CN108107211B - 用于改善的侧向流动测定法的单一垫条 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于预先选择的分析物的酶驱动的侧向层析流动测定法的条。本发明的条由下列各项组成:用血液裂解剂预处理的单一垫;和以干形式沉积的底物;其中底物是测定混合物,其包含葡萄糖‑6‑磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、氢化物或电子转移剂及其混合物;其中底物包含指示剂,指示剂是染料化合物;其中条能通过分析物或血红蛋白组分的差别迁移而将存在于被测定的血液样品中的分析物或反应所得物与血红蛋白分离;其中血红蛋白组分比反应所得物迁移得更快;其中反应所得物是通过分析物和底物之间反应生成的反应产物;和其中血液样品中的红细胞通过与血液裂解剂接触而裂解。
Description
本申请是申请日为2012年7月20日发明名称为“用于改善的侧向流动测定法的单一垫条及使用其的测试装置”的申请号为201280043565.7的发明专利申请的分案申请。
对相关申请的交叉引用
本申请要求2011年7月22日提交的美国临时专利申请流水号61/510,762的优先权权益,其内容通过提及并入本文。
技术领域
本申请涉及生物学标本检测领域,具体地涉及一种用于改善的侧向流动测定法的单一垫条。
背景技术
在护理点(POC)实施的测试已经不仅在健康护理设施,包括医院和医生诊所中,而且还在其它临床位置,包括工作场所或远程现场位置中变成常见且非常有用的诊断工具。由于测试的紧迫和目的,简单且有效的测试装置和以成本和时间有效的方式获得结果的方法是很想要的。更具体而言,在非健康护理设施中,诸如在用于快速增长的流行性疾病的远程现场临床位置测试,用于战场的生物战试剂的测试,用于污染物的环境测试,或用于药物滥用的工作场所测试中的测试需要简单且容易实施。有时,由于这些测试经常由具有很少(若有的话)临床诊断学培训的个体实施,这些护理测试点需要是简单的,快速的,且容易使用的。此外,环境中需要对贮存条件诸如温度或湿度没有大量控制的装置。如此,理想地,用于护理测试点点的装置需要最小量的设备,并且装置内体现的测试方法在对于严格环境条件,包括温度或湿度稳定时会是想要的。
随着不断需要用于不断增加的目的和变化环境的护理测试点,本领域中仍然需要提供用于以成本和时间有效的方式实施用于生物学标本的测试的方法和装置。
发明内容
在一个实施方案中,本发明提供了一种用于侧向流动测定法的基于单一垫(single-pad)的条,其中样品应用(样品)区和反应物-所得物区(reactant-resultantzone)(在那里沉积有反应混合物(反应物))均在同一平面的、单一的、单垫上(a single,one-pad)。
在另一个实施方案中,本发明提供了一种用于预先选择的分析物的酶驱动的侧向层析流动测定法(enzyme-driven,lateral chromatographic flow assay)的条,其由下列各项组成:单一垫;和以干形式(dry form)沉积的底物。
在又一个实施方案中,本发明提供了一种用于预先选择的分析物的酶驱动的侧向层析流动测定法(assay),其包括:
(a)提供包含条的测试装置,所述条由下列各项组成:
(i)单一垫;和
(ii)以干形式沉积的底物;
(b)对其中沉积有所述底物的所述单一垫应用样品;
(c)容许所述样品流过消化垫以到达所述底物;
(d)容许所述样品与所述底物起反应以产生应答;并
(e)鉴定并解读所述应答以指示所述样品中所述分析物的存在或浓度。
在别的实施方案中,本发明提供了一种用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)存在的酶驱动的侧向层析流动测定法,其包括:
(a)提供包含单一垫条的测试装置,所述单一垫条包含:
(i)用裂解缓冲液处理的消化单一垫;
(ii)测定混合物,其包含葡萄糖-6-磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、氢化物或电子转移剂及其混合物;和
(iii)四唑盐,
(b)在所述消化单一垫上应用样品;
(c)容许所述样品流过所述消化垫以接触所述测定混合物;
(d)容许所述样品与所述测定混合物起反应以产生应答,并
(e)鉴定并解读(interprete)所述应答以指示所述样品中所述分析物的存在或浓度。
在另一个实施方案中,本发明基于干形式测定法,其中样品应用区中应用的样品通过毛管力(capillary force)行进至反应区,而应用区和反应区在同一平面上。反应物含有组分的组合,包括引发颜色反应并且以干形式沉积的组合物和酶。在本发明中,样品行进至反应物区,并且与反应物混合。由于样品与反应物混合,所得的组合物会缓慢迁移并且在反应物-所得物区上保留,而样品中的其它组分,诸如血红蛋白比所得的组合物更快移动,并且通过诸如毛管力继续行进以与期望的所得物分开。在与含有分析物的样品起反应后,反应物结果区会呈现指示剂,诸如颜色的结果。所得物的保留和样品的其它组分的继续毛细管移动会消除其它组分,诸如血红蛋白的任何干扰,并且改善结果的鉴定。样品在样品(诸如血液)或另外应用有样品的缓冲溶液中含有的液体中通过毛管力行进。
在一个实施方案中,本发明提供了用于护理测试点的单垫条上干形式测定法中的快速诊断测试(RDT)。单垫上的侧向层析提供了稳定的测试,简单的方法及快速的测试结果。
在另一个实施方案中,本发明提供了层析方法,其中在固相上使用差别层析将血红蛋白与分析物分开。血红蛋白的颜色经常干扰红细胞中分析物的颜色反应的视觉读出。本发明提供了侧向层析方法,其中样品的差别迁移由于大小差异、粘度、分析物与反应物的沉淀、通过充满会与分析物起反应的试剂的多孔基质的电荷差异而发生。
本发明的优点包括容易且简单过程的能力,和没有血红蛋白干扰的清楚视觉读出。
贯穿本申请,以下术语具有下文所列的意义。
“生物学材料”、“生物学样品”或“样品”指从脊椎动物提取的流体或组织,诸如全血、血清、血浆、唾液、尿液和脑脊液。
“分析物”指生物学材料、生物学样品、或样品中含有作为测定法的目的以鉴定结果诸如存在、缺乏或浓度之一的比活的某种组分。
除非另有定义,本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可以在本发明的实施或测试中使用,但是下文描述了合适的方法和材料。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过提及完整并入。在冲突的情况中,应以本说明书,包括定义为准。另外,材料、方法和例子仅是例示性的而不意图为限制性的。
本发明的其它特征和优点从以下发明详述及从权利要求书看会是显而易见的。
附图说明
图1提供了与常规两垫条相比本发明的单垫条(one-pad strip)的结构。
图2提供了在G6PD缺乏测试方面本发明的单垫条与常规两垫条之间的视觉比较测试结果。通过图中提供的得分测量视觉颜色鉴定强度。
图3提供了对G6PD测试使用酶测定法得到的本发明的单垫条与常规两垫条之间的信号强度比较测试结果。通过图中提供的得分测量视觉颜色鉴定强度。
图4提供了在乳酸脱氢酶测试方面本发明的单垫条与常规两垫条之间的视觉比较测试结果。
图5提供了对乳酸脱氢酶测试使用酶测定法得到的本发明的单垫条与常规两垫条之间的信号强度比较测试结果。通过aQzen阅读器测量视觉颜色鉴定的强度。
图6提供了在乙醇(alcohol)测试方面本发明的单垫条与常规两垫条之间的视觉比较测试结果。
图7提供了对醇脱氢酶测试使用酶测定法得到的本发明的单垫条与常规两垫条之间的信号强度比较测试结果。通过aQzen阅读器测量视觉颜色鉴定的强度。
图8提供了对乳酸脱氢酶测试使用酶测定法得到的本发明的单垫条与常规两垫条之间的信号强度比较测试结果。通过图中提供的得分测量视觉颜色鉴定强度。
具体实施方式
本发明提供了一种用于预先选择的分析物的酶驱动的侧向层析流动测定法的条,其由下列各项组成:
单一垫;和
以干形式沉积的底物。
在一个实施方案中,本发明的单一垫是用裂解缓冲液,诸如氯化镁预处理的消化垫。
在另一个实施方案中,分析物选自人和动物流体中的蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸。
在另一个实施方案中,以干形式沉积的底物是测定混合物,其含有分析物的反应性底物,诸如对于葡萄糖磷酸脱氢酶(G6PD)为葡萄糖-6-磷酸,该测定混合物可以进一步包含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、氢化物转移剂、及其混合物。
在某个实施方案中,分析物选自葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、乳酸脱氢酶、或醇(alcohol)。
在一个优选的实施方案中,分析物是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)。
在别的实施方案中,底物含有指示剂,诸如染料化合物。可以不做限制采用许多化合物,该化合物可以通过使底物与分析物接触在电子上或结构上改变,并且以视觉或使用测量方法或仪器可检测的任何形式表示变化。此类化合物的例子包括但不限于染料。表达各种颜色的化合物经常由于结构的任何化学或电子状态改变而改变颜色。甲臜(formazan)染料是自脱氢酶和还原酶还原四唑盐生成的生色化合物。甲臜染料具有从深蓝色至深红色至橙色的多种颜色,这取决于用作反应底物的初始四唑盐。一批四唑盐包括但不限于TTC(四唑、氯化四唑或2,3,5-三苯基-2H-氯化四唑(2,3,5-triphenyl-2H-tetrazoliumchloride))、INT(2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-氯化四唑(2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride))、MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-溴化四唑((3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)))、XTT(2,3-二-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰苯胺(2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide))、NBT(硝基蓝四唑(Nitroblue Tetrazolium))、MTS(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium))、或DCPIP(2,6-二氯靛酚(2,6-dichlorophenolindophenol))。在通过酶或化学条件(诸如与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氢化物(NADH)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)或任何氢化物转移剂起反应)还原后,四唑盐可以转变颜色,并且可以甚至形成不溶性沉淀物。可以通过方法检测结果,所述方法包括但不限于视觉检查、色度计、UV检测仪、分光光度计、图像分析阅读器,等等。
在一个实施方案中,本发明提供了一种用于预先选择的分析物的酶驱动的侧向层析流动测定法,其包括:
(a)提供包含条的测试装置,所述条由下列各项组成:
(i)单一垫;和
(ii)以干形式沉积的底物;
(b)对其中沉积有所述底物的所述单一垫应用样品;
(c)容许所述样品流过消化垫以到达所述底物;
(d)容许所述样品与所述底物起反应以产生应答;并
(e)鉴定并解读所述应答以指示所述样品中所述分析物的存在或浓度。
在一个优选的实施方案中,分析物是酶诸如G6PD。
在另一个优选的实施方案中,本发明提供了一种用于检测G6PD存在的酶驱动的侧向层析流动测定法,其包括:
(a)提供包含单一垫条的测试装置,所述单一垫条包含:
(i)用裂解缓冲液处理的消化单一垫;
(ii)测定混合物,其包含葡萄糖-6-磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、氢化物或电子转移剂及其混合物;和
(iii)四唑盐,
(b)在所述消化单一垫上应用样品;
(c)容许所述样品流过所述消化垫以接触所述测定混合物;
(d)容许所述样品与所述测定混合物起反应以产生应答,并
(e)鉴定并解读所述应答以指示所述样品中所述分析物的存在或浓度。
本发明提供了一种侧向流动测定法,其中样品应用(样品)区和反应物-所得物区(在那里沉积有反应混合物(反应物))均在同一平面的、单一的、单垫上。
另外,本发明基于干形式测定法,其中样品应用区中应用的样品通过毛管力行进至反应区,而应用区和反应区在同一平面上。反应物含有组分的组合,包括引发颜色反应并且以干形式沉积的组合物和酶。在本发明中,样品行进至反应物区,并且与反应物混合。
由于样品与反应物混合,所得的组合物会沉淀,缓慢迁移并且在反应物-所得物区上保留,而样品中的其它组分,诸如血红蛋白通过诸如毛管力继续行进以与期望的所得物分开。在与含有分析物的样品起反应后,反应结果区会以可以视觉检测的指示剂,诸如颜色呈现结果。同时,逆向读出也是有可能的:在与含有分析物的样品起反应后,具有指示剂,诸如颜色的反应结果区会消失。不含分析物的样品:颜色保留于结果区)。所得物的保留和样品的其它组分的继续毛细管移动会消除其它组分,诸如血红蛋白的任何干扰,并且改善结果的鉴定。样品在样品(诸如血液)或另外应用有样品的缓冲溶液中含有的液体中通过毛管力行进。
单垫条
本发明提供了单垫条装置,其中样品应用区和反应物结果区都在单垫上。单一垫中实施的测定法会提供分析物的一致迁移,并且通过消除样品的不均匀迁移通过多层来产生一致的结果。例如,在将血液样品应用于用裂解缓冲液预处理的单垫条时,可以将血红蛋白容易地与所得物分开。
另外,可以通过增加与反应物起反应的分析物的实际量,而不是分析物的量在单垫条装置中提高灵敏性,因为样品会行进到相同表面,而不是通过不同介质或层。还有,通过采用单垫条装置,生产成本会较低,并且过程会比常规多层测定法的过程简单。
例如,G6PD测试具有由两个不同垫组成的条,所述两个不同垫是样品垫和反应垫。具有正常G6PD活性的样品产生截然不同的颜色变化。红色样品颜色在反应垫的上半部分上变化成褐色/黑色颜色。血液样品中反应产物的颜色没有消除血红蛋白的颜色;因此,褐色/黑色颜色与血液的红色颜色没有清楚的差异。与包括G6PD的其它装置中使用的二相或多相且不连续系统不一样,本发明采用单相且连续层析。测试条由单一垫组成,并且连续层析比两相层析提供与染料(诸如甲臜染料)的所得物与条上的血红蛋白的更容易的分开。
本发明由三个区,即样品应用(样品)区、反应物和所得物区构成。反应区是以干形式沉积的引发颜色反应的组成组合,所得物区是视觉读出区,并且样品区是应用样品的区域。由于这些区由相同基质构成,单垫、连续形式通过经由多层消除样品不均匀迁移的可能性实现分析物的一致迁移并且产生一致的结果。另外,可以通过增加与反应物起反应的分析物的实际量而不是通过多层的分析物量来提高灵敏性。还有,本发明的形式降低产生成本,并且使产品过程比常规多层测定法的产品过程更容易。
侧向流动层析测定法
分析物使用各种反应,诸如抗体-抗原反应间的免疫学反应、酶-底物反应、蛋白质-底物缀合、或底物-底物复合物形成与反应物起反应。
虽然免疫学测定法经常利用侧向流动层析测定法,但是侧向流动层析测定法用于酶促测定法尚不常见。侧向流动酶测定法对某种酶鉴定其存在或缺乏和浓度,其使用与底物的反应并且使用可以表示与某种化学品,诸如氢化物起反应后通过酶和底物之间的反应产生的某种颜色的指示剂诸如染料检测反应来进行。
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)
本发明的一个特定的实施方案提供了基于酶的测定法,诸如直接检测样品中酶(诸如血液样品中的G6PD)的存在,其利用来自酶与其底物之间的反应的代谢物活性进行,所述活性可以将染料还原以表示某些指示剂诸如颜色。可以将染料分子诸如四唑化合物还原以形成不溶性甲臜。不溶性甲臜会呈现紫色颜色,其可以不用任何特定的设备容易视觉鉴定。
人酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)在人生物化学中实施至关重要的功能。它是氧化戊糖途径的部分,其中它发挥功能以通过提供还原性等同物使自由基对细胞的氧化攻击最小化。例如,G6PD将葡萄糖-6-磷酸转化成6-磷酸葡萄糖酸,由此释放质子,其将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)还原成NADPH,即NADP的还原形式。NADPH启动一系列下游反应,其最终还原自由基氧化剂,并且使其中许多在正常人生物化学中不太有效。
G6PD存在于大多数人细胞中,但是它以较高浓度在红细胞中,所述红细胞在其主要功能之一中作用为氧转运蛋白,并且因此对氧化攻击特别易感。此酶帮助保护红细胞免于氧化损伤和过早破坏。G6PD系统的效率明显较高,如实际上在正常活性期间小于1%其能力用于对抗和阻止不想要的氧化反应反映的。然而,在必须对人体引入强氧化剂,诸如奎宁类抗疟疾药物的成员时,对还原剂的快速生成的需要大大增加。
编码G6PD的基因的几处突变是已知的,其降低酶在其基因组的两个半份中都拥有此类突变的个体的生物化学中的效率,这引起其G6PD的数量与具有正常基因的人中保持于相同水平,而且还引起其G6PD显示大大降低的比活。在这些个体中,施用强氧化剂诸如奎宁型抗疟疾药物类别的成员可以引起几种临床并发症,诸如溶血性贫血,因为其G6DP的低比活没有实现足够还原剂的生成以阻止对其红细胞的快速的不想要的氧化影响。在疟疾感染常见且有时甚至流行的区域,因此需要快速的有效测试,其会容易区别具有低比活的G6PD的对象与其G6PD活性正常的对象,并且会使医学人员能够确保(1)仅对具有正常或较好的G6PD比活的个体规定奎宁抗疟疾药物,以及(2)用备选类型的抗疟疾药物用药治疗具有低于正常的G6PD活性的对象。
另外,已知多种类型的药物增加溶血性贫血,并且名单包括但不限于抗疟药(伯氨喹(primaquine),扑疟喹(pamaquine),等等),磺胺类药(sulfonamides)(磺胺、磺胺醋酰(sulphacetamide)、磺胺吡啶(sulphapyridine)、磺胺甲基异口恶唑,等等),砜(氨苯砜,等等),硝基呋喃类药(nitrofurans)(呋喃妥因,等等),等等(萘啶酸(nalidix acid)、萘、环丙沙星(ciprofloxacin)、亚甲蓝、甲苯胺蓝,等等)。
为了测试G6PD的缺乏,含有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)的红细胞在其接触用血液裂解剂预处理的样品应用区时裂解到测试条上。裂解的红细胞中的G6PD与其在预处理的干条中的底物起反应,并且发生酶反应以在存在四唑染料和氢化物转移剂的情况中起始颜色形成过程。催化性G6PD可以氧化葡萄糖-6-磷酸以释放NADPH,并且释放的NADPH还原四唑染料以将四唑染料的颜色改变为甲臜,诸如紫色或蓝色等,其可以在同一垫上视觉检查。
在一个特定的实施方案中,测试条在样品应用和颜色形成反应区在同一垫上的单层中构建。若需要的话,测定条的上部由具有吸水性材料的吸收垫构成。测试条用包含离子型或非离子型表面活性剂的裂解试剂预处理。其提供实施测试的简单规程,因为它不需要应用样品前的血液裂解步骤。预处理的测试条用试剂浸渍,该试剂包含:作为G6PD的特异性底物的葡萄糖-6-磷酸、辅酶NADP或NAD、四唑染料、和氢化物转移剂和稳定剂如糖模块或水溶性聚合物。
快速诊断测试(RDT)和双重测试
在一个实施方案中,本发明提供了供护理点测试用的单垫条上干形式测定法中的快速诊断测试(RDT)。干形式侧向层析提供了稳定的测试装置,简单的方法和快速的测试结果。G6PD缺乏是影响4亿人且在疟疾地方病区域中高度流行的最常见人酶缺乏之一。此缺乏似乎提供某种保护免于疟疾感染。然而,它也可以在施用某些疟疾药物,包括PRIMAQUINE后引起溶血。因此,迫切需要适合于现场筛选的快速诊断测试(RDT)。
在另一个实施方案中,本发明提供了测试方法,其中使用临床样品得到的G6PDRDT测试结果可以与定量测试结果相关联。测试可以将约≤4IU/gHb(于37℃正常12±2.09U/gHb)检测为缺乏。截留可以随G6PD缺乏患者中红细胞对伯氨喹的耐受性而变化。结束的稳定性研究提供了测试条对于于45℃持续3个月和于60℃持续10天是稳定的。针对G6PD的此RDT可以与针对疟疾的RDT组合,所述针对疟疾的RDT能够检测每μL血液的小于30种寄生物。此双重测试试剂盒可以使用少量血液(通常小于10μL)同时诊断疟疾感染和G6PD缺乏。测定条是快速的(<10分钟)且用少量样品(<10μL血液),使用简单,成本有效,轻便的,并且没有特殊的贮存要求,其对于现场使用是至关重要的要素。
侧向流动层析
许多常用的护理点测试基于利用多微孔膜的毛细管作用的基于膜的免疫层析的侧向流动测定法。在侧向流动层析测定法中,通过对固定固相上捕捉分子的亲和力结合将流动相标本溶液中的分析物与其它组分分开。由硝酸纤维素或尼龙制成的膜为亲和层析的固体固定相和分配层析的液相提供基质,所述液相通过毛细管作用驱动免疫复合物颗粒与其它液体溶剂分开。
由尼龙或硝酸纤维素制成的多微孔膜在其第一次证明蛋白质可以转移通过膜时从约1979年起已经用于抗原/抗体测试。已经广泛利用硝酸纤维素作为用于在研究技术诸如Western印迹和侧向流动免疫诊断学中固定化蛋白质的表面。微孔性和硝酸纤维素为快速免疫层析测定法提供许多益处,包括例如高结合能力、蛋白质的非共价附接、和稳定的长期固定化环境。
一般地,在侧向层析(包括酶驱动的测定法,诸如用于G6PD缺乏的测试)中,干底物是在层析条(即如本发明中的单垫条)上样品接收区的接合(junction)附近且刚超出该接合预先沉积。然而,它可以置于样品流动路径中的别的地方以适应样品或底物中的一种或多种成分的特定要求,只要它置于基本上在末端或“吸收垫”(在那里样品流动停止,并且存在的任何过量流体流入吸收垫或可以提供的其它接收器(sink)装置中)前的流动路径中。
重要的是,干燥的底物在一定范围中(优选在限制区内)沉积,只要便于其通过样品的向前流动被完全挑出。干燥的底物在流动路径中的放置还应当考虑液体样品内溶解或分散形式的底物的重建到样品到达样品流动停止的点的时间完成是期望的。
为了方便运输、贮存和使用,优选地,本发明的每个层析条可以在构建为使得该条侧向放置的合适装置内容纳。许多此类装置是本领域中公知的,并且可以适当利用其中任一种,其构建为使得通过侧向流动实施置于其内的层析条上的测定法性能。
在一个特定的实施方案中,本发明的单垫条提供特征,其包括但不限于下列各项:
1.单垫条包括选自下组的多孔性基质:硝酸纤维素膜、玻璃纤维、纤维素或聚酯,等等,
2.条包含单垫条,其中所述条的样品应用区和干燥试剂混合物的沉积区在同一垫中,而不管两个区域重叠与否。
3.本发明中的条具有接收样品流体后发生的对反应混合物的液体流动的单一路径。
4.任选地,本发明的单垫条可以用容许通过直接接触样品应用区而不用缓冲液预先裂解来裂解生物学流体的裂解试剂预包被,所述裂解试剂含有离子型(阴离子型、阳离子型和两性离子型)或非离子型表面活性剂和氯化镁。
5.本发明的单垫条含有选自下组的糖模块(moiety):单糖、二糖、多糖或水溶性聚合物如稳定剂以提高热稳定性。
6.本发明的单垫条差别设计并在双重测试形式装置中装配以用肉眼区别中等(例如:正常活性检测的10-60%)和严重G6PD缺乏(例如:正常活性检测的小于10%)。检测活性的%不限于10-60%或小于10%。
7.反应区中的组分包含酶底物、颜色显现试剂和稳定剂。可以采用单垫系统进行定量或半定量测定法,因为条上的颜色变化可以通过仪器可读出,所述仪器诸如光学分光光度计、扫描仪、阅读器、或密度计。
8.单垫系统也可适用于电化学系统。经由氧化还原酶或电子转移介导物(mediator)从由G6PD生成的NADPH或NADH至电极的电子转移可以通过干形式的电子量化。
9.可以采用单垫系统进行免疫测定法,其在固相上固定化捕捉分子。通过差别层析分开血红蛋白与分析物
控制侧向层析测定法中的信号强度的关键参数是膜的毛细管流动率和蛋白质结合能力。毛细管流动率和结合能力由膜的孔径、孔隙率和厚度决定。膜的蛋白质结合能力取决于其孔径,和表面特性。
本发明提供了层析,其中在固相上使用差别层析将血红蛋白与分析物分开。血红蛋白的颜色经常干扰红细胞中分析物的颜色反应的视觉读出。本发明提供了侧向层析方法,其中样品的不同迁移是由于大小差异、粘性、分析物与反应物的沉淀、通过充满会与分析物相互作用的试剂的多孔基质的电荷差异所致。在样品区上应用血细胞,所述样品区用裂解剂预处理以进行红细胞裂解至反应区,并且在需要时应用缓冲液。裂解的血细胞移动至反应-结果区,并且与反应物混合,所得的组合物会保留在反应物-所得物区上,而血红蛋白通过诸如毛管力继续行进以与期望的所得物分开。血红蛋白的分开会使指示剂诸如颜色的结果检测更清楚且更容易鉴定。
实施例
下文具体描述了特定的G6PD测定法,其可以由现场、家庭、医生诊所或缺乏培训过的实验室人员和仪器的任何地方工作的任何人容易成功使用,并且附图1-3中提供了结果。
实施例1:为G6PD缺乏测试条准备和进行样品测试
将垫用裂解缓冲液预处理,并将其于室温干燥。图1中显示了单垫和两垫条的结构。将经预处理的垫在塑料支持物上附接,并且在塑料支持物上头部部分中对垫覆盖吸水纸作为吸附垫。制备含有葡萄糖-6-磷酸、NADP、四唑、和氢化物或电子转移剂的测定混合物,并且将其浸渍至多孔垫上。容许经测定混合物浸渍的垫于室温干燥过夜。
·单垫的制备:塑料支持物上经测定混合物浸渍的垫。
·两垫的制备:通过在塑料支持物上重叠1-2mm将供样品应用的垫附接于经测定混合物浸渍的垫的底部。
将正常或缺乏的样品应用于条上。结果呈现了正常样品的确在本发明的单垫条系统中比在两垫系统中产生更强且更清楚的紫色颜色,如图2中显示的。缺乏样品在单垫和两垫两者中都没有产生任何颜色,因为没有G6PD可用于产生NADPH。另外,结果呈现了流体迁移在单垫中比在两垫中更一致且更快,并且血液清除的完成在本发明的单垫条系统中比在两垫系统中更快。
实施例2:为乳酸脱氢酶测试条准备和进行样品测试
将垫用含有氯化镁的裂解缓冲液预处理,并且将其于室温干燥过夜。将经预处理的垫在塑料支持物上附接,并且在塑料支持物上头部部分中对垫覆盖吸水纸作为吸附垫。制备含有乳酸盐、NAD、四唑、和Tris-HCl缓冲液pH 8.0、氢化物转移剂的测定混合物,并将其浸渍至多孔垫上。容许经测定混合物浸渍的垫于室温干燥过夜。
·单垫的制备:塑料支持物上经测定混合物浸渍的垫。
·两垫的制备:通过在塑料支持物上重叠1-2mm将样品垫附接于经测定混合物浸渍的垫的底部。
将2微升血液样品应用于条上。结果呈现了血液中的LDH酶的确在本发明的单垫条系统中比在两垫系统中产生更强且更清楚的紫色颜色,如图4中显示的。另外,结果呈现了流体迁移在单垫中比在两垫中更一致且更快,并且血液清除的完成在本发明的单垫条系统中比在两垫系统中更快。通过aQzen阅读器测量紫色颜色的强度,如表1中显示的。单垫的强度高于两垫系统的强度,如图5中显示的。
表1.
实施例3:为乙醇测试条准备和进行样品测试
将垫用含有去污剂的缓冲液预处理,并将其于室温干燥过夜。将经预处理的垫在塑料支持物上附接,并且在塑料支持物上头部部分中对垫覆盖吸水纸作为吸附垫。制备含有乙醇(alcohol)、NAD、四唑、和Tris-HCl缓冲液pH 8.0、氢化物转移剂的测定混合物,并将其浸渍至多孔垫上。容许经测定混合物浸渍的垫于室温干燥过夜。
·单垫的制备:塑料支持物上经测定混合物浸渍的垫。
·两垫的制备:通过在塑料支持物上重叠1-2mm将样品垫附接于经测定混合物浸渍的垫的底部。
将2微升含有乙醇(alcohol)的血液样品应用于条上。结果呈现了血液中的乙醇的确在本发明的单垫条系统中比在两垫系统中产生更强且更清楚的紫色颜色,如图6中显示的。通过aQzen阅读器测量紫色颜色的强度,如表2中显示的。单垫的强度高于两垫系统的强度,如图7中显示的。
表2
实施例4:为乳酸脱氢酶测试条准备和进行样品测试:取决于乳酸脱氢酶的活性
将垫用含有去污剂的缓冲液预处理,并将其于室温干燥过夜。将经预处理的垫在塑料支持物上附接,并且在塑料支持物上头部部分中对垫覆盖吸水纸作为吸附垫。制备含有乳酸盐、NAD、四唑、和Tris-HCl缓冲液pH 8.0、氢化物转移剂的测定混合物,并将其浸渍至多孔垫上。容许经测定混合物浸渍的垫于室温干燥过夜。
·单垫的制备:塑料支持物上经测定混合物浸渍的垫。
·两垫的制备:通过在塑料支持物上重叠1-2mm将样品垫附接于经测定混合物浸渍的垫的底部。
将2微升含有乳酸脱氢酶(0.5个单位至6个单位)的样品应用于条上。结果呈现了LDH酶活性在本发明的单垫条系统中比在两垫系统中产生更强且更清楚的紫色颜色,如图8中显示的。
Claims (4)
1.一种用于预先选择的分析物的酶驱动的侧向层析流动测定法的条,其由下列各项组成:
用血液裂解剂预处理的单一垫;和
以干形式沉积的底物;
其中所述底物是测定混合物,其包含葡萄糖-6-磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、氢化物或电子转移剂及其混合物;
其中所述底物包含指示剂,所述指示剂是染料化合物,所述染料化合物选自下组:TTC(四唑,氯化四唑或2,3,5-三苯基-2H-氯化四唑)、INT(2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-氯化四唑)、MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2、5-二苯基-2H-溴化四唑)、XTT(2,3-二-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰苯胺)、NBT(硝基蓝四唑)、MTS(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑)、和DCPIP(2,6-二氯靛酚)
其中所述条能通过所述分析物或血红蛋白组分的差别迁移而将存在于被测定的血液样品中的所述分析物或反应所得物与血红蛋白分离;
其中所述血红蛋白组分比所述反应所得物迁移得更快;
其中所述反应所得物是通过所述分析物和所述底物之间反应生成的反应产物;和
其中所述血液样品中的红细胞通过与血液裂解剂接触而裂解。
2.根据权利要求1所述的条,其中所述分析物选自下组:人流体中的蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸。
3.根据权利要求1所述的条,其中所述分析物选自下组:动物流体中的蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸。
4.根据权利要求1所述的条,其中所述分析物选自下组:葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、乳酸脱氢酶、和醇。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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