CN110637031B - 程序性死亡蛋白1(pd-1)的重组抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了单克隆抗体，特别是兔重组抗体，其特异性结合人PD‑1且具有生物学功能和超高亲和性，以及提供了使用方法。在各种实施方案中，抗体是与人PD‑1结合的完全人源化抗体。还提供了编码抗体的核酸分子和表达抗体的方法。在一些实施方案中，抗体用于抑制或中和PD‑1活性，从而提供治疗、预防和/或诊断疾病或病症如癌症或病毒感染的方法。

Description

程序性死亡蛋白1(PD-1)的重组抗体及其用途
技术领域
本发明涉及与程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)结合的抗体，特别是使用这些抗体的治疗和诊断方法。本发明属于生物技术领域。
背景技术
通常，存在为免疫病症(例如自身免疫疾病、炎性病症、过敏症、移植排斥、癌症、免疫缺陷和其他免疫系统相关病症)提供安全有效的治疗方法的需要。可以通过操纵PD-1途径来完成对这些病症所涉及的免疫应答的调节。
适应性免疫应答涉及称为T细胞和B细胞的两类主要淋巴细胞的活化、选择和克隆增殖。在遇到抗原后，T细胞增殖并分化成抗原特异性效应细胞，而B细胞增殖并分化成抗体分泌细胞。
T细胞活化是一个多步骤过程，需要在T细胞和抗原呈递细胞(APC)之间发生几次信号传导事件。为了发生T细胞活化，必须将两种类型的信号递送至静息T细胞。第一种类型由抗原特异性T细胞受体(TcR)介导，并赋予免疫应答特异性。第二种(共刺激)类型型调节应答的程度，并通过T细胞上的辅助受体递送。
主要的共刺激信号通过CD28受体的配体B7-1或B7-2接合后活化CD28受体来递送。相反，通过相同的B7-1或B7-2配体接合抑制性CTLA-4受体导致T细胞应答减弱。因此，CTLA-4信号拮抗由CD28介导的共刺激。在高抗原浓度下，CD28共刺激优先于CTLA-4抑制作用。CD28和CTLA-4表达的时间调节维持活化和抑制信号之间的平衡，并确保发展出有效的免疫应答，同时防止自身免疫的发展。
最近鉴定了CD28和CTLA-4及其B-7样配体的分子同源物。ICOS是一种CD28样共刺激受体。PD-1(程序性死亡蛋白1或CD279)是抑制性受体和CTLA-4的对应物。本公开涉及PD-1受体介导的免疫应答的调节。
PD-1是50-55kDa的I型跨膜受体，其最初在经历活化诱导的细胞凋亡的T细胞系中被鉴定。PD-1在活化的T细胞、B细胞和巨噬细胞上表达。PD-1的配体是B7家族成员PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)。
PD-1是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员，其在其细胞外区域含有单个IgV样结构域。PD-1细胞质结构域含有两个酪氨酸，其中最接近膜的酪氨酸位于ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序)内。在PD-1上存在ITIM表明该分子通过募集细胞质磷酸酶而起到减弱抗原受体信号传导的作用。人和鼠PD-1蛋白具有约60％的氨基酸相同性，保留有四个潜在的N-糖基化位点，以及定义Ig-V结构域的残基。
实验数据表明PD-1与其配体在中枢和外周免疫应答下调中的相互作用。特别是，在PD-L1的存在下，野生型T细胞而不是PD-1缺陷型T细胞的增殖受到抑制。另外，PD-1缺陷小鼠表现出自身免疫表型。PD-1缺陷的C57BL/6小鼠导致慢性进行性狼疮样肾小球肾炎和关节炎。在Balb/c小鼠中，由于存在心脏组织特异性自反应抗体，PD-1缺陷导致严重的心肌病。
由于PD-1在自身免疫、肿瘤免疫和传染性免疫中起重要作用，因此它是免疫治疗的理想靶点。已经在癌症和慢性病毒感染的治疗中研究了用拮抗剂(包括单克隆抗体)阻断PD-1(Sheridan 2012,Nature Biotechnology 30:729-730)。
PD-1的单克隆抗体是本领域已知的，并且已描述于例如美国专利/公开号US8008449、US8779105、US9084776、US9358289、US9387247、US20090217401、US20130133091、US20140212422、US20140294852、US20140328833、US20140348743、US20150165025，和WO专利/公开号WO2006121168、WO20091154335、WO2012145493、WO2013014668、WO2009101611、EP2262837和EP2504028。
发明内容
本发明涉及抗PD-1抗体及其使用方法。
本公开提供了可以充当PD-1的激动剂和/或拮抗剂的抗体，从而调节由PD-1调节的免疫应答。本公开还提供了包含新型抗原结合片段的抗PD-1抗体。本发明的抗PD-1抗体能够：
(A)特异性结合PD-1，包括人PD-1；
(B)竞争PD-1与Nivolumab的结合；
(C)阻断PD-1与其(一或多个)天然配体的相互作用；或
(D)执行两种功能。
在特定的实施方案中，衍生自兔并由兔定义且进一步被人源化的四种抗体包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)及它们的互补决定区(CDR)，如下表所示：
具体实施方式
通常，本发明提供结合PD-1的兔抗体及其抗原结合片段，特别在于其中它们是重组抗体以及也是人源化抗体。
在一方面，本发明提供特异性结合人PD-1的兔抗体和抗原结合片段，并且包含选自SEQ ID NO：1-3(H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3)的重链可变区(H-CVR)，和/或选自SEQ ID NO：13-15(L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3)的轻链可变区(L-CVR)。
另一方面，本发明提供特异性结合人PD-1的兔抗体和抗原结合片段，并且包含选自SEQ ID NO：4-6(H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3)的重链可变区(H-CVR)，和/或选自SEQ ID NO：16-18(L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3)的轻链可变区(L-CVR)。
另一方面，本发明提供特异性结合人PD-1的兔抗体和抗原结合片段，并且包含选自SEQ ID NO：7-9(H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3)的重链可变区(H-CVR)，和/或选自SEQ ID NO：19-21(L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3)的轻链可变区(L-CVR)。
另一方面，本发明提供特异性结合人PD-1的兔抗体和抗原结合片段，并且包含选自SEQ ID NO：11-12(H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3)的重链可变区(H-CVR)，和/或选自SEQ IDNO：22-24(L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3)的轻链可变区(L-CVR)。
优选地，本发明的兔抗PD-1抗体选自Abs-r-923、Abs-r-924、Abs-r-925和Abs-r-926。
在优选的实施方案中，本发明提供了抗-PD-1抗体或抗原结合片段，其被要求保护为兔抗体或片段。
在另外的优选的实施方案中，本发明提供兔抗体或片段，其包含进一步含有兔IgG或其具有重链FR区的变体的重链可变区(H-CVR)。
在另外的优选的实施方案中，本发明提供兔抗体或片段，其进一步含有兔IgG或其具有重链恒定区的变体。
在优选的实施方案中，本发明提供兔抗体或片段，其包含进一步含有兔κ链或其具有轻链FR区的变体的轻链可变区(L-CVR)。
在另外的优选的实施方案中，本发明提供兔抗体或片段，其进一步含有兔IgG或其具有轻链恒定区的变体。
在优选的实施方案中，本发明提供了抗PD-1抗体或抗原结合片段，其包含嵌合抗体或片段。
在另外的优选的实施方案中，本发明提供嵌合抗体或片段，并且包含来自SEQ IDNO：50、54、58和62的重链可变区(H-CVR)。
在另外的优选的实施方案中，本发明提供嵌合抗体或片段，并且包含来自SEQ IDNO：52、56、60和64的轻链可变区(L-CVR)。
在一方面，本发明提供了特异性结合人PD-1的人源化抗体或抗原结合片段，并且包含选自SEQ ID NO：25、26和27(H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3)的重链可变区(H-CVR)和/或它们的变体，和/或选自SEQ ID NO：37、38和39(L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3)的轻链可变区(L-CVR)或它们的变体。
另一方面，本发明提供了特异性结合人PD-1的人源化抗体或抗原结合片段，并且包含选自SEQ ID NO：28、29和30(H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3)的重链可变区(H-CVR)和/或它们的变体，和/或选自SEQ ID NO：40、41和42(L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3)的轻链可变区(L-CVR)。
另一方面，本发明提供了特异性结合人PD-1的人源化抗体或抗原结合片段，并且包含选自SEQ ID NO：31、32和33(H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3)的重链可变区(H-CVR)和/或它们的变体，和/或选自SEQ ID NO：43、44和45(L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3)的轻链可变区(L-CVR)。
另一方面，本发明提供了特异性结合人PD-1的人源化抗体或抗原结合片段，并且包含选自SEQ ID NO：34、35和36(H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3)的重链可变区(H-CVR)和/或它们的变体，和/或选自SEQ ID NO：46、47和48(L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3)的轻链可变区(L-CVR)。
优选地，本发明的人源化抗PD-1抗体选自Abs-h-923、Abs-h-924、Abs-h-925和Abs-h-926。
在优选的实施方案中，本发明提供了抗-PD-1抗体或抗原结合片段，其被要求保护为人源化抗体或片段。
在另外的优选的实施方案中，本发明提供了人源化抗体或片段，其包含进一步含有人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和/或重链FR区变体的重链可变区(H-CVR)。
在另外的优选的实施方案中，本发明提供了进一步含有人源化抗体和/或重链恒定区的抗体或片段。
在优选的实施方案中，本发明提供了人源化抗体或片段，其包含进一步含有人κ、λ链或轻链FR区变体的轻链可变区(L-CVR)。
在另外的优选的实施方案中，本发明提供了人源化抗体或片段，其进一步含有人IgG和/或轻链恒定区变体。
在优选的实施方案中，本发明提供抗PD-1抗体或抗原结合片段，其包含嵌合抗体或片段，还包含人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和/或重链恒定变体，优选人IgG1或IgG4。
在另外的优选的实施方案中，本发明提供嵌合抗体或片段，并且包含来自SEQ IDNO：66、70、74和78的重链可变区(H-CVR)。
在另外的优选的实施方案中，本发明提供嵌合抗体或片段，并且包含来自SEQ IDNO：68、72、76和80的轻链可变区(L-CVR)。
在一些实施方案中，本发明提供抗-PD-1抗体或片段，其由Fab、Fv、单链可变片段(scFv)、F(ab')2和双抗体组成。
另一方面，本发明提供了分离的核酸，即编码本文所述任何抗体的DNA分子。
另一方面，本发明提供分离的多核苷酸组合物，其包含：本发明的编码器、抗体轻链或其功能片段的抗PD-1多核苷酸和抗体重链或其功能片段的抗PD-1多核苷酸。
另一方面，本发明的抗体或抗原结合部分可以衍生化或连接至另一种功能分子，例如另一种肽或蛋白质(例如，另一种抗体或配体受体)，以产生至少两种不同的双特异性结合位点或靶分子。事实上，本发明的抗体可以衍生化或连接至多于一种的其他功能分子上，以产生多于两种不同的结合位点和/或靶分子结合多特异性分子；这些多特异性分子也旨在如本文所用。
另一方面，本发明提供了包含编码本发明的核酸的表达载体。
另一方面，本发明提供了转染的表达载体的宿主细胞。
在本发明的另一个实施方案中，提供了包含宿主细胞的实施方案。在某些情况下，宿主细胞选自哺乳动物细胞，更具体地，哺乳动物细胞选自中国仓鼠卵巢细胞。
在一些具体实施方案中，根据本发明的抗PD-1抗体或其功能片段阻断相互作用和/或与PD-1和PD-L2相互作用以及与PD-1和PD-L1相互作用。
另一方面，本发明提供了根据本发明的抗PD-1抗体或功能片段在制备用于增强T细胞免疫应答的药物中的用途。在一些实施方案中，增强的免疫应答包括T细胞细胞因子的增强，优选地，细胞因子包括IL-2。
另一方面，本发明提供了根据本发明的抗PD-1抗体或功能片段用于与Nivolumab抗体竞争性结合人PD-1的用途。在特定实施方案中，竞争性结合包括阻断抗体与PD-1的结合，优选地，所述抗体包含Nivolumab。
另一方面，本发明提供了根据本发明的抗PD-1抗体或功能片段用于治疗或预防癌症或感染性疾病的药物的用途。
本发明进一步提供治疗和预防PD-1介导的疾病或病症的方法，或包含其的药物组合物；优选地，其中所述疾病是癌症，最优选乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肾癌和黑素瘤。
实施例
提供以下实施例以进一步解释和说明一些目前优选的实施方案，并且不旨在以任何方式限定本发明的范围或内容。
实施例-1：兔抗PD-1抗体的产生
A.用PD-1免疫兔子
将4只4月龄的雌兔用于免疫。用与完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich,Cat#263810)充分混合的50μg自制的重组人PD-1，对每只兔子进行皮下初免。两到三个星期后，用与不完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich,Cat#263910)仪器的25μg可溶性PD-1加强。通过取自兔耳静脉血的检查抗血清监测免疫应答。然后通过ELISA筛选来自免疫动物的抗血清的连续稀释液与包被的人PD-1的结合。将用于免疫的稀释至1μg/ml的PBS中的相同纯化蛋白质在微量滴定板(Nunc MAXISORP)上包被过夜，100μl/孔，在4℃孵育过夜，然后以200μl/孔用含有5％胎牛血清、0.05％吐温20的PBS溶液封闭。将连续稀释的免疫血清加入各孔中，并在室温孵育1小时。用PBS/吐温20溶液洗涤板，将辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG抗体(JacksonImmunoresearch Labs,Cat#:111-135-046)在室温孵育1小时。在用洗涤缓冲剂洗涤板后，加入TMB底物100μl/孔，然后(Pierce,Cat#34021)着色，停止孵育并测量450nm处的OD值。
B.筛选与人PD-1结合的兔抗PD-1抗体
根据滴度比较，选择具有抗PD-1高滴度免疫球蛋白的兔子来分离兔PD-1特异性B细胞。使用浓度为20ng/mL的LPS(Invivogen)，检查未刺激的或刺激的抗原特异性B细胞。然后将未刺激的或刺激的细胞载入预包被并封闭的板中，如下所述。用含有5％胎牛血清和0.05％吐温20的PBS溶液封闭用抗兔IgG抗体(Jackson Immunoresearch,Cat#111-005-008)包被的384孔板，然后用于捕获含有B细胞的分泌输出的抗原特异性B细胞。然后测定每个孔中B细胞分泌的抗体对人PD-1或无关抗原的应答性，并测定IgG应答性。主要地，以下三种组合方法进一步应用于有效筛选具有阻断功能和高结合亲和性的兔抗PD-1抗体。
(i)通过荧光法微容量测定技术(FMAT)筛选功能性抗PD-1抗体
来自培养上清液的重组抗体也用于基于细胞的结合研究。用编码兔抗PD-1抗体的Ig重链和轻链的表达质粒转染HEK293细胞。3-5天后，收获转染细胞上清液中的重组抗体。表达人PD-1的稳定的HEK293细胞或原代细胞用于基于细胞的结合确认研究。使用荧光标记的抗兔IgG抗体(Jackson Immunoresearch,Cat#111-095-046)评估来自培养上清液的抗体与细胞表面PD-1的结合。荧光显微镜研究显示许多得自转染上清液的抗PD-1抗体从与HEK293细胞表面上表达的PD-1结合。在该筛选试验中，使用自制的抗PD-1抗体和同种型对照兔IgG作为对照。图1A表示抑制PD-1功能的检测来自免疫兔的PD-1抗体的多个384孔板之一。显示无抑制的抗体显示为高于图表平面的信号。抑制PD-1功能的抗体与图表平面保持“平坦”并且代表FMAT筛选中的大多数。图1B进一步总结了各种兔抗PD-1抗体与HEK293细胞表面上表达的PD-1结合的测试结果。选择具有所需抑制功能和结合亲和性的四种抗体，并通过下面的其他测定确认。
(ii)通过酶联免疫吸附测定(ELISA)筛选结合的抗PD-1抗体
为了开始ELISA，将384孔板用人PD-1包被，用测定稀释缓冲剂封闭，并洗涤，然后与来自培养的PD-1特异性B细胞上清液的连续稀释一起孵育。将样品孵育1小时，然后洗涤ELISA板。然后加入在相同测定稀释缓冲剂中用HRP缀合的检测山羊抗兔抗体，洗涤测定板，并将底物溶液加入测定板中的孔中。在酶反应停止后，在常规读板器中测量450nm处的比色密度。通过ELISA筛选出超过数百个PD-1阳性克隆。此外，定义并选择四种具有特异性和强结合活性的兔抗PD-1抗体(命名为Abs-r-923、Abs-r-924、Abs-r-925和Abs-r-926)用于表征(参见图1C)。结合数据显示它们不与包被的其他不相关蛋白质反应，但也与小鼠PD-1没有交叉反应性。
(iii)PD-1与PD-L1的相互作用被选择的抗PD-1抗体阻断(参见下面的实施例3)。
C.分离与人PD-1结合的PD-1抗体
通过上述筛选鉴定的产抗体细胞用于分离编码抗体重链和轻链的基因序列。使用RT-PCR得到编码识别人PD-1的特异性抗体的基因。将得到的细胞置于逆转录缓冲剂中，将来自每个单个细胞的mRNA逆转录成cDNA。在通过标准巢式聚合酶链式反应(PCR)产生这些扩增子后，对这些扩增子进行直接测序。然后对这些DNA序列进行生物信息学过滤以获得序列质量，并组织成用于分支学分析的序列数据库，以鉴定分离出识别PD-1的独特抗体进化枝的数量。根据制造商的方案，将扩增和选择的序列克隆到HEK293表达系统中以产生PD-1抗体。将包含一对重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的完整抗体可变区使用标准分子生物学技术重新安排为具有用于在哺乳动物细胞系(例如的HEK293)中瞬时表达的适当元件的质粒。例如，将可变重链cDNA序列(SEQ ID NO：54)和可变轻链cDNA序列(SEQ ID NO：56)亚克隆到载体骨架中。来自瞬时转染的哺乳动物细胞系的上清液用于测试抗体表达、特异性和亲和性。将各种VH和VL配对以产生超过数百个克隆，其中选择10个(a至j个克隆)并在HEK293细胞中表达并测定PD-1功能性抑制测定(参见图1C)。这些分析鉴定了识别人PD-1的独特序列分支。将选择的序列亚克隆到PCR2.1(LifeTech)中以进一步增殖。
各个重链和轻链可变区的序列示于图3A、4A、5A和6A(HCVR)和图3B、4B、5B和6B(LCVR)。还指示了互补决定区(CDR)和框架区(FR)。表1、2、5、6、9、10、13和14列出每个H-CDR或L-CDR的克隆名称和相应的序列标识符ABS-r-923、ABS-r-924、ABS-r-925和Abs-r-926。它们也在PD-1抗体序列表中描述。
图1D还显示了基于ELISA的结合测定的实例。结果表明两次实验的平均值。根据PD-1抗体阻断PD-L1结合的能力，选择Abs-r-923、Abs-r-924、Abs-r-925和Abs-r-926克隆作为进一步开发人源化抗体的候选物(也参见下面的实施例2)。
实施例-2：兔抗PD-1抗体的人源化
进行选择的兔抗PD-1抗体的人源化以降低兔基抗体的表观免疫原性。使用本领域熟知的抗体工程信息，和常规生物信息学工具，分析本发明的某些兔抗PD-1抗体的氨基酸序列，并与已知的人抗体序列进行比较。基于这些分析和比较，选择某些人序列用于常规的兔CDR移植，并包括合适的回复突变。在与人PD-1结合的测试中，根据标准例如功能、亲和性、亲合力、结合动力学和生物化学行为(例如聚集)以及表达水平评估这些人源化抗体。
A.人源化重链可变区序列
与已知的人种系免疫球蛋白重链序列进行比较，选择低免疫原性人种系框架序列以完成四种兔PD-1抗体Abs-r-923、Abs-r-924、Abs-r-925和Abs-r-926的人源化。四种兔重组单克隆抗体的DNA和氨基酸序列示于图3A、4A、5A和6A，和SEQ ID NO：49、50、53、54、57、58、61和62，并且其他H-CDR示于下表1、5、9和13。在PD-1抗体序列表中也可见这些序列。
人源化Abs-r-923、Abs-r-924、Abs-r-925和Abs-r-926的重链可变区的DNA和氨基酸序列示于SEQ ID NO：65、66、69、70、73、74、77和78，并且其他H-CDR序列示于表3、7、11和15。在PD-1抗体序列表中也可见这些序列。
B.人源化轻链可变区序列
与已知的人种系免疫球蛋白轻链序列进行比较，选择低免疫原性人种系框架序列以完成四种兔PD-1抗体Abs-r-923、Abs-r-924、Abs-r-925和Abs-r-926的人源化。四种兔重组单克隆抗体的DNA和氨基酸序列示于图3B、4B、5B和6B，和SEQ ID NO：51、52、55、56、59、60、63和64，并且其他L-CDR示于表2、6、10和14。在PD-1抗体序列表中也可见这些序列。
人源化Abs-r-923、Abs-r-924、Abs-r-925和Abs-r-926的轻链可变区的DNA和氨基酸序列示于SEQ ID NO：67、68、71、72、75、76、79和80，并且其他L-CDR示于表4、8、12和16。在PD-1抗体序列表中也可见这些序列。
实施例-3：阻断与PD-L1结合的人源化PD-1抗体
通过阻断本发明的PD-1配体结合的方式，即人源化抗PD-1抗体检测。具体地，将PBS中的100μl未标记的人PD-L1(R&D Systems，Cat#156-B7-100)以1μg/mL的浓度在在96孔微量滴定板上在4℃包被过夜，随后使用含0.5％(w/v)BSA和0.05％(w/v)吐温20的PBS溶液封闭非特异性结合位点。在阻断测定中，将恒定浓度为1.5nM(0.5ug/ml)人PD-1蛋白加入到人源化抗PD抗体或Nivoiumab或同种型对照抗体的连续稀释液中。将具有1.5nM恒定人PD-1的抗体-蛋白质复合体转移至包被有人PD-L1的微量板上。在室温孵育1小时后，洗涤孔，用缀合有辣根过氧化物酶(HRP)的抗人IgG Fc抗体(Abcam，Cat#ab97225)检测平板结合的人PD-1。在用洗涤缓冲剂洗涤板后，加入的TMB底物100μl/孔，然后着色，停止反应并测量450nm处的OD值。如图2所示，人源化抗PD-1抗体Abs-h-923、Abs-h-924、Abs-h-925和Abs-h-926仍然保持其功能并且特异性地阻断PD-1与其配体PD-L1的结合，并且显著优于Nivoiumab的阻断作用。因此，本发明的抗体对PD-1与PD-L1结合的阻断效果惊人地高。
实施例-4：构建和表达完全人源化的PD-1抗体
人IgG4重链恒定区片段IgG4 Fc序列和κ轻链恒定区片段序列分别由IDT公司(Integrated DNA Technologies,Coralville,Iowa)合成，然后置入pcDNA3载体骨架变成本发明的pBA-H4和pBA-Cκ，pBA-H4(含有人IgG4重链恒定区IgG4Fc)和pBA-Cκ(含有人κ轻链恒定区片段)载体由Bioabs公司制造，在pBA-H4的VH和CH中使用CMV启动子，嘌呤霉素抗性基因使用PGK启动子，在pBA-Cκ的VL中使用CMV启动子，新霉素抗性基因使用SV40启动子。根据编码重链和轻链的抗体重链可变区序列和轻链可变区的蛋白质序列，设计链可变区DNA序列，并根据在CHO细胞中表达优化，并进一步优化编码重链和轻链可变区的DNA序列，其中本发明编码的人源化抗PD-1抗体重链可变区DNA序列如SEQ ID NO：65(Abs-h-923)、69(Abs-h-924)、73(Abs-h-925)和77(Abs-h-926)所示，本发明编码的人源化抗PD-1抗体轻链可变区DNA序列如SEQ ID NO：67(Abs-h-923)、71(Abs-h-924)、75(Abs-h-925)和79(Abs-h-926)所示。所有测试的PD-1抗体通过含有合适树脂的蛋白A柱(来自GE Healthcare的MabSelectTM)纯化。
实施例-5：人源化PD-1抗体的特异性和亲和性
使用BiacoreTM技术通过表面等离子共振(SPR)测定抗PD-1抗体Abs-h-923、Abs-h-924、Abs-h-925和Abs-h-926的结合亲和性。该技术允许无标记地确定配体与受体的结合微观速率常数(ka)和解离微观速率常数(kd)。因此，它特别适用于表征抗体-抗原相互作用。抗体与BiacoreTM芯片表面的间接结合通过固定缓冲剂(10mM乙酸钠pH5.0)中的25pg/ml的抗人IgG抗体(GE Healthcare Bio-Sciences AB；Cat#BR-1008-39)进行。用测定缓冲剂稀释抗PD-1抗体，以2倍增加，浓度从0.14至7.68nM，以测量Abs-h-923、Abs-h-924、Abs-h-925和Abs-h-926的亲和性。用BiacoreTM T2000评估动力学痕迹。随着浓度的增加，这些痕迹的全部集合在一起并被称为运行。在每个分析物浓度系列中包括两个零浓度样品(空白运行)，以允许在数据评估期间进行双重参照。计算结合(ka)和解离(kd)的动力学速率常数以及解离平衡常数(KD)。Abs-h-923、Abs-h-924、Abs-h-925和Abs-h-926的亲和性数据示于表17中。
实施例-6：人源化PD-1抗体与Nivolumab的竞争性结合
使用基于ELISA的测定，对人源化抗体Abs-h-923、Abs-h-924、Abs-h-925和Abs-h-926与Nivolumab进行竞争性结合分析。该测定基本上如下进行。将不同浓度的PD-1抗体Abs-h-923、Abs-h-924、Abs-h-925和Abs-h-926与恒定浓度50ng/ml的Nivolumab或同种型抗体(阴性对照)在37℃预孵育1小时。将混合物以100ng/孔的浓度加入到包被人PD-1的96孔板中，并进一步孵育另外1小时，然后洗涤。加入HRP缀合的抗人抗体并孵育。在用洗涤缓冲剂洗涤板后，加入TMB底物100μl/孔，然后(Pierce,Cat#34021)着色，停止反应并测量450nm处的OD值。
所有人源化抗体竞争性地抑制Nivolumab与PD-1的结合。然而，抗体Abs-h-923与PD-1的结合竞争表现弱。与其他三种抗体相比，抗体Abs-h-926具有最高的竞争活性。相反，同种型抗体根本没有竞争性地抑制Nivolumab与PD-1的结合。代表性的结果如图7所示。
通过测定Abs-h-923、Abs-h-924、Abs-h-925和Abs-h-926的浓度来估计Abs-h-923、Abs-h-924、Abs-h-925和Abs-h-926的EC50，其从Abs-h-923、Abs-h-924、Abs-h-925和Abs-h-926显示饱和行为的点开始表现大约一半的最大吸光度(见表18)。
实施例-7：人源化PD-1抗体在MLR测定中诱导IL-2细胞因子分泌
在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中，应答于四种抗体Abs-h-923、Abs-h-924、Abs-h-925和Abs-h-926，观察到IL-2细胞因子的分泌增加。一个商业阶段的抗PD-1抗体Nivolumab用作该实验的基准。使用市售的单核细胞衍生的树突细胞作为刺激细胞以及来自不同健康献血者的纯化的CD4+T淋巴细胞作为应答细胞来进行MLR测定。在开始测定后2.5天收集上清液。根据供应商的说明，使用微球(Luminex)在捕获夹心免疫测定中测量细胞因子分泌。
图8总结了对用抗PD-1抗体处理的人PBMC进行的MLR测定的结果。数据表明，与抗体Nivolumab或IgG4同种型对照(Biolegend)相比，用人源化PD-1抗体Abs-h-924、Abs-h-925和Abs-h-926处理导致细胞因子IL-2的分泌显著增加。有意义的是，抗体Abs-h-923显示出比其他三种抗体Abs-h-924、Abs-h-925和Abs-h-926更弱的诱导的IL-2应答。这些数据表明，本发明的一些抗PD-1抗体，例如Abs-h-926，以类似于Nivolumab的方式诱导IL-2细胞因子释放增加，而一种抗体Abs-h-923引发与Nivolumab引发的应答明显不同的生理应答。
表1兔抗PD-1抗体Abs-r-923的H-CDR和完整重链可变序列
No 重链结构域&完整重链 序列&注释 序列编号
I H-CDR1 GFTLSSYA SEQ ID NO：1
II H-CDR2 SNAGNGNT SEQ ID NO：2
III H-CDR3 YWYFDL SEQ ID NO：3
VI DNA 参见序列表和图3A SEQ ID NO：49
V 蛋白质 同上 SEQ ID NO：50
表2兔抗PD-1抗体Abs-r-923的L-CDR和完整轻链可变序列
No 轻链结构域&完整轻链 序列&注释 序列编号
I L-CDR1 QSGSSF SEQ ID NO：13
II L-CDR2 ANNKRE SEQ ID NO：14
III L-CDR3 GTYTDSPPT SEQ ID NO：15
VI DNA 参见序列表和图3B SEQ ID NO：51
V 蛋白质 同上 SEQ ID NO：52
表3人源化抗PD-1抗体Abs-h-923的H-CDR和完整重链可变序列
No 重链结构域&完整重链 序列&注释 序列编号
I H-CDR1 GYTFTSYA SEQ ID NO：25
II H-CDR2 SNAGNGNT SEQ ID NO：26
III H-CDR3 YWYFDL SEQ ID NO：27
VI DNA 参见序列表和图3C SEQ ID NO：65
V 蛋白质 同上 SEQ ID NO：66
表4人源化抗PD-1抗体Abs-h-923的L-CDR和完整轻链可变序列
No 轻链结构域&完整轻链 序列&注释 序列编号
I L-CDR1 QSGSSF SEQ ID NO：37
II L-CDR2 ANNKRE SEQ ID NO：38
III L-CDR3 GTYTDSPPT SEQ ID NO：39
VI DNA 参见序列表和图3D SEQ ID NO：67
V 蛋白质 同上 SEQ ID NO：68
表5兔抗PD-1抗体Abs-r-924的H-CDR和完整重链可变序列
No 重链结构域&完整重链 序列&注释 序列编号
I H-CDR1 GFSISSYG SEQ ID NO：4
II H-CDR2 ISYDGSNK SEQ ID NO：5
III H-CDR3 YYYYYGMDV SEQ ID NO：6
VI DNA 参见序列表和图4A SEQ ID NO：53
V 蛋白质 同上 SEQ ID NO：54
表6兔抗PD-1抗体Abs-r-924的L-CDR和完整轻链可变序列
No 轻链结构域&完整轻链 序列&注释 序列编号
I L-CDR1 QSLSSY SEQ ID NO：16
II L-CDR2 DVSNRA SEQ ID NO：17
III L-CDR3 QQRTNWPRA SEQ ID NO：18
VI DNA 参见序列表和图4B SEQ ID NO：55
V 蛋白质 同上 SEQ ID NO：56
表7人源化抗PD-1抗体Abs-h-924的H-CDR和完整重链可变序列
No 重链结构域&完整重链 序列&注释 序列编号
I H-CDR1 GFTFSSYG SEQ ID NO：28
II H-CDR2 ISYDGSNK SEQ ID NO：29
III H-CDR3 YYYYYGMDV SEQ ID NO：30
VI DNA 参见序列表和图4C SEQ ID NO：69
V 蛋白质 同上 SEQ ID NO：70
表8人源化抗PD-1抗体Abs-h-924的L-CDR和完整轻链可变序列
No 轻链结构域&完整轻链 序列&注释 序列编号
I L-CDR1 QSLSSY SEQ ID NO：40
II L-CDR2 DVSNRA SEQ ID NO：41
III L-CDR3 QQRTNWPRA SEQ ID NO：42
VI DNA 参见序列表和图4D SEQ ID NO：71
V 蛋白质 同上 SEQ ID NO：72
表9兔抗PD-1抗体Abs-r-925的H-CDR和完整重链可变序列
No 重链结构域&完整重链 序列&注释 序列编号
I H-CDR1 GFTLSSYA SEQ ID NO：7
II H-CDR2 ISYDGSNK SEQ ID NO：8
III H-CDR3 YYYYYYMDV SEQ ID NO：9
VI DNA 参见序列表和图5A SEQ ID NO：57
V 蛋白质 同上 SEQ ID NO：58
表-10兔抗PD-1抗体Abs-r-925的L-CDR和完整轻链可变序列
No 轻链结构域&完整轻链 序列&注释 序列编号
I L-CDR1 QSVSSY SEQ ID NO：19
II L-CDR2 EASNRA SEQ ID NO：20
III L-CDR3 QQRTNWPPA SEQ ID NO：21
VI DNA 参见序列表和图5B SEQ ID NO：59
V 蛋白质 同上 SEQ ID NO：60
表11人源化抗PD-1抗体Abs-h-925的H-CDR和完整重链可变序列
No 重链结构域&完整重链 序列&注释 序列编号
I H-CDR1 AFTFSSYA SEQ ID NO：31
II H-CDR2 ISYDGSNK SEQ ID NO：32
III H-CDR3 YYYYYYMDV SEQ ID NO：33
VI DNA 参见序列表和图5C SEQ ID NO：73
V 蛋白质 同上 SEQ ID NO：74
表12人源化抗PD-1抗体Abs-h-925的L-CDR和完整轻链可变序列
No 轻链结构域&完整轻链 序列&注释 序列编号
I L-CDR1 QSVSSY SEQ ID NO：43
II L-CDR2 EASNRA SEQ ID NO：44
III L-CDR3 QQRTNWPPA SEQ ID NO：45
VI DNA 参见序列表和图5D SEQ ID NO：75
V 蛋白质 同上 SEQ ID NO：76
表13兔抗PD-1抗体Abs-r-926的H-CDR和完整重链可变序列
No 重链结构域&完整重链 序列&注释 序列编号
I H-CDR1 GISLSSYY SEQ ID NO：10
II H-CDR2 IYYSGSTN SEQ ID NO：11
III H-CDR3 WYFDL SEQ ID NO：12
VI DNA 参见序列表和图6A SEQ ID NO：61
V 蛋白质 同上 SEQ ID NO：62
表14兔抗PD-1抗体Abs-r-926的L-CDR和完整轻链可变序列
No 轻链结构域&完整轻链 序列&注释 序列编号
I L-CDR1 NSVSSS SEQ ID NO：22
II L-CDR2 DTSNRE SEQ ID NO：23
III L-CDR3 QQRDNWPRA SEQ ID NO：24
VI DNA 参见序列表和图6B SEQ ID NO：63
V 蛋白质 同上 SEQ ID NO：64
表15人源化抗PD-1抗体Abs-h-926的H-CDR和完整重链可变序列
No 重链结构域&完整重链 序列&注释 序列编号
I H-CDR1 GGSISSYY SEQ ID NO：34
II H-CDR2 IYYSGSTN SEQ ID NO：35
III H-CDR3 WYFDL SEQ ID NO：36
VI DNA 参见序列表和图6C SEQ ID NO：77
V 蛋白质 同上 SEQ ID NO：78
表16人源化抗PD-1抗体Abs-h-926的L-CDR和完整轻链可变序列
No 轻链结构域&完整轻链 序列&注释 序列编号
I L-CDR1 NSVSSS SEQ ID NO：46
II L-CDR2 DTSNRE SEQ ID NO：47
III L-CDR3 QQRDNWPRA SEQ ID NO：48
VI DNA 参见序列表和图6D SEQ ID NO：79
V 蛋白质 同上 SEQ ID NO：80
表17人源化PD-1抗体的结合亲和性和动力学速率常数
表18人源化抗体结合的EC50
抗体 EC50(nM)
Abs-h-923 0.41
Abs-h-924 0.14
Abs-h-925 0.15
Abs-h-926 0.18
参考保藏生物材料
不适用于此申请。
序列表自由文本
参见PD-1抗体序列表文件专利文献
PTL1：WO2013173223A1
PTL2：WO2015036394A1，
PTL3：WO2015112800A1，
PTL4：WO2015112900A1，
PTL5：WO2016020856A3，
PTL6：WO2016068801A1
PTL7：WO2016077397A3
PTL8：WO2016106159A1
PTL9：US8735553B1
非专利文献
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附图说明
参考以下附图可以更全面地理解本发明。
图lA
图lA显示了通过FMAT测定的所选兔抗人PD-1重组抗体的特异性和高亲和性结合的总结数据。其在本发明的实施例1和3中进一步说明。
图1B
图1B显示了所选兔抗人PD-1重组抗体Abs-r-923、Abs-r-924、Abs-r-925和Abs-r-926的PD-1抑制功能和结合亲和性的总结数据。其在本发明的实施例1和3中进一步说明。
图1C
图1C显示了通过ELISA进行的所选兔抗人PD-1重组抗体Abs-r-923、Abs-r-924、Abs-r-925和Abs-r-926的结合特异性的总结数据。其在本发明的实施例1和3中进一步说明。
图1D
图1D显示了所选10种兔抗人PD-1重组抗体的抑制活性的总结数据，并挑选了其中4种Abs-r-923、Abs-r-924、Abs-r-925和Abs-r-926用于人源化。其在本发明的实施例1和3中进一步说明。
图2
图2显示了四种人源化抗人PD-1重组抗体Abs-h-923、Abs-h-924、Abs-h-925和Abs-h-926抑制PD-1与PD-L1结合的总结数据。其在本发明的实施例1和3中进一步说明。
图3A
图3A显示来自兔抗人PD-1重组抗体Abs-r-923的重链可变区(H-CVR)的DNA序列(SEQ ID NO：49)和氨基酸序列(SEQ ID NO：50)。表1中还显示了H-CDR1至H-CDR3的互补决定区。其在本发明的实施例3A中进一步说明。
图3B
图3B显示来自兔抗人PD-1重组抗体Abs-r-923的轻链可变区(L-CVR)的DNA序列(SEQ ID NO：51)和氨基酸序列(SEQ ID NO：52)。表2中还显示了L-CDR1至L-CDR3的互补决定区。其在本发明的实施例3B中进一步说明。
图3C
图3C显示来自人源化抗人PD-1重组抗体Abs-h-923的重链可变区(H-CVR)的DNA序列(SEQ ID NO：65)和氨基酸序列(SEQ ID NO：66)。表3中还显示了H-CDR1至H-CDR3的互补决定区。其在本发明的实施例3A中进一步说明。
图3D
图3D显示来自人源化抗人PD-1重组抗体Abs-h-923的轻链可变区(L-CVR)的DNA序列(SEQ ID NO：67)和氨基酸序列(SEQ ID NO：68)。表4中还显示了L-CDR1至L-CDR3的互补决定区。其在本发明的实施例3B中进一步说明。
图4A
图4A显示来自兔抗人PD-1重组抗体Abs-r-924的重链可变区(H-CVR)的DNA序列(SEQ ID NO：53)和氨基酸序列(SEQ ID NO：54)。表5中还显示了H-CDR1至H-CDR3的互补决定区。其在本发明的实施例3A中进一步说明。
图4B
图4B显示来自兔抗人PD-1重组抗体Abs-r-924的轻链可变区(L-CVR)的DNA序列(SEQ ID NO：55)和氨基酸序列(SEQ ID NO：56)。表6中还显示了L-CDR1至L-CDR3的互补决定区。其在本发明的实施例3B中进一步说明。
图4C
图4C显示来自人源化抗人PD-1重组抗体Abs-h-924的重链可变区(H-CVR)的DNA序列(SEQ ID NO：69)和氨基酸序列(SEQ ID NO：70)。表7中还显示了H-CDR1至H-CDR3的互补决定区。其在本发明的实施例3A中进一步说明。
图4D
图4D显示来自人源化抗人PD-1重组抗体Abs-h-924的轻链可变区(L-CVR)的DNA序列(SEQ ID NO：71)和氨基酸序列(SEQ ID NO：72)。表8中还显示了L-CDR1至L-CDR3的互补决定区。其在本发明的实施例3B中进一步说明。
图5A
图5A显示来自兔抗人PD-1重组抗体Abs-r-925的重链可变区(H-CVR)的DNA序列(SEQ ID NO：57)和氨基酸序列(SEQ ID NO：58)。表9中还显示了H-CDR1至H-CDR3的互补决定区。其在本发明的实施例3A中进一步说明。
图5B
图5B显示来自兔抗人PD-1重组抗体Abs-r-925的轻链可变区(L-CVR)的DNA序列(SEQ ID NO：59)和氨基酸序列(SEQ ID NO：60)。表10中还显示了L-CDR1至L-CDR3的互补决定区。其在本发明的实施例3B中进一步说明。
图5C
图5C显示来自人源化抗人PD-1重组抗体Abs-h-925的重链可变区(H-CVR)的DNA序列(SEQ ID NO：73)和氨基酸序列(SEQ ID NO：74)。表11中还显示了H-CDR1至H-CDR3的互补决定区。其在本发明的实施例3A中进一步说明。
图5D
图5D显示来自人源化抗人PD-1重组抗体Abs-h-925的轻链可变区(L-CVR)的DNA序列(SEQ ID NO：75)和氨基酸序列(SEQ ID NO：76)。表8中还显示了L-CDR1至L-CDR3的互补决定区。其在本发明的实施例3B中进一步说明。
图6A
图6A显示来自兔抗人PD-1重组抗体Abs-r-926的重链可变区(H-CVR)的DNA序列(SEQ ID NO：61)和氨基酸序列(SEQ ID NO：62)。表13中还显示了H-CDR1至H-CDR3的互补决定区。其在本发明的实施例3A中进一步说明。
图6B
图6B显示来自兔抗人PD-1重组抗体Abs-r-926的轻链可变区(L-CVR)的DNA序列(SEQ ID NO：63)和氨基酸序列(SEQ ID NO：64)。表14中还显示了L-CDR1至L-CDR3的互补决定区。其在本发明的实施例3B中进一步说明。
图6C
图6C显示来自人源化抗人PD-1重组抗体Abs-h-926的重链可变区(H-CVR)的DNA序列(SEQ ID NO：77)和氨基酸序列(SEQ ID NO：78)。表15中还显示了H-CDR1至H-CDR3的互补决定区。其在本发明的实施例3A中进一步说明。
图6D
图6D显示来自人源化抗人PD-1重组抗体Abs-h-926的轻链可变区(L-CVR)的DNA序列(SEQ ID NO：79)和氨基酸序列(SEQ ID NO：80)。表16中还显示了L-CDR1至L-CDR3的互补决定区。其在本发明的实施例3B中进一步说明。
图7
图7显示了四种人源化抗人PD-1重组抗体Abs-h-923、Abs-h-924、Abs-h-925和Abs-h-926与Nivolumab在体外竞争ELISA中对PD-1的竞争性结合的总结数据。其在本发明的实施例6中进一步说明。
图8
图8显示的是一个条形图，总结了在用抗PD-1抗体Abs-h-923、Abs-h-924、Abs-h-925和Abs-h-926处理的人PBMC上进行的混合淋巴细胞反应(MLR)测定的结果。这些结果表明，与抗体同种型对照(阴性对照)、两种PD-1抗体(参照对照)和Nivolumab(阳性对照)相比，四种人源化抗PD-1抗体中的三种显著诱导IL-2水平的增加。其在本发明的实施例7中进一步说明。
序列表
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Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn
1 5
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> Rabbit
<400> 12
Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> Rabbit
<400> 13
Gln Ser Gly Ser Ser Phe
1 5
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> Rabbit
<400> 14
Ala Asn Asn Lys Arg Glu
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> Rabbit
<400> 15
Gly Thr Tyr Thr Asp Ser Pro Pro Thr
1 5
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> Rabbit
<400> 16
Gln Ser Leu Ser Ser Tyr
1 5
<210> 17
<211> 6
<212> PRT
<213> Rabbit
<400> 17
Asp Val Ser Asn Arg Ala
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> Rabbit
<400> 18
Gln Gln Arg Thr Asn Trp Pro Arg Ala
1 5
<210> 19
<211> 6
<212> PRT
<213> Rabbit
<400> 19
Gln Ser Val Ser Ser Tyr
1 5
<210> 20
<211> 6
<212> PRT
<213> Rabbit
<400> 20
Glu Ala Ser Asn Arg Ala
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Rabbit
<400> 21
Gln Gln Arg Thr Asn Trp Pro Pro Ala
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> Rabbit
<400> 22
Asn Ser Val Ser Ser Ser
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> Rabbit
<400> 23
Asp Thr Ser Asn Arg Glu
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> Rabbit
<400> 24
Gln Gln Arg Asp Asn Trp Pro Arg Ala
1 5
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> human
<400> 25
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Ala
1 5
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> human
<400> 26
Ser Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr
1 5
<210> 27
<211> 6
<212> PRT
<213> human
<400> 27
Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> human
<400> 28
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> human
<400> 29
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> human
<400> 30
Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> human
<400> 31
Ala Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> human
<400> 32
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> human
<400> 33
Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val
1 5
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> human
<400> 34
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> human
<400> 35
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn
1 5
<210> 36
<211> 5
<212> PRT
<213> human
<400> 36
Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5
<210> 37
<211> 6
<212> PRT
<213> human
<400> 37
Gln Ser Gly Ser Ser Phe
1 5
<210> 38
<211> 6
<212> PRT
<213> human
<400> 38
Ala Asn Asn Lys Arg Glu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> human
<400> 39
Gly Thr Tyr Thr Asp Ser Pro Pro Thr
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> human
<400> 40
Gln Ser Leu Ser Ser Tyr
1 5
<210> 41
<211> 6
<212> PRT
<213> human
<400> 41
Asp Val Ser Asn Arg Ala
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> human
<400> 42
Gln Gln Arg Thr Asn Trp Pro Arg Ala
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<211> 6
<212> PRT
<213> human
<400> 43
Gln Ser Val Ser Ser Tyr
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> human
<400> 44
Glu Ala Ser Asn Arg Ala
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<211> 9
<212> PRT
<213> human
<400> 45
Gln Gln Arg Thr Asn Trp Pro Pro Ala
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<213> human
<400> 46
Asn Ser Val Ser Ser Ser
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<213> human
<400> 47
Asp Thr Ser Asn Arg Glu
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<212> PRT
<213> human
<400> 48
Gln Gln Arg Asp Asn Trp Pro Arg Ala
1 5
<210> 49
<211> 345
<212> DNA
<213> Rabbit
<400> 49
tgccagagcg tggaagaaag cgaaggcggc ctggtgaaac cgggcgcgag cctgaccctg 60
agctgcaccg cgagcggctt taccctgagc agctatgcga tgcattgggt gcgccaggcg 120
ccgggcaacg gcctggaatg gattggctgg agcaacgcgg gcaacggcaa caccaaatat 180
agccaggaat ttcagggccg ctttaccatt acccgcaaca ccagcctgag caccgtgacc 240
ctggaaatga ccagcctgac cgcggcggat accgcgacct atttttgcgc gcgctattgg 300
tattttgatc tgtggggccc gggcaccctg gtgaccgtga gcagc 345
<210> 50
<211> 115
<212> PRT
<213> Rabbit
<400> 50
Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ser Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Glu Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asn Thr Ser Leu Ser Thr Val Thr
65 70 75 80
Leu Glu Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 51
<211> 330
<212> DNA
<213> Rabbit
<400> 51
gaactggtgc tgacccagac cccgagcagc gtgagcgcgg cggtgggcgg caccgtgacc 60
attaactgcc aggcgagcca gagcggcagc agctttgtgg cgtggtatca gcagaaaccg 120
ggccagccgc cgaaactgct gatttatgcg aacaacaaac gcgaaaccgg cgtgccgagc 180
cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctggaatgc 240
gaagatgcgg cgacctatta ttgcggcacc tataccgata gcccgccgac ctttggcggc 300
ggcaccaaag tggtggtgaa aggcgatccg 330
<210> 52
<211> 110
<212> PRT
<213> Rabbit
<400> 52
Glu Leu Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Gly Ser Ser Phe
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Asn Asn Lys Arg Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Cys
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Thr Tyr Thr Asp Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Lys Gly Asp Pro
100 105 110
<210> 53
<211> 354
<212> DNA
<213> Rabbit
<400> 53
caggaaagcg tgaaagaaag cggcggcggc ctggtgaaac cgggcgatac cctgaccctg 60
acctgcaaag tgagcggctt tagcattagc agctatggca tgcattgggt gcgccaggcg 120
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<210> 54
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<212> PRT
<213> Rabbit
<400> 54
Gln Glu Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Asp
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Thr Asn Gln Asn Thr Val Thr
65 70 75 80
Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
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Ala Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 55
<211> 330
<212> DNA
<213> Rabbit
<400> 55
gaaattgtgc tgacccagac cccgagcagc gtgagcgcgg cggtgggcag caccgtgacc 60
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ggcaccaaag tggatgtgaa aggcgatccg 330
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<211> 110
<212> PRT
<213> Rabbit
<400> 56
Glu Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Ser Thr Val Thr Ile Asn Cys Arg Gly Ser Gln Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Asp Val Ser Asn Arg Ala Thr Gly Val Pro Arg Arg Phe Lys Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala
65 70 75 80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr Asn Trp Pro Arg
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Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Val Lys Gly Asp Pro
100 105 110
<210> 57
<211> 345
<212> DNA
<213> Rabbit
<400> 57
tgccagagcc tggaagaaag cggcggcggc ctggtgcagc cgggcaccac cctgaccctg 60
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<210> 58
<211> 115
<212> PRT
<213> Rabbit
<400> 58
Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Thr
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Gln Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Thr Ser Gln Asn Thr Val Thr
65 70 75 80
Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
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Ala Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Pro Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 59
<211> 333
<212> DNA
<213> Rabbit
<400> 59
gaactggtgc tgacccagac cccgagcagc gtgagcgcgg cggtgggcgg caccgtgacc 60
acaattacct gccgcgcgag ccagagcgtg agcagctatc tggcgtggta tcagcagaaa 120
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<210> 60
<211> 110
<212> PRT
<213> Rabbit
<400> 60
Glu Leu Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Glu Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys
65 70 75 80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr Asn Trp Pro Pro
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Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Lys Gly Asp Pro
100 105 110
<210> 61
<211> 342
<212> DNA
<213> Rabbit
<400> 61
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<210> 62
<211> 114
<212> PRT
<213> Rabbit
<400> 62
Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Thr Asp
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
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Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 63
<211> 330
<212> DNA
<213> Rabbit
<400> 63
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<210> 64
<211> 110
<212> PRT
<213> Rabbit
<400> 64
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Ser Thr Val Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Asn Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Tyr Asp Thr Ser Asn Arg Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys
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Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Asp Asn Trp Pro Arg
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Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Lys Arg Asp Val
100 105 110
<210> 65
<211> 345
<212> DNA
<213> human
<400> 65
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agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc agctatgcga tgcattgggt gcgccaggcg 120
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agccaggaat ttcagggccg cgtgaccatt acccgcgata ccagcgcgag caccgcgtat 240
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tattttgatc tgtggggccg cggcaccctg gtgaccgtga gcagc 345
<210> 66
<211> 115
<212> PRT
<213> human
<400> 66
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ser Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Glu Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 67
<211> 330
<212> DNA
<213> human
<400> 67
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<210> 68
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<212> PRT
<213> human
<400> 68
Glu Ile Ala Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Gly Ser Ser Phe
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Thr Tyr Thr Asp Ser Pro Pro
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
<210> 69
<211> 354
<212> DNA
<213> human
<400> 69
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tattattatg gcatggatgt gtggggccag ggcaccaccg tgaccgtgag cagc 354
<210> 70
<211> 118
<212> PRT
<213> human
<400> 70
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 71
<211> 330
<212> DNA
<213> human
<400> 71
gagattgtcc tgactcagtc tcccgctacc ctttccttgt ctccaggcga acgggccacc 60
attagctgcc gcggaagcca gagcctgtcc tcatacctcg cttggtatca acagcggcct 120
ggacaggcac ccaggctgct gatctacgac gtgagcaacc gggccacagg gatccccgcc 180
cggtttagtg ggagcggtag cggcacagat ttcactctga ccatcagcgg cctggaaccc 240
gaggacttcg ccgtgtacta ttgccagcag cggaccaact ggcccagagc cttcggccaa 300
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<212> PRT
<213> human
<400> 72
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Tyr Asp Val Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
<210> 73
<211> 354
<212> DNA
<213> human
<400> 73
caggtgcagc tggtggatag cggcggcggc gtggtgcagc cgggccgcag cctgcgcctg 60
agctgcgcgg cgagcgcgtt tacctttagc agctatgcga tgcattgggt gcgccaggcg 120
ccgggcaaag gcctggaatg ggtggcggtg attagctatg atggcagcaa caaatattat 180
gcggatagcg tgaaaggccg ctttaccatt agccgcgata acagcaaaaa caccctgtat 240
ctgcagatga acagcctgcg cgcggaagat accgcggtgt attattgcgc gcgctattat 300
tattattatt atatggatgt gtggggcaaa ggcaccaccg tgaccgtgag cagc 354
<210> 74
<211> 118
<212> PRT
<213> human
<400> 74
Gln Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 75
<211> 330
<212> DNA
<213> human
<400> 75
gagatcgtgc tgacgcaatc acccgccacc ctgagcctgt cccctggcga gcgggctaca 60
ctgagctgcc gggccagtca gtcagtgagc agttacttgg cttggtacca gcagaaaccc 120
ggccaagccc cacggctgct tatttatgag gcatccaaca gagcgaccgg catccctgcc 180
cgcttctctg gctctggatc cgggaccgac ttcactctca ctatcagcag cctggaaccc 240
gaggacttcg cagtctatta ctgccagcag aggaccaact ggcccccagc ctttggtcag 300
ggcacaaagg tggaaatcaa gcggaccgtg 330
<210> 76
<211> 110
<212> PRT
<213> human
<400> 76
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
<210> 77
<211> 339
<212> DNA
<213> human
<400> 77
caggtgcagc tgcaggaaag cggcccgggc ctggtgaaac cgagcgaaac cctgagcctg 60
acctgcaccg tgagcggcgg cagcattagc agctattatt ggagctggat tcgccagccg 120
ccgggcaaag gcctggaatg gattggctat atttattata gcggcagcac caactataac 180
ccgagcctga aaagccgcgt gaccattagc gtggatacca gcaaaaacca gtttagcctg 240
aaactgagca gcgtgaccgc ggcggatacc gcggtgtatt attgcgcgta ttggtatttt 300
gatctgtggg gccgcggcac cctggtgacc gtgagcagc 339
<210> 78
<211> 114
<212> PRT
<213> human
<400> 78
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 79
<211> 330
<212> DNA
<213> human
<400> 79
gagattgtgc tgactcagtc cccatccacc ctgagtctgt cacccggaca gaaagccact 60
ctgtcttgca gagccagcaa tagcgtcagc tcaagcctgg cctggtatca gcagaagccc 120
gggaaagctc cccggcttat gatctacgac accagtaacc gggaaaccgg catccctgag 180
cgcttcagcg gctctaagtc tggcacagat ttcagcctca caatcagctc cctggagccc 240
ggtgactttg ccgtgtacta ctgccagcag cgggacaact ggccccgggc attcggccaa 300
ggcacgaagg tgaccatcaa gaggaccgtg 330
<210> 80
<211> 110
<212> PRT
<213> human
<400> 80
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Lys Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Asn Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Met Ile
35 40 45
Tyr Asp Thr Ser Asn Arg Glu Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Lys Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Gly Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Asp Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Thr Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110

Claims (4)

1.一种抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含：
-由SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列的重链可变区和由SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列的轻链可变区；或者
-由SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列的重链可变区和由SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列的轻链可变区；或者
-由SEQ ID NO：74所示的氨基酸序列的重链可变区和由SEQ ID NO：76所示的氨基酸序列的轻链可变区；或者
-由SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列的重链可变区和由SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的轻链可变区。
2.权利要求1的抗PD-1抗体或其抗原结合片段在制备用于在混合淋巴细胞反应中诱导IL-2释放的药物中的用途。
3.权利要求1的抗PD-1抗体或其抗原结合片段在制备用于在体外用于检测PD-1的诊断剂中的用途。
4.权利要求1的抗PD-1抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗对象中的PD-1介导的癌症的药物中的用途。
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