KR102555329B1 - 베르베논 유도체를 포함하는 안구질환의 치료 또는 예방용 약학조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 베르베논 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 안구질환의 치료 또는 예방용 약학조성물 또는 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 상세하게는 본 발명의 베르베논 유도체는 각막의 섬유증을 약화시키는 CD147 억제제로 작용하고 MMP-9 활성화를 통한 각막 혼탁 및 관련 근섬유아세포 분화를 억제함으로써 결막염, 각막화상 또는 안구건조증 등의 안구 손상 및 염증을 억제하고 증상을 완화하여 안구질환을 치료 및 예방할 수 있다.

Description

베르베논 유도체를 포함하는 안구질환의 치료 또는 예방용 약학조성물{Composition for Treating or Preventing Ocular Diseases Comprising Verbenone Derivatives}

본 발명은 베르베논 유도체를 포함하는 안구질환의 치료 또는 예방용 약학조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 각막화상을 입은 쥐 각막에서 병리학적 섬유증을 약화시키는 CD147 억제제로 작용하고 MMP-9 활성화를 통해 각막 혼탁 및 관련 근섬유아세포 분화를 억제함으로써 각막화상뿐만 아니라 결막염 또는 안구건조증 등의 안구 손상 및 염증을 억제하고 증상을 완화하여 안구질환을 치료 및 예방할 수 있는 베르베논 유도체를 포함하는 안구질환의 치료 또는 예방용 약학조성물에 관한 것이다.

각막 및 결막질환은 각막 상피 표면의 결함에 의해 유발된다. 원인은 안구건조증, 다양한 각막결막염, 알레르기 및 바이러스, 박테리아, 곰팡이 등의 미생물의 감염과 같은 병원성 인자, 화학 물질에 의한 세포독성 및 산 및 염기로 인한 부식과 같은 화학적 인자, 안구 표면의 건조, 콘택트 렌즈 등과 같은 외부 물질 및 뜨거운 물로 인한 손상과 같은 물리적 인자 등을 포함할 수 있다. 안약 조성물에 포함된 벤즈알코늄 클로라이드, 클로로부탄올 등과 같은 방부제 및 아미노글리코사이드 항생제, 비-스테로이드성 항염제, IDU, 피마리신 등의 안약용제가 각막 상피의 병변을 야기한다는 것이 보고되었다.

각막질환은 안구를 보호하는 방어역할과 눈으로 들어오는 광선을 굴절시켜 망막에 도달하도록 전달하는 역할을 하는 각막에 손상을 입음으로써 투명한 시각의 손상을 야기하는 모든 질환을 의미한다. 각막질환에는 건성 각막염(안구건조증), 각막염, 각막이상, 각막변성, 선천성 각막이상증, 각막미란, 각막혼탁 등이 있다.

안구건조증(Dry Eye Syndrome, DED)은 눈물샘(lacrimal gland) 및 지방선의 일종인 마이봄선(meibomian gland)의 염증으로 인한 눈물 및 지질의 분비 감소가 주요 원인 중 하나이다. 눈물 결핍 또는 과다 증발로 인한 눈물막의 장애로 알려져 있으며, 안검 사이(interpalpebral)의 눈 표면의 훼손을 야기하는 눈의 불편감의 증상과 관련된다. 안구건조증은 불편감, 시력 장애 및 눈물막 불안정성의 증상과 함께 눈 표면에 잠재적인 훼손을 야기하는 눈물 및 눈 표면의 다인자 질병으로, 이는 눈물막의 증가된 삼투압 및 눈 표면의 염증을 동반한다. 안구건조증을 야기하는 다양한 인자가 있다. 감소된 양의 눈물을 정상으로 회복시키는 적합한 방법은 아직까지 발견되지 않았다. 현재로서는 안구건조증을 치료하기 위해, 눈물을 보충할 목적의 인공 누액, 및 자각 증상을 경감할 목적의 콘드로틴 술페이트, 글루타티온, 히알루론산, 피브로넥틴, 혈청 안약 등이 투여되지만 아직까지 그 효과가 충분하지 않다.

또한, 각막 혼탁(corneal opacity)은 각막의 광 투과를 방해하여 시각 기능을 손상시키는 일반적인 임상 결과이며 전 세계적으로 실명의 주요 원인이기도 하다(Oliva, M.S. et al., Indian J ophthalmol 2012, 60, 423-427; Dohlman, T.H. et al., Semin Ophthalmol 2019, 34, 205-210). 부상, 수술, 감염, 화학적 화상 등을 포함한 다양한 원인으로 발생한 각막 손상에 대한 각막 섬유증 반응(corneal fibrosis response)은 종종 심각한 병리학적 각막 혼탁을 유발하여 환자의 삶의 질에 큰 영향을 미친다(Dohlman, T.H. et al., Semin Ophthalmol 2019, 34, 205-210). 따라서 각막 혼탁 과정을 예방하거나 기존의 섬유 조직을 투명 각막으로 되돌릴 수 있는 각막 섬유증 치료제 개발이 요구되고 있다.

각막 손상에 따른 각막 섬유증은 손상된 각막에서 지속적으로 일어나는 각막 근섬유아세포(corneal myofibroblast) 활성화와 밀접한 관련이 있다(Sivak, J.M. et al., Prog Retin Eye Res 2002, 21, 1-14; Gabison, E.E. et al., Prog Retin Eye Res 2009, 28, 19-33; Wilson, S.E., Exp Eye Res 2012, 99, 78-88; Hassell, J.R. et al., Exp Eye Res 2010, 91, 326-335). 각막 손상 후 각막 섬유아세포가 활성화되고 근섬유아세포로 분화된다(Wilson, S.E., Exp Eye Res 2012, 99, 78-88). 섬유아세포와 비교하여 근섬유는 비조직화된 섬유성 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)을 생성할 수 있으며, 이는 빛 산란을 크게 증가시키면서 불응성 지수(refractory index)를 감소시키는 데 기여한다(Boote, C. et al., IOVS 2012, 53, 2786-2795; Massoudi, D. et al., Cell Tissue Res 2016, 363, 337-349; Kivanany, P.B. et al., Sci Rep 2018, 8, 12580). 세포외 기질 금속단백분해효소(matrix metalloproteinase, MMP) 유도제(EMMPRIN)로도 알려진 분화 클러스터 147 (CD147)은 MMP 활성화를 유도하는 잘 알려진 막횡단 당단백질(transmembrane glycoprotein)이다(Gabison, E.E. et al., Am J Pathol 2005, 166, 209-219). 축적된 증거는 CD147이 종양 성장 인자-β (TGF-β) 매개 근섬유아세포 분화를 촉진한다는 것을 시사한다(Huet, E. et al., FASEB J 2008, 22, 1144-1154). 또한, CD147은 상피 기저막을 파괴하는 MMP-9를 유도하여 상피-기질 세포 상호작용과 근섬유아세포 유도 인자의 침투를 촉진하여 결국 근섬유아세포 분화를 가속화한다(Huet, E. et al., Am J Pathol 2011, 179, 1278-1286; Mauris, J. et al., J Cell Sci 2014, 127, 3141-3148). 따라서 CD147과 그에 따른 MMP-9 활성화는 각막 섬유증의 약화를 위한 잠재적인 치료 표적이 될 수 있다.

현재로서는 각막 및 결막 병변을 치료하기 위하여 콘드로이틴 술페이트, 글루타티온, 히알루론산, 피브로넥틴, EGF 등이 투여되거나, 또한 누액을 보충할 목적으로 인공 누액이 투여되지만 치료의 효과가 충분하지 않다는 문제점이 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 베르베논 유도체 화합물이 알칼리로 화상을 입은 쥐 각막에서 병리학적 섬유증을 약화시키는 CD147 억제제로 작용하고, MMP-9 활성화를 통한 각막 혼탁 및 관련 근섬유아세포 분화를 억제함으로써 결막염, 각막화상 또는 안구건조증 등의 안구 손상 및 염증을 억제하고 증상을 완화하여 안구질환을 치료 및 예방할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 결막염, 각막화상 또는 안구건조증 등의 안구 손상 및 염증을 억제하고 증상을 완화하여 치료 및 예방하는 베르베논 유도체의 신규 용도를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 베르베논 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 안구질환의 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공한다.

[화학식 1]

화학식 1에서,

R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅는 각각 독립적으로 수소원자, 할로겐 원자, 하이드록시기, C_1-3 알킬기, C_1-3 알콕시기, 아미노기, C_1-3 알킬아민기, C_1-3 알킬디아민기, C_5-8 아릴기, C_5-8 사이클릭기, C_5-8 헤테로아릴기,

또는

이고,

X, Y 및 Z는 각각 독립적으로 탄소원자 또는 N, O 또는 S 원자이며;

은 이중결합 또는 단일결합을 의미한다.

본 발명은 또한, 상기 화학식 1로 표시되는 베르베논 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 안구질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 심한 각막 손상 후 병적 섬유화를 예방하여 각막 혼탁을 예방할 수 있어 잠재적으로 유망한 각막 섬유증 치료제가 될 수 있다. 본 발명에 따른 베르베논 유도체를 유효성분으로 포함하는 약학조성물은 CD147 결합을 억제하고 MMP-9 활성화를 통한 각막 혼탁 및 관련 근섬유아세포 분화를 억제하고, 기존의 약물인 코르티코스테로이드 (PA)에 비해 손상된 각막에 대해 우수한 항섬유화 효과를 나타낸다. 따라서, 결막염, 각막화상 또는 안구건조증 등의 안구 손상 및 염증을 억제하고 증상을 완화하여 안구질환을 치료 및 예방할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 SP-8356이 알칼리 화상 2주 후 알칼리성 각막 혼탁 및 각막 두께 증가를 억제하는 것을 나타낸 도면이다. (A) 각막 헤이즈의 대표적인 이미지. 알칼리 화상 전체 각막 절편을 H & E (SP-8356; 0.9% 염수, PA에 혼합된 0.933 mM SP-8356; 1% 프레드니솔론 아세테이트)로 염색한 사진. (B) 각막 혼탁도의 정량 분석 결과. (C) 5개 관심 영역의 각막 두께에 대한 정량 분석 결과.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 SP-1154가 알칼리 화상 2주 후 알칼리성 각막 혼탁을 억제하는 것을 나타낸 도면이다. 도 1의 경우 SP-8356은 염(saline)에서 잘 녹지 않기 때문에 현탁액으로 사용하였으나 도 2부터의 실시예에서는 SP-8356의 프로드럭(prodrug) 형태인 SP-8356의 발린 에스테르(valine ester, SP-8356 1154)를 사용하였다. SP-8356의 프로드럭(prodrug) 형태인 SP-8356의 발린 에스테르(valine ester, SP-8356 1154)는 SP-8356으로 매우 빠르게 전환되고 수용성이 높아 점성이 있는 히알루론산(hyaluronic acid)에 녹여 사용하였다. (A) 각막 헤이즈의 대표적인 이미지 (HA; 0.1% 히알루론산, SP-1154/HA; 0.1% 히알루론산, PA에 용해된 0.05% SP-1154; 1% 프레드니솔론 아세테이트). (B) 각막 혼탁의 정량 분석.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 SP-1154이 알칼리 화상 후 2주에 각막의 근섬유아세포 집단을 억제하는 것을 나타낸 도면이다. (A) 근섬유아세포 집단의 대표적인 이미지. 알칼리 화상을 입힌 전체 각막 절편을 편평하게 장착하고 H&E 및 항-αSMA 항체로 염색하였다. (B) 전체 각막에서 αSMA의 정량 분석. (C) αSMA의 상대적 mRNA 수준의 정량적 분석.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 SP-1154이 알칼리 화상 후 2주에 MMP 활성을 억제한다는 것을 나타낸 도면이다. (A) 인시츄(in situ) 자이모그래피(zymography)로 시각화되는 MMP 활동의 대표적인 이미지. 스케일 바, 100 ㎛ (배율, X 200). (B) MMP-9 젤라틴 아크릴아미드 겔 자이모그래피의 대표적인 이미지. (C) 전체 각막용 용해물에서 MMP-9 활성의 상대적 수준에 대한 정량 분석.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 건성안 안구 표면의 형광색소 플루오레세인(fluorescein) 염색을 통해 SP-1154의 약효를 평가하여 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 건성안 동물 모델에서 SP-1154의 신생혈관생성 억제능을 확인한 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 건성안 동물 모델에서 SP-1154의 염증세포 침윤 억제능을 확인한 도면이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

각막 손상에 대한 각막 섬유화 반응은 종종 심각한 각막 혼탁화로 이어져 심각한 시각 장애 또는 실명을 초래한다. 각막 혼탁의 지속성은 각막 근섬유아세포의 활동에 크게 좌우된다. 근섬유아세포는 불투명하고 체계적이지 못한 세포외 기질(disorganized extracellular matrix, ECM)를 합성하여 불투명화를 촉진한다. 면역 글로불린 수퍼 패밀리의 구성원인 분화 클러스터 147 (CD147)은 손상된 각막에서 섬유 모세포에서 근섬유아세포로의 분화 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으므로 각막 혼탁 치료에 효과적인 표적이 될 수 있다. 따라서, 베르베논 유도체 (1S,5R)-4-(3,4-디히드록시-5-메톡시스티릴)-6,6-디메틸비시클로[3.1.1]헵트-3-엔-2-온((1S,5R)-4-(3,4-dihydroxy-5-methoxystyryl)-6,6-dimethylbicyclo[3.1.1]hept-3-en-2-one), SP-8356)가 CD147을 억제하여 각막섬유증을 치료하는 효능이 있는 것을 확인하였다.

또한, SP-8356은 알칼리-화상 각막에서의 각막 혼탁과 섬유증을 현저하게 감소시켰다. 구체적으로 SP-8356은 근섬유아세포를 발현하는 alpha-평활근 액틴(α-smooth muscle actin, α-SMA)과 MMP-9 (matrix-metalloproteinase-9) 및 콜라겐 유형 III 및 IV와 같은 ECM 관련 생성물을 모두 억제하였다. SP-8356과 유사하게 국소 코르티코스테로이드 (프레드니솔론 아세테이트, PA)도 ECM 관련 생성물 및 혼탁화를 감소시켰다. 그러나 프레드니솔론 아세테이트는 α-SMA 양성 각막 근섬유아세포의 개체수를 감소시키지 못하다는 것을 확인하였다.

본 발명에서는 합성 소분자 약물 SP-8356 ((1S,5R)4-(3,4-dihydroxy-5-methoxystyryl)-6,6-dimethylbicyclo[3.1.1]hept-3-en-2-one)이 CD147에 직접 결합하여 신생내막비후(neointimal hyperplasia)를 억제하고 MMP-9 활성의 억제를 통해 동물 모델의 플라크 취약성을 안정화시키고(Pahk, K. et al., J Transl Med 2019, 17, 274; Pahk, K. et al., Int J Mol Sci 2019, 21, 95) CD147/MMP-9 경로의 억제를 통해 항종양 효과를 가지고 있는 것(Mander, S. et al., Sci Rep 2019, 9, 6595)을 기초로 하여 CD147/MMP-9에 의해 매개되는 것으로 알려진 각막섬유증에 대한 SP-8356의 억제 약리 효과를 확인하였다.

안구건조증(Dry Eye Syndrome, DED)은 눈물샘 (lacrimal gland) 및 지방선의 일종인 마이봄선 (meibomian gland)의 염증으로 인한 눈물 및 지질의 분비 감소가 주요 원인 중 하나이다. 각막(cornea)와 결막(conjunctiva)의 항상성은 눈물 및 지방샘의 분비량에 전적으로 의존하며, 분비량에 문제가 생길 경우 각막 및 결막내 MMP의 증가로 이어지게 된다. 특히 MMP9의 경우 눈물내 농도에 따라 직접적으로 각막 및 결막 상피내 세포외 기질에 손상을 유발하여 염증세포 침투 및 각막 두께 증가로 이어지게 된다.

뇌졸중, 동맥경화 및 알칼리성 각막 손상에서 SP-8356이 MMP9의 활성 및 발현을 억제하는 것에 착안하여 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride, BAC) 유도 안구건조증 동물 모델에서 기존 치료제인 사이클로스포린 A(cyclosporin A, Restasis)와의 효능을 비교 및 평가하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 화학식 1로 표시되는 베르베논 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 안구질환의 치료 또는 예방용 약학조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

화학식 1에서, R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅는 각각 독립적으로 수소원자, 할로겐 원자, 하이드록시기, C_1-3 알킬기, C_1-3 알콕시기, 아미노기, C_1-3 알킬아민기, C_1-3 알킬디아민기, C_5-8 아릴기, C_5-8 사이클릭기, C_5-8 헤테로아릴기,

또는

이고,

X, Y 및 Z는 각각 독립적으로 탄소원자 또는 N, O 또는 S 원자이며;

은 이중결합 또는 단일결합을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅는 각각 독립적으로 수소원자, 할로겐 원자, 하이드록시기, 메틸기, 에틸기, 메톡시기, 에톡시기, 아미노기, C_5-6 아릴기, C_5-6 사이클릭기, C_5-6 헤테로아릴기,

또는

일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅는 각각 독립적으로 수소원자, 할로겐 원자, 하이드록시기, 메틸기, 메톡시기, 페닐기, 피롤기, 피리딘기,

또는 일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 베르베논 유도체는

(1S,5R)-4-(4-히드록시스티릴)-6,6-디메틸비시클로[3.1.1]헵트-3-엔-2-온 (3a);

(1S,5R)-4-(4-히드록시-2-메톡시스티릴)-6,6-디메틸비시클로[3.1.1]헵트-3-엔-2-온 (3b);

(1S,5R)-4-(3,4-디히드록시스티릴)-6,6-디메틸비시클로[3.1.1]헵트-3-엔-2-온 (3c);

(1S,5R)-4-(3-브로모-4-히드록시스티릴)-6,6-디메틸비시클로[3.1.1]헵트-3-엔-2-온 (3d);

(1S,5R)-4-(4-히드록시-2,6-디메톡시스티릴)-6,6-디메틸비시클로[3.1.1] 헵트-3-엔-2-온 (3e);

(1S,5R)-4-(3,4-디히드록시-5-메톡시스티릴)-6,6-디메틸비시클로[3.1.1] 헵트-3-엔-2-온 (3f);

(1S,5R)-4-(3-히드록시스티릴)-6,6-디메틸비시클로[3.1.1]헵트-3-엔-2-온 (3g);

(1S,5R)-4-(2-히드록시스티릴)-6,6-디메틸비시클로[3.1.1]헵트-3-엔-2-온 (3h);

(1S,5R)-4-(2-히드록시-4-메톡시스티릴)-6,6-디메틸비시클로[3.1.1]헵트-3-엔-2-온 (3i);

(1S,5R)-6,6-디메틸-4-스티릴비시클로[3.1.1]헵트-3-엔-2-온 (4a);

(1S,5R)-4-(4-플루오로스티릴)-6,6-디메틸비시클로[3.1.1]헵트-3-엔-2-온 (4b);

(1S,5R)-4-(4-메톡시스티릴)-6,6-디메틸비시클로[3.1.1]헵트-3-엔-2-온 (4c);

(1S,5R)-4-(2-(비페닐-4-일)비닐)-6,6-디메틸비시클로[3.1.1]헵트-3-엔-2-온 (4d);

(1S,5R)-4-(4-(1H-피롤-1-일)스티릴)-디메틸비시클로[3.1.1]헵트-3-엔-2-온 (4e);

(1S,5R)-4-(3,4-디메톡시스티릴)-6,6-디메틸비시클로[3.1.1]헵트-3-엔-2-온 (4f);

(1S,5R)-4-(3,5-디메톡시스티릴)-6,6-디메틸비시클로[3.1.1]헵트-3-엔-2-온 (4g);

(1S,5R)-4-(2,5-디메톡시스티릴)-6,6-디메틸비시클로[3.1.1]헵트-3-엔-2-온 (4h);

(1S,5R)-4-(5-브로모-2-메톡시스티릴)-6,6-디메틸비시클로[3.1.1]헵트-3-엔-2-온 (4i);

(1S,5R)-6,6-디메틸-4-((E)-2-(피리딘-2-일)비닐)비시클로[3.1.1]헵트-3-엔-2-온 (5a);

(1S,5R)-6,6-디메틸-4-((E)-2-(피리딘-3-일)비닐)비시클로[3.1.1]헵트-3-엔-2-온 (5b);

(1S,5R)-6,6-디메틸-4-((E)-2-(피리딘-4-일)비닐)비시클로[3.1.1]헵트-3-엔-2-온 (5c); 및

(2S,2'S)-5-((E)-2-((1R,5S)-6,6-디메틸-4-옥소비시클로[3.1.1]헵트-2-엔-2-일)비닐)-3-메톡시-1,2-페닐렌 비스(2-아미노-3-메틸부타노에이트)-2-하이드로클로라이드(6)로 구성된 군에서 하나 이상 선택될 수 있으며, 바람직하게는 (1S,5R)-4-(3,4-디히드록시-5-메톡시스티릴)-6,6-디메틸비시클로[3.1.1]헵트-3-엔-2-온 (3f) 또는 (2S,2'S)-5-((E)-2-((1R,5S)-6,6-디메틸-4-옥소비시클로[3.1.1]헵트-2-엔-2-일)비닐)-3-메톡시-1,2-페닐렌 비스(2-아미노-3-메틸부타노에이트)-2-하이드로클로라이드(6)일 수 있다.

[화학식 2]

(화합물 3f)

[화학식 3]

(화합물 6)

본 발명에 있어서, 상기 안구질환은 각막질환 또는 결막질환일 수 있고, 상기 안구질환은 결막염, 각막화상, 안구건조증, 안구 충혈, 각막 신생혈관 및 각막염으로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 상기 안구질환은 비감염성일 수 있다. 바람직하게는 상기 약학조성물은 안구 외용제형일 수 있다.

본 발명에 있어서, SP-8356은 염(saline)에서 잘 녹지 않기 때문에 현탁액으로 사용할 때, 약효가 약하기는 하나 유의적이다. 또한, SP-8356의 프로드럭(prodrug) 형태인 SP-8356의 발린 에스테르(valine ester, SP-8356 1154)는 SP-8356으로 매우 빠르게 전환되고 수용성이 높아 점성이 있는 히알루론산(hyaluronic acid)에 녹여 사용한다. 용해성(soluble) SP-8356 (SP1154)는 현탁액으로 투여한 SP-8356보다 효과가 우수하다.

본 발명에서 사용된 용어 "치료"란, 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 베르베논 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여로 안구질환의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 "예방"이란, 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 베르베논 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여로 안구질환의 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 "프로드럭"이란 신체 내 및 신체 외에서 활성 약물을 방출하기 위해 효소나 가수분해를 통하여 모 약물(parent drug)로 전환을 필요로 하는 약물 분자의 유도체를 나타낸다. 프로드럭은 빈번히, 반드시 그런 것은 아니지만, 모 약물이 변환되는 동안 약학적으로 비활성이다.

상기 화학식 1로 표시되는 본 발명의 화합물들은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가 염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산 (lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 화학식 1의 구조를 갖는 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "약학 조성물"이란, 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각의 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 구체적으로, 점안투여하기 적합한 형태, 예를 들어, 점안제, 크림제, 연고제, 겔제 또는 로션제로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하, 점안 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 점안, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 캡슐, 정제 및 수성 현탁액 및 용액을 포함하여 경구적으로 허용되는 어떠한 용량형으로도 경구 투여될 수 있다. 경구용 정제의 경우, 흔히 사용되는 담체로는 락토즈 및 옥수수 전분이 포함된다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제가 또한 전형적으로 첨가된다. 캡슐형으로 경구 투여하는 경우 유용한 희석제로는 락토즈 및 건조된 옥수수전분이 포함된다. 수성 현탁액이 경구 투여될 때 활성 성분은 유화제 및 현탁화제와 배합된다. 필요한 경우, 감미제 및/또는 풍미제 및/또는 착색제가 첨가될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 칼슘채널 차단제, 항산화제, 글루타메이트 길항제, 항응고제, 항고혈압제, 항혈전제, 항히스타민제, 소염진통제, 항암제 및 항생제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 약제와 함께 제제화하거나 병용하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서 화학식 1로 표시되는 베르베논 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 안구질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

본 발명의 기능성 식품은 염증 예방을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은, 예를 들어, 각종 식품류, 캔디, 초콜릿, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 이에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 적어도 면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 화합물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 그러므로 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 다른 관점에서 화학식 1로 표시되는 베르베논 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 안구질환의 치료 또는 예방용 약학조성물을 개체의 안구에 투여하는 단계를 포함하는 안구질환의 치료 또는 예방방법에 관한 것이고, 화학식 1로 표시되는 베르베논 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 안구질환의 치료 또는 예방용 약학조성물의 새로운 용도에 관한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예]

제조예 1: 베르베논 유도체의 제조

시약급(1S)-(-)-베르베논(verbenone), 3,4-디히드록시-5-메톡시벤즈알데히드, 메틸클로로메틸에테르(methylchloromethylether; MOM-Cl), 디이소프로필에틸아민(diisopropylethylamine; DIPEA), 수산화 칼륨(potassiumhydroxide; KOH), 및 소듐 메톡사이드(sodium methoxide; NaOCH3)을 시중 구입하고 모든 시약 및 용매는 고순도로 구입사용하였고 수산화 칼슘으로 증류한 디클로메탄을 제외하고 추가 정제과정없이 바로 사용하였으며, 별다른 언급이 없는 한, 반응은 진공-처리된 건조 유리용기(vacuum-flame dried glassware)에서 건조 질소 대기하에서 수행되었다. 박층 크로마토그래피법(Thin-layer chromatography; TLC)은 UV로 시각화하는 실리카겔(Merck silica gel 60 F₂₅₄)을 사용하고 컬럼 크로마토그래피는 실리카겔(E.Merck silica gel, 70-230, 230-400mesh)을 사용하였다.

¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 스펙트럼은 기기(Varian)으로 500 MHz에서 측정하였고 화학적 이동(Chemical shift)은 내부 표준시약(s are reported in ppm from (TMS) as an internal standard (CDCl₃:d7.26ppm)로서 사용한 TMS(tetramethysilane)로부터 이동을 ppm으로 기록하고 결합상수(coupling constant)를 헤르츠(hertz)로 기록하였다. 다중도(Multiplicity)는 하기와 같은 약어를 사용하였다: singlet(s), doublet(d), doublet of doublet(dd), doublet of doublet of doublet(ddd), triplet(t), triplet of doublet(td), doublet of triplet(dt), quartet(q), multiplet(m) 및 broad(br). 우태아 혈청(Fetal bovine serum; FBS)은 회사(Hyclone, Logan, UT)에서 구입하여 사용하고 배양액 (neurobasal medium, NBM) 및 보충제(B27 supplement)는 회사(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 구입하여 사용하였다. 모든 화학물질 및 시약은 회사(SigmaAldrich, St. Louis, MO)에서 구입하여 사용하였다.

화학식 3f의 화합물은 하기 반응식 1에 따라 제조하였다.

[반응식 1]

(1 S ,5 R )-4-(3-메톡시-4,5-비스(메톡시메톡시)스티릴)-6,6-디메틸비시클로[3.1.1]헵트-3-엔-2-온 (2f) 화합물의 제조

3,4-디히드록시-5-메톡시벤즈알데히드 400 mg을 디클로로메탄 4 mL에 투입한 후 디이소프로필에틸아민 920 mg을 투입하고 냉각시켰다. 메틸클로로메틸에테르 570mg을 가하고 실온에서 교반하였다. 소량의 물을 가하고 층분리한 후 유기층을 탈수하고 감압 농축하였다.

알돌 축합반응(aldol condensation)으로 (1S)-(-)-베르베논(verbenone)으로부터 디엔체(diene)를 얻기 위하여, (1S)-(-)-베르베논(verbenone 1, 380mg과 3-메톡시-4,5-비스(메톡시메톡시)벤즈알데히드 620 mg을 MeOH 6.2 mL에 투입하고 KOH 270 mg을 투입한 후 60℃에서 교반하고 실온으로 냉각시켰다. 소량의 물을 첨가하고 유기층을 분리한 후 탈수하여 감압 농축 하면 황색 산물을 얻고 이를 실리카겔 컬럼 크로마토그리피로 정제하여 (1S,5R)-4-(3-메톡시-4,5-비스(메톡시메톡시)스티릴)-6,6-디메틸비시클로[3.1.1]헵트-3-엔-2-온(2f)[(1S,5R)-4-(3-methoxy-4,5-bis(methoxymethoxy)styryl)-6,6-dimethylbicyclo[3.1.1]hept-3-en-2-one(2f)]을 수득하였다(수율 90%).

¹H-NMR(CDCl₃,500MHz);

d6.94(d,J=1.96Hz,1H),6.84(s,2H),6.78(d,J=1.71Hz,1H),5.92(s,1H),5.22(s,2H),5.15(s,2H), 3.89(s,3H), 3.60(s,3H), 3.52(s,3H), 3.09(t,J=5.75Hz,1H), 2.90(dt,J=9.48,5.53Hz,1H),2.72(td,J=5.75,1.47Hz,1H),2.10(d,J=9.29Hz,1H),1.57(s,3H),1.00(s,3H);

¹³C-NMR(CDCl₃,75MHz); d203.92, 164.02, 153.63, 151.19, 136.64, 134.76, 132.10, 126.91, 122.43, 108.91,104.88, 98.37, 95.33, 58.19, 57.11, 56.07, 52.70, 43.78, 39.93, 26.70, 22.11.

(1S,5R)-4-(3,4-디히드록시-5-메톡시스티릴)-6,6-디메틸비시클로[3.1.1] 헵트-3-엔-2-온(((1S,5R)-4-(3,4-dihydroxy-5-methoxystyryl)-6,6-dimethylbicyclo[3.1.1]hept-3-en-2-one), 3f)화합물의 제조

2f 화합물 960mg을 MeOH 5 mL에 투입하고 진한 염산 630 mg을 적가하고 교반하였다. 포화 NaHCO₃을 첨가하여 반응액을 중성으로 맞추고 에틸아세테이트로 추출하고 탈수한 후 감압 농축하였다. 최종 화합물을 컬럼 크로마토그리피로 정제 및 분리하여 하기 물성치를 나타내는 황색 고체상의 (1S,5R)-4-(3,4-디히드록시-5-메톡시스티릴)-6,6-디메틸비시클로[3.1.1] 헵트-3-엔-2-온(3f)을 수득하여 하기 실험예의 시료로 사용하였다(수율 92%):

mp 168-170 ℃;

[a]²⁰ _D-158.8000°(ㅊ1.0,MeOH);

¹H-NMR(CDCl₃,500MHz): d6.78-6.82(m,3H),6.64(d,J=1.47Hz,1H),5.82-6.01(m,3H),3.92(s,3H),3.10(t,J=5.62Hz,1H),2.91(dt,J=9.35,5.59Hz,1H),2.74(td,J=5.69,1.59Hz,1H),2.12(d,J=9.29Hz,1H),2.04(s,2H),1.58(s,3H),1.01(s,3H);

¹³C-NMR(CDCl₃,75MHz); d204.92,165.07,147.23,144.24,135.54,134.13,128.07,125.

50,121.62,108.63,58.08,56.25,53.12,43.75,40.18,26.78,22.16;

HRMS 계산치 C18H20O4(M+H)301.1440, 측정치 301.1453;

HPLC 분석결과:(방법 1)100%(t_R=3.46 분).

프로드럭 SP-1154는 하기 반응식 2에 따라 제조하였다.

[반응식 2]

(2 S ,2' S )-5-(( E )-2-((1 R ,5 S )-6,6-디메틸-4-옥소비시클로[3.1.1]헵트-2-엔-2-일)비닐)-3-메톡시-1,2-페닐렌 비스(2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부타노에이트) 화합물의 제조(LTV)

디클로로메탄(5 mL)중 3f 화합물(SP-8356, (1S,5R)-4-(3,4-디히드록시-5-메톡시스티릴)-6,6-디메틸비시클로[3.1.1]헵트-3-엔-2-온, 600 mg, 2.0 mmol)이 교반되는 용액에, N-(tert-부톡시카보닐)-L-발린(Boc-Val-OH (1.3g 6.0 mmol)), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 염산 (EDCI (1.15g 6.0 mmol))과 4-디메틸아미노피리딘(DMAP (120 mg 1.0 mmol))을 투입하고 실온에서 1시간 동안 교반한다. 반응완료 후 물 6 mL를 투입하고 유기층을 분리한 후 20% NaCl 수용액 6 mL로 세척한다. 유기층을 무수황산나트륨으로 탈수하고 감압 농축한다. 디에틸에테르 6 mL로 재결정하여 (2S,2'S)-5-((E)-2-((1R,5S)-6,6-디메틸-4-옥소비시클로[3.1.1]헵트-2-엔-2-일)비닐)-3-메톡시-1,2-페닐렌 비스(2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부타노에이트)를 수득하였다(수율 67%).

¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz): d 6.97 (2H, brs), 6.90 (1H, d, J = 16.0 Hz), 6.84 (1H, d, J = 15.5 Hz), 5.95 (1H, s), 5.34 (1H, d, J = 9.0 Hz, NH), 5.14 (1H, d, J = 9.0 Hz, NH), 4.23 - 4.50 (2H, m), 3.87 (3H, s), 3.09 (1H, t, J = 5.5 Hz), 2.91 - 2.95 (1H, m), 2.73 - 2.75 (1H, m), 2.32 - 2.40 (2H, m), 2.12 (1H, d, J = 9.5 Hz), 2.04 (3H, s), 1.59 (3H, s), 1.47 (18H, brs), 1.01 - 1.09 (12H, m)

¹³C-NMR (CDCl₃, 100 MHz): d 204.0, 169.9, 169.4, 163.6, 155.9, 155.6, 152.4, 143.5, 134.7, 133.5, 132.0, 128.5, 123.3, 114.3, 108.0, 80.0, 79.9, 59.1, 58.4, 58.2, 56.1, 52.9, 43.6, 39.9, 31.1, 30.8, 28.3, 26.7, 22.1, 19.2, 19.1, 17.7, 17.1

(2 S ,2' S )-5-(( E )-2-((1 R ,5 S )-6,6-디메틸-4-옥소비시클로[3.1.1]헵트-2-엔-2-일)비닐)-3-메톡시-1,2-페닐렌 비스(2-아미노-3-메틸부타노에이트) 이염산염 화합물의 제조

(2S,2'S)-5-((E)-2-((1R,5S)-6,6-디메틸-4-옥소비시클로[3.1.1]헵트-2-엔-2-일)비닐)-3-메톡시-1,2-페닐렌 비스(2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부타노에이트) (920 mg, 1.32 mmol)에 아세토니트릴 9.2 mL과 2N HCl 디에틸에테르 용액 9.2 mL를 투입한다. 실온에서 3시간 동안 교반 후 고체를 여과하고 에틸아세테이트 18.4 mL를 투입하여 24시간 동안 교반한다. 고체를 여과하고 건조하여 (2S,2'S)-5-((E)-2-((1R,5S)-6,6-디메틸-4-옥소비시클로[3.1.1]헵트-2-엔-2-일)비닐)-3-메톡시-1,2-페닐렌 비스(2-아미노-3-메틸부타노에이트) 이염산염을 수득하였다, (수율: 89%)

¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): d 9.00 (6H, brs), 7.48 (1H, m), 7.33 (1H, d, J = 16.0 Hz), 7.19 - 7.24 (2H, m), 5.96 (1H, s), 4.52 (2H, m), 3.88 (3H, s), 3.23 (1H, t, J = 5.0 Hz), 2.92 (1H, m), 2.58 (1H, d, J = 4.5 Hz), 2.38 - 2.43 (2H, m), 1.96 (1H, d, J = 9.0 Hz), 1.54 (3H, s), 1.08 - 1.14 (12H, m), 0.91 (3H, s)

¹³C-NMR (CDCl₃, 100 MHz): d 203.1, 167.2, 166.8, 164.6, 152.3, 142.7, 136.2, 134.0, 131.0, 129.6, 123.13, 123.08, 114.6, 109.8, 58.0, 57.4, 57.35, 57.0, 56.9, 52.5, 43.2, 30.0, 26.7, 22.3, 18.9, 18.3, 18.2, 17.7

실시예 1: 각막 화상 후 각막 혼탁에 대한 베르베논 유도체의 효과

1.1. 동물

6주령 수컷 Sprague-Dawley (SD) 쥐는 Orient Bio (한국 성남)에서 입수하였다. 모든 쥐는 물과 음식에 자유롭게 접근할 수 있는 12시간의 명암 주기로 수용되었다. 모든 실험 프로토콜은 고려대학교 의과대학 동물실험 및 사용위원회(승인번호 KOREA-2018-0030)의 승인을 받았다.

1.2. 각막 알칼리 손상 (Corneal alkali injury, CAI) 모델

2주간의 순응 후 8주령 쥐는 앞에서 설명한대로 각막 알칼리 화상을 입었다(50). 간단히 말해서, 쥐는 2:1 N₂O/O₂ 혼합물에서 3.5% 이소플루란(isoflurane)으로 마취되었다. 가스 혼합물은 2.5% 코뿔을 통해 쥐의 흡입을 통해 마취실에서 유지되었다. 1N NaOH에 담근 3mm 직경의 원형 여과지를 각막 중앙에 1 분간 부착하였다. 이어서 각막을 0.9% 식염수 30mL로 헹구었다. 모든 CAI는 오른쪽 눈에 유도되었다. 알칼리 화상 유도 후, 의도하지 않은 감염을 방지하기 위해 모든 쥐는 안락사될 때까지 하루에 두 번 항생제(5mg/mL levofloxacin, Santen; Osaka, Japan)를 50μL 국소 투여하였다. 쥐는 무작위로 4개의 그룹으로 세분화되었다. 식염수 군은 50μL의 0.9% 식염수를 하루 2회, HA 군은 50μL의 0.1% 히알루론산 나트륨(Xenobella 0.1 SD, 종근당, 서울, 한국)을 하루 2회 국소 처리하였다. SP-8356/HA 그룹은 0.1% 히알루론산 나트륨에 용해된 0.05% (w/v,) SP-8356 50μL를 하루 2회 국소 처리하고 PA 그룹은 50μL의 1% 프레드니솔론 아세테이트(prednisolone acetate, Pred Forte, Allergan; Dublin, Ireland)를 하루에 두 번 국소 처리하였다. HA의 효능을 배제하기 위해 0.9% 식염수로 1:4 비율로 희석한 1X PBS (137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na₂HPO₄, 1.4mM KH₂PO₄, pH 7.2, 바이오세상, 성남, 한국)로부터 제조된 0.2X 인산염 완충 식염수(PBS) 버퍼를 비히클로 사용하였다. 0.2X PBS 그룹은 50 μL의 0.2X PBS로 하루에 두 번 국소 처리되었다. SP-8356 그룹은 1일 2회 0.2X PBS에 용해된 0.05% (w/v) SP-8356 50 μL로 국소 처리되었다. 손상 후 각막에서 사이토카인 발현을 평가하기 위해 쥐를 CAI 5일 후에 안락사시켰다. 알칼리 화상에 의한 각막 혼탁 및 섬유증의 평가를 위해 쥐를 CAI 2주 후 안락사시켰다.

1.3. CAI 눈의 거시적 이미지

눈의 거시적 이미지를 캡처하기 위해 쥐에게 케타민 1mL (유한 케타민 50 Inj., 유한; 서울, 한국)와 자일라진 염산염(xylazine hydrochloride, Rompun^® Inj., 바이엘; 레버쿠젠, 독일)의 10:3 비율의 혼합물을 복강 주사하여 마취하였다. 이미지는 CCD 카메라(AcquCAM 23GR, JNOpTIC Co; 서울, 한국)로 촬영되었다. 다양한 초점 영역에서 캡처된 눈 이미지 세트는 Photoshop CC 2018 소프트웨어(Adobe; San Jose, CA, USA)를 사용하여 하나의 이미지로 측설되고(staked) 수직으로 병합되었다.

1.4. 각막 혼탁도 평가

각막의 불투명도 등급은 Sonoda와 Streilein(51)의 점수 시스템을 사용하여 결정되었으며, 0에서 +4 사이의 불투명도 점수는 이전에 설명한대로 등급이 매겨졌다(52). 두 명의 독립적인 연구자(CJ와 KP)가 블라인드 방식으로 불투명도 등급을 매겼다.

1.5. 조직 준비

CO₂ 챔버를 이용하여 쥐를 인간적으로 희생시키고 각막 조직 분리를 위해 쥐의 안구를 절개하였다. 각막은 4℃에서 12시간 동안 4% 파라 포름알데히드(PFA, Biosesang)에서 교반하면서 고정하고, 1X PBS로 밤새 4℃에서 교반하여 세척하고, 30% 수크로스에서 0.1M PB 완충액에서 12시간 동안 4℃에서 교반하면서 동결보호하였다(cryoprotect). 각막은 최적의 절단 온도(optimal cutting temperature, O.C.T) 화합물(Scigen Scientific; Gardena, CA, USA)에 포매되었고, 동결절단(cryosection)이 수행될 때까지 -80℃에서 보관되었다. 8 ㎛ 두께의 가로 연속 섹션을 저온유지장치(cryostat, CM3050S, Leica; Wetzlar, Germany)로 준비하고 실란으로 코팅된 유리 슬라이드(5116-20F, Muto Pure Chemicals, Tokyo, Japan) 상에서 수집하였다. 샘플은 IHC 및 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색이 수행될 때까지 -20℃에서 보관되었다.

1.6. H&E 염색

동결된 각막 동결절편의 H&E 염색은 다음 절차에 따라 수행되었다: (i) 각막 샘플을 실온에서 1시간 동안 건조하고 1X PBS로 세척, (ii) 증류수로 세척, (iii) 헤마톡실린 용액(Harris 변형)에 2분 동안 담그고 염색, (iv) 증류수로 10회 세척, (v) 에오신 용액에 2분 동안 침지 및 역염색, (vi) 증류수로 10회 세척, (vii) 50% 에탄올로 10초 동안 세척 및 탈수, (viii) 70% 에탄올에서 10초 동안 세척 및 탈수, (ix) 90% 에탄올에서 10초 동안 세척 및 탈수, (x) 100% 에탄올에서 10초 동안 2회 세척 및 탈수, (xi) 자일렌에 10초 동안 담그고, (xii) 자일렌에 용해된 캐나다 발삼(Canada balsam, Junsei, 도쿄, 일본)과 함께 장착하였다. 모든 H&E 염색 이미지는 Zeiss Axio Scan.Z1 (Carl Zeiss; Jena, Germany)으로 촬영하였다.

1.7. IHC

동결된 각막 동결절편의 IHC는 다음 절차에 의해 수행되었다: (i) 각막 샘플을 실온에서 1시간 동안 건조시키고 1X PBS로 2회 세척, (ii) 1X PBS 중의 5% 정상 염소 혈청(normal goat serum, NGS)(Vector Laboratories; Burlingame, CA, USA) 및 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich)로 구성된 블록킹버퍼에서 1시간 동안 실온에서 차단, (iii) 4℃의 1차 항체 용액에서 밤새 배양, (iv) 1X PBS 2회 세척, (v) Alexa 555 또는 488 (Invitrogen; Carlsbad, CA, USA) 형광 염료와 5% NGS-기반 블록킹 버퍼에서 1시간 동안 실온에서 접합된 2차 항체와 함께 배양, (vi) 1X PBS로 2회 세척, (vii) 장착 매체(DAKO; Santa Clara, CA, USA)로 장착하였다. IHC에 사용된 1차 항체는 anti-α-SMA (1:400 희석, ab7817, Abcam), 항-콜라겐 타입 III(anti-collagen type III, 1:400 희석, ab7778, Abcam), 항-콜라겐 타입 IV (1:400 희석, ab6586, Abcam) 및 항-TGF-

1 (1:500 희석, ab92486, Abcam) 항체들이다. 모든 형광 이미지는 Zeiss Axio Scan.Z1 (Carl Zeiss; Jena, Germany)으로 촬영하였다.

1.8. 편평한 각막 IHC

각막의 편평한 각막 IHC는 다음 절차에 의해 수행되었다: (i) 고정된 각막을 1X PBS로 4℃에서 24시간 동안 교반하면서 세척, (ii) 1X PBS (1% PBST) 중 1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich)으로 옮기고 4℃에서 24시간 동안 교반하면서 배양, (iii) 4℃의 5% NGS-기반 블록킹 버퍼에서 24시간 동안 교반하면서 침지, (iv) 4℃에서 48시간 동안 교반하면서 형광단이 결합된 1차 항체 용액에 침지, (v) 1% PBST로 1시간 동안 실온에서 두 번 교반하면서 세척, (vi) 시편을 슬라이드 유리 위에 놓고 장착 매체(ProLong^TM Gold, Invitrogen)를 장착하였다. 항-α-SMA-Alexa 647 (1:100 희석, sc-53015-AF647, Santa Cruz) 및 항-COL3A1-Alexa 488 (콜라겐 타입 III, 1:100 희석, sc-271249-AF488, Santa Cruz) 항체 플랫-마운트(flat-mount) IHC에 사용되었다. 모든 형광 이미지는 Zeiss Axio Scan.Z1 (Carl Zeiss)으로 촬영하였다. 콜라겐 타입 III 및 α-SMA 발현 영역의 면적은 Zeiss Efficient Navigation (ZEN) 소프트웨어 (desk, 버전 2.3, Carl Zeiss)를 사용하여 임계값-기반 면적 측정 방법으로 정량화되었다.

1.9. 각막의 불투명한 부위 평가

전체 각막의 불투명 영역을 평가하기 위해 평평한 각막의 명시야 이미지(bright field images)를 캡처하였다. 구체적으로 레이저 프린터로 검은 색으로 인쇄된 오버헤드 프로젝터(OHP) 필름을 슬라이드 유리 아래에 배치하였다. 영역의 3 mm 깊이는 40 ㎛ 간격으로 40X 배율로 이미지화되었다. 이미지는 Edge 3D 현미경(Edge-3D; Paia, HI, USA)으로 캡처하고 D5500 디지털 카메라 (Nikon; Tokyo, Japan)에 장착하였다. Edge panfocal 소프트웨어 2.7.4 (Edge-3D)를 사용하여 각막 이미지 세트를 측설하고 단일 이미지로 수직 병합하였다. 불투명 영역의 영역은 다음 절차에 따라 등급이 매겨졌다: (i) 평면-장착 각막을 5개의 관심 영역(ROI, 사분면 및 중앙)으로 나누고, (ii) 불투명 영역의 면적은 시각적 채점 시스템을 기준으로 평가(0; 선명하고 인쇄된 검은 색 패턴의 세부 사항이 각막을 통해 보이며 빈 모공의 경계가 각막에 의해 흩어지지 않음; 1+, 30% 미만 영역이 불투명함; 2+, 30% 초과한 영역이 불투명함) (iii) 5개의 ROI 점수를 합산하여 각 CAI 랫트의 대표 점수로 사용하였다. 두 명의 독립적인 연구자(CJ와 KP)가 블라인드 방식으로 등급을 평가하였다.

1.10. 인 시츄 MMP 자이모그래피

고정되지 않은 각막은 동결절편을 위해 준비되었다. 간단히 말해서, O.C.T 화합물(Scigen Scientific)에 포매된 고정되지 않은 각막은 액체 질소에 담근 이소펜탄으로 채워진 용기로 동결되었다. 8 ㎛ 두께의 가로 연속 섹션을 저온유지장치(CM3050S, Leica)로 준비하고 수확 후 1주 이내에 실란으로 코팅된 유리 슬라이드(5116-20F, Muto Pure Chemicals)에서 수집하였다. 인 시츄 MMP 자이모그래피는 다음 절차에 따라 수행되었다: (i) 각막 절편을 실온에서 1시간 동안 건조, (ii) 자이모그램 현상 완충액과 1:50 비율로 희석된 DQ 젤라틴 플루오레세인 접합체(DQ gelatin fluorescein conjugate, Invitrogen)를 포함하는 기질을 준비, (iii) 각막 절편을 재수화(rehydrated), (iv) 37℃ 습도 챔버에서 12시간 동안 기질에서 배양, (v) 1X PBS로 3회 세척, (vi) 마운팅 배지(DAKO)에 장착하였다. 모든 젤라티나제 활성 이미지는 Zeiss Axio Scan.Z1 (Carl Zeiss)으로 촬영하였다.

1.11. 웨스턴 블롯 분석

희생된 랫트의 각막을 얼음으로 냉각된 1X PBS에서 수확하고 프로테아제 억제제(Gendepot; Katy, TX, USA)를 함유한 RIPA 완충액(Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA)에서 용해시켰다. BCA 단백질 분석 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 각막 용해물의 단백질 농도를 정량화하였다. 단백질 20μg을 함유한 용해물을 SDS 시료 완충액과 혼합하여 99℃에서 5분 동안 가열하였다. SDS-PAGE를 통해 200 V에서 90분 동안 단백질을 분리한 후 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮겨 anti-COL3A1 (1:100 희석, sc-271249, Santa Cruz), 항-콜라겐 타입 IV (1:2000 희석, ab6586, Abcam) 및 항-GAPDH (1:2000 희석, MA5-15738, Thermo Fisher Scientific) 항체로 블롯팅하였다. 이어서, 염소 항-마우스 HRP 및 염소 항-토끼 HRP 항체 (1:20000 희석, 31430, 31460, Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다. 단백질 밴드는 ECL 시약(GE Healthcare; Marlborough, MA, USA)을 사용하여 검출하였다. 필름 이미지는 Bio 5000 스캐너 Microtek, 대만 신주)로 캡쳐하였다. 단백질 밴드 크기의 정량화는 ImageJ 오픈 소스 소프트웨어(버전 1.45s, National Institute of Health, NIH; Bethesda, MD, USA)로 분석되었다.

1.12. 젤라틴 자이모그래피

손상된 각막에서 MMP-9의 활성이 젤라틴 자이모그래피로 평가되었다. 고정되지 않은 각막의 용해물이 웨스턴 블롯 방법에 설명된 것과 동일한 방법으로 준비되었다. 10 ㎍의 단백질을 함유한 용해물을 비-환원 로딩 완충액과 혼합한 후 가열 과정 없이 10% 젤라틴 아크릴아미드 겔로 옮겼다. 겔은 통상적인 조성의 10% SDS-PAGE 겔 중에서 1mg/ml 젤라틴 분말(JT Baker Chemical Co.; Phillipsburg, NJ, USA) 및 0.4% 글리세롤(Sigma-Aldrich)을 포함하고 있다. 각막 용해물은 200 V에서 100분 동안 전기영동으로 분리되었다. 양성 대조군으로 10 ㎍의 MMP-9 재조합 단백질(ab168863, Abcam)이 로딩되었다. 겔 전기영동 후, 겔을 1시간 동안 2회 교반하면서 실온에서 자이모그램 리네이쳐링 버퍼(zymogram renaturing buffer, Invitrogen)로 세척하였다. 리네이쳐링 단계 후, 젤을 흔들면서 실온에서 30분 동안 자이모그램 현상 퍼버(zymogram developing buffer, Invitrogen)에 담갔다. 그 후 겔을 교반하면서 37℃에서 48시간 동안 신선한 자이모그램 현상 완충액에서 배양하였다. 완전하게 현상된 겔을 콜로이드 블루 염색 키트(Invitrogen)로 염색하였다. 염색된 겔의 이미지를 Bio 5000 스캐너(Microtek)로 캡쳐하였다. MMP-9 활성의 정량화는 ImageJ 오픈 소스 소프트웨어(버전 1.45s, NIH)로 분석하였다.

1.13. 정량적 실시간 RT-PCR (qRT-PCR)

CAI 각막의 총 RNA는 TRIzol (Invitrogen)로 추출하였다. 간단히 말해서, 각 각막을 40 μL의 얼음으로 냉각된 TRIzol에 담그고 일회용 균질기(Biomasher II, 890863, LMS Co.; Tokyo, Japan)로 분쇄하였다. RNA 농도는 Nanodrop^TM 2000 (Thermo Fisher Scientific)으로 측정했으며, cDNA 합성을 위해 1 ㎍의 RNA 템플릿을 사용하였다. cDNA의 생성은 역전사 반응 키트(iScript® cDNA 합성 키트, Bio-Rad; Hercules, CA, USA)를 사용하여 수행되었다. qRT-PCR에 대해서는 SYBR Green 혼합물(iQ^TM SYBR® Green Supermix, Bio-Rad) 및 GenScript (Piscataway, NJ, USA)에서 디자인한 표적 유전자 mRNA 주형 특이적 프라이머 세트가 있는 iCycler PCR 써모사이클러(PCR thermocycler, Bio-Rad)를 사용하였다. 프라이머의 서열은 다음과 같다: α-SMA (5'-GCTATTCAGGCTGTGCTGTC-3' 및 5'-GTTGTGAGTCACGCCATCTC-3'), GAPDH (5'-AAGGCTGTGGGCAAGGTCAT-3' 및 5'-TTTCTCCAGGCGGCATGTCA-3') 및 TGF-

1 (5'-GGCTACCATGCCAACTTCTG-3' 및 5'-CGTAGTAGACGATGGGCAGT-3'). mRNA 수준은 이전에 보고된 바와 같이 글리세알데하이드 3-포스페이트 디하이드로게나제(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)의 mRNA 수준으로 정규화되었다(53).

1.14. 통계 분석

모든 데이터는 평균±표준편차(SD)로 표시된다. 데이터 분포의 정규성은 Shapiro-Wilk 테스트로 결정되었다. 모수 데이터(parametric data)의 경우, 여러 그룹을 비교하는데 사용된 사후 Tukey의 테스트(post-hoc Tukey's test)를 사용하여 일원 분산 분석(one-way analysis of variance, ANOVA)을 수행하였다. 비모수 데이터(non-parametric data)의 경우 여러 그룹을 비교하는데 사용된 다음 사후 Conover 테스트(post-hoc Conover test)를 사용하여 Kruskal-Wallis 테스트를 수행하였다. 모든 통계 분석에는 Medcalc 소프트웨어 버전 18.11.6 (MedCalc; Mariakerke, Belgium)이 사용되었다. 0.05 미만의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

알칼리 화상 후 각막 혼탁의 개선 효과

SP-8356은 염(saline)에서 잘 녹지 않기 때문에 현탁액으로 사용하였으며, 약효가 약하기는 하나 유의적이다(도 1).

SP-8356의 발린 에스테르(valine ester, SP-8356 1154)는 SP-8356으로 매우 빠르게 전환되고 수용성이 높아 점성이 있는 0.1% 히알루론산(hyaluronic acid)에 녹였다. 용해성(soluble) SP-8356 (SP1154)는 현탁으로 투여한 SP-8356보다 효과가 우수하다. SP-1154/HA과 프레드니솔론 아세테이트(prednisolone acetate, PA) 모두 CAI 쥐 모델에서 식염수 처리된 대조군과 비교하여 각막 혼탁의 심각도를 현저하게 약화시켰다(도 2A 및 B).

또한 각막의 불투명한 영역은 SP-1154/HA와 PA에 의해 감소한 반면 HA만으로는 각막 혼탁을 개선할 수 없었다.

알칼리 화상 각막에서 근섬유아세포 집단의 감소 효과

근섬유아세포의 지속적인 집단이 알파-평활근 액틴(α-SMA)의 발현을 증가시키고 각막 혼탁을 촉진한다는 것은 잘 알려져 있다(Wilson, S.E., Exp Eye Res 2012, 99, 78-88; Boote, C. et al., IOVS 2012, 53, 2786-2795; Mohan, R.R. et al., Exp Eye Res 2003, 76, 71-87). 가로 각막 단면 면역조직화학(IHC)은 SP-8356/HA가 각막 간질에서 α-SMA 발현을 감소시켰음을 보여주었다(도 3A). 또한, 플랫 마운트 IHC 이미지는 SP-1154/HA가 전체 각막 중에서 α-SMA(+) 영역의 면적을 대폭 하향 조절하는 것으로 나타났다(도 3A 및 B). 전체 각막 용해물에서 α-SMA의 mRNA 수준은 SP-1154/HA가 처리된 각막에서도 유의하게 감소하였다(도 3C). HA 단독 처리는 알칼리 손상 각막에서 α-SMA 발현을 감소시켰지만 SP-1154과의 병용 처리는 α-SMA 단백질과 α-SMA의 mRNA 수준을 모두 감소시켰다(도 3). 또한, SP-1154 단독 처리는 알칼리 손상 각막에서 α-SMA의 mRNA 수준을 대폭 감소시켰다. 그러나 PA는 각막 기질의 α-SMA 발현 또는 전체 각막 용해물에서 α-SMA의 mRNA 수준을 대폭 감소시키는데 주목할 만한 효과를 나타내지 않았다(도 3).

손상된 각막에서 MMP-9 활성의 하향 조절 효과

인 시츄 자이모그래피 및 젤라틴 아크릴아마이드 겔 자이모그래피는 SP-1154/HA 및 PA가 각막에서 MMP 활성을 현저하게 감소시키는 것으로 나타났다(도 4).

CD147은 각막 손상에 대한 반응으로 섬유증 과정에서 중요한 역할을 한다(Huet, E. et al., FASEB J 2008, 22, 1144-1154; Girard, M.T. et al., J Cell Sci 1993, 104, 1001-1011; Fini, M.E., Prog Retin Eye Res 1999, 18, 529-551; Fini, M.E. et al., Cornea 2005, 24 (Suppl. 1), S2-S11; Huet, E. et al., Connect Tissue Res 2008, 49, 175-179). CD147 억제제 SP-8356이 알칼리 화상 각막에서 근섬유아세포 집단과 MMP-9 활성을 억제함으로써 각막 섬유증과 헤이즈를 현저하게 감소시킨다는 것을 분명히 발견하였다.

손상된 각막의 섬유증은 각막 세포 간의 직접적인 세포-세포 상호 작용에 의존한다(Gabison, E.E. et al., Prog Retin Eye Res 2009, 28, 19-33). 이전의 여러 연구에서는 CD147이 각막 세포 사이의 접촉 의존적(즉, juxtacrine) 신호를 통해 이러한 직접적인 세포-세포 상호 작용에 관여한다고 보고하였다(Gabison, E.E. et al., Prog Retin Eye Res 2009, 28, 19-33; Wilson, S.E. Exp Eye Res 2012, 99, 78-88). Gabison et al.은 CD147 발현과 그에 따른 MMP 활성화가 상피 세포와 접촉한 후 각막 섬유아세포에서 상향 조절된다는 것을 발견하였다(Gabison, E.E. et al., Am J Pathol 2005, 166, 209-219). 더욱이, 외인성 CD147 세포외 도메인에 대한 각막 섬유아세포의 노출은 근섬유아세포 분화와 MMP 생산을 유도한다(Huet, E. et al., FASEB J 2008, 22, 1144-1154). 섬유아세포에 대한 리간드 역할을 하는 외인성 CD147 외에도 각막 섬유아세포의 막에 위치한 내인성 CD147도 섬유증에 기여한다. Huet et al. 내인성 CD147의 감소된 발현이 TGF-의존성 근섬유아세포 분화 및 MMP 생산을 약화시킨다는 보고가 있다. 따라서, 외인성 및 내인성 CD147은 모두 각막 섬유증에 중요하지만, juxtacrine 신호 전달에서 CD147의 상세한 기본 메커니즘은 명확하지 않다. 한 가지 가능한 메커니즘은 CD147이 인접한 CD147에 대한 수용체와 리간드로 작용할 수 있다는 것이다. 이것은 이량체화와 같은 동종성 상호작용(homophilic interaction)이라고 한다(Mauris, J. et al., J Cell Sci 2014, 127, 3141-3148; Fadool, J.M. et al., Biochem Biophys Res Commun 1996, 229, 280-286; Yu, X.L. et al., J Biol Chem 2008, 283, 18056-18065). 최근에, SP-8356이 CD147과 높은 결합 친화성을 보이고 CD147 이체화를 직접적으로 억제한다는 것을 발견하였다(Pahk, K. et al., J Transl Med 2019, 17, 274). 따라서 CD147 이량체화에 대한 SP-8356의 억제 효과는 알칼리 화상 각막에서 섬유화 방지 효과에 기여할 수 있다.

이전에 Singh et al. TGF-

1 신호 전달 경로의 억제는 근섬유아세포를 발현하는 α-SMA를 파라크린 신호 의존적 방식으로 감소시키는 반면, α-SMA 양성 세포는 간질 섬유아세포와 골수 사이에서 juxtacrine 및 paracrine 신호 의존적 방식에서 약간 감소했다고 보고하였다. 파생된 세포. 손상된 각막에서 각막 섬유아세포와 다른 세포 유형간에 더 높은 빈도의 접촉 의존(juxtacrine) 신호 전달을 고려한다(Gabison, E.E. et al., Am J Pathol 2005, 166, 209-219; Singh, V. et al., Exp Eye Res 2012, 98, 1-8; Barbosa, F.L. et al., Exp Eye Res 2010, 91, 92-96). 따라서, TGF-

1 단독의 차단은 손상된 각막에서 근섬유아세포 집단을 감소시키는 데 충분하지 않을 수 있으며, juxtacrine 신호 전달 경로의 동시 차단은 근섬유아세포 활동의 약화에 중요할 수 있다. CD147은 손상된 각막에서 juxtacrine 신호 전달 경로의 핵심 매개체이기 때문에 각막 섬유증에 대한 SP-8356의 심오한 치료 효과는 CD147에 대한 높은 결합 친화도와 CD147 유도 신호 경로의 억제로 설명될 수 있다.

국소 코르티코스테로이드는 임상 분야에서 각막 혼탁을 예방하기 위해 자주 사용되며 PA는 인기있는 국소 스테로이드 중 하나이다(Wilson, S.E., Exp Eye Res 2012, 99, 78-88; Baek, S.H. et al., J Refract Surg 1997, 13, 644-652; Vetrugno, M. et al., Acta Ophthalmol Scand 2001, 79, 23-27; Pleyer, U. et al., Ophthalmol Ther 2013, 2, 55-72; Hindman, H.B. et al., Exp Eye Res 2019, 181, 49-60). 따라서 PA를 양성 대조군 약물로 사용하였다. P-8356만이 손상된 각막에서 α-SMA(+) 근섬유아세포 집단을 고갈시켰지만 PA는 근섬유아세포의 수와 α-SMA 발현을 약간 감소시켰다(도 3). 마찬가지로 Hindman et al. 및 Kim et al. PA가 손상된 각막에서 근섬유아세포의 수를 감소시켰다고 보고했지만 PA 치료를 중단하면 이러한 감소 효과가 사라졌다. 또한 Hill et al.은 코르티코 스테로이드가 손상된 각막에서 근섬유아세포 집단을 제거하는 데 효과가 없다고 보고하였다(Hill, L.J. et al., NPJ Regen Med 2018, 3, 23). 따라서 PA는 근섬유아세포(myofibroblast) 개체군의 고갈과 관계없이 각막 혼탁을 개선하는 것으로 보인다(도 2). 더욱이 이전의 여러 연구에서 PA의 중단이 각막 혼탁의 재발 또는 악화를 초래했다고 보고하였다(Gartry, D.S. et al., Eye 1993, 7, 584-590; Nien, C.J. et al., J Cataract Refract Surg 2011, 37, 937-944). 또한 PA의 만성적 사용은 안압 상승과 같은 원치 않는 부작용으로 인해 결국 원추 각막 또는 녹내장을 유발하기 때문에 임상 분야에서 제한적이다(Fan, J.C. et al., Eye 2009, 23, 2056-2062; Kanellopoulos, A.J. et al., Eye and vision 2016, 3, 4; Phulke, S. et al., J Curr Glaucoma Pract 2017, 11, 67-72). 따라서 각막 연무에 대한 새로운 비스테로이드성 항섬유화 약물의 개발이 필요하며 SP-8356은 이를 위한 강력한 후보가 될 수 있다.

HA 자체는 각막 상피 결손을 치료할 수 있는 개선 효과가 있어 안구 건조증 및 각막 상피 질환에 널리 사용되고 있다(Rah, M.J., Optometry 2011, 82, 38-43; Zhong, J. et al., J Ophthalmol 2016, 2016, 6538051; Carlson, E. et al., J Ocul Pharmacol Ther 2018, 34, 360-364). 또한 HA의 점탄성 특성은 각막 표면에 머무르는 것을 확장한다(Singh, A. et al., Cont Lens Anterior Eye 2015, 38, 79-84). 따라서 SP-8356의 안구 체류 시간을 연장하기 위해 희석된 HA와 함께 SP-8356을 처리하였다. HA 단독 처리는 알칼리 화상 각막에서 α-SMA의 발현을 유의하게 감소시켰다. 그리고 이 완화 효과는 SP-8356과의 병용 치료로 더욱 강화되었다. HA 단독 치료는 각막 혼탁, 병리적 콜라겐 합성 및 MMP 활성화를 억제할 수 없었지만 SP-8356과의 병용 치료로 감소시켰다. 더욱이 SP-8356의 항 섬유화 효과는 HA가 없는 상태에서 관찰되었다. 따라서 HA와 함께 SP-8356의 국소 투여는 각막 혼탁 및 관련 각막 섬유증을 효과적으로 약화시킬 수 있다.

종합하면, SP-8356 자체 혹은 프로드럭 SP1154로 투여 후 SP-8356은 CD147 결합을 억제하고 MMP-9 활성화를 통해 각막 혼탁 및 관련 근섬유아세포 분화를 억제한다. 또한 SP-8356은 코르티코스테로이드 (PA)에 비해 손상된 각막에 대해 우수한 항섬유화 효과를 나타낸다. 손상된 각막에서 SP-8356의 항섬유화 효과의 상세한 기본 메커니즘을 밝히기 위한 추가 연구가 필요하지만, SP-8356은 각막 혼탁을 유발하는 병적 각막 섬유증의 잠재적인 치료제가 될 수 있다.

실시예 2: 안구건조증에 대한 베르베논 유도체의 효과

각막(cornea)와 결막(conjunctiva)의 항상성은 눈물 및 지방샘의 분비량에 전적으로 의존하며, 분비량에 문제가 생길 경우 각막 및 결막내 MMP의 증가로 이어지게 된다.

특히 MMP9의 경우 눈물내 농도에 따라 직접적으로 각막 및 결막 상피내 세포외 기질에 손상을 유발하여 염증세포 침투 및 각막 두께 증가로 이어지게 된다.

뇌졸중, 동맥경화 및 알칼리성 각막 손상에서 SP-8356이 MMP9의 활성 및 발현을 억제하는 것에 착안하여 benzalkonium chloride (BAC) 유도 안구건조증 동물 모델에서 기존 치료제인 cyclosporin A (Restasis)와의 효능을 비교 및 평가하였다.

2.1. 플루오레세인 염색(fluorescein staining)에 의한 각막상피 손상(corneal epithelial damage)의 측정

각막표면 손상은 건성안의 모델에서 하나의 지표이다. 건성안 안구 표면의 형광색소 플루오레세인(fluorescein) 염색을 통해 약효를 평가하여 도 5에 나타내었다.

건성안 안구 표면의 형광색소염색을 통한 건성안 약제 효능 평가 결과, BAC 처치로 건성안이 유도된 왼쪽 눈에 비해 약물 SP-1154를 처치한 (BAC+ SP-1154 OD, 오른쪽) 눈의 각막 표면에서 형광으로 표지된 각막 상피 손상 부위가 현저하게 감소됨을 확인하였다.

즉, SP-8356은 restasis와 마찬가지로 건성안 모델에서 각막표면 손상 억제능을 가지고 있음을 확인하였다. 각막 표면의 손상은 추후의 혈관 신생이나, 염증 세포 침투로 이어지기 때문에 이를 억제하는 것은 건성안 치료제 평가의 주요한 지표이다.

Restasis는 1% Cyclosporin을 주성분으로 하는 상업적으로 판매 중인 건성안 치료제로써 비교 약물로 사용한 것이고, BAC (benzalkonium chloride)는 건성안 유도 약물이다.

2.2. 혈관 신생과 염증(angiogenesis and inflammation)

Restasis와 같이 프로드럭 SP-1154 처치 시 각막과 결막에서 F4/80, CD31 발현 감소를 확인하였다(도 6, CD31: vascular endothelial cell, F4/80: macrophage, inflammation marker). 염증 관련 마커인 F4/80, 혈관 발현 관여 마커인 CD31의 발현이 BAC 처치 후 약물을 처치한 동물의 각막(cornea)과 결막(conjunctiva) 에서 감소하는 경향을 보였다.

건성안 동물 모델에서 SP-8356이 염증세포의 침투는 restasis와 비슷한 수준으로 막았으나, 신생혈관생성 억제능은 restasis에 비해 떨어지는 것으로 판단된다.

2.3. MMP 발현과 염증세포(대식 세포) 침윤(inflammatory cell infiltration)에 대한 억제 효과

도 7에 나타낸 바와 같이, BAC 건성안 동물모델에서 프로드럭 SP-1154 처치 시 각막과 결막에서 CD11b, MMP9 발현 감소를 확인하였다(CD11b: inflammatory macrophage infiltration marker).

도 7에 나타낸 바와 같이, 염증반응에 의한 대식세포의 침윤 마커인 CD11b, 세포외기질 분해효소인 MMP9 발현이 BAC 처치 후 약물을 처치한 동물의 각막(cornea)과 결막(conjunctiva)에서 감소하는 경향을 보였다.

따라서, 건성안 동물 모델에서 SP-8356이 대식세포의 침투 및 MMP9의 발현을 restasis와 유사하거나 더 많이 억제하는 것으로 관찰되었다.

안구건조증에 대한 베르베논 유도체의 효과의 정리하면 표 1과 같다.

	TEAR	H&E	Fluorescein Staining
SP-1154 (0.05%)	평균 눈물양 분석결과 SP-1154, Restasis 모두 BAC처치군보다 눈물양이 유사하게 높게 관찰되었음. SP-1154의 눈물 회복능이 비교약물인 restasis 와 유사한 눈물 회복능을 보였다고 판단됨.	H&E 염색 결과 약물 처리군에서 염증세포가 감소하는 경향을 보였고 각막의 두께가 개체간 차이는 있었으나 약물 처리군에서 감소하는 경향이 관찰되었음	건성안 안구 표면의 형광색소염색을 통한 건성안 약제 효능 평가 결과 BAC 처치한 OS에 비해 약물처치한 군에서 각막 표면에서 형광의 발현이 현저히 감소한 결과가 관찰되었음.
Restasis
0.1% HA(제노벨라)
	MMP9	F4/80	CD31	CD11b
SP-1154 (0.05%)	- 건성안 마커인 MMP9의 발현, 염증 관련 마커인 F4/80, 혈관 발현 관여 마커인 CD31의 발현, 염증반응에 의한 대식세포의 침윤 마커인 CD11b의 발현이 BAC 처치군에 비해 약물 처치 동물의 각막(cornea)과 결막(conjunctiva) 에서 유의성 있게 감소함 - 또한 현재 건성안에 사용되는 종근당의 제노벨라에 비해 모든 측면에서 우수한 결과를 보임 MMP9: SP-1154 = Restasis < Xenobella F4/80: SP-1154 ≤ Restasis < Xenobella CD31: SP-1154 ≤ Restasis < Xenobella CD11b: SP-1154 ≤ Restasis < Xenobella
Restasis
0.1% HA(제노벨라)

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

1. (1S,5R)-4-(3,4-디히드록시-5-메톡시스티릴)-6,6-디메틸비시클로[3.1.1]헵트-3-엔-2-온(3f) 또는 (2S,2'S)-5-((E)-2-((1R,5S)-6,6-디메틸-4-옥소비시클로[3.1.1]헵트-2-엔-2-일)비닐)-3-메톡시-1,2-페닐렌비스(2-아미노-3-메틸부타노에이트)-2-하이드로클로라이드(6)의 베르베논 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 안구질환의 치료 또는 예방용 약학조성물로서,
   상기 안구질환은 결막염, 각막화상, 안구건조증 , 안구충혈, 각막 신생혈관 및 각막염으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 안구질환의 치료 또는 예방용 약학조성물.
   
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8. 제1항에 있어서, 상기 안구질환은 비감염성인 것을 특징으로 하는 약학조성물.
   
9. 제1항에 있어서, 상기 약학조성물은 안구 외용제형인 것을 특징으로 하는 약학조성물.
   
10. (1S,5R)-4-(3,4-디히드록시-5-메톡시스티릴)-6,6-디메틸비시클로[3.1.1]헵트-3-엔-2-온(3f) 또는 (2S,2'S)-5-((E)-2-((1R,5S)-6,6-디메틸-4-옥소비시클로[3.1.1]헵트-2-엔-2-일)비닐)-3-메톡시-1,2-페닐렌비스(2-아미노-3-메틸부타노에이트)-2-하이드로클로라이드(6)의 베르베논 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 안구질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품로서,
    상기 안구질환은 결막염, 각막화상, 안구건조증 , 안구충혈, 각막 신생혈관 및 각막염으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 안구질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
    
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