BR112017000664B1

BR112017000664B1 - Anticorpo anti-pd-1, combinação de polinucleotídeos isolados, vetor de expressão, e composição farmacêutica

Info

Publication number: BR112017000664B1
Application number: BR112017000664-2A
Authority: BR
Inventors: Jie Liu
Original assignee: Livzon Mabpharm Inc
Priority date: 2014-07-30
Filing date: 2015-08-28
Publication date: 2024-04-30
Also published as: JP2018502044A; JP6654186B2; US20170210806A1; KR20180035728A; CN105330740B; EP3176180A1; CA2955541C; US10414821B2; EP3176180A4; RU2661678C1; CN105330740A; AU2015295946B2; KR102540601B1; EP3176180B1; WO2016015685A1; BR112017000664A2; CA2955541A1; AU2015295946A1

Abstract

A presente invenção refere-se a um anticorpo PD-1 ou fragmento funcional do mesmo e uso de tal anticorpo na preparação de medicamentos para o tratamento de tumores.

Description

CAMPO TÉCNICIO

[001] A presente invenção se refere a um novo anticorpo anti-PD- 1 ou um fragmento funcional do mesmo. Especificamente, a presente invenção se refere ainda ao uso de anticorpo na preparação de um medicamento para o tratamento de tumores.

TÉCNICA ANTERIOR

[002] A sinalização do correceptor da célula T é um importante mecanismo para regular rigorosamente as respostas imunes. As moléculas da superfície celular para cossinalização (incluindo coestimulação e cossupressão) podem ser divididas em duas famílias principais: superfamília da imunoglobulina (Ig) e superfamília do fator de necrose tumoral (TNF)-receptor do fator de necrose tumoral (TNFR). Geralmente, a ativação de células T é dependente dos peptídeos do antígeno apresentados por moléculas de HLA classe I ou II. A sinalização de correceptor irá aumentar ou evitar esta ativação. Por exemplo, o início e a maturidade de linfócitos em órgãos linfoides secundários podem ser promovidos, ou os seus efeitos de resposta em um organismo podem ser reforçados pela ativação de CD28 ou 4- 1BB com agonistas através das vias de coestimulação únicas. A ativação imune poderia ser atingida também pelo bloqueio de vias de sinalização de cossupressão com antagonistas, tais como proteína 1 de morte celular programada (PD-1), via de B7 homólogo 1 (B7-H1, também referido como PDL1), antígeno 4 de linfócitos T citotóxicos (CTLA4), atenuador de linfócitos B/ T (BTLA) e outras vias. Estas vias de sinalização de cossupressão desempenham um papel importante na regulação da tolerância imunológica, que fornecem sinais negativos que limitam, encerraram e/ou atenuam as respostas imunes. Ativação imune mediada por receptores de coestimulação é ativada por estimular a membrana-quinase proximal e produz a amplificação da cascata de fosforilação, enquanto receptores de cossupressão como CTLA4, PD1 e atenuador de linfócitos B/T (BTLA) recrutam fosfatase para inverter a fosforilação que é induzida pela ativação imune. As formulações biológicas de imunomoduladores podem ser amplamente utilizadas no tratamento de doenças relacionadas com a imunidade, para inibir a hiperfunção imune causada pela rejeição ao transplante, doença autoimune ou doença inflamatória ou para estimular a resposta imune a hipofunção imune como o câncer, infecção bacteriana crônica e infecção por vírus etc. Ao contrário das terapias principais com base em anticorpos monoclonais e proteínas de fusão recombinantes, ou seja, pela neutralização ou consumo de antígenos alvo ou células positivas alvo, as formulações biológicas imunomoduladoras regulam os sinais para o receptor de células T específico de antígeno (TCR) e receptor de células B (BCR) principalmente pela ligação ou regulação das moléculas de sinalização na superfície de células imunológicas do hospedeiro, assim como para controlar a direção e a intensidade da resposta linfocitária.

[003] O gene PD-1 está regulamentado positivamente quando hibridomas de células T sofrem apoptose e é nomeado como proteína 1 de morte celular programada. O PD-1 (CD279) é expressado em células T ativadas, células B e células mieloide ativadas (Ishida Y, Agata Y, Shibahara K, Honjo T. EMBO J. 1992, 1: 3887-3895) e também é expressado em macrófagos ativados, DC e monócitos, mas não está presente nas suas células imaturas (Agata Y, et al. Int. Immunol. 1996, 8: 765-772 ; Said E A, et al. Nature Med. 2010, 16: 452-459). Essas expressões reguladas positivamente de PD-1 na superfície celular podem inibir as respostas imunes e inatas capturadas de um organismo. O domínio intracelular de PD-1 contém dois sítios de tirosina, um é o motivo de inibição do imunorreceptor baseado em tirosina (ITIM) e o outro é o motivo de troca do imunorreceptor baseado em tirosina (ITSM). A fosforilação da tirosina em ITSM recruta tirosina fosfatase SHP2 e/ou SHP1. Estas fosfatases irão desfosforilar o ZAP70, CD3 e PKC, atenuando os sinais de células T. O PD-1 inibe principalmente a proliferação das células T e células B, fazendo com que as células sejam presas na fase G0/G1, e inibe a produção de citocinas de células T. Os animais com supressão da expressão PD-1 desenvolvem diversos fenótipos autoimunes, incluindo cardiomiopatia autoimune, síndromes do tipo lúpus com artrite e nefrite (Nishimura et al. Immunity. 1999, H: 141-51; Nishimura et al. Science. 2001, 291: 319-22). Além disso, o PD-1 também desempenha um papel importante na encefalomielite autoimune, lúpus eritematoso sistêmico (LES), doença enxerto contra hospedeiro (DECH), diabetes tipo I e artrite reumatoide, etc (Salama et al. J Exp Med. 2003, 198: 71-78; Prokunina e Alarcon-Riquelme, Hum MoI Genet. 1992, 13: R143; Nielsen et al. Lupus. 2004, 11: 510).

[004] Dois ligantes PD-1 têm sido relatados atualmente, PD- L1/B7H1/CD274 e PD-L2/B7-DC/CD273 (Freeman G J, et al. J. Exp. Med. 2000, 192: 1027-1034; Latchman Y, et al. Nature Immunol. 2001, 2: 261-268). O PD-L1 é expressado a um nível baixo em células imunes, tais como células B, células dendríticas, macrófagos e células T, e é regulada positivamente mediante a ativação de células. O PD- L1 também é expressado em órgãos não linfoides como células endoteliais vasculares, coração, pulmão, pâncreas, músculos, queratinócitos e placenta etc. A expressão de PD-L1 no tecido não linfoide revela que PD-L1 pode regular a função de células T autorreativas, células B e células mieloide em tecidos periféricos e pode também participar nas respostas inflamatórias de um órgão-alvo. A expressão de PD-L1 é principalmente regulada pelo interferon 1 ou 2, que são também os principais reguladores de PD-L1 em células endoteliais vasculares e células epiteliais. O PD-L1 também é expressado em células tumorais e está intimamente associado ao mau prognóstico. Várias infecções virais podem induzir a expressão de PD- L1 em tecidos de hospedeiros a um nível alto. Apesar da transcrição de PD-L2 ser encontrada em tecidos não hematopoiéticos como coração, fígado e pâncreas, a expressão de PD-L2/B7-DC na superfície celular é apenas limitada para os macrófagos e células dendríticas e depende da produção de IFNY e citocinas Th2. As expressões de PD-L1 e PD-L2 são também afetadas por estímulos diferentes. PD-L1 em macrófagos é induzido pela INFY, enquanto PD- L2 é regulado pelo IL-4. Um fenômeno semelhante também aparece sobre as células dendríticas. O estudo revela que PD-L1 pode preferencialmente regular a resposta de Th1, enquanto o PD-L2 regularia a resposta celular de Th2. PD-L1 e PD-L2 ambos podem inibir a proliferação das células T, produção de citocinas e adesão mediada por β1/β2 integrina. PD-L2 também pode desencadear a sinalização reversa de células dendríticas, resultando na produção de IL-12 e ativação de células T.

[005] O eixo de regulação PD-L1-PD-1 desempenha um papel chave no controle da ativação de células T humanas e a manutenção da tolerância imunológica do organismo e também é utilizado pela célula tumoral bem como o vírus na infecção pelo vírus crônica (Yao S, Chen L. Tendências Mol. Med. 2006, 12: 244-246; Zou W, Chen L. Nature Rev. Immunol. 2008, 8: 467-477). O PD-L1 é altamente expressado em uma variedade de tecidos de câncer humano (Dong et al, Nat. Med. 2002, 8: 787-9). A expressão de PD-L1 está associada à progressão e ao prognóstico ruim de certos tipos de malignidades (Thompson R H, et al. Cancer Res. 2006, 66: 3381-3385). A via PD- L1-PD1 também foi confirmada para promover depleção de células T (Zajac um J, et al. J. Exp. Med. 1998, 188: 2205-2213). A via PD-L1- PD1 causada por tumores ou vírus pode alcançar a fuga da vigilância imunológica do hospedeiro através de uma variedade de mecanismos, incluindo a promoção de inativação de células T, fadiga, falta de resposta e apoptose, induzindo a amplificação de células Tregs, e reforçando a capacidade intrínseca do tumor para resistir à morte e à apoptose. A interação de PD-1 e PD-L1 mediada por células cancerosas resulta na redução de linfócitos infiltrantes no tumor, a inibição da proliferação das células T mediada por receptores das células T e aumento da fuga imune (Dong et al. J. Mol. Med. 2003, 81: 281-7 ; Blank et al. Cancer Immunol. Immunother. 2005, 54: 307-314; Konishi et al. Clin. Cancer Res. 2004, 10: 5094-100).

[006] Até hoje, ainda não existe um método satisfatório que possa induzir a resposta imune efetiva para um paciente com câncer para bloquear especificamente o eixo de regulação PD-L1-PD-1 e para fornecer a ativação da resposta imune antitumoral e antiviral. Portanto, existe uma urgente necessidade de desenvolvimento e design de um método terapêutico que bloqueia especificamente o eixo de regulação PD-L1-PD-1, para superar a imunossupressão dos pacientes com câncer ou infecção crônica.

REVELAÇÕES DA INVENÇÃO

[007] Geralmente, a presente invenção fornece um novo anticorpo PD-1 ou um fragmento funcional do mesmo. Em especial, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo humanizado.

[008] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo ou fragmento funcional do mesmo que pode se ligar especificamente ao PD-1, onde o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, onde (i) cadeia pesada compreende H-CDR1, H-CDR2 e H-CDR3, que tem as sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NOs: 7, 8 e 11, ou 9, 10 e 11, respectivamente; e (ii) a cadeia leve inclui L-CDR1, L-CDR2 e L-CDR3, que têm as sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NOs:12, 13 e 14, respectivamente.

[009] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo ou fragmento funcional do mesmo que pode se ligar especificamente ao PD-1, onde (i) cadeia pesada compreende a região variável de cadeia pesada, que tem as sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO: 1, 2, 4 ou 5; e (ii) a cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve, que tem a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3 ou 6.

[0010] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo ou fragmento funcional do mesmo que pode se ligar especificamente ao PD-1, onde (i) cadeia pesada compreende a região variável de cadeia pesada, que tem as sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO: 4 ou 5; e (ii) a cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve, que tem a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6.

[0011] De preferência, o anticorpo anti-PD-1 da presente invenção é selecionado a partir de 10F8, 15H6, BA08-1 e BA08-2.

[0012] Ainda em um outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotídeo isolado, que codifica o anticorpo anti-PD-1 ou um fragmento funcional do mesmo da presente invenção.

[0013] Ainda em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma combinação de polinucleotídeos isolados, que compreende um polinucleotídeo de codificação de cadeia leve do anticorpo anti-PD-1 ou um fragmento funcional do mesmo da presente invenção, e um polinucleotídeo de codificação de cadeia pesada do anticorpo anti-PD- 1ou um fragmento funcional do mesmo da presente invenção.

[0014] Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece um vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo da presente invenção ou a combinação de polinucleotídeos da presente invenção, o polinucleotídeo se liga eficazmente a uma sequência regulatória que permite a expressão de um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo em uma célula hospedeira ou um sistema de expressão livre de células. De preferência, o vetor de expressão é um vetor viral ou um vetor não viral.

[0015] Ainda em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica, que compreende o anticorpo anti-PD-1 ou um fragmento funcional do mesmo da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0016] Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para o tratamento ou a prevenção de um câncer ou uma doença infecciosa em um indivíduo que dela necessite, que compreende a administração do anticorpo anti-PD-1 ou um fragmento funcional do mesmo, o polinucleotídeo, a combinação de polinucleotídeos, o vetor de expressão e/ou a composição farmacêutica da presente invenção ao indivíduo. Em algumas certas modalidades, o indivíduo recebeu ou pretende receber uma terapia com anticorpo anti-CD3.

[0017] Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para melhorar a resposta imune da célula T em um indivíduo que dela necessite, que compreende a administração do anticorpo anti-PD-1 ou um fragmento funcional do mesmo, o polinucleotídeo, a combinação de polinucleotídeos, o vetor de expressão e/ou a composição farmacêutica da presente invenção ao indivíduo. Em algumas modalidades, o reforço da resposta imune de células T inclui reforçar a produção de citocinas de células T, preferencialmente, a citocina inclui IL-2 e/ou IFN-Y. Em algumas modalidades preferidas, o reforço da produção de citocinas de células T inclui a produção de citocinas de células T estimulada por um anticorpo anti-CD3. Em algumas outras modalidades preferidas, o indivíduo é um paciente com câncer, por exemplo, um paciente com câncer positivo PD-L1, de preferência um paciente com câncer de pulmão e melanoma.

[0018] Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para promover a ativação da célula T em um indivíduo que dela necessite, que compreende a administração do anticorpo anti-PD- 1 ou um fragmento funcional do mesmo, o polinucleotídeo, a combinação de polinucleotídeos, o vetor de expressão e/ou a composição farmacêutica da presente invenção ao indivíduo. De preferência, o método inclui ainda a administração de um anticorpo anti-CD3 ao indivíduo.

[0019] Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para eliminar a inibição de PD-L1 na ativação da célula T em um indivíduo que dela necessite, que compreende a administração do anticorpo anti-PD-1 ou um fragmento funcional do mesmo, o polinucleotídeo, a combinação de polinucleotídeos, o vetor de expressão e/ou a composição farmacêutica da presente invenção ao indivíduo. De preferência, o método inclui ainda a administração de um anticorpo anti-CD3 ao indivíduo.

[0020] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um método (de preferência in vitro) para promover a ativação da célula T, que compreende colocar o anticorpo anti-PD-1 ou um fragmento funcional do mesmo, o polinucleotídeo, a combinação de polinucleotídeos, o vetor de expressão e/ou a composição farmacêutica da presente invenção em contato com as células T. De preferência, o método inclui ainda colocar um anticorpo anti-CD3 em contato com células T.

[0021] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um método (de preferência in vitro) para eliminar a inibição de PD-L1 na ativação da célula T, que compreende colocar o anticorpo anti-PD-1 ou um fragmento funcional do mesmo, o polinucleotídeo, a combinação de polinucleotídeos, o vetor de expressão e/ou a composição farmacêutica da presente invenção em contato com as células T. De preferência, o método inclui ainda colocar um anticorpo anti-CD3 em contato com células T.

[0022] Em ainda outro aspecto, o método da invenção fornece ainda uma terapia de combinação, que compreende a administração do anticorpo anti-PD-1 da presente invenção e um anticorpo anti-CD3 a um indivíduo que dela necessitem.

[0023] Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece o uso do anticorpo anti-PD-1 ou um fragmento funcional do mesmo da presente invenção na preparação de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de um câncer ou uma doença infecciosa.

[0024] Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece o uso do anticorpo anti-PD-1 ou um fragmento funcional do mesmo da presente invenção na preparação de um medicamento para o reforço da resposta imune da célula T. Em algumas modalidades, o reforço da resposta imune de células T inclui reforçar a produção de citocinas de células T, preferencialmente, a citocina inclui IL-2 e/ou IFN-Y. Em algumas modalidades preferidas, o reforço da produção de citocinas de células T inclui a produção de citocinas de células T estimulada por um anticorpo anti-CD3.

[0025] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 ou um fragmento funcional do mesmo da presente invenção pode ser utilizado para o tratamento de câncer positivo PD-L1 e câncer negativo PD-1. Em algumas certas modalidades, o câncer é o câncer de pulmão ou melanoma (por exemplo, câncer de pulmão positivo PD-L1 ou melanoma e/ou câncer de pulmão negativo PD-L1 ou melanoma), e a doença infecciosa é uma infecção pelo HIV ou uma infecção por vírus da hepatite B.

[0026] Em algumas certas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 ou um fragmento funcional do mesmo de acordo com a presente invenção bloqueia a interação entre PD-1 e PD-L1 e/ou a interação entre PD-1 e PD-L2.

[0027] Em algumas modalidades preferidas, o anticorpo anti-PD-1 ou um fragmento funcional do mesmo da presente invenção inclui ainda uma região constante da cadeia pesada da IgG4 ou IgGlhumana 4 e uma região constante de cadeia leve K humana.

[0028] A presente invenção também se refere a um método de triagem e preparação do anticorpo humanizado descrito acima: imunizar camundongos BLAC/C com proteína PD-1 humana, triagem de células B específicas de antígeno de camundongo de um alto título através de um citômetro de fluxo, clonar os genes da região variável de cadeia pesada e de cadeia leve de anticorpos com um método de RT-PCR, expressando então o anticorpo recombinante utilizando 293 células. Depois da purificação com proteína A e através de triagem para afinidade e bloquear a atividade de ligação com PD-L1, os anticorpos 10F8 e 15H6 são finalmente selecionados com a inesperada alta afinidade de PD-1 e capacidade de ativação de células T. As sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada dos anticorpos 10F8 e 15H6 são representadas por SEQ ID NO: 1 e 2, respectivamente; os dois anticorpos contêm a região variável de cadeia leve com a mesma sequência de aminoácidos, conforme representado pela SEQ ID NO: 3. As sequências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada (H-CDR1, H-CDR2 e H-CDR3) do anticorpo 10F8 são representadas por SEQ ID NOs: 7, 8 e 11, respectivamente; as sequências de aminoácidos das CDRs da cadeia pesada (H-CDR1, H-CDR2 e H-CDR3) do 15H6 são representadas por SEQ ID NOs: 9, 10 e 11, respectivamente; as sequências de aminoácidos das CDRs da cadeia leve (L-CDR1, L-CDR2 e L-CDR3) dos anticorpos 10F8 e 15H6 são representadas por SEQ ID NOs: 12, 13 e 14, respectivamente. Com base em suas sequências da região variável da cadeia pesada FR1, FR2, FR3 e de FR4, uma comparação é feita contra a da sequência do gene de anticorpos humanos e uma série de sequências de candidatos correspondentes das regiões variáveis de uma linha germinal humana anticorpos são encontrados, que são semelhantes com as sequências da região variável da cadeia pesada FR1, FR2, FR3 e FR4. As afinidades de ligação da série de sequências candidatas com moléculas HLA-DR são analisadas por um método de simulação por computador (em silício), para selecionar as sequências de estruturas de menor afinidade, para assim, finalmente estabelecer as sequências humanizadas de FR1, FR2, FR3 e FR4 da região variável da cadeia pesada. Com base nessas sequências de fotogramas, uma análise de modelo molecular de computador é aplicada para analisar a correspondente estrutura de resíduos de aminoácidos reservados no anticorpo murino necessários para suportar a configuração de CDR. As sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada dos anticorpos humanizados BA08-1 correspondente a 10F8 e anticorpo humanizado BA08-2 correspondente ao 15H6 são representadas por SEQ ID NOs: 4 e 5, respectivamente. A mesma análise é realizada na sequência da região variável de cadeia leve do anticorpo de camundongo. Com base nas sequências da região variável da cadeia leve FR1, FR2, FR3 e de FR4, uma comparação é feita contra a biblioteca de sequência do gene de anticorpo humano (NCBI Ig BLAST), e as sequências de candidatos correspondentes das regiões variáveis de uma linha germinal humana anticorpos são encontrados, que são semelhantes com as sequências da região variável da cadeia leve FR1, FR2, FR3 e FR4. As afinidades de ligação das sequências com moléculas HLA-DR são analisadas por análise de computador (em silício), e as sequências de estruturas de menor afinidade são selecionadas, para assim, finalmente estabelecer as sequências humanizadas de FR1, FR2, FR3 e FR4 da região variável da cadeia leve. Com base nessas sequências de fotogramas, uma análise de modelo molecular de computador é aplicada para analisar a estrutura estérea espacial do anticorpo de camundongo e para analisar os resíduos de aminoácidos de estrutura correspondentes reservados na cadeia leve do anticorpo murino necessários para suportar a configuração de CDR. As regiões variáveis de cadeia leve do anticorpo humanizado BA08-1 e anticorpo humanizado BA08-2 correspondente ao 10F8 e 15H6 são representadas por SEQ ID NO: 6.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0029] A Figura 1 mostra que os anticorpos BA-08-1 e BA-08-2 se ligam à proteína PD-1 com alta afinidade.

[0030] A Figura 2 mostra que os anticorpos BA-08-1 e BA-08-2 bloqueiam a ligação do PD-L1 para PD-1.

[0031] A Figura 3 mostra que os anticorpos BA-08-1 e BA-08-2 aumentam significativamente a produção de IL-2 de células T. As colunas mostram a partir da esquerda para a direita: controle negativo sem o anticorpo, controle positivo (anticorpo anti-CD3 sozinho), inibição de PD-L1 no anticorpo anti-CD3 estimulou a expressão de IL-2 (com a adição de PD-L1 e anticorpo anti-CD3), antagonismo do efeito inibitório de PD-L1 pelo anticorpo BA08-1 da presente invenção (com a adição de BA08-1, PD-L1 e anticorpo anti-CD3), antagonismo do efeito inibitório de PD-L1 pelo anticorpo BA08-2 da presente invenção (com a adição de BA08-2, PD-L1 e anticorpo anti-CD3), e antagonismo do efeito inibitório de PD-L1 por MK3475 (com a adição de MK3475, PD- L1 e anticorpo anti-CD3), conforme especificado nas legendas na parte inferior da figura.

[0032] A Figura 4 mostra que os anticorpos BA-08-1 e BA-08-2 aumentam significativamente a produção IFN-Y de células T. As colunas mostram a partir da esquerda para a direita: controle sem o anticorpo CD3, controle positivo (anticorpo anti-CD3 sozinho), inibição de PD-L1 no anticorpo anti-CD3 estimulou a expressão de IFN-Y (com a adição de PD-L1 e anticorpo anti-CD3), antagonismo do efeito inibitório de PD-L1 pelo anticorpo BA08-1 da presente invenção (com a adição de BA08-1, PD-L1 e anticorpo anti-CD3), antagonismo do efeito inibitório de PD-L1 pelo anticorpo BA08-2 da presente invenção (com a adição de BA08-2, PD-L1 e anticorpo anti-CD3), e antagonismo do efeito inibitório de PD-L1 por MK3475 (com a adição de MK3475, PD- L1 e anticorpo anti-CD3), conforme especificado nas legendas na parte inferior da figura.

[0033] A Figura 5 mostra os efeitos de anticorpos BA-08-1 e BA- 08-2 sobre a produção de citocinas por linfócitos.

[0034] A Figura 6 mostra os efeitos dos anticorpos BA-08-1 e BA- 08-2 sobre células tumorais (incluindo células de melanoma e células do câncer de pulmão) para inibir a produção de IL-2 de células T ativadas, onde PD-L1 é PD-L1 imobilizado.

[0035] A Figura 7 mostra a avaliação in vivo do efeito antitumoral do anticorpo anti-PD-1 humanizado usando camundongos Hu-PBL SCID tendo câncer de pulmão humano.

[0036] A Figura 8 mostra a avaliação in vivo do efeito antitumoral do anticorpo anti-PD-1 humanizado contra melanona.

MODALIDADES ESPECÍFICAS

[0037] A menos que definidos de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui terão o mesmo significado que normalmente entendido pelo versado na técnica. Para definições e terminologia na técnica, referência específica pode ser feita aos protocolos atuais em biologia molecular (Ausubel) por profissionais. As abreviaturas para resíduos de aminoácidos são as 3 letras padrão e/ou códigos de 1 letra para qualquer um dos 20 L-aminoácidos comumente utilizados na técnica.

[0038] A presente invenção fornece um anticorpo anti-PD-1 e um fragmento funcional do mesmo que pode se ligar ao fator 1 de morte programada (PD-1). O anticorpo ou fragmento funcional do mesmo da presente invenção tem pelo menos uma das seguintes características: ser capaz de bloquear a interação de PD-1 e PD-L1 com alta afinidade; ser capaz de se ligar ao PD-1 com alta especificidade; ativar células T específicas de tumor, assim matando as células tumorais; reforçar significativamente a resposta imune de células T, por exemplo, reforçando a produção de citocina (incluindo IFNY e IL-2) de células T; e aumentando consideravelmente os níveis de efetores imunes.

[0039] A presente invenção fornece também um anticorpo anti-PD- 1 humanizado ou um fragmento funcional do mesmo. Por exemplo, o anticorpo humanizado é obtido por design de simulação em computador do anticorpo derivado de camundongo produzido por um camundongo imunizado em combinação com a tecnologia de exibição de levedura.

[0040] Na premissa de não influenciar substancialmente a atividade do anticorpo, a substituição, adição e/ou supressão de um ou mais (como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou dez ou mais) aminoácidos nas sequências da presente invenção podem ser feitas por aqueles versados na técnica a fim de obter as variantes da sequência do anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo. Eles são considerados para ser incluído no âmbito de proteção da presente invenção. Por exemplo, um aminoácido nas regiões variáveis pode ser substituído com o de propriedades semelhantes. A sequência da variante da invenção pode ter pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade para a sequência de origem. A identidade da sequência da presente invenção pode ser medida pelo software de análise de sequência. Por exemplo, programa de computador BLAST com parâmetros padrão, especialmente BLASTP ou TBLASTN pode ser usado.

[0041] Conforme usado aqui, o termo "anticorpo" engloba os anticorpos de comprimento total (por exemplo, anticorpo IgGI ou IgG4), vários fragmentos funcionais dos mesmos (por exemplo, que só pode incluir uma porção de ligação de antígeno, tais como fragmento Fab, F(ab’)2 ou scFv) e anticorpos modificado (por exemplo, humanizado, glicosilado). A presente invenção compreende o anticorpo anti-PD-1 com um padrão de glicosilação modificado. Em algumas aplicações, a modificação da remoção de sítios de glicosilação indesejados pode ser útil, ou a ausência da porção de fucose sobre a cadeia de oligossacarídeos do anticorpo, por exemplo, melhora a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (função ADCC). Em outros pedidos, uma modificação de galactosilação pode ser feita para alterar a citotoxidade dependente de complemento (CDC).

[0042] Conforme usado aqui, o termo "fragmento funcional" é destinado para representar um fragmento que reserva a função de um anticorpo de comprimento total, por exemplo, um fragmento de ligação ao antígeno, particularmente os seguintes fragmentos de anticorpos: por exemplo, Fv, scFv (sc se refere a uma fita simples), Fab, F(ab’)2, Fab’, fragmento ou diacorpo ScFv-Fc, ou quaisquer fragmentos que são quimicamente modificados ou incorporados em um lipossoma para prolongar a meia-vida e a modificação química é, por exemplo, a adição de poli(alquileno glicol), como o polietileno glicol ("peguilação, baseados em PEG") (os fragmentos peguilados são referidos como Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG ou Fab'-PEG) ("PEG" é polietileno glicol).

[0043] A molécula de DNA de codificação do anticorpo anti-PD-1 da presente invenção pode ser clonada em um vetor por aqueles qualificados na técnica e depois transformada em células hospedeiras. Por conseguinte, a presente invenção também fornece um vetor de DNA recombinante, que compreende uma molécula de DNA de codificação do anticorpo anti-PD-1 da presente invenção.

[0044] De preferência, o vetor de DNA recombinante é um vetor de expressão e aqueles versados na técnica podem clonar a molécula de DNA do anticorpo no vetor de expressão e transformá-lo em células hospedeiras para obter o anticorpo através da expressão de indução. O vetor de expressão da presente invenção contém as sequências de DNA de codificação da região variável da cadeia pesada, da região variável de cadeia leve e/ou a região constante do anticorpo anti-PD-1. No entanto, os dois vetores de expressão podem ser calculados separadamente, com um contendo a região variável da cadeia pesada e a região constante e outro contendo a região variável de cadeia leve e a região constante, que transfectam um mamífero junto. Em uma modalidade preferencial, o vetor de expressão inclui ainda um promotor e uma sequência de DNA que codifica um peptídeo sinal de secreção e pelo menos um gene de resistência aos fármacos para triagem.

[0045] A célula hospedeira da presente invenção pode ser uma célula hospedeira procariótica, uma célula hospedeira eucariótica ou um bacteriófago. A célula hospedeira procariótica pode ser Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces ou Proteus mirabilis etc. A célula hospedeira eucariótica pode ser fungos como Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, trichoderma etc.; célula de inseto como Mythimna separate; célula vegetal como o tabaco, e células de mamíferos como células BHK, células CHO, célula COS, célula de mieloma, etc. Em algumas modalidades, a célula hospedeira da presente invenção é preferencialmente célula de mamíferos, mais de preferência células BHK, células CHO, células COS, células NSO ou células COS.

[0046] Conforme usado aqui, o termo "composição farmacêutica" se refere a uma combinação de pelo menos um fármaco e opcionalmente um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, que são combinadas para atingir uma finalidade especial. Em certas modalidades, a composição farmacêutica é composta por uma combinação de componentes separados em termos de tempo e/ou espaço, enquanto eles possam funcionar coletivamente para realizar o objetivo da presente invenção. Por exemplo, os ingredientes contidos na composição farmacêutica (por exemplo, o anticorpo, a molécula de ácido nucleico, a combinação de moléculas de ácido nucleico e/ou o conjugado de acordo com a presente invenção) podem ser administrados a um indivíduo como um todo, ou administrado a um indivíduo separadamente. Quando os ingredientes contidos na composição farmacêutica são administrados ao indivíduo separadamente, os ditos ingredientes podem ser administrados ao indivíduo de forma simultânea ou sequencial. De preferência, o veículo farmaceuticamente aceitável é água, uma solução tampão, uma solução salina isotônica como PBS (solução salina tamponada com fosfato), glicose, manitol, dextrose, lactose, amido, estearato de magnésio, celulose, carbonato de magnésio, 0,3% de glicerol, ácido hialurônico, etanol, ou polialquileno glicois como polipropilenoglicol, triglicérides e similares. O tipo de veículo farmaceuticamente aceitável depende da via de administração específica para a qual a composição da invenção é formulada, tais como administração oral, nasal, intradérmica, subcutânea, intramuscular ou intravenosa. A composição da invenção pode conter agentes umectantes, agentes emulsionantes ou substâncias tampão como aditivos.

[0047] As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção podem ser administradas através de qualquer via adequada, por exemplo, administração nasal, intradérmica, subcutânea, intramuscular ou intravenosa.

[0048] Em um aspecto relacionado, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que é uma combinação do anticorpo anti-PD-1 com um segundo agente terapêutico. Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico é qualquer agente vantajosamente combinado com o anticorpo anti-PD-1. O agente exemplar que é vantajosamente combinado com o anticorpo anti-PD-1 inclui, mas não está limitado a, outros agentes inibindo a atividade de PD-1 (incluindo outros anticorpos ou os fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, inibidores de peptídeo, antagonistas de molécula pequena, etc) e/ou agentes interferindo a montante ou a jusante a transdução do sinal de PD-1. De preferência, o segundo agente terapêutico é um anticorpo anti-CD3.

[0049] Como usado aqui, o termo "câncer positivo PD-L1 ou doença infecciosa" se destina a referir ao câncer ou à doença infecciosa que resultou da expressão de PD-1 ou tem o sintoma/característica da expressão de PD-1. O câncer inclui, mas não está limitado ao, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de ovário, câncer do colo do útero, câncer de pele, câncer de bexiga, câncer de cólon, câncer de mama, glioma, câncer renal, câncer gástrico, câncer de esôfago, carcinoma de células escamosas, câncer de cabeça e pescoço. A doença infecciosa inclui, mas não está limitada a, infecção pelo vírus HIV e infecção do vírus da hepatite B.

[0050] "Quantidade terapeuticamente eficaz" como usado aqui se refere a uma dose suficiente para conferir vantagem para um indivíduo para o qual é administrado. A quantidade real administrada e a taxa e o tempo de administração dependerão da condição e da gravidade do indivíduo que está sendo tratado. A prescrição do tratamento (por exemplo, a determinação da dose) é em última análise a responsabilidade de um médico de clínica geral e outros médicos, e irá depender de suas decisões, geralmente considerando a doença a ser tratada, a condição do paciente individual, o local de entrega e o método de administração e outros fatores conhecidos pelos médicos.

[0051] O termo "indivíduo" como usado aqui se refere a um mamífero, como um ser humano, mas também podem ser outros animais, como os animais selvagens (como garça, cegonha, grua, etc), gado (como patos, gansos, etc) ou animais de laboratório (como orangotango, macaco, rato, camundongo, coelho, cobaia, etc).

[0052] Os seguintes exemplos são fornecidos para demonstrar e explicar mais alguns aspectos e modalidades preferenciais da presente invenção, e não devem ser interpretados como limitando o seu escopo.

EXEMPLOS Exemplo 1. Produção de anticorpo monoclonal anti-PD-1 de camundongo

[0053] Camundongos BALB/C de 6-10 semanas foram imunizados por via subcutânea (SC) por antígeno da proteína de fusão recombinante PD-1-mFc compreendendo a porção extracelular PD-1 (25μg) (Sino Biological Inc, Cat lot: 10377-H08H). Os camundongos foram inicialmente imunizados por inoculação do antígeno misturado com adjuvante completo de Freund (F5881, Sigma), seguido de uma inoculação de imunização subcutânea do antígeno misturado com antígeno adjuvante de Freund incompleto (F5506, Sigma) (total de 6 imunizações, nos dias 1, 7, 14, 28, 60 e 64, respectivamente). A resposta imune foi monitorada por amostragem de sangue do plexo venoso orbital. O antissoro foi rastreado por ELISA e a proteína de fusão PD-1 recombinante purificada (Sino Biological Inc, Cat lot: 10377-H08H) foi diluída a 1 μg/mL com PBS, revestida em uma placa de micropoços com 100 μL/poço e incubadas a 4°C durante a noite. Os poços foram então bloqueados com uma solução de PBS contendo 5% de soro fetal bovino e 0,05% de Tween 20 a 200 μL/poço. Depois de uma diluição do gradiente, o soro de camundongos imunizados com PD-1 foi adicionado a cada poço e incubado em temperatura ambiente por 1 hora. Depois de lavar a placa com uma solução de PBS/Tween-20, o anticorpo policlonal de IgG de cabra anticamundongo conjugado com peroxidase de rábano (Jackson Immunoresearch Labs, Cat#: 115-035-044) foi adicionado e incubado durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois de lavar a placa, a placa foi visualizada com substrato TMB (Pierce, Cat# 34021), e detectada sob OD 450. De acordo com a comparação de título, os camundongos com um alto título de imunoglobulina anti-PD-1 foram utilizados para o isolamento de células B específicas de PD-1. As células de linhagem B de cada camundongo foram separadas por seleção de células ativadas por fluorescência (FACS) de acordo com a ligação com PD-1 marcada com biotina, e as transcrições do gene da correspondente região variável cadeia pesada (H) da Ig de comprimento completo e região variável da cadeia leve (L) da IG foram amplificadas por RT-PCR. De acordo com o protocolo do fabricante, os produtos amplificados foram clonados em um sistema de expressão 293 (Life Technology). Uma coluna de proteína A foi utilizada para purificar o anticorpo monoclonal resultante, que ainda foi analisado para a capacidade de ligação com PD-1 e bloqueio da interação entre PD-1 e PD-L1. De acordo com a capacidade do anticorpo para bloquear a ligação do PD-1 com PD-L1, 10F8 e 15H6 foram selecionados como os clones candidatos para a investigação e o desenvolvimento de anticorpos humanizados.

Exemplo 2. Design da sequência da região variável da cadeia pesada do anticorpo do receptor anti-PD-1 monoclonal humanizado

[0054] As sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada dos anticorpos monoclonais 10F8 e 15H6 são representadas por SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente. As sequências de estrutura da linha germinal humana com baixa imunogenicidade foram escolhidas por uma comparação com a sequência conhecida da linha germinal humana da cadeia pesada da imunoglobulina, e foi finalmente determinada que o segmento 3-66 de VH da linha germinal humana, segmento D indeterminado e segmento JH4 da linha germinal humana poderiam ser usados como cadeias pesadas de 10F8 e 15H6 humanizados. As sequências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada de 10F8 (ou seja, BA08-1) humanizado e 15H6 (ou seja, BA08-2) humanizado foram as SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, respectivamente. Tabela 1. CDRs da cadeia pesada (H-CDRs) do anticorpo da presente invenção

Exemplo 3. Design da sequência da região variável da cadeia leve do anticorpo do receptor anti-PD-1 monoclonal humanizado

[0055] As sequências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia leve de 10F8 e 15H6 são idênticas (SEQ ID NO: 3). A sequência de estrutura da linha germinal humana com baixa imunogenicidade foi escolhida por uma comparação com a sequência conhecida da linha germinal humana da cadeia pesada da imunoglobulina, e foi finalmente determinada que o segmento 3-11 de VH da linha germinal humana e segmento JK4 poderiam ser usados como cadeias leves de 10F8 e 15H6 humanizados. As sequências de aminoácidos da região variável da cadeia leve dos anticorpos 10F8 (BA08-1) humanizados e 15H6 (BA08-2) humanizados são representadas por SEQ ID NO: 6. Tabela 2. CDRs da cadeia leve (L-CDRs) do anticorpo da presente invenção

Exemplo 4. Expressão e preparação do anticorpo monoclonal do receptor anti-PD-1 humanizado

[0056] A sequência do fragmento Fc IgG4 da região constante da cadeia pesada de IgG4 humana (J Ellison, J Buxbaum, L Hood-DNA, 1981) e sequência de fragmento de K da região constante de cadeia leve (Hieter, P. A., Max, E. E., Seidman, J. G., Maizel, J. V. Jr., and Leder, P. Cell. 1980, 22: 197-207) foram ambas sintetizadas por IDT Inc. (Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa). Os vetores pBA- H4 e pBA-Ck da presente invenção foram construídos com pcDNA3 como cadeias principais, onde os vetores pBA-H4 (contendo a região constante da cadeia pesada de IgG4 humano IgG4Fc) e pBA-Ck (contendo o fragmento k da região constante da cadeia leve) foram construídos pela Bioabs Inc. No pBA-H4, um promotor CMV é usado para o VH e CH e um promotor PGK é usado para o gene de resistência a puromicina, enquanto no pBA-Ck, um promotor CMV é utilizado para o VL e um promotor SV40 é utilizado para o gene de resistência a neomicina. De acordo com as sequências de proteínas da sequência de região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve do anticorpo, as sequências do DNA de codificação das regiões variáveis de cadeia pesada e regiões variáveis de cadeia leve foram projetadas, que foram ainda mais optimizadas para a expressão otimizada em células CHO, onde as sequências de DNA de codificação da região variável da cadeia pesada do anticorpo anti-PD- 1 humanizado da presente invenção são representadas por SEQ ID NOs: 15 (BA08-1) e 16 (BA08-2), respectivamente, e a sequência de DNA de codificação da região variável de cadeia leve do anticorpo anti-PD-1 humanizado da presente invenção é representada por SEQ ID NO: 17. Os DNAs de codificação da região variável da cadeia pesada otimizados e região variável de cadeia leve foram sintetizados pela IDT Inc. (Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa). Usando kit de clonagem In-Fusion® HD (Clontech Cat#: 638910), o fragmento de DNA sintetizado contendo cadeias pesadas de BA08-1 e BA08-2 foi diretamente clonado no vetor pBA-H4 linearizado com a enzima Nhe I e o fragmento de DNA sintetizado contendo as cadeias leves de BA08- 1 e BA08-2 foi diretamente clonado no vetor linearizado pBA-Ck com a enzima BsiWI, seguido por transformação em bactérias DH5α, e extração de plasmídeos e sequenciamento, e o resultado de sequenciamento é consistente com as sequências de codificação do DNA do anticorpo humanizado desenvolvido. As células CHO-S (disponíveis a partir de Invitrogen) foram cultivadas com 1*CD-CHO (disponível a partir de GIBCO), 1*HT (disponível a partir de GIBCO), 8 mM glutamina (disponível a partir de GIBCO), em uma incubadora a 37°C, 8% CO2. As células CHO-S foram cotransfectadas com os plasmídeos contendo a cadeia pesada e cadeia leve de anticorpos BA08-1 e BA08-2 e o método de transfecção está em conformidade com as instruções para o kit de transfecção DMRIE-C (adquiridos de Invitrogen). 3 dias após a transfecção, as células foram cultivadas no meio de cultura descrito acima e 500 μg/mL G418 (disponível a partir de GIBCO) e 12,5 μg/mL puromicina (disponível da Sigma) foram adicionados para triagem pressurizada. 14 dias após a pressurização, os clones positivos foram selecionados, cultivados em uma placa de seis poços e detectados por um método de ELISA direto para a expressão da quantidade de anticorpo. O clone positivo com a maior taxa de expressão foi selecionado, cultivado em grande escala por dez dias e em seguida centrifugado para recolher o sobrenadante da cultura, que foi purificado por uma coluna de cromatografia de afinidade da proteína A (disponível a partir de GE), dialisado em PBS e filtrado através de uma membrana de 0,22 μm para os diversos estudos.

Exemplo 5. Especificidade de ligação e afinidade relativa entre o anticorpo e PD-1

[0057] A ligação relativa do anticorpo da presente invenção com PD-1 humano foi determinada por um método de ELISA baseado em proteínas. Brevemente, a proteína de fusão PD-1 recombinante purificada (Sino Biological Inc, Cat#: 10377-H08H) foi diluída a 1 μg/mL com PBS, revestida em uma placa de micropoços com 100 μL/poço e incubadas a 4°C durante a noite. Os poços foram então bloqueados com uma solução de PBS contendo 5% de soro fetal bovino e 0,05% de Tween 20 a 200 μL/poço. Após uma diluição de gradiente, o anticorpo anti-PD-1 da presente invenção, MK3475 (um MC-3475 análogo de controle construído pelo presente inventor usando um vetor de expressão da presente invenção de acordo com a sequência de MK3475 divulgada, a seguir referida como MK3475, o protocolo específico de construção é semelhante com a presente invenção) e IgG controle foram adicionados em cada poço e incubados em temperatura ambiente por 1 hora. Depois de lavar a placa com uma solução de PBS/Tween-20, o anticorpo policlonal de IgG de cabra anticamundongo conjugado com peroxidase de rábano (Jackson Immunoresearch Labs, Cat#:109-035-088) foi adicionado e incubado à temperatura ambiente durante 1 hora. Depois de lavar a placa, a placa foi visualizada com substrato TMB (Cat# 34021, Pierce), e detectada sob OD 450. Os resultados de ELISA são mostrados na Figura 1. A afinidade medida pelo instrumento Blitz (Pall Life Science) é mostrada na Tabela 3.

[0058] O anticorpo da presente invenção apresenta a afinidade de ligação alta inesperada e especificidade de ligação com PD-1. Tabela 3. Cinética de ligação do anticorpo anti-PD-1

Exemplo 6. O anticorpo anti-PD-1 bloqueia a ligação do ligante de PD-L1 com o receptor de PD-1

[0059] O anticorpo anti-PD-1 humanizado da presente invenção foi testado para a forma de bloquear a ligação de PD-1 com seu ligante. Especificamente, uma placa de 96 poços foi revestida por 1 μg/mL hPD-L1/Fc não marcado (R&D Systems, Cat# 156-B7-100) por 16 horas. 0,5 μg/mL de proteína PD-1 foi pré-incubado com os anticorpos anti-PD-1 recombinantes das diferentes concentrações a 37°C por 30 minutos, depois adicionado em uma placa de micropoços para a reação. A ligação proteica de PD-1 para o PD-L1 revestido foi hibridizada com um anticorpo anti-PD-1 humano de camundongo (eBioscience, Cat# 14-9989-8214), e detectado posteriormente com um método baseado anticorpo policlonal de IgG de cabra anticamundongo conjugado com peroxidase de rábano. Depois de lavar a placa, a placa foi visualizada com substrato TMB (Pierce, Cat# 34021), e detectada sob OD 450. Como mostrado na Figura 2, os anticorpos BA08-1 e BA08-2 anti-PD-1 especificamente bloquearam a ligação do PD-1 com seu ligante PD-L1 (Figura 2), com efeito bloqueador significativamente melhor do que o de MK-3475. Assim, o anticorpo da presente invenção atinge o bloqueio surpreendentemente maior contra a ligação de PD-L1 e PD-1.

Exemplo 7. Efeito do anticorpo anti-PD-1 na inibição da atividade das células T humanas mediadas pelo PD-L1

[0060] As células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) foram isoladas a partir de doadores saudáveis pelo método de Ficoll. As células T do sangue periférico de repouso humano foram obtidas por uma seleção negativa através de coluna enriquecida com células CD3+ T (R&D Systems). Uma placa de 96 poços estava revestida por 500 ng/mL de anticorpo anti-CD3 e 1 μg/mL de PD-L1/Fc recombinante humano durante a noite a 4°C. 1 μg do anticorpo anti- PD-1 da presente invenção ou MK3475 foi adicionado a cada poço e incubado a 37 °C durante 4 horas. Uma suspensão RMPI de células T isoladas (2 x 104) foi adicionada e o sobrenadante foi coletado após a cultura celular por 2 dias. As expressões de IL-2 e IFN-Y foram detectadas com o kit de ELISA IL-2 (eBioscience Cat# 88-7025-88) e kit ELISA IFN-y (R&D Systems) respectivamente de acordo com as instruções de utilização. Como mostrado na figura 3 e Figura 4, as colunas mostradas da esquerda para a direita: controle sem anticorpos CD3, controle positivo (anticorpo anti-CD3 foi utilizado isoladamente), inibição de PD-L1 na expressão de IL-2 ou IFN-y estimulada pelo anticorpo anti-CD3 (com a adição de PD-L1 e anticorpo anti-CD3), antagonismo do anticorpo BA08-1 da presente invenção para o efeito inibitório de PD-L1 (com a adição de anticorpo BA08-1, PD-L1 e anti- CD3), antagonismo do anticorpo BA08-2 da presente invenção para o efeito inibitório PD-L1 (com a adição de anticorpo BA08-2, PD-L1 e anti-CD3), e antagonismo de MK3475 para o efeito inibitório PD-L1 (com a adição de anticorpo MK3475, PD-L1 e anti-CD3). Os anticorpos BA08-1 e BA08-2 anti-PD-1 ambos significativamente eliminam o efeito inibitório do PD-L1 na produção de IL-2 e IFN-y de células T estimuladas por CD3 (** p <0,01), com o efeito de reforço imune que é significativamente mais elevado do que o do análogo MC-3475 (* p <0,05).

Exemplo 8. Efeito do anticorpo anti-PD-1 na expressão de citocinas na reação de linfócitos mistos

[0061] O efeito do bloqueio da via de PD-L1/PD-1 nos linfócitos efetores foi detectado usando uma reação de linfócitos mistos heterólogos (MLR). O efeito da presença ou ausência do anticorpo monoclonal humano anti-PD-1 na secreção de IFN-Y por células T foi determinado. Células CD4+T humanas foram obtidas através da purificação de PBMC com um kit de seleção negativa CD4+ (Miltenyi Biotech). As células dendríticas foram derivadas de monócitos purificados que foram cultivados com 1000 U/mL IL-4 e 500 U/mL GM- CSF (R&D Biosystems) durante sete dias. Cada reação de MLR envolve 105 de células T purificadas e 104 de células dendríticas alogênicas em um volume total de 200 μL. O anticorpo monoclonal humanizado anti-PD-1 foi adicionado em uma placa de cultura com diferentes concentrações, após a cultura de células a 37 °C por 5 dias, 100 μL de sobrenadante da cultura foram tomados para medir o conteúdo de citocinas. A medição de IL-2 foi realizada pelo mesmo método como no Exemplo 7, com o resultado como mostrado na Fig.5. Os anticorpos BA08-1 e BA08-2 anti-PD-1 significativamente promoveram a ativação de células T e aumento da expressão de IL-2 de maneira dose-dependente, com os efeitos sendo significativamente superiores aos do MC-3475.

Exemplo 9. Efeito do anticorpo anti-PD-1 na inibição de células tumorais da produção de IL-2 de células T ativadas

[0062] As células da linhagem celular de melanoma humano A2058 e linhagem celular do câncer de pulmão humano HCC827 foram adquiridas a partir de ATCC (Manassas, VA). O interferon humano recombinante (IFN)-Y, forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) e fito-hemaglutinina (PHA) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (S. Louis, MO). As células de melanoma e do câncer de pulmão foram cultivadas em meio RPMI 1640 completo para 80% de confluência, então 500 U/mL de IFN-Y recombinante humano foram adicionados para o tratamento por mais de 48 horas para regular positivamente a expressão de PD-L1, que foi confirmado por um citômetro de fluxo com um anticorpo anti-PD-L1 humano de camundongo (BD Pharmingen, Cat# 557924). As células T do sangue periférico de repouso humano foram obtidas por uma seleção negativa através de coluna enriquecida com células CD3+T (R&D Systems).As células T resultantes foram tratadas com 1 μg/mL HAP e 50 ng/mL PMA durante a noite, então adicionadas em uma placa de 96 poços pré-revestida com 1 μg/mL de proteínas PD-L1-Fc recombinante (Corning, NY) (marcada como PD-L1 na Figura 6); ou em presença de 3 μg/mL de anticorpo (IgG controle, anticorpos BA08-2 ou BA08-1 anti-PD-1 da presente invenção, ou MK3475), adicionadas às células tumorais tratadas com IFN-Y na proporção de 6: 1 (células tumorais: células T) e incubadas por 48 h (marcado como A2058 e HCC827 na Figura 6); ou sem qualquer tratamento adicional (controle, marcado como PMA + HAP na Figura 6). O sobrenadante foi coletado e detectado para expressão de IL-2 por ELISA. Como mostrado na Figura 6, o PD-L1 imobilizado pode inibir a capacidade de produção de IL-2 das células T ativadas e anticorpos BA08-1 e BA08-2 anti-PD-1 significativamente eliminam o efeito inibitório do PD-L1. Da mesma forma, as células tumorais pré-tratadas com IFN-y também apresentam inibição da expressão de IL-2 mediada por células T ativadas e o efeito inibitório também pode ser bloqueado por anticorpos BA08-1 e BA08-2 anti-PD- 1 (*p<0,05), e o efeito do anticorpo da presente invenção é significativamente melhor do que a de MC-3475.

Exemplo 10. Experimento in vivo de anticorpo anti-PD 1 da presente invenção para o tratamento de câncer de pulmão

[0063] Para avaliar o efeito in vivo do anticorpo anti-PD-1 humanizado, no 1 dia do experimento, camundongos NOD-SCID com 6 semanas de idade foram inoculados por via subcutânea com 1*107 células de câncer de pulmão humano HCC827 obtidas a partir de cultura de tecidos. O tratamento é iniciado no Dia 8 quando o volume médio do tumor atinge 100 mm3 (55-150 mm3), com 6 animais em cada grupo e todos os animais foram injetados intraperitonealmente com o PBMC humano no mesmo lote. O método de preparação para o PBMC humano é como descrito acima. O PBMC é obtido pelo método de purificação de Ficoll dentro de 3 horas. Cada camundongo foi inoculado por injeção pela via intraperitoneal com uma suspensão RPMI contendo 1*107 de PBMC humano e injetados intraperitonealmente com o anticorpo no mesmo dia, duas vezes por semana, na dose de 5mg/kg, totalizando quatro doses. O volume do tumor do camundongo foi medido duas vezes por semana com um paquímetro, e foi calculado utilizando a seguinte fórmula: = Volume (comprimento x largura2) / 2. Como mostrado na Figura 7, o anticorpo anti-PD-1 humanizado mostrou a atividade antitumoral efetiva e de longa duração, e o efeito do anticorpo da presente invenção foi significativamente melhor do que o de MC-3475. Em comparação com o grupo controle, as taxas de inibição do tumor de anticorpos BA08-1 e BA08-2 anti-PD-1 no dia 32 foram de 84,5% e 77,8% (p<0,01) respectivamente, que estavam significativamente aumentadas do que a amostra de MK3475 com uma taxa de inibição de tumor de 66% (p<0,05).

Exemplo 11. Experimento in vivo de anticorpo anti-PD1 da presente invenção para o tratamento de melanoma

[0064] Camundongos NOD-SCID em 6 semanas de idade foram inoculados por via subcutânea com ambas as células de melanoma humano 2*106 A375 e 1*106 células T humanas estimuladas pelas mesmas células de tumor que foram obtidas a partir de cultura de tecidos. As células T humanas estimuladas pelas células do tumor foram obtidas do seguinte modo: a partir de células T negativamente selecionadas de células mononucleares do sangue periférico em humanos sadios pelo kit RosetteSep (Stemcell A375 tratadas com 2 μg de mitomicina C por 16 horas em 10% meio de cultura SFB-RPMI contendo 50 U/mL de IL-2 recombinante por sete dias e coletadas para uso. O tratamento foi iniciado no mesmo dia com 6 animais incluídos em cada grupo, e os animais foram injetados intraperitonealmente com o anticorpo anti-PD-1 duas vezes por semana com uma dose de 3 mg/kg, com um total de quatro doses. O volume do tumor do camundongo foi medido duas vezes por semana com um paquímetro, e foi calculado utilizando a seguinte fórmula: = Volume (comprimento x largura2) / 2. Conforme mostrado na Figura 8, em comparação com o grupo controle, as taxas de inibição do tumor de anticorpos BA08-1 e BA08-2 anti-PD-1 no dia 35 foram de 82% e 72% (p<0,01) respectivamente, que estavam significativamente aumentadas do que a amostra de MK3475 com uma taxa de inibição de tumor de 58% (p<0,05).

[0065] As modalidades preferenciais acima são descritas apenas a título de exemplo e não como limitações para uma combinação de recursos essenciais para a realização da presente invenção. Os títulos são fornecidos, não se destinam a limitar a várias modalidades da presente invenção. Os termos como "compreende", "contém" e "incluí" não se destinam a ser limitações. Além disso, salvo indicação em contrário, quando um substantivo não é modificado por um numeral, ele inclui a sua forma plural, e "ou" significa "e/ou". A menos que definidos de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados neste documento têm o mesmo significado que normalmente entendido pelos versados na técnica.

[0066] Todas as publicações e patentes mencionadas no presente pedido são aqui incorporadas por referência. Sem que se desvie do espírito e escopo da invenção, as diversas modificações e variações dos métodos e composições descritos na presente invenção são evidentes para os versados na técnica. Enquanto a presente invenção é descrita por meio de modalidades específicas e preferidas, será entendido que a invenção como reivindicada não deve ser indevidamente limitada a tais modalidades específicas. Na verdade, muitas variantes aparentes para aqueles versados na técnica para a realização dos modos descritos da presente invenção são destinadas a ser incluídas dentro do escopo nas reivindicações.

Claims

1. Anticorpo compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, que é capaz de se ligar especificamente ao PD-1, caracterizado pelo fato de que a. (i) a cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada, que apresenta a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 ou 2; e (ii) a cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve, que apresenta a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3; ou b. (iii) a cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada, que apresenta a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 ou 5; e (iv) a cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve, que apresenta a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que (i) a cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada, que apresenta a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 ou 5; e (ii) a cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve, que apresenta a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6.

3. Combinação de polinucleotídeos isolados, caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica a cadeia leve do anticorpo como definido na reivindicação 1 ou 2, e um polinucleotídeo que codifica a cadeia pesada do anticorpo como definido na reivindicação 1 ou 2, em que o polinucleotídeo que codifica a cadeia leve do anticorpo apresenta a sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 17, e o polinucleotídeo que codifica a cadeia pesada do anticorpo apresenta a sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 15 ou 16.

4. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a combinação de polinucleotídeos como definida na reivindicação 3, em que o polinucleotídeo se liga eficazmente a uma sequência regulatória que permite a expressão de um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo em uma célula hospedeira ou um sistema de expressão livre de células.

5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido na reivindicação 1 ou 2, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, a combinação de polinucleotídeos isolados, como definida na reivindicação 3, o vetor de expressão, como definido na reivindicação 4 e/ou a composição farmacêutica, como definida na reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento ou prevenção de um câncer ou uma doença infecciosa.

7. Anticorpo, combinação de polinucleotídeos isolados, vetor de expressão, e/ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de pulmão ou melanoma, e a doença infecciosa é infecção pelo HIV ou infecção pelo vírus da hepatite B.