidos nucleicos mantendo-se uma sequência de aminoácidos nativa, enquanto substitui pelo menos um códon da sequência nativa por um. códon utilizado com mais frequência ou o mais frequentemente utilizado em. células hospedeiras de modo a melhorar a expressão nas células hospedeiras. Uma variedade de espécies tem uma predisposição especifica a um códon especifico de um aminoácido específico, e a predisposição de códons (a diferença no uso de códon entre organismos) é frequentemente correlacionada à eficácia da tradução de mRNA, que é considerada dependente da característica de um códon traduzido e da disponibilidade de uma molécula de
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2 / 2 5 3 tRNA específica. A dominância de tRNA selecionado nas células geralmente reflete os códons utilizados com mais frequência na síntese de peptídeos. Portanto, um gene pode ser personalizado por expressão de genes ideal em um determinado organismo com base na otimização por códon.
3. SEQUÊNCIA-ALVO [07441 O termo sequência-alvo é uma sequência de bases presente em um gene ou ácido nucleico alvo e tem complementaridade com uma sequência-guia contida em um dominio-guia de um ácido nucleico-guia. A sequência-alvo é uma sequência de bases que pode variar de acordo com um gene ou ácido nucleico alvo, isto é, um indivíduo para manipulação ou correção de genes, que pode ser projetado de várias formas de acordo com o gene ou ácido nucleico alvo.
[0745] A sequência-alvo pode formar uma ligação complementar com a sequência-guia contida no dominio-guia do ácido nucleico-guia, e um comprimento da sequência-alvo pode ser o mesmo que o da sequência-guia.
[0746] A sequência-alvo pode ser uma sequência de 5 a 50 bases.
[0747] Em uma modalidade, a sequência-alvo pode
ser uma sequência de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou
25 bases.
[0748] A sequência-a ilvo pode ser uma sequência de
ácidos nucleicos complementa r à sequência-guia contida no
dominio-guia do á< sido nuclei co-guia que tem, por exemp] .o,
pelo me η o s 7 0 %, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% ou mais de
complementaridade ou complementaridade completa.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 193/315 [0749] Em um exemplo, a sequência-alvo pode ser ou incluir uma sequência de 1 a 8 bases que não é complementar à sequência-guia contida no domínio-guia do ácido nucleicoguia.
[0750] Além disso, a sequência-alvo pode ser uma sequência de bases adjacente a uma sequência de ácidos nucleicos que tem capacidade para ser reconhecida por uma proteína editora.
[0751] Em um exemplo, a sequência-alvo pode ser uma sequência de 5 a 50 bases contínua adjacente à extremidade 5' e/ou à extremidade 3’ da sequência de ácidos nucleicos que tem capacidade para ser reconhecida pela proteína editora.
[0752] Em uma modalidade exemplificativa, as sequências-alvo para um complexo de gRNA e enzima CRISPR serão descritas abaixo.
[0753] Quando o gene ou ácido nucleico alvo for alvejado pelo complexo de gRNA e enzima CRISPR, a sequência-alvo tem complementaridade com a sequência-guia contida no domínio-guia de gRNA. A sequência-alvo é uma sequência de bases que varia de acordo com o gene ou ácido nucleico alvo, isto é, um indivíduo para manipulação ou correção de genes que pode ser projetado de várias formas de acordo com o gene ou ácido nucleico alvo.
[0754] Além disso, a sequência-alvo pode ser uma sequência de bases adjacente a uma sequência PAM que tem capacidade para ser reconhecida pela enzima CRISPR, isto é,
Cas9 ou Cpfl.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 194/315 [0755] Em urn exemplo, a sequência-alvo pode ser uma sequência de 5 a 50 bases contínua adjacente à extremidade 5 e/ou à extremidade 3’ da sequência PAM que é reconhecida pela enzima CRISPR.
[0756] Em uma modalidade exemplificativa, quando a enzima CRISPR for SpCas9, a sequência-alvo pode ser uma sequência, de 16 a. 2 5 bases contínua adjacente à extremidade 5' e/ou à extremidade 3' de uma sequência 5 ’ -NGG-3', 5'NAG-3' e/ou 5'-NGA-3' (N= A, T, G ou C; ou A, U, G ou C).
[0757] Em uma outra modalidade exemplificativa, quando a enzima CRISPR for StCas9, a sequência-alvo pode ser uma. sequência de 16 a 25 bases contínua adjacente à extremidade 5' e/ou à extremidade 3' de uma sequência 5'NGGNG-3' e/ou 5'-NNAGAAW-3' (W = A ou T, e A, T, G ou C; ou A, U, G ou C) .
[0758] Em ainda uma. outra. modalidade exemplificativa, quando a enzima CRISPR for NmCas9, a sequência-alvo pode ser uma sequência de 16 a 2 5 bases contínua adjacente à extremidade 5 e/ou à extremidade 3' de uma sequência 5’-NNNNGATT-3’ e/ou 5'-NNNGCTT-3 ' (N= A,
T, G ou C; ou A, U, G ou C) .
[0759] Em uma modalidade exemplificativa, quando a enzima CRISPR for CjCas9, a sequência-alvo pode ser uma sequência de 16 a 25 bases contínua adjacente à extremidade 5' e/ou à extremidade 3' de uma sequência 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C ou A; R = A ou G, Y = C ou T, N= A, T, G ou C; ou A,
U, G ou C) .
[0760] Em uma outra modalidade exemplificativa,
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 195/315 quando a enzima CRISPR for SmCas9, sequência-alvo pode ser uma sequência de 16 a 25 bases contínua adjacente à extremidade 5' e/ou à extremidade 3' de uma sequência 5fNGG-3 ' e/ou 5' -NAAR-3> ' (R = A ou G, A, T, G ou C; ou Ά, U, G ou C) .
[0761] Em ainda uma outra modalidade exemplif icativa, quando a enzima. CRISPR for SaCas9, a sequência-alvo pode ser uma sequência de 16 a 2 5 bases contínua adjacente à extremidade 5' e/ou à extremidade 3' de uma sequência 5'-NNGRR-3’, 5'-NNGRRT-3' e/ou 5'-NNGRRV3' (R ------ A ou G, V ------ G, C ou A, N= A, T, G ou C; ou A, U, G ou C) .
[0762] Em uma. modalidade exemplificativa, quando a enzima CRISPR for Cpfl, a sequência-alvo pode ser uma sequência de 16 a 25 bases contínua adjacente à extremidade 5' e/ou à extremidade .3' de uma sequência 5,-ΤΤΝ-3,Γ (N= A, T, G ou C; ou A, U, G ou C) .
[0763] Em uma modalidade exemplificativa da presente invenção, a sequência-alvo pode ser uma sequência de ácidos nucleicos contida em um ou mais crenes
s e 1 e c i c ; nados den tre o grupo que consiste em. um. gene FAI 32,
um gem i FAD3, um gene FAD6, um g< ene FAD7 e um gene FAD 8 .
[07641 '1 1 sequência- alvo pode ser uma sequência de
ácidos nucleicos c o n 11 d a η o gene FAD 2 .
[0765] '1 1 sequência- alvo pode ser uma sequência de
ácidos nucleicos c o n 11 d a η o gene L?AD3 .
[0766] '1 1 sequência- alvo pode ser uma sequência de
ácidos nucleicos contida no gene i?AD6 .
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156/25 3 [0767] A sequência-alvo pode ser uma sequência de ácidos nucleicos contida no gene FAD7.
[0768] A sequência-alvo pode ser uma sequência de ácidos nucleicos contida no gene FAD8.
[0769] Alternativamente, a sequência-alvo pode ser uma sequência parcial de ácidos nucleicos de um ou mais genes selecionados dentre o grupo que consiste em um gene
FAD2, um gene FAD3, um gene FAD6, um gene FAD7 e um gene FAD8 .
[0770] A s e qu ê n c i a - a 1 v o pode 8ΘΓ uma sequência
parcial de ácidos nucleicos do gen e FAD2 *
[0771] A s e qu ê n c i a - a 1 v o pode 8ΘΓ uma sequência
parcial de ácidos nucleicos do gen e FAD3
[0772] A s e qu ê n c i a - a 1 v o pode ser uma. sequência
parcial de ácidos nucleicos do gen e FAD6 *
[0773] A s e qu ê n c i a - a 1 v o pode ser uma. sequência
parcial de ácidos nucleicos do gen e FAD7
[0774] A s e qu ê n c i a - a 1 v o pode ser uma. sequência
parcial de ácidos nucleicos do gen e FAD8
[0775] Alternativamente, a sequência-alvo pode ser uma sequência de ácidos nucleicos da região de codificação ou de não codificação ou uma mistura das mesmas de um ou mais genes selecionados dentre o grupo que consiste em um gene FAD2, um gene FAD3, um gene FAD6, um gene FAD7 e um gene FAD8.
[0776] A sequência-alvo pode ser uma sequência de
ácidos nucleicos da região de codificação ou de i são
codifi cação ou ume i mistura das me smas do gene FAD2.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 197/315 [0777] A sequência-alvo pode ser uma sequência de ácidos nucleicos da região de codificação ou de não codificação ou uma mistura das mesmas do gene FAD3.
[0778] A sequência-alvo pode ser uma sequência de ácidos nucleicos da região de codificação ou de não codificação ou uma mistura das mesmas do gene FAD6.
[0779] A sequência-alvo pode ser uma sequência de ácidos nucleicos da região de codificação ou de não codificação ou uma mistura das mesmas do gene FAD7.
[0780] A sequência-alvo pode ser uma sequência de ácidos nucleicos da região de codificação ou de não codificação ou uma mistura das mesmas do gene FAD8.
[0781] Alternativamente, a sequência-alvo pode ser uma sequência de ácidos nucleicos da região promotora, intensificadora, UTR 3' ou poliadenila (poliA) ou uma mistura das mesmas de um ou mais genes selecionados dentre o grupo que consiste em um. gene FAD2, um gene FAD3, um gene FA.D6, um gene FAD7 e um gene FAD8 .
[0782] A sequência-alvo pode ser uma sequência de ácidos nucleicos da região promotora, intensificadora, UTR 3' ou poliadenila. (poliA) ou uma mistura das mesmas do gene FAD2 .
[0783] A sequência-alvo pode ser uma sequência de ácidos nucleicos da região promotora, intensificadora, UTR 3' ou poliadenila (poliA) ou uma mistura das mesmas do gene FAD3 .
[0784] A sequência-alvo pode ser uma sequência de ácidos nucleicos da região promotora, intensificadora, UTR
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 198/315
8 / 2 5 3 ou poliadenila (poliA) ou uma mistura das mesmas do gene [0785] A sequência-alvo pode ser uma sequência de ácidos nucleicos da região promotora, intensificadora, UTR 3 ou poliadenila (poliA) ou uma mistura das mesmas do gene FAD 7 .
[0786] A sequência-alvo pode ser uma sequência de ácidos nucleicos da região promotora, intensificadora, UTR 3' ou poliadenila (poliA) ou uma mistura das mesmas do gene FAD 8 .
[0787] Alternativamente, a sequência-alvo pode ser uma sequência de ácidos nucleicos de um éxon, um intron ou
uma misto sra dos mesmos de um. ( au mais genes s e 1 e c i o n a d o s
dentre o grupo que cons iste em um gene FAD2, um. gene FAD.3,
um gene FAD6, um gene F2 [0788] A sequêr ID 7 e um icia-alvo gene FAD8. pode ser uma sequência de
ácidos nu ciei cos de um éxon, um intron ou uma mistura dos
mesmos do [0789] gene FAD2. A sequêr icia-alvo pode ser uma sequência de
ácidos nu cieicos de um éxon, um intron ou uma mistura dos
mesmos do [ 0790 ] gene FAD3. A sequêr icia-alvo pode ser uma sequência de
ácidos nu cleicos de um éxon, um intron ou uma mistura dos
mesmos do [ 0791 ] gene FAD6 . A sequêr icia-alvo pode ser uma sequência de
ácidos nu cleicos de um éxon, um intron ou uma mistura dos
mesmos d. o [07921 gene FAD 7. A sequêr icia-alvo pode ser uma sequência de
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 199/315 ácidos nucleicos de um éxon, um intron ou uma mistura dos mesmos do gene FAD8 .
[0793] Alternativamente, a sequência-alvo pode ser uma sequência de ácidos nucleicos que inclui uma região mutada ou adjacente à mesma (por exemplo, uma região diferente de um gene do tipo selvagem) de um ou mais genes selecionados dentre o grupo que consiste em um gene FAD2, um gene FAD3, um gene FAD6, um gene FAD7 e um gene FAD8.
[0794] A sequência-alvo pode ser uma sequência de ácidos nucleicos que inclui uma região mutada ou adjacente à mesma do gene FAD2.
[0795] A sequência-alvo pode ser uma sequência de ácidos nucleicos que inclui uma região mutada ou adjacente à mesma do gene FAD3.
[0796] A sequência-alvo pode ser uma sequência de ácidos nucleicos que inclui uma região mutada ou adjacente à mesma do gene FAD6.
[0797] A sequência-alvo pode ser uma sequência de ácidos nucleicos que inclui uma região mutada ou adjacente à mesma do gene FAD7.
[0798] A sequência-alvo pode ser uma sequência de ácidos nucleicos que inclui uma região mutada ou adjacente à mesma do gene FAD8.
[0799] Alternativamente, a sequência-alvo pode ser uma sequência de 5 a 50 ácidos nucleicos contínua de um ou mais genes selecionados dentre o grupo que consiste em um gene FAD2, um gene FAD3, um gene FAD6, um gene FAD7 e um gene FAD8.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 200/315 [0800] A sequência-alvo pode ser uma sequência de a 50 ácidos nucleicos contínua do gene FAD2 .
[0801] A sequência-alvo pode ser uma sequência de a 50 ácidos nucleicos contínua do gene FAD3 .
[0802] A sequência-alvo pode ser uma sequência de a 50 ácidos nucleicos contínua do gene FAD6.
[0803] A sequência-alvo pode ser uma sequência de a 50 ácidos nucleicos contínua do gene FAD'7.
[0804] A sequência-alvo pode ser uma sequência de a 50 ácidos nucleicos contínua do gene FAD8.
[0805] Como uma modalidade exemplificativa da presente invenção, as sequências-alvo do gene FAD2 acima são resumidas na Tabela 1.
[PRODUTO MANIPULADO POR FATOR ASSOCIADO À. BIOSSÍNTESE DE ÁCIDOS GRAXOS INSATURADOS]
4. COMPLEXO DE ÁCIDOS NUCLEICOS-GUIA E PROTEÍNAS EDITORAS E USO DO MESMO [0806] Um. complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia pode modificar um alvo.
[ 080’7] Por exemplo, o complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia pode ser usado para ultimamente regular (por exemplo, inibir, suprimir, reduzir, aumentar ou promover) a expressão de uma proteína de interesse, remover uma proteína, regular (por exemplo, inibir, suprimir, reduzir, aumentar ou promover) a atividade de proteína ou expressar uma nova proteína.
[0808] No presente documento, o complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia pode atuar em um
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 201/315 nível de DNA, RNA, gene ou cromossômico.
[0809] Por exemplo, o complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia pode regular (por exemplo, inibir, suprimir, reduzir, aumentar ou promover) a expressão de uma proteína codificada por DNA-alvo, remover uma proteína, regular (por exemplo, inibir, suprimir, reduzir, aumentar ou promover) a atividade de proteína ou expressar uma proteína modificada através da manipulação ou modificação do DNA-alvo.
[0810] Em um outro exemplo, o complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia pode regular (por exemplo, inibir, suprimir, reduzir, aumentar ou promover) a expressão de uma proteína codificada por DNAalvo, remover uma proteína, regular (por exemplo, inibir, suprimir, reduzir, aumentar ou promover) a atividade de proteína ou expressar uma proteína modificada através da manipulação ou modificação de RNA-alvo.
[0811] exemplo, o complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia pode regular (por exemplo, inibir, suprimir, reduzir.
aumentar ou promover) expressão de uma proteína codificada por DNA-alvo, remover uma proteína, regular (por exemplo, inibir, suprimir, reduzir, aumentar ou promover) a atividade de proteína ou expressar uma proteína modificada através da manipulação ou modificação de um gene-alvo.
[0812] Em um outro exemplo, o complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia pode regular (por exemplo, inibir, suprimir, reduzir, aumentar ou
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 202/315 promover) a expressão de uma proteína codificada por DNAalvo, remover uma proteína, regular (por exemplo, inibir, suprimir, reduzir, aumentar ou promover) a atividade de proteína ou expressar uma proteína modificada através da manipulação ou modificação de um cromossomo-alvo.
[0813] O complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia pode atuar na transcrição do gene e nos estágios de tradução.
[0814] Em um exemplo, o complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia pode promover ou suprimir a transcrição de um gene-alvo, regulando, assim, (por exemplo, inibindo, suprimindo, reduzindo, aumentando ou promovendo) a expressão de uma proteína codificada pelo gene-alvo.
[0815] Em um outro exemplo, o complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia pode promover ou suprimir a tradução de um gene-alvo, regulando, assim, (por exemplo, inibindo, suprimindo, reduzindo, aumentando ou promovendo) a expressão de uma proteína codificada pelo gene-alvo.
[0816] O complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia pode atuar em um nível de proteína.
[0817] Em um exemplo, o complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia pode manipular ou modificar uma proteína-alvo, removendo, assim, a proteínaalvo ou regulando (por exemplo, inibindo, suprimindo, reduzindo, aumentado ou promovendo) a atividade de proteína.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 203/315 rnece modalidade um complexo exemplificativa de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia usado para manipular um fator associado à biossíntese de ácidos grax insaturado exemplo, um gene FAD, de preferência, um gene FAD2, um gene FAD3, um gene FAD6, um gene FAD7 e/ou um gene FAD8. De preferência, é fornecido um complexo de gRNA e enzima CRISPR.
articularme a presente invenção pode fornecer gRNA que inclui um domínio-guia com capacidade rmar uma ligaçao complementar com uma de um gene, por exemplo, gRNA isolado ou não natural e DNA que codifica o mesmo. 0 gRNA e a sequência de DNA que codifica o mesmo podem ser projetados de modo a terem, capacidade para se ligar de modo complementar a uma sequência-alvo listada na Tabela 1.
[0820] Além disso, uma região-alvo do gRNA é projetada para, fornecer um. terceiro gene que tem uma modificação de ácido nucleico, por exemplo, rupturas de fita dupla ou simples; ou uma função específica em um. sítio-alvo em um gene FAD2, um gene FAD3, um gene FA.D6, um. gene FAD7 e/ou um gene FAD8.
[0821] Além disso, quando dois ou mais gRNAs forem usados para induzir dois ou mais eventos de divagem em um gene-alvo, por exemplo, uma ruptura de fita dupla ou simples, os dois ou mais eventos de divagem podem ocorrer devido às proteínas Cas9 iguais ou diferentes.
[0822] O gRNA pode alvejar, por exemplo, dois ou
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 204/315 mais dentre o gene FAD2, o gene FAD3, o gene FAD6, o gene FAD7 e/ou o gene FAD8, ou duas ou mais regiões em cada um dentre o gene FAD2, o gene FAD3, o gene FAD6, o gene FAD7 e/ou o gene FAD8, e pode independentemente induzir a divagem de uma fita dupla e/ou a fita simples do gene FAD2, do gene FAD3, do gene FAD6, do gene FAD7 e/ou do gene FAD8, ou pode induzir a inserção de um nucleotideo estranho em um sitio de divagem do gene FAD2, do gene FAD3, do gene FAD6, do gene FAD7 e/ou do gene FAD8.
[08231 Além disso, em uma outra modalidade exemplificativa da presente invenção, um ácido nucleico que constitui o complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia pode incluir:
(a) uma sequência que codifica um ácido nucleico-guia que inclui um domínio-guia que é complementar a uma sequência-alvo do gene FAD2, conforme descrito no presente documento; e (b) uma sequência que codifica uma proteína eaitora.
[0824] No presente documento, pode haver duas ou mais do (a) de acordo com a região-alvo e (b) pode empregar as mesmas proteínas editoras ou duas ou mais proteínas editoras.
[0825] Em uma modalidade, o ácido nucleico pode ser projetado para alvejar uma proteína editora enzimaticamente inativa ou uma proteína de fusão (por
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 205/315 exemplo, uma fusão de domínio repressor de transcrição) da mesma para colocá-lo suficientemente adjacente a um sítioalvo de knockdown a fim de reduzir, diminuir ou inibir a expressão do gene FAD2 .
[0826] Além disso, deve ser óbvio que a estrutura, função e todas as aplicações descritas acima do complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia serão utilizadas na manipulação do gene FAD2, do gene FAD3, do gene FAD6, do gene FAD'7 e/ou do gene FAD8 .
USO DE COMPLEXO DE PROTEÍNAS EDITORAS E ÁCIDOS NUCLEICOS-GUIA [ 082'7] Em uma modalidade para o uso do complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia da presente invenção, a manipulação ou modificação de DNA-alvo, RNA, genes ou cromossomas com o uso do complexo de gRNA e enzima
CRISPR será descrita abaixo.
MANIPULAÇÃO DE GENE [0828] Um. gene ou ácido nucleico alvo pode ser manipulado ou corrigido com o uso do complexo de gRNA e enzima CRISPR descrito acima, isto é, o complexo CRISPR. No presente documento, a manipulação ou correção do gene ou ácido nucleico alvo inclui todos os estádios de i) clivar ou danificar o gene ou ácido nucleico alvo e ii) reparar o gene ou ácido nucleico alvo danificado.
1) CLIVAGEM OU DANO DE GENE OU ÁCIDO NUCLEICO ALVO [0829] i) A clivagem ou dano do gene ou ácido nucleico alvo pode ser a clivagem ou dano do gene ou ácido
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6/2 5 3 nucleico alvo com o uso do complexo CRISPR e, particularmente, a divagem ou dano de uma sequência-alvo no gene ou ácido nucleico alvo.
[0830] Em um exemplo, a divagem ou dano do gene ou ácido nucleico alvo com o uso do complexo CRISPR pode ser a divagem ou dano completo à fita dupla de uma sequência-alvo.
[0831] Em uma modalidade exemplificativa, quando a SpCas9 do tipo selvagem for usada, a fita dupla de uma sequência-alvo que forma uma ligação complementar com gRNA pode ser completamente clivada.
[0832] Em uma outra modalidade exemplificativa, quando SpCas9 nickase (D10A) e SpCas9 nickase (H840A) forem, usadas, uma fita simples complementar de uma sequência-alvo que forma uma ligação complementar com gRNA pode ser clivada pela SpCas9 nickase (D10A), e uma fita simples não complementar da sequência-alvo que forma uma ligação complementar com. gRNA pode ser clivada pela SpCas9 nickase (Η840Ά), e as divagens podem ocorrer sequencial ou simultaneamente.
[0833] uma.
o u t r a. m o d a 1 i d a d e exemplificativa, quando SpCas9 nickase (D10A) e SpCas9 nickase (H840A) e dois gRNAs que têm sequências-alvo diferentes forem usados, uma fita simples complementar de uma sequência-alvo que forma uma ligação complementar com o primeiro gRNA pode ser clivada pela SpCas9 nickase (D10A), uma fita simples não complementar de uma sequência-alvo que forma uma ligação complementar com o segundo gRNS pode ser
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 207/315 clivada pela SpCas9 nickase (H840A) e as clivagens podem ocorrer sequencial ou simultaneamente.
[0834] Em um outro exemplo, a divagem ou dano de um gene ou ácido nucleico alvo com o uso do complexo CRISPR pode ser a divagem ou dano apenas à fita simples de uma sequência-alvo. No presente documento, a fita simples pode ser uma fita simples complementar de uma sequência-alvo que forma uma ligação complementar com gRNA ou uma fita simples não complementar da sequência-alvo que forma uma ligação complementar com gRNA.
[0835] Em uma modalidade exemplificativa, quando SpCas9 nickase (D10A) for usada, uma fita simples complementar de uma sequência-alvo que forma uma ligação complementar com. gRNA pode ser clivada pela SpCas9 nickase (D10A), mas uma fita simples não complementar da sequênciaalvo que forma uma ligação complementar com. gRNA pode não ser clivada.
[0836] Em uma outra modalidade exemplificativa, quando SpCas9 nickase (H.840A) for usada, uma. fita simples complementar de uma sequência-alvo que forma uma. ligação complementar com. gRNA pode ser clivada pela SpCas9 nickase (H840A), mas uma fita simples não complementar da sequência-alvo que forma uma ligação complementar com gRNA pode não ser clivada.
[0837] Em ainda um outro exemplo, a divagem ou dano de um gene ou ácido nucleico alvo com o uso do complexo CRISPR pode ser a remoção parcial de um fragmento de ácido nucleico.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 208/315 [0838] Em uma modalidade exemplificativa, quando dois gRNAs que têm sequências-alvo diferentes e SpCas9 do tipo selvagem forem usados, uma fita dupla de uma sequência-alvo que forma uma ligação complementar com o primeiro gRNA pode ser clivada, e uma fita dupla de uma sequência-alvo que forma uma ligação complementar com o segundo gRNA pode ser clivada, resultando na remoção de fragmentos de ácido nucleico pelo primeiro e segundo gRNAs e pela SpCas9.
[0839] Em uma outra modalidade exemplificativa, quando dois gRNAs que têm sequências-alvo diferentes, SpCas9 do tipo selvagem, SpCas9 nickase (D10A) e SpCas9 nickase (H840A) forem usados, uma fita dupla de uma sequência-alvo que forma uma ligação complementar com o primeiro gRNA pode ser clivada pela SpCas9 do tipo selvagem, uma fita simples complementar de uma sequênciaalvo que forma uma ligação complementar com o segundo gRNA pode ser clivada pela SpCas9 nickase (D10A) e uma fita simples não complementar pode ser clivada pela SpCas9 nickase (H840A), resultando na remoção de fragmentos de ácido nucleico pelo primeiro e segundo gRNAs, pela SpCas9 do tipo selvagem, pela SpCas9 nickase (D10A) e pela SpCas9 nickase (H840A).
[0840] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, quando dois gRN21s que têm sequências-alvo diferentes, SpCas9 nickase (D10A) e SpCas9 nickase (H840A) forem usados, uma fita simples complementar de uma sequência-alvo que forma uma ligação complementar com o
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 209/315 primeiro gRNA pode ser clivada pela SpCas9 nickase (D10A), uma fita simples não complementar pode ser clivada pela SpCas9 nickase (H840A), uma fita dupla complementar de uma sequência-alvo que forma uma ligação complementar com o segundo gRNA pode ser clivada pela SpCas9 nickase (D10A) e uma fita simples não complementar pode ser clivada pela SpCas9 nickase (H840A), resultando na remoção de fragmentos de ácido nucleico pelo primeiro e segundo gRNAs, pela SpCas9 nickase (D10A) e pela SpCas9 nickase (H840A).
[08411 Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, quando três gRNAs que têm sequências-alvo diferentes, SpCas9 do tipo selvagem, SpCas9 nickase (D10A) e SpCas9 nickase (H840A) forem usados, uma fita dupla de uma sequência-alvo que forma uma ligação complementar com o primeiro gRNA pode ser clivada pela SpCas9 do tipo selvagem, uma fita simples complementar de uma sequênciaalvo que forma uma ligação complementar com o segundo gRNA pode ser clivada pela SpCas9 nickase (D10A) e uma fita simples não complementar de uma sequência-alvo que forma uma ligação complementar com. o terceiro gRNA pode ser clivada pela SpCa.s9 nickase (H840A) , resultando na. remoção de fragmentos de ácido nucleico pelo primeiro gRNA, pelo segundo gRNA, pelo terceiro gRNA, pela SpCas9 do tipo selvagem, pela SpCas9 nickase (D10A) e pela SpCas9 nickase (H840A).
[0842] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, quando quatro gRNAs que têm sequênciasalvo diferentes, SpCas9 nickase (D10A) e SpCas9 nickase
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(H840A) foram usadc >s, uma fita simples compl ementar de uma
S Θ Cf u Θ R C X a-alvo θ' ό e forma uma ligação compl ementar com o
primeiro gRNA pode ser clivada pela Sr ) C_. ο. s n ickase (D10A),
uma fita simples não complementar de uma sequência-alvo que forma uma ligação complementar com o segundo gRNA pode ser clivada pela SpCas9 nickase (H840A), uma fita simples complementar de uma sequência-alvo que forma uma ligação complementar com o terceiro gRNA pode ser clivada pela SpCas9 nickase (D10A) e uma fita simples não complementar de uma sequência-alvo que forma uma ligação complementar com o quarto gRNA pode ser clivada pela SpCas9 nickase (H840A), resultando na remoção de fragmentos de ácido nucleico pelo primeiro gRNA, pelo segundo gRNA, pelo terceiro gRNA, pelo quarto gRNA, pela SpCas9 nickase (D10A) e pela SpCas9 nickase (H840A).
II) REPARO OU RESTAURAÇÃO DE GENE OU ÁCIDO
NUCLEICO ALVO DANIFICADO
[0843] 0 gene ou ácido nucleicc ) alvo clivado ou
danificac io pelo complexo CRISPR pode ser reparado ou
restaurac io através da união de extremida des não homólogas
(NHEJ) e reparo di recionado por homologia. (HDR).
UNIÃO DE EXTREMIDADES NAO HOMÓLOGAS (NHEJ) [0844] NHEJ é um método de restauração ou reparo de rupturas de fita dupla no DNA unindo-se ambas as extremidades de uma fita dupla ou simples clivada e, geralmente, quando duas extremidades compatíveis formadas por meio da ruptura da fita dupla (por exemplo, clivagem) estiverem frequentemente em contato uma com a outra para
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 211/315 unir completamente as duas extremidades, a fita dupla romoida recuperad
A NHEJ é um método de tauraçao que tem capacidade para ser usado em todo o ciclo celular e normalmente ocorrer quando não há genoma homólogo para ser usado como um modelo em células, como a fase G1.
No processo de reparo do gene ou ácido .eico danificad uso de NHEJ gumas riser ecoes com nucleicos ocorrem na região reparada por NHEJ, tais inserções deleções fazem com que a estrutura principal seja deslocada, resultando no mRNA de transcriptoma com deslocamento da estrutura. Como resultado, funções inatas são perdidas devido ao decaimento mediado por sem. sentido ou à faina em sintetizar proteínas normais. Além disso, embora a estrutura principal seja mantida, mutações nas quais a inserção ou deleção de uma quantidade considerável de sequência podem, provocar a destruição da funcionalidade das proteínas. A mutação é dependente de locus devido à mutação, em um. domínio funcional significativo, ser provavelmente menos tolerada que as mutações em uma região não significativa de uma proteína.
[0846] Embora seja impossível esperar mutações de indel produzidas por NHEJ em um estado natural, uma sequência indel específica é preferencial em uma determinada região rompida e pode ser proveniente de uma pequena região de micro-homologia. Convencionalmente, o comprimento de deleção varia de 1 bp a 50 bp, as inserções tendem a ser mais curtas e frequentemente incluem uma
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 212/315 sequência de repetição curta que circunda diretamente uma r e g i a o r o mp ida.
[0847] Além disso, a NHEJ é um processo que provoca uma mutação e, quando não for necessário produzir uma sequência final específica, pode ser usada para deletar um motivo da sequência pequena.
[0848] Um knockout específico de um gene alvejado pelo complexo CRISPR pode ser realizado com o uso de tal NHEJ. Uma fita dupla ou duas fitas simples de um gene ou ácido nucleico alvo podem ser clivadas com o uso da enzima CRISPR, tal como Cas9 ou Cpfl, e a fita dupla ou duas fitas simples rompidas do gene ou ácido nucleico alvo podem ter inserções de deleções através da NHEJ, induzindo, assim, knockout específico do gene ou ácido nucleico alvo. No presente documento, o sítio de um gene ou ácido nucleico alvo clivado pela enzima CRISPR pode ser uma região de não codificação ou de codificação e, além disso, o sítio do gene ou ácido nucleico alvo restaurado por NHEJ pode ser uma região de não codificação ou de codificação.
REPARO DIRECIONADO POR HOMOLOGIA (HDR) [0849] HDR é um método de correção sem erro que usa uma sequência homóloga como um modelo para o reparo ou a restauração de um gene ou ácido nucleico danificado e, geralmente, para o reparo ou a restauração de DNA rompido, isto é, para restaurar informações inatas de células, sendo que o DNA rompido é reparado com o uso de informações de uma sequência de bases complementar que não é modificada ou informações de um cromatídeo-írmão. O tipo mais comum de
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HDR é recombinaçao homóloga (HR). HDR é um método de reparo ou restauração que ocorre normalmente na fase S ou G2/M de células ativamente em divisão.
[0850]
Para reparar ou restaurar DNA danificado com o uso de HDR, em vez de usar uma sequência de bases complementar ou cromatina-irma das células, um modelo de
DNA artificialmente sintetizado com o uso de informações de uma sequência de bases complementar ou sequência de bases homóloga, isto é, um modelo de ácido nucleico que inclui uma sequência de bases complementar ou sequência de bases homóloga, pode ser fornecido às células, reparando, assim, o DNA rompido. No presente documento, quando uma sequência de ácidos nucleicos ou fragmento de ácido nucleico for, ainda, adicionado ao modelo de ácido nucleico para reparar o DNA rompido, a sequência de ácidos nucleicos ou fragmento de ácido nucleico, ainda, adicionado ao DNA rompido pode ser submetida a knockin. A sequência de ácidos nucleicos ou fragmento de ácido nucleico, ainda, adicionado pode ser uma sequência de ácidos nucleicos ou fragmento de ácido nucleico para corrigir o gene ou ácido nucleico alvo modificado por meio de uma mutação para um. gene ou ácido nucleico normal, ou um gene ou ácido nucleico a ser expresso em células, mas a presente invenção não se limita aos mesmos.
[0851] Em um exemplo, uma fita dupla ou simples de um gene ou ácido nucleico alvo pode ser clivada com o uso do complexo CRISPR, um modelo de ácido nucleico que inclui uma sequência de bases complementar a uma sequência de
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 214/315 bases adjacente ao sítio de clivagem pode ser fornecido às células e a sequência de bases clivada do gene ou ácido nucleico alvo pode ser reparada ou restaurada através de HDR« [0852] No presente documento, o modelo de ácido nucleico que inclui a sequência de bases complementar pode ter DNA rompido, isto é, uma fita dupla ou simples clivada de uma sequência de bases complementar, e incluir, ainda, uma sequência de ácidos nucleicos ou fragmento de ácido nucleico a ser inserido no DNA rompido. Uma sequência de ácidos nucleicos ou fragmento de ácido nucleico adicional pode ser inserido em um sitio clivado do DNA rompido, isto é, o gene ou ácido nucleico alvo que usa o modelo de ácido nucleico que inclui uma sequência de ácidos nucleicos ou fragmento de ácido nucleico a ser inserido na sequência de bases complementar. No presente documento, a sequência de ácidos nucleicos ou fragmento de ácido nucleico a ser inserido e a sequência de ácidos nucleicos ou fragmento de ácido nucleico adicional podem ser uma sequência de ácidos nucleicos ou fragmento de ácido nucleico para corrigir um.
gene ou ácido I lucleico alvo modificado por uma mutação em.
um gene ou ác ido nucleico normal ou um gene ou áci do
nucleico a ser expresso em células. A sequência de bas es
complementar p< ode ser uma sequência de bases que t em
ligações comple: mentares com ] DNA rompido, isto é, sequênci as
de bases à direita e à esquerda da fita dupla ou simples clivada do gene ou ácido nucleico alvo. Alternativamente, a sequência de bases complementar pode ser uma sequência de
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 215/315 bases que tem ligações complementares com DNA rompido, isto é, extremidades 3' e 5' da fita dupla ou simples clivada do gene ou ácido nucleico alvo. A sequência de bases complementar pode ser uma sequência de 15 a 3.000 bases, um comprimento ou tamanho da sequência de bases complementar pode ser adequadamente projetado de acordo com um tamanho do modelo de ácido nucleico ou do gene-alvo. No presente documento, como o modelo de ácido nucleico, um ácido nucleico de fita dupla ou simples pode ser usado, ou o mesmo pode ser linear ou circular, mas a presente invenção não se limita aos mesmos.
[08531 Em um outro exemplo, um gene ou ácido nucleico alvo de fita dupla ou simples é clivado com o uso do complexo CRISPR, um modelo de ácido nucleico que inclui uma sequência de bases homóloga com uma sequência de bases adjacente a um. sítio de divagem é fornecido às células e a sequência, de bases clivada do gene ou ácido nucleico alvo pode ser reparada, ou restaurada por HDR.
[0854] No presente documento, o modelo de ácido nucleico que inclui a sequência de bases homóloga, pode ser DNA rompido, isto é, uma. sequência de bases homóloga de fita dupla ou simples clivada, e incluir, ainda, uma sequência de ácidos nucleicos ou fragmento de ácido nucleico a ser inserido no DNA rompido. Uma sequência de ácidos nucleicos ou fragmento de ácido nucleico adicional pode ser inserido no DNA rompido, isto é, um sítio clivado de um gene ou ácido nucleico alvo com o uso do modelo de ácido nucleico que inclui uma sequência de bases homóloga e
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6/2 5 3 uma sequência de ácidos nucleicos ou fragmento de ácido nucleico a ser inserido. No presente documento, a sequência de ácidos nucleicos ou fragmento de ácido nucleico a ser inserido e a sequência de ácidos nucleicos ou fragmento de ácido nucleico adicional podem ser uma sequência de ácidos nucleicos ou fragmento de ácido nucleico para corrigir um
gene ou ácido nucleico alvo modi . f .1 cado por uma mut aç ; a o em
um gene ou á oido nuc .1 e i c ο η o r i nal ou um gene 3 ou a c ido
nu c 1 e 2. c o a sei 2 express o em célu i -j s-. a .1. cl o ♦ .rt sequenc .1 .a de ba ses
homóloga pode ser DNA rompido, .isto é , uma se Bquênc ϊ a de
bases que tem homologia com sequência de bases de fita dupla ou sequências de bases de fita simples à esquerda e à direita clivadas de um gene ou ácido nucleico alvo. Alternativamente, a sequência de bases complementar pode ser uma sequência de bases que tem homologia com DNA rompido, isto é, as extremidades 3' e 5' de uma fita dupla ou simples clivada de um gene ou ácido nucleico alvo. A sequência de bases homóloga pode ser uma sequência de 15 a 3.000 bases, e um. comprimento ou tamanho da sequência de bases homóloga pode ser adequadamente projetado de acordo com um. tamanho do modelo de ácido nucleico ou um. gene ou ácido nucleico alvo. No presente documento, como o modelo de ácido nucleico, um ácido nucleico de fita dupla ou simples pode ser usado e pode ser linear ou circular, mas a presente invenção não se limita aos mesmos.
[0855] Diferentemente da NHEJ e do HDR, há métodos de reparo ou restauração de DNA rompido.
ANELAMENTO DE FITA SIMPLES (SSA)
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 217/315 [0856] SSA é um método de reparo de rupturas de fita dupla entre duas sequências de repetição presentes em um ácido nucleico-alvo e, geralmente, usa uma sequência de repetição de mais de 30 bases. A sequência de repetição é clivada (para ter extremidades pegajosas) para ter uma fita simples em relação a uma fita dupla do ácido nucleico-alvo em cada uma das extremidades rompidas e, após a divagem, uma projeção de fita simples que contém a sequência de repetição é revestida com uma proteína RPA de modo que o anelamento impróprio das sequências de repetição umas com as outras seja impedido. RAD52 se liga a cada sequência de repetição na projeção, e uma sequência com capacidade para anelar uma sequência de repetição complementar é disposta. Após o anelamento, uma aba de fita simples da projeção é clivada, e a síntese de novo DNA preenche uma determina lacuna para restaurar uma fita dupla de DMA. Como resultado desse reparo, uma sequência de DNA entre duas repetições é deletada, e um comprimento de deleção pode depender de vários fatores, incluindo as localizações das duas repetições usadas no presente documento e uma trajetória ou grau do processo de clivagem.
[0857] SSA, similar ao HDR, utiliza uma sequência complementar, isto é, uma sequência de repetição complementar e, em contrapartida, não requer um modelo de ácido nucleico para modificar ou corrigir uma sequência de ácidos nucleicos-alvo.
REPARO DE RUPTURA DE FITA SIMPLES (SSBR) [0858] Rupturas de fita simples em um genoma são
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8 / 2 5 3 reparadas através de um mecanismo separado, SSBR, dos mecanismos de reparo descritos acima. No caso de rupturas de DNA de fita simples, PARP1 e/ou PARP2 reconhecem as rupturas e recrutam um mecanismo de reparo. A ligação a PARP1 e a atividade em relação às rupturas de DNA são temporárias, e SSBR é promovido por meio da promoção da estabilidade de um complexo de proteínas de SSBR nas regiões danificadas. A proteína mais importante no complexo de SSBR é XRCC1 que interage com uma proteína que promove o processamento das extremidades 3' e 5' do DNA para estabilizar o DNA. 0 processamento de extremidade está geralmente envolvido no reparo da extremidade 3' danificada para um. estado hidroxilado e/ou da extremidade 5' danificada para uma porção química fosfática e, após as extremidades serem processadas, ocorre o preenchimento de lacunas de DNA. Há dois métodos para o preenchimento de lacunas de DNA, isto é, um reparo de remendo curto e um. reparo de remendo longo, e o reparo de remendo curto envolve a inserção de uma única base. Após o preenchimento de lacunas de DNA, uma DNA ligase promove a união das extremidades.
REPARO DE DISPARIDADES (MMR) [0859] MMR trabalha em bases de DNA díspares. Cada um dentre um complexo MSH2/6 ou MSH2/3 tem atividade ATPase e, dessa forma, desempenha um importante papel no reconhecimento de uma disparidade e na inicialização de um reparo, e o MSH2/6 reconhece principalmente disparidades base-base e identificai uma ou duas disparidades de base,
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 219/315 mas o MSH2/3 reconhece principalmente uma disparidade maior.
REPARO POR EXCISÃO DE BASE (BER) [0860] BER é um método de reparo que é ativo ao longo de todo o ciclo celular e usado para remover uma pequena região danificada da base sem distorção da hélice do genoma. No DNA danificado, bases danificadas são removidas clivando-se uma ligação N-glicosídeo que une uma
Figure BR112019012779A2_D0007
fita simples rompidas, assim, formadas foram removidas, uma lacuna gerada devido à fita simples removida é preenchida com uma nova base complementar e, então, uma extremidade da complementar recém-preenchida é ligada à cadeia principal por uma DNA ligase, resultando no reparo do DNA danificado.
REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS (NER) [0861] NER é um mecanismo de excisão importante para remover danos de grande distorção de hélice do DNA e, quando o dano for reconhecido, uma segmento curto de DNA de fita simples que contém a região danificada é removido, resultando em uma lacuna de fita simples de 22 a 30 bases. A lacuna gerada é preenchida com uma nova base complementar, e uma extremidade da base complementar recémpreenchida é ligada à cadeia principal por meio de uma DNA ligase, resultando no reparo do DNA danificado.
EFEITOS DE MANIPULAÇAO DE GENES [0862] A manipulação ou correção de um gene ou
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 220/315 ácido nucleico alvo pode amplamente levar a efeitos de kn o ck o u t, kn o ck d o wn e kn o ck i n .
KNOCKGUT [0863
O termo “knockout refere-se à inativaçao de um gene ou ácido nucleico alvo, e a inativação de um gene ou ácido nucleico alvo refere-se a um estado no qual a transcrição e/ou tradução de um gene ou ácido nucleico alvo não ocorrem. A transcrição e a tradução de um gene que provoca uma doença ou um gene que tem uma função anormal podem ser inibidas através de knockout, resultando no impedimento da expressão de proteína.
[08641 Por exemplo, quando um gene ou ácido nucleico alvo for editado ou corrigido com o uso de um. complexo de gRNA e enzima. CRISPR, isto é, um complexo CRISPR, o gene ou ácido nucleico alvo pode ser clivado com o uso do complexo CRISPR. O gene ou ácido nucleico alvo danificado pode ser reparado através de NHEJ com o uso do complexo CRISPR. O gene ou ácido nucleico alvo danificado pode ter inserções e deleções devido à NHEJ e, assim., pode ser induzido knockout específico para o gene ou ácido nucleico alvo.
KNOCKDOWN [0865] O termo “knockdown refere-se a uma diminuição na transcrição e/ou tradução de um gene ou ácido nucleico alvo ou na expressão de uma proteína-alvo. O inicio de uma doença pode ser prevenido ou uma doença pode ser tratada regulando-se a superexpressão de um gene ou proteína através do knockdown.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 221/315 [0866 ] Por exemplo, quando um gene ou ácido nucleico alvo for editado ou corrigido com o uso de um complexo de gRNA e enzima CRISPR do domínio de atividade inibitória inativa da transcrição, isto é, um complexo inativo CRISPR, incluindo um domínio de atividade inibitória da transcrição, o complexo inativo CRISPR pode ser ligar especificamente ao gene ou ácido nucleico alvo, a transcrição do gene ou ácido nucleico alvo pode ser inibida pelo domínio de atividade inibitória da transcrição incluído no complexo inativo CRISPR, induzindo, assim, o knockdown no qual a expressão do gene correspondente ou ácido nucleico é inibida.
KNOCKIN [ 086'7] O termo knockin'' refere-se à inserção de um ácido nucleico ou gene específico em um gene ou ácido nucleico alvo e, no presente documento, o ácido nucleico específico refere-se a um. gene ou ácido nucleico de interesse a ser inserido ou expresso. Um gene mutante que desencadeia uma doença pode ser utilizado no tratamento da doença por meio de correção para, normal ou inserção de um. gene normal para induzir a expressão de tal. gene normal através do knockin.
[08681 Além disso, o knockin pode, ainda, precisar de um doador.
[08691 Por exemplo, quando um gene ou ácido nucleico alvo for editado ou corrigido com o uso de um complexo de gRNA e enzima CRISPR, isto é, um complexo
CRISPR, o gene ou ácido nucleico alvo pode ser clivado com
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 222/315
2 / 2 5 3 o uso do complexo CRISPR. 0 gene ou ácido nucleico alvo danificado com o uso do complexo CRISPR pode ser reparado através de HDR. No presente documento, um ácido nucleico especifico pode ser inserido no gene ou ácido nucleico danificado com o uso de um doador.
[0870] O termo doados refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos que auxilia o reparo com base em HDR do gene ou ácido nucleico danificado e, no presente documento, o doador pode incluir um ácido nucleico especifico.
[0871] O doador pode ser um ácido nucleico de fita dupla ou simples.
[0872] O doador pode estar presente em um formato linear ou circular.
[0873] O doador pode incluir uma sequência de ácidos nucleicos que tem homologia com um gene ou ácido nucleico alvo.
[0874] Por exemplo, o doador pode incluir uma sequência de ácidos nucleicos que tem homologia com cada uma das sequências de bases em uma localização na qual um. ácido nucleico especifico deve ser inserido, por exemplo, a
montante (esquerda) e a. jusante ( direita) de um acido
nucleico danificado • No presente documento, o ácido
nucleico especifico a ser inserido pode estar localizado
entre uma S Θ C[U 6Í1C13. de ácidos nucle icos que tem homologia
com uma sequência de bases a jusante do ácido nucleico danificado e uma sequência de ácidos nucleicos que tem homologia com uma sequência de bases a montante do ácido nucleico danificado. No presente documento, a sequência
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 223/315
3 / 2 5 3
Figure BR112019012779A2_D0008
homóloga de ácidos nucleicos pode ter pelo menos 50%, 55%,
60%, 65%,
80%, 85%,
0% ou mais de homologia ou homologia completa.
[0875] O doador pode opcionalmente incluir uma sequência de ácidos nucleicos adicional. No presente documento, a sequência de ácidos nucleicos adicional pode servir para aumentar a estabilidade do doador, a eficácia de knackin ou a eficácia de HDR.
[0876] Por exemplo, a sequência de ácidos nucleicos adicional pode ser uma sequência de ácidos
nucleicos rica em A, T, isto é, um domíni o rico em Ά-Τ .
A1 é m d i s s o, a sequênci ,a de ácidos nucleicos adicional pode
ser uma região de fixa ção arcabouço/matriz ( SMAR).
[0877] Em uma modalidade exemplificativa relacionada a um efeito de manipulação de genes da presente invenção, um gene-alvo manipulado obtido com o uso de um. complexo de gRNA. e enzima CRISPR, isto é, um fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados manipulado, pode ter a seguinte constituição.
[0878] Em uma modalidade exemplificativa, quando o fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados for um gene, a constituição do fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado pelo complexo de gRNA e enzima CRISPR pode incluir modificação de um ou mais ácidos nucleicos entre uma deleção ou inserção de um ou mais nucleotideos;
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 224/315 s u b s 11 l. u i ç a o mais nucleotideos diferentes de um gene do tipo selvagem; e uma inserção de um ou mais nucleotideos estranhos em uma região continua de 1 bp a 50 bp, 1 bp a 40 bp ou 1 bp a 30 bp, de preferência, bp a 25 bp na sequência, de bases, que está localizada em uma sequência
FAM em uma sequência de ácidos nucleicos que const fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados ou adjacente a uma extremidade e/ou extremidade 3' da mesma.
[08791
Além disso, uma modificação química de um ou mais nucleotideos pode ser incluída na sequência, de ácidos nucleicos que constitui o fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados.
[0880] No presente documento, o nucleotídeo estranho é o conceito que inclui todos os nucleotideos exógenos, por exemplo, heterólogos ou artificialmente sintetizados, além, dos nucleotideos incluídos inatamente no fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados.
O nucleotídeo estranho também inclui um nucleotídeo com um.
tamanho de diversas centenas, milhares ou dezenas de milhares de bp para expressar uma proteína que tem uma função específica, assim como um oligonucleotideo pequeno com um tamanho de 50 bp ou menos. Tal nucleotídeo estranho pode ser um doador.
[0881] A modificação química pode incluir metilação, acetilação, fosforilação, ubiquitinação, ADPPetição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 225/315 ribosilação, miristilação e glicosilação, por exemplo, substituição de alguns grupos funcionais contidos em um nucleotideo com qualquer um dentre um átomo de hidrogênio, um átomo de flúor, um grupo -O-alquila, um grupo -O-acila e um grupo amino, mas a presente invenção não se limita aos mesmos. Além disso, para aumentar a transferabilidade de uma molécula de ácido nucleico, os grupos funcionais podem ser também substituídos por qualquer um dentre -Br, -Cl, R, -R'OR, -SH, -SR, -N3 e -CN (R= alquila, arila, alquileno). Além disso, a cadeia principal de fosfato de pelo menos um nucleotideo pode ser substituída por qualquer um dentre uma forma de alquilfosfonato, uma forma de fosforoamidato e uma forma boranofosfato. Além disso, a modificação química pode ser a substituição de pelo menos um tipo de nucleotideo contido na molécula de ácido
nucleico por qualquer um dentre um. ácido nuclei .co bloqueado
(LNA), um ácido nucleico n ã o b .1 o qu e a d o (UNA), um. mor folino
e um ácido nucleico de peptídeo (PNA) , e a mod i f icação
químíc a pode ser ligação d a mo .1 é c u .1 a de ácido nuclei co por
um. ou mais selecionados dentre o grupo que consiste em. um
lipídio, um peptídeo de penetração celular e um ligante de alvo celular.
[0882] Para formar um sistema desejado de controle da biossíntese de ácidos graxos insaturados, modificação artificial com o uso de um complexo de gRNA e enzima CRISPR pode ser aplicada ao ácido nucleico que constitui o fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados.
[0883] Uma região que inclui a modificação de
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6/25 3 ácido nucleico do fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados pode ser uma região-alvo ou sequência alvo .
Tal sequência-alvo pode ser um alvo para o complexo de gRNA e enzima CRISPR, e a sequência-alvo pode incluir ou não incluir uma sequência PAM reconhecida pela enzima CRISPR. Tal sequência-alvo pode fornecer um padrão essencial em um estágio de projeto de gRNA para aqueles de habilidade comum na técnica.
[08851 Tal modificação de ácido nucleico inclui a divagem de um ácido nucleico.
[0886] O termo divagem em uma região-alvo refere-se à ruptura de uma cadeia principal covalente de polinucleot ídeos. A divagem inclui, hidrólise enzimátíca ou química de uma ligação de fosfodiéster, mas a presente invenção não se limita aos mesmos, e também inclui, vários outros métodos. A divagem pode ser realizada tanto em uma fita simples quanto uma. fita dupla, e a. divagem de uma fita dupla, pode resultar da divagem, de fita simples distinta. A divagem de fita dupla pode gerar extremidades cegas ou extremidades desalinhadas.
[0887] Quando uma enzima CRISPR inativada é usada, a mesma pode induzir um fator que possui uma função específica para abordar uma certa região da região-alvo ou fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados sem o processo de divagem. A modificação química de um ou mais nucleotídeos na sequência de ácidos nucleicos do fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados pode
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 227/315 ser incluída de acordo com tal função especifica.
[0888] Em um exemplo, várias inserções e deleções podem ocorrer devido a atividade alvo e não alvo através da divagem de ácido nucleico formada pelo complexo de gRNA e enzima CRISPR.
[0889] O termo inserções e deleções é o termo genérico para urna mutação por inserção ou deleção que ocorre entre algumas bases em uma sequência de bases de DNA. As inserções e deleções podem ser introduzidas em uma sequência-alvo durante o reparo de um mecanismo HDR ou NHEJ quando o complexo de gRNA e enzima CRISPR cliva o ácido nucleico (DNA ou RNA) do fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados conforme descrito acima.
[0890] O fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulados da presente invenção refere-se à modificação da sequência de ácidos nucleicos de um gene original, por divagem, inserções e deleções ou inserção com o uso de um doador de tal ácido nucleico e contribui, para um sistema, desejado controlar ácidos graxos insaturados biossíntese, por exemplo, exibição de um efeito de promoção ou supressão de um ácido graxo insaturado específico.
[0891] Por exemplo, uma proteína específica pode ser expressa e sua atividade pode ser estimulada pelo fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulados.
[0892] Uma proteína específica pode ser inativada
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 228/315
8 / 2 5 3 pelo fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulados.
[0893] Em um exemplo, uma região-alvo específica de cada fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados do genoma, por exemplo, gene regulador reverso, tal como um gene FAD2, um gene FAD3, um gene FAD6, um gene FAD7 e/ou um gene FAD8, pode ser clivada, resultando em knockdown ou knockout do gene.
[0894] Em um outro exemplo, o knockdown alvejado pode ser mediado com o uso de uma enzima CRISPR enzimaticamente inativa fundida a um domínio repressor de transcrição ou proteína modificada com cromatina para alterar a transcrição, por exemplo, para bloquear, regular negativamente ou diminuir a transcrição de um gene FAD2, um. gene FAD3, um gene FAD6, um gene FAD7 e/ou um gene FAD8.
[0895] Uma produção de ácidos graxos insaturados pode ser regulada pelo fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado.
[0 896] Um. corpo de planta, com. teor aumentado ou diminuído de um ácido graxo insaturado específico ou um. produto processado com o uso do corpo de planta pode ser produzido pelo fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado.
[0897] Em uma modalidade exemplificaiiva da presente invenção, o fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado pode fornecer vários fatores associados à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulados de acordo
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9 / 2 5 3 com a característica constitucional do complexo de gRNA e enzima CRISPR (por exemplo, incluído em uma região-alvo do fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados ou diferente na sequência PAM principal adjacente).
[0898] Doravante, embora exemplos representativos de enzimas CRISPR e um gene associado à biossintese de ácidos graxos insaturados tenham sido ilustrados, os mesmos são exemplos meramente específicos e, dessa forma, a presente invenção não se limita aos mesmos.
[0899] Por exemplo, quando a enzima CRISPR for uma proteína SpCas9, a sequência PAM é 5 ' -NGG-3' (N é A, T, G ou C) , e a região de sequência de bases clivada (regiãoalvo) pode ser uma região contínua com 1 bp a 2 5 bp, por exemplo, 17 bp a 23 bp ou 21 bp a 23 bp, na sequência de bases adjacente à extremidade 5' e/ou à extremidade 3' da sequência 5'-NGG-3' em. um gene-alvo.
[0900] A presente invenção pode fornecer um fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado, por exemplo, um gene FAD2, gene FAD3, gene FAD6, gene FAD7 e/ou gene FAD8 artificialmente manipulado, que é preparado por
a) deleção de um ou mais nucleotídeos de uma região contínua com 1 bp a 25 bp, por exemplo, 17 bp a 23 bp, na sequência de bases adjacente à extremidade 5' e/ou extremidade 3' da sequência 5'-NGG-3’ (N é A, T, C ou
b) substituição de um ou mais nucleotídeos de uma região contínua com 1 bp a 25 bp, por exemplo, 17 bp
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 230/315 a 23 bp, na sequência de bases adjacente à extremidade 5' e/ou à extremidade 3' da sequência 5,-NGG-3? com nucleotideos diferentes daqueles do gene do tipo selvagem,
c) inserção de um ou mais nucleotideos em uma região contínua com 1 bp a 25 bp, por exemplo, 17 bp a 23 bp, na sequência de bases adjacente à extremidade 5 e/ou à extremidade 3' da sequência 5'-NGG-3' ou
d) uma combinação de dois ou mais selecionados dentre a) através c) na sequência de ácidos nucleicos do fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados.
[09011 Por exemplo, quando a enzima CRISPR for uma proteína CjCas9, a sequência PAM é 5'-NNNNRYAC-3' (cada N é independentemente A, T, C ou G, R é ou G, e W é ou T) , e a região de sequência de bases clivada (região-alvo) pode ser uma região contínua com 1 bp a 25 bp, por exemplo, 17 bp a 23 bp ou 21 bp> a 23 bp, na sequência de bases adjacente à extremidade 5' e/ou à extremidade 3' da sequência 5 ' -NNNNRYAC-3 ' em um. gene-alvo.
[0902] A presente invenção pode fornecer um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado, por exemplo, um gene FAD2, gene FAD3, gene FAD6, gene FAD7 e/ou gene FAD8 artificialmente manipulado, que é preparado por a ’) deleção de um ou mais nucleotideos de uma região contínua com 1 bp a 25 bp, por exemplo, 17 bp a bp, na sequência de bases adjacente à extremidade 5' e/ou à extremidade 3' da 5’-NNNNRYAC-3' (cada N é
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 231/315 independentemente A, T, C ou G, R é A ou G, e Y é 0 ou T), b') substituição de um ou mais nucleotídeos de uma região contínua com 1 bp a 25 bp, por exemplo, 17 bp a 23 bp, na sequência de bases adjacente à extremidade 5' e/ou à extremidade 3' da sequência 5 ’ -NNNNRYAC-3’ com nucleotídeos diferentes daqueles do gene do tipo selvagem, c') inserção de um ou mais nucleotídeos em uma região contínua com 1 bp a 25 bp, por exemplo, 17 bp a 23 bp, na sequência de bases adjacente à extremidade 5' e/ou à extremidade 3' da sequência 5’-NNNNRYAC-3’ ou d’) uma combinação dos dois ou mais selecionados dentre a') a c') na sequência de ácidos nucleicos do fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados.
[09031 Por exemplo, quando a enzima CRISPR for uma proteína StCas9, a sequência PAM é 5'-NNAGAAW-3’ (cada N é independentemente A, T, C ou G, e W é A ou T) , e a região de sequência de bases clivada (região-alvo) pode ser uma região contínua com. 2. bp a 25 bp, por exemplo, 17 bp a 23 bp ou 21 bp a 23 bp, na sequência de bases adjacente à extremidade 5' e/ou à extremidade 3' da sequência 5 ’ NNAGAAW-3' em um gene-alvo.
[0904] A presente invenção pode fornecer um fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado, por exemplo, um gene FAD2, gene FAD3, gene FAD6, gene FAD7 e/ou gene FAD8 artificialmente manipulado, que é preparado por a ' ’} deleção de um ou mais nucleotídeos de
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 232/315
2 / 2 5 3 uma região contínua com bp a 25 bp, por exemplo, 17 bp a bp, na sequência de bases adjacente à extremidade 5' da sequência 5’-NNAGAAW-3' (cada N é independentemente A, T, C ou G, e W é A ou T) , b'') substituição de um ou mais nucleotideos de uma região contínua com 1 bp a 25 bp, por exemplo, 17 bp a 23 bp, na sequência de bases adjacente à extremidade 5' e/ou à extremidade 3' da sequência 5'NNAGAAW-3' com nucleotideos diferentes daqueles do gene do tipo selvagem, c ’ ') inserção de um ou mais nucleotideos em uma região contínua com 1 bp a 25 bp, por exemplo, 17 bp a 23 bp, na sequência de bases adjacente à extremidade 5' e/ou à extremidade 3’ da sequência 5 ’ -NNAGAAW-3 ’ ou d'') uma combinação dos dois ou mais selecionados dentre a ’ ’) a c ’ ’) na sequência de ácidos nucleicos do fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados.
[0905] Por exemplo, quando a enzima CRISPR for uma proteína NmCas9, a sequência PAM é 5'-NNNNGATT-3' (cada N é independentemente A, T, C ou G), e a região de sequência de bases clivada (região-alvo) pode ser uma região contínua com 1 bp a 25 bp, por exemplo, 17 bp a 23 bp ou 21 bp a 23 bp, na sequência de bases adjacente à extremidade 5’ e/ou à extremidade 3' da sequência 5'-NNNNGATT-3' em um gene-alvo. [0906] A presente invenção pode fornecer um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado, por exemplo, um gene FAD2, gene
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 233/315
FAD3, gene FAD6, gene FAD7 e/ou gene FAD8 artificialmente manipulado, que é preparado por a!'’) deleção de um ou mais nucleotideos de uma região contínua com 1 bp a 25 bp, por exemplo, 17 bp a 23 bp, na sequência de bases adjacente à extremidade 5 e/ou à extremidade 3’ da sequência 5’-NNNNGATT-3’ (cada N é independentemente A, T, C ou G), bf ' ’) substituição de um ou mais nucleotideos de uma região contínua com 1 bp a 25 bp, por exemplo, 17 bp a 23 bp, na sequência de bases adjacente à extremidade 5' e/ou à extremidade 3' da sequência 5'NNNNGATT-3’ com nucleotideos diferentes daqueles do gene do tipo selvagem, c ’ ' ') inserção de um ou mais nucleotideos em uma região continua com 1 bp a 25 bp, por exemplo, 17 bp a 23 bp, na sequência de bases adjacente à sequência 5fNNNNGATT-3' ou d’'') uma combinação dos dois ou mais selecionados dentre a’ ' ’ ) a c’’’ na sequência de ácidos nucleicos do fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados.
[0907] Por exemplo, quando a enzima CRISPR for uma proteína SaCas9, a sequência ΡΆΜ é 5'-NNGRR(T)-3' (cada N é independentemente A, T, C ou G, R é A ou G, e (T) é uma sequência aleatoriamente adicionável) , e a região de sequência de bases clivada (região-alvo) pode ser uma região contínua com 1 bp a 25 bp, por exemplo, 17 bp a 23 bp ou 21 bp a 23 bp, na sequência de bases adjacente à
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 234/315 extremidade 5' e/ou à extremidade 3' da sequência 5'NNGRR(T)-3' em um gene-alvo.
[0908] A presente invenção pode fornecer um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado, por exemplo, um gene FAD2, gene FAD3, gene FAD6, gene FAD7 e/ou gene FAD8 art if icialmente manipulado, que é preparado por a' ' ' ' ) deleção de um ou mais nucleotídeos de uma região continua com 1 bp a 25 bp, por exemplo, 17 bp a 23 bp, na sequência de bases adjacente à extremidade 5' e/ou à extremidade 3' da sequência 5 ' -NNGRR (T) -3 ’ (cada N é independentemente A, T, C ou G, R é A ou G, e (T) é uma sequencia aleauoriamenue adicionavel) , b' ' ' ) substituição de um ou mais nucleotídeos de uma região contínua com 1 bp a 25 bp, por exemplo, 17 bp a 23 bp, na sequência de bases adjacente à extremidade 5' e/ou à extremidade 3' da sequência 5 1-NNGRR(T)~3'’ com nucleotídeos diferentes daqueles do gene do tipo selvagem, c' ' ' ) inserção de um ou mais nucleotídeos em. uma região continua com. 1 bp a. 25 bp, por exemplo, 17 bp a 23 bp, na sequência de bases adjacente à sequência 5'NNGRR(T)—3' ou d'''') uma combinação dos dois ou mais selecionados dentre a!’'’) a c’'’’) na sequência de ácidos nucleicos do fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados.
[0909] Por exemplo, quando a enzima CRISPR for uma
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 235/315 proteína Cpfl, a sequência PAM é 5,~TTN~3'' (N é A, T, C ou G) , e a região de sequência de bases clivada (região-alvo) pode ser uma região contínua com 10 bp a 3 0 bp, por exemplo, 15 bp a 26 bp, 17 bp a 30 bp ou 17 bp a 26 bp, na sequência de bases adjacente à extremidade 5' ou à extremidade 3 da sequência 5'-TTN~3’.
[09101 A proteína Cpfl pode ser derivada de um bacterium {GWC 2 011__GWC 2__4 4__1
Lachnospiraceae bacterium (MC2017),
Butyrivibrio proteoclasiicus, Peregrinibacteria bacterium (GW2011_GWA_33_10), Acidaminococcus
Porphyromonas ma ca cae,
Lachnospiraceae bacterium (ND2006),
Porphyromonas crevioricanis, Prevotelia disiens, Moraxella bovoculi (237), ( SC__KO8D17 ) ,
Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium (MA2020), Francisella novicida (U112), Candidatas Methanoplasma termitum,
Eubacterium eligens, por exemplo, Parcubacteria bacterium (GWC 2 011__GWC 2__4 4__17 ) , (GW2011_GWA_33_10), Acidaminococcus sp. (BV3L6),
Porphyromonas macacae, Lachnospiraceae bacterium (ND2006),
Porphyromonas crevioricanis, Prevotella disiens, Moraxella bovoculi (237), Leptospira. inadai, Lachnospiraceae bacterium (MA2020), Francisella novicida (U112), Candidates Methanoplasma termitum ou Eubacterium eligens, mas a presente invenção não se limita aos mesmos.
[0911] A presente invenção pode fornecer um fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulado, por exemplo, um gene FAD2, gene
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6/2 5 3
FAD3, gene FAD6, gene FAD7 e/ou gene FAD8 artificialmente manipulado, que é preparado por deleçãc mais nucleotídeos de uma região contínua com 10 bp a 30 bp, por exemplo, 15 bp a 26 bp, na sequência de bases adjacente à extremidade 5 e/ou à extremidade 3 da sequência 5'-TTN-3’ (N é A, T, C ou G), bf ' ’ ’) substituição de um ou mais nucleotídeos de uma região continua com 10 bp a 30 bp, por exemplo, 15 bp a 26 bp, na sequência de bases adjacente à extremidade 5' e/ou à extremidade 3' da sequência 5’-TTN-3' com nucleotídeos diferentes daqueles do gene do tipo selvagem, c ’ ' ' ’ ’ ) inserção de um ou mais nucleotídeos de uma região contínua com 10 bp a 30 bp, por exemplo, 15 bp a 26 bp, na sequência de bases adjacente à extremidade 5' e/ou à extremidade 3' da sequência 5'-TTN-3' ou d') uma combinação dos dois ou mais selecionados dentre a ’ ’ ’ ’ ’) a c ’ ’ ’ ’ ’) na sequência de ácidos nucleicos do fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados.
[0912] Em uma outra modalidade exemplificativa, quando o fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados é uma proteína, a proteína artificialmente manipulada inclui todas as proteínas envolvidas na formação de biossíntese de ácidos graxos insaturados novos ou modificados por uma ação direta ou indireta do complexo de
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 237/315 gRNA e enzima. CRISPR.
[0913] Por exemplo, a proteína artificialmente manipulada pode ser uma proteína expressa por um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados (gene)
artificialmente manipulados pelo complexo dl e gRNA e enzima
CRISPR ou outr a proteína aumen tada ou re duz ida por uma
i n f 1 u ê n c i a p o r tal atividade de proteína, mas a presente
invenção não se limita aos mesmos.
[0914] O fator associado à biossíntese de ácidos g r a x o s i n s a t u r a d o s a r t i f i c i a 1 m e n t e m a n i p u .1 a d o s (p r o t e í n a)
pode ter uma com posição e atividade de aminoácic io
c o r r e s p o n d e r: t e à composição do fator associado
bi oss í ntese de acid os graxos insaturados a r11 f i c 1 a J men' te
manipulados (gene) .
[0915] Como uma modalidade, uma (i) proteíj
artificialmente manipulada que é alterada em. características de expressão pode ser fornecida.
[0916] Por exemplo, a modificação de proteína pode ter uma ou mais características:
uma diminuição ou aumento em nível de expressão de acordo com a. deleção ou inserção de um ou mais nucleotídeos em uma região contínua com 1 bp a 50 bp, 1 bp a 40 bp, 1 bp a 30 bp, e, de preferência, 3 bp a 25 bp na sequência de bases da sequência PAM na sequência de ácidos nucleicos do fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados ou adjacente à extremidade 5' e/ou à extremidade 3' da mesma;
uma diminuição ou aumento em nível de
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 238/315 expressão de acordo com a substituição por um ou mais nucleotídeos diferentes daqueles de um gene do tipo selvagem;
uma diminuição ou aumento em nivel de expressão, expressão de uma proteína de fusão ou expressão independente de uma proteína específica de acordo com a inserção de um ou mais nucleotídeos estranhos; e uma diminuição ou aumento em nivel de expressão de uma terceira proteína influenciada por características de expressão das proteínas descritas acima. [091'7] Uma (ii) proteína artificialmente manipulada que é alterada em características estruturais pode ser fornecida.
[0918] Por exemplo, a modificação de proteína pode ter uma ou mais características:
uma alteração em códons, aminoácidos e estrutura tridimensional. de acordo com a deleção ou inserção de um ou mais nucleotídeos em uma região contínua com 2. bp a 5 0 bp, 1 bp a 4 0 bp, 1 bp a 3 0 bp, e, de preferência, 3 bp a 25 bp na sequência de bases da sequência PAM na sequência de ácidos nucleicos do fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados ou adjacente à extremidade 51 e/ou à extremidade 3 da mesma;
uma alteração em códons, aminoácidos e estrutura tridimensional, assim, de acordo com a substituição por um ou mais nucleotídeos diferentes de um gene do tipo selvagem;
uma alteração em códons, aminoácidos e
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 239/315 estrutura tridimensional, ou uma estrutura de fusão com uma proteína específica ou estrutura independente da qual uma proteína específica é separada de acordo com inserção de um ou mais nucleotideos estranhos; e uma alteração em coa aminoácid estrutura tridimensional de uma terceira proteína influenciada pela proteína descrita acima alterada em característica estrutural.
[09191
Uma proteína a r t i f i c i a 1 me n t e manipulada alterada em características funcionais pode ser fornecida.
[0920]
For exemplo, a modificação de proteína pode ter uma ou mais característi a ativação especifica por modificação deleção ou inserção de um região contínua com 1 bp a bp, e, de preferência, 3 bp ou inativação de uma função de proteína causada por uma ou mais nucleotideos em uma
0 bp, 1 bp> a 4 0 bp, 1 bp a 3 0 a 25 bp na sequência de bases da sequência PAM na sequência de ácidos nucleicos do fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados ou adjacente à extremidade e/ou à extremidade 3' da mesma;
a ativaçao ou inativaçao de uma função especifica ou introdução de uma nova função por modificação de proteína causada por substituição por um ou mais nucleotideos diferentes daqueles de um gene do tipo selvagem;
a ativaçao ou inativaçao de uma função especifica ou introdução de uma nova função por modificação
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 240/315 de proteína causada por inserção de uma ou mais nucleotídeos estranhos, particularmente, introdução de uma terceira função a uma função existente devido à fusão ou expressão independente de uma proteína específica; e a alteração na função de uma terceira proteína influenciada pela proteína descrita acima alterou as características funcionais.
[09211 Além disso, uma proteína artificialmente manipulado pela modificação química de um ou mais nucleotídeos na sequência de ácidos nucleicos que constitui o fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados pode ser incluída.
[0922] Por exemplo, uma ou mais dentre a expressão, características estruturais e funcionais de uma proteína causadas por metilação, acetilação, fosforilação, ubiquitinação, ADP-ribosilação, miristilação e glicosilação podem ser alteradas.
[0923] Por exemplo, a terceira estrutura e função podem ser atingidas por ligação de uma terceira proteína na sequência de ácidos nucleicos do gene devido à modificação química de nucleotídeos.
5. OUTROS COMPONENTES ADICIONAIS [0924] Um componente adicional pode ser seletivamente adicionado para aumentar a eficiência de um complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia ou melhorar a eficiência de reparo de um gene ou ácido nucleico cianif icacio.
[0925] O componente adicional pode ser
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 241/315 seletivamente usado para melhorar a eficiência do complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia.
ATIVADOR [0926] O componente adicional pode ser usado como um ativador para aumentar a eficiência de divagem de um ácido nucleico, gene ou cromossomo alvo do complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia.
[ 092'7] O termo ativador refere-se a ácido nucleico que serve para estabilizar a ligação entre o complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia e o ácido nucleico, gene ou cromossomo alvo, ou para permitir que o complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicosguia aborde mais facilmente o ácido nucleico, gene ou c r o m o s s o m o a 1 v o .
[0928] O ativador pode ser um ácido nucleico de fita dupla ou ácido nucleico de fita simples.
[0929] O ativador pode ser linear ou circular.
[0930] O ativador pode ser dividido em um.
auxiliar que estabiliza a ligação entre o complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia e o ácido nucleico, gene ou cromossomo alvo, e um acompanhante que serve ou para permitir que o complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia aborde mais facilmente o ácido nucleico, gene ou cromossomo alvo.
[0931] O auxiliar pode aumentar a eficiência de divagem do complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia em relação ao ácido nucleico, gene ou cromossomo alvo.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 242/315
0 2/2 5 3 [0932] Por exemplo, o auxiliar inclui uma sequência de ácidos nucleicos que tem homologia com o ácido nucleico, gene ou cromossomo alvo. Portanto, quando o complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia está ligado ao ácido nucleico, gene ou cromossomo alvo, a sequência de ácidos nucleicos homóloga incluída no auxiliar pode formar uma ligação complementar com o ácido nucleico, gene ou cromossomo alvo para estabilizar a ligação entre o complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia e o ácido nucleico, gene ou cromossomo alvo.
[0933] O acompanhante pode aumentar a eficiência de divagem do complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia em. relação ao ácido nucleico, gene ou cr omo s s omo a1vo.
[0934] Por exemplo, o acompanhante inclui uma sequência de ácidos nucleicos que tem homologia com o ácido nucleico, gene ou cromossomo alvo. No presente documento, a sequência de ácidos nucleicos homóloga incluída no acompanhante pode formar parcialmente uma ligação complementar com um ácido nucleico-guia do complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia. Portanto, o acompanhante que forma parcialmente uma ligação complementar com o complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia pode formar parcialmente uma ligação complementar com o ácido nucleico, gene ou cromossomo alvo, e, como resultado, pode permitir o complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia para abordar precisamente a posição do ácido nucleico, gene ou cromossomo alvo.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 243/315
203/253 [0935] A sequência de ácidos nucleicos homóloga pode ter pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% ou mais de homologia ou homologia completa.
[0936] Além disso, o componente adicional pode ser seletivamente usado para melhorar a eficiência de reparo do gene ou ácido nucleico danificado.
ASSISTENTE [0937] O componente adicional pode ser usado como um assistente para melhorar a eficiência de reparo do gene ou ácido nucleico danificado.
[0938] O termo assistente refere-se a ácido nucleico que serve para participar em um processo de reparo ou aumentar a eficiência de reparo do gene ou ácido nucleico danificado, por exemplo, do gene ou ácido nucleico clivado pelo complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia.
[0939] O assistente pode ser um ácido nucleico de fita dupla ou ácido nucleico de fita simples.
[0940] O assistente pode estar presente em um.
formato linear ou circular.
[0941] 0 a. s s istente pode ser dividido em. um.
cí s s 1 s t ente de E iHEJ que pamcipa em um a proce s s o de
reparo com o uso de NÍ iEJ ou melhora a eficiência de reparo
e Ltiil ( assistente de í ID R qu e p a r t i c /ipa em um proce sso de
reparo com o uso de H DR ou melhora a eficiência de reparo
de acordo com um métod o de reparo.
[0942] 0 a s s i stente de NHEJ pode participar em um
processo de reparo ou melhorar a eficiência de reparo do
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 244/315 gene ou ácido nucleico danificado com o uso de NHEJ.
[0943] Por exemplo, o assistente de NHEJ pode incluir uma sequência de ácidos nucleicos que tem homologia com uma parte da sequência de ácidos nucleicos danificada. No presente documento, a sequência de ácidos nucleicos homóloga pode incluir uma sequência de ácidos nucleicos que tem homologia com a sequência de ácidos nucleicos em uma extremidade (por exemplo, a extremidade 3') da sequência de ácidos nucleicos danificada e incluem uma sequência de ácidos nucleicos que tem homologia com a sequência de ácidos nucleicos na outra extremidade (por exemplo, a extremidade 5') da sequência de ácidos nucleicos danificada. Além disso, uma sequência de ácidos nucleicos que tem homologia com cada uma das sequências de bases a montante ou a jusante da sequência de ácidos nucleicos
ianificada pc >de ser incluída. A sequência de ácidos
sucleicos que tem tal homologia pode auxiliar dua s partes
ia sequência c le ácidos nucleicos danificada a ser colocada
em. estreita proxim.ida.de, aumentando, assim., a. eficiência de reparo do ácido nucleico danificado por NHEJ.
[0944] 0 assistente de HDR pode participar no processo de reparo ou melhorar a eficiência de reparo do gene ou ácido nucleico danificado com o uso de HDR.
[0945] Por exemplo, o assistente de HDR pode incluir uma sequência de ácidos nucleicos que tem homologia com uma parte da sequência de ácidos nucleicos danificada. No presente documento, a sequência de ácidos nucleicos homóloga pode incluir uma sequência de ácidos nucleicos que
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 245/315 tem homologia com a sequência de ácidos nucleicos em uma extremidade (por exemplo, a extremidade 3') da sequência de ácidos nucleicos danificada e uma sequência de ácidos nucleicos que tem homologia com a sequência de ácidos nucleicos na outra extremidade (por exemplo, a extremidade 5) da sequência de ácidos nucleicos danificada. Alternativamente, uma sequência de ácidos nucleicos que tem homologia com cada uma das sequências de bases a montante ou a jusante da sequência de ácidos nucleicos danificada pode ser incluída. A sequência de ácidos nucleicos que tem tal homologia pode servir como um modelo da sequência de
á c i d o s n u c 1 e i c :os danificada para aumen tar a eficiência de
reparo do ácid o nucleico danificad o por HDR e
[0946] Em um. outro exemp 1 o, c ) a. s sistente de HDR
pode incluir uma sequência de á cidos nucleicos que tem
h orno 1 o g i a com uma parte oa sequê n c i a de í á. cidos nucleicos
danificada e um ácido nucleico específico, por exemplo, um. ácido nucleico ou gene a ser inserido. No presente documento, a sequência de ácidos nucleicos homóloga pode incluir uma sequência, de ácidos nucleicos que tem homologia com cada uma das sequências de bases a montante e a jusante da sequência de ácidos nucleicos danificada. 0 ácido nucleico específico pode estar localizado entre uma sequência de ácidos nucleicos que tem homologia com uma sequência de bases a jusante do ácido nucleico danificado e uma sequência de ácidos nucleicos que tem homologia com uma sequência de bases a montante do ácido nucleico danificado. A sequência de ácidos nucleicos que tem tal homologia e
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0 6/25 3 ácido nucleico específico pode servir como ura doador para inserir um ácido nucleico específico no ácido nucleico danificado, aumentando, assim, a eficiência de HDR para knock in .
[0947] A sequência de ácidos nucleicos homóloga pode ter pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%,
90% ou 95% ou mais de homologia ou homologia completa.
6. INDIVÍDUO [0948] O termo indivíduo refere-se a um organismo no qual um ácido nucleico-guia, proteína editora ou complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia é introduzido, um organismo em que ura ácido nucleico-guia, proteína editora ou complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia operara ou um espécime ou amostra obtida a partir do organismo.
[0949] O indivíduo pode ser um organismo incluindo um. ácido nucleico, gene, cromossomo ou proteína alvo do complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia.
[0950] O organismo podem ser células, tecido ou uma planta.
[0951] As células podem ser células eucarióticas.
[0952] As células eucarióticas podem ser células vegetais.
[0953] O tecido pode ser tecido de uma planta, tal como uma folha, caule, raiz, flor, fruta ou calo e semelhantes, etc.
[0954] A planta pode ser uma planta em vários períodos de uma semente a ura corpo maduro.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 247/315 [0955] A planta pode ser um corpo de planta incluindo um ácido graxo insaturado.
[0956] Além disso, o indivíduo pode ser um espécime ou amostra incluindo um ácido nucleico, gene, cromossomo ou proteína alvo do complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia.
[095'7] O espécime ou amostra pode ser obtida a partir de um corpo de planta.
[0958] Na presente invenção, como um exemplo especifico, o indivíduo pode incluir um gene ou ácido nucleico alvo do complexo de proteínas editoras e ácidos nu cleicos-guia.
[0959] No presente documento, o gene-alvo pode ser um. fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados, por exemplo, um gene FAD2, um gene FAD3, um gene FAD6, um gene FAD7 e/ou um gene FAD8.
[096 0] O gene-alvo pode ser um tipo selvagem, ou uma forma modificada no tipo selvagem.
[0961] Em uma modalidade exemplificativa da presente invenção, o indivíduo pode incluir um gene ou ácido nucleico manipulado pelo complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia.
[0962] No presente documento, o gene manipulado pode ser um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados, por exemplo, um gene FAD2, um gene FAD3, um gene FAD6, um gene FAD7 e/ou um gene FAD8.
[0963] No presente documento, o ácido nucleicoguia pode alvejar um fator associado à biossíntese de
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0 8/2 5 3 ácidos graxos insaturados, por exemplo, um gene FAD2, um
gene FAD3, um . gene i?AD6, i. im gene FAD7 e/ou um gene FAD8.
[0964] 0 ácido nucleico-guia pode ser uma
sequência de ácido s nuclei Lcos complementar a uma sequência-
alvo do gene FAD2 , gene FAD3, gene FAD6, gene FAD7 e/ou
gene FAD8.
Figure BR112019012779A2_D0009
[09661 0 ácido nucleico-guia pode alvejar simultaneamente dois ou mais genes. No presente documento, os dois ou mais genes podem ser genes homólogos ou h e t e r ó 1 o g o s .
[0967] O ácido nucleico-guia pode alvejar uma ou mais sequências-alvo.
[0968] O ácido nucleico-guia pode ser projetado em várias formas de acordo com o número ou as localizações das s e qu ê n c i a s - a 1 v o .
[0969] Em uma modalidade exemplificativa da presente invenção, o ácido nucleico-guia pode ser uma sequência de ácidos nucleicos complementar a uma ou mais sequências-alvo das sequências listadas na Tabela 1.
[0970] Em uma determinada modalidade, para manipulação artificial do gene FAD2, uma sequência de ácidos nucleicos-guia que corresponde a qualquer uma das sequências-alvo de SEQ ID NOs: 1 a 30.
[0971] Em uma determinada modalidade, para manipulação artificial do gene FAD2, uma proteína editora que interage com uma sequência de ácidos nucleicos-guia que
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Ο 9 / 2 5 3 corresponde, por exemplo, à formação de um complexo com qualquer uma das sequências-alvo de SEQ ID NOs: 1 a 30, por exemplo, SEQ ID NOs: 7 ou 30, é fornecida.
[0972] Em uma determinada modalidade, um produto de modificação de ácido nucleico de cada gene em que a manipulação artificial ocorre a uma região de sequênciaalvo de qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 1 a 30, por exemplo, SEQ ID NOs: 7 ou 30, e um produto de expressão do mesmo são fornecidos.
7. ENTREGA [0973] O ácido nucleico-guia, proteína editora ou complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia pode ser entregue ou introduzido em um. indivíduo por vários métodos de entrega e várias formas.
[0974] O ácido nucleico-guia pode ser entregue ou introduzido em um indivíduo na forma de DNA, RNA ou uma forma, misturada.
[0975] A proteína editora pode ser entregue ou introduzida em. um. indivíduo na forma, de DNA, RNA, um. mistura de DNA/RNA, um peptídeo, um. polipeptídeo, que codifica a proteína editora, ou uma proteína.
[0976] O complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia pode ser entregue ou introduzido em um alvo na forma de DNA, RNA ou uma mistura dos mesmos, que codifica cada componente, isto é, um ácido nucleico-guia ou uma proteína editora.
[0977] O complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia pode ser entregue ou introduzido em um
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 250/315 indivíduo como um complexo de um ácido nucleico-guia que tem uma forma de DNA, RNA ou uma mistura dos mesmos e uma proteína editora que tem uma forma de um peptídeo, polipeptídeo ou proteína.
[0978] Além disso, um componente adicional com a capacidade para aumentar ou inibir a eficiência do complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia pode ser entregue ou introduzido em um indivíduo por vários métodos de entrega e em várias formas.
[0979] O componente adicional pode ser entregue ou introduzido em um indivíduo na forma, de DNA, RNA, um mistura de DNA/RNA, um peptídeo, um polipeptídeo ou uma proteína.
I) ENTREGA NA FORMA DE DNA, RNA OU MISTURA
DOS MESMOS [0980] A forma de DNA, RNA ou uma mistura dos mesmos que codifica o ácido nucleico-guia e/ou proteína editora pode ser entregue ou introduzida em um indivíduo por um. método conhecido na técnica.
[0981] Ou a forma de DNA, RNA ou uma mistura dos mesmos que codifica o ácido nucleico-guia e/ou proteína editora pode ser entregue ou introduzida em um indivíduo por um vetor, um não vetor ou uma combinação dos mesmos.
[0982] O vector pode ser um vetor viral ou não viral (por exemplo, um plasmídeo).
[0983] O não vetor pode ser DNA nu, um complexo de
DNA ou mRNA.
INTRODUÇÃO COM BASE EM VETOR
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 251/315 [0984] A sequência de ácidos nucleicos que codifica o ácido nucleico-guia e/ou proteína editora pode ser entregue ou introduzida em um indivíduo por um vetor.
[0985] O vetor pode incluir uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um ácido nucleico-guia e/ou proteína editora.
[0986] Por exemplo, o vetor pode incluir simultaneamente sequências de ácidos nucleicos, que codificam o ácido nucleico-guia e a proteína editora, r e s p e c t i v a m e n t e .
[ 098'7] Por exemplo, o vetor pode incluir a sequência de ácidos nucleicos que codifica o ácido nucleico-guia.
[0988] Como um exemplo, os domínios incluídos no ácido nucleico-guia podem estar contidos todos em um vetor ou podem ser divididos e, então, contidos em diferentes vetores.
[0989] Por exemplo, o vetor pode incluir a sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína editora .
[0990] Em um exemplo, no c a s o da proteína editora,
a sequêr i C d_ Cl Cl k 3 ácido s nucleicos que codifica a proteína
β Cl 110 Z? cL pode estar contida em um vector ou p ) o Cl θ s θ z?
dividida e, então, contida em diversos vetores.
[0991] O vetor pode incluir um ou mais componentes reguladores/de controle.
[0992] No presente documento, os componentes reguladores/de controle podem incluir um promotor, um
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 252/315
212/253 intensificador, um intron, um sinal de poliadenilação, uma sequência de consenso Kozak, ura sitio de entrada de ribossomo interno (IRES), um aceitante de splice e/ou uma sequoncia 2A.
r 0 9 9 3 ΐ Cj p> r o m o t o r p> o d e ser um promotor reconhecido
por RNA polimeras e II .
[0994] 0 p r o m o t o r p o d e ser u m p r o m o t o r r e c o n h e c i d o
por RNA polimeras e III.
[0995] 0 p r o m o t o r p o d e ser um promotor induzível.
[0996] 0 promotor pode ser um promotor especifico
de indivíduo.
[ 099'7] O promotor pode ser um promotor viral ou não viral.
[09981 O promotor pode usar um promotor adequado de acordo com uma região de controle (isto é, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um ácido nucleico-guia ou proteína editora).
[0999] Por exemplo, i um promotor útil para o ácido
nucleico-guia p 7ode ser um pre imo t or H1, EF -1. a, tRNA . ou U6 .
Por exemplo, un 2 promotor úti.1 para a proteína edite ira pode
ser um. promotor CMV, EF-la, EFS, MSCV, PGK ou CAG.
[01000] Por exemplo, um promotor útil para o ácido nucleico-guia e/ou a proteína editora pode ser um promotor de expressão específico de raiz, um promotor específico de semente, promotor indizível de expressão de corpo inteiro ou um promotor específico de folha ou outros tecidos.
[01001] O vetor pode ser um vetor viral ou vetor irai recombinante.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 253/315 [01002] O vírus pode ser um vírus de DNA ou um V 1 r u s d e RN A.
[01003] No presente documento, o vírus de DNA pode ser um vírus de DNA de fita dupla (dsDNA) ou vírus de DNA de fita simples (ssDNA).
[01004] No presente documento, o vírus de RNA pode ser um vírus de RNA de fita simples (ssRNA).
[01005] O vírus pode ser um virus do mosaico, um retrovirus, um lentivírus, um adenovirus, vírus adenoassociado (AAV), virus de vaccinia, um poxvirus ou um virus da herpes simplex, mas a presente invenção não se limita aos mesmos.
[01006] Em. geral, a vírus pode infectar um. hospedeiro (por exemplo, células), assim, introduzindo um. ácido nucleico que codifica as informações genéticas do vírus no hospedeiro ou inserindo um ácido nucleico que codifica as informações genéticas no genoma hospedeiro. O ácido nucleico-guia e/ou proteína editora podem. ser introduzidos em. um indivíduo com. o uso de um vírus que tem. tal característica. O ácido nucleico-guia e/ou a proteína editora introduzidos com. o uso do vírus podem ser temporariamente expressos no indivíduo (por exemplo, células). Alternativamente, o ácido nucleico-guia e/ou a proteína editora introduzidos com o uso do vírus podem ser
continuamente expressos em un i indivíduo (por exempl< 3 f
células) por um longo tempo (por exemplo, 1, 2 ou
semanas, 1, 2, 3, 6 C) '[j meses, 1 ou 2 anos < D LI
permanentemente).
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 254/315 [01007]
A caoacidade de empacotamento do virus pode variar de pelo menos 2 kb a 50 kb de acordo com o tipo de vírus. Dependendo de tal capacidade de encapsulamento, um vetor viral incluindo um ácido nucleico-guia ou uma proteína editora ou um vetor viral incluindo tanto um ácido nucleico-guia quanto uma proteína editora pode ser projetado. Alternativamente, um vetor viral incluindo um ácido nucleico-guia, uma proteína editora e componentes adicionais pode ser projetado.
[01008] Em um exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um ácido nucleico-guia e/ou proteína editora pode ser entregue ou introduzida por um vírus do mosaico recombinante.
[01009] Em outro exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um ácido nucleico-guia e/ou proteína editora pode ser entregue ou introduzida por um adenovirus reco mb i n a n t e.
[01010] Em ainda outro exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um. ácido nucleico-guia e/ou proteína editora pode ser entregue ou introduzida por um. A AV reco mb i n a. n t e .
[01011]
Em ainda um outro exemplo, uma sequência de nucleicos codifica um ácido nucleico-guia e/ou proteína editora pode ser entregue ou introduzida por um virus híbrido, por exemplo, um ou mais híbridos do vírus listado no presente documento.
[01012] Além disso, um vetor pode ser incluído em uma bactéria e introduzido em um indivíduo.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 255/315 [01013] No presente documento, o vetor pode ser incluído em uma agrobactéria e introduzido em um indivíduo, mas a presente invenção não se limita aos mesmos.
[01014] Em geral, um método para transferir um material genético para um indivíduo com o uso de agrobactér ias é mais amplamente usado, e, no caso de uma planta, para modificar geneticamente a planta, o DNA das agrobactérias pode ser inserido no cromossomo de um corpo de planta em uma forma de uma proteína de ácido nucleico chamada plasmídeo. Isso pode servir para transferir um material genético para as células do corpo de planta, e o material genético transferido é fundido às células. O método descrito acima pode ser amplamente usado para produzir uma cultura modificada por gene de agrobactéria, e, diferente disso, o mesmo pode também ser usado como um sistema para estudar a reação de células à transformação genética.
INTRODUÇÃO COM BASE EM NÃO VETOR [01015] Uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um ácido nucleico-guia e/ou proteína editora pode ser entregue ou introduzida em um indivíduo com o uso de um. não vetor.
[01016] O não vetor pode incluir uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um ácido nucleico-guia e/ou proteína editora.
[01017] O não vetor pode ser DNA nu, um complexo de
DNA, mRN21 ou uma mistura dos mesmos.
[01018] O não vetor pode ser entregue ou
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 256/315
216/25 3 introduzido em um indivíduo por eletroporação, bombardeio de partículas, sonoporação, magnetofecção, aperto ou compressão de célula temporária (por exemplo, descrita na literatura [Lee, et al, (2012) Nano Lett., 12, 6.322 a 6.327]), transfecção mediada por lipídio, um dendrímero, nanopartícuias, fosfato de cálcio, silica, um silicato (Ormosil) ou uma combinação dos mesmos.
[01019] Como um exemplo, a entrega através de eletroporação pode ser realizada misturando-se células e uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um ácido nucleico-guia e/ou proteína editora em um cartucho, câmara ou cadinho e aplicando-se estímulos elétricos com uma duração e amplitude predeterminadas às células.
[01020] Em um outro exemplo, o não vetor pode ser entregue com o uso de nanopartículas. As nanopartícuias podem ser nanopartículas inorgânicas (por exemplo, nanopartículas magnéticas, silica, etc.) ou nanopartículas orgânicas (por exemplo, um lipídio revestido com. polietileno glicol (PEG), etc.) . A superfície externa das nanopartículas pode ser conjugada a um polímero positivamente carregado que é fixável (por exemplo, polietilenoimina, polilisina, polisserina, etc.).
[01021] Em uma determinada modalidade, o não vetor pode ser entregue com o uso de um invólucro de lipídio.
[01022] Em uma determinada modalidade, o não vetor pode ser entregue com o uso de um exossoma. O exossoma é uma nanovesívula endógena para transferir uma proteína e
RNA, que pode entregar RNA ao cérebro e outro órgão-alvo.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 257/315 [01023] Em uma determinada modalidade, o não vetor pode ser entregue com o uso de um lipossoma. O lipossoma é uma estrutura de vesícula esférica que é composta de bicamadas lipídicas lamelares múltiplas ou únicas que circundam compartimentos aquosos internos e uma bicamada de fosfolipídio lipofílica externa que é relativamente não transparente. Embora o lipossoma possa ser feito de diversos tipos diferentes de lipídios; fosfolipídios são mais geralmente usados para produzir o lipossoma como um c a r r e a d o r d e f á r m a c o .
[01024] Outros aditivos podem ser incluídos.
TI) ENTREGA NA FORMA DE PEPTÍDEO, POLIPEPTÍDEO OU PROTEÍNA [01025] Uma proteína editora na forma de um peptídeo, polipeptídeo ou proteína pode ser entregue ou introduzida em um. indivíduo por um método conhecido na t θ c n i c a. o [01026] A forma. de peptídeo, polipeptídeo ou proteína pode ser entregue ou introduzida em um indivíduo por eletroporação, microinjeção, aperto ou compressão de célula temporária (por exemplo, descrita na literatura [Lee, et al, (2012) Nano Lett., 12, 6.322 a 6.327]), transfecção mediada por lipídio, nanopartícuias, um lipossoma, entrega mediada por peptídeo ou uma combinação dos mesmos.
[01027] O peptídeo, polipeptídeo ou proteína pode ser entregue com uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um ácido nucleico-guia.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 258/315
218/253 [01028] Em urn exemplo, a transferência através eletroporação pode ser realizada misturando-se as células nas quais a proteína editora será introduzida com ou sem um ácido nucleico-guia em um cartucho, câmara ou cadinho e aplicando-se estímulos elétricos com uma duração e amplitude predeterminadas às células.
III) ENTREGA NA FORMA DE MISTURA DE ÁCIDO NUCLEICO E PROTEÍNA [01029] O ácido nucleico-guia e a proteína editora podem ser entregues ou introduzidos em um indivíduo na forma de um complexo de proteínas editoras e ácidos nu c1e i c o s-guia.
[01030] Por exemplo, o ácido nucleico-guia pode ser DNA, RNA ou uma mistura dos mesmos. A proteína editora pode ser um peptídeo, polipeptídeo ou proteína.
[01031] Em um. exemplo, o ácido nucleico-guia e a proteína editora podem, ser entregues ou introduzidos em um. indivíduo na. forma de um. complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia que contém um. ácido nucleico-guia do tipo RNA e uma proteína editora do tipo proteína, isto é, uma ribonucleoproteína (RNP).
[01032] Na presente invenção, como uma modalidade de um método para entregar o ácido nucleico-guia e/ou proteína editora em um indivíduo, a entrega de gRNA, uma enzima CRISPR ou um complexo de gRNA e enzima CRISPR será descrita abaixo.
[01033] Em uma modalidade da presente invenção, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o gRNA e/ou
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 259/315
219/253
enzima CRISPR será entregue ou introduzida em um indivíduo
com o uso de um vetor.
[01034] O vetor pode incluir a sequência de ácidos
nucleicos que codifica o gRNA t í/ou a enzima CRISPR.
[01035] Por exemplo, o vetor pode incluir
simultaneamente as sequência/ 3 de ácidos nucleicos que
codifica o gRNA e a enzima CRISPR.
[010.36] Por exemplo, o vetor pode incluir a
sequência de ácidos nucleicos c gue codifica o gRNA.
[010.37] Em um exemplo, os domínios contidos no gRNA
podem ser contidos em um vetoi 2, ou podem ser divididos e,
então, contidos em vetores dife í -T? θ Π t_. 6 S »
[010 3 8] Por exemplo, o vetor pode incluir a
sequência de ácidos nucleicos que codifica a enzima CRISPR.
[010.3 9] Em um exemplo, no caso da enzima CRISPR, a
sequência de ácidos nucleicos que codifica a enzima CRISPR
pode ser contida em um. vetoi 2, ou pode ser dividida e,
então, contida em diversos vete ores .
[01040] 0 vetor pode ir icluir um ou mais componentes
reguladores/de controle.
[010 41] No presente documento, os componentes
reguladores/de controle podem incluir um promotor, um
intensificador, um intron, um sinal de poliadenilação, uma
secmência de consenso Kozak, , um sítio de entrada de
ribossomo interno (IRES), um aceitante de splice e/ou sequência 2A.
[01042] 0 promotor podt 3 ser um promotor reconhecido
por RNA polimerase II.
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 260/315
[01 0 43] 0 promotor pode ser um promotor reconhecido
por RNA poli: meras. e III .
[01 044] 0 promotor pode ser um promotor induzível.
[01 0 45] 0 promotor pode ser um promotor específico
de indivíduo -
[01 0 4 6 ] 0 promotor pode ser um promotor viral ou
Π ci O viral.
[01 0 4 7] 0 promotor pode usa r um promotor adequado
de acordo co: m uma região d< e controle (isto é, uma sequência
de ácidos nucleicos que codifica o gRNA e/ou enzima
CRISPR).
[01048] Por exemplo, urn promotor útil para o gRNA pode ser um promotor Hl, EF-la, tRNA ou U6 . Por exemplo, um. promotor útil para, a enzima CRISPR pode ser um promotor CMV, EF-la, EFS, MSCV, PGK ou CAG.
[01049] Por exemplo, um promotor útil para o ácido nucleico-guia e/ou a proteína editora pode ser um promotor de expressão específico de raiz, um promotor específico de semente, promotor indizível de expressão de corpo inteiro ou um promotor específico de folha ou outros tecidos.
[01050] O vetor pode ser um. vetor viral ou vetor viral recombinante.
[01051] O vírus pode ser um vírus de DNA ou um virus de RNA.
[01052] No presente documento, o vírus de DNA pode ser um vírus de DNA de fita dupla (dsDNA) ou vírus de DNA de fita simples (ssDNA).
[01053] No presente documento, o vírus de RNA pode
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 261/315 ser ura vírus de RNA de fita simples (ssRNA).
[01054] O virus pode ser um virus do mosaico, um retrovirus, um lentivirus, um adenovirus, virus adenoassociado (AAV), virus de vaccinia, um poxvirus ou um virus da herpes simplex, mas a presente invenção não se limita aos mesmos.
[01055] Em geral, a virus pode infectar ura hospedeiro (por exemplo, células), assim introduzindo ura ácido nucleico que codifica as informações genéticas do virus no hospedeiro ou inserindo um ácido nucleico que codifica as informações genéticas no genoma hospedeiro. O gRNA e/ou a enzima CRISPR pode ser introduzida em ura indivíduo com o uso de um vírus que tem tal característica. O gRNA e/ou a enzima CRISPR introduzida com o uso do vírus pode ser temporariamente expressada no indivíduo (por exemplo, células). Alternativamente, o gRNA e/ou a enzima CRISPR introduzida com o uso do vírus pode ser continuamente expressada em. um indivíduo (por exemplo, células) por um tempo longo (por exemplo, 1, 2 ou 3 semanas, 1, 2, 3, 6 ou 9 meses, 1 ou 2 anos, ou permanentemente).
[01056] A capacidade de empacotamento do vírus pode variar de pelo menos 2 kb a 50 kb de acordo com o tipo de vírus. Dependendo de tal capacidade de empacotamento, um vetor viral que inclui apenas gRNA ou uma enzima CRISPR ou um vetor viral que inclui tanto um gRNA quanto uma enzima CRISPR pode ser projetado. Alternativamente, um vetor viral que inclui gRNA, uma enzima CRISPR e componentes adicionais
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 262/315 pode ser projetado.
[01057] Em um exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica gRNA e/ou uma enzima CRISPR pode ser entregue ou introduzida por um virus do mosaico recombinante.
[01058] Em um outro exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica gRNA e/ou uma enzima CRISPR pode ser entregue ou introduzida por um adenovirus r e c o mb i nant e.
[01059] Em ainda outro exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica gRNA e/ou uma enzima CRISPR pode ser entregue ou introduzida por um AAV recombinante.
[01060] Em ainda um outro exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica gRNA e/ou uma enzima CRISPR pode ser entregue ou introduzida por um ou mais híbridos de vírus híbridos, por exemplo, os vírus descritos no presente documento.
[01061] O vetor pode ser incluído em uma bactéria e introduzido em. um indivíduo.
[01062] No presente documento, o vetor pode ser incluído em uma agrobactéria e introduzido em um indivíduo, mas a presente invenção não se limita aos mesmos.
[01063] Como um exemplo, um vetor que Inclui uma
sequência de á cidos nucleicos (ou sequências i de ácidos
nucleicos) que c o d i f i c a gRNA e / < su uma enzima CRISPR pode
ser incluído em de planta. uma agrobactéria e i n t r o du z i d o em um corpo
[01064] Em uma modalidade exemplif icativa da
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 263/315 presente invenção, o complexo de gRNA e enzima CRISPR pode ser entregue ou introduzido em um indivíduo.
Por exemplo, o gRNA pode estar presente na forma de DNA,
RN A ou uma mistura mesmos.
CRISPR pode estar presente na forma de um peptídeo, polipeptídeo ou proteína.
[01066] Em um exemplo, o gRNA e a enzima CRISPR pode ser entregue ou introduzido em um indivíduo na forma de um complexo de gRNA e enzima CRISPR incluindo gRNA do tipo RNA e uma CRISPR do tipo proteína, isto é, uma ribonucleoproteina (RNP).
[01067] O complexo de gRNA e enzima CRISPR pode ser entregue ou introduzido em um indivíduo por eletroporação, microinjeção, compressão ou aperto de célula transiente (por exemplo, descrito na literatura [Lee, et al, (2012) Nano Lett., 12, 6.322 a 6.327]), transfecção mediada por lipídio, nanopartícuias, um. lipossomo, entrega mediada, por peptídeo ou uma combinação dos mesmos.
8. TRANSFORMANTE [01068] O termo transformante refere-se a um. organismo no qual um ácido nucleico-guia, proteína editora ou complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia é introduzido, um organismo no qual um ácido nucleico-guia, proteína editora ou complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia é expressado, ou um espécime ou amostra obtida a partir do organismo.
[01069] O transformante pode ser um organismo no qual um ácido nucleico-guia, proteína editora ou complexo
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 264/315 de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia é introduzido na forma de DNA, RNA ou uma mistura dos mesmos.
[01070] Por exemplo, o transformante pode ser um organismo no qual um vetor incluindo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um ácido nucleico-guia e/ou proteína editora é introduzido. No presente documento, o vetor pode ser um vetor não viral, vetor viral ou vetor viral recombinante.
[01071] Em um outro exemplo, o transformante pode ser um organismo no qual uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um ácido nucleico-guia e/ou proteína editora é introduzido em uma forma de não vetor. No presente documento, o não vetor pode ser DNA nu, um. complexo de DNA, mRNA ou uma mistura dos mesmos.
[01072] O transformante pode ser um organismo no qual um ácido nucleico-guia, proteína editora ou complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia. é introduzido na forma de um. peptídeo, polipeptídeo ou proteína.
[01073] O transf ormante pode ser um. organismo no qual um ácido nucleico-guia, proteína editora ou complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia. é introduzido na forma de DNA, RNA, um peptídeo, um polipeptídeo, uma proteína ou uma mistura dos mesmos.
[01074] Por exemplo, o transformante pode ser um organismo no qual um complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia incluindo um ácido nucleico-guia do tipo RNA e uma proteína editora do tipo proteína é
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 265/315 [01075] O transformante pode ser um organismo que inclui um ácido nucleico, gene, cromossomo ou proteína alvo do complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia.
[01076] O organismo pode ser células, tecido ou uma planta.
[01077] As células pode ser células procarióticas ou células eucarióticas.
[01078] As células eucarióticas podem ser células vegetais, mas a presente invenção não se limita às mesmas.
[01079] O tecido pode ser tecido de um corpo de planta, como uma raiz, um caule, uma folha, uma flor, um fruto ou um calo, e semelhantes, etc.
[01080] O transformante pode ser um corpo de planta no qual um ácido nucleico-guia, proteína editora ou complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia é introduzido ou expressado, ou um espécime ou amostra obtida do corpo de planta.
[01081] O espécime ou amostra pode ser uma raiz, um. caule, uma folha, uma flor, um fruto, um calo ou células dos mesmos.
[ U S O j [01082] Uma modalidade exemplificativa da presente invenção se refere a um uso para produzir uma composição para manipular artificialmente um fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados de um indivíduo, como uma planta, um corpo de planta no qual o teor de um ácido graxo insaturado específico é controlado por um fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 266/315
2 6/2 5 3 artificialmente manipulado, ou um produto processado com o uso dos mesmos.
ÁCIDOS GRAXOS INSATURADOS ESPECÍFICOS
SOJA (GLYCINE MAX L.) [01083] A soja é a cultura mais amplamente cultivada no mundo, e fornece o óleo vegetal de qualidade mais alta e proteínas em termos de produção e uso. A
Figure BR112019012779A2_D0010
método de método de nó cotiledonar (CN) (Hinchee et al., 1988, Nat. Biotechnol., Volume 6, 915 a 922), e recentemente, um sistema para produzir um transformante estável foi melhorado com o uso de explantes meio visíveis (Paz et al., 2006, Plant Cell Rep., Volume 25, 206 a 213) . Além disso, a aplicação de uma volta em um. sítio-alvo com o uso de um. uso misturado de um composto de tiol, um. concentrado de agrobactéria e uma degradação de ultrassom. resultaram. em uma melhora. positiva na eficácia. de transformação (Meurer et al., 1998, Plant Cell Rep., Volume 18, 180 a 186; Olhoft et al., 2003, Planta, Volume 216, 723 a 735; Kim et al., 2013, Plant Biotechnol Rep., Volume 7, 425 a 433; Kim et al., 2016, Plant Biotechnol Rep., Volume 10, 257 a 267).
[01084] A soja contém cerca de 2 0% de gordura na composição total, e a gordura consiste em ácidos graxos. Os
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 267/315 ácidos graxos consistem em ácidos graxos saturados e ácidos graxos insaturados. Os ácidos graxos insaturados consistem em ácido oleico, ácido linoleico e ácido oí-linolênico. Entre os mesmos, o ácido cx-linolênico é um ácido graxo ômega 3 vegetal, o qual foi conhecido por inibir o crescimento de célula de câncer, prevenir uma doença cardiovascular, inibir a inflamação e coagulação sanguínea, e degradar a gordura. 0 ácido linolênico é um ácido graxo ômega 6, e é conhecido por promover o crescimento de célula de câncer, reduzir a pressão sanguínea, produzir inflamação e trombos, e acumular gordura, diferente de ácido oí1inolênico.
[01085] Fo.i relatado que uma baixa razão de ômega 6/ômega 3 em gorduras tem um efeito de inibir as doenças mencionadas acima. Em alguns exemplos, quando a razão é 4:1, a prevenção de uma doença cardiovascular pode ser excelente e a circulação sanguínea pode ser melhorada, quando a razão é 2 a 3:1, a inflamação de artrite reumatoide pode ser inibida, e, portanto, a razão mais ideal é conhecida como 2 a 1:1. O óleo de soja contém 54% do ácido graxo ômega 6 e 8% do ácido graxo ômega 3, e uma razão entre os dois ácidos graxos é significativamente alta a 6 a 7:1.
[01086] No metabolismo de ácido graxo insaturado de
soja, s ;e sabe que um gene FAD2 serve para mudar o ácido
oleico P ara ácido linoleico, e um ge ne FAD3 serve para
mudar ácido lin o i e i c o p a r a ácido α-linolênico. No
metabo1 ismo de ác: ído graxo, as variaç :ões no conteúdo de
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 268/315
2 8 / 2 5 3 ácido oleico e ácido linoleico pela mutação do gene FAD2 foram relatadas. Quando há uma mutação no gene FAD2, o teor de ácido oleico é aumentado, e o teor de ácido linoleico é diminuído, de modo que a razão entre o ácido linoleico e o ácido α-linolênico fosse ajustada, mas há uma limitação na constatação de uma razão satisfatória de 4:1 ou menos. Portanto, é necessário controlar o conteúdo de ácido oleico e ácido linoleico.
ÁCIDOS GRAXOS INSATURADOS ESPECÍFICOS [01087]
Uma modalidade exemplificativa da presente invenção pode dotar um corpo de planta de teor aumentado de um ácido graxo insaturado especifico ou um produto processado com. o uso do mesmo.
[01088] No presente documento, o ácido graxo insaturado especifico pode ser um ácido graxo insaturado C8 [01089] O ácido graxo insaturado especifico pode ser um. ácido graxo insaturado C16 a 22:D1.
[01090] O ácido graxo insaturado especifico pode ser um. ácido graxo insaturado C18:D1.
[01091] O ácido graxo insaturado especifico pode ser ácido oleico.
[01092] Alternativamente, o ácido graxo insaturado especifico pode ser um ácido graxo insaturado produzido removendo-se uma ligação dupla a partir de um ácido graxo insaturado C8 a
24:D2, o ácido graxo nsaturado especifico pode
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 269/315 ser um ácido graxo insaturado produzido removendo-se uma ligação dupla a partir de um ácido graxo insaturado C16 a 22:D2, o ácido graxo insaturado específico pode ser um ácido graxo insaturado produzido removendo-se uma ligação dupla a partir de um ácido graxo insaturado C18:D2, e o ácido graxo insaturado específico pode ser um ácido graxo insaturado produzido removendo-se uma ligação dupla a partir de ácido linoleico.
[01093] Outra modalidade exemplificativa da presente invenção refere-se a um corpo de planta com teor diminuído de um ácido graxo insaturado específico ou um. produto processado produzido com o uso do mesmo.
[01094] No presente documento, o ácido graxo insaturado específico pode ser um ácido graxo insaturado C8 a 2 4 : D 2 .
[01095] 0 ácido graxo insaturado específico pode
ser um. ácido graxc ) i. n s a t u r a d o C N6 a 22:D2.
[01096] 0 ácido graxo insaturado específico pode
ser um. ácido graxc ) i. n s a t u r a d o C N 8 : D2 .
[01097] 0 ácido graxo insaturado específico pode
ser ácido linoleico.
[01098] A11 e r n a t i v ame n t e f
o ácido graxo insaturado específico pode
ser um ácido graxo insaturado produzido formando-se uma
ligação dupla em um ácido graxo insaturado C8 a 24:D1,
o ácido graxo insaturado específico pode
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 270/315 ser um ácido graxo insaturado produzido formando-se uma ligação dupla em um ácido graxo insaturado C16 a 22:Dl, o ácido graxo insaturado específico pode ser um ácido graxo insaturado produzido formando-se uma ligação dupla em um ácido graxo insaturado C18:D1, e o ácido graxo insaturado específico pode ser um ácido graxo insaturado produzido formando-se uma ligação dupla em ácido oleico.
[01099] A11 e r n at i vame nt e, o ácido graxo insaturado específico pode ser um ácido graxo insaturado produzido removendo-se uma ligação dupla a partir de um ácido graxo insaturado C8 a
24:D3, o ácido graxo insaturado específico pode ser um ácido graxo insaturado produzido removendo-se uma ligação dupla a partir de um ácido graxo insaturado C16 a 22:03, o ácido graxo insaturado específico pode ser um ácido graxo insaturado produzido removendo-se uma ligação dupla a partir de um ácido graxo insaturado C18:D3, o ácido graxo insaturado específico pode ser um ácido graxo insaturado produzido removendo-se uma ligação dupla de ácido α-linolênico.
[01100] Em uma modalidade, o ácido graxo insaturado especifico pode ser um ácido graxo insaturado Cl8:Dl ou um ácido graxo insaturado C18:D2.
[01101] Em uma modalidade, o ácido graxo insaturado
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 271/315 específico ser acia oleico ou acia linoleico.
[01102] Em uma outra modalidade exemplificativa, a presente invenção pode fornecer um uso de um sistema para controlar um terceiro mecanismo adicional em um corpo, o qual é envolvido em várias funções de um fator específico cuja função é artificialmente modificada (por exemplo, um gene conhecido como um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados).
[01103] Por exemplo, o fato r espe cif: íco cu; ja função
é artificialmente m o d i f i c a d a p o d e s e r um ou ma is genes
selecionados a par tir de um gene FAD2, um gene FAD3, um
gene FAD6, um gene FAD7 e um gene F AD8 .
[01104] O terceiro mecanismo pode ser um mecanismo em. um corpo de planta, diferente da biossíntese de um ácido graxo insaturado, envolvido nesses genes.
COMPOSIÇÕES PARA CONTROLAR ÁCIDO GRAXO INSATURADO [01105] Uma modalidade exemplificativa da presente invenção refere-se a uma composição usada para controlar o teor de um ácido graxo insaturado de uma planta, com o uso de um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulados.
[01106] A composição pode incluir um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulados ou uma composição de manipulação que pode manipular artificialmente uma biossíntese de ácidos graxos insaturados associada.
iLlTl UlTicimodalidade exemplificativa,
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 272/315
2/2 5 3 composição pode incluir um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulados, isto é, um gene e/ou uma proteína.
[01108] Em uma modalidade exemplificativa, a composição pode incluir uma composição de manipulação que pode manipular artificialmente um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados.
[01109] A c o mp o s i ç: ã o de ma nipulação pode inc 1 u i i ? um
c o mp1e x o d e ρ roteínas editor a s e a cidos nucleicos-gu Ϊ ci *
[OHIO] A c o mp o s i ç: ã o de ma nipulação pode inc 1 u i i ? um
ácido nucleic o-guia e/ou pro teí na editora.
[01111] A c o mp o s i ç: ã o de ma nipulação pode inc 1 u i i ? um
ácido nuclei c o que c o d _i f i c a á c _i d o n u c 1 e i c o - g u i. . ã € 5/ ou
proteína edit ora.
[01112] A c o mp o s i ç: ã o de ma nipulação pode inc 1 u i i ? um
vírus que compreende um ácido nucleico que codifica o ácido nucleico-guia e/ou proteína editora.
[01113] Em. uma outra modalidade exemplificativa, a composição pode incluir, ainda, um. elemento adicional.
[01114] 0 fator adicional pode incluir um carreador adequado para transferir o mesmo para um corpo de planta de um i ndivíduo.
[01115] Em uma modalidade exemplificativa, a composição pode incluir um produto de expressão de um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados que é manipulado a uma quantidade suficiente para aumentar ou diminuir o teor de um ácido graxo insaturado especifico.
[01116] A quantidade suficiente para aumentar ou
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 273/315 diminuir o teor de um ácido graxo insaturado específico significa uma quantidade eficaz necessária para aumentar ou diminuir o teor de um ácido graxo insaturado específico. [01117] Em uma modalidade exemplificativa, a presente invenção pode fornecer composições para controlar um ácido graxo insaturado conforme a seguir:
Uma composição para controlar o teor de um ácido graxo insaturado específico, que inclui um ácido nucleico-guia com capacidade para formar uma ligação complementar independentemente com uma ou mais sequênciasalvo na sequência de ácidos nucleicos de um ou mais genes selecionados dentre o grupo que consiste em um gene FAD2, um. gene FAD3, um gene FAD6, um gene FAD7 e um gene FAD8, ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica os mesmos, e uma proteína editora ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a mesma;
uma composição para controlar o teor de um. ácido graxo insaturado específico, que inclui um ácido nucleico-guia com capacidade para formar uma ligação complementar independentemente com uma sequência-alvo de um. ou mais genes selecionados dentre o grupo que consiste em. um gene FAD2, um gene FAD3, um gene FAD6, um gene FAD7 e um gene FAD8, ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica os mesmos; e uma proteína editora ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a mesma; e uma composição para controlar o teor de um ácido graxo insaturado específico, que inclui um complexo
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 274/315 formado de um ácido nucleico-guia com capacidade para formar uma ligação complementar independentemente com uma sequência-alvo de um ou mais genes selecionados dentre o grupo que consiste em um gene FAD2, um gene FAD3, um gene FAD6, um gene FAD7 e um gene FAD8, ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica os mesmos, e uma proteína editora.
Figure BR112019012779A2_D0011
mais vetores. Os mesmos podem estar presentes na forma de um. vetor homologo ou neterologo.
MÉTODO PARA CONTROLAR ÁCIDO GRAXO
INSATURADO [01119] Em uma outra modalidade exemplificativa da presente invenção, a presente invenção fornece um. método para controlar o teor de um ácido graxo insaturado, que inclui produzir a composição descrita acima e administrar uma quantidade eficaz da composição a um corpo de plantaalvo.
MANIPULAÇÃO DE GENE [01120] Um método para controlar o teor de um ácido graxo insaturado manipulando-se o gene de um corpo pode ser usado. Tal método de controle pode consistir em introduzir a composição para manipulação genética para manipular o gene de um corpo de planta no corpo de planta.
[01121] A composição para manipulação genética pode
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 275/315 incluir ura complexo de proteínas editoras e ácidos nucleicos-guia.
[01122] A composição para manipulação genética pode ser injetada em um tipo de planta especifico.
[01123] No presente documento, o tipo de planta específico pode ser uma semente, mas a presente invenção não se limita aos mesmos.
[01124] Em um aspecto, a presente invenção pode fornece rum método para modificar um polinucleotídeo-alvo em células vegetais.
[01125] Em uma modalidade exemplificativa, o método inclui obter células ou uma população de células de uma planta como uma amostra, e modificar as células ou população de células. O cultivo pode ser realizado em qualquer etapa fora de um corpo de planta. A célula ou células podem ser re-introduzidas em uma planta.
[01126] Além disso, em outra modalidade exemplificativa, a presente invenção pode fornecer um método para manipular artificialmente as células, as quais incluem:
introduzir (a) um ácido nucleico-guia com capacidade para formar uma ligação complementar com cada uma das sequências-alvo de um ou mais genes selecionados dentre o grupo que consiste em um gene FAD2, um gene FAD3, um gene FAD6, um gene FAD7 e um gene FAD8, ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica os mesmos; e (b) uma proteína editora que inclui uma ou mais proteínas selecionadas dentre o grupo que consiste em
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6/25 3 uma proteína Cas9 derivada de Streptococcus pyogenes, uma proteína Cas9 derivada de Campylobacter jejuni, uma proteína Cas9 derivada de Streptococcus thermophilus, uma proteína Cas9 derivada de Staphylococcus aureus, uma proteína Cas9 derivada de Neisseria meningitidis e uma proteína Cpfl ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a mesma para as células vegetais.
[01127] O ácido nucleico-guia e a proteína editora podem estar presentes em um ou mais vetores na forma de uma sequência de ácidos nucleicos, ou em um complexo de uma combinação do ácido nucleico-guia e a proteína editora.
(01128]
Uma técnica da seção descrita acima 7.
Entrega pode ser referenciada antes da etapa de introdução.
[01129] exempi.
o estágio de introdução pode ser alcançado por um ou mais métodos selecionados dentre uma biobalística, eletroporaçao, iipo s s ornas, ρ1a s mio e o s, vetores virais, nanopartícuias, e um método de proteína de fusão de domínio de translocação de proteínas (PTD).
[01130] Por exemplo, o vetor viral pode ser um ou mais vírus selecionados dentre o grupo que consiste em. um. vírus do mosaico, um retrovirus, um lentivírus, um adenovirus, vírus adenoassociado (AAV), vírus de vaccinia, um poxvirus e um vírus da herpes simplex.
[01131] Por exemplo, um vetor pode estar incluído em agrobactérias e ser introduzido.
[01132] Quando um fator associado à biossintese de ácidos graxos insaturados é artificialmente manipulado com
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 277/315 o uso dos métodos e composições de acordo com algumas modalidades exemplificativas da presente invenção, é possível controlar o tipo e/ou teor de um ácido graxo insaturado, por exemplo, um aumento ou uma diminuição de um ácido graxo insaturado específico, e/ou uma mudança no teor de um ácido graxo insaturado específico, e portanto, uma planta na qual um ácido graxo insaturado vantajoso para saúde humana é aumentado ou um ácido graxo insaturado nocivo é diminuído, e/ou um produto processado (alimento, etc.) do mesmo pode ser obtido.
US0S ADICIONAIS [01133] Em qualquer modalidade exemplificativa, a presente invenção pode fornecer um kit para preparar uma composição para controlar o teor de um ácido graxo insaturado, o qual inclui a composição.
[01134] O kit pode ser preparado por um método de preparação convencional conhecido na técnica.
[01135] O kit pode incluir, ainda, uma identificação detectável. O termo identificação detectável refere-se a um átomo ou molécula para detectar especificamente uma molécula que contém uma identificação entre o mesmo tipo de moléculas sem uma identificação. A
ide ntificação detectável pode ser af IxaClcL cl um anticorpo
que se liga especificamente a uma pro t Θ1Π 5. O 'U í um fragmento
do mesmo, uma proteína de inte r a ç a o f um ligando,
nanopartícuias, ou um aptâmero. A ide n 11 f ± c a ς tão detectável
pode incluir um radionuclídeo, um tluoróforo, e uma enzima.
[01136] Em qualquer modalidade exemplificativa, a
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8/2 5 3
presente invenção pode fornecer um método P a r a t £ i a. r um
material com capacidade para controlar um nível de
expressão de um ou mais genes selecionados a partir de um
gene FAD2 gene FAD8„ , um gene FAD3, um gene FAD6, um , os quais são artificialmente man: gene FAD7 e Lpulados. um
[01137] Em qualquer modalidade exemplificativa, a presente invenção pode fornecer um método para fornecer informações na sequência a uma posição-alvo artificialmente manipulada a um indivíduo analisando-se a sequência de um ou mais genes selecionados dentre o grupo que consiste em um gene FAD2, um gene FAD3, um gene FAD6, um gene FAD7 e um gene FAD8.
[01138] Além disso, a presente invenção fornece um.
método de construir uma. biblioteca com. o uso das i n f o r m a ç õ e s f o r n e c i d a s .
[01139] No presente documento, um banco de dados conhecido pode ser usado.
[01140] Em modalidades exemplificativas específicas, a presente invenção pode fornecer uma planta ou células que podem ser usadas para pesquisa com. o uso do método da presente invenção.
[01141] Uma planta ou células que incluem uma edição de cromossomo em uma ou mais sequências de ácidos nucleicos associadas à biossintese de um ácido graxo insaturado podem ser produzidas com o uso do método da presente invenção. A sequência de ácidos nucleicos pode ser uma sequência que pode codificar uma sequência de proteína associada à biossintese de um ácido graxo insaturado, ou
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3 9 / 2 5 3 uma sequência de referência associada à biossíntese de um ácido graxo insaturado.
[01142] Em uma modalidade exempli ficativa, o efeito
de mutação e o mecanismo da biossíntese de um ácido graxo
insaturado po de ser estudado em uma plant a ou células com o
uso de medição convencionalmente usado em um estado relacionado à biossíntese de um ácido graxo insaturado com o uso da planta ou células fabricadas pelo método da presente invenção. Alternativamente, o efeito de um composto ativo na biossíntese de um ácido graxo insaturado pode ser estudado com o uso da planta ou células.
[01143] Em uma outra modalidade exemplificativa, o efeito de uma estratégia de manipulação de genes disponível pode ser avaliado com o uso da planta ou células fabricadas pelo método da presente invenção. Em outras palavras, modificando-se uma sequência cromossômica que codifica uma proteína relacionada à biossíntese de um ácido graxo
insaturado, a biossínte ;se do ácido graxo in saturado
c o r r e s p o n d ente pode ser promovida ou inibida.
Part i c u1arme nt e, esse mé todo inclui formar uma proteína
m o d i f i c a da e d itando-se uma sequência cromossôm ica que
codifica uma proteína relacionada èi biossíntese de um ácido graxo insaturado, o que resulta na modificação da planta ou células. Portanto, em algumas modalidades exemplificativas, um efeito da planta geneticamente modificada pode ser avaliada comparando-se um mecanismo da biossíntese de um ácido graxo insaturado com aquele de um tipo selvagem.
[01144] A planta geneticamente modificada pode ser
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 280/315 usada para produzir um corpo diminuir em ácidos graxos in fator associado à biossíntese artificialmente manipulado e ácido graxo insaturado, que é função pelo mesmo. Através do envolvidos em uma variedad de planta que é aumentado ou saturados específicos por um de ácidos graxos insaturados um sistema para controlar um artificialmente modificado em controle de vários mecanismos b de f a t ores a, s s o c i a d o s a biossíntese de ácidos graxos insaturados, um sistema para controlar um ácido graxo insaturado pode ser melhorado.
[EXEMPLOS] [01145] Doravante, a presente invenção será descrita em detalhes adicionais com referência aos exemplos.
[01146] Estes exemplos são meramente fornecidos para descrever a presente invenção em detalhes adicionais, e pode ser óbvio para aqueles de habilidade comum na técnica que o escopo da presente invenção não é limitado aos exemplos a seguir.
MÉTODOS EXPERIMENTAIS . PROJETO de gfRNA [01147] Um. sítio-alvo de CRISPR/Cas9 de um gene
FAD2 de soja foi selecionado com o uso de ferramentas de CRISPR RGEN (Institute for Basic Science, Coréia). O sítioalvo de cada gene pode ser diferente de acordo com o tipo de uma enzima CRISPR, e uma sequência-alvo do gene para SpCas9 foi resumida na Tabela 1 descrita acima.
2. CONSTRUÇÃO DE VETOR PARA TRANSFORMAÇÃO
DE SOJA
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241/253
[01148] Em um teste de tn ansformação de sc zja, um
vetor pPZP i .ncluindo gRNA de FAD2-7 ou FAD2-30 para alve j ar
um gene FAD( 2 foi usado, e o vetor também inclui Ca s9 . i Jma
cepa de Agrobacterium tumefaciens, EHA105, foi transformada com o os vetores pPZP-FAD2~7 e pPZP-FAD2-30 construídos (Figura 1).
3. TRANSFORMANTES DE SOJA E PRODUÇÃO DE SEMENTES T1
1) ESTERILIZAÇÃO E EMBEBIMENTO DE SEMENTES [01149] As sementes foram esterilizadas com gás de ácido clorídrico gerado misturando-se alvejante de cloro (100 ml de 12% de hipoclorito de sódio) com ácido clorídrico forte (HC1 12 N, 5 ml) por 20 horas, cultivado em suspensão em 1% de hipoclorito de sódio por 10 minutos para esterilização secundária, e lavado com água estéril três vezes em. um intervalo de 10 minutos. Cada uma das sementes estéreis foi colocada em um tubo cônico de 50 ml, e então, a água estéril foi vertida no tubo cônico para realizar o embeb.im.ento à temperatura ambiente por 20 horas.
2) PREPARAÇÃO DE INOCULAÇÃO (AGROBACTERIUM TUMEFACIENS) [01150] Em um teste de transformação de soja, os vetores pPZP-FAD2-7 e pPZP-FAD2-30 construídos na cepa Agrobacterium tumefaciens EHA105 foram usados, e incluem PPTR. Uma cepa bacteriana que contém o vetor foi riscada em
um meio YEP sólido [75 mg/1 de e s ρ e c t i n o m i c i n a, 2.5 mg/1 de
rifampicina, 10 g/1 de peptona, 5 g/1 de NaCl, 5 g/1 de um
extrato de levedura , 1,5% (p/v) ágar (pH 7,0)] e cultivada
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242/253 a 28 °C, assim obtendo uma colônia única. A colônia suspensa em 10 ml de um meio YEP líquido que contém o mesmo antibiótico incluído no meio YEP sólido, e agitada a 220 rpm a 2 8 °C até OD6 5 0 alcançar 0,6 a 0,8. 10 ml de um estoque de 30% de glicerol foram adicionados a e misturados com células bacterianas completamente cultivadas, 1 ml da suspensão de célula foi dispensada em cada tubo de 1,5 ml, rapidamente resfriada com nitrogênio líquido, e armazenada a -70 °C. Um dia antes da inoculação, 1 ml do estoque de Agrobacteri um tumef adens que foi armazenado a -70 °C foi adicionado a 200 ml de um meio YEP líquido que contém um antibiótico, e cultivado por agitação em uma incubadora a 250 rpm. a 25 °C até OD650 alcançar 0,6 a 0,8. No dia de inoculação, 200 ml de um. meio YEP líquido foram divididos em 50 ml, e centrifugados a 20 °C e 3.270 g por 10 minutos. 15 ml de um meio de cocultivo líquido (CCM; 0,32 g/1 de sal B5, 1,67 mg/1 de BA, MES 20 mM, 0,25 mg/1 de GA3, acetoseringona 0,2 mM, L-Cisteína 3,3 mM, tiossulfato de sódio 1,0 mM, DTT 1,0 mM, 3% de sacarose, pH 5,4) foram, adicionados ao pélete de Agrobacterium turnefaciens em cada tubo.
3) INOCULAÇÃO E COCULTIVO [01151] Após a semente embebida ter sido verticalmente cortada até o hipocótilo por um bisturi inserido entre ambas as cotiledôneas, um revestimento de semente foi removido. O eixo geométrico embrionário foi cortado a cerca de 1 cm além da cotiledônea, e um lado ao qual o eixo geométrico embrionário foi afixado foi
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4 3 / 2 5 3
Figure BR112019012779A2_D0012
alvo. Cerca de 50 explantes foram colocados em cocultura de 15 ml/Agrobacterium tumefaciens e sonicados por 20 segundos, seguidos por inoculação por 30 minutos. Após cada explante ter sido retirado do tubo e colocado em um filtro de papel para remover a umidificação, uma folha de papel de filtro foi colocada em CCM sólido (o mesmo que o CCM liquido, ágar (0,7%)), e, então, 10 explantes foram colocados no mesmo (para colocar o lado adaxial para baixo) . Ά placa foi vedada com uma fita de microporos, e cocultivada fotoperiodicamente por 18 horas a 25 °C por 5 dias .
4) INDUÇÃO DE LAVAGEM E BROTO [01152] Cinco dias após a cocultura, os explantes foram brevemente lavados com um meio de indução de 1/2 broto líquido (SIM) por 10 minutos para esterilização. Os explantes foram, colocados em um. papel de filtro para remover a umidificação, e, então, seis explantes por placa foram embebidos em placas que contêm SI-Ql) livre de antibiótico selecionável (meio de indução de broto; 3,2 g/1 de sal B5, 1,67 mg/1 de BA, MES 3 mM, 0,8% de ágar, .3% de sacarose, 250 mg/1 de cefotaxima, 50 mg/1 de vancomicina, 100 mg/1 de ticarcilina, pH 5,6), e uma parte de regeneração do explante foi posicionada com o lado para cima em um ângulo de cerca de 30°. Cada placa foi vedada com uma fita de microporos e cultivada fotoperiodicamente a
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[01153] Após duas semanas, os explantes de broto foram embebidos em 10 mg/1 de SI-l^.J que contém PPT antibiótico selecionável (o mesmo que SI-UJ, 10 mg/1 de DLfosfinotricina foram adicionados, pH 5,6), e a outra parte que exclui um broto foi removida e embebida de modo que a parte adaxial fosse voltada para baixo.
5) ALONGAMENTO DE BROTO [01154] Após duas semanas, um broto escurecido/placa de broto foi excisado com um bisturi (lâmina n° 15) e embebido em um meio de alongamento de broto que contém PPT de antibiótico selecionável 5 mg/1 (SEM; 4,4 g/1 de de sal de MS, MES 3 mM, GA.3 0,5 mg/1, asparagina 50 mg/1, ácido piroglutâmico 100 mg/1, IAA 0,1 mg/1, zeatina 1 mg/1, 3% de sacarose, 0,6% de ágar, cefotaxima 250 mg/1, vancomicina 50 mg/1, ticarcilina 100 mg/1, DL-fosfinotricina 5 mg/1, pH 5,6). A cada duas semanas, o broto/placa de broto foi transferida para SEM fresco, e a parte escurecida do broto foi removida usandose o lado superior de um. bisturi. (lâmina n° 15), e a placa de broto foi. raspada gradualmente para que o meio fosse bem. absorvido. Quando o broto foi cultivado para a placa da placa de petri, duas placas de petri (100 mm x 40 mm) foram empilhadas de modo que o fosse cultivado a cerca de 8 cm. Cada placa foi vedada com uma fita de microporos, e incubada fotoperiodicamente a 25 °C por 18 horas.
6) ENRAIZAMENTO, ACLIMATIZAÇÃO E PINTURA DE
FOLHA DE PPT
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 285/315 [01155] Quando o broto alongado através da seleção em SEM foi 4 cm ou mais, o broto foi excisado com um bisturi (lâmina n° 11) e transferido para um meio de enraizamento (RM; 4,4 g/1 de sal de MS, MES 3 mM, 3% de sacarose, 0,8% de ágar, cefotaxima 50 mg/1, vancomicina 50 mg/1, ticarcilina 50 mg/1, asparagina 25 mg/1, ácido piroglutâmico 25 mg/1, pH 5,6) . No presente documento, a parte inferior do broto alongado separado por corte foi imersa em IBA 1 mg/ml por três minutos, e então, colocado em um tubo de teste que contém RM.
[01156] Quando a raiz foi suficientemente cultivada, o meio foi removido por lavagem da raiz com água destilada terciária. A raiz cultivada foi transplantada em. um. pote pequeno (6 cm x 6 cm χ 5,6 cm) que contém uma mistura de solo de leito (Bio Plug n° 2, semeadura Heungnong) e vermiculite (2 : 1) e colocada em. uma. caixa Magenda. Cerca de 10 dias depois, uma superfície de folha foi pintada com DL-fosfinotricina 100 mg/1.
7) PRODUÇÃO DE SEMENTES TI [01157] Quando o corpo de planta foi suficientemente cultivado, o corpo de planta foi transplantado em um pote maior, e coberto com uma tampa de plástico transparente que tem cerca de 10 poros. 21pós 10 dias, o corpo de planta foi tratado com Basta® (BAYER, 53 mg/1) . Como resultado, não transformantes (Glycine max L. Kwangan, NT) reagiram sensivelmente e, desse modo, falharam, mas os transformantes não mostraram qualquer mudança e exibiram resistência. Nove transformantes de soja
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46/25 3 (oito pPZP~FAD2~7 e um pPZP~FAD2~30) que exibem resistência foram transferidos para uma estufa, assim obtendo sementes
REMOÇÃO
DE
GENE
INTRODUZIDO
POR
TRANSFORMANTE Τι E PRODUÇÃO DE SEMENTES T2 [01158] Para confirmar que um gene induzido por corpo de planta Ti foi removido, as sementes TI foram semeadas e o corpo de planta cresceu 15 cm ou mais por uma porta pequena e teve 9 ou mais folhas, seguido por realização de pintura de folha com fosfinotricina. O corpo de planta transgênico selecionado foi transferido para um pote maior (20 cm (diâmetro) χ 25 cm (altura)) e cresceu em uma estufa para obter uma amostra Ti e obter sementes T2 .
4. ANÁLISE DE TRANSFERENCIA DE GENE [01159] 1 g de folhas de transformantes transientes foi quantificado e congelado com nitrogênio líquido, e as folhas congeladas foram, bem trituradas em. um almofariz, seguido por extração de DNA genômico com o uso de um método CTAB. Para, determinar a possibilidade de um gene ser introduzido, PCR foi realizado com o uso de sequências de gRNA FAD2-7 e FAD2-3 0, gene Bar selecionável e um gene Cas9. Para confirmar a introdução de genes FAD2-7 e FAD230, os iniciadores a seguir foram usados.
[01160] Para o gene FAD2-7, o iniciador direto de
AtUop de promotor (b’-GAATGATTAGGCATCGAACC-3’(SEQ ID NO:
31) ) imciadc reverso ie
FAD2-7
AAAC T C C T CAAGGG T T C CAAACAC-3
SEQ ID NO: 31)) foram usados.
Para o gene FAD2-30, o iniciador direto de AtU6p de
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 287/315 promotor (5’-GAATGATTAGGCATCGAACC-3’(SEQ ID NO: 31)) e o iniciador reverso de FAD2-7 (5’-AAACTCCTCAAGGGTTCCAAACACC3(SEQ ID NO: 33)) foram usados. Para confirmar a introdução do gene Bar, o iniciador direto de Bar (5fTCCGTACCGAGCCGCAGGAA-3’(SEQ ID NO: 34)) e o iniciador reverso de Bar (5'-CCGGCAGGCTGAAGTCCAGC-3'(SEQ ID NO: 35)) foram usad [01161] Além disso, para confirmar a introdução de Cas9, PCR foi realizada com o uso de três conjuntes de iniciadores conforme a seguir: um conjunto de iniciador direto de Cas9-(T) (5'-ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGC-3'(SEQ ID NO: 36)) e o iniciador reverso de Cas9-Q.) (5fAACTTGTAGAACTCCTCCTGGCTG-3'(SEQ ID NO: 37)); um conjunto de iniciador direto de Cas9-@ (5'-TTCAGGAAGTCCAGGATGGTCTTG3' (SEQ ID NO: 38)) e iniciador reverso de Cas9-(2) (5‘AGAACTGGAAGTCCTTGCGGAAGT-3'(SEQ ID NO: 39)); e um conjunto de iniciador direto de Cas9-@ (5'-CTGAGCGAGCTGGACAAGGCCGG3’ (SEQ ID NO: 40)) e iniciador reverso de Cas9-(3) (5’TTAGGCGTAGTCGGGCACGTCGTA-3'(SEQ ID NO: 41)) foram usados.
5. ANÁLISE DE REMOÇÃO DE GENE [01162] 1 g de folhas de um corpo de planta Ti transgênico foi quantificado e congelado com nitrogênio líquido, e as folhas congeladas foram todas trituradas em um almofariz. 0,5 g das folhas trituradas foram colocados em um tubo de 2 ml, 1 ml de uma solução preparada misturando-se tampão cetiltrimetilamônio (cTAB) e βmercaptoetanol (2-ME) em uma razão de 20:1 foram adicionados e tratados em um bloco de calor de 65 °C por 1
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4 8 / 2 5 3 hora, e, então, 10 μΐ de RNase (1,5 mg/150 μΐ BÇO) foram adicionados para permitir a incubação a 37 °C por 1 hora. Após uma hora, clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) foram misturados no mesmo volume e bem misturados para preparar um reagente e, então, centrifugados a 4 °C e 12.000 rpm por 10 minutos. Um sobrenadante foi transferido para um tubo novo, e tratado com um reagente de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) novamente. Após um sobrenadante ter sido colocado no mesmo volume de isopropanol e misturado ao ser invertido 3 a 4 vezes, colocado em um refrigerador a -20 °C por 1 hora, e centrifugado a 4 °C e 12.000 rpm por 10 minutos. Após um sobrenadante ter sido descartado, 1 ml de etanol 70% foi adicionado ao mesmo, e a solução resultante foi centrifugada novamente por 2 minutos, assim obtendo um. pélete. Após um sobrenadante ter sido descartado, o pélete foi secado à temperatura ambiente por 20 minutos e, então, suspenso em 3 0 μΐ de água destilada, para extrair DNA genômico. O DNA genômico extraído foi diluído em 20 vezes, e usado como um modelo.
[01163] As sequências de bases do gene introduzido e o gene BAR antibiótico selecionável foram submetidos a 35 ciclos de PCR que consiste em pré-desnaturação a 95 °C por 10 minutos, desnaturação a 95 °C por 30 segundos, recozimento a 55 a 65 °C por 30 segundos e extensão a 72 °C por 30 segundos a 1,5 minutos, e adicionalmente submetido à extensão a 72 °C por 10 minutos, e o resultado foi determinado com o uso de um kit de PCR (Prime Taq Premix, GENETBIO, Coréia).
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249/253
6. ANÁLISE DE TEOR DE ÁCIDO OLEICO [01164] Para a análise de ácido graxo, três sementes de soja obtidas a partir de cada transformante foram individualmente analisadas. Cada semente foi colocada em uma bolsa de papel, triturada com o uso de um martelo, e o ácido graxo foi extraído com o uso de 5 ml de um solvente de extração (clorofórmio:hexano:metanol, 8:5:2) à temperatura ambiente por 12 horas. 150 μΐ do ácido graxo extraído foram transferidos para um frasco, 75 μΐ de um
reagente de m< etilação (0,25 M de metóxido de sódio
metanólico:éter de petróleo:éter etílico, 1: 5:2) foram
adicionados, e, então, hexano foi a d i c i o n a d ο ρ a r a a J ..cançar
ml. 1 μΐ de uma amostra foi injetada e analisada com o uso de um aparelho de cromatografia gasosa (GC, Aglient
Techno log.i .es, EUA), e a s c o n d i ç õ e s d e a n á. 11 s e são mostradas
Π O. 1 ã b O -1. ã 2 abaixo. u ma razão de ácid .o graxo Ml o o fu o fu 9J
com uma á. rea de cac ia ácido graxo em relação à área total
dos ácidos graxos.
TABELA 2. AS CONDIÇÕES DE GC PARA ANALISAR
ÁCIDO GRAXO EM SOJA __________________[TABELA 2]______________________________________
Item. Condição
I n s t r u m e n t o A g i 1 e n t 7 8 9 0 A
Coluna 0,25 pm i.d. * 30 m de coluna capilar DB-FFAP
Detector Detector de ionização de chama
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Item Condição
Temperatura de forno 23 0 °C
Temperatura de .1Π j e ç s o 210 °C
Temperatura de detector 250 °C
Gás carreador N2 (1,5 ml/min)
Volume de injeção 1 μ.1
7. ANÁLISE DE SEQUÊNCIA DE GENE FAD2
[ 012 .65] A amp 1 i f _i cação de PCR foi realiz ada para
uma região-alvo r > a r a. t e r um tamanho de 200 a .3 0 0 bp com o
uso de Hipi Plus DNA. pol . imerase (Elpisbio) . 0 pr oduto de
PCR obtido pelo método descrito acima foi subm etido ao
S Θ Q u θ Π c a. a m e n t o c o m o uso de um sistema MiSeq (11 lumina), e,
então f analisado com. o uso de urn. 3 η 3. .1.1. s 3. ei o .1? Cosz ferramenta
CRISPR RGEN (www. rgenome. net) ) *
EXEMPLO 1 . VETOR TRANSFORMANTE E PRODUÇÃO
DE TRANSFORMANTE [01166] Para realizar knockout do gene FAD2, conforme mostrado na Tabela 1, o RNA guia que alveja o gene FAD2 foi projetado, e clonado com uma proteína Cas9 em um vetor pPZP, assim construindo um vetor para transformação de soja (Figura 1) . Conforme mostrado na Figura 2, através do processo de regeneração de uma planta, um total de 9 transformantes (Tg) (oito pPZP~FAD2~7 8 e um pPZP-FAD2~30)
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 291/315 foi produzido (Figura 3). As sementes TI foram coletadas a partir dos transformantes To, assim produzindo os transformantes Tj (Figura 10) .
EXEMPLO 2. ANÁLISE DE PCR PARA DETERMINAR A TRANSFERÊNCIA DE PARA TRANSFORMANTE [01167] O DNA foi isolado dos transformantes TO de FAD2-7 e FAD2-30 e submetido à PCR de acordo com o método descrito acima, o que confirma toda a introdução de RNA guia, FAD2-7 e FAD2-30, e gene selecionável Bar e Cas9 introduzidos (Figura 4).
EXEMPLO 3. ANÁLISE DE TEOR DE ÁCIDO OLEICO EM SOJA TRANSGÊNICA [01168]
Os teores de ácido oleico foram analisados a partir das sementes Tl de FAD2-7 e FAD2-30, de acordo com o método descrito acima. O conteúdo de ácido oleico nas
sementes Tl de F7\.D2~7 e F7\.D2~ 3 0 foram. s i gn i f i c a. t i v ame n t e
m o. 1. s η 1 l o s do que aqi. deles de sementes de tipo selvagem,
como Glycin. le max L. Pungsan, Glycine max L. Kwang an e
Glycine max L. Hosim (Figura 5).
EXEMPLO 4. ANÁLISE DE SEQUÊNCIA DE GENE FAD2 EM SOJA TRANSGÊNICA [01169] As frequências (Figura 6) e as sequências indel (Figura 7) foram analisadas para confirmar a possibilidade de uma mutação ser induzida em genes FAD2 das sementes Tl de FAD2-7 e FAD2-30 de acordo com o método descrito acima. Foi confirmado que uma mutação foi induzida na semente 11 de FAD2-7.
[01170] Além disso, os transformantes Tl foram
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52/2 5 3 analisados através de sequenciamento profundo para confirmar possibilidade da mutação induzida em um gene FAD2 . Como resultado, foi confirmado que uma mutação foi induzida em um sítio-alvo de um gene FAD2 no cromossomo n° 10 (chrlO) e no cromossomo n° 20 (chr20) de outros transformantes Tl, exceto por FAD2-7 n° 1-1 e FAD2-30 n° 24, n° 9-1 e n° 3-1 (Figuras 8 e 9) .
EXEMPLO 5. ANÁLISE DE REMOÇÃO DE GENE
INTRODUZIDO DE SOJA TRANSGÊNICA
Figure BR112019012779A2_D0013
gene selecionável BAR e um gene introduzido de um vetor introduzido. Como resultado, foi confirmado que, a partir de um transformante T-j de FAD2-7, tanto o gene introduzido quanto o gene BAR foram removidos, e entre quinze transformantes Tl de FAD2-30, indivíduos (9-1, 19-1, 21-1, 21-5) cujos genes não foram parcialmente removidos foram, confirmados (Figura 11).
[APLICABILIDADE INDUSTRIAL] [01172] Um. produto processado pode ser fabricado com o uso de corpo de planta com teor aumentado de um ácido graxo insaturado específico que é bom para a saúde humana ou com teor diminuído de um ácido graxo insaturado específico que é prejudicial para a saúde humana usando-se um fator associado à biossíntese de ácidos graxos insaturados artificialmente manipulados e um sistema para controlar um ácido graxo insaturado, que é assim artificialmente modificado, e, desse modo, pode ser usado
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253/253 para alimento.

Claims (11)

1. Planta caracterizada por compreender um genoma artificialmente manipulado, sendo que o genoma artificialmente manipulado inclui uma ou mais modificações selecionadas dentre o grupo que consiste em (i) uma deleção de 1 a 30 nucleotídeos;
(ii) uma. inserção de um ou mais nucleotídeos estranhos;
(iii) uma deleção de 1 a 30 nucleotídeos e uma inserção de um ou mais nucleotídeos estranhos; e (iv) uma substituição por um ou mais nucleotídeos diferentes de um gene do tipo selvagem, em. uma. sequência de 1 a. 50 nucleotídeos contínua que inclui uma sequência PAM em uma sequência de ácidos nucleicos que consiste em um gene FAD2, sendo que a sequência. PAM é um.a ou mais sequências selecionadas a. partir de 5?-NGG-3'; 5'~NNNNRYAC~ 3'; 5'-NNAGAAW-3 ' ; 5'-NNNNGATT-3 ' ; 5’-NNGRR(T)-3 ! ; e 5'TTN-3 ’ , sendo que cada N é independentemente A, T, C ou G, cada R é independentemente A ou G, o Y é C ou T e o W é A ou 1’, sendo que a planta que compreende um genoma artificialmente manipulado tem pelo menos um dentre o fenótipo selecionado dentre o grupo que consiste em, em comparação com a planta do tipo selvagem:
(a) uma expressão diminuída de uma proteína cie FAD2 *
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 295/315 (b) transcrições de RNA diminuídas de um gene FAD2;
(c) uma expressão aumentada de uma proteína de FAD2 mutada;
(d) um teor aumentado de ácido graxo insaturado C8~24:D1; e (e) um teor diminuído de ácido graxo insaturado C8~24:D2.
2. Planta, de acordo com a reivindicação 1,
ΛΚ* « <MO ««k «ut, Q « A o. CâI. ClCLSLxZuQm. 'ΡΘ la sequência de 1 a 50 nucleotídeos contínua que -i. n c -i .ui i; ima sequência PAM em uma sequência de ácidos nuclei ..COS que constitui um gene FAD 2 c o mp r e e n d e r pelo menos uma den Έ.ι?θ a. s s equêuc -1. ã s de nu c .1 e o t í de o s
sθ 1 θ c -Ί- ο π ao.a s a. par tir de SEQ ID NO: 1 a 30. 3 . Plante t, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pele o ácido graxo insaturado C8~24:D1 ser um
ácido graxo insaturado C16~22:D1.
4. Planta, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo ácido graxo insaturado C8~24:D1 ser um ácido graxo insaturado C18:D1.
5. Planta, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo ácido graxo insaturado C8~24:D2 ser um ácido graxo insaturado C16~22:D2.
6. Planta, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo ácido graxo insaturado C8~24:D2 ser um. ácido graxo insaturado C18:D2.
7. Planta, de acordo com a reivindicação 1, sendo que a pianta é por ser uma soja.
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8. Composição para manipulação de genes que é usada para produzir uma planta que inclui um genoma artificialmente manipulado caracterizada por compreender:
um ácido nucleico-guia com capacidade para alvejar um gene FAD2 ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o mesmo; e uma proteína editora ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica, a mesma, sendo que o ácido nucleico-guia é uma sequência de RNA com capacidade para ligar uma região-alvo em uma sequência de ácidos nucleicos que constitui um gene FAD2, sendo que o gene da região-alvo compreende pelo menos uma dentre as sequências de nucleotídeos selecionadas a partir de SEQ ID NO: 1 a 30, sendo que a proteína editora, inclui uma ou mais proteínas selecionadas dentre o grupo que consiste em. uma proteína Cas9 derivada, de Streptococcus pyogenes, uma proteína Cas9 derivada de Campylobacter jejuni, uma proteína Cas9 derivada de Streptococcus thermophilus, uma proteína Cas9 derivada de Staphylococcus aureus, uma proteína Cas9 derivada de Neisseria meningitidis e uma pr ot e i na Cpf1 .
9. Composição, de acordo com a reivindicação 8, sendo que a composição para manipulação de genes é por ser formada em um sistema-vetor de agrobactérias.
10. Composição, de acordo com a
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 297/315 reivindicação 8, sendo que a composição para manipulaçao de genes é ¢3. XT 3™ cátíS· por ser formada em um. sistema-vetor viral.
11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo vetor viral incluir um ou mais vírus selecionados dentre um vírus do mosaico, um retrovirus, um lentivírus, um adenovirus, um vírus adenoassociado (AAV), um vírus de vaccinia, um poxvirus e um vírus da herpes simplex.
12. Método para, produzir uma planta, que inclui um genoma artificialmente manipulado caracterizado por compreender uma introdução (administração) de uma composição a um indivíduo, sendo que o indivíduo é uma célula vegetal, uma semente, uma. parte de um corpo de planta ou o corpo inteiro da planta, sendo que a composição compreende:
um. ácido nucleico-guia com. capacidade para alvejar um gene FAD2 ou uma sequência, de ácidos nucleicos que codifica o mesmo; e
um.a proteína editora ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a mesma > s endo que o ácido nucleico-guia é uma. sequênc ia de RNA com capacida: de para ligar uma região-alvo em uma FAD 2, sequência de ácidos nu c 1 e i c o s que constitui um gene
sendo que o gene da região-alvo compreende pelo menos uma dentre as sequências de nucleotídeos
Petição 870190056996, de 19/06/2019, pág. 298/315 selecionadas a partir de SEQ ID NO: 1 a 30, sendo que a proteína editora inclui uma ou mais proteínas selecionadas dentre o grupo que consiste em uma proteína Cas9 derivada de Streptococcus pyogenes, uma proteína Cas9 derivada de Campylobacter jejuni, uma proteína Cas9 derivada de Streptococcus thermophilus, uma proteína Cas9 derivada de Staphylococcus aureus, uma proteína Cas9 derivada de Neisseria meningitidis e uma pr ot e i na Cpf1, sendo que o genoma artificialmente manipulado inclui uma ou mais modificações selecionadas dentre o grupo que consiste em (i) uma deleção de 1 a 30 nucleotideos;
(ii) uma inserção de um ou mais nucleotideos estranhos;
( i i i) uma c ieleção de 1 a 30 nucleotideos e ma inserção de um. ou mai s n u c 1 e o t í d e o s estranhos; e (iv) uma s u b s t .1. t u i ç a o por um ou mais .ucleot ide os diferent es de um gene do t: ipo selvagem,
em. uma. sequência de 1 a. 50 nucleotideos contínua que inclui uma. sequência PAM em uma sequência de ácidos nucleicos que consiste em um gene FAD2, sendo que a sequência PAM é uma ou mais sequências selecionadas a partir de 5'-NGG-3'; 5'-NNNNRYAC3’; 5'-NNAGAAW-3'; 5’-NNNNGATT-3’; 5’-NNGRR(T)-3’; e 5'TTN-3 ’, sendo que cada N é independentemente A, T, C ou G, cada R é independentemente A ou G, o Y é C ou T e o W é A
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