CN118477173A - 靶向HER2/p95HER2的P329G抗体及其与嵌合抗原受体细胞的组合和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物组合，所述药物组合包含组分(i)，其选自表达分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞(例如，T细胞)、编码所述CAR多肽的核酸分子、包含所述核酸分子的载体和它们的任意组合；和组分(ii)，其是包含P329G突变的特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的抗体。本发明还涉及包含所述药物组合的成套药盒、以及所述药物组合在受试者中治疗肿瘤的用途。
Description
技术领域
本发明总体上涉及抗体工程和细胞免疫学领域，具体地，本发明涉及包含P329G突变的特异性结合HER2/p95HER2的抗体与经工程化以表达分子开关调控型嵌合抗原受体的免疫效应细胞(例如，T细胞)的组合，并涉及所述组合用于治疗肿瘤，例如p95HER2阳性的肿瘤，或者p95HER2阳性和HER2阳性的肿瘤，例如乳腺癌。
背景技术
人表皮生长因子受体2(HER2，也称为HER2/neu或ErbB-2)属于表皮生长因子受体家族成员，是一种185kDa的跨膜酪氨酸激酶受体。HER2基因扩增导致的HER2蛋白过表达或HER2基因激活突变在许多类型的癌症发生发展中起着关键作用。例如，15-30％乳腺癌、7-34％胃癌、30％唾液导管癌以及卵巢癌、子宫内膜癌、肺腺癌中存在HER2过表达，非小细胞肺癌中存在HER2激活突变，并与不良预后相关。目前，已批准包括单克隆抗体(曲妥珠单抗(Trastuzumab)、Pertuzumab)、抗体偶联药物(ADC，包括T-DM1、DS-8201)、小分子抑制剂(Laptinib、Neratinib)等多种靶向药物用于HER2阳性肿瘤治疗。
嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR-T)是一种基因工程修饰的T细胞，能够通过其表面表达的CAR分子精准靶向识别杀伤肿瘤细胞，过继回输CAR-T细胞为肿瘤治疗提供了一种突破性的创新疗法，已经在治疗复发难治性B细胞急性淋巴白血病(B-ALL)、淋巴瘤(NHL)及骨髓瘤(MM)等血液肿瘤中取得惊人的临床疗效。鉴于HER2作为已验证的临床治疗靶点，目前已开发多种HER2靶向CAR-T细胞产品处于临床试验中；但由于HER2在正常组织中也有低水平表达，可能导致严重的“在靶脱肿瘤(on-target off-tumor)”效应。例如，基于曲妥珠单抗序列开发的HER2靶向CAR-T细胞在治疗一例具有肝肺转移的结直肠癌患者时，可能由于CAR-T识别低水平表达HER2的肺表皮细胞诱导了严重、快速的细胞因子释放综合征(CRS)，最终导致患者死亡(Richard A Morgan等人，Mol Ther.2010；18(4)：843-851)。因此，亟待开发更安全的HER2靶向CAR-T细胞治疗产品。
虽然曲妥珠单抗等现有HER2靶向疗法已经在临床取得较好治疗效果，但多数接受治疗的肿瘤患者最终产生耐药。一种主要的耐药机制在于出现了分子量90-115kDa的HER2变体，统称为p95HER2羧基末端片段(p95HER2/CTFs)。这些变体由蛋白水解导致的胞外结构域脱落或从内部AUG启动密码子翻译而形成，其中由611位AUG启动密码子可变翻译导致的611-CTF由于通过分子间二硫键组成性组成二聚体其活性尤其显著，体内能够促进乳腺癌启动和进展，可能是导致p95HER2阳性肿瘤进展和治疗抵抗的关键变体。据报道，30％HER2阳性肿瘤表达p95HER2，与仅表达全长受体肿瘤相比，p95HER2阳性肿瘤预后更差，转移概率更高，对曲妥珠单抗等靶向治疗抵抗。因此，特异靶向p95HER2或同时靶向HER2/p95HER2有望克服耐药或提高现有靶向治疗疗效。此外，由于p95HER2在正常组织中不表达，因此，靶向p95HER2有望降低“在靶脱肿瘤”产生的毒副反应。
鉴于传统CAR-T细胞对于细胞活性缺乏控制，本领域需要分子开关调控型PG CAR-T细胞技术。根据HER2在正常组织表达的特点以及p95HER2表达在HER2靶向治疗抵抗中的作用，开发单独靶向p95HER2或能够同时靶向HER2/p95HER2的PG CAR-T细胞产品具有重要临床价值，以避免或降低由于识别正常组织中低水平表达HER2即“在靶脱肿瘤”导致的毒副效应；且靶向p95HER2的PG CAR-T细胞同时有望克服由p95HER2表达产生的HER2靶向治疗耐药情况。
发明概述
本发明提供了分子开关调控型PG CAR-T细胞技术。有别于传统CAR-T细胞，本发明的分子开关调控型PG CAR-T细胞不直接识别肿瘤细胞，而是通过Fc段携带P329G突变的单克隆抗体作为“分子开关”(molecular switch)，后者识别肿瘤细胞表面抗原后，PG CAR-T细胞再通过识别P329G抗体从而间接识别肿瘤细胞，激活后启动效应功能，杀伤肿瘤细胞。本发明的分子开关调控型PG CAR-T细胞技术的特点在于，只有在P329G抗体存在情况下，CAR-T细胞才能发挥对肿瘤细胞的杀伤效应；在没有P329G抗体或在P329G抗体被代谢清除后，PG CAR-T细胞处于失能状态。本发明的这种设计赋予了CAR-T细胞体内活性的可调控性，在发生体内急性毒性情况下可以通过停止抗体给药达到快速终止CAR-T细胞活性的目的；在肿瘤清除后通过停止抗体给药也能够有效阻止持续的靶特异识别相关的慢性毒性；此外，结合抗体的灵活性，能够有效处理抗原异质表达的肿瘤或抗原逃逸的复发肿瘤。
因此，在第一方面，本发明提供了药物组合，所述药物组合包含
组分(i)，其选自表达分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞(例如，T细胞)、编码所述CAR多肽的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、和它们的任意组合；和
组分(ii)，其是包含P329G突变的特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的抗体或抗原结合片段(也称为P329G突变抗体)，例如，所述P329G突变抗体包含突变Fc结构域，其中根据EU编号的P329位置处的氨基酸突变为甘氨酸(G)，与未突变的亲本抗体Fc结构域的Fcγ受体结合相比，突变Fc结构域的Fcγ受体结合降低；以及
任选地可药用辅料；
其中，所述分子开关调控型CAR多肽包含
(1)人源化抗P329G突变scFv序列，其中所述scFv序列包含能够特异性结合包含P329G突变的抗体Fc结构域，但不能特异性结合未突变的亲本抗体Fc结构域的如下序列：
(i)重链可变区，其包含根据Kabat编号的
(a)氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO：31)所示的重链互补决定区CDR H1、或所述CDRH1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
(b)氨基酸序列EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO：32)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和
(c)氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO：33)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和
(ii)轻链可变区，其包含根据Kabat编号的
(d)氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO：34)所示的轻链互补决定区(CDR L)1、或所述CDRL1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
(e)氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO：35)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和
(f)氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO：36)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代；
(2)铰链区/间隔区，其选自
(i)(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n肽接头，其中“n”是1至10的整数，例如1至4的整数；例如SEQ ID NO：23所示的序列；
(ii)CD8α铰链区或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO：24所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
(3)跨膜区(TM)，其选自CD8跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO：25所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
(4)共刺激信号结构域(CSD)，其选自4-1BB共刺激结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO：26所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
(5)刺激信号结构域(SSD)，为CD3ζ信号传导结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO：27所示的序列或其具有1-10个、1-5个氨基酸修饰的变体。
在一些实施方案中，所述CAR多肽包含
(1)人源化抗P329G突变scFv序列，其中所述scFv序列包含能够特异性结合包含P329G突变的抗体Fc结构域，但不能特异性结合未突变的亲本抗体Fc结构域的如下序列：
(i)重链可变区，其包含根据Kabat编号的
(a)氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO：31)所示的CDR H1；
(b)氨基酸序列EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO：32)所示的CDR H2；和
(c)氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO：33)所示的CDR H3；和
(ii)轻链可变区，其包含根据Kabat编号的
(d)氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO：34)所示的CDR L1；
(e)氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO：35)所示的CDRL2；和
(f)氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO：36)所示的CDR L3；
例如，(i)重链可变区，其包含SEQ ID NO：29的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，和
(ii)轻链可变区，其包含SEQ ID NO：30的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
例如，(i)重链可变区，其包含SEQ ID NO：29的序列，和(ii)轻链可变区，其包含SEQ IDNO：30的序列；
(2)铰链区/间隔区，其选自
(i)(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n肽接头，其中“n”是1至4的整数，例如SEQ ID NO：23所示的序列；
(ii)SEQ ID NO：24所示的CD8α铰链区序列或其具有1个氨基酸修饰的变体；
(3)跨膜区(TM)，其选自SEQ ID NO：25所示的CD8跨膜结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；
(4)共刺激信号结构域(CSD)，其选自SEQ ID NO：26所示的4-1BB共刺激结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；
(5)刺激信号结构域(SSD)，其选自SEQ ID NO：27所示的CD3ζ信号传导结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；
其中所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。
在一些实施方案中，本发明的药物组合中的所述包含P329G突变的特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列GFTFSTYGMA(SEQ ID NO：14)所示的CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；氨基酸序列TINSNGGKTYHPDSVKG(SEQ ID NO：15)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和氨基酸序列EGFDY(SEQ ID NO：16)所示的CDRH3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KASQNVGTAVA(SEQ ID NO：11)所示的CDR L1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；氨基酸序列SASNRYT(SEQID NO：12)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和氨基酸序列QQYSTYPLT(SEQ ID NO：13)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代。
在一些实施方案中，本发明的药物组合中的所述包含P329G突变的特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列GFTFSTYGMA(SEQ ID NO：14)所示的CDR H1；氨基酸序列TINSNGGKTYHPDSVKG(SEQ ID NO：15)所示的CDR H2；和氨基酸序列EGFDY(SEQ ID NO：16)所示的CDR H3；所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KASQNVGTAVA(SEQ ID NO：11)所示的CDR L1；氨基酸序列SASNRYT(SEQ ID NO：12)所示的CDR L2；和氨基酸序列QQYSTYPLT(SEQ ID NO：13)所示的CDRL3。
在一些实施方案中，本发明的药物组合中的所述包含P329G突变的特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的抗体或抗原结合片段的特征在于：
(a)重链可变区包含SEQ ID NO：8的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO：9的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
(b)重链可变区包含SEQ ID NO：10的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO：9的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
例如，其中：
(a)重链可变区包含SEQ ID NO：8的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO：9的序列；
(b)重链可变区包含SEQ ID NO：10的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO：9的序列。
在一些实施方案中，本发明的药物组合中的所述包含P329G突变的特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体；优选地，其是IgG1或IgG4抗体；更优选地，其是IgG1抗体。
在一些实施方案中，本发明的药物组合中的特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的抗体的抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链Fv、单链Fab、双体抗体(diabody)。
对于所述特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的抗体或抗原结合片段，通过将根据EU编号的P329位置处的氨基酸突变为甘氨酸(G)获得了具有突变Fc结构域的抗体，其中，与未突变的亲本抗体Fc结构域的Fcγ受体结合相比，突变Fc结构域的Fcγ受体结合降低。
在一些实施方案中，所述突变Fc结构域是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的突变Fc结构域，优选地，所述突变Fc结构域是IgG1或IgG4抗体的突变Fc结构域；更优选地，所述突变Fc结构域是IgG1抗体的突变Fc结构域；
在一些实施方案中，特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：39所示的重链恒定区序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列且其中根据EU编号的P329位置处的氨基酸突变为G；
例如，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：39所示的重链恒定区序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列且其中根据EU编号的P329位置处的氨基酸突变为G；和SEQ ID NO：40所示的轻链恒定区序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一个实施方案中，特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：39所示的重链恒定区序列和SEQ ID NO：40所示的轻链恒定区序列。
在一些实施方案中，本发明的分子开关调控型CAR多肽还包含位于N端的信号肽序列，例如，SEQ ID NO：28所示的信号肽序列。在一个优选的实施方案中，本发明的分子开关调控型CAR多肽具有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明提供了编码本发明药物组合中所述的分子开关调控型CAR多肽的核酸、包含编码所述CAR多肽的核酸的载体、和包含所述CAR核酸分子或载体的细胞、或表达所述CAR多肽的细胞，优选地，所述细胞是自体T细胞或同种异体T细胞。
在一些实施方案中，编码本发明药物组合中所述的分子开关调控型CAR多肽的核酸分子是编码SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的核酸分子。
在一些实施方案中，包含编码本发明药物组合中所述的分子开关调控型CAR多肽的核酸分子的载体选自DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，本发明药物组合中的免疫效应细胞是自体T细胞或同种异体T细胞制备的表达本发明所述的分子开关调控型CAR多肽的T细胞，例如，所述免疫效应细胞是自人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)分离的T细胞制备的表达本发明所述的分子开关调控型CAR多肽的T细胞。
在一些实施方案中，本发明利用自多个不同供者来源的人PBMC制备的原代P329GCAR-T细胞，并利用P329G突变的抗p95HER2抗体H2-214D8或P329G突变的抗HER2和p95HER2的抗体H1-214D8，在体外共培养体系中评价了P329G CAR-T细胞针对表达p95HER2或HER2的肿瘤细胞通过抗体发挥的效应功能，由此，P329G突变的抗p95HER2抗体或P329G突变的抗HER2和p95HER2的抗体能够作为“分子开关”调节P329G CAR-T细胞对p95HER2阳性的肿瘤细胞，或者p95HER2阳性和HER2阳性的肿瘤细胞的识别及杀伤活性，该体外效应功能与直接靶向HER2/p95HER2阳性肿瘤细胞的传统CAR-T细胞相当，但传统CAR-T细胞的活性不依赖P329G突变抗体。
体外实验表明，只有在P329G抗体存在情况下，P329G CAR-T细胞活性才能“开启”，产生效应功能，识别和杀伤p95HER2阳性的肿瘤，或者p95HER2阳性和HER2阳性的肿瘤细胞。这有别于传统CAR-T细胞直接识别杀伤表达HER2的肿瘤或正常组织细胞，本发明药物组合中的靶向p95HER2的P329G CAR-T细胞体外具有特异、可控的肿瘤识别及杀伤效应。本发明的药物组合包含2种组分：携带P329G突变的p95HER2或HER2/p95HER2特异的抗体(即，P329G抗体，也简称为PG抗体)，以及P329G CAR-T细胞(即，分子开关调控型PG CAR-T细胞，也简称为PG CAR-T细胞)，使得P329G抗体首先识别表达p95HER2或HER2/p95HER2阳性肿瘤细胞，P329G CAR-T细胞再通过识别PG抗体上的P329G突变，由此间接识别和杀伤肿瘤细胞。在本发明的药物组合中，PG抗体作为桥接分子，将P329GCAR-T细胞和肿瘤细胞交联在一起，发挥“分子开关”作用：只有在PG抗体存在情况下，P329G CAR-T细胞才能识别和杀伤肿瘤细胞，一旦不加入或清除PG抗体后，P329G CAR-T细胞不再发挥靶特异识别和杀伤活性。
本发明还考虑了在体内实验中，通过调节P329G抗体剂量及给药间隔，来调控P329GCAR-T细胞体内扩增程度及其抗肿瘤活性强度。
在第二方面，本发明提供了本发明的药物组合的用途，用于在受试者中治疗治疗肿瘤，例如，p95HER2阳性的肿瘤，或者p95HER2阳性和HER2阳性的肿瘤，包括向受试者施用治疗有效量的前述第一方面所定义的药物组合。
在第三方面，本发明提供了本发明的药物组合在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途，所述肿瘤是例如p95HER2阳性的肿瘤，或者p95HER2阳性和HER2阳性的肿瘤，例如乳腺癌。
在第四方面，本发明提供了用于治疗肿瘤的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的药物组合，所述肿瘤是例如p95HER2阳性的肿瘤，或者p95HER2阳性和HER2阳性的肿瘤，例如乳腺癌。
在第五方面，本发明提供了成套药盒，其包含如前述第一方面所定义的药物组合，优选地所述药盒为药物剂量单元形式。
第六方面，本发明提供了一种药物复合物，其是一种由
(i)表达本发明的药物组合中所述的分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞(例如，T细胞)；和
(ii)包含P329G突变的特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的抗体或抗原结合片段(也称为P329G突变抗体)，例如，所述P329G突变抗体包含突变Fc结构域，其中根据EU编号的P329位置处的氨基酸突变为甘氨酸(G)，与未突变的亲本抗体Fc结构域的Fcγ受体结合相比，突变Fc结构域的Fcγ受体结合降低；结合而产生的复合物，
其中，所述免疫效应细胞通过CAR多肽的胞外结构域中的人源化抗P329G突变scFv序列与所述P329G突变抗体的Fc结构域结合而产生所述复合物；
例如，其中所述免疫效应细胞是自自体T细胞或同种异体T细胞制备的表达本发明的药物组合中所述的分子开关调控型CAR多肽的T细胞，例如，所述免疫效应细胞是自人PBMC分离的T细胞制备的表达本发明的药物组合中所述的分子开关调控型CAR多肽的T细胞；
例如，其中P329G突变抗体是H1-214D8 PG Ab和/或H2-214D8 PG Ab。
本发明还提供了所述药物复合物的用途，用于在受试者中治疗治疗肿瘤，优选地，所述肿瘤是例如p95HER2阳性的肿瘤，或者p95HER2阳性和HER2阳性的肿瘤，例如乳腺癌。
附图简述
结合以下附图一起阅读时，将更好地理解以下详细描述的本发明的优选实施方案。出于说明本发明的目的，图中显示了目前优选的实施方案。然而，应当理解本发明不限于图中所示实施方案的精确安排和手段。
结合以下附图一起阅读时，将更好地理解以下详细描述的本发明的优选实施方案。出于说明本发明的目的，图中显示了目前优选的实施方案。然而，应当理解本发明不限于图中所示实施方案的精确安排和手段。
图1A显示了构建的HuR968B CAR的结构。图中，“SP”表示信号肽(signalpeptide)；“TMD”表示跨膜结构域(transmembrane domain)；“CSD”表示共刺激信号结构域(costimulatory domain)；“SSD”表示刺激信号结构域(stimulatory signaling domain)。在该P329GCAR构建体中，胞外结构域包含能够特异性结合含有P329G突变的突变Fc结构域的抗原结合部分，且所述抗原结合部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
图1B显示了P329G CAR-T细胞通过包含Fc区P329G突变的抗体靶向表达肿瘤相关抗原(TAA)的靶细胞的作用机制示意图。
图2显示了采用流式细胞术检测HuR968B CAR-T细胞中，CD3+细胞以及CD4+(CD8-)、CD8+T细胞亚群中CAR的表达。
图3显示了野生型(WT)抗体和P329G突变的抗体(也称为PG抗体)的结构示意图。
图4显示了不同浓度WT和PG突变的曲妥珠单抗(Trastuzumab)、H1-214D8抗体(也简称为H1-214D抗体)以及H2-214D8抗体(也简称为H2-214D抗体)与稳定表达HER2或p95HER2蛋白的肿瘤细胞结合活性。
图5显示了通过荧光素酶法测定的HuR968B CAR-T在WT抗体或PG抗体存在下对表达HER2或表达p95HER2的靶细胞的杀伤实验结果。
图6A显示了HuR968B CAR-T细胞在PG抗体存在下对表达HER2的MCF-7-HER2-ECD-GL肿瘤细胞的动态杀伤实验结果。图中“PC”表示阳性对照，为对靶细胞添加细胞裂解液，使靶细胞全部裂解；“NC”表示阴性对照，为仅有靶细胞。
图6B显示了HuR968B CAR-T细胞在PG抗体存在下对表达p95HER2的MCF-7-p95HER2-ECD-GL肿瘤细胞的动态杀伤实验结果。图中“PC”表示阳性对照，为对靶细胞添加细胞裂解液，使靶细胞全部裂解；“NC”表示阴性对照，为仅有靶细胞。
图7显示了在WT抗体或PG抗体存在下，HuR968B CAR-T细胞与表达HER2或表达p95HER2的细胞共培养后释放IL-2、IFN-γ、TNF-α等效应细胞因子的结果，其中横坐标是抗体浓度。
图8A显示了HuR968B CAR-T细胞在WT抗体或不同浓度PG抗体存在下对表达HER2或表达p95HER2的肿瘤细胞的动态杀伤实验结果。图中“PC”表示阳性对照，为对靶细胞添加细胞裂解液，使靶细胞全部裂解；“NC”表示阴性对照，为仅有靶细胞。
图8B显示了通过LDH法检测的在PG抗体存在下，HuR968B CAR-T细胞对稳定表达HER2或p95HER2肿瘤细胞的杀伤效应。
图8C显示了在PG抗体存在下，HuR968B CAR-T细胞与表达HER2或表达p95HER2的细胞共培养后释放IL-2、IFN-γ、TNF-α等效应细胞因子，图中横坐标是抗体浓度。
发明详述
除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。
I.定义
为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。
如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项。
在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
术语“嵌合抗原受体”或备选地“CAR”指至少包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质信号结构域(在本文中也称为“胞内信号传导结构域”)的重组多肽构建体，其中所述CAR的胞外抗原结合结构域直接靶向特定的疾病抗原例如肿瘤相关抗原。当使用所述CAR修饰免疫细胞例如T细胞时，存在CAR-T细胞过度刺激免疫系统的情形，由此，触发细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome)、神经系统疾病等。为了让细胞疗法更安全，有必要提供“分子开关调控型CAR多肽”。
术语“分子开关调控型CAR多肽”是指至少包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质信号结构域(在本文中也称为“胞内信号传导结构域”)的重组多肽构建体，其中所述胞外抗原结合结构域不直接靶向特定的疾病抗原例如肿瘤相关抗原，而是结合作为“分子开关”的组件。当使用所述“分子开关调控型CAR多肽”修饰免疫细胞例如T细胞时，获得的CAR-T细胞在没有作为“分子开关”的组件存在下，不能刺激免疫系统；仅在作为“分子开关”的组件存在下，才能活化并刺激免疫系统，由此，能够避免发生细胞因子释放综合征、神经系统疾病等。在一些实施方案中，“分子开关调控型CAR多肽”的胞外抗原结合结构域结合融合蛋白中或抗体中Fc结构域的P329G突变，由此，该融合蛋白或抗体作为连接“分子开关调控型CAR多肽”修饰的免疫细胞例如T细胞和疾病细胞例如肿瘤细胞的桥梁，发挥“分子开关”的作用，调节“分子开关调控型CAR多肽”修饰的免疫细胞例如T细胞活性。
术语“Her-2”、“ErbB2”、“c-Erb-B2”、“HER2”、“HER2受体”、“Her2”和“neu”在本文中可互换使用，指天然的Her-2及其等位基因变体，如Semba等人，1985，P.N.A.S.USA 82∶6497-650和Yamamoto等人，1986，Nature 319∶230-234所述。HER2是在约25％的乳腺癌和胃癌中过表达的受体酪氨酸激酶，由胞外结构域、跨膜结构域和胞内酪氨酸激酶结构域组成。尽管抗HER2治疗(例如，单克隆抗体曲妥珠单抗)取得了一些效果，但大部分晚期乳腺癌病例最终恶化。此外，由于HER2在心肌细胞中的表达，在治疗的患者中经常观察到心脏毒性。
术语“p95HER2”是指HER2受体蛋白的羧基末端片段(CTF)，也称为“611-CTF”或“100-115kDa p95HER2”。p95HER2片段是通过在全长HER2分子的密码子位置611启动HER2mRNA的翻译而在细胞中产生的(Anido等人，EMBO J.，25；3234-3244(2006)，其分子量为100-115kDa，在细胞膜上表达，在细胞膜上可形成由分子间二硫键维持的同型二聚体。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用，指包含抗原结合位点的蛋白质，涵盖各种结构的天然抗体和人工抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体、完整抗体和抗体片段。优选地，本发明的抗体是单结构域抗体或重链抗体。
“抗体片段”或“抗原结合片段”在本文中可互换地使用，指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链Fv、单链Fab、双体抗体(diabody)。
术语“scFv”指一种融合蛋白，其包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段，其中轻链可变区和重链可变区任选地借助柔性短多肽接头连续地连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留衍生它的完整抗体的特异性。除非另外指出，否则如本文所用，scFv可以具有按任何顺序(例如，相对于多肽的N末端和C末端)的VL可变区和VH可变区，scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。
“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”或“高变区”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作CDR H1、CDR H2和CDR H3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作CDR L1、CDR L2和CDR L3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人，(1989)Nature342：877-883，Al-Lazikani等人，“Standardconformations for the canonical structures of immunoglobulins”，Journal ofMolecular Biology，273，927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S.Department ofHealth and Human Services，National Institutes of Health(1987))，AbM(Universityof Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(万维网imgt.cines.fr/)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinitypropagation clustering)的North CDR定义。
除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。
CDR也可以基于与参考CDR序列(例如本发明示例的CDR之任一)具有相同的Kabat编号位置而确定。在本发明中，当提及抗体可变区和具体CDR序列(包括重链可变区残基)时，是指根据Kabat编号系统的编号位置。
尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的，但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用Kabat，Chothia，AbM和Contact方法中的至少两种，可以确定最小重叠区域，从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的一个子部分。正如本领域技术人员明了，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定CDR序列其余部分的残基。因此，本发明也考虑本文所给出的任何CDR的变体。例如，在一个CDR的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据Kabat或Chothia或AbM定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。
术语“嵌合抗体”是这样的抗体分子，其中(a)将恒定区或其部分改变、替换或交换，从而抗原结合位点与不同的或改变的类别和/或物种的恒定区或赋予嵌合抗体新性能的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物)等连接；或(b)将可变区或其部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。例如，鼠抗体可以通过将其恒定区更换为来自人免疫球蛋白的恒定区进行修饰。由于更换为人类恒定区，该嵌合抗体可以保留其在识别抗原方面的特异性，同时如与原始鼠抗体相比，具有在人类中降低的抗原性。
“人源化”抗体是指包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在一些实施方案中，人源化抗体中的所有或基本上所有的CDR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可以包含至少一部分的来源于人抗体的抗体恒定区。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人源化的抗体。
“人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于下述抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源，其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
术语“Fc区”指免疫球蛋白重链的C端区域，包括天然序列Fc区和变异Fc区。人IgG重链Fc区通常定义为自其Cys226或Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段，Fc区的C末端447位的赖氨酸残基(依照EU编号系统)可以存在或者缺失。因而，完整抗体组合物可以包括所有K447残基都被消除的抗体群、无K447残基被消除的抗体群、或者混合了有K447残基的抗体和没有K447残基的抗体的抗体群。
在某些实施方案中，免疫球蛋白的Fc区包含两个恒定结构域域，即CH2和CH3，在另一些实施方案中，免疫球蛋白的Fc区包含三个恒定结构域，即CH2、CH3和CH4。
IgG与Fcγ受体或C1q的结合依赖于定位在铰链区和CH2结构域中的残基。CH2结构域的两个区域对FcγR和补体C1q结合至关重要，并且在IgG2和IgG4中具有唯一的序列。已显示取代人IgG1和IgG2中233-236位的残基和取代人IgG4中327、330和331位的残基可大幅降低ADCC和CDC活性(Armour等人，Eur.J.Immunol.29(8)，1999，2613-2624；Shields等人，J.Biol.Chem.276(9)，2001，6591-6604)。
“功能性Fc区”与“有功能Fc区”等类似术语可以互换使用，指具有野生型Fc区的效应功能的Fc区。
“变异Fc区”、“Fc突变体”、“携带突变的Fc区”、“突变Fc区”、“Fc区变体”、“Fc变体”、“变体Fc区”和“突变的Fc区”等类似术语可以互换使用，指包含至少一处氨基酸修饰而区别于天然序列Fc区/野生型Fc区的Fc区。
在一些实施方案中，变异Fc区包含与天然序列Fc区的氨基酸序列相差一处或多处氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列。在一些实施方案中，变异Fc区与野生型IgG的Fc区相比具有至少一处氨基酸取代，所述至少一处氨基酸取代是将根据EU编号的P329位置处的氨基酸取代为甘氨酸(G)。
“Fc受体”或“FcR”指结合抗体Fc区的分子。在一些实施方案中，FcR是天然人FcR。在一些实施方案中，FcR是结合IgG抗体的受体，即FcγR，包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)三种受体，以及这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA和FcγRIIB，FcγRIII受体包括FcγRIIIA和FcγRIIIB。
术语“效应功能”指随免疫球蛋白同种型变动的归因于免疫球蛋白Fc区的那些生物学活性。免疫球蛋白效应子功能的例子包括：Fc受体结合作用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞摄取抗原、C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)和B细胞活化。
术语“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)”是某些细胞毒性效应细胞(例如天然杀伤(NK)细胞)介导对靶细胞和外来宿主细胞杀伤的主要机制之一。在一些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体提供T淋巴细胞的抗体依赖性细胞毒作用、增强NK细胞的抗体依赖性细胞毒作用。本发明的嵌合抗原受体通过与结合肿瘤细胞的抗体(或包含Fc部分的其他抗肿瘤分子)结合，诱发表达该嵌合抗原受体的T细胞活化、持续增殖和发挥经该抗体(或包含Fc部分的其他抗肿瘤分子)介导的对目的癌细胞的特异性细胞毒性。
术语“抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)”指一种细胞反应，其中通过结合靶细胞的抗体与巨噬细胞表面的FcγRIIIa结合，诱导激活巨噬细胞，从而使靶细胞内化和被吞噬体酸化降解。ADCP也可由FcγRIIa和FcγRI介导，但是占比较小。
术语“补体依赖的细胞毒性作用(CDC)”是指在补体存在下靶细胞的裂解。补体系统是由一系列蛋白质组成的先天免疫系统的一部分。补体系统的蛋白质称为“补体”，以缩写符号C1、C2、C3等表示，其是存在于人或脊椎动物血清、组织液中的一组不耐热的，经活化后具有酶活性的蛋白质。C1q是依赖补体的细胞毒性(CDC)途径的第一成分，其能够结合六个抗体，但与两个IgG结合就足以活化补体级联。经典补体途径的激活由补体系统的第一组分(C1q)与结合相关抗原的抗体(适当的亚类)结合而启动，活化一系列补体级联反应，在靶细胞膜中形成孔洞，从而导致靶细胞死亡。为了评估补体活化，可以执行CDC测定法，通过例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述的方法。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。(参见，例如，Kindt等Kuby Immunology，6thed.，W.H.Freeman and Co.91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以给予抗原结合特异性。
如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗体与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)、SPR或生物膜层干涉技术或本领域已知的其他常规结合测定法测定。
术语“刺激”指由刺激分子(例如，TCR/CD3复合体)与其相应配体的结合所诱导的初次应答，所述初次应答因而介导信号转导事件，例如但不限于借助TCR/CD3复合体的信号转导。刺激可以介导某些分子改变的表达，如下调TGF-β和/或细胞骨架结构的再组织等。
术语“刺激分子”指由提供初级胞质信号传导序列的T细胞表达的分子，所述的初级胞质信号传导序列在T细胞信号传导途径的至少某个方面以刺激性方式调节TCR复合体的初级活化。在一个实施方案中，初级信号例如通过TCR/CD3复合体与载有肽的MHC分子的结合引发并且导致介导T细胞反应，包括但不限于增殖、活化、分化等。在本发明的具体CAR中，本发明的任一种或多种CAR中的胞内信号结构域包含胞内信号传导序列，例如，CD3ζ的初级信号传导序列。
术语“CD3ζ”定义为GenBan登录号BAG36664.1提供的蛋白质或其等同物，并且“CD3ζ刺激信号结构域”定义为来自CD3ζ链胞质结构域的氨基酸残基，所述氨基酸残基足以在功能上传播T细胞活化必需的初始信号。在一个实施方案中，CD3ζ的胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1的残基52至残基164或作为其功能直向同源物的来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在一个实施方案中，“CD3ζ刺激信号结构域”是在SEQID NO：17中提供的序列或其变体。
术语“共刺激分子”是指细胞上的与共刺激配体特异性结合从而介导细胞的共刺激反应(例如但不限于增殖)的相应结合配偶体。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的有助于有效免疫应答的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、OX40、CD40、GITR、4-1BB(即CD137)、CD27和CD28。在一些实施方案中，“共刺激分子”是4-1BB(即CD137)。共刺激信号结构域是指共刺激分子的胞内部分。
术语“4-1BB”指TNFR超家族成员，所述成员具有作为GenBank登录号AAA62478.2提供的氨基酸序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基；并且“4-1BB共刺激信号结构域”定义为GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸残基214-255或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在一个实施方案中，“4-1BB共刺激结构域”是作为SEQ ID NO：16提供的序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。
术语“信号传导途径”指在从细胞一个部分传播信号至细胞的另一个部分中发挥作用的多种信号传导分子之间的生物化学关系。
术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子、白介素(IL)，诸如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12，IL-15；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括γ-干扰素。
“分离的”抗体是指已经与其天然环境的组分分离。在一些实施方案中，将本发明的抗体纯化至超过95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。
“分离的”核酸是指这样的核酸分子，其已经与其天然环境的组分分离。分离的核酸包括包含在通常包含该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。“分离的编码本发明抗体的核酸”是指一个或多个核酸分子，其编码本发明抗体的链或其片段，包括在单一载体或分开的载体中的这样的核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的这样的核酸分子。
如下进行序列之间序列同一性的计算。
为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实施方案中，为比较目的，所比对的参考序列的长度是至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％和甚至更优选地至少70％、80％、90％、100％的参考序列长度。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。
可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlcma和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48：444-453)算法(在http://www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(在http://www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdha.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum 62评分矩阵。
还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4)，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法，((1989)CABIOS，4：11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。
额外地或备选地，可以进一步使用本文所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。
术语“氨基酸变化”和“氨基酸修饰”可互换地使用，是指氨基酸的添加、缺失、取代和其他修饰。可以进行氨基酸的添加、缺失、取代和其他修饰的任意组合，条件是最终的多肽序列具有所需的特性。在一些实施方案中，对抗体的氨基酸取代导致抗体与Fc受体的结合降低。为了改变例如Fc区结合特征的目的，特别优选非保守氨基酸取代，即用具有不同结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸。氨基酸取代包括用非天然存在的氨基酸或二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如、4-羟基脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟基赖氨酸)的取代。可以使用本领域公知的遗传或化学方法产生氨基酸变化。遗传方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等。通过除基因工程化之外的方法(如化学修饰)改变氨基酸侧链基团的方法可能是有用的。本文可使用多种名称来表示相同的氨基酸变化。例如，从Fc结构域的329位的脯氨酸到甘氨酸的取代可以表示为329G、G329、G329、P329G Pro329Gly、或简称为“PG”。
术语“保守序列修饰”、“保守序列变化”指未显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰或变化。这类种保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，如位点定向诱变和PCR介导的诱变向本发明的抗体或抗体片段引入修饰。保守性取代是氨基酸残基由具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸取代。已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β-侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因而，可以将本发明CAR内部的一个或多个氨基酸残基替换为来自相同侧链家族的其他氨基酸残基，并且可以使用本文所述的功能测定法测试改变的CAR。
术语“自体的”指这样的任何物质，所述物质从稍后将向个体再次引入所述物质的相同个体衍生。
术语“同种异体的”指这样的任何物质，所述物质从与引入所述物质的个体相同的物种的不同动物衍生。当一个或多个基因座处的基因不相同时，两位或更多位个体据称彼此是同种异体的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异体物质可以在遗传上足够地不相似以发生抗原性相互作用。
术语“异种的”指从不同物种的动物衍生的移植物。
如本文所用的术语“单采血液成分术”指本领域认可的体外方法，借助所述方法，供体或患者的血液从供体或患者取出并且穿过这样的装置，所述装置分离选择的特定组分并将剩余部分返回供体或患者的循环，例如，通过再输血。因此，在“单采样品”的语境中，指使用单采血液成分术获得的样品。
术语“免疫效应细胞”指参与免疫应答，例如参与促进免疫效应反应的细胞。免疫效应细胞的例子包括T细胞，例如，α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞、和髓细胞衍生的吞噬细胞。
“免疫效应功能”、“免疫效应应答”或“免疫效应反应”指例如免疫效应细胞的增强或促进免疫攻击靶细胞的功能或应答。例如，免疫效应功能或应答指促进杀伤靶细胞或抑制靶细胞生长或增殖的T细胞或NK细胞特性。在T细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应功能或应答的例子。
术语“效应功能”指细胞的特化功能。T细胞的效应功能例如可以是溶细胞活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。
术语“T细胞激活”是指T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞应答，选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒活性和活化标志物的表达。本发明的嵌合抗原受体能够诱导T细胞激活。用于测量T细胞激活的合适测定法在实施例中描述，并是本领域中已知的。
术语“慢病毒”指逆转录病毒科(Retroviridae)的一个属。慢病毒在逆转录病毒当中的独特之处在于能够感染非分裂性细胞；它们可以递送显著量的遗传信息至宿主细胞，从而它们是基因递送载体的最高效方法之一。HIV、SIV和FIV均是慢病毒的例子。
术语“慢病毒载体”指从慢病毒基因组的至少一部分衍生的载体，尤其包括如Milone等人，Mol.Ther.17(8)：1453-1464(2009)中提供的自我失活慢病毒载体。可以在临床使用的慢病毒载体的其他例子例如包括但不限于来自Oxford BioMedica的基因递送技术、来自Lentigen的LENTIMAXTM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可获得的并且是本领域技术人员已知的。
术语“个体”或“受试者”可互换地使用，包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，牛、羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。特别地，个体或受试者是人。
术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，涵盖实体瘤和液体肿瘤。
术语“癌症”和“癌性”是指哺乳动物中细胞生长不受调节的生理疾患。
术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
“肿瘤免疫逃逸”指肿瘤逃避免疫识别和清除的过程。如此，作为治疗概念，肿瘤免疫在此类逃避减弱时得到“治疗”，并且肿瘤被免疫系统识别并攻击。肿瘤识别的例子包括肿瘤结合，肿瘤收缩和肿瘤清除。
术语“半数有效浓度(EC50)”是指在特定的暴露时间后诱导在基线和最大值之间的50％的应答的药物、抗体或毒剂的浓度。
术语“荧光激活细胞分选”或“FACS”是指专门类型的流式细胞术。它提供了根据每个细胞的特定光散射和荧光特征，将生物细胞的异质混合物以每次一个细胞分拣到两个或更多个容器中的方法(FlowMetric.“Sorting Out Fluorescence Activated CellSorting”.2017-11-09)。用于进行FACS的仪器是本领域技术人员已知的并且对于公众是可商购获得的。这种仪器的实例包括Becton Dickinson(Foster City，CA)的FACS StarPlus、FACScan和FACSort仪器、来自Coulter Epics Division(Hialeah，FL)的Epics C和来自Cytomation(Colorado Springs，Colorado)的MoFlo。
术语“可药用辅料”指与活性物质一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂、缓冲剂或稳定剂等。
用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体分子用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。
术语“有效量”指本发明的抗体或组合物的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如哺乳动物的物种；体重、年龄和一般健康状况；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。
“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。抗体或抗体片段或其组合物的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和抗体或抗体部分在个体中激发所需反应的能力而变动。治疗有效量也是这样的一个量，其中抗体或抗体片段或其组合物的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤生长率、肿瘤体积等)至少约20％、更优选地至少约40％、甚至更优选地至少约50％、60％或70％和仍更优选地至少约80％或90％。可以在预示人肿瘤中的功效的动物模型系统中评价化合物抑制可度量参数(例如，癌症)的能力。
术语“药物组合”是指非固定组合产品或固定组合产品，包括但不限于药盒、药物组合物。术语“非固定组合”意指活性成分(例如，(i)P329G CAR-T细胞、以及(ii)针对p95HER2的或针对HER2和p95HER2的P329G突变抗体)以分开的实体被同时、无特定时间限制或以相同或不同的时间间隔、依次地施用于受试者，其中这类施用在受试者体内提供有效治疗。术语“固定组合”是指本发明的针对p95HER2的或针对HER2和p95HER2的P329G突变抗体和P329G CAR-T细胞的组合各自以特定的单一剂量的形式同时施用于患者。术语“非固定组合”意指本发明的针对p95HER2的或针对HER2和p95HER2的329G突变抗体和P329G CAR-T细胞的组合作为分开的实体同时、并行或依次施用于患者，没有特定的剂量和时间限制，其中这样的施用提供了患者体内本发明药物组合的治疗有效水平。在一个优选的实施方案中，药物组合是非固定组合。
术语“组合疗法”或“联合疗法”是指施用两种或更多种组分以治疗如本公开所述的癌症。这种施用包括以基本上同时的方式共同施用这些组分。或者，这种施用包括对于各个活性成分在多种或在分开的容器(例如，胶囊、粉末和液体)中的共同施用或分开施用或依次施用。粉末和/或液体可以在施用前重构或稀释至所需剂量。在一些实施方案中，施用还包括以大致相同的时间，或在不同的时间以顺序的方式，使用本发明的针对p95HER2的或针对HER2和p95HER2的P329G突变抗体和P329G CAR-T细胞。在任一情况下，治疗方案将提供药物组合在治疗本文所述的病症或病状中的有益作用。
在本文中当谈及核酸时使用的术语“载体(vector)”是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其有效相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。
术语“宿主细胞”指已经向其中引入外源多核苷酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从其衍生的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸内容上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是可以用来产生本发明抗体分子的任何类型的细胞系统，包括真核细胞，例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞；和原核细胞，例如，大肠杆菌细胞。宿主细胞包括培养的细胞，也包括转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。
“受试者/患者样品”指从患者或受试者得到的细胞、组织或体液的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。肿瘤样品的例子在本文中包括但不限于肿瘤活检、细针吸出物、支气管灌洗液、胸膜液(胸水)、痰液、尿液、手术标本、循环中的肿瘤细胞、血清、血浆、循环中的血浆蛋白质、腹水、衍生自肿瘤或展现出肿瘤样特性的原代细胞培养物或细胞系，以及保存的肿瘤样品，诸如福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。
在谈及疾病时，术语“治疗”是指减轻所述疾病(即，减缓或阻止或减少所述疾病或其至少一个临床症状的发展)、防止或延迟所述疾病的发作或发展或进展。
II.本发明的药物组合中的分子开关调控型嵌合抗原受体(CAR)
本发明涉及能够特异性结合针对p95HER2的或针对HER2和p95HER2分子的抗体的突变Fc结构域的嵌合抗原受体多肽。具体地，本发明的嵌合抗原受体包含人源化抗P329G突变scFv序列，且所述scFv序列能够特异性结合包含P329G突变的抗体Fc结构域，但不能特异性结合未突变的亲本抗体Fc结构域。与未突变的亲本抗体Fc结构域对Fc受体的结合相比较，包含P329G突变的抗体Fc结构域对Fc受体(例如，Fcγ受体)的结合降低。
本发明的重组CAR构建体包含编码CAR的序列，其中CAR包含人源化抗P329G突变scFv序列，所述scFv序列特异性结合P329G突变的抗体Fc结构域。
在一个实施方案中，本发明的CAR构建体中的scFv序列包含如下序列：
(i)重链可变区，其包含根据Kabat编号的
(a)氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO：31)所示的重链互补决定区CDR H1、或所述CDRH1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
(b)氨基酸序列EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO：32)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和
(c)氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO：33)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和
(ii)轻链可变区，其包含根据Kabat编号的
(d)氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO：34)所示的轻链互补决定区(CDR L)1、或所述CDRL1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
(e)氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO：35)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和
(f)氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO：36)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代。
进一步地，scFv可以在N端连接有信号肽序列，例如，SEQ ID NO：28所示的信号肽序列，并且scFv可以在C端连接有如SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24中提供的任选铰链区/间隔区序列、如SEQ ID NO：25中提供的跨膜区、如SEQ ID NO：26的共刺激信号结构域和包含SEQ ID NO：27或其变体的胞内刺激信号结构域，例如，其中各个结构域彼此邻接并处于相同的可读框以形成单个融合蛋白。
在一些实施方案中，scFv结构域包含(i)重链可变区，其包含SEQ ID NO：29的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，和(ii)轻链可变区，其包含SEQ ID NO：30的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
在一些实施方案中，scFv结构域包含(i)SEQ ID NO：29所示的重链可变区和(ii)SEQ ID NO：30所示的轻链可变区。在一个实施方案中，scFv结构域还包含(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6、优选地3或4。scFv的轻链可变区和重链可变区可以例如处于以下任何取向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
在一些实施方案中，本发明的示例性CAR构建体包含信号肽序列、人源化抗P329G突变scFv序列、铰链区/间隔区、跨膜结构域、胞内共刺激信号结构域和胞内刺激信号结构域。
在一个实施方案中，本发明将全长CAR多肽的氨基酸序列作为SEQ ID NO：37提供，如序列表中所示。
在一些实施方案中，本发明提供了重组核酸构建体，其包含编码本发明的CAR的核酸分子，例如，其包含编码SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：37具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的核酸分子。可以使用本领域公知的重组方法获得编码本发明的CAR构建体。备选地，可以合成地产生目的核酸，而非通过基因重组方法产生目的核酸。
本发明包括表达可以直接转导入细胞中的CAR的逆转录病毒载体构建体和慢病毒载体构建体。
在一些实施方案中，将本发明CAR构建体的核酸序列克隆至慢病毒载体中以在单个编码框中产生全长CAR构建体，并用EF1α启动子用于表达。
本领域普通技术人员将理解，本发明的CAR多肽还可以进行修饰，从而在氨基酸序列上变动，但是在所需的活性方面不变动。例如，可以对CAR多肽进行导致“非必需”氨基酸残基处氨基酸置换的额外核苷酸置换。例如，可以将分子中的非必需氨基酸残基替换为来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基。在另一个实施方案中，可以将一个氨基酸片段替换为结构上相似的片段，所述的片段在侧链家族成员的顺序和组成方面中不同，例如，可以进行保守性置换，其中将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基。
本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，所述侧链包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分枝侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
在一些实施方案中，本发明构思了产生功能上等同的CAR多肽分子，例如，可以修饰CAR中包含的人源化抗P329G突变scFv序列的VH或VL，获得与SEQ ID NO：29具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH和与SEQ ID NO：30具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL。
本发明的CAR中包含的跨膜结构域是锚定的跨膜结构域，其是能够整合在细胞膜中的多肽链的组成部分。跨膜结构域可以与其他胞外和/或胞内多肽结构域融合，其中这些胞外和/或胞内多肽结构域也将被限制在细胞膜上。在本发明的嵌合抗原受体(CAR)多肽中，跨膜结构域赋予本发明的CAR多肽的膜附着。本发明的CAR多肽包含至少一个跨膜结构域，其可以衍生自天然来源或重组来源，包含优势疏水的残基如亮氨酸和缬氨酸。在来源是天然的情况下，结构域可以衍生自膜结合蛋白或跨膜蛋白例如CD28、CD8(例如，CD8α，CD8β)的跨膜结构域。在一个实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的跨膜结构域借助铰链区/间隔区与CAR的胞外区(即，人源化抗P329G突变scFv序列)连接。例如，在一个实施方案中，铰链可以是CD8α铰链区、CD28的铰链区。在一些实施方案中，铰链区或间隔区序列包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列。
另外，甘氨酸-丝氨酸双联体也提供特别合适的接头作为铰链区/间隔区。例如，在一个实施方案中，接头包含GGGGS的氨基酸序列(SEQ ID NO：23)。
本发明的CAR中包含的胞质结构域包含胞内信号结构域。胞内信号结构域能够活化引入了本发明CAR的免疫细胞的至少一个效应功能。
用于本发明CAR中的胞内信号结构域的例子包括协同发挥作用以在胞外结构域结合P329G突变的抗体Fc结构域后启动信号转导的T细胞受体(TCR)和共受体的胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能性能力的任何重组序列。
考虑到仅通过TCR生成的信号尚不足以完全活化T细胞，因此本发明的CAR还设计了能够产生共刺激信号的共刺激信号结构域(CSD)。T细胞的活化由两类不同的胞质信号传导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的那些序列(初级胞内信号结构域)和以抗原非依赖性方式发挥作用以提供共刺激信号的那些序列(次级胞质结构域，例如，共刺激结构域)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含初级胞内信号结构域，例如，CD3ζ的初级信号结构域，例如，SEQ ID NO：27所示的CD3ζ信号传导结构域。
本发明CAR中的胞内信号结构域还包次级信号结构域(即，共刺激信号结构域)。共刺激信号结构域指包含共刺激分子的胞内结构域的CAR部分。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外淋巴细胞对抗原作出有效反应所需要的细胞表面分子。在一些实施方案中，共刺激分子包括但不限于CD28、4-1BB(CD137)，其引起的共刺激作用在体外增强人CART细胞的增殖、效应功能和存活并且在体内增进人T细胞的抗肿瘤活性。
在本发明CAR的胞内信号传导序列可以彼此按随机顺序或按指定的顺序连接。任选地，短寡肽接头或多肽接头可以在胞内信号传导序列之间形成键接。在一个实施方案中，甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作合适的接头。在一个实施方案中，单个氨基酸，例如，丙氨酸、甘氨酸，可以用作合适的接头。
在一个实施方案中，本发明CAR的胞内信号结构域设计成包含4-1BB的共刺激信号结构域和CD3ζ的刺激信号结构域。
III.编码本发明CAR的核酸分子、载体和表达本发明CAR的细胞
本发明提供了编码本文所述的CAR构建体的核酸分子。在一个实施方案中，核酸分子作为DNA构建体提供。
本发明还提供了插入有本发明CAR构建体的载体。通过将编码CAR多肽的核酸有效连接至启动子并将构建体并入表达载体中，实现编码CAR的天然或合成的核酸的表达。载体可以适合在真核生物中复制和整合。常见的克隆载体含有用于调节所需核酸序列的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
已经开发了众多基于病毒的系统用于转移基因至哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒提供了用于基因递送系统的便利平台。可以使用本领域已知的技术，将选择的基因插入载体并且包装在逆转录病毒粒子中。随后可以分离重组病毒并将其在体内或离体递送至受试者的细胞。众多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。
衍生自逆转录病毒(如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合和其在子代细胞中增殖。慢病毒载体具有胜过衍生自癌-逆转录病毒(如鼠白血病病毒)的载体的额外优点，因为它们可以转导非增殖性细胞，如肝细胞。它们还具有额外的低免疫原性优点。逆转录病毒载体也可以例如是γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以例如包含启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(PBS)、一个或多个(例如，两个)长末端重复序列(LTR)和目的转基因，例如，编码CAR的基因。γ逆转录病毒载体可以缺少病毒结构性基因如gag、poi和env。
能够在哺乳动物T细胞中表达CAR转基因的启动子的例子是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合体的α亚基表达，所述α亚基负责酶促递送氨酰基tRNA至核糖体。已经在哺乳动物表达质粒中广泛使用了EF1a启动子并且已经显示有效驱动从克隆至慢病毒载体中的转基因表达CAR。参见，例如，Milone等人，Mol.Ther.17(8)：1453-1464(2009)。
启动子的另一个例子是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这个启动子序列是能够驱动与之有效连接的任何多核苷酸序列高水平表达的组成型强启动子序列。但是，也可以使用其他组成型启动子序列，所述其他组成型启动子序列包括但不限于猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、埃巴病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1α启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。另外，本发明不应当限于使用组成型启动子。还构思了诱导型启动子作为本发明的部分。
在一些实施方案中，本发明提供了在哺乳动物免疫效应细胞(例如哺乳动物T细胞)中表达本发明的CAR构建体的方法和由此产生的免疫效应细胞。
从受试者获得细胞来源(例如，免疫效应细胞，例如，T细胞)。术语“受试者”意在包括可以激发免疫应答的活生物(例如，哺乳动物)。可以从众多来源获得T细胞，包括外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。
可以使用本领域技术人员已知的任何技术(如FicollTM分离法)，从采集自受试者的血液成分中获得T细胞。在一个优选的方面，通过单采血液成分术获得来自个体循环血液的细胞。单采产物一般含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核的白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以洗涤通过单采血液成分术采集的细胞，以除去血浆级分并且以在用于后续加工步骤的适宜缓冲液或培养基中放置细胞。在本发明的一个方面，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。
可以通过正向或负向选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，在一个实施方案中，通过与抗CD3/抗CD28缀合的珠(如M-450 CD3/CD28 T)温育一段足够正向选择所需T细胞的时间，分离T细胞。在一些实施方案中，该时间段是约30分钟至36小时之间或更长时间。较长的温育时间可以用来在存在少量T细胞的任何情况下分离T细胞，如用于从肿瘤组织或从免疫受损个体分离肿瘤浸润型淋巴细胞(TIL)。另外，使用较长的温育时间可以增加捕获CD8+T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长该时间，允许T细胞与CD3/CD28珠结合和/或通过增加或减少珠对T细胞的比率，可以在培养伊始或在培养过程期间的其他时间点偏好地选择T细胞亚群。
可以用抗体的组合，通过负选择过程完成T细胞群体的富集，其中所述抗体针对负向选择的细胞独有的表面标志物。一种方法是借助负向磁力免疫粘附法或流式细胞术分选和/或选择细胞，所述负向磁力免疫粘附法或流式细胞术使用针对负向选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。
在一些实施方案中，免疫效应细胞可以是同种异体免疫效应细胞，例如，T细胞。例如，细胞可以是同种异体T细胞，例如，缺少功能性T细胞受体(TCR)和/或人白细胞抗原(HLA)(例如，HLA I类和/或HLA II类)表达的同种异体T细胞。
缺少功能性TCR的T细胞可以例如经工程化，从而它在其表面上不表达任何功能性TCR；经工程化，从而它不表达构成功能性TCR的一个或多个亚基(例如，经工程化，从而它不表达或显示出减少表达的TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、TCRε和/或TCRζ)；或经工程化，从而它在其表面上产生非常少的功能性TCR。
本文所述的T细胞例如可以如此工程化，从而它不在其表面上表达功能性HLA。例如，本文所述的T细胞可以如此工程化，从而HLA(例如，HLA I类和/或HLA II类)的细胞表面表达下调。在一些方面，可以通过减少或消除β-2微球蛋白(B2M)表达实现HLA的下调。
在一些实施方案中，T细胞可以缺少功能性TCR和功能性HLA，例如，HLA I类和/或HLA II类。
在一个实施方案中，对编码本发明所述的CAR的核酸转导的细胞进行增殖，例如，将细胞在培养下增殖2小时至约14天。
对经体外增殖后获得的表达CAR的免疫效应细胞可以如实施例中所述进行效应功能的检测。
IV.本发明的药物组合中的作为“分子开关”的包含突变Fc结构域的抗体
本文中所提供的特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的抗体包含突变Fc结构域，其中根据EU编号的P329位置处的氨基酸突变为甘氨酸(G)，与未突变的亲本抗体Fc结构域的Fcγ受体结合相比，突变Fc结构域的Fcγ受体结合降低；例如，所述突变Fc结构域是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的突变Fc结构域，优选地，所述突变Fc结构域是IgG1或IgG4抗体的突变Fc结构域；更优选地，所述突变Fc结构域是IgG1抗体的突变Fc结构域，例如，所述突变Fc结构域是人IgG1抗体的突变Fc结构域。
包含P329G突变Fc结构域的特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的抗体不能通过与Fcγ受体结合来发挥抗体依赖性细胞毒性，也不能发挥抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)。
本发明的以高靶特异性和高亲和性结合p95HER2的或结合HER2和p95HER2的抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列GFTFSTYGMA(SEQ ID NO：14)所示的CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；氨基酸序列TINSNGGKTYHPDSVKG(SEQ ID NO：15)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和氨基酸序列EGFDY(SEQ ID NO：16)所示的CDRH3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KASQNVGTAVA(SEQ ID NO：11)所示的CDR L1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；氨基酸序列SASNRYT(SEQID NO：12)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和氨基酸序列QQYSTYPLT(SEQ ID NO：13)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合HER2和p95HER2的抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：
重链可变区包含SEQ ID NO：8的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO：9的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
其中所述至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列中的氨基酸变化优选氨基酸取代，更优选氨基酸保守取代，优选地，所述氨基酸变化不发生在CDR区中。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合p95HER2的抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：
重链可变区包含SEQ ID NO：10的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO：9的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
其中所述至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列中的氨基酸变化优选氨基酸取代，更优选氨基酸保守取代，优选地，所述氨基酸变化不发生在CDR区中。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体；优选地，其是IgG1或IgG4抗体；更优选地，其是IgG1抗体，例如，人IgG1抗体。
在一些实施方案中，本发明提供了编码以上任何结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的抗体或其片段或其任一条链的核酸。在一个实施方案中，提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。在一个实施方案中，提供包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如CHO细胞或293细胞)或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是原核的。
例如，本发明的核酸包含编码本发明的特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的抗体的核酸。在一些实施方案中，提供包含所述核酸的一个或多个载体。在一个实施方案中，载体是表达载体，例如真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。在一个实施方案中，载体是pcDNA3.4表达载体。
一旦已经制备了用于表达的表达载体或DNA序列，则可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以用来实现这个目的，例如，原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因枪、基于脂质的转染或其他常规技术。在原生质体融合的情况下，将细胞在培养基中培育并且筛选适宜的活性。用于培养所产生的转染细胞和用于回收产生的抗体分子的方法和条件是本领域技术人员已知的并且可以基于本说明书和现有技术已知的方法，根据使用的特定表达载体和哺乳动物宿主细胞变动或优化。
另外，可以通过引入允许选择已转染的宿主细胞的一个或多个标记物，选出已经稳定将DNA掺入至其染色体中的细胞。标记物可以例如向营养缺陷型宿主提供原养型、杀生物抗性(例如，抗生素)或重金属(如铜)抗性等。可选择标记基因可以与待表达的DNA序列直接连接或通过共转化引入相同的细胞中。也可能需要额外元件以便最佳合成mRNA。这些元件可以包括剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。
在一个实施方案中，提供了包含本发明多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了包含本发明表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体的其它细胞。合适的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌。宿主细胞还可以是真核微生物如丝状真菌或酵母，或各种真核细胞，例如昆虫细胞等。也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(HEK293或293F细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝脏细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝脏细胞(HepG2)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、CHO-S细胞、NSO细胞、骨髓瘤细胞系如Y0、NS0、P3X63和Sp2/0等。适于产生蛋白质的哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编著，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是CHO细胞或HEK293细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了制备特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的P329G突变抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达编码所述抗体的核酸的条件下培养包含编码所述特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的P329G突变抗体的核酸或包含所述核酸的表达载体的宿主细胞，以及任选地分离所述结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的P329G突变抗体。在某个实施方案中，所述方法还包括从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的P329G突变抗体。
如本文所述制备的本发明的特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的P329G突变抗体可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且这些对本领域技术人员是显而易见的。可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的P329G突变抗体的纯度，所述熟知分析方法包括大小排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的P329G突变抗体鉴定、筛选或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。一方面，对本发明的特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的P329G突变抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如FACS、ELISA或Western印迹等来进行。在一些实施方案中，使用FACS测定本发明的特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的P329G突变抗体对细胞表面表达的HER2/p95HER2的结合。
供任何上述体外测定法使用的细胞包括天然表达HER2/p95HER2或经改造而表达HER2/p95HER2细胞系。所述经改造而表达HER2/p95HER2细胞系是正常情况下不表达p95HER2或HER2的、将编码HER2/p95HER2的DNA转染入细胞之后表达p95HER2或HER2的细胞系。
V.本发明的药物组合
对于优化CAR疗法的安全性和疗效而言，本发明的分子开关调控型嵌合抗原受体是可以控制CAR活性的可调控型CAR。本发明使用将Pro329Gly(抗体Fc段根据EU编号的第329位脯氨酸突变为甘氨酸，简写为P329G)突变抗体作为本发明CAR治疗中的安全开关。在所述P329G突变抗体不存在时，本发明的CAR活性关闭；在所述P329G突变抗体存在时，本发明的CAR活性开启；由此，本发明的CAR分子活性的开启和关闭受到P329G突变抗体的调控。
在一些实施方案中，本发明提供了药物组合，其包含(i)表达本发明的分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞(例如，T细胞)；和(ii)特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的P329G突变抗体。例如，所述免疫效应细胞是自自体T细胞或同种异体T细胞制备的表达本发明的分子开关调控型CAR多肽的T细胞，例如，所述免疫效应细胞是自人PBMC分离的T细胞制备的表达本发明的分子开关调控型CAR多肽的T细胞。在一些实施方案中，所述P329G突变抗体是H1-214D8 PG Ab和/或H2-214D8 PG Ab。
在一些实施方案中，本发明提供了药物组合，其包含(i)编码本发明的分子开关调控型CAR多肽的核酸分子或包含所述核酸组分的载体；和(ii)特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的P329G突变抗体。
在一些实施方案中，本发明的药物组合任选地进一步包含合适制剂的可药用辅料。例如，所述药物组合中的(ii)可根据常规方法制剂化(例如Remington’sPharmaceutical Science，最新版，Mark Publishing Company，Easton，U.S.A)。
在一些实施方案中，本发明的药物组合用于治疗癌症，例如表达或过表达p95HER2或者表达或过表达p95HER2和HER2的癌症。
VI.本发明的药物组合的用途和使用本发明的药物组合的治疗方法
本发明提供了前述本发明的药物组合，其用于在受试者中治疗肿瘤。
在一个实施方案中，本发明的药物组合用于在受试者中治疗表达或过表达p95HER2或者表达或过表达p95HER2和HER2的癌症，并且能够减轻癌症的至少一种症状或指征的严重性或抑制癌细胞生长。
本发明提供了在受试者中治疗癌症(例如，表达或过表达p95HER2或者表达或过表达p95HER2和HER2的癌症)的方法，其包括向有需要的个体施用治疗有效量的本发明的药物组合。
本发明提供了前述本发明的药物组合在制备用于治疗癌症(例如，表达或过表达p95HER2或者表达或过表达p95HER2和HER2的癌症)的药物中的用途。
本发明的药物组合也可以施用于已经用一种或多种先前疗法治疗癌症但随后复发或转移的个体。
在一些实施方案中，本发明的药物组合中的(i)表达本发明的分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞是自自体T细胞或同种异体T细胞制备的表达本发明CAR多肽的T细胞；本发明的药物组合中的(ii)特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的P329G突变抗体是任何特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的抗体，其包含P329G突变。优选地。所述P329G突变抗体是H1-214D8 PG Ab和/或H2-214D8 PG Ab。
本发明的药物组合可以以合适的剂量施用于受试者。剂量方案将由主治医生和临床因素决定。如医学领域中公知的，用于任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体重、身体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况、和待并行施用的其他药物。
在一些实施方案中，向患有癌症的个体施用本发明的药物组合导致肿瘤的完全消失。在一些实施方案中，向患有癌症的个体施用本发明的药物组合导致肿瘤细胞或肿瘤大小减少至少85％或更多。可以通过本领域已知的任何方法测量肿瘤的减少，例如X-线、正电子发射断层扫描(PET)、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、细胞学、组织学或分子遗传分析。
在一些实施方案中，本发明的药物组合可以降低CAR-T细胞存在的“在靶/脱肿瘤(On-target/off tumor)”毒性。
VII.本发明的药盒
本发明提供了一种成套药盒，其包含本发明的药物组合，优选地所述药盒为药物剂量单元形式。由此可以依据给药方案或药物施用间隔提供剂量单元。
在一个实施方案中，本发明的成套药盒在同一包装内包含：
(i)选自表达本发明的分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞(例如，T细胞)、编码本发明的分子开关调控型CAR多肽的核酸分子、包含所述核酸的载体、和它们的任意组合；
(ii)特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的P329G突变抗体。
本发明所述的各个实施方案/技术方案以及各个实施方案/技术方案中的特征应当被理解为可以任意进行相互组合，这些相互组合得到的各个方案均包括在本发明的范围内，就如同在本文中具体地且逐一地列出了这些相互组合而得到的方案一样，除非上下文清楚地显示并非如此。
描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成对本发明的保护范围的限制。
实施例
实施例1、CAR-T细胞制备及CAR表达检测
1.1.CAR基因合成及病毒表达载体构建
构建了P329G CAR分子(本文中有时也简称为“PG CAR”)，也称为HuR968B CAR(SEQID NO：37)。如图1A所示，该P329G CAR分子从N端到C端分别包含SEQ ID NO：28所示的CD8α信号肽(SP)、特异性识别融合蛋白或抗体上P329G突变的单链抗体片段(VH-接头-VL，具有SEQ ID NO：29所示的VH、SEQ ID NO：22所示的(G4S)4接头序列、SEQ ID NO：30所示的VL)、SEQ ID NO：23所示的G4S铰链区、SEQ ID NO：25所示的CD8α分子跨膜区、SEQ ID NO：26所示的4-1BB分子共刺激信号域及SEQ ID NO：27所示的CD3ξ分子胞内刺激信号结构域(SSD)(CD3ζSSD)。
人工合成编码HuR968B CAR(SEQ ID NO：37)的DNA片段，插入pRK慢病毒表达载体(由pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE载体(Addgene，12252，购自生物风)通过替换启动子和抗性基因改构而成)的EF1α启动子下游，替换载体中的EGFP序列，获得了CAR表达质粒pRK-HuR968B。
与传统CAR-T细胞不同，表达P329G CAR分子的P329G CAR-T细胞不直接识别肿瘤细胞表面抗原(TAA)，而且借助携带Fc段P329G突变的融合蛋白或抗体来识别肿瘤细胞，然后P329G CAR-T细胞发挥对肿瘤细胞的杀伤(图1B)。
1.2.慢病毒浓缩液的制备：
将实施例1.1制备的CAR表达质粒与结构质粒pMDLg/pRRE(Addgene，12251，购自生物风)、调节质粒pRSV-rev(Addgene，12253，购自生物风)及包膜质粒pMD2G(Addgene，12259，购自生物风)以3∶3∶2∶2的质量比例用PEI转染法转染Lenti-X-293T细胞(Takara公司)，转染16小时后，更换为含有2％胎牛血清(FBS)的新鲜DMEM培养基，继续培养48小时后，收集细胞上清，离心去细胞碎片，加入PEG80004℃孵育16-64小时进行慢病毒浓缩，再次离心后去上清，采用T细胞培养基重悬慢病毒沉淀物，获得慢病毒浓缩液，分装后-80℃冻存。
1.3.慢病毒滴度检测：
消化Lenti-X-293T细胞(Takara公司)并用含有8μg/ml Polybrene(Sigma，H9268-5G)的DMEM培养基重悬细胞，将细胞悬液加入到24孔板中，加入不同体积的自实施例1.2获得的慢病毒浓缩液，培养72小时，进行293T细胞的转导。
将慢病毒浓缩液转导后的293T细胞消化，用生物素-SP-缀合的抗人IgG，F(ab’)2-特异的(Biotin-SP-conjugated anti-Human IgG，F(ab’)2-specific)(JacksonImmunoResearch，109-066-006)以及APC-链亲和素(BioLegend，405207)进行染色，并采用细胞流式术检测APC阳性细胞的比例。通过起始细胞量、病毒体积和阳性细胞比例计算出病毒滴度(TU/ml)。
1.4.T细胞分选、感染及CAR-T扩增培养：
添加注射用重组人白介素-2(国药准字S20040020)至TexMACS GMP Medium(Miltenyi Biotec，170-076-309)中，配制成IL-2浓度为200IU/ml的T细胞培养基。
第0天使用Pan T Cell Isolation Kit(human)(Miltenyi，130-096-535)对复苏后的PBMC(供者信息见表1)进行分选，获得T细胞，使用T细胞培养基将T细胞重悬至一定的密度并添加TransAct(Miltenyi，130-111-160)进行激活。
表1供者来源的PBMC细胞的相关信息
| 供者ID | 年龄 | 性别 | 血型 | 病毒测试 | CD3+ | CD4+ | CD8+ | CD14+ | CD19+ | CD56+ | |
| 供者5 | Z0086 | 22 | 男性 | O | 阴性 | 60％ | 36％ | 21％ | 22％ | 9％ | 6％ |
| 供者6 | Z0084 | 26 | 男性 | A+ | 阴性 | 58％ | 35％ | 19％ | 17％ | 13％ | 7％ |
| 供者7 | Z0091 | 25 | 男性 | AB+ | 阴性 | 55％ | 27％ | 21％ | 24％ | 7％ | 10％ |
第1天分出一定量T细胞不添加慢病毒继续培养，该部分细胞为未转导的T细胞(UNT，un-transduced T cells)，剩余的细胞按MOI＝1～5添加不同种类的自实施例1.2获得的慢病毒浓缩液并将T细胞吹打均匀；第2天离心去除病毒上清，重悬细胞至新鲜配制的T细胞培养基。UNT细胞无任何操作；第3天将所有细胞转移至G-Rex(WILSONWOLF，货号80040S)中，并添加适量新鲜T细胞培养基，放置于37℃CO2培养箱中静置培养；每隔2～3天，将细胞以培养基的半量更换为新鲜培养基或直接补加IL-2，其中，添加IL-2至细胞培养基浓度中IL-2浓度为200IU/ml。当细胞数量扩增至约为20-80倍时，满足需求后(一般达到2～8x108个细胞)进行细胞收获。离心去除培养基后CAR-T细胞采用CS10(Stemcell，07930)重悬后分装，程序降温至-80℃进行冻存。
1.5.CAR表达检测
取适量自上述实施例1.4获得的CAR-T细胞，FACS缓冲液(PBS+2％FBS)洗涤一次，重悬后加入含LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain(Thermo，L34963)的FACS缓冲液，室温染色10-15min，洗涤两次，加入PerCP-Cy5.5-CD3(BD，560835)、BUV805-CD8(BD，749366)、生物素-F(ab′)2片段山羊抗人IgG(Biotin-F(ab′)2Fragment Goat Anti-Human IgG)(Jackson ImmunoResearch，109-066-006)抗体组合，洗涤两次后再加入APC-链亲和素，4℃染色30～45min；细胞洗涤两次后FACS缓冲液重悬，用流式细胞仪检测。代表性流式细胞图如图2所示。
图2显示了对各供体来源的T细胞转导HuR968B CAR后，CD3+细胞、CD4+(也表示为CD8-)、CD8+T细胞亚群中CAR的表达，结果表明这些经转导的T细胞中CAR表达阳性率约为11％～38％。
实施例2、HER2以及p95HER2稳定表达细胞系的构建
人工合成编码HER2的胞外区域及跨膜区域以及胞内近膜结构域(JMD)区域(保留二聚化的能力)(本文中也称为HER2-ECD)的DNA片段。HER2-ECD的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
人工合成编码p95HER2的胞外区域及跨膜区域以及胞内近膜结构域(JMD)区域(保留二聚化的能力)(本文中也称为p95HER2-ECD)的DNA片段。p95HER2-ECD的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
合成SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA片段，添加5′BamHI限制性酶切位点和5′UTR(GCCACC)(SEQ ID NO：41)，通过5′BamHI限制性酶切位点使用重组的方法将目标序列克隆至载体pRK-GL(包含荧光素酶以及EGFP的pRK慢病毒载体)，获得pRK-HER2-ECD-GL、pRK-p95HER2-ECD-GL表达质粒。用Lenti-X-293T细胞(购自Clontech，632180)包装慢病毒，并用获得的慢病毒感染MCF7细胞(购自上海细胞库，TCHU74)、MDA-MB-468细胞(购自南京科佰生物科技有限公司，CBP60387)，然后经流式细胞术分选，得到过量表达HER2或p95HER2的、EGFP和荧光素酶双表达的MCF-7-HER2-ECD-GL、MCF-7-p95HER2-ECD-GL、MDA-MB-468-HER2-ECD-GL、MDA-MB-468-p95HER2-ECD-GL细胞系。
另外，将编码HER2或p95HER2的DNA片段插入pRK慢病毒载体中，用Lenti-X-293T细胞(购自Clontech，632180)包装慢病毒，并用获得的慢病毒感染MCF10A细胞(人正常乳腺上皮细胞)(购自南京科佰生物科技有限公司，CBP60419)、CHO-K1细胞(购自南京科佰生物科技有限公司，CBP60296)，然后经流式细胞术分选，得到过量表达HER2或p95HER2的MCF10A-HER2、MCF10A-p95HER2-CTF611、CHO-K1-HER2、CHO-K1-p95HER2-CTF611细胞系。
实施例3、p95HER2特异性P329G突变抗体与抗原结合活性检测
3.1.p95HER2特异性抗体的合成：
从欧洲专利申请号EP20382457.8(已获授权使用)获得抗p95HER2抗体H1-214D8的重链可变区序列(SEQ ID NO：8)和轻链可变区序列(SEQ ID NO：9)；抗p95HER2抗体H2-214D8的重链可变区序列(SEQ ID NO：10)和轻链可变区序列(SEQ ID NO：9)。采用全基因合成所述抗体的重链可变区编码序列和轻链可变区编码序列。
将编码抗p95HER2抗体H1-214D8的重链可变区序列(SEQ ID NO：8)的核苷酸序列装入含有WT的人源IgG1重链恒定区或含有P329G点突变的人源IgG1重链恒定区的pcDNA3.4表达载体(购自上海伯英)上，获得分别编码SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示重链的表达载体。类似地，将编码抗p95HER2抗体H2-214D8的重链可变区序列(SEQ ID NO：10)的核苷酸序列装入含有WT的人源IgG1重链恒定区或含有P329G点突变的人源IgG1重链恒定区的pcDNA3.4表达载体(购自上海伯英)上，获得分别编码SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示重链的表达载体。
将编码抗p95HER2抗体H1-214D8和H2-214D8的轻链可变区序列(SEQ ID NO：9)的核苷酸序列装入含有K轻链恒定区的pcDNA3.4表达载体(购自上海伯英)上，获得编码SEQID NO：5所示轻链的表达载体。
将轻链表达载体和重链表达载体按照2∶3摩尔比通过PEI共转染到HEK293细胞中，培养5～7天后收集培养基上清。含有抗体的上清培养基通过ProteinA柱进行一步纯化，之后用PBS透析。采用NanoDrop仪器读取280nm吸光度值检测浓度，并用SDS-PAGE和SEC-HPLC方法检测样品纯度。图3例示了野生型(WT)和突变型(PG)抗p95HER2抗体的结构示意图。
3.2.抗体的亲和力检测：
通过生物膜干涉技术(BLI)测定了PG突变的抗体H1-214D8、H2-214D8与HER2以及p95HER2蛋白的亲和力。
首先，获得如下蛋白：人CTF611-his(为His标签偶联的单体p95HER2蛋白，GenScript，AGF0601)，人Her2-mIgG2a(为使用小鼠IgG2a偶联的二聚体人HER2蛋白，BIOINTRON，B652901)、人CTF611-mIgG2a(为使用小鼠IgG2a偶联的二聚体人p95HER2蛋白，BIOINTRON，B652902)、cyno CTF611-mIgG2a(为使用小鼠IgG2a偶联的二聚体食蟹猴p95HER2蛋白，BIOINTRON，B652903)、小鼠CTF611-mIgG2a(为使用小鼠IgG2a偶联的二聚体小鼠p95HER2蛋白，BIOINTRON，B652903)。
生物膜干涉技术(BLI)测定的具体方法如下：实验开始前半个小时，根据样品数量，取合适数量的AHC传感器(Sartorius，18-5060)浸泡于SD缓冲液(1x PBS，0.1％BSA，0.05％Tween-20)中。将作为抗原的人CTF611-his的浓度稀释为200nM，人Her2-mIgG2a、人CTF611-mIgG2a、猴CTF611-mIgG2a、小鼠CTF611-mIgG2a蛋白的浓度稀释为100nM。分别将SD缓冲液、抗体溶液、作为抗原的蛋白溶液加入到96孔黑色聚苯乙烯微孔板(Greiner，655209)中。使用Fortebio Octet Red96e进行检测，根据样品位置布板，选择传感器位置。仪器运行步骤和设置参数如下：平衡基线120s、加样固定化抗体100s、平衡基线120s、结合抗原100s和解离120s，转速为1000rpm，温度为30℃。实验完成后，使用ForteBio Octet分析软件，采用1∶1结合模型进行亲和力及动力学拟合。结果见表2A和表2B。
表2A PG抗体与来自人HER2蛋白的结合亲和力
表2B PG抗体与来自不同种属的p95HER2蛋白的结合亲和力
由表2A和表2B可见，H1-214D8 PG抗体与HER2蛋白和p95HER2蛋白均可结合，其中结合活性的高低顺序依次为：人p95HER2蛋白>猴p95HER2蛋白>小鼠p95HER2蛋白>人HER2蛋白。H2-214D8 PG抗体仅与人和食蟹猴p95HER2蛋白结合。
3.3.P329G p95HER2抗体与肿瘤细胞表面抗原结合活性检测：
用FACS缓冲液将WT或P329G突变(本文中也称为“PG突变”或“PG”)的曲妥珠单抗(Trastuzumab)、H1-214D8、H2-214D8或对照hIgG1配制成100倍梯度稀释溶液，分别与2×105个靶细胞(MCF-7-HER2-ECD-GL、MCF-7-p95HER2-ECD-GL、MDA-MB-468-HER2-ECD-GL、MDA-MB-468-p95HER2-ECD-GL、MCF10A-HER2、MCF10A-p95HER2、CHOK1-HER2、CHOK1-p95HER2)4℃孵育30分钟，用FACS缓冲液清洗后，再加入APC-山羊抗人IgG Fcγ片段特异的(Jackson ImmunoResearch，109-136-098)第二抗体4℃孵育30分钟。采用流式细胞术检测与细胞结合的抗体，分析APC通道MFI，以抗体浓度为X轴，APC通道MFI为Y轴进行绘图并计算结合的EC50(表3和图4)。
图4显示不同浓度WT和PG突变的曲妥珠单抗(Trastuzumab)、H1-214D8以及H2-214D8抗体与稳定表达HER2或p95HER2蛋白的肿瘤细胞结合活性。WT或PG突变的曲妥珠单抗(Trastuzumab)、H1-214D8抗体能够与表达HER2的肿瘤细胞结合并呈现浓度依赖性。WT或PG突变的H1-214D8及H2-214D8抗体能够与表达p95HER2的肿瘤细胞结合并呈现浓度依赖性。
表3 PG抗体与过量表达HER2或p95HER2蛋白的肿瘤细胞系结合的EC50值
实施例4、抗体介导P329GCAR-T细胞体外杀伤乳腺癌细胞的功能研究
4.1.荧光素酶法细胞杀伤实验：
复苏HuR968B CAR-T细胞，过夜培养恢复；复苏培养稳定转染荧光素酶的MCF-7-HER-ECD-GL、MCF-7-p95HER-ECD-GL靶肿瘤细胞，将靶肿瘤细胞(10000个细胞/100μL)铺至96孔白底酶标板中，放置37℃培养箱过夜。
将CAR-T细胞按照E∶T 1∶1与肿瘤靶细胞混合，并于相应孔内添加梯度浓度的WT或PG突变的曲妥珠单抗(Trastuzumab)、H1-214D8抗体、H2-214D8抗体(终浓度0.016、0.08、0.4、2、10μg/ml)，置于37℃培养箱培养24小时。设置基线孔，其中向基线孔内添加培养液。采用One-GloTM Luciferase Assay System(Promega，E6120)以及酶标仪(MolecularDevices，SpectraMax i3x)检测CAR-T细胞对靶细胞的杀伤的荧光值，使用如下公式计算杀伤效率％。
荧光素酶法测定的细胞杀伤实验结果如图5所示。PG突变的曲妥珠单抗(Trastuzumab)、H1-214D8抗体能够介导HuR968B CAR-T细胞对表达HER2的MCF-7-HER2-ECD-GL肿瘤细胞产生浓度依赖性杀伤效应。PG突变的曲妥珠单抗(Trastuzumab)、H1-214D8抗体及H2-214D8抗体能够介导HuR968B CAR-T细胞对表达p95HER2的MCF-7-p95HER2-ECD-GL肿瘤细胞(本底低表达HER2)产生浓度依赖性杀伤效应，且PG突变的H1-214D8抗体、H2-214D8抗体显示出更优的杀伤效果。
4.2.动态杀伤实验：
采用xCELLigence RTCA MP仪器(Agilent)动态实时检测HuR968B CAR-T细胞对MCF-7-HER-ECD-GL、MCF-7-p95HER-ECD-GL靶肿瘤细胞的杀伤情况。
具体地，在96孔E-Plates板(Agilent，3006000910)中添加50μL培养基，仪器读取基准值后，添加50μL各肿瘤靶细胞(10000个细胞)，放置仪器内动态检测。同时，复苏未转导(UNT)细胞及实施例1制备的P329G CAR-T细胞，过夜培养恢复后，采用UNT细胞将来自不同健康供者(表1)制备的P329G CAR-T细胞用CAR阳性率调整一致，按E∶T比例1∶1加入至含有肿瘤靶细胞的E-Plates板孔中，并加入梯度浓度的WT(10μg/ml)或PG突变的曲妥珠单抗(Trastuzumab)、H1-214D8、H2-214D8(终浓度0.00064、0.0032、0.016、0.08、0.4、2、10μg/ml)。xCELLigence RTCA MP仪器系统动态持续监测P329G CAR-T细胞对靶细胞杀伤情况，持续60小时。对表达HER2的MCF-7-HER2-ECD-GL肿瘤细胞的杀伤效应如图6A所示；对表达p95HER2的MCF-7-p95HER2-ECD-GL肿瘤细胞的杀伤效应如图6B所示。
图6A和图6B的动态杀伤实验结果显示，PG突变的曲妥珠单抗(Trastuzumab)、H1-214D8抗体能够介导HuR968B CAR-T细胞对表达HER2的肿瘤MCF-7-HER2-ECD-GL细胞产生浓度依赖性杀伤效应。PG突变的曲妥珠单抗(Trastuzumab)、H1-214D8抗体及H2-214D8抗体能够介导HuR968B CAR-T细胞对表达p95HER2的MCF-7-p95HER2-ECD-GL肿瘤细胞(本底低表达HER2)产生浓度依赖性杀伤效应，且PG突变的H1-214D8抗体、H2-214D8抗体显示出更优的杀伤效果。
4.3.细胞因子检测：
将肿瘤靶细胞和P329G CAR-T细胞按照E∶T为1∶1进行混合，加入5倍梯度稀释的WT或PG突变的曲妥珠单抗(Trastuzumab)、H1-214D8抗体、H2-214D8抗体(终浓度0.016、0.08、0.4、2、10μg/ml)，37℃共孵育24h，离心取细胞上清液。
使用BDTM Cytometric Bead Array(CBA)Human Th1/Th2 Cytokine Kit II对收获的细胞上清液中的细胞因子进行检测。
具体地，按照试剂盒说明书，将6种细胞因子Capture Beads等体积混匀后，以25μL/孔在96孔V底板进行布板。添加等体积收获的细胞上清液或上清稀释液或标准品。混匀后添加25μL等体积的Human Th1/Th2 PE Detection Reagent，室温避光孵育3h。使用洗涤缓冲液进行两次洗涤后重悬，用流式细胞仪检测，通过PE通道MFI值计算细胞因子浓度。
细胞因子检测结果显示于图7。在PG突变的曲妥珠单抗(Trastuzumab)、H1-214D8抗体存在情况下，HuR968B CAR-T细胞与MCF-7-HER2-ECD-GL细胞共培养可浓度依赖性释放IL-2、IFN-γ、TNF-α效应细胞因子。在PG突变的曲妥珠单抗(Trastuzumab)、H1-214D8抗体、H2-214D8抗体存在情况下，HuR968B CAR-T细胞与MCF-7-p95HER2-ECD-GL细胞共培养可浓度依赖性释放IL-2、IFN-γ、TNF-α效应细胞因子。
实施例5、抗体介导P329G CAR-T细胞体外杀伤稳定表达HER2、p95HER2乳腺细胞的
功能研究
5.1.动态杀伤实验：
采用xCELLigence RTCA MP仪器(Agilent)动态实时检测HuR968B CAR-T细胞对MCF-10A-HER2、MCF-10A-p95HER2-CTF611靶细胞的杀伤情况。
具体地，在96孔E-Plates板(Agilent，3006000910)中添加50μL培养基，仪器读取基准值后，添加50μL肿瘤靶细胞(10000个细胞)，放置仪器内动态检测。同时，复苏未转导(UNT)细胞及实施例1制备的P329G CAR-T细胞，过夜培养恢复后，采用UNT细胞将来自不同健康供者(表3)制备的P329G CAR-T细胞用CAR阳性率调整一致，按E∶T比例1∶1加入至含有肿瘤靶细胞的E-Plates板孔中，并加入梯度浓度的WT(10μg/ml)或PG突变的H1-214D8、H2-214D8(终浓度0.00064、0.0032、0.016、0.08、0.4、2μg/ml)。xCELLigence RTCA MP仪器系统动态持续监测P329G CAR-T细胞对靶细胞的杀伤情况。
图8A显示了动态杀伤实验结果。PG突变的H1-214D8抗体、PG突变的H2-214D8抗体能够介导HuR968B CAR-T细胞对表达p95HER2的MCF-10A-p95HER2-CTF611细胞产生浓度依赖性杀伤效应。
5.2.终点法细胞杀伤实验：
复苏HuR968B CAR-T细胞，过夜培养恢复。将靶细胞(10000个细胞)100μL铺至96孔白底酶标板中，放置37℃培养箱过夜。将HuR968B CAR-T细胞按照E∶T为2∶1(50μL)添加至相应孔内，同时加入梯度浓度稀释的WT或PG突变的H1-214D8、H2-214D8抗体(终浓度0.4、2、10μg/ml)。37℃培养24小时后，采用CytoToxNon-Radioactive Cytotoxicity Assay(LDH)kit(Promega)检测HuR968B CAR-T细胞对靶细胞(MCF10A-HER2、MCF10A-p95HER2-CTF611)的杀伤，使用如下公式计算杀伤效率％。
图8B显示了LDH法检测杀伤实验的结果。只有在加入PG抗体的情况下，HuR968BCAR-T细胞才对稳定表达HER2或p95HER2肿瘤细胞产生杀伤效应，并且杀伤效果呈现PG抗体浓度依赖性。H2-214D8仅可介导HuR968B CAR-T细胞针对MCF10A-p95HER2细胞的杀伤。加入WT的抗体不能诱导CAR-T细胞对靶细胞产生杀伤效应。
5.3.细胞因子检测：
具体实验步骤同实施例4.3，除了使用的靶细胞为MCF-10A-HER2、MCF-10A-p95HER2-CTF611靶细胞之外。
图8C显示了细胞因子检测结果。在PG突变的H1-214D8抗体存在情况下，HuR968BCAR-T细胞与MCF-10A-HER2细胞共培养可浓度依赖性释放IL-2、IFN-γ、TNF-α效应细胞因子。在PG突变的H1-214D8、H2-214D8抗体存在情况下，HuR968B CAR-T细胞与MCF10A-p95HER2细胞共培养可浓度依赖性释放IL-2、IFN-γ、TNF-α效应细胞因子。
以上描述了本发明的示例性实施方案，本领域技术人员应当理解的是，这些公开内容仅是示例性的，在本发明的范围内可以进行各种其它替换、适应和修改。因此，本发明不限于文中列举的具体实施方案。
示例性序列
Claims (13)
1.药物组合，其包含
组分(i)，其选自表达分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞(例如，T细胞)、编码所述CAR多肽的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、和它们的任意组合；和
组分(ii)，其是包含P329G突变的特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的抗体或抗原结合片段(也称为P329G突变抗体)，例如，所述P329G突变抗体包含突变Fc结构域，其中根据EU编号的P329位置处的氨基酸突变为甘氨酸(G)，与未突变的亲本抗体Fc结构域的Fcγ受体结合相比，突变Fc结构域的Fcγ受体结合降低；以及
任选地可药用辅料；
其中，所述分子开关调控型CAR多肽包含
(1)人源化抗P329G突变scFv序列，其中所述scFv序列包含能够特异性结合包含P329G突变的抗体Fc结构域，但不能特异性结合未突变的亲本抗体Fc结构域的如下序列：
(i)重链可变区，其包含根据Kabat编号的
(a)氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO：31)所示的重链互补决定区CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
(b)氨基酸序列EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO：32)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和
(c)氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO：33)所示的CDRH3、或所述CDRH3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和
(ii)轻链可变区，其包含根据Kabat编号的
(d)氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO：34)所示的轻链互补决定区(CDR L)1、或所述CDRL1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
(e)氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO：35)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和
(f)氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO：36)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代；
(2)铰链区/间隔区，其选自
(i)(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n肽接头，其中“n”是1至10的整数，例如1至4的整数；例如SEQID NO：23所示的序列；
(ii)CD8α铰链区或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO：24所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
(3)跨膜区(TM)，其选自CD8跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQID NO：25所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
(4)共刺激信号结构域(CSD)，其选自4-1BB共刺激结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO：26所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
(5)刺激信号结构域(SSD)，为CD3ζ信号传导结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO：27所示的序列或其具有1-10个、1-5个氨基酸修饰的变体；
优选地，所述CAR多肽包含
(1)人源化抗P329G突变scFv序列，其中所述scFv序列包含能够特异性结合包含P329G突变的抗体Fc结构域，但不能特异性结合未突变的亲本抗体Fc结构域的如下序列：
(i)重链可变区，其包含根据Kabat编号的
(a)氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO：31)所示的CDR H1；
(b)氨基酸序列EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO：32)所示的CDR H2；和
(c)氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO：33)所示的CDR H3；和
(ii)轻链可变区，其包含根据Kabat编号的
(d)氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO：34)所示的CDR L1；
(e)氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO：35)所示的CDRL2；和
(f)氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO：36)所示的CDR L3；
例如，(i)重链可变区，其包含SEQ ID NO：29的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，和
(ii)轻链可变区，其包含SEQ ID NO：30的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
例如，(i)重链可变区，其包含SEQ ID NO：29的序列，和(ii)轻链可变区，其包含SEQ IDNO：30的序列；
(2)铰链区/间隔区，其选自
(i)(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n肽接头，其中“n”是1至4的整数，例如SEQ ID NO：23所示的序列；
(ii)SEQ ID NO：24所示的CD8α铰链区序列或其具有1个氨基酸修饰的变体；
(3)跨膜区(TM)，其选自SEQ ID NO：25所示的CD8跨膜结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；
(4)共刺激信号结构域(CSD)，其选自SEQ ID NO：26所示的4-1BB共刺激结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；
(5)刺激信号结构域(SSD)，其选自SEQ ID NO：27所示的CD3ζ信号传导结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；
其中所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。
2.根据权利要求1所述的药物组合，其中所述包含P329G突变的特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列GFTFSTYGMA(SEQ ID NO：14)所示的CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；氨基酸序列TINSNGGKTYHPDSVKG(SEQ ID NO：15)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和氨基酸序列EGFDY(SEQ ID NO：16)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KASQNVGTAVA(SEQ ID NO：11)所示的CDR L1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；氨基酸序列SASNRYT(SEQ ID NO：12)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和氨基酸序列QQYSTYPLT(SEQ ID NO：13)所示的CDR L3、或所述CDRL3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代；
例如，其中：
所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列GFTFSTYGMA(SEQ ID NO：14)所示的CDR H1；氨基酸序列TINSNGGKTYHPDSVKG(SEQ ID NO：15)所示的CDR H2；和氨基酸序列EGFDY(SEQ ID NO：16)所示的CDR H3；所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KASQNVGTAVA(SEQ ID NO：11)所示的CDR L1；氨基酸序列SASNRYT(SEQ ID NO：12)所示的CDR L2；和氨基酸序列QQYSTYPLT(SEQ ID NO：13)所示的CDR L3；
例如，其中：
(a)重链可变区包含SEQ ID NO：8的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO：9的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
(b)重链可变区包含SEQ ID NO：10的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO：9的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
例如，其中：
(a)重链可变区包含SEQ ID NO：8的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO：9的序列；
(b)重链可变区包含SEQ ID NO：10的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO：9的序列；
例如，所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体；优选地，其是IgG1或IgG4抗体；更优选地，其是IgG1抗体；
例如，所述抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链Fv、单链Fab、双体抗体(diabody)。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合，其中所述突变Fc结构域是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的突变Fc结构域，优选地，所述突变Fc结构域是IgG1或IgG4抗体的突变Fc结构域；更优选地，所述突变Fc结构域是IgG1抗体的突变Fc结构域；
例如，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：39所示的重链恒定区序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列且其中根据EU编号的P329位置处的氨基酸突变为G；
例如，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：39所示的重链恒定区序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列且其中根据EU编号的P329位置处的氨基酸突变为G；和SEQ ID NO：40所示的轻链恒定区序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
例如，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：39所示的重链恒定区序列和SEQ IDNO：40所示的轻链恒定区序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的药物组合，其中所述分子开关调控型CAR多肽还包含位于N端的信号肽序列，例如，SEQ ID NO：28所示的信号肽序列，
优选地，所述分子开关调控型CAR多肽具有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的药物组合，其中编码CAR多肽的核酸分子是编码权利要求1-4中任一项所述药物组合中所述的CAR多肽的核酸分子，例如，是编码SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的核酸分子。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的药物组合，其中所述载体是包含编码权利要求1-4中任一所述药物组合中所述的CAR多肽的核酸分子的载体，例如，所述载体选自DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的药物组合，其中所述免疫效应细胞是自自体T细胞或同种异体T细胞制备的表达权利要求1-4中任一项所述的药物组合中的分子开关调控型CAR多肽的T细胞，例如，所述免疫效应细胞是自人PBMC分离的T细胞制备的表达权利要求1-4中任一项所述的药物组合中的分子开关调控型CAR多肽的T细胞。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的药物组合的用途，用于在受试者中治疗肿瘤，例如，p95HER2阳性的肿瘤，或者p95HER2阳性和HER2阳性的肿瘤，包括向受试者施用治疗有效量的权利要求1-7中任一项所述的药物组合，优选地，所述肿瘤例如是乳腺癌。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的药物组合在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途，所述肿瘤是例如p95HER2阳性的肿瘤，或者p95HER2阳性和HER2阳性的肿瘤，例如乳腺癌。
10.用于治疗肿瘤的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的权利要求1-7中任一项所述的药物组合，所述肿瘤是例如p95HER2阳性的肿瘤，或者p95HER2阳性和HER2阳性的肿瘤，例如乳腺癌。
11.成套药盒，其包含权利要求1-7中任一项所述的药物组合，优选地所述药盒为药物剂量单元形式。
12.一种药物复合物，其是一种由
(i)表达权利要求1-4中任一项所述药物组合中所述的分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞(例如，T细胞)；和
(ii)包含P329G突变的特异性结合p95HER2的或特异性结合HER2和p95HER2的抗体或抗原结合片段(也称为P329G突变抗体)，例如，所述P329G突变抗体包含突变Fc结构域，其中根据EU编号的P329位置处的氨基酸突变为甘氨酸(G)，与未突变的亲本抗体Fc结构域的Fcγ受体结合相比，突变Fc结构域的Fcγ受体结合降低；结合而产生的复合物，
其中，所述免疫效应细胞通过CAR多肽的胞外结构域中的人源化抗P329G突变scFv序列与所述P329G突变抗体的Fc结构域结合而产生所述复合物；
例如，其中所述免疫效应细胞是自自体T细胞或同种异体T细胞制备的表达权利要求1-4中任一项所述药物组合中所述的分子开关调控型CAR多肽的T细胞，例如，所述免疫效应细胞是自人PBMC分离的T细胞制备的表达权利要求1-4中任一项所述药物组合中所述的分子开关调控型CAR多肽的T细胞；
例如，其中P329G突变抗体是H1-214D8 PG Ab和/或H2-214D8 PG Ab。
13.根据权利要求12所述的药物复合物的用途，用于在受试者中治疗肿瘤，优选地，所述肿瘤是例如p95HER2阳性的肿瘤，或者p95HER2阳性和HER2阳性的肿瘤，例如乳腺癌。
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