CN108289959B - 用于治疗脊髓性肌萎缩的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含式(I)的化合物及其药用盐的药物组合物，其中A、R1、R2和R3如本文中所述。本发明还涉及包含式(I)的化合物的药物组合物的制备及其作为药物的用途。

Description

用于治疗脊髓性肌萎缩的组合物
引言
本发明提供包含作为SMN2基因剪接调节剂的化合物的药物组合物、其制备及其用于脊髓性肌萎缩(SMA)的治疗、进展延迟或改善的用途。此外，本发明的药物组合物可以任选地包含细胞保护剂(cytoprotector)。本发明还涉及SMN2基因剪接调节剂和细胞保护剂的联合使用，用于治疗或改善脊髓性肌萎缩(SMA)。
特别地，本发明涉及这样的药物组合物及其药用盐，所述药物组合物包含式(I)的化合物
Figure BDA0001658050020000011
其中A、R1、R2和R3如本文中所述。
背景
脊髓性肌萎缩(SMA)以其最广泛的含义描述了以脊髓和脑干中进行性运动神经元损伤为特征的多种遗传性和获得性中枢神经系统(CNS)疾病，其造成肌无力和肌萎缩。SMA最常见的形式是由运动神经元存活(SMN)基因中的突变所引起的，并且表现为影响从婴儿到成年人的广泛严重性(Crawford和Pardo，Neurobiol.Dis.，1996，3：97)。
婴儿SMA是这种神经退行性病症的最严重形式。症状包括肌无力、肌张力低下、哭泣无力、跛行或摔倒倾向、吮吸或吞咽困难、肺或咽喉中分泌物积累、摄食困难和对呼吸道感染敏感度提高。腿部往往比手臂更无力，并且不能达到发育标志，如抬头或坐起。一般地，症状出现得越早，寿命就越短。由于运动神经元细胞恶化，随后不久出现症状。所述疾病的严重形式是致死的，并且所有形式均无已知的治愈。SMA的进程直接与运动神经元细胞恶化速度和所导致的虚弱严重度相关。患有严重形式的SMA的婴儿由于支持呼吸的肌肉无力而经常死于呼吸道疾病。患有较轻形式的SMA的儿童存活时间较长，但是他们可能需要广泛的医疗支撑，尤其是那些处于病症谱的更严重末期的患者。SMA病症的临床谱已被分成下列五组。
(a)0型SMA(子宫内SMA)是最严重的疾病形式并且在出生前开始。通常，0型SMA的首次症状是可以首先在妊娠30至36周之间观察到的胎儿运动减少。出生后，这些新生儿很少运动并且吞咽和呼吸困难。
(b)1型SMA(婴儿SMA或韦-霍二氏病(Werdnig-Hoffmann disease))在0至6个月出现症状，该类型的SMA也是非常严重的。患者永远不能实现坐起，并且由于无呼吸支持，死亡通常发生在头2年。
(c)2型SMA(过渡SMA)的发病年龄在7-18个月。患者能够实现无支持坐起，但是无法独立站立或行走。该组的预后很大程度上依赖于呼吸相关的程度。
(d)3型SMA(青少年SMA或库-韦二氏病(Kugelberg-Welander disease))通常在18个月后确诊。3型SMA个体在疾病过程期间在某些时候能够独立行走，但是在青年或成年期间通常会依靠轮椅。
(e)4型SMA(成年发病的SMA)。无力通常在青春期晚期在舌、手或足中开始，然后发展至身体的其他区域。成年SMA的过程更缓慢并且对预期寿命没有或几乎没有影响。
已通过对染色体5q中复杂区域的连锁分析获得SMN基因图谱。在人类中，该区域含有约50万个碱基对(kb)倒转复制，从而导致产生了两种几乎相同的SMN基因拷贝。SMA是由两个染色体中基因(SMN1)的端粒拷贝的失活突变或缺失，从而导致SMN1基因功能丧失所引起的。然而，所有患者保留了基因(SMN2)的着丝粒拷贝，并且SMA患者中SMN2基因的拷贝数通常与疾病严重性负相关；即SMA不太严重的患者具有更多的SMN2拷贝。然而，由于通过外显子7中翻译沉默的C向T的突变所引起的外显子7的选择性剪接，所以SMN2不能完全补偿SMN1功能的损失。因此，由SMN2产生的大部分转录物缺乏外显子7(Δ7 SMN2)并且编码具有受损的功能并且被快速降解的截短的SMN蛋白。
SMN蛋白被认为在RNA加工和代谢中起作用，其具有良好鉴定的介导被称为snRNP的特定种类的RNA-蛋白质复合物组装的功能。在运动神经元中，SMN可以具有其他功能，然而，它在防止运动神经元选择性退化中的作用尚未得到很好的确认。
在大多数情况下，基于临床症状并且通过SMN1基因试验的至少一个拷贝的存在来诊断SMA。然而，在约5％的病例中，SMA是由除SMN1失活之外的基因突变所引起的，这些基因中的一些是已知的而其他的尚未确定。在一些情况下，当SMN1基因测试不可行或者未显示任何异常时，其他测试如肌电描记术(EMG)或肌肉活组织检查可以被指示。
目前，SMA患者的医疗护理限于支持疗法，包含呼吸、营养和康复护理；尚无已知的药物能够解决该疾病的根本病因。目前对SMA的治疗由预防和控制慢性运动单元丧失的继发作用组成。1型SMA中的主要控制问题是肺部问题的预防和早期治疗，这是大部分病例中造成死亡的原因。尽管一些患有SMA的婴儿生长至成年，但是1型SMA患者的预期寿命少于两年。
已开发了几种SMA小鼠模型。具体地，SMNΔ外显子7(Δ7 SMN)模型(Le等人，Hum.Mol.Genet.，2005，14：845)携带SMN2基因和Δ7 SMN2cDNA的几个拷贝并且再现了1型SMA的多种表型特征。Δ7 SMN模型可以用于SMN2表达研究以及运动功能和存活的评价。C/C-等位基因小鼠模型(Jackson Laboratory品系#008714，The Jackson Laboratory，BarHarbor，ME)提供了不太严重的SMA疾病模型，利用具有降低水平的SMN2全长(FL SMN2)mRNA和SMN蛋白二者的小鼠。该C/C-等位基因小鼠表型具有SMN2基因与经过选择性剪接的混合mSMN1-SMN2基因，但是不具有明显的肌无力。C/C-等位基因小鼠模型用于SMN2表达研究。
由于对SMA的遗传基础和病理生理学的了解增加，已开发了几种治疗策略，但是均尚未在临床中显示成功。
使用病毒递送载体的对SMN1的基因置换和使用分化的SMN1+/+干细胞的细胞置换已在SMA动物模型中显示出效力。在这些方法可以应用于人类之前，需要更多研究以确定安全性和免疫应答和解决在新生儿阶段开始治疗的要求。
利用合成核酸作为治疗剂：(i)靶向SMN2前mRNA中的序列元件并使剪接反应的结果转向产生全长SMN2 mRNA的反义寡核苷酸(Passini等人，Sci.Transl.Med.，2011，3：72ra18；以及Hua等人，Nature，2011，478：123)；和(ii)提供在剪接期间替换突变体片段的完全功能性RNA序列并产生全长SMN1 mRNA的反式剪接RNA分子(Coady和Lorson，JNeurosci.，2010，30：126)还实现了培养细胞中SMN2的选择性剪接的修正。
正在研究的其他方法包括寻找提高SMN水平、增强残余SMN功能或补偿其损失的药物。氨基糖苷类已显示通过促进异常终止密码子的翻译通读来增强由Δ7 SMN2 mRNA产生的稳定的SMN蛋白的表达，但是其具有较差的中枢神经系统渗透并且在反复剂量施用后是有毒的。化疗剂如阿柔比星(aclarubicin)已显示增加细胞培养物中的SMN蛋白；然而，这些药物的毒性特征阻止在SMA患者中的长期使用。正在临床研究的用于治疗SMA的一些药物包括转录激活剂如组蛋白去乙酰化酶(″HDAC″)抑制剂(例如，丁酸酯、丙戊酸和羟基脲)以及mRNA稳定剂(来自Repligen的mRNA脱帽抑制剂RG3039)，其旨在增加从SMN2基因转录的总RNA的量。然而，HDAC抑制剂或mRNA稳定剂的使用不能解决造成SMA的根本原因，并且在人类中可能导致转录和基因表达的全局性提高，这具有潜在的安全性问题。
在一种替代方法中，已选择细胞保护剂如奥利索西(Olesoxime)进行研究。这些策略的目标不在于SMN用于治疗SMA，而是已被开发以不仅保护SMN缺陷型运动神经元免于神经退化，而且保护受疾病影响的其他系统如肌肉细胞。奥利索西已在治疗2型SMA(中间SMA)和3型SMA(青少年SMA，非流动的)中显示临床功效。
已在国际专利申请WO2009/151546A1中描述了被设计成用于鉴别提高SMN的外显子7在从SMN2基因转录的RNA中包含的化合物的系统以及由此鉴别的某些苯并
Figure BDA0001658050020000041
唑和苯并异
Figure BDA0001658050020000042
唑化合物。已在国际专利申请WO2010/019236A1和WO2013/119916A2中描述了被设计成用于鉴别导致核糖体移码为由Δ7 SMN2 mRNA产生稳定化SMN蛋白的化合物以及由此鉴别的某些异二氢吲哚酮化合物。
奥利索西(胆甾-4-烯-3-酮肟，(EZ)-N-(胆甾-4-烯-3-亚基)羟胺，CAS登记号22033-87-0)是一种细胞保护药物，其已被发现通过与线粒体通透性转换孔(mPTP)相互作用促进神经元和其他细胞型在疾病相关应激条件下的功能和存活。
Figure BDA0001658050020000051
WO 20047082581(A2)描述了奥利索西用于在患者中提供神经保护的用途并且WO2008/142231(A2)描述了包含其的药物组合物。
合成d6-胆甾烯酮的肟和奥利索西的方法已经例如由Nobel prize laureateAdolf Friedrich Johann Butenandt(Butenandt A.等，Berichte der DeutschenChemischen Gesellschaft(1936)，69B，882-8)或由Ponsold K.等(Journal fuerPraktische Chemie(1964)，23(3-4)，173-6)描述。
奥利索西的作用模式、其毒性、代谢作用和药效学已描述于Martin L.J.(IDrugs(2010)13(8)：568-80)。在体内，奥利索西在新生大鼠中拯救运动神经元免于由神经损伤诱发的细胞死亡并且在成年小鼠中促进神经挤压后的神经再生。通过促进运动神经元的轴突再生和存活二者，奥利索西用于SMA的合理治疗方式。另外，存在在SMA的非临床模型中的功能改进的证据。
在分子水平，结合数据表明奥利索西与两种外线粒体膜蛋白相互作用，其看起来调控线粒体通透性转换孔复合体(mPTP)的打开。通过结合至这些蛋白，奥利索西可以保留必需的线粒体功能，如在应激神经元中的钙缓冲，由此降低细胞退化和死亡。在经受生理应激的原代神经元中、在经受蒽环类抗生素毒性的原代心肌细胞中以及在忍受Fas诱导细胞凋亡的小鼠干细胞中，观察到这些细胞保护效应。因此，奥利索西在神经元细胞以及非神经元细胞中具有减少病理学、应激诱发的细胞凋亡的潜力。因此，这些结合位点可以在奥利索西的神经、细胞和组织保护作用中起作用，因为应激诱导的线粒体功能障碍已涉及大多数神经变性疾病。在体内，利用奥利索西治疗观察到的运动神经元拯救和神经再生促进证实了奥利索西在运动神经元细胞体水平、在轴突水平二者起作用，并且潜在地对于肌肉具有保护作用(Pathak D等.J Biological Chemistry(2015)290(37)：22325-36)。
奥利索西已被开发用于治疗2型和3型SMA。奥利索西的临床开发方案旨在证实在两年的观察期内维持运动功能。奥利索西在SMA方面的临床开发包括两种临床研究，即利用硬胶囊制剂的Ib期PK和安全性研究(TRO19622CLEQ1115-1)和利用口服混悬制剂的II期研究(TRO19622CLEQ1275-1)。安慰剂对照的II期研究(TRO19622CLEQ1275-1)是当前已对此适应症进行的最大且最长时间的临床研究。该研究显示，相比于在安慰剂组中主端点的近两点下降(运动功能测量[MFM])，这与所报道的自然疾病进展一致(Vuillerot C等Arch PhysMed Rehabil(2013)94(8)：1555-61.)，在奥利索西组中在两年治疗期内维持运动功能。II期研究证实了对于奥利索西用于治疗患有2型和3型SMA的患者的正效益-风险轮廓。
尽管对SMA遗传基础和病理生理学了解取得了进展，但仍需要鉴别改变作为最具破坏性的儿童神经学疾病之一的脊髓性肌萎缩的病程的化合物和化合物组合及其合适施用形式。
发明详述
除非另外限定，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本文中所述那些类似或等效的方法和材料可以用于实施或测试本发明，但是以下描述合适的方法和材料。
本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均通过引用完整地结合。
除非另外指出，本申请中使用的命名法是基于IUPAC系统命名法。
除非另外指出，本文中的结构中的碳、氧、硫或氮原子上出现的任何开放的化合价表示氢的存在。
不管所讨论的术语单独出现还是组合出现，本文中所述的定义都适用。预期的是，本文中所述的定义可被附加以形成化学相关组合，如例如“杂环烷基芳基”、“卤代烷基杂芳基”、“芳基烷基杂环烷基”或“烷氧基烷基”。组合中最后的成员是与分子的其余部分连接的基团。组合中的其他成员以与文字顺序相反的次序附于所述结合基团，例如组合氨基-C1-7-烷基是指被氨基取代的C1-7-烷基，或者例如组合芳基烷基杂环烷基是指被烷基(其被芳基取代)取代的杂环烷基基团。
术语“部分(moiety)”是指原子或化学键合原子的基团，其通过一个或多个化学键与另一个原子或分子连接，由此形成分子的一部分。例如，式(I)的变量A、R1、R2和R3是指通过共价键与式(I)的核心结构相连的部分。
当指示取代基的数目时，术语“一个或多个”是指从一个取代基到可能的最高取代数目的范围，即由取代基取代一个氢至取代所有氢。
术语“任选的”或“任选地”意为随后描述的事件或情况可以但不必需发生，并且该描述包括事件或情况发生的情形和其不发生的情形。
术语“取代基”是指替代母体分子上的氢原子的原子或原子团。
术语“取代的”表示指定基团带有一个或多个取代基。在任何基团可以带有多个取代基并且提供多种可能的取代基的情况下，取代基可以独立选择并且不需要是相同的。术语“未取代的”是指所指定的基团不带有取代基。术语“任选地取代的”是指所指定的基团是未取代的或被一个或多个独立地选自可能的取代基的组的取代基取代。当表示取代基的数目时，术语“一个或多个”意味着从一个取代基到可能的最大取代数，即由取代基取代一个氢至取代所有氢。
术语“此发明的化合物”和“本发明的化合物”是指如本文中所公开的化合物及其立体异构体、互变异构体、溶剂化物和盐(例如，药用盐)。
当本发明的化合物是固体时，本领域技术人员理解的是，这些化合物及其溶剂化物和盐可以以不同固体形式(特别是不同晶形)存在，所有这些形式都预期在本发明和指定的分子式的范围内。
术语“药用盐”是指这样的盐，其在生物学或其他方面不是不合需要的。药用盐包括酸和碱加成盐。
术语“药用酸加成盐”是指这样的药用盐，所述药用盐利用无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、碳酸、磷酸以及选自脂肪族、脂环族、芳香族、芳脂族、杂环、羧酸和磺酸类型的有机酸中的有机酸比如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、葡糖酸、乳酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、天冬氨酸、抗坏血酸、谷氨酸、邻氨基苯甲酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、双羟萘酸、苯乙酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸和水杨酸形成。
术语“药用碱加成盐”是指与有机或无机碱形成的那些药用盐。可用无机碱的实例包括钠盐、钾盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐和铝盐。源自药用有机无毒性碱的盐包括如下各项的盐：伯胺、仲胺和叔胺，取代的胺，包括天然存在的取代的胺，环胺和碱性离子交换树脂，比如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙基氨基乙醇、三甲胺、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶和聚胺树脂。
本文中使用的立体化学定义和约定一般按照S.P.Parker，Ed.，McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(McGraw-Hill化学术语词典)(1984)McGraw-Hill BookCompany，New York；以及Eliel，E.和Wilen，S.，“Stereochemistry of Organic Compounds(有机化合物的立体化学)”，John Wiley&Sons，Inc.，New York，1994。在描述具有旋光性的化合物时，前缀D和L或R和S用于指示分子关于其手性中心的绝对构型。与研究中的手性中心相连的取代基根据Cahn、Ingold和Prelog顺序法则排序。(Cahn等人，Angew.Chem.Inter.Edit.1966，5，385；勘误表511)。前缀D和L或(+)和(-)被用于指明化合物的平面偏振光的旋转标志，其中(-)或L指示化合物是左旋的。具有前缀(+)或D的化合物是右旋的。
术语“手性中心”是指与四个不相同的取代基结合的碳原子。术语“手性的”是指与镜像不能重叠，而术语“非手性的”是指可与其镜像重叠的情况。手性分子具有光学活性，即，其能够使面偏振光的平面旋转。
本发明的化合物可以具有一个或多个手性中心并且可以以光学纯的对映异构体、对映异构体的混合物如例如外消旋物、光学纯的非对映异构体、非对映异构体的混合物、非对映异构外消旋物或非对映异构外消旋物的混合物的形式存在。当化学结构中存在手性中心时，意欲的是，本发明包括与所述手性中心相关的所有立体异构体。
术语“卤代”、“卤素”和“卤化物”在本文中可互换地使用并且是指氟、氯、溴或碘。卤素的一个具体实例是氟。
术语“烷基”表示1至12个碳原子的一价直链或支链饱和烃基。在特别的实施方案中，烷基具有1至7个碳原子，并且在更特别的实施方案中具有1至4个碳原子。烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基。烷基的特别实例是甲基和乙基。
术语“卤代烷基”表示烷基，其中所述烷基的至少一个氢原子已被相同或不同的卤素原子(特别是氟原子)替代。卤代烷基的实例包括一氟-、二氟-或三氟-甲基、-乙基或-丙基，例如3，3，3-三氟丙基、2-氟乙基、2，2，2-三氟乙基、氟甲基或三氟甲基等。术语“全卤代烷基”表示这样的烷基，其中所述烷基的全部氢原子已被相同或不同的卤素原子替代。
术语“二环的环体系”表示经由共同的单或双键彼此稠合的两个环(环状的(annelated)二环的环体系)，经由三个以上的共同原子的序列彼此稠合的两个环(桥连的二环的环体系)或经由单个共同原子彼此稠合的两个环(螺二环的环体系)。二环的环体系可以是饱和的、部分不饱和的、不饱和的或芳族的。二环的环体系可以包含选自N、O和S的杂原子。
术语“环烷基”是指具有3至10个环碳原子的饱和单环或二环烃基。在特别的实施方案中，环烷基是指具有3至8个环碳原子的一价饱和单环烃基。二环是指由两个共有一个或多个碳原子的饱和碳环组成。特别的环烷基是单环的。单环的环烷基的实例是环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基。二环的环烷基的实例是二环[2.2.1]庚基或二环[2.2.2]辛基。环烷基的一个特别的实例是环丙基。
术语“杂环烷基”表示3至9个环原子的饱和或部分不饱和单环、二环或三环的环体系，其包含1、2或3个选自N、O和S的环杂原子，其余的环原子是碳。在特别的实施方案中，杂环烷基是4至7个环原子的一价饱和单环环体系，其包含1、2或3个选自N、O和S的环杂原子，其余的环原子是碳。单环的饱和杂环烷基的实例有氮杂环丙基、氧杂环丙基、氮杂环丁基、氧杂环丁基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢-噻吩基、吡唑烷基、咪唑烷基、
Figure BDA0001658050020000101
唑烷基、异
Figure BDA0001658050020000102
唑烷基、噻唑烷基、哌啶基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、1，1-二氧代-硫代吗啉-4-基、氮杂环庚基、二氮杂环庚基、高哌嗪基或氧杂氮杂环庚基。二环的饱和杂环烷基的实例有8-氮杂-二环[3.2.1]辛基、奎宁环基、8-氧杂-3-氮杂-二环[3.2.1]辛基、9-氮杂-二环[3.3.1]壬基、3-氧杂-9-氮杂-二环[3.3.1]壬基或3-硫杂-9-氮杂-二环[3.3.1]壬基。部分不饱和的杂环烷基的实例有二氢呋喃基、咪唑啉基、二氢-
Figure BDA0001658050020000103
唑基、四氢-吡啶基或二氢吡喃基。杂环烷基的具体实例是1，4-二氮杂环庚基、六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪基、哌啶基、哌嗪基和吡咯烷基。杂环烷基的更具体实例是六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪基和哌嗪基。
术语“N-杂环烷基”是指含至少一个氮环原子的杂环烷基，并且其中杂环烷基与分子的其余部分的连接点是通过氮环原子。N-杂环烷基的具体实例是1，4-二氮杂环庚基、六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪基、哌啶基、哌嗪基和吡咯烷基。N-杂环烷基的更具体实例是六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪基和哌嗪基。
本文中涉及化合物的术语“碱度”被表示为负的共轭酸的酸度常数的十进制对数(pKa＝-log Ka)。共轭酸的pKa越大，碱越强(pKa+pKb＝14)。在本申请中，如果原子或官能团适于接受质子并且如果计算的其共轭酸的pKa至少是7，更特别地如果计算的其共轭酸的pKa至少是7.8，最特别地如果计算的其共轭酸的pKa至少是8，则所述原子或官能团被标为“碱性”。pKa值通过电脑(in-silico)计算，如F.Milletti等人，J.Chem.Inf.Model(2007)47：2172-2181中所述。
术语“亚烷基”表示1至7个碳原子的直链饱和二价烃基或3至7个碳原子的二价支链饱和烃基。亚烷基的实例包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、2-甲基亚丙基、亚丁基、2-乙基亚丁基、亚戊基、亚己基。亚烷基的特别实例是亚乙基、亚丙基和亚丁基。
术语“氨基”是指式-NR’R”的基团，其中R’和R”独立地是氢、烷基、烷氧基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基或如本文中所述。备选地，R’和R”与它们所连接的氮一起可以形成杂环烷基。术语“伯氨基”是指这样的基团，其中R’和R”都是氢。术语“仲氨基”是指这样的基团，其中R’是氢并且R”是除氢以外的基团。术语“叔氨基”是指这样的基团，其中R’和R”都不是氢。特别的仲胺和叔胺是甲胺、乙胺、丙胺、异丙胺、苯胺、苄胺、二甲胺、二乙胺、二丙胺和二异丙胺。
术语“活性药物成分”(或“API”)表示药物组合物中具有特别生物学活性的化合物或分子。
术语“药物组合物”和“药物制剂”(或“制剂”)可互换地使用并且是指被施用于有需要的哺乳动物(例如，人)的包含治疗有效量的活性药物成分以及药用赋形剂(excipient)的混合物或溶液。
术语“药用”表示可用于制备药物组合物的材料的属性，即通常是安全的，无毒性，并且在生物学和其他方面不是不合需要的，并且可用于兽医以及人类药物用途。
术语“药用赋形剂”、“药用载体”和“治疗惰性赋形剂”可互换地使用并且是指药物组合物中不具有治疗活性并且对施用对象无毒性的任何药用成分，如用于配制药物产品的崩解剂、粘合剂、填充剂、溶剂、缓冲剂、张力剂、稳定剂、抗氧化剂、表面活性剂、载体、稀释剂或润滑剂。
术语“个体”或“受治者”是指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，驯养动物(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)、兔和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，所述个体或受治者是人。
术语“治疗有效量”是指本发明的化合物或分子当施用于受治者时(i)治疗或预防特定疾病、病症或障碍，(ii)消弱、改善或消除特定疾病、病症或障碍的一种或多种症状，或(iii)预防或延迟本文中所述的特定疾病、病症或障碍的一种或多种症状的发生的量。治疗有效量将根据所述化合物、治疗的疾病状态、治疗的疾病的严重性、受治者的年龄和相对健康、给药途径和形式、主治医生或兽医的判断及其他因素而变化。
术语疾病状态的“治疗”包括抑制所述疾病状态，即，阻止所述疾病状态或其临床症状的发展，或减轻所述疾病状态，即，使得所述疾病状态或其临床症状暂时或永久性的退去。
术语“脊髓性肌萎缩”(或SMA)是指由两个染色体上SMN1基因的失活突变或缺失，从而导致SMN1基因功能丧失引起的疾病。
SMA的症状包括肌无力、肌张力低下、哭泣无力、咳嗽无力、跛行或摔倒倾向、吮吸或吞咽困难、呼吸困难、肺或咽喉中分泌物积累、用汗手紧握的拳头、舌头颤动/振动、常常倾向一侧的头部(即使在躺下时)、倾向于弱于臂部的腿部、经常呈“蛙腿”位置的腿部、摄食困难、对呼吸道感染敏感度提高、肠/膀胱无力、低于正常的体重、不能无支撑坐立、不能行走、不能爬行、和张力减退、反射消失、以及与前角细胞丧失相关的多发性先天性挛缩(关节挛缩)。
术语“治疗脊髓性肌萎缩(SMA)”或“脊髓性肌萎缩(SMA)的治疗”包括以下效果中的一个或多个：(i)减小或改善SMA的严重度；(ii)延迟SMA的发作；(iii)抑制SMA的进展；(iv)减少受治者入院；(v)减少受治者的入院时长；(vi)增加受治者的存活；(vii)提高受治者的生活质量；(viii)减少SMA相关症状的数目；(ix)减小或改善与SMA相关的一种或多种症状的严重度；(x)缩短与SMA相关的症状的持续时间；(xi)防止与SMA相关的症状的复发；(xii)抑制SMA症状的发展或发作；和/或(xiii)抑制与SMA相关的症状的进展。
更特别的，术语“治疗SMA”表示以下有益效果中的一种或多种：(i)减小肌力损伤；(ii)增加肌力；(iii)减少肌萎缩；(iv)减少运动功能丧失；(v)增加运动神经元；(vii)减少运动神经元损失；(viii)使SMN不足的运动神经元免于退化；(ix)提高运动功能；(x)提高肺功能；和/或(xi)减小肺功能丧失。
更详细地，术语“治疗SMA”是指人类婴儿或人类幼童无辅助坐立或人类婴儿、人类幼童、人类儿童或人类成人无辅助站立、无辅助行走、无辅助奔跑、无辅助呼吸、睡眠期间无辅助翻身或无辅助吞咽的功能性能力或所述功能性能力的保持。
术语“产生全长SMN2小基因mRNA的EC1.5x浓度”(或“EC1.5x小基因”)被定义为有效地使全长SMN2小基因mRNA的量提高至与载体处理的细胞中的水平相比的1.5倍水平的测试化合物的浓度。
术语“SMN蛋白表达的EC1.5x浓度”(或“EC1.5xSMN蛋白”)被定义为在SMA患者成纤维细胞中有效地产生与由载体对照产生的量相比的1.5倍量的SMN蛋白的测试化合物的浓度。
术语“半最大有效浓度”(EC50)是指用于在体内获得特定作用的最大值的50％所需的特定化合物或分子的血浆浓度。
“药用载体”是指药物组合物中除了活性成分之外的成分，其对于受试者是无毒的。药用载体包括但不限于缓冲剂、酸化剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
术语“缓冲剂”或“缓冲体系”是指使药物制剂的pH稳定的药用赋形剂或赋形剂混合物。合适的缓冲剂在本领域是已知的并且可以在文献中找到。特别的药用缓冲剂包括柠檬酸缓冲剂、苹果酸盐缓冲剂、马来酸盐缓冲剂或酒石酸盐缓冲剂，更特别地是酒石酸盐缓冲剂。本发明的特别缓冲体系是有机酸及其所选盐的组合，例如柠檬酸三钠和柠檬酸、苹果酸和苹果酸钠、酒石酸钠钾和酒石酸或酒石酸二钠和酒石酸，特别地酒石酸钠钾和酒石酸。备选地，有机酸(特别地酒石酸)可以单独采用作为“酸化剂”来代替酸和相应盐的组合。独立于所使用的缓冲剂，pH可以用本领域已知的酸或碱进行调节，例如盐酸、乙酸、磷酸、硫酸和柠檬酸，氢氧化钠和氢氧化钾。具体的酸化剂是酒石酸。
术语“抗氧化剂”是指防止活性药物成分氧化的药用赋形剂。抗氧化剂包括抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、甲硫氨酸、柠檬酸、EDTA。
术语“表面活性剂”是指被用来保护蛋白组合物免于机械应力如搅拌和剪切的药用赋形剂。药用表面活性剂的实例包括泊洛沙姆、聚山梨醇酯、聚氧乙烯烷基醚
Figure BDA0001658050020000131
烷基苯基聚氧乙烯醚
Figure BDA0001658050020000132
或十二烷基硫酸钠(SDS)。
术语“泊洛沙姆(poloxamer)“是指由聚(环氧丙烷)(PPO)的中心疏水链和两个侧悬的聚(环氧乙烷)(PEO)的亲水链组成的非离子三嵌段共聚物，各个PPO或PEO链可以具有不同的分子量。已知的泊洛沙姆还有商品名Pluronics。具体的泊洛沙姆是泊洛沙姆188、其中PPO链的分子量为1800g/mol且PEO含量为80％(w/w)的泊洛沙姆。
术语“聚山梨醇酯(polysorbate)”是指山梨糖醇的油酸酯及其酸酐，典型地与环氧乙烷共聚合。具体的聚山梨醇酯是聚山梨酯20(聚(环氧乙烷))(20)失水山梨糖醇单月桂酯，TWEEN
Figure BDA0001658050020000142
)或聚山梨酯80(聚(环氧乙烷)(80)失水山梨糖醇单月桂酯，TWEEN
Figure BDA0001658050020000143
)。
“亲水亲油平衡”(HLB)值是指非离子型表面活性剂的亲水性程度。HLB值通过该表面活性剂的亲水部分的分子量和其总体分子量之间的比率来确定，如由Griffin W.C.，Journal of the Society of Cosmetic Chemists(1949)1：311所描述的。
术语“亲水的”是指分子或分子的一部分与极性溶剂，特别是与水，或者与由氢键、偶极离子相互作用和/或偶极-偶极相互作用驱动的其他极性部分发生相互作用的能力。
术语“亲油的”和“疏水的”可以互换使用并且是指分子或分子的一部分溶解在非极性环境如脂肪、油以及由伦敦分散力(London dispersion force)驱动的非极性溶剂中的趋势。
“logP”值是指分配系数P的十进制对数并且是中性不带电荷化合物的亲油性的量度。在本申请中，分配系数P通过处于平衡时在有机相特别是1-辛醇中的溶质的浓度和其在水相中的浓度之间的比率确定。
式(I)的化合物
详细地，本发明涉及一种包含式(I)的化合物的药物组合物
Figure BDA0001658050020000141
其中
R1是氢或C1-7-烷基；
R2是氢、氰基、C1-7-烷基、C1-7-卤代烷基或C3-8-环烷基；
R3是氢、C1-7-烷基或C3-8-环烷基；
A是N-杂环烷基或NR12R13，其中N-杂环烷基包含1或2个氮环原子并且任选地被1、2、3或4个选自R14的取代基取代；
R12是包含1个氮环原子的杂环烷基，其中杂环烷基任选地被1、2、3或4个选自R14的取代基取代；
R13是氢、C1-7-烷基或C3-8-环烷基；
R14独立地选自氢、C1-7-烷基、氨基、氨基-C1-7-烷基、C3-8-环烷基和杂环烷基，或者两个R14一起形成C1-7-亚烷基；
条件是：如果A是仅包含1个氮环原子的N-杂环烷基，则至少一个R14取代基是氨基或氨基-C1-7-烷基；
或其药用盐；
其中所述组合物是口服水溶液或适用于构建口服水溶液的干粉。
本发明的一个特别实施方案是包含式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物。
此外，应理解，涉及如本文中公开的具体A、R1、R2或R3的每一个实施方案可以与涉及如本文中公开的另外的A、R1、R2或R3的任何其他实施方案进行组合。
在本发明的一个特别实施方案中：
R1是氢或C1-7-烷基；
R2是氢、氰基、C1-7-烷基、C1-7-卤代烷基或C3-8-环烷基；
R3是氢、C1-7-烷基或C3-8-环烷基；
A是包含1或2个氮环原子的N-杂环烷基，其中N-杂环烷基任选地被1、2、3或4个选自R14的取代基取代；
R14独立地选自氢、C1-7-烷基、氨基、氨基-C1-7-烷基、C3-8-环烷基和杂环烷基，或者两个R14一起形成C1-7-亚烷基；
条件是：如果A是仅包含1个氮环原子的N-杂环烷基，则至少一个R14取代基是氨基或氨基-C1-7-烷基。
在本发明的一个特别实施方案中，R1是C1-7-烷基，特别是甲基。
在本发明的一个特别实施方案中，R2是氢或C1-7-烷基，特别是氢或甲基。
在本发明的一个特别实施方案中，R3是氢或C1-7-烷基，特别是氢或甲基。
在本发明的一个特别实施方案中，R12是任选被1、2、3或4个选自R14的取代基取代的哌啶基。
在本发明的一个特别实施方案中，R13是氢或C1-7-烷基，特别是氢或甲基。
在本发明的一个特别实施方案中，R14独立地选自C1-7-烷基和杂环烷基，或者两个R14一起形成C1-7-亚烷基。
在本发明的一个特别实施方案中，R14独立地选自甲基、乙基和吡咯烷基，或者两个R14一起形成亚乙基。
在本发明的一个特别实施方案中，A是含有1或2个氮原子的饱和单环或二环N-杂环烷基，并且任选地被1、2、3或4个选自R14的取代基取代。
在本发明的一个特别实施方案中，如本文中所定义的A中的N-杂环烷基或R12中的杂环烷基被1或2个选自R14的取代基取代。
在本发明的一个特别实施方案中，如本文中所定义的A中的N-杂环烷基的特征还在于：一个环氮原子是碱性的。
在本发明的一个特别实施方案中，A是
Figure BDA0001658050020000161
其中
X是N或CH；
R4是氢、C1-7-烷基或-(CH2)m-NR9R10；
R5是氢或C1-7-烷基；
R6是氢或C1-7-烷基；
R7是氢或C1-7-烷基；
R8是氢或C1-7-烷基；
R9和R10独立地选自氢、C1-7-烷基和C3-8-环烷基；
R13是氢、C1-7-烷基或C3-8-环烷基；
n为0、1或2；
m为0、1、2或3；
或者R4和R5一起形成C1-7-亚烷基；
或者R4和R7一起形成C1-7-亚烷基；
或者R5和R6一起形成C2-7-亚烷基；
或者R5和R7一起形成C1 - 7-亚烷基；
或者R5和R9一起形成C1-7-亚烷基；
或者R7和R8一起形成C2-7-亚烷基；
或者R7和R9一起形成C1-7-亚烷基；
或者R9和R10一起形成C2-7-亚烷基；
条件是，如果X是CH则R4是-(CH2)m-NR9R10；并且
条件是，如果X是N并且R4是-(CH2)m-NR9R10，则m为2或3.
已发现，当R4、R5、R6、R7和R8中的至少一个不是氢时，脑穿透得到提高。
在本发明的一个特别实施方案中，R4、R5、R6、R7和R8中的至少一个不是氢。
在本发明的一个特别实施方案中，X是N。
在本发明的一个特别实施方案中，n为1。
在本发明的一个特别实施方案中，R4是氢、甲基或-(CH2)m-NR9R10，更特别地是氢。
在本发明的一个特别实施方案中，R5是氢、甲基或乙基，更特别地是甲基。
在本发明的一个特别实施方案中，R6是氢或甲基，更特别地是氢。
在本发明的一个特别实施方案中，R7是氢或甲基。
在本发明的一个特别实施方案中，R8是氢。
在本发明的一个特别实施方案中，m为0。
在本发明的一个特别实施方案中，R4和R5一起形成亚丙基。
在本发明的一个特别实施方案中，R5和R6一起形成亚乙基；
在本发明的一个特别实施方案中，R9和R10一起形成亚丁基。
在本发明的一个特别实施方案中，A选自由以下各项组成的组：
Figure BDA0001658050020000181
其中R4、R5、R6、R7、R8和R13如本文中所定义并且其中R11是氢或C1-7-烷基。
在本发明的一个特别实施方案中，A选自哌嗪基、二氮杂环庚烷基、吡咯烷基和六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪基的组，各自任选地被1、2、3或4个选自如本文中所定义的R14的取代基取代。
在本发明的一个特别实施方案中，A选自哌嗪-1-基、1，4-二氮杂环庚烷-1-基、吡咯烷-1-基和六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-2(1H)-基的组，各自任选地被1或2个选自如本文中所定义的R14的取代基取代。
在本发明的一个特别实施方案中，A是NR12R13，其中R12和R13如本文中所述。
在本发明的一个特别实施方案中，A选自由以下各项组成的组：
Figure BDA0001658050020000191
在本发明的一个特别实施方案中，R1是甲基，R2是氢或甲基，R3是氢并且A是
Figure BDA0001658050020000192
在本发明的一个特别实施方案中，R1是甲基，R2是甲基，R3是氢并且A是
Figure BDA0001658050020000193
在本发明的一个特别实施方案中，式(I)的化合物选自由以下各项组成的组：
2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-[(8aR)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-[(8aS)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-[(8aR)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-[(8aS)-8a-甲基-1，3，4，6，7，8-六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-[(8aR)-8a-甲基-1，3，4，6，7，8-六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3S，5R)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-(1，4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-(1，4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-[(3R，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-[(8aS)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-[(8aS)-8a-甲基-1，3，4，6，7，8-六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-[(8aR)-8a-甲基-1，3，4，6，7，8-六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3R)-3-吡咯烷-1-基吡咯烷-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3R)-3-吡咯烷-1-基吡咯烷-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-(3，3-二甲基哌嗪-1-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-(3，3-二甲基哌嗪-1-基)-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-9-甲基-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-9-甲基-7-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3R，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-9-甲基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-(3，3-二甲基哌嗪-1-基)-9-甲基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-9-甲基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3S，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3S)-3-吡咯烷-1-基吡咯烷-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3S)-3-吡咯烷-1-基吡咯烷-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-[(3S，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-[(3R，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-(3，3-二甲基哌嗪-1-基)-9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-[(3S，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-[(3R)-3-乙基哌嗪-1-基]-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
及其药用盐。
在本发明的一个特别实施方案中，式(I)的化合物选自由以下各项组成的组：
7-[(8aR)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-[(8aS)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-[(8aR)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3S，5R)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-[(3R，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-[(8aS)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-9-甲基-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-9-甲基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-[(3R，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；
及其药用盐。
本发明的特别的式(I)的化合物是7-[(8aR)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮或其药用盐。
本发明的一个特别实施方案涉及包含7-[(8aR)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮或其药用盐的药物组合物。
本发明的特别的式(I)的化合物是7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮或其药用盐。
本发明的一个特别实施方案涉及包含7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮或其药用盐的药物组合物。
制备方法
如上所定义的式(I)的化合物及其药用盐可以按照本领域中已知的标准方法制备。
如方案1中举例说明的，将商购可得的式(II)的氨基-吡啶与丙二酸酯反应以提供式(III)的中间体，其中Y和R3如本文中所定义并且R是C1-2-烷基，特别是甲基。然后将式(III)的化合物与氯化试剂(如POCl3等)反应以提供式(IV)的化合物。然后在催化剂(如(1，1′-二(二苯基膦基))二茂铁)二氯化钯(II)(Pd(dppf)Cl2)等)和碱(如K2CO3等)存在下，在合适溶剂(如DMF等)中，将式(IV)的化合物在Suzuki交叉偶联反应中与式(V)的化合物反应，其中R1和R2如本文中所定义并且Z是B(OH)2或C1-7-烷基硼酸酯如4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基，以提供式(VI)的化合物。最后，在溶剂(例如二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)或二甲基甲酰胺(DMF))中，将式(VI)的化合物在以下a)或b)中与化合物M-A反应：
a)芳族亲核取代反应(特别是如果Y是氟)，通过在80℃至200℃的温度加热而进行；或
b)Buchwald-Hartwig胺化反应，在钯催化剂(例如四(三苯基膦)钯(Pd(PPh3)4)或二(二亚苄基丙酮)钯(Pd(dba)2)存在下，通过在20℃至100℃的温度加热而进行；
得到式(I)的化合物，其中A如本文中所定义，M是氢、钠或钾，特别是氢，并且其中M经由A的氮原子连接至A。
Figure BDA0001658050020000241
方案1.
在一个实施方案中，本发明涉及用于制备如上所定义的式(I)的化合物及其药用盐的方法，所述方法包括在溶剂(例如二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)或二甲基甲酰胺(DMF))中，式(VI)的化合物与化合物M-A在以下a)或b)中的反应：
a)芳族亲核取代反应(特别是如果Y是氟)，通过在80℃至200℃的温度加热而进行；或
b)Buchwald-Hartwig胺化反应中，在钯催化剂(例如四(三苯基膦)钯(Pd(PPh3)4)或二(二亚苄基丙酮)钯(Pd(dba)2)存在下，通过在20℃至100℃的温度加热而进行；
其中A、Y、R1、R2和R3如本文中所定义，M是氢、钠或钾，特别是氢，并且其中M经由A的氮原子连接至A。
Figure BDA0001658050020000251
本发明的一个特别实施方案涉及用于制备如上所定义的式(I)的化合物及其药用盐的方法，所述方法包括在如上述的式(VI)的化合物与式M-A的化合物之间的芳族亲核取代反应通过在溶剂中加热而进行，其中A、R1、R2、R3和Y如上所定义，M是氢、钠或钾，并且其中M经由A的氮原子连接至A。
本发明的一个特别实施方案涉及用于制备如上所定义的式(I)的化合物及其药用盐的方法，其中所述芳族亲核取代反应在80℃至200℃的温度进行。
本发明的一个特别实施方案涉及用于制备如上所定义的式(I)的化合物及其药用盐的方法，其中所述芳族亲核取代反应的溶剂选自二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)和二甲基甲酰胺(DMF)。
本发明的一个特别实施方案涉及用于制备如上所定义的式(I)的化合物及其药用盐的方法，其中M是氢。
特别地，式(I)的化合物及其药用盐可以根据本文中的实施例中所述的方法制备。
医药用途
如上所述的，式(I)的化合物及其药用盐具有有价值的药理学性质并且被发现增强SMN1和/或SMN2的外显子7包含到由SMN1和/或SMN2基因转录的mRNA中，由此增加SMN蛋白在有此需要的人受治者中的表达。
本发明的化合物可以单独地或与其他药物组合地用于由SMN1基因的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能丧失或缺陷相关的疾病的治疗、预防、延迟进展和/或改善。这些疾病包括但不限于脊髓性肌萎缩(SMA)。
本发明的一个特别实施方案涉及包含如上所定义的式(I)的化合物或其药用盐和一种或多种药用赋形剂的药物组合物，其用于由SMN1基因中的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能损失或缺陷相关的疾病的治疗、预防、延迟进展和/或改善，特别是用于SMA的治疗、预防、延迟进展和/或改善。
本发明的一个特别实施方案涉及包含如上所定义的式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物，其用作治疗活性物质，尤其是用作用于由SMN1基因中的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能损失或缺陷相关的疾病的治疗、预防、延迟进展和/或改善，特别是用于脊髓性肌萎缩(SMA)的治疗、预防、延迟进展和/或改善的治疗活性物质。
本发明的一个特别实施方案涉及包含如上所定义的式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物，其用于由SMN1基因中的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能损失或缺陷相关的疾病的治疗、预防、延迟进展和/或改善，特别是用于脊髓性肌萎缩(SMA)的治疗、预防、延迟进展和/或改善。
本发明的一个特别实施方案涉及用于由SMN1基因中的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能损失或缺陷相关的疾病的治疗、预防、延迟进展和/或改善，特别是用于脊髓性肌萎缩(SMA)的治疗、预防、延迟进展和/或改善的方法，所述方法包括向受试者施用包含如上所定义的式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物。
本发明的一个特别实施方案涉及包含如上所定义的式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物用于由SMN1基因中的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因的损失或缺陷相关的疾病的治疗、预防、延迟进展和/或改善，特别是用于脊髓性肌萎缩(SMA)的治疗、预防、延迟进展和/或改善的用途。
本发明的一个特别实施方案涉及包含如上所定义的式(I)的化合物或其药用盐用于制备药物的用途，所述药物用于由SMN1基因中的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能损失或缺陷相关的疾病的治疗、预防、延迟进展和/或改善，特别是用于脊髓性肌萎缩(SMA)的治疗、预防、延迟进展和/或改善。这样的药物包含如上所定义的式(I)的化合物或其药用盐。
组合
细胞保护剂(如奥利索西)和SMN2基因剪接调节剂(如式(I)的化合物)是用于治疗脊髓性肌萎缩(SMA)的互补方式。存在支持性证据表明，作为联合治疗的细胞保护剂和SMN2基因剪接调节剂的一起施用将对所有类型的SMA患者提供额外的益处。增加的益处的程度可以通过在SMA小鼠模型中联合治疗的研究而量化。
本发明的具体SMN2基因剪接调节剂是如本文所述的式(I)的化合物或其药用盐。
本发明的一种具体细胞保护剂是奥利索西。
全身性低水平的SMN蛋白引起SMA。脊髓的α-运动神经元被认为在此遗传性病症中是特别易受攻击的，并且它们的功能障碍和损失引起进行性肌无力、瘫痪并且最终地受侵袭个体的过早死亡。历史上，SMA因此被认为是一种运动神经元-自发疾病。然而，正常小鼠的运动神经元中的SMN的耗减仅引发非常温和的表型(Park等，J Neurosci.2010Sep 8；30(36)：12005-19)。相反，在SMA小鼠模型中SMN向运动神经元的回复对于SMA表型和存活仅具有最温和的效应(Hua等Nature.2011年，10月5日；478(7367)：123-6)。集中地，这些结果表明，另外的细胞型对SMA的发病机理有贡献，并且理解非自发的要求对于开发有效疗法是关键的。
当前的研究指向作为多细胞、多组织、多系统病症的SMA。存在多种体外、体内研究，以及人类情形研究，其显示在SMA中多种多样的组织受影响，如：传入神经，肌肉，脉管系统，大脑，心脏和胰腺(Hamilton和Gillingwater等，Trends MolMed.2013年1月；19(1)：40-50。例如，存在显示SMA中的肌肉固有缺陷的大量研究结果，表明SMN在肌肉发育和再生中起作用(Boyer等，Front Physiol.2013年12月18日；4：356.；Hayhurst M等.，Dev Biol.2012年8月15日；368(2)：323-34；Briccino等，Hum MolGenet.2014，年9月15日；23(18)：4745-57.；Shafey等，Exp Cell Res.2005年11月15日；311(1)：49-61.，Cifuentes-Diaz等，JCell Biol.2001年，3月5日；152(5)：1107-14.；Martinez等J Neurosci.2012年，6月20日；32(25)：8703-15。这突显了肌肉靶向治疗对于SMA患者的重要性。许多治疗策略靶向恢复SMN蛋白。反义寡核苷酸和基因疗法潜在治疗仅靶向在CNS组织中增加SMN。对其他关键关键的受影响细胞和组织的有效靶向治疗仍存在挑战。
细胞保护剂奥利索西和式(I)的SMN2基因剪接调节剂二者可以经口施用并且全身分布。此外，它们具有互补的作用机制。奥利索西是通过保存线粒体膜并且防止线粒体功能障碍(SMA中的疾病病理生理学的重要要素)的细胞保护剂。线粒体在耗能细胞中是特别充足的，所述耗能细胞如运动神经元和肌肉细胞，二者被鉴别为SMA中的钯治疗组织。式(I)的SMN2基因剪接调节剂靶向全身增加SMN蛋白。
式(I)的SMN2基因剪接调节剂通过校正SMN前-mRNA的错剪接而在RNA水平校正SMN蛋白。SMA运动神经元和成纤维细胞上述未处理细胞中在SMN蛋白方面的最大增加导致两种细胞型中的类似增加(60-80％)。此外，在SMA的重度和轻度模型二者中，用式(I)的SMN2基因剪接调节剂处理的小鼠在SMN蛋白方面具有增加，在杂合型小鼠中达到大约43％(脑)和55％(肌肉)的蛋白水平。蛋白的增加足以提供实质性益处(在神经肌肉接头(NMJ)处恢复连通性并且对于用式(I)的化合物处理的重度小鼠的存活提供实质性益处。假定蛋白的增加没有校正至100％的杂合型小鼠或野生型小鼠，则可合理地认为利用共同处理，尤其是对疾病发病机制的其他机制靶向的处理可能存在额外的改善。
体外结合研究和氧化应激测定表明，细胞保护剂奥利索西在其中存在线粒体功能障碍(SMA)的证据的疾病中保存线粒体膜，由此防止细胞死亡。体外荧光成像实验显示，奥利索西在神经元中在线粒体的膜水平积累。另外，在奥利索西处理的SOD1小鼠(重度家族性ALS模型)中，当早期治疗时神经肌肉接头(NMJ)被保持。因此，奥利索西通过线粒体和细胞保护机制可以提供额外且互补的益处。
细胞保护剂奥利索西和式(I)的SMN2基因剪接调节剂的联合处理的额外益处正在SMA的轻度小鼠模型中确认。该轻度模型通过用低剂量的SMN剪接调节剂处理重度SMA Δ7小鼠模型产生。在该研究中，细胞保护剂奥利索西和式(I)的SMN2基因剪接调节剂单独和组合地进行测试。处理对小鼠NMJ的影响是这些研究的主要评估指标，前提是此表型的重要性。还评价了肌肉组织中的氧化应激标记物。
式(I)的化合物或其药用盐可以与奥利索西在一个单一药物组合物(例如固定剂量组合)中组合，或者式(I)的化合物或其药用盐和奥利索西可以相继地依次联合施用。
如本文中所述的，式(I)的化合物和奥利索西的联合施用可以具有这样的有益和协同效应，其用于由SMN1基因中的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能损失或缺陷相关的疾病的治疗、预防、延迟进展和/或改善，并且另外地用于保护在所述疾病的病理生理学中涉及的细胞，特别是用于脊髓性肌萎缩(SMA)的治疗、预防、延迟进展和/或改善。
在本发明的上下文中，术语两种API的“联合施用(co-administration)”可以是同时的、几乎同时的或在时间上延迟几天或几周，例如延迟多至4或5周。
本发明的化合物可以与细胞保护剂如奥利索西联合使用，其用于由SMN1基因中的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能损失或缺陷相关的疾病的治疗、预防、延迟进展和/或改善，并且另外地用于保护在所述疾病的病理生理学中涉及的细胞。这些疾病包括但不限于脊髓性肌萎缩(SMA)。
在一个特别实施方案中，本发明将显示式(I)的化合物与奥利索西的组合单独地或以其组合在由SMN1基因中的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能损失或缺陷相关的疾病的治疗、预防、延迟进展和/或改善，并且另外地用于保护在所述疾病的病理生理学中涉及的细胞，特别是用于脊髓性肌萎缩(SMA)的治疗、预防、延迟进展和/或改善方面的协同效应。
本发明的一个特别实施方案涉及包含式(I)的化合物或其药用盐和奥利索西以及一种或多种药用赋形剂的药物组合物，其用于由SMN1基因中的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能损失或缺陷相关的疾病的治疗、预防、延迟进展和/或改善，并且另外地用于保护在所述疾病的病理生理学中涉及的细胞，特别是用于SMA的治疗、预防、延迟进展和/或改善。
本发明的一个特别实施方案涉及包含式(I)的化合物或其药用盐和奥利索西的药物组合物，其用作治疗活性物质，尤其是用作用于由SMN1基因中的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能损失或缺陷相关的疾病的治疗、预防、延迟进展和/或改善，并且另外地用于保护在所述疾病的病理生理学中涉及的细胞，特别是用于脊髓性肌萎缩(SMA)的治疗、预防、延迟进展和/或改善的治疗活性物质。
本发明的一个特别实施方案涉及包含式(I)的化合物或其药用盐和奥利索西的药物组合物，其用于由SMN1基因中的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能损失或缺陷相关的疾病的治疗、预防、延迟进展和/或改善并且额外地用于保护在所述疾病的病理生理学中涉及的细胞，特别是用于脊髓性肌萎缩(SMA)的治疗、预防、延迟进展和/或改善。
本发明的一个特别实施方案涉及用于由SMN1基因中的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能损失或缺陷相关的疾病的治疗、预防、延迟进展和/或改善并且额外地用于保护在所述疾病的病理生理学中涉及的细胞，特别是用于脊髓性肌萎缩(SMA)的治疗、预防、延迟进展和/或改善的方法，所述方法包括向受试者施用包含式(I)的化合物或其药用盐和奥利索西的药物组合物。
本发明的一个特别实施方案涉及包含式(I)的化合物或其药用盐和奥利索西的药物组合物用于由SMN1基因中的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能损失或缺陷相关的疾病的治疗、预防、延迟进展和/或改善并且额外地用于保护在所述疾病的病理生理学中涉及的细胞，特别是用于脊髓性肌萎缩(SMA)的治疗、预防、延迟进展和/或改善的用途。
本发明的一个特别实施方案涉及式(I)的化合物或其药用盐和奥利索西用于制备药物的用途，所述药物用于由SMN1基因中的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能损失或缺陷相关的疾病的治疗、预防、延迟进展和/或改善，并且另外地用于保护在所述疾病的病理生理学中涉及的细胞，特别是用于脊髓性肌萎缩(SMA)的治疗、预防、延迟进展和/或改善。这样的药物包含式(I)的化合物或其药用盐和奥利索西。
本发明因此还涵盖用于制备包含式(I)的化合物或其药用盐和奥利索西的药物组合物的试剂盒。
在一个实施方案中，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括(a)包含治疗有效量的(i)式(I)的化合物和(ii)药用载体的第一药物组合物，(b)包含(i)奥利索西和(ii)药用载体的第二药物组合物，(c)处方信息，和(d)容器，其中所述处方信息包括对患者关于所述两种API的联合施用的建议。
在另一个实施方案中，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括包含治疗有效量的式(I)的化合物和奥利索西的组合物、处方信息(也称为“散页印刷品(leaflet)”、泡罩包装(blister package)或瓶(HDPE或玻璃)和容器。
如本文使用的，术语“试剂盒(kit)”是指可以分开地或在单个容器内提供的上述组件的集合。所述容器任选地包括用于实施本公开内容的方法的说明书。
本发明的一个实施方案提供SMN2基因剪接调节剂和细胞保护剂的组合。
本发明的一个实施方案提供SMN2基因剪接调节剂和细胞保护剂的组合，其用于由SMN1基因中的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能损失或缺陷相关的疾病的治疗、预防、延迟进展和/或改善，和/或用于保护在所述疾病的病理生理学中涉及的细胞。
本发明的一个实施方案提供根据权利要求1至9中任一项的式(I)的化合物或其药用盐和奥利索西的组合，其用于由SMN1基因中的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能损失或缺陷相关的疾病的治疗、预防、延迟进展和/或改善，和/或用于保护在所述疾病的病理生理学中涉及的细胞。
本发明的一个实施方案提供用于由SMN1基因中的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能损失或缺陷相关的疾病的治疗、预防、延迟进展和/或改善，和/或用于保护在所述疾病的病理生理学中涉及的细胞的方法，所述方法包括向受试者施用SMN2基因剪接调节剂和细胞保护剂的组合。
本发明的一个实施方案提供用于由SMN1基因中的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能损失或缺陷相关的疾病的治疗、预防、延迟进展和/或改善，和/或用于保护在所述疾病的病理生理学中涉及的细胞的方法，所述方法包括向受试者施用根据权利要求1至9中任一项的式(I)的化合物或其药用盐和奥利索西的组合。
本发明的一个实施方案提供SMN2基因剪接调节剂和细胞保护剂的组合用于由SMN1基因中的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能损失或缺陷相关的疾病的治疗、预防、延迟进展和/或改善，和/或用于保护在所述疾病的病理生理学中涉及的细胞的用途。
本发明的一个实施方案提供根据权利要求1至9中任一项的式(I)的化合物或其药用盐和奥利索西的组合用于由SMN1基因中的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能损失或缺陷相关的疾病的治疗、预防、延迟进展和/或改善，和/或用于保护在所述疾病的病理生理学中涉及的细胞的用途。
本发明的一个实施方案提供SMN2基因剪接调节剂和细胞保护剂的组合用于制备药物的用途，所述药物用于由SMN1基因中的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能损失或缺陷相关的疾病的治疗、预防、延迟进展和/或改善，和/或用于保护在所述疾病的病理生理学中涉及的细胞。
本发明的一个实施方案提供根据权利要求1至9中任一项的式(I)的化合物或其药用盐和奥利索西的组合用于制备药物的用途，所述药物用于由SMN1基因中的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能损失或缺陷相关的疾病的治疗、预防、延迟进展和/或改善，和/或用于保护在所述疾病的病理生理学中涉及的细胞。
药物组合物
已发现，本发明的式(I)的化合物具有高的水溶解度。由于在所有年龄组的SMA患者的吞咽方面的障碍所致，已发现施用溶液是优选的。
为了提供足够高的药物浓度，通过将药物物质溶解在pH为小于pH 4，特别是小于pH 3.8，更特别地是小于pH 3.6，最特别地是pH 3.4的缓冲体系，例如柠檬酸缓冲体系、苹果酸盐缓冲体系、马来酸盐缓冲体系或酒石酸盐缓冲体系，最特别地是酒石酸盐缓冲体系中，可以将式(I)的化合物配制为口服水溶液。
通过制备用于构建口服溶液的干粉或颗粒剂，可以实现式(I)的化合物的制剂的长期稳定性。通过选择作为细粉的有机酸及其盐，例如柠檬酸三钠和柠檬酸、苹果酸二钠和苹果酸、酒石酸钠钾和酒石酸或酒石酸二钠和酒石酸，特别是酒石酸钠钾和酒石酸，可以将缓冲体系结合到干制剂中。备选地，所述有机酸(特别是酒石酸)可以单独采用作为酸化剂，代替酸和相应盐的组合。
包含式(I)的化合物的粉末或颗粒可以包含稀释剂，如山梨糖醇、异麦芽糖醇或特别是甘露糖醇及其组合，其确保粉末共混物在构建口服溶液期间快速溶解。在填料的引入中，为了改善流动性以及确保鲁棒均匀性(robust uniformity)，可以将粉末共混物造粒。
用于构建式(I)的化合物的溶剂体系的成分可以配制为单独的制剂。构建的溶剂可以在口服溶液的在用期开始时用于在瓶中溶解式(I)的化合物。
本发明的一个特别实施方案涉及包含式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物，其为用于构建口服溶液的粉末形式。
在本发明的一个特别实施方案中，将包含式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物装填到具有用于使用口服分配器(oral dispenser)的适配器(adapter)的多剂量瓶。已发现，这样的具有用于使用口服分配器的适配器的多剂量瓶能够实现高用药量灵活性，例如体重调节的用药量，并提供安全且方便的剂量施用。
在本发明的一个特别实施方案中，包含式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物通过辊压机压实的干法造粒接着装瓶来制备。已发现，这样的加工有益于(特别是对于水溶性填料)防止分层(demixing)。
本发明的一个特别实施方案涉及包含式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物，其中所述组合物是口服水溶液或适用于构建口服水溶液的干粉。
本发明的一个特别实施方案涉及包含式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物，其中所述组合物是口服水溶液(不包括气雾剂(aerosol))或适用于构建口服水溶液的干粉。
在本发明的一个特别实施方案中，包含式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物不是气雾剂。
在本发明的一个特别实施方案中，包含式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物不包含张度调节剂(tonicifier)，例如盐如氯化钠。
本发明的一个特别实施方案涉及包含式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物，其中所述组合物是口服水溶液或适用于构建口服水溶液的干粉，并且其中该口服水溶液具有的pH小于pH4，特别是小于pH3.8，更特别地是小于pH 3.6，最特别地是pH 3.4。
本发明的一个特别实施方案涉及这样的药物组合物，其包含式(I)的化合物或其药用盐以及柠檬酸盐、苹果酸盐、马来酸盐或酒石酸盐缓冲体系，特别是苹果酸盐或酒石酸盐缓冲体系，最特别地是酒石酸盐缓冲体系；或者备选地单独作为酸化剂的缓冲体系的相应酸，特别是酒石酸；其中所述组合物是口服水溶液或适用于构建口服水溶液的干粉。
本发明的一个特别实施方案涉及包含式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物，其中所述组合物是口服水溶液。
本发明的一个特别实施方案涉及包含式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物，其中所述组合物是在pH为小于pH4，特别是小于pH3.8，更特别地是小于pH 3.6，最特别地是pH 3.4的缓冲体系中的口服水溶液。
本发明的一个特别实施方案涉及包含式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物，其中所述组合物是在柠檬酸盐、苹果酸盐、马来酸盐或酒石酸盐缓冲体系，特别是在苹果酸盐或酒石酸盐缓冲体系，最特别地是在酒石酸盐缓冲体系，或者备选地单独作为酸化剂的缓冲体系的相应酸，特别是酒石酸中的口服水溶液。
本发明的一个特别实施方案涉及包含式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物，其中所述组合物是适用于构建口服水溶液的干粉。
本发明的一个特别实施方案涉及包含式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物，其中所述组合物是包含适用于构建pH为小于pH4，特别是小于pH3.8，更特别地是小于pH3.6，最特别地是pH 3.4的口服水溶液的缓冲体系的干粉。
本发明的一个特别实施方案涉及包含式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物，其中所述组合物是适用于构建口服水溶液的包含柠檬酸盐、苹果酸盐、马来酸盐或酒石酸盐缓冲体系，特别是在苹果酸盐或酒石酸盐缓冲体系，最特别地是在酒石酸盐缓冲体系；或者备选地单独作为酸化剂的缓冲体系的相应酸，特别是酒石酸中的干粉。
在本发明的一个实施方案中，包含式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物任选地还包含颗粒外填料(extragranular filler)，如乳糖、淀粉、水解淀粉、麦芽糊精、微晶纤维素、甘露糖醇、山梨糖醇、蔗糖、葡萄糖、磷酸氢钙、硫酸钙或其组合。
在本发明的一个特别实施方案中，颗粒外填料是山梨糖醇、异麦芽糖醇、甘露糖醇或其组合，特别是甘露糖醇，更特别地是结晶甘露糖醇，最特别地是平均直径为160μm的结晶甘露糖醇(
Figure BDA0001658050020000351
160C)。
在稀释剂的引入中，为了改善流动性以及确保鲁棒均匀性，通过干压实可以将粉末共混物造粒。
在本发明的一个实施方案中，包含式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物任选地还包含稀释剂，如乳糖、淀粉、水解淀粉、麦芽糊精、微晶纤维素、甘露糖醇、异麦芽糖醇(E953，(2ξ)-6-O-α-D-吡喃葡萄糖基-D-阿拉伯糖-己糖醇)、山梨糖醇、蔗糖、葡萄糖、磷酸氢钙、硫酸钙或其组合。
在本发明的一个实施方案中，包含式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物任选地还包含稀释剂，如乳糖、淀粉、水解淀粉、微晶纤维素、甘露糖醇、山梨糖醇、蔗糖、葡萄糖、磷酸氢钙、硫酸钙或其组合。
在本发明的一个特别实施方案中，稀释剂是甘露糖醇，特别是适用于直接压实的D-甘露糖醇如
Figure BDA0001658050020000361
M100。
在本发明的一个特别实施方案中，稀释剂是甘露糖醇和异麦芽糖醇的混合物，特别是D-甘露糖醇和(2ξ)-6-O-α-D-吡喃葡萄糖基-D-阿拉伯糖-己糖醇)。
本发明的发明人已发现异麦芽糖醇作为第二稀释剂改善颗粒性质。
通过使用防腐剂、稳定剂和抗氧化剂，如维生素A、维生素C、维生素E、维生素ETPGS、棕榈酸视黄酯、硒、半胱氨酸、甲硫氨酸、柠檬酸、柠檬酸钠、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、依地酸二钠、丁基羟基甲苯、核黄素、抗坏血酸或其组合，在缓冲液中构建的式(I)的化合物的溶液可以提供超过两周的在用时间(in-use times)。
通过使用防腐剂、稳定剂和抗氧化剂，如维生素E TPGS、依地酸二钠、丁基羟基甲苯、核黄素、抗坏血酸或其组合，在缓冲液中构建的式(I)的化合物的溶液可以提供超过两周的在用时间。
在本发明的一个实施方案中，包含式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物任选地还包含防腐剂、抗氧化剂和/或稳定剂，如维生素E TPGS(D-α生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯)、乙二胺四乙酸二钠(依地酸二钠、Na2EDTA)、丁基羟基甲苯、核黄素、抗坏血酸或其组合。已发现，防腐剂、抗氧化剂和/或稳定剂可以有益于多剂量容器中的延长使用时间或者有益于改善在在用期内溶液中的药物稳定性。
在本发明的一个特别实施方案中，防腐剂是山梨酸或苯甲酸钠(E211)，特别是苯甲酸钠。
对于儿科制剂，包含的防腐剂的量应尽可能低。已发现，其中防腐剂浓度低至1％wt的本发明的组合物生成稳定的溶液。
在本发明的一个特别实施方案中，抗氧化剂是抗坏血酸((5R)-[(1S)-1，2-二羟基乙基]-3，4-二羟基呋喃-2(5H)-酮)。
在本发明的一个特别实施方案中，稳定剂是乙二胺四乙酸二钠(依地酸二钠，Na2EDTA)。
在本发明的一个实施方案中，包含式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物任选地还包含润滑剂。已发现，润滑剂可以用作用于辊压机压实的加工助剂。此外，润滑剂可以用于水溶性成分如PEG以确保外观的可接受性。
在本发明的一个特别实施方案中，润滑剂是聚(乙二醇)，特别是具有数均分子量Mn 6,000的聚(乙二醇)(PEG 6000)。
在本发明的一个实施方案中，包含式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物任选地还包含增甜剂和/或香料以改善适口性。
在本发明的一个特别实施方案中，香料是草莓香料或香草香料。
在本发明的一个特别实施方案中，增甜剂是三氯蔗糖(1，6-二氯-1，6-二脱氧-β-D-呋喃果糖基-4-氯-4-脱氧-α-D-吡喃半乳糖苷，E955)或糖精钠。
在本发明的一个特别实施方案中，式(I)的化合物是7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮。
在本发明的一个特别实施方案中，药物组合物包含：
●式(I)的化合物或其药用盐；和
●选自柠檬酸盐、苹果酸盐、马来酸盐或酒石酸盐，特别是苹果酸盐或酒石酸盐，最特别地是酒石酸盐的缓冲体系；或者备选地单独作为酸化剂的缓冲剂的相应酸，特别是酒石酸。
在本发明的一个特别实施方案中，药物组合物包含：
●式(I)的化合物或其药用盐；
●缓冲体系，特别是选自柠檬酸盐、苹果酸盐、马来酸盐或酒石酸盐，更特别地是苹果酸盐或酒石酸盐，最特别地是酒石酸盐的缓冲体系；或者备选地单独作为酸化剂的缓冲剂的相应酸，特别是酒石酸；和
●稀释剂，特别是甘露糖醇或甘露糖醇和异麦芽糖醇的混合物，更特别地是甘露糖醇。
在本发明的一个特别实施方案中，药物组合物包含：
●式(I)的化合物或其药用盐；和
●稀释剂，特别是甘露糖醇或甘露糖醇和异麦芽糖醇的混合物，更特别地是甘露糖醇。
在本发明的一个特别实施方案中，药物组合物包含：
●式(I)的化合物或其药用盐；
●缓冲体系，特别是选自柠檬酸盐、苹果酸盐、马来酸盐或酒石酸盐，更特别地是苹果酸盐或酒石酸盐，最特别地是酒石酸盐的缓冲体系；或者备选地单独作为酸化剂的缓冲剂的相应酸，特别是酒石酸；
●抗氧化剂，特别是抗坏血酸；和
●稳定剂，特别是依地酸二钠。
在本发明的一个特别实施方案中，药物组合物包含：
●式(I)的化合物或其药用盐；
●缓冲体系，特别是选自柠檬酸盐、苹果酸盐、马来酸盐或酒石酸盐，更特别地是苹果酸盐或酒石酸盐，最特别地是酒石酸盐的缓冲体系；或者备选地单独作为酸化剂的缓冲剂的相应酸，特别是酒石酸；
●稀释剂，特别是甘露糖醇或甘露糖醇和异麦芽糖醇的混合物，更特别地是甘露糖醇；
●抗氧化剂，特别是抗坏血酸；和
●稳定剂，特别是依地酸二钠。
在本发明的一个特别实施方案中，药物组合物包含：
●式(I)的化合物或其药用盐；
●缓冲体系，特别是选自柠檬酸盐、苹果酸盐、马来酸盐或酒石酸盐，更特别地是苹果酸盐或酒石酸盐，最特别地是酒石酸盐的缓冲体系；或者备选地单独作为酸化剂的缓冲剂的相应酸，特别是酒石酸；
●稀释剂，特别是甘露糖醇或甘露糖醇和异麦芽糖醇的混合物，更特别地是甘露糖醇；
●抗氧化剂，特别是抗坏血酸；
●稳定剂，特别是依地酸二钠；和
●润滑剂，特别是PEG6000。
在本发明的一个特别实施方案中，药物组合物包含：
●式(I)的化合物或其药用盐；
●缓冲体系，特别是选自柠檬酸盐、苹果酸盐、马来酸盐或酒石酸盐，更特别地是苹果酸盐或酒石酸盐，最特别地是酒石酸盐的缓冲体系；或者备选地单独作为酸化剂的缓冲剂的相应酸，特别是酒石酸；
●稀释剂，特别是甘露糖醇或甘露糖醇和异麦芽糖醇的混合物，更特别地是甘露糖醇；
●抗氧化剂，特别是抗坏血酸；
●稳定剂，特别是依地酸二钠；
●润滑剂，特别是PEG6000；和
●防腐剂，特别是山梨酸或苯甲酸钠，最特别地是苯甲酸钠。在本发明的一个特别实施方案中，药物组合物包含：
●式(I)的化合物或其药用盐；
●缓冲体系，特别是选自柠檬酸盐、苹果酸盐、马来酸盐或酒石酸盐，更特别地是苹果酸盐或酒石酸盐，最特别地是酒石酸盐的缓冲体系；或者备选地单独作为酸化剂的缓冲剂的相应酸，特别是酒石酸；
●稀释剂，特别是甘露糖醇或甘露糖醇和异麦芽糖醇的混合物，更特别地是甘露糖醇；
●抗氧化剂，特别是抗坏血酸；
●稳定剂，特别是依地酸二钠；
●润滑剂，特别是PEG6000；
●防腐剂，特别是山梨酸或苯甲酸钠，最特别地是苯甲酸钠，
●任选的增甜剂，特别是三氯蔗糖或糖精钠，最特别地是三氯蔗糖；和
●任选的香料，特别是草莓香料或香草香料。
在本发明的一个特别实施方案中，药物组合物包含：
●1至10％wt的式(I)的化合物或其药用盐；
●5至15％wt的缓冲体系，特别是选自柠檬酸盐、苹果酸盐、马来酸盐或酒石酸盐，更特别地是苹果酸盐或酒石酸盐，最特别地是酒石酸盐的缓冲体系；或者备选地单独作为酸化剂的缓冲剂的相应酸，特别是酒石酸；
●40至70％wt的稀释剂，特别是甘露糖醇或甘露糖醇和异麦芽糖醇的混合物，更特别地是甘露糖醇；
●1至4％wt的抗氧化剂，特别是抗坏血酸；
●0.5至2％wt的稳定剂，特别是依地酸二钠；
●0.5至2％w的润滑剂，特别是PEG6000；
●1至8％wt的防腐剂，特别是山梨酸或苯甲酸钠，最特别地是苯甲酸钠，
●0至3％wt的增甜剂，特别是三氯蔗糖或糖精钠，最特别地是三氯蔗糖；和
●0至20％wt的香料，特别是草莓香料或香草香料；
其中这些成分的总量不超过100％wt。
在本发明的一个特别实施方案中，药物组合物包含：
●2至6％wt的7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮或其药用盐；
●9至13％wt的酒石酸盐缓冲体系；
●45至55％wt的甘露糖醇作为第一稀释剂和8至10％wt的异麦芽糖醇作为第二稀释剂；
●1至3％wt的抗坏血酸作为抗氧化剂；
●0.5至2％wt的依地酸二钠作为稳定剂；
●0.5至2％w的PEG6000作为润滑剂；
●1至7％wt的苯甲酸钠作为防腐剂，
●1.5至2％wt的三氯蔗糖作为增甜剂；和
●13至17％wt的草莓香料；
其中这些成分的总量不超过100％wt。
本发明的另一个实施方案涉及一种用于制备包含式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物的试剂盒，其中所述试剂盒包括：
●包含式(I)的化合物或其药用盐的粉末共混物，和
●作为构建用溶剂的水。
本发明的另一个实施方案涉及用于制备包含式(I)的化合物或其药用盐的药物组合物的试剂盒，其中所述试剂盒包括：
●式(I)的化合物或其药用盐，
●作为构建用赋形剂(vehicle)的粉末共混物，和
●任选的作为构建用溶剂的水。
另一个实施方案涉及作为适用于构建如本文所述的式(I)的化合物或其药用盐的赋形剂的粉末共混物，所述粉末共混物包含：
●缓冲体系，特别是选自柠檬酸盐、苹果酸盐、马来酸盐或酒石酸盐，更特别地是苹果酸盐或酒石酸盐，最特别地是酒石酸盐的缓冲体系；或者备选地单独作为酸化剂的缓冲剂的相应酸，特别是酒石酸；和
●稀释剂，特别是甘露糖醇或甘露糖醇和异麦芽糖醇的混合物，更特别地是甘露糖醇。
另一个实施方案涉及作为适用于构建如本文所述的式(I)的化合物或其药用盐的赋形剂的粉末共混物，所述粉末共混物包含：
●缓冲体系，特别是选自柠檬酸盐、苹果酸盐、马来酸盐或酒石酸盐，更特别地是苹果酸盐或酒石酸盐，最特别地是酒石酸盐的缓冲体系；或者备选地单独作为酸化剂的缓冲剂的相应酸，特别是酒石酸；
●稀释剂，特别是甘露糖醇或甘露糖醇和异麦芽糖醇的混合物，更特别地是甘露糖醇；
●抗氧化剂，特别是抗坏血酸；
●稳定剂，特别是依地酸二钠；
●润滑剂，特别是PEG6000；和
●防腐剂，特别是山梨酸或苯甲酸钠，最特别地是苯甲酸钠。
另一个实施方案涉及作为适用于构建如本文所述的式(I)的化合物或其药用盐的赋形剂的粉末共混物，所述粉末共混物包含：
●缓冲体系，特别是选自柠檬酸盐、苹果酸盐、马来酸盐或酒石酸盐，更特别地是苹果酸盐或酒石酸盐，最特别地是酒石酸盐的缓冲体系；或者备选地单独作为酸化剂的缓冲剂的相应酸，特别是酒石酸；
●稀释剂，特别是甘露糖醇或甘露糖醇和异麦芽糖醇的混合物，更特别地是甘露糖醇；
●抗氧化剂，特别是抗坏血酸；
●稳定剂，特别是依地酸二钠；
●润滑剂，特别是PEG6000；
●防腐剂，特别是山梨酸或苯甲酸钠，最特别地是苯甲酸钠，
●任选的增甜剂，特别是三氯蔗糖或糖精钠，最特别地是三氯蔗糖；和
●任选的香料，特别是草莓香料或香草香料。
另一个实施方案涉及作为适用于构建如本文所述的式(I)的化合物或其药用盐的赋形剂的粉末共混物，所述粉末共混物包含：
●4至15％wt的缓冲体系，特别是选自柠檬酸盐、苹果酸盐、马来酸盐或酒石酸盐，更特别地是苹果酸盐或酒石酸盐，最特别地是酒石酸盐的缓冲体系；或者备选地单独作为酸化剂的缓冲剂的相应酸，特别是酒石酸；
●40至70％wt的稀释剂，特别是甘露糖醇或甘露糖醇和异麦芽糖醇的混合物，更特别地是甘露糖醇；
●1至4％wt的抗氧化剂，特别是抗坏血酸；
●0.2至2％wt的稳定剂，特别是依地酸二钠；
●0.5至2％w的润滑剂，特别是PEG6000；
●1至8％wt的防腐剂，特别是山梨酸或苯甲酸钠，最特别地是苯甲酸钠，
●0至3％wt的增甜剂，特别是三氯蔗糖或糖精钠，最特别地是三氯蔗糖；和
●0至20％wt的香料，特别是草莓香料或香草香料；
其中这些成分的总量不超过100％wt。
另一个实施方案涉及作为适用于构建如本文所述的式(I)的化合物或其药用盐的赋形剂的粉末共混物，所述粉末共混物包含：
●9至13％wt的酒石酸盐缓冲体系或酒石酸；
●45至55％wt的甘露糖醇作为第一稀释剂和8至10％wt的异麦芽糖醇作为第二稀释剂；
●1至3％wt的抗坏血酸作为抗氧化剂；
●0.3至0.9％wt的依地酸二钠作为稳定剂；
●0.5至2％w的PEG6000作为润滑剂；
●3至7％wt的苯甲酸钠作为防腐剂，
●0.8至2.0％wt的三氯蔗糖作为增甜剂；和
●7.5至19％wt的草莓香料；
其中这些成分的总量不超过100％wt。
本发明的一个特别实施方案涉及包含如本文所述的式(I)的化合物或其药用盐和另外的奥利索西的药物组合物。
在本发明的一个特别实施方案中，奥利索西具有这样的粒度分布，其中d90值小于200μm，特别是d90值小于100μm，更特别地是d90值为50-100μm。
术语“d90值”是指其中全体粒子的90wt％具有比该值更小的当量球径的直径。
本发明的一个特别实施方案涉及药物组合物，其包含如本文中所述的式(I)的化合物或其药用盐，奥利索西以及选自芝麻油、橄榄油、大豆油、棉籽油、蓖麻油(castororil)、胡桃油、菜籽油、玉米油、杏仁油、向日葵油及其组合的油。
本发明的一个特别实施方案涉及药物组合物，其包含如本文中所述的式(I)的化合物或其药用盐；奥利索西；选自芝麻油、橄榄油、大豆油、棉籽油、蓖麻油、胡桃油、菜籽油、玉米油、杏仁油、向日葵油及其组合的油；选自单油酸甘油酯(PeceolTM、Inwitor 948TM、Capmul GMOTM)、单亚油酸甘油酯(Maisine 35-1TM)、单油酸失水山梨糖醇酯(Span 80TM)、油酸及其组合的乳化剂和/或亲脂性增溶剂；和任选的极性表面活性剂，特别是HLB值为小于7的表面活性剂，更特别地是聚山梨酯80(Tween 80TM)、辛酰己酰聚氧甘油酯(LabrasolTM)及其组合。
在本发明的一个特别实施方案中，药物组合物包含：
●式(I)的化合物或其药用盐；
●选自柠檬酸盐、苹果酸盐、马来酸盐或酒石酸盐的缓冲体系，特别是苹果酸盐或酒石酸盐，最特别地是酒石酸盐；或者备选地单独作为酸化剂的缓冲剂的相应酸，特别是酒石酸；
●奥利索西；
●油，特别是芝麻油、橄榄油、大豆油、棉籽油、蓖麻油、胡桃油、菜籽油、玉米油、杏仁油、向日葵油或其组合，最特别地是芝麻油；
●乳化剂和/或亲脂性增溶剂，特别是单油酸甘油酯(PeceolTM、Inwitor 948TM、Capmul GMOTM)、单亚油酸甘油酯(Maisine 35-1TM)、单油酸失水山梨糖醇酯(Span 80TM)、油酸或其组合；和
●任选的极性表面活性剂，特别是HLB值小于7的表面活性剂，更特别地是聚山梨酯80(Tween 80TM)、辛酰己酰聚氧甘油酯(LabrasolTM)或其组合。
在本发明的一个特别实施方案中，药物组合物包含：
●式(I)的化合物或其药用盐；
●缓冲体系，特别是选自柠檬酸盐、苹果酸盐、马来酸盐或酒石酸盐，更特别地是苹果酸盐或酒石酸盐，最特别地是酒石酸盐的缓冲体系；或者备选地单独作为酸化剂的缓冲剂的相应酸，特别是酒石酸；
●稀释剂，特别是甘露糖醇或甘露糖醇和异麦芽糖醇的混合物，更特别地是甘露糖醇；
●奥利索西；
●油，特别是芝麻油、橄榄油、大豆油、棉籽油、蓖麻油、胡桃油、菜籽油、玉米油、杏仁油、向日葵油或其组合，最特别地是芝麻油；
●乳化剂和/或亲脂性增溶剂，特别是单油酸甘油酯(PeceolTM、Inwitor 948TM、Capmul GMOTM)、单亚油酸甘油酯(Maisine 35-1TM)、单油酸失水山梨糖醇酯(Span 80TM)、油酸或其组合；和
●任选的极性表面活性剂，特别是HLB值小于7的表面活性剂，更特别地是聚山梨酯80(Tween 80TM)、辛酰己酰聚氧甘油酯(LabrasolTM)或其组合。
在本发明的一个特别实施方案中，药物组合物包含：
●式(I)的化合物或其药用盐；
●稀释剂，特别是甘露糖醇或甘露糖醇和异麦芽糖醇的混合物，更特别地是甘露糖醇；
●奥利索西；
●油，特别是芝麻油、橄榄油、大豆油、棉籽油、蓖麻油、胡桃油、菜籽油、玉米油、杏仁油、向日葵油或其组合，最特别地是芝麻油；
●乳化剂和/或亲脂性增溶剂，特别是单油酸甘油酯(PeceolTM、Inwitor 948TM、Capmul GMOTM)、单亚油酸甘油酯(Maisine 35-1TM)、单油酸失水山梨糖醇酯(Span 80TM)、油酸或其组合；和
●任选的极性表面活性剂，特别是HLB值小于7的表面活性剂，更特别地是聚山梨酯80(Tween 80TM)、辛酰己酰聚氧甘油酯(LabrasolTM)或其组合。
在本发明的一个特别实施方案中，药物组合物包含：
●式(I)的化合物或其药用盐；
●缓冲体系，特别是选自柠檬酸盐、苹果酸盐、马来酸盐或酒石酸盐，更特别地是苹果酸盐或酒石酸盐，最特别地是酒石酸盐的缓冲体系；或者备选地单独作为酸化剂的缓冲剂的相应酸，特别是酒石酸；
●抗氧化剂，特别是抗坏血酸；
●稳定剂，特别是依地酸二钠；
●奥利索西，
●油，特别是芝麻油、橄榄油、大豆油、棉籽油、蓖麻油、胡桃油、菜籽油、玉米油、杏仁油、向日葵油或其组合，最特别地是芝麻油；
●乳化剂和/或亲脂性增溶剂，特别是单油酸甘油酯(PeceolTM、Inwitor 948TM、Capmul GMOTM)、单亚油酸甘油酯(Maisine 35-1TM)、单油酸失水山梨糖醇酯(Span 80TM)、油酸或其组合；和
●任选的极性表面活性剂，特别是HLB值小于7的表面活性剂，更特别地是聚山梨酯80(Tween 80TM)、辛酰己酰聚氧甘油酯(LabrasolTM)或其组合。
在本发明的一个特别实施方案中，药物组合物包含：
●式(I)的化合物或其药用盐；
●缓冲体系，特别是选自柠檬酸盐、苹果酸盐、马来酸盐或酒石酸盐，更特别地是苹果酸盐或酒石酸盐，最特别地是酒石酸盐的缓冲体系；或者备选地单独作为酸化剂的缓冲剂的相应酸，特别是酒石酸；
●稀释剂，特别是甘露糖醇或甘露糖醇和异麦芽糖醇的混合物，更特别地是甘露糖醇；
●抗氧化剂，特别是抗坏血酸；
●稳定剂，特别是依地酸二钠；
●奥利索西；
●油，特别是芝麻油、橄榄油、大豆油、棉籽油、蓖麻油、胡桃油、菜籽油、玉米油、杏仁油、向日葵油或其组合，最特别地是芝麻油；
●乳化剂和/或亲脂性增溶剂，特别是单油酸甘油酯(PeceolTM、Inwitor 948TM、Capmul GMOTM)、单亚油酸甘油酯(Maisine 35-1TM)、单油酸失水山梨糖醇酯(Span 80TM)、油酸或其组合；和
●任选的极性表面活性剂，特别是HLB值小于7的表面活性剂，更特别地是聚山梨酯80(Tween 80TM)、辛酰己酰聚氧甘油酯(LabrasolTM)或其组合。
在本发明的一个特别实施方案中，药物组合物包含：
●式(I)的化合物或其药用盐；
●缓冲体系，特别是选自柠檬酸盐、苹果酸盐、马来酸盐或酒石酸盐，更特别地是苹果酸盐或酒石酸盐，最特别地是酒石酸盐的缓冲体系；或者备选地单独作为酸化剂的缓冲剂的相应酸，特别是酒石酸；
●稀释剂，特别是甘露糖醇或甘露糖醇和异麦芽糖醇的混合物，更特别地是甘露糖醇；
●抗氧化剂，特别是抗坏血酸；
●稳定剂，特别是依地酸二钠；
●润滑剂，特别是PEG6000；
●奥利索西；
●油，特别是芝麻油、橄榄油、大豆油、棉籽油、蓖麻油、胡桃油、菜籽油、玉米油、杏仁油、向日葵油或其组合，最特别地是芝麻油；
●乳化剂和/或亲脂性增溶剂，特别是单油酸甘油酯(PeceolTM、Inwitor 948TM、Capmul GMOTM)、单亚油酸甘油酯(Maisine 35-1TM)、单油酸失水山梨糖醇酯(Span 80TM)、油酸或其组合；和
●任选的极性表面活性剂，特别是HLB值为小于7的表面活性剂，更特别地是聚山梨酯80(Tween 80TM)、辛酰己酰聚氧甘油酯(LabrasolTM)或其组合。
在本发明的一个特别实施方案中，药物组合物包含：
●式(I)的化合物或其药用盐；
●缓冲体系，特别是选自柠檬酸盐、苹果酸盐、马来酸盐或酒石酸盐，更特别地是苹果酸盐或酒石酸盐，最特别地是酒石酸盐的缓冲体系；或者备选地单独作为酸化剂的缓冲剂的相应酸，特别是酒石酸；
●稀释剂，特别是甘露糖醇或甘露糖醇和异麦芽糖醇的混合物，更特别地是甘露糖醇；
●抗氧化剂，特别是抗坏血酸；
●稳定剂，特别是依地酸二钠；
●润滑剂，特别是PEG6000；
●防腐剂，特别是山梨酸或苯甲酸钠，最特别地是苯甲酸钠；
●奥利索西；
●油，特别是芝麻油、橄榄油、大豆油、棉籽油、蓖麻油、胡桃油、菜籽油、玉米油、杏仁油、向日葵油或其组合，最特别地是芝麻油；
●乳化剂和/或亲脂性增溶剂，特别是单油酸甘油酯(PeceolTM、Inwitor 948TM、Capmul GMOTM)、单亚油酸甘油酯(Maisine 35-1TM)、单油酸失水山梨糖醇酯(Span 80TM)、油酸或其组合；和
●任选的极性表面活性剂，特别是HLB值小于7的表面活性剂，更特别地是聚山梨酯80(Tween 80TM)、辛酰己酰聚氧甘油酯(LabrasolTM)或其组合。
在本发明的一个特别实施方案中，药物组合物包含：
●式(I)的化合物或其药用盐；
●缓冲体系，特别是选自柠檬酸盐、苹果酸盐、马来酸盐或酒石酸盐，更特别地是苹果酸盐或酒石酸盐，最特别地是酒石酸盐的缓冲体系；或者备选地单独作为酸化剂的缓冲剂的相应酸，特别是酒石酸；
●稀释剂，特别是甘露糖醇或甘露糖醇和异麦芽糖醇的混合物，更特别地是甘露糖醇；
●抗氧化剂，特别是抗坏血酸；
●稳定剂，特别是依地酸二钠；
●润滑剂，特别是PEG6000；
●防腐剂，特别是山梨酸或苯甲酸钠，最特别地是苯甲酸钠；
●任选的增甜剂，特别是三氯蔗糖或糖精钠，最特别地是三氯蔗糖；
●任选的香料，特别是草莓香料或香草香料；
●奥利索西；
●油，特别是芝麻油、橄榄油、大豆油、棉籽油、蓖麻油、胡桃油、菜籽油、玉米油、杏仁油、向日葵油或其组合，最特别地是芝麻油；
●乳化剂和/或亲脂性增溶剂，特别是单油酸甘油酯(PeceolTM、Inwitor 948TM、Capmul GMOTM)、单亚油酸甘油酯(Maisine35-1TM)、单油酸失水山梨糖醇酯(Span 80TM)、油酸或其组合；和
●任选的极性表面活性剂，特别是HLB值小于7的表面活性剂，更特别地是聚山梨酯80(Tween 80TM)、辛酰己酰聚氧
甘油酯(LabrasolTM)或其组合。
本发明的另一个实施方案涉及一种用于制备包含式(I)的化合物或其药用盐和奥利索西的药物组合物的试剂盒，其中所述试剂盒包括：
●包含式(I)的化合物或其药用盐的粉末共混物；
●作为构建用溶剂的水；
●奥利索西；
●油，特别是芝麻油、橄榄油、大豆油、棉籽油、蓖麻油、胡桃油、菜籽油、玉米油、杏仁油、向日葵油或其组合，最特别地是芝麻油；
●乳化剂和/或亲脂性增溶剂，特别是单油酸甘油酯(PeceolTM、Inwitor 948TM、Capmul GMOTM)、单亚油酸甘油酯(Maisine 35-1TM)、单油酸失水山梨糖醇酯(Span 80TM)、油酸或其组合；和
●任选的极性表面活性剂，特别是HLB值小于7的表面活性剂，更特别地是聚山梨酯80(Tween 80TM)、辛酰己酰聚氧甘油酯(LabrasolTM)或其组合。
本发明的另一个实施方案涉及一种用于制备包含式(I)的化合物或其药用盐和奥利索西的药物组合物的试剂盒，其中所述试剂盒包括：
●式(I)的化合物或其药用盐；
●作为构建用赋形剂的粉末共混物；
●任选的作为构建用溶剂的水；
●奥利索西；
●油，特别是芝麻油、橄榄油、大豆油、棉籽油、蓖麻油、胡桃油、菜籽油、玉米油、杏仁油、向日葵油或其组合，最特别地是芝麻油；
●乳化剂和/或亲脂性增溶剂，特别是单油酸甘油酯(PeceolTM、Inwitor 948TM、Capmul GMOTM)、单亚油酸甘油酯(Maisine 35-1TM)、单油酸失水山梨糖醇酯(Span 80TM)、油酸或其组合；和
●任选的极性表面活性剂，特别是HLB值小于7的表面活性剂，更特别地是聚山梨酯80(Tween 80TM)、辛酰己酰聚氧甘油酯(LabrasolTM)或其组合。
附图
图1. 7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6- 基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(实施例20)在体外增加SMN mRNA和蛋白生产。
(A)1型SMA成纤维细胞中的SMN2剪接。(B)1型SMA成纤维细胞中的SMN蛋白。(C)1型SMA运动神经元中的SMN蛋白。(D)在来源于HV的全血中的SMN1和SMN2剪接。在实施例20的化合物存在下，将来自1型SMA患者的成纤维细胞培养24小时(A)或48小时(B)；将来自1型SMA患者iPSC(诱导多能干细胞)的运动神经元培养72小时(C)并且将来自健康自愿者(HV)的全血培养4小时(D)。SMN剪接通过RT-PCR进行评估，并且SMN蛋白水平通过在成纤维细胞溶解产物中的均相时间分辨荧光(HTRF)和通过对运动神经元中的SMN免疫染色进行评估。数据代表每个数据点3次评价的平均值±标准误差(SEM)并且表示为相对于未处理对照的倍数变化。
图2. 7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6- 基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(实施例20)在体内诱导SMN蛋白表达。
(A)C/C-等位基因小鼠的脑中的SMN蛋白。(B)SMNΔ7小鼠的脑中的SMN蛋白。(C)C/C-等位基因小鼠的四头肌中的SMN蛋白。(D)SMNΔ7小鼠的四头肌中的SMN蛋白。C/C-等位基因小鼠和SMNΔ7小鼠用实施例20的化合物处理。在最后一个剂量后一小时，收集脑和四头肌并通过HTRF评估SMN蛋白的水平。数据代表每组5-6只动物的平均值±SEM并且表示为相对于赋形剂处理的对照的倍数变化。相对于未处理的对照，*＝p＜0.05，**＝p＜0.01，***＝p＜0.001。
图3.用7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪- 6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(实施例20)处理SMNΔ7小鼠的体内效应。
从P3向前，SMNΔ7小鼠用实施例20的化合物处理并且动物存活(A)和体重(B)每天进行评估直至P100。数据代表每组10-12只小鼠的平均值±SEM。HET＝杂合型同窝幼畜。
图4.在体内在SMNΔ7小鼠中运动回路(Motor CircuM和肌肉萎缩通过7-(4，7-二 氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶- 4-酮(实施例20)的保护。
从P3至P14，SMNΔ7小鼠用实施例20的化合物处理，并且神经肌肉连接性和肌肉萎缩通过免疫组织化学评估。(A)L3-5脊髓中的vGlutl-正本体感受输入。(B)L3-5脊髓中的腹侧运动轴突。(C)最长肌上的NMJ神经分布。(D)EDL肌横截面积。数据代表每组4-5只小鼠的平均值±SEM。相对于赋形剂处理的SMNΔ7小鼠，*＝p＜0.05；**＝p＜0.01；***＝p＜0.001。
图5.体外FoxM1的选择性剪接
将1型SMA患者成纤维细胞用实施例20的化合物处理24小时，并通过RT-q-PCR分析FoxM1全长(FL)和缺乏外显子9的(Δ9)mRNA。数据代表6次重复的平均值±SEM并且表示为相对于未处理对照的倍数变化。
图6.水包油乳剂
组合物4A在添加酒石酸盐缓冲溶液之前的照片(A)和刚刚添加20％(B)或30％(C)的酒石酸盐缓冲溶液(组合物5A)并由此得到油包水乳剂之后的照片。
图7.水包油乳剂的稳定性
包含70％组合物4A和30％组合物5A的油包水乳剂在构建后15分钟(A)(10次振荡)和构建后30分钟(B)(10此振荡)的照片。
图8.水包油乳剂
组合物4F在添加酒石酸盐缓冲溶液酒石酸盐缓冲溶液之前的照片(A)和刚刚添加20％(B左)、25％(B中)或30％(B右)的酒石酸盐缓冲溶液(组合物5A)并由此得到油包水乳剂之后的照片。
图9.水包油乳剂的稳定性
包含70％组合物4F和30％组合物5A的油包水乳剂在构建后15分钟(A)(10次振荡)和构建后30分钟(B)(10次振荡)的照片。
实施例
通过参考以下实施例将更全面地理解本发明。然而以下实施例不应被视为限制本发明的范围。
所使用的缩写
ACN：乙腈；CH2Cl2：二氯甲烷(DCM)；DIPEA：二异丙基乙胺；DMA：二甲基乙酰胺；TEA：三乙胺；RT：室温；B2(pin)2：双(频哪醇)二硼；Pd(dppf)Cl2：(1，1′-二(二苯基膦基))二茂铁)二氯化钯(II)：PPTS：对甲苯磺酸吡啶
Figure BDA0001658050020000522
。
中间体1
7-氟-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
a)2-氯-7-氟-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000521
将2-氨基-5-氟吡啶(11.20g，0.10mol)和丙二酸二甲酯(57.0mL，0.50mol)的混合物在230℃加热1.5h。在冷却至室温后，将沉淀物过滤并用ACN洗涤(3x)，得到7-氟-2-羟基-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮，为深色固体(14g)，将其直接用于下一步骤。MS m/z 181.3[M+H]+。
将粗制7-氟-2-羟基-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(14g，～77mmol)在POCl3(50mL)和DIPEA(13.3mL，77mmol)的深色混合物在110℃加热15小时。将溶剂除去并将深色剩余物用冰-水处理，用水洗涤(3x)并干燥，得到褐色固体。将粗制褐色固体层析(在CH2Cl2中的5％MeOH)，得到2-氯-7-氟-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮，为黄色固体(9.84g，50％，2步骤)，MS m/z 199.2[M+H]+。
b)2-甲基-6-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)咪唑并[1，2-b] 哒嗪
Figure BDA0001658050020000531
将6-氯-2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪(900mg，5.37mmol)、4，4，4′，4′，5，5，5′，5′-八甲基-2，2＇-二(1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷)(1.36g，5.37mmol，1.0eq.)、KOAc(1.05g，10.7mmol)和Pd(dppf)Cl2●CH2Cl2(393mg，0.54mmol)在二
Figure BDA0001658050020000533
烷(50mL)中的混合物脱气并在N2下在95℃加热。在15小时之后，将混合物用EtOAc稀释，通过硅藻土过滤并在真空下浓缩，得到2-甲基-6-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)咪唑并[1，2-b]哒嗪，将其直接用于下一步骤。
c)7-氟-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000532
向2-氯-7-氟-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(750mg，3.78mmol)在ACN(36mL)中的溶液中加入2-甲基-6-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)咪唑并[1，2-b]哒嗪(1.17g，4.53mmol，Eq：1.2)、Pd(Ph3P)4(218mg，0.189mmol，0.05eq.)和K2CO3的水溶液(3.78mL，7.55mmol，2.0eq.)。将混合物脱气并在氩气下在105℃加热过夜。将反应冷却至室温，并过滤。将沉淀物用Et2O洗涤然后用水洗涤，在真空中干燥，得到250mg(22％)的7-氟-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮，为浅褐色固体。MS m/z296.1[M+H]+。
中间体2
2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-氟-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
a)2，8-二甲基-6-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)咪唑并[1， 2-b]哒嗪
Figure BDA0001658050020000541
在密封烧瓶中，将3，6-二氯-4-甲基哒嗪(27g，161mmol)悬浮在氨水(25％，300mL)中。将反应混合物在110℃加热48小时(在1小时之后变成溶液)。在冷却至室温之后，将反应倒入CH2Cl2中，并将有机相分离，用Na2SO4干燥，并在真空下浓缩，得到22.4g区域异构体混合物形式的6-氯-4-甲基-哒嗪-3-胺和6-氯-5-甲基-哒嗪-3-胺，将其直接用于下一步骤。
将区域异构体6-氯-4-甲基-哒嗪-3-胺和6-氯-5-甲基-哒嗪-3-胺的混合物(22.4g)悬浮在2-丙醇(300mL)中。加入1-溴-2，2-二甲氧基丙烷(36.0g，26.6mL，193mmol，1.2eq.)和PPTS(2.96g，11.6mmol，0.0725eq.)，并将所得溶液在105℃加热过夜。将溶剂在真空中除去并将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3洗涤。有机相用Na2SO4干燥，在真空中浓缩并将粗制浅褐色固体层析(EtOAc/庚烷1/2-1/1)，分别地得到6.1g的6-氯-2，8-二甲基-咪唑并[1，2-b]哒嗪MS m/z 182.1[M+H]+(21％)，为白色固体，和5.9g的6-氯-2，7-二甲基-咪唑并[1，2-b]哒嗪MS m/z 182.1[M+H]+(20％)，为白色固体。
将6-氯-2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪(0.9g，4.96mmol)、4，4，4′，4′，5，5，5′，5′-八甲基-2，2′-二(1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷)(1.26g，4.96mmol，1.0eq.)、KOAc(0.97g，9.91mmol)和Pd(dppf)Cl2●CH2Cl2(363mg，0.49mmol)在二
Figure BDA0001658050020000552
烷(50mL)中的混合物脱气，并在N2下在110℃加热。在15小时之后，将混合物用EtOAc稀释，通过硅藻土过滤并在真空下浓缩，得到2，8-二甲基-6-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)咪唑并[1，2-b]哒嗪，将其直接用于下一步骤。
b)2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-氟-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000551
向2-氯-7-氟-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(750mg，3.78mmol，以上本文中所述)在ACN(36mL)中的溶液中，加入2，8-二甲基-6-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)咪唑并[1，2-b]哒嗪(1.24g，4.53mmol，1.2eq.)、Pd(Ph3P)4(218mg，0.189mmol，0.05eq.)和K2CO3的水溶液(3.78mL，7.55mmol，2.0eq.)。将混合物脱气并在氩气下在100℃加热6小时。将反应冷却至室温，并过滤。将沉淀物用Et2O洗涤，然后用水洗涤，在真空中干燥，得到700mg(60％)的2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-氟-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮，为浅褐色固体。MS m/z 310.1[M+H]+。
中间体3
7-氟-9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
a)2-氯-7-氟-9-甲基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000561
将5-氟-3-甲基吡啶-2-胺(3.3g，26.2mmol)和丙二酸二甲酯(15.0mL，0.13mol，5.0eq.)的混合物在210℃加热1.5小时。在冷却至室温之后，将沉淀物过滤并用ACN洗涤(3x)，得到7-氟-2-羟基-9-甲基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮，为深色固体(2.3g)，将其直接用于下一步骤。MS m/z 195.1[M+H]+。
将粗制7-氟-2-羟基-9-甲基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(2.3g，11.8mmol)在POCl3(7.7mL，82.9mmol)和DIEA(2.07mL，11.8mmol)中的混合物在110C加热15小时。将溶剂除去并将剩余物用冰-水处理，用水洗涤(3x)并干燥，得到褐色固体。将粗制褐色固体层析(在CH2Cl2中的5％MeOH)，得到2-氯-7-氟-9-甲基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮，为黄色固体(1.77g，70％，2步骤上)，MS m/z 213.1[M+H]+。
b)7-氟-9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000562
向2-氯-7-氟-9-甲基-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(2.2g，10.3mmol)在ACN(80mL)中的溶液中，加入2-甲基-6-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)咪唑并[1，2-b]哒嗪(3.22g，12.4mmol，1.2eq.，以上本文中所述)、Pd(Ph3P)4(1.20g，1.03mmol，0.1eq.)和K2CO3的水溶液(10.3mL，20.7mmol，2.0eq.)。将混合物脱气并在氩气下在100℃加热6小时。将反应冷却至室温，并过滤。将沉淀物用Et2O洗涤，然后用水洗涤，在真空中干燥，得到1.80g(56％)的7-氟-9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮，为浅褐色固体。MS m/z 310.1[M+H]+。
中间体4
2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-氟-9-甲基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000571
向2-氯-7-氟-9-甲基-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(0.98g，4.61mmol，以上本文中所述)在ACN(50mL)中的溶液中，加入2，8-二甲基-6-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)咪唑并[1，2-b]哒嗪(1.51g，5.53mmol，1.2eq.，以上本文中所述)、Pd(Ph3P)4(0.32g，0.277mmol，0.06eq.)和K2CO3的水溶液(4.61mL，9.22mmol，2.0eq.)。将混合物脱气并在氩气下在100℃加热6小时。将反应冷却至室温，并过滤。将沉淀物用Et2O和水洗涤，然后在真空中干燥，得到0.89g(60％)的2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-氟-9-甲基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮，为浅褐色固体。MS m/z 324.4[M+H]+。
实施例1
2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000572
在密封试管中，将7-氟-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体1；35mg，0.119mmol)和1-甲基哌嗪(47.5mg，0.474mmol，4eq.)在DMSO(1mL)中在120℃搅拌过夜。LC-MS显示总的转化。将溶剂在高真空下除去。粗制产物通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至9/1)纯化，得到标题产物(25mg，56％)，为浅黄色固体。MSm/z 376.3[M+H+]。
实施例2
7-[(8aR)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000581
在密封试管中，将7-氟-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体1；125mg，0.426mmol)和(R)-八氢吡咯并-[1，2-a]吡嗪(160mg，1.27mmol，3eq.)在DMSO(5mL)中在125℃搅拌过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝98/2至95/5)纯化，得到标题产物(65mg，38％)，为浅黄色固体。MS m/z 402.5[M+H+]。
实施例3
7-[(8aS)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000591
在密封试管中，将2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-氟-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体2；200mg，0.647mmol)和(S)-八氢吡咯并-[1，2-a]吡嗪(286mg，2.26mmol，3.5eq.)在DMSO(5mL)中在125℃搅拌过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝98/2至95/5)纯化，得到标题产物(115mg，43％)，为浅黄色固体。MSm/z 416.3[M+H+]。
实施例4
7-[(8aR)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000592
在密封试管中，将2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-氟-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体2；200mg，0.647mmol)、DIPEA(0.113mL，0.67mmol，1eq.)和(R)-八氢吡咯并-[1，2-a]吡嗪(245mg，1.95mmol，3.0eq.)在DMSO(2.5mL)中在125℃搅拌过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝98/2至95/5)纯化，得到标题产物(132mg，49％)，为浅黄色固体。MS m/z 416.3[M+H+]。
实施例5
7-[(8aS)-8a-甲基-1，3，4，6，7，8-六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000601
在密封试管中，将2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-氟-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体2；90mg，0.291mmol)、DIPEA(0.05mL，0.29mmol，1eq.)和(S)-8a-甲基八氢吡咯并[1，2-a]吡嗪(81mg，0.58mmol，2.0eq.)在DMSO(2.5mL)中在125℃搅拌过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至90/10)纯化，得到标题产物(55mg，44％)，为浅黄色固体。MS m/z 430.3[M+H+]。
实施例6
7-[(8aR)-8a-甲基-1，3，4，6，7，8-六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000602
在密封试管中，将2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-氟-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体2；90mg，0.291mmol)、DIPEA(0.05mL，0.29mmol，1eq.)和(R)-8a-甲基八氢吡咯并[1，2-a]吡嗪(81mg，0.58mmol，2.0eq.)在DMSO(2.5mL)中在125℃搅拌过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至90/10)纯化，得到标题产物(50mg，40％)，为浅黄色固体。MS m/z 430.4[M+H+]。
实施例7
2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3S，5R)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000611
在密封试管中，将2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-氟-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体2；50mg，0.162mmol)和顺式-2，6-二甲基哌嗪(74mg，0.647mmol，4.0eq.)在DMSO(1.5mL)中在110℃搅拌过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至90/10)纯化，得到标题产物(32mg，49％)，为浅黄色固体。MS m/z 404.4[M+H+]。
实施例8
2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000621
在密封试管中，将2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-氟-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体2；33mg，0.107mmol)和(S)-2-甲基哌嗪(43mg，0.427mmol，4.0eq.)在DMSO(2mL)中在120℃搅拌过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至90/10)纯化，得到标题产物(18mg，43％)，为浅黄色固体。MS m/z 390.3[M+H+]。
实施例9
2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000622
在密封试管中，将2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-氟-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体2；85mg，0.275mmol)和(R)-2-甲基哌嗪(110mg，1.10mmol，4.0eq.)在DMSO(5mL)中在120℃搅拌过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至90/10)纯化，得到标题产物(35mg，33％)，为浅黄色固体。MS m/z 390.3[M+H+]。
实施例10
7-(1，4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000631
在密封试管中，将2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-氟-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体2；33mg，0.107mmol)和1，4-二氮杂环庚烷(32mg，0.320mmol，3.0eq.)在DMSO(2mL)中在120℃搅拌过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至90/10)纯化，得到标题产物(20mg，48％)，为浅黄色固体。MS m/z 390.3[M+H+]。
实施例11
2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000632
在密封试管中，将7-氟-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体1；50mg，0.169mmol)和(S)-2-甲基哌嗪(68mg，0.677mmol，4.0eq.)在DMSO(2mL)中在110℃搅拌过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至90/10)纯化，得到标题产物(40mg，63％)，为浅黄色固体。MSm/z 376.2[M+H+]。
实施例12
2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000641
在密封试管中，将7-氟-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体1；50mg，0.169mmol)和(R)-2-甲基哌嗪(68mg，0.677mmol，4.0eq.)在DMSO(2mL)中在110℃搅拌过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至90/10)纯化，得到标题产物(48mg，75％)，为浅黄色固体。MSm/z 376.3[M+H+]。
实施例13
7-(1，4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000642
在密封试管中，将7-氟-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体1；50mg，0.169mmol)和1，4-二氮杂环庚烷(68mg，0.677mmol，4.0eq.)在DMSO(2mL)中在110℃搅拌过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至90/10)纯化，得到标题产物(41mg，65％)，为浅黄色固体。MS m/z 376.2[M+H+]。
实施例14
7-[(3R，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000651
在密封试管中，将7-氟-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体1；50mg，0.169mmol)和顺式-2，6-二甲基哌嗪(77mg，0.677mmol，4.0eq.)在DMSO(2mL)中在110℃搅拌过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至90/10)纯化，得到标题产物(41mg，62％)，为浅黄色固体。MS m/z 390.3[M+H+]。
实施例15
7-[(8aS)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000652
在密封试管中，将7-氟-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体1；50mg，0.169mmol)和(S)-八氢吡咯并[1，2-a]吡嗪(85mg，0.677mmol，4.0eq.)在DMSO(2mL)中在125℃搅拌过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至90/10)纯化，得到标题产物(36mg，53％)，为浅黄色固体。MS m/z 402.3[M+H+]。
实施例16
7-[(8aS)-8a-甲基-1，3，4，6，7，8-六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000661
在密封试管中，将7-氟-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体1；50mg，0.169mmol)和(S)-8a-甲基八氢吡咯并[1，2-a]吡嗪(95mg，0.677mmol，4.0eq.)在DMSO(2mL)中在125℃搅拌过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至90/10)纯化，得到标题产物(45mg，64％)，为浅黄色固体。MS m/z 416.3[M+H+]。
实施例17
7-[(8aR)-8a-甲基-1，3，4，6，7，8-六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000662
在密封试管中，将7-氟-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体1；100mg，0.339mmol)和(R)-8a-甲基八氢吡咯并[1，2-a]吡嗪(190mg，1.35mmol，4.0eq.)在DMSO(4mL)中在125℃搅拌过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至90/10)纯化，得到标题产物(45mg，64％)，为浅黄色固体。MS m/z 416.3[M+H+]。
实施例18
2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3R)-3-吡咯烷-1-基吡咯烷-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000671
在微波反应器中，将2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-氟-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体2；45mg，0.145mmol)、(R)-1，3′-联吡咯烷二盐酸盐(62mg，0.291mmol，2.0eq.)和DIPEA(0.20mL，1.16mmol，8eq.)在NMP(3mL)中在220℃搅拌1小时。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝98/2至90/10)纯化，得到标题产物(25mg，40％)，为浅黄色固体。MS m/z 430.3[M+H+]。
实施例19
7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000681
在密封试管中，将7-氟-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体1；50mg，0.169mmol)、DIPEA(0.24mL，1.35mmol，8eq.)和4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷二盐酸盐(62.7mg，0.339mmol，2.0eq.)在DMSO(2mL)中在125℃搅拌2天。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至90/10)纯化，得到标题产物(22mg，33％)，为浅黄色固体。MS m/z 388.3[M+H+]。
实施例20
7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000682
在密封试管中，将2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-氟-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体2；50mg，0.162mmol)、DIPEA(0.22mL，1.29mmol，4eq.)和4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷二盐酸盐(32mg，0.320mmol，3.0eq.)在DMSO(2mL)中在130℃搅拌48小时。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝98/2至95/5)纯化，得到标题产物(12mg，18％)，为浅黄色固体。MS m/z 402.3[M+H+]。
实施例21
2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3R)-3-吡咯烷-1-基吡咯烷-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000691
在密封试管中，将7-氟-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体1；40mg，0.135mmol)、DIPEA(0.19mL，1.08mmol，8eq.)和(R)-1，3′-联吡咯烷二盐酸盐(58mg，0.271mmol，2.0eq.)在DMSO(4mL)中搅拌并在微波中在220℃加热40分钟。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝98/2至90/10)纯化，得到标题产物(30mg，53％)，为浅黄色固体。MS m/z 416.3[M+H+]。
实施例22
2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-(3，3-二甲基哌嗪-1-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000692
在密封试管中，将2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-氟-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体2；40mg，0.129mmol)和2，2-二甲基哌嗪(59mg，0.517mmol，4.0eq.)在DMSO(1.6mL)中在130℃搅拌过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至9/1)纯化，得到标题产物(29mg，55％)，为浅黄色固体。MS m/z 404.3[M+H+]。
实施例23
7-(3，3-二甲基哌嗪-1-基)-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000701
在密封试管中，将7-氟-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体1；40mg，0.135mmol)和2，2-二甲基哌嗪(62mg，0.542mmol，4.0eq.)在DMSO(2mL)中在130℃搅拌过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至90/10)纯化，得到标题产物(26mg，49％)，为浅黄色固体。MSm/z 390.3[M+H+]。
实施例24
2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-9-甲基-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000702
在密封试管中，将2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-氟-9-甲基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体4；50mg，0.155mmol)和(S)-2-甲基哌嗪(62mg，0.619mmol，4.0eq.)在DMSO(2mL)中在125℃搅拌过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至90/10)纯化，得到标题产物(45mg，72％)，为浅黄色固体。MS m/z 404.3[M+H+]。
实施例25
2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-9-甲基-7-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000711
在密封试管中，将2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-氟-9-甲基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体4；50mg，0.155mmol)和(R)-2-甲基哌嗪(62mg，0.619mmol，4.0eq.)在DMSO(2mL)中在125℃搅拌过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至90/10)纯化，得到标题产物(40mg，70％)，为浅黄色固体。MS m/z 404.3[M+H+]。
实施例26
2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3R，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-9-甲基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000721
在密封试管中，将2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-氟-9-甲基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体4；50mg，0.155mmol)和顺式-2，6-二甲基哌嗪(70mg，0.619mmol，4.0eq.)在DMSO(2mL)中在125℃搅拌过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至90/10)纯化，得到标题产物(26mg，40％)，为浅黄色固体。MS m/z 418.3[M+H+]。
实施例27
2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-(3，3-二甲基哌嗪-1-基)-9-甲基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000722
在密封试管中，将2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-氟-9-甲基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体4；50mg，0.155mmol)和2，2-二甲基哌嗪(35mg，0.309mmol，2.0eq.)在DMSO(2mL)中在125℃搅拌过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至90/10)纯化，得到标题产物(36mg，56％)，为浅黄色固体。MS m/z 418.3[M+H+]。
实施例28
7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-9-甲基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000731
在密封试管中，将2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-氟-9-甲基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体4；50mg，0.155mmol)、DIPEA(0.21mL，1.24mmol，8eq.)和4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷二盐酸盐(57mg，0.309mmol，2.0eq.)在DMSO(2mL)中在125℃搅拌2天。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至90/10)纯化，得到标题产物(17mg，26％)，为浅黄色固体。MS m/z 416.3[M+H+]。
实施例29
2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3S，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000732
在密封试管中，将2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-氟-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体2；50mg，0.162mmol)、TEA(0.18mL，1.29mmol，8eq.)和(2S，6S)-2，6-二甲基哌嗪二盐酸盐(90mg，0.485mmol，3.0eq.)在DMSO(2mL)中在140℃搅拌过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至9/1)纯化，得到标题产物(20mg，30％)，为浅黄色固体。MS m/z 404.3[M+H+]。
实施例30
2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3S)-3-吡咯烷-1-基吡咯烷-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000741
在密封试管中，将2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-氟-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体2；50mg，0.162mmol)、DIPEA(0.22mL，1.29mmol，8eq.)和(S)-1，3′-联吡咯烷二盐酸盐(103mg，0.485mmol，3.0eq.)在NMP(2mL)中在140℃搅拌过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至9/1)纯化，得到标题产物(22mg，32％)，为浅黄色固体。MS m/z 430.3[M+H+]。
实施例31
2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3S)-3-吡咯烷-1-基吡咯烷-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000751
在密封试管中，将7-氟-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体1；75mg，0.254mmol)、TEA(0.28mL，2.03mmol，8eq.)和(S)-1，3′-联吡咯烷二盐酸盐(162mg，0.762mmol，3.0eq.)在NMP(4mL)中搅拌，并在微波中在220℃加热1小时。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至90/10)纯化，得到标题产物(12mg，11％)，为浅黄色固体。MS m/z 416.2[M+H+]。
实施例32
7-[(3S，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000752
在密封试管中，将7-氟-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体1；75mg，0.254mmol)、TEA(0.28mL，2.03mmol，8eq.)和(2S，6S)-2，6-二甲基哌嗪二盐酸盐(143mg，0.762mmol，3.0eq.)在DMSO(3mL)中搅拌并在140℃加热过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至90/10)纯化，得到标题产物(10mg，10％)，为浅黄色固体。MS m/z 390.3[M+H+]。
实施例33
9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000761
在密封试管中，将7-氟-9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体3；250mg，0.808mmol)和(S)-2-甲基哌嗪(405mg，4.04mmol，5，0eq.)在DMSO(6mL)中搅拌并在130℃加热过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至85/15)纯化，得到标题产物(135mg，43％)，为浅黄色固体。MS m/z 390.3[M+H+]。
实施例34
9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000762
在密封试管中，将7-氟-9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体3；250mg，0.808mmol)和(R)-2-甲基哌嗪(405mg，4.04mmol，5.0eq.)在DMSO(6mL)中搅拌并在130℃加热过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至85/15)纯化，得到标题产物(100mg，32％)，为浅黄色固体。MS m/z 390.3[M+H+]。
实施例35
7-[(3R，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000771
在密封试管中，将7-氟-9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体3；250mg，0.808mmol)和(2S，6R)-2，6-二甲基哌嗪(461mg，4.04mmol，5.0eq.)在DMSO(6mL)中搅拌，并在130℃加热过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至85/15)纯化，得到标题产物(101mg，31％)，为浅黄色固体。MS m/z 404.3[M+H+]。
实施例36
7-(3，3-二甲基哌嗪-1-基)-9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000772
在密封试管中，将7-氟-9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体3；250mg，0.808mmol)和2，2-二甲基哌嗪(461mg，4.04mmol，5.0eq.)在DMSO(6mL)中搅拌并在130℃加热过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至85/15)纯化，得到标题产物(120mg，36％)，为浅黄色固体。MS m/z 404.3[M+H+]。
实施例37
7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000781
在密封试管中，将7-氟-9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体3；125mg，0.404mmol)、K2CO3(223mg，1.62mmol，4eq.)和4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷二盐酸盐(112mg，0.606mmol，1.5eq.)在DMA(2mL)中搅拌，并在130℃加热过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至90/10)纯化，得到标题产物(75mg，46％)，为浅黄色固体。MS m/z 402.2[M+H+]。
实施例38
7-[(3S，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000791
在密封试管中，将7-氟-9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体3；125mg，0.404mmol)、K2CO3(223mg，1.62mmol，4eq.)和(2S，6S)-2，6-二甲基哌嗪二盐酸盐(113mg，0.606mmol，1.5eq.)在DMA(2mL)中搅拌并在130℃加热过夜。将溶剂在高真空下除去。将剩余物放入CH2Cl2中并用NaHCO3的饱和水溶液洗涤。将有机层分离并用Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至90/10)纯化，得到标题产物(50mg，31％)，为浅黄色固体。MSm/z 404.3[M+H+]。
实施例39
7-[(3R)-3-乙基哌嗪-1-基]-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure BDA0001658050020000792
在密封试管中，将7-氟-2-(2-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(中间体1；200mg，0.677mmol)、K2CO3(374mg，2.71mmol，4eq.)和(R)-2-乙基哌嗪二盐酸盐(238mg，0.606mmol，1.5eq.)在DMA(3mL)中在100℃搅拌4天。将溶剂在高真空下除去。将粗制品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝95/5至8/2)纯化，得到标题产物(168mg，64％)，为浅黄色固体。MS m/z 390.2[M+H+]。
实施例40
培养细胞中的SMN2小基因mRNA剪接RT-qPCR测定
为了更详细地描述并且有助于理解本说明书，提供以下非限制性生物学实施例以更全面地说明本说明书的范围，并且其不被视为具体地限定其范围。现在已知的或可以之后开发的本说明书的此种变化(其将在本领域技术人员确定的范围内)被认为落在本说明书的和如下文所要求保护的范围内。这些实施例举例说明了本文所述的某些化合物的体外和/体内测试并且证明了所述化合物通过增强SMN2的外显子7包括在由SMN2基因转录的mRNA中来治疗SMA的有用性。式(I)的化合物增强SMN2的外显子7在由SMN2基因转录的mRNA中的包含并且提高了由SMN2基因产生的SMN蛋白的水平，并且因此可以用于治疗有此需要的人类受治者中的SMA。这些实施例还举例说明了本文所述的某些化合物的体外和/体内测试并且证明了所述化合物增强SMNI的外显子7在由SMN1基因转录的mRNA中的包含的有用性。因此，式(I)的化合物还增强了SMN1的外显子7在由SMN1基因转录的mRNA中的包含并且提高了由SMN1基因产生的SMN蛋白的水平。
将基于反转录-定量PCR(RT-qPCR)的测定用于量化含有SMN2外显子7的全长SMN2小基因(本文中被称为术语“FL SMN2mini”)mRNA在稳定转染有所述小基因并用测试化合物处理的HEK293H细胞系中的水平。使用的材料及各自来源列在下表1中。
Figure BDA0001658050020000801
Figure BDA0001658050020000811
表1.培养细胞中的SMN2小基因mRNA剪接RT-qPCR测定中使用的材料及其各自的来源。
制备SMN2-A小基因构建体，如在国际专利申请WO2009/151546A1第145页第[00400]段至第147页第[00412]段中所述(包括其中的图1和图3)。
将稳定转染有SMN2-A小基因构建体的HEK293H细胞(10,000个细胞/孔)接种在位于96孔平底板中的200μL细胞培养基(DMEM加上10％FBS以及200μg/mL潮霉素)中，并将所述平板立即旋动以保证细胞适当的分散并且形成均匀细胞单层。允许细胞附着达6小时。将测试化合物在100％DMSO中连续稀释3.16倍以产生7个点的浓度曲线。将测试化合物的溶液(1μL，200x，在DMSO中)添加到各个包含细胞的孔中并将平板在细胞培养箱(37℃，5％CO2，100％相对湿度)中温育24小时。为每个测试化合物浓度制备2个重复试样。然后将细胞在Cells-To-Ct裂解缓冲液中裂解并将溶解产物存储在-80℃。
使用WO2014/209841A2中第80页表1中指示的引物和探针来量化全长SMN2-A小基因和GAPDH mRNA。引物SMN正向A (SEQ ID NO.1)杂交至外显子7中的核苷酸序列(核苷酸22至核苷酸40)，引物SMN反向A(SEQ ID NO.2)杂交至萤火虫荧光素酶的编码序列中的核苷酸序列，SMN探针A(SEQ ID NO.3)杂交至以下各项中的核苷酸序列：外显子7(核苷酸50至核苷酸54)和外显子8(核苷酸1至核苷酸21)。这三种寡核苷酸的组合只检测SMN1或SMN2小基因(RT-qPCR)而不检测内源的SMN1或SMN2基因。
以0.4μM的终浓度使用SMN正向和反向引物。以0.15μM的终浓度使用SMN探针。以0.2μM的终浓度使用GAPDH引物并且以0.15μM的终浓度使用探针。
通过将以下各项组合来制备SMN2-小基因GAPDH混合物(15μL总体积)：7.5μL的2xRT-PCR缓冲液，0.4μL的25x RT-PCR酶混合物，0.75μL的20x GAPDH引物-探针混合物，4.0075μL的水，2μL的10倍稀释的细胞溶解产物，0.06μL的100μM SMN正向引物，0.06μL的100μM SMN反向引物，和0.225μL的100μM SMN探针。
在以下温度进行PCR达指定的时间：步骤1：48℃(15min)；步骤2：95℃(10min)；步骤3：95℃(15sec)；步骤4：60℃(1min)；然后重复步骤3和4达总计40个循环。
各个反应混合物包含SMN2-A小基因和GAPDH引物/探针组(多元设计)两者，允许同时测量两种转录物的水平。
使用改进的ΔΔCt方法(如在Livak和Schmittgen，Methods，2001，25：402-8中所述)，由实时PCR数据确定相对于用载体对照处理的细胞的FL SMN2mini mRNA的丰度的增加。扩增效率E计算自单独对于FL SMN2mini和GAPDH的扩增曲线的斜率。然后，FL SMN2mini和GAPDH mRNA的丰度计算为(1+E)-Ct，其中Ct是每个扩增子的阈值。将FLSMN2mini mRNA的丰度相对于GAPDH mRNA丰度进行归一化。然后将来自用测试化合物处理的样品的归一化的FL SMN2mini mRNA丰度除以来自用载体处理的细胞的归一化的FL SMN2mini mRNA丰度，以确定相对于载体对照的FL SMN2mini mRNA的水平。
表2提供了针对全长SMN2小基因mRNA生产的EC1.5x浓度，其获自根据以上用于特别的本发明的化合物的程序生成的7点浓度数据。
特别的本发明的化合物显示≤1μM的针对全长SMN2小基因mRNA生产的EC1.5x浓度。
更特别的本发明的化合物显示≤0.1μM的针对全长SMN2小基因mRNA生产的EC1.5x浓度。
最特别的本发明的化合物显示≤0.02μM的针对全长SMN2小基因mRNA生产的EC1.5x浓度。
Figure BDA0001658050020000831
表2.针对全长SMN2小基因mRNA生产的EC1.5x浓度。
实施例41
培养的细胞中的SMN蛋白测定
将SMN HTRF(均相时间分辨荧光)测定用于量化用测试化合物处理的SMA患者成纤维细胞中的SMN蛋白的水平。使用的材料及各自来源列在下表3中。
Figure BDA0001658050020000832
Figure BDA0001658050020000841
表3.培养的细胞中的SMN蛋白测定中使用的材料及其各自来源。
将细胞解冻并在DMEM-10％FBS中培养72小时。将细胞胰蛋白酶化，计数并重悬在DMEM-10％FBS中至25,000个细胞/mL的浓度。将细胞悬浮液以5,000个细胞/孔铺板于96孔微滴定平板中并且温育3至5小时。将测试化合物在100％DMSO中连续稀释3.16倍以生成7个点的浓度曲线。将1μL的测试化合物溶液转移至含细胞的孔中并将细胞在细胞培养箱(37℃，5％CO2，100％相对湿度)中温育48小时。为每个测试化合物浓度设置三份重复样品。48小时后，将上清液自孔中取出并将含有蛋白酶抑制剂的25μL的RIPA裂解缓冲液添加到孔中并在摇动的情况下在室温温育1小时。加入25μL的稀释剂，然后将35μL所得的溶胞产物转移至384孔板，其中每个孔含有5μL的抗体溶液(抗-SMN d2和抗-SMN穴合物在SMN重构缓冲液中的1∶100稀释液)。将所述平板离心1分钟以使溶液来到孔的底部，然后在室温温育过夜。在EnVision多标记平板读数计(Perkin-Elmer)上测量平板的各个孔在665nm和620nm的荧光。
通过用在665nm的信号除以在620nm的信号来计算每个样品、空白和载体对照孔的归一化的荧光信号。归一化信号解决了由于溶胞产物的基体效应所致的可能的荧光猝灭。各样品孔的ΔF值(作为百分比值的SMN蛋白丰度的量度)通过以下方式计算：从各样品孔的归一化的荧光减去空白对照孔的归一化的平均荧光，然后用该差值除以空白对照孔的归一化的平均荧光，并将所得的值乘以100。各个样品孔的ΔF值表示来自用测试化合物处理的样品的SMN蛋白丰度。将各个样品孔的ΔF值除以载体对照孔的ΔF值以计算相对于载体对照的SMN蛋白丰度的倍数增加。表4提供了针对SMN蛋白表达的EC1.5x浓度，其获自根据以上用于本发明的特别的化合物的程序生成的7点浓度数据。
特别的本发明的化合物显示≤1μM的针对SMN蛋白表达的EC1.5x浓度。
更特别的本发明的化合物显示≤100nM的针对SMN蛋白表达的EC1.5x浓度。
最特别的本发明的化合物显示≤30nM的针对SMN蛋白表达的EC1.5x浓度。
表5提供了SMN蛋白的最大倍数增加，其获自根据以上用于本发明的特别的化合物的程序生成的7点浓度数据。
特别的本发明的化合物显示＞1.5的最大倍数增加。
更特别的本发明的化合物显示＞1.7的最大倍数增加。
最特别的本发明的化合物显示＞1.8的最大倍数增加。
Figure BDA0001658050020000851
表4.对于SMN蛋白表达的EC1.5x浓度。
Figure BDA0001658050020000861
表5.SMN蛋白的最大倍数增加。
实施例42
7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(实施例20)的体外测定
实施例20的化合物是用于治疗SMA的口服可用小分子SMN2剪接调节剂。已发现，通过将选择性剪接反应的平衡完全转移朝向SMN2外显子7的包含和全长mRNA的生产，实施例20的化合物有效地校正了培养的患者细胞(1型SMA成纤维细胞)中的人SMN2前mRNA的剪接功能障碍(图1A：EC50对于FL为29±8nM，对于Δ7 mRNA为12±1nM)。利用增大浓度的实施例20的化合物处理表达SMN2小基因的细胞导致SMN2小基因全长mRNA的量剂量依赖性地增加。EC1.5x为4.7±0.7nM并且最大诱导为20倍。小基因测定结果确认实施例20的化合物是有效的SMN2剪接调节剂。
为了考察由于选择性剪接所致的SMN蛋白生产，进行体外测定以评估在成纤维细胞中和在脊髓运动神经元中来源于SMA患者iPSC(诱导多能干细胞)的SMN蛋白的水平(分别地EC50为12±3nM，和EC50 182±114nM)。高于未处理细胞的SMN蛋白的最大增加导致在两种细胞型中类似的水平(60-80％；图1B和1C)，这表明在来自SMA患者的不同细胞型中，实施例20的化合物在体外作为校正功能障碍SMN2剪接的结果而增加SMN蛋白水平。
为了进一步评估SMN2剪接作为潜在血液生物标志物，利用来自健康自愿者的全血细胞来开发体表外(ex vivo)测定，其中在用实施例20的化合物处理之后4小时(在此时间点，获得最大剪接变化)评估SMN1和SMN2剪接。SMN1剪接很大程度地未受影响，而SMN2剪接剂量依赖性地朝向包含外显子7改变(图1D)。对剪接的作用在高于100nM的实施例20的化合物的浓度下是明显的，表明血液中的这些水平需要利用此测定来观察对SMN2剪接的体内药效(PD)作用。
实施例43
7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(实施例20)的体内测定
在体内，实施例20的化合物在重度SMNΔ7模型和轻度C/C-等位基因模型(带有人SMN2转基因)中增大脑和肌肉中的SMN蛋白。成年C/C-等位基因小鼠用赋形剂或实施例20的化合物(1、3或10mg/kg PO，每天)处理10天，并且将3日龄(P3)SMNΔ7小鼠用赋形剂或实施例20的化合物(0.1、0.3、1或3mg/kg IP，每天)处理7天。实施例20的化合物剂量依赖性地增加脑和肌肉组织中的SMN蛋白水平，其中2-3倍增加的最大效果在成年C/C-等位基因小鼠在10mg/kg达到并且在新生SMNΔ7小鼠中在1-3mg/kg达到(图2)。因此，在10mg/kg剂量下在C/C-等位基因小鼠的肌肉中，获得的SMN水平没有不同于在杂合型小鼠中的那些。在SMNΔ7小鼠中，SMN蛋白增加在脑和肌肉二者中仅为一部分，达到杂合型小鼠中的蛋白水平的大约43％(脑)和55％(肌肉)。这些数据证实，实施例20的化合物增加了SMA的转基因小鼠模型的脑和肌肉组织二者中的SMN蛋白。
在重度和轻度SMA小鼠模型中评估功能益处。SMNΔ7小鼠从P3至P23每天一次地通过IP注射赋形剂或实施例20的化合物进行处理，并且从P24开始每天一次地通过口腔灌胃处理。在处理期期间，监测体重和动物存活。在100天观察期内，仅两只杂合型同窝幼畜死亡。相反，在P21之前所有赋形剂处理的小鼠死亡，其中中位存活时间(MST)为10.5天。实施例20处理剂量依赖性地延长动物存活(图3A)。在较低剂量(0.1mg/kg IP直至P23和之后的0.3mg/kg PO)下观察到MST的较小但显著地延长至P26。中间剂量(0.3mg/kg IP至P23和之后的1mg/kg PO)、中间/高剂量(1mg/kg IP至P23和之后的3mg/kg PO)以及高剂量(3mg/kgIP至P23和之后的10mg/kg PO)处理组分别导致80％、82％和73％的动物存活直至P100，与在P100具有83％存活的杂合型同窝幼畜没有不同。
在整个研究中SMNΔ7小鼠的体重增加严重受损并且经由低剂量的实施例20的化合物轻微校正。如相比于不显示任何SMA相关的表型的杂合型同窝幼畜，利用中间剂量、中间/高剂量和高剂量的实施例20的化合物的处理在体重增益方面分别导致71％、82％和85％的恢复率(图3B)。这些数据表明，当用药在P3开始时，利用实施例20的化合物的处理剂量依赖性地防止SMA表型在严重受影响SMNΔ7小鼠中的表现。
最后，实施例20的化合物在体内在重度SMA小鼠模型中改善神经肌肉连接性。SMNΔ7小鼠从P3至P14通过每天一次地通过IP施用赋形剂或者0.1、0.3、1mg/kg实施例20进行处理。在P14，在最后一个剂量之后1小时，对脊髓和肌肉组织进行加工以进行组织学评估。相对于杂合型同窝幼畜，SMNΔ7小鼠显示水泡型谷氨酸转运体1(vGlutl)本体感受运动神经元输入的显著损失、运动轴突的损失、最长肌中的神经肌肉接头(NMJ)去神经、和肌肉萎缩。相对于赋形剂处理的SMNΔ7小鼠，实施例20处理剂量依赖性地且显著地增加vGlut 1输入的数量、运动轴突的数量、完全神经支配NMJ的百分比和在伸趾长肌(EDL)肌肉中的纤维尺寸(图4)。这些数据表明，当在P3开始时，利用实施例20的化合物的处理保护NMJ去神经的中枢和外周方面并且防止在严重受影响的SMNΔ7小鼠中的肌肉萎缩。
实施例44
7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(实施例20)的转录谱分析
为了鉴别由实施例20的化合物选择性地剪接的其他潜在基因，进行转录谱分析，其揭示了，几个基因的剪接事件在121nM(EC90，高于EC5010倍)的治疗相关浓度下也受影响：STRN3、SLC25A17和GGCT(相比于对照)。STRN3、SLC25A17和GGCT的特异性功能及其失调的后果迄今还没有被阐明。还一致地发现这三个基因在更高剂量(高于EC905倍)下受影响，使用所述剂量以举例说明此化合物的最大效应。11个基因(包括基因FoxM1和MADD)的剪接事件在所述更高剂量下受影响但不受所述较低剂量影响。FoxM1和MADD已被描述为分别涉及细胞周期调节和细胞凋亡。关于SMN2剪接调节剂的近期报告表明，相对于另一个分子NVS-SM1，实施例20的化合物是相对特异性的，对于所述另一个分子NVS-SM1存在其中剪接响应于处理而发生变化的39个候选事件[Palacino等，Nat Chem Biol.2015 Jul；11(7)：511-7]。
另外，转录谱分析证实，在用121nM剂量的实施例20的化合物处理后，0个基因的表达水平发生变化(p＜0.01)。这些数据证实了，相比于关于另外的选择性SMN2剪接分子NVS-SM1(其中存在以大于±2-倍(p＜0.05)变化的175个基因)和NVS-SM3(其显著改变23个基因)的表达水平变化的公开数据[Palacino等，Nat Chem Biol.2015 Jul；11(7)：511-7]，该化合物的相对特异性。
FoxM1(一个由其他剪接调节剂化合物选择性地剪接的基因)编码细胞周期调节因子。仅在人和高级灵长类动物中，转录失活的FoxM1a变体含有外显子9(FL)并且转录活性的FoxM1b/c变体缺乏外显子9(Δ9)[Ye等，Future Oncol.2007年二月；3(1)：1-3.Laoukili等，Biochim Biophys Acta.2007年一月；1775(1)：92-102]。使用利用对于FoxM1a(FL)和FoxM1b/c(Δ9)的特异性引物的RT qPCR，确认了在实施例20处理后FoxM1的选择性剪接的改变(EC50对于FL为67±32nM，对于Δ9 mRNA为139±43nM，参见图5)。增加的FoxM1A同种型的表达，连同降低的缺乏外显子9的FoxM1A同种型的表达，具有破坏和抑制细胞周期进展的能力(如果剪接变化处于生物学显著性的水平)。因此，实施例20的化合物以类似方式对于SMN2和FoxM1剪接机制起作用，但具有关于蛋白功能的相反结果并且处于不同程度。对于MADD的EC50是未知的，所述MADD是一种也被鉴别为受处于高浓度的剪接调节剂(包括实施例20的化合物)影响且已知涉及细胞凋亡过程的基因。
实施例46
包含奥利索西的药物组合物
包含奥利索西(olexosime)的组合物的实例描述于US2010099652A1。奥利索西在固态是稳定的(在25℃/60％RH下＞36个月)，在长期和加速应力条件下在纯度分布方面没有展现出变化。奥利索西在整个生理pH范围上具有低的水溶解性(小于5μg/ml)。其在一系列非水溶剂中是随意可溶的或可溶的。
为了提供用于宽龄范围的适龄制剂，已经开发了口服液体组合物。已发现，由于优越的稳定性性能所致，通过制备奥利索西粉末在芝麻油中的口服或胃悬浮液，可以获得特别有益的药物组合物。奥利索西在芝麻油中的溶解性(大约35mg/ml)不足于能够实现溶液的制备同时限制被受试者吸收的油的量。在没有另外的赋形剂的情况下适口性(味道，气味和质地)是可接受的。
将7.5g结晶奥利索西粉末(具有d90值70-90μm的粒度分布)经由搅拌(振荡)悬浮在75ml(61.6g)作为赋形剂的芝麻油(精炼)中，以得到均匀混悬剂(最终奥利索西浓度为100mg/ml)。已发现，关于降解、外观、颜色、含量均一性和微生物极限，这样的口服混悬剂在25℃/60％RH下稳定至少3个月。
实施例45
包含7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮的口服溶液
为了提供足够高的药物浓度，通过将药物物质溶解在pH小于pH4，特别是pH 3.4的缓冲体系，例如柠檬酸缓冲液、苹果酸盐、马来酸盐或酒石酸盐缓冲液，更特别地是苹果酸盐或酒石酸盐，最特别地是酒石酸盐缓冲液中，可以将7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(即实施例20的化合物)配制为口服水溶液。
实施例20的化合物的制剂的长期稳定性通过制备用于构建口服溶液的干燥粉末或颗粒来实现。通过选择作为细结晶粉末的有机酸及其盐，例如柠檬酸三钠二水合物和无水柠檬酸、苹果酸钠和苹果酸，或优选地酒石酸钠钾和酒石酸，可以将缓冲体系结合到干燥制剂中。
包含实施例20的化合物的粉末或颗粒可以包含颗粒外填料，如山梨糖醇、异麦芽糖醇或甘露糖醇及其组合，这确保了在构建口服溶液期间粉末共混物的快速溶解。在稀释剂的引入中，粉末共混物可以通过干燥压实进行粒化，以改善流动性以及确保良好的均匀性。
用于构建用于实施例20的化合物的溶剂体系的成分可以配制为单独的制剂。在开始口服溶液的在用期时，构建的溶剂可以用于在瓶中溶解实施例20的化合物。
通过使用稳定剂和抗氧化剂，如维生素E TPGS、依地酸二钠、丁基羟基甲苯、核黄素或优选地抗坏血酸，及其组合，实施例20的化合物在缓冲液中构建的口服溶液可以提供超过2周的在用时间。
表6提供了多个提供在溶液中超过2周的稳定性的口服溶液。
Figure BDA0001658050020000911
Figure BDA0001658050020000921
表6.浓度为0.1mg/ml、1.0mg/ml和3.0mg/ml的7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮的口服溶液。
实施例46
作为用于构建7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮的口服溶液的赋形剂的粉末共混物
表7代表用于构建溶剂的粒化粉末共混物，其适合于溶解7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮，以及获得稳定超过2周的在pH3.5的口服溶液。所述共混物含有作为水溶性润滑剂的聚乙二醇6000、作为防腐剂的苯甲酸钠、作为增甜剂的三氯蔗糖，以及用于改善味道目的草莓香料(特别是用于儿科患者)。
表7的组合物与80ml水一起提供适用于溶解7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(分别为80mg、240mg和400mg)的构建溶剂。
Figure BDA0001658050020000922
Figure BDA0001658050020000931
表7.用于构建在pH 3.4的7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮的口服溶液的赋形剂的粉末共混物，其中API浓度为1.0、3.0和5.0mg/ml。
实施例47
用于构建口服溶液的7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮的粉末共混物
表8代表包含7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮的口服溶液，其通过使用构建的用于溶解活性化合物的来自实施例46的赋形剂溶液进行构建。该赋形剂适用于构建在pH3.4的口服溶液，其稳定超过2周。表8的组合物与80ml水一起提供分别(resp.)包含1mg/ml、3mg/ml、5mg/ml的7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮的口服溶液。
Figure BDA0001658050020000932
Figure BDA0001658050020000941
表8.在pH 3.5的包含7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮的口服溶液的口服溶液构建，其中API浓度为1.0、3.0和5.0mg/ml。
实施例48
用于构建口服溶液的7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮的粉末共混物
表9提供包含7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮的粉末共混物，其可以用来与90ml水一起构建口服溶液。表9的组合物也可以由用赋形剂粉末共混物制备的溶剂(类似于实施例46)以及随后API的溶解而构建。
Figure BDA0001658050020000942
Figure BDA0001658050020000951
表9.在含有90ml的瓶中的浓度为1.0mg/ml的7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮的口服溶液。
实施例49
用于构建口服溶液的7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮的粉末共混物
表10提供了包含7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮的粉末共混物，其可以用来与80ml水一起构建口服溶液。表10的组合物也可以由用赋形剂粉末共混物制备的溶剂(类似于实施例46)以及随后API的溶解而构建。
Figure BDA0001658050020000952
表10.用于在含有80ml水的瓶中制备浓度为1mg/ml的7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮的口服溶液的粉末共混物。
实施例50
7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮的口服溶液的稳定性
表11提供7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮的多种溶液的稳定性的比较，表示为按百分比计的API纯度。已发现API在考察的所有口服溶液中都是稳定的，它们在环境温度以及在5℃下的几周内没有显著降解。
实施例45的组合物1A包含0.1mg/ml在柠檬酸盐缓冲体系中的API以及作为抗氧化剂的抗坏血酸和作为稳定剂的依地酸二钠。
实施例46的组合物2A利用200ml的水来溶解200mg的API而构建(1mg/ml)。
实施例48的组合物3A和3B由API粉末共混物连同90ml的水构建(1mg/ml)。
Figure BDA0001658050020000961
表11.在琥珀色玻璃瓶中在5℃或25℃储存的多种组合物的溶液的稳定性。
实施例51
包含7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮和奥利索西的油包水型乳液
对于利用一个单一组合物的实施例20的化合物连同奥利索西一起的联合用药，通过构建口服悬浮液可以将实施例20的化合物的含水口服溶液与奥利索西的油性溶液合并。奥利索西的油性溶液(如例如在实施例46中)可以转移到含有实施例20的化合物的构建溶液的瓶中，并且随后可以通过手动振荡该封闭的瓶达5-20次，优选10次而形成乳液。奥利索西的油性溶液是在芝麻油中的溶液，其可以含有乳化剂和/或亲脂性增溶剂如单油酸甘油酯fPeceolTM、Inwitor 948TM、Capmul GMOTM)、单亚油酸甘油酯(Maisine 35-1TM)、单油酸失水山梨糖醇酯(Span 80TM)或油酸，以增大奥利索西在油性溶剂中的溶解性并且使得当将其与实施例20的化合物的溶液合并时能够由该油性溶液形成乳液。分散在优选溶剂中(任选地在溶解奥利索西之前施加热)的乳化剂和增溶剂可以与HLB值为小于7的更大极性表面活性剂，例如聚山梨酯80(Tween 80TM)、辛酰己酰聚氧甘油酯(LabrasolTM)合并，以提供在构建后更高分散性和更长物理稳定性的乳液。取决于所选的具有低HLB的亲脂性表面活性剂和具有高HLB值的更大亲水性表面活性剂之间的比率，所述乳液可以具有作为分散的内相的水相或油相。
表12提供适用于形成油包水型乳液的油性赋形剂的2个实例，所述油包水型乳液包含在水相中的7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮和在脂相(lipidic phase)中的奥利索西。
Figure BDA0001658050020000971
表12：用于奥利索西以与7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮口服溶液构建油包水型乳液的油性赋形剂。
在多至30％(w/w)酒石酸盐缓冲水溶液pH3.3的组合物4A和4F的情况下可以在10次振荡后分散为乳液。该溶液目测是均匀的，持续至少15分钟。
表3(组合物5A)代表用于制备7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮的水溶液的溶液。
Figure BDA0001658050020000981
表13：用于7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮的含水溶剂。
图6提供了组合物4A在添加酒石酸盐缓冲溶液之前(A)和在刚刚添加20％(B)或30％(C)的酒石酸盐缓冲溶液(组合物5A)并由此得到油包水型乳液之后的照片。
图7提供了包含70％组合物4A和30％组合物5A的油包水型乳液在构建后15分钟(A)(10次振荡)和构建后30min(B)(10次振荡)的照片。
图8提供了组合物4F在添加酒石酸盐缓冲溶液之前(A)和在刚刚添加20％(B左图)、25％(B中间图)或30％(B右图)的酒石酸盐缓冲溶液(组合物5A)并由此得到油包水型乳液之后的照片。
图9提供了包含70％组合物4F和30％组合物5A的油包水型乳液在构建后15分钟(A)(10次振荡)和构建后30min(B)(10次振荡)的照片。
制备的所有乳液稳定持续至少30分钟。
实施例52
包含7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮和奥利索西的油性溶液
作为乳液的备选，实施例20的化合物和奥利索西的共制剂可以通过将两种药物物质溶解在油性溶剂中制备，所述油性溶剂含有芝麻油和亲脂性表面活性剂，如单油酸甘油酯(PeceolTM、Inwitor 948TM、Capmul GMOTM)、单亚油酸甘油酯(Maisine 35-1TM)、单油酸失水山梨糖醇酯(Span 80TM)或油酸，以能够在该溶剂中实现改进的溶解性。
表14提供了油性溶剂系统，该油性溶剂系统对于两种药物提供了增大的溶解性，并且导致在构建后对于在用时间而言足够的稳定性(如表15中所显示的)。
Figure BDA0001658050020000991
表14. 100mg/ml奥利索西和10mg/ml7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮的油性溶液。
Figure BDA0001658050020000992
表15.油性溶液组合物6A和6B的稳定性。
实施例53
赋形剂的粉末共混物和由其构建的口服溶液的稳定性
表16提供了适用于构建在pH 3.4的包含7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮的口服溶液(例如0.25或1.5mg/ml)的赋形剂的干燥粒化粉末共混物。
在这些组合物中，已经使用达到目标pH所需的精确量的酒石酸代替由该酸和相应盐组成的缓冲液。如可以从表17看到的，可以证实所述溶液达至少17天的在用稳定性。
Figure BDA0001658050020001001
表16.用于构建的赋形剂的干燥粒化粉末共混物。
Figure BDA0001658050020001002
表17.包含大约0.25mg/ml或大约1.5mg/ml的7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(在表中标示为API)的口服溶液在利用80ml注射用水构建的组合物7a或7b的赋形剂溶液中的稳定性。
实施例54
7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮的粉末共混物和由其构建的口服溶液的稳定性
表18的组合物8a、8b、8c和8d的干燥粒化粉末共混物已包括API以简化用于所述溶液的构建程序。组合物8a至8d表现出减小的粉末填充重量并且含有异麦芽糖醇作为第二稀释剂以改善颗粒性质。如可从表19看到的，在溶液中多至一个月的优异稳定性在-注射用水和饮用水-二者的情况下可以得到证实。
Figure BDA0001658050020001011
表18.在pH 3.4的利用80ml注射用水构建的7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(0.25mg/ml或0.75mg/ml)的口服溶液的构建用干燥粒化粉末共混物。
Figure BDA0001658050020001021
表19.包含大约0.25mg/ml的7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(在表中标示为API)的口服溶液在利用80ml注射用水(即没有电解质的二次蒸馏水)或利用饮用水(包含电解质)构建的组合物8a的赋形剂溶液中的稳定性。

Claims (18)

1.一种药物组合物，所述药物组合物包含7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
Figure FDA0002818653650000011
或其药用盐；
其中所述组合物是口服水溶液或适用于构建口服水溶液的干粉，其中所述口服水溶液具有小于pH4的pH。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含柠檬酸盐、苹果酸盐、马来酸盐或酒石酸盐缓冲体系；或者备选地酒石酸。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物还包含选自以下各项的颗粒外填料：乳糖、淀粉、水解淀粉、麦芽糊精、微晶纤维素、甘露糖醇、山梨糖醇、蔗糖、葡萄糖、磷酸氢钙、硫酸钙及其组合。
4.根据权利要求1至2中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物还包含选自以下各项的稀释剂：乳糖、淀粉、水解淀粉、麦芽糊精、微晶纤维素、甘露糖醇、异麦芽糖醇、山梨糖醇、蔗糖、葡萄糖、磷酸氢钙、硫酸钙及其组合。
5.根据权利要求1至2中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物还包含选自以下各项的稀释剂：乳糖、淀粉、水解淀粉、微晶纤维素、甘露糖醇、山梨糖醇、蔗糖、葡萄糖、磷酸氢钙、硫酸钙及其组合。
6.根据权利要求1至2中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物还包含选自以下各项的防腐剂、稳定剂或抗氧化剂：维生素A、维生素C、维生素E、维生素E TPGS、棕榈酸视黄酯、硒、半胱氨酸、甲硫氨酸、柠檬酸、柠檬酸钠、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、依地酸二钠、丁基羟基甲苯、核黄素、抗坏血酸及其组合。
7.根据权利要求1至2中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物还包含选自山梨酸和苯甲酸钠的防腐剂。
8.根据权利要求1至2中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物还包含选自抗坏血酸的抗氧化剂。
9.根据权利要求1至2中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物还包含选自乙二胺四乙酸二钠的稳定剂。
10.根据权利要求1至2中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物还包含选自聚(乙二醇)的润滑剂。
11.根据权利要求1至2中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物包含：
·7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮或其药用盐；
·酒石酸；
·甘露糖醇与异麦芽糖醇的混合物；
·抗坏血酸；
·依地酸二钠；
·PEG6000；和
·苯甲酸钠。
12.根据权利要求1至2中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物包含：
·7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮或其药用盐；
·酒石酸；
·甘露糖醇与异麦芽糖醇的混合物；
·抗坏血酸；
·依地酸二钠；
·PEG6000；
·苯甲酸钠；
·三氯蔗糖；和
·草莓香料。
13.根据权利要求1至2中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物包含：
·1至10％wt的7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮或其药用盐；
·5至15％wt的缓冲体系，或者备选地单独的缓冲体系的相应酸；
·40至70％wt的稀释剂；
·1至4％wt的抗氧化剂；
·0.5至2％wt的稳定剂；
·0.5至2％w的润滑剂；
·1至8％wt的防腐剂，
·0至3％wt的增甜剂；和
·0至20％wt的香料；并且
其中成分的总量不超过100％wt。
14.根据权利要求1至2中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物包含：
·1至10％wt的7-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)-2-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮或其药用盐；
·5至15％wt的选自柠檬酸盐、苹果酸盐、马来酸盐或酒石酸盐的缓冲体系，或者备选地单独的酒石酸；
·40至70％wt的选自以下各项的稀释剂：甘露糖醇或甘露糖醇与异麦芽糖醇的混合物；
·1至4％wt的抗坏血酸；
·0.5至2％wt的依地酸二钠；
·0.5至2％w的PEG6000；
·1至8％wt的选自山梨酸或苯甲酸钠的防腐剂，
·0至3％wt的选自三氯蔗糖或糖精钠的增甜剂；和
·0至20％wt的选自草莓香料或香草香料的香料；并且
其中成分的总量不超过100％wt。
15.根据权利要求1至2中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物是口服水溶液。
16.根据权利要求1至2中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物是适用于构建口服水溶液的干粉。
17.一种用于制备药物组合物的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求16所述的干粉和作为构建用溶剂的水。
18.根据权利要求1至2中任一项的药物组合物，其用于由SMN1基因中的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能损失或缺陷相关的疾病的治疗、预防、延迟进展和/或改善。
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