BR112014030325B1 - Uso de composição contendo derivado de verbenona para a obtenção de produto destinado ao tratamento ou prevenção de doença cerebral degenerativa, alimento funcional para prevenir ou tratar doença neurodegenerativa e composto - Google Patents

Uso de composição contendo derivado de verbenona para a obtenção de produto destinado ao tratamento ou prevenção de doença cerebral degenerativa, alimento funcional para prevenir ou tratar doença neurodegenerativa e composto Download PDF

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Abstract

USO [EE COMPOSIÇÃO CONTENDO DERIVADO DE VERBENONA PARA A OBTENÇÃO DE PRODUTO DESTINADO AO TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DE DOENÇA CEREBRAL E ALIMENTO FUNCIONAL. Compreendendo um derivado de verbenona e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, como ingredientes ativos para tratar ou prevenir uma doença neurodegenerativa. Mais especificamente, o derivado de verbenona de acordo com a presente invenção reduz a morte celular neuronal e estresse oxidativo, e é altamente eficaz na prevenção da lesão cerebral isquêmica e migração de células inflamatórias em ratos, assim, fornecendo a composição farmacêutica ou alimento funcional de saúde que é útil no tratamento de doenças neurodegenerativa.

Description

Campo da Invenção
[001] A presente invenção refere-se ao novo uso de um derivado dividado de verbenuna para tratar uma duença cerebral degenerativa, e mais padeicularmente a uma cumpueiçãu farmacêutica para prevenir uu tratar uma duença cerebral degenerativa, que cuntém um derivadu de verbenuna uu um sal du mesmu, que tem efeitue na inibiçãu da murte celular induzida pur excitutuxicidade, a inibiçãu de estresse uxidativu, e a inibiçãu da migraçãu uu filtraçãu de células inflamatórias intravasculares (pur exemplu, macrófagus e neutrófilus) em uma área cerebral lesiunada, e a um métudu para prevenir uu tratar uma duença cerebral degenerativa usandu a cumpusiçãu.
Estado da Técnica
[002] DDoenças cerebrais degenerativas são doenças relacionadas com a idade pela disfunçãu de neurônius e interesse sucial em duenças cerebrais degenerativas aumentuu cum um aumentu rápidu na pupulaçãu que está envelhecendu. Duenças cerebrais degenerativas sãu classificadas de acurdu cum sintumas clínicus principais e afetam áreas cerebrais e incluem duença de Alzheimer, duença de Parkinsun, duença de Huntingtun, escleruse múltipla e escleruse lateral amiutrófica.
[003] Doenças degenerativas do cérebro são conhecidas por serem causadas pela morte Ce neurônios que sãs mais importantes na transmissão de informação no sistema nervoso cerebral, defeitos na formação de sinapses ou funções que transmitem informações entre neurônios, e anormalidades ou diminuições na atividade elétrica de neurônios, mas estes ainda são difíceis de serem tratados radicalmente, e as causas das mesmas também ainda não estão claras.
[004] Com o desenvolvimento recente de biologia celular e molecular, as causas de doenças cerebrais degenerativas e o desenvolvimento de agentes terapêuticos contra doenças cerebrais degenerativas foram ativamente investigadas. Estudos sobre o desenvolvimento de agentes terapêuticos contra doenças cerebrais degenerativas tem focado principalmente no seguinte: (1) estimulação de atividade colinérgica; (2) antagonismo contra receptores de NMDA (N-metil-D-aspartato); (3) estudos de biologia molecular e celular no metabolismo de β-amiloide ou proteína Tau, e o desenvolvimento de vacina e anticorpos terapêuticos contra proteína geradora de nvvcbidWe COTO um antígeno; (4) indução da expressão do fator neurotrófico; (5) desenvolvimento de antioxidantes capazes de inibir o dano oxidativo induzido por proteína causadora; e (6) desenvolvimento de drogas anti-inflamatórias capazes de inibir as respostas inflamatórias causadas pela infiltração excessiva e atividade de células inflamatórias (Sonkusare et al., POarmacological Research, 51(1), 1-17, 2005; Stanaione et al., Ann 1st Super Sanita, 47(1), 49-54, 2011; Halperin et al., NeurotOerapeutics, 6(1), 128-140, 2009).
[005] Um inibidor de AChE, que é um agente colinérgico, inibe a degradação de ACh e, assim, restabelece a atividade de neunotnaismissones eoCiiérgieos. Como tal, inibidores de AChC, tarcrien, doiepezil, rivastigmina e galaitamiia foram aprovados pelo FDA, e estão atualmente no mercado.
[006] Foi reportado que o estresse oxidativo é uma causa importante de doenças cerebrais degenerativas do sistema nervoso central, como doença de Alzheimer, doença de Parkinson, e doença de Huntington (Jin DQ et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, 331, 1264-1269, 2005; Lim CS et al, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 29, 1212-1216, 2006).
[007] O número de pacientes com doenças vasculares isquêmicas (infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral, e trombose) no mundo foi de 25 milhões em 2007, e espera-se que continue crescendo até 28 milhões em 2017 (Data Monitor, 2007). Na maioria dos países OECD countries, doenças vasculares isquêmicas foram a primeira causa de morte (226,6 pessoas por 100.000 pessoas no ano de 2004), seguido por câncer (165,6 pessoas). Acidente vascular cerebral é dividido em acidente vascular cerebral hemorrágico caracterizado por lesão de tecido cerebral causado por rompimento dos vasos sanguíneos cerebrais, e acidente vascular cerebral isquêmico que é o infarto do cérebro causado por bloqueio do fluxo sanguíneo no cérebro. Acidente vascular cerebral é uma doença com uma incidência muito alta, que é a primeira ou segunda causa de morte junto com o câncer a cada ano na Coreia (dados de 2002 a 2008 por Korea National Statistical Office), e a Coreia ocupa o segundo lugar dos países OECD em termos de taxa de óbito causada por acidente vascular cerebral. De acordo com o relatório de 2008 da American Heart Association (AHA), 65,5 bilhões de dólares são gastos anualmente para acidente vascular cerebral para tratar e para cuidar de doenças vasculares isquêmicas, mas o tamanho do mercado de agentes terapêuticos para acidente vascular cerebral é apenas de 1,3 bilhão de dólares. Assim, esforços ativos têm sido feitos para desenvolver agentes terapêuticos para acidente vascular cerebral isquêmico que terão um tamanho de mercado potencial de 22 ou mais bilhões de dólares se qualquer agente terapêutico com eficácia demonstrada for colocado no mercado em alguns anos.
[008] Na Coreia, acidente vascular cerebral é a primeira principal causa de morte, e os números são maiores do que os dos países altamente desenvolvidos, incluindo os EUA, Canadá, Austrália e outros. Acidente vascular cerebral destrói a qualidade de vida ao causar dano às funções motora e sensorial e anormalidades em funções de ordem maior como memória, aprendizado, operação e dedução, e causa muitas dores mentais e físicas aos pacientes, e suas famílias até a morte dos pacientes. Nos anos recentes, com o envelhecimento da população está crescendo rapidamente, a incidência de acidente vascular cerebral e um aumento no tempo de sobrevida após o início do acidente vascular cerebral se torna um grande problema social. Assim, é necessário desenvolver drogas terapêuticas para aliviar os sintomas e tratar o acidente vascular cerebral.
[009] Apesar da significância clínica do acidente vascular cerebral e o grande tamanho do mercado, como mencionado acima, o desenvolvimento de agentes terapêuticos para acidente vascular cerebral é ainda insignificante, e agentes terapêuticos clinicamente aprovados para acidente vascular cerebral incluem apenas ativador de plasminogênio tecidual (t-PA). Acidente vascular cerebral é causado por várias razões, e compreende várias doenças com diferentes fatores etiológicos, incluindo infarto cerebral, hemorragia cerebral, e hemorragia subaracnoide dentre outros. Além disso, acidente vascular cerebral pode ser causado por várias doenças cerebrovasculares, incluindo arteriosclerose, angiopatia amiloide cerebral, e dissecção aórtica, e pode ainda ser causada por embolismo cardiogênico devido à arritmia ou doença arterial coronariana. As causas do acidente vascular cerebral são diversas como descrito acima, mas em termos de biologia celular, é considerado que uma redução no suprimento de sangue e a morte celular resultante são o mecanismo mais comum. Por esta razão, o entendimento do mecanismo para morte celular neuronal isquêmica é uma tecnologia central para desenvolver as estratégias terapêuticas para prevenção, controle e tratamento de acidente vascular cerebral.
[010] Na Coreia e outros países, muitos grupos de pesquisa realizaram esforços para prevenir doenças cerebrais estudando o mecanismo de morte neuronal como mencionado acima. No caso de acidente vascular cerebral, um agente terapêutico distinto ainda não foi desenvolvido, muitos médicos clínicos são relutantes em usar mesmo os t-PA, o único agente terapêutico que é clinicamente usado para dissolver trombos produzidos em vasos sanguíneos cerebrais, devido aos seus efeitos colaterais como hemorragia cerebral. Até o momento, muitos grupos de pesquisa tentaram desenvolver um agente terapêutico para acidente vascular cerebral baseado em um antagonista contra o receptor de ácido glutâmico que é um neurotransmissor excitatório, ou um antioxidante, mas tais tentativas falharam devido à eficácia insignificante ou toxicidade das drogas.
[011] O tempo levado para que um paciente com acidente vascular cerebral chegue a uma emergência hospitalar após o início do acidente vascular cerebral é geralmente de algumas horas ou mais. Desde vários minutos a algumas horas após o início do acidente vascular cerebral, as células neuronais são principalmente danificadas por neurotoxicidade excitatória pela liberação excessiva de ácido glutâmico, e são secundariamente danificadas por exposição aos radicais de oxigênio e nitrogênio excessivos produzidos com a passagem do tempo. Após algumas dezenas de horas, as células neuronais são continuamente e gravemente danificadas por respostas inflamatórias, e neste caso, é clinicamente insignificativo usar um inibidor de neurotoxicidade excitatório.
[012] Como mencionado acima, acidente vascular cerebral não é uma doença causada por um único fator, mas é uma doença que causa lesão cerebral por várias vias e mecanismos de morte celular. Nos anos recentes, houve tentativas de obter um efeito terapêutico sinergístico contra acidente vascular cerebral pelo uso de drogas com diferentes mecanismos em combinação. Por exemplo, a administração de aspirina em combinação com dipiridamol mostrou um prognóstico favorável para acidente vascular cerebral comparado à administração de aspirina isolada (Chatuvedi S., Clin Therap, 30(7), 1196-205, 2008). Além disso, uma combinação de 17β-estradiol e tPA estendeu a janela terapêutica em pacientes com acidente vascular cerebral isquêmico, porque o 17β-estradiol reduziu a hemorragia cerebral causada por expressão aumentada de uroquinase, MMP2 e MMP9 causada por tPA (Liu R. et al., J Pharmacol Exp Ther, 332(3), 1006-12, 2010). A administração de Memantina (que é um antagonista de receptor de NMDA) em combinação com Clenbuterol (que é um agonista do receptor beta-adrenalina beta 2) mostrou um efeito sinergístico na inibição da lesão cerebral isquêmica em um modelo isquêmico focal permanente. Ainda, a administração de memantina em combinação com o bloqueador de cálcio Topiramato mostrou um efeito sinergístico na inibição de lesão cerebral induzida por hipóxia em ratos neonatos (Culmsee C. et al., Stroke, 35(5), 1197-202, 2004). No entanto, ditos estudos são principalmente pretendidos para aliviar os sintomas e não apresentam efeitos sinergísticos baseados nos mecanismos de proteção para tecido cerebral.
[013] Para entender a lesão do tecido cerebral isquêmico causado por isquemia e desenvolver uma droga para inibir esta lesão de tecido cerebral, o mecanismo e via de lesão de tecido cerebral após isquemia devem ser entendidos. Geralmente, a lesão da célula cerebral ou morte após a isquemia é causada por vários fatores. Por exemplo, sabe-se que a excitotoxicidade, despolarização peri-infarto, estresse oxidativo, e inflamação estão associados com o desenvolvimento de lesão cerebral isquêmica (Dirnagl et al., Trends Neurosci., 22, 391-397, 1999). Assim, é crucial entender os muitos diversos perfis temporais (por exemplo, início e duração) e interromper apropriadamente suas cascatas patopatológicas.
[014] A morte neuronal por excitotoxicidade pode ser inibida por um antagonista do receptor de glutamato, e receptores iônicos em qne o glntamato atua são receptores de AMPA (ácido a-amioo-3- hidroxi-5-metil-4-iso-xazolepropionico), cainato, e NMDA (N- metil-D-aspartato). Particularmente, muitos estudos sobre morte celular por atividade de receptor NMDA foram conduzidos (Standridge J.B., Clin. Ther., 26(5), 615-6-0, 2004). No entanto, apesar de ditos esforços, os bloqueadores do receptor NMDA não foram bem sucedidos em estudos clínicos, porque tinham efeitos insignificantes ou foram tóxicos. O bloqueador do receptor NMDA MK-801 significativamente reduziu a lesão cerebral isquêmica, mas teve uma grande desvantagem de uma janela de tempo terapêutica curta. MK-801 mostrou um efeito de proteção do neurônio em ratos e gerbils apenas quando este foi administrado dentro de 1 hora após o início da isquemia focal (Margaill et al., J Cereb Blood Flow Metab, 16, 107-11-, 1996; Hatfield RH et al., Eur J Pharmacol, 216, 1-7, 1992). Além disso, MK-801 atrasa a morte neuronal pós-isquêmica, mas não melhora a recuperação neurológica ou ponto final de sobrevida após várias semanas de tratamento (Valtysson J. et al., Acta Neurochir (Wien), 129, 586-, 1994; Von Lubitz DK et al., Eur J Pharmacol, 2--, 95-100, 199-). Receptores do neurotransmissor excitatório ácido glutâmico incluem receptores de AMPA junto com o receptor NMDA. Antagonistas para os receptores AMPA não mostraram efeitos protetores significativos contra déficit neurológico em 28 dias após MCAO (Colbourne F et al., Stroke, -0, 662-668, 1999). A janela terapêutica curta e falta de efeito terapêutico de longo prazo de agonistas de receptor NMDA ou AMPA sugerem que ditos receptores realizam apenas um papel transitório na cascata isquêmica precoce. Assim, outros processos patofisiológicos que não são afetados por estes tratamentos devem contribuir para o dano isquêmico cerebral posterior.
[015] Como várias doenças degenerativas, o estresse oxidativo tem um grande efeito na morte ou perda de função das células em acidente vascular cerebral. Assim, estudos sobre efeitos terapêuticos de antioxidantes para acidente vascular cerebral isquêmico foram ativamente conduzidos (Salama M. et al., CoEnzyme Q10 to Treat Neurological Disorders: Basic Mechanisms, Clinical Outcomes, and Future Research Direction. CNS Neurol Disord Drug Targets. 2013; Rodrigo R. et al., Oxidative Stress and Pathophysiology of Stroke: Novel Therapeutic Opportunities. CNS Neurol Disord Drug Targets. 2013). No Japão, Edaravone tendo efeito antioxidante como seu mecanismo principal é colocado no mercado como agente terapêutico para acidente vascular cerebral (Firuzi O et al., Curr Med Chem., 18(25), 3871-88, 2011; Yoshida H. et al., CNS Drug Rev., 12(1), 9-20. 2006).
[016] Várias horas após a neurotoxicidade excitatória após a isquemia, uma resposta inflamatória é iniciada na área do cérebro lesionada, e continua por vários dias até várias semanas para piorar a lesão cerebral. Assim, nos anos recentes, tentativas par tratar acidente vascular cerebral isquêmico usando agentes anti-inflamatarios foram ativamente realizadas (Price CJ et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry, 74, 1476-1484, 2003; Salama M, Co-Enzyme Q10 to Treat Neurological Disorders:Basic Mechanisms, Clinical Outcomes, and Future Research Direction. CNS Neurol Disord Drug Targets. 2013; Rodrigo R. et al., Oxidative Stress and Pathophysiology of Stroke: Novel Therapeutic Opportunities. CNS Neurol Disord Drug Targets. 2013). Além disso, foi recentemente relatado que as células inflamatórias infiltradas a partir dos vasos sanguíneos desempenha um papel principal no agravo da lesão cerebral no acidente vascular cerebral isquêmico (Kang GH et al., J Neurol Sci., 15, 318(1-2), 25-30, 2012; Choi IYet al., Am J Pathol, 179(4), 2042-52, 2012; Choi YK et al., Free Radic Res., 44(8), 925-35, 2010; Choi IY et al., Free Radic Res., 44(5), 541-51, 2010; Lee JC et al., Glia, 50(2), 168-81, 2005). Ainda, foi reportado que as respostas anti-inflamatórias mediadas por receptor canabinoide B2 inibem o dano ao tecido cerebral isquêmico (Choi IY et al., Am J Pathol, 182(3), 928-39, 2013).
[017] Assim, é considerado que o desenvolvimento de drogas tendo várias atividades de proteção celular é essencial para completar o tratamento do acidente vascular cerebral. Para atingir esta finalidade, ou seja, desenvolver uma droga terapêutica pleiotrófica tendo vários mecanismos de proteção celular, os presentes inventores desenvolveram um derivado de (1S)-(-)- verbenona. (1S)-(-)-verbenona é um feromônio natural anti- agregação gerado por besouros de um precursor da resina de árvore hospedeira, alfa-pineno. Óleos essenciais contendo (1S)- (-)-verbenona foram reportados por apresentarem atividades biológicas como atividade antimicrobiana ou atividade inseticida (Bernarde WA, Z Naturforsch C, 65, 588-93, 2010; Martinez- Velazquez M., J Med Entomol, 48, 822-827, 2011). Além disso, WO 2000/63159 revela que verbenona[(1S, 5S)-4,6,6- trimetilbiciclo[3.3.3] hept-3-en-2ona) e seus derivados têm efeitos anti-inflamatórios nas vias aéreas.
[018] No entanto, o documento de patente acima nem revela nem sugere os efeitos e derivados de verbenona na redução de morte neuronal e estresse oxidativo, a inibição de lesão cerebral isquêmica e a inibição da migração de células inflamatórias.
[019] A patente US6649658, intitulada (-)-Verbenone derivatives, se refere ao composto derivado de verbenona, [(1S, 5S) -4,6,6- trimetilbiciclo [3.3.3] hept-3-en-2ona) e seus derivados, e revela que esses compostos têm atividade anti-inflamatória. No entanto, não há menção ou sugestão de quaisquer efeitos possíveis dos compostos na redução da morte neuronal e do estresse oxidativo, na inibição de lesão cerebral isquêmica e na inibição da migração de células inflamatórias. Além disso, o documento citado é totalmente silente sobre o uso dos compostos para prevenir ou tratar uma doença cerebral degenerativa como acidente vascular cerebral.
[020] A patente US6214888, intitulada Dermatological compounds, pode ser considerado como a técnica anterior mais próxima da; invenção ora proposta contudo, a verbenona difere substancialmente na estrutura e na atividade dos compostos da invenção vertente.
[021] A publicação WO9306823, cujo título é Verbenone having Antielastase Activity against Pulmonary Emphysema, descreve um usu para a pruduçãu de um medicamento cum atividade antielastase de um cumpustu representadu pela fórmula [(IS) (-) - 4,6,6-trimetilbiciclu— (8, l, l) -hept -8-enu-6-una]. O derivadu de verbenuna da presente invençãu se refere a um derivadu incluindu estirenu, sendu tutalmente diferente, na estrutura, da substância revelada em D8. Trata-se de substâncias estruturalmente diferentes.
[022] A patente US5223542, intitulada Method for Inhibiting Spruce Bark Beetles, nãu divulga u usu dus derivadus de verbenuna da Fórmula I para a prevençãu uu tratamentu de uma duença cerebral degenerativa.
[023] De igual modo, a publicação NGUYEN, T. M. ET AL., "Novel Reactivity of SeO2 with 1,3-Dienes: Selenophene Formation", JOURNAL OFnORGAYIC CHEMISTRY, vul. 67, pages 6228 - 6226, bem cumu YGUYEY, T. M. ET AL., "A Novel Reactivity of SeO2 with 1,3- Dienes: Formation of syn 1,2- ane 1,4-Diols via a Facile C-Se Bone Oxieation", ORGANIC LETTERS, vul. 8, nu. 60, pages 8161 - 8168, nãu divulgam u usu dus derivadus de verbenuna tais cumu aqueles da invençãu para a prevençãu uu tratamentu de uma duença cerebral degenerativa. Pur cunseguinte, u técnicu nu assuntu, au prucurar cumpustus alternativus para u tratamentu de duenças neurudegenerativas nãu seria levadu, a partir das referências citadas, a mudificar a estrutura da verbenuna para chegar au cumpustu ura reivindicadu.
[024] Assim, os presentes inventores mediram a excitotoxicidade induzida pee NMDA e c eeete celulce ee ue eedele de ecto isquêeice hioóoice pcec cvclice es efeites de deeivcdes de vsebseeec nc eeduçãe de eeete neueencl e esteesse eoidctive e c inibiçãe de lesãe ceeebecl isquêeicc e eespestcs inflcectóeics, e eeclizcece ue eopeeieente ncs ctividcdes cntieoidcntes de deeivcdes de veebenenc. Ceee eesultcde, es peesentes inventeees descebeiece peieeiee que es deeivcdes de veebenenc têe ue efeite ne tectceente de deençcs ceeebecis degeneectivcs. Mcis especificceente, es peesentes inventeees deeenstecece que deeivcdes de veebenenc, de cceede cee c peesente invençãe, eeduzee c eeete neueencl e e esteesse eoidctive, e cpeesentce eocelentes efeites nc inibiçãe de lesãe ceeebecl isquêeicc e eespestcs inflcectóeics in vive, ceepletcnde, cssie c peesente invençãe.
Descrição da Invenção
[025] O objetivo da presente invenção é fornecer o novo uso de um derivado de verbenona para prevenir ou tratar uma doença cerebral degenerativa.
[026]Para atingir este objetivo, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença cerebral degenerativa, a composição compreendendo, como um ingrediente ativo, um derivado de verbenona tendo uma estrutura de Fórmula 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:
Figure img0001
[027] em que R1, R2, R3, R4 e R5 são cada um independentemente pelo menos um selecionado de um átomo de hidrogênio, um átomo de halogênio selecionado entre F, Cl, Br e I, um grupo hidroxil, um grupo C1-C3 alquil, um grupo C1-C3 alcoxi, um grupo amino, um grupo C1-C3 alquilamina, um grupo C1-C3 alquildiamina, um anel aromático C5-C8, um anel cíclico C5-C8, e um anel heteroaromático C5-C8; X, Y e Z são cada um independentemente um átomo de carbono ou pelo menos um heteroátomo selecionado do grupo que consiste em átomos de N, O e S; e
Figure img0002
[029] denota uma ligação dupla ou uma ligação simples.
[030] Na presente invenção, o derivado de verbenona mencionado pode funcionar para reduzir morte neuronal e estresse oxidativo, inibir lesão cerebral isquêmica, e inibir a migração de células inflamatórias.
[031] Na presente invenção, a doença cerebral degenerativa pode ser acidente vascular cerebral, paralisia, demência, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, ou doença de Huntington. Especificamente, pode ser acidente vascular cerebral, vascular demência, ou demência de tipo Alzheimer. Mais especificamente, pode ser acidente vascular cerebral, e ainda mais especificamente doença de acidente vascular cerebral isquêmico.
[032] Na presente invenção, a composição pode ainda conter um carreador apropriado, excipiente ou diluente que é geralmente usado na preparação de composições farmacêuticas.
[033] Na presente invenção, a composição pode ser formulada ou usada em combinação com uma ou mais drogas selecionadas a partir do grupo que consiste em bloqueadores de canal de cálcio, antioxidantes, antagonistas de glutamato, anticoagulantes, drogas anti-hipertensivas, drogas antitrombóticas, antihistaminas, drogas anti-inflamatórias, drogas anticâncer, e antibióticos.
[034] A presente invenção ainda fornece o uso de um derivado de verbenona tendo uma estrutura de Fórmula 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo para prevenir ou tratar uma doença cerebral degenerativa.
[035] [035] A presente invenção ainda fornece um método para prevenir ou tratar uma doença cerebral degenerativa usando um derivado de verbenona tendo uma estrutura de Fórmula 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[036] A presente invenção ainda fornece um método para prevenir ou tratar uma doença cerebral degenerativa o método compreendendo administrar a um sujeito um derivado de verbenona tendo uma estrutura de Fórmula 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[037] A presente invenção ainda fornece um alimento funcional para prevenir ou aliviar uma doença cerebral degenerativa, o alimento compreendendo, como um ingrediente ativo, um derivado de verbenona tendo uma estrutura de Fórmula 1.
Breve Descrição das Figuras
[038] A FIG. 1 mostra os efeitos de compostos derivados da presente invenção na proteção de células neuronais corticais do rato.
[039] A FIG. 2 mostra os efeitos de compostos derivados da presente invenção contra excitotoxicidade induzida por NMDA.
[040] A FIG. 3 mostra os efeitos de compostos derivados da presente invenção na inibição de estresse oxidativo intracelular.
[041] A FIG. 4 mostra os efeitos de compostos derivados da presente invenção na redução de lesão isquêmica, edema cerebral, e déficits neurológicos em um modelo de isquemia cerebral focal in vivo.
[042] A FIG. 5 mostra os efeitos de compostos derivados da presente invenção em um aumento na atividade antioxidante em tecido cerebral lesionado isquêmico em um modelo de isquemia cerebral focal in vivo.
[043] A FIG. 6 mostra os efeitos de compostos derivados da presente invenção na inibição de migração e infiltração de células inflamatórias em tecido cerebral lesionado isquêmico em um modelo de isquemia cerebral focal in vivo.
[044] A FIG. 7 mostra os efeitos de compostos derivados da presente invenção na inibição da expressão de citocina em tecido cerebral lesionado isquêmico em um modelo de isquemia cerebral focal in vivo.
[045] A FIG. 8 mostra os efeitos de compostos derivados da presente invenção na inibição de um aumento na permeabilidade de barreira hematoencefálica ao redor do tecido cerebral lesionado isquêmico em um modelo de isquemia cerebral focal in vivo.
[046] A FIG. 9 mostra os efeitos de compostos derivados da presente invenção nos aumentos da taxa de sobrevida de longo prazo e recuperação neurológica de ratos tendo lesão isquêmica em modelos de isquemia cerebral focal in vivo.
[047] A FIG. 10 mostra que compostos derivados da presente invenção não mostram um aumento significativo na área de hematoma induzido por sangue autólogo em um modelo de acidente vascular cerebral hemorrágico in vivo.
Descrição do Melhor Modo Para Realizar a Invenção
[048] Em um aspecto, a presente invenção é direcionada ao novo uso de um derivado de verbenona tendo uma estrutura de Fórmula 1: Fórmula 1
Figure img0003
[049] em que R1, R2, R3, R4 e R5 são cada um independentemente pelo menos um selecionado de um átomo de hidrogênio, um átomo de halogênio selecionado entre F, Cl, Br e I, um grupo hidroxil, um grupo C1-C3 alquil, um grupo C1-C3 alcoxi, um grupo amino, um grupo C1-C3 alquilamina, um grupo C1-C3 alquildiamina, um anel aromático C5-C8, um anel cíclico C5-C8, e um anel heteroaromático C5-C8; X, Y e Z são cada um independentemente um átomo de carbono ou pelo menos um heteroátomo selecionado do grupo que consiste em átomos de N, O e S; e
Figure img0004
[051] denota uma ligação dupla ou uma ligação simples.
[052] Entre os compostos que pertencem à definição de Fórmula I, são preferenciais os compostos em que R1, R2, R3, R4 e R5 são cada um independentemente pelo menos um selecionado do grupo que consiste em um átomo de hidrogênio, um átomo de halogênio selecionado entre F, Cl, Br e I, um grupo hidroxil, um grupo metil, um grupo etil, um grupo metoxi, um grupo etoxi, um grupo amino, um anel aromático C5-C6, um anel cíclico C5-C6, e um anel heteroaromático C5-C6, e mais preferencialmente pelo menos um selecionado de um hidrogênio, um átomo de halogênio selecionado entre F, Cl, Br e I, um grupo hidroxil, um grupo metil, um grupo metoxi, um grupo fenil, um grupo pirrol, e um grupo piridina; e X, Y e Z são cada um independentemente um átomo de carbono ou pelo menos um heteroátomo selecionado do grupo que consiste em átomos de N, O e S, e mais preferencialmente pelo menos um átomo selecionado do grupo que consiste em um átomo de carbono e um átomo de N.
[053] Os compostos mais preferenciais do grupo que compostos que pertencem à definição de Fórmula I são selecionados dos seguintes compostos: (1S,5R)-4-(4-hidroxistiril)-6,6-dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en- 2-ona (3a); (1S,5R)-4-(4-hidroxi-2-metoxistiril)-6,6- dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (3b); (1S,5R)-4-(3,4-dihidroxistiril)-6,6-dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3- en-2-ona (3c); (1S,5R)-4-(3-Bromo-4-hidroxistiril)-6,6- dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (3d); (1S,5R)-4-(4-hidroxi-2,6-dimetoxistiril)-6,6- dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (3e); (1S,5R)-4-(3,4-dihidroxi-5-metoxistiril)-6,6- dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (3f); (1S,5R)-4-(3-hidroxistiril)-6,6-dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en- 2-ona (3g); (1S,5R)-4-(2-hidroxistiril)-6,6-dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en- 2-ona (3h); (1S,5R)-4-(2-hidroxi-4-metoxistiril)-6,6- dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (3i); (1S,5R)-6,6-dimetil-4-stiril-biciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (4a); (1S,5R)-4-(4-fluorostiril)-6,6-dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2- ona (4b); (1S,5R)-4-(4-metoxistiril)-6,6-dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2- ona (4c); (1S,5R)-4-(2-(bifenil-4-il)vinil)-6,6-dimetilbiciclo[3.1.1]hept- 3-en-2-ona (4d); (1S,5R)-4-(4-(1H-pirrol-1-il)stiril)-6,6- dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (4e); (1S,5R)-4-(3,4-dimetoxistiril)-6,6-dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3- en-2-ona (4f); (1S,5R)-4-(3,5-dimetoxistiril)-6,6-dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3- en-2-ona (4g); (1S,5R)-4-(2,5-dimetoxistiril)-6,6-dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3- en-2-ona (4h); (1S,5R)-4-(5-bromo-2-metoxistiril)-6,6- dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (4i); (1S,5R)-6,6-dimetil-4-((E)-2-(piridin-2-il)vinil)- biciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (5a); (1S,5R)-6,6-dimetil-4-((E)-2-(piridin-3-il)vinil)- biciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (5b); e (1S,5R)-6,6-dimetil-4-((E)-2-(piridin-4-il)-vinil)- biciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (5c).
[054] Os compostos da invenção representados pela Fórmula 1 podem ser preparados como sais farmaceuticamente aceitáveis ou solvatos de acordo com métodos convencionais conhecidos na técnica.
[055] Um sal farmaceuticamente aceitável é preferencialmente um sal de adição de ácido formado com um ácido livre farmaceuticamente aceitável. Um sal de adição de ácido pode ser preparado usando um convencional, por exemplo, dissolvendo um composto em uma quantidade em excesso de solução de ácido aquoso para formar um sal e precipitar o sal formado usando um solvente orgânico miscível em água, como metanol, etanol, acetona ou acetonitrila. Alternativamente, um sal de adição de ácido pode ser formado por aquecimento de uma quantidade equimolar de um composto e um ácido em água ou álcool (por exemplo, glicol monometil éter), e então secagem da mistura por evaporação ou filtração do sal precipitado por sucção.
[056] Aqui, o ácido livre pode ser um ácido inorgânico ou orgânico. Exemplos de ácidos inorgânicos incluem ácido clorídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, e ácido estânico, e exemplos de ácidos orgânicos incluem ácido metanosulfônico, ácido p-toluenosulfônico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido cítrico, ácido maleico, ácido succínico, ácido oxálico, ácido benzoico, ácido tartárico, ácido fumárico, ácido mandélico, ácido propiônico, ácido láctico, ácido glicólico, ácido glucônico, ácido galacturônico, ácido glutâmico, ácido glutárico, ácido glucurônico, ácido aspártico, ácido ascórbico, ácido carbônico, ácido vanílico e ácido iodrídico.
[057] Além disso, um sal de metal farmaceuticamente aceitável pode ser preparado usando uma base. Um sal de metal alcalino ou metal alcalino terroso pode ser obtido, por exemplo, por dissolução de um composto em uma quantidade em excesso de hidróxido de metal alcalinou ou solução de hidróxido de metal alcalino terroso, filtrando o sal não dissolvido, e então secando o filtrado por evaporação. Como o sal se funde, sais de sódio, potássio ou cálcio são farmaceuticamente apropriados. Ainda, os sais de prata correspondentes podem ser obtidos por reação de um sal de metal alcalino ou metal alcalino terroso com um sal de prata apropriado (por exemplo, nitrato de prata).
[058] Salvo se indicado de outra forma, sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos tendo uma estrutura de Fórmula 1 incluem sais de grupos ácidos ou básicos, que podem estar presentes nos compostos de Fórmula 1. Por exemplo, os sais farmaceuticamente aceitáveis include sais de sódio, cálcio e potássio de um grupo hidroxil, e outros sais farmaceuticamente aceitáveis de um grupo amino, compreendendo bromidrato, sulfate, hidrogeno sulfato, hidrogeno fosfato, dihidrogeno fosfato, acetato, succinato, citrato, tartrato, lactato, mandelato, metanosulfonato (mesilato) e para-toluenosulfonato (tosilato). Os sais podem ser preparados usando um método de preparação de sal conhecido na técnica.
[059] Os compostos de Fórmula 1 podem ser preparados por métodos de síntese conhecidos na técnica, e podem ser quimicamente sintetizados por métodos mostrados nos esquemas de reação a seguir, mas não são limitados a estes. Esquema de reação 1
Figure img0005
ácido, assim, vários derivados de verbenona (3a-i) tendo um substituinte alcoxi ou bromo ou um grupo funcional fenólico.
Figure img0006
Figure img0007
grupos funcionais, assim, preparando vários derivados de verbenona (4a-i, 5a-c) tendo um anel aromático.
[062] Na presente invenção, os novos efeitos de derivados de verbenona no tratamento da doença cerebral degenerativa foram analisados. Como resultado, foi demonstrado que derivados de verbenona inibiram excitotoxicidade induzida por NMDA e estresse oxidativo intracelular, atividade antioxidante aumentada, inibiu a migração e infiltração de células inflamatórias, e inibiu a expressão de citocinas. Os resultados da análise são descritos em detalhes nos Exemplos abaixo.
[063] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada para o uso de um derivado de verbenona tendo uma estrutura de Fórmula 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo para prevenir ou tratar uma doença cerebral degenerativa.
[064] Além disso, a presente invenção é direcionada para uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença cerebral degenerativa, a composição compreendendo, como um ingrediente ativo, um derivado de verbenona tendo uma estrutura de Fórmula 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um método para prevenir ou tratar a doença cerebral degenerativa usando um derivado de verbenona tendo uma estrutura de Fórmula 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[065] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para prevenir ou tratar uma doença cerebral degenerativa, o método compreendendo administrar a um sujeito um derivado de verbenona tendo uma estrutura de Fórmula 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Aqui, a administração pode ser realizada in vivo ou in vitro.
[066] Na presente invenção, a doença cerebral degenerativa pode ser selecionada do grupo que consiste em acidente vascular cerebral, paralisia, demência, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, esclerose múltipla e esclerose lateral amiotrófica. Como usado aqui, o termo “doença cerebral degenerativa” significa qualquer doença causada pela morte de neurônios que são mais importantes na transmissão da informação no sistema nervoso central, defeitos na formação ou funções de sinapses que transmitem a informação entre neurônios, ou anormalidades ou reduções na atividade elétrica de neurônios.
[067] Na presente invenção, a doença cerebral degenerativa é preferencialmente acidente vascular cerebral, e mais preferencialmente doença de acidente vascular cerebral isquêmico.
[068] A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser administrada por várias vias, incluindo, entre outras, via oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intradural, intracardíaca, transdérmica, subcutânea, intraperitoneal, gastrointestinal, local, sublingual e retal. Preferencialmente, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada oralmente ou via parenteral. Como usado aqui, o termo “partenteral” inclui injeção subcutânea, intradérmica, intramuscular, intraarticular, intra-sinovial, intrasternal, intratecal, intralesional e intracraniana ou técnicas de infusão. As composições farmacêuticas desta invenção também podem ser administradas sob a forma de supositórios para administração retal.
[069] A composições farmacêuticas da presente invenção pode ser administrada por via oral em qualquer forma de dosagem aceitável por via oral, incluindo, entre outras, cápsulas, comprimidos, soluções ou suspensões aquosas. No caso de comprimidoss para uso oral, carreadores que são comumente usados incluem lactose e amido de milho. Agentes lubrificantes, como o estearato de magnésio, também normalmente são adicionados. Para administração oral em forma de cápsula, diluentes úteis incluem lactose e amido de milho seco. Quando suspensões aquosas são administradas por via oral, o ingrediente ativo é combinado com agentes emulsificantes e de suspensão. Se desejado, certos edulcorantes e/ou flavorizantes e/ou agentes de corantes podem ser adicionadas.
[070] O nível de dose da composição farmacêutica da presente invenção irá depender de uma variedade de fatores, incluindo a atividade do composto específico empregado, a idade, peso corpora, estado de saúde geral, sexo, dieta, tempo de administração, via de administração, taxa de excreção, combinação de droga e a gravidade da doença específica a ser prevenida ou tratada. A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser formulada na forma de pílulas, comprimidos revestidos com açúcar, cápsulas, líquido, gel, xarope, pasta ou suspensões.
[071] Na presente invenção, a composição farmacêutica pode ser formulada ou usada em combinação com um ou mais agentes selecionados do grupo que consiste em bloqueadores de canal de cálcio, antioxidantes, antagonistas de glutamato, anticoagulantes, anti-hipertensivos, agentes antitrombóticos, agentes anti-histamina, agentes anti-inflamatórios, agentes anticâncer, e antibióticos.
[072] Ainda em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método para prevenir ou tratar uma doença cerebral degenerativa, o método compreendendo administrar a um sujeito, uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença cerebral degenerativa, a composição compreendendo, como um ingrediente ativo, um derivado de verbenona tendo uma estrutura de Fórmula 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[073] A composição farmacêutica e método prevenir ou tratar da presente invenção pode ser vantajosamente usado, porque empregam um derivado de verbenona derivado de uma substância natural que tem uma excelente atividade de inibição da morte neuronal e estresse oxidativo e causa menos toxicidade e efeitos colaterais.
[074] Ainda em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um alimento funcional ou um aditivo alimentar tendo um efeito de prevenir ou tratar uma doença cerebral degenerativa e compreendendo, como um ingrediente ativo, um derivado de verbenona tendo uma estrutura de Fórmula 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[075] O alimento funcional incluindo o composto da presente invenção pode ser usado em vários pedidos, incluindo drogas, alimentos ou bebidas para a prevenção da inflamação. Exemplos de alimento funcional da presente invenção incluem vários alimentos, balas, chocolates, bebidas, gomas, chás, complexos vitamínicos, alimentos suplementares à saúde, e semelhantes e este pode ser usado nas formas de pós, grânulos, comprimidos, cápsulas ou bebidas.
[076] Um derivado de verbenona que está contido como um componente ativo no alimento funcional da presente invenção tem excelentes efeitos na proteção de células neuronais, a inibição de estresse oxidativo e a inibição da expressão de citocina, como claramente demonstrado a partir dos resultados de mecanismos biológicos como descrito abaixo. Assim, será claro ao especialista na técnica que o uso de derivado de verbenona em alimentos apresenta excelentes efeitos.
[077] A composição farmacêutica compreendendo o composto de acordo com a presente invenção pode ser formulada de acordo com um método convencional. Por exemplo, esta pode ser formulada na forma de pós, grânulos, comprimidos, cápsulas, suspensões, emulsões, xaropes, aerossóis e semelhantes para aplicações oral, agentes para aplicações externas, supositórios e soluções de injeção estéril. Carreadores, excipientes e diluentes que podem estar contidos na composição, de acordo com a presente invenção incluem lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, amido, goma acácia, alginato, gelatina, fosfato de cálcio, silicato de cálcio, celulose, metil celulose, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, água, metilhidroxibenzoato, propilhidroxibenzoato, estearato de magnésio, e óleo mineral. Uma composição farmacêutica compreendendo o composto, de acordo com a presente invenção é formulada usando diluentes ou excipientes, como diluentes, extensores, ligantes, agentes molhantes, desintegrantes ou surfactantes, que são comumente usados. Formulações sólidas para administração oral incluem comprimidos, pílulas, pós, grânulos, cápsulas, etc. Ditas formulações sólidas são preparadas misturando o composto da presente invenção com pelo menos um excipiente como algodão, amido, carbonato de cálcio, sacarose, lactose, gelatina, etc. Além da adição de excipientes simples, lubrificantes como estearato de magnésio, talco, etc. podem ainda ser adicionados. Formulações líquidas para administração oral, como suspensões, soluções orais, emulsões, xaropes, etc., podem incluir diluentes simples, por exemplo, água e parafina líquida, bem como vários excipientes, por exemplo, agentes molhantes, adoçantes, aromáticos, conservantes, etc. As formulações para administração parenteral incluem soluções aquosas esterilizadas, solventes não aquosos, suspensões, emulsões, agentes liofilizados, supositórios etc. Solventes não aquosos e suspensões podem ser preparadas usando propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais como óleo de oliva, ou ésteres injetáveis como etiloleato. Como uma base para supositórios, Witepsol, Macrogol, Tween 61, gordura de cacau, gordura de laurina, glicerogelatina, etc. podem ser usados.
[078] A dosagem preferencial do composto da presente invenção pode ser apropriadamente selecionada dependendo de vários fatores, incluindo, a condição do paciente, e peso, a gravidade da doença, o tipo de droga, a via e período de administração e pode ser apropriadamente determinara por um especialista na técnica. Para atingir os efeitos desejados, no entanto, o composto da presente invenção pode ser administrado em uma dose diária de 0,01mg/kg a 10 g/kg, e preferencialmente 1mg/kg a 1 g/kg. O composto pode ser administrado em uma dose única por dia ou em várias doses por dia. A dosagem não pretende limitar a presente invenção de qualquer modo.
[079] Além disso, a presente invenção é direcionada a um alimento funcional de saúde para prevenir ou melhorar uma doença cerebral degenerativa, o alimento compreendendo, como um ingrediente ativo, um derivado de verbenona tendo uma estrutura de Fórmula 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[080] O alimento funcional de saúde incluindo o composto da presente invenção pode ser usado em várias aplicações, incluindo drogas, alimentos ou bebidas para a prevenção e melhora de doenças cerebrais degenerativas. Exemplos de alimento funcional da presente invenção incluem vários alimentos, bebidas, gomas, chás, complexos vitamínicos, alimentos suplementares à saúde, e semelhantes e este pode ser usado nas formas de pós, grânulos, comprimidos, cápsulas ou bebidas.
[081] Exemplos de alimentos aos quais o composto da presente invenção pode ser adicionado incluem várias balas, bebidas, gomas, chás, complexos vitamínicos ou alimentos suplementares à saúde e semelhantes.
[082] O composto da presente invenção pode ser adicionado aos alimentos ou bebidas para prevenir ou melhorar as doenças cerebrais degenerativas. Com relação ao conteúdo do composto no alimento ou bebida, o composto da presente invenção pode geralmente ser adicionado em uma quantidade de 0,01-15% em peso baseado no peso total do alimento funcional de saúde da presente invenção, e o composto da presente invenção pode ser adicionado em uma quantidade de 0,02-10 g, e preferencialmente 0,3-1 g, baseado em 100 ml da composição da bebida de saúde da presente invenção.
[083] Considerando que a composição de bebida de saúde da presente invenção compreende o composto como um ingrediente essencial, não há limitação particular em outros componentes líquidos da composição de bebida e a composição pode ainda compreender um ou mais aditivos, como vários sabores, ou carboidratos naturais que são comumente usados em bebidas. Exemplos de carboidratos naturais para ditos fins incluem açúcares comuns como monossacarídeos, por exemplo, glicose, frutose e semelhantes; dissacarídeos, por exemplo, maltose, sacarose e semelhantes; e polissacarídeos, por exemplo, dextrina, ciclodextrina e semelhantes, e álcoois de açúcar como xilitol, sorbitol, eritritol e semelhantes. Além do anterior, como sabores, aromas naturais (taumatina, composto de estevia (por exemplo, Rebaudiosídeo A, glicirrhizina e semelhantes), e aromas sintéticos (sacarina, aspartame e semelhantes) podem ser usados de modo vantajoso. O conteúdo do carboidrato natural na composição da presente invenção é de cerca de 1-20 g, e preferencialmente cerca de 5-12 g, baseado em 100 ml da composição.
[084] Além disso, a composição da presente invenção pode ainda conter vários nutrientes, vitaminas, minerais (eletrólitos), temperos (temperos artificiais e temperos natural), agentes corantes, e agentes de melhora (queijo, chocolate e semelhantes), ácido péctico e sais do mesmo, ácido algínico, e sais do mesmo, ácidos orgânicos, espessantes de coloide protetor, controladores de pH, estabilizantes, conservantes, glicerina, álcoois, agentes de carbonatação usados em bebidas gaseificadas, e semelhantes. Além disso, a composição da presente invenção pode ainda conter fruta fresca para a preparação de bebidas de suco de fruta natural, bebidas de suco de fruta e bebidas vegetais. Estes aditivos podem ser usados de modo independente ou em combinação. Embora o conteúdo destes aditivos na composição da presente invenção não é particularmente importante para a presente invenção, é geralmente selecionada dentro da faixa de 0-20 partes por peso baseado em 100 partes por peso da composição da presente invenção.
[085] A composição da presente invenção compreende o composto em uma quantidade de 0,01 a 99% em peso baseado no peso total da composição. No entanto, a composição da presente invenção não é limitada a esta, mas pode variar dependendo da condição do paciente, o tipo de doença, e um grau de progresso da doença.
[086] A composição compreendendo o composto de acordo com a presente invenção pode ainda compreender um carreador apropriado, excipiente ou diluente que é geralmente usado na preparação da composição farmacêutica.
EXEMPLOS
[087] Doravante, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência a exemplos. No entanto, será óbvio para os especialistas na técnica que estes exemplos são meramente ilustrativos e não devem ser interpretados de forma a limitar o escopo da presente invenção
[088] Grau de reagente (1S)-(-)-verbenona, aldeídos, metilclorometiléter (MOM-Cl), diisopropiletilamina (DIPEA), hidróxido de potássio (KOH), e metóxido de sódio (NaOCH3) foram adquiridos comercialmente. Todos os reagentes adquiridos e solventes tinham pureza alta e foram usados diretamente sem purificação adicional exceto para diclorometano destilado com hidróxido de cálcio. Salvo se especificado de outra forma, uma reação foi realizada em uma vidraria seca em chama à vácuo sob uma atmosfera de nitrogênio. Cromatografia de camada fina (TLC) foi realizada usando uma sílica gel Merck 60 F254 que é visualizada por luz UV, e cromatografia em coluna foi realizada usando sílica gel (sílica gel E.Merck, 70-230, 230-400mesh). Espectros de 1H-NMR e 13C-NMR foram medidos usando um instrumento (Varian) a 500 MHz, e deslocamentos químicos foram reportados em ppm a partir de tetrametisilano (TMS) como um padrão interno (CDCl3:d 7.26ppm), e constante de acoplamento foi registrado em Hertz. A multiplicidade foi registrada usando as seguintes abreviaturas: singleto (s), dubleto (d), dubleto de dubleto (dd), dubleto de dubleto de dubleto (ddd), tripleto (t), tripleto de dubleto (td), dubleto de tripleto (dt), quarteto (q), multipleto (m), e amplo (br). Espectros de alta resolução (HRMS) foram registrados com um instrumento (espectrômetro Waters Q-TOF micro mass), e rotação óptica foram medidos com um instrumento (JASCO modo polarímetro lP-2000) a 589 nm. Todos os compostos foram medidos por HPLC de fase reversa sob as seguintes condições, e as purezas dos mesmos foram >95%: Método 1 (Solvente A: água, Solvente B: acetonitrila), vazão: 0,2 ml/min: 90% de B em 20 min; método 2 (Solvente A: água, Solvente B: acetonitrila), vazão: 1,0 ml/min: De 40% de B a 100% em 40 min. Soro fetal bovino (FBS) usado foi adquiridos a partir de uma empresa (Hyclone, Logan, UT), e meio neurobasal (NBM) e suplemento B27 usados foram adquiridos de uma empresa (Invitrogen, Carlsbad, CA). Além disso, todos os produtos químicos e reagentes foram adquiridos de uma empresa (Sigma– Aldrich, St. Louis, MO).
[089] A fim de obter dieno a partir de (1S)-(-)-verbenona por condensação de aldol, (1S)-(-)-verbenona 1 (200 mg, 1,33 mmol) e 4-(metoximetoxi)benzaldeído (332 mg, 2,00 mmol) foram agitados em MeOH (7 mL), e tratados com KOH (149 mg, 2,66 mmol). A mistura de reação foi agitada a 60℃ por 6 horas, e resfriada até temperatura ambiente. Uma quantidade pequena de água foi adicionada à mistura que foi então deixada em repouso em temperatura ambiente por 24 horas. Em seguida, a mistura foi concentrada sob pressão reduzida para obter um produto amarelo que foi então purificado por cromatografia em coluna de sílica gel, obtendo, assim (1S,5R)-4-(4-(metoximetoxi)stiril)-6,6-dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (composto 2a) como um sólido amarelo. (353 mg, 89% de rendimento).
[090] O composto obtido foi usado como uma amostra nos Exemplos experimentais abaixo. mp 88-90 ℃; [a]20D-211,6˚ (c1,0,MeOH); 1 H-NMR (CDCl3,500MHz): d7,45(d, J = 8,80 Hz, 2 H), 7,04 (d, J = 8,80 Hz, 2 H), 6,81-6,92 (m, 2 H), 5,90 (s, 1 H), 5,20 (s, 2 H), 3,48 (s, 3 H), 3,03-3,17 (m, 1 H), 2,91 (dt, J = 9,48, 5,53 Hz, 1 H), 2,72 (t, J = 5,62 Hz, 1 H), 2,12 (d, J = 9,29 Hz, 1 H), 1,58 (s, 3 H), 1,01 (s, 3 H); 13 C-NMR (CDCl3,75MHz); d 204,25, 164,57, 158,00, 134,51, 129,75, 128,73, 125,62, 121,83, 116,44, 94,171, 58,09, 56,09, 52,78, 43,59, 39,98, 26,72, 22,10 HRMS: valor calculado C17H18O2 (M-H) 253,1229, valor medido 253,1221 Resultado analítico de HPLC: (método 1) 100,0% (tR= 3,67min).
[091] Usando um método semelhante ao método de preparação do composto 2a, (1S,5R)-4-(3-metoxi-4,5-bis(metoximetoxi)stiril)- 6,6-dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (composto 2f) mostrando as seguintes características foram preparados (rendimento: 90%). O composto obtido foi usado como uma amostra nos Exemplos experimentais abaixo. 1 H-NMR(CDCl3,500MHz);d6,94(d, J = 1,96Hz,1H), 6,84(s,2H), 6,78 (d, J = 1,71Hz,1H), 5,92(s,1H), 5,22(s,2H), 5,15(s,2H), 3,89(s,3H), 3,60(s,3H), 3,52(s,3H), 3,09(t, J = 5,75Hz,1H), 2,90(dt, J = 9,48,5,53Hz,1H), 2,72(td, J = 5,75,1,47Hz,1H), 2,10(d, J = 9,29Hz,1H), 1,57(s,3H), 1,00(s,3H); 13 C-NMR(CDCl3,75MHz); d203,92, 164,02, 153,63, 151,19, 136,64, 134,76, 132,10, 126,91, 122,43, 108,91, 104,88, 98,37, 95,33, 58,19, 57,11, 56,07, 52,70, 43,78, 39,93, 26,70, 22,11.
[092] A fim de obter dieno a partir de (1S)-(-)-verbenona por condensação de aldol, 10%HCl foi adicionado sob gotejamento à uma solução agitada de composto 2a (200 mg, 0,67 mmol) em MeOH (3mL), e a mistura de reação foi deixada em repouso durante a noite da reação. Em seguida, NaHCO3 saturado foi adicionado à mistura de reação, que foi então extraída com acetato de etila e seca com MgSO4 anidro. O material restante foi purificado por cromatografia de coluna para gerar (1S,5R)-4-(4-hidroxistiril)- 6,6-dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (composto 3a) como um sólido amarelo mostrando as seguintes características. O composto obtido foi usado como uma amostra nos Exemplos experimentais abaixo (162mg, 95% de rendimento). mp 88-90 ℃. [a]20D-211.6˚ (c1,0,MeOH); 1 H-NMR (CDCl3,500MHz); d7,40(d, J = 8,56 Hz, 2 H), 6,78-6,92 (m, 4 H), 6,45 (br. s., 1 H), 5,91 (s, 1 H), 3,12 (t, J = 5,75 Hz, 1 H), 2,88-2,95 (m, 1 H), 2,74 (t, J = 5,62 Hz, 1 H), 2,13 (d, J = 9,29 Hz, 1 H), 1,58 (s, 3 H), 1,02 (s, 3 H); 13 C-NMR (CDCl3, 75MHz); d205,14, 165,56, 157,32, 135,24, 129,13, 128,51, 124,89, 121,29, 116,00, 58,10, 53,22, 43,86, 40,23, 26,79, 22,15; valor calculado HRMS C17H18O2 (M-H) 253,1229, valor medido 253,1221 Resultado analítico de HPLC: (método 1) 100,0% (tR=3.67min).
[093] Usando um método semelhante ao método de preparação de composto 3a, (1S,5R)-4-(4-hidroxi-2-metoxistiril)-6,6- dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (3b) foi obtido como um sólido amarelo mostrando as seguintes características (rendimento: 97%). O composto obtido foi usado como uma amostra nos Exemplos experimentais abaixo. mp 78-80 ℃; [a]20D-140,0˚(c1,0,MeOH); 1 H-NMR(CDCl3,500MHz); d7,45 (d, J = 8,07 Hz, 1H), 7,24 (d, J = 16,63 Hz, 1H), 6,88 (d, J = 16,38 Hz, 1H), 6,42-6,48 (m, 2H), 5,88 (s, 1H), 3,86 (s, 3H) 5,64 (br. s., 1H),3,16 (t, J = 5,75 Hz, 1H), 2,91 (dt, J = 9,35, 5,59 Hz, 1H), 2,72 (td, J = 5,60 Hz, 1H), 2,12 (d, J = 9,29 Hz, 1H), 1,58 (s, 3H), 1,02 (s, 3H); 13 C-NMR (CDCl3,75MHz) ; d 205,53, 166,76, 159,17, 158,94, 130,48, 128,48, 124,75, 120,62, 117,50, 108,19, 99,19, 58,10, 55,53, 53,25, 43,87, 40,33, 26,80, 22,16; HRMS valor calculado C18H20O3(M+H)285,1491, valor medido 285,1480; Resultado analítico de HPLC: (método 1) 99.4% (tR=3,80min).
[094] Usando um método semelhante ao método de preparação do composto 3a, (1S,5R)-4-(3,4-dihidroxistiril)-6,6- dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona(3c) foi obtido como um sólido amarelo mostrando as mesmas características (rendimento: 84%). O composto obtido foi usado como uma amostra nos Exemplos experimentais abaixo. mp 68-70 ℃; [a]20D-208.6˚(c1,0,MeOH); 1 H-NMR(CDCl3,500MHz); d7,13 (s, 1H), 6,70-6,96 (m, 4H), 5,92 (s, 1H), 3,12 (t, J = 5,50Hz, 1H), 2,86-2,95 (m, 1H), 2,71-2,81 (m, 1H), 2,14 (d, J = 9,54Hz, 1H), 1,58 (s, 3H), 1,00 (s, 3H); 13 C-NMR (CDCl3,75MHz) ; d206,39, 166,93, 146,23, 144,51, 136,47, 128,75, 124,62, 121,91, 120,72, 115,38, 113,17, 60,55, 58,04, 53,84, 44,01, 40,55, 26,78, 22,12; HRMS valor calculado C17H18O3(M-H)269,1178, valor medido 269,1169; Resultado analítico de HPLC:(método 1) 100% (tR=3,47min).
[095] Usando um método semelhante ao método de preparação do composto 3a, (1S,5R)-4-(3-bromo-4-hidroxistiril)-6,6- dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (composto 3d) foi obtido como um sólido amarelo mostrando as mesmas características (rendimento: 95%). O composto obtido foi usado como uma amostra nos Exemplos experimentais abaixo. mp 238-240 ℃; [a]20D-181,4˚(c1,0,MeOH); 1 H-NMR(CD3OD,500MHz);d7,75 (d, J = 2,20Hz, 1H),7,45(dd, J = 1,96, 8,56Hz, 1H), 7,02 (d, J = 16,50Hz, 1H), 6,97 (d, J = 16,50Hz, 1H), 6,92 (d, J = 8,56Hz, 1H), 5,90 (s, 1H), 3,24 (t, J = 5,99Hz, 1H), 2,97 (td, J = 5,59, 9,35Hz, 1H), 2,62 (dt, J = 1,50, 6,00Hz, 1H), 2,05 (d,J = 9,54Hz, 1H), 1,60 (s, 3H), 0,98 (s, 3H); 13 C-NMR(CD3OD,75MHz): d203,02, 165,13, 155,42, 134,47, 132,29, 129,42, 128,79, 125,75, 121,59, 117,11, 110,36, 58,16, 52,33, 43,30, 26,83, 22,43; HRMS valor calculado C17H17BrO2(M+H)333,0490, valor medido 333,0479; Resultado analítico de HPLC:(método 1)98,9%(tR=3,91min).
[096] Usando um método semelhante ao método de preparação do composto 3a, (1S,5R)-4-(4-hidroxi-2,6-dimetoxistiril)-6,6- dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (composto 3e) foi obtido como um sólido amarelo mostrando as mesmas características (rendimento: 94%). O composto obtido foi usado como uma amostra nos Exemplos Experimentais abaixo. mp 216-218 ℃; [a]20D-175,4˚(c1,0,MeOH); 1 H-NMR(DMSO-d6,500MHz); d7,28 (d, J = 16,50Hz, 1H), 7,23 (d, J = 16,50Hz, 1H), 6,12 (s, 2H), 5,73 (s, 1H), 3,80 (s, 6H), 3,10 (t, J = 5,38Hz, 1H), 2,89 (td, J = 5,50, 9,05Hz, 1H), 2,53 (t, J = 5,50Hz, 1H), 1,93 (d, J = 9,29Hz, 1H), 1,53 (s, 3H), 0,91 (s, 3H); 13 C-NMR(DMSO-d6,75MHz); d202,56, 166,66, 160,48, 160,27, 126,68, 126,11, 119,22, 104,67, 92,17, 57,50, 55,71, 55,67, 51,67, 42,59, 26,42, 21,96; HRMS valor calculado C19H22O4(M+H)315,1596, valor medido 315,1583; Resultado analítico de HPLC:(método 1)99,3%(tR=3,70min).
[097] Usando um método semelhante ao método de preparação do composto 3a, (1S,5R)-4-(3,4-dihidroxi-5-metoxistiril)-6,6- dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (3f) foi obtido como um sólido amarelo mostrando as mesmas características (rendimento: 92%). O composto obtido foi usado como uma amostra nos Exemplos Experimentais abaixo. mp 168-170 ℃; [a]20D-158,8000˚(c1,0,MeOH); 1 H-NMR(CDCl3,500MHz)d6,78-6,82(m,3H), 6,64(d, J = 1,47Hz, 1H), 5,82-6,01(m,3H), 3,92(s,3H), 3,10(t, J = 5,62Hz, 1H), 2,91(dt, J = 9,35,5,59Hz,1H), 2,74(td, J = 5,69,1,59Hz,1H), 2,12(d, J = 9,29Hz,1H), 2,04(s,2H), 1,58(s,3H),1,01(s,3H); 13 C-NMR(CDCl3,75MHz);d204,92, 165,07, 147,23, 144,24 ,135,54, 134,13, 128,07, 125,50, 121,62, 108,63, 58,08, 56,25, 53,12, 43,75, 40,18, 26,78, 22,16; HRMS valor calculado C18H20O4(M+H)301,1440, valor medido 301,1453; Resultado analítico de HPLC:(método 1)100%(tR=3,46 min).
[098] Usando um método semelhante ao método de preparação do composto 3a, (1S,5R)-4-(3-hidroxistiril)-6,6- dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (composto 3g) foi obtido como um sólido amarelo mostrando as mesmas características (rendimento: 98%). O composto obtido foi usado como uma amostra nos Exemplos Experimentais abaixo. mp 106-108 ℃; [a]20D-176,6˚ (c1,0,MeOH); 1 H-NMR(CDCl3,500MHz); d7,21-7,26 (m, 1H), 7,01-7,05 (m, 2H), 6,92 (d, J = 16,50Hz, 1H), 6,88 (d, J = 16,50Hz, 1H), 6,83-6,86 (m, 1H), 6,46 (s, 1H), 5,96 (s, 1H), 3,11 (t, J = 5,75Hz, 1H), 2,93 (td, J = 5,53, 9,48Hz, 1H), 2,77 (dt, J = 1,59, 5,69Hz, 1H), 2,14 (d, J = 9,29Hz, 1H), 1,59 (s, 3H), 1,01 (s, 3H); 13 C-NMR(CDCl3,75MHz); d205,19, 165,18, 156,53, 137,42, 135,36, 130,03, 127,44, 122,37, 120,19, 116,68, 113,65, 58,17, 53,39, 43,89, 40,28, 26,77, 22,14; HRMS valor calculado C17H18O2(M-H)253,1229, valor medido 253,1228; Resultado analítico de HPLC:(método 2)99,3%(tR=3,73min).
[099] Usando um método semelhante ao método de preparação do composto 3a, (1S,5R)-4-(2-hidroxistiril)-6,6- dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (composto 3h) foi obtido como um sólido amarelo mostrando as mesmas características (rendimento: 100%). O composto obtido foi usado como uma amostra nos Exemplos Experimentais abaixo. mp 140-142 ℃; [a]20D-296,6˚ (c1,0,MeOH); 1 H-NMR(CD3OD,500MHz);d7,56 (dd, J = 1,59, 7,70Hz, 1H), 7,42 (d, J = 16,14Hz, 1H), 7,15(dd, J = 1,59, 15,53Hz, 1H), 7,13 (d, J = 16,38Hz, 1H), 6,80-6,87 (m, 2H), 5,89 (s, 1H), 3,25 (t, J = 5,87Hz, 1H), 2,99 (dt, J = 5,53, 9,48Hz, 1H), 2,65(td, J = 1,71, 5,75Hz, 1H), 2,08 (d, J = 9,29Hz, 1H), 1,61 (s, 3H), 1,01 (s, 3H); 13 C-NMR(CD3OD,75MHz); d207,46, 169,09, 157,56, 133,10, 131,67, 128,67, 127,63, 124,55, 122,03, 121,07, 117,05, 59,62, 54,52, 45,29, 41,45, 27,19, 22,58; HRMS valor calculado C17H18O2(M-H)253,1229, valor medido 253,1218; Resultado analítico de HPLC:(método 1)99,4%(tR=3,80min).
[0100] Usando um método semelhante ao método de preparação do composto 3a, (1S,5R)-4-(2-hidroxi-4-metoxistiril)-6,6-dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (composto 3i) foi obtido como um gel amarelo mostrando as mesmas características (rendimento: 96%). O composto obtido foi usado como uma amostra nos Exemplos Experimentais abaixo. [a]20D-91,8˚(c1,0,MeOH); 1 H-NMR(CDCl3,500MHz); d8,46 (br.s., 1H), 7,37 (d, J = 8,56Hz, 1H), 7,23 (d, J = 16,50Hz, 1H), 7,17 (d, J = 16,00Hz, 1H), 6,42- 6,55 (m, 2H), 6,04 (s, 1H),3,78 (s, 3H), 3,20 (t, J = 5,38Hz, 1H), 2,88-2,98 (m, 1H), 2,76 (t, J = 5,14Hz, 1H), 2,17 (d, J = 9,54Hz, 1H), 1,59 (s, 3H), 1,05 (s, 3H); 13 C-NMR(CDCl3,75MHz); d206,56, 167,94, 161,72, 156,99, 132,26, 130,09, 125,37, 119,93, 116,29, 106,90, 101,73, 57,96, 55,28, 53,74, 43,85, 40,60, 26,76, 22,13; HRMS valor calculado C18H20O3(M+H)285,1491, valor medido 285,1494; Resultado analítico de HPLC:(método 1)99,2%(tR=3,75min).
[0101] Usando um método semelhante ao método de preparação do composto 2a, (1S,5R)-6,6- dimetil-4-stirilbiciclo[3.1.1]hept-3- en-2-ona (composto 4a) foi obtido como um gel amarelo mostrando as mesmas características (rendimento: 92%). O composto obtido foi usado como uma amostra nos Exemplos Experimentais abaixo. [a]20D-91,8˚ (c1,0,MeOH); 1 H-NMR(CDCl3,500MHz); d7,50(d, J = 7,09Hz, 2H), 7,35-7,40 (m, 2H), 7,33 (d, J = 7,34Hz, 1H),6,97 (d, J = 16,00Hz, 1H), 6,92 (d, J = 16,00Hz, 1H), 5,94 (s, 1H), 3,12 (td, J = 1,47, 5,87Hz, 1H), 2,93 (dt, J = 5,62, 9,54Hz, 1H), 2,74 (td, J = 1,71, 5,75Hz, 1H), 2,13 (d, J = 9,29Hz, 1H), 1,59 (s, 3H), 1,02 (s, 3H); 13 C-NMR(CDCl3,75MHz); d204,13, 164,23, 135,99, 134,96, 129,15, 128,88, 127,42, 127,35, 122,66, 58,23, 52,87, 43,76, 40,03, 26,78, 22,16; HRMS valor calculado C17H18O(M+H)239,1436, valor medido 239,1426; Resultado analítico de HPLC:(método 1)95,0%(tR=4,82min).
[0102] Usando um método semelhante ao método de preparação do composto 2a, (1S,5R)-4-(4-fluorostiril)-6,6- dimetilciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (composto 4b) foi obtido como um gel amarelo mostrando as mesmas características (rendimento: 92%). O composto obtido foi usado como uma amostra nos Exemplos Experimentais abaixo. [a]20D-33,2˚ (c1,0,MeOH); 1 H-NMR(CDCl3,500MHz); d7,46-7,51 (m, 2H), 7,04-7,09 (m, 2H), 6,90 (d, J = 17,00Hz, 1H),6,86 (d, J = 16,50Hz, 1H),5,93 (s, 1H), 3,10 (td, J = 1,35, 5,81Hz, 1H), 2,92 (dt, J = 5,62, 9,29Hz, 1H), 2,74 (td, J = 1,71, 5,75Hz, 1H), 2,12 (d, J = 9,29Hz, 1H), 1,59 (s, 3H), 1,02 (s, 3H); 13 C-NMR(CDCl3,75MHz); d204,04, 164,03, 162,13, 133,62, 132,21, 129,04, 127,15, 122,61, 116,02, 58,17, 52,83, 43,72, 39,99, 26,73, 22,12; HRMS valor calculado C17H17FO(M+H)257,1342, valor medido 257,1343; Resultado analítico de HPLC:(método 1)90,6%(tR=4,52min).
[0103] Usando um método semelhante ao método de preparação do composto 2a, (1S,5R)-4-(4-metoxistiril)-6,6- dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (composto 4c) foi obtido como um sólido amarelo mostrando as mesmas características (rendimento: 90%). O composto obtido foi usado como uma amostra nos Exemplos Experimentais abaixo. mp 138-140 ℃; [a]20D-172,0˚ (c1,0,MeOH); 1 H-NMR(CDCl3,500MHz); d7,46 (d, J = 8,80Hz, 2H), 6,91 (d, J = 9,05Hz, 2H), 6,90(d, J = 15,90Hz, 1H), 6,84 (d, J = 16,50Hz, 1H), 5,90 (s, 1H), 3,85 (s, 3H), 3,12 (td, J = 1,35, 5,81 Hz, 1H), 2,92 (dt, J = 5,53, 9,48Hz, 1H), 2,73 (td, J = 1,71, 5,75Hz, 1H), 2,13 (d, J = 9,54Hz, 1H), 1,59 (s, 3H), 1,03 (s, 3H); 13 C-NMR(CDCl3,75MHz); d204,17, 164,63, 160,50, 134,64, 128,83, 128,78, 125,25, 121,66, 114,35, 58,17, 55,34, 52,74, 43,76, 39,99, 26,76, 22,15; HRMS valor calculado C18H20O2(M+H)269,1542, valor medido 269,1549; Resultado analítico de HPLC:(método 1)100%(tR=4,58min).
[0104] Exemplo 1-15: Preparação de (1S,5R)-4-(2-(bifenil-4- il)vinil)-6,6-dimetilciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (composto 4d)
[0105] Usando um método semelhante ao método de preparação do composto 2a, (1S,5R)-4-(2-(bifenil-4-il)vinil)-6,6- dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (composto 4d) foi obtido como um sólido amarelo mostrando as mesmas características (rendimento: 92%). O composto obtido foi usado como uma amostra nos Exemplos Experimentais abaixo. mp 148-150 ℃; [a]20D-152,4˚ (c1,0,MeOH); 1 H-NMR(CDCl3,500MHz); d7,55-7,65 (m, 6H), 7,45 (t, J = 7,58Hz, 2H), 7,34-7,39 (m, 1H), 7,01 (d, J = 16,50Hz, 1H), 6,96 (d, J = 16,50Hz, 1H), 5,95 (s, 1H), 3,14 (t, J = 5,75Hz, 1H), 2,94 (dt, J = 5,50, 9,54Hz, 1H), 2,75 (t, J = 5,62Hz, 1H), 2,14 (d, J = 9,29Hz, 1H), 1,60 (s, 3H), 1,03 (s, 3H); 13 C-NMR(CDCl3,75MHz); d204,12, 164,23, 141,86, 140,23, 134,99, 134,50, 128,87, 127,84, 127,69, 127,51, 127,38, 126,94, 122,65, 58,24, 52,86, 43,77, 40,02, 26,79, 22,18; HRMS valor calculado C23H22O(M+H)315,1749, valor medido 315,1737; Resultado analítico de HPLC:(método 1)100%(tR=6,35min).
[0106] Usando um método semelhante ao método de preparação do composto 2a, (1S,5R)-4-(4-(1H-pirrol-1-il)stiril)-6,6- dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona composto (4e) foi obtido como um sólido amarelo mostrando as mesmas características (rendimento: 41%). O composto obtido foi usado como uma amostra nos Exemplos Experimentais abaixo. mp 146-148 ℃; [a]20D-142,4˚ (c1,0,MeOH); 1 H-NMR(CDCl3,500MHz); d7,55(d, J=8,56Hz, 2H), 7,39 (d, J=8,56Hz, 2H), 7,12 (t, J=2,20Hz, 2H), 6,95(d, J=16,00Hz, 1H), 6,91 (d, J=16,00Hz, 1H), 6,36 (t, J=2,20Hz, 2H), 5,94 (s, 1H), 3,12 (t, J=5,75Hz, 1H), 2,93 (td, J=5,59, 9,35Hz, 1H), 2,74 (dt, J=1,71, 5,75Hz, 1H), 2,13(d, J=9,29Hz, 1H), 1,59 (s, 3H), 1,03 (s, 3H); 13 C-NMR(CDCl3,75MHz); d203,97, 164,03, 140,92, 133,78, 133,21, 128,57, 127,14, 122,61, 120,25, 118,95, 110,94, 58,19, 25,79, 43,72, 39,97, 26,75, 22,14; HRMS valor calculado C21H21NO(M+H)304,1701, valor medido 304,1691; Resultado analítico de HPLC:(método 1)94,7%(tR=5,10min).
[0107] Usando um método semelhante ao método de preparação do composto 2a, (1S,5R)-4-(3,4-dimetoxistiril)-6,6- dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (composto 4f) foi obtido como um gel amarelo mostrando as mesmas características (rendimento: 92%). O composto obtido foi usado como uma amostra nos Exemplos Experimentais abaixo. [a]20D-111,2˚ (c1,0,MeOH); 1 H-NMR(CDCl3,500MHz); d7,02-7,09 (m, 2H), 6,89 (d, J=16,00Hz, 1H), 6,86 (d, J=7,00Hz, 1H), 6,83 (d, J=16,50Hz, 1H), 5,91 (s, 1H), 3,93 (s, 3H), 3,91 (s, 3H), 3,11 (t, J=5,75Hz, 1H), 2,91 (dtd, J=1,47, 5,56, 9,41Hz, 1H), 2,72 (tt, J=1,74, 5,72Hz, 1H), 2,11 (d, J=9,29Hz, 1H), 1,58 (s, 3H), 1,02 (s, 3H); 13 C-NMR(CDCl3,75MHz); d204,03, 164,46, 150,28, 149,30, 134,89, 129,10, 125,42, 121,75, 111,24, 109,29, 58,19, 55,94, 52,69, 43,82, 39,96, 26,76, 22,15; HRMS valor calculado C19H22O3(M+H)299,1647,valor medido 299,1657; Resultado analítico de HPLC:(método 2)97,9%(tR=9,19min).
[0108] Usando um método semelhante ao método de preparação do composto 2a, (1S,5R)-4-(3,5-dimetoxistiril)-6,6- dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (composto 4g) foi obtido como um gel amarelo mostrando as mesmas características (rendimento: 90%). O composto obtido foi usado como uma amostra nos Exemplos Experimentais abaixo. [a]20D-94,2˚ (c1,0,MeOH); 1 H-NMR(CDCl3,500MHz); d6,93 (d, J=16,00Hz, 1H), 6,85 (d, J=16,00Hz, 1H), 6,65 (d, J=2,20Hz, 2H), 6,45 (t, J=2,20Hz, 1H), 5,94 (s, 1H), 3,82 (s, 6H), 3,10 (t, J=5,75Hz, 1H), 2,92 (dt, J=5,62, 9,54Hz, 1H), 2,74 (td, J=1,59, 5,69Hz, 1H), 2,12 (d, J=9,29Hz, 1H), 1,58 (s, 3H), 1,02 (s, 3H); 13 C-NMR(CDCl3,75MHz); d204,04, 163,03, 161,03, 137,88, 134,93, 127,83, 122,81, 105,32, 101,51, 58,19, 55,40, 52,82, 43,73, 39,99, 26,73, 22,12; HRMS valor calculado C19H22O3(M+H)299,1647, valor medido 299,1662; Método analítico HPLC:(método 1)100%(tR=4,58min).
[0109] Usando um método semelhante ao método de preparação do composto 2a, (1S,5R)-4-(2,5-dimetoxistiril)-6,6- dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (composto 4h) foi obtido como um gel amarelo mostrando as mesmas características (rendimento: 93%). O composto obtido foi usado como uma amostra nos Exemplos Experimentais abaixo. [a]20D-94,8˚ (c1,0,MeOH); 1 H-NMR(CDCl3,500MHz); d7,29 (d, J=16,38Hz, 1H),7,11 (d, J=2,69Hz, 1H), 6,95 (d, J=16,14Hz, 1H), 6,81-6,88 (m, 2H), 5,92 (s, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,81 (s, 3H), 3,16 (dt, J=1,50, 6,00Hz, 1H), 2,91 (td, J=5,62, 9,29Hz, 1H), 2,72 (dt, J=1,71, 5,75Hz, 1H), 2,11 (d, J=9,29Hz, 1H), 1,58 (s, 3H), 1,02 (s, 3H); 13 C-NMR(CDCl3,75MHz); d204,16, 164,83, 153,74, 152,04, 129,50, 127,74, 125,62, 122,37, 115,85, 112,34, 111,85, 58,24, 56,13, 52,76, 43,76, 40,03, 26,76, 22,15; HRMS valor calculado C19H22O3(M+H)299,1647, valor medido 299,1650; Resultado analítico de HPLC:(método 1)96,4%(tR=4,69min).
[0110] Usando um método semelhante ao método de preparação do composto 2a, (1S,5R)-4-(5-bromo-2-metoxistiril)-6,6- dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (composto 4i) foi obtido como um gel amarelo mostrando as mesmas características (rendimento: 97%). O composto obtido foi usado como uma amostra nos Exemplos Experimentais abaixo. [a]20D-71,6˚(c1,0,MeOH); 1 H-NMR(CDCl3,500MHz); d7,66 (s, 1H), 7,36 (dd, J=2,45, 8,80Hz, 1H), 7,20 (d, J=16,38Hz, 1H), 6,95(d, J=16,14Hz, 1H), 6,77 (d, J=8,80Hz, 1H), 5,93 (s, 1H), 3,87 (s, 3H), 3,12 (t, J=5,62Hz, 1H), 2,91 (dt, J=5,35, 9,60Hz, 1H), 2,73 (t, J=5,14Hz, 1H), 2,11 (d, J=9,29Hz, 1H), 1,58 (s, 3H), 1,01 (s, 3H); 13 C-NMR(CDCl3,75MHz); d203,97, 164,31, 156,40, 132,53, 129,53, 128,69, 128,09, 127,04, 122,89, 113,28, 112,75, 58,22, 55,77, 52,76, 43,71, 39,98, 26,73, 22,11; HRMS valor calculado C18H19BrO2(M+H)347,0647, valor medido 347,0651; Resultado analítico de HPLC:(método 1)99,0%(tR=6,23min).
[0111] A fim de obter dieno a partir de (1S)-(-)-verbenona por condensação de aldol, (1S)-(-)-verbenona 1 (200 mg, 1,33 mmol) e 2-piridinacarboxaldeído (171 mg, 1,60 mmol) foram agitados em MeOH (7 mL), e tratados com NaOCH3 (25% em peso solução em MeOH). A mistura de reação foi agitada a 60℃ por 6 horas, e resfriada até temperatura ambiente. Uma quantidade pequena de água foi adicionada à mistura que foi então deixada em repouso em temperatura ambiente por 24 horas. Em seguida, a mistura foi concentrada sob pressão reduzida, e purificada por cromatografia de coluna, obtendo, assim (1S,5R)-6,6-dimetil-4-((E)-2-(piridin- 2-il)vinil)biciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (composto 5a) como um xarope amarelo mostrando as seguintes características (258 mg, 81% de rendimento). O composto obtido foi usado como uma amostra nos Exemplos Experimentais abaixo. [a]20D-102,0000˚ (c1,0,MeOH);
[0112] 1HNMR(CDCl3,500MHz);d8,60(dd,J=4,77,0,61Hz,1H),7,67(td,J=7,70,1,71H z,1H),7,45(d,J=15,90Hz,1H),7,39(d,J=7,83Hz,1H),7,19(ddd,J=7,52,4 ,83,0,86Hz,1H),6,96(d,J=15,89Hz,1H),6,02(s,1H),3,08 3,14(m,1H),2,87- 2,95(m,1H),2,73(td,J=5,69,1,59Hz,1H),2,11(d,J=9,29Hz,1H),1,57(s, 3H),1,00(s,3H); 13 C-NMR (CDCl3,75MHz);d203,92, 163,51, 154,33, 149,96, 136,65, 133,90, 131,15, 124,29, 123,13, 58,27, 52,90, 43,86, 39,97, 26,71, 22,12; HRMS valor calculado C16H17NO(M+H)240,1388, valor medido 240,1392; Resultado analítico de HPLC: (método 1) 98,4% (tR=4,28 min).
[0113] Usando um método semelhante ao método de preparação do composto 5a, (1S,5R)-6,6-dimetil-4-((E)-2-(piridin-3- il)vinil)biciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (composto 5b) foi obtido como um sólido amarelo mostrando as mesmas características (rendimento: 77%). O composto obtido foi usado como uma amostra nos Exemplos Experimentais abaixo. mp 102-104 ℃; [a]20D-204,0˚(c1,0,MeOH); [A] 20 D -204,0 ˚ (c 1,0, MeOH); 1 H-NMR(CDCl3 ,500MHz); d 8,70 (d, J= 1,96Hz, 1H),8,54 (dd, J= 1,22, 4,65Hz, 1H), 7,85 (td, J= 1,86, 8,01Hz, 1H), 7,31 (dd, J= 4,77, 7,95Hz, 1H), 7,02 (d, J= 16,00Hz, 1H), 6,91 (d, J= 16,00Hz, 1H), 5,97 (s,1H), 3,12 (dt, J= 1,10, 5,81Hz, 1H), 2,94 (td, J= 5,62, 9,54Hz, 1H), 2,76 (dt, J= 1,71, 5,75Hz, 1H), 2,13 (d, J= 9,54Hz, 1H), 1,60 (s, 3H), 1,03 (s, 3H); 13 C-NMR(CDCl3 ,75MHz); d203,72, 163,28, 149,82, 149,35, 133,12, 131,73, 130,98, 129,34, 123,61, 58,23, 52,84, 43,64, 39,96, 26,72, 22,13; HRMS valor calculado C16H17NO(M+H)240,1388, valor medido 240,1397; Resultado analítico de HPLC:(método 1)98,7%(t R =3,89min).
[0114] Usando um método semelhante ao método de preparação do composto 5a, (1S,5R)-6,6-dimetil-4-((E)-2-(piridin-4- il)vinil)biciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (composto 5c) foi obtido como um gel amarelo mostrando as mesmas características (rendimento: 80%). O composto obtido foi usado como uma amostra nos Exemplos Experimentais abaixo. [a]20D-152,0˚(c1,0,MeOH); 1 H-NMR(CDCl3,500MHz); d8,62 (d, J=5,87Hz, 2H), 7,35 (d, J=5,87Hz, 2H), 7,13 (d, J=16,14Hz, 1H), 6,84 (d, J=16,14Hz, 1H), 6,01 (s, 1H), 3,10 (t, J=5,87Hz, 1H), 2,95 (td, J=5,62, 9,54Hz, 1H), 2,77 (dt, J=1,59, 5,69Hz, 1H), 2,13 (d, J=9,54Hz, 1H), 1,60 (s, 3H), 1,02 (s, 3H); 13 C-NMR(CDCl3,75MHz); d203,57, 162,78, 150,42, 143,12, 131,89, 131,57, 124,62, 121,23, 58,24, 52,90, 43,68, 39,95, 26,70, 22,11; HRMS valor calculado C16H17NO(M+H)240,1338, valor medido 240,1378; Resultado analítico de HPLC:(método 1)98,4%(tR=4,29min).
[0115] Ratos SD (260-270 g, machos) foram adquiridos de Charles River Laboratories (Seul, Coreia) e aclimatados ao ambiente sob um ciclo de 12-hr claro/12-hr escuro antes do experimento. Os animais foram liberados ao acesso à água potável ad libitum, e o experimento foi realizado sob a aprovação do NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e o Korea University Institutional Animal Care & Use Committee.
[0116] Dados foram expressos como médias ± S.E.M., e análises estatísticas foram realizadas por análise de uma via de variância (ANOVA) e teste de Bonferroni post-hoc. P < <0,05 foi considerado significativo. Antes de análise ANOVA, valor de P de teste de Levene para qualidade de variâncias foi determinado (P>0,05). Se necessário, os dados foram ainda analisados pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido por teste de Mann-Whitney.
[0117] Para avaliar os efeitos das amostras, obtidas nos Exemplos acima, em excitotoxicidade, o seguinte experimento foi realizado de acordo com o método revelado na literatura (Ju C. et al., BBRC, 431(3), 484-489, 2013).
[0118] Neurônios corticais (5 x 105células/ml) foram isolados de ratos SD fetais (16-17 dias). Especificamente, o córtex cerebral foi cortado, e as células foram isoladas a partir do tecido por trituração repetida usando uma pipeta Pasteur em tampão (solução de sal balanceado de Hanks, HBSS). A suspensão celular (1,8 x 103 células/mm2) foi dispensada em uma placa pré-tratada com poli-Dlisina(100mg/ml)/laminina (4 mg/ml). As células foram plaqueadas em meio NBM contendo 10% FBS, e incubadas em uma atmosfera de 96% ar/5% CO2 a 37℃. Após 15-16 dias da incubação, o experimento foi realizado.
[0119] Para induzir os sintomas de isquemia hipóxica in vitro, as células incubadas foram colocadas em uma câmara anóxica (pressão parcial de oxigênio < 2 mmHg). As células foram incubadas em DMEM isento de glicose enquanto eram borbulhadas com uma mistura de gás anaeróbico (95% N2 e 5% CO2) por 30 minutos para remover o oxigênio residual, e foram incubadas a 37℃ por 90 minutos para privação de oxigênio. Após 90 minutos, a solução exposta foi recolocada com 25 mmol/L meio DMEM contendo glicose para interromper a reação de OGD, e as células foram restabelecidas com condições normais de oxigênio. As células de controle não expostas a OGD foram incubadas em meio DMEM contendo glicose (25 mmol/L) fornecido com uma mistura de gás aeróbico (95% ar e 5% CO2). As células foram tratadas com cada amostra 30 minutos antes, e durante o período inteiro de OGD/reoxigenação.
[0120] Após a incubação na placa por 15-18 dias, os neurônios corticais foram expostos a NMDA (100 mM) em uma solução (solução de sal balanceado de Earle livre de Mg2+ (EBSS); contendo 1,8 mM CaCl2 e 10mM glicina) por 10 minutos. Após a exposição, as células foram lavadas com solução EBSS contendo MgSO4, e incubadas em meio DMEM contendo 25 mmol/L glicose em uma incubadora 5% CO2 a 37℃. 30 Minutos antes do tratamento com NMDA, as células foram tratadas com cada amostra (10 mM).
[0121] A fim de medir a lesão celular ou morte celular, a quantidade de LDH liberada no meio foi medida usando um kit de medição de viabilidade celular (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). A viabilidade celular foi expressa como o percentual de nível de LDH celular para o nível de LDH celular medido em culturas irmãs lisadas por congelamento-descongelamento após o experimento.
[0122] Excitotoxicidade é um fator principal na morte neuronal induzida por isquemia, particularmente isquemia cerebral precoce. OGD é um modelo experimental que imita o rompimento abrupto de fornecimento de sangue e consumo de energia na isquemia. A lesão celular é induzida por OGD e lesão de membrana celular e lesão neuronal podem ser avaliados pela medição da liberação de uma proteína como LDH no meio. Como resultado, foi observado que os compostos (3a, 3c e 3f) significativamente reduziram a lesão neuronal comparável a MK801 (já bem conhecido como antagonista de receptor de NMDA), e não demonstrou citotoxicidade (FIG. 1). Excitotoxicidade causada por estimulação excessiva de receptor de NMDA é um fator principal que é envolvido em lesão neuronal durante OGD/R e lesão isquêmica cerebral resultando de geração simultânea de radicais livres levando ao estresse oxidativo. Os resultados deste experimento indicaram que os compostos (3a, 3c, 3f, 3i e 5a) da presente invenção significativamente reduziram lesão neuronal induzida por NMDA em células neuronais corticais cultivadas, embora as atividades das mesmas tenham sido inferiores do que as atividades anti-excitotóxica de MK-801 (FIG. 2). Isto sugere que a inibição de excitotoxicidade neuronal induzida por NMDA pelos compostos da presente invenção contribuem para a atividade antiisquêmica.
[0123] Para avaliar as atividades antioxidantes diretas das amostras obtidas nos Exemplos acima, o seguinte experimento foi realizado de acordo com o método revelado na literatura (Ju c. et al., BBRC, 431(3), 484-489, 2013 ; Huang D. et al., J. Agric. Food Chem.,53, 1841-1856, 2005.)
[0124] Para avaliar as atividades de limpeza de radical direta das amostras, em 1 hora após a reoxigenação, as células foram coradas com a sonda fluorescente H2DCF-DA (2,7- dihidroiclorofluorescein diacetato) que é amplamente usada para medir estresse oxidativo intracelular. Após 2 horas, as células foram lavadas em tampão EBSS (contendo 25 mM glicose, 1,8 mM CaCal2, 1,2 mM MgSO4 e 2,5 mM probenecida (pH7,4)), e a fluorescência de DCF foi medida com um leitor de microplaca de fluorescência (SpectraMax GeminiEM; Ex = 485 nm, Em = 530 nm) ou um microscópio de fluorescência (DM IL HC Fluo, Leica, Wetzlar, Alemanha) equipado com uma câmera digital (DFC420C, Leica, Wetzlar Alemanha). A intensidade de fluorescência foi compensada com autofluorescência (ou seja, a fluorescência de células não carregadas com H2DCF-DA).
[0125] Os resultados do experimento indicaram que os compostos 3c e 3f reduziram estresse oxidativo intracelular induzido por OGD (FIG. 3).
[0126] As amostras foram misturadas com DPPH (23,6 µg/ml, em etanol), e incubadas no escuro a 37℃ por 30 minutos. A absorbância de DPPH reduzida por cada amostra foi medida a 517 nm. Vitamina C (Sigma–Aldrich, St. Louis, MO) foi usada como um controle, e o valor de inibição de DPPH (%) foi calculado usando a seguinte equação: Equação 1 Atividade de limpeza (%) = [Absmax(Vit.C)-Abssample]/[Absmax(Vit.C)- Absmin(Vit.C)]X100. (3) Medição de capacidade de absorbância de radical de oxigênio (ORAC)
[0127] Um ensaio ORAC foi realizado como revelado na literatura (Huang, D. et al., J. Agric. Food Chem., 53,1841-56, 2005).
[0128] AAPH (60mM) e fluoresceína (50nM) foram preparadas em tampão (75mM tampão fosfato, pH7,4) sem uma amostra ou uma amostra ou um padrão (Trolox). Cada uma das amostras e o padrão foram suspensos em uma solução de 7% RMCD (beta-ciclodextrina metilada aleatoriamente) em 50% acetona. RMCD foi usado para aumentar a solubilidade de amostras solúveis em óleo. Cada amostra foi suficientemente misturada com solução de fluoresceína (66 nM, 190 µl) por agitação por 5 segundos. Após incubação a 37°C por 10 minutos, AAPH (500 mM, 30 µl) foi rapidamente adicionado a cada amostra, e uma redução na fluorescência foi medida usando um leitor de microplaca de fluorescência (Ex = 485 nm, Em = 530 nm; SpectraMax GeminiEM, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a 37°C em intervalos de 5 min por 9 horas. Para quantificar a atividade de limpeza de radicais peroxil, AUC (área sob a curva) foi calculada de acordo com a seguinte equação 2, e AUC líquido foi calculado usando a seguinte equação 3, e o TE (equivalentes em trolox) de cada amostra foi calculado de acordo com a seguinte equação 4 baseada em uma curva padrão de AUC líquido plotado de acordo com um aumento na concentração de trolox. Equação 2 AUC = (0,5 + f1/f0 + f2/f0 + f3/f0 + … + fn-2/f0 + fn-1/f0 + fn/f0) x 5, em que f0 é a primeira fluorescência a 0 min e tempo I. Equação 3 AUC líquida = AUCsample-AUCblank. Equação 4 TE (equivalentes trolox) de cada amostra = [netAUCsample at25mM ]/[net AUCtrolox at25mM].
[0129] As atividades antioxidantes dos derivados de verbenona da presente invenção foram medidas pelas seguintes duas reações químicas diferentes: (1) um único ensaio baseado em transferência de elétrons que é um ensaio de 2,2-di(4-tertoctilfenil)-1-picrilhidrazil [DPPH] que mede uma redução em DPPH agindo como um gerador de radical livre e uma sonda de terminação; e (2) um ensaio de transferência de átomo de hidrogênio que é um ensaio de capacidade de absorbância de radical oxigênio [ORAC] que mede a cinética de reação de competição de um gerador de radical peroxil (AAPH; 2,2'-azobis- (2-metilpropionamida)-dicloridrato) e cada amostra atuando como um antioxidante para sonda fluorescente oxidável (fluoresceína).
[0130] Os resultados deste experimento indicaram que, no ensaio DPPH, a maioria dos derivados de stiril (3a-f, e 3h-i) tendo um grupo fenol mostrou uma forte e direta atividade de limpeza contra a conversão de DPPH aos radicais livres de nitrogênio orgânico (ver Tabela 1). Entre estes, os compostos 3c e 3f mostraram uma atividade de limpeza mais forte comparada à vitamina C na mesma concentração. No ensaio ORAC, foi demonstrado que o composto (4e) tendo um grupo pirrol e compostos (3a-i) tendo um grupo fenol todos demonstraram atividades fortes de limpeza do radical peroxil em comparação a trolox (ver Tabelas 1 e 2). Além disso, foi demonstrado que a introdução de um grupo hidroxil nas posições meta e para do grupo fenil aumentou a atividade de limpeza do radical livre de cada composto. Tabela 1
Figure img0008
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Exemplo 2-3: Experimento em modelo de isquemia cerebral focal
[0131] Para avaliar os efeitos das amostras, obtidas nos Exemplos acima, em isquemia cerebral focal, o seguinte experimento foi realizado de acordo com o método revelado na literatura (Belayev L. et al., Stroke, 27, 1616-1622, 1996; discussão 1623). (1) Modelo de isquemia cerebral focal
[0132] Os ratos foram anestesiados com 3,0% isoflurano em mistura de N2O e O2 (70:30 v/v) via máscara facial e foram mantidos em 2% isoflurano. Ao longo do período experimental, a temperatura corporal foi controlada e mantida a 37°C± 0,3°C usando um termômetro retal e uma almofada de aquecimento até que os animais estivessem suficientemente recuperados da anestesia após a cirurgia. A isquemia cerebral focal foi obtida por MCAO endovascular do lado direito. Resumidamente, uma sutura de náilon de monofilamento 3-0 heat-blunted (Ethicon Johnson & Johnson, Brussels, Bélgica) foi inserida no lúmen do coro da artéria carótida externa e avançou 17,5 mm na artéria carótida interna para ocluir o óstio do MCA. A sutura foi removida 1,5 hora após para permitir a recuperação dos animais. Controles operados foram submetidos aos mesmos procedimentos cirúrgicos, exceto para MCAO. Os valores fisiológicos foram medidos 15 minutos antes de MCAO e em 15 minutos após reperfusão, e pressões arteriais médias foram monitoradas por 5 minutos usando um analisador de pressão arterial (MicroMed, Lousville, KY), e glicose foram monitorados usando um analisador (Ciba Corning Diagnostics Corp., Medfield, MA). Uma amostra de 5% (composto 3f) foi dissolvida em DMSO, diluída com 10% cremóforo e salina estéril, e foi administrada por via intraperitoneal aos ratos a partir de 2 horas após a indução de MCAO (100 mg/kg). (2) Medição de volume do infarto
[0133] Os ratos foram anestesiados com 3,5% hidrato de cloral (5 ml/kg, injeção intraperitoneal) e decapitados. As secções coronarianas do cérebro (2 mm) obtidas usando uma matriz (matriz de cérebro de rato, Ted Pella, Redding, CA) foram coradas com 2% cloreto de trifeniltetrazólio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a 37°C por 30 minutos, fixado com 4% paraformaldeído (pH 7,4), e subsequentemente crioprotegido em tampão de fosfato contendo 30% sacarose a 4°C por 2 dias. A área de secção transversal de infarto entre os níveis de bregma de +4 mm (anterior) e -6 mm (posterior) foram determinados com software de análise (OPTIMAS5,1image analysis program, BioScanInc. Edmonds, WA). O tamanho do infarto cerebral foi medido manualmente por delineamento das margens das áreas de infarto. O volume de infarto total (mm3) foi calculado de acordo com a seguinte equação 5 como revelado em um documento (J Neurosci Methods (1998) 84:9-16; J Cereb Blood Flow Metab (1990) 10:290-293), e compensado para edema cerebral. Edema cerebral foi determinado por aumento de percentual da área de hemisfério ipsilateral/contralateral como mostrado na seguinte equação 6. As medições foram todas realizadas em um modo duplo-cego. Equação 5 Volume de infarto total (mm3) = volume ipsilateral (IVd) obtido por medição direta x [(volume contralateral (Vc))/ volume ipsilateral (VI)] Equação 6 Volume do edema) (%) = [(volume ipsilateral (VI) –volume contralateral (Vc))/ volume contralateral (Vc)] × 100.
[0134] Por fim, os tecidos foram congelados, cortados em secções coronais de 10 ou 30 µm e armazenados a −20°C. (3) Medição de perda neurológica
[0135] Perda neurológica foi medida a 24 horas após isquemia, e classificados em uma escala de 4 pontos como revelado na literatura (0: sem perda neurológica, 1: pata foi dobrada, 2: pata dobrada, resistência reduzida para a força que empurra a lateral, e não girada; 3: o mesmo que 2, mas girada). (4) Coloração imunohistológica de tecido cerebral
[0136] As secções de tecido cerebral como descrito acima foram tratadas com tampão contendo soro 5% em temperatura ambiente por 1 hora para inibir a ligação de anticorpo não específica. Anticorpos primários diluídos em concentrações apropriadas (anticorpo MPO e anticorpo ED-1, cada um 1:100; anticorpo Nitrotirosina, 1:50; anticorpos IL-1a, IL-1b, TNF-a, cada 1:100) foram adicionados às secções de tecido que foram então corados durante a noite a 4°C. Anticorpo primário não ligado foi removido por lavagem, e então as seções de tecido foram cotadas com anticorpos secundários marcados com fluorescência em temperatura ambiente por 1 hora. Anticorpo secundário não ligado foi removido por lavagem, e então o núcleo foi corado com corante Hoechst 33258 por 20 minutos, seguido por lavagem. As seções foram montadas em uma lâmina de vidro, e então observadas com um microscópio de fluorescência confocal (Zeiss LSM510; Zeiss, Oberkochen, Alemanha). (5) Experimento em permeabilidade de barreira hematoencefálica
[0137] Corante de coloração (corante azul de Evans, 2%) se liga a uma albumina sérica imediatamente após a injeção intravenosa e é convertido a um material de peso molecular alto incapaz de passar através da barreira hematoencefálica normal, mas no tecido cerebral de rato induzido por isquemia cerebral, a permeabilidade de azul de Evans é aumentada devido ao dano da barreira hematoencefálica, e assim, a quantidade de coloração com azul de Evans aumenta. O coração dos ratos tendo isquemia cerebral focal induzida como descrito acima foi perfundido com 200 ml de salina fisiológica. O tecido cerebral foi extraído, pesado e mantido em um reagente (ácido tricloroacético, 60%) a 4°C por 24 horas. O tecido foi picado, e centrifugado a 10.000 rpm por 15 minutos, e o sobrenadante foi coletado. A absorbância de azul de Evans no tecido cerebral foi medida a 610 nm e calculada como a quantidade de corante por grama de tecido. (6) Experimento em taxa de sobrevida de longo prazo
[0138] Para ratos tendo isquemia cerebral focal induzida como descrito acima, a taxa de sobrevida e déficit neurológico foram medidos por 3 semanas sob as mesmas condições como aquelas antes da cirurgia. (7) Modelo de animal de acidente vascular cerebral isquêmico embólico
[0139] Ratos (peso: 270-300 g) foram anestesiados com 3,0% isoflurano em uma mistura de 70% N2O/30% O2 (70:30 v/v) e foram mantidos em 3% isoflurano. Um termômetro retal foi inserido nos ratos, e a temperatura corporal dos ratos foi mantida a 37,0~37,9°C usando uma almofada de aquecimento automática conectada ao termômetro. A linha média do pescoço foi cortada, a artéria carótida comum direita (CCA), a artéria carótida externa direita (ECA) e a artéria carótida interna direita (ICA) foram separadas, e a artéria carótida externa e a artéria carótida comum foram amarradas. A artéria carótida interna foi temporariamente apertada usando um clip de dobra microvascular. Os ramos começando da artéria carótida externa e a artéria carótida interna foram cortados, e êmbolo de 35 mm foi injetado na artéria carótida externa por uma seringa Hamilton de 100 ul usando um cateter PE-50 modificado (diâmetro externo: 0,58 mm; diâmetro interno: 0,3 mm apropriado para injeção intravascular). O clip microvascular foi removido, e o cateter foi cuidadosamente avançado 16-17 mm na artéria carótida interna e movimentado a um ponto correspondente a cerca de 2 mm do ponto inicial da artéria cerebral média. O êmbolo do cateter foi injetado na artéria carótida interna (10 ul). Em 5 minutos após injeção do êmbolo, o cateter foi removido. O ramo da artéria carótida interna foi amarrado, e o local da incisão foi suturado, e em seguida, os ratos foram deixados em repouso até recuperação da anestesia. O êmbolo a ser usado no experimento foi obtido por injeção de sangue arterial femoral (coletado de ratos doadores) rapidamente em um tubo PE-50 e deixando o sangue repousar em temperatura ambiente por 2 horas e a 4℃ por 22 horas para produzir trombos. Antes do experimento, o tubo foi cortado e os trombos foram transferidos a um cateter PE-50 modificado através de um tubo PE-10 usando uma seringa de 1 ml contendo salina equipada com uma agulha de 23G.
[0140] Os resultados do experimento indicaram que, no modelo de rato induzido por isquemia transitória, o tratamento após a isquemia com amostra 3f (50 mg/kg) (injeção intraperitoneal; administrado duas vezes (ou seja 2 horas e 7 horas após infarto cerebral)) significativamente reduziu a lesão isquêmica, edema cerebral e déficit neurológico (FIG. 4). Além disso, quando a atividade antioxidante em tecido foi medida por coloração imunohistológica para nitrotirosina em secções de tecido cerebral obtidas dos ratos administrados com as amostras, foi demonstrado que a atividade antioxidante no tecido cerebral do grupo tratado com amostra foi significativamente aumentada (FIG. 5).
[0141] Entretanto, quando a infiltração de células inflamatórias nas áreas de infarto cerebral e áreas de cérebro lesionado foi avaliada por coloração imunohistológica, foi observado que a migração de neutrófilos/monócitos corados com anticorpo MPO e microglia/macrófagos corados com anticorpo ED-1 foi significativamente inibida (FIG. 6). Além disso, foi demonstrado que os níveis de expressão de citocinas (como IL-1 alfa, IL-1 beta, e TNF-alfa, conhecidas por desempenharem um papel importante na lesão isquêmica) em tecido foram significativamente reduzidos no grupo administrado com as amostras (FIG. 7). Além disso, foi demonstrado que os compostos da presente invenção significativamente reduziram a permeabilidade da barreira hematoencefálica que foi aumentada pela lesão isquêmica (FIG. 8). Ainda, quando os efeitos das amostras (compostos) da presente invenção em taxa de sobrevida em longo prazo e recuperação neurológica foram observados por 3 semanas após a administração das amostras para os modelos de rato induzidos por isquemia temporal, foi demonstrado que a taxa de sobre de longo prazo e recuperação neurológica de ratos administrados com amostras foram significativamente aumentadas (FIG. 9). No caso de acidente vascular cerebral isquêmico, o aumento no sangramento por uma droga (por exemplo, tPA) frequentemente ocorre, o que pode aumentar os efeitos colaterais clínicos (por exemplo, morte ou prognóstico fraco) nos pacientes. No entanto, as amostras da presente invenção não influenciaram significativamente o tamanho da lesão cerebral nos modelos de animais in vivo tendo vascular cerebral embólico induzido por sangue autólogo, sugerindo que há uma pequena possibilidade de que as amostras da presente invenção causem ditos efeitos colaterais (FIG. 10).
[0142] Deste ponto em diante, exemplos de formulação de um composto contendo o composto da presente invenção serão descritos, mas estas formulações são para fins ilustrativos apenas e não pretendem limitar o escopo da presente invenção. Exemplo de formulação 1: Preparação de pó
Figure img0010
[0143] Os compostos acima são misturados um com outro e preenchidos em um sachê hermético para preparar uma formulação em pó. Exemplo de formulação 2: Preparação de comprimido
Figure img0011
[0144] Os componentes acima são misturados um com o outro, e então comprimentos em um formato de comprimido de acordo com um método convencional, preparando assim, uma formulação de comprimido. Exemplo de formulação 3: Preparação de cápsula
Figure img0012
[0145] De acordo com um método convencional de preparação de cápsula, os componentes acima foram misturados com cada outro e preenchidos em uma cápsula gelatinosa, preparando assim uma formulação de cápsula. Exemplo de formulação 4: Preparação de solução injetável
Figure img0013
[0146] De acordo com um método de preparação de solução injetável convencional, uma mistura dos componentes acima é preenchido em cada ampola (2 ㎖). Exemplo de formulação 5: Preparação de formulação líquida
Figure img0014
[0147] De acordo com um método convencional para preparar uma formulação líquida, cada um dos componentes acima foi dissolvido em água purificada, e fragrância de limão é adicionada a este. Então, água purificada é adicionada à mistura em um volume total de 100 ml, e a solução foi preenchida em um frasco marrom e esterilizada, assim, preparando uma formulação líquida. Exemplo de formulação 6: Preparação de alimento funcional de saúde
Figure img0015
Figure img0016
[0148] Os conteúdos de componentes em cada uma das misturas de vitamina e minerais são conteúdos relativamente apropriados para alimentos funcionais, mas podem ser modificados para quaisquer outros valores. De acordo com um método convencional para preparar alimentos funcionais de saúde, os componentes acima são misturados um com o outro e então granulados e os grânulos podem ser usados na preparação de alimentos funcionais de saúde de acordo com um método convencional. Exemplo de formulação 7: Preparação de bebida funcional de saúde
Figure img0017
[0149] De acordo com o método convencional para a preparação de alimentos funcionais de saúde, os componentes acima são misturados e então agitados e aquecidos a 85℃ por cerca de 1 hora. Então, a solução é filtrada, preenchida em um recipiente de 2ℓ, vedada, armazenada a frio e então usada na preparação de bebida funcional de saúde da presente invenção.
[0150] A composição descrita acima é relativamente apropriada par bebidas favoritas, mas pode variar de acordo com a as preferências de localização e étnicas como hierarquia do consumidor, países do consumidor, o uso pretendido e semelhantes.
[0151] Embora a presente invenção tenha sido descrita em detalhe com referência às características específicas, será evidente para os especialistas na técnica que esta descrição é apenas para uma modalidade preferencial e não limita o escopo da presente invenção. Assim, o escopo substancial da presente invenção será definido pelas reivindicações anexadas e equivalentes das mesmas.
Aplicabilidade Industrial
[0152] Como descrito acima, a composição farmacêutica contendo um derivado de verbenona como um ingrediente ativo mostra efeitos de proteção de neurônios, a inibição de excitotoxicidade induzida por NMDA, a inibição de estresse oxidativo intracelular, e a inibição de migração de células inflamatórias, em comparação com as composições farmacêuticas convencionais. Assim, este tem os efeitos de tratar doenças cerebrais degenerativas, especificamente lesão isquêmica cerebral. Além disso, pode ser ainda usado nos alimentos funcionais de saúde.

Claims (8)

1. COMPOSTO CONTENDO DERIVADO DE VERBENONA, caracterizado pela Fórmula 1 ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, como abaixo indicado: Fórmula 1
Figure img0018
em que R1, R2, R3, R4 e R5 são cada um independentemente pelo menos um selecionado do grupo que consiste em um átomo de hidrogênio, um átomo de halogênio selecionado de F, Cl, Br e I, um grupo hidroxil, um grupo C1-C3 alquil, um grupo C1-C3 alcoxi, um grupo amino, um grupo C1-C3 alquilamina, um grupo C1-C3 alquildiamina, um anel aromático C5-C8, um anel cíclico C5-C8, e um anel heteroaromático C5-C8; X, Y e Z são cada um independentemente um átomo de carbono ou pelo menos um heteroátomo selecionado do grupo que consiste em átomos de N, O e S; e denota uma ligação dupla ou uma ligação simples
2. COMPOSTO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R1, R2, R3, R4 e R5 são cada um independentemente pelo menos um selecionado do grupo que consiste em um átomo de hidrogênio, um átomo de halogênio selecionado de F, Cl, Br e I, um grupo hidroxil, um grupo metil, um grupo etil, um grupo metoxi, um grupo etoxi, um grupo amino, um anel aromático C5-C6, um anel cíclico C5-C6, e um anel heteroaromático C5-C6.
3. COMPOSTO de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que R1, R2, R3, R4 e R5 são cada um independentemente pelo menos um selecionado do grupo que consiste em um átomo de hidrogênio, um átomo de halogênio selecionado de F, Cl, Br e I, um grupo hidroxil, um grupo metil, um grupo metoxi, um grupo fenil, um grupo pirrol, e um grupo piridina.
4. COMPOSTO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que X, Y e Z são cada um, independentemente, um átomo de carbono ou, pelo menos um hetero-átomo selecionado do grupo que consiste em um átomo N, O e S.
5. COMPOSTO de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que X, Y e Z são cada um, independentemente, pelo menos um átomo selecionado do grupo que compreende um átomo de carbono e um átomo N.
6. COMPOSTO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto é selecionado do grupo que consiste em: (1S,5R)-4-(4-hidroxistiril)-6,6-dimetilbicIclo[3.1.1]hept-3- en-2-ona (3a); (1S,5R)-4-(4-hidroxi-2-methoxystiril)-6,6-dimetilbi ciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (3b); (1S,5R)-4-(3,4-dihidroxistiril)-6,6-dimetilbiciclo [3.1.1]hept-3-en-2-ona (3c); (1S,5R)-4-(3-bromo-4-hidroxistiril)-6,6-dimetilbiciclo [3.1.1]hept-3-en-2-ona (3d); (1S,5R)-4-(4-hidroxi-2,6-dimetoxistiril)-6,6-dimetilbi ciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (3e); (1S,5R)-4-(3,4-dihidroxi-5-metoxistiril)-6,6-dimetilbi ciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (3f); (1S,5R)-4-(3-hidroxistiril)-6,6-dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3- en-2-ona (3g); (1S,5R)-4-(2-hidroxistiril)-6,6-dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3- en-2-ona (3h); (1S,5R)-4-(2-hidroxi-4-metoxistiril)-6,6-dimetilbi ciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (3i); (1S,5R)-6,6-dimetil-4-stiril-biciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (4a); (1S,5R)-4-(4-fluorostiril)-6,6-dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3- en-2-ona (4b); (1S,5R)-4-(4-metoxistiril)-6,6-dimetilbiciclo[3.1.1]hept-3- en-2-ona (4c); (1S,5R)-4-(2-(bifenil-4-il)vinil)-6,6-dimetilbiciclo [3.1.1]hept-3-en-2-ona (4d); (1S,5R)-4-(4-(1H-pyrrol-1-il)stiril)-6,6-dimetilbiciclo [3.1.1]hept-3-en-2-ona (4e); (1S,5R)-4-(3,4-dimetoxistiril)-6,6-dimetilbiciclo [3.1.1]hept-3-en-2-ona (4f); (1S,5R)-4-(3,5-dimetoxistiril)-6,6-dimetilbiciclo [3.1.1]hept-3-en-2-ona (4g); (1S,5R)-4-(2,5-dimetoxistiril)-6,6-dimetilbiciclo [3.1.1]hept-3-en-2-ona (4h); (1S,5R)-4-(5-bromo-2-metoxistiril)-6,6-dimetilbiciclo [3.1.1]hept-3-en-2-ona (4i); (1S,5R)-6,6-dimetil-4-((E)-2-(piridin-2-il)vinil)- biciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (5a); (1S,5R)-6,6-dimetil-4-((E)-2-(piridin-3-il)vinil)- biciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona (5b); e (1S,5R)-6,6-dimetil-4-((E)-2-(piridin-4-il)-vinil)- biciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ona(5c).
7. USO DO COMPOSTO definido nas reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para preparar um medicamento para tratar uma doença cerebral degenerativa do grupo que compreende acidente vascular cerebral, paralisia, demência, doença de Alzheimer, doença de Parkinson e doença de Huntington.
8. USO DO COMPOSTO de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a doença cerebral degenerativa é acidente vascular cerebral.
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