BR112013014688B1

BR112013014688B1 - Bactérias escherichia coli geneticamente alteradas

Info

Publication number: BR112013014688B1
Application number: BR112013014688-5A
Authority: BR
Inventors: Sudhanshu Dole; R. Rogers Yocum; Theron Hermann; Xiaohui Yu
Original assignee: Myriant Corporation
Priority date: 2010-12-13
Filing date: 2011-12-13
Publication date: 2021-09-28
Also published as: CN103347999A; ES2686301T3; BR112013014688A2; US20130337519A1; EP2652122B1; EP2652122A4; MY170513A; SG191156A1; WO2012082720A3; US9845513B2; WO2012082720A2; CN103347999B; EP2652122A2

Abstract

bactéria geneticamente alterada, bem como método de produção de ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, e 1,4-butanodiol a partir de um meio contendo sacarose. a presente invenção refere-se à produção de químicos por fermentação com um micro-organismo em que o meio de fermentação contém sacarose de açúcar. como um exemplo específico, ácido succínico é produzido de um estoque de alimentação renovável contendo sacarose através de fermentação usando um biocatalisador. exemplos de tal biocatalisador incluem micro-organismos que foram intensificados em sua capacidade de utilizar sacarose como uma fonte de carbono e de energia. os biocatalisadores da presente invenção são derivados da manipulação genética de cepas parentais que foram originalmente construídas com o objetivo de produzir um ou mais químicos (por exemplo, ácido succínico e/ou um sal de ácido succínico) em uma escala comercial usando estoques de alimentação outros do que sacarose. uma manipulação genética da presente invenção envolve a introdução de genes exógenos envolvidos no transporte e metabolismo de sacarose nas cepas parenterais. os genes envolvidos no transporte e metabolismo de sacarose podem também serem introduzidos em um micro- organismo antes do desenvolvimento do organismo para produzir um químico particular. os genes envolvidos no transporte e metabolismo de sacarose podem também serem usados para aumentar ou aperfeiçoar o transporte e metabolismo de sacarose por cepas já conhecidas por terem alguma capacidade de utilização de sacarose em fermentação biológica.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório dos Estados Unidos No. de Série 61/459.446, depositado em 13 de dezembro de 2010.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se a campo de produção de especialidade e comodidade de químicos orgânicos usando biocatalisadores que foram modificados para aumentar sua capacidade de usar estoque de alimentação contendo sacarose. Mais especificamente, a presente invenção está relacionada a modificações genéticas requeridas para transporte e metabolismo de sacarose na produção biológica de ácido succínico e outros químicos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] Um grande número de químicos orgânicos são atualmente derivados de estoques de alimentação petroquímicos. Existe um interesse crescente na produção de muitos destes compostos orgânicos derivados de petroquímico através de processos de fermentação biológica usando estoque de alimentação renovável. A lista de compostos orgânicos que pode ser derivada de estoque de alimentação renovável inclui 1,4-diácidos (succínico, fumárico, málico, glucárico, malônico, e maléico), ácido 2,5-furan dicarboxílico, ácido propiônico, ácido 3-hidroxi propiônico, ácido aspártico, ácido glucárico, ácido glutâmico, ácido itacônico, ácido levunílico, 3-hidroxibutirolactona, glicerol, sorbitol, xilitol, arabinitol, e butanodióis, tais como 1,4 butanodiol, 1,3-butanodiol, e 2,3-butanodiol. Além destes compostos, muitos outros tipos de compostos orgânicos incluindo, mas não limitados a, amino ácidos, vitaminas, alcoóis (tais como etanol, n- propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, e alcoóis mais altos), ácidos graxos, ésteres de ácidos graxos, hidrocarbonetos, isoprenóides, turpenos, carotenóides, e aminas, podem também serem produzidos usando estoques de alimentação renováveis. Qualquer tal composto deve ser referido aqui como um "composto desejado". Contudo, para muitos destes compostos desejados, um processo de fermentação comercialmente atraente que usa sacarose como uma fonte de carbono não foi ainda desenvolvido.

[0004] Entre estes compostos orgânicos que podem ser derivados de estoque de alimentação renovável, o ácido succínico merece uma menção especial. Um número de espécies microbiais incluindo Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum e Brevibacteium flavum, Mannhemia succiniproducens, Basfia succiniproducens e Anaerobiospirilum succiniproducens, foram geneticamente manipulados para uso como um biocatalisador na produção de ácido succínico usando estoques de alimentação renováveis. Estes biocatalisadores foram mostrados produzirem ácido succínico em rendimento muito alto e produtividade. Atualmente, a produção de ácido succínico usando estes biocatalisadores é efetuada usando dextrose como a fonte de carbono orgânico.

[0005] Existe uma necessidade de desenvolver processos que usam estoque de alimentação renovável menos custoso de modo a fazer a produção biológica de ácido succínico ser competitiva com produção de ácido succínico de estoques de alimentação petroquímicos usando processos puramente químicos. Esforços são sob o modo de usar fontes de carbono derivadas a partir da hidrólise de materiais celulósicos para produção de ácido succínico usando um biocatalisador. Contudo, as técnicas para produção de estoque de alimentação de materiais celulósicos para fermentação biológica estão longe de perfeitas neste momento. Desse modo, existe uma necessidade imediata de um estoque de alimentação de custo efetivo adequado para produção biológica de ácido succínico. O preço de vários açúcares varia com o tempo e localização geográfica. Em muitas partes do mundo, a sacarose é menos custosa do que a glicose muitas das vezes ou sempre, especialmente em áreas tropicais onde a cama de açúcar abunda.

[0006] Os melaços derivados a partir de processamento de cana de açúcar representam um estoque de alimentação de custo efetivo para qualquer fermentação industrial. O melaço é pouco custoso, prontamente disponível, e abundante. O melaço é rico em sacarose, e existe uma necessidade de se desenvolver biocatalisadores com a capacidade de usar sacarose como a fonte de carbono na produção fermentativa de ácido succínico. Em alguns casos, será preferível usar sacarose purificada na fermentação como uma fonte de carbono, por exemplo, quando o produto de fermentação de interesse deve ser altamente purificado, e onde é de custo mais efetivo remover os compostos sem açúcar a partir dos melaços antes das fermentações. A sacarose purificada na forma de "açúcar em tablete" foi produzida por muitos anos por métodos bem conhecidos, e equivalente de material para estes pode também ser usado como fonte de carbono na presente invenção. Em adição, melaços ou utilização de sacarose por biocatalisadores têm significância industrial mais ampla, visto que melaços ou sacarose podem ser usados para produzir uma ampla variedade de químicos orgânicos, bem como massa de célula total. Desse modo, a presente invenção tem aplicação mais ampla na indústria de fermentação em geral, além da produção fermentativa de ácido succínico. Um meio contendo sacarose pode compreender suco ou melaços derivados de cana de açúcar, beterraba, sorgo doce, ou qualquer outro material de planta contendo sacarose.

[0007] Um mecanismo para o transporte de sacarose e outros açúcares que é frequentemente encontrado na bactéria é baseado no sistema de fosfotransferase (PTS). PTS é composto de proteínas de acoplamento de duas energias, Enzima I e HPr, e várias proteínas de Enzima II específicas de açúcar, ou complexos de proteína, que tipicamente consistem de três domínios de proteína, EIIA, EIIB e EIIC. A organização dos domínios EII difere entre bactérias. EII pode consistir de uma proteína fundida única, ou domínios não fundidos e fundidos diferentes. A translocalização do açúcar específico através da membrana é facilitada pelo domínio de membrana integral. Contudo, é o complexo dos três domínios de enzima ou proteínas, funcionando juntos, que produzem o transporte e fosforilação do substrato de açúcar, resultando em uma reunião intracelular de carboidrato fosforilatado (Neidhardt e Curtiss, 1996).

[0008] Existem mecanismos alternativos para transporte de sacarose bacterial em adição ao PTS. Estas permeases de açúcar independentes de PTS facilitam o acúmulo de sacarose sem modificações químicas. Elas incluem sistemas de symport de cátion solúvel, tal como o ScrT symporter na sacarose operon em Bifidobacerium lactis e o CscB transporter de cepa de E. coli W. Estes sistemas de transporte específicos de sacarose são geralmente agrupados com os genes catabólicos e regulatórios em vários arranjos em bactérias diferentes.

[0009] Existem vários exemplos na literatura que descrevem a clonagem de utilização de genes de sacarose e a instalação de tais genes nos organismos que não continham nativamente referidos genes. Existem exemplos de clonagem e transferência de ambos genes de utilização de sacarose dependentes de PTS e independentes de PTS. Contudo, cada um destes exemplos tem pelo menos uma característica que os tornam indesejáveis para uso em um ajuste comercial. Por exemplo, a manutenção de utilização de genes de sacarose em plasmídeos replicantes (tal como o plasmídeo pScr1 descrito na Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2008/0274526 A1) não é desejável porque os plasmídeos podem ser instáveis (Shukla et al., 2004), ou perdidos durante as muitas gerações de crescimento de grande escala, e eles frequentemente requerem presença de um antibiótico para manutenção. Também, expressão de um gene de um plasmídeo de multicópia pode ser excessiva, conduzindo a perda de energia e materiais, ou inibição de crescimento.

[00010] A utilização de genes de sacarose cscAKB independentes de PTS cromossomais de E. coli EC3132 foi integrada no cromossomo de cepas derivadas de E. coli K-12 (Patente dos Estados Unidos 6.960.455). Mas este operon particular é conhecido por ser relativamente ineficiente em conferir utilização de sacarose, especialmente em baixas concentrações de sacarose, onde o tempo dobrado foi 20 horas (1200 minutos) (Bockmann et al., 1992). Uma comparação de homologia da sequência de DNA da região de operon de cscRAKB de EC3132 com aquele de um utilizador de sacarose eficiente, E. coli ATCC 9637 (Shukla et al., 2004) usando o programa Megalign de software DNASTAR, revelou um índice de similaridade de 98,1. Desse modo, existem muitas diferenças entre os dois csc operons, e estas diferenças são difundidas através de todo o operon. Muitos destes pontos de mutações no EC3132 operon causam mudanças não conservativas nas sequências de proteína, e algumas das mutações estavam em regiões promotoras, de modo que deve ser o caso que o operon de EC3132 é simplesmente defectivo devido a uma ou mais destas mutações. Mutantes espontâneos de crescimento mais rápido com um tempo dobrado em sacarose de abaixo de 50 minutos, podem ser isolados de EC3132, mas quando os cscAKB operons mutados foram instalados em uma cepa K-12, o tempo de dobra em meio de sacarose aumentou de volta a 75 minutos, o mais tardar (Jahreis et al., 2002). Nenhum dos csc operons mutados de EC3132 mudou a sequência de DNA a ser mais provavelmente o operon eficiente de ATCC 9637. Como tal, parece que o operon revelado por Jahreis et al (2002) não é conforme desejável conforme aquele de ATCC 9637.

[00011] Outra abordagem que foi proposta para capacitar a utilização de sacarose é simplesmente projetar uma cepa para invertase secreta (Lee et al., 2010a). Neste caso, a invertase de Mannheimia succiniproducens foi mostrada ser superior à invertase de E. coli W, passando longe do uso do E. coli W invertase. Além disso, nas bactérias, esta abordagem é inerentemente menos eficiente do que importando a sacarose antes de clivá-la, visto que, após clivagem, a glicose e frutose por invertase, duas moléculas de açúcar devem ser importadas sob preferivelmente do que apenas uma, e isto requer mais energia a ser expendida. Além disso, neste exemplo da técnica anterior, durante fermentação iniciando com 20 g/l de sacarose, frutose externa acumulada a acima de 10 g/l, e levando 50 horas para esta frutose externa ser completamente consumida (Lee et al., 2010b). Desse modo, embora uma sacarose utilizando cepa fosse revelada, o sistema tem características de desempenho que não foram comercialmente atraentes. A secreção de frutose por cepas de E. coli crescidas em sacarose é um problema geral, e a frutose que permanece no final de um tempo de fermentação desejável, que é frequentemente 48 horas ou menos, é indesejável. Desse modo, existe uma necessidade de microorganismos que podem fermentar sacarose a um produto desejável a uma titulação comercialmente atraente, que é usualmente mais do que 20 gramas por litro, sem deixar mais do que 2 gramas por litro de frutose permanecendo após um tempo de fermentação de 48 horas ou menos.

[00012] As cepas de E. coli SZ63 e SZ85 foram anteriormente projetadas para produzir D-lactato oticamente puro de açúcares hexose e pentose. Para expandir a faixa de substrato para incluir sacarose, um cscR’AKB operon foi clonado e caracterizado de E. coli KO11, um derivado de E. coli W (Shukla et al., 2004). O operon originado de plasmídeo resultante foi funcionalmente expresso em SZ63, mas foi instável em SZ85.

[00013] A US 6.960.455 revela um método de produção de amino ácidos usando cepas derivadas de E. coli K-12 transduzidas com um cscRAKB operon de cepa EC3132 que está localizada no local de dsdA no cromossomo. Como uma consequência de inserção de cscRKAB operon nesta localização no cromossomo, as cepas resultantes não podem catabolizar D-serina. Conforme apontado acima, os genes csc nesta técnica anterior foram derivados de um EC3132 operon defectivo, que cresce pobremente em baixas concentrações de sacarose (Bockmann et al., 1992; Jahreis et al, 2002). As cepas resultantes contêm o gene cscR, que codifica um repressor, de modo que as cepas são esperadas serem subótimas para utilização de sacarose, especialmente na presença de glicose, que seria esperado causar repressão dos genes cscAKB (Jahreis et al., 2002; Shukla et al., 2004). Os melaços usualmente contêm alguma glicose. Não existe tentativa mencionada para corrigir quaisquer dos defeitos inerentes no csc operon de EC3132 no US 6.960.455. Além disso, a produção de químicos outros do que amino ácidos, tal como succinato, não foram mencionados nesta patente.

[00014] A US 7.179.623 revela uma cepa construída de uma cepa de sacarose não assimilativa no qual a referida cepa abriga genes PTS de sacarose de E. coli VKPM B-7915 (genes scrKYABR), mas novamente, esta patente não menciona produção de químicos outros do que amino ácidos, e o sistema dependente de PTS reivindicado nesta revelação não é ótimo para produção de químicos que são derivados de fosfoenol piruvato (PEP).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00015] Esta presente invenção proporciona biocatalisadores e um método para uso de estoque de alimentação biológico renovável contendo sacarose na produção fermentativa de produtos comercialmente importantes, por exemplo, mas não limitados a, especialidade e comodidade de químicos. Especificamente, a presente invenção é útil na produção fermentativa de ácidos orgânicos usando estoque de alimentação renovável contendo sacarose. Mais especificamente, a presente invenção é útil na produção fermentativa de ácido succínico de um estoque de alimentação renovável contendo sacarose usando biocatalisadores que foram construídos para terem utilização de sacarose aperfeiçoada. Os princípios da presente invenção podem ser aplicados a quaisquer outros compostos químicos desejados que podem ser produzidos por fermentação, particularmente ácido fumárico e ácido málico.

[00016] De acordo com a presente invenção, os genes que codificam para as proteínas envolvidas no transporte e metabolismo de sacarose podem ser introduzidos em uma ampla variedade de biocatalisadores, ou para conferir uma nova capacidade ao biocatalisador para utilizar sacarose como uma fonte de carbono e energia no meio de fermentação, ou para aumentar ou aperfeiçoar uma capacidade já existente dos biocatalisadores para transporte e metabolismo de sacarose.

[00017] Em uma concretização, a presente invenção aperfeiçoa a capacidade de importar e metabolizar sacarose por um biocatalisador que foi anteriormente construído para produzir um químico, tal como ácido succínico, em quantidades comercialmente significantes, no qual referido biocatalisador não tem originalmente a capacidade de usar eficientemente sacarose como a fonte de carbono orgânico para a produção fermentativa de um químico de interesse comercial como ácido succínico. Em um aspecto da presente invenção, a incapacidade ou pobre capacidade do biocatalisador original usar hastes de sacarose a partir da ausência de genes que codificam para o transporte e metabolismo de sacarose. Em outro aspecto, a incapacidade do biocatalisador usar sacarose resulta da consequência não tencionada de manipulações genéticas objetivadas no aperfeiçoamento do rendimento de ácido succínico, e produtividade do meio de fermentação em que a maioria da fonte de carbono orgânico é outra do que sacarose. Em outro aspecto, a incapacidade do biocatalisador usar sacarose resulta de um ou mais defeitos no sistema nativo de utilização de sacarose que torna o sistema incapaz de alcançar utilização de sacarose comercialmente atraente para fermentação usando meio contendo sacarose. A presente invenção proporciona soluções genéticas para superar quaisquer destes aspectos de deficiência genética na utilização de sacarose.

[00018] Em outra concretização, a presente invenção tem por objetivo aumentar a capacidade de utilização de sacarose dos biocatalisadores usados na produção de ácido succínico. A presente invenção aumenta a utilização de sacarose pelo biocatalisador por meio de aperfeiçoamento de toda capacidade de transporte e metabolismo de sacarose através de manipulações genéticas. Em um aspecto da presente invenção, a capacidade de transporte de sacarose já existente do biocatalisador é aperfeiçoada pela introdução de genes que codificam as proteínas envolvidas em um mecanismo dependente de PTS para aceitação de sacarose. Em outro aspecto, a presente invenção proporciona genes adicionais que codificam para as proteínas associadas com um sistema de sacarose permease independente de PTS, tal como um sistema de sacarose permease de cátion synport para aumentar a capacidade de transporte de sacarose já existente do biocatalisador. Em ainda outro aspecto, a presente invenção aumenta a utilização de sacarose por meio de provisão de genes que codificam para o metabolismo da sacarose transportada na célula.

[00019] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um processo para produção de ácido succínico em um meio contendo sacarose que faz uso de um biocatalisador que tem retido um sistema de fosfotransferase dependente de PEP funcional para aceitação de açúcar.

[00020] A utilização de sacarose na produção de ácido succínico pelo biocatalisador envolve a participação de um número de proteínas responsáveis pela conversão de sacarose em três intermediários de carbono que podem entrar no ciclo de ácido tricarboxílico e por último, produzem ácido succínico. Em um aspecto, a presente invenção intensifica geneticamente a atividade de uma ou mais enzimas envolvidas na conversão de sacarose em seis intermediários de carbono que podem ser adicionalmente metabolizados por trajetórias bioquímicas comuns. Em adição aos transportadores de sacarose, os alvos de enzima adequados para manipulação genética são selecionados de uma lista consistindo em sacarose fosforilase, sacarose hidrolase (invertase), sacarose-6-fosfatase hidrolase, glucose quinase (glucoquinase), e frutose quinase (frutoquinase).

[00021] Em outra concretização, a presente invenção proporciona um processo para produção de ácido succínico usando sacarose como um estoque de alimentação renovável. Em um aspecto, a presente invenção proporciona um processo para produção de ácido succínico em um meio contendo sacarose que faz uso de um biocatalisador que tem atividade diminuída no sistema de fosfotransferase dependente de PEP.

[00022] Em um aspecto, a presente invenção revela a adição de genes a um organismo, tal como para instalar ou aumentar a atividade de uma ou mais proteínas e/ou enzimas envolvidas na importação e conversão de sacarose em intermediários metabólicos, tais como frutose 1,6-bisfosfato, que podem ser adicionalmente metabolizados pela célula. Os genes que codificam proteínas relevantes ou enzimas adequadas para manipulação genética desta invenção são um, ou uma combinação de mais do que um genes selecionados de uma lista consistindo em genes que codificam um importador de sacarose dependente de PTS (uma proteína de PTS usualmente denominada Enzima IIscr, ou EIIscr, que funcionam junto com outras proteínas de PTS para acompanhar a importação e fosforilação de sacarose para dar sacarose-6-fosfatase citoplasmática), sacarose-6-fosfato hidrolase, sacarose permease (uma permease independente de PTS que transporta sacarose na célula sem fosforilação concomitante), invertase ou sacarose hidrolase, sacarose fosforilase, glucose quinase (glucoquinase), frutose quinase (frutoquinase), hexose-fosfato isomerase, e fosfofruto quinase (fructose-1-fosfato quinase).

[00023] Em outra concretização, a presente invenção proporciona um processo para produção de ácido succínico, ou outros químicos, usando sacarose como um estoque de alimentação renovável. Em um aspecto, a presente invenção proporciona um processo para produção de ácido succínico em um meio contendo sacarose que faz uso de um biocatalisador que tem uma atividade diminuída em pelo menos uma proteína do sistema de PTS nativo do organismo relativo àquele da cepa ancestral ou parental. Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um processo para produção de ácido succínico, ou outro químico, em um meio contendo sacarose que faz uso de um biocatalisador que tem retido um sistema dependente de PTS totalmente funcional de fosfotransferase para aceitação de açúcar.

[00024] Os novos aspectos desta invenção são que os genes cscABK de um utilizador de sacarose robusto não patogênico foi estavelmente integrado no cromossomo de uma bactéria, tal que a bactéria recentemente construída pode produzir um produto comercial em um processo comercialmente viável. A titulação de produto de sacarose é igual a pelo menos a titulação produzida pelo organismo de origem de glicose, e o rendimento de produto é maior do que 0,8 g/g de açúcar. O cscABK operon é integrado em um local no cromossomo que não interfere com qualquer aspecto relevante de crescimento ou produção de produtos desejados.

[00025] As vantagens adicionais desta invenção tornar-se-ão prontamente aparentes a partir da seguinte descrição.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00026] A FIG. 1. Cinéticas de utilização de produção de sacarose e ácido succínico pela cepa sD14 de E. coli crescida em meio mínimo suplementado com 10% de sacarose (p/p). Para as Figuras 1-5, fermentações foram feitas em fermentadores microaeróbicos pequenos conforme descrito em Jantama et al (2008a), exceto que o volume foi 300 ml, e neutralização foi acompanhada com uma solução contendo 2,4 M de carbonato de potássio e 1,2 M de hidróxido de potássio.

[00027] A FIG. 2. Cinéticas de utilização de sacarose em três experimentos diferentes com concentrações variadas de concentrações iniciais de sacarose. Concentrações iniciais de 100 g/L, 150 g/L e 200 g/L de sacarose foram usadas. A cepa sD14 de E. coli foi usada nestes experimentos.

[00028] A FIG. 3. Cinéticas de mudança na concentração de glicose no meio de crescimento durante a produção fermentativa de ácido succínico. o meio de fermentação continha sacarose como a fonte de carbono orgânico. Concentrações iniciais de 100 g/L, 150 g/L e 200 g/L de sacarose foram usadas. A cepa sD14 de E. coli foi usada neste experimento.

[00029] A FIG. 4. Cinéticas de mudança na concentração de frutose no meio de crescimento durante a produção fermentativa de ácido succínico. O meio de fermentação continha sacarose como a fonte de carbono orgânico. Concentrações iniciais de 100 g/L, 150 g/L e 200 g/L de sacarose foram usadas. A cepa SD14 de E. coli foi usada neste experimento.

[00030] A FIG. 5. Cinéticas de acúmulo de ácido succínico no meio de crescimento. Concentrações iniciais de 100 g/L, 150 g/L e 200 g/L de sacarose foram usadas. A cepa SD14 de E. coli foi usada neste experimento.

[00031] A FIG. 6. Cinéticas de acúmulo de ácido succínico durante crescimento fermentativo de cepa SD14 de E. coli em um bioreator de 7.000 ml New Brunswick com um volume de partida de 3.000 ml e microaeração na taxa de 0,005 litro de ar por minuto.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

[00032] A presente invenção proporciona biocatalisadores para produção de ácido succínico em alta titulação, rendimento e produtividade, usando estoque de alimentação contendo sacarose. A sacarose é um dissacarídeo também conhecido como sacarose,1-O-α- D-glucopiranosil-β-D-frutofuranosida, e α-D-glucopiranosil-1,2-β-D- frutofuranosida. -. O termo "rendimento", conforme definido nesta invenção, se refere ao número de gramas de produto (tal como ácido succíninco) produzido por grama de açúcar (tal como glicose ou sacarose) consumido. O termo "produtividade", conforme definido nesta presente invenção, se refere ao número de gramas de produto (tal como ácido succínico) produzido por litro de cultura por hora. O termo "titulação" é definido como a concentração de produto (tal como ácido succínico) no caldo de fermentação em gramas por litro. O rendimento desejável para ácido succínico está na faixa de 0,7 - 1,2 gramas de ácido succínico produzido por grama de açúcar consumido. A produtividade desejável para ácido succínico nesta presente invenção está na faixa de 1 grama ou mais de ácido succínico produzido por litro por hora.

[00033] Para qualquer dado composto, pode ser mais apropriado produzir um sal de referido composto; desse modo, por exemplo, ácido succínico pode ser produzido em pH próximo a 7 como um sal de sódio, potássio, cálcio, magnésio, amônia, etc., enquanto que lisina pode ser produzida como um sal de cloreto, sulfato, bicarbonato, etc. Como tal, qualquer momento um composto é denominado aqui, qualquer sal de referido composto é significativo para ser incluído, e qualquer momento um sal é denominado, o ácido livre ou base livre é também significativa para ser incluída.

[00034] A taxa de crescimento bacterial é medida em termos da taxa de aumento na densidade ótima a 550 ou 600 nanômetros da cultura líquida resultante da multiplicação bacterial. A taxa de crescimento bacterial é também expressa em termos de tempo requerido para dobramento de células bacteriais. As células bacteriais de E. coli tipo selvagem são reportadas para replicarem uma vez em todo 20 minutos. Nas células bacteriais adequadas para a presente investigação, as células bacteriais são esperadas ter um tempo de dobramento de pelo menos 20 minutos, mas menos do que 20 horas.

[00035] De acordo com a presente invenção, o biocatalisador para produção de ácido succínico pode ser desenvolvido em dois modos diferentes. Sob a primeira abordagem, espécie bacterial tipo selvagem selecionada é geneticamente manipulada para crescer com a sacarose como a única fonte de carbono. É preferível que a cepa bacterial geneticamente manipulada enquanto que adquire a capacidade de crescer bem em um meio contendo sacarose como a única fonte de carbono, ainda retém a capacidade de usar outras fontes de carbono igualmente bem. Uma vez que uma cepa microbial particular com a capacidade de crescer em sacarose como a única fonte de carbono é identificada, manipulações genéticas subsequentes são efetuadas nas trajetórias metabólicas em seguida aos métodos de engenharia genética conhecidos na técnica para obter uma cepa bacterial que pode crescer no meio contendo sacarose, e produz ácido succínico com alto rendimento e produtividade. Por exemplo, os pedidos de patente publicados sob o Tratado de Cooperação de Patente com a publicação No. WO 2010/115067 e Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. US 20100184171 proporcionam os detalhes sobre as técnicas de engenharia genética úteis na geração de uma cepa de E. coli com capacidade de produção aperfeiçoada de ácido succínico. Estes dois pedidos de patente são incorporados aqui por referência.

[00036] Sob a segunda abordagem, uma cepa bacterial já desenvolvida para ter um rendimento comercialmente atraente e produtividade para produção de ácido succínico, conforme descrito na publicação de pedido de patente US 20100184171 e WO 2010/115067, é usada como uma cepa parental. Manipulações genéticas adicionais são efetuadas com esta cepa para obter uma cepa bacterial que tem a capacidade de crescer em um meio contendo sacarose, e produz ácido succínico a uma titulação comercialmente atraente, rendimento e produtividade.

[00037] Mais especificamente, esta presente invenção é focada no desenvolvimento de um biocatalisador que retém a capacidade original de produzir ácido succínico à titulação alta bastante e produtividade, enquanto que ganhando a nova capacidade de crescer em um meio contendo sacarose como uma fonte maior de carbono. Por exemplo, a cepa KJ122 de E. coli descrita por Jantama et al (2008 a, b) pode ser selecionada como a cepa de partida para a presente invenção. A cepa KJ122 de E. coli é reportada para ter a capacidade de produzir ácido succínico em um meio mínimo de glicose a alta titulação e produtividade. O termo "meio mínimo"deve significar um meio que contém somente sais minerais, uma fonte de carbono purificada (tal como glicose ou sacarose) e betaína. Um "meio mínimo" não contém quaisquer componentes ricos ou quimicamente não definidos, tais como peptídeos ou nucleotídeos, tais como são encontrados em extrato de levedura, triptona, peptona, licor acentuado de milho, ou outros hidrolisatos de material biológico complexo. Um meio mínimo pode estar na forma líquida ou sólida, como em placas agar. Um meio mínimo pode ter um ou mais compostos purificados, tais como vitaminas ou amino ácidos, adicionados para satisfazer um requerimento de crescimento específico de uma cepa particular. A cepa KJ122 de E. coli foi derivada da cepa E. coli C através de anulações de gene e evolução metabólica, conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. US 20100184171, e no pedido de patente publicado em 2 de abril de 2010 sob Tratado de Cooperação de Patente com a publicação No. WO 2010/115067 A1. Estes dois documentos de publicação de pedido de patente proporcionando detalhes sobre as mudanças genéticas que conduzem ao desenvolvimento da cepa KJ122 de E. coli são incorporados aqui por referência. KJ122 não tem qualquer capacidade substancial de usar sacarose como uma fonte de carbono na produção de ácido succínico. Esta deficiência na utilização de sacarose notada em KJ122 é atribuível a deficiência genética em sua cepa parental, denominada a cepa E. coli C que é conhecida para ser geneticamente deficiente na utilização de sacarose.

[00038] O termo "utilização de sacarose", conforme usado neste pedido, inclui ambos o transporte da sacarose a partir do meio de crescimento nas células bacteriais e o metabolismo subsequente da sacarose dentro da célula. A capacidade substancial de KJ122 para transportar e metabolizar hastes de sacarose a partir das falta dos genes que codificam para ambos transporte e metabolismo de sacarose. Os inventores descobriram abordagens genéticas que capacitariam o KJ122 a utilizar sacarose como uma fonte de carboidrato, enquanto que sua capacidade original para produzir ácido succínico a alta titulação, rendimento e produtividade.

[00039] O termo "carboidrato", conforme usado nesta invenção, inclui monossacarídeos tais como glicose, frutose, xilose, e arabinose, dissacarídeos, tais como sacarose, melibiose, maltose e lactose, trissacharídeos, tais como rafinose e maltotriose, e oligossacarídeos mais altos, e hidrolisatos derivados a partir da digestão enzimática ou química de polissacarídeos, tais como amido, celulose, e hemicelulose.

[00040] O transporte de sacarose em células bacteriais, e o metabolismo subsequente de sacarose, podem ser mediados por pelo menos quatro mecanismos diferentes, incluindo um sistema de fosfotransferase (PTS) dependente de fosfoenolpiruvato (PEP) e três sistemas independentes de PTS, incluindo um sistema de sacarose permease de symport de cátion. De acordo com a presente invenção, é possível alterar geneticamente, ou qualquer destes transportes de sacarose e sistemas de utilização com um objetivo, ou para conferir uma nova capacidade de utilizar sacarose, ou intensificar a capacidade de utilização de sacarose já existente. O termo "função de utilização de sacarose", conforme usado nesta invenção, se refere a ambas função de aceitação de sacarose e metabolismo de sacarose dentro da célula. O metabolismo de sacarose dentro da célula envolve conversão de sacarose em três compostos de carbono que podem entrar na síntese de compostos orgânicos comercialmente importantes.

[00041] Os termos "organismo de PTS+" ou "bactéria de PTS+" se referem a uma bactéria que tem a capacidade para transporte de sacarose baseado em um PTS. O termo "organismo de não PTS", ou "bactéria de não PTS" se refere a células bacteriais cuja capacidade de aceitação de sacarose é baseada nos mecanismos de transporte outros do que PTS. Similarmente, o termo "transporte de sacarose de não PTS" se refere ao transporte de sacarose através da membrana de célula bacterial usando um mecanismo outro do que PTS dependente de PEP. O termo "organismo de PTS-" significa um organismo que tem uma mutação em um ou mais genes que codificam uma proteína que funciona em PTS, tal que a atividade do PTS é diminuída relativa àquela do PTS tipo selvagem. O termo "sacarose permease", conforme usado na presente invenção, inclui as proteínas envolvidas na aceitação da sacarose a partir do meio na célula. As proteínas envolvidas na aceitação de sacarose podem ser um componente de PTS ou uma proteína não associada com PTS.

[00042] Um tipo de sistema começa pela importação da sacarose na célula por um sistema de fosfotransferase (PTS) que usa fosfoenolpiruvato (PEP) como a fonte de energia e fosfato, e que fosforilata a sacarose no processo de transporte. Nós devemos denominar este tipo de importação de sacarose e sistema de metabolismo um sistema "dependente de PTS", ou mecanismo. Neste primeiro tipo de sistema, existe um componente de proteína que tem afinidade útil ou específica para sacarose. Esta proteína é denominada, entre outros nomes, Enzima IIscr. Enzima IIscr funciona junto com duas outras proteínas que não são específicas para sacarose, denominadas subunidades de PTS comuns. Estas referidas outras proteínas (proteínas comum a mais do que um PTS específico em um organismo particular) incluem proteínas que são denominadas, entre outros nomes, EI e Hpr. Em Escherichia coli (E. coli), os genes que codificam estes componentes de proteína gerais são denominados, entre outros nomes, ptsH e ptsI. Muitas bactérias têm várias proteínas de PTS que são diferentes de Enzima IIscr, que não são específicas para sacarose, mas que são específicas para outros açúcares (tais como glicose, manose, etc.), e que podem funcionar juntos com as subunidades de PTS comuns na importação de referidos açúcares. Os genes e proteínas que constituem um PTS são encontrados em uma ampla variedade de gênero e espécie bacterial. Muitos tais genes e proteínas são homólogos aos encontrados em E. coli, mas alguns são não muito homólogos, se no todo, as suas contrapartes de E. coli. Um exemplo deste primeiro tipo de sistema de transporte de sacarose (dependente de PTS) é o sistema codificado pelo gene de scrKYABR de, por exemplo, bactéria do gênero Klebsiella e o plasmídeo Gram-negativo pUR400 (Reid e Abratt, 2005). Nestes operons, scrK codifica uma frutoquinase, scrY codifica um porin de membrana externa específica de sacarose, scrA codifica uma proteína de transporte de PTS Enzima IIscr, scrB codifica uma sacarose-6-fosfato hidrolase, e scrR ecodifica um repressor.

[00043] Um segundo tipo de sistema de transporte de sacarose não usa diretamente PEP como uma fonte de energia ou doador de fosfato, mas, ao invés, usa próton (ou outro cátion) symport como uma fonte de energia para transportar sacarose na célula sem fosforilação concomitante. Nós devemos chamar este tipo de transporte de sacarose e sistema de metabolismo um sistema "independente do PTS". Um exemplo deste segundo tipo é o sistema codificado pelos genes cscRAKB cromossomais presentes em algumas, mas não todas, as cepas de E. colipróximas do local de dsdA (D-serina deaminase). Exemplos de cepas de E. coli que contêm os genes cscRAKBsão EC3132 (Bockman et al., 1992) e ATCC 9637, também conhecidas como cepa de E. coli W ou a cepa de Waksman (Shukla et al., 2004). Nota-se que existe alguma confusão na literatura como para a identidade da família de cepas descrita em Shukla et al (2004). Na publicação por Shukla et al (2004), a cepa de origem denominada KO11 foi descrita como sendo derivada de ATCC 11303 ou E. coli B, mas na realidade a cepa é derivada de ATCC 9637. Neste tipo de operon, cscA codifica uma invertase, cscB codifica uma sacarose symporter, cscK codifica uma frutoquinase, e cscR codifica um repressor.

[00044] Um terceiro mecanismo para utilização de sacarose, que é também independente de PTS, pode, em alguns casos, usar alguns dos mesmos genes ou tipo de genes como um do outro sistema. Neste mecanismo, invertase (por exemplo, que codifica por cscA) é liberada no meio, ou deliberadamente, ou por lise de célula, onde ela cliva sacarose em glicose e frutose. Os dois monossacarídeos são então importados na célula e fosforilatados pelas rotas normais para estes monossacarídeos. Este tipo de sistema é usado pela levedura Saccharomyces cerevisiae, em que a invertase é codificada por um gene, por exemplo, SUC2, e a invertase é secretada ao periplasma e espaço extracelular. A glicose resultante mais frutose são, então, importadas por difusores facilitados, e os açúcares são, então, submetidos a quinase dentro da célula.

[00045] Um quarto mecanismo para utilização de sacarose, que é também independente de PTS, pode também, em alguns casos, usar alguns dos mesmos genes, ou tipo de gene como um dos outros sistemas. Neste mecanismo, sacarose é importada por, por exemplo, uma permease codificada por cscB, após ela é clivada por fosforólise catalisada por uma sacarose fosforilase. A glicose-1-fosfato citoplásmica resultante e frutose são, em seguida, metabolizadas pelas rotas normais para aqueles metabólitos.

[00046] Um relatório da literatura (Alaeddinoglu e Charles 1979) cita que os genes de utilização de sacarose cromossalmente codificados de E. coli que são integrados próximos ao local de dsdA (presumivelmente cscRAKB) requerem um gene intacto de ptsI de modo a funcionar. Esta declaração contradiz a grande parte do restante da literatura, que cita que os genes de cscRAKB codificam um sistema independente de PTS. Dada esta contradição aparente, é possível que o um dos sistemas que nós definimos como o sistema "independente de PTS" pode, de fato, ter alguma dependência no sistema de PTS.

[00047] Em um aspecto, a presente invenção revela a adição de genes a um organismo de modo a instalar ou aumentar a atividade de uma ou mais proteínas e/ou enzimas envolvidas na importação e conversão de sacarose em intermediários metabólicos, tais como frutose 1,6-bisfosfato que podem ser adicionalmente metabolizados pela célula. Os genes que codificam proteínas relevantes ou enzimas (aqui chamadas uma "função de utilização de sacarose") adequadas para manipulação genética desta invenção são selecionados de uma lista consistindo em genes que codificam um importador de sacarose dependente de PTS (uma proteína de PTS usualmente denominada Enzima IIscr, ou EIIscr que funciona junto com outras proteínas de PTS para acompanhar a importação e fosforilação de sacarose para dar sacarose-6-fosfato citoplásmica), sacarose-6-fosfato hidrolase, frutoquinase, sacarose permease (uma permease independente de PTS que transporta sacarose na célula sem fosforilação concomitante), invertase ou sacarose hidrolase, sacarose fosforilase, glucose quinase (também conhecida como glucoquinase), fructose quinase (também conhecida como frutoquinase), hexose-fosfato isomerase, e fosfofruto quinase (fructose-1-fosfato quinase).

[00048] Em outra concretização, a presente invenção proporciona um processo para produção de ácido succínico ou outros químicos usando sacarose como um estoque de alimentação renovável. Em um aspecto, a presente invenção proporciona um processo para produção de ácido succínico de um meio contendo sacarose que faz uso de um biocatalisador que tem atividade diminuída em pelo menos uma proteína do sistema de PTS nativo do organismo relativo àquela de uma cepa ancestral ou parental. Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um processo para produção de ácido succínico, ou outro químico em um meio contendo sacarose que faz uso de um biocatalisador que tem retido um sistema dependente de PTS nativo totalmente funcional para aceitação de açúcar.

[00049] O PTS foi originalmente descoberto em E. coli e ele é agora conhecido por desempenhar um papel importante em transporte de carboidrato em um vasto número de espécie bacterial. A organização molecular de PTS é muito bem compreendida. Através da espécie bacterial, o PTS é altamente conservado em sua organização básica. A presente invenção proporciona biocatalisadores no qual os componentes de PTS são geneticamente transferidos de uma segunda bactéria doadora para uma primeira bactéria recipiente de modo a capacitar o biocatalisador a usar melhor uma fonte de carboidrato desejada em fermentação. Em particular, a presente invenção proporciona biocatalisadores que podem utilizar estoque de alimentação renovável contendo sacarose na produção fermentativa de produtos tal como ácido succínico. Mais especificamente, a presente invenção proporciona biocatalisadores que podem utilizar sacarose e melaços derivados de processamento de cana de açúcar na produção de ácido succínico através de fermentação biológica. Desde que o trissacarídeo rafinose contém sacarose, todos os aspectos desta invenção que se aplicam a sacarose também se aplicarão a rafinose, considerando-se que um sistema de clivagem de rafinose está presente nos biocatalisadores.

[00050] A composição base de PTS é similar em todas as espécies bacteriais estudadas. Ela contém três componentes maiores, a saber, EI, HPr, e EII. Os componentes EI e HPr estão no citoplasma e são conhecidos como componentes "gerais" AA medida que eles podem operar em conjunto com uma variedade de componentes de EII específicos de carboidrato.

[00051] O componente de EII contém três subcomponentes denominados EIIA, EIIB e EIIC. As proteínas de EIIB e EIIC são membrana ligada e o componente de EIIA está localizado no citoplasma ou o lado citoplásmico de uma proteína de membrana. A enzima EII ou pode formar uma proteína única com três domínios (A, B, e C), ou pode ser dividida em duas a quatro proteínas distintas. EII é carboidrato específico e E. coli é reportado para ter pelo menos 15 complexos de EII diferentes. Desse modo, o componente específico de EII para o transporte de glicose através da membrana é designado como EIIAGlc/EIICBGlc.

[00052] Todos os componentes dos PTS são proteínas na natureza. Os genes que codificam para os vários componentes de PTS foram identificados. O gene ptsI em E. coli codifica para a proteína EI de 63 kDa. A proteína HPr do fosfotransportador contendo histidina de 10 kDa é codificada pelo gene ptsH em E. coli. Proteína EIIAGlc é codificada pelo gene crr (resistente à repressão de resistência à carboidrato). A proteína EIICBGlc é codificada pelo gene ptsG em E. coli.

[00053] O sistema de PTS não é somente responsável pelo transporte de vários carboidratos através da membrana da célula, mas também catalisa a conversão de carboidratos em seus respectivos fosfoésteres durante o transporte. O transporte acoplado e fosforilação de carboidratos por PTS é alcançado pela interação entre componentes de proteína de EI, HPr, e EII.

[00054] Durante glicólise, quatro moles de PEP são produzidos de dois moles de glicose, e metade do PEP é consumida para proporcionar energia para aceitação de glicose. No caso de importação de sacarose, de dois moles de hexose ocorrendo de um mole de sacarose também produz quatro moles de PEP, mas somente um mole de PEP é consumido para o transporte de sacarose, aumentando, desse modo, 1,5 vezes a quantidade de PEP disponível como esqueletos de fonte de carbono para biossíntese dentro da célula quando sacarose é usada como a fonte de carbono. É possível aperfeiçoar adicionalmente o rendimento de ácido succínico e outros químicos pela provisão do E. coli com um sistema de utilização de sacarose independente de PTS que não consome PEP para a importação de sacarose. Esta abordagem é particularmente vantajosa para produção de químicos que são derivados pelo menos em parte de ou através de PEP, tal como succinato, malato, fumarato, lactato, etanol, butanóis, propano dióis, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido acrílico, ácido propiônico, ácido láctico, amino ácidos tais como glutamato, aspartato, metionina, lisina, treonina, e isoleucina, e muitos outros compostos.

[00055] A presente invenção proporciona modos para manipular um PTS e, por sua vez, o padrão de utilização de carboidrato bacterial. Desde que as proteínas EI e HPr funcionam como "componente geral" do sistema de PTS, a inativação de, ou o gene ptsI que codifica para proteína EI, ou o gene ptsH que codifica para a proteína HPr, conduziria a inativação completa de PTS. Existirá substancialmente menos transporte de carboidrato através do sistema de PTS em células bacteriais onde a atividade de ptsH ou ptsI foi diminuída. Quando o PTS é parcialmente ou completamente inativado, a célula bacterial tem que depender do um ou outro sistemas de permease alternativos para transporte de carboidrato. Por outro lado, quando o gene que codifica para um componente de EII particular específico de carboidrato é inativado, somente o transporte daquele carboidrato particular dependente do componente de EII inativado seria bloqueado. Desse modo, a inativação de genes crr ou ptsG bloquearia somente o transporte da glicose através do PTS, e o transporte de outros carboidratos ocorreria normalmente.

[00056] Quando existe transporte ativo de glicose através dos PTS, a EIIGlc permanece não fosforilatada conforme existe um substrato de carboidrato para aceitar seu grupo fosfato. Contudo, quando não existe glicose no meio, a forma fosforilatada de EIIGlc não pode transferir seu grupo fosfato a glicose e, portanto, ela permanece em seu estado fosforilatado. A EIIGlc não fosforilatada media o fenômeno geralmente conhecido como repressão catabólica de carbono (CCR). Sob CCR, quando a glicose está presente no meio de crescimento, o transporte e utilização de outros carboidratos no meio é impedido até que a glicose no meio seja completamente utilizada. A repressão catabólica de carbono resulta de efeito inibitório de EIIGlc não fosforilatada nos sistemas permease. Um número de permeases envolvida no transporte de carboidrato são conhecidos para serem inibidos por EIIGlc não fosforilatada. Em adição, a EIIGlc não fosforilatada é conhecida por ter um efeito negativo na transcrição de número de genes envolvidos no transporte de carboidrato e metabolismo através de sua influência no sistema de adenilato ciclase. Desse modo, sob certas circunstâncias, é vantajoso diminuir a atividade do sistema de PTS específico de glicose de modo a aliviar a célula de repressão catabólica de carbono.

[00057] Na produção fermentativa de ácido succínico, existe uma necessidade para conservar PEP dentro da célula. PEP pode agir como o substrato para enzimas de carboxilação dentro da célula. A carboxilação da PEP produz ácido oxaloacético que entra no ciclo de ácido tricarboxílico e contribui para a produção de ácido succínico. A importância da carboxilação de PEP na produção biológica de ácido succínico é muito bem reconhecida como evidência pelo fato que alguns dos biocatalisadores mais bem sucedidos atualmente em uso para produção de ácido succínico, tal como KJ122, têm um PTS que é pelo menos parcialmente reduzido na atividade, e transporte de carboidrato é pelo menos parcialmente mediado pelo sistema de permease independente de PTS. A redução de atividade de PTS ajuda na conservação do PEP. Em adição, biocatalisadores para produção de ácido succínico, tal como KJ122, têm modificações genéticas que conduzem a um aumento na taxa de carboxilação de PEP (Zhang et al., 2009 a, b). Desse modo, na cepa KJ122 desenvolvida para produção de ácido succínico, o PTS é pelo menos parcialmente inativado por uma mutação no gene ptsI gene. Em adição, o gene pck de carboxiquinase de PEP adquiriu uma mutação causando um aumento na atividade específica para carboxilação de PEP. Enquanto que é vantajoso reduzir a atividade do PTS quando glicose é usada como a fonte de carbono inorgânico na produção fermentativa de ácido succínico, a mesma estratégia pode não ser ótima para desenvolvimento de uma cepa para produção de ácido succínico usando sacarose como a fonte de carbono orgânico primária.

[00058] Em uma concretização, a presente invenção proporciona um processo para reativação do "Componente geral" do sistema de PTS na cepa KJ122 e, ao mesmo tempo, inativando a aceitação de glicose através do sistema de PTS. O gene ptsI mutado em KJ122 é substituído por um gene ptsI tipo selvagem e o gene ptsG é deletado. Estas manipulações genéticas permitem o transporte de carboidratos outros do que glicose através de PTS. Adicionalmente, a eliminação do gene ptsG elimina a repressão catabólica do carbono resultante da proteína de EIIAGlc não fosforilatada. Esta situação é em contraste à situação quando o gene ptsI é mutado. Na célula bacterial com um gene ptsI intacto e deleção de ptsG, a proteína de EIIAGlc é esperada estar em seu estado fosforilatado. Quando a proteína de EIIAGlc está em seu estado fosforilatado, ela não causa quaisquer atos inibitórios em outras permeases na transcrição dos genes envolvidos no metabolismo de carboidrato.

[00059] Quando sacarose é transportada através de um PTS, ela entra na célula na forma fosforilatada como sacarose-6-fosfato. Metabolismo adicional de sacarose-6-fosfato dentro da célula envolve as seguintes reações bioquímicas. Na primeira etapa, sacarose-6-fosfato é hidrolisada através de uma enzima de hidrolização apropriada, tal como sacarose-6-fosfato hidrolase para liberar glicose-6-fosfato e frutose. A glicose-6-fosfato é convertida em frutose-6-fosfato pela ação de enzima isomerase. Nas próximas etapas, frutose-6-fosfato é adicionalmente fosforilatada para formar frutose 1-6 bisfosfato que é, por sua vez, clivada em fosfogliceraldeído e dihidroxiacetona fosfato. Ambos estes três compostos de carbono derivados de frutose-1,6-bisfosfato entrarão no ciclo de ácido carboxílico e proporcionarão o suporte de carbono para produção de ácido succínico.

[00060] A frutose liberada a partir da hidrólise de sacarose-6- fosfato necessita de ser fosforilatada antes de ela entrar na trajetória glicolítica. A fosforilação de frutose é mediada por frutoquinase. Quando não existe frutoquinase endógena, ou quando a atividade de enzima endógena é baixa, é necessário produzir uma fonte adicional de atividade de enzima de frutoquinase por meio de introdução de um gene exógeno que codifica para a atividade de enzima de frutose quinase.

[00061] Esta abordagem de inativação do gene ptsG e transporte de sacarose através de PTS é possível somente naquelas cepas onde existe um componente de EIIA/CB específico de sacarose do PTS. Esta proteína é denominada, entre outros nomes, Enzima IIscr. Quando não existe tal componente de EIIA/CB específico de sacarose endógeno na cepa já desenvolvida para produção de ácido succínico, existe uma necessidade de proporcionar genes exógenos que codificam para componentes específicos de sacarose, que podem funcionar juntos com os "componentes gerais" de PTS já presentes no biocatalisador para produção de ácido succínico.

[00062] Em outra concretização da presente invenção, onde existe uma necessidade de manter o PTS em um estado de atividade reduzida para a proposta de manter uma reunião suficiente de PEP como o substrato para carboxilase e/ou enzima carboxiquinase, o transporte de sacarose pode ser facilitado pelo uso de uma permease de sacarose independente de PTS. Sob a circunstância onde o biocatalisador já desenvolveu para produção de ácido succínico não tem um gene que codifica para permease específica de sacarose de não PTS, é necessário introduzir um gene exógeno que pode mediar transporte de sacarose de não PTS na célula. Um número de cepas bacteriais, tal como cepa de E. coli W, são reportados terem um operon que codifica para proteínas envolvidas no transporte de sacarose de não PTS na célula. Qualquer um daqueles operons de permease sacarose conhecidos de outras cepas bacteriais pode ser introduzido naquelas cepas bacteriais carecendo de capacidade para não PTS de transporte de sacarose. Um exemplo desta aceitação de sacarose de não PTS é codificada pelos genes cromossomal de cscRAKB presentes próximos ao local de dsdA (D-serina deaminase) em algumas, mas não todas, cepas de E. coli. Exemplos de cepas de E. coli que contêm os genes de cscRAKBsão cepa de EC3132 de E. coli e cepa ATCC 9637 de E. coli, também conhecida como cepa de E. coli W ou a cepa de Waksman, Klebsiella pneumoniae, Salmonella ssp., Erwinia amylovora, e muitos outros.

[00063] Certas cepas de E. coli, tal como a cepa W de E. coli (ATCC 9637), são conhecidas por possuírem uma trajetória metabólica e de transporte de sacarose independente de PTS cromosomalmente codificada. Três genes diferentes envolvidos no transporte e metabolismo de sacarose independente de PTS, a saber, cscB, cscA, e cscK, são organizados no DNA cromossomal como um operon. O gene cscB codifica para uma sacarose:H+ symporter. O gene cscA codifica para uma enzima invertase que cliva a sacarose transportada na célula em glicose e frutose. O gene cscK codifica para uma frutoquinase. O operon de csc está sob o controle de uma proteína repressora codificada pelo gene cscR. Em uma concretização específica da presente invenção, os genes cscA, cscB e cscK foram introduzidos em uma produção de succinato e de cepa de KJ122, sem um gene cscR de controle regulatório intacto. Estes três genes, cscABK, podem ser introduzidos na cepa de KJ122 em um plasmídeo auto-replicante ou, preferivelmente, pode ser integrado no cromossomo hospedeiro. Em uma concretização preferida, os três genes, cscABK, são integrados a uma região não essencial do cromossomo hospedeiro (uma região onde inserção dos genes adicionados não têm uma influência significantemente negativa, em qualquer aspecto relevante de crescimento ou produção do produto desejado, tal como succinato em um processo comercial), e os genes adicionados são expressos de um ou mais promotores constitutivos apropriados.

[00064] A titulação de produto de sacarose é igual pelo menos a titulação produzida pelo organismo de origem de glicose, e o rendimento de produto é maior do que 0,8 grama de ácido succínico produzido/grama de sacarose consumida. Os genes exógenos introduzidos na célula podem ser mantidos dentro da célula em um plasmídeo auto-replicante. Um plasmídeo pode ser mantido através de seleção antibiótica ou complementação de uma mutação cromossomal. Preferencialmente, os genes exógenos são integrados no cromossomo hospedeiro de modo que não existe necessidade de adicionar quaisquer antibióticos para manter os plasmídeos dentro da célula. Existem várias localizações possíveis dentro da célula para a integração dos genes exógenos. As localizações preferenciais para integração dos genes exógenos dentro do DNA cromossomal de E. coli incluem regiões com nenhuma função essencial para crescimento e formação de produto sob condições de fermentação comercial.

[00065] EStas permeases de açúcar independentes de PTS facilitam o transporte de sacarose na célula sem quaisquer modificações químicas. O sistema de permease de sacarose independente de PTS inclui sistemas de symport de cátion solúvel, tal como o synporter de ScrT no operon de sacarose em Bifidobacerium lactis e o transportador de CscB de E. coli. Estes sistemas de transporte específico de sacarose são geralmente agrupados com os genes catabólicos e regulatórios em vários arranjos em bactéria diferente.

[00066] Quando os genes exógenos são obtidos como um operon, é preferencial remover quaisquer genes regulatórios negativos possíveis ou proteínas a partir do operon. É ideal ter somente os genes e proteínas que funcionam positivamente no transporte e metabolismo de sacarose. Desse modo, expressão de genes de utilização de sacarose é preferivelmente não inibida por um repressor, ou por repressão catabólica de carbono.

[00067] Quando um sistema de transporte de sacarose de não PTS é usado como o mecanismo de transporte, a sacarose que entra na célula está ainda em uma forma não fosforilatada, e é necessário fosforilatar a sacarose antes dela entrar na trajetória metabólica dentro da célula. A sacarose pode ser fosforilatada usando um sacarose quinase endógena já presente dentro da célula. No evento que não existe sacarose quinase endógena dentro da célula, DNA exógeno que codifica para sacarose quinase pode ser introduzido na célula. Uma vez que a sacarose é fosforilatada, a sacarose-6-fosfato resultante pode ser metabolizada pelas ações das enzimas sacarose-6-fosfato hidrolase, glicose-6- fosfato isomerase, frutoquinase, fofofrutoquinase e frutose 1,6-bisfosfato aldolase, conforme descrito acima. Novamente, se necessário, os genes que codificam estas enzimas podem ser introduzidos no biocatalisador sendo desenvolvido. Como uma alternativa, após a sacarose entrar na célula, ela pode ser clivada em glicose e frutose por uma invertase. A glicose e frutose resultantes podem entrar no metabolismo por ações das enzimas glucoquinase e frutoquinase, respectivamente.

[00068] A fosforilação de sacarose pode também ser acompanhada por (sacarose fosforilase (SPase). A sacarose fosforilase catalisa a conversão de sacarose (α-D-glucopiranosil-1,2-β-D-frutofuranoside) e fosfato em D-frutose e α-G-1-P (α-D-glicose 1-fosfato). Esta reação de fosforólise acompanha duas etapas requeridas para os carbonos de sacarose entrarem no metabolismo central, 1) a clivagem do dissacarídeo em dois monossacarídeos, e 2) a fosforilação de pelo menos um dos monossacarídeos. Outro benefício desta fosforólise é que ela não consome um ATP para a fosforilação como a reação de glucoquinase. Ao invés, a energia para formação da ligação de fosfato é derivada da energia liberada por hidrólise. Como tal, um aperfeiçoamento na eficiência de utilização de sacarose pode ser realizado por introdução, por exemplo, além de genes de cscAKB de cepa de E. coli W, de um gene que codifica uma sacarose fosforilase em uma célula bacterial com nenhuma capacidade para utilização de sacarose. Alternativamente, o gene de invertase, cscA, pode ser substituído com um gene que codifica sacarose fosforilase. Várias sacaroses fosforilases foram descritas (Goedl et al., 2007). Qualquer tal gene que codifica uma sacarose fosforilase pode ser clonado e expresso em uma cepa de recipiente por métodos bem conhecidos na técnica. Em uma concretização preferida, um cassete de expressão que inclui um gene de sacarose fosforilase é integrado no cromossomo de uma cepa recipiente.

[00069] Os sistemas de permease dependente de PTS e independente de PTS para transporte de sacarose não são mutuamente exclusivos entre si. É possível ter um PTS funcionalmente ativo junto com um sistema de permease independente de PTS funcionalmente ativo para transporte de sacarose de uma célula bacterial única.

[00070] De acordo com a presente invenção, é revelado transferir geneticamente um ou mais transportes de sacarose e sistemas de utilização de um ou mais organismos doadores que contêm naturalmente os genes relevantes (por exemplo, scrKYABR, cscRAKB, scrP, spl, ou uma combinação, ou um subconjunto destes) em um organismo recipiente que não contêm naturalmente referidos genes relevantes, de modo a conferir no referido organismo recipiente uma nova capacidade de utilizar sacarose ou intensificar uma capacidade de utilização de sacarose já existente. ScrP e Splsão genes que codificam uma sacarose fosforilase. Exemplos de referidos organismos recipientes que não contêm naturalmente transporte de sacarose relevante e genes de utilização incluem, mas não são limitados a, cepas de E. coli K-12 (tais como EMG2, MG1655, W3110, W3350, C600, e DH5α), que é o antecedente de cepa para a vasta maioria de trabalho de engenharia genética feito em E. coli, ATCC 8739 (E. coli C), ATCC 11303 (E. coli B), BL21 (ver New England Biolabs catalog, 2007-2008) e derivados destas cepas. Outros exemplos de referidos organismos recipientes incluem uma ampla variedade de outra bactéria e archea que não têm uma capacidade nativa para utilizar sacarose, ou que utiliza sacarose pobremente. A única limitação é que o organismo recipiente deve ser capaz de ser geneticamente alterado (por engenharia genética, união, transdução, transformação, etc.), tal que a utilização de genes de sacarose da invenção pode ser instalada na cepa recipiente. O organismo recipiente pode também ser de um tipo que já foi construído, selecionado, peneirado, gerado, ou, de outro modo, alterado, tal que ele já pode produzir um químico de interesse. Um exemplo deste tipo de cepa recipiente é KJ122 (Jantama et al., 2008 a, b), e um exemplo de um químico de interesse é ácido succínico.

[00071] Outros exemplos de organismos recipientes incluem, mas não são limitados a: Gluconobacter oxydans, Gluconobacter asaii, Achromobacter delmarvae, Achromobacter viscosus, Achromobacter lacticum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Alcaligenes faecalis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter tumescens, Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter oxydans, Aureobacterium saperdae, Azotobacter indicus, Brevibacterium ammoniagenes, divaricatum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium globosum, Brevibacterium fuscum, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium helcolum, Brevibacterium pusillum, Brevibacterium testaceum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium immariophilium, Brevibacterium linens, Brevibacterium protopharmiae, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Enterobacter aerogenes, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Erwinia herbicola, Erwinia chrysanthemi, Flavobacterium peregrinum, Flavobacterium fucatum, Flavobacterium aurantinum, Flavobacterium rhenanum, Flavobacterium sewanense, Flavobacterium breve, Flavobacterium meningosepticum, Micrococcus sp. CCM825, Morganella morganii, Nocardia opaca, Nocardia rugosa, Planococcus eucinatus, Proteus rettgeri, Propionibacterium shermanii, Pseudomonas synxantha, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas acidovolans, Pseudomonas mucidolens, Pseudomonas testosteroni, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus sp. ATCC 15592, Rhodococcus sp. ATCC 19070, Sporosarcina ureae, Staphylococcus aureus, Vibrio metschnikovii, Vibrio tyrogenes, Actinomadura madurae, Actinomyces violaceochromogenes, Kitasatosporia parulosa, Streptomyces coelicolor, Streptomyces flavelus, Streptomyces griseolus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivaceus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces virginiae, Streptomyces antibioticus, Streptomyces cacaoi, Streptomyces lavendulae, Streptomyces viridochromogenes, Aeromonas salmonicida, Bacillus pumilus, Bacillus circulans, Bacillus thiaminolyticus, Escherichia freundii, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Salmonella schottmulleri, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amylolliquefaciens e Xanthomonas citri.

[00072] A presente invenção será explanada em detalhe abaixo. A bactéria pertencente ao gênero Escherichia da presente invenção é uma cepa que é construída de uma sacarose não assimilativa Escherichia coli como uma cepa parental, e que, após construção, abriga genes de sacarose, preferivelmente genes independentes de PTS de sacarose, e têm a capacidade de produzir ácido succínico.

[00073] OS materiais genéticos que conferem capacidade de utilização de sacarose a uma cepa bacterial recipiente podem ser obtidos de um número de cepas bacteriais doadoras. Dependendo da cepa bacterial doadora que serve como a fonte de material genético para conferir capacidade de utilização de sacarose, a cepa recipiente adquire, ou a capacidade de utilização de sacarose dependente de PTS, ou uma capacidade de utilização de sacarose independente de PTS.

[00074] Clostridium acetobutyllicum ATCC 824 e Clostridium beijerinickii são conhecidos por transportar sacarose através de um PTS. O operon para transporte e metabolismo de sacarose em cada um destes organismos é reportado para codificar para três proteínas funcionais e uma proteína regulatória. Desse modo, em Clostridium acetobutylicum, o operon de transporte e metabolismo de sacarose contém os genes scrA, scrB, scrK e scrT que codificam Enzima II do PTS, sacarose-6-fosfato hidrolase, frutoquinase, e uma proteína regulatória antiterminadora, respectivamente. No caso de Clostridium beijerinickii, o operon de transporte e metabolismo de sacarose contém os genes scrA, scrB, scrK e scrR que codificam Enzima II do PTS, sacarose-6-fosfato hidrolase, frutoquinase, e uma proteína regulatória, respectivamente. Quando é requerido converter uma cepa bacterial incapaz de utilização de sacarose em uma cepa de utilização de sacarose, somente os genes scrA, scrB e scrK obtidos de uma ou mais das espécies Clostridial são introduzidos na cepa negativa de sacarose-PTS. Todos estes três genes podem ser derivados de uma espécie de Clostridium única. Alternadamente, um ou dois genes podem ser derivados de uma espécie, e o restante dos genes pode ser derivado de outras espécies.

[00075] Staphylococcus xylosus pode ser uma fonte para um gene scrA que codifica para uma proteína de PTS específica de sacarose, e um gene scrB que codifica para sacarose fosfato hidrolase.

[00076] Mannheimia succiniproducens é outra fonte para um gene que codifica para proteína de PTS específica de sacarose. O gene MS0784 de M. succiniproducens tem recentemente sido mostrado para codificar para uma proteína com função de PTS específica de sacarose. O gene MS0909 tem recentemente sido mostrado para codificar para uma proteína com atividade de sacarose 6-fosfato hidrolase. Corynebacterium glutamicum é ainda outra fonte de genes útil na presente invenção. O gene de PTS de sacarose que codifica para sacarose EIIBCA proteína, bem como que sacarose-6-fosfato hidrolase pode ser obtida a partir do operon de PTS de sacarose de C. glutamicum. O operon de PTS de frutose de C. glutamicum pode ser usado como a fonte de um gene frutose-1-fosfato quinase. Ambos Corynebacterium glutamicum e Mannheimia succiniproducens carecem de gene de frutoquinase, e a frutose liberada a partir da hidrólise de sacarose-6-fosfato é liberada no meio, e retirada através da PTS de frutose. Um modo para aperfeiçoar a utilização de sacarose naquelas cepas carecendo de atividade de enzima de frutose quinase é introduzir um gene exógeno que codifica para enzima de frutose quinase.

[00077] Outras fontes de genes de utilização de sacarose e proteínas são conforme seguem: A proteína de PTS específica de sacarose ScrA pode ser derivada de Erwinia chrysanthemi 3937. Similarmente, Bacillus subtilis pode ser fonte para proteína de PTS específica de sacarose SacP. B. subtilis gene sacP codifica para proteína EIIBCscr presumivelmente funcionando com EIIAglu para transportar sacarose. O gene sacA codifica para sacarose-6-fosfato hidrolase que hidrolisa a sacarose-6-fosfato intracelular.

[00078] No operon de scrARBK de espécie Clostridium, scrA codifica para domínio de EIIBCscr da PTS de sacarose, que é provavelmente complementado pela proteína de EIIAglu. scrB codifica para sacarose hidrolase e scrK codifica para frutoquinase. No Staphylococcus xylosus, scrA é separado de scrB e scrK. O gene scrA codifica para EIIBCscr. O gene scrB codifica para sacarose hidrolase e scrK codifica para frutoquinase. Na bactéria de ácido láctico gram-positiva Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, e Streptococcus mutans, scrA codifica para uma proteína de PTS de sacarose. scrB codifica para sacarose-6-P hidrolase. scrK codifica para frutoquinase. Na bactéria entérica espécie Salmonella, o plasmídeo conjugativo e transposon conjugativo têm um operon de scrKYABR. scrK codifica para frutoquinase, scrY codifica para um porin de membranma externa, scrA codifica para proteína de transporte de EIIscr, e scrB codifica para uma sacarose-6-p hidrolase. Erwinia amylovora tem o mesmo agrupamento de gene de scrKYABR como em Klebsiella pneumonia e pUR400. Vibrio alginolyticus tem o operon de scrRAKB. O gene scrA codifica uma proteína de EIIBCscr que é complementada pela subunidade de E. coli EIIAglu e scrB codifica para sacarose hidrolase.

[00079] E. coli tipo selvagem que isola EC3132 pode usar sacarose, enquanto que a cepa de E. coli K12 pode não utilizar sacarose. Os genes de não PTS envolvidos na utilização de sacarose e metabolismo, a saber, cscB, cscK, cscA e cscR, estão cromossomalmente situados em EC3132. Estes genes cscB, cscK, cscA e cscR de cepa de E. coli EC3132 podem ser introduzidos na cepa de E. coli K12 para conferir capacidade de utilização de sacarose para cepa de E. coli K12.

[00080] O gene de sacarose fosforilase pode ser obtido de Bifidobacterium longum, Leuconostoc mesenteroides (por exemplo, cepa DSM 20193), Pseudobutyrivibrio ruminis, ou Bifidobacterium lactis DNA. O gene scrP de B. lactis e gene spl de B. longum codifica para sacarose fosforilase.

[00081] B. longum pode ser uma fonte para genes permease, fosforilase e frutoquinase. Em B. longum, os genes de permease (scrT) e fosforilase (scrP) ocorrem em um operon junto com um gene que codifica para um regulador transcricional (scrR). Também presente em B. longum é um gene de frutoquinase (frk) que é induzível pela frutose, e é submetido a repressão mediada por glicose. Por meio de uso de conjuntos de prímer, as estruturas de leitura aberta destes genes podem ser obtidas e expressas no biocatalisador usando promotores apropriados.

[00082] Os genes que codificam para glucoquinase e frutoquinase podem ser obtidos de Zymomonas mobilis. Uma glucoquinase com ampla especificidade de hexose pode ser obtida de Bacillus sphaericus C3-41. A glucoquinase desta espécie bacterial foi mostrada fosforilatar frutose e manose também. E. coli glk codificado por glucoquinase genômico sozinho ou em combinação com plasmídeo, Zymomonas mobilis glk codificado por glucoquinase também catalisa a fosforilação de glicose. Além da cópia do glk já presente no DNA genômico de E. coli, cópias adicionais do gene glk são proporcionadas em um de plasmídeo de cópia baixa sob o controle de certos promotores constitutivos, ou integrados no cromossomo.

[00083] Os genes exógenos introduzidos na célula podem ser mantidos dentro da célula em um plasmídeo auto-replicante. Um plasmídeo pode ser mantido através de seleção antibiótica, ou complementação de uma mutação cromossomal. Contudo, quando os genes exógenos são mantidos dentro do biocatalisador em um plasmídeo auto-replicante dentro da célula, é necessário assegurar que não existe perda desnecessária de energia e materiais que conduzem a inibição de crescimento, e uma diminuição no rendimento ou produtividade do material orgânico sendo manufaturado usando o biocatalisador. Preferencialmente, os genes exógenos são integrados no cromossomo hospedeiro de modo que não existe necessidade de adicionar quaisquer antibióticos para manter os plasmídeos dentro da célula. Existem várias localizações possíveis dentro da célula para a integração dos genes exógenos. As localizações preferenciais para integração dos genes exógenos dentro do DNA cromossomal de E. coli incluem regiões com funções não essenciais para crescimento e formação de produto sob condições de fermentação comercial.

[00084] Quando os genes exógenos são obtidos como um operon, é preferível remover quaisquer genes regulatórios negativos possíveis ou proteínas a partir do operon. É ideal ter somente os genes e proteínas que funcionam positivamente em transporte e metabolismo de sacarose. Desse modo, expressão de utilização de genes de sacarose é preferivelmente não inibida por um repressor, ou por repressão de catabólico de carbono.

[00085] Os genes necessários para utilização de sacarose podem ser derivados de dois organismos doadores separados. Por exemplo, o gene scrK para frutoquinase pode ser derivado de K. pneuomoniae, e os genes cscsA e cscB podem ser derivados de cepa W E. coli, e os três genes podem ser combinados em uma cepa recipiente. Como outro exemplo, um gene que codifica sacarose fosforilase de Leuconostoc meseteroides pode ser instalado junto com os genes cscB e cscK de cepa W E. coli, ou com ou sem o gene cscA.

[00086] Qualquer bactéria que é sacarose não assimilativa e tem a capacidade de produzir ácido succínico pode ser aperfeiçoada de acordo com a presente invenção.

[00087] A bactéria da presente invenção pode ser obtida por introdução de genes que utilizam sacarose por um sistema de utilização de sacarose dependente de PTS, ou um sistema de utilização de sacarose independente de PTS, em uma cepa de produção de ácido succínico, tal como KJ122. Alternativamente, a bactéria da presente invenção pode ser obtida por conferência de uma capacidade de produzir ácido succínico a uma bactéria em que um sistema de utilização de sacarose dependente de PTS, ou um sistema de utilização de sacarose independente de PTS, já está presente. Esta última alternativa pode ser acompanhada, por exemplo, pelas seguintes todas as etapas usadas para construção de KJ122 (revelado em Janatama et al., 2008), mas partindo com cepa ATCC 9637, ao invés de começando com cepa ATCC 8739.

[00088] A fonte de um sistema de utilização de sacarose dependente de PTS, ou um sistema de utilização de sacarose independente de PTS, não é particularmente limitada considerando- se que os genes relevantes podem funcionar ou serem feitas funcionar na célula bacterial de interesse.

[00089] OS seguintes exemplos são providos como um modo de ilustrar a presente invenção, e não como uma limitação.

Exemplo 1

[00090] Construção de SD14, um derivado de KJ122 que contém o agrupamento de gene cscBKA de E. coli W.

[00091] O agrupamento de gene cscBKA que codifica genes para aceitação de utilização de sacarose e utilização, foi amplificado a partir do DNA genômico da cepa W de Escherichia coli (ATCC 9637) usando reação de cadeia polimerase. Os prímeres de PCR foram designados de tal modo que o produto de PCR resultante continha somente os genes cscB, cscK, e cscA a partir do operon csc original na cepa W, e não um gene cscR funcional que codifica para um repressor proteína. Em adição, as sequências homólogas ao operon de csc, os prímeres para amplificação de PCR incluíam na extremidade 5’ 50 bases (bp) de sequências que são homólogas ao local para integração nos cromossomos de E. coli KJ122. As sequências dos prímeres de PCR usadas neste exemplo são listadas na Tabela 1. O local alvo para integração é 291 bp a montante do gene rrnC. Este local não codifica para quaisquer genes conhecidos minimizando, desse modo, a possibilidade de rompimento de uma função genética importante de E. coli.

[00092] O produto de PCR obtido pelo uso de prímeres SD032 e SD033 e DNA cromossomal de ATCC 9673 como gabarito foi purificado usando Kits de Purificação de PCR Qiagen QIAquick, conforme instruído pelo fabricante. Os fragmentos purificados foram, em seguida, transformados em plasmídeo auxiliador de pKD46 contendo KJ122, de acordo com o método descrito por Datsenko e Wanner. (Datsenko e Warner 2000). pKD46 é disponível de Coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, CT. A seleção foi para crescimento em placas mínimas de sacarose. As cepas resultantes foram testadas para integração correta dos genes csc no local alvo pretendido a montante de rrnC por PCR de diagnóstico usando prímeres SD033 através de SD036 em várias combinações apropriadas. As cepas corretas crescem bem em meio mínimo de sacarose, e dão colônias vermelhas em placas de sacarose MacConkey. Para todo o meio de cultura, sacarose foi ultrapura (por exemplo, Sigma número do catálogo S 7903). Soluções de estoque de sacarose foram produzidas 50% (peso/volume) em água deionizada, e esterilizadas por filtração através de unidades de filtro de membrana de nylon de 0,2 mícron Nalgene disponível. Um isolado particular denominado SD14 foi usado para operação adicional.

[00093] Em um modo similar àquele descrito acima, qualquer sequência de DNA que codifica utilização de genes de sacarose (ou independente de PTS ou dependente de PTS, por exemplo, um operon de scrKYBA de Klebsiella pneumoniae ou pUR400) pode ser amplificado por PCR, e integrado no cromossomo de uma cepa recipiente no mesmo alvo descrito acima, ou em qualquer outro alvo adequado. Por exemplo, pelo uso de prímeres SD038 e SD039, o operon de cscBAK de E. coli W pode ser integrado imediatamente a montante do gene dnaA em KJ122.

[00094] AS Figuras 1 - 5 proporcionam os resultados dos experimentos feitos com cepa SD14 em fermentadores microaeróbicos de pequena escala. A Figura 1 proporciona os dados nas cinéticas de utilização de sacarose, e cinéticas para o acúmulo de glicose, frutose, e ácido succínico. Também mostradas na Figura 1 são as cinéticas de crescimento bacterial. As Figuras 2 - 5 mostram as cinéticas de utilização de sacarose, cinéticas de acúmulo de glicose, cinéticas de acúmulo de frutose, e cinéticas de acúmulo de ácido succínico, respectivamente. Nos experimentos descritos nas Figuras 2 - 5, três concentrações diferentes de sacarose (100 g/L, 150 g/L e 200 g/L) foram usadas.

Exemplo 2

[00095] Análise de crescimento e utilização de sacarose na cepa recombinante SD14 em um fermentador de 7 litros.

[00096] A cepa SD14 foi crescida em meio mínimo suplementado com 10% de sacarose. Uma solução de estoque contendo ambos hidróxido de amônia e bicarbonato de amônia (7 N de NH4OH e 3M de NH4HCO3) foi usada para neutralizar ácido succínico produzido nos fermentadores a 39oC. O volume de partida de 3 litros continha fosfato de potássio monobásico (18 mM), sulfato de magnésio (2 mM), betaína (1,33 mM), elementos de traço (Jantama et al., 2008a, b), Antiespuma 204 (8 ppm) e sacarose em, batelada a 98 g/l. O pH foi ajustado inicialmente a pH 7,0 e, em seguida, foi mantido a pH 6,5 por adição da solução de hidróxido de amônia/bicarbonato de amônia descrita acima. Ar foi distribuído a 5 ml/minuto. O inóculo de 150 ml foi crescido aerobicamente e continha um meio mínimo com 2% de sacarose e suplementado com 0,1 mM de cloreto de cálcio.

[00097] Para comparação, KJ122 foi fermentado no mesmo meio com a mesma solução de neutralização, exceto que a fonte de carbono foi glicose, que foi loteada a 25 g/l e, em seguida, distribuída em modo de batelada alimentada de uma concentração de 220 g/l. Açúcares, succinato, e subprodutos foram ensaiados por HPLC, conforme descrito (Zhang et al., 2009 a,b; Jantama et al., 2008 a, b).

[00098] Os resultados são comparados a uma operação de batelada alimentada típica da cepa de origem KJ122 crescida em glicose na Tabela 2. As cinéticas de utilização de sacarose, acúmulo de glicose, acúmulo de frutose e produção de succinato durante a fermentação com SD14 é mostrada na Figura 6. Sacarose foi completamente consumida por 50 horas, e a concentração de ácido succínico no meio alcançou um valor de 83,08 gramas por litro de caldo de fermentação a 50 horas. Concentrações de glicose e frutose no meio alcançou seu pico ao redor de 25 horas.

Exemplo 3

[00099] Clonagem e expressão de uma sacarose fosforilase em SD14

[000100] O gene sacarose fosforilase de Leuconostoc mesenteroides cepa DSM 20193 (Goedl et al., 2007) é clonado por amplificação de PCR usando prímeres BY107 e BY108 (ver Tabela 1) e DNA genômico como um gabarito. O produto de PCR resultante 1594 bp é purificado em uma coluna de purificação de PCR Quiagen QIAquick, clivado com enzimas de restrição de XbaI e BamHI (New England Biolabs), e purificado por eletroforese de gel de agarose. O fragmento resultante é ligado em XbaI ao suporte de BamHI de pOM324 (Pedido de Patente dos Estados Unidos 2009/0311756) para dar plasmídeo pRY801, que coloca as placas do gene de sacarose fosforilase sob o controle de um promotor constitutivo forte. O cassete de terminador de gene de fosforilase promotor de sacarose é excisado de pRY801 pelo corte com XhoI e BamHI, e as extremidades colantes do cassete resultante são feitas atenuadas com o Kit Quick Blunting (New England Biolabs), e o fragmento atenuado é ligado em pMH17F (SEQ ID NO. 13) que cortado com BsrBI e tratado com fosfatase de intestino de bezerro (New England Biolabs), para dar plasmídeo pRY802F (SEQ ID 14). Em pRY802F, o cassete de expressão de sacarose fosforilase é flanqueado em cada extremidade com cerca de 500 bp de sequência de DNA que é homóloga a uma sequência imediatamente a jusante do gene thrV de cepa SD14. O cassete e sequência circundante são amplificados por PCR usando pRY802F como gabarito e prímeres BY83 e BY84 (ver Tabela 1). O fragmento resultante de 2,7 kilobases é purificado em uma coluna de purificação de PCR Qiagen QIAquick. Este fragmento é, em seguida, instalado em SD14 em seguida ao local de thrV pelo método de substituição de gene de duas etapas de Jantama et al (2008 a, b), usando um cat-sacB cassete contra-selecionável e selecionável com as mesmas sequências de flanqueamento homólogas à região thrV para a primeira etapa. Para a primeira etapa, o cat-sacB cassete é obtido como um fragmento Eco ICRI atenuado de pCA2, e ligado em BsrBI clivado, e tratado com fosfatase de intestino de bezerro, pMH17F, conforme descrito acima, para dar plasmídeo pRY803F (SEQ ID NO 15). O cat- sacB cassete com sequências circundantes homólogas à região thrV é amplificado por PCR usando prímeres BY83 e BY84. O produto de DNA resultante de 4 kb linear é usado para transformar SD14 em resistência á cloranfenicol para dar cepa de RY863. Na segunda etapa, o produto de DNA de 2,7 kb linear descrito acima (que contém o cassete de expressão de sacarose fosforilase de pRY802F) é usado para transformar RY863 a resistência á sacarose (Jantama et al., 2008 a, b) para dar cepa de RY864. A cepa correta é verificada usando PCR de diagnóstico com DNA cromossomal como gabarito e BY83 e BY84 como prímeres. A cepa resultante, RY864, tem o cassete de sacarose fosforilase integrado próximo ao thrV, e expressa um nível significante de sacarose fosforilase, que aperfeiçoa a eficiência de utilização de sacarose por economia de um ATP por mole de sacarose clivada. Referências

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Claims

1. Bactéria Escherichia coli geneticamente alterada, caracterizada pelo fato de que que produz pelo menos 20 gramas por litro de um químico orgânico selecionado do grupo consistindo em ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, e 1,4-butanodiol, em um meio mínimo, em que a bactéria compreende genes exógenos que codificam uma função de utilização de sacarose que consiste em um sacarose:H+ simporte codificado pelo gene cscB, uma invertase codificada pelo gene cscA e uma frutoquinase codificada pelo gene cscK.

2. Bactéria Escherichia coli geneticamente alterada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os referidos genes exógenos que codificam uma função de utilização de sacarose estão contidos em um plasmídeo replicante.

3. Bactéria Escherichia coli geneticamente alterada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é uma cepa bacteriana sistema de FOSFOTRANSFERASE +.

4. Bactéria Escherichia coli geneticamente alterada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é uma cepa bacteriana sistema de FOSFOTRANSFERASE -.

5. Bactéria Escherichia coli geneticamente alterada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os referidos genes exógenos que codificam uma função de utilização de sacarose são integrados no cromossomo da bactéria Escherichia coli.

6. Bactéria Escherichia coli geneticamente alterada, caracterizada pelo fato de que que produz pelo menos 20 gramas por litro de ácido succínico em um meio mínimo, em que a referida bactéria compreende genes exógenos que codificam uma função de utilização de sacarose que consiste em um sacarose:H+ simporte codificado pelo gene cscB, uma invertase codificada pelo gene cscA e uma frutoquinase codificada pelo gene cscK, diferente do componente específico de sacarose de um PTS.

7. Bactéria Escherichia coli geneticamente alterada de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que os referidos genes exógenos que codificam uma função de utilização de sacarose estão contidos em um plasmídeo replicante.

8. Bactéria Escherichia coli geneticamente alterada de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que os referidos genes exógenos que codificam uma função de utilização de sacarose estão integrados no cromossomo hospedeiro da bactéria Escherichia coli.

9. Bactéria Escherichia coli geneticamente alterada de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que é uma cepa bacteriana sistema de FOSFOTRANSFERASE +.

10. Bactéria Escherichia coli geneticamente alterada de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que é uma cepa bacteriana sistema de FOSFOTRANSFERASE -.