JP6242883B2 - 患者の体外血液治療を監視する装置およびその作動方法 - Google Patents

Description

本発明は、患者の体外血液治療を監視する方法および装置に関する。好ましくは、本発明は、患者の透析治療、血液透析治療、血液透析濾過治療、血液濾過治療、および腹膜透析治療の少なくとも一つを監視する方法および装置に関する。

透析は、最も広く知られ用いられている体外血液治療法の一つである。透析は、患者の腎臓が腎不全を起こした際における腎機能の肩代わりを意図している。

腎不全が起こると、老廃物（尿素、クレアチニン、尿毒症毒素など）を血液から除去するために患者の透析が必要である。さらに、透析中においては、通常は尿により除去される過剰水などの物質が、患者の身体から除去される。最も広く用いられている透析法は、血液透析である。血液透析においては、患者の血液が透析膜に沿って流れ、当該透析膜の逆側には透析液が供給される。よって、血液と透析液は、多孔質膜によって隔てられる。

血液と透析液の濃度勾配により、患者の血液から除去される物質が、この膜を通じて拡散する。膜の血液側から透析液側への液流によって、拡散速度が非常に遅い大分子も対流により運ばれる。

透析液は、特定の物質について（全ての物質である必要はない）血液側から透析液側へ濃度勾配を生じるような濃度に調製される。尿素やクレアチニンのような体内老廃物の除去は確かに望まれるが、例えば、電解質（カリウム、ナトリウム、重炭酸塩など）の除去や濃度変化は全く望まれておらず、むしろ有害である。よって、透析液は、これらの物質については濃度勾配を生じないように、血漿内の電解質濃度と同程度の濃度で電解質を含んでいることが普通である。

血液透析以外では、腹膜透析もまた、膜と透析液を用い、当該膜を通じて老廃物を透析液へ拡散させる透析法である。しかしながら、当該膜は生体膜（腹膜）であり、透析液は腹腔へ直接導入される。

透析中においては、過剰水と小分子尿毒性物質（尿素やクレアチニンなど）の除去は特に問題ない。しかしながら、大分子は多孔質膜を通じて除去することがより難しい。これに対処するため、特定のハイフラックス透析膜が、血液透析濾過のような高対流法と組み合わせて用いられる。これにより、分子量が１ｋＤａを超える分子（いわゆる中分子の範囲）の除去性が向上する。血液透析濾過においては、上述のように構成された透析液を用いる拡散法が、血液濾過と組み合わされる。血液濾過においては、患者の血液はフィルタ前後の圧力勾配に供される。圧力勾配により高い流量で濾過処理がなされるため、中分子のかなりの部分を除去できる高対流法とみなされうる。しかしながら、圧力勾配により、水分のみならず電解質と糖分も高い割合で患者の血液から除去される。これにより、これらの血液成分が補液の注入により補給される必要がある。

ハイフラックス透析液を高対流法と組み合わせて用いることにより、中分子と大分子の除去性が向上する。

大分子とは、訳１１ｋＤａの大きさを有するβ２ミクログロブリンなどのタンパク質を指すことが一般的である。この分子が十分に除去されないと、アミロイド症を引き起こすことがある。有毒な小分子がタンパク質と結合している場合、当該小分子を除去することも難しい。タンパク質と結合した尿毒症毒素の例としては、ｐ−クレシル硫酸やインドキシル硫酸が挙げられる。

よって、透析膜孔のサイズは、これらの中分子が通過するのに十分な大きさを有することが求められる。他方、膜孔のサイズを大きくするほど血液成分が失われやすいというリスクがあるため、膜孔のサイズは無限に大きくできるわけではない。よって、膜の透過性は、６０ｋＤａ程度のサイズに限定されることが一般的である。しかしながら、この値は、人間の血漿アルブミンの分子量（６６ｋＤａ程度）をわずかに下回る。実際には、臨床的に顕著な血漿の損失が生じうる。当該損失は、治療法に係る各パラメータ（圧力や透析液の濃度など）に顕著に依存する。特に、血液濾過中に加えられる圧力勾配にハイフラックス膜を組み合わせると、ヒト血漿のクリアランスが増加する。ヒト血漿損失の別要因としては、膜の複数回利用が考えられる。治療を終えるごとに必要な膜の清掃は、膜の孔のサイズを大きくしがちであり、より大きな分子が膜を通過可能になるからである。したがって、通常の血液透析における通常の状態においても、ヒト血清アルブミンは、膜を通過しうる。

腹膜透析の場合、膜孔のサイズが外部要因の影響を受けないが、各患者の腹膜の状態により定まることは言うまでもない。

透析中における被分析物のクリアランスを特定するためのラマン分光法が、特許文献１に開示されている。当該方法においては、少なくとも一つの被分析物（尿素など）に固有のラマン分光的特徴を利用して血液全体に含まれる当該被分析物の特定および定量を行なうために、透析器を通過した血液のラマンスペクトル測定が行なわれる。

特許文献２は、体外血液治療用の装置に関する。当該装置においては、Ｋｔ／Ｖ値を特定するために透析液における電磁放射吸収が測定される。ここで、Ｋは除去物質のクリアランス（体積流量）であり、ｔは透析時間であり、Ｖは患者の体内分布容積である。腎代替療法においては、治療効率を測定するための指標物質として尿素が用いられることが一般的である。すなわち、Ｋは尿酸のクリアランスである。Ｖは患者の尿素体内分布容積であり、原則として、患者の体液に対応している。しかしながら、総吸収を測定することによっては、特定の分子についてのクリアランスを特定できないことが一般的である。

したがって、透析治療中におけるヒトアルブミンの損失を監視し、医療従事者に当該事態を警告することが望まれている。これにより、治療が調節され、あるいは自動調節がなされ、アルブミンの過剰損失時には治療が中断されうる。

また、上述の中分子のようなタンパク質（サイズが６６ｋＤａ未満のタンパク質）だけでなく、さらに分子量が小さい物質（ｐ−クレシル硫酸、インドキシル硫酸、フェニルなど）のクリアランスが特定されるべきである。これらは毒性を有するからである。

米国特許出願公開２００８／０１５８５４４Ａ１号公報 国際公開２０１０／０９１８２６Ａ１号公報

したがって、本発明の目的は、患者の体外血液治療を監視する方法および装置を提供することである。

上記の目的は、請求項１に係る方法によって達成される。有利な実施形態は、各従属請求項より得られる。

すなわち、上記の患者の体外血液治療を監視する方法、好ましくは透析治療、血液透析治療、血液透析濾過治療、血液濾過治療、および腹膜透析治療の少なくとも一つを監視する方法は、
前記体外血液治療に使用された液体試料に直線偏光された光を照射するステップと、
前記液体試料から放出される蛍光の第一偏光面における強度の検出を行なうステップと、
前記液体試料から放出される蛍光の前記第一偏光面とは異なる第二偏光面における強度の検出を行なうステップと、
前記液体試料から放出される前記蛍光の異方性を特定するステップと、
前記液体試料に係る前記異方性と前記強度の双方に基づいて、前記液体試料内における少なくとも一つの蛍光色素分子の濃度を特定するステップと、
を含んでいる。

測定された異方性と変更蛍光の強度に基づいて液体試料内における各蛍光色素分子の濃度を特定することにより、液体試料内における複数の蛍光活性物質の蛍光信号同士を区別できる。異方性は蛍光色素分子ごとに異なるため、液体試料内における各蛍光色素分子の異方性を用いれば、各蛍光色素分子の濃度を特定可能となる。

前記体外血液治療に使用された前記液体は、透析治療、血液透析治療、血液透析濾過治療、および腹膜透析治療の少なくとも一つにおける使用済み透析液、あるいは血液濾過治療における限外濾過液でありうる。

蛍光分光法の変形であるこの方法により、対流透析治療のパフォーマンスが、治療中にオンラインで特定されうる。特定の分子のクリアランスがある限界を下回ると、あるいはヒトアルブミンのような物質が許容量を超えて患者の血漿から除去されると、治療装置による治療プロセスの自動的調整と、アラーム出力の少なくとも一方が行なわれうる。

好ましくは、前記第一偏光面と前記第二偏光面は、互いに直交する向きとされており、前記異方性（Ａ）は、次式に基づいて特定される。
Ｉ_ｖｖは、垂直偏光面で検出される蛍光の強度である。Ｉ_ｖｈは、水平偏向面で検出される蛍光の強度である。Ｇは、前記第一偏光面と前記第二偏光面で前記強度を検出する際における装置の感度差を補償するための装置定数である。
異なる蛍光色素分子は異なる異方性を示すため、蛍光色素分子を正確に特定するために異方性が用いられうる。

さらに好ましい実施形態においては、前記液体試料が所定の照射波長で照明される場合、前記強度は、所定の検出波長において検出される。前記異方性は、蛍光色素分子を個々に特定するために用いられる。前記強度は、当該蛍光色素分子の濃度を特定するために用いられる。特定の蛍光色素分子の異方性は、既知であることが好ましい。

好ましくは、 前記液体試料中に存在する少なくとも二つの蛍光色素分子の濃度は、総和スペクトルの前異方性（Ａ_ｇｅｓ）についての次式に基づいて特定される。
Ａ_ｇｅｓは、総和スペクトルの全異方性である。Ａ_ｉは、ｉ番目の蛍光色素分子の異方性である。ｆ_ｉは、総強度に対するｉ番目の蛍光色素分子の強度比である。Ｓ_ｉは、ｉ番目の蛍光色素分子による物理放射の総強度である。Ｓ_ｇｅｓは、全ての蛍光色素分子による物理放射の総強度である。Ｉ_ｖｈ，ｉは、ｉ番目の蛍光色素分子の水平蛍光強度の測定値である。Ｉ_ｖｖ，ｉは、ｉ番目の蛍光色素分子の垂直蛍光強度の測定値であり、ｉ番目の蛍光色素分子の異方性Ａ_ｉは、既知であることが好ましい。
これにより、検出された蛍光に基づいて、液体試料内における少なくとも二つの蛍光色素分子の濃度が特定可能となる。すなわち、液体試料（透析液や限外濾過液など）内における異なる蛍光色素分子を区別可能となる。

さらに、前記液体試料は連続的に照射され、前記検出は連続的に行なわれることが好ましい。この手法により、異なる液体試料の濃度変化が容易に観測されうる。「連続」という語は、患者の体外血液治療中における測定プロセスの短い中断（体外血液治療装置の設定作業や調節作業など）を含みうる意味である。

好ましくは、前記濃度は、前記全異方性に基づいて直接的に特定される。アルブミンの濃度は、前記全異方性に基づいて特定されることが好ましい。
この方法は、全異方性に対する蛍光の寄与が顕著である場合に特に有用である。

好ましい実施形態においては、前記濃度、好ましくはヒトアルブミンの濃度は、前記蛍光の垂直強度と水平強度に基づいて直接的に特定される。
この方法も、全異方性に対する蛍光の寄与が顕著である場合に特に適している。この方法に基づくことにより、前記濃度の特定の遂行が非常に容易である。

さらに好ましい実施形態においては、前記液体試料はパルス的に照射され、前記第一偏光面および前記第二偏光面における前記検出は、時間分解的に行なわれる。この場合、前記異方性は、次式に基づいて特定される。
θは、回転相関時間であり、分子の回転によって遷移ダイポールモーメントの軸が拡散的に揃う時間を記述する特徴的な時定数である。Ａ_０は、偏光解消減少が起こる前の、時刻ｔ＝０における異方性である。

好ましくは、前記回転相関時間θの挙動に基づいて蛍光色素分子をさらに特定するために、前記回転相関時間θは、前記液体試料の温度の変更、前記液体試料の粘度の変更、および外部磁場と外部電場の少なくとも一方の印加の少なくとも一つにより変更される。

さらに好ましい方法においては、外部磁場と外部電場の少なくとも一方を印加して前記液体試料の遷移ダイポールモーメントの向きを揃えることにより、総蛍光強度が増加される。
外部場の印加は、検出強度の増加を助け、ＳＮ比を向上させる。

好ましくは、測定された異方性スペクトルの行列分解が行なわれ、既知の物質についての既知の異方性スペクトルとの比較が行なわれることにより、当該既知の物質の強度に基づいて前記濃度が特定される。
これにより、液体試料の実際の組成に基づいて蛍光スペクトルが複雑に重畳していても、分析が可能となる。

透析治療、血液透析治療、血液透析濾過治療、および腹膜透析治療の少なくとも一つに用いられる新鮮な透析液に対して基準測定が行なわれることが好ましい。これにより、初期透析液の汚染が使用済み透析液から得られる結果に及ぼす影響が排除されうる。
前記基準測定は、
前記新鮮な透析液を、直線偏光された照射光で照射するステップと、
前記新鮮な透析液から放出される蛍光の第一偏光面における強度の検出を行なうステップと、
前記新鮮な透析液から放出される蛍光の前記第一偏光面とは異なる第二偏光面における強度の検出を行なうステップと、
前記新鮮な透析液から放出される蛍光の異方性を特定するステップと、
前記新鮮な透析液に係る前記異方性と前記強度の双方に基づいて、前記新鮮な透析液内における少なくとも一つの蛍光色素分子の濃度を特定するステップと、
を含んでいる。

別の好ましい方法においては、前記液体試料におけるヒトアルブミンの濃度が、前記水平強度と前記垂直強度の差に基づいて特定される。

上述の課題は、請求項１５に記載の特徴を有する装置によっても達成される。有利な実施形態は、従属請求項に記載されている。

すなわち、患者の体外血液治療を監視する装置、好ましくは透析治療、血液透析治療、血液透析濾過治療、血液濾過治療、および腹膜透析治療の少なくとも一つを監視する装置は、
前記体外血液治療に使用された液体試料に直線偏光された光を照射する光源と、
前記液体試料から放出される蛍光の第一偏光面における強度、および当該液体試料から放出される蛍光の当該第一偏光面とは異なる第二偏光面における強度を検出する検出器と、
前記液体試料から放出される前記蛍光の異方性を特定し、前記液体試料に係る前記異方性と前記強度に基づいて、前記液体試料内における少なくとも一つの蛍光色素分子の濃度を特定する分析ユニットと、
を備えている。

好ましくは、偏光面が角度を成すようにされた少なくとも二つの偏光器が、前記液体試料と前記検出器の間に設けられており、前記少なくとも二つの偏光器を交互に覆い、前記第一偏光面と前記第二偏光面における前記強度を交互に検出するために、光路上に可動シャッタが設けられている。
二つの偏光器を設けることにより、光学部品の移動を回避し、信頼性の高い測定を可能にする構成が得られる。

好ましくは、前記光源から前記液体試料を通過する透過光の経路上に回転可能なシャッタが設けられうる。これにより、前記透過光の強度と少なくとも二つの偏光面における前記蛍光の強度が、単一の検出器により検出されうる。

あるいは、第一偏光面を有する偏光器と対応付けられた第一検出器と、当該第一偏光面とは異なる第二偏光面を有する偏光器と対応付けられた第二検出器とが、当該第一偏光面と当該第二偏光面における前記蛍光の強度を同時に検出するために、前記液体試料を挟んで反対側に配置される。

好ましくは、前記直線偏光された光の照射方向に第三検出器が設けられる。前記第三検出器は、前記光源から照射され、前記液体試料を透過した光の強度を検出する。

前記装置は、前述の方法を実行するように構成されることが好ましい。

本開示の内容は、以下に列挙する添付の図面と併せて以下の詳細な説明を参酌することによって、より容易に理解されるであろう。

分子のダイポールモーメントおよび当該分子の遷移ダイポールモーメントを示す模式図である。 使用済み透析液における蛍光色素分子の異方性を特定するための実験設備を示す模式図である。 異なる分子（ヒトアルブミンとトリプトファン）の異方性スペクトルを示す模式図である。 提案する方法を実行する装置を示す模式図である。 ヒトアルブミンの濃度を全偏光蛍光強度の測定値の関数として示す模式図である。 分子量の異なるタンパク質の相関時定数を示す模式図である。 紫外光下の異方性を測定するための実験設備（偏光強度が水平面内で測定される）を示す模式図である。 図７に対応するが異なる偏光器を用いる設備（偏光強度が垂直面内で測定される）を示す模式図である。 紫外光下の異方性を測定するための実験設備の別例を示す図である。 紫外光下の異方性を測定するための実験設備のさらなる別例を示す図である。

図面を参照しつつ、本発明について以下詳細に説明する。同一の参照番号は、同様または同一の構成要素を指すために用いられる。また、異なる実施形態においては、冗長性を避けるために、繰り返しとなる説明は省略する。

本発明の目的は、体外血液治療において特定の分子のクリアランスを監視することである。また、ヒトアルブミンのように重要な分子が過剰に除去されないようにすることである。

以下、透析治療に基づく方法について詳しく説明する。しかしながら、当該方法は、透析治療のみに限ることを意図したものではなく、あらゆる体外血液治療（例えば血液透析治療、血液透析濾過治療、血液濾過治療、および腹膜透析治療の少なくとも一つ）を監視するために用いられることを意図している。

この目的を達成するために、アルブミンの濃度に加え、中分子の一部（すなわち、分子量が６６ｋＤａ未満のタンパク質）が個別に測定可能であることを要する。また、使用済み透析液には別の小分子物質（インドキシル硫酸、ｐ−クレゾール、フェノールなど）が存在しており、それらは蛍光活性である。

残念ながら、病理解析的に関心のある各蛍光色素分子の発光スペクトルは、特定の照射波長について大きく重なっており、また、同一の紫外域に存在している。この不都合に加え、前述した分子の蛍光スペクトルは比較的広いため、測定されたスペクトルのデコンボリューションが困難であるか、遂行できたとしても大きな測定誤差を伴う。したがって、一般的な蛍光分光法に基づくと、透析液における各物質の正確な濃度や正確な比率を求めることができない。すなわち、濃度の定量的特定を信頼性高く行なうことができない。

本発明により提案される異方性を用いることによって、この問題が解消されうる。当該事実に関連する効果は、フォトセレクションと称されている。これによれば、試料を直線偏光で励起すると発する蛍光は異方性を示す。

一般に、原子や分子が光子を電子的に吸収すると、電子は、より高い原子あるいは分子軌道に励起される。この電子構造の遷移により、新たな電荷の空間分布が現れ、吸収を行なう原子や分子の電子ダイポールモーメントが変化することが普通である。

遷移ダイポールモーメントは、各原子や分子の基底状態と励起状態間における遷移に対応付けられた電子ダイポールモーメントにより定義される。遷移ダイポールモーメントのベクトルの向きは、遷移の偏光面に対応する。遷移の偏光面は、ある偏光の電磁波と分子がどのように相互作用するかを定める。遷移ダイポールモーメントの大きさの２乗は、分子内の電荷分布に基づく相互作用の強度である。

図１は、励起エネルギー場ベクトルｐ_ｇ→ａによる分子の励起によって、各分子が基底状態ｐ_ｇの電子ダイポールモーメントから励起状態ｐ_ａに励起されたときの遷移ダイポールモーメントｐ_ａ→ｇを簡略化して示したものである。また、遷移ダイポールモーメントｐ_ａ→ｇを介して励起状態から基底状態に緩和する前に、分子の多くは内部プロセス（一般に分子の振動プロセスによる、いわゆる内部転換）によって分子が緩和する旨が示されている。内部緩和プロセスにより、遷移ダイポールモーメントｐ_ａ→ｇのベクトルは、励起ベクトルｐ_ｇ→ａに対して角度αだけシフトすることが一般的である。

遷移ダイポールモーメントは、各分子の構造により定められ、分子とともに移動するが、相対アライメントは分子に対して固定されたままである。

容易に理解されうるように、吸収の確率は、ある電磁波の偏光方向（より正確には場のベクトル）が遷移ダイポールモーメントｐ_ａ→ｇと揃ったときに最も高くなる。よって、直線偏光が透析液試料中の分子の励起に用いられると、当該直線偏光による分子の励起確率は、向きが揃う条件を偶然満たす分子にとっては最も高くなる。このプロセスは、フォトセレクションと称される。照射光の偏光面に対して偶然に特定の位置関係に配置された分子が励起されるからである。

また、遷移ダイポールモーメントｐ_ａ→ｇの向きは、光子の放出によって励起状態から基底状態への遷移がなされたとき（例えばフォノンの放出など、光子の放出を伴わない緩和も可能であることは勿論である）に発せられる蛍光の偏光を定める。ダイポール放射は、ダイポールモーメントの軸に対して対称に伝播する。その強さは、ダイポール軸に直交する向きにおいて最大となり、ダイポール軸と平行な向きにおいて消失する。

したがって、放出される蛍光は、偏光かつ異方性である。

図２は、励起光に加えて放出光を測定するための構成を模式的に示している。励起光は、光源Ｌにより出射され、第一偏光子によって、電場ベクトルが励起光線および放出光線が位置する平面と直交するような偏光とされる。

検出器Ｄの側には、第二偏光子が設けられている。第二偏光子は、回転可能とされている。第二偏光子は、放出された蛍光のみが通過するように配置されている。励起光が検出器に影響を与えることを避けるため、当該励起光の向きと試料に対して検出器Ｄが配置されている向きとは、互いに直交していることが好ましい。

第二偏光子を回転することにより、検出器Ｄによって強度Ｉ_ｖｖ（垂直強度）と強度Ｉ_ｖｈ（水平強度）が検出されうる。強度差Ｉ_ｖｖ−Ｉ_ｖｈは、検出器Ｄにより受光される光の偏光の尺度である。偏光Ｐと異方性Ａは、次式のように定められうる。

Ｉ_ｖｈは、水平偏向光のみが通過できるように第二偏光子が回転されたときに検出される蛍光強度である。Ｉ_ｖｖは、垂直偏向光のみが通過できるように第二偏光子が回転されたときに検出される蛍光強度である。Ｇは、水平面と垂直面について潜在的に存在する装置システムの感度差を補償するための装置定数である。Ｇは、実験的に定められ、当該システムのソフトウェアに定数として入力されうる。また、定数Ｇは、水平偏光された励起光を用いる際には水平偏光子を通過する光の強度を測定することにより、垂直偏光された励起光を用いる際には垂直偏光子を通過する光の強度を測定することにより、オンラインで測定されうる。そして、装置定数は、Ｇ＝Ｉ_ｈｖ／Ｉ_ｈｈにより求められる。Ｉ_ｖｖ＋２ＧＩ_ｖｈは、全角度Ω＝４πにわたって全放出パワーが異方的に放出される場合における、平均放出強度である。

式（１）と（２）から解るように、偏光Ｐと異方性Ａは、相互に代入されうる。

異方性Ａは、−０．２＜Ａ_０ ＜０．４の範囲をとる。最大値０．４は、吸収の遷移ダイポールモーメントと放出の遷移ダイポールモーメントの向きが揃い、偏光を解消させる他の影響が存在しない場合に対応している。すなわち、α＝０°に対応している。しかしながら、現実には、吸収の遷移ダイポールモーメントと放出の遷移ダイポールモーメントの向きは揃わず、角度αが値を持つことが普通である。よって、検出される異方性は、次式で表される。

α＝０°の場合、すなわち、吸収の遷移ダイポールモーメントと放出の遷移ダイポールモーメントの向きが揃っている場合、Ａ_０＝０．４となる。α＝９０°の場合、Ａ_０の値は−０．２となる。いわゆるマジック角であるα＝５４．７°の場合、異方性は観測されない。

遷移ダイポールモーメントの向きは吸収帯に依存して変化するため、角度αとこれに伴うＡ_０異方性もまた、励起波長λ_ｅｘｃと放出波長λ_ｅｍに応じて可変である。異方性の波長依存性Ａ_０（λ_ｅｘｃ、λ_ｅｍ）は、各蛍光色素分子について固有であり、図３において非常に模式的に示されている。

具体的には、図３における上のグラフは、励起波長λ_ｅｘｃ＝２７５ｎｍにおけるヒトアルブミン、ウシアルブミン、および純アルブミンの異方性スペクトルを示している。同図から明らかなように、放出波長λ_ｅｍが２９０ｎｍから４００ｎｍの間で変化すると、異方性が０．２から０．１の間で変化する。

図３における下のグラフは、ヒトアルブミン（６６．５ｋＤａ）、アミノ酸トリプトファン（２０４ｋＤａ）、両物質の混合物、およびインドキシル硫酸の異方性スペクトルを示している。同図においても、異方性の波長依存性Ａ_０（λ_ｅｘｃ、λ_ｅｍ）が各蛍光色素分子に固有であることが明らかである。

さらに、異方性の波長依存性Ａ_０（λ_ｅｘｃ、λ_ｅｍ）は、外部要因（温度、媒質の速度、各蛍光色素分子の別媒質への結合など）に影響される。この現象は、図３における下のグラフを分析することにより確認されうる。すなわち、トリプトファンの異方性の波長依存性は、トリプトファンとヒトアルブミンの結合体におけるそれとは大きく異なっている。

使用済み透析液については、比較的大きな回転相関時定数θ（後に詳述）に起因して大分子のみが顕著な異方性を呈することが重要である。使用済み透析液においては、タンパク質、特にアルブミンが、このような特性を示すものとして代表的である。より小さな蛍光色素分子は、Ｉ_ｖｖとＩ_ｖｈのみに異方的に偏った分布の強度を示す。したがって、このような特有の異方性は、Ａ_ｊ＝０となる。よって、この知見に基づくと、アルブミンの強度比は、全異方性Ａ_ｇｅｓに基づいて求められうる。全異方性Ａ_ｇｅｓは、透析液中に存在して異方性にのみ寄与すると予想される他の蛍光色素分子によりもたらされる。

図４は、本方法と組み合わせて使用されうる測定配置を模式的に示している。具体的には、光源Ｌが用いられる。光源Ｌからの光は、レンズによってコリメートおよび集光される。励起光は、偏光子Ｐ_ｅｘｃによって偏光とされる。偏光とされ、コリメートされ、集光された励起光は、キュベットＣへ向けられ、光源Ｌの変化する強度を調節するために、フォトダイオードＤによって測定される。

キュベットＣ内の蛍光色素分子から放出された蛍光は、光源Ｌからの出射光が当該蛍光に干渉しない角度において抽出される。当該蛍光は、向きを調節可能な第二偏光子Ｐ_ｅｍを通過させられる。そして、偏光蛍光は、回折格子Ｇに入射し、分析ユニットＡにおいて蛍光の全スペクトルが分析されうるように、ＣＣＤセンサへ反射される。その結果は、ディスプレイに表示されうる。

ダイアライザの下流における使用済み透析液は、複数の蛍光色素分子を含んでいることが普通である。それらの吸収スペクトルと放出スペクトルは、重畳していると想定される。よって、総和スペクトルの全異方性Ａ_ｇｅｓは、次式で表される。

Ａ_ｇｅｓは、総和スペクトルの全異方性である。Ａ_ｉは、ｉ番目の蛍光色素分子の異方性である。ｆ_ｉは、総強度に対するｉ番目の蛍光色素分子の強度比である。Ｓ_ｉは、ｉ番目の蛍光色素分子による物理放射の総強度である。Ｓ_ｇｅｓは、全ての蛍光色素分子による物理放射の総強度である。Ｉ_vh,iは、ｉ番目の蛍光色素分子の水平蛍光強度の測定値である。Ｉ_vv,iは、ｉ番目の蛍光色素分子の垂直蛍光強度の測定値である。ｉは、全ての蛍光色素分子を区別するための添え字である。

ある蛍光色素分子の物理放射の総強度Ｓ_ｉは、充分に希釈されている場合において、その濃度Ｃ_ｉに比例する。ｉ番目の蛍光色素分子の異方性Ａ_ｉは、定数とみなされる。強度比ｆ_ｉは、総和スペクトルに基づいて求められることを要する。

上述のように、大分子のみが異方性の顕著な比例関係を示す。よって、上式（４）に基づくと、アルブミンの強度比ｆ_ａｌｂは、アルブミンの蛍光比が総和スペクトルに基づいて直接求められ得ない場合でも、測定された全異方性Ａ_ｇｅｓに基づいて計算されうる。

よって、アルブミンの放射の総物理強度は、式（５）に基づいて次式で与えられる。

したがって、アルブミンの濃度は、次式で与えられる。

Ｉ_exc,0は、偏光された照射光の強度である。εは、電場定数である。λは、波長である（λ_ｅｘｃは照射、λ_ｅｍは放出）。ｃは、光速である。Φ_ｅは、量子効率である。α（λ_ｅｘｃ）は、照射波長λ_ｅｘｃにおける吸収係数である。Ｌは、キュベットを通過する経路長である。ｐは、励起された蛍光色素分子の電気ダイポールモーメントである。

励起強度Ｉ_exc,0は、時間変化しうる。励起強度Ｉ_exc,0は、オンラインで測定され、補正されることが好ましい。関数ｇ（λ）は、純アルブミンなどの標準液に基づいて実験的に求められた較正関数ともみなされうる。関数ｇ（λ）は、例えば、各装置の製造者側で定められうる。

また、装置の動作中には実際の強度Ｉ_Ｈ２Ｏが測定され、較正関数ｇ（λ）が次式に基づいて装置の実状態に調整されうるように、水のスペクトルのストローク線の強度Ｉ_H2O,0も求められうる。

これにより、機械公差が比較的大きい安価なキュベットが蛍光色素分子の濃度特定に用いられうる。

偏光放射成分Ｓ_ｘとＳ_ｚが他の蛍光色素分子の異方性放射と重畳している場合、具体的には、小分子の異方性放射が、前述のように測定される放射強度の異方性に非常に限られた影響を及ぼす場合、異方性成分は、両偏光放射成分Ｓ_ｘとＳ_ｚに対して同じオフセットＳ_offsetをもたらす。

よって、アルブミンの放射強度は、簡単な代入により容易に求められうる（ヒトアルブミンのみが顕著な異方性を示すという前提に基づいている）。

Ｉ_ｖｈ，ｉは、検出された水平蛍光の総強度である。Ｉ_ｖｖ，ｉは、検出された垂直蛍光の総強度である。

図５は、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）と遊離トリプトファンの複数の混合物について、ＨＡＳの濃度を、全偏光蛍光放射の強度測定値の関数として模式的に示している。

異なる蛍光色素分子は、分子量で区別されうる。したがって、以下に示す内容が考察の対象となる。

励起光子の吸収には、約１０^−１５秒しか要しない。分子振動に伴う緩和（すなわち内部変換）によって、励起状態Ｓ_１は、エネルギー的に取りうる最低振動レベルまで非常に速く（通常は１０^−１２秒以内）緩和する。蛍光色素分子の寿命はτ＝１０^−８秒の範囲であり、かなり長いからである。

励起された電子は、光子の放出か放射遷移のいずれかによって、このエネルギー的に最低の振動レベルから基底状態Ｓ_０へ緩和する。両過程は、励起状態Ｓ_１を減少させる。よって、試料が短励起インパルスによって励起されると、蛍光強度Ｉは、次式の崩壊関数を示す。τは、励起状態の寿命である。

異方性Ａについては、強度の偏光解消に別メカニズムが加わる。分子は自身の軸を中心に回転しているからであり、放出の方向に関係する。励起インパルスの直後には全ての分子は同期されるが、その後、全ての分子は、ある特徴的な時間内に拡散する。当該時間は、回転相関時間θと称される。球状分子の自由回転については、ぺランの関係式が与えられている。

θは、回転相関時間であり、分子の回転によって遷移ダイポールモーメントの軸が拡散的に揃う時間を記述する特徴的な時定数である。Ａ_０は、偏光解消減少が起こる前の、時刻ｔ＝０における異方性である。

パルス励起時においては、式（１４）に基づく異方性の崩壊が、時間分解的に観測されうる。これにより、回転相関時間θ、または複数の蛍光信号が重畳する場合における各蛍光色素分子の回転相関時間θ_ｉが求められうる。回転相関時間θは、各蛍光色素分子に固有の値である。よって、求められた回転相関時間θは、個々の蛍光色素分子を指し示す。

試料を連続的に照射すると、異方性Ａ_ｍの値が、以下のように求められうる。

球状分子の相関時間定数θを計算するにあたっては、次式の相関がより頻繁に用いられる。

ηは、温度Ｔにおける溶媒の粘度［Ｐａ・ｓ］である。Ｍは、分子のモル質量［ｇ／ｍｏｌ］である。Ｒは、一般ガス定数（８３１４［Ｊ／ｍｏｌ／Ｋ］）である。Ｔは、温度［Ｋ］である。νは、分子の比体積［ｍｌ／ｇ］（例えば、タンパク質は０．７３ｍｌ／ｇ）である。ｈは、ハイドレーション［ｍｌ／ｇ］（例えば、タンパク質は０．３２ｍｌ／ｇ）である。

低粘度溶媒（例えば水や血漿）中の小分子の場合、異方性の崩壊は非常に速い。例えばタンパク質のような大分子の場合、異方性は比較的長い時間維持され、蛍光の寿命τを上回ることもある。

図６には、別の分子量を有する別タンパク質についての別測定結果が示されている。例えば、６６ｋＤａのアルブミン、より軽いタンパク質の一例として１１．７ｋＤａのβ２ｍ、さらに小さな分子の一例として０．５ｋＤａ未満の遊離トリプトファンが示されている。これらは、相関時定数θによって区別されうる。

式（１５）によれば、平均異方性Ａ_ｍは、相関時定数θと共に変化する。よって、式（１６）より解るように、平均異方性Ａ_ｍは、分子量Ｍと共に変化する。

試料を冷却するなどして低温度にすることにより、あるいは、ゲル形成やフリージングによって粘度を上げることにより、異方性の寿命は延長されうる。

統計的には空間内で均一に分布していることが一般的である分子軸の方向は、各分子の電気または磁気ダイポールモーメントに作用する電場または磁場を外部から印加することにより、揃えられうる。この手法によれば、最適に揃えられた偏光面における励起が増加されうる。これにより、処理における信号強度が改善されうる。さらに、分子の自由回転が抑制されることにより、異方性の寿命が延長されうる。

これにより、分子同士の明確な区別が達成されうる。

例えば、遊離トリプトファン分子の場合、蛍光寿命τは３ナノ秒であり、相関時定数θは５０ピコ秒であるため、Ａ_ｍ／Ａ_０＝１．６％となる。ヒトアルブミンに結合したトリプトファン分子の場合、蛍光寿命τは８ナノ秒であり、相関時定数θは４１ナノ秒であるため、Ａ_ｍ／Ａ_０＝８３．７％となる。

使用済み透析液においては、異方性スペクトルは、異なる中分子物質だけでなく別の蛍光分子による強度部分の重畳を含むことが一般的である。この測定された総和スペクトルに基づいて、各物質の濃度をそれぞれ求めるために、各物質の異方性の割合を計算することが必要とされる。

以下の方法によって、測定されたスペクトルｆ（λ）は、Ｎ個の異なる蛍光色素分子のスペクトルの線形重ね合わせとみなされる。次式において、ｃ_ｉは、ｉ番目の蛍光分子の濃度である。Ｓ_ｉ（λ）は、ｉ番目の蛍光分子の感度である。

Ｍ個の異なる波長ペアλ_ｉ（λ_i,exc、λ_i,em）を用いてスペクトルが測定された場合、ｎ個の未知数を含むｍ個の方程式からなる方程式系が得られる。

上記方程式系の解は、最も実用的には、最小二乗法により与えられうる。

これにより、濃度ｃ_ｊは、線形方程式系における係数となり、ｋ番目の濃度ｃ_ｋは、行列式ｄｅｔ（）を用いて次式により計算されうる。

図７と図８は、上記の方法を実現するための測定装置の配置例を示している。紫外光源１は、励起光を供給するために設けられている。紫外光源１は、狭配光ＬＥＤ、レーザ、広配光の光源（ハロゲンランプ、キセノンランプ、重水素ランプなど）として提供されうる。紫外光源１は、モノクロメータやファブリペローフィルタのような光学バンドパスフィルタと組み合わせて用いられうる。

紫外光源１から出射された励起光は、集光ミラー２によって集光される。集光ミラー２は、紫外光源１からの光を集光やコリメートするものである。集光やコリメートされた光は、偏光子３（固定偏光子が最適）を通過するように案内される。固定偏光子は、垂直偏光（Ｉ_ｖ）を得るように構成されている。垂直偏光は、キュベット４を通過するように案内される。キュベット４内には、使用済み透析液が流れる。

装置定数Ｇ（λ）は、垂直偏光と水平偏光の強度が確実に測定されうるように偏光子３を手で９０度回転させることによって、製造者側で決定されうる。

使用済み透析液が流れるキュベット４内では、偏光された励起光が蛍光色素分子に衝突してこれを励起する。励起された蛍光色素分子から放出された蛍光は、第一偏光子５を通過するように案内され、次いで放出側集光ミラー６によって回折格子へと案内され、実際の蛍光スペクトルを求めるために検出器７へと案内される。

図７において、第一偏光子５は、水平偏光子とされている。図８においては、垂直偏光子とされた第二偏光子５’が配置されている。

図８との比較から判るように、回転可能な遮蔽部８が設けられている。遮蔽部８は、第一偏光子５と第二偏光子５’のいずれかを遮蔽する。これにより、検出器７により検出される蛍光は、水平偏光（図７の場合）と垂直偏光（図８の場合）の間で選択可能とされうる。

さらに、放出光路において、第一水平偏光子５と第二垂直偏光子５’は、装置に内蔵および固定されている。これにより、光学部品が位置ずれを起こさず、装置定数Ｇが確実に求められうる。これら偏光子が堅固に配置されることにより、装置の稼働中に光学部品が移動しない。したがって、機械的再現に基づく公差が存在しない。

図９は、同様の構成において、回転開口の形態である回転可能部の別例を提案している。回転開口は、キュベットの透過側から出る光の経路に配置されている。これにより、キュベットを通過した励起光が、偏光状態の異なる二つの蛍光として、同じ検出器７で測定されうる。具体的には、偏光強度Ｉ_ｖｖ、偏光強度Ｉ_ｖｈ、透過光強度Ｉ_ｔ、および検出器遮蔽時における背景強度Ｉ_ｄが、この配置と単一の検出器７で測定されうる。

図１０においては、二つの異なる偏光強度および透過光強度が同時に測定されうる別の配置が示されている。具体的には、二つの偏光子５、５’、偏光蛍光強度Ｉ_ｖｖ、Ｉ_ｖｈを検出するための対応する二つの検出器、および透過光強度Ｉ_ｔを検出するための第三検出器９が、Ｔ字状に配置されている。

垂直偏光子５’は、キュベット４の一方側に設けられており、水平偏光子５は、キュベット４の反対側に設けられている。これにより、光は、Ｔ字状配置により得られる一方側と他方側のいずれかにおいて検出される。この構成は、キュベット４から放出される蛍光の検出面積が増大され、感度が向上されうる点において有利である。さらに、この構成によれば、互いに９０度異なる向きとされた二つの偏光子を通過してキュベットの異なる側から出た光が検出されるため、二つの強度が同時に分析されうる。

キュベット４から出た光を検出するため、反射防止用の窓４０が設けられうる。

Claims (21)

1. 患者の体外血液治療を監視する装置の作動方法であって、
   前記体外血液治療に使用された液体試料に偏光方向が固定的であるように直線偏光された光を照射するステップと、
   前記液体試料から放出される蛍光の第一偏光面における強度の検出を行なうステップと、
   前記液体試料から放出される蛍光の前記第一偏光面とは異なる第二偏光面における強度の検出を行なうステップと、
   前記第一偏光面において検出された強度と前記第二偏光面において検出された強度に基づいて、前記液体試料から放出される前記蛍光の異方性を特定するステップと、
   前記液体試料から放出される蛍光について特定された前記異方性、前記第一偏光面において検出された強度、および前記第二偏光面において検出された強度に基づいて、前記液体試料内における少なくとも二つの蛍光色素分子の濃度を特定するステップと、
   を含んでいる、
   方法。
2. 前記第一偏光面と前記第二偏光面は、互いに直交する向きとされており、
   前記異方性（Ａ）は、次式に基づいて特定される、
   請求項１に記載の方法。
   
   Ｉｖｖは、垂直偏光面で検出される蛍光の強度である。Ｉｖｈは、水平偏光面で検出される蛍光の強度である。Ｇは、前記第一偏光面と前記第二偏光面で前記強度を検出する際
   における装置の感度差を補償するための装置定数である。
3. 前記液体試料が所定の照射波長で照明される場合、前記強度は、所定の検出波長において検出され、
   前記異方性は、蛍光色素分子を個々に特定するために用いられ、
   前記強度は、当該蛍光色素分子の濃度を特定するために用いられ、
   特定の蛍光色素分子の異方性は、既知である、
   請求項１または２に記載の方法。
4. 前記液体試料中に存在する少なくとも二つの蛍光色素分子の濃度は、総和スペクトルの前異方性（Ａｇｅｓ）についての次式に基づいて特定される、
   請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
   
   Ａｇｅｓは、総和スペクトルの全異方性である。Ａｉは、ｉ番目の蛍光色素分子の異方性である。ｆｉは、総強度に対するｉ番目の蛍光色素分子の強度比である。Ｓｉは、ｉ番
   目の蛍光色素分子による物理放射の総強度である。Ｓｇｅｓは、全ての蛍光色素分子によ
   る物理放射の総強度である。Ｉvh,iは、ｉ番目の蛍光色素分子の水平蛍光強度の測定値で
   ある。Ｉvv,iは、ｉ番目の蛍光色素分子の垂直蛍光強度の測定値であり、ｉ番目の蛍光色
   素分子の異方性Ａｉは、既知である。
5. 前記液体試料は連続的に照射され、前記検出は連続的に行なわれる、
   請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記濃度は、前記全異方性に基づいて直接的に特定され、
   アルブミンの濃度は、前記全異方性に基づいて特定される、
   請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記濃度は、前記蛍光の垂直強度と水平強度に基づいて直接的に特定される、
   請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記液体試料はパルス的に照射され、前記第一偏光面および前記第二偏光面における前記検出は、時間分解的に行なわれ、
   前記異方性は、次式に基づいて特定される、
   請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
   
   θは、回転相関時間であり、分子の回転によって遷移ダイポールモーメントの軸が拡散的に揃う時間を記述する特徴的な時定数である。Ａ０は、偏光解消減少が起こる前の、時
   刻ｔ＝０における異方性である。
9. 前記回転相関時間は、前記液体試料の温度の変更、前記液体試料の粘度の変更、および外部磁場と外部電場の少なくとも一方の印加の少なくとも一つにより変更される、
   請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 外部磁場と外部電場の少なくとも一方を印加して前記液体試料の遷移ダイポールモーメントの向きを揃えることにより、総蛍光強度が増加される、
    請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 測定された異方性スペクトルの行列分解が行なわれ、
    既知の物質についての既知の異方性スペクトルとの比較が行なわれることにより、当該既知の物質の強度に基づいて前記濃度が特定される、
    請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記液体試料におけるヒトアルブミンの濃度が、前記水平強度と前記垂直強度の差に基づいて特定される、
    請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記体外血液治療は、透析治療、血液透析治療、血液透析濾過治療、および腹膜透析治療の少なくとも一つである、
    請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記体外血液治療に使用される新鮮な透析液を、偏光方向が固定的であるように直線偏光された照射光で照射するステップと、
    前記新鮮な透析液から放出される蛍光の第一偏光面における強度の検出を行なうステップと、
    前記新鮮な透析液から放出される蛍光の前記第一偏光面とは異なる第二偏光面における強度の検出を行なうステップと、
    前記第一偏光面において検出された強度と前記第二偏光面において検出された強度に基づいて、前記新鮮な透析液から放出される蛍光の異方性を特定するステップと、
    前記新鮮な透析液から放出される蛍光について特定された前記異方性、前記第一偏光面において検出された強度、および前記第二偏光面において検出された強度に基づいて、前記新鮮な透析液内における少なくとも二つの蛍光色素分子の濃度を特定するステップと、
    を含んでいる、
    請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 患者の体外血液治療を監視する装置であって、
    前記体外血液治療に使用された液体試料に偏光方向が固定的であるように直線偏光された光を照射する光源（１）と、
    前記液体試料から放出される蛍光の第一偏光面における強度、および当該液体試料から放出される蛍光の当該第一偏光面とは異なる第二偏光面における強度を検出する少なくとも一つの検出器（７）と、
    前記第一偏光面において検出された強度と前記第二偏光面において検出された強度に基づいて、前記液体試料から放出される前記蛍光の異方性を特定し、前記液体試料から放出される蛍光について特定された前記異方性、前記第一偏光面において検出された強度、および前記第二偏光面において検出された強度に基づいて、前記液体試料内における少なくとも二つの蛍光色素分子の濃度を特定する分析ユニット（Ａ）と、
    を備えている、
    装置。
16. 患者の体外血液治療を監視する装置であって、
    前記体外血液治療に使用された液体試料に直線偏光された光を照射する光源（１）と、
    前記液体試料から放出される蛍光の第一偏光面における強度、および当該液体試料から放出される蛍光の当該第一偏光面とは異なる第二偏光面における強度を検出する検出器（７）と、
    前記液体試料から放出される前記蛍光の異方性を特定し、前記液体試料から放出される蛍光について特定された前記異方性と検出された前記強度に基づいて、前記液体試料内における少なくとも一つの蛍光色素分子の濃度を特定する分析ユニット（Ａ）と、
    を備えており、
    偏光面が角度を成すようにされた少なくとも二つの偏光器（５、５’）が、前記液体試料と前記検出器（７）の間に設けられており、
    前記少なくとも二つの偏光器（５、５’）を交互に覆い、前記第一偏光面と前記第二偏光面における前記強度を交互に検出するために、光路上に可動シャッタ（８）が設けられ
    ている、
    装置。
17. 前記光源から前記液体試料を通過する透過光の経路上に回転可能なシャッタが設けられており、
    前記透過光の強度と少なくとも二つの偏光面における前記蛍光の強度が、単一の検出器により検出されうる、
    請求項１６に記載の装置。
18. 第一偏光面を有する偏光器（５）と対応付けられた第一検出器と、当該第一偏光面とは異なる第二偏光面を有する偏光器（５’）と対応付けられた第二検出器とが、当該第一偏光面と当該第二偏光面における前記蛍光の強度を同時に検出するために、前記液体試料を挟んで反対側に配置されている、
    請求項１５に記載の装置。
19. 前記直線偏光された光の照射方向に第三検出器（９）が設けられており、
    前記第三検出器は、前記光源から照射され、前記液体試料を透過した光の強度を検出する、
    請求項１８に記載の装置。
20. 請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法を実行するように構成されている、
    請求項１５から１９のいずれか一項に記載の装置。
21. 患者の体外血液治療を行なう体外血液治療装置であって、
    請求項１５から２０のいずれか一項に記載の装置を備えている、
    体外血液治療装置。