BR112018009281B1 - Composições para tratar atrofia muscular espinhal e seu uso - Google Patents

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Abstract

composições para tratar atrofia muscular espinhal e seu uso. a presente invenção oferece composições farmacêuticas compreendendo um composto de fórmula (i) onde a, r1, r2 e r3 são como descritos neste pedido, assim como sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo. ademais, a presente invenção refere-se à produção das composições farmacêuticas compreendendo um composto de fórmula (i) e seu uso como medicamentos.

Description

Introdução
[001] A presente invenção oferece composições farmacêuticas compreendendo compostos que são moduladores da emenda do gene SMN2, sua produção e seu uso para o tratamento, o retardamento da evolução ou a melhora de atrofia muscular espinhal (SMA). Além disso, as composições farmacêuticas da invenção podem opcionalmente compreender citoprotetores. A invenção refere-se ainda ao uso combinado de moduladores da emenda do gene SMN2 e citoprotetores para uso no tratamento ou na melhora de atrofia muscular espinhal (SMA).
[002] Em particular, a presente invenção refere-se a composições farmacêuticas compreendendo compostos de fórmula (I) onde A, R1, R2 e R3 são como descritos neste pedido, e a sais farma- ceuticamente aceitáveis dos mesmos.
Antecedentes
[003] Atrofia muscular espinhal (SMA), em seu sentido mais am plo, descreve uma coletânea de doenças hereditárias e adquiridas no sistema nervoso central (CNS) caracterizadas por perda progressiva dos neurônios motores no cordão espinhal e no tronco cerebral causando fraqueza muscular e atrofia muscular. A forma mais comum de SMA é causada por mutações no gene de sobrevivência do neurônio motor (SMN) e se manifesta com uma ampla gama de severidade afe- tando desde bebê até adultos (Crawford and Pardo, Neurobiol. Dis., 1996, 3:97).
[004] SMA infantil é a forma mais severa deste distúrbio neuro- degenerativo. Os sintomas incluem fraqueza muscular, tono muscular pobre, choro fraco, moleza ou tendência a cair, dificuldade de sugar ou engolir, acúmulo de secreções nos pulmões e na garganta, dificuldade de comer, e maior susceptibilidade a infecções no trato respiratório. As pernas tendem a ficar mais fracas que os braços e marcas do desenvolvimento, tais como levantar a cabeça ou sentar-se, podem não ser atingidas. Em geral, quanto mais cedo aparecem os sintomas, menor é o tempo de vida. Quando as células dos neurônios motores deterioram, os sintomas aparecem logo depois. As formas severas da doença são fatais e todas as formas não têm cura conhecida. O curso da SMA está diretamente relacionado com a taxa de deterioração das células dos neurônios motores e com a severidade da fraqueza resultante. Bebês com uma forma severa de SMA frequentemente não resistem a doenças respiratórias por causa da fraqueza nos músculos que suportam a respiração. Crianças com formas mais leves de SMA vivem muito mais, embora possam precisar de suporte médico extenso, especialmente aquelas na extremidade mais severa do espectro. O espectro clínico dos distúrbios de SMA foi dividido nos cinco grupos a seguir. (a) SMA tipo 0 (SMA no útero) é a forma mais severa da doença e tem início antes do nascimento. Usualmente, o primeiro sintoma da SMA tipo 0 é movimento reduzido do feto que pode ser observado pela primeira vez entre 30 e 36 semanas de gestação. Depois do nascimento, esses recém-nascidos têm pouco movimento e apresentam dificuldade para engolir e respirar. (b) SMA tipo 1 (SMA infantil ou doença de Werdnig- Hoffmann) apresenta sintomas entre 0 e 6 meses, a forma da SMA também é muito severa. Os pacientes nunca adquirem capacidade de sentar, e a morte geralmente ocorre nos primeiros 2 anos sem suporte ventilatório. (c) SMA tipo 2 (SMA intermediária) tem início na idade de 7-18 meses. Os pacientes adquirem capacidade de sentar sem ajuda, mas nunca sentam ou andam sem ajuda. O prognóstico deste grupo depende bastante do grau de envolvimento respiratório. (d) SMA tipo 3 (SMA juvenil ou doença de Kugelberg- Welander) geralmente é diagnosticada depois de 18 meses. Os indiví- cuos com SMA tipo 3 conseguem andar sem ajuda em algum ponto durante o curso da doença, mas com frequência ficam presos a uma cadeira de rodas durante a juventude ou a vida adulta. (e) SMA tipo 4 (SMA de início na vida adulta). Geralmente no final da adolescência aparece fraqueza na língua, mãos, ou pés, e então avança para outras áreas do corpo. O curso da SMA adulta é muito mais lento e tem pouco ou nenhum impacto na expectativa de vida.
[005] O gene SMN foi mapeado por análise da ligação a uma re gião complexa no cromossoma 5q. Nos humanos, esta região contém uma duplicação invertida de aproximadamente 500 mil pares de bases (kb) resultando em duas cópias praticamente idênticas do gene SMN. A SMA é causada por uma mutação ou deleção desativante da cópia telomérica do gene (SMN1) em ambos os cromossomas, resultando na perda da função do gene SMN1. Entretanto, todos os pacientes conservam a cópia centromérica do gene (SMN2), e o número de cópias do gene SMN2 em pacientes com SMA geralmente está inversamente correlacionado com a severidade da doença, isto é, pacientes com SMA menos severa têm mais cópias de SMN2. Contudo, o SMN2 é incapaz de compensar completamente a perda da função de SMN1 devido à emenda alternativa do exon 7 causada por uma mutação de C para T translacionalmente silenciosa no exon 7. Como resultado, a maioria dos transcritos produzidos a partir de SMN2 não possuem o exon 7 (Δ7 SMN2), e codificam uma proteína SMN truncada que tem uma função prejudicada e é rapidamente degradada.
[006] Acredita-se que a proteína SMN desempenha um papel no processamento e no metabolismo do RNA, tendo uma função bem ca-racterizada de mediar a montagem de uma classe específica de complexos RNA-proteína conhecidos como snRNPs. A SMN pode ter outras funções nos neurônios motores, no entanto, seu papel na prevenção da degeneração seletiva dos neurônios motores ainda não está bem estabelecido.
[007] Na maioria dos casos, a SMA é diagnosticada com base nos sintomas clínicos e pela presença de pelo menos uma cópia do teste do gene SMN1. No entanto, em aproximadamente 5% dos casos a SMA é causada por mutação em genes que não a inativação de SMN 1, alguns conhecidos e outros ainda não definidos. Em alguns casos, quando o teste do gene SMN 1 não é viável ou não mostra qualquer anormalidade, outros testes tais como eletromiografia (EMG) ou biópsia muscular podem ser indicados.
[008] Atualmente os cuidados médicos para pacientes com SMA limitam-se à terapia suportiva que inclui cuidados respiratórios, nutricionais e reabilitação; não existem fármacos conhecidos para tratar a causa subjacente da doença. O tratamento atual para SMA consiste na prevenção e no controle dos efeitos secundários da perda da unidade motora crônica. O principal problema de controle na SMA tipo 1 é a prevenção e o trratamento precoce de problemas pulmonares, que são a causa da morte na maioria dos casos. Embora alguns bebês acometidos pela SMA se desenvolvam até a fase adulta, aqueles com SMA tipo 1 têm uma expectativa de vida de menos de dois anos.
[009] Já foram desenvolvidos diversos modelos de SMA em ca mundongo. Em particular, o modelo delta exon 7 de SMN (Δ7 SMN) (Le et al., Hum. Mol. Genet., 2005, 14:845) carrega o gene SMN2 e diversas cópias do cDNA de Δ7 SMN2 e recapitula muitos dos aspectos fenotípicos de SMA tipo 1. O modelo Δ7 SMN pode ser usado para estudos de expressão de SMN2 e também para avaliação da função motora e da sobrevivência. O modelo de camundongo com alelo C/C (Jackson Laboratory cepa #008714, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) oferece um modelo menos severo de SMA, com os camundongos tendo níveis reduzidos de mRNA de comprimento integral de SMN2 (FL SMN2) e de proteína SMN. O fenótipo de camundongo com alelo C/C tem o gene SMN2 e um gene híbrido mSMN1-SMN2 que sofre emenda alternativa, mas não tem a fraqueza muscular evidente. O modelo de camundongo com alelo C/C é usado para estudos de ex-pressão de SMN2.
[0010] Como resultado da melhor compreensão da base genética e da patofisiologia de SMA, várias estratégias de tratamento foram exploradas, mas nenhuma delas ainda demonstrou sucesso clínico.
[0011] Reposição gênica de SMN1, usando vetores de distribuição virais, e reposição celular, usando células-tronco SMN1+/+ diferenciadas, demonstraram eficácia em modelos animais de SMA. Mais pesquisas são necessárias para determinar a segurança e a resposta imunológica e determinar as exigências para o início do tratamento no estágio neonatal antes que estas abordagens possam ser aplicadas a seres humanos.
[0012] Correção da emenda alternativa de SMN2 em células em cultura também foi obtida usando ácidos nucleicos sintéticos como agentes terapêuticos: (i) oligonucleotídeos antissenso que visam elementos da sequência no pré-mRNA de SMN2 e mudam o desfecho da reação de emenda para a geração de mRNA de SMN2 de comprimento integral (Passini et al., Sci. Transl. Med., 2011, 3:72ra18; e, Hua et al., Nature, 2011, 478:123) e (ii) trans-emenda de moléculas de RNA que proporcionam uma sequência totalmente funcional que substitui o fragmento mutante durante a emenda e gera um mRNA de SMN1 de comprimento integral (Coady e Lorson, J Neurosci., 2010, 30:126).
[0013] Outras abordagens sendo exploradas incluem a busca por fármacos que aumentem os níveis de SMN, melhoram a função da SMN residual, ou compensem sua perda. Foi mostrado que aminogli- cosídeos melhoram a expressão de uma proteína SMN estabilizada produzida a partir do mRNA de Δ7 SMN2 promovendo a leitura trans- lacional total do códon finalizador aberrante, mas eles apresentam pobre penetração no sistema nervoso central e são tóxicos depois de repetidas administrações. Foi mostrado que agentes quimioterapêuticos, tais como aclarubicina, aumentam a proteína SMN em cultura de células; no entanto, o perfil de toxicidade destes fármacos impede seu uso prolongado em pacientes com SMA. Alguns fármacos sob investigação clínica para o tratamento de SMA incluem ativadores de transcrição tais como inibidores da histona desacetilase ("HDAC") (por exemplo, butiratos, ácido valproico, e hidroxiureia), e estabilizantes de mRNA (o inibidor de decapagem de mRNA RG3039 da Repligen), o objetivo sendo aumentar a quantidade de RNA total transcrito a partir do gene SMN2. No entanto, o uso dos inibidores de HDAC ou de estabilizantes de mRNA não trata a causa subjacente da SMA e pode resultar em um aumento global na transcrição e na expressão gênica com potenciais problemas de segurança em seres humanos.
[0014] Em uma abordagem alternativa, agentes citoprotetoras tais como olesoxima foram escolhidos para investigação. Tais estratégias não visavam a SMN para o tratamento de SMA, ao contrário, elas foram desenvolvidas para proteger não apenas os neurônios motores deficientes em SMN contra neurodegeneração, mas também outros sistemas afetados pela doença, tais como as células musculares. A olesoxima apresentou eficácia clínica no tratamento de SMA Tipo 2 (SMA Intermediária) e SMA Tipo 3 (SMA Juvenil, não ambulatorial).
[0015] Um sistema projetado para identificar compostos que au mentam a inclusão do exon 7 da SMN em RNA transcrito a partir do gene SMN2 e determinados compostos de benzo-oxazol e benzoiso- xazol identificados pelo mesmo foram descritos no Pedido de Patente Internacional WO2009/151546A1. Um sistema projetado para identificar compostos que causam alteração de quadro de leitura ("frameshifting") ribossômico para produzir uma proteína SMN estabilizada a partir de mRNA de Δ7 SMN2 e determinados compostos de isoindolinona e identificados pelo mesmo foram descritos nos Pedidos de Patente Internacional WO2010/019236A1 e WO2013/119916A2.
[0016] Olesoxima (Colest-4-en-3-ona oxima, (EZ)-N-(colest-4-en- 3-ilideno)hidroxilamina, Número de Registro CAS 22033-87-0) é um fármaco citoprotetor que mostrou promover a função e a sobrevivência de neurônios e outros tipos de células em condições de estresse relevantes para a doença através de interações com o poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP).
[0017] O documento WO 20047082581 (A2) descreve o uso de olesoxima para proporcionar neuroproteção em um paciente e o do- cumento WO 2008/142231 (A2) descreve composições farmacêuticas compreendendo a mesma.
[0018] Métodos de síntese de oximas de d6-colestenonas e oleso- xima já foram descritos, por exemplo, pelo ganhador do prêmio Nobel Adolf Friedrich Johann Butenandt (Butenandt A. et al., Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft (1936), 69B, 882-8) ou por Pon- sold K. et al. (Journal fuer Praktische Chemie (1964), 23(3-4), 173-6).
[0019] O modo de ação da olesoxima, sua toxicidade, metabolis mo, e farmacodinâmica foram descritos por Martin L.J. (IDrugs (2010) 13(8):568-80). In vivo, a olesoxima resgata neurônios motores da morte celular induzida por lesão nervosa em ratos neonatos e promove a regeneração nervosa subsequente a um esmagamento do nervo em camundongos adultos. Por promover tanto a regeneração axonal quanto a sobrevivência dos neurônios motores, a olesoxima é uma abordagem terapêutica sensata para SMA. Adicionalmente, há evidências de melhora funcional em modelos não clínicos de SMA.
[0020] No nível molecular, os dados de ligação indicaram que a olesoxima interage com duas proteínas da membrana mitocondrial ex-terna, o que parece modular a abertura do complexo de poros de tran-sição da permeabilidade mitocondrial (mPTP). Ligando-se a essas pro-teínas, a olesoxima pode preservar as funções mitocondriais essenciais, tais como tamponamento do cálcio nos neurônios estressados, reduzindo assim a degeneração e a morte celular. Os efeitos citoprote- tores foram observados em neurônios primários sujeitos a estresse fisiológico, em cardiomióticos primários sujeitos à toxicidade por antra- ciclina e também em hepatócitos de camundongo submetidos à apop- tose induzida por Fas. Dessa forma, a olesoxima tem o potencial de reduzir a apoptose patológica induzida por estresse tanto em células neuronais como em células não neuronais. Portanto, esses sítios de ligação podem desempenhar um papel na ação neuro-, célula- e teci- do-protetora da olesoxima já que a disfunção mitocondrial induzida por estresse está envolvida na maioria das doenças neurodegenerativas. In vivo, o resgate de neurônios motores e a promoção da regeneração nervosa observados com o tratamento com olesoxima confirmam que a olesoxima age no nível do corpo de células dos neurônios motores, no nível axonal, e potencialmente apresentam um efeito sobre os músculos (Pathak D et al. J Biological Chemistry (2015) 290(37):22325-36).
[0021] A olesoxima fora desenvolvida para o tratamento de SMA Tipo 2 e Tipo 3. O programa de desenvolvimento clínico da olesoxima visava demonstrar a manutenção da função motora durante um período de observação de dois anos. O desenvolvimento clínico da oleso- xima em SMA inclui dois estudos clínicos, um estudo da farmacociné- tica e segurança de Fase Ib (TRO19622CLEQ1115-1) usando uma formulação de cápsula dura, e um estudo de Fase II (TRO19622CLEQ1275-1) usando uma formulação de suspensão oral. O estudo de Fase II controlado com placebo (TRO19622CLEQ1275-1) é atualmente o maior e mais longo estudo clínico a ser conduzido para essa indicação. O estudo mostrou a manutenção da função motora durante o período de tratamento de dois anos no braço da olesoxima em comparação com um declínio de aproximadamente dois pontos no desfecho primário (medida da função motora [MFM]) no braço do placebo, que está de acordo com a evolução natural relatada da doença (Vuillerot C et al. Arch Phys Med Rehabil (2013) 94(8):1555-61.). O estudo de Fase II demonstrou um perfil risco-benefício positivo para a olesoxima para o tratamento de pacientes com SMA Tipos 2 e 3.
[0022] Apesar do progresso feito na compreensão da base genéti ca e da patofisiologia da SMA, continua sendo necessário identificar compostos e combinações de compostos e formas de administração adequadas dos mesmos que alterem o curso da atrofia muscular espi-nhal, uma das doenças neurológicas infantis mais devastadoras.
Descrição Detalhada da Invenção
[0023] A menos que definido em contrário, todos os termos técni cos e científicos usados neste pedido têm o mesmo significado que aquele comumente conhecido pelo versado na técnica à qual a invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste pedido possam ser usados na prática ou tes-tagem da invenção, métodos e materiais adequados estão descritos abaixo.
[0024] Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, e ou tras referências mencionadas neste relatório estão aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.
[0025] A nomenclatura usada neste Pedido tem por base a nomenclatura sistemática IUPAC, a menos que indicado em contrário.
[0026] Toda valência aberta que aparece em um átomo de carbo no, oxigênio, enxofre ou nitrogênio nas estruturas deste pedido indica a presença de um hidrogênio, a menos que indicado em contrário.
[0027] As definições apresentadas neste pedido aplicam-se inde pendente de os termos em questão aparecem sozinhos ou em combi-nação. Contempla-se que as definições apresentadas neste pedido podem ser reunidas para formar combinações quimicamente relevantes, tais como, por exemplo, "heterocicloalquilaril", "haloalquil- heteroaril", "arilalquil-heterocicloalquila", ou "alcoxialquila". O último membro da combinação é o radical que se liga ao resto da molécula. Os outros membros da combinação estão presos ao radical de ligação na ordem invertida em relação à sequência literal, por exemplo, a combinação amino-C1-7-alquila refere-se a uma C1-7-alquila que é substituída com amino, ou por exemplo, a combinação arilalquil- heterocicloalquila refere-se a um radical heterocicloalquil alquila que é substituída com uma alquila que é substituída com um aril.
[0028] O termo "porção" refere-se a um átomo ou grupo de átomos quimicamente ligados que é preso a um outro átomo ou molécula por uma ou mais ligações químicas, fazendo assim parte de uma molécula. Por exemplo, as váriaveis A, R1, R2 e R3 da fórmula (I) referem-se a porções que estão presas à estrutura de núcleo da fórmula (I) por uma ligação covalente.
[0029] Quando indicando o número de substituintes, o termo "um ou mais" refere-se à faixa desde um substituinte até o número mais alto possível de substituições, isto é, a substituição de um hidrogênio até a substituição de todos os hidrogênios por substituintes.
[0030] O termo "opcional" ou "opcionalmente" denota que um evento ou circunstância descrito em seguida pode, mas não precisa, ocorrer, e que a descrição inclui casos em que o evento ou circunstância ocorre e casos em que não ocorre.
[0031] O termo "substituinte" denota um átomo ou grupo de áto mos substituindo um átomo de hidrogênio na molécula parental.
[0032] O termo "substituído" denota que um grupo específico con tém um ou mais substituintes. Onde qualquer grupo pode conter múlti-plos substituintes e uma variedade de substituintes possíveis se apre-senta, os substituintes são independentemente selecionados e não precisam ser os mesmos. O termo "não substituído" significa que o grupo específico não contém substituintes. O termo "opcionalmente substituído" significa que o grupo específico é não substituído ou subs-tituído com um ou mais substituintes, independentemente selecionados do grupo de substituintes possíveis. Quando indicando o número de substituintes, o termo "um ou mais" significa desde um substituinte até o número mais alto possível de substituições, isto é, a substituição de um hidrogênio até a substituição de todos os hidrogênios por subs- tituintes.
[0033] Os termos "compostos desta invenção" e "compostos da presente invenção" referem-se aos compostos revelados neste pedido e aos estereoisômeros, tautômeros, solvatos, e sais (por exemplo, sais farmaceuticamente aceitáveis) dos mesmos. Quando os compostos da invenção são sólidos, os versados na técnica entendem que esses compostos, e seus solvatos e sais, podem existir em diferentes formas sólidas, particularmente em diferentes formas cristalinas, sendo que todas elas se destinam a estar dentro do escopo da presente invenção e fórmulas específicas.
[0034] O termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" denota sais que não são biologicamente ou de outra forma indesejáveis. Sais far- maceuticamente aceitáveis incluem tanto sais de adição de ácido quanto sais de adição de base. O termo "sal de adição de ácido far- maceuticamente aceitável" denota aqueles sais farmaceuticamente aceitáveis formados com ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido carbônico, ácido fosfórico, e ácidos orgânicos selecionados dentre as classes alifática, cicloalifática, aromática, aralifática, heterocíclica, carboxílica, e sulfôni- ca de ácidos orgânicos tais como ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido glucônico, ácido láctico, ácido pirúvi- co, ácido oxálico, ácido málico, ácido maleico, ácido maloneico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido aspártico, ácido ascórbico, ácido glutâmico, ácido antranílico, ácido benzoico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido embônico, ácido fenilacético, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido p-toluenossul- fônico, e ácido salicílico.
[0035] O termo "sal de adição de base farmaceuticamente aceitá vel" denota aqueles sais farmaceuticamente aceitáveis formados com uma base orgânica ou inorgânica. Exemplos de bases inorgânicas aceitáveis incluem sais de sódio, potássio, amônio, cálcio, magnésio, ferro, zinco, cobre, manganês, e alumínio. Sais derivados de bases orgânicas atóxicas farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de aminas primárias, secundárias e terciárias, aminas substituídas incluindo aminas substituídas de ocorrência natural, aminas cíclicas e resinas trocadoras de íons básicas, tais como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2- dietilaminoetanol, trimetamina, diciclo-hexilamina, lisina, arginina, histi- dina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, etilenodiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas, piperizina, piperidi- na, N-etilpiperidina, e resinas de poliamina.
[0036] As definições estereoquímicas e as convenções usadas neste pedido em geral obedecem S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dic-tionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; e Eliel, E. e Wilen, S., "Stereochemistry of Organic Compounds", John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994. Ao descrever um composto oticamente ativo, os prefixos D e L, ou R e S são usados para indicar a configuração absoluta da molécula em volta de seu(s) centro(s) qui- ral(is). Os substituintes presos ao centro quiral em questão são classi-ficados de acordo com a Norma de Sequências de Cahn, Ingold e Prelog. (Cahn et al. Angew. Chem. Inter. Edit. 1966, 5, 385; errata 511). Os prefixos D e L ou (+) e (-) são empregados para designar o sinal de rotação da luz plano-polarizada pelo composto, com (-) ou L designando que o composto é levogiratório. Um composto com o prefixo (+) ou D é dextrogiratório.
[0037] O termo "centro quiral" denota um átomo de carbono ligado a quatro substituintes diferentes. O termo "quiral" denota a capacidade de não sobreponibilidade à imagem especular, enquanto que o termo "aquiral" refere-se a modalidades que são sobreponíveis a sua imagem especular. As moléculas quirais são oticamente ativas, isto é, elas possuem a capacidade de girar o plano da luz plano-polarizada. Os compostos da presente invenção podem ter um ou mais centros qui- rais e podem existir na forma de enantiômeros oticamente puros, misturas de enantiômeros tais como, por exemplo, racematos, diastereoi- sômeros oticamente puros, misturas de diastereoisômeros, racematos diastereoisoméricos ou misturas de racematos diastereoisoméricos. Sempre que um centro quiral está presente em uma estrutura química, todos os estereoisômeros àquele centro quiral são considerados abrangidos pela presente invenção.
[0038] Os termos "halo", "halogênio", e "halogeneto" são usados intercambiavelmente neste relatório e denotam flúor, cloro, bromo, ou iodo. Um exemplo particular de halogênio é flúor.
[0039] O termo "alquila" denota um grupo hidrocarboneto saturado monovalente linear ou ramificado de 1 a 12 átomos de carbono. Em modalidades particulares, a alquila tem 1 a 7 átomos de carbono, em modalidades mais particulares 1 a 4 átomos de carbono. Exemplos de alquila incluem metila, etila, propila, isopropila, n-butila, iso-butila, sec- butila, ou ter-butila. Exemplos particulares de alquila são metila e etila.
[0040] O termo "haloalquila" denota um grupo alquila no qual pelo menos um dos átomos de hidrogênio do grupo alquila fora substituído pelos mesmos átomos de halogênio ou por átomos de halogênio dife-rentes, particularmente átomos de flúor. Exemplos de haloalquila incluem monofluoro-, difluoro- ou trifluoro-metila, -etila ou -propila, por exemplo 3,3,3-trifluoropropila, 2-fluoroetila, 2,2,2-trifluoroetila, fluoro- metila, ou trifluorometila entre outros. O termo "per-haloalquila" denota um grupo alquila no qual todos os átomos de hidrogênio do grupo alquila foram substituídos pelos mesmos átomos de halogênio ou por átomos de halogênio diferentes.
[0041] O termo "sistema anelar bicíclico" denota dois anéis que são fundidos um ao outro via uma ligação simples ou dupla em comum (sistema anelar bicíclico anelado), via uma sequência de três ou mais átomos em comum (sistema anelar bicíclico ligado por meio de ponte) ou via um único átomo em comum (sistema anelar bicíclico espiral). Os sistemas anelares bicíclicos podem ser saturados, parcialmente insaturados, insaturados ou aromáticos. Os sistemas anelares bicíclicos podem compreender heteroátomos selecionados dentre N, O e S.
[0042] O termo "cicloalquila" denota um grupo hidrocarboneto mo- nocílico ou bicílico saturado de 3 a 10 átomos de carbono anelares. Em modalidades particulares cicloalquila denota um grupo hidrocarbo- neto monocílico saturado monovalente de 3 a 8 átomos de carbono anelares. Bicíclico significa consistinddo em dois carbociclos saturados tendo um ou mais átomos de carbono em comum. Grupos cicloalquila particulares são monocílicos. Exemplos de cicloalquila monocícica são ciclopropila, ciclobutanila, ciclopentila, ciclo-hexila ou ciclo-heptila. Exemplos de cicloalquila bicíclicas são biciclo[2,2,1]heptanila, ou bici- clo[2,2,2]octanila. Um exemplo particular de cicloalquila é ciclopropila.
[0043] O termo "heterocicloalquila" denota um sistema anelar mo no- bi- ou tricíclico saturado ou parcialmente insaturado de 3 a 9 átomos anelares, compreendendo 1, 2, ou 3 heteroátomos anelares selecionados dentre N, O e S, os outros átomos anelares sendo carbono. Em modalidades particulares, heterocicloalquila é um sistema anelar monocílico saturado monovalente de 4 a 7 átomos anelares, compre-endendo 1, 2, ou 3 heteroátomos anelares selecionados dentre N, O e S, os outros átomos anelares sendo carbono. Exemplos de heteroci- cloalquila saturada monocíclica são aziridinila, oxiranila, azetidinila, oxetanila, pirrolidinila, tetra-hidrofuranila, tetra-hidro-tienila, pirazolidini- la, imidazolidinila, oxazolidinila, isoxazolidinila, tiazolidinila, piperidinila, tetra-hidropiranila, tetra-hidrotiopiranila, piperazinila, morfolinila, tiomor- folinila, 1,1-dioxo-tiomorfolin-4-ila, azepanila, diazepanila, homopipera- zinila, ou oxazepanila. Exemplos de heterocicloalquila saturada bicícli- ca são 8-aza-biciclo[3,2,1]octila, quinuclidinila, 8-oxa-3-aza-bici- clo[3,2,1]octila, 9-aza-biciclo[3,3,1]nonila, 3-oxa-9-aza-biciclo[3,3,1] no-nila, ou 3-tia-9-aza-biciclo[3,3,1]nonila. Exemplos de heterocicloalquila parcialmente insaturada são di-hidrofurila, imidazolinila, di-hidro-oxazo- lila, tetra-hidro-piridinila, ou di-hidropiranila. Exemplos particulares de heterocicloalquila são 1,4-diazepanila, hexa-hidropirrolo[1,2-a]pirazi- nila, piperidinila, piperazinila e pirrolidinila. Exemplos mais particulares de heterocicloalquila são hexa-hidropirrolo[1,2-a]pirazinila e piperazini- la.
[0044] O termo "N-heterocicloalquila" denota um radical heteroci- cloalquila contendo pelo menos um átomo de nitrogênio anelar e no qual o ponto de ligação do radical heterocicloalquila ao resto da molécula se dá através de um átomo de nitrogênio anelar. Exemplos particulares de N-heterocicloalquila são 1,4-diazepanila, hexa-hidropirrolo [1,2-a]pirazinila, piperidinila, piperazinila e pirrolidinila. Exemplos mais particulares de N-heterocicloalquila são hexa-hidropirrolo[1,2-a]pirazi- nila e piperazinila.
[0045] O termo "basicidade" com referência a um composto é ex presso neste pedido pelo logarítmo decimal negativo da constante de acidez do ácido conjugado (pKa = -log Ka). Quanto maior o pKa do ácido conjugado, mais forte é a base (pKa + pKb = 14). Neste pedido, um átomo ou grupo funcional é indicado como "básico" se ele for adequado para aceitar um próton e se a pKa calculada de seu ácido conjugado for pelo menos 7, mais particularmente se a pKa calculada de seu ácido conjugado for pelo menos 7,8, ainda mais particularmente se a pKa calculada de seu ácido conjugado for pelo menos 8. Os valores da pKa foram calculados in-silico da maneira descrita em F. Milletti et al., J. Chem. Inf. Model (2007) 47:2172-2181.
[0046] O termo "alquileno" denota um grupo hidrocarboneto linear saturado divalente de 1 a 7 átomos de carbono ou um grupo hidrocar- boneto ramificado saturado divalente de 3 a 7 átomos de carbono. Exemplos de grupos alquileno incluem metileno, etileno, propileno, 2- metilpropileno, butileno, 2-etilbutileno, pentileno, hexileno. Exemplos particulares de alquileno são etileno, propileno, e butileno.
[0047] O termo "amino" denota um grupo de fórmula -NR’R" onde R’ e R" são independentemente hidrogênio, alquila, alcóxi, cicloalquila, heterocicloalquila, arila, heteroarila ou como descrito neste pedido. Al- ternativamente, R’ e R", junto com o nitrogênio ao qual eles estão liga-dos, podem formar uma heterocicloalquila. O termo "amino primário" denota um grupo no qual R’ e R" são ambos hidrogênio. O termo "amino secundário" denota um grupo no qual R’ é hidrogênio e R" é um grupo diferente de hidrogênio. O termo "amino terciário" denota um grupo no qual R’ e R" são ambos diferentes de hidrogênio. Aminas secundárias e terciárias particulares são metilamina, etilamina, propila- mina, isopropilamina, fenilamina, benzilamina dimetilamina, dietilami- na, dipropilamina e di-isopropilamina.
[0048] O termo "ingrediente farmacêutico ativo" (ou "API") denota o composto ou molécula em uma composição farmacêutica que tem uma atividade biológica particular.
[0049] Os termos "composição farmacêutica" e "formulação farma cêutica" (ou "formulação") são usados intercambiavelmente e denotam uma mistura ou solução compreendendo uma quantidade terapeuti- camente eficaz de um ingrediente farmacêutico ativo junto com excipi- entes farmaceuticamente aceitáveis para ser administrada a um mamí-fero, por exemplo, um ser humano com necessidade da mesma.
[0050] O termo "farmaceuticamente aceitável" denota um atributo de um material que é útil na preparação de uma composição farma-cêutica que geralmente é segura, atóxica, e não é biologicamente ou de alguma outra forma indesejável e é aceitável para uso farmacêutico tanto humano quanto veterinário.
[0051] Os termos "excipiente farmaceuticamente aceitável", "veí culo farmaceuticamente aceitável" e "excipiente terapeuticamente inerte" podem ser usados intercambiavelmente e denotam qualquer ingrediente farmaceuticamente aceitável em uma composição farmacêutica sem atividade terapêutica e atóxico para o indivíduo que os recebe, tais como desintegrantes, aglutinantes, cargas, solventes, tampões, agentes de tonicidade, estabilizantes, antioxidantes, tensoativos, veí- culos, diluentes ou lubrificantes usados na formulação de produtos farmacêuticos.
[0052] Os termos "indivíduo" ou "sujeito" referem-se a um mamífe ro. Mamíferos incluem, porém sem limitação, animais domésticos (por exemplo, vacas, carneiros, gatos, cachorros, e cavalos), primatas (por exemplo, seres humanos e primatas não humanos tais como macacos), coelhos, e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em certas modalidades, o indivíduo ou sujeito é um ser humano.
[0053] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" denota uma quantidade de um composto ou molécula da presente invenção que, quando administrada a um indivíduo, (i) trata ou previne a doença, condição ou distúrbio particular, (ii) atenua, melhora ou elimina um ou mais sintomas da doença, condição ou distúrbio particular, ou (iii) previne ou retarda a manifestação de um ou mais sintomas da doença, condição ou distúrbio particular descrito neste pedido. A quantidade terapeuticamente eficaz vai variar dependendo do composto, do estado de doença sendo tratado, da gravidade da doença tratada, da idade e do estado geral de saúde do indivíduo, da via e da forma de administração, do critério do médico ou veterinário assistente, e outros fatores.
[0054] Os termos "tratar" ou "tratamento" de um estado de doença incluem inibir o estado de doença, isto é, interromper o desenvolvimento do estado de doença ou dos seus sintomas clínicos, ou aliviar o estado de doença, isto é, causar regressão temporária ou permanente do estado de doença ou dos seus sintomas clínicos.
[0055] O termo "atrofia muscular espinhal" (ou SMA) refere-se a uma doença causada por uma mutação ou deleção desativante no gene SMN1 em ambos os cromossomas, resultando em uma perda da função do gene SMN1. Os sintomas de SMA incluem fraqueza muscular, tono muscular pobre, choro fraco, tosse fraca, moleza ou tendência a cair, dificuldade de sugar ou engolir, dificuldade de respirar, acúmulo de secreções nos pulmões e na garganta, punhos cerrados com as mãos suadas, tremor/vibração da língua, cabeça geralmente tombada para um lado, mesmo quando deitado, pernas que tendem a ficar mais fracas que os braços, pernas frequentemente assumindo a posição de "pernas de sapo", dificuldade para comer, maior susceptibilidade a infecções do trato respiratório, fraqueza do intestino/bexiga, peso mais baixo que o normal, incapacidade de sentar sem ajuda, incapacidade de andar, incapacidade de engatinhar, e hipotonia, arreflexia, e contraturas congênitas múltiplas (artrogripose) associadas à perda de células hom anteriores.
[0056] O termo "tratar atrofia muscular espinhal (SMA)" ou "trata mento de atrofia muscular espinhal (SMA)" inclui um ou mais dos se-guintes efeitos: (i) redução ou melhora da gravidade da SMA; (ii) retar-damento da manifestação da SMA; (iii) inibição da evolução da SMA; (iv) redução no número de hospitalizações de um indivíduo; (v) redução do tempo de hospitalização de um indivíduo; (vi) aumento da sobrevivência de um indivíduo; (vii) melhora da qualidade de vida de um indivíduo; (viii) redução do número de sintomas associados à SMA; (ix) redução ou melhora da gravidade de um ou mais sintomas associados à SMA; (x) redução da duração de um sintoma associado à SMA; (xi) prevenção ou recorrência de um sintoma associado à SMA; (xii) inibição do desenvolvimento ou manifestação de um sintoma de SMA; e/ou (xiii) inibição da evolução de um sintoma associado à SMA. Mais parti-cularmente, o termo "tratar SMA" denota um ou mais dos seguintes efeitos benéficos: (i) uma redução na perda de força muscular; (ii) um aumento na força muscular; (iii) uma redução na atrofia muscular; (iv) uma redução na perda da função motora; (v) um aumento nos neurônios motores; (vii) uma redução na perda de neurônios motores; (viii) proteção contra degeneração dos neurônios motores com deficiência de SMN; (ix) um aumento na função motora; (x) um aumento na fun- ção pulmonar; e/ou (xi) uma redução na perda da função pulmonar. Mais detalhamente, o termo "tratar SMA" refere-se à capacidade funcional ou conservação da capacidade funcional de um bebê humano ou uma criança humana começando a andar de sentar sem ajuda ou de um bebê humano, uma criança humana começando a andar, uma criança humana ou um adulto humano de ficar em pé sem ajuda, andar sem ajuda, correr sem ajuda, respirar sem ajuda, virar durante o sono sem ajuda, ou engolir sem ajuda.
[0057] O termo "concentração EC1,5x para produção de mRNA do minigene SMN2 de comprimento integral" (ou "EC1,5x minigene") é de-finido como aquela concentração do composto de teste que é eficaz para aumentar a quantidade de mRNA do minigene SMN2 de comprimento integral até um nível 1,5 vez maior em relação àquele nas células tratadas com veículo.
[0058] O termo "concentração EC1,5x para expressão da proteína SMN" (ou "EC1,5x SMN proteína") é definido como aquela concentração do composto de teste que é eficaz para produzir 1,5 vezes a quantidade de proteína SMN no fibroblasto de um paciente com SMA em com-paração com a quantidade produzida a partir do controle com veículo.
[0059] O termo "concentração eficaz semimáxima" (EC50) denota a concentração plasmática de um composto ou molécula particular ne-cessária para obter 50% do máximo de um efeito particular in vivo.
[0060] Um "veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a um ingrediente em uma composição farmacêutica, que não um princípio ativo, que é atóxico para um indivíduo. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, porém sem limitação, um tampão ou acidulante, exci- piente, estabilizante, ou conservante.
[0061] O termo "tampão" ou "sistema tampão" denota um excipien- te ou mistura de excipientes farmaceuticamente aceitável, que estabiliza o pH de uma preparação farmacêutica. Tampões adequados são bastante conhecidos no estado da técnica e podem ser encontrados na literatura. Tampões farmaceuticamente aceitáveis particulares compreendem tampão cítrico, tampão malato, tampão maleato, ou tampão tartarato, ainda mais particularmente tampão tartarato. Sistemas tampão particulares da invenção incluem combinações de ácido orgânico e sais seletos dos mesmos, por exemplo, citrato de sódio tri- básico e ácido cítrico, ácido málico e malato de sódio, tartarato misto de potássio e sódio e ácido tartárico, ou tartarato dissódico e ácido tar- tárico, particularmente tartarato misto de potássio e sódio e ácido tartá- rico. Alternativamente, o ácido orgânico (particularmente ácido tartári- co) pode ser empregado sozinho como "acidulante" em vez da combinação de ácido e do sal correspondente. Independentemente do tampão usado, o pH pode ser ajustado com um ácido ou uma base conhecidos na literatura, por exemplo, ácido clorídrico, ácido acético, ácido fosfórico, ácido sulfúrico e ácido cítrico, hidróxido de sódio e hidróxido de potássio. Um acidulante particular é ácido tartárico.
[0062] O termo "antioxidante" denota excipientes farmaceutica- mente aceitáveis, que impedem a oxidação do princípio ativo. Antioxi- dantes compreendem ácido ascórbico, glutationa, cisteína, metionina, ácido cítrico, EDTA.
[0063] O termo "tensoativo" denota um excipiente farmaceutica- mente aceitável que é usado para proteger composições à base de proteínas contra estresses mecânicos como agitação e cisalhamento. Exemplos de tensoativos farmaceuticamente aceitáveis incluem po- loxâmeros, polissorbatos, polioxietileno alquil éteres (BRIJ®), alquilfe- nilpolioxietileno éteres (TRITON-X®) ou dodecil sulfato de sódio (SDS).
[0064] O termo "poloxâmero" denota copolímeros tribloco não iôni- cos compostos de uma cadeia hidrófoba central de poli(óxido de propi- leno) (PPO) flanqueado por duas cadeias hidrofílicas de poli(óxido de etileno) (PEO), cada cadeia de PPO ou PEO podendo ser de pesos moleculares diferentes. Os poloxâmeros também são conhecidos pelo nome comercial Pluronics. Um poloxâmero particular é o Poloxâmero 188, um poloxâmero no qual a cadeia de PPO tem uma massa molecular de 1800 g/mol e um teor de PEO de 80% (p/p).
[0065] O termo "polissorbato" denota oleato ésteres de sorbitol e seus anidridos, tipicamente copolimerizados com óxido de etileno. Po- lissorbatos particulares são Polissorbato 20 (poli(óxido de etileno) (20) monolaurato de sorbitano, TWEEN 20®) ou Polissorbato 80 (poli(óxido de etileno) (80) monolaurato de sorbitano, TWEEN 80®).
[0066] O valor "equilíbrio hidrofílico-lipofílico" (HLB) denota o grau de hidrofilicidade de um tensoativo não iônico. O valor HLB é determinado pela razão entre a massa molecular da porção hidrofílica da molécula de tensoativo e sua massa molecular total, como descrito por Griffin W.C., Journal of the Society of Cosmetic Chemists (1949) 1:311.
[0067] O termo "hidrofílico" denota a capacidade de uma molécula ou de uma porção de uma molécula de interagir com solventes polares, em particular com água, ou com outras porções polares induzidas por ligação de hidrogênio, interações dipolo-íon e/ou interações dipolo- dipolo.
[0068] Os termos "lipofílico" e "hidrófobo" podem ser usados inter- cambiavelmente e denotam a tendência de uma molécula ou porção de uma molécula de dissolver em um ambiente não polar tal como gorduras, óleos, e solventes não polares induzidos por forças de dispersão de London.
[0069] O valor "logP" denota o logarítmo decimal do coeficiente de partição P e é uma medida da lipofilicidade de um composto não car-regado neutro. No presente pedido, o coeficiente de partição P é de-terminado pela razão entre a concentração de soluto na fase orgânica, particularmente 1-octanol, e sua concentração na fase aquosa em equilíbrio.
Compostos de fórmula (I)
[0069] Em detalhes, a presente invenção refere-se a uma compo sição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) onde R1 é hidrogênio ou C1-7-alquila; R2 é hidrogênio, ciano, C1-7-alquila, C1-7-haloalquila ou C3- 8-cicloalquila; R3 é hidrogênio, C1-7-alquila, ou C3-8-cicloalquila; A é N-heterocicloalquila ou NR12R13, onde N- heterocicloalquila compreende 1 ou 2 átomos de nitrogênio anelares e é opcionalmente substituído com 1, 2, 3 ou 4 substituintes selecionados dentre R14; R12 é heterocicloalquila compreendendo 1 átomo de nitrogênio anelar, onde heterocicloalquila é opcionalmente substituída com 1, 2, 3 ou 4 substituintes selecionados dentre R14; R13 é hidrogênio, C1-7-alquila ou C3-8-cicloalquila; R14 é independentemente selecionado dentre hidrogênio, C1-7-alquila, amino, amino-C1-7-alquila, C3-8-cicloalquila e heterocicloal- quila ou dois R14 juntos formam C1-7-alquileno; com a condição de que se A for N-heterocicloalquila com-preendendo apenas 1 átomo de nitrogênio anelar, então pelo menos um R14 substituinte é amino ou amino-C1-7-alquila; ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo; onde a composição é uma solução aquosa oral ou um pó seco adequado para constituição de uma solução aquosa oral.
[0070] Uma modalidade particular da presente invenção é uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
[0071] Além disso, fica entendido que qualquer modalidade refe rente a um A, R1, R2 ou R3 específico descrito neste pedido pode ser combinada com qualquer outra modalidade referente a um outro A, R1, R2 ou R3 descrito neste pedido.
[0072] Em uma modalidade particular da presente invenção: R1 é hidrogênio ou C1-7-alquila; R2 é hidrogênio, ciano, C1-7-alquila, C1-7-haloalquila ou C3- 8-cicloalquila; R3 é hidrogênio, C1-7-alquila, ou C3-8-cicloalquila; A é N-heterocicloalquila compreendendo 1 ou 2 átomos de nitrogênio anelares, onde N-heterocicloalquila é opcionalmente substituída com 1, 2, 3 ou 4 substituintes selecionados dentre R14; R14 é independentemente selecionado dentre hidrogênio, C1-7-alquila, amino, amino-C1-7-alquila, C3-8-cicloalquila e heterocicloal- quila ou dois R14 juntos formam C1-7-alquileno; com a condição de que se A for N-heterocicloalquila com-preendendo apenas 1 átomo de nitrogênio anelar, então pelo menos um R14 substituinte é amino ou amino-C1-7-alquila.
[0073] Em uma modalidade particular da presente invenção R1 é C1-7-alquila, particularmente metila.
[0074] Em uma modalidade particular da presente invenção R2 é hidrogênio ou C1-7-alquila, particularmente hidrogênio ou metila.
[0075] Em uma modalidade particular da presente invenção R3 é hidrogênio ou C1-7-alquila, particularmente hidrogênio ou metila.
[0076] Em uma modalidade particular da presente invenção R12 é piperidinila opcionalmente substituída com 1, 2, 3 ou 4 substituintes selecionados dentre R14.
[0077] Em uma modalidade particular da presente invenção R13 é hidrogênio ou C1-7-alquila, particularmente hidrogênio ou metila.
[0078] Em uma modalidade particular da presente invenção R14 é independentemente selecionado dentre C1-7-alquila e heterocicloalquila ou dois R14 juntos formam C1-7-alquileno.
[0079] Em uma modalidade particular da presente invenção R14 é independentemente selecionado dentre metila, etila e pirrolidinila ou dois R14 juntos formam etileno.
[0080] Em uma modalidade particular da presente invenção A é uma N-heterocicloalquila mono- ou bicíclica saturada compreendendo 1 ou 2 átomos de nitrogênio e é opcionalmente substituída com 1, 2, 3 ou 4 substituintes selecionados dentre R14.
[0081] Em uma modalidade particular da presente invenção a N- heterocicloalquila em A ou a heterocicloalquila em R12 definidas neste pedido são substituídas com 1 ou 2 substituintes selecionados dentre R14.
[0082] Em uma modalidade particular da presente invenção a N- heterocicloalquila em A definida neste pedido caracteriza-se ainda pelo fato de que os átomos de nitrogênio anelares são básicos.
[0083] Em uma modalidade particular da presente invenção A é ,onde X é N ou CH; R4 é hidrogênio, C1-7-alquila ou -(CH2)m-NR9R10; R5 é hidrogênio ou C1-7-alquila; R6 é hidrogênio ou C1-7-alquila; R7 é hidrogênio ou C1-7-alquila; R8 é hidrogênio ou C1-7-alquila; R9 e R10 são independentemente selecionados dentre hi-drogênio, C1-7-alquila e C3-8-cicloalquila; R13 é hidrogênio, C1-7-alquila ou C3-8-cicloalquila; n é 0, 1 ou 2; m é 0, 1, 2 ou 3; ou R4 e R5 juntos formam um C1-7-alquileno; ou R4 e R7 juntos formam um C1-7-alquileno; ou R5 e R6 juntos formam um C2-7-alquileno; ou R5 e R7 juntos formam um C1-7-alquileno; ou R5 e R9 juntos formam um C1-7-alquileno; ou R7 e R8 juntos formam um C2-7-alquileno; ou R7 e R9 juntos formam um C1-7-alquileno; ou R9 e R10 juntos formam um C2-7-alquileno; com a condição de que se X for CH então R4 é -(CH2)m- NR9R10; e com a condição de que se X for N e R4 é -(CH2)m-NR9R10 então m é 2 ou 3.
[0084] Foi constatado que a penetração no cérebro é melhorada quando pelo menos um de R4, R5, R6, R7 e R8 não é hidrogênio.
[0085] Em uma modalidade particular da invenção pelo menos um de R4, R5, R6, R7 e R8 é diferente de hidrogênio.
[0086] Em uma modalidade particular da presente invenção X é N.
[0087] Em uma modalidade particular da presente invenção n é 1.
[0088] Em uma modalidade particular da presente invenção R4 é hidrogênio, metila ou -(CH2)m-NR9R10, mais particularmente hidrogênio.
[0089] Em uma modalidade particular da presente invenção R5 é hidrogênio, metila ou etila, mais particularmente metila.
[0090] Em uma modalidade particular da presente invenção R6 é hidrogênio ou metila, mais particularmente hidrogênio.
[0091] Em uma modalidade particular da presente invenção R7 é hidrogênio ou metila.
[0092] Em uma modalidade particular da presente invenção R8 é hidrogênio.
[0093] Em uma modalidade particular da presente invenção m é 0.
[0094] Em uma modalidade particular da presente invenção R4 e R5 juntos formam propileno.
[0095] Em uma modalidade particular da presente invenção R5 e R6 juntos formam etileno;
[0096] Em uma modalidade particular da presente invenção R9 e R10 juntos formam butileno.
[0097] Em uma modalidade particular da presente invenção A é selecionado do grupo de: onde R4, R5, R6, R7, R8 e R13 são como definidos neste pedido e onde R11 é hidrogênio ou C1-7-alquila.
[0098] Em uma modalidade particular da presente invenção A é selecionado do grupo de piperazinila, diazepanila, pirrolidinila e hexa- hidropirrolo[1,2-a]pirazinila, cada uma delas opcionalmente substituída com 1, 2, 3 ou 4 substituintes selecionados dentre R14 como definido neste pedido.
[0099] Em uma modalidade particular da presente invenção A é selecionado do grupo de piperazin-1-ila, 1,4-diazepan-1-ila, pirrolidin- 1-ila e hexa-hidropirrolo[1,2-a]pirazin-2(1H)-ila, cada uma delas opcio-nalmente substituída com 1 ou 2 substituintes selecionados dentre R14 como definido neste pedido.
[00100] Em uma modalidade particular da presente invenção A é NR12R13, onde R12 e R13 são como descritos neste pedido.
[00101] Em uma modalidade particular da presente invenção A é selecionado do grupo de:
[00102] Em uma modalidade particular da presente invenção R1 é metila, R2 é hidrogênio ou metila, R3 é hidrogênio, e A é
[00103] Em uma modalidade particular da presente invenção R1 é metila, R2 é metila, R3 é hidrogênio, e A é. Em uma modalidade particular da presente invenção o composto de fórmula (I) é selecionado do grupo que consiste em: 2-(2-metilimi- dazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-(4-metilpiperazin-1-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4- ona; 7-[(8aR)-3,4,6,7,8,8a-hexa-hidro-1H-pirrolo[1,2-a]pirazin-2-il]-2-(2- metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-[(8aS)-3,4,6,7,8,8a-hexa-hidro-1H-pirrolo[1,2-a]pirazin-2-il]-2-(2,8- dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-[(8aR)-3,4,6,7,8,8a-hexa-hidro-1H-pirrolo[1,2-a]pirazin-2-il]-2-(2,8- dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-[(8aS)-8a-metil-1,3,4,6,7,8-hexa-hidropirrolo[1,2-a]pirazin-2-il]-2-(2,8- dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-[(8aR)-8a-metil-1,3,4,6,7,8-hexa-hidropirrolo[1,2-a]pirazin-2-il]-2-(2,8- dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3S,5R)-3,5- dimetilpiperazin-1-il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3S)-3-metilpiperazin-1- il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3R)-3-metilpiperazin-1- il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-(1,4-diazepan-1-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3S)-3-metilpiperazin-1- il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3R)-3-metilpiperazin-1- il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-(1,4-diazepan-1-il)-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2- a]pirimidin-4-ona; 7-[(3R,5S)-3,5-dimetilpiperazin-1-il]-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-[(8aS)-3,4,6,7,8,8a-hexa-hidro-1H-pirrolo[1,2-a]pirazin-2-il]-2-(2- metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-[(8aS)-8a-metil-1,3,4,6,7,8-hexa-hidropirrolo[1,2-a]pirazin-2-il]-2-(2- metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-[(8aR)-8a-metil-1,3,4,6,7,8-hexa-hidropirrolo[1,2-a]pirazin-2-il]-2-(2- metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3R)-3-pirrolidin-1- ilpirrolidin-1-il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin- 6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3R)-3-pirrolidin-1-ilpirrolidin-1- il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-(3,3-dimetilpiperazin-1- il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-(3,3-dimetilpiperazin-1-il)-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-9-metil-7-[(3S)-3- metilpiperazin-1-il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-9-metil-7-[(3R)-3- metilpiperazin-1-il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3R,5S)-3,5- dimetilpiperazin-1-il]-9-metil-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-(3,3-dimetilpiperazin-1-il)-9- metil-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin- 6-il)-9-metil-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3S,5S)-3,5- dimetilpiperazin-1-il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3S)-3-pirrolidin-1- ilpirrolidin-1-il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3S)-3-pirrolidin-1-ilpirrolidin-1- il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-[(3S,5S)-3,5-dimetilpiperazin-1-il]-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 9-metil-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3S)-3-metilpiperazin-1- il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 9-metil-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3R)-3-metilpiperazin-1- il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-[(3R,5S)-3,5-dimetilpiperazin-1-il]-9-metil-2-(2-metilimidazo[1,2- b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-(3,3-dimetilpiperazin-1-il)-9-metil-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-9-metil-2-(2-metilimidazo[1,2- b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-[(3S,5S)-3,5-dimetilpiperazin-1-il]-9-metil-2-(2-metilimidazo[1,2- b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-[(3R)-3-etilpiperazin-1-il]-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; e sais farmaceuticamente aceitáveis das mesmas.
[00105] Em uma modalidade particular da presente invenção o composto de fórmula (I) é selecionado do grupo que consiste em:
[00106] 7-[(8aR)-3,4,6,7,8,8a-hexa-hidro-1H-pirrolo[1,2-a]pirazin-2- il]-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona;
[00107] 7-[(8aS)-3,4,6,7,8,8a-hexa-hidro-1H-pirrolo[1,2-a]pirazin-2- il]-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-[(8aR)-3,4,6,7,8,8a-hexa-hidro-1H-pirrolo[1,2-a]pirazin-2-il]-2-(2,8- dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3S,5R)-3,5- dimetilpiperazin-1-il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-[(3R,5S)-3,5-dimetilpiperazin-1-il]-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-[(8aS)-3,4,6,7,8,8a-hexa-hidro-1H-pirrolo[1,2-a]pirazin-2-il]-2-(2- metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin- 6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-9-metil-7-[(3S)-3- metilpiperazin-1-il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin- 6-il)-9-metil-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-[(3R,5S)-3,5-dimetilpiperazin-1-il]-9-metil-2-(2-metilimidazo[1,2- b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-9-metil-2-(2-metilimidazo[1,2- b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona; e sais farmaceuticamente aceitáveis das mesmas. Um composto de fórmula (I) particular da presente invenção é 7- [(8aR)-3,4,6,7,8,8a-hexa-hidro-1H-pirrolo[1,2-a]pirazin-2-il]-2-(2- metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona ou sais farmaceuticamente aceitáveis da mesma.
[00108] Uma modalidade particular da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo 7-[(8aR)- 3,4,6,7,8,8a-hexa-hidro-1H-pirrolo[1,2-a]pirazin-2-il]-2-(2- metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma.
[00109] Um composto de fórmula (I) particular da presente invenção é 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2- b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona ou sais farmaceuticamente aceitáveis da mesma.
[00110] Uma modalidade particular da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo 7-(4,7- diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma.
Processos de Produção
[00109] Os compostos de fórmula (I) e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos como definidos acima podem ser preparados de acordo com métodos tradicionais conhecidos na literatura.
[00110] Como ilustrado no Esquema 1, a amino-piridina de fórmula (II) comercialmente disponível pode ser reagida com um éster malôni- co para dar o intermediário de fórmula (III), onde Y e R3 são como descritos neste pedido e R é C1-2-alquila, particularmente metila. O composto de fórmula (III) é então tratado com um reagente clorinante (tal como POCl3 entre outros) para produzir um composto de fórmula (IV). O composto de fórmula (IV) é então reagido em reação de acoplamento de Suzuki com um composto de fórmula (V), onde R1 e R2 são como descritos neste pedido e Z é B(OH)2 ou um éster de ácido C1-7-alquil boroico tal como 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-ila, na presença de um catalisador (tal como dicloreto de (1,1'- bis(difenilfosfino) ferroceno)paládio(II) (Pd(dppf)Cl2) entre outros) e uma base (tal como K2CO3 entre outras) em um solvente adequado (tal como DMF entre outros), para dar o composto de fórmula (VI). Por fim, o composto de fórmula (VI) é reagido com um composto M-A seja em: a) uma reação de substituição nucleofílica aromática (parti- cularmente se Y for flúor) por aquecimento a uma temperatura de 80°C a 200°C; ou b) uma reação de aminação de Buchwald-Hartwig na pre-sença de um catalisador à base de paládio (por exemplo, tetrakis (tri- fenilfosfina) paládio (Pd(PPh3)4) ou bis(dibenzilidenoacetona) paládio (Pd(dba)2) por aquecimento a uma temperatura de 20°C a 100°C; em um solvente (por exemplo, dimetil sulfóxido (DMSO), N- metilpirrolidona (NMP), ou dimetilformamida (DMF)) para dar um com-posto de fórmula (I), onde A é como definido neste pedido, M é hidro-gênio, sódio ou potássio, particularmente hidrogênio, e onde M está ligado a A via um átomo de nitrogênio de A. Esquema 1.
[00111] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um processo para a produção de compostos de fórmula (I) e sais farmaceuticamen- te aceitáveis dos mesmos como definidos acima, compreendendo a reação de um composto de fórmula (VI) com um composto M-A seja em: a) uma reação de substituição nucleofílica aromática (parti-cularmente se Y for flúor) por aquecimento a uma temperatura de 80°C a 200°C; ou b) uma reação de aminação de Buchwald-Hartwig na pre sença de um catalisador à base de paládio (por exemplo, tetrakis (tri- fenilfosfina) paládio (Pd(PPh3)4) ou bis(dibenzilidenoacetona)paládio (Pd(dba)2) por aquecimento a uma temperatura de 20°C a 100°C; em um solvente (por exemplo, dimetil sulfóxido (DMSO), N-metilpirroli- dona (NMP), ou dimetilformamida (DMF)), onde A, Y, R1, R2 e R3 são como definidos neste pedido, M é hidrogênio, sódio ou potássio, parti-cularmente hidrogênio, e onde M está ligado a A via um átomo de ni-trogênio de A.
[00112] Uma modalidade particular da invenção refere-se a um processo para a preparação de compostos de fórmula (I) e sais farmaceu- ticamente aceitáveis dos mesmos como definidos acima, compreendendo uma reação de substituição nucleofílica aromática entre um composto de fórmula (VI) como descrito acima com um composto de fórmula M-A por aquecimento em um solvente, onde A, R1, R2, R3 e Y são como definidos acima, M é hidrogênio, sódio ou potássio, e onde M está ligado a A via um átomo de nitrogênio de A.
[00113] Uma modalidade particular da invenção refere-se a um processo para a preparação de compostos de fórmula (I) e sais farmaceu- ticamente aceitáveis dos mesmos como definidos acima, onde a reação de substituição nucleofílica aromática é realizada a uma temperatura de 80°C a 200°C.
[00114] Uma modalidade particular da invenção refere-se a um processo para a preparação de compostos de fórmula (I) e sais farmaceu- ticamente aceitáveis dos mesmos como definidos acima, onde o solvente da reação de substituição nucleofílica aromática é selecionado dentre dimetil sulfóxido (DMSO), N-metilpirrolidona (NMP), e dimetil- formamida (DMF).
[00115] Uma modalidade particular da invenção refere-se a um processo para a preparação de compostos de fórmula (I) e sais farmaceu- ticamente aceitáveis dos mesmos como definidos acima, onde M é hi-drogênio.
[00116] Particularmente, os compostos de fórmula (I) e sais farma- ceuticamente aceitáveis dos mesmos podem ser preparados de acordo com os métodos descritos nos exemplos contidos neste pedido.
Usos Médicos
[00117] Como descrito acima, os compostos de fórmula (I) e seus sais farmaceuticamente aceitáveis possuem propriedades farmacológicas valiosas e foi constatado que eles melhoram a inclusão do exon 7 da SMN1 e/ou SMN2 no mRNA transcrito a partir do gene SMN1 e/ou SMN2, aumentando assim a expressão da proteína SMN em um indivíduo humano com necessidade do mesmo.
[00118] Os compostos da presente invenção podem ser usados, seja isoladamente ou em combinação com outros fármacos, para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de uma doença causada por uma mutação ou deleção desativante no gene SMN1 e/ou associada à perda ou defeito da função do gene SMN1. Essas doenças incluem, porém sem limitação, atrofia muscular espinhal (SMA).
[00119] Uma modalidade particular da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como definido acima e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de uma doença causada por uma mutação ou deleção desati- vante no gene SMN1 e/ou associada à perda ou defeito da função do gene SMN1, particularmente para o tratamento, a prevenção, o retar-damento da evolução e/ou a melhora de SMA.
[00120] Uma modalidade particular da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como definido acima para uso como substâncias terapeuticamente ativas, especialmente para uso como substâncias terapeuticamente ativas para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de uma doença causada por uma mutação ou deleção desati- vante no gene SMN1 e/ou associada à perda ou defeito da função do gene SMN1, particularmente para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de atrofia muscular espinhal (SMA).
[00121] Uma modalidade particular da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como definido acima para uso no tratamento, na prevenção, no retardamento da evolução e/ou na melhora de uma doença causada por uma mutação ou deleção desativante no gene SMN1 e/ou associada à perda ou defeito da função do gene SMN1, particularmente para uso no tratamento, na prevenção, no retardamento da evolução e/ou na melhora de atrofia muscular espinhal (SMA).
[00122] Uma modalidade particular da presente invenção refere-se a um método para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de uma doença causada por uma mutação ou deleção desativante no gene SMN1 e/ou associada à perda ou defeito da função do gene SMN1, particularmente para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de atrofia muscular espinhal (SMA), método este que compreende administrar uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como defnido acima a um indivíduo.
[00123] Uma modalidade particular da presente invenção refere-se ao uso de uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como definido acima para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de uma doença causada por uma mutação ou deleção desativante no gene SMN1 e/ou associada à perda ou defeito do gene SMN1, particularmente para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de atrofia muscular espinhal (SMA).
[00124] Uma modalidade particular da presente invenção refere-se ao uso de uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como definido acima para a preparação de medicamentos para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de uma doença causada por uma mutação ou deleção desativante no gene SMN1 e/ou associada à perda ou defeito da função do gene SMN1, particularmente para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de atrofia muscular espinhal (SMA). Estes medicamentos compreendem compostos de fórmula (I) ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis como definidos acima.
Combinações
[00125] Citoprotetores (tais como olesoxima) e moduladores da emenda do gene SMN2 (tais como os compostos de fórmula (I)) são abordagens complementares para tratar atrofia muscular espinhal (SMA). Há evidências de suporte para sugerir que a coadministração de citoprotetores e moduladores da emenda do gene SMN2 como um tratamento combinado proporcionará benefícios adicionais a todos os tipos de pacientes com SMA. A extensão do benefício adicionado pode ser quantificada através de estudos de tratamento combinado em mo-delos de camundongo com SMA.
[00126] Um modulador particular da emenda do gene SMN2 da invenção é um composto de fórmula (I) como descrito neste pedido ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00127] Um citoprotetor particular da invenção é olesoxima.
[00128] Níveis sistemicamente baixos da proteína SMN causam SMA. Os neurônios α-motores do cordão espinhal são considerados particularmente vulneráveis neste distúrbio genético e sua disfunção e perda causam fraqueza muscular progressiva, paralisia e eventualmente morte prematura de indivíduos acometidos. Historicamente, SMA foi assim considerada uma doença autônoma dos neurônios motores. No entanto, a depleção de SMN nos neurônios motores de camundongos normais fez surgir apenas um fenótipo muito leve (Park et al., J Neurosci. 2010 Sep 8;30(36):12005-19). Ao contrário, a restauração de SMN para os neurônios motores em um modelo de camundongo com SMA teve efeitos apenas modestos no fenótipo de SMA e na sobrevivência (Hua et al Nature. 2011 Oct 5;478(7367):123-6). Em conjunto, esses resultados sugerem que tipos adicionais de células contribuem para a patogênese da SMA, e entender as exigências não autônomas é crucial para o desenvolvimento de terapias eficazes.
[00129] A pesquisa atual aponta para SMA como um distúrbio mul- ticelular, multitecidual, multissistêmico. Há diversos estudos in vitro e in vivo, assim como estudos de casos humanos que mostram que uma variedade de tecidos são afetados na SMA, tais como: nervos aferentes, músculo, vasculatura, cérebro, coração e pâncreas (Hamilton e Gillingwater, et al., Trends Mol Med. 2013 Jan;19(1):40-50. Por exemplo, há um corpo de trabalho que mostra defeitos musculares intrínsecos em SMA, indicando que a SMN desempenha um papel no desenvolvimento e regeneração muscular (Boyer et al., Front Physiol. 2013 Dec 18;4:356.; Hayhurst M et al., Dev Biol. 2012 Aug 15;368(2):323- 34; Briccino et al., Hum Mol Genet. 2014 Sep 15;23(18):4745-57. ; Shafey et al., Exp Cell Res. 2005 Nov 15;311(1):49-61., Cifuentes-Diaz et al., J Cell Biol. 2001 Mar 5;152(5):1107-14.; Martinez et al J Neuro- sci. 2012 Jun 20;32(25):8703-15. Isto ressalta a importância de tratamentos direcionados para os músculos para pacientes com SMA. Muitas estratégias terapêuticas estão voltadas para a restauração da proteína SMN. Oligonucleotídeos antissenso e potenciais tratamentos com terapia genética visam aumentar a SMN apenas no tecido do CNS. Direcionar efetivamente o tratamento para outras células e tecidos afetados chave continua sendo um desafio.
[00130] O citoprotetor olesoxima e os moduladores da emenda do gene SMN2 de fórmula (I) podem ser ambos administrados por via oral e são distribuídos sistemicamente. Além disso, eles possuem mecanismos de ação complementares. A olesoxima é citoprotetora preservando a membrana mitocondrial e prevenindo a disfunção mitocondri- al, um elemento importante da patofisiologia da doença em SMA. As mitocôndias são particularmente abundantes em células que demandam energia, tais como neurônios motores e células musculares, ambos identificados como tecidos alvo de tratamento em SMA. Os modu- ladores da emenda do gene SMN2 de fórmula (I) visam aumentar a proteína SMN sistemicamente.
[00131] Os moduladores da emenda do gene SMN2 de fórmula (I) corrigem a proteína SMN no nível do RNA corrigindo a emenda incorreta do pré-mRNA da SMN. O aumento máximo da proteína SMN nos neurônios motores e fibroblastos em SMA acima do de células não tra-tadas resultado em um aumento semelhante em ambos os tipos de células (60-80%). Além disso, nos modelos tanto severo quanto leve de SMA, os camundongos tratados com moduladores da emenda do gene SMN2 de fórmula (I) apresentaram um aumento da proteína SMN atingindo aproximadamente 43% (cérebro) e 55% (músculo) dos níveis de proteína em camundongos heterozigóticos. O aumento de proteína foi suficiente para proporcionar um benefício significativo, res-taurando a conectividade nas junções neuromusculares (NMJ), e na sobrevivência nos camundongos graves tratados com os compostos de fórmula (I). Visto que o aumento de proteína não é corrigido para 100% dos camundongos heterozigóticos ou dos camundongos do tipo selvagem, é razoável acreditar que pode haver melhorias adicionais com cotratamentos, especialmente tratamentos que visam outros me-canismos da patogênese da doença.
[00132] Estudos de ligação in vitro e ensaios de estresse oxidativo indicam que o citoprotetor olesoxima preserva a membrana mitocon- drial em uma doença na qual há evidências de disfunção mitocondrial (SMA), prevenindo assim a morte celular. Experiências de imagem de fluorescência in vitro mostraram que a olesoxima acumula-se no nível da membrana de mitocôndrias nos neurônios. Além disso, em camundongos SOD1 tratados com olesoxima (modelo de ALS familiar severo) as junções neuromusculares (NMJ) foram preservadas quando tratados precocemente. Por conseguinte, a olesoxima conseguiu proporcionar benefícios adicionais e complementares através de mecansi- mos mitocondriais e citoprotetores.
[00133] Os benefícios adicionais do tratamento combinado do cito- protetor olesoxima e os moduladores da emenda do gene SMN2 de fórmula (I) estão sendo confirmados em um modelo de camundongo leve de SMA. O modelo leve foi gerado por meio de tratamento do modelo de camundongo com SMA delta7 severo com uma dose baixa de um modulador da emenda de SMN. No estudo, o citoprotetor ole- soxima e os moduladores da emenda do gene SMN2 de fórmula (I) são testados isoladamente e em combinação. O impacto do tratamento no camundongo NMJs é o objetivo primário desses estudos, dada a importância deste fenótipo. Marcadores de estresse oxidativo em tecidos musculares também são avaliados.
[00134] Um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo pode ser combinado com olesoxima em uma única composição farmacêutica (por exemplo, uma combinação de dose fixa) ou um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e olesoxima podem ser coadministrados em sequência um depois do outro.
[00135] Como descrito neste pedido, a coadministração de um composto de fórmula (I) e olesoxima pode ter efeitos benéficos e si- nergísticos para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de uma doença causada por uma mutação ou de- leção desativante no gene SMN1 e/ou associada à perda ou defeito da função do gene SMN1, e adicionalmente para a proteção de células envolvidas na patofisiologia da doença, particularmente para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de atrofia muscular espinhal (SMA).
[00136] No contexto da presente invenção, o termo "coadministra- ção" de dois API pode ser simultânea, quase simultânea, ou com um intervalo de alguns dias ou semanas, por exemplo, por até 4 ou 5 semanas.
[00137] Os compostos da presente invenção podem ser usados em combinação com citoprotetores tais como olesoxima para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de uma doença causada por uma mutação ou deleção desativante no gene SMN1 e/ou associada à perda ou defeito da função do gene SMN1, e adicionalmente para a proteção de células envolvidas na patofisiologia da doença. Essas doenças incluem, porém sem limitação, atrofia muscular espinhal (SMA).
[00138] Em uma modalidade particular, a presente invenção apre- senta a sinergia de uma combinação de um composto de fórmula (I) com olesoxima apenas ou em combinação no tratamento, na prevenção, no retardamento da evolução e/ou na melhora de uma doença causada por uma mutação ou deleção desativante no gene SMN1 e/ou associada à perda ou defeito da função do gene SMN1, e adicionalmente para a proteção de células envolvidas na patofisiologia da doença, particularmente para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de atrofia muscular espinhal (SMA).
[00139] Uma modalidade particular da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e oleso- xima e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis para uso no tratamento, na prevenção, no retardamento da evolução e/ou na melhora de uma doença causada por uma mutação ou deleção desati- vante no gene SMN1 e/ou associada à perda ou defeito da função do gene SMN1, e adicionalmente para a proteção de células envolvidas na patofisiologia da doença, particularmente para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de SMA.
[00140] Uma modalidade particular da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e oleso- xima para uso como substâncias terapeuticamente ativas, especialmente para uso como substâncias terapeuticamente ativas para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de uma doença causada por uma mutação ou deleção desativante no gene SMN1 e/ou associada à perda ou defeito da função do gene SMN1, e adicionalmente para a proteção de células envolvidas na patofisiolo- gia da doença, particularmente para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de atrofia muscular espinhal (SMA).
[00141] Uma modalidade particular da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e oleso- xima para uso no tratamento, na prevenção, no retardamento da evolução e/ou na melhora de uma doença causada por uma mutação ou deleção desativante no gene SMN1 e/ou associada à perda ou defeito da função do gene SMN1 e adicionalmente para a proteção de células envolvidas na patofisiologia da doença, particularmente para uso no tratamento, na prevenção, no retardamento da evolução e/ou na melhora de atrofia muscular espinhal (SMA).
[00142] Uma modalidade particular da presente invenção refere-se a um método para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de uma doença causada por uma mutação ou deleção desativante no gene SMN1 e/ou associada à perda ou defeito da função do gene SMN1 e adicionalmente para a proteção de células envolvidas na patofisiologia da doença, particularmente para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de atrofia muscular espinhal (SMA), método este que compreende administrar uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e ole- soxima a um indivíduo.
[00143] Uma modalidade particular da presente invenção refere-se ao uso de uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e olesoxima para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de uma doença causada por uma mutação ou de- leção desativante no gene SMN1 e/ou associada à perda ou defeito da função do gene SMN1 e adicionalmente para a proteção de células envolvidas na patofisiologia da doença, particularmente para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de atrofia muscular espinhal (SMA).
[00144] Uma modalidade particular da presente invenção refere-se ao uso de um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e olesoxima para a preparação de medicamentos para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de uma doença causada por uma mutação ou deleção desati- vante no gene SMN1 e/ou associada à perda ou defeito da função do gene SMN1, e adicionalmente para a proteção de células envolvidas na patofisiologia da doença, particularmente para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de atrofia muscular espinhal (SMA). Tais medicamentos compreendem compostos de fórmula (I) ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis e olesoxima.
[00145] A presente invenção, portanto, também abrange um kit para a preparação de composições farmacêuticas compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e olesoxima.
[00146] Em uma modalidade, a invenção oferece um kit compreendendo (a) uma primeira composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de (i) um composto de fórmula (I), e (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável, (b) uma segunda composição farmacêutica compreendendo (i) olesoxima, e (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável, (c) indicações de uso, e (d) um recipiente, onde a indicações de uso inclui advertência ao paciente sobre a coadministração dos dois API.
[00147] Em uma outra modalidade a presente invenção oferece um kit compreendendo uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de fórmula (I) e olesoxima, indicações de uso também conhecidas como "bula", uma cartela ou frasco (HDPE ou vidro) e um recipiente.
[00148] O termo "kit" conforme usado neste relatório refere-se a um conjunto dos componentes mencionados acima que podem apresentados separadamente ou em um único recipiente. O recipiente compreende opcionalmente instruções para realização do método da presente invenção.
[00149] Uma modalidade da invenção oferece uma combinação de um modulador da emenda do gene SMN2 e um citoprotetor.
[00150] Uma modalidade da invenção oferece uma combinação de um modulador da emenda do gene SMN2 e um citoprotetor, para uso no tratamento, na prevenção, no retardamento da evolução e/ou na melhora de uma doença causada por uma mutação ou deleção desati- vante no gene SMN1 e/ou associada à perda ou defeito da função do gene SMN1, e/ou para a proteção de células envolvidas na patofisiolo- gia da doença.
[00151] Uma modalidade da invenção oferece uma combinação de um composto de fórmula (I) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e ole- soxima, para uso no tratamento, na prevenção, no retardamento da evolução e/ou na melhora de uma doença causada por uma mutação ou deleção desativante no gene SMN1 e/ou associada à perda ou defeito da função do gene SMN1, e/ou para a proteção de células envolvidas na patofisiologia da doença.
[00152] Uma modalidade da invenção oferece um método para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de uma doença causada por uma mutação ou deleção desativante no gene SMN1 e/ou associada à perda ou defeito da função do gene SMN1, e/ou para a proteção de células envolvidas na patofisiologia da doença, método este que compreende administrar uma combinação de um modulador da emenda do gene SMN2 e um citoprotetor a um indivíduo.
[00153] Uma modalidade da invenção oferece um método para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de uma doença causada por uma mutação ou deleção desativante no gene SMN1 e/ou associada à perda ou defeito da função do gene SMN1, e/ou para a proteção de células envolvidas na patofisiologia da doença, método este que compreende administrar uma combinação de um composto de fórmula (I) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e olesoxima a um indivíduo.
[00154] Uma modalidade da invenção oferece o uso de uma combinação de um modulador da emenda do gene SMN2 e um citoprotetor para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de uma doença causada por uma mutação ou deleção desati- vante no gene SMN1 e/ou associada à perda ou defeito da função do gene SMN1, e/ou para a proteção de células envolvidas na patofisiolo- gia da doença.
[00155] Uma modalidade da invenção oferece o uso de uma combinação de um composto de fórmula (I) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e olesoxima para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de uma doença causada por uma mutação ou deleção desativante no gene SMN1 e/ou associada à perda ou defeito da função do gene SMN1, e/ou para a proteção de células envolvidas na patofisiologia da doença.
[00156] Uma modalidade da invenção oferece o uso de uma combinação de um modulador da emenda do gene SMN2 e um citoprotetor para a preparação de medicamentos para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de uma doença causada por uma mutação ou deleção desativante no gene SMN1 e/ou associada à perda ou defeito da função do gene SMN1, e/ou para a proteção de células envolvidas na patofisiologia da doença.
[00157] Uma modalidade da invenção oferece o uso de uma combinação de um composto de fórmula (I) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e olesoxima para a preparação de medicamentos para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de uma doença causada por uma mutação ou deleção desativante no gene SMN1 e/ou associada à perda ou defeito da função do gene SMN1, e/ou para a proteção de células envolvidas na patofisiologia da doença.
Composições farmacêuticas
[00158] Foi constatado que os compostos de fórmula (I) da presente invenção apresentam uma alta solubilidade aquosa. Por conta daqueles com dificuldade de engolir de todas as faixas etárias de pacientes com SMA, constatou-se que a administração de uma solução é preferida.
[00159] Os compostos de fórmula (I) podem ser formulados como uma solução aquosa oral dissolvendo-se a substância medicamentosa em um sistema tampão a um pH menor que pH 4, particularmente menor que pH 3,8, mais particularmente menor que pH 3,6, ainda mais particularmente pH 3,4, a fim de proporcionar uma concentração suficientemente alta do fármaco, por exemplo, sistema tampão cítrico, sistema tampão malato, sistema tampão maleato, ou sistema tampão tar- tarato, ainda mais particularmente sistema tampão tartarato.
[00160] Estabilidade prolongada de formulações dos compostos de fórmula (I) pode ser obtida por preparação de um pó seco ou granulação para constituição de uma solução oral. Um sistema tampão pode ser incorporado na formulação seca pela escolha do ácido orgânico e seus sais como pós finos, por exemplo, citrato de sódio tribásico e ácido cítrico, malato dissódico e ácido málico, tartarato misto de sódio e potássio e ácido tartárico, ou tartarato dissódico e ácido tartárico, par- ticularmente tartarato misto de sódio e potássio e ácido tartárico. Alter-nativamente, o ácido orgânico (particularmente ácido tartárico) pode ser empregado isolado como acidulante em vez da combinação de ácido e do sal correspondente.
[00161] Pós ou grânulos compreendendo um composto de fórmula (I) podem compreender um diluente, tal como sorbitol, isomalte, ou particularmente manitol, e combinações dos mesmos, o qual garante a rápida dissolução da blenda em pó durante a constituição da solução aquosa. Na introdução de uma carga a blenda em pó pode ser granulada por compactação a seco para melhorar a fluidez e para garantir uniformidade robusta.
[00162] Os ingredientes para a constituição de um sistema solvente para os compostos de fórmula (I) podem ser formulados como uma formulação separada. O solvente reconstituído pode ser usado para dissolução dos compostos de fórmula (I) em um frasco no início do pe-ríodo de uso da solução oral.
[00163] Uma modalidade particular da invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo na forma de pó para constituição de uma solução oral.
[00164] Em uma modalidade particular da invenção, a composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é introduzida em um frasco multidoses com um adaptador para uso de dispensadores orais. Foi observado que tal frasco multidoses com adaptador para uso dedis- pensadores orais possibilita alta flexibilidade de dosagem, por exemplo, dosagem ajustada ao peso corporal e proporciona a administração segura e conveniente da dose.
[00165] Em uma modalidade particular da invenção, a composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é preparado através de granu-lação a seco por compactação por rolos seguida por preenchimento de frascos. Verificou-se que tal processamento é vantajoso (particularmente para cargas solúveis em água) para evitar decomposição.
[00166] Uma modalidade particular da invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo em que a composição é uma solução aquosa oral ou um pó seco adequado para constituição de uma solução aquosa oral.
[00167] Uma modalidade particular da invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo em que a composição é uma solução aquosa oral que não inclui aerossóis ou um pó seco adequado para constituição de uma solução aquosa oral.
[00168] Em uma modalidade particular da invenção, a composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo não é um aerossol.
[00169] Em uma modalidade particular da invenção, a composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo não compreende um tonificante, por exemplo, um sal tal como cloreto de sódio.
[00170] Uma modalidade particular da invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo em que a composição é uma solução aquosa oral ou um pó seco adequado para constituição de uma solução aquosa oral, e onde a solução aquosa oral tem um pH menor que pH 4, particularmente menor que pH 3,8, mais particularmente menor que pH 3,6, ainda mais particularmente pH 3,4.
[00171] Uma modalidade particular da invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um sistema tampão citrato, malato, maleato ou tartarato, particularmente um sistema tampão malato ou tartarato, ainda mais particularmente um sistema tampão tartarato; ou alternativamente somente o ácido correspondente de um sistema tampão como acidulante, particularmente ácido tartári- co; onde a composição é uma solução aquosa oral ou um pó seco adequado para constituição de uma solução aquosa oral.
[00172] Uma modalidade particular da invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo em que a composição é uma solução aquosa oral.
[00173] Uma modalidade particular da invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo em que a composição é uma solução aquosa oral em um sistema tampão a um pH menor que pH4, particularmente menor que pH 3,8, mais particularmente menor que pH 3,6, ainda mais particularmente pH 3,4.
[00174] Uma modalidade particular da invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo em que a composição é uma solução aquosa oral em um sistema tampão citrato, malato, maleato ou tartarato, particularmente em um sistema tampão malato ou tartarato, ainda mais particularmente em um sistema tampão tarta- rato; ou alternativamente somente o ácido correspondente de um sistema tampão como acidulante, particularmente ácido tartárico.
[00175] Uma modalidade particular da invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo em que a composição é um pó seco adequado para constituição de uma solução aquosa oral.
[00176] Uma modalidade particular da invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo em que a composição é um pó seco compreendendo um sistema tampão adequado para constituição de uma solução aquosa oral a um pH menor que pH 4, particularmente menor que pH 3,8, mais particularmente menor que pH 3,6, ainda mais particularmente pH 3,4.
[00177] Uma modalidade particular da invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo em que a composição é um pó seco compreendendo um sistema tampão citrato, malato, maleato ou tartarato, particularmente em um sistema tampão malato ou tartarato, ainda mais particularmente em um sistema tampão tarta- rato; ou alternativamente somente o ácido correspondente de um sistema tampão como acidulante, particularmente ácido tartárico; adequado para constituição de uma solução aquosa oral.
[00178] Em uma modalidade da invenção, a composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceu- ticamente aceitável do mesmo opcionalmente compreende ainda uma carga extragranular, tal como lactose, amido, amido hidrolisado, mal- todextrina, celulose microcristalina, manitol, sorbitol, sacarose, dextrose, fosfato de cálcio dibásico, sulfato de cálcio, ou combinações dos mesmos.
[00179] Em uma modalidade particular da invenção, a carga ex- tragranular é sorbitol, isomalte, manitol, ou combinações dos mesmos, particularmente manitol, mais particularmente manitol cristalino, ainda mais particularmente manitol cristalino com diâmetro médio de 160 μm (Pearlitol® 160C).
[00180] Na introdução de um diluente, a mistura em pó pode ser granulada por compactação a seco a fim de melhorar a fluidez e ga- rantir uniformidade robusta.
[00181] Em uma modalidade da invenção, a composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceu- ticamente aceitável do mesmo opcionalmente compreende ainda um diluente, tal como lactose, amido, amido hidrolisado, maltodextrina, celulose microcristalina, manitol, isomalte (E 953, (2^)-6-O-a-D- Glucopiranosil-D-arabino-hexitol), sorbitol, sacarose, dextrose, fosfato de cálcio dibásico, sulfato de cálcio, ou combinações dos mesmos.
[00182] Em uma modalidade da invenção, a composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceu- ticamente aceitável do mesmo opcionalmente compreende ainda um diluente, tal como lactose, amido, amido hidrolisado, celulose micro- cristalina, manitol, sorbitol, sacarose, dextrose, fosfato de cálcio dibá- sico, sulfato de cálcio, ou combinações dos mesmos.
[00183] Em uma modalidade particular da invenção, o diluente é manitol, particularmente D-manitol adequado para compressão direta tal como Parteck® M100.
[00184] Em uma modalidade particular da invenção, o diluente é uma mistura de manitol e isomalte, particularmente D-manitol e (2^)-6- O-a-D-Glucopiranosil-D-arabino-hexitol).
[00185] Os inventores da presente invenção verificaram que isomalte como segundo diluente melhorava as propriedades do grânulo.
[00186] A solução oral reconstituída dos compostos de fórmula (I) em um tampão pode oferecer períodos de uso de mais de duas semanas pelo uso de conservantes, estabilizantes e antioxidantes, tais como vitamina A, vitamina C, vitamina E, vitamina E TPGS, retinil palmi- tato, selênio, cisteína, metionina, ácido cítrico, citrato de sódio, metil parabeno, propil parabeno, edetato dissódico, butil hidroxil toluol, ribo- flavina, ácido ascórbico ou combinações dos mesmos.
[00187] A solução oral reconstituída dos compostos de fórmula (I) em um tampão pode oferecer períodos de uso de mais de duas semanas pelo uso de conservantes, estabilizantes e antioxidantes, tais como vitamina E TPGS, edetato dissódico, butil hidroxil toluol, riboflavina, ácido ascórbico, ou combinações dos mesmos.
[00188] Em uma modalidade da invenção, a composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceu- ticamente aceitável do mesmo opcionalmente compreende ainda um conservante, antioxidante e/ou estabilizante, tal como vitamina E TPGS (D-alfa tocoferil polietileno glicol 1000 succinato), etilenodiami- natetra-acetato dissódico (edetato dissódico, Na2 EDTA), butil hidroxil toluol, riboflavina, ácido ascórbico, ou combinações dos mesmos. Foi constatado que um conservante, antioxidante e/ou estabilizante pode ser vantajoso para prazos de validade prolongados em recipientes multidoses ou para melhorar a estabilidade do fármaco em solução durante o período de uso.
[00189] Em uma modalidade particular da invenção, o conservante é ácido sórbico ou benzoato de sódio (E211), particularmente benzoa- to de sódio.
[00190] Para formulações pediátricas a quantidade de conservante incluída deve ser a mais baixa possível. Foi constatado que as compo-sições da invenção com concentrações de conservante tão baixas quanto 1 % em peso produzem soluções estáveis.
[00191] Em uma modalidade particular da invenção, o antioxidante é ácido ascórbico ((5R)-[(1S)-1,2-di-hidroxietil]-3,4-di-hidroxifuran- 2(5H)-ona).
[00192] Em uma modalidade particular da invenção, o estabilizante é etilenodiaminatetra-acetato dissódico (edetato dissódico, Na2 EDTA).
[00193] Em uma modalidade da invenção, a composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceu- ticamente aceitável do mesmo opcionalmente compreende ainda um lubrificante. Foi constatado que um lubrificante pode ser usado como auxiliar de processamento para compactação por rolos. Além disso, um lubrificante pode ser usado para ingredientes solúveis em água tal como PEG para garantir um aspecto aceitável.
[00194] Em uma modalidade particular da invenção, o lubrificante é poli(etileno glicol), particularmente poli(etileno glicol) com peso molecular médio numérico Mn 6.000 (PEG 6000).
[00195] Em uma modalidade da invenção, a composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceu- ticamente aceitável do mesmo opcionalmente compreende ainda um adoçante e/ou flavorizante para melhorar a palatabilidade.
[00196] Em uma modalidade particular da invenção, o flavorizante é sabor morango ou sabor baunilha.
[00197] Em uma modalidade particular da invenção, o adoçante é sucralose (1,6-dicloro-1,6-dideoxi-β-D-fructofuranosil-4-cloro-4-desoxi- a-D-galactopiranosídeo, E955) ou sacarina sódica.
[00198] Em uma modalidade particular da invenção, o composto de fórmula (I) é 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo [1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona.
[00199] Em uma modalidade particular da invenção, a composição farmacêutica compreende: • um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamen- te aceitável do mesmo; e • um sistema tampão selecionado dentre citrato, malato, maleato ou tartarato, particularmente malato ou tartarato, ainda mais particularmente tartarato; ou alternativamente somente o ácido corres-pondente de um sistema tampão como acidulante, particularmente ácido tartárico.
[00200] Em uma modalidade particular da invenção, a composição farmacêutica compreende: • um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamen- te aceitável do mesmo; • um sistema tampão, particularmente um sistema tampão selecionado dentre citrato, malato, maleato ou tartarato, mais particu-larmente malato ou tartarato, ainda mais particularmente tartarato; ou alternativamente somente o ácido correspondente de um sistema tampão como acidulante, particularmente ácido tartárico; e • um diluente, particularmente manitol ou uma mistura de manitol e isomalte, mais particularmente manitol.
[00201] Em uma modalidade particular da invenção, a composição farmacêutica compreende: • um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamen- te aceitável do mesmo; e • um diluente, particularmente manitol ou uma mistura de manitol e isomalte, mais particularmente manitol.
[00202] Em uma modalidade particular da invenção, a composição farmacêutica compreende: • um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamen- te aceitável do mesmo; • um sistema tampão, particularmente um sistema tampão selecionado dentre citrato, malato, maleato ou tartarato, mais particu-larmente malato ou tartarato, ainda mais particularmente tartarato; ou alternativamente somente o ácido correspondente de um sistema tampão como acidulante, particularmente ácido tartárico; • um antioxidante, particularmente ácido ascórbico; e • um estabilizante, particularmente edetato dissódico.
[00203] Em uma modalidade particular da invenção, a composição farmacêutica compreende: • um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamen- te aceitável do mesmo; • um sistema tampão, particularmente um sistema tampão selecionado dentre citrato, malato, maleato ou tartarato, mais particu-larmente malato ou tartarato, ainda mais particularmente tartarato; ou alternativamente somente o ácido correspondente de um sistema tampão como acidulante, particularmente ácido tartárico; • um diluente, particularmente manitol ou uma mistura de manitol e isomalte, mais particularmente manitol; • um antioxidante, particularmente ácido ascórbico; e • um estabilizante, particularmente edetato dissódico.
[00204] Em uma modalidade particular da invenção, a composição farmacêutica compreende: • um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamen- te aceitável do mesmo; • um sistema tampão, particularmente um sistema tampão selecionado dentre citrato, malato, maleato ou tartarato, mais particu-larmente malato ou tartarato, ainda mais particularmente tartarato; ou alternativamente somente o ácido correspondente de um sistema tampão como acidulante, particularmente ácido tartárico; • um diluente, particularmente manitol ou uma mistura de manitol e isomalte, mais particularmente manitol; • um antioxidante, particularmente ácido ascórbico; • um estabilizante, particularmente edetato dissódico; e • um lubrificante, particularmente PEG6000.
[00205] Em uma modalidade particular da invenção, a composição farmacêutica compreende: • um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamen- te aceitável do mesmo; • um sistema tampão, particularmente um sistema tampão selecionado dentre citrato, malato, maleato ou tartarato, mais particu-larmente malato ou tartarato, ainda mais particularmente tartarato; ou alternativamente somente o ácido correspondente de um sistema tampão como acidulante, particularmente ácido tartárico; • um diluente, particularmente manitol ou uma mistura de manitol e isomalte, mais particularmente manitol; • um antioxidante, particularmente ácido ascórbico; • um estabilizante, particularmente edetato dissódico; • um lubrificante, particularmente PEG6000; e • um conservante, particularmente ácido sórbico ou ben- zoato de sódio, ainda mais particularmente benzoato de sódio.
[00206] Em uma modalidade particular da invenção, a composição farmacêutica compreende: • um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamen- te aceitável do mesmo; • um sistema tampão, particularmente um sistema tampão selecionado dentre citrato, malato, maleato ou tartarato, mais particu-larmente malato ou tartarato, ainda mais particularmente tartarato; ou alternativamente somente o ácido correspondente de um sistema tampão como acidulante, particularmente ácido tartárico; • um diluente, particularmente manitol ou uma mistura de manitol e isomalte, mais particularmente manitol; • um antioxidante, particularmente ácido ascórbico; • um estabilizante, particularmente edetato dissódico; • um lubrificante, particularmente PEG6000; • um conservante, particularmente ácido sórbico ou ben- zoato de sódio, ainda mais particularmente benzoato de sódio, • opcionalmente um adoçante, particularmente sucralose ou sacarina sódica, ainda mais particularmente sucralose; e • opcionalmente um flavorizante, particularmente sabor morango ou sabor baunilha.
[00207] Em uma modalidade particular da invenção, a composição farmacêutica compreende: • 1 a 10 % em peso de um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; • 5 a 15 % em peso de um sistema tampão, particular mente um sistema tampão selecionado dentre citrato, malato, maleato ou tartarato, mais particularmente malato ou tartarato, ainda mais par-ticularmente tartarato; ou alternativamente somente o ácido corres-pondente de um sistema tampão como acidulante, particularmente ácido tartárico; • 40 a 70 % em peso de um diluente, particularmente ma- nitol ou uma mistura de manitol e isomalte, mais particularmente mani- tol; • 1 a 4 % em peso de um antioxidante, particularmente ácido ascórbico; • 0,5 a 2 % em peso de um estabilizante, particularmente edetato dissódico; • 0,5 a 2 % em peso de um lubrificante, particularmente PEG6000; • 1 a 8 % em peso de um conservante, particularmente ácido sórbico ou benzoato de sódio, ainda mais particularmente ben- zoato de sódio, • 0 a 3 % em peso de um adoçante, particularmente su cralose ou sacarina sódica, ainda mais particularmente sucralose; e • 0 a 20 % em peso de um flavorizante, particularmente sabor morango ou sabor baunilha; onde a quantidade total de ingredientes não ultrapassa 100 % em peso.
[00208] Em uma modalidade particular da invenção, a composição farmacêutica compreende: • 2 a 6 % em peso de 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2- (2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma; • 9 a 13 % em peso de um sistema tampão tartarato; • 45 a 55 % em peso de um manitol como primeiro diluen- te e 8 a 10 % em peso de isomalte como segundo diluente ; • 1 a 3 % em peso de ácido ascórbico como antioxidante; • 0,5 a 2 % em peso de edetato dissódico como estabili- zante; • 0,5 a 2 % em peso de PEG6000 como lubrificante; • 1 a 7 % em peso de benzoato de sódio como conservan te, • 1,5 a 2 % em peso de sucralose como adoçante; e • 13 a 17 % em peso de sabor morango; onde a quantidade total de ingredientes não ultrapassa 100 % em peso.
[00209] Uma outra modalidade da invenção refere-se a um kit para a preparação de composições farmacêuticas compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, onde o kit compreende: • uma blenda em pó compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e • água como solvente para constituição.
[00210] Uma outra modalidade da invenção refere-se a um kit para a preparação de composições farmacêuticas compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, onde o kit compreende: • um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamen- te aceitável do mesmo, • uma blenda em pó como veículo para constituição, e • opcionalmente água como solvente para constituição.
[00211] Uma outra modalidade refere-se a uma blenda em pó como veículo adequado para constituição de um composto de fórmula (I) como descrito neste pedido ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma, compreendendo: • um sistema tampão, particularmente um sistema tampão selecionado dentre citrato, malato, maleato ou tartarato, mais particu-larmente malato ou tartarato, ainda mais particularmente tartarato; ou alternativamente somente o ácido correspondente de um sistema tampão como acidulante, particularmente ácido tartárico; e • um diluente, particularmente manitol ou uma mistura de manitol e isomalte, mais particularmente manitol.
[00212] Uma outra modalidade refere-se a uma blenda em pó como veículo adequado para constituição de um composto de fórmula (I) como descrito neste pedido ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma, compreendendo: • um sistema tampão, particularmente um sistema tampão selecionado dentre citrato, malato, maleato ou tartarato, mais particu-larmente malato ou tartarato, ainda mais particularmente tartarato; ou alternativamente somente o ácido correspondente de um sistema tampão como acidulante, particularmente ácido tartárico; • um diluente, particularmente manitol ou uma mistura de manitol e isomalte, mais particularmente manitol; • um antioxidante, particularmente ácido ascórbico; • um estabilizante, particularmente edetato dissódico; • um lubrificante, particularmente PEG6000; e • um conservante, particularmente ácido sórbico ou ben- zoato de sódio, ainda mais particularmente benzoato de sódio.
[00213] Uma outra modalidade refere-se a uma blenda em pó como veículo adequado para constituição de um composto de fórmula (I) como descrito neste pedido ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma, compreendendo: • um sistema tampão, particularmente um sistema tampão selecionado dentre citrato, malato, maleato ou tartarato, mais particu-larmente malato ou tartarato, ainda mais particularmente tartarato; ou alternativamente somente o ácido correspondente de um sistema tampão como acidulante, particularmente ácido tartárico; • um diluente, particularmente manitol ou uma mistura de manitol e isomalte, mais particularmente manitol; • um antioxidante, particularmente ácido ascórbico; • um estabilizante, particularmente edetato dissódico; • um lubrificante, particularmente PEG6000; • um conservante, particularmente ácido sórbico ou ben- zoato de sódio, ainda mais particularmente benzoato de sódio, • opcionalmente um adoçante, particularmente sucralose ou sacarina sódica, ainda mais particularmente sucralose; e • opcionalmente um flavorizante, particularmente sabor morango ou sabor baunilha.
[00214] Uma outra modalidade refere-se a uma blenda em pó como veículo adequado para constituição de um composto de fórmula (I) como descrito neste pedido ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma, compreendendo: • 4 a 15 % em peso de um sistema tampão, particular mente um sistema tampão selecionado dentre citrato, malato, maleato ou tartarato, mais particularmente malato ou tartarato, ainda mais par-ticularmente tartarato; ou alternativamente somente o ácido corres-pondente de um sistema tampão como acidulante, particularmente ácido tartárico; • 40 a 70 % em peso de um diluente, particularmente ma- nitol ou uma mistura de manitol e isomalte, mais particularmente mani- tol; • 1 a 4 % em peso de um antioxidante, particularmente ácido ascórbico; • 0,2 a 2 % em peso de um estabilizante, particularmente edetato dissódico; • 0,5 a 2 % em peso de um lubrificante, particularmente PEG6000; • 1 a 8 % em peso de um conservante, particularmente ácido sórbico ou benzoato de sódio, ainda mais particularmente ben- zoato de sódio, • 0 a 3 % em peso de um adoçante, particularmente su cralose ou sacarina sódica, ainda mais particularmente sucralose; e • 0 a 20 % em peso de um flavorizante, particularmente sabor morango ou sabor baunilha; onde a quantidade total de ingredientes não ultrapassa 100 % em peso.
[00215] Uma outra modalidade refere-se a uma blenda em pó como veículo adequado para constituição de um composto de fórmula (I) como descrito neste pedido ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma, compreendendo: • 9 a 13 % em peso de um sistema tampão tartarato ou ácido tartárico; • 45 a 55 % em peso de um manitol como primeiro diluen- te e 8 a 10 % em peso de isomalte como segundo diluente; • 1 a 3 % em peso de ácido ascórbico como antioxidante; • 0,3 a 0,9 % em peso de edetato dissódico como estabili- zante; • 0,5 a 2 % em peso de PEG6000 como lubrificante; • 3 a 7 % em peso de benzoato de sódio como conservan te, • 0,8 a 2,0 % em peso de sucralose como adoçante; e • 7,5 a 19 % em peso de sabor morango; onde a quantidade total de ingredientes não ultrapassa 100 % em peso.
[00216] Uma modalidade particular da invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como descrito neste pedido e ainda olesoxima.
[00217] Em uma modalidade particular da invenção a olesoxima tem uma distribuição de tamanho de partícula com valor d90 menor que 200 μm, particularmente com valor d90 menor que 100 μm, mais particularmente com valor d90 de 50-100 μm.
[00218] O termo "valor d90" denota o diâmetro no qual 90% em peso das partículas do conjunto têm um diâmetro esférico equivalente menor que o valor.
[00219] Uma modalidade particular da invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como descrito neste pedido, olesoxima e um óleo selecionado dentre óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de soja, óleo de algodão, óleo de rícino, óleo de amendoim, óleo de colza, óleo de milho, óleo de amêndoa, óleo de girassol, e combinações dos mesmos.
[00220] Uma modalidade particular da invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como descrito neste pedido; olesoxima; um óleo selecionado dentre óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de soja, óleo de algodão, óleo de rícino, óleo de amendoim, óleo de colza, óleo de milho, óleo de amêndoa, óleo de girassol, e combinações dos mesmos; um emulsificante e/ou agentes solubili- zantes lipofílicos selecionados dentre gliceril mono-oleato (Peceol ™, Inwitor 948 ™, Capmul GMO™), gliceril mono-linoleato (Maisine 35- 1™), mono-oleato de sorbitano (Span 80™), ácido oleico, e combinações dos mesmos; e opcionalmente um tensoativo polar, particularmente um tensoativo com um valor de HLB inferior a 7, mais particularmente polissorbato 80 (Tween 80™), caprilocaproil polioxil glicerí- deos (Labrasol™), e combinações dos mesmos.
[00221] Em uma modalidade particular da invenção, a composição farmacêutica compreende: • um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamen- te aceitável do mesmo; • um sistema tampão selecionado dentre citrato, malato, maleato ou tartarato, particularmente malato ou tartarato, ainda mais particularmente tartarato; ou alternativamente somente o ácido corres-pondente de um sistema tampão como acidulante, particularmente ácido tartárico; • olesoxima; • um óleo, particularmente óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de soja, óleo de algodão, óleo de rícino, óleo de amendoim, óleo de colza, óleo de milho, óleo de amêndoa, óleo de girassol, ou combinações dos mesmos, ainda mais particularmente óleo de gergelim; • um emulsificante e/ou agentes solubilizantes lipofílicos, particularmente gliceril mono-oleato (Peceol ™, Inwitor 948 ™, Capmul GMO™), gliceril mono-linoleato (Maisine 35-1™), mono-oleato de sor- bitano (Span 80™), ácido oleico, ou combinações dos mesmos; e • opcionalmente um tensoativo polar, particularmente um tensoativo com um valor de HLB inferior a 7, mais particularmente po- lissorbato 80 (Tween 80™), caprilocaproil polioxil glicerídeos (Labra- sol™), ou combinações dos mesmos.
[00222] Em uma modalidade particular da invenção, a composição farmacêutica compreende: • um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamen- te aceitável do mesmo; • um sistema tampão, particularmente um sistema tampão selecionado dentre citrato, malato, maleato ou tartarato, mais particu-larmente malato ou tartarato, ainda mais particularmente tartarato; ou alternativamente somente o ácido correspondente de um sistema tampão como acidulante, particularmente ácido tartárico; • um diluente, particularmente manitol ou uma mistura de manitol e isomalte, mais particularmente manitol; • olesoxima; • um óleo, particularmente óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de soja, óleo de algodão, óleo de rícino, óleo de amendoim, óleo de colza, óleo de milho, óleo de amêndoa, óleo de girassol, ou combinações dos mesmos, ainda mais particularmente óleo de gergelim; • um emulsificante e/ou agentes solubilizantes lipofílicos, particularmente gliceril mono-oleato (Peceol ™, Inwitor 948 ™, Capmul GMO™), gliceril mono-linoleato (Maisine 35-1™), mono-oleato de sor- bitano (Span 80™), ácido oleico, ou combinações dos mesmos; e • opcionalmente um tensoativo polar, particularmente um tensoativo com um valor de HLB inferior a 7, mais particularmente po- lissorbato 80 (Tween 80™), caprilocaproil polioxil glicerídeos (Labra- sol™), ou combinações dos mesmos.
[00223] Em uma modalidade particular da invenção, a composição farmacêutica compreende: • um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamen- te aceitável do mesmo; • um diluente, particularmente manitol ou uma mistura de manitol e isomalte, mais particularmente manitol; • olesoxima; • um óleo, particularmente óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de soja, óleo de algodão, óleo de rícino, óleo de amendoim, óleo de colza, óleo de milho, óleo de amêndoa, óleo de girassol, ou combi-nações dos mesmos, ainda mais particularmente óleo de gergelim; • um emulsificante e/ou agentes solubilizantes lipofílicos, particularmente gliceril mono-oleato (Peceol ™, Inwitor 948 ™, Capmul GMO™), gliceril mono-linoleato (Maisine 35-1™), mono-oleato de sor- bitano (Span 80™), ácido oleico, ou combinações dos mesmos; e • opcionalmente um tensoativo polar, particularmente um tensoativo com um valor de HLB inferior a 7, mais particularmente po- lissorbato 80 (Tween 80™), caprilocaproil polioxil glicerídeos (Labra- sol™), ou combinações dos mesmos.
[00224] Em uma modalidade particular da invenção, a composição farmacêutica compreende: • um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamen- te aceitável do mesmo; • um sistema tampão, particularmente um sistema tampão selecionado dentre citrato, malato, maleato ou tartarato, mais particu-larmente malato ou tartarato, ainda mais particularmente tartarato; ou alternativamente somente o ácido correspondente de um sistema tampão como acidulante, particularmente ácido tartárico; • um antioxidante, particularmente ácido ascórbico; • um estabilizante, particularmente edetato dissódico; • olesoxima, • um óleo, particularmente óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de soja, óleo de algodão, óleo de rícino, óleo de amendoim, óleo de colza, óleo de milho, óleo de amêndoa, óleo de girassol, ou combinações dos mesmos, ainda mais particularmente óleo de gergelim; • um emulsificante e/ou agentes solubilizantes lipofílicos, particularmente gliceril mono-oleato (Peceol ™, Inwitor 948 ™, Capmul GMO™), gliceril mono-linoleato (Maisine 35-1™), mono-oleato de sor- bitano (Span 80™), ácido oleico, ou combinações dos mesmos; e • opcionalmente um tensoativo polar, particularmente um tensoativo com um valor de HLB inferior a 7, mais particularmente po- lissorbato 80 (Tween 80™), caprilocaproil polioxil glicerídeos (Labra- sol™), ou combinações dos mesmos.
[00225] Em uma modalidade particular da invenção, a composição farmacêutica compreende: • um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamen- te aceitável do mesmo; • um sistema tampão, particularmente um sistema tampão selecionado dentre citrato, malato, maleato ou tartarato, mais particu-larmente malato ou tartarato, ainda mais particularmente tartarato; ou alternativamente somente o ácido correspondente de um sistema tampão como acidulante, particularmente ácido tartárico; • um diluente, particularmente manitol ou uma mistura de manitol e isomalte, mais particularmente manitol; • um antioxidante, particularmente ácido ascórbico; • um estabilizante, particularmente edetato dissódico; • olesoxima; • um óleo, particularmente óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de soja, óleo de algodão, óleo de rícino, óleo de amendoim, óleo de colza, óleo de milho, óleo de amêndoa, óleo de girassol, ou combinações dos mesmos, ainda mais particularmente óleo de gergelim; • um emulsificante e/ou agentes solubilizantes lipofílicos, particularmente gliceril mono-oleato (Peceol ™, Inwitor 948 ™, Capmul GMO™), gliceril mono-linoleato (Maisine 35-1™), mono-oleato de sor- bitano (Span 80™), ácido oleico, ou combinações dos mesmos; e • opcionalmente um tensoativo polar, particularmente um tensoativo com um valor de HLB inferior a 7, mais particularmente po- lissorbato 80 (Tween 80™), caprilocaproil polioxil glicerídeos (Labra- sol™), ou combinações dos mesmos.
[00226] Em uma modalidade particular da invenção, a composição farmacêutica compreende: • um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamen- te aceitável do mesmo; • um sistema tampão, particularmente um sistema tampão selecionado dentre citrato, malato, maleato ou tartarato, mais particu-larmente malato ou tartarato, ainda mais particularmente tartarato; ou alternativamente somente o ácido correspondente de um sistema tampão como acidulante, particularmente ácido tartárico; • um diluente, particularmente manitol ou uma mistura de manitol e isomalte, mais particularmente manitol; • um antioxidante, particularmente ácido ascórbico; • um estabilizante, particularmente edetato dissódico; • um lubrificante, particularmente PEG6000; • olesoxima; • um óleo, particularmente óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de soja, óleo de algodão, óleo de rícino, óleo de amendoim, óleo de colza, óleo de milho, óleo de amêndoa, óleo de girassol, ou combinações dos mesmos, ainda mais particularmente óleo de gergelim; • um emulsificante e/ou agentes solubilizantes lipofílicos, particularmente gliceril mono-oleato (Peceol ™, Inwitor 948 ™, Capmul GMO™), gliceril mono-linoleato (Maisine 35-1™), mono-oleato de sor- bitano (Span 80™), ácido oleico, ou combinações dos mesmos; e • opcionalmente um tensoativo polar, particularmente um tensoativo com um valor de HLB inferior a 7, mais particularmente po- lissorbato 80 (Tween 80™), caprilocaproil polioxil glicerídeos (Labra- sol™), ou combinações dos mesmos.
[00227] Em uma modalidade particular da invenção, a composição farmacêutica compreende: • um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; • um sistema tampão, particularmente um sistema tampão selecionado dentre citrato, malato, maleato ou tartarato, mais particu-larmente malato ou tartarato, ainda mais particularmente tartarato; ou alternativamente somente o ácido correspondente de um sistema tampão como acidulante, particularmente ácido tartárico; • um diluente, particularmente manitol ou uma mistura de manitol e isomalte, mais particularmente manitol; • um antioxidante, particularmente ácido ascórbico; • um estabilizante, particularmente edetato dissódico; • um lubrificante, particularmente PEG6000; • um conservante, particularmente ácido sórbico ou benzo- ato de sódio, ainda mais particularmente benzoato de sódio; • olesoxima; • um óleo, particularmente óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de soja, óleo de algodão, óleo de rícino, óleo de amendoim, óleo de colza, óleo de milho, óleo de amêndoa, óleo de girassol, ou combinações dos mesmos, ainda mais particularmente óleo de gergelim; • um emulsificante e/ou agentes solubilizantes lipofílicos, particularmente gliceril mono-oleato (Peceol ™, Inwitor 948 ™, Capmul GMO™), gliceril mono-linoleato (Maisine 35-1™), mono-oleato de sor- bitano (Span 80™), ácido oleico, ou combinações dos mesmos; e • opcionalmente um tensoativo polar, particularmente um tensoativo com um valor de HLB inferior a 7, mais particularmente po- lissorbato 80 (Tween 80™), caprilocaproil polioxil glicerídeos (Labra- sol™), ou combinações dos mesmos.
[00228] Em uma modalidade particular da invenção, a composição farmacêutica compreende: • um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamen- te aceitável do mesmo; • um sistema tampão, particularmente um sistema tampão selecionado dentre citrato, malato, maleato ou tartarato, mais particu-larmente malato ou tartarato, ainda mais particularmente tartarato; ou alternativamente somente o ácido correspondente de um sistema tampão como acidulante, particularmente ácido tartárico; • um diluente, particularmente manitol ou uma mistura de manitol e isomalte, mais particularmente manitol; • um antioxidante, particularmente ácido ascórbico; • um estabilizante, particularmente edetato dissódico; • um lubrificante, particularmente PEG6000; • um conservante, particularmente ácido sórbico ou ben- zoato de sódio, ainda mais particularmente benzoato de sódio; • opcionalmente um adoçante, particularmente sucralose ou sacarina sódica, ainda mais particularmente sucralose; • opcionalmente um flavorizante, particularmente sabor morango ou sabor baunilha; • olesoxima; • um óleo, particularmente óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de soja, óleo de algodão, óleo de rícino, óleo de amendoim, óleo de colza, óleo de milho, óleo de amêndoa, óleo de girassol, ou combinações dos mesmos, ainda mais particularmente óleo de gergelim; • um emulsificante e/ou agentes solubilizantes lipofílicos, particularmente gliceril mono-oleato (Peceol ™, Inwitor 948 ™, Capmul GMO™), gliceril mono-linoleato (Maisine 35-1™), mono-oleato de sor- bitano (Span 80™), ácido oleico, ou combinações dos mesmos; e • opcionalmente um tensoativo polar, particularmente um tensoativo com um valor de HLB inferior a 7, mais particularmente po- lissorbato 80 (Tween 80™), caprilocaproil polioxil glicerídeos (Labra- sol™), ou combinações dos mesmos.
[00229] Uma outra modalidade da invenção refere-se a um kit para a preparação de composições farmacêuticas compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e olexosima, onde o kit compreende: • uma blenda em pó compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; • água como solvente para constituição; • olesoxima; • um óleo, particularmente óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de soja, óleo de algodão, óleo de rícino, óleo de amendoim, óleo de colza, óleo de milho, óleo de amêndoa, óleo de girassol, ou combinações dos mesmos, ainda mais particularmente óleo de gergelim; • um emulsificante e/ou agentes solubilizantes lipofílicos, particularmente gliceril mono-oleato (Peceol ™, Inwitor 948 ™, Capmul GMO™), gliceril mono-linoleato (Maisine 35-1™), mono-oleato de sor- bitano (Span 80™), ácido oleico, ou combinações dos mesmos; e • opcionalmente um tensoativo polar, particularmente um tensoativo com um valor de HLB inferior a 7, mais particularmente po- lissorbato 80 (Tween 80™), caprilocaproil polioxil glicerídeos (Labra- sol™), ou combinações dos mesmos.
[00230] Uma outra modalidade da invenção refere-se a um kit para a preparação de composições farmacêuticas compreendendo um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e olesoxima, onde o kit compreende: • um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamen- te aceitável do mesmo; • uma blenda em pó como veículo para constituição; • opcionalmente água como solvente para constituição; • olesoxima; • um óleo, particularmente óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de soja, óleo de algodão, óleo de rícino, óleo de amendoim, óleo de colza, óleo de milho, óleo de amêndoa, óleo de girassol, ou combi-nações dos mesmos, ainda mais particularmente óleo de gergelim; • um emulsificante e/ou agentes solubilizantes lipofílicos, particularmente gliceril mono-oleato (Peceol ™, Inwitor 948 ™, Capmul GMO™), gliceril mono-linoleato (Maisine 35-1™), mono-oleato de sor- bitano (Span 80™), ácido oleico, ou combinações dos mesmos; e • opcionalmente um tensoativo polar, particularmente um tensoativo com um valor de HLB inferior a 7, mais particularmente po- lissorbato 80 (Tween 80™), caprilocaproil polioxil glicerídeos (Labra- sol™), ou combinações dos mesmos.
Figuras Figura 1. 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2- b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Exemplo 20) aumenta o mRNA de SMN e a produção de proteína in vitro.
[00231] (A) Emenda de SMN2 em fibroblastos de SMA Tipo 1. (B) Proteína SMN em fibroblastos de SMA Tipo 1. (C) Proteína SMN em neurônios motores de SMA Tipo 1. (D) SMN1 e emenda de SMN2 em sangue total derivado de HV. Fibroblastos de pacientes com SMA Tipo 1 foram cultivados por 24 horas (A) ou 48 horas (B); neurônios motores de iPSCs de pacientes com SMA Tipo 1 (células-tronco pluripoten- tes induzidas) foram cultivados por 72 horas (C) e células de sangue total de voluntários saudáveis (HV) por 4 horas (D) na presença do composto do Exemplo 20. A emenda de SMN foi avaliada por RT- PCR, e os níveis de proteína SMN foram avaliados por fluorescência homogênea resolvida no tempo (HTRF) em lisados de fibroblastos, e por imunocoloração para SMN em neurônios motores. Os dados representam a média ± desvio padrão (SEM) de 3 avaliações por ponto de dados e estão expressos como alteração proporcional vs. controles não tratados.
Figura 2. 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2- b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Exemplo 20) induz a ex-pressão da proteína SMN in vivo.
[00232] (A) Proteína SMN em cérebros de camundongos com alelo C/C. (B) Proteína SMN em cérebros de camundongos SMN Δ7. (C) Proteína SMN no músculo quadríceps de camundongos com alelo C/C. (D) Proteína SMN no músculo quadríceps de camundongos SMNΔ7. Camundongos com alelo C/C e camundongos SMNΔ7 foram tratados com o composto do Exemplo 20. Uma hora depois da última dose, os cérebros e os músculos quadríceps foram coletados e os níveis de proteína SMN foram avaliados por HTRF. Os dados representam a média ± SEM de 5-6 animais por grupo e estão expressos como alteração proporcional vs. controles tratados com veículo. * = p<0,05, ** = p<0,01, *** = p<0,001 vs. controles não tratados.
Figura 3. Efeitos in vivo do tratamento de camundongos SMNΔ7 com 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin- 6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Exemplo 20).
[00233] Camundongos SMNΔ7 foram tratados com o composto do Exemplo 20 de P3 em diante e a sobrevivência (A) e o peso corporal (B) dos animais foram avaliados até P100. Os dados representam a média ± SEM de 10 - 12 camundongos por grupo. HET = ninhada he- terozigótica.
Figura 4. Proteção dos Circuitos Motores e Atrofia Muscular por 7-(4,7- diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Exemplo 20) em camundongos SMNΔ7 in vivo.
[00234] Camundongos SMNΔ7 foram tratados com o composto do Exemplo 20 de P3 a P14, e a conectividade neuromuscular e a atrofia muscular foram avaliadas por imuno-histoquímica. (A) Entradas pro- prioceptivas vGlut1-positivas em L3-5 do cordão espinhal. (B) Axônios motores ventrais em L3-5 do cordão espinhal. (C) Inervação NMJ no múculo longuíssimo. (D) Área transversal do músculo EDL. Os dados representam a média ± SEM de 4 - 5 camundongos por grupo. * = p<0,05; ** = p<0,01; *** = p<0,001 vs. camundongos SMNΔ7 tratados com veículo.
Figura 5. Emenda Alternativa de FoxMI in vitro
[00235] Fibroblastos de pacientes com SMA Tipo I foram tratados com o composto do Exemplo 20 por 24 horas, e mRNAs de comprimento integral (FL) de FoxM1 e sem o exon 9 (Δ9) foram analisados por RT-qPCR. Os dados representam a média ± SEM de 6 repetições e estão expressos como alteração proporcional vs. controles não tratados.
Figura 6. Emulsões de óleo em água
[00236] Fotografias da composição 4A antes (A) e imediatamente depois da adição de 20% (B) ou 30% (C) de solução tampão tartarato (composição 5A) e resultando assim em emulsões de óleo em água.
Figura 7. Estabilidade das emulsões de óleo em água
[00237] Fotografias das emulsões de óleo em água compreendendo 70% da composição 4A e 30% da composição 5A 15 minutos depois da constituição (A) (agitada 10 vezes) e 30 minutos depois da constituição (B) (agitada 10 vezes).
Figura 8. Emulsões de óleo em água
[00238] Fotografias da composição 4F antes (A) e imediatamente depois da adição de 20% (B à esquerda), 25% (B no centro) ou 30% (B à direita) de solução tampão tartarato (composição 5A) e resultando assim em emulsões de óleo em água.
Figura 9. Estabilidade das emulsões de óleo em água
[00239] Fotografias das emulsões de óleo em água compreendendo 70% da composição 4F e 30% da composição 5A 15 minutos depois da constituição (A) (agitada 10 vezes) e 30 minutos depois da constituição (B) (agitada 10 vezes).
Exemplos
[00240] A invenção será mais completamente entendida com referência aos exemplos que se seguem. No entanto, eles não devem ser interpretados como limitativos do escopo da invenção.
Abreviações usadas
[00241] ACN: Acetonitrila; CH2Cl2: diclorometano (DCM); DIPEA: di- isopropil etilamina; DMA: dimetil acetamida; TEA: trietilamina; RT: temperatura ambiente; B2(pin)2: bis(pinacolato)diboro; Pd(dppf)Cl2: di- cloreto de (1,1'-Bis(difenilfosfino)ferroceno)paládio(II); PPTS: p- toluenossulfonato de piridínio. Intermediário 1 7-fluoro-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4- ona a) 2-cloro-7-fluoro-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00242] Uma mistura de 2-amino-5-fluoropiridina (11,20 g, 0,10 mol) e dimetil malonato (57,0 mL, 0,50 mol) foi aquecida a 230 °C por 1,5 hora. Depois de esfriar para a temperatura ambiente, o precipitado foi filtrado e lavado com ACN (3x) para dar 7-fluoro-2-hidroxi-4H- pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona como um sólido escuro (14 g), que foi usado diretamente na etapa seguinte. MS m/z 181,3 [M+H]+.
[00243] Uma mistura escura de 7-fluoro-2-hidroxi-4H-pirido[1,2- a]pirimidin-4-ona bruta (14g, ~77 mmol) em POCl3 (50 mL) e DIPEA (13,3 mL, 77 mmol) foi aquecida a 110 °C por 15 horas. O solvente foi removido e o resíduo escuro foi tratado com água gelada, lavado com água (3x) e secado para dar um sólido castanho. O sólido castanho foi cromatografado (5% MeOH em CH2Cl2) para dar 2-cloro-7-fluoro-4H- pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona como um sólido amarelo (9,84 g, 50%, 2 etapas), MS m/z 199,2 [M+H]+. b) 2-metil-6-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)imidazo[1,2-b] piridazina
[00244] Uma mistura de 6-cloro-2-metilimidazo[1,2-b]piridazina (900 mg, 5,37 mmol), 4,4,4',4',5,5,5',5'-octametil-2,2'-bi(1,3,2-dioxaborolano) (1,36 g, 5,37 mmol, 1,0 eq.), KOAc (1,05 g, 10,7 mmol) e Pd(dppf) Cl2^CH2Cl2 (393 mg, 0,54 mmol) em dioxano ( 50 mL) foi desgaseifica- da e aquecida em uma atmosfera de N2 a 95 °C. Depois de 15 horas, a mistura foi diluída com EtOAc, filtrada através de celite e concentrada a vácuo para dar 2-metil-6-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2- il)imidazo[1,2-b]piridazina que foi usada diretamente na etapa seguinte. c) 7-fluoro-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4- ona
[00245] A uma solução de 2-cloro-7-fluoro-4H-pirido[1,2-a]pirimidin- 4-ona (750 mg, 3,78 mmol) em ACN (36 mL) foram adicionados 2- metil-6-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)imidazo[1,2- b]piridazina (1,17 g, 4,53 mmol, Eq: 1,2), Pd(Ph3P)4 (218 mg, 0,189 mmol, 0,05 eq.) e uma solução aquosa de K2CO3 (3,78 mL, 7,55 mmol, 2,0 eq.). A mistura foi desgaseificada e aquecida em uma atmosfera de argônio a 105 °C por uma noite. A reação foi resfriada para a temperatura ambiente, e filtrada. O precipitado foi lavado com Et2O e em seguida água, secado a vácuo para dar 250 mg (22%) de 7-fluoro-2- (2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona como um sólido castanho claro. MS m/z 296,1 [M+H]+. Intermediário 2 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-fluoro-pirido[1,2-a]pirimidin- 4-ona a) 2,8-dimetil-6-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)imidazo[1,2- b]piridazina
[00246] Em balão vedado, 3,6-dicloro-4-metilpiridazina (27 g, 161 mmol) foi suspendida em amônia aquosa (25%, 300 mL). A mistura reacional foi aquecida a 110 °C por 48 horas (transformou-se em solução depois de 1 hora). Depois de esfriar para a temperatura ambiente, a reação foi despejada em CH2Cl2, e a fase orgânica foi separada, secada sobre Na2SO4, e concentrada a vácuo, para dar 22,4 g de 6- cloro-4-metil-piridazin-3-amina e 6-cloro-5-metil-piridazin-3-amina como uma mistura de regioisômeros que foram usados diretamente na etapa seguinte.
[00247] A mistura de regioisômeros 6-cloro-4-metil-piridazin-3- amina e 6-cloro-5-metil-piridazin-3-amina (22,4 g) foi suspendida em 2- propanol (300 mL). 1-bromo-2,2-dimetoxipropano (36,0 g, 26,6 mL, 193 mmol, 1,2 eq.) e PPTS (2,96 g, 11,6 mmol, 0,0725 eq.) foram adicionados, e a solução resultante foi aquecida a 105°C por uma noite. O solvente foi removido a vácuo e o resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com NaHCO3. As fases orgânicas foram secadas sobre Na2SO4, concentradas a vácuo e o sólido castanho claro bruto foi cro- matografado (EtOAc / Heptane 1/2 -1/1) para dar separadamente 6,1 g de 6-cloro-2,8-dimetil-imidazo[1,2-b]piridazina MS m/z 182,1 [M+H]+ (21%) como um sólido branco e 5,9 g de 6-cloro-2,7-dimetil- imidazo[1,2-b]piridazina MS m/z 182,1 [M+H]+ (20%) como um sólido branco.
[00248] Uma mistura de 6-cloro-2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazina (0,9 g, 4,96 mmol), 4,4,4',4',5,5,5',5'-octametil-2,2'-bi(1,3,2-dioxaboro- lano) (1,26 g, 4,96 mmol, 1,0 eq.), KOAc (0,97 g, 9,91 mmol) e Pd(dppf)Ch^CH2Ch (363 mg, 0,49 mmol) em dioxano ( 50 mL) foi des- gaseificada e aquecida em uma atmosfera de N2 a 110 °C. Depois de 15 horas, a mistura foi diluída com EtOAc, filtrada através de celite e concentrada a vácuo para dar 2,8-dimetil-6-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2- dioxaborolan-2-il)imidazo[1,2-b]piridazina que foi usada diretamente na etapa seguinte. b) 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-fluoro-pirido[1,2-a]pirimi- din-4-ona
[00249] A uma solução de 2-cloro-7-fluoro-4H-pirido[1,2-a]pirimidin- 4-ona (750 mg, 3,78 mmol, descrita acima) em ACN (36 mL) foram adicionados 2,8-dimetil-6-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il) imidazo[1,2-b]piridazina (1,24 g, 4,53 mmol, 1,2 eq.), Pd(Ph3P)4 (218 mg, 0,189 mmol, 0,05 eq.) e uma solução aquosa de K2CO3 (3,78 mL, 7,55 mmol, 2,0 eq.). A mistura foi desgaseificada e aquecida em uma atmosfera de argônio a 100 °C por 6 horas. A reação foi resfriada para a temperatura ambiente, e filtrada. O precipitado foi lavado com Et2O e em seguida água, secado a vácuo para dar 700 mg (60%) de 2-(2,8- dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-fluoro-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona como um sólido castanho claro. MS m/z 310,1 [M+H]+. Intermediário 3 7-fluoro-9-metil-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimi- din-4-ona a) 2-cloro-7-fluoro-9-metil-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00250] Uma mistura de 5-fluoro-3-metilpiridin-2-amina (3,3 g, 26,2 mmol) e dimetil malonato (15,0 mL, 0,13 mol, 5,0 eq.) foi aquecida a 210 °C por 1,5 hora. Depois de esfriar para a temperatura ambiente, o precipitado foi filtrado e lavado com ACN (3x) para dar 7-fluoro-2- hidroxi-9-metil-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona como um sólido escuro (2,3 g), que foi usado diretamente na etapa seguinte. MS m/z 195,1 [M+H]+.
[00251] Uma mistura de 7-fluoro-2-hidroxi-9-metil-pirido[1,2-a]pirimi- din-4-ona bruta (2,3 g, 11,8 mmol) em POCl3 (7,7 mL, 82,9 mmol) e DIEA (2,07 mL, 11,8 mmol) foi aquecida a 110 °C por 15 horas. O solvente foi removido e o resíduo foi tratado com água gelada, lavado com água (3x) e secado para dar um sólido castanho. O sólido castanho bruto foi cromatografado (5% MeOH in CH2Cl2) para dar 2-cloro-7- fluoro-9-metil-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona como um sólido amarelo (1,77 g, 70% em 2 etapas), MS m/z 213,1 [M+H]+. b) 7-fluoro-9-metil-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]piri- midin-4-ona
[00252] A uma solução de 2-cloro-7-fluoro-9-metil-4H-pirido[1,2- a]pirimidin-4-ona (2,2 g, 10,3 mmol) em ACN (80 mL) foram adicionados 2-metil-6-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)imidazo[1,2- b]piridazina (3,22 g, 12,4 mmol, 1,2 eq., descrita acima), Pd(Ph3P)4 (1,20 g, 1,03 mmol, 0,1 eq.) e uma solução aquosa de K2CO3 (10,3 mL, 20,7 mmol, 2,0 eq.). A mistura foi desgaseificada e aquecida em uma atmosfera de argônio a 100 °C por 6 horas. A reação foi resfriada para a temperatura ambiente, e filtrada. O precipitado foi lavado com Et2O e em seguida água, secado a vácuo para dar 1,80 g (56%) de 7- fluoro-9-metil-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2- a]pirimidin-4-ona como um sólido castanho claro. MS m/z 310,1 [M+H]+. Intermediário 4 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-fluoro-9-metil-pirido[1,2- a]pirimidin-4-ona
[00253] A uma solução de 2-cloro-7-fluoro-9-metil-4H-pirido[1,2- a]pirimidin-4-ona (0,98 g, 4,61 mmol, descrita acima) em ACN (50 mL) foram adicionados 2,8-dimetil-6-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan- 2-il)imidazo[1,2-b]piridazina (1,51 g, 5,53 mmol, 1,2 eq., descrita acima), Pd(Ph3P)4 (0,32 g, 0,277 mmol, 0,06 eq.) e uma solução aquosa de K2CO3 (4,61 mL, 9,22 mmol, 2,0 eq.). A mistura foi desgaseificada e aquecida em uma atmosfera de argônio a 100 °C por 6 horas. A reação foi resfriada para a temperatura ambiente, e filtrada. O precipitado foi lavado com Et2O e água, e em seguida secado a vácuo para dar 0,89 g (60%) de 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-fluoro-9- metil-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona como um sólido castanho claro. MS m/z 324,4 [M+H]+. Exemplo 1 2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-(4-metilpiperazin-1-il)pirido[1,2- a]pirimidin-4-ona
[00254] Em um tubo vedado, 7-fluoro-2-(2-metilimidazo[1,2-b]pirida- zin-6-il)-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 1; 35 mg, 0,119 mmol) e 1-metilpiperazina (47,5 mg, 0,474 mmol, 4 eq.) foram agitadas em DMSO (1 mL) a 120°C por uma noite. LC-MS mostrou conversão total. O solvente foi removido em alto vácuo. O produto bruto foi purifi-cado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 9/1) para dar o produto do título (25 mg, 56%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 376,3 [M+H+]. Exemplo 2 7-[(8aR)-3,4,6,7,8,8a-hexa-hidro-1H-pirrolo[1,2-a]pirazin-2-il]-2-(2- metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00255] Em um tubo vedado, 7-fluoro-2-(2-metilimidazo[1,2-b]pirida- zin-6-il)-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 1; 125 mg, 0,426 mmol) e (R)-octa-hidropirrolo-[1,2-a]pirazina (160 mg, 1,27 mmol, 3 eq.) foram agitadas em DMSO (5 mL) a 125°C por uma noite. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=98/2 a 95/5) para dar o produto do título (65 mg, 38%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 402,5 [M+H+]. Exemplo 3 7-[(8aS)-3,4,6,7,8,8a-hexa-hidro-1H-pirrolo[1,2-a]pirazin-2-il]-2-(2,8- dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00256] Em um tubo vedado, 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)-7-fluoro-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 2; 200 mg, 0,647 mmol) e (S)-octa-hidropirrolo-[1,2-a]pirazina (286 mg, 2,26 mmol, 3,5 eq.) foram agitadas em DMSO (5 mL) a 125°C por uma noite. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=98/2 a 95/5) para dar o produto do título (115 mg, 43%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 416,3 [M+H+]. Exemplo 4 7-[(8aR)-3,4,6,7,8,8a-hexa-hidro-1H-pirrolo[1,2-a]pirazin-2-il]-2-(2,8- dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00257] Em um tubo vedado, 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)-7-fluoro-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 2; 200 mg, 0,647 mmol), DIPEA (0,113 mL, 0,67 mmol, 1eq.) e (R)-octa-hidropirrolo-[1,2- a]pirazina (245 mg, 1,95 mmol, 3,0 eq.) foram agitadas em DMSO (2,5 mL) a 125°C por uma noite. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cro- matografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=98/2 a 95/5) para dar o produto do título (132 mg, 49%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 416,3 [M+H+]. Exemplo 5 7-[(8aS)-8a-metil-1,3,4,6,7,8-hexa-hidropirrolo[1,2-a]pirazin-2-il]-2-(2,8- dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00258] Em um tubo vedado, 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)-7-fluoro-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 2; 90 mg, 0,291 mmol), DIPEA (0,05 mL, 0,29 mmol, 1eq.) e (S)-8a-metilocta-hidro- pirrolo[1,2-a]pirazina (81 mg, 0,58 mmol, 2,0 eq.) foram agitadas em DMSO (2,5 mL) a 125°C por uma noite. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 90/10) para dar o produto do título (55 mg, 44%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 430,3 [M+H+]. Exemplo 6 7-[(8aR)-8a-metil-1,3,4,6,7,8-hexa-hidropirrolo[1,2-a]pirazin-2-il]-2-(2,8- dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00259] Em um tubo vedado, 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)-7-fluoro-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 2; 90 mg, 0,291 mmol), DIPEA (0,05 mL, 0,29 mmol, 1eq.) e (R)-8a-metilocta-hidro- pirrolo[1,2-a]pirazina (81 mg, 0,58 mmol, 2,0 eq.) foram agitadas em DMSO (2,5 mL) a 125°C por uma noite. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 90/10) para dar o produto do título (50 mg, 40%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 430,4 [M+H+]. Exemplo 7 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3S,5R)-3,5-dimetilpipera- zin-1-il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00260] Em um tubo vedado, 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)-7-fluoro-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 2; 50 mg, 0,162 mmol), e cis-2,6-dimetilpiperazina (74 mg, 0,647 mmol, 4,0 eq.) foram agitadas em DMSO (1,5 mL) a 110°C por uma noite. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bru- to foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 90/10) para dar o produto do título (32 mg, 49%) como um sólido ama-relo claro. MS m/z 404,4 [M+H+]. Exemplo 8 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3S)-3-metilpiperazin-1-il] pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00261] Em um tubo vedado, 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)-7-fluoro-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 2; 33 mg, 0,107 mmol), e (S)-2-metilpiperazina (43 mg, 0,427 mmol, 4,0 eq.) foram agitadas em DMSO (2 mL) a 120°C por uma noite. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 90/10) para dar o produto do título (18 mg, 43%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 390,3 [M+H+]. Exemplo 9 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3R)-3-metilpiperazin-1- il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00262] Em um tubo vedado, 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)-7-fluoro-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 2; 85 mg, 0,275 mmol), e (R)-2-metilpiperazina (110 mg, 1,10 mmol, 4,0 eq.) foram agi- tadas em DMSO (5 mL) a 120°C por uma noite. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 90/10) para dar o produto do título (35 mg, 33%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 390,3 [M+H+]. Exemplo 10 7-(1,4-diazepan-1-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00263] Em um tubo vedado, 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)-7-fluoro-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 2; 33 mg, 0,107 mmol), e 1,4-diazepano (32 mg, 0,320 mmol, 3,0 eq.) foram agitados em DMSO (2 mL) a 120°C por uma noite. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 90/10) para dar o produto do título (20 mg, 48%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 390,3 [M+H+]. Exemplo 11 2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3S)-3-metilpiperazin-1- il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00264] Em um tubo vedado, 7-fluoro-2-(2-metilimidazo[1,2-b]pirida- zin-6-il)-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 1; 50 mg, 0,169 mmol), e (S)-2-metilpiperazina (68 mg, 0,677 mmol, 4,0 eq.) foram agi-tadas em DMSO (2 mL) a 110°C por uma noite. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 90/10) para dar o produto do título (40 mg, 63%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 376,2 [M+H+]. Exemplo 12 2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3R)-3-metilpiperazin-1-il] piri- do[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00265] Em um tubo vedado, 7-fluoro-2-(2-metilimidazo[1,2-b]pirida- zin-6-il)-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 1; 50 mg, 0,169 mmol), e (R)-2-metilpiperazina (68 mg, 0,677 mmol, 4,0 eq.) foram agi-tadas em DMSO (2 mL) a 110°C por uma noite. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 90/10) para dar o produto do título (48 mg, 75%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 376,3 [M+H+]. Exemplo 13 7-(1,4-diazepan-1-il)-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2- a]pirimidin-4-ona
[00266] Em um tubo vedado, 7-fluoro-2-(2-metilimidazo[1,2-b]pirida- zin-6-il)-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 1; 50 mg, 0,169 mmol), e 1,4-diazepano (68 mg, 0,677 mmol, 4,0 eq.) foram agitados em DMSO (2 mL) a 110°C por uma noite. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 90/10) para dar o produto do título (41 mg, 65%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 376,2 [M+H+]. Exemplo 14 7-[(3R,5S)-3,5-dimetilpiperazin-1-il]-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00267] Em um tubo vedado, 7-fluoro-2-(2-metilimidazo[1,2-b]pirida- zin-6-il)-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 1; 50 mg, 0,169 mmol), e cis-2,6-dimetilpiperazina (77 mg, 0,677 mmol, 4,0 eq.) foram agitadas em DMSO (2 mL) a 110°C por uma noite. O solvente foi remo-vido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi sepa-rada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 90/10) para dar o produto do título (41 mg, 62%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 390,3 [M+H+]. Exemplo 15 7-[(8aS)-3,4,6,7,8,8a-hexa-hidro-1H-pirrolo[1,2-a]pirazin-2-il]-2-(2-meti- limidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00268] Em um tubo vedado, 7-fluoro-2-(2-metilimidazo[1,2-b]pirida- zin-6-il)-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 1; 50 mg, 0,169 mmol), e (S)-octa-hidropirrolo[1,2-a]pirazina (85 mg, 0,677 mmol, 4,0 eq.) foram agitadas em DMSO (2 mL) a 125°C por uma noite. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 90/10) para dar o produto do título (36 mg, 53%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 402,3 [M+H+]. Exemplo 16 7-[(8aS)-8a-metil-1,3,4,6,7,8-hexa-hidropirrolo[1,2-a]pirazin-2-il]-2-(2- metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00269] Em um tubo vedado, 7-fluoro-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piri- dazin-6-il)-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 1; 50 mg, 0,169 mmol) e (S)-8a-metilocta-hidropirrolo[1,2-a]pirazina (95 mg, 0,677 mmol, 4,0 eq.) foram agitadas em DMSO (2 mL) a 125°C por uma noite. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recu- perado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 90/10) para dar o produto do título (45 mg, 64%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 416,3 [M+H+]. Exemplo 17 7-[(8aR)-8a-metil-1,3,4,6,7,8-hexa-hidropirrolo[1,2-a]pirazin-2-il]-2-(2- metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00270] Em um tubo vedado, 7-fluoro-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piri- dazin-6-il)-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 1; 100 mg,0,339 mmol) e (R)-8a-metilocta-hidropirrolo[1,2-a]pirazina (190 mg, 1,35 mmol, 4,0 eq.) foram agitadas em DMSO (4 mL) a 125°C por uma noite. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 90/10) para dar o produto do título (45 mg, 64%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 416,3 [M+H+]. Exemplo 18 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3R)-3-pirrolidin-1-ilpirro- lidin-1-il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00271] Em um reator micro-ondas, 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b] piri- dazin-6-il)-7-fluoro-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 2; 45 mg, 0,145 mmol), dicloridrato de (R)-1,3'-bipirrolidina (62 mg, 0,291 mmol, 2,0 eq.) e DIPEA (0,20 mL, 1,16 mmol, 8 eq.) foram agitados em NMP (3 mL) a 220°C por 1 hora. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=98/2 a 90/10) para dar o produto do título (25 mg, 40%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 430,3 [M+H+]. Exemplo 19 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00272] Em um tubo vedado, 7-fluoro-2-(2-metilimidazo[1,2-b]pirida- zin-6-il)-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 1; 50 mg, 0,169 mmol), DIPEA (0,24 mL, 1,35 mmol, 8 eq.) e dicloridrato de 4,7- diazaespiro[2.5]octano (62,7 mg, 0,339 mmol, 2,0 eq.) foram agitados em DMSO (2 mL) a 125°C por 2 dias. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 90/10) para dar o produto do título (22 mg, 33%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 388,3 [M+H+]. Exemplo 20 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin- 6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00273] Em um tubo vedado, 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)-7-fluoro-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 2; 50 mg, 0,162 mmol), DIPEA (0,22 mL, 1,29 mmol, 4 eq.) e dicloridrato de 4,7- diazaespiro[2.5]octano (32 mg, 0,320 mmol, 3,0 eq.) foram agitados em DMSO (2 mL) a 130°C por 48 horas. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=98/2 a 95/5) para dar o produto do título (12 mg, 18%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 402,3 [M+H+]. Exemplo 21 2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3R)-3-pirrolidin-1-ilpirrolidin-1- il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00274] Em um tubo vedado, 7-fluoro-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piri- dazin-6-il)-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 1; 40 mg, 0,135 mmol), DIPEA (0,19 mL, 1,08 mmol, 8 eq.) e dicloridrato de (R)- 1,3'-bipirrolidina (58 mg, 0,271 mmol, 2,0 eq.) foram agitados em DMSO (4 mL) e aquecidos a 220°C por 40 minutos em um microondas. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=98/2 a 90/10) para dar o produto do título (30 mg, 53%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 416,3 [M+H+]. Exemplo 22 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-(3,3-dimetilpiperazin-1 -il)pirido [1,2-a]pirimidin-4-ona
[00275] Em um tubo vedado, 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)-7-fluoro-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 2; 40 mg, 0,129 mmol) e 2,2-dimetilpiperazina (59 mg, 0,517 mmol, 4,0 eq.) foram agitadas em DMSO (1,6 mL) a 130°C por uma noite. O solvente foi remo- vido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi se-parada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 9/1) para dar o produto do título (29 mg, 55%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 404,3 [M+H+]. Exemplo 23 7-(3,3-dimetilpiperazin-1-il)-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido [1,2-a]pirimidin-4-ona
[00276] Em um tubo vedado, 7-fluoro-2-(2-metilimidazo[1,2-b]pirida- zin-6-il)-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 1; 40 mg, 0,135 mmol) e 2,2-dimetilpiperazina (62 mg, 0,542 mmol, 4,0 eq.) foram agi-tadas em DMSO (2 mL) a 130°C por uma noite. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 90/10) para dar o produto do título (26 mg, 49%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 390,3 [M+H+]. Exemplo 24 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-9-metil-7-[(3S)-3-metilpipera- zin-1-il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00277] Em um tubo vedado, 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)-7-fluoro-9-metil-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 4; 50 mg, 0,155 mmol) e (S)-2-metilpiperazina (62 mg, 0,619 mmol, 4,0 eq.) foram agitadas em DMSO (2 mL) a 125°C por uma noite. O solvente foi remo-vido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi se-parada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 90/10) para dar o produto do título (45 mg, 72%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 404,3 [M+H+]. Exemplo 25 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-9-metil-7-[(3R)-3-metilpipera- zin-1-il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00278] Em um tubo vedado, 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)-7-fluoro-9-metil-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 4; 50 mg, 0,155 mmol) e (R)-2-metilpiperazina (62 mg, 0,619 mmol, 4,0 eq.) foram agitadas em DMSO (2 mL) a 125°C por uma noite. O solvente foi remo-vido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi se-parada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 90/10) para dar o produto do título (40 mg, 70%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 404,3 [M+H+]. Exemplo 26 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3R,5S)-3,5-dimetilpipera- zin-1-il]-9-metil-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00279] Em um tubo vedado, 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)-7-fluoro-9-metil-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 4; 50 mg, 0,155 mmol) e cis-2,6-dimetilpiperazina (70 mg, 0,619 mmol, 4,0 eq.) foram agitadas em DMSO (2 mL) a 125°C por uma noite. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 90/10) para dar o produto do título (26 mg, 40%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 418,3 [M+H+]. Exemplo 27 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-(3,3-dimetilpiperazin-1-il)-9- metil-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00280] Em um tubo vedado, 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)-7-fluoro-9-metil-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 4; 50 mg, 0,155 mmol) e 2,2-dimetilpiperazina (35 mg, 0,309 mmol, 2,0 eq.) foram agitadas em DMSO (2 mL) a 125°C por uma noite. O solvente foi remo-vido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi se-parada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 90/10) para dar o produto do título (36 mg, 56%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 418,3 [M+H+]. Exemplo 28 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin- 6-il)-9-metil-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00281] Em um tubo vedado, 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)-7-fluoro-9-metil-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 4; 50 mg, 0,155 mmol), DIPEA (0,21 mL, 1,24 mmol, 8 eq.) e dicloridrato de 4,7- diazaespiro[2.5]octano (57 mg, 0,309 mmol, 2,0 eq.) foram agitados em DMSO (2 mL) a 125°C por 2 dias. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 90/10) para dar o produto do título (17 mg, 26%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 416,3 [M+H+]. Exemplo 29 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3S,5S)-3,5-dimetilpipera- zin-1-il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00282] Em um tubo vedado, 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)-7-fluoro-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 2; 50 mg, 0,162 mmol), TEA (0,18 mL, 1,29 mmol, 8 eq.) e dicloridrato de (2S,6S)-2,6- dimetilpiperazina (90 mg, 0,485 mmol, 3,0 eq.) foram agitados em DMSO (2 mL) a 140°C por uma noite. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 9/1) para dar o produto do título (20 mg, 30%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 404,3 [M+H+]. Exemplo 30 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3S)-3-pirrolidin-1-ilpirro- lidin-1-il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00283] Em um tubo vedado, 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)-7-fluoro-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 2; 50 mg, 0,162 mmol), DIPEA (0,22 mL, 1,29 mmol, 8 eq.) e dicloridrato de (S)-1,3'- bipirrolidina (103 mg, 0,485 mmol, 3,0 eq.) foram agitados em NMP (2 mL) a 140°C por uma noite. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cro- matografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 9/1) para dar o produto do título (22 mg, 32%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 430,3 [M+H+]. Exemplo 31 2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3S)-3-pirrolidin-1-ilpirrolidin-1- il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00284] Em um tubo vedado, 7-fluoro-2-(2-metilimidazo[1,2-b]pirida- zin-6-il)-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 1; 75 mg, 0,254 mmol), TEA (0,28 mL, 2,03 mmol, 8 eq.) e dicloridrato de (S)-1,3'- bipirrolidina (162 mg, 0,762 mmol, 3,0 eq.) foram agitados em NMP (4 mL) e aquecidos a 220°C por 1 hora em um micro-ondas. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 90/10) para dar o produto do título (12 mg, 11%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 416,2 [M+H+]. Exemplo 32 7-[(3S,5S)-3,5-dimetilpiperazin-1-il]-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00285] Em um tubo vedado, 7-fluoro-2-(2-metilimidazo[1,2-b]pirida- zin-6-il)-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 1; 75 mg, 0,254 mmol), TEA (0,28 mL, 2,03 mmol, 8 eq.) e dicloridrato de (2S,6S)-2,6- dimetilpiperazina (143 mg, 0,762 mmol, 3,0 eq.) foram agitados em DMSO (3 mL) e aquecidos a 140°C por uma noite. O solvente foi removi-do em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi sepa-rada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 90/10) para dar o produto do título (10 mg, 10%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 390,3 [M+H+]. Exemplo 33 9-metil-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3S)-3-metilpiperazin-1- il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00286] Em um tubo vedado, 7-fluoro-9-metil-2-(2-metilimidazo[1,2- b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 3; 250 mg, 0,808 mmol), e (S)-2-metilpiperazina (405 mg, 4,04 mmol, 5,0 eq.) foram agitadas em DMSO (6 mL) e aquecidas a 130°C por uma noite. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 85/15) para dar o produto do título (135 mg, 43%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 390,3 [M+H+]. Exemplo 34 9-metil-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)-7-[(3R)-3-metilpiperazin-1- il]pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00287] Em um tubo vedado, 7-fluoro-9-metil-2-(2-metilimidazo[1,2- b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 3; 250 mg, 0,808 mmol), e (R)-2-metilpiperazina (405 mg, 4,04 mmol, 5,0 eq.) foram agitadas em DMSO (6 mL) e aquecidas a 130°C por uma noite. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 85/15) para dar o produto do título (100 mg, 32%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 390,3 [M+H+]. Exemplo 35 7-[(3R,5S)-3,5-dimetilpiperazin-1-il]-9-metil-2-(2-metilimidazo[1,2- b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00288] Em um tubo vedado, 7-fluoro-9-metil-2-(2-metilimidazo[1,2- b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 3; 250 mg, 0,808 mmol), e (2S,6R)-2,6-dimetilpiperazina (461 mg, 4,04 mmol, 5,0 eq.) foram agitadas em DMSO (6 mL) e aquecidas a 130°C por uma noite. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 85/15) para dar o produto do título (101 mg, 31%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 404,3 [M+H+]. Exemplo 36 7-(3,3-dimetilpiperazin-1-il)-9-metil-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00289] Em um tubo vedado, 7-fluoro-9-metil-2-(2-metilimidazo[1,2- b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 3; 250 mg, 0,808 mmol), e 2,2-dimetilpiperazina (461 mg, 4,04 mmol, 5,0 eq.) foram agitadas em DMSO (6 mL) e aquecidas a 130°C por uma noite. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 85/15) para dar o produto do título (120 mg, 36%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 404,3 [M+H+]. Exemplo 37 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-9-metil-2-(2-metilimidazo[1,2-b]pirida- zin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00290] Em um tubo vedado, 7-fluoro-9-metil-2-(2-metilimidazo[1,2- b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 3; 125 mg, 0,404 mmol), K2CO3 (223 mg, 1,62 mmol, 4 eq.) e dicloridrato de 4,7- diazaespiro[2.5]octano (112 mg, 0,606 mmol, 1,5 eq.) foram agitados em DMA (2 mL) e aquecidos a 130°C por uma noite. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purifi-cado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 90/10) para dar o produto do título (75 mg, 46%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 402,2 [M+H+]. Exemplo 38 7-[(3S,5S)-3,5-dimetilpiperazin-1-il]-9-metil-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piri- dazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00291] Em um tubo vedado, 7-fluoro-9-metil-2-(2-metilimidazo[1,2- b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 3; 125 mg, 0,404 mmol), K2CO3 (223 mg, 1,62 mmol, 4 eq.) e dicloridrato de (2S,6S)-2,6-dimetilpiperazina (113 mg, 0,606 mmol, 1,5 eq.) foram agi-tados em DMA (2 mL) e aquecidos a 130°C por uma noite. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo foi recuperado em CH2Cl2 e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada orgânica foi separada e secada sobre Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 90/10) para dar o produto do título (50 mg, 31%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 404,3 [M+H+]. Exemplo 39 7-[(3R)-3-etilpiperazin-1-il]-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido [1,2-a]pirimidin-4-ona
[00292] Em um tubo vedado, 7-fluoro-2-(2-metilimidazo[1,2-b]piridazin -6-il)-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Intermediário 1; 200 mg, 0,677 mmol), K2CO3 (374 mg, 2,71 mmol, 4 eq.) e dicloridrato de (R)-2- etilpiperazina (238 mg, 0,606 mmol, 1,5 eq.) foram agitados em DMA (3 mL) a 100°C por 4 dias. O solvente foi removido em alto vácuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (SiO2, CH2Cl2/MeOH=95/5 a 8/2) para dar o produto título (168 mg, 64%) como um sólido amarelo claro. MS m/z 390,2 [M+H+]. Exemplo 40 Ensaio de RT-qPCR de emenda do mRNA do minigene SMN2em células em cultura
[00293] Para descrever mais detalhadamente e ajudar a entender a presente descrição, os seguintes exemplos biológicos não limitativos são oferecidos para ilustrar de forma mais completa o escopo da descrição e eles não devem ser interpretados como especificamente limitativos do seu escopo. Estas variações da presente descrição que já podem ser conhecidas ou vierem a ser desenvolvidas posteriormente, e cuja verificação estaria ao alcance do versado na técnica, enquadram-se no escopo da presente descrição e estão reivindicadas mais adiante. Estes exemplos ilustram os testes realizados com determinados compostos descritos neste pedido in vitro e/ou in vivo e demonstram a utilidade dos compostos para tratar SMA melhorando a inclusão do exon 7 do SMN2 no mRNA transcrito a partir do gene SMN2. Os compostos de fórmula (I) melhoram a inclusão do exon 7 do SMN2 no mRNA transcrito a partir do gene SMN2 e aumentam os níveis da pro- teína SMN produzidas a partir do gene SMN2, e dessa forma podem ser usados para tratar SMA em um indivíduo humano com necessidade dos mesmos. Estes exemplos ilustram ainda os testes realizados com determinados compostos descritos neste pedido in vitro e/ou in vivo e demonstram a utilidade dos compostos para melhorar a inclusão do exon 7 do SMN1 no mRNA transcrito a partir do gene SMN1. Por conseguinte, os compostos de fórmula (I) também melhoram a inclusão do exon 7 do SMN1 no mRNA transcrito a partir do gene SMN1 e aumentam os níveis da proteína SMN produzidos a partir do gene SMN1.
[00294] O ensaio à base de transcrição reversa-PCR quantitativa (RT-qPCR) é usado para quantificar o nível do mRNA do minigene SMN2 de comprimento integral (aqui denominado pelo termo "FL SMN2mini") contendo o exon 7 do SMN2 em uma linhagem celular HEK293H estavelmente transfectada com o referido minigene e tratada com um composto de teste. Os materiais usados e as respectivas fontes estão relacionados abaixo na Tabela 1.Tabela 1. Materiais e suas respectivas fontes usados no ensaio de RT- qPCR de emenda do mRNA do minigene SMN2 mRNA em células em cultura.
[00295] A construção do minigene SMN2-A foi preparada da manei- ra descrita no Pedido de Patente Internacional WO2009/151546A1 página 145 parágrafo [00400] à página 147 parágrafo [00412] (incl. Figura 1 e Figura 3 do mesmo).
[00296] Células HEK293H estavelmente transfectadas com a construção do minigene SMN2-A (10.000 células/poço) são semeadas em 200 μL de meio de cultura de células (DMEM mais 10% de FBS, com 200 μg/mL de higromicina) placas de fundo plano de 96 poços e a placa é imediatamente centrifugada para garantir a dispersão apropriada das células e a formação de uma monocamada uniforme de células. Permite-se que as células se unam por 6 horas. Os compostos de teste são seriadamente diluídos 1 para 3,16 em 100% de DMSO para gerar uma curva de concentração de 7 pontos. Uma solução de composto de teste (1 μL, 200x em DMSO) é adicionada a cada poço contendo células e a placa é incubada por 24 horas em uma incubadora de cultura de células (37°C, 5% de CO2, 100% de umidade relativa). São preparadas 2 réplicas para cada concentração do composto de teste. As células são então lisadas no tampão de lise de células para Ct e o lisado é armazenado a -80°C.
[00297] O minigene SMN2-A de comprimento integral e o mRNA de GAPDH são quantificados usando-se os iniciadores e as sondas indi-cadas no documento WO2014/209841A2, na página 80, Tabela 1. O iniciador de SMN Direto A (SEQ ID NO:1) hibridiza para uma sequência nucleotídica no exon 7 (nucleotídeo 22 ao nucleotídeo 40), o iniciador de SMN Reverso A (SEQ ID NO:2) hibridiza para uma sequência nucleotídica na sequência codificadora da luciferase de pirilampo, a Sonda A de SMN (SEQ ID NO:3) hibridiza para uma sequência nucleo- tídica no exon 7 (nucleotídeo 50 ao nucleotídeo 54) e exon 8 (nucleotí- deo 1 ao nucleotídeo 21). A combinaçãao desses três oligonucleotí- deos detectada somente os SMN1 minigenes ou SMN2 (RT-qPCR) e não vai detectar os genes SMN1 ou SMN2 endógenos.
[00298] Os iniciadores direto e reverso de SMN são usados em concentrações finais de 0,4 μM. A sonda de SMN é usada em uma concentração final de 0,15 μM. Os iniciadores GAPDH são usados em concentrações finais de 0,2 μM e a sonda a 0,15 μM.
[00299] A mistura de SMN2-minigene GAPDH (15 μL de volume total) é preparada combinando-se 7,5 μL de tampão RT-PCR 2x, 0,4 μL de mistura de RT-PCR enzima 25x, 0,75 μL de mistura de iniciador- sonda de GAPDH 20x, 4,0075 μL de água, 2 μL de lisado de células diluído 1 para 10, 0,06 μL de iniciador direto de SMN 100 μM, 0,06 μL de iniciador reverso de SMN 100 μM, e 0,225 μL de sonda de SMN 100 μM.
[00300] A PCR é realizada às seguintes temperaturas pelo tempo indicado: Etapa 1: 48°C (15 min); Etapa 2: 95°C (10 min); Etapa 3: 95°C (15 sec); Etapa 4: 60°C (1 min); e então repetir as Etapas 3 e 4 por um total de 40 ciclos.
[00301] Cada mistura reacional contém tanto o minigene SMN2-A quanto os conjuntos de iniciadores/sonda de GAPDH (desenho multiplex), permitindo medir simultaneamente os níveis dos dois transcritos.
[00302] O aumento na abundância do mRNA do FL SMN2mini em relação àquela nas células tratadas com o veículo de controle é determinado a partir dos dados de PCR em tempo real usando um método de ΔΔCt modificado (como descrito em Livak e Schmittgen, Methods, 2001, 25:402-8). A eficiência de amplificação E é calculada a partir da inclinação da curva de amplificação para FL SMN2mini e GA- PDH individualmente. A abundância de FL SMN2mini e GAPDH mRNA é então calculada como (1 + E)-Ct, onde Ct é o valor limítrofe para cada amplicon. A abundância de FL SMN2mini mRNA é normalizada para a abundância de GAPDH mRNA. A abundância de mRNA de FL SMN2mini normalizada a partir das amostras tratadas com o composto de teste é então dividida pela abundância de mRNA de FL SMN2mini das células tratadas com veículo para determinar o nível de mRNA de FL SMN2mini em relação ao veículo de controle.
[00303] A Tabela 2 apresenta as concentrações EC1,5x para produção de mRNA do minigene SMN2 de comprimento integral que foi obtido a partir dos dados de concentração de 7 pontos gerados de acordo com o procedimento acima para compostos particulares da presente invenção.
[00304] Compostos particulares da presente invenção apresentam uma concentração EC1,5x para produção de mRNA do minigene SMN2 de comprimento integral < 1 μM.
[00305] Compostos mais particulares apresentam uma concentração EC1,5x para produção de mRNA do minigene SMN2 de comprimento integral < 0,1 μM.
[00306] Compostos ainda mais particulares apresentam uma con-centração EC1,5x para produção de mRNA do minigene SMN2 de comprimento integral < 0,02 μM.Tabela 2. Concentrações ECi,5x para produção de mRNA do minigene SMN2 de comprimento integral. Exemplo 41 Ensaio da proteína SMN em células em cultura
[00307] O ensaio de SMN HTRF (fluorescência homogênea resolvida no tempo) é usado para quantificar o nível de proteína SMN em fi- broblastos de pacientes com SMA tratados com os compostgos de teste. Os materiais usados e as respectivas fontes estão relacionados abaixo na Tabela 3. Tabela 3. Materiais e suas respectivas fontes usados no ensaio da proteína SMN em células em cultura.
[00308] As células são descongeladas e cultivadas em DMEM-10% de FBS por 72 horas. As células são tripsinizadas, contadas e ressus- pendidas até uma concentração de 25.000 células/mL em DMEM-10% de FBS. As suspensões de células são plaqueadas a 5.000 células por poço em uma placa de microtitulação de 96 poços e incubadas por 3 a 5 horas. Os compostos de teste são seriadamente diluídos 1 para 3,16 em 100% DMSO para gerar uma curva de concentração de 7 pontos. 1 μL de uma solução de composto de teste é transferido para poços contendo células e as células são incubadas por 48 horas em uma in-cubadora de cultura de células (37°C, 5% de CO2, 100% de umidade relativa). Amostras em triplicata são montadas para cada concentração de composto de teste. Depois de 48 horas, o sobrenadante é removido dos poços e 25 μL do tampão de lise RIPA, contendo inibidores de protease, são acrescentados aos poços e incubados com agitação à temperatura ambiente por 1 hora. 25 μL do diluente são adicionados e então 35 μL do lisado resultante são transferidos para uma placa de 384 poços, onde cada poço contém 5 μL da solução de anticorpo (diluição 1:100 de anti-SMN d2 e anti-SMN criptato em tampão de constituição de SMN). A placa é centrifugada por 1 minuto para levar a solução para o fundo dos poços, e em seguida incubada por uma noite à temperatura ambiente. A fluorescência para cada poço da placa a 665 nm e 620 nm é medida em uma leitora de placas multimarcas EnVision (Perkin-Elmer).
[00309] O sinal de fluorescência normalizado é calculado para cada poço com amostra, e veículo de controle dividindo-se o sinal 665 nm pelo sinal a 620 nm. A normalização do sinal é responsável pelo possível resfriamento bruscamente da fluorescência devido ao efeito matricial do lisado. O valor de ΔF (uma medida da abundância de proteína de SMN como um valor percentual) para cada poço com amostra é calculado substraindo-se a fluorescência média normalizada para os poços com branco de controle a partir da fluorescência normalizada para cada poço com amostra, e em seguida dividindo-se esta diferença pela fluorescência média normalizada para os poços com branco de controle e multiplicando-se o valor resultante por 100. O valor de ΔF para cada poço com amostra representa a abundância de proteína SMN a partir de amostras tratadas com o composto de teste. O valor de ΔF para cada poço com amostra é dividido pelo valor de ΔF para os poços com veículo de controle para calcular o aumento proporcional na abundância de proteína SMN em relação ao veículo de controle. A Tabela 4 apresenta as concentrações EC1,5x para expressão da proteína SMN que foram obtidas a partir dos dados de concentração de 7 pontos gerados de acordo com o procedimento acima para compostos particulares da presente invenção.
[00310] Compostos particulares apresentam uma concentração ECi,5x para expressão da proteína SMN <1 μM.
[00311] Compostos mais particulares apresentam uma concentração EC1,5x para expressão da proteína SMN <100 nM.
[00312] Compostos ainda mais particulares apresentam uma con-centração EC1,5x para expressão da proteína SMN <30 nM.
[00313] A Tabela 5 apresenta o aumento proporcional máximo de proteína SMN que foi obtido a partir dos dados de concentração de 7 pontos gerados de acordo com o procedimento acima para compostos particulares da presente invenção
[00314] Compostos particulares da presente invenção apresentam um aumento proporcional máximo > 1,5.
[00315] Compostos mais particulares da presente invenção apresentam um aumento proporcional máximo > 1,7.
[00316] Compostos ainda mais particulares da presente invenção apresentam um aumento proporcional máximo > 1,8. Tabela 4. Concentrações ECi,5x para expressão da proteína SMN. Tabela 5. Aumento proporcional máximo de proteína SMN. Exemplo 42 Ensaio in vitro de 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo [1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Exemplo 20)
[00317] O composto do Exemplo 20 é um modificador da emenda de SMN2 de molécula pequena disponível por vial oral para o tratamento de SMA. Foi constatado que o composto do Exemplo 20 corrige de forma efetiva a emenda disfuncional do pré-mRNA da SMN2 humana em células do paciente em cultura (fibroblastos de SMA Tipo 1) por deslocamento do equilíbrio da reação de emenda alternativa com-pletamente com vistas à inclusão do exon 7 da SMN2 e à produção de mRNA de comprimento integral (Figura 1A: EC50 29±8 nM para FL, 12±1 nM para Δ7 mRNA).Tratamento das células expressando o minigene SMN2 com concentrações crescentes do composto do Exemplo 20 resultou em um aumento dose-dependente na quantidade do mRNA de comprimento integral do minigene SMN2. A EC1,5x foi 4,7 ± 0,7 nM e a indução máxima foi 20 vezes maior. Os resultado do ensaio de minigene confirmam que o composto do Exemplo 20 é um potente modificador da emenda do SMN2.
[00318] Para investigar a produção de proteína SMN como uma consequência da emenda alternativa, foi realizado um ensaio in vitro para avaliar os níveis de proteína SMN nos fibroblastos e nos neurônios motores da espinha derivados de iPSCs (células-tronco pluripo- tentes induzidas) de pacientes com SMA (EC50 de 12±3 nM, e EC50 182±114 nM, respectivamente). O aumento máximo de proteína SMN nas células não tratadas acima resultou em níveis similares em ambos os tipos de células (60 - 80%; Figuras 1B e 1C), sugerindo que em diferentes tipos de células de pacientes com SMA, o composto do Exemplo 20 aumenta o nível de proteína SMN de maneira similar a um resultado de correção da emenda de SMN2 disfuncional in vitro.
[00319] Para avaliar ainda a emenda de SMN2 como um potencial biomarcador sanguíneo, foi desenvolvido um ensaio ex vivo usando células de sangue total de voluntários saudáveis nas quais a emenda de SMN1 e de SMN2 foi avaliada depois de 4 horas de tratamento com o composto do Exemplo 20 (a esta altura, foram atingidas as alterações máximas na emenda). Enquanto que a emenda de SMN1 fora bastante afetada, a emenda de SMN2 foi alterada de forma dose- dependente em relação à inclusão do exon 7 (Figura 1D). Os efeitos na emenda foram evidentes a concentrações acima de 100 nM de composto do Exemplo 20, sugerindo que são necessários esses níveis no sangue para que sejam observados efeitos farmacodinâmicos in vivo (PD) na emenda de SMN2 com este ensaio. Exemplo 43 Ensaio in vivo de 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimi- dazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Exemplo 20)
[00320] In vivo, o composto do Exemplo 20 aumenta a proteína SMN no cérebro e no músculo do modelo de SMNΔ7 severo e do modelo com alelo C/C mais leve, portador de transgenes SMN2 humanos. Camundongos adultos com alelo C/C foram tratados por 10 dias com veículo ou com o composto do Exemplo 20 (1, 3 ou 10 mg/kg PO, daily), e camundongos SMNΔ7 de 3 dias de idade (P3) foram tratados por 7 dias com veículo ou com o composto do Exemplo 20 (0,1, 0,3, 1 ou 3 mg/kg IP, diários). O composto do Exemplo 20 aumentou de forma dose-dependente os níveis de proteína SMN no cérebro e no tecido muscular, com um efeito máximo de um aumento de 2-3 vezes atingido a 10 mg/kg em camundongos adultos com alelo C/C e a 1-3 mg/kg em camundongos SMNΔ7 neonatos (Figura 2). Assim sendo, no músculo de camundongos com alelo C/C a uma dose de 10 mg/kg, os níveis de SMN atingidos não foram diferentes daqueles de camundongos heterozigóticos. Nos camundongos SMNΔ7, o aumento da proteína SMN foi apenas parcial tanto no cérebro como no músculo, atingido aproximadamente 43% (cérebro) e 55% (músculo) dos níveis de proteína nos camundongos heterozigóticos. Esses dados demonstram que o composto do exemplo 20 aumenta a proteína SMN tanto no cérebro quanto no tecido muscular de modelos de camundongo transgênico de SMA.
[00321] Os benefícios funcionais foram avaliados nos modelos de camundongo de SMA severa e leve. Camundongos SMNΔ7 foram tra-tados de P3 a P23 uma vez ao dia por injeção IP de veículo ou do composto do Exemplo 20, e de P24 em diante uma vez ao dia por ga- vagem oral. Durante o tratamento, o peso corporal e a sobrevivência do animal foram monitorados. Durante o período de observação de 100 dias, somente dois animais heterozigóticos da mesma ninhada morreram. Em constraste, todos os camundongos tratados com veículo morreram antes de P21 com um tempo de sobrevida médio (MST) de 10,5 dias. Tratamento com o Exemplo 20 prolongou a sobrevida do animal de forma dose-dependente (Figura 3A). Um prolongamento pe-queno porém significativo de MST para P26 foi observado com uma dose mais baixa (0,1 mg/kg IP até P23 e 0,3 mg/kg PO depois disso). Os grupos de tratamento com dose média (0,3 mg/kg IP até P23 e 1 mg/kg PO depois disso), média/alta (1 mg/kg IP até P23 e 3 mg/kg PO depois disso), e alta (3 mg/kg IP até P23 e 10 mg/kg PO depois disso) resultaram em 80%, 82%, e 73%, respectivamente, dos animais so-brevivendo até P100, nada diferente de animais heterozigóticos da mesma ninhada com 83% ainda vivos em P100.
[00322] O aumento do peso corporal dos camundongos SMNΔ7 em todo o estudo foi severalmente prejudicado e apenas levemente corrigido pela dose baixa do composto do Exemplo 20. Tratamento com doses média, média/alta e alta do composto do Exemplo 20 resultou em uma recuperação de 71%, 82%, e 85%, respectivamente, de ganho de peso corporal em comparação com os animais heterozigóticos da mesma ninhada que não apresentaram fenótipo relacionado com SMA (Figura 3B). Esses dados sugerem que tratamento com o composto do Exemplo 20 de forma dose-dependente previne a manifestação do fenótipo de SMA nos camundongos SMNΔ7 severamente afetados quando a medicação é iniciada em P3.
[00323] Por fim, o composto do Exemplo 20 melhora a conectividade neuromuscular em um modelo de camundongo com SMA severa in vivo. Camundongos SMNΔ7 foram tratados de P3 a P14 por injeção IP de veículo ou 0,1, 0,3, 1 mg/kg do Exemplo 20 uma vez ao dia. Em P14, 1 hora depois da última dose, tecidos do cordão espinhal e músculo foram processados para avaliação histológica. Em relação aos animais heterozigóticos da mesma ninhada, os camundongos SMNΔ7 apresentaram uma perda significativa de entradas de neurônios motores proprioceptivos do transportador 1 de glutamato vesicular (vGlut1), perda de axônios motores, desnervação das junções neuromusculares (NMJ) no músculo longuíssimo, e atrofia muscular. Tratamento com o Exemplo 20 aumentou de forma dose-dependente e significativamente o número de entradas de vGlut1, o número de axônios motores, a per-centagem de NMJs totalment inervados e o tamanho das fibras nos músculos extensores longos dos dedos (EDL) em relação aos camun-dongos SMNΔ7 tratados com veículo (Figura 4). Esses dados sugerem que o tratamento com o composto do Exemplo 20, quando iniciado em P3, protege os aspectos centrais e periféricos da desnervação das NMJs e protege contra atrofia muscular em camundongos SMNΔ7 severamente afetados. Exemplo 44 análise do perfil transcricional da 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2- (2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (Exemplo 20)
[00324] Para identificar outros genes em potencial alternativamente emendados pelo composto do Exemplo 20, foi efetuada uma análise do perfil transcricional que revelou que os eventos de emenda de alguns genes eram afetados à concentração terapeuticamente relevante de 121 nM (EC90, 10 vezes maior que EC50): STRN3, SLC25A17 e GGCT comparados com o controle. A função específica do STRN3, SLC25A17, e GGCT e as consequências de sua desregulação ainda não foram esclarecidas. Também foi verificado que esses três genes são coerentemente afetados a doses mais altas (5 vezes mais altas que a EC90), uma dose usada para ilustrar o efeito máximo desse composto. Os eventos de emenda de 11 genes, incluindo os genes FoxM1 e MADD, foram afetados pela dose mais alta, mas não pela dose mais baixa. FoxM1 e MADD foram descritos como estando envolvidos na regulação do ciclo celular e na apoptose, respectivamente. Um relatório recente sobre modificadores da emenda de SMN2 sugere que o composto do Exemplo 20 é relativamente específico em compa- ração com uma outra molécula, NVS-SM1, para a qual existem 39 eventos candidatos onde a emenda foi alterada em resposta ao trata-mento [Palacino et al., Nat Chem Biol. 2015 Jul;11(7):511-7].
[00325] Além disso, a análise do perfil transcricional demonstrou que os níveis de expressão de 0 genes foram alterados (p < 0,01) com o tratamento com o composto do Exemplo 20 na dose de 121 nM. Esses dados demonstram a especificidade relativa do composto em comparação com dados publicados sobre as alterações no nível de expressão de uma molécula alternativa de emenda de SMN2, NVS- SM1, na qual existem 175 genes alterados em mais de ± 2 vezes (p < 0,05), e NVS-SM3 que alterou significativamente 23 genes [Pala- cino et al., Nat Chem Biol. 2015 Jul;11(7):511-7].
[00326] FoxM1, um gene alternativamente emendado por outros compostos modificadores de emenda, codifica um regulador do ciclo celular. Apenas em seres humanos e primatas superior a variante FoxM1a transcricionalmente inativa contém o exon 9 (FL) e as variantes FoxM1b/c transcricionalmente ativas não possuem o exon 9 (Δ9) [Ye et al., Future Oncol. 2007 Feb;3(1):1-3. Laoukili et al., Biochim Biophys Acta. 2007 Jan;1775(1):92-102]. Por meio de RT qPCR como iniciadores específicos para FoxM1a (FL), e FoxM1b/c (Δ9), foi confirmada a modificação da emenda alternativa de FoxM1 depois de tratamento com o Exemplo 20 treatment (EC50 67 ± 32 nM para FL, 139 ± 43 nM para Δ9 mRNA; vide Figura 5). Expressão aumentada da isoforma FoxM1A, junto com expressão reduzida das isoformas FoxM1 sem o exon 9, tem capacidade de perturbar e inibir a progressão do ciclo celular se as alterações nas emendas estiverem em um nível que seja biologicamente significativo. Assim sendo, o composto do Exemplo 20 age de maneira similar na maquinaria de emenda de SMN2 e FoxM1, porém com resultados opostos em termos de função da proteína e em graus variáveis. A EC50 para o MADD, um gene também identificado como afetado por modificadores de emenda incluindo o composto do Exemplo 20 a concentrações elevadas e sabidamente envolvido em processos apoptóticos, não é conhecida. Exemplo 46 Composições farmacêuticas compreendendo olesoxima
[00327] Exemplos de composições compreendendo olexosima estão descritos no documento US2010099652A1. A olesoxima é estável no estado sólido (>36 meses a 25°C/60% de umidade relativa), não apresentando alteração no perfil de pureza em condições de estresse prolongado e acelerado. A olesoxima tem baixa solubilidade aquosa (menor que 5 μg/ml) em toda a faixa de pH fisiológico. Ela é livremente solúvel ou solúvel em uma gama de solventes não aquosos.
[00328] Para apresentar uma formulação apropriada para a idade para uma ampla faixa etária, foi desenvolvida uma composição líquida oral. Foi constatado que uma composição farmacêutica particularmente vantajosa pode ser obtida preparando-se uma suspensão oral ou gástrica de pó de olexosima em óleo de gergelim devido ao desempenho de estabilidade superior. A solubilidade da olesoxima em óleo de gergelim (aproximadamente 35 mg/ml) é insuficiente para permitir a preparação de uma solução embora limite as quantidades de óleo absorvido pelo indivíduo. A palatabilidade (sabor, cheiro e textura) é aceitável sem outros excipientes.
[00329] 7,5 g de pó de olesoxima cristalina (distribuição de tamanho de partícula com valor d90 70-90 μm) foram suspendidos em 75 ml (61,6 g) de óleo de gergelim (refinado) como veículo com agitação (por exemplo, sacudida) para produzir uma suspensão homogênea (con-centração final de olesoxima 100 mg/ml). Verificou-se que tal suspensão oral era estável por pelo menos 3 meses a 25°C/60% de umidade relativa no que diz respeito à degradação, aspecto, cor, uniformidade do conteúdo e limites microbianos. Exemplo 45 Soluções orais compreendendo 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2- (2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00330] 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2- b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona, o composto do Exemplo 20, pode ser formulada como uma solução aquosa oral por dissolução da substância medicamentosa em um sistema tampão a um pH menor que pH 4, particularmente pH 3,4, para proporcionar uma concentração suficientemente alta do fármaco, por exemplo, tampão cítrico, tampão malato, maleato, ou tartarato, mais particularmente malato ou tartarato, ainda mais particularmente tampão tartarato.
[00331] Estabilidade prolongada de formulações do composto do Exemplo 20 por preparação de um pó seco ou granulação para consti-tuição de uma solução oral. O sistema tampão pode ser incorporado na formulação seca pela escolha do ácido orgânico e seus sais como pós cristalinos finos, por exemplo, citrato de sódio tribásico di- hidratado e ácido cítrico anidro, malato de sódio e ácido málico, ou preferivelmente tartarato misto de potássio e sódio e ácido tartárico.
[00332] Os pós ou grânulos compreendendo o composto do Exemplo 20 podem compreender uma carga extragranular, tal como sorbitol, isomalte, ou manitol, e combinações dos mesmos, que garante a dis-solução rápida da blenda em pó durante a constituição da solução oral. Na introdução de um diluente a mistura em pó pode ser granulada por compactação a seeco para melhorar a fluidez e garantir uniformidade robusta.
[00333] Os ingredientes para a constituição de um sistema solvente para o composto do Exemplo 20 podem ser formulados como uma formulação separada. O solvente reconstituído pode ser usado para dissolução do composto do Exemplo 20 em um frasco no início no período de uso da solução oral.
[00334] A solução oral reconstituída do composto do Exemplo 20 em um tampão pode oferecer prazos de validade de mais de 2 semanas por meio do uso de estabilizantes e antioxidantes, tais como vitamina E TPGS, edetato dissódico, butil hidroxil toluol, riboflavina, ou de preferência ácido ascórbico, e em combinações dos mesmos.
[00335] A Tabela 6 mostra inúmeras soluções orais que apresentam estabilidade em solução por mais de 2 semanas. Tabela 6. Soluções orais de 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8- dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona a uma concentração de 0,1 mg/ml, 1,0 mg/ml e 3,0 mg/ml. Exemplo 46 Blendas em pó como veículos para constituição de soluções orais de 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin- 6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00336] A Tabela 7 representa uma blenda em pó granulada para a constituição de um solvente, que é adequado para dissolver a 7-(4,7- diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona, e obter uma solução oral ao pH 3,5 que é estável por mais de 2 semanas. A blenda contém polietileno glicol 6000 como lubrificante solúvel em água, benzoato de sódio como conservante, sucralose como adoçante, e sabor morango com a finalidade de melhorar o sabor, particularmente para uso em pacientes pediátricos.
[00337] As composições da Tabela 7 junto com 80 ml de água pro-porcionam a constituição de solventes adequados para a dissolução de 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2- b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (80 mg, 240 mg e 400 mg, respectivamente). Tabela 7. Blenda em pó de um veículo para constituição de uma solu- ção oral de 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2- b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona ao pH 3,4 com concentrações de API de 1,0, 3,0 e 5,0 mg/ml. Exemplo 47 Blendas em pó compreendendo 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2- (2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona para constituição de soluções orais
[00338] A Tabela 8 representa uma solução oral compreendendo 7- (4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona que foi reconstituída pelo uso da solução de veículo reconstituída do exemplo 46 para dissolução do composto ativo. O veículo é adequado para constituição de uma solução oral ao pH3,4 que é estável por mais de 2 semanas. As composições da Tabela 8 junto com 80 ml de água fornecem soluções orais compreendendo 1 mg/ml, 3 mg/ml resp. 5 mg/ml de 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan- 7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4- ona. Tabela 8. Constituição de solução oral de uma solução oral compreen-dendo 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2- b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona ao pH 3,5 com concentrações de API de 1,0, 3,0 e 5,0 mg/ml. Exemplo 48 Blendas em pó de 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimi- dazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona para constituição de soluções orais
[00339] A Tabela 9 apresenta blendas em pó compreendendo 7- (4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona que podem ser usadas para reconstituir soluções orais junto com 90 ml de água. As composições da Tabela 9 também podem ser reconstituídas a partir de um solvente preparado a partir de uma blenda em pó de veículo (semelhante ao exemplo 46) seguido por dissolução do API. Tabela 9. Soluções orais de 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8- dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona a uma concentração de 1,0 mg/ml em um frasco contendo 90 ml. Exemplo 49 Blendas em pó de 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimi- dazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona para constituição de soluções orais
[00340] A Tabela 10 apresenta blendas em pó compreendendo 7- (4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona que podem ser usadas para reconstituir soluções orais junto com 80 ml de água. As composições da Tabela 10 também podem ser reconstituídas a partir de um solvente preparado a partir de uma blenda em pó de veículo (semelhante ao exemplo 46) seguido por dissolução do API. Tabela 10. Blenda em pó para a preparação de uma solução oral de 7- (4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona a uma concentração de 1 mg/ml em um frasco contendo 80 ml de água. Exemplo 50 Estabilidade das soluções orais de 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2- (2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
[00341] A Tabela 11 apresenta uma comparação das estabilidades de várias soluções de 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetili- midazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona, expressas como pureza do API em percentagem. Foi constatado que o API era estável em todas as soluções orais investigadas sem degradação acentuada durante várias semanas à temperatura ambiente e também a 5°C.
[00342] A Composição 1A do Exemplo 45 compreende 0,1 mg/ml de API em um sistema tampão citrato junto com ácido ascórbico como antioxidante e edetato dissódico como estabilizante.
[00343] A Composição 2A do Exemplo 46 foi reconstituída com 200 ml de água para dissolver 200 mg de API (1 mg/ml).
[00344] As Composições 3A e 3B do Exemplo 48 foram reconstituídas a partir da blenda em pó de API junto com 90 ml de água (1 mg/ml). Tabela 11. Estabilidade da solução de várias composições armazenadas a 5°C ou 25°C em frascos de vidro de cor âmbar. Exemplo 51 Emulsões de água em óleo compreendendo 7-(4,7-diazaespiro [2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[ 1,2- a]pirimidin-4-ona e olesoxima
[00345] Para uma administração combinada do composto do Exemplo 20 com olesoxima em uma única composição, as soluções orais aquosas do composto do Exemplo 20 podem ser combinadas com uma solução oleosa de olesoxima por constituição de uma suspensão oral. Uma suspensão oleosa de olesoxima (como, por exemplo, no exemplo 46) pode ser transferida para um frasco contendo a solução reconstituída do composto do Exemplo 20 e subsequentemente é possível formar uma emulsão agitando-se manualmente os frascos fechados 5-20 vezes, de preferência 10 vezes. A solução oleosa de olesoxima é uma solução em óleo de gergelim que pode conter agentes emulsificantes e/ou solubilizantes lipofílicos tais como gliceril mono-oleato (Peceol ™, Inwitor 948 ™, Capmul GMO™), gliceril mo- no-linoleato (Maisine 35-1™), mono-oleato de sorbitano (Span 80™), ou ácido oleico, para aumentar a solubilidade da olesoxima no solvente oleoso e possibilitar a formação de uma emulsão a partir da solução oleosa quando ela for combinada com as soluções de composto do Exemplo 20. Emulsificantes e agentes solubilizantes que são dispersados no solvente oleoso, opcionalmente antes da dissolução da ole- soxima com a aplicação de calor, podem ser combinados com tensoa- tivos mais polares com um valor de HLB menor que 7, por exemplo, polissorbato 80 (Tween 80™), caprilocaproil polioxil glicerídeos (La- brasol™) para fornecer uma emulsão de dispersibilidade mais alta e estabilidade física mais longa depois da constituição. A emulsão pode ter a fase aquosa ou a fase oleosa como a fase interna dispersada dependendo da proporção selecionada entre o tensoativo lipofílico com HLB baixo e o tensoativo mais hidrófilo com valor de HLB alto.
[00346] A Tabela 12 apresenta 2 exemplos de um veículo oleoso que é adequado para a formação de uma emulsão de água em óleo, compreendendo 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo [1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona na fase aquosa e oleso- xima na fase lipídica. Tabela 12: Veículos oleosos para olesoxima para reconstituir uma emulsão de água em óleo com uma solução oral de 7-(4,7-diazaespiro [2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]piri- midin-4-ona.
[00347] Com as composições 4A e 4F, foi possível dispersar até 30% (p/p) de uma solução tampão aquosa de tartarato pH 3,3 como emulsão depois de agitada 10 vezes. As emulsões foram visualmente homogêneas por pelo menos 15 minutos.
[00348] A Tabela 3 (Composição 5A) representa uma solução usada para preparar uma solução aquosa de 7-(4,7-diazaespiro [2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2- a]pirimidin-4-ona. Tabela 13: Solvente aquoso para 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2- (2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona.
[00349] A Figura 6 mostra fotografias da composição 4A antes (A) e imediatamente depois da adição de uma solução tampão de tartarato a 20% (B) ou 30% (C) (composição 5A) resultando assim em emulsões de água em óleo.
[00350] A Figura 7 mostra fotografias de emulsões de água em óleo compreendendo 70% da composição 4A e 30% da composição 5A 15 minutos depois da constituição (A) (agitada 10 vezes) e 30 minutos depois da constituição (B) (agitada 10 vezes).
[00351] A Figura 8 mostra fotografias da composição 4F antes (A) e imediatamente depois da adição de 20% (B à esquerda), 25% (B no centro) ou 30% (B à direita) de solução tampão de tartarato (composição 5A) resultando assim em emulsões de água em óleo.
[00352] A Figura 9 mostra fotografias de emulsões de água em óleo compreendendo 70% da composição 4F e 30% da composição 5A 15 minutos depois da constituição (A) (agitada 10 vezes) e 30 minutos depois da constituição (B) (agitada 10 vezes).
[00353] Todas as emulsões preparadas ficaram estáveis por pelo menos 30 minutos. Exemplo 52 Soluções oleosas compreendendo 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2- (2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona e olesoxima
[00354] Como uma alternativa para as emulsões, é possível preparar coformulações do composto do Exemplo 20 e olesoxima por dissolução das duas substâncias medicamentosas em um solvente oleoso contendo óleo de gergelim e tensoativos lipofílicos, tais como gliceril mono-oleato (Peceol ™, Inwitor 948 ™, Capmul GMO™), gliceril mo- no-linoleato (Maisine 35-1™), mono-oleato de sorbitano (Span 80™), ou ácido oleico, para possibilitar solubilidade melhorada no solvente.
[00355] A Tabela 14 mostra um sistema solvente oleoso que pro- porciona solubilidade aumentada para ambos os fármacos e leva à estabilidade suficiente por um certo prazo de validade depois da cons-tituição como mostrado na Tabela 15. Tabela 14. Solução oleosa de 100 mg/ml de olesoxima e 10 mg/ml de 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin- 6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona. Tabela 15. Estabilidade das composições 6A e 6B em solução oleosa. Exemplo 53 Blendas em pó de veículos e estabilidade de soluções orais reconstitu-ídas a partir das mesmas
[00356] A Tabela 16 mostra blendas em pó secas granuladas de veículos adequadas para constituição de soluções orais compreendendo 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2- b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (por exemplo, 0,25 ou 1,5 mg/ml) ao pH 3,4.
[00357] Nestas composições a quantidade exata de ácido tartárico necessária para atingir o pH alvo foi usada no lugar do tampão que consiste no ácido e no sal correspondente. Foi possível demonstrar estabilidade da solução por um prazo de validade de pelo menos 17 dias, como pode ser visto a partir da Tabela 17. Tabela 16. Blendas em pó secas granuladas de veículos para consti-tuição. Tabela 17. Estabilidades de soluções orais compreendendo cerca de 0,25 mg/ml ou cerca de 1,5 mg/ml of 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)- 2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (indicado como API na tabela) em solução da Composição 7a ou 7b em veículo reconstituída com 80 ml de água para injeção. Exemplo 54 Blendas em pó de 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimi- dazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona e estabilidade das soluções orais reconstituídas a partir das mesmas
[00358] As blendas em pó secas granuladas da Composição 8a, 8b, 8c e 8d da Tabela 18 já incluem o API a fim de simplificar o procedimento de constituição para a solução. As composições 8a a 8d apresentam peso de enchimento de pó reduzido e contêm isomalte como segundo diluente para melhorar as propriedades dos grânulos. Foi possível demonstrar excelente estabilidade até um mês em solução - tanto com água para injeção como com água potável - como pode ser visto a partir da Tabela 19. Tabela 18. Blendas em pó secas granuladas para constituição de so-luções orais de 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo [1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (0,25 mg/ml ou 0,75 mg/ml) reconstituída com 80 ml de água para injeção em pH 3,4. Tabela 19. Estabilidades de soluções orais compreendendo cerca de 0,25 mg/ml de 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo [1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (indicado como API na tabela) em solução da Composição 8a em veículo reconstituída com 80 ml de água para injeção (isto é, água duplamente destilada destituída de eletrólitos) ou com água potável (compreendendo eletrólitos).

Claims (9)

1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que 7-(4,7-diazaspiro[2.5]octan-7-il)-2-(2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6- il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; em que a composição é uma solução aquosa oral ou um pó seco adequado para constituição de uma solução aquosa oral, em que a solução aquosa oral tem um pH inferior a pH 4, em que a composição farmacêutica compreende ainda: • um sistema tampão citrato, malato, maleato ou tartara- to; ou alternativamente ácido tartárico; • carga extragranular selecionada dentre lactose, amido, amido hidrolisado, maltodextrina, celulose microcristalina, manitol, sorbitol, sacarose, dextrose, fosfato de cálcio dibásico, sulfato de cálcio, e combinações dos mesmos; um diluente selecionado dentre lactose, amido, amido hidrolisado, celulose microcristalina, manitol, sorbitol, sacarose, dextrose, fosfato de cálcio dibásico, sulfato de cálcio, e combinações dos mesmos; e • um conservante selecionado dentre ácido sórbico e benzoato de sódio.
2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um antioxidante selecionado dentre ácido ascórbico.
3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um estabili- zante selecionado dentre etilenodiaminatetra-acetato dissódico.
4. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um lubrificante selecionado dentre poli(etileno glicol).
5. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende: • 1 a 10 % em peso de um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; • 5 a 15 % em peso de um sistema tampão ou alternativa mente somente o ácido correspondente de um sistema tampão; • 40 a 70 % em peso de um diluente; • 1 a 4 % em peso de um antioxidante; • 0,5 a 2 % em peso de um estabilizante; • 0,5 a 2 % em peso de um lubrificante; • 1 a 8 % em peso de um conservante, • 0 a 3 % em peso de um adoçante; e • 0 a 20 % em peso de um flavorizante; e onde a quantidade total de ingredientes não ultrapassa 100 % em peso.
6. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que compreende: • 1 a 10 % em peso de 7-(4,7-diazaespiro[2.5]octan-7-il)-2- (2,8-dimetilimidazo[1,2-b]piridazin-6-il)pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma; • 5 a 15 % em peso de um sistema tampão selecionado dentre citrato, malato, maleato ou tartarato ou alternativamente somente ácido tartárico; • 40 a 70 % em peso de um diluente selecionado dentre manitol ou uma mistura de manitol e isomalte; • 1 a 4 % em peso de ácido ascórbico; • 0,5 a 2 % em peso de edetato dissódico; • 0,5 a 2 % em peso de PEG6000; • 1 a 8 % em peso de um conservante selecionado dentre ácido sórbico ou benzoato de sódio, • 0 a 3 % em peso de um adoçante selecionado dentre su cralose ou sacarina sódica; e • 0 a 20 % em peso de um flavorizante selecionado dentre sabor morango ou sabor baunilha; e em que a quantidade total de ingredientes não ultrapassa 100 % em peso.
7. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que é uma solução aquosa oral.
8. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que é um pó seco adequado para constituição de uma solução aquosa oral.
9. Uso de um composto de fórmula I ou de uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por ser para a preparação de medicamentos para o tratamento, a prevenção, o retardamento da evolução e/ou a melhora de atrofia muscular espinhal.
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