BR112014017474B1 - sistema e dispositivo para uso na detecção de afinidades de ligação - Google Patents

Abstract

DISPOSITIVO PARA USO NA DETECÇÃO DE AFINIDADES DE LIGAÇÃO. Trata-se de um dispositivo para uso na detecção de afinidades de ligação que compreende um guia de onda plano (2) disposto em um substrato (3) e um acoplador óptico (4) para acoplar luz coerente (1) de um comprimento de onda predeterminado para o interior do guia de onda plano. A luz coerente se propaga através do guia de onda plano (2) com um campo evanescente (6) que se propaga ao longo de uma superfície externa (5) do guia de onda plano. A superfície externa (5) do guia de onda plano compreende sítios de ligação (7) na mesma capazes de ligar amostras-alvo (8) aos sítios de ligação (7) de modo que a luz do campo evanescente (6) seja espalhada pelas amostras-alvo (8) ligadas aos sítios de ligação (7). Os sítios de ligação (7) são dispostos ao longo de uma pluralidade de linhas predeterminadas (9) que são dispostas de modo que a luz espalha da interfira de modo construtivo em uma localização de detecção predeterminada com uma diferença em comprimento de trajetória óptica que é um número inteiro múltiplo do comprimento de onda predeterminado.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a um dispositivo para uso na detecção de afinidades de ligação bem como a um sistema e um método para a detecção de afinidades de ligação em conformidade com a reivindicação independente respectiva.

[0002] Tais dispositivos são usados, por exemplo, como biossen- sores em uma grande variedade de aplicações. Uma aplicação particular é a detecção ou monitoramento de processo ou afinidades de ligação. Por exemplo, com o auxílio de tais biossensores vários ensaios que detectam a ligação de amostras-alvo para sítios de ligação podem ser realizados. Tipicamente, grandes números de tais ensaios são realizados em um biossensor em pontos que são dispostos em um micro- arranjo bidimensional na superfície do biossensor. O uso de microar- ranjos fornece uma ferramenta para a detecção simultânea dos processos ou afinidades de ligação de diferentes amostras-alvo em triagens de alta produtividade, em que grandes quantidades de DNA, proteínas ou moléculas semelhantes a amostras-alvo podem ser analisadas rapidamente. Para detectar as afinidades de amostras-alvo para ligação a sítios de ligação específicos (por exemplo, as afinidades de moléculas-alvo para ligação a diferentes moléculas de captura), um grande número de sítios de ligação é imobilizado na superfície do biossensor em pontos que podem ser aplicados, por exemplo, marcação por jato de tinta. Cada ponto forma uma zona de medição individual para um tipo predeterminado de moléculas de captura. A afinidade de uma amostra-alvo a um tipo específico de moléculas de captura é de-tectada e é usada para fornecer informações sobre a afinidade de ligação da amostra-alvo.

[0003] Uma técnica conhecida para detectar afinidades de ligação de amostras-alvo usa rótulos capazes de emitir luz fluorescente mediante excitação. Por exemplo, marcadores fluorescentes podem ser usados como rótulos para rotular as amostras-alvo. Mediante excitação, os marcadores fluorescentes são forçados a emitir uma luz fluo-rescente que tem um espectro de emissão característico. A detecção desse espectro de emissão característico em um ponto particular indica que a molécula-alvo rotulada foi ligada ao tipo particular de sítios de ligação presentes no ponto respectivo.

[0004] Um sensor para detectar amostras-alvo rotuladas é descrito no artigo "Zeptosens' protein microarrays: A novel high performance microarray platform for low abundance protein analysis", Proteomics 2002, 2, S. 383 a 393, Wiley-VCH Verlag GmbH, 69451 Weinheim, Alemanha. O sensor descrito nesse documento compreende um guia de onda plano disposto em um substrato e uma grade para acoplar uma luz coerente de um comprimento de onda predeterminado ao interior do guia de onda plano. Uma grade adicional é disposta naquela extremidade do guia de onda plano longe da grade para acoplar a luz ao interior do guia de onda. A luz coerente que foi propagada através do guia de onda plano é acoplada para fora do guia de onda pela grade adicional. A luz acoplada para fora é usada para ajuste do acoplamento da luz coerente de comprimento de onda predeterminado ao interior do guia de onda plano. A luz coerente se propaga através do guia de onda plano sob reflexo total com um campo evanescente da luz coerente que se propaga ao longo da superfície externa do guia de onda plano. A profundidade de penetração do campo evanescente ao interior do meio de índice refrativo mais baixo na superfície externa do guia de onda plano está na ordem de magnitude de uma fação do comprimento de onda da luz coerente que se propaga através do guia de onda plano. O campo evanescente excita os marcadores fluorescentes das amostras-alvo rotuladas ligadas aos sítios de ligação dis- postos na superfície do guia de onda plano. Devido à penetração demasiadamente pequena do campo evanescente ao interior do meio opticamente mais fino na superfície externa do guia de onda plano, apenas as amostras rotuladas ligadas aos sítios de ligação imobilizados na superfície externa do guia de onda plano são excitadas. A luz fluorescente emitida por esses marcadores é, então, detectada com o auxílio com o auxílio de uma câmera com CCD.

[0005] Embora seja essencialmente possível detectar as afinidades de ligação com o uso de rótulos fluorescentes, esse conjunto de procedimentos é desvantajoso pelo fato de que o sinal detectado é produzido pelos rótulos em vez de ser produzido pelos próprios parceiros de ligação. Além disso, rotular as amostras-alvo requer etapas adicionais de trabalho. Ademais, amostras-alvo rotuladas têm um custo comparativamente mais alto. Outra desvantagem é a falsificação dos resultados causada por efeitos de resfriamento brusco ou fotobran- queamento.

[0006] É um objetivo da presente invenção fornecer um dispositivo para uso na detecção de afinidades de ligação de uma amostra-alvo bem como um sistema e um método podem detectar tais afinidades de ligação que superam ou pelo menos reduzem grandemente as desvantagens do sensor de técnica anterior descrito acima.

[0007] Em conformidade com a invenção, esse objetivo é alcançado por um dispositivo para uso na detecção de afinidades de ligação. O dispositivo compreende um guia de onda plano disposto em um substrato e compreende, adicionalmente, um acoplador óptico para acoplar uma luz coerente de um comprimento de onda predeterminado no interior do guia de onda plano de modo que a luz coerente se propague através do guia de onda plano com um campo evanescente da luz coerente que se propaga ao longo de uma superfície externa do guia de onda plano. A superfície externa do guia de onda plano com- preende sítios de ligação na mesma capazes de ligar amostras-alvo aos sítios de ligação de modo que a luz do campo evanescente seja espalhada pelas amostras-alvo ligadas aos sítios de ligação. Os sítios de ligação são dispostos ao longo de uma pluralidade de linhas predeterminadas, sendo que as linhas predeterminadas são dispostas de modo que a luz espalhada pelas amostras-alvo ligadas aos sítios de ligação interfira em uma localização de detecção predeterminada com uma diferença e comprimento de trajetória óptica que é um número inteiro múltiplo do comprimento de onda predeterminado da luz.

[0008] A detecção de afinidades de ligação de acordo com a invenção não é limitada aos tipos específicos de amostras-alvo nem a um tipo de sítios de ligação, mas em vez disso as características de ligação de moléculas, proteínas, DNA, etc. podem ser analisadas com relação a qualquer tipo de sítios de ligação no guia de onda plano. A detecção de afinidades de ligação pode ser alcançada de uma maneira livre de rótulo. Alternativamente, intensificadores de espalhamento (por exemplo, rótulos de espalhamento) que espalham fortemente a luz podem ser usados para aumentar a sensibilidade de detecção. Tais intensificadores de espalhamento podem ser uma nanopartícula (sozinha ou com um aglutinante) ou em outro exemplo uma partícula coloidal. A característica de ligação a ser analisada pode ser do tipo estática (por exemplo, pode ser analisada se uma amostra-alvo estiver ou não estiver ligada aos sítios de ligação) ou do tipo dinâmica (por exemplo, a dinâmica do processo de ligação ao longo do tempo pode ser analisada). Sítios de ligação são localizações na superfície externa do guia de onda plano às quais uma amostra-alvo pode se ligar. Por exemplo, sítios de ligação podem compreender moléculas de captura que são imobilizadas na superfície externa do guia de onda plano, ou podem simplesmente compreender localizações ativadas na superfície externa do guia de onda plano capazes de ligar amostras-alvo às loca- lizações ativadas, ou podem ser incorporadas de qualquer outra maneira para ligar amostras-alvo às localizações desejadas na superfície externa do guia de onda plano. A pluralidade de linhas predeterminadas pode compreender linhas separadas individuais ou pode compreender um padrão de linha no qual as linhas individuais são conectadas para formar uma única linha, por exemplo, um padrão de linha única sinuoso. A distância entre as linhas predeterminadas adjacentes ao longo das quais os sítios de ligação são dispostos é escolhida em relação ao comprimento de onda predeterminado da luz. Distâncias preferenciais entre as linhas predeterminadas adjacentes são da ordem de mais de 100 nm. Uma faixa de cerca de 100 nm a cerca de 1000 nm para a distância entre as linhas predeterminadas adjacentes é preferencial para o uso da luz visível no guia de onda plano de modo que a luz espalhada possa ser detectada por meios ópticos padrões. Além disso, é preferencial que o guia de onda óptico plano tenha um alto índice refrativo em relação ao meio na superfície externa do guia de onda plano, de modo que a profundidade de penetração do campo evanescente seja apenas pequena e a fração de luz coerente que se propaga no campo evanescente seja alta. Por exemplo, o índice refrativo do guia de onda plano pode ser na faixa de 1,6 a 2,5, enquanto o índice refrativo do meio na superfície do guia de onda plano é tipicamente na faixa de 1 a 1,5. A título de exemplo, os sítios de ligação podem compreender moléculas de captura que são imobilizadas na superfície externa do guia de onda plano. As moléculas de captura imobilizadas juntamente com as amostras-alvo ligadas às mesmas formam uma pluralidade de centros de espalhamento que espalham a luz coerente do campo evanescente. A luz coerente que se propaga ao longo do guia de onda plano tem um comprimento de onda predeterminado e é preferencialmente monocromática (idealmente em um único comprimento de onda). Visto que a luz do campo evanescente que se propaga ao longo da superfície do guia de onda plano é coerente assim como a luz que se propaga dentro do guia de onda plano, a luz coerente do campo evanescente é espalhada de modo coerente pelos centros de espalhamento formados pelas moléculas-alvo ligadas às moléculas de captura (ou, mais geralmente, pela amostra-alvo ligada aos sítios de ligação) que são dispostas nas linhas predeterminadas diferentes. A luz espalhada em qualquer localização pode ser determinada adici- onando-se as contribuições de cada um dos centros de espalhamento individuais. Um limite máximo da luz espalhada está localizado na localização de detecção predeterminada visto que as linhas predeterminadas são dispostas de modo que, na localização de detecção predeterminada, o comprimento de trajetória óptica da luz espalhada pelos diferentes centros de espalhamento seja diferente por um número inteiro múltiplo do comprimento de onda da luz. Para um sinal máximo na localização de detecção, o comprimento de trajetória óptica da luz do acoplador óptico às linhas predeterminadas e das mesmas à localização de detecção predeterminada também é um número inteiro múltiplo do comprimento de onda predeterminado. Assim, a luz espalhada pelas amostras-alvo ligadas aos sítios de ligação interfere em uma localização de detecção predeterminada. O requisito de interferência construtiva é satisfeito por qualquer luz espalhada que é adicionada ao sinal detectável na localização de detecção. A localização de detecção predeterminada não é limitada a um formato particular, por exemplo, a mesma pode ter o formato de uma ponta ou uma tira. A disposição dos sítios de ligação "ao longo das linhas predeterminadas" representa o caso ótimo no qual todos os sítios de ligação estão exatamente nas linhas predeterminadas. Tal disposição ótima dos sítios de ligação resulta em sinal máximo na localização de detecção. É óbvio ao indivíduo versado na técnica que na prática a disposição dos sítios de ligação pode desviar de certa forma de tal disposição ótima. Por exemplo, o desvio pode ser causado pelo método para dispor os sítios de ligação na superfície externa do guia de onda plano, conforme será explicado em mais detalhes abaixo.

[0009] Em conformidade com um aspecto do dispositivo de acordo com a invenção, a distância entre linhas predeterminadas adjacentes diminui na direção de propagação da luz do campo evanescente. Em geral, os ângulos sob os quais a luz espalhada do campo evanescente interfere na localização de detecção predeterminada são diferentes para os vários centros de espalhamento (amostras-alvo ligadas aos sítios de ligação), os quais estão dispostos ao longo das linhas predeterminadas. Visto que na localização de detecção predeterminada a luz espalhada deve interferir a um máximo, a diferença no comprimento de trajetória óptica da luz espalhada a partir dos vários centros de espalhamento precisa ser um número inteiro múltiplo do comprimento de onda da luz. A diminuição na distância entre as linhas predeterminadas adjacentes leva esse fato em consideração e faz com que a luz interfira a um máximo na localização de detecção predeterminada, a qual não precisa ter o formato de uma ponta ou um pequeno ponto, mas pode ter, ainda, o formato de um atira ou qualquer outro formato desejado.

[00010] De acordo com um aspecto adicional do dispositivo de acordo com a invenção, a pluralidade de linhas predeterminadas nas quais os sítios de ligação são dispostos compreende linhas curvadas. A curvatura das linhas é de modo que a luz do campo evanescente espalhada pelas amostras-alvo ligadas aos sítios de ligação dispostos ao longo dessas linhas predeterminadas interfira a um máximo na localização de detecção predeterminada. A localização de detecção preferencialmente tem o formato de uma ponta. Cada uma das linhas predeterminadas individuais pode ter uma curvatura que é diferente da curvatura das outras linhas predeterminadas. Na prática, a localização de detecção não é uma ponta mas pode ser um pequeno ponto ou uma tira que tem um comprimento que é menor que o comprimento das linhas predeterminadas ao longo das quais os sítios de ligação estão dispostos. A curvatura de cada linha predeterminada curvada individual é escolhida de modo que o comprimento de trajetória óptica da luz que se propaga do acoplador óptico à linha predeterminada individual e dessa à localização de detecção predeterminada seja um número inteiro múltiplo do comprimento de onda predeterminado da luz de propagação para toda a linha curvada. Isso é vantajoso, ainda, pelo fato de que a luz espalhada pelos centros de espalhamento localizados nas seções externas das linhas predeterminadas contribui para o sinal na área espacialmente reduzida da localização de detecção com formato de ponta (ou com formato de ponto ou tira).

[00011] Em conformidade, ainda, com um aspecto adicional do dispositivo de acordo com a invenção, a pluralidade de linhas predeterminadas é disposta na superfície externa do guia de onda plano de modo que as localizações das mesmas em coordenadas Xj.yj sejam geometricamente definidas pela equação

em que

[00012] Àéo comprimento de onda no vácuo da luz de propagação,

[00013] N é o índice refrativo eficaz do modo guiado no guia de onda plano; N depende da espessura e do índice refrativo do guia de onda plano, do índice refrativo do substrato, do índice refrativo de um meio na superfície externa do guia de onda plano e da polarização do modo guiado,

[00014] nsé o índice refrativo do substrato,

[00015] f é a espessura do substrato,

[00016] Ao é um número inteiro que é escolhido para ser próximo do produto do índice refrativo ns e da espessura f do substrato dividido pelo comprimento de onda À, e

[00017] j é um número inteiro sequencial que indica o índice da linha respectiva.

[00018] O número inteiro escolhido Ao atribui valores de x negativos no centro das linhas com valores de j negativos e valores de x positivos no centro das linhas com valores de j positivos. Ou em outras palavras, o número inteiro Ao define a origem do quadro de coordenadas x,y que é usado para a localização das linhas na superfície externa do guia de onda plano; o valor de Ao escolhido coloca a localização de detecção em x=0, y=0, z=-f.

[00019] Conforme já delineado acima, para um sinal aprimorado na localização de detecção predeterminada é preferencial que a pluralidade de linhas predeterminadas seja disposta de modo que os centros de espalhamento dispostos ao longo dessas linhas predeterminadas estejam localizados em uma estrutura similar a grade curvada com uma distância decrescente entre as linhas predeterminadas adjacentes. Tal disposição satisfaz a condição de que a diferença no comprimento de trajetória óptica para a luz que se propaga do acoplador óptico às linhas predeterminadas individuais e espalhadas pelos centros de espalhamento à localização de detecção predeterminada seja um número inteiro múltiplo do comprimento de onda predeterminado da luz que se propaga no guia de onda. Além disso, o comprimento de trajetória óptica da luz que se propaga do acoplador óptico às linhas predeterminadas individuais e dessas à localização de detecção predeterminada é um número inteiro múltiplo do comprimento de onda predeterminado da luz de propagação para toda a linha curvada. Assim, é possível formar um dispositivo compacto devido aos sítios de ligação que são dispostos na superfície do guia de onda plano en- quanto a localização de detecção pode ser formada na superfície do inferior substrato que porta o guia de onda plano.

[00020] Duas modalidades são particularmente previstas de como os sítios de ligação podem ser dispostos ao longo da pluralidade de linhas predeterminadas. De acordo com uma primeira modalidade, os sítios de ligação compreendem moléculas de captura presas à superfície do guia de onda plano ao longo das linhas predeterminadas apenas. Essas moléculas de captura capazes de ligar as amostras-alvo e são imobilizadas na superfície externa do guia de onda plano (embora, conforme mencionado acima, os sítios de ligação podem ser formados pela superfície ativada do próprio guia de onda plano). A imobilização das moléculas de captura na superfície externa do guia de onda plano ao longo das linhas predeterminadas pode geralmente ser realizada através de qualquer método adequado, por exemplo, pode ser realizada com o uso de métodos fotolitográficos que usam uma máscara litográfica com linhas curvadas. Não é necessário dizer que a disposição dos sítios de ligação ao longo das linhas predeterminadas deve ser entendida em qualquer modalidade da invenção em um sentido de que a maior parte dos sítios de ligação - na modalidade presente, as moléculas de captura - estão localizados ao longo das linhas predeterminadas e não inclui explicitamente que alguns sítios de ligação são dispostos em localizações diferentes dessas.

[00021] De acordo com uma segunda modalidade, os sítios de ligação compreendem, novamente, moléculas de captura que têm uma capacidade de ligar as amostras-alvo, o que não é uma restrição a um determinado tipo de sítio de ligação ou a um determinado tipo de amostra-alvo. Novamente, as moléculas de captura capazes de ligar as amostras-alvo. Entretanto, a disposição de moléculas de captura capazes de ligar as moléculas-alvo ao longo das linhas predeterminadas é realizada distribuindo-se e imobilizando-se as moléculas de captura capazesde ligar as amostras-alvo em (toda) a superfície do guia de onda plano, e desativando-se, subsequentemente, aquelas moléculas de captura que não estão dispostas ao longo das linhas predeterminadas. O termo "desativar", nesse sentido, se refere a qualquer método adequado para alterar a capacidade de ligação das moléculas de captura (por exemplo, expondo-se as moléculas de captura à luz por um tempo predeterminado) a fim de alcançar que as mesmas não tenham mais a capacidade de ligar amostras-alvo. De acordo com essa modalidade da invenção, as moléculas de captura podem ser aplicadas de modo uniforme ou estático à superfície externa do guia de onda plano. Após a desativação das moléculas de captura que estão dispostas entre as linhas predeterminadas, apenas as moléculas de captura dispostas ao longo das linhas predeterminadas (essas não foram desativadas) capazes de ligar uma amostra-alvo. Não obstante, as moléculas de captura desativadas permanecem imobilizadas na superfície externa do guia de onda plano.

[00022] Essa modalidade tem a vantagem adicional que a contribuição do sinal gerado pela luz espalhada pelas moléculas-alvo ligadas às moléculas de captura ao sinal geral na localização de detecção é aumentada. Geralmente, a diferença entre os sinais da luz espalhada pelas moléculas-alvo ligadas às moléculas de captura e a luz espalhada pelas moléculas de captura sem qualquer molécula-alvo às mesma é pequena em comparação com a luz espalhada pelas moléculas de captura sozinhas. Supondo-se que as propriedades de espalhamento das moléculas de captura dispostas ao longo das linhas predeterminadas (que não foram desativadas) e das moléculas de captura desativadas dispostas entre as linhas predeterminadas sejam idênticas e supondo-se, adicionalmente, que as moléculas de captura sejam distribuídas de modo homogêneo sobre a superfície externa do guia de onda plano, então idealmente nenhum sinal é produzido na localização de detecção após as moléculas de captura terem sido imobilizadas na superfície externa do guia de onda plano e após as moléculas de captura dispostas entre as linhas predeterminadas terem sido desativadas. Na prática, entretanto, a desativação das moléculas de captura altera ligeiramente as propriedades de espalhamento das moléculas de captura, de modo que pode não ser ideal desativar todas as das moléculas de captura que estão dispostas entre as linhas predeterminadas. Em vez disso, apenas a vasta maioria das moléculas de captura dispostas entre as linhas predeterminadas pode ser desativada. A desativação das moléculas de captura é realizada em um determinado grau de modo que o sinal geral na localização de detecção produzido por aquelas moléculas de captura dispostas ao longo das linhas predeterminadas e por aquelas desativadas e pelas poucas moléculas de captura não desativadas dispostas entre as linhas predeterminadas esteja em um mínimo e seja preferencialmente zero. Supondo-se que o sinal assim obtido na localização de detecção pode ser reduzido a zero, isso significa que após adicionar as amostras-alvo o sinal produzido na localização de detecção resulta apenas das amostras-alvo ligadas às moléculas de captura. No caso de nenhuma amostra-alvo estar ligada às moléculas de captura, o sinal na localização de detecção permanece zero. Isso aumenta a sensibilidade do detector para o sinal gerado pela luz espalhada pelas moléculas-alvo ligadas às moléculas de captura na localização de detecção.

[00023] Em conformidade com um aspecto adicional do dispositivo de acordo com a invenção, o guia de onda plano tem um índice refrati- vo nw que é substancialmente mais alto que o índice refrativo ns do substrato e que é, ainda, substancialmente mais alto que o índice refrativo nmed do meio na superfície externa do guia de onda plano, de modo que, para um comprimento de onda predeterminado da luz, o campo evanescente tenha uma profundidade de penetração na faixa de 40 nm a 200 nm. O termo "substancialmente mais alto"deve ser entendido como designando uma diferença em índice refrativo que permite um acoplamento da luz no interior do guia de onda plano em que a mesma se propaga sob reflexo total. A luz que se propaga ao longo do guia de onda plano tem um campo evanescente que se propaga ao longo da superfície externa do guia de onda plano. O campo evanescente tem uma profundidade de penetração que depende do índice nmed, do índice refrativo eficaz N do modo guiado, bem como no comprimento de onda da luz de propagação, de modo que a profundidade de penetração possa ser adaptada para que a luz do campo evanescente seja espalhada de modo coerente pelas amostras-alvo ligadas aos sítios de ligação localizados nas linhas predeterminadas (ou próximo das mesmas) na superfície externa. Os valores aproximados da profundidade de penetração mencionada acima devem ser entendidos como incluindo explicitamente os valores limítrofes exatos da mesma.

[00024] Em conformidade com um aspecto adicional do dispositivo de acordo com a invenção, o dispositivo compreende um acoplador óptico adicional para acoplar para fora a luz que foi propagada através do guia de onda plano. Tanto o acoplador óptico para acoplar a luz no interior do guia de onda plano bem como o acoplador óptico adicional para acoplar para fora a luz que foi propagada através do guia de onda plano podem compreender uma grade óptica para acoplar de modo coerente a luz para dentro e para fora do guia de onda plano. O acoplador óptico e o acoplador óptico adicional compreendem uma grade óptica para acoplar de modo coerente a luz par dentro e para fora do guia de onda plano sob um ângulo de acoplamento interno ou ângulo de acoplamento externo predeterminado respectivo. O ângulo de acoplamento interno ou ângulo de acoplamento externo é determinado pelo comprimento de onda da luz bem como pela característica do acoplador óptico. Entretanto, dentro do escopo da invenção, a luz também pode ser acoplada para dentro e para fora do guia de onda plano por quaisquer outros meios adequados para acoplar luz para dentro e para fora de um guia de onda plano de uma espessura na faixa de alguns nanometres a algumas centenas de nanômetros. Apenas a título de exemplo, um acoplador óptico alternativo pode ser um prisma óptico.

[00025] Em conformidade com um aspecto adicional do dispositivo da invenção, o guia de onda plano tem uma primeira seção de extremidade e uma segunda seção de extremidade que são dispostas em extremidades opostas do guia de onda plano em relação à direção de propagação da luz através do guia de onda plano. A primeira seção de extremidade e a segunda seção de extremidade compreendem um material com capacidade de absorção no comprimento de onda da luz que se propaga através do guia de onda plano. O material com capacidade de absorção minimiza os reflexos da luz que se propaga ao longo do guia de onda plano em direção à seção de extremidade respectiva e de volta ao interior do guia de onda plano. Isso aprimora o sinal detectado à medida que a luz que foi refletida a partir das extremidades do guia de onda plano é eliminada ou pelo menos consideravelmente minimizada.

[00026] Em conformidade com um aspecto adicional do dispositivo de acordo com a invenção, uma pluralidade de zonas de medição é disposta na superfície externa do guia de onda plano. Em cada zona de medição, os sítios de ligação são dispostos ao longo da pluralidade de linhas predeterminadas. Para uma triagem de alta produtividade, as detecções de afinidade de ligação simultâneas de uma amostra podem ser alcançadas para diferentes tipos de sítios de ligação e amostras- alvo dispondo-se as amostras-alvo respectivas ligadas aos sítios de ligação em zonas de medição separadas. Cada zona de medição tem uma localização de detecção individual correspondente para permitir uma detecção separada da luz espalhada do campo evanescente.

[00027] Em conformidade com um aspecto adicional do dispositivo de acordo com a invenção, a pluralidade de zonas de medição compreende zonas de medição de tamanhos diferentes. Todos os tamanhos das zonas de medição são conhecidos. Na localização de detecção respectiva, a luz espalhada em zonas de medição correspondentes de tamanho diferente nas quais o mesmo tipo de amostras-alvo é ligado ao mesmo tipo de sítios de ligação pode ser comparada. A intensidade da luz espalhada na localização de detecção tem uma correlação quadrática com o número de centros de espalhamento na zona de medição respectiva na superfície plana do guia de onda. Assim, para uma distribuição uniforme e densidade de área dos centros de espalhamento nas zonas de medição de tamanhos diferentes, as intensidades da luz espalhada nas localizações de detecção respectivas de zonas de medição correspondentes de tamanhos diferentes têm uma correlação quadrática com o tamanho das zonas de medição respectivas. Portanto, as intensidades da luz espalhada em localizações de detecção de zonas de medição de tamanhos diferentes podem ser usadas para verificar que as intensidades medidas são de fato repre-sentativas da luz espalhada pelos centros de espalhamento dispostos nas linhas predeterminadas.

[00028] De acordo com um aspecto da invenção, cada zona de medição tem uma área maior que 25 pm2, em que a pluralidade de linhas predeterminadas tem uma distância entre as linhas predeterminadas adjacentes menor que 1,5 pm, em particular menor que 1 pm. Isso permite alcançar dispositivos altamente integrados com altos números de zonas de medição, isto é 1.000, 10.000, 100.000, ..., até 4 X 106 zonas de medição por centímetro quadrado.

[00029] Vantajosamente, os sítios de ligação são dispostos ao lon- go de pelo menos duas pluralidades de linhas predeterminadas em uma única zona de medição. Cada uma das duas pluralidades de linhas predeterminadas é disposta de modo que a luz espalhada pelas amostras-alvo ligadas aos sítios de ligação dispostos ao longo da plu-ralidade respectiva de linhas predeterminadas interfira com uma diferença em comprimento de trajetória óptica que é um número inteiro múltiplo do comprimento de onda predeterminado da luz em uma localização de detecção individual para cada uma dentre a pluralidade de linhas predeterminadas. As localizações de detecção individuais são separadas espacialmente umas das outras. Mais de uma pluralidade de linhas predeterminadas na zona de medição que estão dispostas de modo a fornecer localizações de detecção espacialmente separadas permitem a realização de métodos adicionais para a detecção de eventos de ligação (por exemplo, a detecção de ligações cooperativas ou a detecção de cascatas de reação).

[00030] Em conformidade com outro aspecto do dispositivo de acordo com a invenção, o dispositivo compreende um diafragma que tem uma abertura que é disposta de modo que a luz na localização de detecção seja permitida a passar através da abertura enquanto a luz em uma localização diferente da localização de detecção é bloqueada pelo diafragma. Um diafragma mecânico bem como um diafragma eletrônico podem ser adaptados para bloquear toda a luz além daquela que é espalhada para a localização de detecção. Vantajosamente, o diafragma pode ser formado na superfície externa do substrato naquele lado longe do guia de onda plano. Por exemplo, um material não transparente, por exemplo, uma camada de cromo, pode ser aplicado à superfície do substrato longe do guia de onda. A camada de cromo não transparente tem uma abertura transparente na localização de detecção através da qual a luz espalhada para a localização de detecção pode passar enquanto o restante da luz não espalhada para a abertura é bloqueado.

[00031] Em conformidade com um aspecto ainda adicional do dispositivo de acordo com a invenção, o diafragma compreende, adicionalmente, pelo menos uma abertura adicional que é disposta adjacente à abertura quando visto na direção de propagação da luz através do guia de onda plano. A abertura adicional é localizada adjacente à abertura de modo que uma luz incoerente espalhada para a abertura adicional possa passar através da abertura adicional. Vantajosamente, a luz de segundo plano incoerente detectada pode ser corrigida pelo uso de um diafragma que tem uma abertura adicional. A abertura adicional não detecta, por si só, a luz de segundo plano incoerente na localização de detecção, mas permite a determinação da quantidade da luz incoerente na localização de detecção a partir de uma medição da luz incoerente em uma localização diferente da localização de detecção. A quantidade de luz incoerente assim determinada na localização de detecção não pode ser separada da luz na localização de detecção, mas pode ser subtraída de todo sinal na localização de detecção, uma vez que todo sinal na localização de detecção tenha sido medido por um detector. Para uma correção aprimorada, uma primeira abertura adicional está localizada em relação à direção da luz de propagação diante da localização de detecção e uma segunda abertura adicional está localizada atrás da localização de detecção. Tal configuração permite detectar um valor médio para a luz incoerente na localização de detecção para corrigir o sinal na localização de detecção.

[00032] Outro aspecto da invenção se refere a um sistema para a detecção de afinidades de ligação que compreende um dispositivo para a detecção de afinidades de ligação de acordo com a invenção. O sistema compreende, adicionalmente, uma fonte de luz para emitir luz coerente de um comprimento de onda predeterminado, sendo que a fonte de luz e o dispositivo são dispostos em relação um ao outro de modo que a luz coerente seja acoplada no interior do guia de onda plano através do acoplador óptico. Alternativamente, o sistema compreende, adicionalmente, meios ópticos para realizar a varredura e/ou ajuste do ângulo de luz que incide no acoplador óptico visto que o ângulo exato de acoplamento do acoplador óptico pode variar de dispositivo para dispositivo. Alternativamente, o comprimento de onda da luz emitida pela fonte de luz no sistema pode ser ajustado, o que pode ser vantajoso no caso do ângulo da luz que incide no acoplador óptico ser fixo por razões de construção.

[00033] De acordo com ainda outro aspecto do sistema de acordo com a invenção, o sistema compreende, adicionalmente, uma unidade de imageamento óptico, sendo que a unidade de imageamento óptico é focalizada de modo a produzir uma imagem da localização de detecção do dispositivo. A unidade de imageamento óptico tem a capacidade de fornecer uma imagem da localização de detecção predeterminada na qual a luz espalhada pelas amostras-alvo ligadas aos sítios de ligação interfere com uma diferença em comprimento de trajetória óptica que é um número inteiro múltiplo do comprimento de onda predeterminado da luz. A unidade de imageamento óptico pode ser usada para imagear a luz presente na localização de detecção para uma localização de observação. A unidade de imageamento óptico pode ser adaptada para imagear tanto a luz a partir da localização de detecção bem como a luz a partir da abertura adicional ou aberturas adicionais, visto que essa luz pode ser usada para a subtração da luz de segundo plano incoerente de toda a luz presente na localização de detecção. Alternativamente ou além disso, a unidade de imageamento óptico pode ser usada para selecionar apenas a luz na localização de detecção focando-se a unidade de imageamento óptico para a localização de detecção. Desse modo, um diafragma não é mais necessário.

[00034] Outro aspecto da invenção se refere a um método para a detecção de afinidades de ligação. O método compreende as etapas de:

[00035] - fornecer um dispositivo que compreende um guia de onda plano disposto em um substrato e um acoplador óptico,

[00036] - acoplar a luz coerente de um comprimento de onda prede terminado no interior do guia de onda plano de modo que a luz coerente se propague ao longo do guia de onda plano com um campo evanescente da luz coerente que se propaga ao longo de uma superfície externa do guia de onda plano,

[00037] - prender as amostras-alvo aos sítios de ligação dispostos ao longo de uma pluralidade de linhas predeterminadas na superfície externa do guia de onda plano,

[00038] - detectar, em uma localização de detecção predetermina da, a luz do campo evanescente espalhada pelas amostras-alvo ligadas aos sítios de ligação dispostos ao longo das linhas predeterminadas, sendo que a luz espalhada pelas amostras-alvo ligadas aos sítios de ligação tem, na localização de detecção predeterminada, uma diferença em comprimento de trajetória óptica que é um número inteiro múltiplo do comprimento de onda predeterminado da luz.

[00039] Aspectos vantajosos adicionais da invenção se tornam evidentes a partir da seguinte descrição das modalidades da invenção com referência aos desenhos anexos nos quais:

[00040] a Figura 1 mostra uma vista em perspectiva de uma modalidade do dispositivo de acordo com a invenção;

[00041] a Figura 2 mostra uma vista em corte do dispositivo da Figura 1;

[00042] a Figura 3 mostra uma ilustração de trajetórias ópticas diferentes para a luz do campo evanescente que se propaga ao longo da superfície externa e que é espalhada para a localização de detecção;

[00043] a Figura 4 mostra uma zona de medição do dispositivo de acordo com a invenção que compreende uma disposição de uma pluralidade de linhas predeterminadas, sendo que os sítios de ligação são imobilizados ao longo das linhas predeterminadas;

[00044] a Figura 5 mostra a medição da Figura 4, sendo que algumas amostras-alvo são ligadas aos sítios de ligação;

[00045] a Figura 6 mostra uma zona de medição de um dispositivo de acordo com a invenção que compreende uma disposição de uma pluralidade de linhas predeterminadas, sendo que os sítios de ligação são imobilizados ao longo das linhas predeterminadas e entre as linhas predeterminadas;

[00046] a Figura 7 mostra a zona de medição da Figura 6, sendo que aqueles sítios de ligação dispostos entre as linhas predeterminadas são desativados;

[00047] a Figura 8 mostra a zona de medição da Figura 7 com as amostras-alvo são adicionadas;

[00048] a Figura 9 mostra a zona de medição da Figura 8 sendo que as amostras-alvo são ligadas aos sítios de ligação imobilizados ao longo das linhas predeterminadas;

[00049] a Figura 10 mostra uma ilustração da construção de uma seção de vazio na qual as linhas predeterminadas de uma zona de medição devem ser eliminadas;

[00050] a Figura 11 mostra a zona de medição da Figura 10, com uma seção de vazio na qual as linhas predeterminadas são eliminadas;

[00051] a Figura 12 mostra uma vista superior de uma modalidade adicional do dispositivo de acordo com a invenção que compreende uma pluralidade de zonas de medição;

[00052] a Figura 13 mostra uma vista inferior da modalidade do dispositivo da Figura 10, sendo que uma abertura é fornecida na localização de detecção e duas aberturas adicionais são fornecidas em locali- zações diante e atrás da localização de detecção para cada zona de medição;

[00053] as Figuras 14 a 17 mostram uma porção de uma zona de medição de um dispositivo de acordo com a invenção em fases diferentes de um processo de ligação amostras-alvo;

[00054] a Figura 18 mostra uma vista em corte de uma modalidade adicional do dispositivo na qual o dispositivo compreende um substrato de carreador adicional;

[00055] a Figura 19 mostra uma ilustração de trajetórias ópticas diferentes para a luz do campo evanescente espalhada em duas pluralidades diferentes de linhas predeterminadas dispostas em uma única zona de medição;

[00056] a Figura 20 mostra uma vista superior do dispositivo da Figura 18 que tem doze zonas de medição dispostas no mesmo, sendo que três pluralidades de linhas predeterminadas são dispostas em cada zona de medição; e

[00057] a Figura 21 mostra uma vista inferior do dispositivo da Figura 18 com aberturas em uma camada não transparente formada no topo do substrato de carreador adicional.

[00058] A Figura 1 mostra uma vista em perspectiva de uma modalidade do dispositivo de acordo com a invenção para a detecção de afinidades de ligação de uma amostra. O dispositivo compreende um substrato 3 de um material transparente que na modalidade mostrada tem o formato de um cubo retangular, sem se limitar a esse formato. Um guia de onda plano 2 (consulte também a Figura 2) é disposto no lado superior do substrato 3, dentro do qual uma luz coerente 1 é acoplada de modo que a luz coerente se propague através do guia de onda plano 2 sob um reflexo total. Visto que o guia de onda plano 2 tem uma espessura na faixa de alguns nanometres a algumas centenas de nanômetros apenas, o mesmo não é ilustrado como uma camada se- parada na Figura 1, mas é mostrado exagerado na Figura 2. Conforme ilustrado pelas setas paralelas na Figura 1, a luz coerente 1 de um comprimento de onda predeterminado é acoplada através do substrato 3 no interior do guia de onda plano 2 com o auxílio de uma grade 4 que atua como um acoplador óptico. A luz coerente acoplada no interior do guia de onda plano 2 se propaga ao longo do guia de onda plano 2 com um campo evanescente 6 (representado por uma seta) que penetra no meio acima da superfície superior do guia de onda plano 2 (consulte novamente a Figura 2). O campo evanescente 6 se propaga ao longo da superfície externa 5 do guia de onda plano 2. Uma zona de medição 10 disposta na superfície externa do guia de onda plano 2 compreende uma pluralidade de linhas predeterminadas 9 (cada uma das linhas mostradas representa uma multiplicidade de linhas, em particular cinquenta linhas no presente exemplo de tal dispositivo; e apenas uma de tal zona de medição é mostrada na Figura 1 para fins de clareza). Os sítios de ligação (não mostrados na Figura 1) aos quais as amostras-alvo podem se ligar são dispostos ao longo dessas linhas predeterminadas 9. A luz coerente do campo evanescente 6 é espalhada pelas amostras-alvo ligadas aos sítios de ligação dentro da zona de medição 10. Parte da luz espalhada pelas amostras-alvo ligadas aos sítios de ligação é direcionada a uma localização de detecção em que o diafragma 11 que compreende uma abertura 21 está disposto. O diafragma 11 é produzido a partir de um material não transparente e pode, por exemplo, ser uma camada de cromo que é aplicada na superfície inferior do substrato 3.

[00059] A Figura 2 mostra uma vista em corte do dispositivo da Figura 1, sendo que a espessura do guia de onda plano é mostrada exagerada para fins de explicação do princípio geral de trabalho. Conforme pode ser observado, a luz acoplada no interior do guia de onda plano 2 com o auxílio de grade óptica 4 se propaga através do guia de onda plano 2 sob um reflexo total até alcança uma grade adicional 13 disposta na extremidade oposta do guia de onda plano 2. Essa grade adicional serve como um acoplador óptico adicional para acoplar a luz para fora do guia de onda plano. Para evitar reflexos e para minimizar a luz de segundo plano incoerente, uma primeira seção de extremidade 14 e uma segunda seção de extremidade 15 do guia de onda plano 2 compreendem um material com capacidade de absorção. Correspondente à luz que se propaga no guia de onda plano, o campo evanescente 6 se propaga ao longo da superfície externa 5 do guia de onda plano 2.

[00060] O índice refrativo nw do guia de onda plano 2 é substancialmente mais alto que o índice refrativo ns do substrato 3 e também substancialmente mais alto que o índice refrativo nmed do meio na su-perfície externa 5 do guia de onda plano 2. O índice refrativo nmed do meio na superfície externa 5 pode variar dependendo do tipo de amostra aplicada ao mesmo. Por exemplo, o índice refrativo nmed para o meio na superfície externa 5 pode ser da ordem do índice refrativo de água no caso da amostra-alvo estar presente em uma solução aquosa aplicada à superfície externa 5 do guia de onda plano 2, ou pode ser da ordem do índice refrativo de ar no caso de amostras-alvo secas, ou pode ser da ordem do índice refrativo de uma camada de hidrogel 16 no caso dos sítios de ligação ao quais as amostras-alvo 8 podem ser ligar estarem contido em uma camada de hidrogel 16 na superfície externa 5. A profundidade de penetração do campo evanescente 6 no meio na superfície externa 5 do guia de onda plano 2 (distância entre a superfície externa 5 do guia de onda plano 2 e o declínio de intensidade de 1/e2 do campo evanescente 6) depende do índice nmed do meio na superfície externa 5 do guia de onda plano 2, do índice refrativo eficaz N do modo guiado e do comprimento de onda À da luz.

[00061] A luz no campo evanescente 6 que se propaga ao longo da superfície externa 5 do guia de onda plano 2 é espalhada pelas amos-tras-alvo 8 ligadas aos sítios de ligação, e esses sítios de ligação podem compreender as moléculas de captura 7 capazes ligar as amostras-alvo 8 e que são dispostas na zona de medição 10 ao longo das linhas predeterminadas 9 (Figura 1). Na Figura 2, é indicado por setas de comprimento decrescente que a distância entre as linhas predeterminadas adjacentes ao longo das quais as moléculas de captura 7 são dispostas diminui quando vistas na direção de propagação da luz. Conforme pode ser adicionalmente observado, na modalidade mostrada na Figura 2 as amostras-alvo 8 foram aplicadas à zona de medição distribuindo-se uma gota que contém as amostras-alvo 8. Parte da luz espalhada pelas amostras-alvo 8 ligadas às moléculas de captura 7 é direcionada à localização de detecção onde a abertura 21 do diafragma 11 está disposta. Como opção, a luz na localização de detecção pode ser imageada em um fotodetector 20 por uma unidade de imageamento óptico 19. A unidade de imageamento óptico 19 e o fotodetector 20 são mostrados circundados por uma caixa desenhada em linhas tracejadas, visto que podem ser fornecidos alternativamente ou em combinação, e podem em particular ser fornecidos em combinação em uma unidade.

[00062] Embora já seja evidente a partir da Figura 2 que os comprimentos das trajetórias ópticas da luz do campo evanescente 6 que é espalhada pelas amostras-alvo 8 ligadas a diferentes moléculas de captura 7 à localização de detecção é diferente, isso se torna ainda mais evidente quando observa-se a Figura 3 na qual várias de tais trajetórias ópticas diferentes são explicitamente mostradas. Parte da luz coerente do campo evanescente 6 é espalhada pelas amostras- alvo 8 ligadas a diferentes moléculas de captura 7 de modo a interferir na localização de detecção que é a localização da abertura 21 do diafragma 11. Para uma localização de detecção predeterminada, a dis- posição e a geometria das linhas predeterminadas 9 bem como a espessura do substrato 3 são selecionadas de modo que na localização de detecção a diferença no comprimento de trajetória óptica seja um número inteiro múltiplo do comprimento de onda predeterminado da luz coerente. Assim, a interferência da luz na localização de detecção é a sobreposição aditiva coerente da luz espalhada para a localização de detecção pelas moléculas-alvo 8 ligadas às diferentes moléculas de captura 7.

[00063] Para a modalidade mostrada na Figura 3, a pluralidade de linhas predeterminadas curvadas 9 é disposta na superfície externa 5 do guia de onda plano de modo que as localizações das mesmas no plano da superfície externa 5 do guia de onda plano sejam geometricamente expressas em coordenadas Xj.yj pela equação

em que

[00064] À é o comprimento de onda no vácuo da luz de propagação,

[00065] N é o índice refrativo eficaz do modo guiado no guia de onda plano; N depende da espessura e do índice refrativo do guia de onda plano, do índice refrativo do substrato, do índice refrativo de um meio na superfície externa do guia de onda plano e da polarização do modo guiado,

[00066] ns é o índice refrativo do substrato,

[00067] f é a espessura do substrato,

[00068] Ao é um número inteiro que é escolhido para ser próximo do produto do índice refrativo ns e da espessura f do substrato dividido pelo comprimento de onda À, e

[00069] j é um número inteiro sequencial que indica o índice da linha respectiva.

[00070] A Figura 4 mostra uma zona de medição 10 em uma vista ampliada que compreende as linhas predeterminadas 9 e os sítios de ligação representados pelas moléculas de captura 7 que são imobilizadas na superfície externa do guia de onda plano 5 (consulte a Figura 1) ao longo das linhas predeterminadas 9. A imobilização das moléculas de captura 7 ao longo das linhas predeterminadas pode ser realizada apenas com o auxílio de conjuntos de procedimentos litográficos, conforme foi discutido acima. Na Figura 5, as amostras-alvo 8 são ligadas a algumas das moléculas de captura 7. Visto que as moléculas de captura 7 são dispostas ao longo da pluralidade de linhas predeterminadas 9, as amostras-alvo 8 ligadas às moléculas de captura 7 também são dispostas ao longo da pluralidade de linhas predeterminadas 9. Na localização de detecção isso resulta na sobreposição aditiva coerente da luz espalhada pelas centros de espalhamento formados pelas amostras-alvo 8 ligadas às moléculas de captura 7, conforme explicado acima.

[00071] A Figura 6, a Figura 7, a Figura 8 e a Figura 9 mostram, novamente, uma zona de medição 10 em uma vista ampliada. Entretanto, a maneira como as moléculas de captura 7 capazes de ligar as amostras-alvo 8 foram imobilizadas ao longo das linhas predeterminadas 9 é diferente.

[00072] Conforme pode ser observado na Figura 6, em uma primeira etapa as moléculas de captura 7 são imobilizadas sobre (toda) a superfície externa do guia de onda plano na zona de medição 10, de modo que não haja qualquer disposição das moléculas de captura ao longo da pluralidade de linhas predeterminadas 9. Assim, a luz do campo evanescente espalhada pelas moléculas de captura 7 não interfere na localização de detecção da maneira descrita acima.

[00073] Conforme pode ser observado na Figura 7, as moléculas de captura dispostas entre as linhas predeterminadas 9 foram desativa- das de modo que nenhuma amostra-alvo possa se ligar a essas moléculas de captura desativadas 12. Consequentemente, as únicas moléculas de captura 7 capazes de ligar amostras-alvo são dispostas ao longo da pluralidade de linhas predeterminadas 9. A precisão da imobilização das moléculas de captura 7 ao longo das linhas predeterminadas 9 depende do método de fixação, imobilização ou desativação das moléculas de captura 7. Como resultado, a localização das moléculas de captura imobilizadas 7 capazes de ligar as amostras-alvo 8 pode não estar exatamente "nas" linhas predeterminadas 9, mas pode de determinada maneira ser desviada da localização exata "nas" linhas predeterminadas 9. Na prática, o desvio da localização exata "nas" linhas predeterminadas pode ser abrangido por uma faixa que é menor que um quarto da distância das linhas predeterminadas adjacentes 9. Isso resulta em uma interferência ainda construtiva da luz espalhada para a localização de detecção.

[00074] Conforme será explicado na parte introdutória, a desativação das moléculas de captura 12 dispostas entre as linhas predeterminadas 9 é realizada de modo que após a desativação o sinal geral na localização de detecção (nenhuma amostra-alvo 8 foi adicionada ainda) produzido pelas moléculas de captura desativadas 12 e pelas moléculas de captura 7 capazes de ligar as amostras-alvo 8 é definido ou ajustado para um sinal mínimo sintonizado na localização de detecção, idealmente para zero.

[00075] A próxima etapa é adicionar as amostras-alvo 8 à zona de medição 10 na superfície externa do guia de onda plano, conforme mostrado na Figura 8. Visto que apenas as moléculas de captura 7 dispostas ao longo das linhas predeterminadas 9 capazes de ligar as amostras-alvo 8, as amostras-alvo 8 são ligadas àquelas moléculas de captura 7 ao longo das linhas predeterminadas 9, conforme mostrado na Figura 9. Devido ao sinal sintonizado na localização de detecção causado pelas moléculas de captura desativadas 12 e pelas moléculas de captura 7 que foram definidas ajustadas para um mínimo anteriormente (consulte acima), o sinal na localização de detecção é, então, principalmente (ou inteiramente, se o sinal produzido pelas moléculas de captura desativadas e pelas moléculas de captura foram reduzidos a zero anteriormente) causado pela luz espalhada pelas amostras-alvo 8 ligadas às moléculas de captura 7 dispostas ao longo das linhas predeterminadas.

[00076] A Figura 10 mostra uma porção da zona de medição 10 conforme descrito acima para ilustrar a construção de uma seção de vazio na qual as linhas predeterminadas 9 devem ser eliminadas para evitar reflexos de Bragg de segunda ordem no guia de onda plano. Os reflexos de Bragg devem ser evitados visto que resultam em uma redução na intensidade da luz que se propaga ao longo do guia de onda plano. Isso particularmente desvantajoso no caso de uma pluralidade de zonas de medição 10 serem dispostas uma após a outra na superfície externa do guia de onda plano na direção da luz de propagação. Assim, uma diminuição da intensidade da luz de propagação espalhada nas zonas de medição subsequentes se deve não apenas aos processos de espalhamento descritos nas várias zonas de medição, mas além disso diminui devido aos reflexos de Bragg no guia de onda plano. Visto que em cada uma das zonas de medição as linhas predeterminadas 9 em uma seção circular da zona de medição têm uma distância entre as linhas adjacentes que satisfaz a condição para o reflexo de Bragg de segunda ordem, o reflexo de Bragg de segunda ordem no guia de onda plano define uma localização adicional 22 na qual a luz refletida de Bragg interfere de modo construtivo. No exemplo mostrado, os pontos de interseção do arco do círculo 21 mostrado com as linhas predeterminadas 9 indica aquelas localizações das linhas predeterminadas 9 para as quais a condição de Bragg é exatamente satisfeita, de modo que a luz seja refletida de volta e interfira de modo construtivo na localização adicional 22. Essa luz refletida não está disponível para espalhamento em zonas de medição subsequentemente dispostas 10.

[00077] A Figura 11 mostra uma zona de medição 10 que compreende uma região 23 na proximidade arco de círculo 21 em que as linhas predeterminadas 9 são eliminadas para evitar tais reflexos de Bragg de segunda ordem.

[00078] A Figura 12 e a Figura 13 mostram vistas superior e inferior de uma modalidade adicional do dispositivo de acordo com a invenção. Essa modalidade do dispositivo compreende uma pluralidade de zonas de medição 10 de um primeiro tamanho e zonas de medição 17 de um tamanho diferente. Cada zona de medição 10 compreende uma região 23 na qual a pluralidade de linhas predeterminadas 9 é eliminada para evitar reflexos de Bragg (consulte acima). Geralmente, é possível, ainda, que as zonas de medição do não compreendam as regiões 23. Uma grade óptica 4 para acoplar luz no interior do guia de onda plano e uma grade adicional 13 para acoplar a luz para fora do guia de onda plano são fornecidas. Entre a grade óptica 4 e a grade óptica adicional 13 uma pluralidade de zonas de medição 10 do primeiro tamanho e de zonas de medição 17 de tamanho diferente são dispostos onde os sítios de ligação são dispostos ao longo das linhas predeterminadas 9, conforme foi discutido em detalhes acima. A pluralidade de zonas de medição 10 do primeiro tamanho e a pluralidade de zonas de medição 17 de tamanho diferente permite a detecção simultânea de diferentes combinações de amostras-alvo e sítios de ligação, de modo que uma pluralidade de combinações de amostras-alvo e sítios de ligação possa ser analisada simultaneamente em relação à afinidade de ligação de amostras-alvo específicas a sítios de ligação específicos. Alternativamente, medições redundantes podem ser realizadas para as mesmas combinações de amostras-alvo e sítios de ligação.

[00079] A partir da vista inferior da Figura 13 é possível observar que uma abertura 21 é fornecida para cada zona de medição na localização de detecção, em que a luz espalhada tem uma diferença em comprimento de trajetória óptica que é um número inteiro múltiplo do comprimento de onda da luz que se propaga no guia de onda para o centro de espalhamento em uma linha predeterminada e a partir desse para a localização de detecção predeterminada, também conforme discutido em detalhes acima. Não é necessário dizer que uma unidade de imageamento óptico pode ser fornecida conforme discutido em detalhes em relação à Figura 2.

[00080] As zonas de medição 17 de tamanho diferente são dispostas entre as zonas de medição 10. As zonas de medição 17 têm um tamanho conhecido diferente do tamanho da zona de medição 10, sendo que todos os tamanhos são conhecidos. Na localização de detecção respectiva, a luz espalhada nas zonas de medição 10 e nas zonas de medição correspondentes 17 pode ser comparada (para o mesmo tipo de amostra-alvo ligada ao mesmo tipo de sítios de ligação). A intensidade da luz espalhada na localização de detecção tem uma correlação quadrática com o número de centros de espalhamento na zona de medição na superfície plana do guia de onda. Supondo-se que uma distribuição uniforme e densidade de área de centros de espalhamento nas zonas de medição de tamanhos diferentes, as intensidades da luz espalhada nas localizações de detecção respectivas das zonas de medição correspondentes de tamanhos diferentes têm uma correlação quadrática com o tamanho das zonas de medição respectivas. Consequentemente, as intensidades da luz espalhada em localizações de detecção das zonas de medição de tamanhos diferentes podem ser usadas para verificar que as intensidades medidas sejam de fato representativas da luz espalhada pelos centros de espalhamento dispostos nas linhas predeterminadas.

[00081] Para uma detecção aprimorada de afinidades de ligação, duas aberturas adicionais 18 são formadas no substrato 3 diante de e atrás de cada abertura 21 dedicado à zona de medição respectiva 10. Visto que a luz coerente que se propaga através do guia de onda plano 2 também pode ser espalhada de modo coerente ao longo da trajetória através do guia de onda plano 2, uma contribuição dessa luz espalhada de modo coerente também é detectada na localização de detecção através da abertura 21. As aberturas 18 diante da e atrás da abertura 21 em uma distância predeterminada a determinação de um sinal médio representativo dessa luz espalhada de modo coerente que pode ser usada para corrigir o sinal detectado na localização de detecção subtraindo-se o sinal médio da luz incoerente do sinal geral detectado na localização de detecção. Essa correção do sinal na localização de detecção é particularmente vantajosa em combinação com a redução supramencionada do sinal de segundo plano causada pelo espalhamento nos sítios de ligação em quaisquer moléculas-alvo presas aos mesmos.

[00082] A Figura 14 à Figura 17 mostram uma porção de uma zona de medição que é formada na superfície externa 5 de um guia de onda plano de acordo com a invenção. Diferentes fases de um processo de ligação das amostras-alvo 8 às moléculas de captura 7 são mostradas. Nesse processo, a ligação das amostras-alvo 8 às moléculas de captura 7 é intensificada. As moléculas de captura 7 são imobilizados na superfície externa 5. Subsequentemente, as amostras-alvo 8 e os ligantes 24 são aplicados. As amostras-alvo 8 aplicadas são permitidas a se ligar às moléculas de captura 7 até que uma condição de equilíbrio seja alcançada na qual a ligação das amostras-alvo 8 às moléculas de captura 7 e a liberação das amostras-alvo 8 a partir das moléculas de captura estão em equilíbrio. O ligante é, então, ativado (por exemplo, através de luz) para reforçar as ligações entre as amostras- alvo 8 e as moléculas de captura 7. Subsequentemente, as amostras- alvo 8 não ligadas bem como os ligantes 24 não usados serão removidos por lavagem. Devido às ligações reforçadas entre as amostras- alvo 8 e as moléculas de captura 7 causadas pelos ligantes 24, a remoção por lavagem inadvertida das amostras-alvo 8 ligadas às moléculas de captura 7 é evitada ou pelo menos consideravelmente reduzida. Assim, o sinal na localização de detecção pode ser adicionalmente intensificado. Um exemplo para tal processo que usa ligantes fotoati- vados é descrito em detalhes em "Capture Compound Mass Spectrometry: A Technology for the Investigation of Small Molecule Protein Interactions", ASSAY and Drug Development Technologies, Volume 5, Número 3, 2007.

[00083] A Figura 18 mostra uma vista em corte de um dispositivo que é essencialmente mostrado na Figura 1 mas que em conformidade com uma modalidade adicionalmente tem uma estrutura de camada a ser usada, por exemplo, em sistemas altamente integrados (isto é, de até cerca de 4x106 zonas de medição por cm2). No exemplo mostrado, a zona de medição 10 tem uma área de um tamanho de cerca de 25 pm2. Esse tamanho permite dispor uma multiplicidade de zonas de medição 10 na superfície externa 5 do guia de onda plano 2 para realizar uma multiplicidade de medições com o uso de um único dispositivo. Uma zona de medição 10 de tamanho reduzido é alcançada, por exemplo, "cortando-se" virtualmente a dita área de tamanho reduzido de 25 pm2 a partir de uma zona de medição maior. Entretanto, manter a distância entre as linhas predeterminadas em tal zona de medição 10 de tamanho reduzido inalterada resultaria no fato de que o cone formado pela luz espalhada nas amostras-alvo ligadas aos sítios de ligação na zona de medição 10 de tamanho reduzido teria um ângulo de abertura que é substancialmente menor que o da zona de medição de tamanho grande. O ângulo de abertura menor do cone de luz resultaria no fato de que a mesma unidade de detecção óptica (comparável à Figura 2) que tem sido usada para medir a zona de medição maior e que tem um determinado ângulo de abertura medirá não apenas a luz na localização de detecção, mas também parte da luz de segundo plano incoerente. Isso piora a razão sinal-ruído (razão S/R). Para evitar essa piora da razão S/R, a distância entre a zona de medição 10 e a localização de detecção deve ser reduzida idealmente de modo que o ângulo de abertura do cone formado pela luz espalhada pelas amostras-alvo ligadas aos sítios de ligação da zona de medição 10 de tamanho reduzido e que interfere na localização de detecção seja idêntico ao ângulo de abertura da unidade de detecção óptica. Para reduzir a distância entre a zona de medição 10 de tamanho reduzido e a localização de detecção, a disposição da pluralidade de linhas predeterminadas na zona de medição 10 de tamanho reduzido deve ser determinada de acordo com a fórmula descrita acima com referência à Figura 3 de modo que a luz espalhada pelas amostras-alvo ligadas aos sítios de ligação interfira em uma nova localização de detecção. Visto que a distância entre a zona de medição 10 de tamanho reduzido e a nova localização de detecção está somente na faixa de dez micrometros (pm) a algumas centenas de micrometros (pm), a espessura do substrato 3 pode se tornar impraticavelmente fina. Em particular sob condições de laboratório, pode ser desvantajoso manipular dispositivos que compreendem substratos 3 que têm uma espessura na faixa de 10 a algumas centenas de micrometros (pm). A fim de aprimorar o manejo de tal dispositivo, o dispositivo de acordo com essa modalidade tem a seguinte estrutura de camadas (do lado inferior para o lado superior): um substrato de carreador adicional 24, uma camada 111 de material não transparente, o substrato 3 e o guia de onda plano 2. O substrato de carreador adicional 24 é produzido a partir de um material transparente (por exemplo, vidro, plástico) e tem uma espessura que torna o dispositivo adequado para manuseio (por exemplo, até 3 mm). A camada 111 de material não transparente é formada em cima do substrato de carreador adicional 24. A camada 111 de material não transparente é, por exemplo, uma camada de cromo preto na qual as aberturas 21, 18 são formadas litograficamente. O substrato é de um material transparente e tem uma espessura que corresponde à distância entre a zona de medição de tamanho reduzido 10 e a localização de detecção. O guia de onda plano 2 e as zonas de medição 10 são a princípio semelhantes, conforme descrito adicionalmente. Cada zona de medição 10 pode compreender mais de uma pluralidade de linhas predeterminadas, conforme será discutido em conexão com a Figura 19 abaixo.

[00084] A ilustração das trajetórias ópticas na Figura 19 é semelhante à Figura 3. Entretanto, duas pluralidades diferentes de linhas predeterminadas 9, 91 são dispostas em uma única zona de medição, e em cada tal zona a luz é espelhada para diferentes localizações de detecção espacialmente separadas (focos) pelas amostras-alvo ligadas às diferentes pluralidades de linhas predeterminadas 9, 91. A luz do campo evanescente 6 que se propaga ao longo da superfície externa 5 é espelhada nas amostras-alvo ligadas aos sítios de ligação ao longo da primeira pluralidade de linhas predeterminadas 9 de modo a interferir no foco de lado direito (linhas em negrito) e nas amostras- alvo ligadas aos sítios de ligação ao longo da segunda pluralidade de linhas predeterminadas 91 de modo a interferir no foco de lado esquerdo (linhas tracejadas). Esse princípio se aplica para cada pluralidade de linhas predeterminadas 9, 91 em relação à localização de detecção respectiva, de modo que pluralidades adicionais das linhas predeterminadas possam ser adicionadas dentro de tal zona de medição (por exemplo, três, conforme mostrado na Figura 20). Uma amos- tra- que tem a capacidade de se ligar aos sítios de ligação dispostos nas duas linhas predeterminadas 9, 91 (Figura 19) pode formar ligações cooperativas através de interação de ligação múltipla a interseção das linhas 9, 91. Tal interação de ligação múltipla tem uma resistência alta. As duas ligações podem ser formadas de modo simultâneo ou sequencial dentro de curtos períodos de tempo (de modo instantâneo). Tais interações de ligação múltipla são opticamente detectadas em duas localizações de detecção separadas que fornecem sinais correlacionados nas duas localizações de detecção.

[00085] A Figura 20 mostra uma vista superior do dispositivo da Figura 18 com doze zonas de medição 10 disposta na superfície externa do guia de onda plano. Em cada zona de medição 10, três pluralidades de linhas predeterminadas são fornecidas, e as amostras-alvo ligadas aos sítios de ligação ao longo dessas três pluralidades de linhas predeterminadas espalham a luz acoplada no interior do guia de onda plano através do acoplador óptico 4 para as três localizações de detecção individuais espacialmente separadas. A disposição de três pluralidades é vantajosa visto que cascatas de processo são detectá- veis. Tal cascata de processo existe, por exemplo, quando uma amostra-alvo é dividida em produtos separados no primeiro tipo de molécula de captura disposta de modo a fornecer um sinal na primeira localização de detecção. Um primeiro produto dessa reação não se liga, desse modo, ao segundo tipo de moléculas de captura de modo a fornecer um sinal na segunda localização de detecção. Um segundo produto da reação se liga ao terceiro tipo de molécula de captura de modo a fornecer um sinal na terceira localização de detecção.

[00086] A Figura 21 mostra uma vista inferior do dispositivo da Figura 20. A partir de baixo, através do substrato de carreador adicional transparente 24, a camada 111 do material não transparente disposto no topo do substrato de carreador adicional 24 pode ser vista. Grupos de nove aberturas são formados na camada de material não transparente 111. Estruturalmente, a camada de material não transparente 111 compreende diversas aberturas que têm um formato para bloquear qualquer luz além da luz espalhada necessária para a medição na localização de detecção respectiva. Para uma supressão ótima da luz de segundo plano não coerente difusa na localização de detecção, o diâmetro de uma abertura redonda é escolhido para ser maior que o diâmetro do do ponto focal produzido pela luz espalhada que interfere na localização de detecção. A princípio, o tamanho é fornecido pela fórmula de Abbe para o cálculo da resolução teoricamente possível do microscópio:

[00087] do = À / 2ns sina = = Àf / ns D em que

[00088] À é o comprimento de onda no vácuo da luz coerente que se propaga no guia de onda plano,

[00089] α é metade do ângulo de abertura da zona de medição,

[00090] ns é o índice refrativo do substrato 3,

[00091] f é o comprimento focal da zona de medição, e

[00092] D é o diâmetro da zona de medição.

[00093] Aberturas adicionais são formadas nas camadas não trans-parentes 111 diante e atrás das aberturas 21 (consulte a Figura 18) para determinar um sinal de segundo plano médio. O formato das aberturas pode ser escolhido de modo a corresponder ao formato do ponto focal formado pela luz que interfere na localização de detecção. Pode ser vantajoso fornecer uma abertura alongada 21 (que se estende na direção de propagação do campo evanescente) a fim de evitar o corte da luz a ser detectada na localização de detecção com a borda da abertura, por exemplo, no caso de alterações na localização do ponto focal causadas pelas alterações no índice refrativo da amostra aplicada à superfície externa do guia de onda plano ou causadas por pequenas alterações na espessura do guia de onda plano.

[00094] Embora as modalidades da invenção tenham sido descritas com o auxílio dos desenhos, várias modificações e alterações das modalidades descritas são possíveis, sem se distanciar do ensinamento geral subjacente à invenção. Portanto, a invenção não deve ser entendida como sendo limitada às modalidades descritas, mas em vez disso o escopo de proteção é definido pelas reivindicações.

Claims (18)

1. Dispositivo para uso na detecção de afinidades de ligação, sendo que o dispositivo é caracterizadopelo fato de que compreende um guia de onda plano (2) disposto em um substrato (3) e tendo um acoplador óptico (4) para acoplar luz coerente (1) de um comprimento de onda predeterminado ao guia de onda plano (2) de modo que a luz coerente se propague através do guia de onda plano (2) com um campo evanescente (6) da luz coerente que se propaga ao longo de uma superfície externa (5) do guia de onda plano (2), em que a superfície externa (5) do guia de onda plano (2) compreende sítios de ligação (7) na mesma capazes de ligar as amostras-alvo (8) aos sítios de ligação (7) de modo que a luz do campo evanescente (6) seja espalhada pelas amostras-alvo (8) ligadas aos sítios de ligação (7), em que os sítios de ligação (7) são dispostos ao longo de uma pluralidade de linhas predeterminadas (9), sendo que as linhas predeterminadas (9) são dispostas de modo que a luz espalhada pelas amostras-alvo (8) ligadas aos sítios de ligação (7) interfira em uma localização de detecção predeterminada com uma diferença em comprimento de trajetória óptica que é um número inteiro múltiplo do comprimento de onda predeterminado da luz coerente.

2. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a distância entre linhas predeterminadas adjacentes (9) diminui na direção de propagação da luz do campo evanescente.

3. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a pluralidade de linhas predeterminadas (9) na qual os sítios de ligação (7) são dispostos compreende linhas curvadas, sendo que a curvatura das linhas é de modo que a luz do campo evanescente (6) espalhada pelas amostras-alvo (8) ligadas aos sítios de ligação (7) interfira em um ponto de detecção predeterminado como uma localização de detecção.

4. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a pluralidade de linhas predeterminadas (9) é disposta na superfície externa (5) do guia de onda plano (2) de modo que suas localizações sejam geometricamente definidas pela equação

em que A é o comprimento de onda no vácuo da luz de propagação, N é o índice refrativo eficaz do modo guiado no guia de onda plano; N depende da espessura e do índice refrativo do guia de onda plano, do índice refrativo do substrato, do índice refrativo de um meio na superfície externa do guia de onda plano e da polarização do modo guiado, ns é o índice refrativo do substrato, f é a espessura do substrato, Aoé um número inteiro que é escolhido para ser próximo do produto do índice refrativo ns e da espessura f do substrato dividido pelo comprimento de onda A, e j é um número inteiro sequencial que indica o índice da linha respectiva.

5. Dispositivo, de acordo a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os sítios de ligação compreendem moléculas de captura (7) presas à superfície do guia de onda plano (2) ao longo das li-nhas predeterminadas (9) apenas, sendo que as moléculas de captura capazes de ligar as amostras-alvo (8).

6. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que os sítios de ligação compreendem moléculas de captura (7) capazes de ligar as amostras-alvo (8), sendo que as moléculas de captura (7) capazes de ligar as amostras-alvo (8) estão dispostas ao longo das linhas predeterminadas (9) distribuindo-se as moléculas de captura (7) capazes de ligar as amostras-alvo (8) na superfície externa (5) do guia de onda plano (2) e desativando-se aquelas moléculas de captura (12) que não estão dispostas ao longo das linhas predeterminadas (9).

7. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o guia de onda plano (2) tem um índice refrativo (nw) que é substancialmente mais alto que o índice refrativo (ns) do substrato (3) e que é, ainda, substancialmente mais alto que o índice refrativo (nmed) do meio na superfície externa (5) do guia de onda plano (2), de modo que para um comprimento de onda predeterminado da luz o campo evanescente (6) tenha uma profundidade de penetração na faixa de 50 nm a 200 nm.

8. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o dispositivo é caracterizadopelo fato de que compreende um aco-plador óptico adicional (13) para acoplar para fora a luz coerente que foi propagada através do guia de onda plano (2), assim como o acoplador óptico (4) para acoplar para fora a luz coerente que foi propagada através do guia de onda plano (2) compreendem uma grade óptica (4, 13) para acoplar de modo coerente a luz coerente para dentro e para fora do guia de onda plano (2).

9. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o guia de onda plano (2) tem uma primeira seção de extremidade (14) e uma segunda seção de extremidade (15) que são dispostas em extremidades opostas do guia de onda plano (2) em relação à direção de propagação da luz através do guia de onda plano (2), sendo que a primeira seção de extremidade (14) e a segunda seção de extremidade (15) compreendem, cada uma, um material com capacidade de absorção no comprimento de onda da luz que se propaga através do guia de onda plano (2).

10. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que uma pluralidade de zonas de medição (10, 17) é disposta na superfície externa (5) do guia de onda plano (2), em que em cada zona de medição (10) os sítios de ligação (7) são dispostos ao longo da pluralidade de linhas predeterminadas (9).

11. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que a pluralidade de zonas de medição compreende zonas de medição de tamanhos diferentes (10, 17).

12. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que cada zona de medição (10) tem uma área maior que 25 pm2, e em que a pluralidade de linhas predeterminadas (9) tem uma distância entre as linhas predeterminadas adjacentes (9) menor que 1,5 pm.

13. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que os sítios de ligação (7) são dispostos ao longo de pelo menos duas pluralidades de linhas predeterminadas (9) em uma única zona de medição (10), sendo que cada uma das duas pluralidades de linhas predeterminadas (9) é disposta de modo que a luz coerente do campo evanescente que é espalhada pelas amostras-alvo (8) ligadas aos sítios de ligação (7) dispostos ao longo da pluralidade respectiva das ao menos duas pluralidades de linhas predeterminadas (9) interfira em uma localização de detecção predeterminada individual para cada uma da respectiva pluralidade de linhas predeterminadas (9) com uma diferença no comprimento do caminho óptico que é um múltiplo inteiro do comprimento de onda predeterminado da luz coerente,com as localizações de detecção individuais prédeterminadas para cada das pluralidades respectivas de linhas predeterminadas (9) sendo separadas espacialmente umas das outras.

14. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que compreende, adicionalmente, um diafragma (11) que tem uma abertura (21) que é disposta de modo que a luz na localização de detecção seja permitida passar através da abertura (21) enquanto a luz em uma localização diferente da localização de detecção é bloqueada pelo diafragma (11).

15. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que o diafragma (11) compreende, adicionalmente, pelo menos uma abertura adicional (18) que é disposta adjacente à abertura (21) quando vista na direção de propagação da luz através do guia de onda plano (2).

16. Sistema para a detecção de afinidades de ligação caracterizadopelo fato de que compreende um dispositivo, como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores, e que compreende, adicionalmente, uma fonte de luz para emitir uma luz coerente (1) de um comprimento de onda predeterminado, sendo que a fonte de luz e o dispositivo são dispostos em relação um ao outro de modo que a luz coerente (1) seja acoplada no interior do guia de onda plano (2) através do acoplador óptico (4).

17. Sistema, de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que compreende, adicionalmente, uma unidade de imageamento óptico (19), sendo que a unidade de imageamento óptico (19) é focada de modo a produzir uma imagem da localização de detecção do dispositivo.

18. Sistema, de acordo com a reivindicação 16, em que o sistema é caracterizadopelo fato de que compreende, adicionalmente, um fotodetector (20) para medir a intensidade da luz na localização de detecção.

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