BR112014001544B1 - Fita com almofada individual para um ensaio de fluxo lateral melhorado e ensaio cromatográfico - Google Patents
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Abstract
fita com almofada individual para um ensaio de fluxo lateral melhorado e dispositivo de teste utilizando a mesma. a presente invenção diz respeito a uma fita para um ensaio de fluxo lateral melhorado de uma amostra biológica num plano único e um ensaio de cromatografia de fluxo lateral utilizando um teste que contenha a mesma. a fixa da presente invenção é constituída por uma almofada individual, que pode melhorar o ensaio de fluxo lateral proporcionando um procedimento fácil e simples e uma leitura visual evidente. a fita da presente invenção é constituída por uma zona de aplicação da amostra (amostra) e uma zona resultante de reagente, na qual a mistura de reação é depositada (reagente), que se encontram num mesmo plano. além disso, a presente invenção proporciona um método cromatográfico em que a hemoglobina é separada da substância a analisar por meio de cromatografia diferencial em fase sólida. qualquer interferência na detecção do resultado por parte da hemoglobina é removida pela presente invenção. a presente invenção proporciona vantagens, incluindo um procedimento fácil e simples com uma resposta rápida e evidente.
Description
[001] O presente pedido de patente de invenção reivindica prioridade relativamente ao pedido provisório norte-americano de patente de invenção com o número de série 61/510 762, depositado a 22 de Julho de 2011, cujo conteúdo se considera aqui incorporado por referência.
[002] Os testes efetuados no local de prestação de cuidados (em inglês “point of care”, POC) tornaram-se ferramentas de diagnóstico comuns e bastante úteis não só em instalações de cuidados médicos, incluindo hospitais e consultórios médicos, mas também em outros locais clínicos, incluindo locais de trabalho ou locais mais remotos. Devido à urgência e finalidade dos testes, é bastante desejável um dispositivo de teste simples e eficaz, bem como um método para adquirir os resultados de um modo econômico e eficaz em termos de tempo. De um modo mais específico, os testes em instalações que não sejam de cuidados clínicos, tais como testes em locais clínicos remotos de doenças epidêmicas de rápido desenvolvimento, testes para agentes de armas biológicas em cenários de guerra, testes ambientes para poluentes ou testes no local de trabalho quanto à utilização de fármacos, deverá ser efetuado de um modo simples e fácil. Por vezes, visto que estes testes são frequentemente realizados por indivíduos com pouca, se alguma, experiência em diagnósticos clínicos, estes testes em locais “point of care” deverão ser simples, rápidos e fáceis de utilizar. Além disso, os dispositivos são necessários em ambientes com pouco controle sob as condições de armazenamento, tais como em termos de temperatura ou de umidade. Assim, idealmente, o dispositivo para os testes no local “point of care” requer uma quantidade mínima de equipamento e seria desejável um método de teste embebido no dispositivo estável em condições ambientais severas, incluindo a temperatura e a umidade.
[003] Com o aumento da necessidade de testes nos locais “point of care” para um número aumentado de propósitos e variantes ambientais, existe ainda uma necessidade na especialidade em proporcionar um método e um dispositivo para a realização de testes para um espécime biológico de um modo econômico e eficaz em termos de tempo.
[004] De acordo com uma variante, a presente invenção proporciona uma fita com base numa almofada individual para um ensaio de fluxo lateral em que a zona de aplicação da amostra (amostra) e a zona resultante de reagente onde a mistura de reação é depositada (reagente) se encontram todas no mesmo plano de uma almofada individual.
[005] De acordo com outra variante, a presente invenção proporciona uma fita para um ensaio de fluxo lateral cromatográfico enzimático para uma substância a analisar pré-selecionada, a qual é constituída por: uma almofada individual e um substrato depositado como forma anidra.
[006] Ainda de acordo com outra variante, a presente invenção proporciona um ensaio de fluxo lateral cromatográfico enzimático para uma substância a analisar pré-selecionada, o qual compreende; (a) proporcionar um dispositivo de teste que compreende uma fita constituída por: (i) uma almofada individual e (ii) um substrato depositado como forma anidra; (b) aplicar uma amostra na almofada individual na qual o substrato está depositado; (c) permitir que a amostra flua através do percurso digestivo para chegar ao substrato; (d) permitir que a amostra reaja com o substrato para produzir uma resposta e (e) identificar e interpretar a resposta para indicar a presença ou a concentração da substância a analisar na amostra.
[007] De acordo com outra variante, a presente invenção proporciona um ensaio de fluxo lateral cromatográfico enzimático para detectar a presença de glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD), o qual compreende: (a) proporcionar um dispositivo de teste que compreende uma fita de almofada individual constituída por: (i) uma almofada individual de percurso digestivo pré-tratada com um tampão de lise; (ii) uma mistura de ensaio que compreende glicose-6-fosfato, fosfato de nicotinamida-adenina-dinucleótido (NADP) ou nicotinamida-adenina- dinucleótido (NAD), agente de transferência de hidreto ou de elétrons, e uma sua mistura e (iii) um sal de tetrazólio, (b) aplicar a amostra sobre a almofada individual de percurso digestivo; (c) permitir que a amostra flua através do percurso digestivo até contactar com a mistura de ensaio; (d) permitir que a amostra reaja com a mistura de ensaio para produzir uma resposta e (e) identificar e interpretar a resposta para indicar a presença ou a concentração da substância a analisar na amostra.
[008] De acordo com outra variante, a presente invenção é baseada num ensaio em formato seco no qual a amostra aplicada na zona de aplicação da amostra viaja até à zona de reação por força capilar, estando a zona de aplicação e a zona de reação no mesmo plano. O reagente contém uma combinação de componentes incluindo a enzima e uma composição para promover a cor da reação, estando este depositado como forma anidra. Na presente invenção, a amostra viaja para a zona do reagente e é misturada com o reagente. À medida que a amostra é misturada com o reagente, a composição resultante irá migrar lentamente e irá permanecer na zona resultante de reagente, ao passo que os outros componentes na amostra, tais como hemoglobina, se movem mais rápido do que a composição resultante irão continuar a deslocar-se para se separar da composição resultante desejada através dessa força capilar. Após a reação com uma amostra que contêm a substância a analisar, a zona resultante de reagentes irá apresentar o resultado sob a forma de um indicador, tal como uma cor. A retenção do movimento capilar resultante e contínuo dos outros componentes da amostra irá remover qualquer interferência por partes dos outros componentes, tais como hemoglobina, e melhorar a identificação do resultado. A amostra desloca-se por meio de força capilar num líquido contido na amostra, tal como sangue, ou numa solução tampão, a qual é aplicada suplementarmente com a amostra.
[009] De acordo com uma variante, a presente invenção proporciona um teste de diagnóstico rápido (em inglês RDT) num ensaio em formato anidro numa fita de almofada individual para um teste num local “point of care”. A cromatografia lateral num almofada individual proporciona urn teste estável, um processo simples e um resultado rápido do teste.
[010] De acordo com outra variante, a presente invenção proporciona um método cromatográfico em que a hemoglobina é separada da substância a analisar utilizando cromatografia diferencial em fase sólida. A cor da hemoglobina interfere frequentemente na leitura visual da cor da reação da substância a analisar em células vermelhas sanguíneas. A presente invenção proporciona um método cromatográfico lateral em que a migração diferencial de amostras ocorre devido a diferenças no tamanho, à viscosidade, à precipitação da substância a analisar com reagente, à diferença de carga através da matriz porosa impregnada com reagentes que irão interagir com a substância a analisar.
[011] As vantagens da invenção compreendem a capacidade de obtenção de um procedimento fácil e simples e uma leitura visual limpa isenta da interferência de hemoglobina.
[012] Ao longo do presente pedido de patente de invenção, os termos seguintes possuem os significados a seguir apresentados.
[013] O termo “material biológico”, “amostra biológica” ou “amostra” designa um fluido ou tecido extraído a partir de vertebrados, tais como sangue completo, soro, plasma, saliva, urina e fluido da medula espinal.
[014] O termo “substância a analisar” designa um determinado componente num material biológico, amostra biológica ou amostra que contém uma atividade específica, que constitui a finalidade do ensaio identificar um dos resultados, tais como a presença, a ausência ou a concentração.
[015] Salvo quando indicado de outro modo, todos os termos técnicos ou científicos aqui utilizados possuem o mesmo significado que o habitualmente conhecido pelos especialistas na matéria, à qual a presente invenção pertence. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou em testes da presente invenção, são a seguir descritos os métodos e materiais adequados. Todas as publicações, pedidos de patente de invenção, patentes de invenção e outras referências são aqui incorporadas na sua totalidade por referência. Em caso de conflito, a presente memória descritiva, incluindo as definições, deverá constituir a referência. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos, não se pretendendo que sejam limitativos.
[016] Outras características e vantagens da invenção serão aparentes a partir da seguinte descrição minuciosa e a partir das reivindicações.
[017] A fig. 1 proporciona uma estrutura da fita de almofada individual da presente invenção, em comparação com a fita de duas almofadas convencional.
[018] A fig. 2 proporciona resultados de testes de comparação visual entre a fita de almofada individual da presente invenção em comparação com a fita de duas almofadas convencional para o teste de deficiência em G6PD. A intensidade da identificação visual de cor é medida pela classificação proporcionada na figura.
[019] A fig. 3 proporciona resultados do teste de comparação de intensidade de sinal entre a fita de almofada individual da presente invenção em comparação com a fita de duas almofadas convencional utilizando um ensaio enzimático para o teste de G6PD. A intensidade da identificação visual da cor é medida pela classificação proporcionada na figura.
[020] A fig. 4 proporciona resultados de teste de comparação visual entre a fita de almofada individual da presente invenção em comparação com a fita de duas almofadas convencional para um teste de lactato desidrogenase.
[021] A fig. 5 proporciona resultados de teste de comparação de intensidade de sinal entre a fita de almofada individual da presente invenção em comparação com a fita de duas almofadas convencional utilizando um ensaio enzimático para o teste de lactato desidrogenase. A intensidade da identificação visual da cor foi medida através de um leitor aQzen.
[022] A fig. 6 proporciona resultados de teste de comparação visual entre a fita de almofada individual da presente invenção em comparação com a fita de duas almofadas convencional para um teste de álcool.
[023] A fig. 7 proporciona resultados de teste de comparação de intensidade de sinal entre a fita de almofada individual da presente invenção em comparação com a fita de duas almofadas convencional utilizando um ensaio enzimático para um teste de álcool desidrogenase. A intensidade da identificação visual da cor foi medida através de um leitor aQzen.
[024] A fig. 8 proporciona resultados de teste de comparação de intensidade de sinal entre a fita de almofada individual da presente invenção em comparação com a fita de duas almofadas convencional utilizando um ensaio enzimático para um teste de lactato desidrogenase. A intensidade da identificação visual da cor é medida pela classificação proporcionada na figura.
[025] A presente invenção proporciona uma fita para um ensaio de fluxo lateral cromatográfico conduzido por enzima para uma substância a analisar pré- selecionada, a qual é constituída por: uma almofada individual e um substrato depositado como forma anidra.
[026] De acordo com uma variante, a almofada individual da presente invenção constitui um percurso digestivo pré-tratado com um tampão de lise, tal como cloreto de magnésio.
[027] De acordo com outra variante, a substância a analisar é selecionada entre proteínas, hidratos de carbono, lipídios, ácidos nucleicos em fluidos de seres humanos e de animais.
[028] De acordo com outra variante, o substrato depositado como forma anidra é uma mistura de ensaio que contém um substrato reativo para a substância a analisar, tal como glicose-6-fosfato para glicose fosfato desidrogenase (G6PD), o qual pode ainda compreender fosfato de nicotinamida-adenina-dinucleótido (NADP), agente de transferência de hidreto e uma sua mistura.
[029] De acordo com uma determinada variante, a substância a analisar é selecionada entre glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD), lactato desidrogenase ou álcool.
[030] De acordo com uma variante preferida, a substância a analisar é glicose- 6-fosfato desidrogenase (G6PD).
[031] De acordo com outra variante, o substrato contém um indicador, tal como um composto corante. É possível utilizar, sem limitações, muitos compostos, os quais podem ser alterados eletronicamente ou estruturalmente pelo contato do substrato com a substância a analisar e que expressam a alteração sob uma forma qualquer detectável visualmente ou por meio da utilização de um método ou instrumento de medida. Como exemplos de tais compostos refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, corantes. Os compostos que expressão diversas cores alteram frequentemente a cor por qualquer alteração química ou do estado dos elétrons na estrutura. Os corantes de formazano são compostos cromogênicos produzidos a partir de uma redução de sais de tetrazólio por desidrogenases e reductases. Os corantes de formazano possuem uma variedade de cores que vão desde o azul escuro até vermelho profundo até cor-de-laranja, dependendo do sal de tetrazólio original utilizado como substrato para a reação. Uma listagem de sais de tetrazólico compreende, mas sem que isso constitua qualquer limitação, TTC (tetrazólio, cloreto de tetrazólio ou cloreto de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazólio), INT (cloreto de 2-(4-iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5- fenil-2H-tetrazólio), MMT (brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H- tetrazólio), XTT (2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazólio-5- carboxanilida), NBT (Nitroblue tetrazólio), MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3- carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio) ou DCPIP (2,6- diclorofenolindofenol). Alguns dos sais de tetrazólio são mais solúveis em água do que outros. Por redução quer com enzimas quer por condições químicas, tais como por reação com hidreto de nicotinamida-adenina-dinucleótido (NADH) ou com fosfato de nicotinamida-adenina-dinucleótido (NADPH) ou com qualquer agente de transferência de hidreto, o sal de tetrazólio pode mudar de cor, podendo mesmo formar um precipitado insolúvel. O resultado pode ser detectado por métodos, tais como, mas sem que isso constitua qualquer limitação, inspeção visual, colorímetro, detector de UV, espectrofotômetro, leitor de análise de imagem, etc.
[032] De acordo com uma variante, a presente invenção proporciona um ensaio cromatográfico de fluxo lateral enzimático para uma substância a analisar pré- selecionada, o qual consiste em: (a) proporcionar um dispositivo de teste que compreende uma fita constituída por: (i) uma almofada individual e (ii) um substrato depositado como forma anidra; (b) aplicar uma amostra à almofada individual na qual o substrato é depositado; (c) permitir que a amostra flua através do percurso digestivo para chegar ao substrato; (d) permitir que a amostra reaja com o substrato para produzir uma resposta e (e) identificar e interpretar a resposta para indicar a presença ou a concentração da substância a analisar na amostra.
[033] De acordo com uma variante preferida, a substância a analisar é uma enzima, tal como G6PD.
[034] De acordo com outra variante preferida, a presente invenção proporciona um ensaio cromatográfico de fluxo lateral enzimático para detectar a presença de G6PD, o qual consiste em: (a) proporcionar um dispositivo de teste que compreende uma fita constituída por: (i) uma almofada individual de percurso digestivo pré-tratada com um tampão de lise; (ii) uma mistura de ensaio que compreende glicose-6-fosfato, fosfato de nicotinamida-adenina-dinucleótido (NADP) ou nicotinamida-adenina- dinucleótido (NAD), agente de transferência de hidreto e uma sua mistura e (iii) um sal de tetrazólio, (b) aplicar uma amostra à almofada individual de percurso digestivo; (c) permitir que a amostra flua através do percurso digestivo para contactar a mistura de ensaio; (d) permitir que a amostra reaja com a mistura de ensaio para produzir uma resposta e (e) identificar e interpretar a resposta para indicar a presença ou a concentração da substância a analisar na amostra.
[035] A presente invenção proporciona um ensaio de fluxo lateral no qual a zona de aplicação da amostra (amostra) e a zona resultante de reagente, na qual é depositada a mistura de reação (reagente), se encontram no mesmo plano, numa almofada individual.
[036] Além disso, a presente invenção é baseada num ensaio de formato anidro, no qual a amostra aplicada na zona de aplicação de amostra viaja para a zona de reação por força capilar, ao passo que a zona de aplicação e a zona de reação se encontram num mesmo plano. O reagente contém uma combinação de componentes para promover uma reação com cor, a qual é depositada como forma anidra. De acordo com a presente invenção, a amostra viaja para a zona de reação e mistura-se com o reagente.
[037] À medida que a amostra é mistura com o reagente, a composição resultante irá precipitar, movendo-se lentamente e permanecendo na zona resultante de reagente, ao passo que os outros componentes na substância a analisar, tais como hemoglobina, continuarão a deslocar-se, separando-se do material resultante desejado por meio de força capilar. Após reação com a amostra que contém a substância a analisar, a zona resultante de reação irá apresentar o resultado com um indicador, tal como cor, o qual poderá ser detectado visualmente. Em simultâneo, também é possível uma leitura inversa: após reação com uma amostra que contém a substância a analisar, a zona resultante de reação com um indicador, tal como cor, desapareceria. (Amostra que não contém substância a analisar: a cor mantém-se na zona de resultados). A retenção do movimento capilar resultante e contínuo dos outros componentes da amostra irá remover qualquer interferência pelas outras substâncias a analisar, tal como hemoglobina, e melhorar a identificação do resultado. A amostra viaja por força capilar num líquido contido na amostra, tal como sangue, ou numa solução tampão que poderá ser aplicada suplementarmente com a amostra.
[038] A presente invenção proporciona um dispositivo de fita de almofada individual, em que a zona de aplicação da amostra e a zona resultante de reagente se encontram todas na almofada individual. O ensaio realizado numa almofada individual irá proporcionar uma migração uniforme das substâncias a analisar e produzir resultados consistentes por eliminação de migração não uniforme da amostra através de múltiplas camadas. Por exemplo, quando uma amostra de sangue é aplicada à fita de almofada individual que é pré-tratada com tampão de lise, a hemoglobina pode ser facilmente separada do material resultante.
[039] Além disso, é possível aumentar a sensibilidade no dispositivo de fita de almofada individual aumentando a quantidade atual de substância a analisar que reage com o reagente em vez da quantidade de substância a analisar, visto que a amostra irá viajar através da mesma superfície em vez de passar através de diferentes meios ou camadas. Além disso, utilizando o dispositivo de fita de almofada individual, o custo de produção irá ser inferior e o processo irá ser mais simples do que no caso de um ensaio convencional de múltiplas camadas.
[040] Por exemplo, o teste BinaxNOW®G6PD possui uma fita que é constituída por duas almofadas diferentes que são uma almofada de amostra e uma almofada de reação. As amostras com atividade normal de G6PD produzem uma alteração de cor distinta. A cor vermelha da amostra é alterada para uma cor castanha/preta na metade superior da almofada de reação. A cor do produto de reação numa amostra de sangue na elimina a cor da hemoglobina; assim sendo, a cor castanha/preta não apresenta uma diferença evidente da cor vermelha do sangue. Ao contrário da do sistema bi-fase ou multi-fase e descontínuo utilizado em outros dispositivos, incluindo o BinaxNOW®G6PD, a presente invenção utiliza uma cromatografia de fase única e contínua. A fita de teste é constituída por uma almofada individual e a cromatografia contínua proporciona uma separação mais fácil do produto resultante com um corante, tal como um corante de formazano, a partir da hemoglobina na fita do que na cromatografia de duas fases.
[041] A presente invenção é constituída por três áreas, a zona de aplicação da amostra (amostra), a zona de reagente e a zona resultante. A zona de reação é a área em que a combinação de componentes para promover a reação com cor é depositada como forma anidra, a zona resultante é uma área de leitura visual e a zona de amostra é uma área sobre a qual a amostra é aplicada. Visto que estas zonas são constituídas pela mesma matriz, a almofada individual, obtém- se um formato contínuo que permite a migração uniforme da substância e que produz resultados consistentes por meio da eliminação da possibilidade de uma migração não uniforme da amostra através de multi-camada. Além disso, a sensibilidade pode ser aumentada por meio do aumento da quantidade atual de substância a analisar que passa através das multi-camada. Além do mais, o formato da presente invenção faz diminuir o custo do produto e torna o processo do produto mais fácil do que o ensaio convencional de camadas múltiplas.
[042] A substância a analisar reage com o reagente utilizando várias reação, tais como, reação imunológica entre reação anticorpo-antígeno, reação enzima- substrato, conjugação proteína-substrato ou formação de complexo substrato- substrato.
[043] Embora os ensaios imunológicos utilizem frequentemente um ensaio cromatográfico de fluxo lateral, o ensaio cromatográfico de fluxo lateral não é habitualmente utilizado para ensaios enzimáticos. Um ensaio enzimático de fluxo lateral identifica uma determinada enzima quanto à sua presença ou ausência e a concentração utilizando uma reação com um substrato e detecta a reação utilizando um indicador, tal como um corante, que pode expressar uma determinada cor após reação com um determinado químico, tal como um hidreto, produzido pela reação entre a enzima e o substrato.
[044] Uma variante específica da presente invenção proporciona um ensaio com base em enzimas, tal como a deteção direta da presença de uma enzima na amostra, tal como de G6PD numa amostra de sangue, utilizando a atividade do metabolito proveniente da reação entre a enzima e o seu substrato, o qual pode reduzir o corante para expressar determinados indicadores, tais como cores. A molécula de corante, tal como um composto de tetrazólio, pode ser reduzida para formar um formazano insolúvel. O formazano insolúvel irá apresentar uma cor púrpura que pode ser facilmente identificada visualmente sem recorrer a qualquer equipamento específico.
[045] A enzima humana glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) desempenha uma função crítica na bioquímica humana. Faz parte da via oxidativa de pentose, em que atua para minimizar os ataques oxidativos dos radicais livres em células proporcionando equivalentes de redução. Por exemplo, a G6PD converte glicose-6-fosfato em 6-fosfonoglutonato, libertando assim um protão que reduz fosfato de nicotinamida-adenina-dinucleótido (NADP) a NADPH, uma forma reduzida de NADP. 0 NADPH dá início a um conjunto de reações a jusante que, no fim, reduzem o radical livre de agentes de oxidação e tornam muitos deles ineficazes na bioquímica humana normal.
[046] A G6PD esta presenta na maior parte das células humanas, mas está presente numa concentração mais elevada em células vermelhas sanguíneas, que, como uma das suas funções principais, atuam como transportadores de oxigênio, sendo, por tal motivo, particularmente susceptíveis a ataques oxidativos. Esta enzima ajuda a proteger as células vermelhas sanguíneas de danos oxidativos e de destruição prematura. A eficácia do G6PD é bastante elevada, tal como refletido pelo fato de, durante atividade normal, menos de 1% da sua capacidade é utilizada no combate e prevenção de reações oxidativas indesejadas. No entanto, quando agentes de oxidação fortes, tais como membros da classe de quinina de fármacos anti-malária têm de ser introduzidos no corpo humano, a necessidade de uma produção rápida de agente redutor é fortemente aumentada.
[047] São conhecidas diversas mutações do gene que codifica a G6PD, o que diminui a eficácia das enzimas na bioquímicas de indivíduos que processem uma tal mutação em ambas as metades do seu genoma, causando que a quantidade da sua G6PD permaneça no mesmo nível que em pessoas com o gene normal, mas causando também que a sua G6PD apresente uma atividade específica bastante reduzida. Nestes indivíduos, a administração de agentes de oxidação fortes, tais como os membros da classe de fármacos anti-malária do tipo quinina, pode provocar complicações clínicas graves, tais como anemia hemolítica, visto que a atividade específica reduzida da sua G6DP não permite a produção de agentes redutores suficientes para prevenir efeitos oxidativos rápidos indesejados nas suas células vermelhas sanguíneas. Em áreas em que as infecções com malária são comuns e por vezes mesmo epidêmicas, existe assim a necessidade de um teste eficaz rápido que distinga facilmente pessoas que possuem uma G6PD de atividade específica reduzida de pessoas cuja atividade de G6PD seja normal, permitindo assim que o pessoal médico garanta que (1) os fármacos anti-malária de quinina são apenas prescritos a indivíduos com atividade específica de G6PD normal ou melhor e (2) pessoas com uma atividade de G6PD inferior à normal sejam medicados com um tipo alternativo de fármacos anti-malária.
[048] Além disso, são conhecidos diversos tipos de fármacos que aumentam a anemia hemolítica, em que a lista compreende, mas sem que isso constitua qualquer limitação, fármacos anti-malária (primaquina, pamaquina, etc.), sulfonamidas (sulfanilamida, sulfacetamida, sulfapiridina, sulfametoxazole, etc.), sulfonas (dapsona, etc.), nitrofuranos (nitrofurantoína, etc.) e outros (ácido nalidíxico, naftaleno, ciprofloxacina, azul de metileno, azul de toluidina, etc.).
[049] Para se testar a deficiência em G6PD, as células vermelhas sanguíneas que contêm glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) são lisadas na fita de teste quando contactam com a zona de aplicação de amostra pré-tratada com reagente de lise sanguíneo. A G6PD na célula vermelha sanguínea lisada reage com o seu substrato na fita seca pré-tratada e a reação enzimática tem lugar para ar início ao processo de formação de cor na presença de um corante de tetrazólio e de um agente de transferência de hidreto. A G6PD catalisada pode oxidar glicose-6-fosfato para libertar NADPH e o NADPH liberto reduz o corante de tetrazólio para alterar a cor do corante de tetrazólio para formazano, tal como púrpura ou azul, etc., que pode ser detectada visualmente na mesma almofada.
[050] De acordo com uma variante específica, a fita de teste é construída numa camada única, em que a área de aplicação da amostra e a área de reação de formação de cor se encontram na mesma almofada. A parte superior da fita de teste é constituída por uma almofada absorvente com material absorvente, se necessário. A fita de teste é pré-tratada com reagente de lise, incluindo tensoativos iônicos ou não iônicos. É proporcionado um procedimento simples para a realização do teste, uma vez que não existem requisitos para o passo de lise do sangue antes da aplicação da amostra. A fita de teste pré-tratada é impregnada com reagentes, os quais compreendem: glicose-6-fosfato que é um substrato específico para G6PD, coenzima NADP ou NAD, corante de tetrazólio e agentes de transferência de hidreto, e um estabilizador, tal como um resíduo de açúcar ou um polímero solúvel em água.
[051] De acordo com uma variante, a presente invenção proporciona um teste rápido de diagnóstico (RDT) num ensaio em formato anidro numa fita de almofada individual para teste “point of care” no local. A cromatografia lateral em formato seco proporciona um dispositivo de teste estável, um processo simples e um resultado de teste rápido. A deficiência em G6PD é uma deficiência em enzimas humanas mais comuns afetando 400 milhões de pessoas e apresentando uma elevada prevalência em áreas endémicas de malária. Este deficiência parece proporcionar alguma proteção contra a infecção com malária. No entanto, também pode provocar hemólise após administração de determinados fármacos contra a malária, incluindo PRIMAQUINA. Assim sendo, existe uma necessidade urgente de um teste rápido de diagnóstico (RDT) adequado para a área de rastreio.
[052] De acordo com outra variante, a presente invenção proporciona um método de teste em que os resultados do teste RDT de G6PD utilizando amostras clínicas pode ser correlacionado com os resultados quantitativos do teste. O teste pode detectar cerca de < 4 IU/gHb (normal 12 ± 2,09 U/gHb a 37 °C), como deficiente. O valor limite pode ser alterado em função da tolerância de células vermelhas sanguíneas contra PRIMAQUINA em pacientes com deficiência em G6PD. Os estudos de estabilidade acelerada indicaram que as fitas de teste eram estáveis durante três meses a 45°C e durante 10 dias a 60°C. Este RDT para G6PD pode ser combinado com um RDT para malária que é capaz de detectar menos de 30 parasitas por pL de sangue. Este estojo de teste duplo pode diagnosticar uma infecção com malária e uma deficiência em G6PD em simultâneo utilizando uma pequena quantidade de sangue (normalmente inferior a 10 pL). O teste de ensaio é rápido (< 10 minutos) com uma pequena quantidade de amostra (< 10 pL de sangue), simples de utilizar, econômico e não possui qualquer requisito especial de armazenamento, o que constitui um elemento crítico para utilização no local.
[053] Muitos dos testes “point of care” no local utilizados habitualmente utilizam um ensaio de fluxo lateral baseados em imuno-cromatografia com base em membrana, que beneficia da ação capilar das membranas microporosas. Em ensaios cromatográficos de fluxo lateral, as substâncias a analisar na solução de espécime na fase móvel são separadas dos outros componentes por afinidade de ligação para se capturar moléculas em fases sólidas estacionárias. As membranas, feitas de nitrocelulose ou de nylon, proporcionam uma matriz para a fase sólida estacionária da cromatografia de afinidade e para a fase líquida de cromatografia de partição que conduz as partículas de imunocomplexo que se pretende separar a partir dos outros solutos líquidos por ação capilar.
[054] As membranas microporosas, deitas de nylon ou de nitrocelulose, têm vindo a ser utilizadas para testes de antígeno/anticorpo desde cerca de 1979, quando foi demonstrado pela primeira vez que as proteínas podiam ser transferidas através de uma membrana. A nitrocelulose tem vindo a ser utilizada em técnicas de pesquisa, tais como transferência Western e imunodiagnósticos de fluxo lateral. A microporosidade e nitrocelulose oferecem muitos benefícios para ensaios de imuno-cromatografia rápidos, incluindo, por exemplo, elevada capacidade de ligação, ligação não covalente das proteínas e um ambiente de imobilização a longo prazo estável.
[055] De um modo geral, na cromatografia lateral, incluindo ensaios conduzidos por enzima, tais como um teste para deficiência em G6PD, o substrato anidro é pré-depositado junto, ou logo atrás, da junção da área receptora da amostra na fita cromatográfica, isto é, fita de almofada individual, tal como na presente invenção. No entanto, poderá ser colocada em outro local no caminho do fluxo de amostra para acomodar requisitos particulares da amostra ou de um ou mais ingredientes no substrato, desde que seja colocado no caminho do fluxo bastante antes do fim da “almofada de absorção”, onde o fluxo de amostra é interrompido e qualquer excesso de fluido presente escorre para a almofada de absorção ou outro dispositivo escoadouro que possa ser fornecido.
[056] É importante que o substrato seco seja depositado num intervalo, de preferência dentro de uma área confinada, para facilitar que este seja completamente agarrado pelo fluxo da amostra. A colocação do substrato seco no caminho do fluxo também deverá ter em conta que a reconstituição do substrato numa forma dissolvida ou dispersa na amostra líquida deverá ser completa no momento em que a amostra atinge o ponto em que o fluxo de amostra cessa.
[057] Por razões de conveniência de transporte, armazenamento e utilização, cada fita cromatográfica da presente invenção pode ser preferencialmente condicionada num dispositivo adequado construído de modo que a fita se encontra posicionada lateralmente. São bem conhecidos na especialidade muitos destes dispositivos e qualquer um deles que seja construído de modo que a performance de um ensaio na fita cromatográfica colocada neste seja executado por fluxo lateral pode ser utilizado de um modo adequado.
[058] De acordo com uma variante específica, a fita de almofada individual da presente invenção proporciona as seguintes características, mas sem que isso constitua qualquer limitação: 1. A fita de almofada individual compreende uma matriz porosa selecionada entre membrana de nitrocelulose, fibra de vidro, celulose ou poliéster, etc. 2. A fita compreende uma fita de almofada individual em que a área de aplicação de amostra e a área de deposição da mistura de reagente seco da referida fita se encontram na mesma almofada, independentemente de as duas áreas se sobreporem ou não. 3. A fita na presente invenção possui um pista individual de fluxo líquido para a mistura de reação que ocorre após receber o fluido da amostra. 4. A fita de almofada individual da presente invenção pode ser, facultativamente, pré-revestida com um reagente de lise que contém um tensoativo iônico (aniônico, catiônico e zwitteriônico) ou não iônico e cloreto de magnésio, permitindo a lise do fluido biológico por contato da área de aplicação da amostra diretamente sem pré-lise com tampão. 5. A fita de almofada individual da presente invenção contém um resíduo açúcar selecionado entre monossacárido, dissacárido, polissacárido ou polímero solúvel em água enquanto estabilizador para aumentar a estabilidade térmica. 6. A fita de almofada individual da presente invenção é formulada e montada diferencialmente num dispositivo com formato de teste duplo para descriminar entre deficiência em G6PD moderada (por exemplo: 10%-60% de detecção de atividade normal) e deficiência em G6PD grave (por exemplo: inferior a 10% de detecção de atividade normal) à vista desarmada. A percentagem (%) de atividade para detecção não está limitada a 10%-60 % ou inferior a 10%. 7. Os componentes na zona de reação compreendem substratos de enzima, reagentes para o desenvolvimento de cor e estabilizador. O sistema de almofada individual pode ser utilizado para um ensaio quantitativo ou semi- quantitativo visto que a alteração de cor na fita pode ser lida por instrumentos, tais como um espectrofotômetro óptico, digitalizador, leitor ou densitômetro. 8. O sistema de almofada individual também é aplicável a um sistema eletroquímico. A transferência de elétrons a partir de NADPH ou de NADH produzida pela G6PD para um eletrodo através de oxireductase ou de um mediador de transferência de elétrons pode ser quantificada utilizando um eletrodo no formato seco. 9. O sistema de almofada individual pode ser utilizado para um imuno- ensaio que imobilize as moléculas capturadas em fase sólida.
[059] Os parâmetros chave que controlam a intensidade de sinal nos ensaios cromatográficos laterais são o caudal capilar e a capacidade de ligação à proteína da membrana. O caudal capilar e a capacidade de ligação são determinados pelo tamanho do poro, pela porosidade e pela espessura da membrana. A capacidade de ligação à proteína da membrana depende do seu tamanho de poro e das propriedades da superfície.
[060] A presente invenção proporciona uma cromatografia em que a hemoglobina é separada da substância a analisar utilizando cromatografia diferencial em fase sólida. A cor da hemoglobina interfere frequentemente na leitura visual da cor da reação da substância a analisar nas células vermelhas sanguíneas. A presente invenção proporciona um método de cromatografia lateral em que a migração diferente das amostras devido à diferença de tamanho, viscosidade, precipitação da substância a analisar com reagente, diferença de carga através da matriz porosa impregnada com reagentes que irão interagir com a substância a analisar. As células sanguíneas são aplicadas na zona de amostra, a qual está pré-tratada com agente de lise para lise de glóbulos vermelhos na zona de reação e o tampão é aplicado consoante necessário. As células de sangue lisadas movem-se para a zona de reação-resultados e misturam-se com o reagente, sendo que a composição resultante irá permanecer na zona de reação-resultados, ao passo que a hemoglobina continua a viagem, sendo separada do resultante desejado por tal força capilar. A separação da hemoglobina irá tornar a detecção de resultados através de um indicador, tal como cor, mais evidente e mais fácil de identificar.
[061] Um ensaio específico de G6PD que possa ser facilmente utilizado com sucesso por qualquer um que atue num local, em casa, num consultório ou em qualquer local em que não exista pessoal de laboratório treinado e instrumentos é a seguir descrito especificamente e os resultados são apresentados nas figuras 1 a 3 anexas. Exemplo 1. Preparação e realização de testes de amostras para fitas de testes de deficiência em G6PD
[062] Pré-tratou-se a almofada com tampão de lise e secou-se à temperatura ambiente. As estruturas das fitas de almofada individual e de almofada dupla são apresentadas na fig. 1. Fixou-se a almofada pré-tratada no suporte de plástico e sobrepôs-se um papel absorvente na almofada na porção superior no suporte de plástico, como uma almofada absorvente. Preparou-se a mistura de ensaio contendo glicose-6-fosfato, NADP, tetrazólio e um agente de transferência de hidreto ou de elétrons e impregnou-se sobre a almofada porosa. Deixou-se secar a almofada impregnada com mistura de ensaio à temperatura ambiente de um dia para o outro. • Preparação da almofada individual: a almofada impregnada com a mistura de ensaio no suporte plástico. • Preparação das duas almofadas: a almofada para aplicação da amostra é ligada à parte inferior da mistura de ensaio - almofada impregnada por sobreposição de 1-2 mm no suporte plástico.
[063] Aplicou-se amostra normal ou deficiente na fita. O resultado mostra que as amostras normais produzem certamente um cor púrpura mais forte e mais evidente no sistema de almofada individual da presente invenção do que nas duas almofadas, conforme apresentado na fig. 2. A amostra deficiente não produziu qualquer cor em ambas as almofadas, na almofada individual e nas duas almofadas, visto que não existia G6PD disponível para produzir NADPH. O resultado mostra ainda que a migração de fluido é mais uniforme e mais rápida na almofada individual do que nas duas almofadas e que a finalização da limpeza do sangue é mais rápida no sistema de fita de almofada individual da presente invenção do que nas duas almofadas. Exemplo 2. Preparação e realização de testes de amostras para fitas de teste de lactato desidrogenase
[064] Pré-tratou-se a almofada com tampão de lise que contém cloreto de magnésio e secou-se de um dia para o outro à temperatura ambiente. Fixou-se a almofada pré-tratada num suporte plástico e sobrepôs-se papel absorvente na parte superior da almofada no suporte plástico como almofada absorvente. Preparou-se a mistura de ensaio contendo lactato, NAD, tetrazólio e tampão Tris- HCI pH 8,0, agente de transferência de hidreto e impregnou-se sobre a almofada porosa. Deixou-se secar a almofada impregnada com a mistura de ensaio à temperatura ambiente de um dia para o outro. • Preparação da almofada individual: a almofada impregnada com a mistura de ensaio no suporte plástico. • Preparação das duas almofadas: as almofadas de amostra são ligadas à parte inferior da mistura de ensaio - almofada impregnada por sobreposição de 1-2 mm no suporte plástico.
[065] Aplicou-se dois microlitros de amostra de sangue a esta fita. O resultado mostra que a enzima LDH no sangue produziu certamente uma cor púrpura mais forte e mais evidente no sistema de fita de almofada individual do que nas duas almofadas, conforme apresentado na fig. 4. O resultado mostra ainda que a migração de fluido é mais uniforme e mais rápida na almofada individual do que nas duas almofadas e que a finalização da limpeza do sangue é mais rápida no sistema de fita de almofada individual da presente invenção do que nas duas almofadas. A intensidade da cor púrpura foi medida através de um leitor aQzen conforme apresentado no quadro 1. A intensidade da almofada individual é superior à do sistema de duas almofadas, conforme apresentado na fig. 5.
Exemplo 3. Preparação e realização de testes de amostras para fitas de teste de álcool Preparação das duas almofadas: as almofadas de amostra são ligadas à parte inferior da mistura de ensaio - almofada impregnada por sobreposição de 1-2 mm no suporte plástico.
[066] Pré-tratou-se a almofada com tampão contendo detergente e secou-se de um dia para o outro à temperatura ambiente. Fixou-se a almofada pré-tratada num suporte plástico e sobrepôs-se papel absorvente na parte superior da almofada no suporte plástico como uma almofada absorvente. Preparou-se a mistura de ensaio contendo álcool, NAD, tetrazólio e tampão Tris-HCl pH 8,0, agente de transferência de hidreto e impregnou-se sobre a almofada porosa. Deixou-se secar a almofada impregnada com mistura de ensaio à temperatura ambiente de um dia para o outro. •Preparação da almofada individual: a almofada impregnada com a mistura de ensaio no suporte plástico. •Preparação das duas almofadas: as almofadas de amostra são ligadas à parte inferior da mistura de ensaio – almofada impregnada por sobreposição de 1-2 mm no suporte plástico.
[067] Aplicou-se dois microlitres de amostra de sangue contendo álcool a esta fita. O resultado mostra que a presença de álcool no sangue produziu certamente uma cor púrpura mais forte e mais evidente no sistema de fita de almofada individual do que nas duas almofadas, conforme apresentado na fig. 6. A intensidade da cor púrpura foi medida através de um leitor aQzen conforme apresentado no quadro 2. A intensidade da almofada individual é superior à do sistema de duas almofadas, conforme apresentado na fig. 7.
Exemplo 4. Preparação e realização de testes de amostras para fitas de teste de lactato desidrogenase - dependentes da atividade de lactato desidrogenase
[068] Pré-tratou-se a almofada com tampão contendo detergente e secou-se de um dia para o outro à temperatura ambiente. Fixou-se a almofada pré-tratada num suporte plástico e sobrepôs-se papel absorvente na parte superior da almofada no suporte plástico como uma almofada absorvente. Preparou-se a mistura de ensaio contendo álcool, NAD, tetrazólio e tampão Tris-HCI pH 8,0, agente de transferência de hidreto e impregnou-se sobre a almofada porosa. Deixou-se secar a almofada impregnada com mistura de ensaio à temperatura ambiente de um dia para o outro. • Preparação da almofada individual: a almofada impregnada com a mistura de ensaio no suporte plástico. • Preparação das duas almofadas: as almofadas de amostra são ligadas à parte inferior da mistura de ensaio - almofada impregnada por sobreposição de 1-2 mm no suporte plástico.
[069] Aplicou-se dois microlitros de amostra contendo lactato desidrogenase (entre 0,5 unidade e 6 unidades) a esta fita. O resultado mostra que a atividade da enzima LDH produziu uma cor púrpura mais forte e mais evidente no sistema de fita de almofada individual do que nas duas almofadas, conforme apresentado na fig. 8.
Claims (16)
1. Fita para um ensaio cromatográfico de fluxo lateral conduzido por enzima para um analito pré-selecionado caracterizada por ser constituída por: uma almofada individual; e um substrato depositado como forma anidra. em que a almofada individual é pré-tratada com um tampão de lise; em que a almofada individual compreende uma zona de aplicação de amostra e uma zona reagente resultante, e a zona de aplicação de amostra e a zona reagente resultante são formadas em um mesmo local da almofada individual; em que o substrato é capaz de formar um precipitado quando reagido com o analito pré-selecionado; e em que o analito pré-selecionado é uma enzima; e em que a referida fita é capaz de separar o dito analito pré-selecionado ou reação resultante da hemoglobina presente em uma amostra de sangue em análise por migração diferencial do dito analito pré-selecionado ou componentes de hemoglobina; os glóbulos vermelhos na dita amostra de sangue são lisados mediante contato com o referido tampão de lise; o referido resultante de reação é um produto de reação gerado a partir da interação entre o referido analito pré-selecionado e o referido substrato anidro; e os referidos componentes da hemoglobina migram de forma mais rápida em comparação ao referido analito pré-selecionado ou o referido resultante de reação.
2. Fita, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o analito ser selecionado entre o conjunto constituído por glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) e lactato desidrogenase.
3. Fita, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o analito ser G6PD.
4. Fita, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o substrato ser uma mistura de ensaio que compreende glicose-6-fosfato, um um agente de transferência de elétron ou hidreto e pelo menos um entre um fosfato de nicotinamida-adenina-dinucleotídeo (NADP) ou nicotinamida- adenina-dinucleotídeo (NAD).
5. Fita, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o substrato compreender um indicador.
6. Fita, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de o indicador ser um composto corante.
7. Fita, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de o composto corante ser selecionado entre o conjunto constituído por TTC (cloreto de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazólio), INT (cloreto de 2-(4-iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5- fenil-2H-tetrazólio), MMT (brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H- tetrazól io), XTT (2,3-bis-(2-m etoxi-4-n itro-5-su Ifofen i I )-2 H-tetrazól io-5- carboxanilida), NBT (Nitroblue tetrazólio), MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3- carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio) e DCPIP (2,6- diclorofenolindofenol).
8. Fita, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de o composto corante ser um sal de tetrazólio.
9. Ensaio cromatográfico de fluxo lateral conduzido por enzima para um analito pré-selecionado, caracterizado por compreender; (a) proporcionar um dispositivo de teste que compreende uma fita, conforme definida na reivindicação 1; (b) aplicar uma amostra na almofada individual na qual o substrato está depositado; (c) permitir que a amostra flua através da almofada individual para chegar o substrato; (d) permitir que a amostra reaja com o substrato para formar um precipitado; e (e) identificar e interpretar a resposta para indicar a presença ou a concentração do analito na amostra.
10. Ensaio, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o analito é selecionado entre o conjunto constituído por glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) e lactato desidrogenase.
11. Ensaio, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de o substrato ser uma mistura de ensaio que compreende glicose-6-fosfato, um hidreto ou agente de transferência de elétron e pelo menos um de nicotinamida-adenina-dinucleotídeo (NADP) ou nicotinamida-adenina- dinucleotídeo (NAD).
12. Ensaio, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de o substrato compreender um indicador.
13. Ensaio, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de o indicador ser um composto corante.
14. Ensaio de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de o composto corante ser selecionado entre o conjunto constituído por TTC (cloreto de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazólio), INT (cloreto de 2-(4-iodofenil)-3-(4- nitrofenil)-5-fenil-2H-tetrazólio), MMT (brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5- difenil-2H-tetrazólio), XTT (2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazólio-5- carboxanilida), NBT (Nitroblue tetrazólio), MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3- carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio) e DCPIP (2,6- diclorofenolindofenol).
15. Ensaio, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de o composto corante ser um sal de tetrazólio.
16. Ensaio cromatográfico de fluxo lateral conduzido por enzima para detectar a presença de G6PD, caracterizado pelo fato de compreender; (a) proporcionar um dispositivo de teste que compreende uma fita de almofada individual, conforme definida na reivindicação 1: (i) uma almofada individual pré-tratada com tampão de lise; (ii) uma mistura de ensaio que compreende glicose-6-fosfato, um agente de transferência de hidreto e pelo menos um de fosfato de nicotinamida-adenina-dinucleótido (NADP) ou nicotinamida-adenina- dinucleótido (NAD), e (iii) um sal de tetrazólio, (b) aplicar a amostra sobre a almofada individual; (c) permitir que a amostra flua através da almofada individual para contatar com a mistura de ensaio; (d) permitir que a amostra reaja com a mistura de ensaio para produzir um precipitado; e (e) identificar e interpretar a resposta para indicar a presença ou a concentração do analito na amostra.
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