BR112013029951B1 - composição farmacêutica e uso de anticorpos ou fragmentos de anticorpos anti-cgrp para tratar ou prevenir formas de diarreia crônicas e agudas - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DE ANTICORPOS OU FRAGMENTOS DE ANTICORPOS ANTI-CGRP OU ANTI- CGRP-R PARA TRATAR OU PREVENIR FORMAS DE DIARREIA CRÔNICAS E AGUDAS. A presente invenção é dirigida a métodos para tratar diarreia, em ambas as formas crônica ou aguda, pela administração de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de anticorpos e fragmentos dos mesmos tendo especificidade de ligação para CGRP. Em particular, os métodos previnem ou reduzem diarreia em condições ou tratamentos resultando em elevados níveis de CGRP, por exemplo, no trato Gl (cólon), que estão associados com diarreia e/ou excreção imprópria de eletrólito e fluido do intestino ou do sistema urinário. Mais especificamente, esta invenção se refere a tratamentos usando os anticorpos e fragmentos anti-CGRP descritos neste documento e fragmentos de ligação dos mesmos.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US 61/496.873 (Atty. Docket No. 67858.770000), depositado em 14 de junho de 2011, intitulado "USE OF ANTI-CGRP ANTIBODIES AND ANTIBODY FRAGMENTS TO TREAT DIARRHEA IN SUBJECTS WITH DISEASES OR TREATMENTS THAT RESULT IN ELEVATED CGRP LEVELS" e pedido provisório US 61/488.660 (Atty. Docket No. 67858.730300) depositado em 20 de maio de 2011, intitulado "ANTI-CGRP COMPOSITIONS AND USE THEREOF"cada um dos quais é incorporado por referência aqui em sua totalidade.

O presente pedido contém uma listagem de sequência que foi submetida em formato ASCII via EFS-Web e é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Dita cópia ASCII, criada em 18 de maio de 2012, é chamada de 67858o730304.txt e tem 203.920 bytes em tamanho.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da Invenção

Esta invenção pertence à descoberta que polipeptídeos que se ligam a CGRP ou receptor CGRP e/ou outros polipeptídeos que inibem a interação de CGRP/receptor CGRP como anticorpos anti-CGRP ou antirreceptor CGRP e fragmentos de anticorpo ou fragmentos de CGRP ou o receptor CGRP que inibe a interação de CGRP/receptor CGRP podem ser usados para tratar ou prevenir a diarreia, especialmente diarreia associada com condições ou tratamentos que resultam em níveis aumentados de CGRP. Condições exemplares e tratamentos envolvendo CGRP aumentada são identificados aqui. A invenção, em particular, refere-se aos métodos para inibir, prevenir ou tratar diarreia e/ou manter equilíbrio de eletrólitos e níveis de fluido no cólon de um sujeito contendo uma condição ou tratamento associado com níveis elevados de CGRP que resultam em diarreia e/ou flu xo aumentado de eletrólitos e fluidos do cólon compreendendo administrar uma quantidade efetiva de um anticorpo anti-CGRP ou fragmento de anticorpo anti-CGRP. Condições exemplares incluem, entre outras, distúrbio intestinal funcional e doenças intestinais inflamatórias, infecções bacterianas ou virais, e mais especificamente refluxo gastroesofágico, dispepsia, síndrome do intestino irritável, síndrome de dor abdominal funcional, diverticu- lose, e diverticulite, Doença de Crohn, ileíte, colite colagenosa, colite linfocí- tica, colite ulcerativa, cânceres ou tratamentos de câncer associados com CGRP aumentado e diarreia como quimioterapia, radiação, carcinoma de tireoide medular, e câncer colorretal.

Além disso, a presente invenção fornece métodos para triar poli- peptídeos como anticorpos anti-CGRP ou antirreceptor CGRP e fragmentos dos mesmos (incluindo fragmentos Fab) tendo especificidade de ligação a Peptídeo Relacionado ao Gene de Calcitonina humana (doravante "CGRP") bem como fragmentos de CGRP ou um receptor de CGRP em modelos animais para determinar os efeitos in vivo dos mesmos, especialmente sua capacidades em antagonizar os efeitos colaterais adversos de CGRP e para tratar condições envolvendo CGRP excesso, especialmente condições ou tratamentos associados com CGRP com diarreia. A invenção ainda pertence aos métodos para triar doenças e distúrbios associados com CGRP aumentado, que são associados com diarreia e regimes terapêuticos específicos para prevenir ou tratar doenças e distúrbios que envolvem diarreia associada a CGRP ao administrar ditos anticorpos ou fragmentos dos mesmos, isolados ou em combinação com outros ativos.

Descrição da técnica relacionada

Peptídeo Relacionado ao Gene de Calcitonina (CGRP) é produzido como um neuropeptídeo multifuncional de 37 aminoácidos em comprimento. Duas formas de CGRP, as formas CGRP-alfa e CGRP-beta, existem em humanos e têm atividades semelhantes. CGRP-alfa e CGRP-beta diferem em três aminoácidos em humanos e são derivados de genes diferentes. A família de peptídeos CGRP inclui amilina, adrenomedulina, e calcitonina, embora cada um tenha receptores distintos e atividades biológicas. Doods, H., Curr. Op. Invest. Drugs, 2(9):1261-68 (2001).

CGRP é liberada de vários tecidos como nervos trigeminais, que quando ativados liberam neuropeptídeos dentro das meninges, mediando inflamação neurogênica que é caracterizada por vasodilatação, extravasamento do vaso e degradação de mastócito. Durham, P.L., New Eng. J. Med., 350 (11): 1073-75 (2004). Os efeitos biológicos de CGRP são mediados via o receptor de CGRP (CGRP-R), que consiste em um componente sete- transmembrana, em conjunto com a proteína de membrana associada ao receptor (RAMP). CGRP-R ainda requer a atividade da proteína componente do receptor (RCP), que é essencial para um acoplamento eficiente para a- denilato ciclase através de proteínas G e a produção de cAMP. Doods, H., Curr. Op. Invest. Drugs,2(9): 1261-68 (2001).

Enxaquecas são distúrbios neurovasculares que afetam aproxi-madamente 10% da população adulta nos EUA, e são tipicamente acompanhados por intensas dores de cabeça. Aproximadamente 20-30% dos que sofrem dores de cabeça sofrem de experiência de aura, compreendendo fenômeno neurológico que precede e/ou acompanha o evento. CGRP parece desempenhar um papel proeminente no desenvolvimento de enxaquecas. Por exemplo, concentrações plasmáticas de CGRP foram identificadas elevadas no sangue venoso jugular durante a fase de dor de cabeça de enxaquecas, à exclusão de neuropeptídeos. Além disso, de acordo com Arulmo- zhi et al, o seguinte foi identificado nos enxaquecosos: (1) uma forte correlação entre concentrações plasmáticas de CGRP e enxaquecas; (2) a infusão de CGRP produziu uma dor de cabeça tipo enxaqueca; (3) níveis basais de CGRP foram elevados; e (4) alterações em níveis plasmáticos de CGRP durante ataques de enxaqueca significativamente se correlacionaram com a intensidade de dor de cabeça. Arulmozhi, D.K., etal., Vas. Pharma., 43: 176- 187 (2005). Além disso, no Journal of the International Association for the Study of Pain PII:S0304-3959(11)00313-7; doi: 10.1016/j.pain.2011.04.033, publicado online 06 de junho de 2011, Hou et al., reportaram que a expressão de queratinócito de peptídeo β relacionado ao gene de calcitonina tern implicações para mecanismos de dor neuropáticas e inflamatórias.

Um tratamento eficaz para enxaquecas é a administração de triptanos, que são uma família de fármacos à base de triptamina, incluindo sumatriptano e rizatriptano. Membros desta família têm uma afinidade para múltiplos receptores de serotonina, incluindo 5-HTIB, 5-HTID, e 5-HTIF. Membros desta família de fármacos seletivamente contraem os vasos cerebrais, mas ainda causam efeitos de vasoconstrição em vasos coronários. Durham, P.L., New Eng. J. Med., 350 (11 ):1073-75 (2004). Há um risco teórico de espasmos coronários em pacientes com doença cardíaca estabelecida após administração, e eventos cardíacos após receberem triptanos podem raramente ocorrer. Nota-se ser contraindicado para pacientes com doença vascular coronariana.

De modo semelhante, a dor geralmente pode ser direcionada a- través da administração de certos narcóticos ou fármacos anti-inflamatórios (NSAIDs). No entanto, a administração destes tratamentos pode ocorre ao custo de certas consequências negativas. NSAIDs têm o potencial de causar falência renal, sangramento intestinal e disfunção hepática. Os narcóticos têm o potencial de causar náusea, vômito, funcionamento mental comprometido e vício. Portanto, é desejável identificar tratamentos alternativos para dor para evitar algumas destas consequências negativas.

CGRP parece desempenhar um papel em uma multitude de doenças e distúrbios, incluindo, entre outros, enxaquecas, dores de cabeça e dor. Devido ao envolvimento percebido de CGRP nestas doenças e distúrbios, ainda permanece uma necessidade na técnica par as composições e métodos úteis para prevenir ou tratar doenças e distúrbios associados com CGRP, enquanto evitando efeitos colaterais adversos. Especialmente permanece uma necessidade na técnica para composições ou métodos que reduzem ou inibem doenças ou distúrbios associados com CGRP, como enxaquecas, dores de cabeça e dor.

Além das condições acima mencionadas há uma necessidade para tratar outras condições ou efeitos colaterais adversos que estão associados com CGRP aumentados. Com relação a isto, tem havido alguma evidência anedótica reportada na literatura que sugere que aumentos em níveis de CGRP podem ter um papel em algumas doenças associadas com diarreia. Por exemplo, foi reportado por Rolston et al. em Digestive Diseases and Sciences, (April 1989) 34(4):612-6, "Intravenous calcitonin gene-related peptide stimulates net water secretion in rat colon in vivo" que peptídeo relacionado ao gene de calcitonina tem um efeito no fluxo líquido de água e eletróli- tos no intestino delgado e grosso de rato. Eles reportam que nas alças intestinais ligadas, peptídeo relacionado ao gene de calcitonina (CGRP) induziu secreção de fluido colônico, mas não teve efeito no intestino delgado. Ainda reportam usando uma técnica de perfusão de passagem única que eles observaram uma secreção dependente de dose imediata de água pelo cólon do rato mediante administração intravenosa de CGRP e ainda que a secreção líquida de sódio, potássio e cloro foram ainda elevadas. Eles sugerem as implicações destas observações para o possível envolvimento de concentrações circulantes altas de CGRP na síndrome de diarreia aquosa que a- companham carcinoma de tireoide medular.

Ainda, foi reportado por Keates et al., Gastroenterology 114:956- 64(1998), "CGRP Upregulation in dorsal root ganglia and ilea mucosa during Clostridium difficile toxin A-induced enteritis in mice" que CGRP pode de-sempenhar um papel na diarreia mediada por toxina A e que o antagonista CGRP substancialmente inibiu a diarreia e inflamação mediadas por toxina A.

Além disso, Picard et al. reportaram em International Journal of Radiation Biology, (2001), Vol. 77, No. 3, pp. 349-356, "Presence of protective role of afferent nerves in early intestinal mucosal alterations induced by abdominal irradiation in rats" que os níveis de CGRP aumentam a irradiação abdominal e particularmente em radiação de entente, uma condição caracterizada por diarreia e outras reações inflamatórias.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Apesar de ser desconfortável para o indivíduo afligido, diarreia, especialmente se crônica ou grave pode ser ameaçador à vida, especialmente em pacientes geriátricos e crianças e adolescentes bem como pacientes com doenças como câncer e infecção viral associada com diarreia crônica que pode substancialmente depletar níveis de fluido e eletrólitos. Há 2 tipos gerais de diarreia, aguda e crônica.

A diarreia é geralmente classificada como uma condição que tem três ou mais evacuações frouxos ou líquidos por dia. É uma causa comum de óbito em países em desenvolvimento e a segunda causa mais comum de mortes infantis em todo o mundo. A perda de fluidos através da diarreia pode causar desidratação e desequilíbrios de eletrólitos. Em 2009 a diarreia foi estimada por ter causado 1,1 milhão de mortes em pessoas de até 5 anos e mais de 1,5 milhão de mortes em crianças até a idade de 5 a- nos. As soluções de reidratação oral (ORS) com quantidades modestas de eletrólitos e comprimidos de zinco são o tratamento de escolha e estima-se que tenham salvado 50 milhões de crianças nos últimos 25 anos. ORS devem ser iniciados o mais cedo possível. O vômito não ocorre durante a primeira hora ou duas de tratamento com ORS, mas isso raramente previne reidratação bem sucedida conforme o máximo de fluido é ainda absorvido. A Organização Mundial da Saúde (OMS) recomenda que se uma criança vomitar, esperar cinco ou dez minutos e então iniciar novamente mais lentamente.

Soluções caseiras recomentadas pela OMS incluem bebidas salgadas (por exemplo, água de arroz salgada ou uma bebida láctea salgada) e sopa de vegetais ou galinha com sal. Se disponível, potássio complementar, bem como zinco suplementar, podem ser adicionados ou administrados junto com esta solução caseira. É ainda recomendado que as pessoas com diarreia, se capazes, continuem ou voltem a comer conforme recuperem a função intestinal normal e geralmente leva à diarreia de duração mais curta. Água pura limpa pode ser um dos vários fluidos administrados. Há soluções comerciais como Pedialyte, e agencias de alívio como UNICEF amplamente distribuem pacotes de sais e açúcar.

Apesar das designações de crônicas e agudas de diarreia, esta condição é ainda classificada em tipos diferentes cujas classificações são baseadas na causa e manifestações da doença. Um tipo é a "diarreia secretária". A diarreia secretária significa que há um aumento na secreção ativa, ou há uma inibição de absorção. Há pouco ou nenhum dano estrutural. A causa mais comum deste tipo de diarreia é uma toxina colérica que estimula a secreção de ânions, especialmente íons cloreto. Neste tipo de diarreia a secreção de fluido intestinal é isotônica com plasma mesmo durante jejum.[8] <> Esta continua mesmo quando não há ingestão de alimento oral.

Um segundo tipo é "diarreia osmótica". A diarreia osmótica pode ocorrer quando muita água é arrastada para os intestinos. Se uma pessoa bebe soluções com açúcar excessivo ou sal excessivo, estes podem puxar a água do corpo para o intestino e causar a diarreia osmótica. Ainda, a diarreia osmótica pode também ser o resultado de má digestão (por exemplo, doença pancreática ou doença celíaca), em que os nutrientes são deixados no lúmen para puxar água. Ou esta pode ser causada por laxativos osmóticos (que trabalham para aliviar a constipação puxando água nos intestinos). Em indivíduos saudáveis, muito magnésio ou vitamina C ou lactose não digerida podem produzir diarreia osmótica e distensão do intestino. Uma pessoa que tem intolerância a lactose pode ter dificuldade de absorver lactose após uma ingesta extraordinariamente alta de laticínios. Em pessoas que têm má ab-sorção de frutose, excesso de ingestão de frutose pode ainda causar diarrei- a. Alimentos com alto teor de frutose também têm um teor alto em glicose são mais absorvíveis e menos provavelmente causam diarreia. Álcoois de açúcar como sorbitol (geralmente encontrados em alimentos isentos de açúcar) são difíceis para o corpo absorver e, em grandes quantidades podem levar à diarreia osmótica.

Um terceiro tipo de diarreia é "diarreia exudativa". Diarreia exudativa ocorre com a presença de sangue e pus nas fezes. Isto ocorre com doenças intestinais inflamatórias, como Doença de Crohn ou colite ulcerati- va, e infecções como E. coli ou outras formas de intoxicação alimentar.

Um quarto tipo de diarreia é "diarreia relacionada a motilidade". A diarreia relacionada à motilidade é causada por movimento rápido de alimento através dos intestinos (hipermotilidade). Se o alimento se movimenta muito rapidamente através do trato gastrointestinal, não há tempo suficiente para que os nutrientes e a água sejam absorvidos. Isto pode ser devido a uma vagotomia ou neuropatia diabética ou uma complicação de menstruação. Hipertiroidismo pode produzir hipermotilidade e levar a este tipo de diarreia. A diarreia pode ser tratada coma gentes antimotilidade (como loperami- da). A hipermotilidade pode ser observada em pessoas que têm partes do intestino removidas, o que permite menos tempo total para absorção de nutrientes.

Um quinto tipo de diarreia é a "diarreia inflamatória". A diarreia inflamatória ocorre quando há dano ao revestimento de mucosa ou borda em escova, que leva a uma perda passiva de fluidos ricos em proteína e uma capacidade reduzida em absorver esta perda de fluidos. As características de três dos outros tipos de diarreia podem ser encontradas neste tipo de diarreia. Ela pode ser causada por infecções bacterianas, infecções virais, infecções parasíticas, ou problemas autoimunes como doenças intestinais inflamatórias. Ela pode ainda ser causada por tuberculose, câncer de cólon e enterite.

Uma condição relacionada a diarreia é "disenteria". Geralmente, se há sangue visível nas fezes, não é diarreia, mas disenteria. O sangue é traço de uma invasão de tecido intestinal. A disenteira é um sintoma de, entre outros Shigella, Entamoeba histolytica, e Salmonella.

A diarreia é mais comumente devido à gastroenterite viral com rotavirus, que conta para 40% dos casos em crianças abaixo de cinco anos. Em viajantes, no entanto, predominam infecções bacterianas. Várias toxinas como intoxicação por cogumelos e fármacos podem ainda causar diarreia aguda.

Como notado acima, diarreia pode ser classificada como crônica ou aguda. "Diarreia crônica pode ser parte das apresentações de uma diversidade de condições médicas crônicas que afetam o intestino. Causas comuns incluem colite ulcerativa, Doença de Crohn, colite microscópica, doença celíaca, síndrome do intestino irritável e má absorção de ácido biliar.

Há muitas causas de diarreia infecciosa, que incluem vírus, bactérias e parasitas. Norovirus é a causa mais comum de diarreia virai em a- dultos, mas rotavirus é a causa mais comum em crianças até cinco anos de idade. Adenovirus tipos 40 e 41, e astrovírus causam um número significativo de infecções.

A bactéria Campylobacter é uma causa comum de diarreia bac- teriana, mas infecções por Salmonellae, Shigellae e algumas cepas de Escherichia coli (E.coli) são frequentes. Nos idosos, particularmente aqueles que foram tratados com antibióticos para infecções não relacionadas, uma toxina produzida por Clostridium difficile geralmente causa diarreia.

Alguns parasitas podem causar diarreia como o protozoário Gi- ardia, que pode causar infecções crônicas se estas não são diagnosticadas e tratadas com fármacos como metronidazol, e Entamoeba histolytica.

Outras causas de diarreia crônica incluem: deficiências enzimá- ticas ou anormalidade de mucosa, como em alergia alimentar e intolerância alimentar, por exemplo, doença celíaca (intolerância ao glúten), intolerância à lactose (intolerância ao açúcar do leite, comum em não europeus), e má absorção de frutose, anemia perniciosa, ou função intestinal comprometida devido à incapacidade de absorver vitamina B12, perda de secreções pan- creáticas, que podem ser devido à fibrose cística ou pancreatite, defeitos estruturais, com síndrome do intestino curto (intestino cirurgicamente removido) e fibrose de radiação, como geralmente após tratamento de câncer e outros fármacos, incluindo agentes uados em quimioterapia; e certos fármacos como orlistat, que inibe a absorção de gordura.

Colite ulcerativa é marcada por diarreia sanguinolenta crônica e inflamação afeta principalmente o cólon distai próximo ao reto. Doença de Crohn tipicamente afeta segmentos razoavelmente bem demarcados do intestino no cólon e geralmente afeta o fim do intestino delgado.

Outra causa de diarreia é síndrome do intestino irritável (IBS) que geralmente se apresenta com desconforto abdominal aliviado por defe- cação e fezes não usuais (diarreia ou constipação) por pelo menos 3 dias por semana no período de 3 meses. Os sintomas de IBS predominante em diarreia podem ser gerenciados através de uma combinação de alterações da dieta, suplementos de fibra solúvel, e/ou medicações como loperamida ou codeína. Cerca de 30% dos pacientes com IBS com predominância de diar- reia têm má absorção de ácido biliar diagnosticado com teste SeHCAT a- normal.

Outras causas de diarreia são ingestão crônica de etanol, doença intestinal isquêmica, colite microscópica, má absorção de sal biliar (diarreia de ácido biliar primária) onde os ácidos biliares excessivos no cólon produzem uma diarreia secretária, tumores secretadores de hormônio (alguns hormônios (por exemplo, serotonina) podem causar diarreia se excretado em excesso (geralmente de um tumor)).

As medicações como loperamida (Imodium) e subsalicitado de bismuto podem ser benéficas no tratamento de algumas condições de diarreia, no entanto, podem ser contraindicados em determinadas situações.

Enquanto antibióticos são benéficos em certos tipos de diarreia aguda, são geralmente não usados exceto em situações específicas. De fato, antibióticos podem causar diarreia e diarreia associada a antibiótico é o efeito adverso mais comum do tratamento com antibióticos gerais.

Compostos de bismuto como em (Pepto-Bismol) podem ser u- sados para tratar as condições de diarreia. Ainda, agentes anti motilidade podem ser usados para tratar algumas condições diarreicas. Estes incluem loperamida. Codeína é algumas vezes usada no tratamento de diarreia para reduzir a peristalsia e a passagem de material fecal através dos intestinos. Ainda, sequestradores de ácido biliar como colestiramina, colestipol e cole- sevelam podem ser efetivos em diarreia crônica devido à má absorção de ácido biliar.

Suplementação com zinco pode ser usada para tratar algumas condições de diarreia crônica. Probióticos podem às vezes ser usados para reduzir a duração dos sintomas.

Como mencionado, um segundo tipo de diarreia é diarreia aguda. A causa mais comum de diarreia aguda é infecção virai, bactéria e parasitica. As bactérias ainda podem causar intoxicação alimentar aguda. Uma terceira causa importante de diarreia aguda é iniciando uma nova medicação.

Outras causas específicas de diarreia aguda incluem gastroente- rite viral que é a causa mais comum de diarreia aguda em todo o mundo. Gastroenterite viral pode ocorrer em uma forma esporádica (em um indivíduo único) ou em uma forma epidêmica (entre grupos de indivíduos). Diarreia esporádica provavelmente é causada por vários diferentes vírus e acredita- se que seja espalhado por contato entre pessoas. A causa mais comum de diarreia epidêmica (por exemplo, em navios de cruzeiros) é infecção com uma família de vírus conhecidos como calicivírus dos quais o gênero norovirus é a causa mais comum (por exemplo, "agente Norwalk"). Os calicivírus são transmitidos por alimento que é contaminado por manipuladores de alimentos doentes ou por contato entre pessoas.

Outra causa de diarreia aguda é intoxicação alimentar causada por toxinas produzidas por bactérias. As toxinas causam dor abdominal (cólicas) e vômitos e ainda causam o intestino delgado para secretar grandes quantidades de água que levam à diarreia. Os sintomas de intoxicação alimentar geralmente duram menos do que 24 horas. Com algumas bactérias, as toxinas são produzidas nos alimentos antes de serem ingeridos, enquanto com outras bactérias as toxinas são produzidas no intestino após o alimento ser ingerido.

Staphylococcus aureus é um exemplo de uma bactéria que produz toxinas em alimentos antes de serem ingeridos. Tipicamente, alimento contaminado com Staphylococcus (como salada, carne ou sanduíches com maionese) é deixado sem refrigeração em temperatura ambiente durante a noite. As bactérias Staphylococcal se multiplicam no alimento e produzem toxinas. Clostridium perfringens é um exemplo de uma bactéria que se multiplica em alimentos (geralmente alimentos enlatados), e produz toxinas no intestino delgado após o alimento contaminado ser ingerido.

Outra causa de diarreia aguda é diarreia do viajante geralmente causada por cepas patogênicas em bactérias E. coli. Ocasionalmente, outras bactérias ou parasitas podem causar diarreia em viajantes (por exemplo, Shigella, Giardia, Campylobacter). A diarreia causada por estes outros organismos geralmente dura mais do que 3 dias.

Já outra causa de diarreia aguda é enterocolite bacteriana que ocorre quando as bactérias que causam diarreia geralmente invadem os in-testinos delgados e cólon e causam enterocolite (inflamação do intestino delgado e cólon). Enterocolite bacteriana é caracterizada por sinais de inflamação (sangue ou pus nas fezes, febre) e dor abdominal e diarreia. Campylobacter jejuni é a bactéria mais comum que causa enterocolite aguda nos EUA. Outras bactérias que causam enterocolite incluem Shigella, Salmonella, e EPEC. Estas bactérias geralmente são adquiridas por ingestão de água contaminada ou ingerindo alimentos contaminados como vegetais, aves doméstica, e laticínios.

Enterocolitis causada pela bactéria Clostridium difficile é geral- mente causadas por tratamento antibiótico. Clostridium difficile é ainda a infecção nosocomial mais comum (infecção adquirida enquanto no hospital) por causar diarreia. Infelizmente, a infecção ainda está crescendo entre os indivíduos que tão tomara antibióticos ou estiveram no hospital.

Outra causa de diarreia é E. coli O157:H7 que é uma cepa de E. coli que produz uma toxina que causa enterocolite hemorrágica (enterocolite com sangramento). Houve um surto de enterocolite hemorrágica nos EUA rastreado até carne moída contaminada em hambúrgueres (por isso foi chamada de colite do hambúrguer). Aproximadamente 5% dos pacientes infectados com E. coli O157:H7, particularmente crianças, podem desenvolver síndrome urêmica hemolítica (HUS), uma síndrome que pode levar a falência renal. Algumas evidências sugerem que o uso prolongado de agentes antidiarreia ou uso de antibióticos podem aumentar a chance de desenvolver HUS.

Ainda outra causa de diarreia aguda é a infecção por parasita, mais comum fora dos EUA. Por exemplo, infecção com Giardia lamblia ocorre entre indivíduos que visitam montanhas ou viajam para fora e é transmitida por água potável contaminada. Criptosporidium é outro parasita que produz diarreia que é tipicamente disseminado por água contaminada.

Já outra causa de diarreia aguda é diarreia induzida por fárma- co. As medicações que mais frequentemente causam diarreia são antiácidos e suplementos nutricionais que contêm magnésio. Outras classes de medicação que causam diarreia incluem: fármacos anti-inflamatórios não esteroi- dais (NSAIDs), medicamentos de quimioterapia , antibióticos, medicamentos para controlar frequências cardíacas irregulares (antiarrítmicos), e medicamentos para pressão arterial, misoprostol (Cytotec), quinidina (Quinaglute, Quinidex), olsalazina (Dipentum), colchicina (Colchicine), metoclopramida (Reglan), e cisaprida (Propulsid, Motilium).

Causas comuns de diarreia crônica incluem síndrome do intestino irritável. Doenças infecciosas como Giardia lamblia, infecção por AIDS, supercrescimento bacteriano do intestino delgado, diarreia pós-infecção em que os indivíduos após infecções por vírus, bactérias ou parasitas desenvolvem diarreia crônica (ainda referenciada como uma IBS pós-infecção), doença intestinal inflamatória (IBD), Doença de Crohn e colite ulcerativa, e outras doenças que causam inflamação do intestino delgado e/ou cólon, co- mumente causam diarreia crônica, câncer de cólon, particularmente na parte distal do cólon, pode levar a fezes finas. Constipação grave, carboidrato (a- çúcar) má absorção, como deficiência de (também conhecida como lactose ou intolerância ao leite), má absorção de gordura, pancreatite ou câncer pancreático, doenças do revestimento do intestino delgado que previne a absorção de gordura digerida como doença celíaca, doenças endócrinas como hipertiroidismo ou em uma glândula adrenal ou pituitária subativa (doença de Addinson) e abuso de laxantes.

Ambas a diarreia aguda e a crônica podem envolver complicações adversas incluindo desidratação resultante de uma perda excessiva de fluidos e eletrólitos do corpo devido à diarreia. A desidratação é comum entre pacientes adultos com diarreia aguda que têm grandes quantidades de fezes, particularmente quando a ingesta de fluidos é limitada por letargia ou é associada com náusea e vômito e é comum em crianças e jovens que desenvolvem gastroenterite virai ou infecção bacteriana.

Desidratação moderada a grave pode causar hipotensão ortostá- tica com sincope (desmaios quando de pé devido a um volume reduzido de sangue, que causa uma queda na pressão quando de pé), uma produção diminuída de urina, fraqueza grave, choque, falência renal, confusão, acido- se (muito ácido no sangue), e até coma.

Eletrólitos (minerais) são ainda perdidos com água quando a diarreia é prolongada ou grave, e deficiências minerais ou em eletrólitos podem ocorrer. As deficiências mais comuns ocorrem com sódio e potássio. Anormalidades de cloreto e bicarbonato podem ainda se desenvolver. Finalmente, pode haver irritação no ânus devido à passagem frequente de fezes aquosas contendo substâncias irritantes.

Assim, um método eficaz de prevenir ou tratar formas diferentes de diarreia como são descritos acima, e em particular diarreia aguda ou crônica poderia ser benéfico.

Ao longo destas linhas, a presente invenção fornece métodos e medicamentos para tratar ou prevenir diarreia associada com CGRP com-preendendo a administração de pelo menos um polipeptídeo que se liga a CGRP ou ao receptor de CGRP e/ou um polipeptídeo que inibe a interação de CGRP/receptor CGRP. Estes polipeptídeos incluem anticorpos anti- CGRP ou antirreceptor CGRP e fragmentos de anticorpo, e fragmentos ou variantes de CGRP ou o receptor de CGRP que inibe a interação de C- GRP/receptor CGRP. Estas terapias efetivamente tratam ou previnem a diarreia, especialmente diarreia que ocorre como resultado de condições de doença ou tratamentos associados com níveis aumentados de CGRP, por e- xemplo, níveis aumentados no sistema gastrointestinal e mais particularmente no cólon.

A invenção, em particular, refere-se aos métodos para inibir, prevenir ou tratar diarreia e/ou manter equilíbrio de eletrólitos e níveis de fluido no cólon de um sujeito contendo uma condição (por exemplo, condição gastrointestinal, câncer, distúrbio virai ou infeccioso) ou tratamentos associados com níveis elevados de CGRP (como radiação ou quimioterapia) que resultam em diarreia e/ou fluxo aumentado de eletrólitos e fluidos do cólon compreendendo administrar uma quantidade efetiva de um anticorpo anti- CGRP ou fragmento de anticorpo anti-CGRP. Estas condições incluem por meio de exemplo, distúrbios intestinais funcionais e doenças intestinais inflamatórias, diarreia induzida por bactérias ou vírus, radiação e quimioterapi- as e mais especificamente distúrbios intestinais funcionais selecionados do grupo que consiste em refluxo gastroesofágico, dispepsia, síndrome do intestino irritável, síndrome de dor abdominal funcional, diverticulose, e diverti- culite, doenças intestinais inflamatórias selecionadas do grupo que consiste em Doença de Crohn, ileíte, colite colagenosa, colite linfocítica, e colite ulce- rativa, e cânceres associadas com diarreia como carcinoma de tireoide medular, e câncer colorretal.

A invenção ainda se refere aos métodos de triar anticorpos e fragmentos dos mesmos (incluindo fragmentos Fab) tendo especificidade de ligação ao Peptídeo Relacionado ao Gene de Calcitonina (doravante "C- GRP") ou o receptor de CGRP ou que inibe a interação CGRP/receptor C- GRP em modelos animais para determinar os efeitos in vivo dos mesmos, especialmente suas capacidades de antagonizar os efeitos colaterais adversos de CGRP e para tratar ou prevenir diarreia em condições ou tratamentos envolvendo excesso de CGRP.

Ainda, a invenção envolve um método para avaliar o potencial de eficácia in vivo de um anticorpo anti-CGRP candidato ou fragmento de anticorpo ou outro polipeptídeo que inibe a interação de CGRP/receptor CGRP para tratar ou prevenir diarreia compreendendo determinar se o anticorpo ou outro polipeptídeo inibe diarreia em um roedor administrado CGRP exógeno comparado a um roedor administrado com CGRP na ausência do anticorpo CGRP candidato ou fragmento de anticorpo outro inibidor de polipeptídeo.

Ainda, a invenção envolve um método para administrar um anticorpo anti-CGRP ou antirreceptor CGRP ou fragmento de anticorpo ou outro polipeptídeo que inibe a interação de CGRP/receptor CGRP para tratar condições de dor e neurológicas caracterizadas por níveis aumentados de C- GRP que são associados com diarreia.

Ainda, a invenção se refere aos medicamentos para tratar uma condição associada com diarreia selecionada de refluxo gastroesofágico, dispepsia, síndrome do intestino irritável, síndrome de dor abdominal funcional, diverticulose, diverticulite, Doença de Crohn, ileíte, colite colagenosa, colite linfocítica, e colite ulcerativa, carcinoma de tireoide medular ou um câncer colorretal.

Ainda, a invenção refere-se aos métodos para avaliar baseado em resultados em um modelo de animal de CGRP em roedor uma dosagem terapêutica apropriada ou regime de dosagem do anticorpo candidato ou fragmento de anticorpo em humanos para prevenir ou tratar diarreia associada a CGRP.

Ainda, a invenção refere-se às composições para inibir, prevenir ou tratar diarreia e/ou manter equilíbrio de eletrólitos e níveis de fluidos no cólon de um sujeito contendo uma condição associada com níveis elevados de CGRP que resultam em diarreia e/ou fluxo aumentado de eletrólitos e fluidos do cólon compreendendo uma quantidade efetiva de um anticorpo anti-CGRP ou antirreceptor CGRP ou fragmento de anticorpo anti-CGRP ou antirreceptor CGRP e opcionalmente outro agente ativo.

Relacionados a estes, a invenção especificamente refere-se às composições para tratar ou prevenir distúrbios intestinais funcionais ou doenças intestinais inflamatórias, diarreia induzida por bactéria ou vírus, câncer associado com diarreia, como carcinoma de tireoide medular ou um câncer colorretal, e distúrbios intestinais funcionais ou doenças intestinais inflamatórias, incluindo, entre outras, refluxo gastroesofágico, dispepsia, síndrome do intestino irritável, síndrome de dor abdominal funcional, diverticulose, e diver- ticulite ou doença intestinal inflamatória é selecionada do grupo que consiste em Doença de Crohn, ileíte, colite colagenosa, colite linfocítica, e colite ulcerativa em que estas terapias administram uma quantidade efetiva de um anticorpo anti-CGRP ou fragmento de anticorpo que é administrado como uma monoterapia ou em combinação com outro agente ativo. .

Em modalidades preferenciais a presente invenção é dirigida ao uso terapêutico de anticorpos específicos e fragmentos dos mesmos para tratamento ou prevenção da diarreia em doenças ou tratamentos associados com níveis aumentados de CGRP, ditos anticorpos ou fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação para CGRP, em particular, anticorpos contendo especificidade epitópica desejada, propriedades de alta afinidade ou avidez e/ou funcionais. Em outras modalidades preferenciais esta invenção se refere aos ensaios e usos de anticorpos descritos aqui, compreendendo as sequências de polipeptídeos VH, VL e CDR descrias aqui, e os po- linucleotídeos que codificam os mesmos. Uma modalidade preferencial da invenção é direcionada para anticorpos quiméricos ou humanizados e fragmentos dos mesmos (incluindo fragmentos Fab) capazes de se ligar ao C- GRP e/ou inibir as atividades biológicas mediadas pela ligação de CGRP ao receptor de CGRP ("CGRP-R").

Em outra modalidade preferencial da invenção, os ensaios e terapias usam anticorpos completos e fragmentos Fab dos mesmos para tratamento ou prevenção de diarreia em doenças ou condições resultando em níveis aumentados de CGRP que inibem a produção de cAMP direcionada por CGRP-alfa-, CGRP-beta-, e CGRP de rato. Em outra modalidade preferencial da invenção, Fab completos e fragmentos dos mesmos são contemplados que reduzem a vasodilatação em um receptor após administração.

Em outra modalidade da invenção, anticorpos quiméricos e hu-manizados e fragmentos dos mesmos (incluindo fragmentos Fab) capazes de ligação ao CGRP ou ao receptor de CGRP são úteis nos métodos direcionados para reduzir, tratar ou prevenir diarreia em doenças ou condições resultando em níveis aumentados de CGRP como enxaquecas (com ou sem aura), câncer ou tumores, angiogênese associada com câncer ou crescimento de tumor, angiogênese associada com câncer ou sobrevida de tumor, perda de peso, dor, enxaquecas hemiplágicas, dores de cabeça histamíni- cas, neuralgia enxaquecosa, dores de cabeça crônicas, dores de cabeça de tensão, dores de cabeça gerais, fogachos, hemicrania paroxisomal crônica, dores de cabeça secundárias devido a problema estrutural subjacente na cabeça e pescoço, neuralgia cranial, dores de cabeça dos seios nasais (como, por exemplo, associada com sinusite), e dores de cabeça induzidas por alergia ou enxaquecas.

Em outra modalidade da invenção, anticorpos quiméricos e hu-manizados e fragmentos dos mesmos (incluindo fragmentos Fab) capazes de se ligarem a CGRP são úteis nos métodos direcionados para reduzir, tra- tar ou prevenir diarreia e dor visceral associada com refluxo gastroesofágico, dispepsia, síndrome do intestino irritável, doença intestinal inflamatória, Doença de Crohn, ileíte, colite ulcerativa, cólica renal, dismenorreia, cistite, período menstrual, parto, menopausa, prostatite, ou pancreatite.

Em outra modalidade da invenção estes anticorpos e versões humanizadas para tratamento ou prevenção de diarreia em doenças ou condições resultando em níveis aumentados de CGRP podem ser derivados de células imunes de coelho (linfócitos B) e podem ser selecionados baseado em suas homologias (identidade de sequência) às sequências de linhagem germinativa humana. Estes anticorpos podem requerer modificação de sequência ou mínima ou nenhuma, assim, facilitando a retenção de propriedades funcionais após a humanização. Outra modalidade da invenção é direcionada aos fragmentos de anticorpos anti-CGRP incluindo polipeptídeos VH, VL e CDR, por exemplo, derivados de células imunes de coelhos e os poli- nucleotídeos que codificam os mesmos, bem como o uso destes fragmentos de anticorpo e os polinucleotídeos que codificam os mesmos na criação de novos anticorpos e composições de polipeptídeos capazes de se ligarem a CGRP e/ou complexos CGRP/CGRP-R para tratamento ou prevenção de diarreia em doenças ou condições resultando em níveis aumentados de CGRP.

A invenção ainda contempla conjugados de anticorpos anti- CGRP e fragmentos de ligação aos mesmos conjugados a uma ou mais frações funcionais ou detectáveis para tratamento ou prevenção de diarreia em doenças ou condições resultando em níveis aumentados de CGRP. A invenção ainda contempla métodos para preparar ditos anticorpos complexos quiméricos ou humanizados anti-CGRP ou anti-CGRP/CGRP-R e fragmentos de ligação aos mesmos para tratamento ou prevenção de diarreia em doenças ou condições resultando em níveis aumentados de CGRP. Em uma modalidade, fragmentos de ligação incluem, entre outros, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, SMIPs (imunofármacos moléculas pequenas), camelbodies, nanobodies, e IgNAR.

Modalidades da invenção pertencem ao uso de anticorpos anti- CGRP e fragmentos de ligação aos mesmos para o diagnóstico, avaliação e tratamento de doenças e distúrbios com CGRP ou expressão anormal do mesmo que resulta em diarreia devido aos níveis aumentados de CGRP. A invenção ainda contempla o uso de fragmentos de anticorpos anti-CGRP para o diagnóstico, avaliação e tratamento de doenças e distúrbios associados com CGRP ou expressão anormal do mesmo como doenças ou condições em que os níveis aumentados de CGRP no intestino resultam em diarreia. Outras modalidades da invenção referem-se à produção de anticorpos anti-CGRP ou fragmentos dos mesmos em células hospedeiras recombinan- tes, por exemplo, células mamíferas como células CHO, NSO ou HEK 293, ou células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploi- de) e outras cepas de leveduras.

BREVE DESCRIÇÃO DAS VÁRIAS VISTAS DO8 DESENHOS

Figura 1 fornece sequências de polinucleotídeo e de polipeptí- deos correspondendo ao Anticorpo completo Ab1.

Figura 2 fornece sequências de polinucleotídeo e de polipeptí- deos correspondendo ao Anticorpo completo Ab2.

Figura 3 fornece sequências de polinucleotídeo e de polipeptí- deos correspondendo ao Anticorpo completo Ab3.

Figura 4 fornece sequências de polinucleotídeo e de polipeptí- deos correspondendo ao Anticorpo completo Ab4.

Figura 5 fornece sequências de polinucleotídeo e de polipeptí- deos correspondendo ao Anticorpo completo Ab5.

Figura 6 fornece sequências de polinucleotídeo e de polipeptí- deos correspondendo ao Anticorpo completo Ab6.

Figura 7 fornece sequências de polinucleotídeo e de polipeptí- deos correspondendo ao Anticorpo completo Ab7.

Figura 8 fornece sequências de polinucleotídeo e de polipeptí- deos correspondendo ao Anticorpo completo Ab8.

Figura 9 fornece sequências de polinucleotídeo e de polipeptí- deos correspondendo ao Anticorpo completo Ab9.

Figura 10 fornece sequências de polinucleotídeo e de polipeptí- deos correspondendo ao Anticorpo completo Ab10.

Figura 11 fornece sequências de polinucleotídeo e de polipeptídeos correspondendo ao Anticorpo completo Ab11.

Figura 12 fornece sequências de polinucleotídeo e de polipeptídeos correspondendo ao Anticorpo completo Ab12.

Figura 13 fornece sequências de polinucleotídeo e de polipeptídeos correspondendo ao Anticorpo completo Ab13.

Figura 14 fornece sequências de polinucleotídeo e de polipeptídeos correspondendo ao Anticorpo completo Ab14.

Figura 15 fornece os dados de ligação de CGRP-alfa ELISA obtidos seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra para os anticorpos Ab1, Ab2, Ab3, e Ab4.

Figura 16 fornece os dados de ligação de CGRP-alfa ELISA obtidos seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra para os anticorpos Ab5, Ab6, Ab7, e Ab8.

Figura 17 fornece os dados de ligação de CGRP-alfa ELISA obtidos seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra para os anticorpos Ab9, Ab10, e Ab14.

Figura 18 fornece os dados de ligação a CGRP-alfa ELISA obtidos seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra para os anticorpos Ab11, Ab12, e Ab13.

Figura 19 demonstra a inibição de produção de cAMP direcionada por CGRP-alfa por anticorpos Ab1, Ab2, e Ab4, obtida seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.

Figura 20 demonstra a inibição de produção de cAMP direcionada por CGRP-alfa pelo anticorpo Ab3, obtida seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.

Figura 21 demonstra a inibição de produção de cAMP direcionada por CGRP-alfa por anticorpos Ab5 e Ab6, obtida seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.

Figura 22 demonstra a inibição de produção de cAMP direcionada por CGRP-alfa por anticorpos Ab7, Ab8, Ab9, e Ab10, obtida seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.

Figura 23 demonstra a inibição de produção de cAMP direcionada por CGRP-alfa por anticorpos Ab11, Ab12, e Ab13, obtida seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.

Figura 24 demonstra a inibição de produção de cAMP direcionada por CGRP-alfa pelo anticorpo Ab14, obtida seguindo o protocolo no E- xemplo 1 infra.

Figura 25 demonstra a inibição de produção de cAMP direcionada por CGRP-beta por anticorpos Ab1, Ab2, e Ab3, obtida seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.

Figura 26 demonstra a inibição de produção de cAMP direcionada por CGRP-beta por anticorpos Ab4, Ab5, e Ab6, obtida seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.

Figura 27 demonstra a inibição de produção de cAMP direcionada por CGRP-beta por anticorpos Ab7 e Ab8, obtida seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.

Figura 28 demonstra a inibição de produção de cAMP direcionada por CGRP-beta por anticorpos Ab9, Ab10, e Ab14, obtida seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.

Figura 29 demonstra a inibição de produção de cAMP direcionada por CGRP-beta por anticorpos Ab11, Ab12, e Ab13, obtida seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.

Figura 30 demonstra a inibição de produção de cAMP direcionada por CGRP de rato por anticorpos Ab1, Ab2, Ab4, e Ab5, obtida seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.

Figura 31 demonstra a inibição de produção cAMP direcionada por CGRP de rato por anticorpos Ab3 e Ab6, obtida seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.

Figura 32 demonstra a inibição de produção de cAMP direcionada por CGRP de rato por anticorpos Ab7 e Ab8, obtida seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.

Figura 33 demonstra a inibição de produção de cAMP direciona- da por CGRP de rato pelo anticorpo Ab9, obtida seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.

Figura 34 demonstra a inibição de produção de cAMP direcionada por CGRP de rato pelo anticorpo Ab10, obtida seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.

Figura 35 demonstra a inibição de produção de cAMP direcionada por CGRP de rato por anticorpos Ab11 e Ab12, obtida seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.

Figura 36 demonstra a inibição de produção de cAMP direcionada por CGRP de rato pelo anticorpo Ab13, obtida seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.

Figura 37 demonstra a inibição de produção de cAMP direcionada por CGRP de rato pelo anticorpo Ab14, obtida seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.

Figura 38 demonstra a inibição de ligação de CGRP radiomar- cado para CGRP-R por anticorpos Ab1-Ab13, obtida seguindo o protocolo no Exemplo 6 infra.

Figura 39 demonstra uma redução em vasodilatação obtida por administração de anticorpos Ab3 e Ab6 após administração de capsaicina em um modelo de rato, em relação ao anticorpo controle, obtida seguindo o protocolo no Exemplo 7 infra.

Figura 40 demonstra uma redução em vasodilatação obtida por administração de anticorpo Ab6 em diferentes concentrações após administração de capsaicina em um modelo de rato, em relação ao anticorpo controle, obtida seguindo o protocolo no Exemplo 7 infra.

Figura 41 contém os resultados dos experimentos em que os e- feitos de CGRP em camundongos transgênicos Nestin/hRampl foram avaliados. Os dados mostram que administração de CGRP-alfa de rato induziu diarreia em camundongos Nestin/hRAMPI tg e que a injeção intra peritoneal de Ab3 (30mgs/kg, ~24 h antes do desafio CGRP) inibe injetado intra cere- broventricular (ICV), CGRP-alfa de rato induziu diarreia em camundongos Nestin/hRAMPI tg.

Figura 42 contém os resultados dos experimentos que mostram que a injeção intra cerebroventricular (ICV) de CGRP-alfa humano induz diarreia em um modo dose dependente em camundongos C57BL/6J.

Figura 43 contém os resultados de experimentos que mostram que injeção intraperitoneal de Ab3 (30mgs/kg ip, ~24 h antes de desafio com CGRP-alfa humano) inibe diarreia induzida por CGRP-alfa humano injetado ICV em camundongos C57/BL6J.

Figura 44 contém os resultados de experimentos que mostram que Ab3 (30mgs/kg ip, ~24 h antes de desafio com CGRP-alfa humano) inibe diarreia induzida por CGRP-alfa humano injetado IP em camundongos C57/BL6J.

FIG. 45 mostra prevenção de diarreia induzida por CGRP por Ab3 e Ab6 (ambos administrados a 10 mg/kg). Animais de controle negativo (tratados com anticorpo de controle e solução salina tamponada com fosfato, barra da esquerda) não apresentaram diarreia, e 80% dos animais controle positivos (tratados com CGRP e um anticorpo de controle negativo, barra cheia) apresentaram diarreia. Administração de Ab3 (barra de listas diagonais) e Ab6 (barras de listas invertidas) reduziu a incidência de diarreia a 40% e 60%, respectivamente.

FIGURA 46 mostra peso fecal bruto resultando de diarreia induzida por CGRP para o experimento mostrado na FIGURA 45. Peso fecal bruto foi enormemente aumentado por administração de CGRP (segunda barra) comparado aos animais de controle negativo (primeira barra). No entanto, animais tratados com Ab3 e Ab6 apresentaram peso fecal bruto enormemente reduzido (terceira e quarta barras, respectivamente). Os valores mostrados são a média de todos os animais em cada grupo de teste mais ou menos erro padrão da média (SEM).

FIGURA 47 confirma a prevenção de diarreia induzida por C- GRP por Ab3 e Ab6 em outro experimento (ambos os anticorpos administrados a 30 mg/kg). Diarreia foi ausente em animais controle negativo (tratados com um anticorpo controle e solução salina tamponada com fosfato, primeira barra), mas observada em 80% dos animais controles positivos (segunda barra, cheia). Incidência de diarreia foi reduzida a 20% e 40%, respectivamente por Ab3 (terceira barra, listras diagonais) e Ab6 (quarta barra, linhas invertidas).

FIGURA 48 mostra peso fecal bruto resultando de diarreia induzida por CGRP para o experimento mostrado na FIG. 47. Peso fecal bruto foi enormemente aumentado por administração de CGRP (segunda barra, chei- a) comparado aos animais de controle negativo (primeira barra, não cheia). No entanto, animais tratados com Ab6 apresentaram peso fecal bruto enormemente reduzido (quarta barra, quadriculada), e animais tratados com Ab3 (terceira barra, linhas invertidas) apresentaram peso fecal médio comparável aos animais de controle negativo (barra da esquerda, não cheia). Os valores mostrados são a média de todos os animais em cada grupo de teste mais ou menos erro padrão da média (SEM).

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERENCIAIS Definições

É entendido que esta invenção não é limitada à metodologia particular, protocolos, linhagens celulares, espécies animais ou gêneros, e reagentes descritos como tal podem, claro, variar. Deve ainda ser entendido que a terminologia usada aqui tem a finalidade de descrever modalidades particulares apenas, e não pretende limitar o escopo da presente invenção que será limitado apenas pelas reivindicações anexas. Como usado, as formas singular "um""uma", "o" e "a" incluem os plurais referentes salvo se o contexto claramente indicar de outra forma. Assim, por exemplo, a referência a "uma célula" inclui uma pluralidade de ditas células e a referência a "a proteína" inclui referência a uma ou mais proteínas e equivalentes das mesmas conhecidas aos especialistas na técnica, e assim por diante. Todos os termos científicos e técnicos usados aqui têm o mesmo significado como co- mumente entendido por um especialista na técnica a que pertence esta in-venção, salvo se o indicado claramente de outra forma.

Peptídeo Relacionado ao Gene Calcitonina (CGRP): Como usado aqui, CGRP inclui não somente as seguintes sequências de aminoácidos CGRP-alfa Homo sapiens e CGRP-beta amino Homo sapiens disponíveis de

American Peptides (Sunnyvale CA) e Bachem (Torrance, CA):

CGRP-alfa: ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGWKNNFVPTNVGS KAF-NH2 (SEQ ID NO: 281), em que N-terminal fenilalanina é amidada;

CGRP-beta: ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGS KAF-NH2 (SEQ ID NO: 282), em que N-terminal fenilalanina é amidada; mas ainda qualquer forma ligada à membrana destas sequências de aminoácidos CGRP, bem como mutantes (mutiens), variantes splice, isoformas, ortólogos, homólogos e variantes desta sequência. Em particular CGRP aqui inclui CGRPs de roedores e sequências CGRP de outros mamíferos.

"Receptor CGRP" aqui inclui todos os receptores endógenos que são especificamente ligados por CGRP, incluindo CGRP humanos e de roedores e outros CGRP de mamíferos. Assim como "receptor de CGRP" inclui mutantes (mutiens), variantes splice, isoformas, ortólogos, homólogos, fragmentos e variantes de receptores CGRP que são especificamente ligados por CGRP. Em particular receptor de CGRP aqui inclui receptores CGRP de humanos, ratos, murinos, e primatas não humanos e sequências de receptor de CGRP de outros mamíferos.

"Inibidor de CGRP/receptor CGRP" aqui refere-se a uma molécula, preferencialmente um polipeptídeo como um anticorpo ou fragmento de anticorpo que inibe a interação de CGRP e seu receptor. Exemplos não limi- tantes dos mesmos incluem anticorpos e fragmentos de anticorpo que especificamente se ligam a CGRP ou o receptor de CGRP e fragmentos de C- GRP ou o receptor de CGRP.

"Diarreia"refere-se a um aumento na frequência de evacuações ou uma redução na forma de fezes (maior frouxidão de fezes). Embora alterações na frequência de evacuações e frouxidão das fezes possam variar independentemente de cada outro, alterações geralmente ocorrem em ambos. A diarreia precisa ser distinguida de quatro outras condições. Embora estas condições possam acompanhar a diarreia, geralmente têm diferentes causas e diferentes tratamentos além da diarreia. Estas outras condições são: incontinência de fezes, que é uma incapacidade de controlar (atrasar) evacuações até um tempo apropriado, por exemplo, até chegar ao banheiro, urgência retal, que é uma vontade súbita de ter uma evacuação que é tão forte que se não houver um banheiro imediatamente disponível haverá incontinência, evacuação incompleta, que é uma sensação que outra evacuação é necessária logo após uma evacuação, já que já uma dificuldade de passar mais fezes no segundo momento, e evacuações imediatamente após fazer uma refeição.

A diarreia pode ser definida em termos absolutos ou relativos baseado na frequência das evacuações ou a consistência (frouxidão) de fezes.

Frequência de evacuações. Diarreia absoluta é ter mais evacuações do que o normal. Assim, uma vez que entre indivíduos saudáveis o número máximo de evacuações diários é aproximadamente três, a diarreia pode ser definida como qualquer número de fezes maior do que três. Diarreia relativa é ter mais evacuações do que o usual. Assim, se um indivíduo que geralmente tem uma evacuação por dia começa a ter duas evacuações a cada dia, então a diarreia está presente, mesmo embora não haja mais do que três evacuações por dia, ou seja, não há diarreia absoluta.

Consistência das fezes. Diarreia absoluta é mais difícil de definir com base na consistência de fezes por que a consistência das fezes pode variar consideravelmente em indivíduos saudáveis dependendo de suas dietas. Assim, indivíduos que comem grandes quantidades de vegetais irão ter fezes mais soltas do que indivíduos que comem poucos vegetais. As fezes que são líquidas ou aquosas são sempre anormais e consideradas diarrei- cas. A diarreia relativa é mais fácil de definir baseado na consistência de fezes. Assim, um indivíduo que desenvolve fezes mais soltas do que o usual tem diarreia, muito embora as fezes possam estar na faixa de normal com relação à consistência.

Diarreia geralmente é dividida em dois tipos, aguda e crônica. Diarreia aguda dura de alguns dias até uma semana. Diarreia crônica pode ser definida de várias formas mas quase sempre dura mais do que três semanas. Diarreia aguda e crônica geralmente têm diferentes causas, requerem diferentes testes de diagnóstico e geralmente envolvem diferentes tra- tamentos.

"Tratamento ou prevenção de diarreia induzida por CGRP" significa que o tratamento, por exemplo, administração de um anticorpo anti- CGRP ou fragmento efetivamente inibe ou trata diarreia e/ou mantém eletró- lito apropriado e níveis de fluidos no cólon de um sujeito em necessidade do mesmo relação ao sujeito não tratado.

"Diarreia induzida por CGRP ou diarreia associada a CGRP" re- fere-se a uma condição ou tratamento em níveis elevados de CGRP, especialmente no sistema gastrointestinal e especialmente no cólon que resulta em um ou mais de excreção aumentada de fluido do cólon, equilíbrio de ele- trólito comprometido e uma ou mais de evacuações aquosas (diarreia).

"Tratamentos que resultam em diarreia associada a CGRP" aqui se referem a qualquer tratamento para uma condição de doença, por exemplo, radiação, quimioterapia, terapia de fármaco que resulta em níveis aumentados de CGRP que são associados com diarreia.

"Doença ou condição associada a CGRP" é qualquer doença ou condição que é associada com níveis aumentados de CGRP em relação aos níveis de CGRP em indivíduos normais.

Espécies de levedura competentes para reprodução: Na presente invenção pretende-se amplamente incluir qualquer levedura diploide ou tetraploide que pode ser cultivada em cultura. Ditas espécies de leveduras podem existir em uma forma haploide, diploide, ou outra poliploide. As células de dada ploidia podem, em condições apropriadas, se proliferar para um número indefinido de gerações naquela forma. Células diploides podem ainda esporular para formar células haploides. Reprodução sequencial pode resultar em cepas tetraploides por outra reprodução de cepas diploides. A presente invenção contempla o uso de levedura haploide, bem como células de leveduras diploides ou outras poliploides produzidas, por exemplo, por reprodução ou fusão de esferoplasto.

Em uma modalidade da invenção, a levedura de reprodução competente é um membro de família de Saccharomycetaceae, que inclui o gênero Arxiozyma\ Ascobotryozyma\ Cíteromyces', Debaryomyces', Dekkera', Eremotheciunr, Issatchenkia', Kazachstania', Kluyveromyces', Kodamaea', Lodderomyces', Pachysoleir, Pichia', Saccharomyces\ Saturnispora\ Tetrapi- sispora\ Torulaspora', Williopsis', e Zygosaccharomyces.Outros tipos de leveduras potencialmente úteis na invenção incluem Yarrowia', Rhodosporidi- um\ Candida', Hansenula', Filobasiunr, Spohdiobolo', Bullera', Leucosporidium e Filobasidella.

Em uma modalidade preferencial da invenção, levedura competente para reprodução é uma levedura competente do gênero Pichia. Em outra modalidade preferencial da invenção, levedura competente para reprodução do gênero Pichia é uma das seguintes espécies. Pichia pastoris, Pichia metanólica, e Hansenula polymorpha (Pichia angusta). Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, a levedura competente para reprodução do gênero Pichia é a espécie Pichia pastoris.

Célula de levedura haploide: Uma célula contendo uma única cópia de cada gene de seu complemento genômico normal (cromossômico).

Célula de levedura poliploide: Uma célula contendo mais do que uma cópia de seu complemento genômico normal (cromossômico).

Célula de levedura diploide: Uma célula contendo duas cópias (alelos) de essencialmente cada gene de seu complemento genômico normal, tipicamente formado pelo processo de fusão (reprodução) de duas células haploides.

Célula de levedura tetraploide: Uma célula contendo quatro cópias (alelos) de essencialmente cada gene de seu complemento genômico normal, tipicamente formado pelo processo de fusão (reprodução) de duas células diploides. Tetraploides podem conter dois, três, quatro, ou mais diferentes cassetes de expressão. Ditas tetraploides podem ser obtidas em S. cerevisiae por reprodução heterosseletiva homozigótica heterotálico a/a e alfa/alfa diploides e em Pichia por reprodução sequencial de haploides para obter diploides auxotróficos. Por exemplo, um haploide [met his] pode ser reproduzido com haploide [ade his] para obter diploide [his]; e um haploide [met arg] pode ser reproduzido com haploide [ade arg] para obter diploide [arg]; então o diploide [his] x diploide [arg] para obter o tetraploide prototrof.

Será entendido pelos especialistas na técnica que a referência aos benefícios e usos de células diploides pode ainda aplicar às células tetraploides.

Reprodução de levedura: O processo pelo qual duas células de leveduras haploides se fundem naturalmente para formar uma única célula de levedura diploide.

Meiose: O processo pelo qual uma célula de levedura diploide passa por divisão redutora para formar quatro produtos esporos haploides. Cada esporo pode então germinar e formar uma linhagem celular haploide crescendo vegetativamente.

Marcador selecionável: Um marcador selecionável é um gene ou fragmento de gene que confere um fenótipo de crescimento (características de crescimento físico) em uma célula que recebe aquele gene como, por exemplo, através de um evento de transformação. O marcador selecionável permite que a célula sobreviva e cresça em um meio de crescimento seletivo em condições em que as células que não recebem aquele gene marcador selecionável não podem crescer. Genes de marcadores selecionáveis caem em vários tipos, incluindo genes marcadores selecionáveis positivos como um gene que confere em uma célula resistência a um antibiótico ou outro fármaco, temperatura quando dois mutantes sensíveis à temperatura ("ts") são cruzados ou uma mutante ts é transformada; genes de marcadores selecionáveis negativos como um gene biossintético que confere em uma célula a capacidade de crescer em um meio sem um nutriente específico necessário por todas as células que não têm o gene biossintético ou um gene biossintético mutagenizado que confere em uma célula incapacidade para crescer por células que não têm o gene tipo selvagem; e semelhantes. Marcadores selecionáveis incluem, entre outros: ZEO; G418; LYS3; MET1; MET3a; ADE1; ADE3; URA3; e semelhantes.

Vetor de expressão: Estes vetores de DNA contêm elementos que facilitam a manipulação para a expressão de uma proteína estranha dentro da célula hospedeira alvo. Convenientemente, a manipulação de sequências e produção de DNA para transformação é primeiro realizada em um hospedeiro bacteriano, por exemplo, E. coli, e geralmente vetores irão incluir sequências para facilitar ditas manipulações, incluindo uma origem bacteriana de replicação e marcador de seleção bacteriano apropriado. Os marcadores de seleção codificam proteínas necessárias para a sobrevivência ou crescimento de células hospedeiras transformadas em um meio de cultura seletivo. As células hospedeiras não transformadas com o vetor contendo o gene de seleção não irão sobreviver no meio de cultura. Os genes de seleção típicos codificam as proteínas que (a) conferem resistência aos antibióticos ou outras toxinas, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis do meio complexo. Vetores exemplares e métodos para transformação de leveduras são descritos, por exemplo, em Burke, D., Dawson, D., & Stearns, T. (2000). Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. Plainview, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Vetores de expressão para uso nos métodos da invenção podem ainda incluir sequências específicas de levedura, incluindo um marcador au- toxtrófico selecionável ou de fármaco para identificar cepas de levedura transformadas. Um marcador de fármaco ainda pode ser usado para amplificar número de cópia do vetor em uma célula hospedeira de levedura.

A sequência de codificação de polipeptídeo de interesse é tipicamente operacionalmente ligada às sequências regulatórias de transcrição e tradução que fornecem a expressão do polipeptídeo em células de leveduras. Estes componentes vetores podem incluir, entre outros, um ou mais dos seguintes: um elemento potencializador, um promotor, e uma sequência de terminação de transcrição. As sequências para a secreção do polipeptídeo podem ainda ser incluídas, por exemplo, uma sequência sinal, e semelhantes. Uma origem de levedura de replicação é opcional, como vetores de expressão são geralmente integrados no genoma de levedura. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo de interesse é operacionalmente ligados, ou fundidos, às sequências que fornecem secreção otimizada do polipeptídeo de células diploides de leveduras.

Ácidos nucleicos são "operacionalmente ligados" quando colocados em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, DNA para uma sequência sinal é operacionalmente ligada ao DNA para um polipeptídeo se este é expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou potencializador é operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se esta afeta a transcrição da sequência. Geralmente, "operacionalmente ligado" significa que a sequência de DNA sendo ligada é contígua e, no caso de um líder secretor, contíguo e no quadro de leitura. No entanto, potencializadores não devem ser contíguos. A ligação pode ser obtida por ligação em sítios de restrição convenientes ou alternativamente via um método de PCR/recombinação familiar aos especialistas na técnica (GatewayR Technology; Invitrogen, Carlsbad California). Se ditos sítios não existem, os adaptadores de oligonucleotí- deos sintéticos ou ligantes podem ser usados de acordo com a prática convencional.

Promotores são sequências localizadas à montante (5') ao có- don de início de um gene estrutural (geralmente dentro de cerca de 100 a 1000 bp) que controlam a transcrição e tradução de sequências de ácido nucleico particulares às quais são operacionalmente ligadas. Ditos promotores caem em várias classes: promotores induzíveis, constitutivos, e reprimíveis (que aumentam os níveis de transcrição em resposta à ausência de um repressor). Promotores induzíveis podem iniciar níveis aumentados de transcrição de DNA sob seus controles em resposta à alguma alteração nas condições de cultura, por exemplo, a presença ou ausência de um nutriente ou uma alteração em temperatura.

O fragmento de promotor de levedura pode ainda servir como o sítio para recombinação homóloga e integração do vetor de expressão no mesmo sítio no genoma de levedura; alternativamente um marcador selecionável é usado como o sítio para recombinação homóloga. A transformação de Pichia é descrita em Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385.

Exemplos de promotores apropriados de Pichia incluem AOX1 e o promotor (Cregg et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:1316-1323); promotor ICL1 (Menendez et al. (2003) Yeast 20(13): 1097-108); promotor gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase (GAP) (Waterham et al. (1997) Gene 186(1):37-44); e promotor FLD1 (Shen et al. (1998) Gene 216(1):93-102). O promotor GAP é um promotor constitutivo forte e os promotores A0X1, e FLD1 são induzí- veis.

Outros promotores de leveduras incluem ADH1, álcool desidro- genase II, GAL4, PHO3, PHO5, Pyk, e promotores quiméricos derivados dos mesmos. Além disso, não promotores de leveduras podem ser usados na invenção como promotores de mamíferos, insetos, vegetais, répteis, anfíbios, virais, e de aves. Mais tipicamente, o promotor irá compreender um promotor de mamífero (potencialmente endógeno aos genes expressos) ou irão compreender um promotor de levedura ou virai que fornece transcrição eficiente em sistemas de leveduras.

Os polipeptídeos de interesse podem ser produzidos recombi- nantemente não somente diretamente, mas ainda como um polipeptídeo de fusão com um polipeptídeo heterólogo, por exemplo, uma sequência sinal ou outro polipeptídeo contendo um sítio de clivagem específico em N-terminal da proteína ou polipeptídeo maduro. Em geral, a sequência sinal pode ser um componente do vetor, ou este pode ser parte da sequência de polipeptídeo de codificação que é inserida no vetor. A sequência sinal heteróloga selecionada preferencialmente é uma que é reconhecida e processada através de uma das vias padrões disponíveis dentro da célula hospedeira. O sinal pré-pró de fator alfa de S. cerevísíae demonstrou ser efetivo na secreção de uma variedade de proteínas recombinantes de P. pastoris. Outras sequências sinais de levedura incluem a sequência sinal de fator alfa de reprodução, a sequência sinal de invertase, e sequências sinais derivadas de outros polipeptídeos de levedura secretados. Além disso, estas sequências de pep-tídeo sinal podem ser projetadas para fornecer secreção melhorada em sistemas de expressão de levedura diploide.

Outros sinais de secreção de interesse ainda incluem sequências sinais de mamíferos, que podem ser heteró- logas à proteína sendo secretada, ou podem ser uma sequência nativa para a proteína sendo secretada. As sequências sinais incluem sequências de pré-peptídeo, e em alguns casos podem incluir sequências de pró-peptídeo. Muitas ditas sequências sinais são conhecidas na técnica, incluindo as se- quências sinais encontradas em cadeias de imunoglobulina, por exemplo, sequência pré-pró-toxina K28, PHA-E, FACE, MCP-1 humana, sequências sinais de albumina sérica humana, cadeia pesada de lg humana, cadeia leve de lg humana, e semelhantes. Por exemplo, ver Hashimoto et. al. Protein Eng 11(2) 75 (1998); e Kobayashi et. al. Therapeutic Apheresis 2(4) 257 (1998).

A transcrição pode ser aumentada por inserção de uma sequência ativadora de transcrição no vetor. Estes ativadores são elementos de atuação cis de DNA, geralmente de cerca de 10 a 300 bp, que atuam em um promotor para aumentar sua transcrição. Os potencializadores de transcrição são de orientação e posição relativamente independentes, tendo sido encontrado 5' e 3' à unidade de transcrição, dentro de um intron, bem como dentro da própria sequência de codificação. O potencializador pode ser unido ao vetor de expressão em uma posição 5' ou 3' à sequência de codificação, mas é preferencialmente localizado em um sítio 5' do promotor.

Os vetores de expressão usados em células hospedeiras euca- rióticas podem ainda conter sequências necessárias para a terminação da transcrição e para a estabilização de mRNA. Ditas sequências são comu- mente disponíveis de 3' para o códon de terminação da tradução, em regiões não traduzidas de DNAs ou cDNAs eucarióticos ou virais. Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeo transcritos como fragmentos poliadenila- dos na parte não traduzida do mRNA.

A construção de vetores apropriados contendo um ou mais dos componentes listados acima emprega técnicas de ligação padrões ou métodos de PCR/recombinação. Plasmídeos isolados ou fragmentos de DNA são clivados, ajustados, e novamente ligados na forma desejada para gerar os plasmídeos requeridos ou por métodos de recombinação. Para análise para confirmar as sequências corretas nos plasmídeos construídos, as misturas de ligação são usadas para transformar as células hospedeiras, e transfor- mantes bem sucedidas selecionadas por resistência ao antibiótico (por e- xemplo, ampificilina ou Zeocina) onde apropriado. Plasmídeos dos transfor- mantes são preparados, analisados por digestão de endonuclease de restri- ção e/ou sequenciados.

Como uma alternativa à restrição e ligação de fragmentos, métodos de recombinação baseado em sítios att e enzimas de recombinação podem ser usadas para inserir sequências de DNA em um vetor. Ditos métodos são descritos, por exemplo, por Landy (1989) Ann. Rev. Biochem. 58:913-949; e são conhecidos aos especialistas na técnica. Ditos métodos utilizam recombinação de DNA intermolecular que é mediada por uma mistura de lambda e proteínas de recombinação codificadas por E. coli. A recombinação ocorre entre sítios de ligação específicos (att) nas moléculas de DNA interagindo. Para uma descrição de sítios att ver Weisberg and Landy (1983) Site-Specific Recombination in Phage Lambda, in Lambda II, Weisberg, ed. (Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Press), pp. 211-250. Os segmentos de DNA flanqueando os sítios de recombinação são trocados, de modo que após a recombinação, os sítios att são sequências híbridas compreendidas de sequências doadas por cada vetor parental. A recombinação pode ocorrer entre DNAs de qualquer topologia.

Sítios att podem ser introduzidos em uma sequência de interesse por ligação da sequência de interesse em um vetor apropriado; gerando um produto de PCR contendo sítios att B através do uso de iniciadores específicos; gerando uma biblioteca de cDNA clonada em um vetor apropriado contendo sítios att; e semelhantes.

Dobra, como usado aqui, refere-se à estrutura tridimensional de polipeptídeos e proteínas, onde as interações entre resíduos de aminoácidos atual para estabilizar a estrutura. Enquanto interações não covalentes são importantes para determinar a estrutura, geralmente as proteínas de interesse terão ligações dissulfetos covalentes intra e/ou intermoleculares formadas por dois resíduos de cisteína. Para proteínas e polipeptídeos de ocorrência natural ou derivados dos mesmos e variantes dos mesmos, a dobra apropriada é tipicamente o arranjo que resulta em atividade biológica ideal e pode convenientemente ser monitorada por ensaios para atividade, por exemplo, ligação ao ligante, atividade enzimática, etc.

Em alguns casos, por exemplo, onde o produto desejado é de o- rigem sintética, ensaios baseados em atividade biológica serão menos signi-ficativos. A dobra apropriada de ditas moléculas pode ser determinada com base nas propriedades físicas, considerações energéticas, estudos de modelagem, e semelhantes.

O hospedeiro de expressão pode ser ainda modificado pela introdução de sequências que codificam uma ou mais enzimas que permitem a dobra e formação de ligação dissulfeto, ou seja foldases, chaperoninas, etc. Ditas sequências podem ser constitutivamente ou indutivelmente expressas na célula hospedeira de levedura, usando vetores, marcadores, etc. como conhecido na técnica. Preferencialmente as sequências, incluindo e- lementos regulatórios de transcrição suficientes para o padrão desejado de expressão são estavelmente integradas no genoma de levedura através de uma metodologia de direcionamento.

Por exemplo, o PDI eucariótico não é somente um catalisador e- ficiente de oxidação de cisteína proteína e isomerização de ligação dissulfeto, mas ainda apresenta atividade de chaperona. Coexpressão de PDI pode facilitar a produção de proteínas ativas contendo várias ligações dissulfeto. Ainda de interesse é a expressão de BIP (proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina); ciclofilina; e semelhantes. Em uma modalidade da invenção, cada uma das cepas parentais haploides expressão uma enzima de dobra distinta, por exemplo, uma cepa pode expressar BIP, e a outra cepa pode expressar PDI ou combinações das mesmas.

Os termos "proteína desejada" ou "proteína alvo" são usados de modo intercambiável e referem-se geralmente a um anticorpo parente, ou seja, CGRP ou um anticorpo quimérico ou humanizado ou uma porção de ligação ao mesmo derivado destes como descrito aqui. O termo "anticorpo" pretende incluir qualquer estrutura molecular contendo cadeia de polipeptídeo com uma forma específica que se ajusta a e reconhece um epitopo, onde uma ou mais interações de ligação não covalentes estabilizam o complexo entre a estrutura molecular e o epitopo. A molécula de anticorpo arquétipo é a imunoglobulina, e todos os tipos de imunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, etc., de todas as origens, por exemplo, humanas, roedores, coelho, vaca, ovelha, porco, cão, outros mamíferos, galinha, outras aves, etc., são considerados sendo "anticorpos." Uma origem preferencial para produzir anticorpos úteis como material de partida de acordo com a invenção são os coelhos. Várias sequências de codificação de anticorpo foram descritas; e outras podem ser levantadas por métodos bem conhecidos na técnica. E- xemplos dos mesmos incluem anticorpos quiméricos, anticorpos humanos e outros anticorpos mamíferos não humanos, anticorpos humanizados, anticorpos de cadeia simples (como scFvs), camelbodies, nanobodies, IgNAR (anticorpos de cadeia simples derivados de tubarões), imunofármacos modulares pequenos (SMIPs), e fragmentos de anticorpo como Fabs, Fab', F(ab')2 e semelhantes. Ver Streltsov V A, et al., Structure of a shark IgNAR antibody variable domain and modeling of an early-developmental isotype, Protein Sci. 2005 Nov; 14( 11 ):2901 -9. Epub 2005 Sep. 30; Greenberg A S, et al., A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks, Nature. 1995 Mar. 9; 374(6518): 168-73; Nuttall S D, et al., Isolation of the new antigen receptor from wobbegong sharks, and use as a scaffold for the display of protein loop libraries, Mol Immunol. 2001 Aug;38(4):313-26; Hamers-Casterman C, et al., Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature. 1993 Jun 3;363(6428):446-8; Gill DS, et al., Biopharmaceutical drug discovery using novel protein scaffolds, Curr Opin Biotechnol. 2006 Dec;17(6):653-8. Epub 2006 Oct 19.

Por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno podem ser produzidos por engenharia genética. Nesta técnica, como com outros métodos, células que produzem anticorpos são sensibilizadas ao antígeno ou imunógeno desejado. O RNA mensageiro isolado de células que produzem anticorpos é usado como um molde para preparar cDNA usando amplificação por PCR. Uma biblioteca de vetores, cada uma contendo um gene de cadeia pesada e um gene de cadeia leve retendo a especificidade de antígeno inicial, é produzida por inserção de seções apropriadas do cDNA de imunoglobulina amplificada em vetores de expressão. Uma biblioteca combinatorial é construída por combinação de uma biblioteca de gene de cadeia pesada com uma biblioteca de gene de cadeia leve. Isto resulta em uma biblioteca de clones que co-expressam uma cadeia pesada e uma leve (semelhante ao fragmento Fab ou fragmento de ligação ao antígeno de uma molécula de anticorpo). Os vetores que contêm estes genes são co- transfectados em uma célula hospedeira. Quando a síntese de gene de anticorpo é induzida no hospedeiro transfectado, as proteínas de cadeia pesada e leve se auto montam para produzir anticorpos ativos que podem ser detectados por triagem com o antígeno ou imunógeno.

Sequências de codificação de anticorpo de interesse incluem aquelas codificadas por sequências nativas, bem como ácidos nucleicos que, em virtude da degeneração do código genético, não são idênticas aos ácidos nucleicos revelados e variantes dos mesmos. Polipeptídeos variantes podem incluir substituições de aminoácidos (aa), adições ou deleções. As substituições de aminoácidos podem ser substituições de aminoácidos conservadas ou substituições para eliminar aminoácidos não essenciais, como para alterar o sítio de glicosilação, ou para minimizar dobra errada por substituição ou deleção de um ou mais resíduos de cisteína que não são necessários para a função. Variantes podem ser projetadas de modo a reter ou ter atividade biológica melhorada de uma região particular da proteína (por e- xemplo, um domínio funcional, resíduos de aminoácidos catalíticos, etc). As variantes ainda incluem fragmentos dos polipeptídeos revelados aqui, particularmente fragmentos biologicamente ativos e/ou fragmentos correspondente aos domínios funcionais. Técnicas para mutagênese in vitro de genes clonados são conhecidas. Ainda incluído na invenção objeto são polipeptídeos que foram modificados usando técnicas de biológica molecular ordinárias de modo a melhorar suas resistências à degradação proteolítica ou para otimizar as propriedades de solubilidade ou para gerar os mesmos mais a- propriados como um agente terapêutico.

Anticorpos quiméricos de acordo coma invenção tratamento ou prevenção de diarreia em doenças ou condições resultando em níveis aumentados de CGRP podem ser preparados por meios recombinantes combinando as regiões de cadeia leve e pesada variáveis (VL e VH), obtidas de células que produzem anticorpos com as regiões de cadeia constante leve e pesada de outro. Tipicamente anticorpos quiméricos utilizam regiões variáveis de roedores ou coelhos e regiões constantes humanas, para produzir um anticorpo com domínios predominantemente humanos. A produção de ditos anticorpos quiméricos é bem conhecida na técnica e pode ser obtida por meios padrões (como descrito, por exemplo, na patente US 5.624.659, incorporada aqui por referência em sua totalidade). É ainda contemplado que as regiões constantes humanas de anticorpos quiméricos da invenção podem ser selecionadas de regiões constantes de lgG1, lgG2, lgG3, lgG-4, lgG5, lgG6, lgG7, lgG8, lgG9, lgG10, lgG11, lgG12, lgG13, lgG14, lgG15, lgG16, lgG17, lgG18ou lgG19.

Anticorpos humanizados são projetados para conter ainda mais domínios de imunoglobulinas tipo humanas, e incorporar somente as regiões determinantes de complementariedade do anticorpo derivado de animal. Isto é obtido por avaliação cuidadosa da sequência de alças hipervariáveis das regiões variáveis do anticorpo monoclonal, e ajustando as mesmas à estrutura de cadeias de anticorpo humano. Embora facialmente complexo, o processo é fácil na prática. Ver, por exemplo, patentes US 6.187.287, totalmente incorporada aqui por referência.

Além disso, as imunoglobulinas inteiras (ou suas contrapartes recombinantes), fragmentos de imunoglobulina compreendendo o sítio de ligação ao epitopo (por exemplo, Fab’, F(ab’)2, ou outros fragmentos) podem ser sintetizados. "Fragmento," ou imunoglobulinas mínimas podem ser desenhadas utilizando técnicas de imunoglobulina recombinantes. Por exemplo, imunoglobulinas "Fv" para uso na presente invenção podem ser produzidas por síntese de uma região de cadeia leve variável e uma região de cadeia pesada variável fundidas. As combinações de anticorpos são ainda de interesse, por exemplo, diabodies, que compreendem duas distintas especificidades de Fv. Em outra modalidade da invenção, SMIPs (imunofármacos moléculas pequenas), camelbodies, nanobodies, e IgNAR são incluídos por fragmentos de imunoglobulina

Imunoglobulinas e fragmentos das mesmas podem ser modifica- dos após a tradução, por exemplo, para adicionar frações efetoras como li- gantes químicos, frações detectáveis, como corantes fluorescentes, enzimas toxinas, substratos, materiais bioluminescentes, materiais radioativos, frações quimioluminescentes e semelhantes, ou frações de ligação específicas, como estreptavidina, avidina, ou biotina, e semelhantes podem ser utilizados nos métodos e composições da presente invenção. Exemplos de moléculas efetoras adicionais são fornecidos abaixo.

Uma sequência de polinucleotídeo "corresponde" à sequência de polipeptídeo se a tradução da sequência de polinucleotídeo de acordo com o código genético gera a sequência de polipeptídeo (ou seja, a sequência de polinucleotídeo "codifica" a sequência de polinucleotídeo), uma sequência de polinucleotídeo "corresponde" a outra sequência de polinucleotídeo se as duas sequências codificam a mesma sequência de polinucleotídeo.

Uma região "heteróloga" ou domínio de um construto de DNA é um segmento identificável de DNA dentro de uma molécula de DNA maior que não é encontrada em associada com a molécula maior na natureza. Assim, quando a região heteróloga codifica um gene de mamífero, o gene irá geralmente ser flanqueado por DNA que não flanqueia o DNA genômico de mamífero no genoma do organismo fonte. Outro exemplo de uma região heteróloga é um construto onde a própria sequência de codificação não é encontrada na natureza (por exemplo, cDNA onde a sequência de codificação genômica contém introns, ou sequências sintéticas contendo códons diferentes do gene nativo). Variações alélicas ou eventos de mutação de ocorrência natural não geram regiões heterólogas de DNA como definido aqui.

Uma "sequência de codificação" é uma sequência em linha de códons que (em vista do código genético) corresponde à ou codifica uma sequência de proteína ou peptídeo. Duas sequências de codificação correspondem à cada outra se as sequências ou suas sequências complementares codificam as mesmas sequências de aminoácidos. Uma sequência de codificação em associação com sequências regulatórias apropriadas pode ser transcrita e traduzida em um polipeptídeo. Uma sequência de sinal de polia- denilação e de terminação de transcrição estará geralmente localizada 3' à sequência de codificação. Uma "sequência promotora" é uma região regula- tória de DNA capaz de ligar RNA polimerase em uma célula e inicia a transcrição de uma sequência de codificação à montante (direção 3'). Sequências promotoras tipicamente contêm sítios adicionais para ligação de moléculas regulatórias (por exemplo, fatores de transcrição) que afetam a transcrição da sequência de codificação. Uma sequência de codificação está "sob o controle" da sequência promotora ou "operacionalmente ligada" ao promotor quando a RNA polimerase se liga à sequência promotora em uma célula e transcreve a sequência de codificação em mRNA, que é então, por sua vez, traduzida na proteína codificada pela sequência de codificação.

Os vetores são usados para introduzir uma substância estranha, como DNA, RNA ou proteína em um organismo ou célula hospedeira. Vetores típicos incluem vírus recombinantes (para polinucleotídeos) e lipossomas (para polipeptídeos). Um "vetor de DNA" é um replicon, como plasmídeo, fago ou cosmídeo, ao qual outro segmento de polinucleotídeo pode ser ligado de modo a trazer próximo à replicação do segmento ligado. Um "vetor de expressão" é um vetor de DNA que contém sequências regulatórias que irão direcionar a síntese de polipeptídeo por uma célula hospedeira apropriada. Isto geralmente significa um promotor para ligar RNA polimerase e iniciar a transcrição de mRNA, bem como sítios de ligação ao ribossomo e sinais de iniciação para direcionar a tradução do em um polipeptídeo. A incorporação de a sequência de polinucleotídeo em um vetor de expressão no sítio apropriado e na região de leitura correta, seguido por transformação de uma célula hospedeira apropriada pelo vetor, permite a produção de um polipeptídeo codificado por dita sequência de polinucleotídeo.

"Amplificação" da sequência de polinucleotídeos é a produção in vitrode várias cópias de uma sequência de ácido nucleico particular. A sequência amplificada é geralmente na forma de DNA. Uma variedade de técnicas para realizar dita amplificação é descrita nos seguintes artigos de revisão por Van Brunt (1990, Bio/Technol., 8(4):291-294); Reação em cadeia da polimerase ou PCR é um protótipo de amplificação de ácido nucleico e uso de PCR aqui deve ser considerado exemplar de outras técnicas de amplificação apropriadas.

A estrutura geral dos anticorpos na maioria dos vertebrados é agora bem entendida (Edelman, G. M., Ann. N.Y. Acad. Sci., 190: 5 (1971)). Anticorpos convencionais consistem em duas cadeias de polipeptídeo leves idênticas de peso molecular aproximadamente 23.000 daltons (a "cadeia leve"), e duas cadeias pesadas idênticas de peso molecular 53.000-70.000 (a "cadeia pesada"). As quatro cadeias são unidas por ligações dissulfeto em uma configuração "Y" em que as cadeias leves agrupam as cadeias pesadas iniciando na boca da configuração em "Y". A porção "ramificada" da configuração "Y" é designado como a região Fab; a porção em haste da configuração "Y" é designada como a região FC. A orientação da sequência de aminoácido vai da extremidade N-terminal ao topo da configuração "Y" à extremidade C-terminal no fundo de cada cadeia. A extremidade N-terminal possui a região variável contendo especificidade para o antígeno que induziu este, e é aproximadamente 100 aminoácidos em comprimento, havendo variações leves entre cadeia leve e pesada e de anticorpo para anticorpo.

A região variável é ligada em cada cadeia para conter uma região constante que se estende ao comprimento restante da cadeia e que dentro de uma classe particular e anticorpo não varia com a especificidade do anticorpo (ou seja, o antígeno que induz este). Há cinco classes principais conhecidas de regiões constantes que determinam a classe de molécula de imunoglobulina (IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE correspondendo às regiões constantes de cadeia pesada y, p, α, δ, e ε (gama, mu, alfa, delta, e epsilon)). A região constante ou classe determina a função efetora subsequente do anticorpo, incluindo ativação de complemento (Kabat, E. A., Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, 2nd Ed., p. 413-436, Holt, Rinehart, Winston (1976)), e outras respostas celulares (Andrews, D. W., et al., Clinical Immunobiology, pp 1-18, W. B. Sanders (1980); Kohl, S., et al., Immunology, 48: 187 (1983)); enquanto a região variável determina o antígeno com o qual este irá reagir. As cadeias leves são classificadas como capa ou lambda (K, À). Cada classe de cadeia pesada pode ser preparada com uma cadeia leve capa ou lambda. As cadeias leves e pesadas são covalentemente ligadas a cada outra e as porções de "cauda" das duas cadeias pesadas são ligadas a cada outra por ligações dissulfeto covalentes quando as imunoglobulinas são geradas por hibridomas ou por células B.

A expressão "região variável" ou "VR" refere-se aos domínios dentro de cada par de cadeias leves e pesadas em um anticorpo que estão envolvidas diretamente na ligação do anticorpo ao antígeno. Cada cadeia pesada tem em uma extremidade um domínio variável (VH) seguido por um número de domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável em uma extremidade (VL) e um domínio constante na sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve é alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve é alinhado com o domínio variável da cadeia pesada.

As expressões "regiões determinantes de complementaridade,""região hipervariável," ou "CDR" referem-se a uma ou mais das regiões hi- perváriaveis ou regiões determinantes de complementaridade (CDRs) encontradas nas regiões variáveis de cadeias leve ou pesadas de um anticorpo (ver Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987)). Estas expressões incluem as regiões hipervariáveis como definido por Kabat et al. ("Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat E., et al., US Dept, of Health and Human Services, 1983) ou as alças hipervariáveis em estruturas de 3 dimensões de anticorpos (Chothia and Lesk, J Mol. Biol. 196 901-917 (1987)). Os CDRs em cada cadeia são mentidos em íntima proximidade por regiões estruturais com os CDRs de outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação ao antígeno. Dentro das CDRs há aminoácidos selecionados que foram descritos como as regiões determinantes de seletividade (SDRs) que representam os resíduos de contato críticos usados pela CDR na interação de anticorpo-antígeno (Kashmiri, S., Methods, 36:25-34 (2005)).

As expressões "região estrutural" ou "FR"referem-se a uma ou mais das regiões estruturais dentro das regiões variáveis da cadeia leve e pesada de um anticorpo (ver, Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987)). Estas expressões incluem aquelas regiões de sequência de aminoácido interpostas entre as CDRs dentro das regiões variáveis das cadeias leve e pesada de um anticorpo.

ANTICORPOS ANTI-CGRP E FRAGMENTOS DE LIGAÇÃO AOS MESMOS CONTENDO ATIVIDADE DE LIGAÇÃO PARA CGRP Anticorpo Ab 1

A presente invenção amplamente contempla o uso de qualquer anticorpo anti-CGRP ou fragmento de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada a CGRP em qualquer doença ou condição em níveis aumentados de CGRP que estão envolvidas em diarreia, e/ou fluido aumentado ou excreção de eletrólito do cólon. Condições e tratamentos resultando em CGRP aumentada que é associada com diarreia são identificados neste pedido.

Em uma modalidade preferencial, a invenção inclui anticorpos quiméricos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com C- GRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGQPPKQLIY STSTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYYCLGSYDCSSGDCF VFGGGTEVWKR (SEQ ID NO: 1).

A invenção ainda inclui anticorpos quiméricos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSV YDNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDL ECADAATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTEVWKRTVAAPSVFIFPPSDEQL KSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 2).

A invenção ainda inclui anticorpos quiméricos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QSLEESGGRLVTPGTPLTL TCTVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWIGVIGINDNTYYASWAKGRFTISR ASSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 3).

A invenção ainda inclui anticorpos quiméricos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTV SGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWIGVIGINDNTYYASWAKGRFTISRASST TVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS WTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL G G P S VF L F P P KP KDTLMIS RTP E VTC VWD VS H E D P E VKF N WYVD G VE VH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 4).

A invenção ainda contempla anticorpos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; e SEQ ID NO: 7 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 2, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; e SEQ ID NO: 10 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 3 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 4, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos compreendem, ou alternativamente consistem em, combinações de uma ou mais das CDRs, as sequências de cadeia pesada variável e leve variável, e as sequências de cadeia pesada e leve estabelecidas acima, incluindo todas elas.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; e SEQ ID NO: 7 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 2.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; e SEQ ID NO: 10 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 3 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 4.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpo descritos aqui para o tratamento ou prevenção de diarreia associada a CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos tendo especificidade de ligação a CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes fragmentos de anticorpos a região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 1; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 3; as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; e SEQ ID NO: 7) da região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 1; e as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; e SEQ ID NO: 10) da região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 3.

Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, o anticorpo quimérico anti-CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP é Ab1, compreendendo, ou alternativamente consistindo em, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas estabelecidas aqui.

Em outra modalidade particularmente preferencial da invenção, fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, fragmentos Fab (ligação ao fragmento de antígeno) tendo especificidade de ligação for CGRP. Com relação ao anticorpo Ab1, o fragmento Fab inclui a sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 1 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 3. Esta modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes da SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO: 3 em dito Fab enquanto retendo a especificidade de ligação para CGRP.

Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab1. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP como Ab1 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão em células mamíferas como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de células de fungos, insetos ou microbianas como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Anticorpo Ab2

Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQSPSSL SASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEI KR (SEQ ID NO: 11).

A invenção ainda inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINC QASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 12).

A invenção ainda inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: EVQLVESGGGLVQPG GSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGINDNTYYASWAK GRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 13).

A invenção ainda inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência estabelecida abaixo: EVQLVESGGGLVQPGGSLRL SCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGINDNTYYASWAKGRFTIS RDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYV D G VE VH N AKTKP R E E Q YASTYRVVS VLTVL H Q D WL NGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 14).

A invenção ainda contempla anticorpos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; e SEQ ID NO: 17 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 11 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 12, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; e SEQ ID NO: 20 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 13 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 14, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos compreendem, ou alternativamente consistem em, combinações de uma ou mais das CDRs, as sequências de cadeia pesada variável e leve variável, e as sequências de cadeia pesada e leve estabelecidas acima, incluindo todas elas.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; e SEQ ID NO: 17 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 11 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 12.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; e SEQ ID NO: 20 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 13 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 14.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpo descritos aqui para o tratamento ou prevenção de diarreia associada a CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos tendo especificidade de ligação a CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes fragmentos de anticorpos a região de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 11; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 13; as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; e SEQ ID NO: 17) da região de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 11; e as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; e SEQ ID NO: 20) da região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 13.

Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, o anticorpo anti-CGRP humanizado para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP é Ab2, compreendendo, ou alternativamente consistindo em, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 14, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas estabelecidas aqui.

Em outra modalidade particularmente preferencial da invenção, fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, fragmentos Fab (ligação ao fragmento de antígeno) tendo especificidade de ligação for CGRP. Com relação ao anticorpo Ab2, o fragmento Fab inclui a sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 11 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 13. Esta modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes da SEQ ID NO: 11 e/ou SEQ ID NO: 13 em dito Fab enquanto retendo a especificidade de ligação para CGRP.

Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab2. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP como Ab2 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão em células mamíferas como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de células de fungos, insetos ou microbianas como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Anticorpo Ab3

Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQSPSSLS ASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIK R (SEQ ID NO: 21).

A invenção ainda inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQ ASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPSRFSGSGSGTDFT LTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 22).

A invenção ainda inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: EVQLVESGGGLVQPG GSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGINDNTYYASWAK GRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 23).

A invenção ainda inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência estabelecida abaixo: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLS CAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGINDNTYYASWAKGRFTISR DNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTHTCPP C P AP E L LG G P S VF L F P P KP KDTLMIS RTP E VTC VWD VS H E D P E VKF N WYV D G VE VH N AKTKP R E E Q YASTYRVVS VLTVL H Q D WL N G KE YKC KVS N KAL P APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 24).

A invenção ainda contempla anticorpos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; e SEQ ID NO: 27 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 21 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 22, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; e SEQ ID NO: 30 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 23 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 24, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, combinações de uma ou mais das CDRs, as sequências de cadeia pesada variável e leve variável, e as sequências de cadeia pesada e leve estabelecidas acima, incluindo todas elas.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo tendo es-pecificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada a CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou altemativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 22. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou altemativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 24.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; e SEQ ID NO: 27 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 21 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 22.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; e SEQ ID NO: 30 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 23 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 24.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos tendo especificidade de ligação a C- GRP compreendem, ou altemativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes fragmentos de anticorpos a região de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 21; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 23; as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; e SEQ ID NO: 27) da região de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 21; e as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; e SEQ ID NO: 30) da região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 23.

Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, o anticorpo anti-CGRP quimérico para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP é Ab3, compreendendo, ou alternativamente consistindo em, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 24, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas estabelecidas aqui.

Em outra modalidade particularmente preferencial da invenção, fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, fragmentos Fab (ligação ao fragmento de antígeno) tendo especificidade de ligação for CGRP. Com relação ao anticorpo Ab3, o fragmento Fab inclui a sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 21 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 23. Esta modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes da SEQ ID NO: 21 e/ou SEQ ID NO: 23 em dito Fab enquanto retendo a especificidade de ligação para CGRP.

Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab3. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP como Ab3 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão em células mamíferas como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de células de fungos, insetos ou microbianas como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Píchía diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Anticorpo Ab4

Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos quiméricos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo espe-cificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQTPSPVS AAVGSTVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGQPPKQLIYDASTLASGVPS RFSGSGSGTQFTLTISGVQCNDAAAYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTEW VKR (SEQ ID NO: 31).

A invenção ainda inclui anticorpos quiméricos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQS VYHNTYLAWYQQKPGQPPKQLIYDASTLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISG VQCNDAAAYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTEVWKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 32).

A invenção ainda inclui anticorpos quiméricos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QSLEESGGRLVTPGTPLTL TCSVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWIGVIGINGATYYASWAKGRFTISK TSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 33).

A invenção ainda inclui anticorpos quiméricos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCS VSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWIGVIGINGATYYASWAKGRFTISKTSS TTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 34).

A invenção ainda contempla anticorpos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; e SEQ ID NO: 37 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 31 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 32, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; e SEQ ID NO: 40 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 33 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 34, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos compreendem, ou alternativamente consistem em, combinações de uma ou mais das CDRs, as sequências de cadeia pesada variável e leve variável, e as sequências de cadeia pesada e leve estabelecidas acima, incluindo todas elas.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 32. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 34.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; e SEQ ID NO: 37 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 31 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 32.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; e SEQ ID NO: 40 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 33 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 34.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos tendo especificidade de ligação a C- GRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes fragmentos de anticorpos a região de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 31; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 33; as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; e SEQ ID NO: 37) da região de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 31; e as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; e SEQ ID NO: 40) da região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 33.

Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, o anticorpo anti-CGRP humanizado para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP é Ab4, compreendendo, ou altemativamente consistindo em, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 34, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas estabelecidas aqui.

Em outra modalidade particularmente preferencial da invenção, fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, fragmentos Fab (ligação ao fragmento de antígeno) tendo especificidade de ligação for CGRP. Com relação ao anticorpo Ab4, o fragmento Fab inclui a sequên- cia de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 31 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 33. Esta modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes da SEQ ID NO: 31 e/ou SEQ ID NO: 33 em dito Fab enquanto retendo a especificidade de ligação para CGRP.

Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab4. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP como Ab4 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão em células mamíferas como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de células de fungos, insetos ou microbianas como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Anticorpo Ab5

Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQSPSSLSA SVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTLASGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 41).

A invenção ainda inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQA SQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 42).

A invenção ainda inclui anticorpos humanizados para o trata- mento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: EVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGINGATYYASWAK GRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 43).

A invenção ainda inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência estabelecida abaixo: EVQLVESGGGLVQPGGSLRL SCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGINGATYYASWAKGRFTIS RDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 44).

A invenção ainda contempla anticorpos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; e SEQ ID NO: 47 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 41 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 42, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 49; e SEQ ID NO: 50 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 43 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 44, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos compreendem, ou alternativamente consistem em, combinações de uma ou mais das CDRs, as sequências de cadeia pesada variável e leve variável, e as sequências de cadeia pesada e leve estabelecidas acima, incluindo todas elas.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo tendo es-pecificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada a CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 42. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou altemativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 44.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; e SEQ ID NO: 47 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 41 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 42.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 49; e SEQ ID NO: 50 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 43 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 44.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos tendo especificidade de ligação a C- GRP compreendem, ou altemativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes fragmentos de anticorpos a região de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 41; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 43; as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; e SEQ ID NO: 47) da região de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 41; e as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 49; e SEQ ID NO: 50) da região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 43.

Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, o anticorpo anti-CGRP quimérico para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP é Ab5, compreendendo, ou alternativamente consistindo em, SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 44, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas estabelecidas aqui.

Em outra modalidade particularmente preferencial da invenção, fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, fragmentos Fab (ligação ao fragmento de antígeno) tendo especificidade de ligação for CGRP. Com relação ao anticorpo Ab5, o fragmento Fab inclui a sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 41 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 43. Esta modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes da SEQ ID NO: 41 e/ou SEQ ID NO: 43 em dito Fab enquanto retendo a especificidade de ligação para CGRP.

Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab5. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab5 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão em células mamíferas como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de células de fungos, insetos ou microbianas como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Anticorpo Ab6

Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo es-pecificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQSPSSLSA SVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTLASGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 51).

A invenção ainda inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINC QASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTLASGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 52).

A invenção ainda inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: EVQLVESGGGLVQ PGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGINGATYYASW AKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 53).

A invenção ainda inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência estabelecida abaixo: EVQLVESGGGLVQPGGSLR LSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGINGATYYASWAKGRFTI SRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTKGPSV FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 54).

A invenção ainda contempla anticorpos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; e SEQ ID NO: 57 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 51 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 52, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; e SEQ ID NO: 60 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 53 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 54, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos compreendem, ou alternativamente consistem em, combinações de uma ou mais das CDRs, as sequências de cadeia pesada variável e leve variável, e as sequências de cadeia pesada e leve estabelecidas acima, incluindo todas elas.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo tendo es-pecificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada a CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 52. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 53 ou SEQ ID NO: 54.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; e SEQ ID NO: 57 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 51 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 52.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; e SEQ ID NO: 60 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 53 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 54.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos tendo especificidade de ligação a C- GRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes fragmentos de anticorpos a região de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 51; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 53; as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; e SEQ ID NO: 57) da região de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 51; e as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; e SEQ ID NO: 60) da região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 53.

Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, o anticorpo anti-CGRP humanizado para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP é Ab6, compreendendo, ou alternativamente consistindo em, SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO: 54, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas estabelecidas aqui.

Em outra modalidade particularmente preferencial da invenção, fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, fragmen- tos Fab (ligação ao fragmento de antígeno) tendo especificidade de ligação for CGRP. Com relação ao anticorpo Ab6, o fragmento Fab inclui a sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 51 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 53. Esta modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes da SEQ ID NO: 51 e/ou SEQ ID NO: 53 em dito Fab enquanto retendo a especificidade de ligação para CGRP.

Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab6. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP como Ab6 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão em células mamíferas como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de células de fungos, insetos ou microbianas como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Anticorpo Ab7

Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos quiméricos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQTASPVS AAVGSTVTINCQASQSVYNYNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVSSR FKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSTGDCFVFGGGTEVWK R (SEQ ID NO: 61).

A invenção ainda inclui anticorpos quiméricos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSV YNYNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDV QCDDAATYYCLGSYDCSTGDCFVFGGGTEVWKRTVAAPSVFIFPPSDEQ LKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 62).

A invenção ainda inclui anticorpos quiméricos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QEQLKESGGRLVTPGTSL TLTCTVSGIDLSNHYMQWVRQAPGKGLEWIGWGINGRTYYASWAKGRFTI SRTSSTTVDLKMTRLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 63).

A invenção ainda inclui anticorpos quiméricos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QEQLKESGGRLVTPGTSLTLTC TVSGIDLSNHYMQWVRQAPGKGLEWIGWGINGRTYYASWAKGRFTISRT SSTTVDLKMTRLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPA PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 64).

A invenção ainda contempla anticorpos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66; e SEQ ID NO: 67 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 61 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 62, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; e SEQ ID NO: 70 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 63 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 64, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos compreendem, ou alternativamente consistem em, combinações de uma ou mais das CDRs, as sequências de cadeia pesada variável e leve variável, e as sequências de cadeia pesada e leve estabelecidas acima, incluindo todas elas.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo tendo es-pecificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada a CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 61 ou SEQ ID NO: 62. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 63 ou SEQ ID NO: 64.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66; e SEQ ID NO: 67 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 61 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 62.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; e SEQ ID NO: 70 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 63 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 64.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos tendo especificidade de ligação a C- GRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes fragmentos de anticorpos a região de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 61; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 63; as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66; e SEQ ID NO: 67) da região de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 61; e as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; e SEQ ID NO: 70) da região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 63.

Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, o anticorpo anti-CGRP quimérico para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP é Ab7, compreendendo, ou alternativamente consistindo em, SEQ ID NO: 62 e SEQ ID NO: 64, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas estabelecidas aqui.

Em outra modalidade particularmente preferencial da invenção, fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, fragmentos Fab (ligação ao fragmento de antígeno) tendo especificidade de ligação for CGRP. Com relação ao anticorpo Ab7, o fragmento Fab inclui a sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 61 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 63. Esta modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes da SEQ ID NO: 61 e/ou SEQ ID NO: 63 em dito Fab enquanto retendo a especificidade de ligação para CGRP.

Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab7. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab7 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão em células mamíferas como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de células de fungos, insetos ou microbianas como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Anticorpo Ab8

Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos quiméricos e humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYNYNYLAWYQQKPGKVPKQLIY STSTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSTGDC FVFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 71).

A invenção ainda inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQ ASQSVYNYNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPSRFSGSGSGTDFT LTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSTGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 72).

A invenção ainda inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: EVQLVESGGGLVQPG GSLRLSCAVSGIDLSNHYMQWVRQAPGKGLEWVGWGINGRTYYASWAK GRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 73).

A invenção ainda inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência estabelecida abaixo: EVQLVESGGGLVQPGGSLRL SCAVSGIDLSNHYMQWVRQAPGKGLEWVGWGINGRTYYASWAKGRFTIS RDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYV D GVEVH NAKTKP R E E Q YASTYRVVS VLTVL H Q D WL NGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 74).

A invenção ainda contempla anticorpos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76; e SEQ ID NO: 77 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 71 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 72, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 79; e SEQ ID NO: 80 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 73 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 74, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos compreendem, ou altemativamente consistem em, combinações de uma ou mais das CDRs, as sequências de cadeia pesada variável e leve variável, e as sequências de cadeia pesada e leve estabelecidas acima, incluindo todas elas.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo tendo es-pecificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada a CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou altemativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 71 ou SEQ ID NO: 72. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou altemativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 73 ou SEQ ID NO: 74.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76; e SEQ ID NO: 77 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 71 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 72.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 79; e SEQ ID NO: 80 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 73 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 74.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos tendo especificidade de ligação a C- GRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes fragmentos de anticorpos a região de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 71; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 73; as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76; e SEQ ID NO: 77) da região de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 71; e as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 79; e SEQ ID NO: 80) da região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 73.

Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, o anticorpo anti-CGRP humanizado para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP é Ab8, compreendendo, ou alternativamente consistindo em, SEQ ID NO: 72 e SEQ ID NO: 74, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas estabelecidas aqui.

Em outra modalidade particularmente preferencial da invenção, fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia assoei- ada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, fragmentos Fab (ligação ao fragmento de antígeno) tendo especificidade de ligação for CGRP. Com relação ao anticorpo Ab8, o fragmento Fab inclui a sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 71 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 73. Esta modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes da SEQ ID NO: 71 e/ou SEQ ID NO: 73 em dito Fab enquanto retendo a especificidade de ligação para CGRP.

Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab8. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP como Ab8 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão em células mamíferas como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de células de fungos, insetos ou microbianas como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Anticorpo Ab9

Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos quiméricos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQTPSPV SAAVGSTVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVS SRFRGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTEW VKR (SEQ ID NO: 81).

A invenção ainda inclui anticorpos quiméricos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQN VYNNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVSSRFRGSGSGTQFTLTISD VQCDDAATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTEVWKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 82).

A invenção ainda inclui anticorpos quiméricos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QSLEESGGRLVTPGTPLTL TCTVSGIGLSSYYMQWVRQSPGRGLEWIGVIGSDGKTYYATWAKGRFTIS KTSSTTVDLRMASLTTEDTATYFCTRGDIWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 83).

A invenção ainda inclui anticorpos quiméricos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVS GIGLSSYYMQWVRQSPGRGLEWIGVIGSDGKTYYATWAKGRFTISKTSSTT VDLRMASLTTEDTATYFCTRGDIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGK (SEQ ID NO: 84).

A invenção ainda contempla anticorpos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 86; e SEQ ID NO: 87 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 81 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 82, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; e SEQ ID NO: 90 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 83 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 84, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, combinações de uma ou mais das CDRs, as sequências de cadeia pesada variável e leve variável, e as sequências de cadeia pesada e leve estabelecidas acima, incluindo todas elas.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo tendo es-pecificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada a CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 81 ou SEQ ID NO: 82. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 83 ou SEQ ID NO: 84.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 86; e SEQ ID NO: 87 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 81 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 82.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; e SEQ ID NO: 90 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 83 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 84.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos tendo especificidade de ligação a C- GRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes fragmentos de anticorpos a região de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 81; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 83; as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 86; e SEQ ID NO: 87) da região de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 81; e as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; e SEQ ID NO: 90) da região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 83.

Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, o anticorpo anti-CGRP quimérico para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP é Ab9, compreendendo, ou altemativamente consistindo em, SEQ ID NO: 82 e SEQ ID NO: 84, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas estabelecidas aqui.

Em outra modalidade particularmente preferencial da invenção, fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, fragmentos Fab (ligação ao fragmento de antígeno) tendo especificidade de ligação for CGRP. Com relação ao anticorpo Ab9, o fragmento Fab para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP inclui a sequência de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 81 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 83. Esta modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes da SEQ ID NO: 81 e/ou SEQ ID NO: 83 em dito Fab enquanto retendo a especificidade de ligação para CGRP.

Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab9. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP para o trata- mento ou prevenção de diarreia associada com CGRP como Ab9 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão em células mamíferas como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de células de fungos, insetos ou microbianas como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Anticorpo Ab10

Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQSPSSL SASVGDRVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKVEI KR (SEQ ID NO: 91).

A invenção ainda inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINC QASQNVYNNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPSRFSGSGSGTD FTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 92).

A invenção ainda inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: EVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCAVSGIGLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGSDGKTYYATWA KGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRGDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 93).

A invenção ainda inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência estabelecida abaixo: EVQLVESGGGLVQPGG SLRLSCAVSGIGLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGSDGKTYYATWAKG RFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRGDIWGQGTLVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTH TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 94).

A invenção ainda contempla anticorpos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; e SEQ ID NO: 97 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 91 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 92, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; e SEQ ID NO: 100 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 93 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 94, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos compreendem, ou alternativamente consistem em, combinações de uma ou mais das CDRs, as sequências de cadeia pesada variável e leve variável, e as sequências de cadeia pesada e leve estabelecidas acima, incluindo todas elas.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo tendo es-pecificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada a CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 91 ou SEQ ID NO: 92. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 93 ou SEQ ID NO: 94.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; e SEQ ID NO: 97 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 91 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 92.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; e SEQ ID NO: 100 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 93 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 94.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos tendo especificidade de ligação a C- GRP compreendem, ou altemativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes fragmentos de anticorpos a região de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 91; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 93; as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; e SEQ ID NO: 97) da região de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 91; e as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; e SEQ ID NO: 100) da região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 93.

Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, o anticorpo anti-CGRP humanizado para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP é Ab10, compreendendo, ou altemativamente consistindo em, SEQ ID NO: 92 e SEQ ID NO: 94, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas estabelecidas aqui.

Em outra modalidade particularmente preferencial da invenção, fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, fragmentos Fab (ligação ao fragmento de antígeno) tendo especificidade de ligação for CGRP. Com relação ao anticorpo Ab10, o fragmento Fab para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP inclui a sequência de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 91 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 93. Esta modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes da SEQ ID NO: 91 e/ou SEQ ID NO: 93 em dito Fab enquanto retendo a especificidade de ligação para CGRP.

Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab10. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab10 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão em células mamíferas como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de células de fungos, insetos ou microbianas como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Anticorpo Ab11

Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos quiméricos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQTASPVS PAVGSTVTINCRASQSVYYNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVSSR FKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSNGDCFVFGGGTEVW KR (SEQ ID NO: 101).

A invenção ainda inclui anticorpos quiméricos tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQTASPVSPAVGSTVTI NCRASQSVYYNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVSSRFKGSGSGT QFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSNGDCFVFGGGTEVWKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 102).

A invenção ainda inclui anticorpos quiméricos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QSLEESGGRLVTPGGSL TLTCTVSGIDVTNYYMQWVRQAPGKGLEWIGVIGVNGKRYYASWAKGRFT ISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 103).

A invenção ainda inclui anticorpos quiméricos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QSLEESGGRLVTPGGSLTLTCT VSGIDVTNYYMQWVRQAPGKGLEWIGVIGVNGKRYYASWAKGRFTISKTS STTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 104).

A invenção ainda contempla anticorpos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 106; e SEQ ID NO: 107 que corresponde às regiões determinantes de complemen- taridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 101 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 102, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109; e SEQ ID NO: 110 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 103 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 104, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos compreendem, ou alternativamente consistem em, combinações de uma ou mais das CDRs, as sequências de cadeia pesada variável e leve variável, e as sequências de cadeia pesada e leve estabele-cidas acima, incluindo todas elas.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo tendo es-pecificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada a CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 101 ou SEQ ID NO: 102. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 103 ou SEQ ID NO: 104.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 106; e SEQ ID NO: 107 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 101 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 102.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109; e SEQ ID NO: 110 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 103 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 104.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos tendo especificidade de ligação a C- GRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes fragmentos de anticorpos a região de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 101; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 103; as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 106; e SEQ ID NO: 107) da região de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 101; e as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109; e SEQ ID NO: 110) da região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 103.

Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, o anticorpo anti-CGRP quimérico para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP é Ab11, compreendendo, ou alternativamente consistindo em, SEQ ID NO: 102 e SEQ ID NO: 104, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas estabelecidas aqui.

Em outra modalidade particularmente preferencial da invenção, fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, fragmentos Fab (ligação ao fragmento de antígeno) tendo especificidade de ligação for CGRP. Com relação ao anticorpo Ab11, o fragmento Fab para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP inclui a sequência de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 101 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 103. Esta modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes da SEQ ID NO: 101 e/ou SEQ ID NO: 103 em dito Fab enquanto retendo a especificidade de ligação para CGRP.

Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab11. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab11 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão em células mamíferas como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de células de fungos, insetos ou microbianas como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Anticorpo Ab12

Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQSPSSLS ASVGDRVTINCRASQSVYYNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSNGDCFVFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 111).

A invenção ainda inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCR ASQSVYYNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPSRFSGSGSGTDFT LTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSNGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 112).

A invenção ainda inclui anticorpos humanizados tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: EVQLVESGGGL VQPGGSLRLSCAVSGIDVTNYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGVNGKRYYA SWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 113).

A invenção ainda inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência estabelecida abaixo: EVQLVESGGGLVQPGGSLR LSCAVSGIDVTNYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGVNGKRYYASWAKGRFT ISRDN SKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNW YVD G VE VH N AKTKP RE E Q YASTYR WS VLTVL H Q D WL N G KE YKC KVS N KA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 114).

A invenção ainda contempla anticorpos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 116; e SEQ ID NO: 117 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 111 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 112, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119; e SEQ ID NO: 120 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 113 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 114, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, combi-nações de uma ou mais das CDRs, as sequências de cadeia pesada variável e leve variável, e as sequências de cadeia pesada e leve estabelecidas acima, incluindo todas elas.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo tendo es-pecificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada a CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 111 ou SEQ ID NO: 112. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 113 ou SEQ ID NO: 114.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 116; e SEQ ID NO: 117 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 111 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 112.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119; e SEQ ID NO: 120 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 113 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 114.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos tendo especificidade de ligação a C- GRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes fragmentos de anticorpos a região de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 111; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 113; as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 116; e SEQ ID NO: 117) da região de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 111; e as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119; e SEQ ID NO: 120) da região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 113.

Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, o anticorpo anti-CGRP humanizado para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP é Ab12, compreendendo, ou alternativamente consistindo em, SEQ ID NO: 112 e SEQ ID NO: 114, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas estabelecidas aqui.

Em outra modalidade particularmente preferencial da invenção, fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, fragmentos Fab (ligação ao fragmento de antígeno) tendo especificidade de ligação for CGRP. Com relação ao anticorpo Ab12, o fragmento Fab para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP inclui a sequência de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 111 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 113. Esta modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes da SEQ ID NO: 111 e/ou SEQ ID NO: 113 em dito Fab enquanto retendo a especificidade de ligação para CGRP.

Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab12. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP como Ab12 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão em células mamíferas como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de células de fungos, insetos ou microbianas como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Anticorpo Ab13

Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos quiméricos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo espe- cificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: AIVMTQTPSSKS VPVGDTVTINCQASESLYNNNALAWFQQKPGQPPKRLIYDASKLASGVPSR FSGGGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCGGYRSDSVDGVAFAGGTEVWKR (SEQ ID NO: 121).

A invenção ainda inclui anticorpos quiméricos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência estabelecida abaixo: AIVMTQTPSSKSVPVGDTVTINCQASE SLYNNNALAWFQQKPGQPPKRLIYDASKLASGVPSRFSGGGSGTQFTLTIS GVQCDDAATYYCGGYRSDSVDGVAFAGGTEVWKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 122).

A invenção ainda inclui anticorpos quiméricos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QSVEESGGGLVQPEGSLTLT CTASGFDFSSNAMWWVRQAPGKGLEWIGIIYNGDGSTYYASWVNGRFSIS KTSSTTVTLQLNSLTVADTATYYCARDLDLWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 123).

A invenção ainda inclui anticorpos quiméricos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QSVEESGGGLVQPEGSLTLT CTASGFDFSSNAMWWVRQAPGKGLEWIGCIYNGDGSTYYASWVNGRFSI SKTSSTTVTLQLNSLTVADTATYYCARDLDLWGPGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPP C P AP E L LG G P S VF L F P P KP KDTLMIS RTP E VTC VWD VS H E D P E VKF N WYV DGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 124).

A invenção ainda contempla anticorpos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 126; e SEQ ID NO: 127 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 121 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 122, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129; e SEQ ID NO: 130 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 123 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 124, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos compreendem, ou alternativamente consistem em, combinações de uma ou mais das CDRs, as sequências de cadeia pesada variável e leve variável, e as sequências de cadeia pesada e leve estabele-cidas acima, incluindo todas elas.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 121 ou SEQ ID NO: 122. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 123 ou SEQ ID NO: 124.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 126; e SEQ ID NO: 127 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 121 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 122.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129; e SEQ ID NO: 130 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 123 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 124.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos tendo especificidade de ligação a C- GRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes fragmentos de anticorpos a região de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 121; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 123; as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 126; e SEQ ID NO: 127) da região de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 121; e as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129; e SEQ ID NO: 130) da região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 123.

Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, o anticorpo anti-CGRP quimérico para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP é Ab13, compreendendo, ou alternativamente consistindo em, SEQ ID NO: 122 e SEQ ID NO: 124, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas estabelecidas aqui.

Em outra modalidade particularmente preferencial da invenção, fragmentos de anticorpo compreendem, ou alternativamente consistem em, fragmentos Fab (ligação ao fragmento de antígeno) tendo especificidade de ligação for CGRP. Com relação ao anticorpo Ab13, o fragmento Fab para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP inclui a sequên- cia de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 121 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 123. Esta modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes da SEQ ID NO: 121 e/ou SEQ ID NO: 123 em dito Fab enquanto retendo a especificidade de ligação para CGRP.

Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab13. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP como Ab13 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão em células mamíferas como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de células de fungos, insetos ou microbianas como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Anticorpo Ab14

Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQSPSSLSA SVGDRVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 131).

A invenção ainda inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINC QASQNVYNNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 132).

A invenção ainda inclui anticorpos humanizados para o trata- mento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: EVQLVESGGGLVQPGG SLRLSCAVSGIGLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGSDGKTYYATWAKG RFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRGDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 133).

A invenção ainda inclui anticorpos humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP tendo especificidade de ligação a CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência estabelecida abaixo: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLS CAVSGIGLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGSDGKTYYATWAKGRFTISR DNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRGDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTHTCPPC PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 134).

A invenção ainda contempla anticorpos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 136; e SEQ ID NO: 137 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 131 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 132, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 139; e SEQ ID NO: 140 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 133 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 134, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos compreendem, ou altemativamente consistem em, combinações de uma ou mais das CDRs, as sequências de cadeia pesada variável e leve variável, e as sequências de cadeia pesada e leve estabelecidas acima, incluindo todas elas.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo tendo es-pecificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada a CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 131 ou SEQ ID NO: 132. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 133 ou SEQ ID NO: 134.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 136; e SEQ ID NO: 137 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 131 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 132.

Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 139; e SEQ ID NO: 140 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 133 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 134.

A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos tendo especificidade de ligação a C- GRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes fragmentos de anticorpos a região de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 131; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 133; as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 136; e SEQ ID NO: 137) da região de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 131; e as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 139; e SEQ ID NO: 140) da região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 133.

Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, o anticorpo anti-CGRP humanizado para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP é Ab14, compreendendo, ou alternativamente consistindo em, SEQ ID NO: 132 e SEQ ID NO: 134, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas estabelecidas aqui.

Em outra modalidade particularmente preferencial da invenção, fragmentos de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, fragmentos Fab (ligação ao fragmento de antígeno) tendo especificidade de ligação for CGRP. Com relação ao anticorpo Ab14, o fragmento Fab inclui a sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 131 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 133. Esta modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes da SEQ ID NO: 131 e/ou SEQ ID NO: 133 em dito Fab enquanto retendo a especificidade de ligação para CGRP.

Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab14. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab14 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão em células mamíferas como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de células de fungos, insetos ou microbianas como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Em outra modalidade, fragmentos de anticorpos podem estar presentes em uma ou mais das seguintes formas não limitantes: Formas de Fab, Fab', F(ab')2, Fv e Fc de cadeia simples de anticorpo. Em uma modalidade preferencial, os anticorpos anti-CGRP descritos aqui para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP ainda compreendem a sequência de cadeia leve constante capa compreendendo a sequência estabelecida abaixo: VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 283).

Em outra modalidade preferencial, os anticorpos anti-CGRP descritos aqui para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP ainda compreendem a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada constante gama-1 compreendendo a sequência estabelecida abaixo: ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV WD VS H E D P E VKF N WYVD G VE VH N AKTKP RE E Q YASTYR WS VLTVL H Q D WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 284).

Em outra modalidade, a invenção contempla um anticorpo anti- CGRP isolado para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendendo uma sequência de polipeptídeo VH selecionada de: SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, ou 133, ou uma variante da mesma; e ainda compreendendo uma sequência de polipeptídeo VL selecionada de: SEQ ID NO: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, ou 131, ou uma variante da mesma, em que um ou mais dos resíduos estruturais (resíduos FRs) em dito polipeptídeo VH ou VL foi substituído com outro resíduo de aminoácido resultando em um anticorpo anti-CGRP que especificamente liga CGRP. A invenção contempla formas humanizadas e quiméricas destes anticorpos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada a CGRP. Os anticorpos quiméricos podem incluir um Fc derivado de lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgG5, lgG6, lgG7, IgGS, lgG9, lgG10, lgG11, lgG12, lgG13, lgG14, lgG15, lgG16, lgG17, lgG18 ou lgG19 regiões constantes.

Em uma modalidade da invenção, os anticorpos ou polipeptídeos VH ou VL par ao tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP se originam ou são selecionados de uma ou mais populações de célula B de coelho antes do início do processo de humanização referenciado aqui.

Em outra modalidade da invenção, os anticorpos anti-CGRP e fragmentos dos mesmos para tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRO não têm especificidade de ligação para CGRP-R Em outra modalidade da invenção, os anticorpos anti-CGRP e fragmentos dos mesmos inibem a associação de CGRP com CGRP-R. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos anti-CGRP e fragmentos dos mesmos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP inibem a associação de CGRP com CGRP-R e/ou proteínas adicionais e/ou multímeros dos mesmos, e/ou antagoniza os efeitos biológicos dos mesmos.

Como declarado no parágrafo [0127] aqui, anticorpos e fragmentos dos mesmos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP podem ser modificados após a tradução para adicionar frações efeto- ras como ligantes químicos, frações detectáveis como, por exemplo, corantes fluorescentes, enzimas, substratos, materiais bioluminescentes, materiais radioativos, e materiais quimioluminescentes, ou frações funcionais como, por exemplo, estreptavidina, avidina, biotina, uma citotoxina, um agente cito- toxina, e materiais radioativos.

Anticorpos ou fragmentos dos mesmos podem ainda ser quimicamente modificados para fornecer vantagens adicionadas como solubilidade aumentada, estabilidade e tempo de circulação (meia-vida in vivo) do polipeptídeo ou imunogenicidade reduzida (ver patente US 4.179.337). As frações químicas para derivatização podem ser selecionadas de polímeros solúveis em água como polietileno glicol, copolímeros etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrano, polivinil álcool e semelhantes. Os anticorpos e fragmentos dos mesmos podem ser modificados em posições aleatórias dentro da molécula, ou em posições predeterminadas dentro da molécula e podem incluir uma, duas, três ou mais frações químicas ligadas.

O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e pode ser ramificado ou não ramificado. Para polietileno glicol, o peso molecular preferencial é entre cerca de 1 kDa e cerca de 100 kDa (o termo "cerca de" indica que nas preparações de polietileno glicol, algumas moléculas irão pesar mais, algumas menos e o peso molecular declarado) para facilitar o manuseio e fabricação. Outros tamanhos podem ser usados, dependendo do perfil terapêutico desejado (por exemplo, a duração de liberação sustentada, os efeitos, se qualquer um na atividade biológica, a facilidade no manuseio, o grau ou falta de antigenicidade e outros efeitos conhecidos de polietileno glicol a uma proteína terapêutica ou análogo). Por exemplo, o polietileno pode ter um peso molecular médio de cerca de 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10.000, 10,500, 11.000, 11.500, 12.000, 12.500, 13.000, 13.500, 14.000, 14.500, 15.000, 15.500, 16.000, 16.500, 17.000, 17.500, 18.000, 18.500, 19.000, 19.500, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 50.000, 55.000, 60.000, 65.000, 70.000, 75.000, 80.000, 85.000, 90.000, 95.000, ou 100.000 kDa. Polietilenoglicois ramificados são descritos, por e- xemplo, na patente US 5.643.575; Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72 (1996); Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999); and Caliceti et al., Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999), as revelações das quais são incorporadas aqui por referência.

Há um número de métodos de ligação disponíveis aos especialistas na técnica, ver, por exemplo, EP 0 401 384, aqui incorporado por referência (acoplamento de PEG a G-CSF), Ver ainda Malik et al., Exp. Hematol. 20:1028-1035 (1992) (relato de peguilação de GM-CSF usando cloreto de tresila). Por exemplo, polietileno glicol pode ser covalentemente ligado por resíduos de aminoácido através de um grupo reativo, como, um amino livre ou grupo carboxil. Grupos reativos são aqueles aos quais uma molécula ati- vada de polietileno glicol pode estar ligada. Os resíduos de aminoácidos contendo um grupo amino livre podem incluir resíduos de lisina e os resíduos de aminoácido N-terminal; aqueles contendo um grupo carboxil livre podem incluir resíduos de ácido aspártico, resíduos de ácido glutâmico e o resíduo de aminoácido C-terminal. Os grupos sulfidril podem ainda ser usados como um grupo reativo para ligar as moléculas de polietileno glicol. São preferenciais para fins terapêuticos na ligação em grupo amino, como ligação no grupo N-terminal ou lisina.

Como sugerido acima, polietileno glicol pode ser ligado às proteínas através de ligação a qualquer um de um número de resíduos de aminoácidos. Por exemplo, polietileno glicol pode ser ligado aos polipeptídeos a- través de ligação covalente aos resíduos de lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ou cisteína. Uma ou mais reações químicas podem ser empregadas para ligar polietileno glicol aos resíduos de aminoácidos específicos (por exemplo, lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ou cisteína) ou em mais do que um tipo de resíduo de aminoácido (por exemplo, lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, cisteína e combinações dos mesmos).

Altemativamente, anticorpos ou fragmentos dos mesmos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP podem ter meias vidas in vivo aumentadas via fusão com albumina (incluindo, entre outras, albumina sérica humana recombinante ou fragmentos ou variantes dos mesmos (ver, por exemplo, patente US 5.876.969, emitida em 2 de março de 1999, patente EP 0 413 622, e patente US 5.766.883, emitida em 16 de junho de 1998, aqui incorporada por referência em sua totalidade)) ou outras proteínas sanguíneas circulantes como transferrina ou ferritina. Em uma modalidade preferencial, polipeptídeos e/ou anticorpos da presente invenção (incluindo fragmentos ou variantes dos mesmos) são fundidos com a forma madura de albumina sérica humana (ou seja, aminoácidos 1-585 de albumina sérica humana como mostrado nas FIGS. 1 e 2 de patente EP 0 322 094) que é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Polinucleotídeos que codificam proteínas de fusão da invenção estão ainda incluídos pela invenção.

Com relação às frações detectáveis, outras enzimas exemplares incluem, entre outras, peroxidase de rábano silvestre, acetilcolinesterase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase e luciferase. Outros materiais fluorescentes exemplares incluem, entre outros, rodamina, fluoresceína, fluoresceí- na isotiocianato, umbelliferona, diclorotriazinilamina, ficoeritrina e danisl cloreto. Outras frações quimioluminescentes exemplares incluem, entre outras, luminol. Outros materiais bioluminescentes exemplares incluem, entre outros, luciferina e aequorin. Outros materiais radioativos exemplares incluem, entre outros, lodo 125 (1251), Carbono 14 (14C), Enxofre 35 (35S), Trítio (3H) e fósforo 32 (32P).

Com relação às frações funcionais, agentes citotóxicos exemplares incluem, entre outros, metotrexato, aminopterina, 6-mercaptopurina, 6- tioguanina, citarabina, 5-fluoruracil decarbazina; agentes alquilantes como mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU), mitomicina C, lomustina (CCNU), 1-metilnitrosoureia, ciclotosfamida, mecloretamina, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina e carboplatina (paraplatina); antraciclinas incluem daunorrubicina (antigamente daunomicina), doxorrubicina (adriamicina), de- torrubicina, carminomicina, idarrubicina, epirrubicina, mitoxantrona e bisan- treno; antibióticos incluem dactinomicina (actinomicina D), bleomicina, cali- ceamicina, mitramicina, e antramicina (AMC); e agentes antimitóticos como os alcaloides da vinca, vincristina e vinblastina. Outros agentes citotóxicos incluem paclitaxel (taxol), ricina, pseudomonas exotoxina, gemcitabina, cito- calasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, etoposídeo, tenoposí- deo, colchicina, dihidroxi antracina diona, 1-dehidrotestosterona, glicocorti- coides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, procarbazi- na, hidroxiureia, asparaginase, corticosteroides, mitotano (O,P'-(DDD)), interferons, e misturas destes agentes citotóxicos.

Outros agentes citotóxicos incluem, entre outros, agentes quimi- oterápicos como carboplatina, cisplatina, paclitaxel, gemcitabina, calicheami- cina, doxorubicina, 5-fluoruracil, mitomicina C, actinomicina D, ciclofosfami- da, vincristina e bleomiciπa. Enzimas tóxicas de plantas e bactérias como ricina, toxina diftérica e toxina de Pseudomonas podem ser conjugadas aos anticorpos humanizados ou quiméricos, ou fragmentos de ligação aos mesmos, para gerar reagentes de morte específica por tipo de célula (Youle, et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 77:5483 (1980); Gilliland, et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 77:4539 (1980); Krolick, et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 77:5419(1980)).

Outros agentes citotóxicos incluem ribonucleases como descrito por Goldenberg na patente US 6.653.104. Modalidades da invenção ainda referem-se aos radioimunoconjugados onde um radionuclídeo que emite partículas alfa ou beta é estavelmente acoplado ao anticorpo, ou fragmentos de ligação ao mesmo, com ou sem o uso de um agente de formação de complexo. Ditos radionuclídeos incluem emissores beta como Fósforo-32 (32P), Escádio-47 (47Sc), Cobre-67 (67Cu), Gálio-67 (67Ga), ítrio-88 (88Y), ítrio-90 (90Y), lodo-125 (1251), lodo-131 (1311), Samário-153 (153Sm), Lutécio-177 (177Lu), Rênio-186 (186Re) ou Rênio-188 (188Re), e emissores alfa como Astatina-211 (211At), Chumbo-212 (212Pb), Bismuto-212 (212BÍ) ou -213 (213Bi) ou Actínio-225 (225Ac).

Métodos são conhecidos na técnica para a conjugação de um anticorpo ou fragmento de ligação ao mesmo em uma fração detectável e semelhantes, como por exemplo, aqueles métodos descritos por Hunter et al, Nature 144:945 (1962); David et al, Biochemistry 13:1014 (1974); Pain et al, J. Immunol. Meth. 40:219 (1981); e Nygren, J., Histochem. and Cyto- chem. 30:407 (1982).

Modalidades descritas aqui ainda incluem variantes e equivalentes que são substancialmente homólogas aos anticorpos, fragmentos de anticorpos, diabodies, SMIPs, camelbodies, nanobodies, IgNAR, polipeptídeos, regiões variáveis e CDRs estabelecidos aqui. Estas podem conter, por e- xemplo, mutações de substituição conservadoras (ou seja, a substituição de um ou mais aminoácidos por aminoácidos semelhantes). Por exemplo, substituição conservada refere-se à substituição de um aminoácido com outro dentro da mesma classe geral, por exemplo, um aminoácido ácido com outro aminoácido ácido, um aminoácido básico com outro aminoácido básico, ou um aminoácido neutro por outro aminoácido neutro. O que é entende por uma substituição do aminoácido conservador é bem conhecido na técnica.

Em outra modalidade, a invenção contempla sequências de poli-peptídeo contendo pelo menos 90% ou mais homologia de sequência a qualquer uma ou mais das sequências de polipeptídeo de fragmentos de anticorpo, regiões variáveis e CDRs estabelecidas aqui. Mais preferencial- mente, a invenção contempla sequências de polipeptídeos contendo pelo menos 95% ou mais homologia de sequência, ainda mais preferencialmente pelo menos 98% ou mais homologia de sequência, e ainda mais preferencialmente pelo menos 99% ou mais homologia de sequência a qualquer uma ou mais das sequências de polipeptídeo de fragmentos de anticorpos, regiões variáveis e CDRs estabelecidos aqui. Métodos para determinar homologia entre ácido nucleico e sequências de aminoácido são bem conhecidas aos especialistas na técnica.

Em outra modalidade, a invenção ainda contempla os homólogos de polipeptídeo mencionados acima dos fragmentos de anticorpos, regiões variáveis CDRs estabelecidas aqui ainda contendo atividade anti-CGRP. Exemplos não limitantes de atividade anti-CGRP são estabelecidos aqui, por exemplo, nos parágrafos [0329]-[0350] infra.

Em outra modalidade, a invenção ainda contempla a geração e uso de anticorpos anti-idiotípicos que se ligam a qualquer uma das sequências acima. Em uma modalidade exemplar, dito um anticorpo anti-idiotípico poderia ser administrado a um sujeito que recebeu um anticorpo anti-CGRP para modular, reduzir ou neutralizar o efeito de anticorpo anti-CGRP. Ditos anticorpos anti-idiotípicos poderiam ainda ser úteis para tratamento de uma doença autoimune caracterizada pela presença de anticorpos anti-CGRP. Outro uso exemplar de ditos anticorpos anti-idiotípicos é para detecção de anticorpos anti-CGRP da presente invenção, por exemplo, para monitorar os níveis de anticorpos anti-CGRP presentes no sangue do sujeito ou outros fluidos corporais.

A presente invenção ainda contempla anticorpos anti-CGRP compreendendo qualquer uma das sequências de polipeptídeo ou polinucleotídeo descritas aqui substituídas por qualquer uma das outras sequências de polinucleotídeos descritas aqui. Por exemplo, sem limitação, a presente invenção contempla anticorpos compreendendo a combinação de qualquer uma das sequências variáveis de cadeia leve e variáveis de cadeia pesada descritas aqui, e ainda contempla anticorpos resultando da substituição de qualquer uma das sequências CDR descritas aqui para qualquer uma das outras sequências CDR descritas aqui.

Modalidades exemplares adicionais da invenção

Em outra modalidade, a invenção contempla um ou mais anticorpos anti-CGRP humano ou fragmentos de anticorpos dos mesmos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP que especificamente se liga aos mesmos epitopos lineares ou conformacionais e/ou compete para ligação aos mesmos epitopos lineares ou conformacionais em um polipeptídeo CGRP humano intacto ou fragmento do mesmo como um anticorpo anti-CGRP humano selecionado de Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, ou Ab14. Em uma modalidade preferencial, o anticorpo anti-CGRP humano ou fragmento do mesmo especificamente se liga aos mesmos epitopos lineares ou conformacionais e/ou compete para ligação aos mesmos epitopos lineares ou conformacionais em um polipeptídeo CGRP humano intacto ou um fragmento do mesmo como Ab3, Ab6, Ab13, Ab12 ou Ab14.

Uma modalidade preferencial da invenção é direcionada aos anticorpos quiméricos e humanizados e fragmentos dos mesmos (incluindo fragmentos Fab) tendo especificidade de ligação para CGRP e inibir atividades biológicas mediadas por ligação de CGRP ao receptor de CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada a CGRP. Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, os anticorpos anti-CGRP quiméricos ou humanizados para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP são selecionados de Ab3, Ab6, Ab10, Ab13, ou Ab14.

Uma modalidade preferencial da invenção é direcionada aos métodos de triagem de anticorpos e fragmentos dos mesmos (incluindo fragmentos Fab) tendo especificidade de ligação para Peptídeo Relacionado ao Gene Calcitonina (doravante "CGRP") em modelos animais para determinar os efeitos in vivo dos mesmos, especialmente suas capacidades de antagonizar os efeitos colaterais adversos de CGRP incluindo diarreia associada com CGRP e para tratar condições que envolvem excesso de CGRP.

Outra modalidade preferencial mais específica da invenção envolve um método para avaliar a eficácia potencial in vivo de um anticorpo anti-CGRP candidato ou fragmento de anticorpo compreendendo determinar se o anticorpo inibe diarreia associada a CGRP comparado a um roedor administrado a CGRP na ausência do anticorpo CGRP candidato ou fragmento de anticorpo.

Uma modalidade mais específica da invenção envolve um método para avaliar a eficácia potencial in vivo de um anticorpo anti-CGRP candidato ou fragmento de anticorpo para tratar uma condição neurológica caracterizada por níveis aumentados de CGRP.

Outra modalidade mais específica da invenção envolve um método para avaliar a eficácia potencial in vivo de um anticorpo anti-CGRP candidato ou fragmento de anticorpo para tratar um distúrbio associado a CGRP associado com diarreia como enxaqueca ou enxaqueca crônica, (com ou sem aura), perda de peso, câncer ou tumores, angiogênese associada com crescimento de câncer ou tumor, angiogênese associada com sobrevivência de câncer ou tumor, enxaquecas hemiplágicas, dores de cabeça his- tamínicas, neuralgia enxaquecosa, dores de cabeça crônicas, dores de tensão, dores gerais, fogachos, hemicrania paroxisomal crônica, dores de cabeça secundárias devido à problema estrutural subjacente na cabeça ou pescoço, neuralgia cranial, dores de cabeça dos seios nasais (como, por exemplo, associado com sinusite), dores de cabeça ou enxaquecas induzidas por alergia, dor, dor inflamatória, dor de incisão pós-operatória, síndrome de dor regional complexa, dor de câncer, dor de câncer ósseo primário ou metastático, dor de fratura, dor crônica, dor de fratura osteoporótica, dor resultante de queimadura, osteoporose, dor de articulação com gota, dor abdominal, dor associada com crises de célula do manto, e outra dor noci- céptica, bem como carcinoma hepatocelular, câncer de mama, cirrose hepática, dor neurogênica, dor neuropática, dor nocicéptica, neuralgia trigeminal, neuralgia pós-herpética, dor do membro fantasma, fibromialgia, dor menstruai, ovarialgia, distrofia simpatética reflexa, dor neurogênica, dor de osteo- artrite ou artrite reumatoide, dor lombar, neuropatia diabética, ciática, ou dor ou dor visceral associada com: refluxo gastroesofágico, dispepsia, síndrome do intestino irritável, cólon irritável, cólon espástico, colite mucosa, doença intestinal inflamatória, Doença de Crohn, ileíte, colite ulcerativa, cólica renal, dismenorreia, cistite, período menstrual, parto, menopausa, prostatite, pancreatite, cólica renal, dismenorreia, cistite, incluindo intersticial cistite (IC), cirurgia associada com o íleo, diverticulite, peritonite, pericardite, hepatite, apendicite, colite, colecistite, endometriose, pancreatite crônica e/ou aguda, infarto do miocárdio, dor renal, dor pleural, prostatite, dor pélvica, trauma em um órgão, dor nociceptiva crônica, dor neuropática crônica, dor inflamatória crônica, fibromialgia, dor avançada e dor persistente.

Outra modalidade mais específica da invenção envolve um método para usar um anticorpo anti-CGRP ou fragmento de anticorpo para tratar um distúrbio associado a CGRP associado com diarreia em que a condição é dor de câncer que surge de malignidade de ou de câncer preferencialmente selecionado de um ou mais de: adenocarcinoma em tecido glandular, blastoma em tecido embrionário dos órgãos, carcinoma no tecido epiteli- al, leucemia em tecidos que formam células sanguíneas, linfoma em tecido linfático, mieloma em medula óssea, sarcoma em tecido conectivo ou de suporte, câncer adrenal, linfoma relacionado a AIDS, anemia, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer cerebral, câncer de mama, tumores carcinoides, câncer cervical, quimioterapia, câncer de cólon, citopenia, câncer endometrial, câncer esofágico, câncer gástrico, câncer de cabeça, câncer de pescoço, câncer hepatobiliar, câncer renal, leucemia, câncer hepático, câncer pulmonar, linfoma, doença de Hodgkin, linfoma, não Hodgkin, tumores do sistema nervoso, câncer oral, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer retal, câncer de pele, câncer de estômago, câncer testicular, câncer de tireoide, câncer uretral, câncer ósseo, sarcomas câncer do tecido co- nectivo, câncer do tecido ósseo, câncer de células formadoras do sangue, câncer de medula óssea, mieloma múltiplo, leucemias, câncer ósseo primário ou secundário, tumores que metastizam ao osso, tumores que infiltram o nervo e vísceras ocas, tumores pertos de estruturais neurais. Ainda preferencialmente a dor de câncer compreende dor visceral, preferencialmente dor visceral que surge de câncer pancreático e/ou metástases no abdômen. Ainda preferencialmente a dor de câncer compreende dor somática, preferencialmente dor somática devido a um ou mais de câncer ósseo, metástase no osso, dor pós-cirúrgico, sarcomas câncer do tecido conectivo, câncer do tecido ósseo, câncer de células formadoras do sangue da medula óssea, mieloma múltiplo, leucemia, câncer ósseo primário ou secundário.

Outra modalidade preferencial da invenção refere-se aos métodos para inibir, prevenir ou tratar diarreia e/ou manter equilíbrio de eletrólitos e níveis de fluido nos intestinos de um sujeito contendo uma condição ou tratamento associado com níveis elevados de CGRP que resultam em diarreia e/ou fluxo aumentado de eletrólitos e fluidos dos intestinos compreendendo administrar uma quantidade efetiva de um anticorpo anti-CGRP ou fragmento de anticorpo anti-CGRP.

Relacionado a este outra modalidade preferencial da invenção especificamente refere-se aos métodos para tratar ou prevenir diarreia em indivíduos com distúrbios intestinais funcionais ou doenças intestinais infla-matórias, diarreia induzida por bactéria ou vírus, câncer associado com diarreia, como, carcinoma de tireoide medular ou um câncer colorretal, e mais especificamente distúrbios intestinais funcionais ou doenças intestinais in-flamatórias, incluindo por meio de exemplo, refluxo gastroesofágico, dispepsia, síndrome do intestino irritável, síndrome de dor abdominal funcional, di- verticulose, e diverticulite ou doença intestinal inflamatória é selecionada do grupo que consiste em Doença de Crohn, ileíte, colite colagenosa, colite lin- focítica, e colite ulcerativa em que estas terapias administram uma quantidade efetiva de um anticorpo anti-CGRP ou fragmento de anticorpo administrado como uma monoterapia ou em combinação com outro agente ativo.

Outras modalidades preferenciais da presente invenção são di- recionadas para triar ensaios e usos terapêuticos de anticorpos específicos e fragmentos dos mesmos tendo especificidade de ligação para CGRP, em particular anticorpos contendo especificidade epitópica desejada, alta afinidade ou avidez e/ou propriedades funcionais. Em outras modalidades preferenciais esta invenção se refere aos ensaios e usos de anticorpos descritos aqui, compreendendo as sequências de polipeptídeos VH, VL e CDR descritas aqui, e os polinucleotídeos que codificam os mesmos. Uma modalidade preferencial da invenção é direcionada aos anticorpos quiméricos e humanizados e fragmentos dos mesmos (incluindo fragmentos Fab) capazes de se ligarem a CGRP e/ou inibir as atividades biológicas mediadas por ligação de CGRP ao receptor de CGRP ("CGRP-R").

Em outra modalidade da invenção é contemplado um método para reduzir, tratar ou prevenir doenças ou distúrbios associados com CGRP que podem incluir diarreia como um efeito colateral adverso afetando aquelas atividades biológicas mediadas por CGRP, assim, evitando as atividades biológicas através da ligação de CGRP a CGRP-R. Outra listagem não limi- tante de doenças e distúrbios associada com CGRP é fornecida aqui.

Em outra modalidade da invenção, o anticorpo anti-CGRP humano para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP é um anticorpo que especificamente se liga aos mesmos epitopos lineares ou conformacionais em um polipeptídeo CGRP intacto ou fragmento do mesmo que são especificamente ligados por Ab3, Ab6, Ab13, ou Ab14 como determinado por mapeamento epitópico usando fragmentos de peptídeos lineares de sobreposição que alcançam o comprimento completo do polipeptídeo CGRP humano nativo.

A invenção é ainda direcionada a um anticorpo anti-CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP que se liga ao mesmo epitopo CGRP e/ou compete com um anticorpo anti-CGRP para ligação a CGRP como um anticorpo ou fragmento de anticorpo revelado aqui, incluindo entre outros, um anticorpo anti-CGRP selecionado de Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, ou Ab14.

Em outra modalidade, a invenção é ainda direcionada a um anti- corpo anti-CGRP isolado ou fragmento de anticorpo para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP compreendendo uma ou mais CDRs contidas nas sequências de polipeptídeo VH selecionadas de: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, ou 133, ou uma variante da mesma, e/ou uma ou mais das CDRs contidas nas sequências de polipeptídeo VL selecionadas de: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, ou 131, ou uma variante da mesma.

Em uma modalidade da invenção, o anticorpo anti-CGRP humano discutido nos dois parágrafos anteriores compreende pelo menos 2 regiões determinantes de complementaridade (CDRs) em cada uma das regiões leve variável e pesada variável são idênticas às contidas em um anticorpo anti-CGRP humano selecionado de Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, ou Ab14.

Em uma modalidade preferencial, o anticorpo anti-CGRP humano discutido acima compreende pelo menos 2 regiões determinantes de complementaridade (CDRs) em cada região leve variável e pesada variável que são idênticas às contidas em Ab3 ou Ab6. Em outra modalidade, todas as CDRs do anticorpo anti-CGRP humano discutido acima são idênticas às CDRs contidas em um anticorpo anti-CGRP humano selecionado de Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, ou Ab14. Em uma modalidade preferencial da invenção, todas as CDRs do anticorpo anti-CGRP humano discutido acima são idênticos às CDRs contidas em um anticorpo anti-CGRP humano selecionado de Ab3 ou Ab6.

A invenção ainda contempla que um ou mais dos anticorpos anti-CGRP humanos discutidos acima para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP que são aglicosilados; ou minimamente glicosila- dos, por exemplo, que não têm N-glicosilação, mas podem compreender alguma O-glicosilação, como, resíduos de manose, e/ou que contêm uma região Fc que foi modificada alterar função efetora, meia-vida, proteólise, e/ou glicosilação; são humanos, humanizados, cadeia simples ou quiméricos; e são um anticorpo humanizado derivado de um anticorpo anti-CGRP humano de coelho (parente).

A invenção ainda contempla um ou mais anticorpos anti-CGRP humanos para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP em que as regiões estruturais (FRs) na região leve variável e a região pesada variável de dito anticorpo respectivamente são FRs humanas que são não modificadas ou que foram modificadas pela substituição de um ou mais resíduos FR humanos na região leve variável ou cadeia pesada com os resíduos FR correspondente do anticorpo de coelho parente, e em que ditas FRs humanas foram derivadas de sequências de anticorpo de cadeia pesada e cadeia leve humanas que foram selecionadas de uma biblioteca de sequências de anticorpo de linhagem germinativa humana baseada em seus altos níveis de homologia às correspondentes regiões de cadeia variável pesada ou leve de coelho em relação às outras sequências de anticorpo de linhagem germinativa humana contidas na biblioteca.

Em uma modalidade da invenção, o anticorpo anti-CGRP humano ou fragmento para o tratamento ou prevenção de diarreia associada com CGRP especificamente se liga a células humanas que expressam CGRP e/ou para moléculas CGRP solúveis em circulação ín vivo, incluindo CGRP expresso em ou por células humanas em um paciente com uma doença associada com células que expressam CGRP.

Em outra modalidade, a doença relacionada a CGRP que pode ser associada com diarreia é selecionada de enxaquecas (com ou sem aura), perda de peso, câncer ou tumores, angiogênese associada com crescimento de câncer ou tumor, angiogênese associada com sobrevivência de câncer ou tumor, enxaquecas hemiplágicas, dores de cabeça histamínicas, neuralgia enxaquecosa, dores de cabeça crônicas, dores de tensão, dores gerais, fogachos, hemicrania paroxisomal crônica, dores de cabeça secundárias devido à problema estrutural subjacente na cabeça ou pescoço, neuralgia cranial, dores de cabeça dos seios nasais (como, por exemplo, associado com sinusite), dores de cabeça ou enxaquecas induzidas por alergia, dor, dor inflamatória, dor de incisão pós-operatória, síndrome de dor regional complexa, dor de câncer, dor de câncer ósseo primário ou metastático, dor de fratura, dor crônica, dor de fratura osteoporótica, dor resultante de queimadura, osteoporose, dor de articulação com gota, dor abdominal, dor associada com crises de célula do manto, e outra dor nocicéptica, bem como carcinoma hepatocelular, câncer de mama, cirrose hepática, dor neurogênica, dor neuropática, dor nocicéptica, neuralgia trigeminal, neuralgia pós- herpética, dor do membro fantasma, fibromialgia, dor menstrual, ovarialgia, distrofia simpatética reflexa, dor neurogênica, dor de osteoartrite ou artrite reumatoide, dor lombar, neuropatia diabética, ciática, ou dor ou dor visceral associada com: refluxo gastroesofágico, dispepsia, síndrome do intestino irritável, cólon irritável, cólon espástico, colite mucosa, doença intestinal inflamatória, Doença de Crohn, ileíte, colite ulcerativa, cólica renal, dismenor- reia, cistite, período menstrual, parto, menopausa, prostatite, pancreatite, cólica renal, dismenorreia, cistite, incluindo intersticial cistite (IC), cirurgia associada com o íleo, diverticulite, peritonite, pericardite, hepatite, apendicite, colite, colecistite, endometriose, pancreatite crônica e/ou aguda, infarto do miocárdio, dor renal, dor pleural, prostatite, dor pélvica, trauma em um órgão, dor nociceptiva crônica, dor neuropática crônica, dor inflamatória crônica, fibromialgia, dor avançada e dor persistente.

Em outra modalidade da invenção, a doença tratada que pode ser associada com diarreia é dor de câncer que surge de malignidade ou de câncer preferencialmente selecionada de um ou mais de: adenocarcinoma em tecido glandular, blastoma em tecido embrionário dos órgãos, carcinoma no tecido epitelial, leucemia em tecidos que formam células sanguíneas, lin- foma em tecido linfático, mieloma em medula óssea, sarcoma em tecido co- nectivo ou de suporte, câncer adrenal, linfoma relacionado a AIDS, anemia, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer cerebral, câncer de mama, tumores carcinoides, câncer cervical, quimioterapia, câncer de cólon, citopenia, câncer endometrial, câncer esofágico, câncer gástrico, câncer de cabeça, câncer de pescoço, câncer hepatobiliar, câncer renal, leucemia, câncer hepático, câncer pulmonar, linfoma, doença de Hodgkin, linfoma, não Hodgkin, tumores do sistema nervoso, câncer oral, câncer ovariano, câncer pancreáti- co, câncer de próstata, câncer retal, câncer de pele, câncer de estômago, câncer testicular, câncer de tireoide, câncer uretral, câncer ósseo, sarcomas câncer do tecido conectivo, câncer do tecido ósseo, câncer de células formadoras do sangue, câncer de medula óssea, mieloma múltiplo, leucemias, câncer ósseo primário ou secundário, tumores que metastizam ao osso, tumores que infiltram o nervo e vísceras ocas, tumores pertos de estruturais neurais. Ainda preferencialmente a dor de câncer compreende dor visceral, preferencialmente dor visceral que surge de câncer pancreático e/ou metás- tases no abdômen. Ainda preferencialmente a dor de câncer compreende dor somática, preferencialmente dor somática devido a um ou mais de câncer ósseo, metástase no osso, dor pós-cirúrgico, sarcomas câncer do tecido conectivo, câncer do tecido ósseo, câncer de células formadoras do sangue da medula óssea, mieloma múltiplo, leucemia, câncer ósseo primário ou secundário.

A invenção ainda contempla anticorpos anti- CGRP humanos ou fragmentos diarreia direta ou indiretamente ligada a um marcador detectável ou agente terapêutico.

A invenção ainda contempla uma ou mais sequências de ácido nucleico que resultam na expressão de um anticorpo anti-CGRP humano ou fragmento de anticorpo como estabelecido acima, incluindo aquelas com-preendendo, ou alternativamente consistindo em, códons preferenciais de leveduras ou humanos. A invenção ainda contempla vetores (incluindo plasmídeos ou vetores virais recombinantes) compreendendo ditas sequências de ácido nucleico. A invenção ainda contempla células hospedeiras ou células hospedeiras recombinantes que expressam pelo menos um dos anticorpos estabelecidos acima, incluindo células de mamíferos, leveduras, bactérias e insetos. Em uma modalidade preferencial, a célula hospedeira é uma célula de levedura. Em outra modalidade preferencial, a célula de levedura é uma célula de levedura diploidal. Em uma modalidade mais preferencial, a célula de levedura é uma levedura Pichia.

A invenção ainda contempla um método para tratamento com-preendendo administrar a um paciente com uma doença ou condição associada com células que expressam CGRP que resultam em diarreia ou uma quantidade terapeuticamente efetiva de pelo menos um anticorpo anti-CGRP humano ou fragmento descrito aqui. A invenção ainda contempla que o método de tratamento pode envolver a administração de dois ou mais anticorpos anti-CGRP ou fragmentos dos mesmos e revelados aqui. Se mais do que um anticorpo é administrado ao paciente, os vários anticorpos podem ser administrados simultaneamente ou concomitantemente, ou podem ser escalonados em suas administrações. As doenças que podem ser tratadas são apresentadas na lista não limitante estabelecida acima e em outro ponto aqui. Em uma modalidade preferencial, a doença é selecionada de enxaqueca, dor de cabeça, perda de peso, dor, dor de câncer ou dor neuropática. Em outra modalidade o tratamento ainda inclui a administração de outro agente terapêutico ou regime selecionado de quimioterapia, radioterapia, administração de citocina ou terapia gênica.

Em uma modalidade não limitante da invenção, outro agente te-rapêutico ou regime inclui opioides, analgésicos como, NSAIDs, Taxol (paclitaxel) ou seus derivados, compostos de platina como, carboplatina ou cisplatina, antrociclinas como, doxorubicina, agentes alquilantes como, ciclofosfa- mida, antimetabólitos como, 5-fluoruracil, ou etoposídeo.

A invenção ainda contempla um método para imagear in vivo que detecta a presença de células que expressam CGRP compreendendo administrar uma quantidade diagnosticamente efetiva de pelo menos um anticorpo anti-CGRP humano. Em uma modalidade, dita administração ainda inclui a administração de um radionuclídeo ou fluróforo que facilita a detecção do anticorpo em sítios de doença que expressam CGRP. Em outra modalidade, os resultados de dito método de imagem in vivo são usados para facilitar o desenho de um regime terapêutico apropriado, incluindo regimes terapêuticos incluindo radioterapia, quimioterapia ou uma combinação dos mesmos.

A atividade anti-CGRP dos anticorpos anti-CGRP da presente invenção, e fragmentos dos mesmos tendo especificidade de ligação para uma derreia por CGRP, pode ainda ser descrita por sue força de ligação ou sua afinidade para CGRP. Em uma modalidade da invenção, os anticorpos anti-CGRP da presente invenção, e fragmentos dos mesmos tendo especificidade de ligação a CGRP, se ligam a CGRP como uma constante de dissociação (KD) de menos do que ou igual a 5x10-7 M, 10-7 M, 5x10-8 M, 10-8 M, 5x10-9 M, 10-9 M, 5x10-10 M, 10-10 M, 5x10-11 M, 10-11 M, 5x10-12 M, 10-12 M, 5x10-13 M, ou 10-13 M. Preferencialmente, os anticorpos anti- CGRP e fragmentos dos mesmos se ligam a CGRP como uma constante de dissociação de menos do que ou igual a 10-11 M, 5x10-12 M, ou 10-12 M. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos anti-CGRP da presente invenção, e fragmentos dos mesmos tendo especificidade de ligação a C- GRP, se ligam a um epitopo linear ou conformacional de CGRP.

Em outra modalidade da invenção, a atividade de anti-CGRP dos anticorpos anti-CGRP da presente invenção, e fragmentos dos mesmos tendo especificidade de ligação para CGRP, se ligam a CGRP com uma off- rate de menos do que ou igual a 10-4 S-1, 5x10-5 S-1, 10-5 S-1, 5x10-6 S-1, 10-6 S-1,5x10-7 S-1, ou 10-7 S-1.

Em outra modalidade da invenção, a atividade de anti-CGRP dos anticorpos anti-CGRP da presente invenção, e fragmentos dos mesmos tendo especificidade de ligação para CGRP, apresentam atividade de anti- CGRP prevenindo, melhorando ou reduzindo os sintomas de, ou alternativamente tratando, doenças e distúrbios associados com CGRP especialmente diarreia. Exemplos não limitantes de doenças e distúrbios associados com CGRP são estabelecidos aqui.

Polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpo anti-CGRP Anticorpo Ab 1

A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 1: CAAGTGCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGT GGGAAGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGAT AACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAG CAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGT TCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCT GGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGT AGTAGTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGT CAAACGT (SEQ ID NO: 141).

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 2: CAAGTGCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGT GGGAAGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGAT AACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAG CAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGT TCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCT GGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGT AGTAGTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTC AAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATG AGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTT CTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCA ATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAG CACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGA GAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTC GCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 142).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 3: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTG GGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGACTCGACCTCAGTA GCTACTACATGCAATGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAAT GGATCGGAGTCATTGGTATTAATGATAACACATACTACGCGAGCTGGG GAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGCCTCGTCGACCACGGTGGATCT GAAAATGACCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCC AGAGGGGACATCTGGGGCCCAGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 143).

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou altemativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 4: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTG GGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGACTCGACCTCAGTA GCTACTACATGCAATGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAAT GGATCGGAGTCATTGGTATTAATGATAACACATACTACGCGAGCTGGGC GAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGCCTCGTCGACCACGGTGGATCT GAAAATGACCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCC AGAGGGGACATCTGGGGCCCAGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGC CTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCAcCCTCCTCCAAGAG CACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTT CCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCG GCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCT CAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTA CATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAG AGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA GCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAA CCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTG GTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTAC GTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGA GCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCA CCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAA AGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCA GCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGAT GACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCC CAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACA ACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACG TCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCA GAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 144).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 146; e SEQ ID NO: 147 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 2.

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 148; SEQ ID NO: 149; e SEQ ID NO: 150 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 3 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 4.

A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeos incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 141 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 1; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 142 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 2; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 143 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 3; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 144 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 4; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 146; e SEQ ID NO: 147) que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 1 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 2; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de com-plementaridade (SEQ ID NO: 148; SEQ ID NO: 149; e SEQ ID NO: 150) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 3 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 4.

Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) tendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab1, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab1 completo compreendem, ou alternativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 142 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 2; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 144 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 4.

Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células mamíferas, como células CHO, NSO, HEK-293, ou sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab1 após expressão dos polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab1 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de polinucleotídeos Ab1 em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos, ou microbianos como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Anticorpo Ab2

A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codifi- cam polipeptídeos de anticorpo tendo especificidade de ligação à CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 11: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcac catcAATtgcCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGATAACAACTACCTAGCCtggt atcagcagaaaccagggaaagttcctaagCAActgatctatT CT ACATCCACT CTGGCAT C Tggggtcccatctcgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcc tgaagatgttgcaacttattactgtCT AG G C AGTT AT GATT GT AGT AGT G GT G ATT GTT TTGTTttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgt (SEQ ID NO: 151).

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 12: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcac catcAATtgcCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGATAACAACTACCTAGCCtggt atcagcagaaaccagggaaagttcctaagCAActgatctatT CT ACATCCACT CTGGCAT C Tggggtcccatctcgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcc tgaagatgttgcaacttattactgtCT AG G C AGTT AT GATT GT AGT AGT G GT G ATT GTT TTGTTttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgtACGGTGGCTGCACCATCTGT CTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCT GTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGT GGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCA CAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGA CGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAG TCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGG GAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 152).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 13: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagact ctcctgtgcaGTCtctggaCTCGACCTCagtAGCTACTACATGCAAtgggtccgtcaggc tccagggaaggggctggagtgggtcGGAGTCATTGGTATCAATGATAACACATACT AC G C GAG CT G G G C G AAAG G Ccgattcaccatctccagagacaattccaag AC C AC G G TGtatcttcaaatgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtGCTAGAGGGGA CATCtggggccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGC (SEQ ID NO: 153)

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou altemativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 14: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagact ctcctgtgcaGTCtctggaCTCGACCTCagtAGCTACTACATGCAAtgggtccgtcaggc tccagggaaggggctggagtgggtcGGAGTCATTGGTATCAATGATAACACATACT AC G C G AG CTG G G C G AAAG G Ccgattcaccatctccagagacaattccaag AC C AC G G TGtatcttcaaatgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtGCTAGAGGGGA CATCtggggccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCAT CGGTCTTCCCCCTGGCAcCCTCCTCCaAGAGCACCTCTGGGGGCACAG CGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACG GTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCG GCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACC GTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAAT CACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCT TGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC ATGaTCTCCCgGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCAC GTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAA TGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCC CATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACA GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGT CAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGT GGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGC CTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCAC CGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGT GATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCT GTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 154).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 156; e SEQ ID NO: 157 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 11 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 12.

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 158; SEQ ID NO: 159; e SEQ ID NO: 160 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 13 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 14.

A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeos incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 151 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 11; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 152 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 12; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 153 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 13; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 154 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 14; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 156; e SEQ ID NO: 157) que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 11 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 12; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de com-plementaridade (SEQ ID NO: 158; SEQ ID NO: 159; e SEQ ID NO: 160) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 13 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 14.

Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) tendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab2, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab2 completo compreendem, ou alternativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 152 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 12; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 154 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 14.

Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células mamíferas, como células CHO, NSO, HEK-293, ou sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab2 após expressão dos polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab2 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de polinucleotídeos Ab2 em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos, ou microbianos como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Anticorpo Ab3

A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpo tendo especificidade de ligação à CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 21: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcac catcAATtgcCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGATAACAACTACCTAGCCtggt atcagcagaaaccagggaaagttcctaagCAActgatctatTCTACATCCACTCTGGCATC Tggggtcccatctcgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcc tgaagatgttgcaacttattactgtCT AG G C AGTT AT GATT GT AGT AGT G GT G ATT GTT TTGTTttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgt (SEQ ID NO: 161).

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 22: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcac catcAATtgcCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGATAACAACTACCTAGCCtggt atcagcagaaaccagggaaagttcctaagCAActgatctatTCTACATCCACTCTGGCATC Tggggtcccatctcgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcc tgaagatgttgcaacttattactgtCT AG G C AGTT AT GATT GT AGT AGT G GT G ATT GTT TTGTTttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgtACGGTGGCTGCACCATCTGT CTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCT GTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGT GGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCA CAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGA CGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAG TCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGG GAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 162).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 23: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagact ctcctgtgcaGTCtctggaCTCGACCTCagtAGCTACTACATGCAAtgggtccgtcaggc tccagggaaggggctggagtgggtcGGAGTCATTGGTATCAATGATAACACATACT AC G C GAG CT G G G C G AAAG G Ccgattcaccatctccagagacaattccaag AC C AC G G TGtatcttcaaatgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtGCTAGAGGGGA CATCtggggccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGC (SEQ ID NO: 163)..

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou altemativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 24: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagact ctcctgtgcaGTCtctggaCTCGACCTCagtAGCTACTACATGCAAtgggtccgtcaggc tccagggaaggggctggagtgggtcGGAGTCATTGGTATCAATGATAACACATACT AC G C G AG CTG G G C G AAAG G Ccgattcaccatctccagagacaattccaag AC C AC G G TGtatcttcaaatgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtGCTAGAGGGGA CATCtggggccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCAT CGGTCTTCCCCCTGGCAcCCTCCTCCaAGAGCACCTCTGGGGGCACAG CGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACG GTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCG GCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACC GTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAAT CACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACGCGAGAGTTGAGCCCAAATCT TGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC ATGaTCTCCCgGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCAC GTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAA TGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCC CATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACA GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGT CAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGT GGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGC CTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCAC CGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGT GATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCT GTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 164).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 166; e SEQ ID NO: 167 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 21 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 22.

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 168; SEQ ID NO: 169; e SEQ ID NO: 170 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 23 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 24.

A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeos incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 161 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 21; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 162 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 22; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 163 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 23; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 164 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 24; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 166; e SEQ ID NO: 167) que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 21 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 22; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de com-plementaridade (SEQ ID NO: 168; SEQ ID NO: 169; e SEQ ID NO: 170) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 23 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 24.

Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) tendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab3, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab3 completo compreendem, ou alternativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 162 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 22; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 164 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 24.

Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células mamíferas, como células CHO, NSO, HEK-293, ou sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab3 após expressão dos polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab3 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de polinucleotídeos Ab3 em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos, ou microbianos como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Anticorpo Ab4

A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpo tendo especificidade de ligação à CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 31: CAAGTGCTGACCCAGACTCCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGT GGGAAGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCAT AACACCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAA CAACTGATCTATGATGCATCCACTCTGGCGTCTGGGGTCCCATCGCGGT TCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCG TGCAGTGTAACGATGCTGCCGCTTACTACTGTCTGGGCAGTTATGATTG TACTAATGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGT CAAACGT (SEQ ID NO: 171).

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 32: CAAGTGCTGACCCAGACTCCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGT GGGAAGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCAT AACACCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAA CAACTGATCTATGATGCATCCACTCTGGCGTCTGGGGTCCCATCGCGGT TCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCG TGCAGTGTAACGATGCTGCCGCTTACTACTGTCTGGGCAGTTATGATTG TACTAATGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTC AAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATG AGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTT CTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCA ATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAG CACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGA GAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTC GCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 172).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 33: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTG GGACACCCCTGACACTCACCTGTTCCGTCTCTGGCATCGACCTCAGTG GCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAAT GGATCGGAGTCATTGGTATTAATGGTGCCACATACTACGCGAGCTGGG CGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGGATCT GAAAATGACCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCC AGAGGGGACATCTGGGGCCCGGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 173).

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 34: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTG GGACACCCCTGACACTCACCTGTTCCGTCTCTGGCATCGACCTCAGTG GCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAAT GGATCGGAGTCATTGGTATTAATGGTGCCACATACTACGCGAGCTGGG CGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGGATCT GAAAATGACCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCC AGAGGGGACATCTGGGGCCCGGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGC CTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCAcCCTCCTCCAAGAG CACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTT CCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCG GCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCT CAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTA CATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAG AGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA GCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAA CCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTG GTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTAC GTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGA GCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCA CCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAA AGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCA GCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGAT GACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCC CAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACA ACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACG TCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCA GAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 174).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 175; SEQ ID NO: 176; e SEQ ID NO: 177 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 31 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 32.

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 178; SEQ ID NO: 179; e SEQ ID NO: 180 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 33 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 34.

A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeos incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 171 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 31; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 172 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 32; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 173 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 33; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 174 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 34; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 175; SEQ ID NO: 176; e SEQ ID NO: 177) que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 31 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 32; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de com-plementaridade (SEQ ID NO: 178; SEQ ID NO: 179; e SEQ ID NO: 180) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 33 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 34.

Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) tendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab4, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab4 completo compreendem, ou alternativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 172 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 32; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 174 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 34.

Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células mamíferas, como células CHO, NSO, HEK-293, ou sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab4 após expressão dos polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab4 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de polinucleotídeos Ab4 em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos, ou microbianos como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Anticorpo Ab5

A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpo tendo especificidade de ligação à CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou altemativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 41: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcac catcAATtgcCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCATAACACCTACCTGGCCtggt atcagcagaaaccagggaaagttcctaagCAActgatctatGATGCATCCACTCTGGCAT CTggggtcccatctcgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcag cctgaagatgttgcaacttattactgtCT G G G C AGTT AT G ATT GTACT AAT G GT G ATT G TTTTGTTttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgt (SEQ ID NO: 181).

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 42: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcac catcAATtgcCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCATAACACCTACCTGGCCtggt atcagcagaaaccagggaaagttcctaagCAActgatctatGATGCATCCACTCTGGCAT CTggggtcccatctcgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcag cctgaagatgttgcaacttattactgtCT G G G C AGTT AT G ATT GTACT AAT G GT G ATT G TTTTGTTttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgtACGGTGGCTGCACCATCT GTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCT CTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACA GTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGT CACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCT GACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGA AGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACA GGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 182).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 43: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagact ctcctgtgcaGTCtctggaATCGACCTCagtGGCTACTACATGAACtgggtccgtcaggc tccagggaaggggctggagtgggtcGGAGTCATTGGTATTAATGGTGCCACATACT AC G C G AG CTG G G C G AAAG G Ccgattcaccatctccagagacaattccaag AC C AC G G TGtatcttcaaatgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtGCTAGAGGGGA CATCtggggccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGC (SEQ ID NO: 183).

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 44: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagact ctcctgtgcaGTCtctggaATCGACCTCagtGGCTACTACATGAACtgggtccgtcaggc tccagggaaggggctggagtgggtcGGAGTCATTGGTATTAATGGTGCCACATACT AC G C G AG CTG G G C G AAAG G Ccgattcaccatctccagagacaattccaag AC C AC G G TGtatcttcaaatgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtGCTAGAGGGGA CATCtggggccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCAT CGGTCTTCCCCCTGGCAcCCTCCTCCaAGAGCACCTCTGGGGGCACAG CGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACG GTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCG GCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACC GTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAAT CACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCT TGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC ATGaTCTCCCgGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCAC GTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAA TGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCC CATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACA GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGT CAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGT GGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGC CTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCAC CGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGT GATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCC TGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 184).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 185; SEQ ID NO: 186; e SEQ ID NO: 187 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 41 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 42.

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 188; SEQ ID NO: 189; e SEQ ID NO: 190 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 43 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 44.

A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeos in- cluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 181 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 41; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 182 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 42; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 183 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 43; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 184 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 44; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 185; SEQ ID NO: 186; e SEQ ID NO: 187) que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 41 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 42; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 188; SEQ ID NO: 189; e SEQ ID NO: 190) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 43 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 44.

Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) tendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab5, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab5 completo compreendem, ou altemativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 182 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 42; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 184 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 44.

Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células mamíferas, como células CHO, NSO, HEK-293, ou sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalida- de da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab5 após expressão dos polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab5 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de polinucleotídeos Ab5 em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos, ou microbianos como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Anticorpo Ab6

A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpo tendo especificidade de ligação à CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 51: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcac catcAATtgcCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCATAACACCTACCTGGCCtggt atcagcagaaaccagggaaagttcctaagCAActgatctatGATGCATCCACTCTGGCAT CTggggtcccatctcgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcag cctgaagatgttgcaacttattactgtCT G G G C AGTT AT G ATT GTACT AAT G GT G ATT G TTTTGTTttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgt (SEQ ID NO: 191).

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 52: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcac catcAATtgcCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCATAACACCTACCTGGCCtggt atcagcagaaaccagggaaagttcctaagCAActgatctatGATGCATCCACTCTGGCAT CTggggtcccatctcgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcag cctgaagatgttgcaacttattactgtCT G G G C AGTT AT G ATT GTACT AAT G GT G ATT G TTTTGTTttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgtACGGTGGCTGCACCATCT GTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCT CTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACA GTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGT CACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCT GACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGA AGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAG GGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 192).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 53: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagact ctcctgtgcaGTCtctggaATCGACCTCagtGGCTACTACATGAACtgggtccgtcaggc tccagggaaggggctggagtgggtcGGAGT CATTGGTATTAATGGTGCCACATACT AC G C G AG CTG G G C G AAAG G Ccgattcaccatctccagagacaattccaag AC C AC G G TGtatcttcaaatgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtGCTAGAGGGGA CATCtggggccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGC (SEQ ID NO: 193).

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 54: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagact ctcctgtgcaGTCtctggaATCGACCTCagtGGCTACTACATGAACtgggtccgtcaggc tccagggaaggggctggagtgggtcGGAGTCATTGGTATTAATGGTGCCACATACT AC G C G AG CTG G G C G AAAG G Ccgattcaccatctccagagacaattccaag AC C AC G G TGtatcttcaaatgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtGCTAGAGGGGA CATCtggggccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCAT CGGTCTTCCCCCTGGCAcCCTCCTCCaAGAGCACCTCTGGGGGCACAG CGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACG GTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCG GCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACC GTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAAT CACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACGCGAGAGTTGAGCCCAAATCT TGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC ATGaTCTCCCgGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCAC GTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAA TGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCC CATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACA GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGT CAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGT GGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGC CTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCAC CGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGT GATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCT GTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 194).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 195; SEQ ID NO: 196; e SEQ ID NO: 197 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 51 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 52.

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 198; SEQ ID NO: 199; e SEQ ID NO: 200 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 53 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 54.

A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeos incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 191 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 51; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 192 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 52; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 193 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 53; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 194 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 54; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 195; SEQ ID NO: 196; e SEQ ID NO: 197) que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 51 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 52; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de com-plementaridade (SEQ ID NO: 198; SEQ ID NO: 199; e SEQ ID NO: 200) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 53 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 54.

Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou altemativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) tendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab6, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab6 completo compreendem, ou altemativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 192 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 52; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 194 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 54.

Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células mamíferas, como células CHO, NSO, HEK-293, ou sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab6 após expressão dos polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab6 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de polinucleotídeos Ab6 em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos, ou microbianos como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Anticorpo Ab7

A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpo tendo especificidade de ligação à CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 61: CAAGTGCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGT GGGAAGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATAAT TACAACTACCTTGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAG CAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGAT TCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACGT GCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGACTGT AGTACTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGT CAAACGT (SEQ ID NO: 201).

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 62: CAAGTGCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGT GGGAAGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATAAT TACAACTACCTTGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAG CAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGAT TCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACGT GCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGACTGT AGTACTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTC AAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATG AGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTT CTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCA ATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAG CACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGA GAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTC GCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 202).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 63: CAGGAGCAGCTGAAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGC CTGGGACATCCCTGACACTCACCTGCACCGTCTCTGGAATCGACCTCA GTAACCACTACATGCAATGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGG AGTGGATCGGAGTCGTTGGTATTAATGGTCGCACATACTACGCGAGCTG GGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGTCGACCACGGTGGA TCTGAAAATGACCAGGCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGT GCCAGAGGGGACATCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCGA GC (SEQ ID NO: 203).

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 64: CAGGAGCAGCTGAAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGC CTGGGACATCCCTGACACTCACCTGCACCGTCTCTGGAATCGACCTCA GTAACCACTACATGCAATGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGG AGTGGATCGGAGTCGTTGGTATTAATGGTCGCACATACTACGCGAGCTG GGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGTCGACCACGGTGGA TCTGAAAATGACCAGGCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGT GCCAGAGGGGACATCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAG CGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCAcCCTCCTCCAA GAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACT ACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCA GCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACT CCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGA CCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAA GAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGC CCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCA AAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGC GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGG TACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGA GGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCT GCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAA CAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGG GCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGG AGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCT ATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAG AACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC TTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGG AACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACA CGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 204).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 205; SEQ ID NO: 206; e SEQ ID NO: 207 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 61 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 62.

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 208; SEQ ID NO: 209; e SEQ ID NO: 210 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 63 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 64.

A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeos incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 201 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 61; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 202 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 62; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 203 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 63; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 204 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 64; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 205; SEQ ID NO: 206; e SEQ ID NO: 207) que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 61 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 62; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de com-plementaridade (SEQ ID NO: 208; SEQ ID NO: 209; e SEQ ID NO: 210) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 63 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 64.

Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) tendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab7, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab7 completo compreendem, ou altemativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 202 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 62; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 204 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 64.

Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células mamíferas, como células CHO, NSO, HEK-293, ou sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab7 após expressão dos polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab7 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de polinucleotídeos Ab7 em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos, ou microbianos como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Anticorpo Ab8

A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpo tendo especificidade de ligação à CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 71: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcac catcAATtgcCAGGCCAGTCAGAGTGTTTAcAATTACAACTACCTTGCCtggtat cagcagaaaccagggaaagttcctaagCAActgatctatT CT ACATCCACT CTGGCAT CT ggggtcccatctcgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcct gaagatgttgcaacttattactgtCT G G G C AGTT AT G ATT GT AGT ACTG GT G ATT GTT TTGTTttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgt (SEQ ID NO: 211).

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 72: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcac catcAATtgcCAGGCCAGTCAGAGTGTTTAcAATTACAACTACCTTGCCtggtat cagcagaaaccagggaaagttcctaagCAActgatctatTCTACATCCACTCTGGCATCT ggggtcccatctcgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcct gaagatgttgcaacttattactgtCT G G G C AGTT AT G ATT GT AGT ACTG GT G ATT GTT TTGTTttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgtACGGTGGCTGCACCATCTGT CTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCT GTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGT GGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCA CAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGA CGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAG TCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCC- GTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 212).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 73: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcac catcAATtgcCAGGCCAGTCAGAGTGTTTAcAATTACAACTACCTTGCCtggtat cagcagaaaccagggaaagttcctaagCAActgatctatTCTACATCCACTCTGGCATCT ggggtcccatctcgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcct gaagatgttgcaacttattactgtCT G G G C AGTT AT G ATT GT AGT ACTG GT G ATT GTT TTGTTttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgtACGGTGGCTGCACCATCTGT CTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCT GTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGT GGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCA CAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGA CGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAG TCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCC- GTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 212). (SEQ ID NO: 213).

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 74: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagact ctcctgtgcaGTCtctggaATCGACCTCagtAACCACTACATGCAAtgggtccgtcaggct ccagggaaggggctggagtgggtcGGAGTCGTTGGTATcAATGGTCGCACATACTA C G C GAG CT G G G C G AAAG G Ccgattcaccatctccagagacaattccaag AC C AC G GT GtatcttcaaatgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtGCTAGAGGGGAC ATCtggggccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATC GGTCTTCCCCCTGGCAcCCTCCTCCaAGAGCACCTCTGGGGGCACAGC GGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGT GTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGG CTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGT GCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCA CAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTG TGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGG GGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATG aTCTCCCgGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAC GAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTG CATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTAC CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGC AAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATC GAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTG TACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGC CTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTG GACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATG CATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTC CGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 214).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 215; SEQ ID NO: 216; e SEQ ID NO: 217 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 71 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 72.

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 218; SEQ ID NO: 219; e SEQ ID NO: 220 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 73 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 74.

A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeos incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 211 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 71; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 212 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 72; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 213 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 73; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 214 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 74; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 215; SEQ ID NO: 216; e SEQ ID NO: 217) que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 71 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 72; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de com-plementaridade (SEQ ID NO: 218; SEQ ID NO: 219; e SEQ ID NO: 220) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 73 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 74.

Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) tendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab8, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab8 completo compreendem, ou alternativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 212 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 72; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 214 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 74.

Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células mamíferas, como células CHO, NSO, HEK-293, ou sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab8 após expressão dos polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab8 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de polinucleotídeos Ab8 em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos, ou microbianos como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Anticorpo Ab9

A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpo tendo especificidade de ligação à CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 81: CAAGTGCTGACCCAGACTCCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGT GGGAAGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAATGTTTATAAT AACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAG CAACTGATCTATTCTACGTCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGAT TCAGAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACG TGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGATTG TAGTCGTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTG GTCAAACGT (SEQ ID NO: 221).

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 82: CAAGTGCTGACCCAGACTCCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGT GGGAAGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAATGTTTATAAT AACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAG CAACTGATCTATTCTACGTCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGAT TCAGAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACG TGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGATTG TAGTCGTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGT CAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGAT GAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACT TCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCC AATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACA GCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACG AGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCT CGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 222).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 83: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTG GGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGAATCGGCCTCAGTA GCTACTACATGCAGTGGGTCCGCCAGTCTCCAGGGAGGGGGCTGGAAT GGATCGGAGTCATTGGTAGTGATGGTAAGACATACTACGCGACCTGGG CGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAGACCTCGTCGACCACGGTGGATC TGAGAATGGCCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTAC CAGAGGGGACATCTGGGGCCCGGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 223).

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 84: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTG GGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGAATCGGCCTCAGTA GCTACTACATGCAGTGGGTCCGCCAGTCTCCAGGGAGGGGGCTGGAAT GGATCGGAGTCATTGGTAGTGATGGTAAGACATACTACGCGACCTGGG CGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAGACCTCGTCGACCACGGTGGATC TGAGAATGGCCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTAC CAGAGGGGACATCTGGGGCCCGGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCG CCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCAcCCTCCTCCAAGA GCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTAC TTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGC GGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCC CTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACC TACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGA GAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCC AGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAA ACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGT GGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTA CGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGG AGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGC ACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA AAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGC AGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAG ATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATC CCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAAC AACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTC CTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGC AGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 224).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 225; SEQ ID NO: 226; e SEQ ID NO: 227 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 81 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 82.

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 228; SEQ ID NO: 229; e SEQ ID NO: 230 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 83 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 84.

A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeos incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 221 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 81; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 222 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 82; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 223 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 83; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 224 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 84; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 225; SEQ ID NO: 226; e SEQ ID NO: 227) que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 81 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 82; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de com-plementaridade (SEQ ID NO: 228; SEQ ID NO: 229; e SEQ ID NO: 230) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 83 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 84.

Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) tendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab9, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab9 completo compreendem, ou alternativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 222 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 82; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 224 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 84.

Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células mamíferas, como células CHO, NSO, HEK-293, ou sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab9 após expressão dos polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab9 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de polinucleotídeos Ab9 em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos, ou microbianos como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Anticorpo Ab10

A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpo tendo especificidade de ligação à CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 91: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcac catcAATtgcCAGGCCAGTCAGAATGTTTAcAATAACAACTACCTAGCCtggtat cagcagaaaccagggaaagttcctaagCAActgatctatTCTACATCCACTCTGGCATCT ggggtcccatctcgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcct gaagatgttgcaacttattactgtCTGGGCAGTTATGATTGTAGTCGTGGTGATTGTT TTGTTttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgt (SEQ ID NO: 231).

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 92: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcac catcAATtgcCAGGCCAGTCAGAATGTTTAcAATAACAACTACCTAGCCtggtat cagcagaaaccagggaaagttcctaagCAActgatctatTCTACATCCACTCTGGCATCT ggggtcccatctcgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcct gaagatgttgcaacttattactgtCTGGGCAGTTATGATTGTAGTCGTGGTGATTGTT TTGTTttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgtACGGTGGCTGCACCATCTGT CTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCT GTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGT GGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCA CAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGA CGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAG TCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGG GGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 232).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 93: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagact ctcctgtgcaGTCtctggaATCGGCCTCagtAGCTACTACATGCAAtgggtccgtcaggc tccagggaaggggctggagtgggtcGGAGTCATTGGTAGTGATGGTAAGACATACT AC G C G AC CTG G G C G AAAG G Ccgattcaccatctccagagacaattccaag AC C AC G G TGtatcttcaaatgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtACCAGAGGGGA CATCtggggccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGC (SEQ ID NO: 233).

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou altemativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 94: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagact ctcctgtgcaGTCtctggaATCGGCCTCagtAGCTACTACATGCAAtgggtccgtcaggc tccagggaaggggctggagtgggtcGGAGTCATTGGTAGTGATGGTAAGACATACT AC G C G AC CTG G G C G AAAG G Ccgattcaccatctccagagacaattccaag AC C AC G G TGtatcttcaaatgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtACCAGAGGGGA CATCtggggccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCAT CGGTCTTCCCCCTGGCAcCCTCCTCCaAGAGCACCTCTGGGGGCACAG CGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACG GTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCG GCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACC GTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAAT CACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCT TGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC ATGaTCTCCCgGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCAC GTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAA TGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCC CATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACA GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGT CAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGT GGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGC CTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCAC CGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGT GATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCT GTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 234).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 236; e SEQ ID NO: 237 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 91 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 92.

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 239; e SEQ ID NO: 240 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 93 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 94.

A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeos incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codifi- cam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 231 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 91; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 232 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 92; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 233 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 93; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 234 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 94; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 236; e SEQ ID NO: 237) que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 91 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 92; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de com-plementaridade (SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 239; e SEQ ID NO: 240) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 93 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 94.

Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou altemativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) tendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab10, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab10 completo compreendem, ou altemativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 232 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 92; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 234 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 94.

Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células mamíferas, como células CHO, NSO, HEK-293, ou sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab10 após expressão dos polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab10 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de polinucleotídeos Ab10 em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos, ou microbianos como células de leveduras (por e- xemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Anticorpo Ab11

A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpo tendo especificidade de ligação à CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 101: CAGGTGCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTCCAGCTGT GGGAAGCACAGTCACCATCAATTGCCGGGCCAGTCAGAGTGTTTATTAT AACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAG CAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGT TCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACGT GCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGT AGTAATGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGT CAAACGT (SEQ ID NO: 241).

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 102: CAGGTGCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTCCAGCTGT GGGAAGCACAGTCACCATCAATTGCCGGGCCAGTCAGAGTGTTTATTAT AACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAG CAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGT TCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACGT GCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGT AGTAATGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTC AAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATG AGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTT CTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCA ATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAG CACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGA GAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTC GCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 242).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 103: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTG GAGGATCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGAATCGACGTCACTAA CTACTATATGCAATGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATG GATCGGAGTCATTGGTGTGAATGGTAAGAGATACTACGCGAGCTGGGC GAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGGATCT GAAAATGACCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCC AGAGGCGACATCTGGGGCCCGGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 243).

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 104: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTG GAGGATCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGAATCGACGTCACTAA CTACTATATGCAATGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATG GATCGGAGTCATTGGTGTGAATGGTAAGAGATACTACGCGAGCTGGGC GAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGGATCT GAAAATGACCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCC AGAGGCGACATCTGGGGCCCGGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGC CTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCAcCCTCCTCCAAGAG CACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTT CCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCG GCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCT CAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTA CATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAG AGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA GCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAA CCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTG GTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTAC GTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGA GCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCA CCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAA AGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCA GCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGAT GACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCC CAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACA ACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACG TCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCA GAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 244).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 245; SEQ ID NO: 246; e SEQ ID NO: 247 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 101 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 102.

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 248; SEQ ID NO: 249; e SEQ ID NO: 250 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 103 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 104.

A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeos incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 241 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 101; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 242 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 102; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 243 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 103; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 244 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 104; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 245; SEQ ID NO: 246; e SEQ ID NO: 247) que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 101 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 102; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 248; SEQ ID NO: 249; e SEQ ID NO: 250) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 103 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 104.

Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou altemativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) tendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab11, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab11 completo compreendem, ou altemativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 242 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 102; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 244 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 104.

Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células mamífe- ras, como células CHO, NSO, HEK-293, ou sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab11 após expressão dos polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab11 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de polinucleotídeos Ab11 em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos, ou microbianos como células de leveduras (por e- xemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Anticorpo Ab12

A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpo tendo especificidade de ligação à CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 111: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcac catcAATtgcCGGGCCAGTCAGAGTGTTTAcTATAACAACTACCTAGCCtggta tcagcagaaaccagggaaagttcctaagCAActgatctatT CT ACATCCACT CTGGCAT CT ggggtcccatctcgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcct gaagatgttgcaacttattactgtCTGGGCAGTT AT GATT GT AGT AATGGT GATT GTT TTGTTttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgt (SEQ ID NO: 251).

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 112: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcac catcAATtgcCGGGCCAGTCAGAGTGTTTAcTATAACAACTACCTAGCCtggta tcagcagaaaccagggaaagttcctaagCAActgatctatTCTACATCCACTCTGGCATCT ggggtcccatctcgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcct gaagatgttgcaacttattactgtCTGGGCAGTT AT GATT GT AGT AATGGT GATT GTT TTGTTttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgtACGGTGGCTGCACCATCTGT CTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCT GTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGT GGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCA CAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGA CGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAG TCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGG GAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 252).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 113: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagact ctcctgtgcaGTCtctggaATCGACGTCACTAACTACTACATGCAAtgggtccgtcagg ctccagggaaggggctggagtgggtcGGAGT CATT GGT GT GAATGGT AAGAGAT AC TAC G C G AG CTG G G C G AAAG G Ccgattcaccatctccagagacaattccaag AC C AC G GTGtatcttcaaatgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtGCCAGAGGGG ACATCtggggccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGC (SEQ ID NO: 253).

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 114: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagact ctcctgtgcaGTCtctggaATCGACGTCACTAACTACTACATGCAAtgggtccgtcagg ctccagggaaggggctggagtgggtcGGAGT CATT GGT GT GAATGGT AAGAGAT AC TAC G C G AG CTG G G C G AAAG G Ccgattcaccatctccagagacaattccaag AC C AC G GTGtatcttcaaatgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtGCCAGAGGGG ACATCtggggccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCA TCGGTCTTCCCCCTGGCAcCCTCCTCCaAGAGCACCTCTGGGGGCACA GCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGAC GGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCC GGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGAC CGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAA TCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATC TTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC ATGaTCTCCCgGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCAC GTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAA TGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCC CATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACA GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGT CAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGT GGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGC CTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCAC CGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGT GATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCT GTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 254).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 255; SEQ ID NO: 256; e SEQ ID NO: 257 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 111 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 112.

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 258; SEQ ID NO: 259; e SEQ ID NO: 260 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 113 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 114.

A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeos incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 251 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 111; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 252 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 112; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 253 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 113; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 254 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 114; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 255; SEQ ID NO: 256; e SEQ ID NO: 257) que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 111 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 112; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 258; SEQ ID NO: 259; e SEQ ID NO: 260) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 113 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 114.

Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) tendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab12, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab12 completo compreendem, ou alternativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 252 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 112; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 254 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 114.

Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células mamíferas, como células CHO, NSO, HEK-293, ou sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab12 após expressão dos polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab12 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de polinucleotídeos Ab12 em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, siste-mas de fungos, insetos, ou microbianos como células de leveduras (por e- xemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Anticorpo Ab13

A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpo tendo especificidade de ligação à CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 121: GCCATCGTGATGACCCAGACTCCATCTTCCAAGTCTGTCCC TGTGGGAGACACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTGAGAGTCTTTAT AATAACAACGCCTTGGCCTGGTTTCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCC AAGCGCCTGATCTATGATGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCATCGC GGTTCAGTGGCGGTGGGTCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGTG GCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGGAGGCTACAGAA GTGATAGTGTTGATGGTGTTGCTTTCGCCGGAGGGACCGAGGTGGTG GTCAAACGT (SEQ ID NO: 261).

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 122: GCCATCGTGATGACCCAGACTCCATCTTCCAAGTCTGTCCC TGTGGGAGACACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTGAGAGTCTTTAT AATAACAACGCCTTGGCCTGGTTTCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCC AAGCGCCTGATCTATGATGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCATCGC GGTTCAGTGGCGGTGGGTCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGTG GCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGGAGGCTACAGAA GTGATAGTGTTGATGGTGTTGCTTTCGCCGGAGGGACCGAGGTGGTGG TCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGA TGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAAC TTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTC CAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGAC AGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTAC GAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGC TCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 262).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou altemativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 123: CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCCAGCCT GAGGGATCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCGACTTCAGTA GCAATGCAATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAG TGGATCGGATGCATTTAcAATGGTGATGGCAGCACATACTACGCGAGCT GGGTGAATGGCCGATTCTCCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGA CTCTGCAACTGAATAGTCTGACAGTCGCGGACACGGCCACGTATTATTG TGCGAGAGATCTTGACTTGTGGGGCCCGGGCACCCTCGTCACCGTCT CGAGC (SEQ ID NO: 263).

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 124: CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCCAGCCT GAGGGATCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCGACTTCAGTA GCAATGCAATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAG TGGATCGGATGCATTTAcAATGGTGATGGCAGCACATACTACGCGAGCT GGGTGAATGGCCGATTCTCCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGA CTCTGCAACTGAATAGTCTGACAGTCGCGGACACGGCCACGTATTATTG TGCGAGAGATCTTGACTTGTGGGGCCCGGGCACCCTCGTCACCGTCTC GAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCAcCCTCCTC CAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGG ACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGA CCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCT ACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCC AGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGG ACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACC GTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCC CCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCAC ATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAA CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG GGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGT CCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTC CAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGA GGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGG AGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCT TCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGG GGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTA CACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 264).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 265; SEQ ID NO: 266; e SEQ ID NO: 267 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 121 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 122.

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 268; SEQ ID NO: 269; e SEQ ID NO: 270 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 123 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 124.

A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeos incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 261 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 121; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 262 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 122; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 263 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 123; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 264 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 124; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 265; SEQ ID NO: 266; e SEQ ID NO: 267) que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 121 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 122; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 268; SEQ ID NO: 269; e SEQ ID NO: 270) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 123 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 124.

Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) tendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab13, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab13 completo compreendem, ou altemativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 262 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 122; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 264 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 124.

Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células mamíferas, como células CHO, NSO, HEK-293, ou sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab13 após expressão dos polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab13 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de polinucleotídeos Ab13 em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos, ou microbianos como células de leveduras (por e- xemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Anticorpo Ab14

A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpo tendo especificidade de ligação à CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 131: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcac catcAATtgcCAGGCCAGTCAGAATGTTTAcAATAACAACTACCTAGCCtggtat cagcagaaaccagggaaagttcctaagCAActgatctatTCTACATCCACTCTGGCATCT ggggtcccatctcgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcct gaagatgttgcaacttattactgtCTGGGCAGTTATGATTGTAGTCGTGGTGATTGTT TTGTTttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgt (SEQ ID NO: 271).

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 132: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcac catcAATtgcCAGGCCAGTCAGAATGTTTAcAATAACAACTACCTAGCCtggtat cagcagaaaccagggaaagttcctaagCAActgatctatTCTACATCCACTCTGGCATCT ggggtcccatctcgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcct gaagatgttgcaacttattactgtCTGGGCAGTTATGATTGTAGTCGTGGTGATTGTT TTGTTttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgtACGGTGGCTGCACCATCTGT CTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCT GTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGT GGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCA CAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGA CGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAG TCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCC- GTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 272).

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 133: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagact ctcctgtgcaGTCtctggaATCGGCCTCagtAGCTACTACATGCAAtgggtccgtcaggc tccagggaaggggctggagtgggtcGGAGTCATTGGTAGTGATGGTAAGACATACT AC G C G AC CT G G G C G AAAG G Ccgattcaccatctccagagacaattccaag AC C AC G G TGtatcttcaaatgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtACCAGAGGGGA CATCtggggccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGC (SEQ ID NO: 273).

Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a seguinte sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 134: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagact ctcctgtgcaGTCtctggaATCGGCCTCagtAGCTACTACATGCAAtgggtccgtcaggc tccagggaaggggctggagtgggtcGGAGTCATTGGTAGTGATGGTAAGACATACT AC G C G AC CTG G G C G AAAG G Ccgattcaccatctccagagacaattccaag AC C AC G G TGtatcttcaaatgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtACCAGAGGGGA CATCtggggccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCAT CGGTCTTCCCCCTGGCAcCCTCCTCCaAGAGCACCTCTGGGGGCACAG CGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACG GTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCG GCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACC GTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAAT CACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACGCGAGAGTTGAGCCCAAATCT TGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC ATGaTCTCCCgGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCAC GTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAA TGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCC CATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACA GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGT CAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGT GGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGC CTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCAC CGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGT GATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCT GTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 274)..

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das se- quências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 275; SEQ ID NO: 276; e SEQ ID NO: 277 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 131 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 132.

Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos tendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 278; SEQ ID NO: 279; e SEQ ID NO: 280 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 133 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 134.

A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeos incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo tendo especificidade de ligação a CGRP compreendem, ou altemativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 271 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 131; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 272 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 132; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 273 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 133; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 274 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 134; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 275; SEQ ID NO: 276; e SEQ ID NO: 277) que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 131 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 132; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 278; SEQ ID NO: 279; e SEQ ID NO: 280) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 133 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 134.

Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) tendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab14, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab14 completo compreendem, ou alternativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 272 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 132; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 274 que codifica a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 134.

Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células mamíferas, como células CHO, NSO, HEK-293, ou sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab14 após expressão dos polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab14 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de polinucleotídeos Ab14 em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos, ou microbianos como células de leveduras (por e- xemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.

Em uma modalidade, a invenção é direcionada a um polinucleotídeo isolado compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácido VH de anticorpo anti-CGRP antibody selecionada da SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, ou 133, ou que codifica uma variante do mesmo em que pelo menos um resíduo estrutural (resíduo FR) foi substituído com um aminoácido presente na posição correspondente em um polipeptídeo VH de anticorpo anti-CGRP de coelho ou uma substituição de aminoácido conservada.

Em outra modalidade, a invenção é direcionada a um polinucleo- tídeo isolado compreendendo a sequência de polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácido do anticorpo VL anti-CGRP 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, ou 131, ou que codifica uma variante do mesmo em que pelo menos um resíduo estrutural (resíduo FR) foi substituído com um aminoácido presente na posição correspondente em um polipeptídeo VL de anticorpo anti-CGRP de coelho ou uma substituição de aminoácido conservada.

Já outra modalidade, a invenção é direcionada a um ou mais po-linucleotídeos heterólogos compreendendo uma sequência que codifica os polipeptídeos contidos na SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:31 e SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:41 e SEQ ID NO:43; SEQ ID NO:51 e SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:61 e SEQ ID NO:63; SEQ ID NO:71 e SEQ ID NO:73; SEQ ID NO:81 e SEQ ID NO:83; SEQ ID NO:91 e SEQ ID NO:93; SEQ ID NQ:101 e SEQ ID NQ:103; SEQ ID NO:111 e SEQ ID NO:113; SEQ ID NO:121 e SEQ ID NO:123; ou SEQ ID NO:131 e SEQ ID NO:133.

Em outra modalidade, a invenção é direcionada a um polinucleotídeo isolado que expressa um polipeptídeo contendo pelo menos um polipeptídeo CDR derivado de um anticorpo anti-CGRP em que dito polipeptídeo expresso isolado especificamente se liga a CGRP ou especificamente se liga a CGRP quando expresso em associação com outra sequência de polinucleotídeo que expressa um polipeptídeo contendo pelo menos um polipeptídeo CDR derivado de um anticorpo anti-CGRP em que dita pelo menos uma CDR é selecionada daquelas contidas nos polipeptídeos VL ou VH da SEQ ID NO: 1, 3, 11, 13, 21, 23, 31, 33, 41, 43, 51, 53, 61, 63, 71, 73, 81, 83, 91, 93, 101, 103, 111, 113, 121, 123, 131, ou SEQ ID NO:133.

Células hospedeiras e vetores compreendendo ditos polinucleotídeos são ainda contemplados.

A invenção ainda contempla vetores compreendendo as sequências de polinucleotídeos que codificam as sequências de polipeptídeos variáveis de cadeia pesada e leve, bem como as regiões determinantes de complementaridade individuais (CDRs, ou regiões hipervariáveis), como estabelecidas aqui, bem como células hospedeiras compreendendo ditas sequências de vetor. Em uma modalidade da invenção, a célula hospedeira é uma célula de levedura. Em outra modalidade da invenção, a célula hospedeira de levedura pertence ao gênero Pichia.

Triagem e isolamento de célula B

Em uma modalidade, a presente invenção contempla a preparação e isolamento de uma população clonal de células B específicas de antígeno que podem ser usadas pra isolar pelo menos uma célula específica para o antígeno CGRP, que pode ser usado para produzir um anticorpo monoclonal contra CGRP, que é específico a um antígeno CGRP desejado, ou uma sequência de ácido nucleico correspondente a dito um anticorpo. Métodos para preparar e isolar dita população clonal de células B específicas para antígeno são ensinados, por exemplo, em publicação de patente US 2007/0269868 para Carvalho-Jensen et al., a revelação da qual é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Métodos para preparar e isolar dita população clonal de células B específicas ao antígeno e são ensinados aqui nos exemplos. Métodos para "enriquecer" uma população celular por tamanho ou densidade são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, patentes US 5.627.052. Estas etapas podem ser usadas em adição ao enriquecimento da população celular por especificidade de antígeno.

Métodos para humanizar anticorpos

Em outra modalidade, a presente invenção contempla métodos para humanizar cadeias pesadas e leves de anticorpo. Métodos para produzir cadeias pesada e leve de anticorpo que podem ser aplicados aos anticorpos anti-CGRP são ensinados, por exemplo, na publicação do pedido de patente US 2009/0022659 para Olson et al., e na patente US 7.935.340 para Garcia-Martinez et al., as revelações das quais são aqui incorporadas por referência em suas totalidades.

Métodos para produzir anticorpos e fragmentos dos mesmos

Em outra modalidade, a presente invenção contempla métodos para produzir anticorpos anti-CGRP e fragmentos dos mesmos para diarreia. Métodos para produzir anticorpos anti-CGRP e fragmentos dos mesmos se- cretados de cepas poliploidais, preferencialmente diploides ou tetraploides de leveduras competentes para reprodução são ensinadas, por exemplo, na publicação de pedido de patente US 2009/0022659 para Olson et al., e na patente US 7.935.340 para Garcia-Martinez et al., as revelações das quais são aqui incorporadas por referência em suas totalidades.

Outros métodos para produzir anticorpos são bem conhecidos aos especialistas na técnica. Por exemplo, métodos para produzir anticorpos quiméricos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, patente US 4.816.567 para Cabilly et al.; Morrison et al., P.N.A.S. USA, 81:8651-55 (1984); Neuberger, M.S. et al., Nature, 314:268-270 (1985); Boulianne, G.L. et al., Nature, 312:643-46 (1984), as revelados das quais são aqui incorporadas por referência em suas totalidades).

Da mesma forma, métodos para produzir anticorpos humanizados são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, patente US 5.530.101, 5.585.089, 5.693.762, e 6.180.370 para Queen et al; patentes US 5.225.539 e 6.548.640 para Winter; patentes US 6.054.297, 6.407.213 e 6.639.055 para Carter et al; patente US 6.632.927 para Adair; Jones, P.T. et al, Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann, L, et al, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen, M, et al, Science, 239:1534-36 (1988), as revelações de cada uma das quais são aqui incorporadas por referência em suas totalidades).

Polipeptídeos anticorpos da invenção tendo especificidade de ligação a CGRP para diarreia podem ainda ser produzidos construindo, usando técnicas convencionais bem conhecidas aos especialistas na técnica, um vetor de expressão contendo um operon e uma sequência de DNA que codifica uma cadeia pesada de anticorpo em que a sequência de DNA que codifica as partes restantes da cadeia do anticorpo é derivada de uma fonte de célula humana.

Um segundo vetor de expressão é produzido usando os mesmos meios convencionais bem conhecidos aos especialistas na técnica, dito vetor de expressão contendo um operon e uma sequência de DNA que codifica uma cadeia leve de anticorpo em que a sequência de DNA que codifica as CDRs requeridas para a especificidade de anticorpo de é derivada de uma fonte de célula não humana, preferencialmente uma fonte de célula B de coelho, enquanto a sequência de DNA que codifica as partes restantes da cadeia de anticorpo é derivada de uma fonte de célula humana.

Os vetores de expressão são transfectados em uma célula hospedeira por técnicas bem conhecidas aos especialistas na técnica para produzir uma célula hospedeira transfectadas, dita célula hospedeira transfec- tadas cultivada por técnicas convencionais bem conhecidas aos especialistas na técnica para produzir ditos polipeptídeos anticorpos.

A célula hospedeira pode ser co-transfectada com os dois vetores de expressão descritos acima, o primeiro vetor de expressão contendo DNA que codifica um operon um poliptpídeo derivado de cadeia leve e o segundo vetor contendo DNA que codifica um operon e um polipeptídeo derivado de cadeia pesada. Os dois vetores contêm marcadores selecionáveis diferentes, mas preferencialmente atingem expressão substancialmente i- gual dos polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Alternativamente, um vetor único pode ser usado, o vetor incluindo DNA que codifica ambos os polipeptídeos de cadeia pesada e leve. As sequências de codificação para as cadeias pesada e leve podem compreender cDNA, DNA genômico, ou ambos.

As células hospedeiras usadas para expressar os polipeptídeos de anticorpos podem ser uma célula bacteriana como E. coli, ou uma célula eucariótica como P. pastoris. Em uma modalidade da invenção, uma célula de mamífero de um tipo bem definido para esta finalidade, como uma célula de mieloma, uma linhagem celular de ovário de hamster chinês (CHO), uma linhagem celular NSO, ou uma linhagem celular HEK293 podem ser usadas.

Os métodos gerais pelos quais os vetores podem ser construídos, os métodos de transfecção requeridos para produzir a célula hospedeira e métodos de cultivo requeridos para produzir os polipeptídeos de anticorpos de ditas células hospedeiras todas incluem técnicas convencionais. Embora preferencialmente a linhagem celular usada para produzir o anticorpo é uma linhagem celular mamífera, ou qualquer outra linhagem celular a- propriada, uma linhagem celular bacteriana, uma cepa bacteriana derivada de E. coli, ou uma linhagem celular de levedura, pode alternativamente ser usada.

De modo semelhante, uma vez produzidos os polipeptídeos de anticorpos podem ser purificados de acordo com os procedimentos padrões na técnica, como por exemplo, filtração de fluxo cruzado, precipitação por sulfato de amónio, cromatografia de coluna de afinidade, e semelhantes.

Os polipeptídeos de anticorpos descritos aqui podem ainda ser usados para o desenho e síntese de miméticos de peptídeo ou não peptídeo que poderiam ser úteis para as mesmas aplicações terapêuticas como os polipeptídeos de anticorpos da invenção. Ver, por exemplo, Saragobi et al, Science, 253:792-795 (1991), os conteúdos dos quais é aqui incorporado por referência em suas totalidades.

Ensaios de triagem

A invenção ainda inclui ensaios de triagem desenhados para assistir na identificação das doenças e distúrbios associadas com CGRP e diarreia em pacientes que apresentam os sintomas de uma doença ou distúrbio associado a CGRP.

Em uma modalidade da invenção, os anticorpos anti-CGRP da invenção, ou fragmentos CGRP de ligação ao mesmo, são usados para detectar a presença de CGRP em uma amostra biológica obtida de um paciente que apresenta sintomas de uma doença ou distúrbio associada com C- GRP e diarreia. A presença de CGRP, ou níveis elevados dos mesmos especialmente no cólon quando comparado aos níveis de pré-doença de C- GRP em uma amostra biológica comparável, pode ser benéfica em diagnosticar uma doença ou distúrbio associado com CGRP associado com diarreia.

Outra modalidade da invenção fornece um ensaio de diagnóstico ou triagem para assistir no diagnóstico de doenças ou distúrbios associados com CGRP em pacientes que apresentam sintomas de uma doença ou distúrbio associado com CGRP identificados aqui, compreendendo avaliar o nível de expressão de CGRP em uma amostra biológica de dito paciente usando um anticorpo anti-CGRP modificado após a tradução ou fragmento de ligação ao mesmo. O anticorpo anti-CGRP ou fragmento de ligação ao mesmo pode ser modificado após a tradução para incluir uma fração detec- tável como estabelecido anteriormente na revelação.

O nível de CGRP na amostra biológica é determinado usando um anticorpo anti-CGRP modificado ou fragmento de ligação ao mesmo como estabelecido aqui, e comparar o nível de CGRP na amostra biológica contra um nível de CGRP (por exemplo, o nível nas amostras biológicas normais). O médico especialista poderia entender que alguma variabilidade pode existir entre as amostras biológicas normais e poderia levar em consideração quando avalia os resultados. Em uma modalidade da invenção, os anticorpos anti-CGRP da invenção podem ser usados para se correlacionar aos níveis de expressão de CGRP com um estágio particular de desenvolvimento de câncer. Um especialista na técnica poderia ser capaz de medir CGRP em vários sujeitos para estabelecer faixas de expressão de CGRP que correspondem aos estágios clinicamente definidos de desenvolvimento de câncer. Estas faixas irão permitir ao especialista medir CGRP em um sujeito diagnosticado com um câncer e se correlaciona aos níveis em cada sujeito com uma faixa que corresponde a um estágio de dito câncer. Um especialista na técnica poderia entender que medir CGRP no paciente em intervalos diferentes, a progressão do câncer pode ser determinada.

O ensaio mencionado acima pode ainda ser útil no monitoramento de uma doença ou distúrbio, onde o nível de CGRP obtido em uma amostra biológica de um paciente que se acredita ter uma doença ou distúrbio associado com CGRP é comparado com o nível de CGRP nas amostras biológicas anteriores do mesmo paciente, para definir se o nível de CGRP em ditos pacientes mudou com, por exemplo, um regime de tratamento.

A invenção é ainda direcionada a um método para imagear in vivo que detecta a presença de células que expressam CGRP compreendendo administrar uma quantidade diagnosticamente efetiva de uma composição diagnóstica. Dito imageamento in vivo é útil para a detecção ou image- amento de tumores ou metástases que expressam CGRP, por exemplo, e podem ser úteis como parte de um regime de planejamento para o desenho de um protocolo de tratamento efetivo do câncer. O protocolo de tratamento pode incluir, por exemplo, um ou mais de radiação, quimioterapia, terapia com citocina, terapia gênica e terapia com anticorpo, bem como um anticorpo anti-CGRP ou fragmento dos mesmos.

A presente invenção ainda fornece um kit para detectar a ligação de um anticorpo anti-CGRP da invenção a CGRP. Em particular, o kit pode ser usado para detectar a presença de um reativo especificamente a CGRP com um anticorpo anti-CGRP da invenção ou um fragmento imunoreativo do mesmo. O kit pode ainda incluir um anticorpo ligado a um substrato, um anticorpo secundário reativo com o antígeno e um reagente para detectar uma reação do anticorpo secundário com o antígeno. Dito kit pode ser um kit E- LISA e pode compreender o substrato, anticorpos primários e secundários quando apropriados, e qualquer outro reagente necessário como frações detectáveis, enzimas substratos, e reagentes de cor, por exemplo, como descrito aqui. O kit diagnóstico pode ainda estar na forma de um kit immu- noblot. O kit diagnóstico pode ainda estar na forma de um kit quimiolumines- cente (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD). O kit diagnóstico pode a- inda ser um kit de detecção baseado em lantanídeo (PerkinElmer, San Jose, CA).

Um clínico especialista poderia entender que uma amostra biológica inclui, entre outras, soro, plasma, urina, saliva, mucosa, fluido pleural, fluido sinovial e fluido espinhal.

Métodos para melhorar ou reduzir os sintomas de ou tratar ou prevenir, doenças e distúrbios associados com CGRP

Os anticorpos anti-CGRP descritos aqui, ou fragmentos dos mesmos, são úteis para melhorar ou reduzir os sintomas de, ou tratar ou prevenir doenças e distúrbios associados com CGRP especialmente diarrei- a. Em uma modalidade preferencial os anticorpos anti-CGRP ou fragmentos de anticorpo demonstrarão ser eficazes (bloqueiam os efeitos colaterais adversos associados com excesso de CGRP em circulação incluindo diarreia no modelo animal de roedor revelado no exemplo 8).

Anticorpos anti-CGRP descritos aqui, ou fragmentos dos mesmos, bem como combinações, podem ainda ser administrados em uma quantidade terapeuticamente efetiva aos pacientes em necessidade de tratamento de doenças e distúrbios associados com CGRP na forma de uma composição farmacêutica como descrito em maiores detalhes abaixo.

Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP descritos aqui, ou fragmentos dos mesmos são úteis para melhorar ou reduzir os sintomas de, ou tratar ou prevenir diarreia em condições relacionadas a CGRP enxaquecas (com ou sem aura), perda de peso, câncer ou tumores, angiogênese associada com crescimento de câncer ou tumor, angiogênese associada com sobrevivência de câncer ou tumor, dor, enxaquecas hemiplá- gicas, dores de cabeça histamínicas, neuralgia enxaquecosa, dores de cabeça crônicas, dores de tensão, dores gerais, fogachos, hemicrania paroxi- somal crônica, dores de cabeça secundárias devido à problema estrutural subjacente na cabeça ou pescoço, neuralgia cranial, dores de cabeça dos seios nasais (como, por exemplo, associado com sinusite), e dores de cabeça ou enxaquecas induzidas por alergia.

Em uma modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP descritos aqui, ou fragmentos dos mesmos e/ou com um segundo agente, são ú- teis para melhorar ou reduzir os sintomas de, ou tratar, ou prevenir, diarreia associada com a seguinte listagem não limitante de doenças e distúrbios relacionados a CGRP: dor, dor inflamatória, dor de incisão pós-operatória, síndrome de dor regional complexa, dor de câncer, dor de câncer ósseo primário ou metastático, dor de fratura, dor crônica, dor de fratura osteoporóti- ca, dor resultante de queimadura, osteoporose, dor de articulação com gota, dor abdominal, dor associada com crises de célula do manto, e outra dor nocicéptica, bem como carcinoma hepatocelular, câncer de mama, cirrose hepática, dor neurogênica, dor neuropática, dor nocicéptica, neuralgia trigeminal, neuralgia pós-herpética, dor do membro fantasma, fibromialgia, dor menstrual, ovarialgia, distrofia simpatética reflexa, dor neurogênica, dor de osteoartrite ou artrite reumatoide, dor lombar, neuropatia diabética, ciática, ou dor ou dor visceral associada com: refluxo gastroesofágico, dispepsia, síndrome do intestino irritável, cólon irritável, cólon espástico, colite mucosa, doença intestinal inflamatória, Doença de Crohn, ileíte, colite ulcerativa, cólica renal, dismenorreia, cistite, período menstrual, parto, menopausa, prosta- tite, pancreatite, cólica renal, dismenorreia, cistite, incluindo intersticial cistite (IC), cirurgia associada com o íleo, diverticulite, peritonite, pericardite, hepatite, apendicite, colite, colecistite, endometriose, pancreatite crônica e/ou aguda, infarto do miocárdio, dor renal, dor pleural, prostatite, dor pélvica, trauma em um órgão, dor nociceptiva crônica, dor neuropática crônica, dor inflamatória crônica, fibromialgia, dor avançada e dor persistente, e dor de câncer que surge de malignidade ou de câncer preferencialmente selecionado de um ou mais de: adenocarcinoma em tecido glandular, blastoma em tecido embrionário dos órgãos, carcinoma no tecido epitelial, leucemia em tecidos que formam células sanguíneas, linfoma em tecido linfático, mieloma em medula óssea, sarcoma em tecido conectivo ou de suporte, câncer adrenal, linfoma relacionado a AIDS, anemia, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer cerebral, câncer de mama, tumores carcinoides, câncer cervical, quimioterapia, câncer de cólon, citopenia, câncer endometrial, câncer esofágico, câncer gástrico, câncer de cabeça, câncer de pescoço, câncer hepatobiliar, câncer renal, leucemia, câncer hepático, câncer pulmonar, linfoma, doença de Hodgkin, linfoma, não Hodgkin, tumores do sistema nervoso, câncer oral, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer retal, câncer de pele, câncer de estômago, câncer testicular, câncer de tireoide, câncer uretral, câncer ósseo, sarcomas câncer do tecido conectivo, câncer do tecido ósseo, câncer de células formadoras do sangue, câncer de medula óssea, mieloma múltiplo, leucemias, câncer ósseo primário ou secundário, tumores que metastizam ao osso, tumores que infiltram o nervo e vísceras ocas, tumores pertos de estruturais neurais. Ainda preferencialmente a dor de câncer compreende dor visceral, preferencialmente dor visceral que surge de câncer pancreático e/ou metástases no abdômen. Ainda preferencial- mente a dor de câncer compreende dor somática, preferencialmente dor somática devido a um ou mais de câncer ósseo, metástase no osso, dor pós-cirúrgico, sarcomas câncer do tecido conectivo, câncer do tecido ósseo, câncer de células formadoras do sangue da medula óssea, mieloma múltiplo, leucemia, câncer ósseo primário ou secundário.

Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP descritos aqui, ou fragmentos dos mesmos e/ou com um segundo agente, são ú- teis para melhorar ou reduzis os sintomas de, ou tratar ou prevenir, a seguinte listagem não limitante de doenças e distúrbios: câncer ou tumores, angiogênese associada com crescimento de câncer ou tumor, angiogênese associada com sobrevivência de câncer ou tumor.

Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP descritos aqui, ou fragmentos dos mesmos e/ou com um segundo agente, são ú- teis para melhorar ou reduzis os sintomas de, ou tratar ou prevenir, a seguinte listagem não limitante de doenças e distúrbios: dor neurogênica, neuropática ou nocicéptica. Dor neuropática pode incluir, entre outras, neuralgia trigeminal, neuralgia pós-herpética, dor de membro fantasma, fibromialgia, dor menstrual, ovarialgia, distrofia simpatética de reflexo e dor neurogênica. Em outras modalidades preferenciais, dor de osteoartrite ou artrite reumatoide, dor lombar, neuropatia diabética, ciática, e outra dor neuropática.

Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP descritos aqui, ou fragmentos dos mesmos e/ou com um segundo agente, são ú- teis para melhorar ou reduzis os sintomas de, ou tratar ou prevenir, a seguinte listagem não limitante de doenças e distúrbios: diarreia e dor visceral associada com refluxo gastroesofágico, dispepsia, síndrome de intestino irritável, doença intestinal inflamatória, Doença de Crohn, ileíte, colite ulcerativa, cólica renal, dismenorreia, cistite, período menstrual, parto, menopausa, prostatite, prurite, ou pancreatite.

Administração

Em uma modalidade da invenção, os anticorpos anti-CGRP descritos aqui, ou CGRP fragmentos de ligação ao mesmo, bem como combinações de ditos anticorpos ou fragmento de anticorpos, são administrados a um sujeito em uma concentração de entre cerca de 0,1 e 100,0 mg/kg de peso corporal do sujeito receptor. Em uma modalidade da invenção, os anticorpos anti-CGRP descritos aqui, ou CGRP fragmentos de ligação ao mesmo, bem como combinações de ditos anticorpos ou fragmento de anticorpos, são administrados a um sujeito em uma concentração de entre cerca de 0,4 mg/kg de peso corporal do sujeito receptor. Em uma modalidade preferencial da invenção, os anticorpos anti-CGRP descritos aqui, ou fragmentos CGRP de ligação ao mesmo, bem como combinações de ditos anticorpos ou fragmentos de anticorpos são administrados a um sujeito receptor com uma frequência de uma vez a cada vinte e seis semanas ou menos, como, uma vez a cada dezesseis semanas ou menos, uma vez a cada oito semanas ou menos, uma vez a cada quatro semanas ou menos, uma vez a cada duas semanas ou menos, uma vez a cada semana ou menos ou uma vez diariamente ou menos.

Fragmentos Fab podem ser administrados a cada duas semanas ou menos, a cada semana ou menos, uma vez ao dia ou menos, várias vezes ao dia e/ou e com intervalo de algumas horas. Em uma modalidade da invenção, um paciente que recebe fragmentos Fab de 0,1 mg/kg a 40 mg/kg por dia administrado em doses divididas de 1 a 6 vezes ao dia, ou em uma forma de liberação sustentada, efetiva para obter os resultados desejados.

Deve ser entendido que a concentração do anticorpo ou Fab administrado a um determinado paciente pode ser maior ou menor do que as concentrações de administração exemplares estabelecidas acima nos parágrafos [0566] e [0567],

Um especialista na técnica poderia ser capaz de determinar uma dosagem efetiva e frequência de administração através de experimentação de rotina, por exemplo, guiado pela revelação aqui e os ensinamentos em Goodman, L. S., Gilman, A., Brunton, L. L, Lazo, J. S., & Parker, K. L. (2006). Goodman &Gilman's the pharmacological basis of therapeutics. New York: McGraw-Hill; Howland, R. D., Mycek, M. J., Harvey, R. A., Champe, P. C., & Mycek, M. J. (2006). Pharmacology. Lippincott's illustrated reviews. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; and Golan, D. E. (2008). Principles of pharmacology: the pathophysiologic basis of drug therapy. Philadelphia, Pa., [etc.]: Lippincott Williams & Wilkins.

Em outra modalidade da invenção, os anticorpos anti-CGRP descritos aqui, ou fragmentos CGRP de ligação aos mesmos, bem como combinações de ditos anticorpos ou fragmentos de anticorpos são adminis- trados a um sujeito em uma formulação farmacêutica.

Uma "composição farmacêutica"refere-se a uma composição química ou biológica apropriada para administração a um mamífero. Ditas composições podem ser especificamente formuladas para administração via um ou mais de um número de vias, incluindo entre outros bucal, epicutânea, epidural, inalação, intraarterial, intracardíaca, intracerebroventricular, intra- dérmica, intramuscular, intranasal, intraocular, intraperitoneal, intraespinhal, intratecal, intravenosa, oral, parenteral, retal via um enema ou supositório, subcutânea, subdérmica, sublingual, transdérmica, e transmucosal. Além disso, a administração pode ocorrer por meio de injeção, pó, líquido, gel, gotas ou outros meios de administração.

Em uma modalidade da invenção, os anticorpos anti-CGRP descritos aqui, ou fragmentos CGRP de ligação aos mesmos, bem como combinações de ditos anticorpos ou fragmentos de anticorpos podem ser administrados em combinação com um ou mais agentes ativos. Ditos agentes ativos incluem agentes analgésicos, anti-histamínicos, antipiréticos, anti- inflamatórios, antibiótico, antiviral, e anti-citocina. Agentes ativos incluem agonistas, antagonistas, e moduladores de TNF-α, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL- 12, IL-13, IL-18, IFN-a, IFN-y, BAFF, CXCL13, IP-10, VEGF, EPO, EGF, HRG, fator de crescimento de hepatócito (HGF), Hepcidina, incluindo anticorpos reativos contra qualquer um dos seguintes, e anticorpos reativos contra qualquer um de seus receptores. Agentes ativos ainda incluem, entre outros ácidos 2-Arilpropionicos, Aceclofenac, Acemetacina, ácido acetilsalicílico (Aspirina), Alclofenoaco, Alminoprofeno, Amoxiprin, Ampirone, ácidos Arilal- canoico, Azapropazona, Benorilato/Benorilato, Benoxaprofeno, Bromfenaco, Carprofeno, Celecoxib, salicilato de colina magnésio, Clofezona, inibidores de COX-2, Dexibuprofeno, Dexcetoprofeno, Diclofenaco, Diflunisal, Droxi- cam, Etenzamida, Etodolac, Etoricoxib, Faislamina, ácidos fenâmicos, Fen- bufen, Fenoprofeno, ácido Flufenamico, Flunoxaprofeno, Flurbiprofeno, Ibu- profeno, Ibuproxam, Indometacina, Indoprofeno, Cebuzona, Cetoprofeno, Cetorolac, Lornoxicam, Loxoprofeno, Lumiracoxib, salicilato de magnésio, ácido Meclofenoamico, ácido Mefenamico, Meloxicam, Metamizole, Metil salicilato, Mofebutazona, Nabumetoπa, Naproxeno, ácidos N-Arilantranilicos, fator de crescimento de nervo (NGF), Oxametacina, Oxaprozina, Oxicams, Oxifenbutazona, Parecoxib, Pfenazona, Fenilbutazona, Fenilbutazona, Piroxicam, Pirprofeno, profenos, Proglumetacina, derivados de Pirazolidina, Ro- fecoxib, Salicil salicilato, Salicilamida, Salicilatos, substância P, Sulfinpirazo- na, Sulindac, Suprofeno, Tenoxicam, ácido Tiaprofenoico, ácido Tolfenami- co, Tolmetina, e Valdecoxib.

Um anti-histaminico pode ser qualquer composto que opõe a ação de histamina ou sua liberação das células (por exemplo, mastócitos). Anti-histamínicos incluem, entre outros acrivastina, astemizole, azatadina, azelastina, betatastina, bromfeniramina, buclizina, cetirizina, análogos de cetirizina, clorfeniramina, clemastina, CS 560, ciproheptadina, desloratadina, dexclorfeniramina, ebastina, epinastina, fexofenadina, HSR 609, hidroxizina, levocabastina, loratidina, metescopolamina, mizolastina, norastemizol, fenin- damina, prometazina, pirilamina, terfenadina, e tranilast.

Antibióticos incluem, entre outros, Amicacin, Aminoglicosídeos, Amoxicilina, Ampicilina, Ansamicinas, Arsfenamina, Azitromicina, Azlocilina, Aztreonam, Bacitracina, Carbacefem, Carbapenems, Carbenicilina, Cefaclor, Cefadroxil, Cefalexin, Cefalotina, Cefalotina, Cefamandol, Cefazolina, Cefdi- nir, Cefditoren, Cefepima, Cefixima, Cefoperazona, Cefotaxima, Cefoxitina, Cefpodoxima, Cefprozil, Ceftazidima, Ceftibuten, Ceftizoxima, Ceftobiprol, Ceftriaxona, Cefuroxima, Cefalosporinas, Cloramfenicol, Cilastatina, Cipro- floxacina, Claritromicina, Clindamicina, Cloxacilina, Colistina, Co-trimoxazol, Dalfopristina, Demeclociclina, Dicloxacilina, Diritromicina, Doripenem, Doxi- ciclina, Enoxacina, Ertapenem, Eritromicina, Etambutol, Flucloxacilina, Fos- fomicina, Furazolidona, Ácido fusidico, Gatifloxacina, Geldanamicina, Gen- tamicina, Glicopeptideos, Herbimicina, Imipenem, Isoniazid, Canamicina, Levofloxacina, Lincomicina, Linazolid, Lomefloxacina, Loracarbef, Macroli- deos, Mafenideo, Meropenem, Meticilina, Metronidazol, Mezlocilina, Minoci- clina, Monobactamas, Moxifloxacina, Mupirocina, Nafcilina, Neomicina, Ne- tilmicina, Nitrofurantoina, Norfloxacina, Ofloxacina, Oxacilina, Oxitetraciclina, Paromomicina, Penicilina, Penicilinas, Piperacilina, Platensimicina, Polimixi- na B, Polipeptídeos, Prontosil, Pirazinamida, Quinolonas, Quinupristina, Ri- fampicina, Rifampina, Roxitromicina, Espectinomicina, Estreptomicina, Sul- facetamida, Sulfametizol, Sulfanilimida, Sulfasalazina, Sulfisoxazol, Sulfo- namídeos, Teicoplanin, Telitromicina, Tetraciclina, Tetraciclinas, Ticarcilina, Tinidazol, Tobramicina, Trimatoprim, Trimatoprim-Sulfametoxazol, Trolan- domicina, Trovafloxacina, e Vancomicina.

Agentes ativos ainda incluem Aldosterona, Beclometasona, Be- tametasona, Corticosteroides, Cortisol, Cortisona acetato, Deoxicorticostero- na acetato, Dexametasona, Fludrocortisona acetato, Glicocorticoides, Hidro- cortisona, Metilprednisolona, Prednisolona, Prednisona, Esteroides, eTriam- cinolona. Qualquer combinação apropriada destes agentes ativos é ainda contemplada.

Um "excipiente farmacêutico" ou um "excipiente farmaceuticamente aceitável" é um carreador, geralmente um líquido, em que um agente terapêutico ativo é formulado. Em uma modalidade da invenção, o agente terapêutico ativo é um anticorpo humanizado descrito aqui, ou um ou mais fragmentos dos mesmos. O excipiente geralmente não fornece qualquer atividade farmacológica à formulação, embora isto possa fornecer estabilidade química e/ou biológica, e características de liberação. Formulações exemplares podem ser encontradas, por exemplo, em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Ed., Grennaro, A., Ed., 1995 que é incorporado por referência.

Como usado aqui "carreador farmaceuticamente aceitável" ou "excipiente" incluem qualquer um e todos os solventes, meio de dispersão, revestimentos e agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores de absorção que são fisiologicamente compatíveis. Em uma modalidade, o carreador é apropriado para administração parenteral. Alter-nativamente, o carreador pode ser apropriado para administração intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, ou sublingual. Carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. O uso de ditos meios e agentes para substâncias ativas farma- ceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o composto ativo, o uso do mesmo nas composições farmacêuticas da invenção é contemplado. Compostos ativos complementares podem ainda ser incorporados nas composições.

Composições farmacêuticas normalmente devem ser estéreis e estáveis nas condições de fabricação e de armazenagem. A invenção contempla que a composição farmacêutica esteja presente na forma liofilizada. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipos- soma ou outra estrutura ordenada apropriada para uma concentração alta do fármaco. O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão que contém, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietilenoglicol líquido e afins) e a mistura apropriada dos mesmos. A invenção ainda contempla a inclusão de um estabilizador na composição farmacêutica. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos.

Em muitos casos, será preferencial incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poli álcoois como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provocada por inclusão na composição de um agente que atrasa a absorção, por exemplo, sais monoestearato e gelatina. Além disso, o polipeptídeo alcalino pode ser formulado em uma formulação de liberação no tempo, por exemplo, em uma composição que inclui um polímero de liberação lenta. Os compostos ativos podem ser preparados com carreadores que irão proteger o composto contra liberação rápida, como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de liberação microencapsula- das. Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados, como etileno vinil acetato, polianidretos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoéste- res, ácido poliláctico, copolímeros poliglicólicos (PLG). Muitos métodos para a preparação de ditas formulações são conhecidos aos especialistas na técnica.

Para cada uma das modalidades mencionadas, os compostos podem ser administrados por uma variedade de formas de dosagem. Qualquer forma de dosagem biologicamente aceitável conhecida aos especialistas na técnica, e combinações dos mesmos, são contempladas. Exemplos de ditas formas de dosagens incluem, entre outras, pós reconstituíveis, elixires, líquidos, soluções, suspensões, emulsões, pós, grânulos, partículas, micropartículas, grânulos dispersíveis, cachês, inalantes, inaladores de aerossóis, adesivos, inalantes de partículas, implantes, implantes em depósitos (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa, e intradérmica), infusões e combinações dos mesmos.

A descrição acima de várias modalidades ilustradas da invenção não pretende ser exaustiva ou limitar a invenção para precisar a forma revelada. Enquanto modalidades específicas de, e exemplos para, a invenção são descritos aqui para fins ilustrativos, várias modificações equivalentes são possíveis dentro do escopo da invenção, como os especialistas na técnica reconhecerão. Os ensinamentos fornecidos aqui da invenção podem ser aplicados a outras finalidades, além dos exemplos descritos acima.

Estas e outras alterações podem ser realizadas em uma invenção à luz da descrição detalhada acima. Em geral, nas reivindicações a seguir, os termos usados não devem ser interpretadas para limitar a invenção às modalidades reveladas específicas e as reivindicações. Assim, a invenção não é limitada pela revelação, mas, por outro lado, o escopo da invenção deve ser determinado totalmente pelas seguintes reivindicações.

A invenção pode ser praticada nas formas além daquelas parti-cularmente descritas na descrição acima e exemplos. Várias modificações e variações da invenção são possíveis na luz dos ensinamentos acima e, portanto, estão dentro do escopo e das reivindicações anexadas.

Certos ensinamentos relacionados aos métodos para obter uma população clonal de células B específicas para antígeno foram revelados no pedido de patente provisório U.S. no. 60/801.412, depositado dia 19 de maio de 2006, a revelação das quais é aqui incorporados por referência em sua totalidade.

Certos ensinamentos relacionados a humanização de anticorpos monoclonais derivados de coelho e modificações sequenciais preferenciais para manter a afinidade de ligação ao antígeno foram revelados no pedido internacional PCT/US2008/064421, correspondendo à publicação internacional WO/2008/144757, intitulado "Novel Rabbit Antibody Humanization Methods and Humanized Rabbit Antibodies", depositado em 21 de maio de 2008, a revelação das quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

Certas técnicas relacionadas para produzir anticorpos ou fragmentos dos mesmos usando levedura de reprodução competente e métodos correspondentes foram revelados no pedido de patente US 11/429.053, depositado em 8 de maio de 2006, (publicação de pedido de patente US2006/0270045), a revelação das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

Certos polinucleotídeos and polipeptídeos de anticorpos CGRP são revelados na listagem de sequência que acompanha este depósito de pedido de patente, e a revelação de dita listagem de sequência é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

A revelação completa de cada documento citado (incluindo patentes, pedido de patentes, artigos científicos, resumos, manuais, livros ou outras revelações) no Fundamento da invenção, descrição detalhada, e e- xemplos é aqui incorporada por referência em suas totalidades.

Os seguintes exemplos são colocados para fornecer aos especialistas na técnica com uma revelação e descrição completas de como preparar o uso de invenção objeto e não pretendem limitar o escopo do que está relacionado com a invenção. Esforços foram realizados para garantir a precisão com relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, concentrações, etc.), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser contabilizados. Salvo se indicado de outra forma, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular médio do peso, a temperatura é em graus centígrados, e a pressão é ou está próxima a da atmosférica.

EXEMPLOS

Exemplo 1 Preparação de anticorpos que se ligam a CGRP

Ao usar o protocolo de seleção de anticorpo descrito aqui, pode- se gerar um painel extensivo de anticorpos.

Estratégia de imunização

Os coelhos foram imunizados com CGRP humano (American Peptides, Sunnyvale CA and Bachem, Torrance CA). A imunização consistiu de uma primeira injeção subcutânea (sc) de 100 pg de antígeno misturado com 100 pg de KLH em adjuvante completo de Freund (CFA) (Sigma) seguido por dois impulsos, duas semanas separadas cada uma contendo 50 pg antígeno misturado com 50 pg em adjuvante incompleto de Freund (IFA) (Sigma). Os animais foram sangrados no dia 55, e os títulos de soro foram determinados por ELISA (reconhecimento de antígeno) e por inibição de aumento de cAMP direcionada a CGRP em SK-N-MC.

Avaliação de título de seleção de anticorpo

Para identificar e caracterizar anticorpos que se ligam ao CGRP humano, soluções contendo anticorpo foram testadas por ELISA. Resumidamente, placas revestidas por neutravidina (Thermo Scientific), foram revestidas com N-term biotinilado CGRP humano (50 L por poço, 1 g/mL) diluídas em tampão ELISA (0,5% de gelatina de pele de peixe em PBS pH 7,4,) por aproximadamente 1 hora em temperatura ambiente ou alternativamente durante a noite a 4T:. As placas foram então bloque adas com tampão ELISA por uma hora em temperatura ambiente e lavadas usando tampão de lavagem (PBS, PBS,0,05% de tween 20). Amostras de soro testadas foram serialmente diluídas usando tampão ELISA. Cinquenta microlitros de amostras de soro diluídas foram transferidos em poços e incubados por uma hora em temperatura ambiente por uma hora. Após esta incubação, a placa foi lavada com tampão de lavagem. Para o desenvolvimento um an anti- Fc- HARP específico de coelho (1:5000 diluição em tampão ELISA) foi adicionado aos poços por 45 min em RT. Após uma etapa de lavagem 3x com solução de lavagem, a placa foi desenvolvida usando TMB substrato por dois minutos em temperatura ambiente e a reação foi extinta usando 0,5M HCI. A absorbância do poço foi lida a 450 nm.

A determinação do título de amostras de soro por atividade funcional (inibição de níveis de cAMP direcionadas por CGRP)

Para identificar e caracterizar anticorpos com atividade funcional, um ensaio de inibição de aumento direcionado por CGRP de níveis de cAMP foi realizado usando eletroquimioluminescência (Meso Scale Discovery, MSD). Resumidamente, preparações de anticorpo a serem testadas foram serialmente diluídas em tampão de ensaio MSD (Hepes, MgCI2, pH 7,3, ImgZmL bloqueador A, Meso Scale Discovery) em uma placa de poliestireno de fundo redondo de 96 poços (Costar). A esta placa, o CGRP humano foi adicionado (10ng/ml_ concentração final) diluído em tampão de ensaio MSD e incubado por uma hora a 37°C. Os controles apropriados foram usados como sugerido pelo fabricante de kit do ensaio. Células de neuroepitelioma humanas (SK-N-MC, ATCC) foram detectadas usando uma solução EDTA (5mM em PBS) e lavadas usando meio de crescimento (MEM, 10% FBS, antibióticos) por centrifugação. O número de células foi ajustado para 2 milhões de células por ml_ em tampão de ensaio, e IBMX (3-lsobutil- IMetilxantina, Sigma) foi adicionado a uma concentração final de 0,2mM imediatamente antes de carregar as células na placa de ensaio de cAMP. Após a solução de anticorpo CGRP foi incubada por uma hora 20 microlitros de solução contendo as células foram transferidas a uma placa de ensaio cAMP. Todas as amostras testadas correram em duplicadas com os controles apropriados. Dez microlitros de células foram adicionados aos poços e a placa foi incubada por 30 minutos com agitação em temperatura ambiente. Enquanto as células estavam sendo incubadas com a solução de CGRP, a solução de parada foi preparada em uma solução de 1:200 de cAMP marcado por TAG (MSD) em tampão de lise (MSD). Para parar a incubação de células-CGRP, 20 microlitros de solução de parada e as células e a placa foram incubadas por uma hora com agitação em temperatura ambiente. O tampão de leitura (MSD) foi diluído quatro vezes com água e 100 microlitros foram adicionados aos poços na placa. A placa foi então lida usando um Sector Imager 2400 (MSD) e o software Prism foi usado para ajustar os da- dos e determinação de IC50.

Coleta de tecido

Uma vez que os títulos aceitáveis foram estabelecidos, os coelhos foram sacrificados. Baço, linfonodos e sangue total foram coletados e processados como a seguir:

Baço e linfonodos foram processados em uma suspensão celular única dissociando o tecido e empurrando através de fio estéril malha 70 pm (Fisher) com um êmbolo de uma seringa de 20 cm3. As células foram coletadas em PBS. As células foram lavadas duas vezes por centrifugação. Após a última lavagem, a densidade celular foi determinar por azul de tripa- no. As células foram centrifugadas a 1500 rpm por 10 minutos; o sobrena- dante foi descartado. As células foram resusspensas no volume apropriado de 10% de dimetil sulfóxido (DMSO, Sigma) em FBS (Hyclone) e dispensados a 1 ml/frasco. Os fracos foram armazenados a -70X3 em uma câmara de congelamento lento por 24 horas e armazenados em nitrogênio líquido.

As células mononucleares de sangue periféricas (PBMCs) foram isoladas por mistura de sangue total com partes iguais no meio baixo em glicose descrito acima sem FBS. 35 ml de mistura de sangue total foi cuidadosamente separado em camada de 8 ml de linfócito de coelho (Cedarlane) em um tubo cônico 45 ml (Corning) e centrifugado 30 minutos a 2500 rpm em temperatura ambiente sem quebras. Após centrifugação, as camadas PBMC foram cuidadosamente removidas em uma pipeta Pasteur de vidro (VWR), combinadas e colocadas em um frasco limpo de 50 ml. As células foram lavadas duas vezes com o meio modificado descrito acima por centrifugação a 1500 rpm por 10 minutos em temperatura ambiente, e a densidade celular foi determinada por coloração com azul de tripano. Após a última lavagem as células foram novamente suspensas em um volume apropriado de meio 10% de DMSO/FBS e congelado como descrito acima.

Seleção de célula B, enriquecimento e condições de cultura

No dia de ajuste de cultura de célula B, frascos de PBMC, es- plenócito, ou linfonodos foram descongelados para uso. Os frascos foram removidos de tanque LN2 e colocados em um banho de água de 37X3 até descongelado. Os conteúdos dos fracos foram transferidos em um tubo de centrífuga cônico de 15 ml (Corning) e 10 ml de RPMI modificado descrito acima foi lentamente adicionado ao tubo. As células foram centrifugadas por 5 minutos a 2K RPM; o sobrenadante foi descartado. As células foram novamente suspensas em 10 ml de meio fresco. A densidade e viabilidade de células foram determinadas por azul tripano.

a) O seguinte protocolo foi usado para Ab1 e Ab 13

As células foram pré-misturadas com o CGRP humano biotinila- do como a seguir. As células foram novamente lavadas e novamente suspensas em meio 1E07 células/80 pL. CGRP humano biotinilado foi adicionado à suspensão celular em concentração final de 5 ug/mL e incubada por 30 minutos a 413. CGRP α humano biotinilado não ligado foi removido realizando duas lavagens de 10 ml usando PBF [PBS sem Ca /Mg (Hyclone), 2 mM ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA), 0,5% albumina sérica humana (BSA) (Sigma isento de biotina)]. Após a segunda lavagem, as células foram novamente suspensas a 1E07 células/80 pl PBF e 20 pl de esferas de MACS® estreptavidina (Miltenyi Biotech, Auburn CA) por 10E7 células foram adicionados à suspensão celular. As células e esferas foram incubadas a 413 por 15 minutos e lavadas uma vez com 2 ml de PB F por 10E7 células.

b) O seguinte protocolo foi usado para Ab4, Ab7, Ab9 e Ab11:

CGRPa humano biotinilado foi pré-carregado nas esferas de es- treptavidida como a seguir. Setenta e cinco microlitros de esferas de estreptavidina (Milteny Biotec, Auburn CA) foram misturadas com huCGRPa biotinilado N-terminalmente (10ug/ml concentração final) e 300 ul PBF. Esta mistura foi incubada a 413 por 30 min e CGRP α humano biotinilado não ligado foi removida usando uma coluna de separação MACS® (Miltenyi Biotec, com uma rinsagem de 1ml para remover o material não ligado). Então o material foi extraído, então usado para ressuspender as células acima em 100ul per 1E7 células, a mistura foi então incubada a 413 por 30min e lavada uma vez com 10 ml de PBF.

Para ambos os protocolos a) e b) o seguinte é aplicado: Após lavagem, as células foram novamente suspensas em 500pl de PBF e coloca- das de lado. Uma coluna MACS® MS (Miltenyi Biotec, Auburn CA) foi pré- rinsada com 500 ml de PBF em uma fita magnética (Milteni). A suspensão celular foi aplicada à coluna por um pré-filtro, e a fração não ligada foi coletada. A coluna foi lavada com 2.5 ml de tampão PBF. A coluna foi removida da fita magnética e colocada em um tubo eppendorf claro, estéril de 1.5 ml. 1 ml de tampão PBF foi adicionado ao topo da coluna e as células selecionadas positivas foram coletadas. O rendimento e viabilidade de fração de célula positiva foram determinados por coloração de azul tripano. A seleção positiva gerou uma média de 1% da concentração inicial de célula.

Uma triagem de célula piloto foi estabelecida para fornecer informações em níveis de semeadura para a cultura. As placas foram semeadas a 10, 25, 50, 100, ou 200 B células enriquecidas/poço. Além disso, cada poço continha 50K células/poço de células EL-4.B5 irradiadas (5.000 Rads) e um nível apropriado de sobrenadante de célula T ativada de coelho (ver publicação de pedido de patente US 20070269868) (variando de 1-5% dependendo da preparação) em meio RPMI modificado por alto em um volume final de 250 pl/poço. As culturas foram incubadas por 5 a 7 dias a 3713 em 4% CO2.

Triagem de cultura de célula B por reconhecimento de antígeno (ELISA)

Para identificar poços que produzem anticorpos anti-CGRPa humanos, o mesmo protocolo como descrito para a determinação de título de amostras séricas por reconhecimento de antígeno (ELISA) foi usado com as seguintes alterações. Resumidamente, placas revestidas com neutravidi- na foram revestidas com uma mistura de ambos CGRPa humanos biotinila- dos N e C-terminalmente (50 pL por poço, 1 pg/mL cada). As amostras de sobrenadante de célula B (50pL) foram testadas sem diluição anterior.

Identificação de atividade funcional em sobrenadantes de célula B usando produção de cAMP direcionada por CGRP

Para determinar a atividade funcional contida em sobrenadantes de célula B, um procedimento semelhante ao descrito para a determinação do título funcional de amostras séricas foi usada com as seguintes modificações. Resumidamente, sobrenadante de célula B (20pL) foram usados no lugar de amostras séricas policlonais diluídas.

Isolamento de células B específicas de antígeno

As placas contendo poços de interesse foram removidas de -70 'C, e as células de cada poço foram recuperadas usa ndo cinco lavagens de 200 microlitros de meio (10% RPMI completo, 55pM BME) por poço. As células recuperadas foram peletizadas por centrifugação e o sobrenadante foi cuidadosamente removido. As células peletizadas foram novamente suspensas em 100 pl de meio. Para identificar as células que expressam anticorpo, esferas magnéticas revestidas por estreptavidina (M280 dynabeads, Invitro- gen) foram revestidas com uma combinação de CGRPa humano biotinilado N- e C- terminal. Lotes de CGRP α humano biotinilados individuais foram otimizados por diluição serial. Cem microlitros contendo aproximadamente 4x10E7 de esferas revestidas foram então misturadas com as células res- suspensas. À esta mistura 15 microlitros de IgG de cabra anti-H&L de coe- Iho-FITC (Jackson Immunoresearch) diluído 1:100 em meio foram adicionados.

Vinte microlitros de suspensão célula/esferas/anti- H&L de coelho foram removidos e gotículas de 5 microlitros foram dispensadas em uma lâmina de vidro de um poço anteriormente tratada com Sigmacote (Sigma) totalizando 35 a 40 gotículas por lâmina. Uma barreira impermeável de óleo de parafina (JT Baker) foi usada para submergir as gotículas e a lâmina foi incubada por 90 minutos a 37^ em uma incubadora de 4% CO2 no escuro.

Células B específicas que produzem anticorpo podem ser identificadas pelo anel fluorescente ao redor produzido por secreção de anticorpo, reconhecimento de antígeno biotinilado associado à esfera, e detecção sub-sequente pelo reagente de detecção de IgG fluorescente. Uma vez uma célula de interesse foi identificada esta foi recuperada através de um microma- nipulador (Eppendorf). A célula única sintetizando e exportando o anticorpo foi transferida em um tubo de microcentrífuga, congelada usando gelo seco e armazenada a -70G.

Amplificação e determinação de sequência de sequências de anticorpo de células B específicas para o antígeno

As sequências de anticorpo foram recuperadas usando um método baseado em RT-PCR combinado de uma única célula B isolada. Iniciadores contendo enzimas de restrição foram desenhados para anelar em regiões conservadas e constantes do gene de imunoglobulina alvo (pesada e leve), como sequências de imunoglobulina de coelho, e uma recuperação de PCR ninho de duas etapas foi usada para amplificar a sequência de anticorpo. Amplicons de cada poço foram analisados para recuperação e integridade de tamanho. Os fragmentos resultantes são então digeridos com Alui para mapear a clonalidade de sequência. Sequências idênticas apresentaram um padrão de fragmentação comum em suas análises eletroforéticas. Os fragmentos originais amplicon de cadeia pesada e leve foram então digeridos usando os sítios de enzimas de restrição contidos dentro dos iniciadores de PCR e clonados em um vetor de expressão. O vetor contendo fragmentos de DNA subclonados foi amplificado e purificado. A sequência de cadeias pesadas e leves subclonadas foi verificada antes da expressão.

Produção recombinante de anticorpo monoclonal de propriedades de especi-ficidade ao antígeno e/ou funcionais desejadas

Para determinar a especificidade de antígeno e propriedades funcionais de anticorpos específicos de células B recuperados, os vetores que direcionam a expressão das sequências de cadeia pesada e leve pare- adas desejadas foram transfectados em células HEK-293.

Reconhecimento de antígeno de anticorpos recombinantes por ELISA

Para caracterizar anticorpos expressos recombinantes para suas capacidades de ligar soluções contendo anticorpo CGRPoc humano foram testadas por ELISA. Todas as incubações foram realizadas em temperatura ambiente. Resumidamente, placas Immulon IV (Thermo Scientific) foram revestidas com uma solução contendo CGRPo (1ut/mL em PBS) por 2 horas. Placas revestidas com CGRPoc foram então lavadas em tampão de lavagem (PBS, 0,05% de Tween-20). As placas foram então bloqueadas u- sando uma solução de bloqueio (PBS, 0,5% de gelatina de pele de peixe, 0,05% de Tween-20) por aproximadamente uma hora. A solução de bloqueio foi então removida e as placas foram então incubadas com uma série de diluições do anticorpo sendo testados por aproximadamente uma hora. Ao fim desta incubação, a placa foi lavada três vezes com tampão de lavagem e ainda incubada com uma solução contendo anticorpo secundário (Peroxidase conjugada affinipure fragmento anti-lgG humano F(ab’)2 de cabra, especifico de fragmento Fc (Jackson Immunoresearch) por aproximadamente 45 minutos e lavada três vezes. Neste ponto uma solução de substrato (substrato TMB peroxidase, BioFx) e incubada por 3 a 5 minutos no escuro. A reação foi interrompida por adição de uma solução contendo HCI (0.5M) e a placa foi lida a 450 nm em um leitor de placa.

Resultados: Figuras 15-18 demonstram que anticorpos anti- CGRP Ab1-Ab14 se ligam e reconhecem CGRPa.

Caracterização funcional de anticorpos recombinantes por modulação de níveis de cAMP intracelulares direcionados por CGRP e reatividade cruzada aos ratos

Para caracterizar anticorpo expresso recombinante para suas capacidades de inibir níveis celulares aumentados de ensaio de cAMP mediados por CGRP a, um kit de ensaio eletroquimioluminescência (Meso Scale Discovery, MSD) foi usado. Resumidamente, preparações de anticorpo a serem testadas foram serialmente diluídas em tampão de ensaio MSD (Hepes, MgCI2, pH 7,3, 1mg/ml_ bloqueador A, Meso Scale Discovery) em uma placa de poliestireno de fundo redondo de 96 poços (Costar). A esta placa, o CGRPa humano foi adicionado (25ng/ml_ concentração final) diluído em tampão de ensaio MSD e incubado por uma hora a 37°C. Os controles apropriados foram usados como sugerido pelo fabricante de kit do ensaio. Células de neuroepitelioma humanas (SK-N-MC, ATCC) foram detectadas usando uma solução EDTA (5mM) e lavadas usando meio de crescimento (MEM, 10% de FBS, antibióticos) por centrifugação. O número de células foi ajustado para 2 milhões de células por ml_ em tampão de ensaio, e IBMX (3- lsobutil-1 Metilxantina, 50mM Sigma) foi adicionado a uma concentração final de 0,2mM imediatamente antes de carregar as células na placa de ensaio de cAMP. Após a solução de anticorpo CGRPa foi incubada por uma hora 20 microlitros de solução contendo as células foram transferidas a uma placa de ensaio cAMP. Todas as amostras testadas correram em duplicadas com os controles apropriados. Dez microlitros de células foram adicionados aos poços e a placa foi incubada por 30 minutos com agitação. Enquanto as células estavam sendo incubadas com a solução de CGRP, a solução de parada foi preparada em uma solução de 1:200 de cAMP marcado por TAG (MSD) em tampão de lise (MSD). Para parar a incubação de células-CGRP, 20 microlitros de solução de parada foram adicionados às células e a placa foi incubada por uma hora com agitação. O tampão de leitura (MSD) foi diluído quatro vezes com água e 100 microlitros foram adicionados aos poços na placa. A placa foi então lida usando um Sector Imager 2400 (MSD) e o software Prism foi usado para ajustar os dados e determinação de IC50.

Para testar a capacidade de anticorpos recombinantes em antagonizar CGRPβ humano um ensaio semelhante foi realizado com a substituição de agonista de CGRP (CGRPβ 10ng/ml_ concentração final). A avaliação dos anticorpos recombinantes em reconhecer e inibir geração de cAMP mediada por CGRP foi conduzida usando CGRP de rato (5ng/ml_ concentração final) e a linhagem celular L6 de rato (ATCC).

Resultados: Figuras 19-37 demonstram que os anticorpos anti- CGRP Ab1-Ab14 inibem níveis celulares aumentados de cAMP mediados por CGRPα, CGRPβ, e CGRP de rato.

Exemplo 2: Produção enzímátíca de fragmentos Fab

Digestões por papaína foram conduzidas usando papaína imobilizada (Thermo/Pierce) como por instruções do fabricante. Resumidamente, anticorpos purificados foram incubados em um tampão contendo cisteí- na/HCI com papaína imobilizada a 37^ com balanço suave. A digestão foi monitorada tomando uma alíquota e analisando usando SDS-PAGE para clivagem da cadeia pesada. Para interromper a reação, a papaína imobilizada foi girada e lavada usando 50 mM Tris pH 7,5 e filtrada. Anticorpo completo não digerido e fragmentos Fc foram removidos usando uma coluna MabSelectSure (GE).

Exemplo 3 Expressão em célula de levedura Construção de vetores de expressão de Pichia pastoris para cadeia pesada e leve.

Os fragmentos de cadeia leve e pesadas foram comercialmente sintetizados e subclonados em um vetor de expressão pGAP. O vetor de expressão pGAP usa o promotor GAP para direcionar a expressão da cadeia de imunoglobulina e a sequência líder de albumina sérica humana (HSA) para exportar. Além disso, este vetor contém elementos comuns como uma origem bacteriana de replicação, e uma cópia de gene de resistência a ca- namicina que confere resistência ao antibiótico G418 em P. pastoris. G418 fornece um meio de seleção para cepas que contém o vetor de expressão desejado integrado nos seus genomas.

Transformação de vetores de expressão em cepas hospedeiras haploides meti e Ivs3 de Pichia pastoris

Todos os métodos usados para transformação de cepas haploi- des P. pastoris e manipulação de ciclo sexual de P. pastoris realizada como descrito em protocolos de Pichia (Methods in Molecular Biology Higgings, DR, and Cregg, JM, Eds. 1998. Humana Press, Totowa, NJ). Antes da transformação cada vetor foi linearizado dentro das sequências promotoras GAP para direcionar a integração do vetor no local do promotor GAP do genoma de P. pastoris. Cepas haploides foram transfectadas usando eletroporação e transformantes bem sucedidas foram selecionadas em YPDS (extrato de levedura, peptona dextrose com sorbitol) em placas ágar G418. Números de cópia de genes de cadeia pesada e leve foram determinados para cepas haploides por análise Southern blot. Cepas haploides foram então reproduzidas e selecionadas por suas capacidades de crescer na ausência dos marcadores de aminoácidos (ou seja, Lys e Met). Clones diploides resultantes foram então submetidos a uma Southern blot final para conformar números de cópia de genes de cadeia pesada e leve. Um clone que expressa o anticorpo de interesse foi selecionado usando biocamada interferometria Proteína-A biosensores para monitorar a expressão (Octet, ForteBio).

Exemplo 4 Expressão de Ab3, Ab6 e Ab14 em Pichia pastoris

Três cepas de Pichia para expressão de anticorpo completo foram feitas. Para todas as cepas que expressam anticorpo, as cepas haploi- des foram criadas e subsequentemente cruzadas. Uma cepa haploide expressou a sequência de cadeia leve completa e outra cepa haploide expressou a sequência de cadeia pesada completa. Cada cepa diploide foi usada para gerar um banco de célula de pesquisa e usadas para expressão em um biorreator.

Primeiro, um inóculo foi expandido usando o banco de célula de pesquisa usando o meio compreendido dos seguintes nutrientes (%p/v): extrato de levedura 3%, dextrose anidra 4%, YNB 1.34%, Biotina 0,004% e 100 mM fosfato de potássio. Para gerar o inóculo para os fermentadores, o banco de célula foi expandido por aproximadamente 24 horas em uma incubadora por agitação a 30°C e 300 rpm. Um inóculo de 10% foi então adicionado aos vasos de trabalho de Labfors 2,5L de volume contendo 1 L de meio de crescimento estéril. O meio de crescimento foi compreendido dos seguintes nutrientes: sulfato de potássio 18,2 g/L, fosfato de amónio monobásico 36,4 g/L, fosfato de potássio dibásico 12,8 g/L, sulfato de magnésio heptahi- dratado 3,72 g/L, citrato de sódio di-hidratado 10 g/L, glicerol 40 g/L, extrato de levedura 30 g/L, PTM1 metais traços 4,35 mL/L, e antiespuma 204 1,67 mL/L. A solução de metal traço PTM1 foi compreendida dos seguintes componentes: sulfato cúprico penta-hidratado 6 g/L, iodeto de sódio 0,08 g/L, sulfato de magnésio hidratado 3 g/L, molibdato de sódio di-hidratado 0,2 g/L, ácido bórico 0,02 g/L, cloreto de cobalto 0,5 g/L, cloreto de zinco 20 g/L, sulfato ferroso hepta-hidratado 65 g/L, biotina 0,2 g/L, e ácido sulfúrico 5 mL/L.

Os parâmetros de controle de processo do biorreator foram ajustados como a seguir: Agitação 1000 rpm, fluxo de ar 1,35 litro padrão por minuto, temperatura 28°C e pH foi controlado em seis usando hidróxido de amónio. Nenhuma suplementação de oxigênio foi fornecida.

As culturas de fermentação cresceram por aproximadamente 12 a 16 horas até o glicerol inicial ser consumido como denotado por uma inoculação ao pico de oxigênio dissolvido. As culturas foram colhidas por aproximadamente três horas após a inoculação de oxigênio dissolvido. Após este período de privação, uma adição de etanol em bolus foi inserida no reator para atingir 1% etanol (p/v). As culturas de fermentação foram deixadas e- quilibrar por 15 a 30 minutos. Adição de alimentação foi iniciada 30 minutos após etanol em bolus e ajustado em uma taxa constante de 1 mL/min por 40 minutos, então a bomba de alimentação foi controlada por um detector de etanol mantendo a concentração de etanol a 1 % para o restante da corrida usando uma sonda de detecção (Raven Biotech). A alimentação foi compreendida dos seguintes componentes: extrato de levedura 50 g/L, dextrose 500 g/L, sulfato de magnésio heptahidratado 3 g/L, e PTM1 metais traços 12 mL/L. Para a fermentação do Ab6 e Ab14 completo, citrato de sódio dihidra- tado (0,5g/L) foi ainda adicionado ao alimentador. O tempo de fermentação total foi aproximadamente 90 horas.

Exemplo 5 Métodos para humanizar anticorpos

Métodos para humanizar anticorpos foram descritos anterior- mente na patente US 7935340, a revelação da qual é incorporada aqui por referência em sua totalidade. Em alguns casos, uma determinação de se resíduos estruturais de coelho adicionais são requeridos para manter a atividade é necessária. Em alguns casos os anticorpos humanizados ainda requerem alguns resíduos estruturais de coelho críticos a serem retidos para minimizar a perda de afinidade ou atividade. Nestes casos, é necessário alterar aminoácidos estruturais simples ou múltiplos das sequências humanas de linhagem germinativa de volta aos aminoácidos de coelho originais para ter a atividade desejada. Estas alterações são determinadas experimentalmente para identificar quais resíduos de coelho são necessários para preservar afinidade e atividade. Isto é agora o fim da sequência de aminoácido humanizado de cadeia pesada e leve variáveis.

Exemplo 6 Inibição de ligação CGRP ao seu receptor celular

Para caracterizar anticorpos recombinantemente expressos para suas capacidades em inibir a ligação de CGRP ao seu receptor celular, um ensaio de ligação ao radio-ligante foi realizado como anteriormente descrito [Elshourbagy et al, Endocrinology 139:1678 (1998); Zimmerman et al, Peptides, 16:421 (1995)]. As preparações de membrana de receptores CGRP recombinantes humanos, receptor tipo receptor de calcitonina e RAMP1 (Chemiscreen, Millipore) foram usados. Diluições de anticorpos foram pré- incubadas com CGRPoc humano radiomarcado com 1251 (0,03nM) por 30 minutos em temperatura ambiente. Nenhuma ligação não específica foi estimada na presença de 0.1 uM CGRPa humano. Membranas foram filtradas e lavadas. Os filtros foram então contados para determinar CGRP α humano 1251 radiomarcado especificamente ligado. Resultados: A Figura 38 demonstra que anticorpos anti-CGRP Ab1-Ab13 inibem a ligação de CGRP ao seu receptor celular.

Exemplo 7 Inibição de vasodilatação neurogênica por Anticorpos anti-CGRP em ratos

CGRP é um potente vasodilatador (Nature 313: 54-56 (1985) e Br J. Clin. Pharmacol. 26(6):691-5. (1988)). Um ensaio farmacodinâmico para medir atividade antagonista de receptor de CGRP não invasivamente foi usado para caracterizar anticorpos anti-CGRP. O modelo dependia de alterações em fluxo sanguíneo dérmico medido usando um gerador de imagem Doppler laser seguido por aplicação de uma solução de capsaicina. Capsai- cina ativa o potencial receptor transitório receptor vaniloide tipo 1 (TRPV-1), produzindo inflamação neurogênica e vasodilatação através da liberação local de mediadores vasoativos incluindo CGRP e substância P (Br. J. Pharmacol. 110: 772-776 (1993)).

No dia antes do ensaio de vasodilatação, os animais foram dosados com o agente teste ou controle via IP (intraperitoneal). Após a dosagem, os animais foram raspados e depilados na região posterior inferior de seus lados dorsais, em uma área de aproximadamente 2x6cm. Os animais foram então retornados às suas gaiolas durante a noite. No dia do teste, a- proximadamente 24 horas após a dosagem, os animais foram anestesiados com gás isoflurano e colocados em um bloco de aquecimento de temperatura controlada e ajustado com um cone do nariz para liberação contínua de isoflurano. Um gerador de imagem Doppler laser foi usado para a observação de vasodilatação. Um feixe de luz vermelha coerente gerada por um laser de hélio-néon 633 nm foi direcionado para a área raspada, um retângulo (2x6 cm), e escaneado em um modo de resolução médio. Um scan Doppler basal foi obtido primeiro e o local de colocação do O-ring predeterminado ou identificação de duas áreas de fluxo baixo semelhantes. Dois O-rings de borracha (~1cm em diâmetro) foram colocados nas regiões selecionados e um scan basal foi realizado. Imediatamente após a conclusão do scan, 1mg de capsaicina em 5 pL de uma solução de etanokacetona (1:1) foi aplicado dentro de cada um dos O-rings, os scans Doppler foram repetidos a 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 22,5, 25, 27,5 e 30 minutos após a aplicação da capsaicina. O percentual de alteração do fluxo médio basal dentro de cada um dos dois O-rings foi plotado como os resultados de vasodilatação devido à capsaicina.

Para testar os anticorpos recombinantemente expressos para suas capacidades de inibir a ligação de CGRP ao seu receptor celular, um ensaio de ligação ao radioligante foi realizado como anteriormente descrito.

Resultados: Figuras 39 e 40 demonstram que anticorpos anti- CGRP Ab3 e Ab6 reduziram a vasodilatação neste modelo após administração de capsaicina.

Exemplo 8 Uso de anticorpos anti-CGRP para bloquear diarreia induzida por CGRP em duas cepas de camundongos (camundongos transgênicos Nestin/RAMP1 humanos e camundongos C57BL/6J)

A descoberta inicial que anticorpos CGRP podem ser usados para prevenir ou tratar diarreia induzida por CGRP foi baseada em estudos no efeito de anticorpos CGRP em CGRP induziu fotofobia ou fotoaversão. Isto foi realizada como um marco das enxaquecas é fotofobia, ou sensibilidade aumentada à luz [Mulleners et al, Headache 41: 31-39 (2001); Recober et al, J. Neuroscience 29:8798:8804 (2009)]. Sabe-se ainda que enxaquecosos, mas não os não enxaquecosos são sensíveis à dor de cabeça induzida por CGRP [revisado em Neurology 22:241-246 (2009)]. CGRP se liga a um receptor acoplado à proteína G chamado CLR (receptor tipo calcitonina) que trabalha concomitantemente com a proteína modificadora de atividade do receptor 1 (RAMP1) na mediação da ligação de CGRP e sinalização. In vitro, a atividade de CGRP é fortemente melhorada por super expressão de subu- nidade RAMP1 do receptor de CGRP [(J. Neurosci. 27:2693-2703 (2007)]. Para estudar o comportamento de aversão à luz em camundongos, um modelo de camundongo transgênico a nestin/ RAMP1 humano foi desenvolvido [Recober et al, J. Neuroscience 29: 8798-8804 (2009); Russo et al, Mol. Cell. Pharmacol., 1:264-270 (2009)]. Estes camundongos quando expostos a CGRP apresentam sintomas associados com enxaquecas em aversão à luz particular (ibid). Este protocolo é detalhado abaixo.

PROTOCOLO DE AVERSÃO À LUZ

Para testar a capacidade de anticorpos anti-CGRP em bloquear a fotofobia induzida por CGRP, camundongos são engaiolados em condições padrões em grupos de 2-5 por gaiola com um ciclo de 12 horas de luz (luzes ligadas as 0500 CST)/0600 CDT e desligadas as 1700 CST/1800 CDT) e o acesso a água e alimento ad libitum.Os camundongos usados nos estudos são compreendidos em colônias de camundongos de genótipo Nes- tin/hRAMP1 que contêm dois alelos transgene Tg(Nes-cre)1 Kln/J e alelos Tg(RAMP1) (B6;SJL-Tg(Nes-cre)1 Kln Tg(RAMP1). Nes-cre foi introduzido nestes camundongos por um intercruzamento envolvendo camundongos obtidos de The Jackson Laboratory (estoque 003771) em um fundo genético B6.

Os camundongos de controle usados no protocolo são de ninhada que são não transgênicos ou transgênicos simples (não expressam hRAMPI) contendo os transgenes: nestin- cre ou Cx1-GFP-hRAMP1. A colônia estoque é mantida por cruzamento reverso de camundongos CX1- GFP-hRAMP1 com ninhadas não transgênicas na instalação de barreira. Para estudos de comportamento, a colônia é mantida por cruzamento de camundongos transgênicos simples CX1-GFP-hRAMP1 com camundongos nestin-cre em instalações de não barreira. Todos estes camundongos são tratados por procedimentos de tratamento de animais aprovados pela University of Iowa Animal Care and Use Committee e ainda são realizados de acordo com o grupo padrão pelos National Institutes of Health.

Os materiais e equipamentos usados neste protocolo incluem uma caixa de Claro/Escuro e câmaras de teste compreendendo um campo aberto plexiglass (27 x 27 x 20,3 cm) contendo 16 arranjos de feixes infravermelhos (Med Associates Inc., St. Albans, VT). A caixa de claro /escuro é dividida em duas zonas igualmente divididas por um inserto escuro que é opaco à luz visível. Há uma abertura (5,2 x 6,8 cm) no inserto escuro que permite que os camundongos se movimentem livremente entre as duas zonas. Esta câmara de teste é colocada dentro de um cubículo de atenuação de som (56 x 38 x 36 cm) com um ventilador para ventilação (Med Associates Inc.). Há seis câmaras para o sistema geral que integra com um computador contendo software para registrar e coletar dados (Med Associates Inc.).

O software usado para monitorar resultados são Activity Monitor v 6.02 (Med Associates Inc.). Os ajustes de software usados para registrar compreendem: Resolução (ms): 50, tamanho da caixa: 3, Delay restante (ms): 500, Gatilho ambulatorial: 3, tipo de sessão: C, tempo de sessão (min): 20, intervalo de bloco (see): 300, e arquivo comprimido: DEFAULT.ZIP.

No protocolo a fonte de luz para cada câmara é um painel LED que foi instalado ao teto do cubículo de atenuação de som. O painel de LED contém 36 bulbos LED colimados □ de 1 watt (5500k Daylight White) (LEDwholesalers, Burlingame, CA). Para controlar a intensidade de luz, cada painel de LED é conectado a um driver LED regulável (LINEARdrive; eldo- LED America Inc., San Jose, CA) levando a uma faixa potencial de intensidade de luz de ~300 a 27.000 lux. A intensidade de luz padrão é ~1000-1200 lux salvo se indicado de outra forma.

Os injetares usados são feitos à mão inserindo uma agulha despojada 30 de calibre x 1Z" no tubo de polietileno não radiopaco (diâmetro interno 0,38 mm; diâmetro externo 1,09 mm). Usando o tubo descrito acima, uma rolha (~1cm em comprimento) é colocada na agulha deixando aproximadamente 2,5 mm do bisel não coberto. Estes injetares são conectados a uma seringa 10 pL Hamilton.

Os camundongos são injetados ICV com a-CGRP de rato (Sigma) diluídos em solução salina tamponada com fosfato (D-PBS) (Hyclone). A liberação de dose total é 0,5 nmol. Por exemplo, 250 ou 500 pg CGRP é diluído em 250 ou 500 pL PBS estéril para uma concentração final de 1 pg/pL. O CGRP é armazenado a -2010 e alíquotas são congela das-descongeladas na maioria das vezes uma vez. O PBS é armazenado a 410.

Os camundongos são administrados com um anticorpo exemplar anti-CGRP discutido aqui (Ab3) que é armazenado a 4G antes da administração. Neste protocolo antes da administração do anticorpo, ou seja, aproximadamente 24 horas antes do teste, os camundongos são pesados e então recebem uma injeção sistêmica de (intraperitoneal (ip)) de: veículo, anticorpo controle (anticorpo anti-digoxina), ou anticorpo de ligação a CGRP em uma dosagem de 30 mg/kg. Os camundongos são ainda triados para detectar qualquer condição física anormal que poderia afetar o ensaio como, a- nolftamia, catarata, ou outras anormalidades como, asseamento, etc. O dia após administração do anticorpo, os camundongos são transportados em gaiolas do alojamento animal em um carrinho e então os camundongos são colocados em sala de comportamento para aclimatação pelo menos 1 hora antes de qualquer injeção ou teste. Qualquer cobertura requerida para transporte é removida das gaiolas e condições de luz normais (iluminação fluorescente sobre a cabeça padrão) são ligadas durante aclimatação e permanecem ligadas pelo restante do procedimento. Além disso, todo equipamento que produz som incluindo dispositivos anestésicos, câmaras de claro/escuro, e painéis LED são ligados durante aclimatação e permanecem ligados até o teste estar completo. Tipicamente há presença humana mínima na sala durante aclimatação.

Após aclimatação cada camundongo é colocado em uma câmara de indução e administrada 3,5% isoflurano. Após o camundongo ser anestesiado, este é transferido a um cone de nariz mantendo 3,5% de administração de isoflurano, de modo que permanece anestesiado durante a injeção. Em seguida, a administração do fármaco é realizada usando o injetor por injeção direta no ventrículo lateral direito através de couro cabeludo intacto objetivando 1 mm posterior ao bregma e 1 mm à direta da linha média.

Tipicamente para consistência todas as injeções são realizadas pela mesma pessoa após um período de treinamento gerando uma taxa de sucesso de >90% como demonstrado por injeções nos ventrículos. Os fár- macos injetados aos 2,0 pL veículo (D-PBS) pL ou 2,0 pg CGRP em 2,0 pL veículo (1 pg/pL) administrados como uma injeção direta intracerebroventri- cular no ventrículo lateral direito do cérebro através do couro cabeludo intacto objetivando 1 mm posterior ao bregma e 1 mm à direita da linha média como descrito antes [Recober et al, J. Neuroscience 29: 8798-8804 (2009)] após todos 2,0 pL serem liberados, a agulha permanece no local por 10 segundos e então removida. O tempo de injeção é então registrado.

Após a injeção os camundongos são deixados recuperar por 30 minutos antes do teste em uma gaiola vazia não coberta contendo um papel toalha para forrar. Durante a recuperação, o seguinte é registrado: diarreia, urinação excessiva, sangramento após a injeção, comportamento anormal como falta de movimento, convulsões, etc. Baseado nestas observações foi determinado se a administração no anticorpo anti-CGRP tem um efeito (preventivo ou paliativo) em diarreia induzida por CGRP nos camundongos transgênicos que são administrados e depois administrados com CGRP ICV em relação aos camundongos transgênicos que são somente administrados com CGRP e o controle (veículo ou anticorpo controle no veículo). Anticorpos que inibem diarreia induzida por CGRP neste protocolo são identificados como sendo potencialmente úteis para tratar ou prevenir diarreia aguda ou crônica, particularmente diarreia que é associada com níveis de CGRP elevados.

Após uma recuperação de 30 minutos o teste do protocolo de luz é realizado. Cada camundongo é colocado junto à parede posterior (mais longe da abertura entre as duas zonas) na zona de luz aproximadamente no centro. Isto dispara o registro a começar. Até seis camundongos são testados de uma vez (um camundongo por câmara). Durante o teste a prateleira com a câmara é empurrada de volta no armário e as portas são fechadas. O software registra o movimento do camundongo por 20 minutos. Após o registro ser completado, cada camundongo é removido e colocado de volta em gaiola doméstica para transporte de volta ao alojamento animal.

Resultados

Usando este protocolo um anticorpo anti-CGRP desenvolvido por Alder Biopharmaceuticals identificado como Ab3 aqui demonstrou resultar em camundongos transgênicos gastando uma quantidade estatisticamen- te significativa do tempo na luz. (estes resultados não são mostrados uma vez que se referem a uma invenção diferente que é revelada no pedido provisório US 61/496.860 (Atty. Docket No. 67858.760000) depositado em 14 de junho de 2011 e US(Attorney Docket No. 67858.730303) depositado na mesma que este pedido, e cujo pedido é incorporado por referência aqui).

De relevância à presente invenção foi descoberto durante estes experimentos que os camundongos que foram tratados com o mesmo anticorpo Alder anti-CGRP (Ab3) também não apresentaram diarreia associada a CGRP. Enquanto que a administração de CGRP induziu diarreia na maioria dos camundongos transgênicos nos estudos de fotoaversão que não são administrados o anticorpo anti-CGRP, diarreia não foi observada nos mesmos camundongos transgênicos que receberam a administração de CGRP e que foram ainda administrados com Ab3 sistemicamente (intraperitoneal).

Estes resultados são mostrados na Figura 41. Mais especificamente, Figura 41 contém os resultados dos experimentos em que os efeitos de CGRP injetadas por via intracerebroventricular (ICV) em camundongos transgênicos Nestin/hRampl. Os dados mostram que administração de C- GRP de rato injetada ICV induziu diarreia em camundongos Nestin/hRAMPI tg e que a injeção intra peritoneal de Ab3 (30mgs/kg, ~24 h antes do desafio CGRP) inibe diarreia induzida por CGRP injetada intra cerebroventricular (ICV) em camundongos Nestin/hRAMPI tg.

Pode ser ainda observado na figura que todos os camundongos transgênicos Nestin/hRampl que não receberam CGRP (camundongos ad-ministrados com veículo IP e veículo ICV somente) não desenvolveram diarreia. Nestes estudos os camundongos transgênicos RAMP1 C57/BL6J receberam CGRP(alfa) de rato.

Em contraste, a maioria dos mesmos camundongos transgênicos que receberam CGRP de rato administrado ICV e que foram ainda administrados com controles (o anticorpo controle em um veículo IP ou uma combinação de veículo IP e ICV) desenvolveram diarreia (foi respectivamente observado em 90% ou cerca de 80% dos camundongos que receberam o CGRP e o anticorpo ou veículos controles). Mais significativamente os dados na Figura 41 mostram que todos os camundongos transgênicos que receberam o anticorpo Alder Ab3 e CGRP não desenvolveram diarreia.

Além disso, os experimentos foram conduzidos em camundongos não transgênicos (camundongos C57BL/6J). Em contraste aos estudos anteriores usando os camundongos Nestin/hRAMPI, a cepa C57/BL6J foi administrada com CGRP(a) humano. Estes experimentos resultaram em resultados semelhantes, ou seja, o anticorpo anti-CGRP preveniu a diarreia associada com CGRP nestes animais. Estes resultados cumulativamente sugerem que os anticorpos que especificamente se ligam a CGRP (e possivelmente outros polipeptídeos que inibem a interação de CGRP/receptor CGRP) podem ser usados para inibir diarreia associada a CGRP em indivíduos diferentes, e tratar diferentes condições ou tratamentos que envolvem níveis excessivos de CGRP como, aqueles identificados aqui.

As Figuras 42-44 contêm os resultados destes experimentos CGRP semelhantes realizados em não transgênicos (camundongos C57BL/ 6J). Estes resultados mostram que o mesmo anticorpo anti-CGRP (Ab3) preveniu a diarreia nos camundongos C57BL/6J que receberam CGRP humano. Em contraste a maioria dos camundongos C57BL/6J que receberam o CGRP(a) humano e os mesmos controles desenvolveram diarreia.

Especificamente, Figura 42 contém os resultados dos experimentos que mostram que a injeção intra cerebroventricular (ICV) de CGRP humano (semelhante ao CGRP de rato) induz diarreia em um modo dose dependente em camundongos C57BL/6J. Os dados ainda mostram que cerca de 80% dos camundongos C57BL/6J administrados com 2,0 pg do CGRP humano via injeção intra cerebroventricular desenvolveram diarreia enquanto que nenhum dos camundongos que recebeu o controle ou uma quantidade reduzida de CGRP humano (0,4 pg) desenvolveu diarreia.

Figura 43 contém os resultados de experimentos adicionais que mostram que injeção intraperitoneal de Ab3 (30mgs/kg ip, ~24 h antes de desafio com CGRP-alfa humano) inibe diarreia induzida por CGRP injetado ICV em camundongos C57/BL6J. Em contraste, a administração do anticor- po controle ou veículo não teve efeito em diarreia induzida por CGRP injetada ICV.

Figura 44 contém os resultados de experimentos adicionais que mostram que Ab3 (30mgs/kg injeção ip, ~24 h antes de desafio com CGRP- alfa humano) inibe diarreia induzida por CGRP injetado IP em camundongos C57/BL6J. Em contraste, a administração do anticorpo controle continha no mesmo veículo como Ab3 não teve efeito em diarreia induzida por CGRP.

Estes resultados obtidos em diferentes cepas de camundongos persuasivamente demonstram que a administração de um anticorpo anti- CGRP ou fragmento de anticorpo podem prevenir ou melhorar a diarreia, especialmente em condições que são associadas com níveis elevados de CGRP. Estes resultados ainda indicam que há um efeito profilático semelhante quando o CGRP é administrado por 2 diferentes meios (injeção intraperitoneal ou intracerebroventricular) e é específico às espécies diferentes. Assim, o anticorpo anti-CGRP é aparentemente capaz de efetivamente se ligar a CGRP e previne os efeitos adversos da diarreia independente se foi liberada sistemicamente ou localmente via injeção ICV.

Além disso, os resultados mostram que os ensaios em roedores que são administrados com CGRP podem ser usados para avaliar se um anticorpo anti-CGRP candidato ou outro inibidor polipeptídeo CGRP/recep- tor CGRP pode ser usado para inibir ou tratar distúrbios gastrointestinais ou outras condições caracterizadas por CGRP excessivo que envolve anormalidades nas evacuações, equilíbrio de eletrólito e/ou excreção de fluido, e em particular diarreia. Estas condições incluem por meio de exemplo doença intestinal inflamatória, diarreia induzida por bactéria ou vírus, distúrbios intestinais funcionais selecionados do grupo que consiste em refluxo gastroeso- fágico, dispepsia, síndrome do intestino irritável, síndrome de dor abdominal funcional, diverticulose, e diverticulite, Doença de Crohn, ileíte, colite colage- nosa, colite linfocítica, e colite ulcerativa e cânceres e tratamentos de câncer associados com diarreia, por exemplo, carcinoma de tireoide medular ou câncer colorretal e outras condições anteriormente identificadas.

Exemplo 9 Efeito de administração de anticorpo CGRP em evacuação colônica

Os experimentos foram conduzidos em camundongos C57BL/6 para avaliar a eficácia potencial de administração de anticorpo CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia e distúrbios gastrointestinais relacionados. Em relação aos experimentos usando camundongos C57BL/6J no E- xemplo 8, uma dosagem maior de CGRP e uma dosagem inferior foram utilizadas; independentemente, Ab3 e Ab6 foram efetivos para reduzir a incidência de diarreia.

Métodos

Camundongos machos C57BL/6 (Harlan Partoatories) em 6-8 semanas de idade foram alojados individualmente em gaiolas convencionais de policarbonato claras ou gaiolas de microisolador de policarbonato cla- ra/amarela com forração de contato irradiada certificada e aclimatados à instalação do estudo por pelo menos 24 horas. Alimento e água foram fornecidos ad libitum.Controles ambientais foram ajustados para manter temperaturas de 18 a 26 graus C (64 a 79 graus F) com uma umidade relativa de 30% a 70%. Um ciclo de 12:12 horas de claro:escuro foi mantido.

Os animais foram randomizados em quatro grupos de tratamento (dez animais cada), baseado em peso corporal no dia seguinte à chegada. Os pesos corporais médios para cada grupo foram revisados para garantir que os valores médios e desvio padrão satisfaziam a hipótese de homogeneidade.

No dia 1, grupos de tratamento 1 e 2 foram administrados com o anticorpo de controle negativo (do mesmo isotipo como os anticorpos anti- CGRP) e grupos 3 e 4 receberam anticorpos Ab3 e Ab6, respectivamente (todos os anticorpos administrados i.p. a 10 mg/kg, volume de dose 2,63 mL/kg).

No dia 2, grupos de tratamento 2, 3, e 4 foram administrados com CGRP (0,05 mg/kg, volume de dose 3,33 mL/kg) i.p. e grupo 1 foi administrado em volume igual de dose de solução salina tamponada com fosfato i.p.. Os animais foram então colocados em um pedaço de papel absorvente dentro da gaiola separada de suas gaiolas iniciais imediatamente após a dose. O pedaço de papel foi pesado antes de colocar este no fundo da gaiola e o peso foi registrado. As evacuações dos animais foram monitoradas por 30 minutos após a dose de CGRP. As observações foram feitas como incidência e peso total de diarreia (que adere no papel). Uma incidência positiva de diarreia foi registrada se fezes soltas estavam presentes. Peso fecal bruto foi determinado por elevação do papel fora da gaiola segurando a lateral e elevando enquanto se mantêm o papel em aproximadamente um ângulo de 45 graus, e agitando suavemente. Quaisquer fezes que caíram foram consideradas normais, as que grudaram no papel foram consideradas diarreicas. O pedaço de papel com as fezes grudadas foi então colocado na escala e pesada.

Resultados

Após administração CGRP os efeitos de dois diferentes anticorpos anti-CGRP em distresse gastrointestinal, neste caso a diarreia, foram avaliados durante um período de observação de 30 minutos e comparado com os dois grupos de controle. Conforme mostrado na FIG. 45, 80% dos animais controle positivo (recebendo CGRP e o anticorpo de controle negativo) apresentaram diarreia, comparado a somente 60% e 40% dos animais que receberam Ab6 e Ab3. Nenhum dos animais de controle negativo apresentou diarreia. Além disso, o peso fecal bruto nos animais que receberam o anticorpo CGRP foi significativamente menos do que os animais de controle (FIG. 46). Ainda, a consistência fecal nos animais que receberam o anticorpo controle foi muito mais fluida (aquosa) em relação aos animais que receberam os anticorpos anti-CGRP, outra indicação que o anticorpo CGRP ajudou a restaura a função gastrointestinal normal e especificamente evacuação colônica normal.

Estes resultados ainda confirmam que um anticorpo anti-CGRP pode ser efetivo para prevenir ou tratar diarreia e condições relacionadas.

Exemplo 10 Efeito de administração de anticorpo CGRP em evacuação colônica

Outro experimento foi conduzido em camundongos C57BL/6 para avaliar a eficácia potencial de administração de anticorpo CGRP para o tratamento ou prevenção de diarreia e distúrbios gastrointestinais relacionados. Uma dosagem maior de anticorpos anti-CGRP foi utilizada do que no Exemplo 9 e o efeito na incidência de diarreia e peso fecal bruto foi mais pronunciado.

Métodos

A diarreia foi experimentalmente induzida em camundongos C57BL/6, com dez camundongos em cada um dos quatro grupos de tratamento como no exemplo 9, exceto que a dosagem de cada anticorpo foi três vezes maiores (30 mg/kg, volume de dose 7,89 mL/kg), e o volume de dose de CGRP foi três vezes maiores através da dose de CGRP foi a mesma (0,05 mg/kg, volume de dose foi 10 mL/kg). Grupo 1 (controle negativo) recebeu o anticorpo controle negativo no dia 1 e solução salina tamponada com fosfato no dia 2. Os grupos 2, 3, e 4 receberam o anticorpo de controle, Ab3, e Ab6, respectivamente, no dia 1, e CGRP no dia 2. Anticorpos e C- GRP foram administrados i.p..

Resultados

Após administração CGRP os efeitos de dois diferentes anticorpos anti-CGRP em distresse gastrointestinal, neste caso a diarreia, foram avaliados durante um período de observação de 30 minutos e comparado com os dois grupos de controle. Conforme mostrado na FIG. 47, 80% dos animais controle positivo (recebendo CGRP e o anticorpo de controle negativo) apresentaram diarreia, comparado a somente 40% e 20% dos animais que receberam Ab6 e Ab3. Nenhum dos animais de controle negativo apresentou diarreia. Além disso, o peso fecal bruto médio nos animais que receberam os anticorpos anti-CGRP foi significativamente menos do que os animais de controle (FIG. 48). Ainda, a consistência fecal nos animais que receberam o anticorpo controle foi muito mais fluida (aquosa) em relação aos animais que receberam os anticorpos anti-CGRP, outra indicação que o anticorpo CGRP ajudou a restaura a função gastrointestinal normal e especifi-camente evacuação colônica normal.

Estes resultados ainda confirmam que um anticorpo anti-CGRP pode ser efetivo para prevenir ou tratar diarreia e condições relacionadas.

Claims (27)

1. Composição farmacêutica para inibir, prevenir ou tratar diarreia ou disenteria e/ou manter níveis apropriados de eletrólito e fluido no colon de um sujeito tendo uma condição associada com diarreia ou 5 disenteria, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-CGRP, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo anti-CGRP compreende sequências de polipeptídeo de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve variável (VL) e sequências de polipeptídeo de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada variável (VH) selecionadas das seguintes:

2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo anti-CGRP compreende uma sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável (VL) e uma sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável 15 (VH) selecionada das seguintes combinações:

3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo anti-CGRP compreende uma sequência de polipeptídeo de cadeia leve e uma sequência de polipeptídeo de cadeia pesada selecionadas das seguintes combinações:

4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido anticorpo anti-CGRP ou fragmento de anticorpo compreende sequências de polipeptídeo de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve variável (VL) compreendendo respectivamente as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 55, 56 e 57 e sequências de polipeptídeo de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada variável (VH) compreendendo respectivamente as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, 59 e 60.

5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que referido anticorpo anti-CGRP ou fragmento de anticorpo compreende um leve (variável que VL polipeptídeo de cadeia) compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e um pesada variável (VH polipeptídeo de cadeia) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53.

6. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o referido anticorpo anti- CGRP ou fragmento de anticorpo compreende domínios constantes de lgG1 humana.

7. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o referido anticorpo anti- CGRP ou fragmento de anticorpo compreende domínios constantes de lgG1 humana que compreendem a função efetora prejudicada.

8. Composição farmacêutica, de acordo a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o referido anticorpo anti-CGRP ou fragmento de anticorpo compreende domínios constantes de lgG1 humana modificados para alterar a meia-vida, proteólise e/ou glicosilação.

9. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o referido anticorpo anti- CGRP ou fragmento de anticorpo é expresso em células de Pichia pastoris.

10. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o referido anticorpo anti- CGRP ou fragmento de anticorpo é expresso em células CHO.

11. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que (i) a diarreia ou disenteria é associada com CGRP aumentada; (ii) a diarreia é diarreia aguda ou diarreia crônica; (iii) a diarreia compreende diarreia osmótica, diarreia secretória, diarreia de motilidade, diarreia exsudativa e/ou diarreia inflamatória; (iv) a diarreia é causada por uma condição crônica ou aguda selecionada de um distúrbio do intestino funcional, síndrome do intestino irritável, doença celíaca, doença pancreática, pancreatite, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, fibrose cística, doença de Crohn, neuropatia diabética, menstruação, hipertireoidismo, desequilíbrio hormonal, enterite, uma doença intestinal inflamatória, colite microscópica, doença intestinal isquêmica, colite ulcerativa, mucosite ou tuberculose; (v) a condição associada com diarreia é uma diarreia induzida bacteriana, parasitica ou virai; (vi) a condição associada com diarreia é um parasita selecionado de Entaamoeba histolytica, Giardia ou outro protozoário; (vii) a condição associada com diarreia é infecção por uma bactéria selecionada de E coli, Shigella, Entaamoeba histolytica, Salmonella, Campylobacterou Clostridium difficile', (viii) a condição associada com diarreia é infecção por um vírus selecionado de rotavirus, RSV, HIV, norvovírus, adenovirus e astrovírus; (ix) a condição associada com diarreia é envenenamento alimentar; (x) a condição associada com diarreia é um distúrbio do intestino funcional selecionado do grupo consistindo em refluxo gastroesofágico, dispepsia, síndrome do intestino irritável, síndrome da dor abdominal funcional, má absorção de ácido biliar ou diverticulite; (xi) a condição associada com diarreia é uma doença intestinal inflamatória que é selecionada do grupo consistindo em doença de Crohn, ileíte, colite colagenosa, colite linfocítica ou colite ulcerativa; (xii) a condição associada com diarreia é um câncer ou um tratamento de câncer associado com diarreia; (xiii) a condição associada com diarreia é um câncer selecionado de carcinoma de tireoide medular, condição de tumor secretando hormônio, câncer renal, câncer de fígado ou um câncer colorretal; (xiv) a condição associada com diarreia é um tratamento de câncer selecionado de quimioterapia, terapia de citocina, radiação ou uma combinação das mesmas; (xv) a condição associada com diarreia é um câncer ou um tratamento de câncer que resulta em mucosite ou dano à borda em escova intestinal; (xvi) a condição associada com diarreia é uma terapia envolvendo o uso de um fármaco, quimioterapia, um imunorregime, terapia celular e/ou terapia de radiação; ou (xvii) a condição associada com diarreia é um tratamento envolvendo o uso de um antibiótico, agente analgésico, tal como uma NSAID ou composto opioide, antidepressivo ou hormônio.

12. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que (i) o anticorpo ou fragmento de anticorpo anti-CGRP é usado como uma monoterapia, ou (ii) o anticorpo ou fragmento de anticorpo anti-CGRP ou anti-CGRP-R é usado em um regime de tratamento que inclui a administração de outro agente de tratamento antidiarreia.

13. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo anti-CGRP é usado em um regime de tratamento que inclui a administração de outro agente de tratamento antidiarreia que é selecionado de um agente antimotilidade, tal como loperamida; um composto de bismuto; codeína; composto de zinco; sequestrante de ácido biliar, tal como colestiramina, colestipol ou colesevelam; solução de eletrólito ou probiótico.

14. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que: (i) o fragmento de anticorpo é um fragmento Fab, um fragmento Fab’ ou um fragmento F(ab’)2; (ii) o anticorpo ou fragmento de anticorpo CGRP anti-humano é não glicosilado, carece de N-glicosilação ou, se glicosilado, apenas contém somente resíduos de manose; (iii) o anticorpo ou fragmento de anticorpo CGRP anti-humano contém uma região Fc que foi modificada para alterar função efetora, meia- vida, proteólise e/ou glicosilação; (iv) o anticorpo ou fragmento de anticorpo CGRP anti-humano é um anticorpo humanizado, de cadeia simples ou quimérico; (v) o anticorpo ou fragmento de anticorpo CGRP anti-humano é um anticorpo quimérico que compreende um Fc humano derivado de lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4;e (vi) combinações de qualquer uma das anteriores.

15. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que (i) a composição farmacêutica é adaptada para administração 6/9 intramuscular, subcutânea, intravenosa, retal, por infusão, oral, transdérmica ou via inalação; ou (ii) a composição farmacêutica é adaptada para administração intravenosa.

16. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a diarreia associada a CGRP é selecionada de diarreia associada com síndrome do intestino irritável, doença intestinal inflamatória, doença de Crohn, ileíte, colite ulcerativa, cólera, doença pancreática, intolerância a lactose, má absorção de frutose, má absorção, overdose ou superingestão de magnésio, overdose ou superingestão de vitamina C, overdose ou superingestão de sorbitol, envenenamento alimentar, infecção por E. coli, deficiência de enzima, anormalidade de mucosa, doença celíaca, intolerância a glúten, anemia perniciosa, alergia a alimento, intolerância a alimento, síndrome do intestino delgado, fibrose de radiação, diarreia associada com quimioterapia, tratamento orlistat, fibrose cística, pancreatite, ingestão de etanol crônica, doença intestinal isquêmica, colite microscópica, má absorção de sal de bile, diarreia de ácido biliar primária, secreção ou níveis de seratonina elevados ou fezes amolecidas recorrentes.

17. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-CGRP ou fragmento de anticorpo anti-CGRP é usado em um regime de tratamento que ainda inclui: (i) outro agente terapêutico ou regime selecionado de: antibióticos, antivirais, absorventes, medicamentos antimotilidade, compostos de bismuto, subsalicilato de bismuto, sequestrantes de ácido biliar, probióticos, enzimas digestivas, lactase, zinco, terapia de reidratação oral e qualquer combinação dos mesmos; (ii) agentes antimotilidade selecionados de loperamida, difenoxilato com atropina, opiatos, tintura paregórica de ópio, codeína e morfina; e/ou (iii) um sequestrantes de ácido biliar selecionado de: colestiramina, colestipol ou colesevelam.

18. Uso de um anticorpo anti-CGRP ou fragmento de anticorpo anti-CGRP, caracterizado pelo fato de ser para preparação de uma composição farmacêutica para inibir, prevenir ou tratar diarreia ou disenteria 5 e/ou manter níveis apropriados de eletrólito e fluido no colon de um sujeito tendo uma condição associada com diarreia ou disenteria, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo anti-CGRP compreende sequências de polipeptídeo de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve variável (VL) e sequências de polipeptídeo de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada variável (VH) se ecionadas das seguintes:

19. Uso de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo anti-CGRP compreende uma sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável (VL) e uma sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável (VH) selecionada das seguintes combinações:

20. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo anti-CGRP compreende uma sequência de polipeptídeo de cadeia leve e uma sequência de polipeptídeo de cadeia pesada selecionadas das seguintes combinações:

21. Uso, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CGRP ou fragmento de anticorpo compreende sequências de polipeptídeo de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve variável (VL) compreendendo respectivamente as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 55, 56 e 57 e sequências de polipeptídeo de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada variável (VH) compreendendo respectivamente as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, 59 e 60.

22. Uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que referido anticorpo anti-CGRP ou fragmento de anticorpo compreende um leve (variável que VL polipeptídeo de cadeia) compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e um pesada variável (VH polipeptídeo de cadeia) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53.

23. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CGRP ou fragmento de anticorpo compreende domínios constantes de lgG1 humana.

24. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CGRP ou fragmento de anticorpo compreende domínios constantes de lgG1 humana que compreendem a função efetora prejudicada.

25. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CGRP ou 5 fragmento de anticorpo compreende domínios constantes de lgG1 humana modificados para alterar a meia-vida, proteólise e/ou glicosilação.

26. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 25, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CGRP ou fragmento de anticorpo é expresso em células de Pichia 10 pastoris.

27. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 26, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CGRP ou fragmento de anticorpo é expresso em células CHO.

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