BR112014031407B1

BR112014031407B1 - Método e dispositivo para o monitoramento de um tratamento de sangue extracorpóreo de um paciente e aparelho de tratamento de sangue extracorpóreo para execução de um tratamento de sangue extracorpóreo em um paciente

Info

Publication number: BR112014031407B1
Application number: BR112014031407-1A
Authority: BR
Inventors: Andreas Maierhofer; Alfred Gagel
Original assignee: Fresenius Medical Care Deutschland Gmbh
Priority date: 2012-06-15
Filing date: 2013-06-14
Publication date: 2021-12-28
Also published as: AU2013276453A1; CA2876542A1; US10010289B2; JP2015521492A; CA2876542C; JP6242883B2; CN104363820A; EA201492106A1; AU2013276453B2; EP2861127B1; IN2015DN00165A; KR20150024405A; BR112014031407A2; WO2013186357A1; EP2861127A1; US20140046150A1; KR102058260B1; CN104363820B; EP2674103A1; EA028556B1

Abstract

método e dispositivo para a monitoração de um tratamento de sangue extracorpóreo de um paciente. a presente invenção se refere a um método para a monitoração de um tratamento de diálise de um paciente, preferencialmente para a monitoração de um tratamento de hemodiálise, hemodiafiltração e/ou diálise peritoneal de um paciente, o método incluindo as etapas de: - irradiação de uma amostra de um fluido de diálise usado no tratamento de diálise com luz de irradiação polarizada linearmente; - detecção da intensidade da luz de fluorescência emitida pelo fluido de diálise em um primeiro plano polarizado; - detecção da intensidade da luz de fluorescência emitida pelo fluido de diálise em um segundo plano de polarização o qual é diferente do primeiro plano de polarização; - determinação da anisotropia da luz de fluorescência emitida pelo fluido de diálise; e -determinação da concentração de pelo menos um fluoróforo no fluido de diálise com base na anisotropia determinada e na intensidade da luz de fluorescência emitida pelo fluido de diálise.

Description

Campo Técnico

[001] A presente invenção refere-se a um método e a um dispositivo para o monitoramento de um tratamento de sangue extracorpóreo de um paciente, preferencialmente para o monitoramento de um tratamento de diálise, hemodiálise, hemodiafiltração, hemofiltração e/ou diálise peritoneal de um paciente.

Antecedentes Técnicos

[002] A diálise é um dos métodos de tratamento de sangue extracorpóreo mais comumente conhecidos e usados e é pretendida para a substituição da função dos rins quando uma falha rena dos rins ocorreu em um paciente.

[003] Quando os rins falham, a diálise de um paciente é necessária para a remoção de produtos residuais, tais como ureia, creatinina e toxinas urêmicas do sangue do paciente. Mais ainda, durante uma diálise, a água em excesso e outras substâncias as quais usualmente são eliminadas pela urina são removidas do corpo do paciente. O método mais comumente usado de diálise é a hemodiálise, na qual o sangue do paciente flui ao longo de uma membrana de diálise, em que no outro lado desta membrana de diálise é provido um líquido de diálise. Assim sendo, o sangue e o líquido de diálise são separados pela membrana porosa.

[004] Através desta membrana, as substâncias as quais devem ser removidas do sangue do paciente se difundem, por causa de um gradiente de concentração entre o sangue e o líquido de diálise. Moléculas maiores, cuja velocidade de difusão é muito baixa, também podem ser transportadas de forma convectiva por meio de um fluxo de líquido a partir do lado de sangue para o lado de líquido de diálise da membrana.

[005] O líquido de diálise é preparado para ter uma concentração a qual provê um gradiente de concentração a partir do lado de sangue para o lado de líquido de diálise para certas substâncias, mas não necessariamente para todas as substâncias. De fato, a remoção de ureia e creatinina, bem como de outros produtos residuais no corpo humano é desejada, mas, por exemplo, a remoção ou a mudança de concentração de eletrólitos, tais como potássio, sódio ou bicarbonato não é desejada de forma alguma, mas é considerada prejudicial. Assim sendo, o líquido de diálise tipicamente contém uma concentração dos eletrólitos a qual se assemelha à concentração de eletrólitos no plasma do sangue do paciente, de modo que um gradiente de concentração não esteja presente para estas substâncias.

[006] Além da hemodiálise, uma diálise peritoneal é um outro método de diálise, o qual também usa uma membrana e um líquido de diálise, de modo a se obter uma difusão do produto residual através da membrana para o líquido de diálise. A membrana, contudo, é uma membrana natural, especificamente, o peritônio, e o líquido de diálise é introduzido diretamente na cavidade abdominal.

[007] Durante uma diálise, a eliminação de água em excesso e pequenas substâncias urêmicas moleculares, tais como ureia e creatinina, tipicamente não é problema; as moléculas maiores, contudo, são mais difíceis de remover através da membrana porosa. De modo a lidar com isto, membranas de diálise de fluxo alto específicas são providas em combinação com métodos altamente convectivos, tal como hemodiafiltração. Isto resulta em melhoramento na depuração de moléculas de massas moleculares de mais de 1 kDa, o que é a faixa das assim denominadas moléculas de tamanho médio. Em hemodiafiltração, um método de difusão usando o líquido de diálise na forma conforme descrito acima é combinado com hemofiltração, no qual o sangue de um paciente é submetido a um gradiente de pressão através de um filtro. Assim sendo, o processo de filtração ao longo do gradiente de pressão leva a um fluxo de líquido aumentado e, assim, é considerado um método altamente convectivo, o que permite a remoção de uma porção considerável de moléculas de tamanho médio. Contudo, devido ao gradiente de pressão, a água, bem como eletrólitos e açúcares, também são removidos do sangue do paciente a uma taxa alta, de modo que estes constituintes de sangue tenham que ser substituídos por meio da infusão de um fluido de substituição.

[008] A introdução das membranas de diálise de fluxo alto em combinação com métodos altamente convectivos melhora a depuração de moléculas de tamanho médio e maiores.

[009] As moléculas maiores tipicamente são proteínas, em que, por exemplo, uma beta2-microglobulina tem um tamanho de em torno de 11 kDa, em que esta molécula pode induzir uma amiloidose, se não for suficientemente removida. Moléculas menores, as quais não tóxicas, também podem ser difíceis de dialisar, se as moléculas estiverem ligadas a proteínas. Por exemplo, toxinas urêmicas, as quais são ligadas a proteínas, são sulfato de p-cresil e sulfato de indoxil.

[010] Assim sendo, é desejado ter tamanhos de poros nas membranas de diálise, os quais sejam suficientemente grandes para deixarem estas moléculas de tamanho médio passar. Por outro lado, o tamanho de poro da membrana não pode ser estendido infinitamente, porque quanto mais alto o tamanho de poro da membrana, mais alto o risco de componentes vitais do sangue serem perdidos da mesma forma. Assim sendo, a permeabilidade da membrana tipicamente é limitada a tamanhos em torno de 60 kDa. Contudo, este valor está apenas ligeiramente abaixo da massa molecular de albumina de plasma humano, o qual tem um tamanho em torno de 66 kDa. Na prática, perdas clinicamente significativas de albumina podem acontecer, em que estas perdas dependem significativamente dos respectivos parâmetros do método, tais como as respectivas pressões e as respectivas concentrações no líquido de diálise. Em particular, uma membrana de fluxo alto em combinação com o gradiente de pressão aplicado durante uma hemofiltração aumenta a depuração de albumina humana. Uma outra razão para a perda de albumina humana pode ser o uso múltiplo das membranas, porque a limpeza da membrana a qual é necessária entre tratamentos diferentes tende a aumentar o tamanho dos poros na membrana. Isto desloca a permeabilidade da membrana em direção a moléculas mais altas. Assim sendo, mesmo sob condições normais em uma hemodiálise normal, a albumina de soro humano pode penetrar através da membrana.

[011] É desnecessário dizer que, no caso de diálise peritoneal, os tamanhos dos poros da membrana não podem ser influenciados, mas são dados pela condição do peritônio do respectivo paciente. Contudo, uma perda de albumina humana no líquido de diálise pode ocorrer, não obstante, uma vez que o peritônio tenha sido prejudicado, por exemplo, por uma inflamação.

[012] De modo a determinar a depuração de um analisado durante uma diálise, um método de espectroscopia de Raman é exposto na US 2008/0158544 A1, em que as medições espectrais de Raman são realizadas no sangue, após ele ter passado pelo dialisador, de modo a se utilizar a assinatura espectroscópica de Raman única de um ou mais analisados, por exemplo, ureia, para a identificação e a quantificação desses analisados contra um fundo de sangue total.

[013] O WO 2010/091826 A1 se refere a um aparelho para o tratamento extracorpóreo de sangue, em que a absorção de radiação eletromagnética no líquido de diálise é medida, de modo a se determinar o valor Kt/V, especificamente, a depuração L do fluxo em volume de substâncias limpas, em que t é o tempo de tratamento e V é o volume de distribuição do paciente. Em uma terapia de substituição renal, a ureia é tipicamente usada como uma substância marcadora para medição da eficiência de tratamento de ácido úrico, de modo que K seja a depuração de ácido úrico e V o volume de distribuição de ureia do paciente, o que corresponde a princípio à água do corpo do paciente. Contudo, pela medição da absorção total, em geral, a depuração para uma molécula específica não pode ser determinada.

[014] Assim sendo, é desejado monitorar a perda de albumina humana durante tratamentos de diálise, de modo a se alertar o pessoal médico desta condição, de modo que o tratamento possa ser ajustado ou mesmo para ajustar automaticamente ou mesmo interromper o tratamento, no caso de perda excessiva de albumina.

[015] Mais ainda, outras proteínas, tais como as moléculas médias mencionadas acima (proteínas com tamanhos menores do que 66 kDa), bem como outras substâncias moleculares menores, tal como sulfato de p-cresil, sulfato de indoxil ou fenil, também podem ser determinadas quanto a sua depuração, porque estas substâncias são tóxicas.

Sumário da Invenção

[016] Assim sendo, é um objetivo da presente invenção prover um método e um aparelho para o monitoramento de um tratamento de sangue extracorpóreo de um paciente.

[017] Este objetivo é resolvido por meio do método de acordo com a reivindicação 1. As modalidades vantajosas podem ser tomadas a partir das reivindicações dependentes.

[018] Assim sendo, o método para o monitoramento de um tratamento de sangue extracorpóreo de um paciente, preferencialmente para o monitoramento de um tratamento de diálise, hemodiálise, hemodiafiltração, hemofiltração e/ou diálise peritoneal de um paciente, inclui as etapas de irradiação de uma amostra de um fluido sendo usado no tratamento de sangue extracorpóreo com luz de irradiação polarizada linearmente, detecção da intensidade da luz de fluorescência emitida pela amostra do fluido no primeiro plano de polarização, detecção da intensidade da luz de fluorescência emitida pela amostra a partir do fluido em um segundo plano de polarização, o qual é diferente do primeiro plano de polarização, determinação da anisotropia da luz de fluorescência emitida pela amostra do fluido, e determinação da concentração de pelo menos um fluoróforo na amostra do fluido com base na pronúncia determinada e na intensidade da luz de fluorescência emitida pelo fluido.

[019] Por meio da determinação das concentrações os respectivos fluoróforos na amostra do fluido com base na anisotropia medida e na intensidade da luz de fluorescência polarizada, é possível distinguir entre os sinais de fluorescência de várias substâncias ativas de fluorescência na amostra do fluido. De fato, pelo uso da anisotropia para a determinação das concentrações individuais do fluoróforo individual na amostra do fluido, torna-se possível determinar a concentração individual do respectivo fluoróforo na amostra do fluido, porque a anisotropia é diferente para todo fluoróforo.

[020] O fluido usado no tratamento de sangue extracorpóreo pode ser um fluido de diálise no caso dos tratamentos de diálise, hemodiálise, hemodiafiltração e/ou diálise peritoneal de um paciente ou de um ultrafiltrado, no caso de um tratamento de hemofiltração de um paciente.

[021] Por meio do uso desta variante de espectroscopia de fluorescência, a performance, por exemplo, de tratamentos de diálise convectivos podem ser determinados on-line durante o tratamento. A performance pode ser determinada, por exemplo, pela análise do conteúdo do fluido de diálise. Se a depuração de moléculas específicas estiver abaixo de um certo limite ou se substâncias, tal como albumina humana, forem removidas do plasma do paciente em quantidades inaceitáveis, o processo de tratamento poderá ser ajustado automaticamente pelo aparelho de tratamento e/ou um alarme poderá ser emitido.

[022] Preferencialmente, o primeiro plano de polarização e o segundo plano de polarização são orientados perpendiculares um com respeito ao outro, e a anisotropia A ser determinada com base na equação a seguir:

[023] onde Ivv é a intensidade da luz de fluorescência detectada no plano de polarização vertical, Ivh é a intensidade da luz de fluorescência detectada no plano de polarização horizontal, e G é uma constante de aparelho que compensa as diferenças nas sensibilidades do aparelho, quando da detecção das intensidades nos primeiro e segundo planos de polarização. A anisotropia pode ser usada para a determinação do fluoróforo exatamente, porque fluoróforos diferentes mostram anisotropias diferentes.

[024] Em uma outra modalidade preferida, a intensidade da luz de fluorescência é detectada em um comprimento de onda de detecção predeterminado, quando da iluminação da amostra no fluido em um comprimento de onda de irradiação predeterminado, e a anisotropia é usada para a determinação do fluoróforo individual, e a intensidade da luz de fluorescência é usada para a determinação da concentração deste fluoróforo individual, em que preferencialmente a anisotropia de fluoróforos individuais é conhecida.

[025] Preferencialmente, as concentrações de pelo menos dois fluoróforos presentes na amostra do fluido são determinadas com base na equação a seguir da anisotropia total Ages dos espectros somados:

onde

[026] e em que Ages é a anisotropia total dos espectros somados, Ai é a anisotropia do iésimo fluoróforo, fi é a fração de intensidade do iésimo fluoróforo com respeito à intensidade total, Si é a intensidade total da radiação física do iésimo fluoróforo, Sges é a intensidade total da radiação física de todos os fluoróforos, Ivh,i é a intensidade de fluorescência horizontal detectada do iésimo fluoróforo, Ivv,i é a intensidade de fluorescência vertical detectada do iésimo fluoróforo, e i é o índice para todos os fluoróforos, e em que a anisotropia Ai do iésimo fluoróforo é preferencialmente conhecida. Com base nisto, torna-se possível determinar as concentrações de pelo menos dois fluoróforos na amostra do fluido, com base na luz de fluorescência detectada. Em outras palavras, torna-se possível distinguir entre fluoróforos individuais diferentes na amostra do fluido, por exemplo, no fluido de diálise ou no ultrafiltrado.

[027] Mais ainda, é preferido irradiar continuamente a amostra do fluido e realizar a detecção continuamente. As variações nas concentrações de amostras diferentes do fluido podem ser observadas desta maneira facilmente. O termo “contínuo” é entendido como incluindo intercepções curtas do processo de medição durante o tratamento de sangue extracorpóreo do paciente, por exemplo, durante a configuração ou procedimentos de ajuste de um aparelho de tratamento de sangue extracorpóreo.

[028] Preferencialmente, a concentração de um fluoróforo é diretamente determinada com base na anisotropia total, em que preferencialmente a concentração de albumina é determinada com base na anisotropia total. Isto é particularmente útil se a contribuição do fluoróforo para a anisotropia total for significativa.

[029] Em uma modalidade preferida, a concentração de um fluoróforo, preferencialmente a concentração de albumina humana, é determinada diretamente com base nas intensidades vertical e horizontal da luz de fluorescência detectada. De novo, isto é particularmente adequado quando a contribuição do fluoróforo para a anisotropia total é significativa. Com base neste método, a determinação da concentração é muito fácil de realizar.

[030] Em uma outra modalidade preferida, a amostra do fluido é irradiada com uma luz de irradiação pulsada e polarizada linearmente e a detecção da luz de fluorescência nos primeiro e segundo planos de polarização ser realizada de uma forma resolvida no tempo, e

[031] em que θ é o tempo de correlação de rotação, o qual é uma constante de tempo característica que descreve o período de tempo dentro do qual os eixos geométricos de momentos de dipolo de transição são orientados de forma difusa por meio da rotação das moléculas, e A0 é a anisotropia no ponto de tempo t = 0, antes dos efeitos de despolarização se aplicarem. O tempo de correlação de rotação θ da anisotropia pode ser usado para a determinação da substância do fluoróforo, porque todo fluoróforo tem um tempo de correlação de rotação θ diferente.

[032] Preferencialmente, o tempo de correlação de rotação θ é variado por meio da temperatura da amostra do fluido, pela variação da viscosidade da amostra do fluido e/ou pela aplicação de campos magnéticos e/ou elétricos externos, de modo a identificar adicionalmente o fluoróforo com base no comportamento do tempo de correlação de rotação θ.

[033] Em uma modalidade preferida adicional, a intensidade de fluorescência total é aumentada pelo alinhamento dos momentos de dipolo de transição da amostra do fluido pela aplicação de campos elétricos e/ou magnéticos externos. A aplicação de campos externos ajuda no aumento das intensidades detectadas e, assim, melhora a relação de sinal para ruído.

[034] Preferencialmente, uma decomposição de matriz do espectro de anisotropia medido é realizada e uma comparação com espectros de anisotropia conhecidos de substâncias conhecidas é realizada, de modo a se determinar com base nas respectivas intensidades das substâncias conhecidas suas respectivas concentrações. Com base nisto, torna-se possível analisar mesmo superposições complexas de espectros de fluorescência como a composição real da amostra do líquido.

[035] É preferido realizar uma medição de referência em um fluido de diálise fresco em um tratamento de diálise, hemodiálise, hemodiafiltração e/ou diálise peritoneal de um paciente, de modo que a contribuição de contaminações do fluido de diálise inicial para as leituras feitas a partir do fluido de diálise usado possa ser eliminada. O método preferencialmente usa as etapas de irradiação de uma amostra de fluido de diálise fresco a ser usado no tratamento de sangue extracorpóreo com uma luz de irradiação polarizada linearmente; a detecção da intensidade da luz de fluorescência emitida pela amostra do fluido de diálise fresco em um primeiro plano de polarização; a detecção da intensidade da luz de fluorescência emitida pela amostra do fluido de diálise fresco em um segundo plano de polarização o qual é diferente do primeiro plano de polarização; a determinação da anisotropia da luz de fluorescência emitida pela amostra do fluido de diálise fresco; e a determinação da concentração de pelo menos um fluoróforo na amostra do fluido de diálise fresco com base em ambas a anisotropia determinada e a intensidade da luz de fluorescência emitida pelo fluido.

[036] Em um outro método preferido, a concentração de albumina humana na amostra é determinada com base em uma subtração da intensidade horizontal detectada menos a intensidade vertical detectada.

[037] O objetivo mencionado acima também é atendido por um dispositivo com as características da reivindicação 15. As modalidades preferidas podem ser tomadas a partir das reivindicações dependentes.

[038] Assim sendo, o dispositivo para o monitoramento de um tratamento de sangue extracorpóreo de um paciente, preferencialmente, para o monitoramento de um tratamento de diálise, hemodiálise, hemodiafiltração, hemofiltração e/ou diálise peritoneal de um paciente, inclui uma fonte de luz de irradiação para irradiação de uma amostra de um fluimandeido usado no tratamento de diálise com luz polarizada linearmente, e um detector para a detecção da intensidade da luz de fluorescência emitida pela amostra do fluido em um primeiro plano de polarização e em um segundo plano de polarização, o qual é diferente do primeiro plano de polarização, em que uma unidade de análise está presente para a determinação da anisotropia da luz de fluorescência emitida pela amostra do fluido, e para a determinação da concentração de pelo menos um fluoróforo na amostra do fluido, com base na anisotropia determinada e na intensidade da luz de fluorescência emitida pela amostra do fluido.

[039] Preferencialmente pelo menos dois polarizadores com planos de polarização alinhados segundo um ângulo são providos entre a amostra do fluido e um detector para detecção da intensidade da luz de fluorescência, em que um obturador móvel está presente no percurso de luz para alternativamente cobrir um dos dois polarizadores para detectar alternativamente as intensidades da luz de fluorescência nos dois planos de polarização. Por meio da provisão dos dois polarizadores, uma configuração pode ser provida, a qual evita o movimento das partes óticas e, assim, permite medições confiáveis.

[040] Preferencialmente, um obturador rotativo pode estar presente no percurso de luz da luz transmitida da fonte de luz através da amostra do fluido, de modo que a intensidade da luz transmitida, bem como as intensidades da luz de fluorescência em pelo menos dois planos de polarização diferentes possa ser detectada por meio do detector único.

[041] Mais ainda, em uma alternativa, um primeiro detector com um polarizador associado a um primeiro plano de polarização e um segundo detector com um polarizador associado com um segundo plano de polarização diferente do primeiro plano de polarização são dispostos em lados opostos da amostra do fluido para a detecção da luz de fluorescência de um primeiro e de um segundo plano de polarização simultaneamente.

[042] Preferencialmente, um terceiro detector está presente de forma colinear com a luz de irradiação e de modo que a amostra do fluido seja posicionada entre o detector e a fonte de luz de irradiação para a detecção da intensidade de transmissão.

[043] O dispositivo preferencialmente é configurado para execução do método esboçado acima.

Breve Descrição dos Desenhos

[044] A presente exposição será mais prontamente apreciada com referência à descrição detalhada a seguir, quando for considerada em relação com os desenhos associados, nos quais: A figura 1 mostra um diagrama esquemático dos momentos de dipolo de uma molécula, bem como o momento de dipolo de transição da molécula; A figura 2 mostra uma configuração experimental esquemática para determinação da anisotropia dos fluoróforos em um dialisado usado; A figura 3 mostra diagramas esquemáticos de espectros de anisotropia de moléculas diferentes, em particular de albumina humana e triptofano; A figura 4 é uma representação esquemática de um aparelho para a realização do método sugerido; A figura 5 é um diagrama esquemático representando a concentração de albumina humana como uma função da intensidade medida da luz de fluorescência polarizada total; A figura 6 é um diagrama esquemático que mostra as constantes de tempo de correlação para proteínas de massa molecular diferente; A figura 7 é uma representação esquemática de uma configuração experimental para medição da anisotropia em luz UV, em que a intensidade de luz polarizada é medida no plano horizontal; A figura 8 corresponde à representação esquemática da figura 7, mas com um polarizador diferente, de modo que a intensidade de luz polarizada seja medida no plano vertical; A figura 9 mostra um arranjo alternativo de uma configuração experimental para medição de anisotropia com UV; e A figura 10 mostra ainda um outro arranjo alternativo de uma configuração experimental para medição da anisotropia com UV.

Descrição Detalhada de Modalidades Preferidas

[045] A seguir, a invenção será explicada em maiores detalhes com referência às figuras associadas. Nas figuras, elementos iguais são denotados por números de referência idênticos, e uma descrição repetida dos mesmos pode ser omitida, de modo a se evitarem redundâncias.

[046] É um objetivo da presente invenção monitorar a depuração de certas moléculas em um tratamento de sangue extracorpóreo e, ao mesmo tempo, garantir que moléculas importantes, tal como a albumina humana, não sejam removidas em quantidades excessivas.

[047] A seguir, o método é elaborado com base em um tratamento de diálise. Contudo, não é pretendido que seja limitado a tratamentos de diálise apenas, mas é pretendido, ao invés disso, para ser usado em todos os outros tratamentos de sangue extracorpóreos, tal como para o monitoramento de um tratamento de diálise, hemodiálise, hemodiafiltração, hemofiltração e/ou diálise peritoneal de um paciente.

[048] De modo a atender a este objetivo, a concentração de albumina, bem como as concentrações de uma fração das assim denominadas moléculas médias, especificamente, proteínas com um tamanho menor do que 66 kDa, devem ser medidas individualmente. Mais ainda, no dialisado usado, substâncias moleculares pequenas adicionais, tais como sulfato de indoxil, p-cresol e fenol, estão presentes, as quais também são de fluorescência ativa.

[049] Infelizmente, os espectros de emissão dos fluoróforos individuais, os quais são de interesse para uma análise patológica, amplamente se sobrepõem para um comprimento de onda de irradiação específico, e também estão presentes nas faixas de UV idênticas. Além desta inconveniência, os espectros de fluorescência das moléculas mencionadas antes são relativamente amplos, de modo que uma desconvolução dos espectros medidos seja difícil ou apenas possa ser realizada com grandes erros de medição. Assim sendo, com base na espectroscopia de fluorescência comum, não é possível determinar a concentração exata ou a proporção exata de uma substância individual em um fluido de diálise e, assim, não é possível prover uma determinação quantitativa confiável das concentrações.

[050] Por meio do uso da anisotropia, conforme sugerido na presente invenção, este problema pode ser suplantado. O efeito relacionado a isto é denominado fotosseleção, de acordo com o que a luz de fluorescência emitida de uma amostra mostra anisotropia da luz de fluorescência emitida após uma excitação da amostra com luz polarizada linearmente.

[051] Geralmente, quando um átomo ou uma molécula absorve eletronicamente um fóton, um elétron é elevado para uma órbita atômica ou molecular mais alta. Devido a este deslocamento da estrutura eletrônica, uma nova distribuição espacial das cargas está presente, de modo que o momento de dipolo eletrônico do átomo ou da molécula de absorção tipicamente seja mudado.

[052] O momento de dipolo de transição é definido pelo momento de dipolo elétrico, o qual está associado a uma transição entre o estado fundamental e o estado excitado do respectivo átomo ou da respectiva molécula. A direção do vetor do momento de dipolo de transição corresponde ao plano de polarização da transição, o que determina como a molécula interagirá com uma onda eletromagnética de uma dada polarização. O quadrado da magnitude do momento de dipolo de transição é a intensidade da interação com base na distribuição das cargas na molécula.

[053] A figura 1 mostra uma representação simplificada do momento de dipolo de transição p > , quando a respectiva molécula é excitada a partir do momento de dipolo eletrônico do estado fundamento pg no estado elevado pa pela excitação da molécula por meio do vetor de campo de energia de excitação pg>a. Mais ainda, é mostrado que a molécula tipicamente relaxa por meio de processos internos (uma assim denominada conversão interna, a qual tipicamente é devido a processos de vibração na molécula), antes de relaxar a partir do estado excitado para o estado fundamental através do momento de dipolo de transição p — g. Devido aos processos de relaxação internos, o vetor do momento de dipolo de transição p —: é tipicamente deslocado por meio do ângulo α com respeito ao vetor de excitação pg——a .

[054] O momento de dipolo de transição é determinado pela estrutura de cada molécula e se move em conjunto com a molécula, mas o alinhamento relativo com respeito à molécula permanece fixo.

[055] Conforme pode ser facilmente apreciado, a probabilidade para absorção é a mais alta quando a orientação da onda eletromagnética de uma dada polarização, ou, mais precisamente, seu vetor de campo, é colinear com o momento de dipolo de transição pa—g. Assim sendo, se uma luz polarizada linearmente for usada para excitação de uma molécula na amostra de fluido de diálise, a probabilidade de excitação da molécula por meio da luz polarizada linearmente será a mais alta para moléculas as quais atendem às exigências de colinearidade por acaso. Este processo é determinado fotosseleção, porque as moléculas são excitadas, as quais - por acaso - são dispostas em uma relação espacial específica para o plano de polarização da luz de irradiação.

[056] Além disso, a orientação do momento de dipolo de transição pa—g determina a polarização da luz de fluorescência emitida, quando a transição do estado excitado para o estado fundamental é realizada por meio da emissão de um fóton (obviamente, uma relaxação sem a emissão de fótons também é possível, por exemplo, pela emissão de um fônon). A emissão de dipolo se propaga simetricamente com o eixo geométrico do momento de dipolo, em que a intensidade está em seu máximo perpendicular ao eixo geométrico de dipolo, em que se desvanece paralelo ao eixo geométrico de dipolo.

[057] Assim sendo, a luz de fluorescência emitida é polarizada e anisotrópica.

[058] A figura 2 mostra esquematicamente um arranjo para a medição da luz de excitação, bem como da luz emitida. A luz de excitação é emitida por uma fonte de luz L e é polarizada no primeiro polarizador, de modo que o vetor do campo elétrico seja perpendicular ao plano no qual a excitação e os raios de emissão estão localizados.

[059] No lado de detector D, um segundo polarizador é provido, o qual pode ser rodado e o qual é posicionado de modo que apenas a luz de fluorescência emitida seja passada através dali. Preferencialmente, a direção da luz de excitação e a direção na qual o detector D é disposto em relação à amostra são perpendiculares um com respeito ao outro, de modo a se evitar que a luz de excitação impinja sobre o detector.

[060] Pela rotação do segundo polarizador, as intensidades Ivv (intensidade vertical) e a intensidade Ivh (intensidade horizontal) podem ser detectadas pelo detector D. As diferenças nas intensidades Ivv — Ivh é uma medida para a polarização da luz recebida pelo detector D. A polarização P, bem como a anisotropia A podem ser determinada conforma se segue:

[061] Aqui, Ivh é a intensidade detectada da luz de fluorescência quando o segundo polarizador é rodado de modo que apenas a luz polarizada horizontalmente possa passar. Ivv é a intensidade detectada da luz de fluorescência quando o polarizador de emissão é rodado, de modo que apenas a luz polarizada verticalmente possa passar. G é uma constante de aparelho a qual é provida de modo a compensar sensibilidades diferentes potenciais do sistema de medição nos planos horizontal e vertical. G é para ser determinada experimentalmente, e pode ser colocada em um software do sistema como uma constante. A constante G também pode ser medida on-line pela medição da intensidade da luz a qual passa através do polarizador na polarização horizontal, quando se usa uma luz de excitação polarizada horizontalmente e pela medição da intensidade do sistema em uma polarização vertical, quando uma luz de excitação polarizada verticalmente é usada. A constante de aparelho então é determinada como G = Ihv/Ihh. Ivv + 2G Ivh é a intensidade de emissão média, se a potência emitida total fosse emitida de forma isotrópica pelo ângulo total Q = 4π.

[062] Conforme pode ser tirado a partir das equações (1) e (2), a polarização P e a anisotropia A podem ser facilmente substituídas uma com respeito à outra.

[063] A anisotropia varia entre -0,2 < Ao < 0,4. O valor máximo de 0,4 corresponde a um alinhamento colinear dos momentos de dipolo de transição de absorção e de emissão na ausência de quaisquer outras influências de despolarização. Em outras palavras, corresponde a α = 0°.Contudo, na realidade, os momentos de dipolo de absorção, bem como os momentos de dipolo de emissão tipicamente não são colineares, mas envolvem um ângulo α um com respeito ao outro. A anisotropia detectada então é:

[064] Para α = 0, isto é, um arranjo colinear do momento de dipolo de absorção e do momento de dipolo de emissão, A0 = 0,4 e para α = 90°, o valor é A0 = 0,2. No assim denominado ângulo mágico de α = 54,7°, nenhuma anisotropia pode ser observada.

[065] Devido ao fato da orientação do momento de dipolo de transição variar, dependendo das bandas de absorção, o ângulo α e com ele a anisotropia A0 também são variáveis com o comprimento de onda de excitação Xθxc e também com o comprimento de onda de emissão Xθm. A função de anisotropia A0 (Xexc, Aem) é específica para todo fluoróforo, conforme é mostrado muito esquematicamente na figura 3.

[066] Em particular, na figura 3, no diagrama de topo, os espectros de anisotropia de albumina humana, albumina bovina e albumina pura são mostrados em um comprimento de onda de excitação de Àexc = 275 nm. Pode ser visto claramente que a anisotropia varia entre 0,2 e 0,1 para diferentes comprimentos de onda de emissão Xθm entre 290 nm e 400 nm.

[067] No diagrama de fundo da figura 3, os espectros de anisotropia de albumina humana (66,5 kDa), do aminoácido triptofano (204 Da), de uma mistura de ambas as substâncias, bem como de sulfato de indoxil são mostrados. Aqui, de novo, pode ser visto claramente que a função anisotrópica Ao (A.θxc, M é específica para cada fluoróforo.

[068] Mais ainda, a função anisotrópica Ao (Aexc, M é influenciada por fatores externos, tal como a temperatura e a viscosidade do meio, bem como a ligação do respectivo fluoróforo a outros meios. Isto também pode ser visto quando da análise do diagrama inferior na figura 3, em que a função anisotrópica de triptofano é consideravelmente diferente daquela de uma combinação de triptofano e albumina humana.

[069] Uma consideração importante com respeito à análise de dialisados usados é provida pelo fato de apenas as moléculas maiores mostrarem anisotropias significativas, devido a sua constante de tempo de correlação de rotação relativamente grande θ, conforme será discutido adicionalmente abaixo. Estas substâncias no dialisado usado são tipicamente proteínas, em que a albumina é um representante importante desta espécie. Os fluoróforos moleculares menores tipicamente proveem apenas intensidades distribuídas de forma isotrópica nas intensidades polarizadas Ivv e Ivh. Suas anisotropias específicas são, portanto, Aj = 0. Assim sendo, com base nesta descoberta, a proporção de intensidade de albumina pode ser determinada com base na anisotropia total Ages, desde que os outros fluoróforos os quais se espera que estejam presentes no fluido de diálise provejam apenas contribuições isotrópicas.

[070] A figura 4 mostra esquematicamente uma configuração de medição a qual pode ser usada em combinação com o presente método. Em particular, uma fonte de luz L é provida, a qual é colimada e focalizada por meio de uma lente, e a luz de excitação é polarizada por meio do polarizador Pexc. A luz de excitação polarizada, colimada e focalizada então é dirigida para uma cuveta C e é medida por meio de um fotodiodo D, de modo a se ajustarem as intensidades variáveis da fonte de luz L.

[071] A luz de fluorescência emitida pelos fluoróforos na cuveta C é extraída sob um ângulo tal que a luz de emissão a partir da fonte de luz L não interfira com a luz de fluorescência. A luz de fluorescência é enviada através de um segundo polarizador Pem, o qual pode ser ajustado na sua orientação. Então, a luz de fluorescência polarizada impinge sobre um retículo de difração G e é refletida para um sensor de CCD, de modo que o espectro total da luz de fluorescência possa ser analisado na unidade de análise A. Os resultados podem ser exibidos em um visor.

[072] Devido ao fato do dialisado usado a jusante do dialisador tipicamente incluir mais de um fluoróforo, os espectros de absorção e emissão dos mesmos são assumidos como senso sobrepostos. Assim sendo, a anisotropia total Ages dos espectros resumidos é lida como:

onde

[073] Ages é a anisotropia dos espectros resumidos, Ai é anisotropia do iésimo fluoróforo, fi é a fração de intensidade do iésimo fluoróforo com respeito à intensidade total, Si é a intensidade total da radiação física do iésimo fluoróforo, Sges é a intensidade total da radiação física de todos os fluoróforos, Ivh,i é a intensidade de fluorescência horizontal detectada do iésimo fluoróforo,Ivv,i é a intensidade de fluorescência vertical detectada do iésimo fluoróforo, e i é o índice para todos os fluoróforos. A intensidade física total da radiação física Si de um fluoróforo é, desde que seja suficientemente diluída, proporcional a sua concentração Ci. As anisotropias Ai dos i fluoróforos são assumidas como sendo constantes conhecidas. As frações de intensidade fi têm que ser determinadas com base no espectro resumido.

[074] Conforme foi mencionado acima, apenas moléculas maiores proveem uma proporção significativa das anisotropias. Assim sendo, com base na equação (4) acima, a fração de intensidade de albumina falb pode ser calculada com base na isotropia total medida Ages, mesmo se a fração de fluorescência de albumina não puder ser determinada diretamente com base no espectro resumido:

[075] Com base nisto, a intensidade física total da radiação da albumina é dada, com base na equação (5), conforme se segue:

[076] Com base nisto, a concentração de albumina pode ser determinada conforme se segue:

onde

[077] Em que Iexc,0 é intensidade da luz de irradiação polarizada, ε é a constante de campo elétrico, À é um par de comprimentos de onda (Àexc de irradiação, Àem de emissão), c é a velocidade da luz, Φθ é a eficiência quantum, a(Àexc) é o coeficiente de absorção no comprimento de onda de irradiação Àexc, L é o percurso através da cuveta, e p é o momento de dipolo elétrico do fluoróforo excitado.

[078] A intensidade de excitação Iexc,0 pode variar ao longo do tempo e, preferencialmente, é medida on-line e corrigida. A função g(À) também pode ser vista como uma função de calibração, a qual é determinada experimentalmente com base em albumina pura ou outras soluções de referência. A função g(À) pode ser determinada, por exemplo, no lado de fabricante do respectivo aparelho.

[079] Como um aparte, a intensidade IH2O,0 das linhas de Stokes do espectro de água também pode ser determinada, de modo que, em uma operação do dispositivo, a intensidade real IH2O possa ser medida e a função de calibração g(À) possa ser ajustada para o estado real do aparelho:

[080] Com base nisto, cuvetas efetivas com tolerâncias mecânicas relativamente grandes podem ser usadas para determinação das concentrações dos fluoróforos.

[081] Se as componentes de radiação polarizada Sx e Sz forem sobrepostas por radiação isotrópica de outros fluoróforos, em particular, pela radiação isotrópica de moléculas menores as quais, conforme foi discutido acima, apenas uma influência limitada, se houver, sobre a anisotropia das intensidades de radiação medida, as componentes isotrópicas proverão o mesmo deslocamento Soffset para ambas as componentes de radiação polarizada Sx e Sz:

[082] Assim sendo, a intensidade da radiação da albumina pode ser facilmente determinada por uma subtração simples (sob a hipótese de que seja apenas a albumina humana que mostra uma anisotropia significativa):

[083] onde Ivh,i é a intensidade de fluorescência horizontal total detectada, Ivv,i é a intensidade de fluorescência vertical total detectada.

[084] A figura 5 mostra em um diagrama esquemático a concentração de albumina de soro humano (HAS) como uma função da intensidade medida da radiação de fluorescência polarizada total para misturas diferentes de HAS e triptofano livre.

[085] Os fluoróforos diferentes podem ser distinguidos com respeito aos tamanhos moleculares. Neste sentido, as considerações a seguir são de interesse:

[086] A absorção do fóton de excitação leva apenas em torno de 10-15 s. Por meio de relaxação com as vibrações de molécula, em outras palavras, por meio de conversão interna, o estado excitado S1 relaxa muito rapidamente, de forma típica em 10-12 s, para o nível de vibração mais baixo possível energeticamente, porque o tempo de vida da fluorescência está na faixa de T = 10-8 s, e, assim, substancialmente mais longo.

[087] A partir deste nível de vibração energeticamente mais baixo, o elétron excitado relaxa para o estado fundamental S0 por emissão de um fóton ou por meio de uma transição de radiação. Ambos os processos esvaziam o estado excitado S1. Assim sendo, se a amostra for excitada por meio de um impulso de excitação curto, a intensidade de fluorescência I mostrará a função de decaimento a seguir:

[088] em que t é o tempo de vida do estado excitado.

[089] Com respeito à anisotropia A, um outro mecanismo se adiciona à despolarização da intensidade, porque as moléculas rodam em torno de seus eixos geométricos, o que está relacionado à direção de emissão. Imediatamente após o impulso de excitação, todas as moléculas são sincronizadas, mas, depois deste impulso, todas difundem durante um intervalo de tempo característico, o qual é denominado o tempo de correlação de rotação θ. Para uma rotação livre de moléculas esféricas, a relação de Perrin é dada por:

[090] em que θ é o tempo de correlação de rotação, o qual é uma constante de tempo característica descrevendo o período de tempo dentro do qual os eixos geométricos dos momentos de dipolo de transição são orientados de forma difusa por meio da rotação das moléculas, e A0 é a anisotropia no tempo t = 0, antes de quaisquer efeitos de despolarização ocorrerem.

[091] Em uma excitação pulsada, o decaimento da anisotropia de acordo com a equação (14) pode ser observado de uma maneira resolvida no tempo. Com base nisto, o tempo de correlação de rotação θ - ou, por superposição de mais de um sinal d fluorescência, os tempos de correlação de rotação dos fluoróforos individuais θi - pode ser determinado, em que o tempo de correlação de rotação θ é específico para cada fluoróforo. Assim sendo, o tempo de correlação de rotação θ determinado é indicativo para os fluoróforos individuais.

[092] Quando irradiando continuamente a amostra, o valor a seguir da anisotropia Am pode ser determinado:

[093] Para o cálculo da constante de tempo de correlação θ de moléculas esféricas mais frequentemente, a correlação a seguir é usada:

[094] em que ^ representa a viscosidade do solvente a uma temperatura T [Pa*s], M é a massa molar da molécula [g/mol], R é a constante de gás geral [8,314 J/mol/K], T é a temperatura [K], v é o volume específico da molécula [ml/g], por exemplo, proteínas: 0,73 ml/g, e h é a hidratação [ml/g] (por exemplo, para proteínas: 0,32 ml/g).

[095] Para moléculas menores em solventes de viscosidade mais baixa (por exemplo, em água ou em plasma), a anisotropia decai muito rapidamente, em que, para moléculas maiores, por exemplo, proteínas, a anisotropia é mantida por um intervalo de tempo relativamente longo e pode mesmo exceder o tempo de vida de fluorescência T.

[096] Na figura 6, medições diferentes de proteínas diferentes de massa molecular diferente são mostradas, por exemplo, albumina (66 kDa), e de proteínas mais leves, tal como, por exemplo, β2m (11,7 kDa), e mesmo para moléculas menores, tal como, por exemplo, triptofano livre (< 0,5 kDa), as quais podem ser distinguidas por meio da constante de tempo de correlação θ.

[097] De acordo com a equação (15), a anisotropia média Am varia com a constante de tempo de correlação θ e, assim, com a massa molecular M, conforme pode ser tomado a partir da equação (16).

[098] Pela aplicação de temperaturas mais baixas, tal como pelo resfriamento da amostra, ou pela elevação da viscosidade por meio, por exemplo, de construção de gel ou congelamento, o tempo de vida da anisotropia pode ser prolongado.

[099] As orientações dos eixos geométricos moleculares, as quais tipicamente são distribuídas de forma estatisticamente uniforme no espaço, podem ser alinhadas por meio da aplicação de um campo elétrico ou magnético externo, o que atua no seu respectivo momento de dipolo elétrico ou magnético. Por meio desta medida, a excitação em um plano de polarização alinhado de forma ótima pode ser aumentada, de modo que a intensidade de sinal do processo possa ser melhorada. Mais ainda, a rotação livre das moléculas poderia ser prejudicada, de modo que o tempo de vida da anisotropia possa ser prolongado.

[100] Com base nisto, uma distinção clara entre as moléculas pode ser obtida.

[101] Por exemplo, para moléculas de triptofano livre, um tempo de vida de fluorescência de T = 3 ns e uma constante de tempo de correlação de θ = 50 picossegundos são providos, de modo que Am/A0 = 1,6%. Para moléculas de triptofano as quais são ligadas à albumina humana, contudo, o tempo de vida de fluorescência é t = 8 ns e a constante de tempo de correlação é θ = 41 nsec, tal que Am/A0 =83,7%.

[102] Em um dialisado usado, o espectro de anisotropia contém, em geral, uma superposição de porções de intensidade de substâncias moleculares médias diferentes e mesmo outros fluoróforos. Com base neste espectro total medido, as proporções de anisotropia das substâncias individuais precisam ser calculadas, de modo a se determinarem as concentrações individuais das substâncias individuais.

[103] Por meio do método a seguir, o espectro medido f(À) é visto como uma oposição linear dos espectros de N fluoróforos diferentes:

[104] Aqui, ci é a concentração do iésimo fluoróforo e Si (A) é a sensibilidade.

[105] Se o espectro for medido em M pares diferentes de comprimento de onda Ai (Ai,exc, Ai,em), um sistema de equações de m equações com n desconhecidas é obtido:

[106] A solução do sistema mencionado acima de equações pode ser provida, de forma mais prática, por meio de um ajuste de mínimos quadrados:

[107] Assim sendo, as concentrações cj são os coeficientes no sistema de equações lineares, em que a k- ésima concentração ck pode ser calculada por meio do determinante det(), conforme se segue:

[108] As figuras 7 e 8 mostram exemplos de uma configuração de um aparelho de medição para a realização do método. Uma fonte de luz de irradiação UV 1 é provida, a qual é usada para a provisão da luz de excitação.

[109] A fonte de luz UV 1 pode ser provida como um LED de emissão estreita, como um laser ou também como uma fonte de luz de emissão ampla, tal como uma lâmpada de Hg, Xe ou deutério, a qual então seria usada em relação com um monocromador ou qualquer outro filtro de passa banda ótico, tal como de Fabry-Perrot.

[110] A luz de excitação emitida a partir da fonte de luz 1 é focalizada por meio de um espelho de focalização 2. O espelho de focalização 2 serve para focalizar e/ou colimar a luz a partir da fonte de luz UV 1. A luz focalizada e/ou colimada então é guiada através de um polarizador 3, o qual, mais preferencialmente, é um polarizador fixo. O polarizador fixo é pretendido para a polarização da luz verticalmente (Iv). A luz polarizada verticalmente então é guiada através da cuveta 4, na qual o fluido de diálise na forma do dialisado usado flui.

[111] Uma constante de aparelho G (X) pode ser determinada no lado do fabricante por meio da rotação manual do polarizador 3 por 90°, de modo que as intensidades para a polarização vertical e a polarização horizontal possam ser medidas de forma confiável.

[112] Na cuveta 4 através da qual o dialisado usado flui, a luz de excitação polarizada impinge sobre os fluoróforos para excitá-los. A luz de fluorescência emitida a partir dos fluoróforos excitados então é guiada através de um primeiro polarizador 5 e, então - por meio de um espelho de focalização de emissão 6 - para um retículo de difração e para um detector 7, de modo a se determinar o espectro de fluorescência real.

[113] O polarizador 5 é disposto como um polarizador horizontal na figura 7. Na figura 8, um segundo polarizador 5’ está presente, o qual é disposto como um polarizador vertical.

[114] Conforme pode ser visto na comparação com a figura 8, um segmento de obturador virável 8 é provido, o qual obtura o primeiro polarizador 5 ou o segundo polarizador 5’, de modo que, por meio do segmento de obturador virável 8, a luz de fluorescência detectada pelo detector 7 possa ser selecionada entre uma polarização horizontal (como na figura 7) e uma polarização vertical (como na figura 8).

[115] Mais ainda, no percurso de emissão de luz, o primeiro polarizador horizontal 5 e o segundo polarizador vertical 5’ são construídos de forma fixa no dispositivo, de modo que as partes óticas não posam se tornar desalinhadas e a constante de aparelho G possa ser determinada de forma confiável. A vantagem dos arranjos rígidos dos polarizadores mostrados é que os componentes óticos não têm que ser movidos em operação.

[116] Assim sendo, as tolerâncias com base em rus mecânicas não estão presentes.

[117] A figura 9 sugere o uso, em um arranjo similar, de um outro segmento virável na forma de uma abertura rotativa, a qual está localizada em um percurso de derivando do lado de transmissão cada cuvete, de modo que a luz de excitação transmitida através da cuveta possa ser medida com o mesmo detector 7 que as duas luzes de fluorescência polarizadas diferentemente. Em particular, a intensidade da polarização Ivv, a intensidade da polarização Ivh, a intensidade da transmissão It, bem como a intensidade de fundo do detector de parada Id podem ser medidas com esta configuração e com um único detector 7.

[118] Na figura 10, um outro arranjo é mostrado de acordo com o qual as intensidades das duas polarizações diferentes bem com a intensidade de transmissão podem ser medidas ao mesmo tempo. Em particular, o arranjo em formato de T dos dois polarizadores 5 e 5’ com os detectores associados para a detecção das intensidades de fluorescência polarizada Ivv e Ivh, bem como um terceiro detector 9 para detecção da intensidade de transmissão It estão presentes.

[119] O polarizador vertical 5 é provido em um lado da cuveta 4 e o polarizador horizontal 5 é provido no lado oposto da cuveta 4, de modo que a luz seja acoplada fora por um lado ou em por outro lado, resultando em um arranjo em formato de T. Isto tem a vantagem de que a superfície para acoplamento da luz de fluorescência emitida para fora da cuveta 4 pode ser aumentada, de modo que a sensibilidade possa ser aumentada. Mais ainda, com o arranjo mencionado no qual a luz é acoplada fora em dois lados diferentes da cuveta através de polarizadores, os quais são orientados um com respeito ao outro a 90°, e as duas intensidades podem ser analisadas ao mesmo tempo.

[120] De modo a acoplar a luz fora da cuveta 4, janelas específicas 40 podem ser providas, de modo a se evitarem reflexões.

Claims

1. Método para monitoramento de um tratamento de sangue extracorpóreo de um paciente, o método caracterizado por incluir as etapas de: - irradiar uma amostra de um fluido de tratamento sendo usado em e considerado durante o tratamento de sangue extracorpóreo com luz de irradiação polarizada linearmente; - detectar a intensidade da luz de fluorescência emitida pela amostra do fluido no primeiro plano de polarização; - detectar a intensidade da luz de fluorescência emitida pela amostra do fluido em um segundo plano de polarização o qual é diferente do primeiro plano de polarização; - determinar a anisotropia da luz de fluorescência emitida pela amostra do fluido a partir da intensidade detectada no primeiro plano de polarização e da intensidade detectada no segundo plano de polarização; e - determinar a concentração de pelo menos um fluoróforo na amostra do fluido com base em ambas, a anisotropia determinada e a intensidade da luz de fluorescência emitida pelo fluido.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro plano de polarização e o segundo plano de polarização são orientados de modo perpendicular em relação ao outro, e a anisotropia A é determinada com base na equação a seguir:

onde Ivv é a intensidade da luz de fluorescência detectada no plano de polarização vertical, Ivh é a intensidade da luz de fluorescência detectada no plano de polarização horizontal, e G é uma constante de aparelho que compensa as diferenças nas sensibilidades do aparelho, quando da detecção das intensidades nos primeiro e segundo planos de polarização.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a intensidade da luz de fluorescência é detectada em um comprimento de onda de detecção predeterminado, quando da iluminação da amostra no fluido em um comprimento de onda de irradiação predeterminado, e a anisotropia é usada para a determinação do fluoróforo individual, e a intensidade da luz de fluorescência é usada para a determinação da concentração deste fluoróforo individual, em que preferencialmente a anisotropia de fluoróforos individuais específicos é conhecida.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as concentrações de pelo menos dois fluoróforos presentes na amostra do fluido são determinadas com base na equação a seguir da anisotropia total Ages dos espectros somados:

onde

e onde Ages é a anisotropia total dos espectros somados, Ai é a anisotropia do iésimo fluoróforo, fi é a fração de intensidade do iésimo fluoróforo com respeito à intensidade total, Si é a intensidade total da radiação física do iésimo fluoróforo, Sges é a intensidade total da radiação física de todos os fluoróforos, Ivh,i é a intensidade de fluorescência horizontal detectada do iésimo fluoróforo, Ivv,i é a intensidade de fluorescência vertical detectada do iésimo fluoróforo, e i é o índice para todos os fluoróforos, e em que a anisotropia Ai do iésimo fluoróforo é preferencialmente conhecida.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a amostra do fluido é continuamente irradiada e a detecção é continuamente realizada.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a concentração de um fluoróforo é diretamente determinada com base na anisotropia total.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a concentração de um fluoróforo é determinada diretamente com base nas intensidades vertical e horizontal da luz de fluorescência detectada.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a amostra do fluido é irradiada com uma luz de irradiação pulsada e polarizada linearmente e a detecção da luz de fluorescência nos primeiro e segundo planos de polarização é realizada de uma forma resolvida no tempo, e A = A^e"'* em que θ é o tempo de correlação de rotação, o qual é uma constante de tempo característica que descreve o período de tempo dentro do qual os eixos geométricos de momentos de dipolo de transição são orientados de forma difusa por meio da rotação das moléculas, e A0 é a anisotropia no ponto de tempo t = 0, antes dos efeitos de despolarização se aplicarem.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o tempo de correlação de rotação é variado por meio da variação da temperatura da amostra do fluido, pela variação da viscosidade da amostra do fluido e/ou pela aplicação de campos magnéticos e/ou elétricos externos.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a intensidade de fluorescência total é aumentada pelo alinhamento dos momentos de dipolo de transição da amostra do fluido pela aplicação de campos elétricos e/ou magnéticos externos.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que uma decomposição de matriz do espectro de anisotropia medido é realizada e uma comparação com espectros de anisotropia conhecidos de substâncias conhecidas é realizada, de modo a se determinar com base nas respectivas intensidades das substâncias conhecidas suas respectivas concentrações.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a concentração de albumina humana na amostra é determinada com base em uma subtração da intensidade horizontal detectada menos a intensidade vertical detectada.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o fluido usado no tratamento de sangue extracorpóreo é um fluido de diálise usado de um tratamento de diálise, hemodiálise, hemodiafiltração e/ou diálise peritoneal de um paciente, ou um ultrafiltrado de um tratamento de hemofiltração de um paciente.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que uma medição de referência é realizada em um fluido de diálise fresco em um tratamento de diálise, hemodiálise, hemodiafiltração e/ou diálise peritoneal de um paciente, usando as etapas de: - irradiar uma amostra de fluido de diálise fresco a ser usado no tratamento de sangue extracorpóreo com uma luz de irradiação polarizada linearmente; - detectar a intensidade da luz de fluorescência emitida pela amostra do fluido de diálise fresco em um primeiro plano de polarização; - detectar a intensidade da luz de fluorescência emitida pela amostra do fluido de diálise fresco em um segundo plano de polarização o qual é diferente do primeiro plano de polarização; - determinar a anisotropia da luz de fluorescência emitida pela amostra do fluido de diálise fresco; e - determinar a concentração de pelo menos um fluoróforo na amostra do fluido de diálise fresco com base em ambas a anisotropia determinada e a intensidade da luz de fluorescência emitida pelo fluido.

15. Dispositivo para o monitoramento de um tratamento de sangue extracorpóreo de um paciente, o dispositivo caracterizado por incluir uma fonte de luz de irradiação (1) para irradiar uma amostra de um fluido de tratamento usado em e considerado durante o tratamento de sangue extracorpóreo com luz polarizada linearmente, e um detector (7) para a detecção da intensidade da luz de fluorescência emitida pela amostra do fluido em um primeiro plano de polarização e em um segundo plano de polarização, o qual é diferente do primeiro plano de polarização, em que uma unidade de análise (A) está presente para a determinação da anisotropia da luz de fluorescência emitida pela amostra do fluido a partir da intensidade detectada no primeiro plano de polarização e da intensidade detectada no segundo plano de polarização e para a determinação da concentração de pelo menos um fluoróforo na amostra do fluido, com base na anisotropia determinada e na intensidade da luz de fluorescência emitida pela amostra do fluido.

16. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que pelo menos dois polarizadores (5, 5’) com planos de polarização alinhados segundo um ângulo são providos entre a amostra do fluido e um detector (7) para detecção da intensidade da luz de fluorescência, em que um obturador móvel (8) está presente no percurso de luz para alternativamente cobrir qualquer um dos dois polarizadores (5, 5’) para detectar alternativamente as intensidades da luz de fluorescência nos dois planos de polarização.

17. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que adicionalmente um obturador rotativo está presente no percurso de luz da luz transmitida da fonte de luz através da amostra do fluido, de modo que a intensidade da luz transmitida, bem como as intensidades da luz de fluorescência em pelo menos dois planos de polarização diferentes possa ser detectada por meio do detector único.

18. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o primeiro detector com um polarizador associado (5) com um primeiro plano de polarização e um segundo detector com um polarizador associado (5’) com um segundo plano de polarização diferente do primeiro plano de polarização serem dispostos em lados opostos da amostra do fluido para a detecção da luz de fluorescência de um primeiro e de um segundo plano de polarização simultaneamente.

19. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que um terceiro detector (9) está presente de forma colinear com a luz de irradiação e de modo que a amostra do fluido seja posicionada entre o detector e a fonte de luz de irradiação para a detecção da intensidade de transmissão.

20. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, caracterizado pelo fato de que o dispositivo é configurado para a execução do método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.

21. Aparelho de tratamento de sangue extracorpóreo para execução de um tratamento de sangue extracorpóreo em um paciente, preferencialmente para execução de um tratamento de diálise, hemodiálise, hemodiafiltração, hemofiltração e/ou diálise peritoneal em um paciente, caracterizado pelo fato de que um dispositivo para monitoramento do tratamento de sangue extracorpóreo do paciente, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 20, está presente.