KR20140072023A - 개선된 측방 유동 분석을 위한 단일 패드 스트립 및 이를 이용한 테스트 장치 - Google Patents

개선된 측방 유동 분석을 위한 단일 패드 스트립 및 이를 이용한 테스트 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단일 평면 상에서 생물학적 시료의 개선된 측방 유동 분석을 위한 스트립 및 이를 포함하는 테스트 장치를 이용한 측방 유동 크로마토그래피 분석 방법에 관한 것이다. 본 발명의 스트립은 단일 패드로 이루어진 것으로, 이는 쉽고 간단한 절차 및 명확한 시각적 판독을 제공함으로써, 측방 유동 분석을 개선 시킬 수 있다. 본 발명의 스트립은 시료 적용 구역 (시료) 및 증착된 반응 혼합물(반응물)이 모두 동일한 평면에 존재하는 반응물-생성물 구역으로 이루어진다. 또한, 본 발명은 헤모글로빈이 고체상에서 차등 크로마토그래피에 의해 분석물로부터 분리되는 크로마토그래피 방법을 제공한다. 헤모글로빈에 의한 결과의 검출에서의 임의의 간섭은 본 발명에 의해 제거된다. 본 발명은 신속하고 명확한 반응을 이용하여 쉽고 간단한 절차를 포함하는 이점을 제공한다.

Description

개선된 측방 유동 분석을 위한 단일 패드 스트립 및 이를 이용한 테스트 장치 {A single-pad strip for an improved lateral flow assay and a test device using the same}
관련 출원의 상호-참조
본 출원은 2011년 7월 22일자로 출원된, 미국 가특허출원 제61/510,762호를 우선권으로 주장하며, 상기 출원의 전체 개시내용은 참조로서 본 명세서에 통합된다.
현장 진단 (POC:Point of Care) 테스트는 병원과 의원을 포함하는 의료 시설에서 뿐만 아니라 작업장 또는 원거리 현장을 포함하는 다른 임상 장소에서도 사용될 수 있는 일반적이고 매우 유용한 진단 도구이다. 긴급성 및 테스트의 목적으로 인해, 결과가 비용 및 시간 효율적 방법으로 획득될 수 있도록 간단하고 효율적인 테스트 장치 및 방법이 매우 바람직하다. 더 구체적으로, 빠르게-성장하는 있는 전염병을 위한 원거리 현장 장소 테스트, 전장에서 세균전 물질(bio-warfare agents)을 위한 테스트, 오염물질을 위한 환경 테스트, 또는 약물 남용을 위한 작업장에서의 테스트와 같은 비-의료 시설에서의 테스트는 간단하고 쉽게 수행될 것이 요구된다. 때로는, 약간의, 필요한 경우, 임상 진단 훈련을 받은 개인들이 상기 테스트들을 수행하기 때문에, 현장 진단 테스트는 간단하고, 신속하며, 사용하기 쉬워야 한다. 또한, 장치는 온도 또는 습도와 같은 저장 조건의 제한이 없는 환경을 필요로 한다. 따라서, 현장 진단 테스트를 위한 장치는 이상적으로 최소한의 장비를 요구하고, 장치 내에 포함된 테스트 방법은 온도 또는 습도를 포함하는 열악한 환경 조건에서 안정한 것이 바람직할 것이다.
목적 및 가변 환경의 증가로 현장 진단에 대한 요구가 증가함에 따라, 당업계에서는 여전히 비용 및 시간 효율적 방법으로 생물학적 표본을 위한 테스트 수행 방법 및 장치를 제공할 것이 요구되고 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 측방 유동 분석을 위한 단일-패드 기반 스트립을 제공하는 것으로, 여기서 시료 적용 (시료) 구역 및 반응 혼합물이 증착되는 반응물-생성물 구역 (반응물)은 모두 동일한 평면, 단일의 원-패드(one-pad) 위에 존재한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 소정의 분석물을 위한 효소 기반(enzyme-driven), 측방 크로마토그래피 유동 분석용 스트립을 제공하는 것으로, 상기 스트립은:
단일-패드; 및
건조된 형태로서 증착된 기판으로 이루어진다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 소정의 분석물을 위한 효소 기반. 측방 크로마토그래피 유동 분석 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 하기로 이루어지는 스트립을 포함하는 테스트 장치를 제공하는 단계 :
(i) 단일-패드; 및
(ii) 건조된 형태로 증착된 기판;
(b) 기판이 증착된 단일-패드에 시료를 적용하는 단계;
(c) 시료를 분해 패드(digestive pad)를 통해 흘려보내어 기판에 도달하도록 하는 단계;
(d) 시료를 기판과 반응시켜 반응을 생성하도록 하는 단계; 및
(e) 상기 반응을 식별하고 해석하여 시료 내 분석물의 존재 또는 농도를 나타내는 단계를 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 글루코오스-6-포스페이트 데하이드로게나제(G6PD)의 존재를 검출하기 위한 효소 기반, 측방 크로마토그래피 유동 분석 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 하기를 포함하는 단일-패드 스트립을 포함하는 테스트 장치를 제공하는 단계:
(i) 용해 버퍼로 전 처리된 분해 단일 패드;
(ii) 글루코오스-6-포스페이트, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADP) 또는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD), 수소화물 또는 전자 전달제, 및 이의 혼합물을 포함하는 분석 혼합물; 및
(iii) 테트라졸리움 염;
(b) 시료를 분해 단일-패드에 적용하는 단계;
(c) 시료를 분해 패드를 통해 흘려보내어 분석 혼합물과 접촉하도록 하는 단계;
(d) 시료를 분석 혼합물과 반응시켜 반응을 생성하도록 하는 단계; 및
(e) 상기 반응을 식별하고 해석하여 시료 내 분석물의 존재 또는 농도를 나타내는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 건식 형태 분석 방법을 기반으로 하는 것으로, 시료 적용 구역 및 반응 구역이 동일 평면 상에 존재하지만 시료 적용 구역에 적용된 시료는 반응 구역으로 모세관력(capillary force)에 의해 이동한다. 반응물은 효소를 포함하는 구성 성분과, 건조된 형태로 증착된 발색반응 유도용 조성물과의 조합을 함유한다. 본 발명에서, 시료는 반응물 구역으로 이동하여 반응물과 혼합된다. 시료가 반응물과 혼합될 때, 생성된 조성물은 천천히 움직여서 반응물-생성물 구역에 남아있게 되는 반면, 헤모글로빈과 같은 시료 내의 다른 성분들은 생성된 조성물보다 더 빠르게 움직이고 지속적으로 이동하여 모세관력에 의해 목적 생성물로부터 분리된다. 분석물을 함유하는 시료와 반응시, 반응물-생성물 구역은 색상과 같은, 표시기(indicator)로 결과를 제시한다. 생성물의 잔류와 시료의 다른 성분들의 지속적인 모세관 운동은 헤모글로빈과 같은 다른 구성성분에 의한 간섭을 제거하므로, 결과의 식별이 향상될 것이다. 상기 시료는 혈액과 같은 시료 내에 함유된 액체 또는 상기 시료에 추가로 적용되는 완충 용액에서 모세관력에 의해 이동한다.
일 구현예에서, 본 발명은 현장 진단 테스트용 원-패드 스트립 상에 건식 형태 분석 방법을 이용한 신속 진단 테스트 (rapid diagnostic test; RDT)를 제공한다. 원 패드 상의 측방 크로마토그래피는 안정적인 테스트, 단순한 공정 및 빠른 테스트 결과를 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 크로마토그래피 방법을 제공하는 것으로, 여기서 헤모글로빈은 차등 크로마토그래피를 이용하여 고체상에서 분석물로부터 분리된다. 헤모글로빈의 색상은 종종 적혈구 내의 분석물의 색상 반응에 대한 시각적 판독을 방해한다. 본 발명은 측방 크로마토그래피 방법을 제공하는 것으로, 시료의 차등한 이동은 크기의 차이, 점도, 반응물과 분석물의 침전, 분석물과 상호작용하게 될 시약과 함침된 다공질 매트릭스를 통과하는 전하의 차이로 인해 발생한다.
본 발명의 장점은 쉽고 간단한 절차, 및 헤모글로빈의 간섭이 없는 명확한 시각적 판독을 가능하게 한다는 점이다.
본 출원 명세서 전반에 걸쳐, 다음의 용어들은 하기에 명시된 의미를 갖는다.
"생물학적 물질", "생물학적 시료" 또는 "시료"는 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 및 뇌척수액과 같은 체액 또는 척추동물로부터 추출된 조직을 의미한다.
"분석물"은 존재, 부재, 또는 농도와 같은 결과 중 하나를 식별하기 위한 분석의 목적이 되는 특이적 활성을 갖는 생물학적 물질, 생물학적 시료, 또는 시료 내의 특정 성분을 의미한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 동일 또는 유사한 방법 및 재료는 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료는 하기에 기술된다. 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 본 명세서에 언급된 다른 참고 문헌은 전체가 참고로 통합된다. 상충하는 경우, 정의를 포함하여 본 명세서가 우선한다. 또한, 재료, 방법, 및 실시예는 예시적으로 사용하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 제한을 의도하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, 및 특허 청구범위에 상세히 설명될 것이다.
도 1은 본 발명에 의한 원-패드 스트립의 구조를 종래의 투-패드 스트립과 비교하여 나타낸다.
도 2는 본 발명에 의한 원-패드 스트립과 종래의 투-패드 스트립의 G6PD 결핍 테스트를 위한 시각적 비교 테스트 결과를 나타낸다. 시각적 색상 식별의 강도는 상기 도면에 제시된 점수로 측정된다.
도 3은 본 발명에 의한 원-패드 스트립과 종래의 투-패드 스트립의 G6PD 테스트를 위한 효소 분석을 이용한 신호 강도 비교 테스트 결과를 나타낸다. 시각적 색상 식별의 강도는 상기 도면에 제시된 점수로 측정된다.
도 4는 본 발명에 의한 원-패드 스트립과 종래의 투-패드 스트립의 젖산 탈수소효소 테스트에 대한 시각적 비교 테스트 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 의한 원-패드 스트립과 종래의 투-패드 스트립의 젖산 탈수소효소 테스트를 위한 효소 분석을 이용한 신호 강도 비교 테스트 결과를 나타낸다. 시각적 색상 식별의 강도는 상기 도면에 제시된 점수로 측정된다.
도 6은 본 발명에 의한 원-패드 스트립과 종래의 투-패드 스트립의 알코올 테스트를 위한 시각적 비교 테스트 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명에 의한 원-패드 스트립과 종래의 투-패드 스트립의 알코올 탈수소효소 테스트를 위한 효소 분석을 이용한 신호 강도 비교 테스트 결과를 나타낸다. 시각적 색상 식별의 강도는 aQzen Reader로 측정하였다.
도 8은 본 발명에 의한 원-패드 스트립과 종래의 투-패드 스트립의 젖산 탈수소효소 테스트를 위한 효소 분석을 이용한 신호 강도 비교 테스트 결과를 나타낸다. 시각적 색상 식별의 강도는 상기 그림에 제시된 점수로 측정된다.
본 발명은 소정의 분석물을 위한 효소 기반, 측방 크로마토그래피 유동 분석용 스트립을 제공하는 것으로, 상기 스트립은:
단일 패드; 및
건조된 형태로 증착된 기판으로 이루어진다.
일 구현예에서, 본 발명의 단일-패드는 염화 마그네슘과 같은 용해 버퍼로 전 처리된 분해 패드이다.
또 다른 구현예에서, 상기 분석물은 인간 및 동물 체액 내의 단백질, 탄수화물, 지질, 핵산으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 상기 건조된 형태로 증착된 기판은 글루코오스-6-포스페이트와 같은 분석물에 대한 반응성 기판을 함유하는 분석 혼합물로서, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADP), 수소화물 전달제 및 이의 혼합물을 더욱 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 분석물은 글루코오스-6-포스페이트 데하이드로게나제(G6PD), 젖산 탈수소효소, 또는 알코올로부터 선택된다.
일 바람직한 구현예에서, 상기 분석물은 글루코오스-6-포스페이트 데하이드로게나제(G6PD)이다.
추가의 구현예에서, 상기 기판은 염료 화합물과 같은 하나의 표시기를 포함한다. 상기 화합물은 분석물과 기판의 접촉에 의해 전기적 또는 구조적으로 변형되어 시각적으로 검출 가능하거나 측정 방법 또는 기기를 사용하여 상기 변화를 임의의 형태로 나타낼 수 있는 것으로, 제한 없이 사용될 수 있다. 그러한 화합물의 예는 염료를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다양한 색상을 나타내는 화합물은 종종 구조적으로 어떤 화학적 또는 전자 상태의 변화에 의해 색상이 변경된다. 포르마잔 염료는 탈수소효소 및 환원효소에 의한 테트라졸리움 염의 환원과정으로 생성되는 발색 화합물이다. 포르마잔 염료는 반응을 위한 기판으로 사용되는 원래의 테트라졸리움 염에 따라 감청색(dark blue)에서부터 진적색(deep red), 오렌지색(orange)까지 다양한 색상을 가진다. 테트라 졸리움 염의 예로는 TTC(테트라졸리움, 테트라졸리움 클로라이드 또는 2,3,5-트리페닐-2H-테트라졸리움 클로라이드), INT(2-(4-아이오도페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-페닐-2H-테트라졸리움 클로라이드); MTT(3-(4,5-디메틸-2-티아졸일)-2,5-디페닐-2H-테트라졸리움 브로마이드), XTT(2,3-비스-(2-메톡시-4-니트로-5-술포페닐)-2H-테트라졸리움-5-카르복사닐라이드), NBT(니트로블루 테트라졸리움), MTS (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-술포페닐)-2H-테트라졸리움), 또는 DCPIP(2,6-디클로로페놀린도페놀)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 테트라졸리움 염은 다른 것들보다 더 수용성이다. 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 하이드라이드(NADH) 또는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADPH) 또는 임의의 수소화물 전달제를 사용한 반응과 같이, 효소 또는 화학적 조건에 의한 환원 반응시, 테트라졸리움 염은 색상이 바뀔 수 있고 심지어 불용성 침전물을 형성할 수도 있다. 그 결과, 육안 검사, 색상계, UV 검출기, 분광 광도계, 이미지 분석 리더기 등과 같은 방법으로 검출될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 본 발명은 소정의 분석물을 위한 효소 기반, 측방 크로마토그래피 유동 분석을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 하기로 이루어지는 스트립을 포함하는 테스트 장치를 제공하는 단계:
(i) 단일 패드; 및
(ii) 건조된 형태로 증착된 기판;
(b) 상기 기판이 증착된 단일-패드에 시료를 적용하는 단계;
(c) 시료를 분해 패드를 통해 흘려보내어 기판에 도달하도록 하는 단계;
(d) 시료를 기판과 반응시켜 반응물을 생성하도록 하는 단계;
(e) 상기 반응을 식별하고 해석하여 시료 내 분석물의 존재 또는 농도를 나타내는 단계를 포함한다.
일 바람직한 구현예에서, 상기 분석물은 G6PD와 같은 효소이다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 G6PD의 존재를 검출하기 위한 효소 기반, 측방 크로마토그래피 유동 분석 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 하기를 포함하는 단일-패드 스트립을 포함하는 테스트 장치를 제공하는 단계:
(i) 용해 버퍼로 전 처리된 분해 단일-패드;
(ii) 글루코오스-6-포스페이트, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADP) 또는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD), 수소화물 전자 전달제 및 이의 혼합물을 포함하는 분석 혼합물; 및
(iii) 테트라졸리움 염;
(b) 시료를 분해 단일 패드에 적용하는 단계;
(c) 시료를 분해 패드를 통해 흘려보내어 분석 혼합물과 접촉하도록 하는 단계;
(d) 시료를 분석 혼합물과 반응시켜 반응을 생성하도록 하는 단계; 및
(e) 상기 반응을 식별하고 해석하여 시료 내 분석물의 존재 또는 농도를 나타내는 단계를 포함한다.
본 발명은 측방 유동 분석을 제공하고자 하는 것으로, 여기서 시료 적용 (시료) 구역 및 반응 혼합물이 증착되는 반응물-생성물 (반응물) 구역은 모두 동일한 평면, 단일의, 원 패드 위에 존재한다.
또한, 본 발명은 건식 형태 분석 방법을 기반으로 하는 것으로, 시료 적용 구역 및 반응 구역이 동일 평면 상에 존재하지만, 모세관력에 의해 시료 적용 구역에 적용된 시료는 반응 구역으로 이동한다. 반응물은 효소를 포함하는 성분과, 건조된 형태로 증착된 발색반응 유도용 조성물과의 조합을 함유한다. 본 발명에서, 상기 시료는 반응물 구역으로 이동하여 반응물과 혼합된다.
상기 시료가 반응물과 혼합될 때, 생성된 조성물은 침전되고, 천천히 이동하여 반응물-생성물 구역에 남아있게 되는 반면, 헤모글로빈 같은 분석물 내의 다른 성분들은 지속적으로 이동하여 모세관력 등에 의해 목적 생성물로부터 분리된다. 분석물을 함유하는 시료와 반응시, 반응물-생성물 구역은 색상과 같은 시각적으로 검출될 수 있는 표시기로 결과를 제시한다. 동시에, 역 판독(reverse reading) 또한 가능하다: 분석물을 포함하는 시료와 반응시, 색상과 같은 표시기를 갖는 반응물-생성물 구역은 사라질 것이다. 분석물을 포함하지 않는 시료와 반응시, 색상은 생성물 구역에서 머물러 있을 것이다. 생성물의 잔류물과 시료의 다른 성분들의 지속적인 모세관 운동은 헤모글로빈과 같은 다른 분석물에 의한 임의의 간섭을 제거하므로, 결과의 식별이 향상될 것이다. 상기 시료는 혈액과 같은 시료내 함유된 액체, 또는 상기 시료 내에 추가로 적용될 수 있는 완충 용액에서 모세관력에 의해 이동한다.
원-패드 스트립 ( One - Pad Strip )
본 발명은 원-패드 스트립 장치를 제공하는 것으로, 여기서 시료 적용 구역과 반응물-생성물 구역이 모두 하나의 패드 위에 존재한다. 단일 패드에서 수행되는 분석은 분석물의 균일한 이동을 제공하고, 다중층(multiple layer)을 통해 시료의 불균일한 이동을 제거함으로써, 일관된 결과를 야기한다. 예를 들면, 혈액 시료가 용해 버퍼로 전 처리된 원 패드 스트립에 적용되는 경우, 헤모글로빈은 생성물로부터 쉽게 분리될 수 있다.
게다가, 시료가 다른 매질 또는 층을 통과하는 대신에 동일한 평면을 지나가므로, 분석물의 양보다 반응물과 반응하는 실제 분석물의 양을 증가시킴으로써 민감도가 증가 될 수 있다. 또한, 원-패드 스트립 장치를 사용함으로써, 원-패드 스트립 장치의 생산비용이 절감될 것이며, 종래의 다중-층 분석의 공정보다 더 단순해질 것이다.
예를 들면, BinaxNOW®G6PD 테스트는 시료 패드 및 반응 패드로 존재하는 두 개의 다른 패드로 이루어진 스트립을 가진다. 정상 G6PD 활성을 갖는 시료는 식별력 있는 색상 변화를 야기한다. 적색 시료는 반응 패드의 상단부에서 갈색/흑색으로 바뀐다. 혈액 시료 내의 반응 생성물의 색상은 헤모글로빈의 색상을 제거하지 않으므로; 그 결과, 갈색/흑색은 혈액의 적색과 명확히 구분되지 않는다. BinaxNOW®G6PD를 포함하는 다른 장치에서 사용하는 이중 또는 다중상 및 불연속적 시스템과 달리, 본 발명은 단일한 상 및 연속 크로마토그래피를 이용한다. 단일 패드 및 연속 크로마토그래피로 이루어진 테스트 스트립은 이중상 크로마토그래피 보다 스트립 상에서 헤모글로빈으로부터 포르마잔 염료와 같은 염료를 갖는 생성물을 더 쉽게 분리한다.
본 발명은 세 개의 영역, 시료 적용 (시료) 구역, 반응물 및 생성물 구역으로 이루어진다. 상기 반응 구역은 발색 반응을 유도하기 위한 성분의 조합이 건조된 형태로 증착된 영역이고, 생성물 구역은 시각적 판독 영역이며, 시료 구역은 시료가 적용되는 영역이다. 이러한 구역들은 동일한 매트릭스로 구성되기 때문에, 원-패드, 연속 형태가 분석물의 균일한 이동을 가능하게 하여, 다중층을 통해 시료의 불균일한 이동의 가능성을 제거함으로써 일관된 결과를 야기하는 것이다. 게다가, 다중층을 통과하는 분석물의 양보다 반응물과 반응하는 실제 분석물의 양을 증가시킴으로써, 민감도가 증가될 수 있는 것이다. 또한, 본 발명의 형태는 생산 비용을 절감시키며 생성 공정은 종래의 다중-층 분석법 보다 더 단순하다.
측방 유동 크로마토그래피 분석 ( Lateral Flow Chromatography Assay )
분석물은 항체-항원 반응, 효소-기질 반응, 단백질-기질 컨쥬게이션, 또는 기질-기질 복합체 형성 사이의 면역성 반응과 같은 다양한 반응을 이용하여, 반응물과 반응한다.
면역성 분석법은 측방 유동 크로마토그래피 분석을 종종 이용하고 있지만, 상기 측방 유동 크로마토그래피 분석은 효소 분석법을 위해 흔히 이용되진 않았다. 측방 유동 효소 분석법은 기질과의 반응을 이용하고 효소와 기질 사이의 반응에 의해 생성되는 수소화물과 같은, 특정 화학물질과 반응시 특정 색상을 나타낼 수 있는, 염료와 같은 표시기(indicator)를 이용하여 반응을 검출함으로써, 특정 효소의 존재 또는 부재 및 농도를 식별한다.
글루코오스-6- 포스페이트 데하이드로게나제 ( G6PD )
본 발명의 일 구체적인 구현예에서 효소의 색상과 같은 특정 표시기를 나타내기 위한 염료를 환원시킬 수 있는, 효소와 그의 기질 사이의 반응으로부터의 대사산물의 활성을 이용하여, 예를 들면, 혈액 시료 내의 G6PD와 같은 시료 내의 효소의 존재의 직접적인 검출과 같은 효소 기반 분석법을 제공한다. 테트라졸리움 화합물과 같은 염료 분자는 환원되어 불용성 포르마잔을 형성할 수 있다. 불용성 포르마잔은 특정 기구 없이도 시각적으로 쉽게 식별될 수 있는 보라색을 나타낸다.
인간 효소 클루코오스-6-포스페이트 데하이드로게나제(G6PD)는 인간의 생화학반응에서 중요한 기능을 수행한다. 이는 산화적 5탄당 경로(oxidative pentose pathway)의 일부로서, 환원 등가물을 제공하여 세포를 향한 자유 라디칼의 산화적 공격을 최소화시키는 역할을 한다. 예를 들면, G6PD는 글루코오스-6-포스페이트를 6-포스포글루토네이트로 전환시키고, 이로 인해, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADP)를 NADP의 환원된 형태인, NADPH로 환원시키는 양성자가 방출된다. NADPH는 궁극적으로 자유 라디칼 산화제를 환원시키고 정상적인 인간의 생화학반응에서 이들의 대부분을 비작동상태(ineffective)로 만드는 일련의 다운스트림 반응을 개시한다.
G6PD는 대부분의 인간 세포에서 존재하지만, 그들은 주요 기능 중 하나인 산소 운반체로서 작용하므로, 특히 산소 공격을 받기 쉬운 적혈구에서 높은 농도로 존재한다. 이 효소는 적혈구 세포를 산화적 손상 및 미성숙 파괴로부터 보호한다. G6PD 시스템의 효율성은 정상 활성인 동안, 그 용량의 1% 미만이 바람직하지 않은 산화 반응을 방지하고 예방하는데 이용되고 있다는 사실에 의해 비추어 볼 때, 현저히 높은 편이다. 그러나, 항-말리리아 약제의 퀴닌류의 구성성분들과 같은 강한 산화제가 인체에 투여되어야 하는 경우, 환원제를 신속히 생산할 필요성이 매우 증가한다.
G6PD를 암호화하는, 몇몇 유전자의 돌연변이는 그들의 게놈의 양쪽에 있는 돌연변이를 가공하는 개체의 생화학반응에서 효소의 활성을 감소시키는 것으로, G6PD의 양은 정상 유전자를 가진 사람과 동일한 수준으로 남아있도록 하지만, G6PD는 특이적 활성을 나타내도록 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 개체들에서, 퀴닌-타입 항-말라리아 약제류의 구성성분들과 같은 강한 산화제의 투여는 G6PD에 대한 낮은 특이적 활성으로 인해 적혈구에 미치는 신속하고 불필요한 산화적 효과를 막기에 충분한 환원제를 생산하지 못하기 때문에 용혈성 빈혈과 같은 심각한 임상 합병증을 야기시킬 수도 있다. 말라리아 감염이 흔하고 때로는 심지어 전염성으로 발병되는 지역에서, 낮은 특이적 활성을 가진 G6PD가 있는 사람과 G6PD의 활성이 정상인 사람을 쉽게 구별하고 의료인이 (1) 퀴닌 항-말라리아 약제를 정상 또는 더 나은 G6PD 특이적 활성을 가진 개체들에게만 처방하고 (2) 정상 G6PD 활성보다 더 낮은 활성을 가진 사람에게는 항-말라리아 약제의 대체 약물이 투여할 수 있도록 빠르고 효과적인 테스트에 대한 요구가 존재한다.
게다가, 용혈성 빈혈을 증가시키는 여러 약제가 알려져 있는바, 예로서 항말라리아제 (프리마퀸, 파마퀸 등), 술폰아미드 (술파닐마이드, 술프아세트아미드, 술파피리딘, 술파메톡사졸 등), 술폰 (답손 등), 니트로퓨란 (니트로퓨란토인 등), 및 그 밖의 약제 (날리딕스 산, 나프탈렌, 시프로플록사신, 메틸렌 블루, 톨루이딘 블루 등)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
G6PD의 결핍을 테스트하기 위하여, 글루코오스-6-포스페이트 데하이드로게나제(G6PD)를 포함하는 적혈구는 혈액 용해제로 전-처리된 시료 적용 구역에 들어와서 접촉시, 테스트 스트립 위에서 용해된다. 용해된 적혈구 세포에서 G6PD는 전-처리된 건조된 스트립에서 기질과 반응한다. 그리고 효소 반응이 테트라졸리움 염료 및 수소화물 전달제의 존재 하에서 색상 형성 과정을 시작하기 위해 일어난다. 촉매된 G6PD는 글루코오스-6-포스페이트을 산화시켜 NADPH를 방출시키고, 방출된 NADPH는 테트라졸리움 염료를 환원시켜, 테트라졸리움의 색을 동일한 패드에서 시각적으로 검출할 수 있는 보라색 또는 파란색 등과 같은 포르마잔의 색으로 변하도록 한다.
일 구체적인 구현예에서, 테스트 스트립은 시료 적용 및 색상-형성 반응 영역이 동일한 패드에 존재하는 단일 층으로 만들어진다. 테스트 스트립의 상부는 필요한 경우, 흡수성(bibulous) 물질로 된, 흡수성 패드를 포함한다. 테스트 스트립은 이온성 또는 비-이온성 계면활성제를 포함한 용해제로 전-처리 된다. 시료의 적용 전 혈액-용해 단계를 요구하지 않으므로, 테스트를 수행하는 데에 간단한 과정을 제공한다. 전-처리된 테스트 스트립은 G6PD의 특이적 기질인 글루코오스-6-포스페이트, 코엔자임 NADP 또는 NADP, 테트라졸리움 염료, 및 수소화물 전달제 및 당 모이어티 또는 수용성 고분자와 같은 안정화제를 포함하는 시약으로 함침 된다.
신속 진단 테스트(RDT) 및 듀얼 테스트
일 구현예에서, 본 발명은 현장 진단을 위한 원-패드 스트립 상에 건식 형태 분석법에 대한 신속 진단 테스트(RDT)를 제공한다. 건식 형태 측방 유동 크로마토그래피는 안정한 테스트 장치, 단순한 공정 및 빠른 테스트 결과를 제공한다. G6PD 결핍은 4억명의 사람들에게 영향을 미치는 가장 흔한 인간 효소 결핍 중 하나로서, 말라리아 주 감염지역에서 매우 우세하다. 상기 결핍은 말라리아 감염에 대해 상당한 보호를 제공하는 것으로 보인다. 그러나, 이는 또한 PRIMAQUINE을 포함하는 특정 말라리아 약제의 투여 시, 용혈을 야기할 수 있다. 따라서, 검진을 위한 현장에 적합한 신속 진단 테스트에 대한 긴급한 요구가 존재한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 테스트 방법을 제공하는 것으로, 여기서 임상 시료를 이용하는 G6PD RDT 테스트 결과는 정량적 테스트 결과와 상호 연관될 수 있다. 테스트는 결핍일 때 약 ≤4 IU/gHb (37 ℃에서, 정상 12 ± 2.09 U/gHb)으로 검출된다. 컷오프(cutoff)는 G6PD 결핍 환자에서 PRIMAQUINE에 대한 적혈구 세포의 내성에 따라 변경될 수 있다. 가속 안정성 연구에 따르면, 테스트 스트립은 45℃에서 3개월 및 60℃에서 10일 동안 안정하였다. G6PD에 대한 상기 RDT는 혈액 ㎕ 당 30 미만 기생충을 검출할 수 있는 말라리아에 대한 RDT와 결합될 수 있다. 이 듀얼 테스트 키트는 말라리아 감염 및 G6PD 결핍을 적은 양 (일반적으로 10㎕ 미만)의 혈액을 이용하여 동시에 진단할 수 있다. 상기 분석 테스트는 적은 양의 시료 (10 ㎕ 미만의 혈액)을 사용하여 신속하고 (10분 미만), 사용하기 간단하고, 비용-효율적이며, 휴대용이며 현장에서 사용하기에 중요한 요소인 특별한 저장에 대한 요구사항이 없다.
측방 유동 크로마토그래피
현장 진단 테스트에서 흔히 사용되는 대다수는 미세 다공성 막의 모세관 작용을 이용하는 막-기반 면역-크로마토그래피를 기반으로 한 측방 유동 분석을 이용한다. 측방 유동 크로마토그래피 분석에서, 이동상 표본 용액 내의 분석물은 고정된 고체상에서 포획 분자에 대한 결합 친화도에 의해 다른 구성성분들로부터 분리된다. 니트로셀룰로오스 또는 나일론으로 만들어진 막은 친화성 크로마토그래피의 고체 고정상 및 모세관 작용에 의해 다른 액체 용질로부터 분리되는 면역 복합체 입자를 유도하는 분배 크로마토그래피의 액체상을 위한 매트릭스를 제공한다.
나일론 또는 니트로셀룰로오스로 만들어진 미세 다공성 막은 단백질이 막을 통해 전달될 수 있음이 처음 입증된 약 1979년 이후로 항원/항체 테스트에 사용되어 왔다. 니트로셀룰로오스는 웨스턴 블로팅 및 측방-유동 면역진단과 같은 연구 기법에서 단백질을 고정하기 위한 표면으로 광범위하게 사용되고 있다. 미세 세공도 및 니트로셀룰로오스는 예를 들면, 고 결합능, 단백질의 비-공유 결합, 및 안정적인 장-기간 고정화 환경을 포함하는 신속 면역-크로마토 분석에 많은 이점을 제공한다.
일반적으로, G6PD의 결핍에 대한 테스트와 같이 효소 기반 분석을 포함하는, 측방 크로마토그래피에서, 건조 기판은 크로마토그래피 스트립 즉, 본 발명에 따른 원-패드 스트립 상의 시료 수신 영역의 연결부 근처 또는 바로 뒤에 미리-증착된다. 그러나, 그것은 시료의 흐름이 멈추고 액체의 존재가 흡수 패드 또는 제공 될 수도 있는 다른 싱크(sink) 장치로 흘러 넘치게 되는 말단 또는“흡수 패드” 이전의 유동 경로에 실질적으로 위치하기만 한다면, 시료 또는 기판 내의 일 이상의 성분들 특별 요건을 수용할 수 있도록 시료 유동 경로의 다른 곳에도 배치될 수도 있다. 실질적인 유동 경로 이내에 또는 시료의 흐름이 중지되는“흡수 패드”에 놓이기만 하면 된다. 개별 요구사항을 수용하기 위해 시료 유동 경로의 다른 곳에 배치될 수도 있다.
시료의 순방향 흐름에 의한 완전히 포착되는 것을 용이하게 하기 위하여, 건조된 기판을 영역 내에, 바람직하기는 한정된 영역 내에서, 증착하는 것이 중요하다. 건조된 기판의 유동 경로내에서의 배치는 액체 시료에서 용해 또는 분산 형태로 기판의 재구성이 바람직하기는 시료의 흐름이 중단되는 지점에 도달할 때까지 완료되도록 고려하여야 한다.
운송, 보관 및 사용의 편리성을 위해, 본 발명의 각각의 크로마토그래피 스트립은 바람직하게 스트립이 측방에 위치하도록 구성된 적합한 장치 내에 하우징 될 수 있다. 대부분의 이러한 장치는 당업계에서 잘 알려져 있는 것으로, 측방 유동에 의한 수행이 일어나는 범위 내에 크로마토그래피 스트립 위에서 분석의 수행이 적절하게 이용될 수 있도록 구성된다.
일 구체적인 구현예에서, 본 발명의 원-패드 스트립은 다음을 포함하는 특성을 제공하지만, 이에 한정되는 것은 아니다:
1. 원-패드 스트립은 니트로세룰로오스막, 유리섬유, 셀룰로오스 또는 폴리에스터 등으로부터 선택되는 다공성 매트릭스를 포함한다.
2. 스트립은 두 영역들이 겹쳐지는지 여부에 관계없이 시료 적용 영역 및 상기 스트립의 건조된 시약 혼합물의 증착 영역이 동일한 패드에 존재하는 원-패드 스트립을 포함한다.
3. 본 발명의 스트립은 시료 액체를 받은 후 발생하는 반응 혼합물로의 액체 유동의 단일 경로를 가진다.
4. 본 발명의 원-패드 스트립은 버퍼를 사용하여 미리-용해됨이 없이 시료 적용 영역과 직접 접촉하여 생물학적 유체의 용해가 가능하도록 선택적으로 이온성(음이온, 양이온 및 양쪽 성이온) 또는 비-이온성 계면활성제 및 염화 마그네슘을 포함하는 용해제로 미리-코팅될 수 있다.
5. 본 발명의 원-패드 스트립은 열 안정도를 증가시키기 위해 안정화제로서 단당류, 이당류, 다당류 또는 수용성 고분자로부터 선택된 당 모이어티를 포함한다.
6. 본 발명의 원-패드 스트립은 보통 (예를 들면: 정상 활성 검출의 10-60%) 및 심각한 G6PD 결핍 (예를 들면; 정상 활성 검출의 10% 미만)을 육안으로 식별하기 위해 듀얼 테스트 형태로 차등적으로 만들어지고 조립되었다. 검출을 위한 활성 %는 10-60% 또는 10% 미만에 제한되는 것은 아니다.
7. 반응 구역 내의 성분은 효소 기질, 발색 시약 및 안정화제를 포함한다. 원 패드 시스템은 스트립 상의 색상 변화가 광학 분광광도계, 스캐너, 리더기, 또는 농도계와 같은 기구로 판독될 수 있도록, 정량적 또는 반-정량적 분석법을 위해 이용될 수 있다.
8. 하나의 패드 시스템은 또한 전기화학 시스템에 적용 가능하다. G6PD에 의해 생성된 NADPH 또는 NADH로부터 산화환원효소 또는 전자전달 매개체를 통한 전극으로의 전자 전달은 건조 형태로 전극을 사용하여 정량화될 수 있다.
9. 원 패드 시스템은 고체상에 포획분자를 고정화하는 면역 분석을 위해 사용될 수 있다.
차등 크로마토그래피에 의한 분석물로부터 헤모글로빈의 분리
측방 크로마토그래피 분석에서 신호 강도를 조절하는 주요 파라미터는 모세관 유량 및 막의 단백질 결합능이다. 모세관 유랑 및 결합능은 기공 크기, 기공도, 및 막의 두께에 의해 결정된다. 막의 단백질 결합능은 기공 크기, 및 표면 특성에 따라 달라진다.
본 발명은 크로마토그래피를 제공하는 것으로, 여기서 헤모글로빈은 고체상에서 차등 크로마토그래피를 이용하여 분석물로부터 분리된다. 헤모글로빈의 색상은 종종 적혈구에서 분석물의 색상 반응에 대한 시각적인 판독을 방해한다. 본 발명은 측방 크로마토그래피 방법을 제공하는 것으로, 여기서 시료의 다른 이동은 크기 차이, 점도, 분석물과 반응물의 침전, 분석물과 상호 작용을 하게 되는 시약으로 함침된 다공성 매트릭스를 통한 전하의 차이로 인해 발생한다. 혈액 세포는 적혈구용 용해제로 전처리 된 시료 영역 위에서 반응 구역으로 적용되고, 버퍼는 필요에 따라 적용된다. 용해된 혈액 세포는 반응-결과 구역으로 이동하여 반응물과 혼합되고, 생성된 조성물은 반응물-결과물 구역에 잔존하는 반면, 헤모글로빈은 계속 이동하여 모세관력 등에 의해 목적 생성물로부터 분리된다. 헤모글로빈의 분리는 표시기에 의한 결과 검출을 선명하고 식별이 용이하게 만든다.
실시예
이하에서는 현장, 집, 의원, 또는 숙련된 검사자 및 기기 결여된 어떤 장소에서도 누구나 성공적으로 쉽게 사용할 수 있는 특정 G6PD 분석에 대해 구체적으로 설명하며, 그 결과는 도 1-3에 첨부하였다.
실시예 1. G6PD 결핍 테스트 스트립의 준비 및 시료 테스트 실시
패드를 용해제로 전처리한 후 이를 실온에서 건조시켰다. 원-패드와 투-패드 스트립의 구조를 도 1에 나타내었다. 전-처리된 패드를 플라스틱 지지대에 부착하고 흡수성(bibulous) 종이를 흡수 패드로서 플라스틱 지지대 위의 머리 부분 내의 패드에 적층(overlap)하였다. 글루코오스-6-포스페이트, NADP, 테트라졸리움, 및 수소화물 또는 전자 전달제를 함유하는 분석 혼합물을 준비하고 이를 다공성 패드 위에 함침하였다. 분석 혼합물이 함침된 패드를 실온에서 하룻밤 건조시켰다.
· 원 패드의 준비: 플라스틱 지지대의 분석 혼합물이-함침된 패드.
· 투 패드의 준비: 시료 적용을 위한 패드를 플라스틱 지지대 위에 1-2 mm로 덮어 분석 혼합물- 함침된 패드의 밑 부분에 부착하였다.
정상 또는 결핍 시료를 스트립에 적용하였다. 그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, 정상 시료는 확실히 투패드의 것보다 본 발명의 원 패드 스트립 시스템에서 더 진하고 선명한 보라색을 나타내었다. 결핍된 시료는 G6PD가 NADPH를 생성할 수 없기 때문에 원 및 투 패드 모두에서 어떠한 색상도 나타내지 않았다. 또한, 투 패드 보다 원 패드에서 액체 이동이 더 균일하고 빨랐으며, 혈액 제거의 완료는 투 패드 보다 원-패드 스트립 시스템에서 더 빨랐다.
실시예 2. 젖산 탈수소효소 테스트 스트립의 준비 및 시료 테스트 실시
패드를 염화 마그네슘이 포함된 용해 버퍼로 전-처리하고 이를 실온에서 하룻밤 건조시켰다. 전-처리된 패드를 플라스틱 지지대에 부착하고 흡수성 종이를 흡수 패드로서 플라스틱 지지대 위의 머리 부분 내의 패드에 적층하였다. 젖산, NAD, 테트라졸리움, 및 Tris-HCl 버퍼 pH 8.0 수소화물 전달제를 포함하는 분석 혼합물을 준비하고 이를 다공성 패드 위에 함침하였다. 분석 혼합물이 함침된 패드를 실온에서 하룻밤 건조시켰다.
· 원 패드의 준비: 플라스틱 지지대의 분석 혼합물이-함침된 패드.
· 투 패드의 준비: 시료 적용을 위한 패드를 플라스틱 지지대 위에 1-2 mm로 덮어 분석 혼합물- 함침된 패드의 밑 부분에 부착하였다.
혈액 시료 2㎕를 스트립 위로 적용하였다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 혈액 내의 LDH 효소는 투 패드 보다 본 발명의 원 패드 스트립 시스템에서 확실히 진하고 선명한 보라색을 나타내었다. 또한, 투 패드 보다 원 패드에서 액체 이동이 더 균일하고 빨랐으며, 혈액 제거의 완료는 투 패드 보다 원 패드 스트립 시스템에서 더 빨랐다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 보라색 색상의 강도는 aQzen Reader로 측정했다. 도 5에서 나타낸 바와 같이, 투 패드 시스템 보다 원 패드 시스템의 강도가 더 높았다.
실험 횟수 유스트립의 유형
원 투

임의의 강도		 1회 49.51 35.79
2회 47.38 36.49
3회 45.37 34.99
평균 47.42 35.76
실시예 3. 알코올 테스트 스트립의 준비 및 시료 테스트 실시
패드를 세제를 포함하는 버퍼로 전-처리하고 이를 실온에서 하룻밤 건조시켰다. 전-처리된 패드를 플라스틱 지지대에 부착하고 흡수성 종이를 흡수 패드로서 플라스틱 지지대 위의 머리 부분 내의 패드에 적층하였다. 알코올, NAD, 테트라졸리움, 및 Tris-HCl 버퍼 pH 8.0, 수소화물 전달제를 포함하는 분석 혼합물을 준비하여 이를 다공성 패드 위에 함침 하였다. 분석 혼합물이 함침된 패드를 실온에서 하룻밤 건조시켰다.
· 원 패드의 준비: 플라스틱 지지대의 분석 혼합물이-함침된 패드.
· 투 패드의 준비: 시료 적용을 위한 패드를 플라스틱 지지대 위에 1-2 mm로 덮어 분석 혼합물- 함침된 패드의 밑 부분에 부착하였다.
알코올을 포함하는 혈액 시료 2㎕를 스트립 위로 적용하였다. 그 결과, 도 6에서 나타낸 바와 같이, 혈액 내의 알코올의 존재 투 패드 보다 본 발명의 원 패드 스트립 시스템에서 확실히 진하고 선명한 보라색을 나타냈다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 보라색 색상의 강도는 aQzen Reader로 측정하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 투 패드 시스템 보다 원 패드의 강도가 더 높았다.
원 투

임의의 강도 		1회 89.00 48.45
2회 89.88 49.90
3회 90.42 51.00
평균 89.77 49.79
표준편차 0.51 0.90
실시예 4. 젖산 탈수소효소의 활성에 따른 젖산 탈수소 효소 스트립의 준비 및 시료 테스트의 실시
패드를 세제를 포함하는 버퍼로 전-처리하고 실온에서 하룻밤 건조시켰다. 전-처리된 패드를 플라스틱 지지대에 부착하고 흡수성 종이를 흡수 패드로서 플라스틱 지지대 위의 머리 부분 내의 패드에 적층하였다. 젖산, NAD, 테트라졸리움, 및 Tris-HCl 버퍼 pH 8.0 수소화물 전달제를 포함하는 분석 혼합물을 준비하고 다공성 패드 위에 함침하였다. 분석 혼합물이 함침된 패드를 실온에서 하룻밤 건조시켰다.
· 원 패드의 준비: 플라스틱 지지대의 분석 혼합물이-함침된 패드.
· 투 패드의 준비: 시료 적용을 위한 패드를 플라스틱 지지대 위에 1-2 mm로 덮어 분석 혼합물- 함침된 패드의 밑 부분에 부착하였다.
젖산 탈수소효소 (0.5 유닛 내지 6 유닛)를 포함하는 시료 2 ㎕를 스트립 위에 적용하였다. 그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 투 패드 보다 원 패드 스트립 시스템에서 LDH 효소 활성이 진하고 선명한 보라색을 생성하였다.

Claims (20)

  1. 단일 패드; 및
    건조된 형태로 증착된 기판으로 이루어진, 소정의 분석물을 위한 효소 기반, 측방 크로마토그래피 유동 분석용 스트립.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 분석물은 사람 및 동물의 체액 내의 단백질, 탄수화물, 지질 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 스트립.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 분석물은 글루코오스-6-포스페이트 데하이드로게나제 (G6PD), 젖산 탈수소효소 및 알코올로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 스트립.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 단일 패드는 버퍼 또는 용해 버퍼로 전처리 되는 것인, 스트립.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 기판은 글루코오스-6-포스페이트, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADP) 또는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD), 수소화물 또는 전자 전달제 및 이의 혼합물을 포함하는 분석 혼합물인 것인, 스트립.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 기판은 표시기를 포함하는 것인, 스트립.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 표시기는 염료 화합물의 것인, 스트립.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 염료 화합물은 TTC(테트라졸리움, 테트라졸리움 클로라이드 또는 2,3,5-트리페닐-2H-테트라졸리움 클로라이드), INT(2-(4-아이오도페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-페닐-2H-테트라졸리움 클로라이드), MTT(3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H-테트라졸리움 브로마이드), XTT(2,3-비스-(2-메톡시-4-니트로-5-술포페닐)-2H-테트라졸리움-5-카르복사닐라이드), NBT(니트로블루 테트라졸리움), MTS(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-술포페닐)-2H-테트라졸리움), 및 DCPIP(2,6-디클로로페놀린도페놀)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 스트립.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 염료 화합물은 테트라졸리움 클로라이드 또는 테트라졸리움인 것인, 스트립
  10. (a) 하기로 이루어지는 스트립을 포함하는 테스트 장치를 제공하는 단계:
    (i) 단일- 패드; 및
    (ii) 건조된 형태로서 증착된 하나의 기판;
    (b) 기판이 증착된 단일-패드에 시료를 적용하는 단계;
    (c) 시료를 분해 패드(digestive pad)를 통해 흘려보내어 기판에 도달하도록 하는 단계;
    (d) 시료를 기판과 반응시켜 반응을 생성하도록 하는 단계; 및
    (e) 상기 반응을 식별하고 해석하여 시료 내 분석물의 존재 또는 농도를 나타내는 단계를 포함하는, 소정의 분석물을 위한 효소 기반, 측방 크로마토그래피 유동 분석 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 분석물은 사람 및 동물의 체액 내의 단백질, 탄수화물, 지질, 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 분석물은 글루코오스-6-포스페이트 데하이드로게나제(G6PD), 젖산 탈수소효소 및 알코올로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  13. 제 10항에 있어서,
    상기 단일 패드는 버퍼 또는 용해 버퍼로 전처리 되는 것인, 방법.
  14. 제 10항에 있어서,
    상기 기판은 글루코오스-6-포스페이트, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (NADP) 또는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD), 수소화물 또는 전자 전달제 및 이의 혼합물을 포함하는 분석 혼합물인 것인, 방법.
  15. 제 10항에 있어서,
    상기 기판은 표시기를 포함하는 것인, 방법.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 표시기는 염료 화합물의 것인, 방법.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 염료 화합물은 TTC(테트라졸리움, 테트라졸리움 클로라이드 또는 2,3,5-트리페닐-2H-테트라졸리움 클로라이드), INT(2-(4-아이오도페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-페닐-2H-테트라졸리움 클로라이드), MTT(3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H-테트라졸리움 브로마이드), XTT(2,3-비스-(2-메톡시-4-니트로-5-술포페닐)-2H-테트라졸리움-5-카르복사닐라이드), NBT(니트로블루 테트라졸리움), MTS(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-술포페닐)-2H-테트라졸리움) 및 DCPIP(2,6-디클로로페놀린도페놀)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 염료 화합물은 테트라졸리움 클로라이드 또는 테트라졸리움인 것인, 방법.
  19. 제 13항에 있어서,
    상기 용해 버퍼는 염화 마그네슘을 포함하는 것인, 방법.
  20. (a) 하기를 포함하는 단일-패드 스트립을 포함하는 테스트 장치를 제공하는 단계:
    (i) 용해 버퍼로 전 처리된 분해 단일 패드;
    (ii) 글루코오스-6-포스페이트, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADP) 또는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD), 수소화물 또는 전자 전달제 및 이의 혼합물을 포함하는 분석 혼합물; 및
    (iii) 테트라졸리움 염 (tetrazolium salt);
    (b) 시료를 분해 단일-패드에 적용하는 단계;
    (c) 시료를 분해 패드를 통해 흘려 보내어 분석 혼합물과 접촉하도록 하는 단계;
    (d) 시료를 분석 혼합물과 반응시켜 반응을 생성하도록 하는 단계; 및
    (e) 상기 반응을 식별하고 해석하여 시료 내 분석물의 존재 또는 농도를 나타내는 단계를 포함하는, G6PD의 존재를 검출하기 위한 효소 기반, 측방 크로마토그래피 유동 분석의 방법.
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