BR112013009255B1

BR112013009255B1 - composição sólida de vacina oral de dissolução rápida

Info

Publication number: BR112013009255B1
Application number: BR112013009255-6A
Authority: BR
Inventors: Wei Tian; Rosie McLaughlin
Original assignee: R.P. Scherer Technologies, Llc
Priority date: 2010-10-08
Filing date: 2011-10-11
Publication date: 2021-02-23
Also published as: MX2013003875A; AU2011312107A1; JP6403738B2; CA2813146A1; US9956169B2; CA2813146C; EP3095441A1; JP2013539766A; ES2842290T3; MX347101B; JP6061859B2; EP2624815B8; PL3095441T3; PT3095441T; US20120087944A1; RU2017137357A3; AU2011312107B2; CN108434089A; HUE052853T2; EP2624815B1

Abstract

FORMA DE DOSAGEM ORAL DE DISSOLUÇÃO RÁPIDA DE VACINA QUE USA AMIDO. É preparada uma forma de dosagem de dissolução rápida (FDDF) para a liberação de uma vacina, usando uma formulação que contenha um amido, opcionalmente, junto com pelo menos um agente formador de matriz adicional, preferivelmente uma combinação de gelatina e manitol, em que uma resposta imune seja induzida em um paciente necessitado.

Description

[001]O presente pedido reivindica o benefício do Pedido dePatente Provisória Norte-americana No. 61/391.238, depositado em 8 de outubro de 2010, cuja descrição completa está incorporada aqui por referência.

CAMPO TÉCNICO

[002]A presente invenção refere-se a uma forma de dosagem dedissolução rápida (FDDF) que compreende amido como um agente que forma matriz que potencializa a resposta imune para a liberação de uma vacina. Mais especificamente, a invenção refere-se a uma FDDF que contém amido e, opcionalmente, manitol e gelatina como agentes formadores de matriz adicionais para a liberação de uma vacina oral para estimular a imunidade para infecção causada por bactérias, vírus tais como influenza, outros microrganismos ou parasitas tais como protozoários ou vermes.

ANTECEDENTES

[003]Uma grande variedade de formas de dosagem para ingestão oral é conhecida e prontamente disponível no campo médico. A mais comum dessas é o comprimido. As principais limitações dos comprimidos farmacêuticos incluem a pouca complacência do paciente devido à dificuldade de deglutição e falta de biodisponibilidade do ativo através da dissolução ineficaz do comprimido.

[004]As formas de dosagem de dissolução rápida (FDDFs) são convenientes para usar e são geralmente usadas para abordar as questões de complacência do paciente. Existem várias formas de FDDFs, por exemplo, comprimidos "frouxamente" compactados que compreendem uma grande quantidade de agentes de absorção/desintegração, comprimidos que compreendem uma grande quantidade de agentes efervescentes e comprimidos liofilizados. As formas de dosagem mais comuns, liofilizadas, de dissolução rápida que são designadas para liberar o ingrediente ativo na cavidade oral, são formuladas usando matrizes rapidamente solúveis baseadas em gelatina. Essas formas de dosagem são bem conhecidas e podem ser usadas para liberar uma ampla faixa de fármacos. As formas de dosagem que dissolvem mais rapidamente utilizam gelatina e manitol como veículos ou agentes formadores de matriz. (Seagae, H., "DrugDelivery Products and Zydis Fast Dissolving Dosage Form", J. Pharm. Pharmaco, vol. 50, p.375-382 (1998)).

[005]FDDFs fabricadas pelo processo de liofilização tal como a forma de dosagem Zydis® são geralmente preferidas. Elas possuem as vantagens distintas de um tempo de desintegração mais rápido (isto é, menos do que 5 segundos, em oposição a 1 minuto para os comprimidos frouxamente compactados), sensação mais suave na boca (isto é, livre da aspereza associada com os agentes de alta absorção nos comprimidos compactados), potencial para absorção pré-gástrica aperfeiçoada (reduzindo dessa maneira os efeitos colaterais e melhorando a eficácia de certas medicações) e opções de armazenamento aumentadas.

[006]Tipicamente, a gelatina é usada para dar resistência suficiente à forma de dosagem para prevenir a ruptura durante a remoção da embalagem, mas uma vez colocada na boca, a gelatina permite a dispersão imediata da forma de dosagem. Gelatina hidrolisada de mamífero é geralmente o agente formador de matriz de escolha em FDDFs por que ela gelifica rapidamente depois do resfriamento. A gelatina de peixe não gelificante também pode ser usada. Durante o processamento, a solução/suspensão dosada é preferivelmente congelada pela passagem através de um meio gasoso. Dessa maneira, a solução/suspensão congela rapidamente, o que aperfeiçoa a eficiência da fabricação.

[007]As vacinas, que são importantes na profilaxia contra uma doença, exercem seus efeitos pela provocação de uma resposta imune, cujo efeito é evitar uma infecção pelo organismo desafiador ou o aparecimento de processos de doença, que de outra maneira, ocorreriam quando o antígeno contra o qual resposta imune tenha sido provocada desafiar de novo um tecido sensível. As vacinas também podem ser usadas terapeuticamente para modificar a natureza ou o nível da resposta imune a um antígeno para permitir que o hospedeiro elimine o patógeno ao qual ele já tinha sido exposto.

[008]A maioria das vacinas existentes é liberada por injeção, o que é traumático, inconveniente, caro e pode falhar em induzir a resposta imunogênica apropriada nos tecidos mucosos. A maioria das infecções afeta ou começa nas superfícies mucosas. A imunização ativa contra esses agentes infecciosos pode depender da indução bem sucedida de uma resposta imune da mucosa. As vacinas mucosas bem sucedidas podem proteger as superfícies secretórias, isto é, imunidade da mucosa e também induzem imunidade sistêmica pela indução de anticorpos circulatórios. As vacinas de mucosa são fáceis de administrar aos pacientes e são menos caras para fabricar do que as vacinas convencionais. A liberação por injeção, é claro, não atinge diretamente a superfície das mucosas ou fornece as vantagens associadas com as vacinas orais.

[009]A indução da imunidade pela mucosa é evidenciada pelo aparecimento de imunoglobulinas (Ig), das quais os anticorpos IgA no muco subjacente a mucosa são particularmente significativos. IgA exerce múltiplos efeitos dentro da mucosa. Muito notavelmente, ela age para neutralizar patógenos e componentes de patógenos, evitando que eles acessem e penetrem as camadas epiteliais subjacentes, que é o que causa a infecção. A estimulação da imunidade em um sítio da mucosa é conhecida conferir proteção a membranas mucosa de outros sítios do corpo. Potencialmente, as vacinas orais podem ser usadas para induzir a imunidade contra patógenos orais, gastrintestinais, respiratórios, urogenitais e oculares. Essa habilidade de gerar imunidade em sítios do corpo distantes do ponto da estimulação antigênica original tem levado ao conceito de um sistema imune mucoso comum. Existem indicações adicionais que a estimulação do sistema imune mucoso pode induzir anticorpos circulatórios protetores no sistema imune sistêmico, particularmente anticorpos IgG. As vacinas mucosas ótimas podem também induzir respostas de linfócitos T, tal como a produção de células T auxiliares que podem suportar a produção de anticorpos e, para patógenos particulares, células Th17, Th1, Th2 e linfócitos T citotóxicos (CTL) que atuam localmente e/ou sistemicamente.

[0010]As vacinas liberadas oralmente podem estimular o tecido linfoide associado ao nariz na boca e região da nasofaringe, os linfonodos, amígdalas e adenoides e o tecido linfoide associado ao intestino nas placas de Peyer no intestino delgado.

[0011]Vacinas incorporam antígenos que podem ser peptídeos, proteínas, polissacarídeos ou fragmentos completos ou parciais ou extratos de bactérias, vírus ou outros microrganismos, geralmente atenuados para remover os componentes tóxicos. A fim de que as vacinas produzam o efeito protetor desejado, a exposição ao antígeno deve ser suficiente para provocar uma resposta imune no receptor. Um problema primário nos procedimentos de vacinação é garantir que esses antígenos ou compostos antigênicos alcancem o sítio apropriado em quantidades suficientes para provocar a resposta imune requisitada. Existem dois aspectos do sistema imune que podem fornecer a resposta imune requisitada quando estimulado por um antígeno em um sistema de vacina: o sistema imune sistêmico e osistema imune de mucosa.

[0012]O sistema imune de mucosa consiste em áreas de tecidos linfoides indutores e efetores localizados no trato gastrintestinal, trato respiratório, trato geniturinário e as membranas que circundam os órgãos sensoriais. Os sítios indutores geralmente possuem uma estrutura linfoide organizada e a habilidade para detectar a presença de antígenos na mucosa. As células que apresentam antígeno em áreas localizadas do tecido linfoide possuem a habilidade de remover o antígeno absorvido e estimular as respostas de célula T e B, resultando na produção de células plasmáticas. Essas células plasmáticas podem residir localmente ou em sítios efetores através do corpo secretando anticorpos, tais como IgA. As moléculas de IgA secretadas resistem a proteólise e previnem a colonização e entrada de patógenos pela neutralização ou aglutinação deles. Em outras situações, a molécula de IgA ativa a citotoxicidade mediada por célula T dependente de anticorpo, nos caos onde o patógeno penetrou a barreira inicial. A estimulação do tecido mucoso também pode resultar na produção de outros isotipos de anticorpo, tais como IgG, IgM e IgE. Esses outros isotipos de anticorpo podem exercer efeitos localmente na mucosa ou ter efeitos sistêmicos, dessa maneira fornecendo proteção adicional se os patógenos manobram para penetrar a mucosa. As respostas de célula T induzidas na mucosa também podem estar presentes em sítios mucosos ou sistemicamente, o que intensifica a proteção das superfícies mucosas e a proteção contra patógenos que penetram na mucosa.

[0013]A principal função das células que formam o tecido linfoide é evitar a absorção de patógenos e toxinas ou inativar esses patógenos e toxinas depois da absorção para o tecido mucoso. Em geral, doses consideravelmente altas de antígenos são necessárias para a imunização pela mucosa, especialmente quando pretendida para a via oral. Isso é devido a existência de barreiras mecânicas e químicas eficazes e a degradação e digestão dos antígenos pelas enzimas e ácidos. Adicionalmente, há uma rápida depuração do material a partir dos tratos respiratório superior e digestivo para o estômago pelos processos mucociliares, peristálticos e secretores.

[0014]A mucosa evoluiu para prevenir a indução de respostas imunes efetoras contra antígenos prejudiciais tais como alimentos e partículas inaladas. Consequentemente, vários antígenos que são introduzidos nas superfícies mucosas induzem "tolerância" ao invés de respostas produtivas de célula B e T. Portanto, há uma necessidade de superar esses processos naturais a fim de tornar as vacinas mais eficazes.

[0015]Tem sido encontrada dificuldade no preparo de formas de dosagem sólida oral para liberar vacinas através da via mucosa enquanto ao mesmo tempo se preserva a facilidade de administração e o conforto do paciente. Certos pacientes que têm dificuldade de deglutir são tipicamente pobres candidatos para vacinas sólidas orais com a permanência física aumentada da forma de dosagem na cavidade oral.

[0016]As vacinas orais comercialmente disponíveis são vacinas vivas atenuadas (por exemplo, pólio, tifoide, rotavírus) ou vacinas inativadas (por exemplo, cólera) e são eficazes em desencadear uma resposta imune da mucosa apropriada kA que seu sítio natural de infecção é a mucosa intestinal e a unidade de vacina desencadeia os mecanismos de defesa imune naturais do corpo. Entretanto, vacinas orais eficazes e seguras de subunidades de vacina (contendo fragmentos antigênicos de micróbios), vacinas de toxoide ou vacinas de conjugados ainda não estão bem estabelecidas. A liberação oral dessas estratégias de vacina baseada em peptídeo é significativamente impedida devido a sua degradação com a exposição ao ambiente ácido do estômago e as enzimas proteolíticas que residem no trato gastrintestinal (GIT). O antígeno em geral também é muito grande para difundir através da mucosa do GIT para a circulação sistêmica e falha em sofrer transporte ativo para a circulação sistêmica. Portanto, geralmente há antígeno insuficiente que permaneça para fazer surgir uma resposta imune sistêmica ou de mucosa. Em adição, um pré-requisito de uma resposta da mucosa dentro do GIT PE a absorção dos antígenos pelas células que apresentam antígeno (APCs). A absorção de antígenos solúveis pelas APCs é muito menos eficaz do que de micropartículas de antígeno. Portanto, antígenos solúveis geralmente falham em obter uma resposta imune adequada, o que pode, de fato, levar a tolerância ao antígeno.

[0017]Várias estratégias têm sido empregadas para proteger os antígenos do ambiente hostil do GIT e para facilitar a resposta da mucosa. Essas incluem o envelopamento dos antígenos em lipossomas, complexos imuno-estimulatórios (ISCOMs), proteossomas e micropartículas. Entretanto, tais estratégias podem requerer ainda doses muito altas do antígeno a ser liberado, junto com a coadministração de adjuvantes de mucosa a fim de fazer surgir uma resposta humoral mediada por célula e anticorpo eficaz. Adicionalmente, vários adjuvantes sob estudo, tais como a toxina da cólera, são altamente tóxicos para humanos. Esses problemas existem não importando a fonte do antígeno (bacteriano, viral, parasitário, etc.).

[0018]Consequentemente, existe uma necessidade no campo farmacêutico de formas de dosagem de vacina oral aperfeiçoadas que efetivamente liberem quantidades imunogênicas de preparações antigênicas e resistam a barreiras químicas e mecânicas à absorção antigênica. Existe ainda uma necessidade de formas de dosagem sólida oral que possam induzir a resposta imune tão eficazmente quanto uma vacina injetável enquanto são fáceis de fabricar e fáceis e confortáveis de administrar.

[0019]A Publicação de Pedido de Patente Norte-americano No. 2008-0014260 descreve uma forma de dispersão rápida sólida oral para a liberação de vacinas. Entretanto, a publicação descreve uma FDDF compreendida por manitol e gelatina como agentes formadores de matriz. A Patente Norte-americana No. 6.509.040 preconiza uma composição farmacêutica para administração oral na forma de uma forma de dosagem de dispersão rápida essencialmente livre de gelatina de mamífero e que compreende pelo menos um agente formador de matriz e um amido. Nenhuma dessas referencias ensina ou sugere os benefícios obtidos pela presente invenção, especificamente o efeito potencializador imune do amido.

[0020]A presente invenção é uma nova formulação de FDDF que usa amido como um agente formador de matriz que potencializa a resposta imune junto com agentes formadores de matriz opcionais tais como manitol e gelatina, para estimular a imunidade contra infecções causadas por bactérias, vírus ou outros microrganismos e obter uma melhor resposta imune do que as formulações FDDF conhecidas na técnica. O efeito potencializador imune do amido descrito na presente invenção não foi previamente descrito ou sugerido na técnica. O efeito potencializador imune também pode ser intensificado por certos agentes ou componentes formadores de matriz adicionais. que também não foram previamente descritos ou sugeridos na técnica. Isso é um avanço significativo na técnica atual.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0021]A presente invenção é direcionada para uma forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida compreendendo: (a) uma quantidade imunogênica de uma preparação antigênica; e (b) pelo menos um agente formador de matriz que potencialize uma resposta imune, em que o pelo menos um agente formador de matriz que potencializa uma resposta imune é um amido. Em uma modalidade preferida da invenção, a preparação antigênica compreende um vírus influenza inativado.

[0022]Em certas modalidades preferidas, o amido está presente na forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida em uma quantidade de cerca de 2% a cerca de 90% em peso e/ou é selecionado do grupo que consiste em amido nativo, amido modificado e suas combinações. Em uma modalidade preferida da invenção, a forma de dosagem se desintegra dentro de 60 segundos, mais preferivelmente em 30 segundos, ainda mais preferivelmente em 10 segundos e o mais preferivelmente em 5 segundos depois de ser colocada na cavidade oral.

[0023]As formas de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida da presente invenção são preferivelmente preparadas pela liofilização. As formas de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida podem compreender agentes formadores de matriz adicionais tais como manitol e/ou gelatina. Em modalidades adicionais, as formas de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida podem compreender, adicionalmente, pelo menos um agente formador de matriz adicional selecionado do grupo que consiste em gomas, preferivelmente, goma xantana ou um tensoativo, preferivelmente, Tween 80 ou poloxâmero. As formas de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida podem compreender um adjuvante e/ou mucoadesivo.

[0024]Em modalidades preferidas da invenção, uma resposta imune, por exemplo, uma resposta de anticorpo específico para influenza, é induzida quando a forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida é administrada a um paciente pela colocação na cavidade oral. Preferivelmente, a colocação na cavidade oral é a colocação sobre ou sob a língua ou na cavidade bucal ou região faríngea.

[0025]A presente invenção também é direcionada para um método de induzir uma resposta imune, por exemplo, uma resposta de anticorpo específica para influenza, em um paciente, o dito método compreendendo a etapa de: colocar a forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida compreendendo: (a) uma quantidade imunogênica de uma preparação antigênica; e (b) pelo menos um agente formador de matriz que potencialize uma resposta imune, em que o pelo menos um agente formador de matriz que potencializa uma resposta imune é um amido, na cavidade oral de uma pessoa que necessite da resposta imune. Preferivelmente, a colocação na cavidade oral é a colocação sobre ou sob a língua ou na cavidade bucal ou região faríngea.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0026]A Figura 1 mostra o grupo dos títulos médios dos pontos de avaliação (EPT) +/- SEM (n=8 por grupo) com 14, 28 e 59 dias para uma forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida da presente invenção quando comparada com formulações dos exemplos comparativos e quando comparada com camundongos não tratados.

[0027]A Figura 2 mostra os resultados da análise da Intensidade Fluorescente Média (MFI) do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) Classe II de um estudo in vitro que usa macrófagos esplênicos de murino em cultura.

[0028]A Figura 3 mostra os resultados da análise MFI de CD25 de um estudo in vitro que usa macrófagos esplênicos de murino em cultura.

[0029]A Figura 4 mostra os resultados da análise MFI de CD86 de um estudo in vitro que usa macrófagos esplênicos de murino em cultura.

[0030]A Figura 5 mostra os resultados da análise de perfil de citocina de um estudo in vitro que usa macrófagos esplênicos de murino em cultura.

[0031]A Figura 6 mostra a alteração no peso corporal depois da imunização e infecção de camundongos no teste in vivo.

[0032]A Figura 7 mostra os escores clínicos da doença depois da imunização e infecção de camundongos no teste in vivo.

[0033]A Figura 8 mostra a taxa de sobrevida depois de 7 dias de camundongos infectados e imunizados no teste in vivo.

[0034]As Figuras 9 até 11 mostram as respostas de anticorpo IgG, IgG1 e IgG2a para as formulações do Exemplo 2.

[0035]A Figura 12 mostra as respostas de anticorpo de mucosa através da análise de lavados nasais.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0036]A presente invenção soluciona problemas na técnica pelo desenvolvimento de um FDDF que libere uma vacina oral para invocar uma resposta imunogênica aperfeiçoada para proteção contra infecções causadas por bactérias, vírus ou outros microrganismos. Os inventores descobriram que uma FDDF da presente invenção, que emprega um amido como um agente formador de matriz que potencializa a resposta imune, opcionalmente junto com pelo menos um agente formador de matriz adicional, para a liberação de vacinas estimula melhor a imunidade contra infecções no corpo humano. A invenção fornece resultados surpreendentes na resposta imune quando se usa uma formulação contendo amido para fazer uma FDDF, em que o amido potencializa uma resposta imune fornecendo uma resposta sistêmica humoral mediada por anticorpo e célula. Portanto, ela pode ser eficaz contra uma gama de antígenos.

[0037]Um aspecto novo e surpreendente da presente invenção é que as formulações baseadas em amido contornam obstáculos à liberação oral de antígenos de vacina como descrito acima. A habilidade de superar os processos naturais que atuam como uma barreira à geração de uma resposta imune eficaz depois da liberação oral da vacina resulta dos atributos únicos das formulações aqui descritas. As formulações de dissolução rápida baseadas em amido, sendo de uma natureza microparticulada, facilitam a absorção do antígeno dentro da cavidade oral (preferivelmente através da administração sublingual ou bucal), evitando dessa maneira os mecanismos de degradação do GIT. Esse mecanismo de absorção invoca uma resposta humoral de anticorpo e de mucosa sem a necessidade de adjuvantes potentes.

[0038]O perfil da resposta imune obtida mostra que a invenção é aplicável a qualquer subunidade de vacina, conjugado de proteína e vacinas de toxoide, tornando-a eficaz contra todos os agentes infecciosos, isto é, preparações de antígeno a partir de vírus, bactérias (completas ou fragmentos parciais ou extratos de células bacterianas ou partículas virais) ou de derivação parasitária, tal como um protozoário ou verme, que causam doenças, ou suas combinações.

[0039]A primeira modalidade é direcionada para uma forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida que compreende: (a) uma quantidade imunogênica de uma preparação antigênica; e (b) pelo menos um agente formador de matriz que potencialize uma resposta imune, em que o pelo menos um agente formador de matriz que potencializa uma resposta imune é um amido.

[0040]Aqui, as frases "dissolução rápida", "dispersão rápida" e "que se desintegram rapidamente" podem ser usadas alternativamente. Para os propósitos da presente invenção, "dissolução rápida" refere-se a capacidade da forma de dosagem sólida inventiva de se desintegrar em 60 segundos (um minuto) depois da colocação na cavidade oral e/ou contato com a saliva. Em modalidades mais preferidas, a forma de dosagem se desintegra em 30 segundos, em modalidades adicionais preferidas, em 10 segundos e nas modalidades mais preferidas, em 5 segundos. Como usada nesse, "oral" e "forma de dosagem oral" referem-se a uma formulação farmacêutica que é administrada pela colocação na cavidade oral de um humano ou animal. "Cavidade oral", como usada aqui, refere-se a todos os espaços dentro da boca e da garganta de um humano ou animal, incluindo sobre ou sob a língua (sublingual) ou na região bucal ou faríngea.

[0041]Uma "preparação antigênica" como usada aqui, é uma formulação que incorpora antígenos solúveis ou particulados, que podem ser peptídeos, proteínas, polissacarídeos, fragmentos completos ou parciais ou extratos de células bacterianas ou partículas virais ou podem ser derivadas de um parasita, tal como um protozoário ou verme, que causam doença ou suas combinações. Qualquer antígeno conhecido na técnica é adequado para uso na presente invenção, incluindo aqueles comercialmente disponíveis ou feitos pela purificação de preparações de um patógeno, recombinantemente expressos em vetores inofensivos ou produzidos sinteticamente pela fabricação padronizada. Métodos para a geração de antígenos adequados e preparações de antígeno para incorporação em FDDF são conhecidos na técnica e qualquer um dos métodos pode ser usado na presente invenção.

[0042]A preparação antigênica está incluída na forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida, que é suficiente para torná-la imunogênica quando fornecida na forma de uma FDDF. A "quantidade imunogênica" é definida como a quantidade apropriada para provocar uma resposta imune desejada. Para influenza, a quantidade imunogênica da preparação antigênica é preferivelmente cerca de 1 μg a cerca de 1 mg. Aquele versado na técnica pode determinar prontamente a quantidade imunogênica para uma dada doença ou infecção baseado, entre outros fatores, na idade e peso dopaciente para os quais a FDDF será administrada.

[0043]A forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida da presente invenção pode ser usada para liberar vacinas que previnem ou reduzem os sintomas (isto é, estimulam a imunidade pela indução da criação de anticorpos e linfócitos T) de uma grande variedade de doenças. Para esse fim, a preparação antigênica da presente invenção pode conter antígenos úteis no fornecimento de proteção contra a seguinte lista representativa de doenças que não é exaustiva: influenza, tuberculose, meningite, hepatite, coqueluche, pólio, tétano, difteria, malária, cólera, herpes, febre tifoide, HIV, AIDS, sarampo, doença de Lyme, diarreia do viajante, hepatite A, B e C, otite média, dengue, hidrofobia, parainfluenza, rubéola, febre amarela, disenteria, febre dos legionários, toxoplasmose, febre Q, febre hemorrágica, febre hemorrágica argentina, cáries, doença de Chagas, infecção do trato urinário causada por E. coli, doença pneumocócica, catapora, chikungunya e combinações dessas. Adicionalmente, a preparação antigênica da presente invenção pode conter antígenos úteis no fornecimento de proteção contra doenças causadas pela seguinte lista não exaustiva de organismos causadores: espécies de Vibrio, espécies de Salmonella, espécies de Bordetella, espécies de Haemophilus, Toxoplasma gondii, Citomegalovirus, espécies de Chlamydia, espécies de Estreptococcus, Vírus Norwalk, Escherischia coli, Helicobacter pylori, Rotavirus, Neisseria gonorrhae, Neisseria meningiditis, Adenovirus, vírus de Epstein Barr, Vírus da Encefalite Japonesa, Pneumocystis carini, Herpes simplex, espécies de Clostridia, Vírus Sincicial Respiratório, espécies de Klebsiella, espécies de Shigella, Pseudomonas aeruginosa, Parvovirus, espécies de Campylobacter, espécies de Rickettsia, Varicella zoster, espécies de Yersinia, Vírus Ross River, Vírus J.C., Rhodococcus equi, Moraxella catarrhalis, Borrelia burgdorferi, Pasteurella haemolytica ecombinações dos mesmos.

[0044]Também são contempladas aplicações veterinárias da presente invenção. Consequentemente, a preparação antigênica da presente invenção pode conter antígenos úteis no fornecimento de proteção contra a seguinte lista representativa de doenças veterinárias: coccidiose, doença de Newcastle, pneumonia enzootica, leucemia felina, rinite atrófica, erispela, doença do pé e da boca, pneumonia e outras condições de doença e outras infecções que afetam animais de companhia e de fazenda e combinações dos mesmos.

[0045]A forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida da primeira modalidade da invenção compreende pelo menos um agente que forma matriz que potencializa a resposta imune, em que o pelo menos um agente que forma matriz que potencializa a resposta imune é um amido. Como usado aqui, amido refere-se não apenas a amidos nativos, mas também a uma ampla variedade de produtos relacionados ao amido e, mais geralmente, a qualquer material que forneça a mesma funcionalidade que o amido na forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida da presente invenção. Preferivelmente, o amido é selecionado entre amido nativo, amido modificado e suas combinações. Preferivelmente, o amido modificado é selecionado de um grupo que consiste em amido pré- gelatinizado, amido substituído, amido reticulado, amido degradado e combinações desses. Amidos nativos exemplificadores incluem, sem limitação, amido de batata, trigo, milho, mandioca (tapioca), cevada, araruta, arroz, sorgo, aveia, milheto e combinações desses. Amidos modificados exemplificadores incluem adicionalmente, sem limitação, amidos preparados a partir de amidos nativos, mas fisicamente, enzimaticamente, quimicamente ou tratados de outra maneira, tais como amidos de hidroxialquila (por exemplo, amido de hidroxipropila), amidos de carboxialquila (por exemplo amido de carboximetila), amidos catiônicos de amônia quaternária (por exemplo, betainato de amido), ésteres de amido (por exemplo, fosfato de diamido acilado, octenilsuccinato de amido de sódio, adipato de diamido acetilado, nitrato de amido, sulfato de amido, fosfato de monoamido, fosfato de diamido, carbato de amido, etc,). Amidos degradados exemplificadores, preparados tratando o amido fisicamente, termicamente, quimicamente, enzimaticamente ou de outra maneira, incluem sem limitação, a dextrina, maltodextrina, pululano, glicose, ciclodextrina e combinações dos mesmos.

[0046]A quantidade de amido em uma solução ou suspensão subsequentemente congelada para formar a forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida varia, preferivelmente, entre cerca de 1% a cerca de 12%, mais preferivelmente entre cerca de 2% a cerca de 10% e o mais preferivelmente entre cerca de 2% a cerca de 8% em peso. A solução ou suspensão de antígeno pode ser dispensada em qualquer quantidade para ser congelada e liofilizada para fornecer a quantidade final no produto desidratado. Por exemplo, se 30 mg de uma solução 2% é dispensada e seca, então o comprimido desidratado conterá 0,6 mg de amido, enquanto que se 1 g da mesma solução é dispensada e desidratada, então o comprimido desidratado conterá 20 mg de amido. Isso fornece a flexibilidade necessária para o tratamento de diferentes populações de pacientes. Preferivelmente, a quantidade de amido presente na forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida varia entre cerca de 2% a cerca de 90%, mais preferivelmente entre cerca de 5% a cerca de 80% e o mais preferivelmente entre cerca de 7% a cerca de 75% em peso.

[0047]Sem estar limitado a uma teoria, é considerado que como o amido é feito de multiparticulados de estrutura granular, isso potencializa a amostragem ou a absorção dos antígenos sobre a superfície granular e quando o amido é absorvido na circulação sanguínea, os antígenos são absorvidos com ele. Portanto, é considerado que o amido tem uma funcionalidade além de atuar como um agente formador de matriz na presente invenção, isto é, ele atua como um agente formador de matriz que potencializa a resposta imune. Em adição ao aperfeiçoamento da liberação de antígenos para o corpo humano, é considerado que o amido auxilie e melhore a absorção de proteínas e peptídeos no corpo humano em geral.

[0048]Como usado aqui, "potencializar a resposta imune" significa que o agente formador de matriz é responsável, pelo menos em parte, pelo tipo ou grau de resposta imune obtida pela forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida da presente invenção.

[0049]Em uma modalidade preferida, a forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida compreende ainda pelo menos uma agente formador de matriz adicional. Um ou mais agentes formadores de matriz adicionais podem ser incorporados na solução ou suspensão antes de congelar para formar uma forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida durante a produção. Qualquer agente formador de matriz convencional é adequado para uso na presente invenção como um agente formador de matriz adicional. Agentes formadores de matriz adicionais adequados incluem, sem limitação, materiais derivados de proteínas animais ou vegetais, tais como gelatinas, dextrinas e soja, proteínas do trigo ou sementes de psyllium; gomas; polissacarídeos; alginatos; carboximetilceluloses; carragena; dextrans. pectinas; polímeros sintéticos tais como polivinilpirrolidona; complexos de polipeptídeo/proteína ou polissacarídeo tais como complexos de gelatina-acácia; açúcares tais como manitol, dextrose, lactose, galactose, trealose; açúcares cíclicos tais como ciclodextrina; sais inorgânicos tais como fosfato de sódio, cloreto de sódio e silicatos de alumínio; e aminoácidos que possuem 2 a 12 átomos de carbono tais como glicina, L-alanina, ácido L-aspártico, ácido L-glutâmico, L- hidroxiprolina, L-isoleucina, L-leucina e L-fenilalanina ou combinações desses. A quantidade de pelo menos um agente formador de matriz adicional presente na forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida pode variar preferivelmente entre cerca de 10% a cerca de 98%, mais preferivelmente entre cerca de 20% a cerca de 95% e o mais preferivelmente entre cerca de 25% a cerca de 93% em peso. A quantidade do pelo menos um agente formador de matriz adicional presente em uma solução ou suspensão subsequentemente congelado para formar a forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida varia preferivelmente entre cerce de 0,01% a cerca de 45%, mais preferivelmente entre cerca de 0,01% a cerca de 33% e mais preferivelmente entre cerca de 0,01% a cerca de 21% em peso.

[0050]Em adição a formação da matriz, o agente formador de matriz pode ajudar na manutenção da dispersão de qualquer preparação antigênica com a solução ou suspensão. Isso é especialmente útil no caso de preparações antigênicas que não são suficientemente solúveis em água e devem, portanto, ser suspensas ao invés de dissolvidas.

[0051]Em uma modalidade preferida, o pelo menos um agente formador de matriz adicional é o manitol. Em outra modalidade preferida, o pelo menos um agente formador de matriz é a gelatina. Em outra modalidade preferida, o pelo menos um agente formador de matriz compreende manitol e gelatina, em combinação com amido como o pelo menos um agente formador de matriz que potencializa a resposta imune.

[0052]Quando presente, a quantidade de manitol na forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida varia preferivelmenteentre cercade 2% a cerca de 90%,mais preferivelmenteentrecercade 5%a cerca de 80% emais preferivelmente entre cerca de 7% a cerca de 65% em peso. Quando presente, a quantidade de manitol em uma solução ou suspensão subsequentemente congelada para formar a forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida varia preferivelmente entre cerca de 1% a cerca de 15%, mais preferivelmente entre cerca de 2% a cerca de 10% e mais preferivelmente entre cerca de 2% a cerca de 5% em peso. Quando presente, a quantidade de gelatina na forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida varia preferivelmente entre cerca de 2% a cerca de 85%, mais preferivelmente entre cerca de 2,5% a cerca de 65% e mais preferivelmente entre cerca de 3% a cerca de 55% em peso. Quando presente, a quantidade de gelatina em uma solução ou suspensão subsequentemente congelada para formar a forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida varia preferivelmenteentrecercade1% a cerca de 10%,mais preferivelmenteentrecercade1%acerca de 7% emais preferivelmente entre cerca de 1% a cerca de 4% em peso.

[0053]Em uma modalidade preferida da invenção, na forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida, a gelatina está presente em uma quantidade de cerca de 3% a cerca de 55%; o manitol está presente em uma quantidade de cerca de 7% a cerca de 65%; e um amido está presente em uma quantidade de cerca de 7% a cerca de 75% em peso. Em uma modalidade preferida da invenção, em uma solução ou suspensão subsequentemente congelada para formar a forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida, a gelatina está presente em uma quantidade de cerca de 1%; o manitol está presente em uma quantidade de cerca de 2% a cerca de 5%; e um amido está presente em uma quantidade de cerca de 2% a cerca de 8% em peso.

[0054]Em outra modalidade preferida, o pelo menos um agente formador de matriz é uma goma tal como, mas não limitada a acácia, guar, agar, xantana, gelana, carragena, curdlana, konjac, alfarroba, welan, goma de tragacanto, goma arábica, goma karaya, goma ghatti, pectinas, dextran, glucomanana e alginatos ou combinações dessas. Quando presente, a goma na forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida varia preferivelmente em uma quantidade entre cerca de 0,01% a cerca de 80% em peso. Quando presente, a goma em uma solução ou suspensão subsequentemente congelada para formar a forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida varia preferivelmente em uma quantidade que varia entre cerca de 0,01% a cerca de 10% em peso. Em uma modalidade mais preferida, o pelo menos um agente formador de matriz adicional é a goma xantana. Quando presente, a goma xantana na forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida varia preferivelmente em uma quantidade entre cerca de 0,01% a cerca de 80% em peso. Quando presente, a goma xantana em uma solução ou suspensão subsequentemente congelada para formar a forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida varia preferivelmente em uma quantidade que varia entre cerca de 0,01% a cerca de 10% em peso. Quando a goma xantana é adicionada à solução ou suspensão , a resposta imune potencializada com relação a IL-6 e TNFalfa pode estar aumentada em relação a soluções ou suspensões que não contêm goma xantana.

[0055]Em uma modalidade preferida, o pelo menos um agente formador de matriz adicional compreende manitol, gelatina e goma xantana. Em uma modalidade adicional preferida da invenção, na forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida, a gelatina está presente em uma quantidade de cerca de 3% a cerca de 55%; o manitol está presente em uma quantidade de cerca de 7% a cerca de 65%; o amido está presente em uma quantidade de cerca de 7% a cerca de 75%; e a goma xantana está presente em uma quantidade de cerca de 0,01% a cerca de 80% em peso. Em uma modalidade preferida da invenção, em uma solução ou suspensão subsequentemente congelada para formar a forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida, a gelatina está presente em uma quantidade de cerca de 1% a cerca de 4%; o manitol está presente em uma quantidade de cerca de 2% a cerca de 5%; o amido está presente em uma quantidade de cerca de 2% a cerca de 8%; e a goma xantana está presente em uma quantidade de cerca de 0,01% a cerca de 10% em peso.

[0056]Em outra modalidade da presente invenção, a forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida compreende ainda um tensoativo. Qualquer tensoativo conhecido na técnica é adequado para uso na presente invenção, incluindo tensoativos não iônicos, aniônicos e catiônicos. Exemplos de tensoativos não iônicos que podem ser usados na presente invenção incluem, mas não são limitados a éteres de alquil polietileno, éteres de alquil polioxietileno, ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitana (por exemplo, Tweens), estearatos de polioxietileno, ésteres de ácido graxo de sorbitana (por exemplo, Spans) e copolímeros de polioxietileno- polioxipropileno (por exemplo, poloxâmeros). Exemplos de tensoativos aniônicos que podem ser usados na presente invenção incluem, mas não são limitados a lauril sulfato de sódio, docusato de sódio e monoleato de glicerol. Exemplos de tensoativos catiônicos que podem ser usados na presente invenção incluem, mas não são limitados a cloreto de benzalcônio, cetrimida e cloreto de cetilpiridínio. Preferivelmente, o tensoativo é selecionado a partir do grupo que consiste em Tween 80, poloxâmero e combinações desses. Quando presente, o tensoativo na forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida varia preferivelmente em uma quantidade entre cerca de 0,01% a 80% em peso. Quando presente, o tensoativo em uma solução ou suspensão subsequentemente congelada para formar a forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida varia preferivelmente em uma quantidade entre cerca de 0,01% a cerca de 10% em peso. Quando um tensoativo é adicionado a solução ou suspensão, a resposta imune potencializada pode ser aumentada com relação a soluções ou suspensões que não contêm o tensoativo.

[0057]Em uma modalidade preferida da presente invenção, o pelo menos um agente formador de matriz compreende manitol e gelatina e a forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida compreende ainda um tensoativo. Em uma modalidade preferida da invenção, na forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida, a gelatina está presente em uma quantidade de cerca de 3% a cerca de 55%; o manitol está presente em uma quantidade de cerca de 7% a cerca de 65%; o amido está presente em uma quantidade de cerca de 7% a cerca de 75%; e o tensoativo está presente em uma quantidade de cerca de 0,01% a cerca de 80%. Em uma modalidade preferida da invenção, em uma solução ou suspensão subsequentemente congelada para formar a forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida, a gelatina está presente em uma quantidade de cerca de 1% a cerca de 4%; o manitol está presente em uma quantidade de cerca de 2% a cerca de 5%; o amido está presente em uma quantidade de cerca de 2% a cerca de 8%; e o tensoativo está presente em uma quantidade de cerca de 0,01% a cerca de 10% em peso.

[0058]A forma de dosagem da invenção compreende, opcionalmente, um adjuvante, que é útil para reforçar uma resposta imune para vacinas mortas ou inativadas, resultando na produção intensificada de anticorpos e memória imunológica intensificada. Para ser mais eficaz, a resposta imune está associada com a geração de uma resposta de memória que fornece uma proteção de longa duração da doença específica. Uma vez exposto, o sistema imune "se lembra" do antígeno e a resposta imune é iniciada para inativar o antígeno. A eficácia de um adjuvante para intensificar uma resposta imune pode ser independente do antígeno com o qual ele está sendo combinado. Adjuvantes adequados incluem, mas não são limitados a: fragmentos bacterianos não tóxicos, toxina da cólera (e formas purificadas e suas frações), quitosana, toxina termossensível de E. coli (e formas purificadas e suas frações), homo e +-copolímeros de lactide/glicolide (PLA/GA), polianidrido, por exemplo, trimelitilimido-L-tirosina, DEAE- dextran, saponinas complexadas com antigenos de membrana (complexos de estimulação imune -ISCOMS), produtos bacterianos tais como lipopolissacarídeo (LPS) e dipeptídeo de muramil, (MDP), lipossomas, cocleatos, proteinoides, citocinas (interleucinas, interferons), vetores microbianos vivos geneticamente manipulados, toxina pertussis mutante não infecciosa, neurimidase/galactose oxidase e toxinas bacterianas e virais derivadas de cepas mutantes e suas combinações. Uma quantidade adequada de um adjuvante pode ser prontamente determinada por aquele versado na técnica.

[0059]A forma de dosagem da presente invenção promove a liberação de uma vacina em um sítio alvo e, em certas modalidades, um sistema mucoadesivo pode ser designado para manter a vacina em contato com os tecidos linfoides mucosos alvos na cavidade oral e para aumentar o tempo de permanência do elemento de vacina nessas superfícies de absorção em potencial. Como um produto para ingestão oral, a partir do qual a vacina é liberada rapidamente uma vez que o produto é tomado, altas concentrações de vacina podem então ser rapidamente liberadas nos sítios-alvo desejados.

[0060]Algumas formas de dosagem sólida de dissolução rápida são inerentemente mucoadesivas. Não obstante, um mucoadesivo pode ser opcionalmente adicionado à forma de dosagem de dissolução rápida da presente invenção, o que pode aumentar a permanência do antígeno em contato com o tecido mucoso na cavidade oral. Mucoadesivos adequados que podem ser usados na presente invenção incluem, mas não são limitados aqueles descritos no Pedido de Patente Europeia No. 92109080.9 e incluem: polímeros de poliacrílico tais como carbômero e derivados de carbômero (por exemplo, PolycarbophilTM, CarbopolTM, e semelhantes); derivados de celulosetaiscomohidroxipropilmetilcelulose(HPMC), hidroxietilcelulose(HEC),hidroxipropilcelulose(HPC)e carboximetilcelulose de sódio (NaCPC); e polímeros naturais tais como gelatina, alginato de sódio, e pectina. Fontes comerciais adequadas para polímeros mucoadesivos (bioadesivos) representativos incluem, mas não são limitadas a copolímero de acrílico CarbopolTM (disponibilizado por BF Goodrich Chemical Co., Cleveland, Ohio); hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) (disponibilizado por Dow Chemical, Midland, Mich.); HEC (Natrosol) (disponibilizado por Hercules Inc., Wilmington, Del.); HPC (KlucelTM) (disponibilizado por Dow Chemical Co., Midland, Mich.); MaCMC (disponibilizado por Hercules, Inc., Wilmington, Del.); gelatina (disponibilizado por Deamo Chemical Corp., Elmford, N.Y.); alginato de sódio (disponibilizado por Edward Mandell Co., Inc., Carmel, N.Y.); pectina (disponibilizado por BDH Chemicals Ltd., Poole, Dorset, UK); PolycarbophilTM (disponibilizado por BF Goodrich Chemical Co., Cleveland, Ohio). Uma quantidade adequada de um mucoadesivo pode ser prontamente determinada por aquele versado na técnica.

[0061]A forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida da presente invenção também pode conter outros componentes opcionais tais como conservadores, antioxidantes, intensificadores da viscosidade, agentes corantes, agentes flavorizantes, modificadores do pH, adoçantes, agentes que mascaram o sabor e suas combinações. Agentes corantes adequados incluem, sem limitação, óxidos de ferro vermelho, preto e amarelo e corantes FD&C tais como FD&C azul No. 2 e FD&C vermelho No. 40 disponibilizados por Ellis & Everard. Agentes flavorizantes adequados incluem, sem limitação, sabores de menta, framboesa, alcaçuz, laranja, limão, grapefruit, caramelo, baunilha, cereja e uva e combinações desses. Modificadores de pH adequados incluem, sem limitação, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido fosfórico, ácido maleico, hidróxido de sódio, carbonato de sódio e tampão Tris. Adoçantes adequados incluem, sem limitação, aspartame, sucrose, sucralose, acessulfame K e taumatina. Agentes que mascaram o sabor incluem, sem limitação, bicarbonato de sódio e compostos de inclusão de ciclodextrina. Aquele versado na técnica pode determinar prontamente quantidades adequadas desses ingredientes opcionais para inclusão na forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida da presente invenção.

[0062]Em uma certa modalidade da invenção, a forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida pode incluir opcionalmente microesferas que podem ser biodegradáveis. O próprio material da microesfera pode funcionar como um adjuvante ou pode ser usada em conjunto com outros adjuvantes. A preparação antigênica pode ser absorvida ou incorporada sobre ou em microesferas, formando dessa maneira um complexo microesfera- antígeno. Portanto, a preparação antigênica está disponível para absorção no tecido linfoide efetivamente tão cedo quanto o tecido contata o complexo de preparação microesfera-antígeno.

[0063]Materiais de microesfera adequados que podem ser usados com a invenção incluem materiais poliméricos biodegradáveis. São particularmente adequados os materiais hidrofóbicos tais como os polímeros de poli(ácido láctico) e poli(lactide-coglicolide) e copolímeros de látex. Esses materiais poliméricos também conferem resistência contra a digestão enzimática e hidrolítica até sua absorção pelo tecido linfoide, onde o antígeno liberado pode exercer seu efeito imunogênico. Os materiais poliméricos preferidos são materiais hidrofóbicos que intensificam a absorção nos tecidos-alvos. Em modalidades preferidas, a microesfera é de alginato de sódio ou poli(lactide-coglicolide) (PLGA).

[0064]Quando a forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida da primeira modalidade é administrada a cavidade oral de um paciente (humano ou animal) com necessidade de proteção contra doença, uma resposta imune é induzida. Uma resposta imune inclui a produção de anticorpos específicos para o patógeno a partir do qual o antígeno dentro da forma de dosagem foi derivado, a geração de um anticorpo de célula T adequado e, em alguns casos, a produção de linfócitos T citotóxicos (CTL). A resposta imune também pode incluir a geração de uma resposta de memória que fornece proteção de longa duração para a doença específica.

[0065]Na presente invenção, a colocação da forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida é preferivelmente sobre ou sob a língua (sublingual) ou na região bucal ou faríngea.

[0066]As formas de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida da presente invenção podem ser tomadas sem água e dispersas em volumes muito pequenos de saliva. Isso aumenta o revestimento de tecidos mucosos que contêm o tecido tonsilar associado ao linfoide e aumenta o tempo de permanência dos antígenos dentro desses tecidos. As formas de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida são conhecidas por dispersar rapidamente e revestir as superfícies mucosas da boca e da faringe, onde os tecidos mucoso associado com o linfoide estão localizados. Com relação a isso, é feita referencia a um documento de Wilson et al., International Journal of Pharmaceutics, 40 (1997), páginas 119123, cujo texto está incorporado aqui por referencia. Consequentemente, as formas de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida aperfeiçoam o direcionamento das vacinas para tecidos linfoides suscetíveis na boca, particularmente sob a língua e a faringe. Consequentemente, a concentração de vacina que faz contato com esses tecidos, por exemplo, tecido linfoide suscetível nas áreas bucofaringea e sublingual, aumenta quando liberado através de FDDF.

[0067]Qualquer método de fabricação de formas de dosagem de dissolução rápida pode ser usado de acordo com essa invenção. Preferivelmente, as formas de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida da presente invenção são liofilizadas. Uma forma de dosagem de dissolução rápida preferida para uso com a invenção é aquela descrita na Patente U.K. No. 1.548.022, que é dirigida para uma forma de dosagem sólida oral de dissolução rápida que compreende uma rede do ingrediente ativo e um veículo solúvel em água ou dispersível em água que é inerte frente ao ingrediente ativo, a rede tendo sido obtida pela sublimação do solvente de uma composição que compreende o ingrediente ativo e uma solução do veículo em um solvente. A Patente U.K. No. 1.548.022 falha na descrição do uso de um amido em uma FDDF liofilizada, mas o método dessa pode ser prontamente adaptado para fazer as formas de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida.

[0068]A forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida é tipicamente um comprimido branco, redondo formulado para se desintegrar rapidamente na boca. Entretanto, a cor pode variar dependendo dos materiais usados nele ou da adição de corantes. O tamanho do comprimido é geralmente de cerca de 5 mm a cerca de 25 mm e formatado de acordo com o tamanho e a forma da cavidade do blister no qual ele será colocado durante a fabricação e/ou armazenamento. O comprimido compreende uma rede altamente porosa que auxilia a desintegração tipicamente em 60 segundos, mais preferivelmente em 30 segundos, ainda mais preferivelmente em 10 segundos e o mais preferivelmente em 5 segundos, depois de ser colocado na cavidade oral. O comprimido é fisicamente robusto a fim de resistir ao manuseio e a remoção da embalagem do tipo blister sem quebrar.

[0069]Em uma segunda modalidade, a forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida compreende: (a) uma quantidade imunogênica de um vírus influenza inativado; e (b) pelo menos um agente formador de matriz que potencialize uma resposta imune, em que o pelo menos um agente formador de matriz que potencializa uma resposta imune é um amido.

[0070]Qualquer cepa de vírus influenza é adequada para uso na presente invenção. Na fabricação de vacinas para influenza, organizações internacionais, tais como a Organização Mundial de Saúde, monitoram as cepas que causam doença e anualmente fornecem informações específicas sobre as cepas mais importantes para as quais a vacinação é necessária. Devido a mutação contínua de antígenos-chave sobre a superfície do vírus influenza, novas cepas são continuamente monitoradas e novas vacinas fabricadas. As amostras das cepas influenza identificadas são tornadas disponíveis para os fabricantes de vacina que as usa para a preparação de vacinas.Os vírussãogeralmente preparadosparauso emumavacina,isto é,umapreparação antigênica, deacordocom procedimentos padronizados conhecidos. O vírus influenza inativado pode ser incluído na forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida da invenção em uma quantidade imunogênica. Tipicamente, a quantidade de vírus a ser adicionada é definida a partir de estudos de imunogenicidade em animais, onde os níveis de anticorpos funcionais como definidos em ensaios, tal como o ensaio de Inibição de Hemaglutinina (HAI), alcançam um nível desejado como combinado pelas reguladores de vacina.

[0071]Os detalhes observados acima com relação a quantidade imunogênica, amido, agentes formadores de matriz, tensoativos, microesferas, adjuvante, mucoadesivo, etc., são os mesmos para a segunda modalidade da invenção como a primeira modalidade da invenção.

[0072]Quando a forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida da segunda modalidade é administrada na cavidade oral de um paciente (humano ou animal) necessitado de proteção contra influenza, uma resposta de anticorpo específico para influenza é induzida. Essa resposta de anticorpo neutraliza a habilidade do vírus de infectar as células de mamíferos, como medido por HAI ou pelo Teste de Neutralização de Vírus (VNT), que avaliam a habilidade funcional da resposta de anticorpo. Outros aspectos desejados da resposta imune anti-influenza incluem a geração de respostas de célula B e T de memória e a presença de CTL, que é capaz de matar as células infectadas pelo vírus. A maioria das vacinas são atualmente avaliadas apenas quanto a sua habilidade de estimular uma resposta de anticorpo. Entretanto, a habilidade de produzir vacinas capazes de conferir imunidade cruzada protetora contra a cepa de influenza pode ser obtida pela intensificação da habilidade de novas vacinas para gerar CTL. A colocação da forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida é preferivelmente sobre ou sob a língua (sublingual) ou na região bucal ou faríngea.

[0073]A terceira modalidade da presente invenção é direcionada para um método de indução de uma resposta imune em um paciente, o dito método compreendendo a etapa de: colocar a forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida da primeira modalidade da invenção na cavidade oral de uma pessoa necessitada de uma resposta imune. Preferivelmente, a colocação na cavidade oral é a colocação sobre ou sob a língua (sublingual) ou na região bucal ou faríngea.

[0074]Em modalidades preferidas da invenção, a forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida é administrada para induzir uma resposta imune maior do que um controle negativo e maior do que a administração de uma FDDF sem a inclusão de um amido como um agente formador de matriz que potencializa a resposta imune. "Controle negativo" como definido aqui é um animal usado em experimentos que não é tratado com o vírus inativado e não infectado pelo vírus.

[0075]A quarta modalidade da presente invenção é direcionada a um método de indução de uma resposta de IgG específica para influenza em um paciente, o dito método compreendendo a etapa de: colocar a forma de dosagem de vacina sólida oral de dissolução rápida da segunda modalidade da invenção na cavidade oral de uma pessoa com necessidade da resposta imune. Preferivelmente, a colocação na cavidade oral é a colocação sobre ou sob a língua (sublingual) ou na região bucal ou faríngea.

[0076]A presente invenção não está limitada a qualquer vacina específica, mas a solucionar os problemas da liberação oral de vacinas. Os exemplos a seguir ilustrarão a prática da presente invenção em algumas das modalidades preferidas. Outras modalidades dentro do escopo das reivindicações ficarão aparentes para aquele versado na técnica.

EXEMPLO 1

[0077]Uma FDDF do tipo conhecido na técnica como descrita por Seager, H., "Drug-Delivery Products and Zydis Fast Dissolving Dosage Form," J. Pharm. Pharmacol, vol. 50, p. 375-382 (1998) foi preparada, mas com gelatina, manitol e amido. A nova formulação de matriz foi preparada pela combinação de gelatina de pele bovina tratada com cal 1,5% (375 mg), amido de hidroxipropila 2,5% (625 mg), manitol 3,0% (750 mg) e 25 ml de água e aquecendo a mistura a 75°C por 15 minutos. A solução foi coberta durante o aquecimento para minimizar a evaporação. A solução foi subsequentemente resfriada para a temperatura ambiente, por exemplo, 20-25°C, em um banho de água gelada.5,5 μl de uma solução concentrada de influenza (A/Panama/2007/99H3N2) foram adicionados a 24,5 μl da nova formulação de matriz, tal que cada comprimido continha 1 μg de influenza. Depois da adição do concentrado de influenza, as concentrações finais dos agentes formadores de matriz na formulação eram as seguintes: amido 2,0% (p/v), manitol 2,4% (p/v) e gelatina 1,2% (p/v). A formulação foi então dosada nas cavidades do blister usando uma bomba dosadora semiautomática Hamilton liberando 30 mg por dose. As formulações dosadas foram rapidamente congeladas sendo colocadas em uma câmara com nitrogênio líquido por 5 minutos. As formulações congeladas foram subsequentemente liofilizadas usando um liofilizador Edwards, Modulyo 4K acoplado a uma bomba Edwards RV5. Primeiro, o liofilizador foi ativado por um período de 15 minutos para pré-congelar o sistema a -45°C. As formulações congeladas foram transferidas imediatamente para a prateleira dentro de uma câmara do liofilizador. A tampa foi colocada sobre a câmara e a bomba de vácuo foi ligada para assegurar que a válvula de drenagem estava fechada. O liofilizador foi deixado funcionar por uma noite para liofilizar completamente as amostras. Uma vez secas, a bomba de vácuo e o condensador foram desligados e a torneira de drenagem aberta lentamente para permitir a entrada de ar no sistema. As embalagens de blister cheias totalmente congeladas foram então removidas e colocadas em saches de alumínio e lacrados em uma jarra de vidro contendo um absorvente de umidade e armazenados a 4°C até o uso.

[0078]Os comprimidos liofilizados foram inspecionados visualmente; nenhum defeito importante foi encontrado. Os comprimidos estavam todos intactos e com aparência normal apesar de estarem um pouco elevados. Os comprimidos se desintegraram instantaneamente, em dez segundos, ao serem colocados em água purificada a 37°C.

[0079]Os comprimidos resultantes foram administrados por via sublingual a camundongos e amostras de sangue foram subsequentemente testadas nos dias 14, 28 e 59. ELISAs de subclasses foram realizados para avaliar os níveis de IgG1 e IgG2 específica para influenza em amostras de soro coletadas dos animais tratados. As amostras forma diluídas para dar uma concentração superior de 1 a 40. Uma diluição seriada em 2 vezes de amostras foi então realizada em salina tamponada com fosfato com albumina sérica bovina (PBS/BSA) (1%) em uma placa de 96 poços. Anticorpos de detecção conjugados com peroxidase de rábano silvestre (HRP), conjugado de HRP:IgG1 e IgG2a (Fc) de cabra anti-camundongo (ambos de AbD Serotec) foram diluídos 1 para 1000 em PBS/BSA. Soro dos animais que não foram tratados nem infectados foi incluído como controle negativo. Os resultados são mostrados na Figura 1 abaixo como "Zydis + flu s.1 (nova matriz)".

EXEMPLO COMPARATIVO 1

[0080]Uma FDDF foi preparada de acordo com a preparação conhecida de modo geral de um comprimido Zydis®. O comprimido Zydis® foi preparado pela combinação de 200 mg de gelatina com 3,3 ml de água e aquecendo a mistura a 60°C por 30 minutos. A solução foi coberta durante o aquecimento para minimizar a evaporação. A solução foi subsequentemente resfriada para cerca de 25°C em um banho de água gelada. Depois disso, 150 mg de manitol foram adicionadas sob agitação. Uma solução concentrada de antígeno influenza A/Panama/2007/99 H3N2 foi adicionada para dar o volume de 5 ml tal que cada comprimido continha 1 μg de influenza. A concentração final dos agentes formadores de matriz depois da adição do influenza era de 4% de gelatina e 3% de manitol (p/v). A formulação foi processada sob as mesmas condições do Exemplo 1, isto é, dissolução, resfriamento, congelamento, liofilização. Os comprimidos liofilizados foram inspecionados da mesma maneira como no Exemplo 1. Os comprimidos liofilizados foram inspecionados quanto a defeitos da superfície; nenhum defeito importante foi descoberto e os comprimidos estavam intactos. Um teste de dispersão (pela colocação de um comprimido em 100 μl de água purificada a 37°C) foi realizado nos comprimidos Zydis® e eles se dissolveram em menos de 10 segundos.

[0081]Dois lotes foram feitos de acordo com esse processo. Os comprimidos resultantes do primeiro lote foram administrados por via sublingual a camundongos, enquanto que 10 comprimidos do segundo lote foram dissolvidos em 2 ml de água aquecida a 37°C e 200 μl foram administrados por via intragástrica (i.g) por animal. Amostras de sangue foram subsequentemente testadas em camundongos de cada grupo nos dias 14, 28 e 59. ELISAs de subclasses foram realizados para avaliar os níveis de IgG1 e IgG2 específica para influenza em amostras de soro coletadas dos animais tratados. As amostras forma diluídas para dar uma concentração superior de 1 a 40. Uma diluição seriada em 2 vezes de amostras foi então realizada em PBS/BSA (1%) em uma placa de 96 poços. Anticorpos de detecção conjugados com peroxidase de rábano silvestre (HRP), conjugado de HRP:IgG1 e IgG2a (Fc) de cabra anti-camundongo (ambos de AbD Serotec) foram diluídos 1 para 1000 em PBS/BSA. Soro dos animais que não foram tratados nem infectados foi incluído como controle negativo. Os resultados são mostrados na Figura 1 abaixo como "Zydis + flu s.l" e como "Zydis + flu i.g".

EXEMPLO COMPARATIVO 2

[0082]Uma FDDF foi preparada de acordo com o Exemplo Comparativo 1, exceto que antes da dosagem nas cavidades do blister, foi adicionado vírus influenza A/Panama/2007/99 H3N2 microencapsulado em alginato, tal que cada comprimido continha 1 μg de influenza. Para obter essa quantidade final, 3 esferas com influenza microencapsulado foram adicionadas por comprimido. A solução foi subsequentemente processada sob as mesmas condições como no Exemplo 1, isto é, dissolução, resfriamento, congelamento, liofilização. Os comprimidos liofilizados foram inspecionados da mesma maneira como no Exemplo 1.

[0083]Os comprimidos liofilizados foram inspecionados quanto a defeitos da superfície; nenhum defeito importante foi descoberto. Um teste de dispersão (pela colocação de um comprimido em 100 μl de água purificada a 37°C) foi realizado nos comprimidos e eles se dissolveram em menos de 10 segundos.

[0084]Os comprimidos resultantes foram administrados por via sublingual a camundongos e amostras de sangue foram subsequentemente testadas nos dias 14 e 28. ELISAs de subclasses foram realizados para avaliar os níveis de IgG1 e IgG2 específica para influenza em amostras de soro coletadas dos animais tratados. As amostras forma diluídas para dar uma concentração superior de 1 a 40. Uma diluição seriada em 2 vezes de amostras foi então realizada em PBS/BSA (1%) em uma placa de 96 poços. Anticorpos de detecção conjugados com peroxidase de rábano silvestre (HRP), conjugado de HRP:IgG1 e IgG2a (Fc) de cabra anti-camundongo (ambos de AbD Serotec) foram diluídos 1 para 1000 em PBS/BSA. Soro dos animais que não foram tratados nem infectados foi incluído como controle negativo. Os resultados são mostrados na Figura 1 abaixo como "Zydis + flu s.l (esferas de alginato)".

EXEMPLO COMPARATIVO 3

[0085]Uma FDDF foi preparada de acordo com o Exemplo Comparativo 1, exceto que antes da dosagem nas cavidades do blister, foi adicionado vírus influenza A/Panama/2007/99 H3N2 microencapsulado em PLGA, tal que cada comprimido continha 1 μg de influenza. Para obter a quantidade final, um total de 10 μl de esferas de PLGA foi adicionado a 20 μl de mistura de FDDF para obter uma quantidade de 10 μl de esferas de influenza microencapsulado por comprimido. A solução foi subsequentemente processada sob as mesmas condições como no Exemplo 2, isto é, dissolução, resfriamento, congelamento, liofilização. Os comprimidos liofilizados foram inspecionados da mesma maneira como no Exemplo 1.

[0086]Os comprimidos liofilizados foram inspecionados quanto a defeitos da superfície; nenhum defeito importante foi descoberto. Um teste de dispersão (pela colocação de um comprimido em 100 μl de água purificada a 37°C) foi realizado nos comprimidos e eles se dissolveram em menos de 10 segundos.

[0087]Os comprimidos resultantes foram administrados por via sublingual a camundongos, e amostras de sangue foram subsequentemente testadas em camundongos de cada grupo nos dias 14, 28 e 59. ELISAs de subclasses foram realizados para avaliar os níveis de IgG1 e IgG2 específica para influenza em amostras de soro coletadas dos animais tratados. As amostras forma diluídas para dar uma concentração superior de 1 a 40. Uma diluição seriada em 2 vezes de amostras foi então realizada em PBS/BSA (1%) em uma placa de 96 poços. Anticorpos de detecção conjugados com peroxidase de rábano silvestre (HRP), conjugado de HRP:IgG1 e IgG2a (Fc) de cabra anti-camundongo (ambos de AbD Serotec) foram diluídos 1 para 1000 em PBS/BSA. Soro dos animais que não foram tratados nem infectados foi incluído como controle negativo. Os resultados são mostrados na Figura 1 abaixo como "Zydis +flu s.l (esferas de PLGA)".

EXEMPLO 2

[0088]Como demonstrado pelos exemplos acima, a formulação Zydis® é um meio eficaz de estimular as respostas sistêmicas de anticorpo para antígenos (Ag) depois da liberação sublingual. O perfil da resposta imune obtida foi dependente da formulação Zydis® e incluiu uma alta resposta de anticorpos neutralizantes. Isso é importante na neutralização de toxinas virais/bacterianas extracelulares e antígenos presentes na circulação sistêmica. A formulação do Exemplo 1 também foi capaz de direcionar a expansão de célula T citotóxica (CTL) específica para o antígeno, que uma resposta imune mediada por célula importante para neutralizar a infecção intracelular. Estudos adicionais foram conduzidos para aperfeiçoar a resposta mediada por célula obtida pelas formulações.

[0089]Depois desses primeiros estudos, estudos in vitro adicionais foram realizados usando macrófagos esplênicos de murino em cultura e citometria de fluxo para determinar seus níveis de ativação e a expressão de moléculas que são críticas na mediação da ativação de célula T. Para esses estudos in vitro, lipopolissacarídeo (LPS), um potente estimulador conhecido de vários desses fatores, foi usado como controle positivo. As formulações foram preparadas para uso em um estudo in vitro que usa macrófagos esplênicos de murino como mostrado na Tabela 1 abaixo. Tabela 1

*Processada a 50˚C, todas as outras formulações processadas a 70˚C.

[0090]As formulações foram preparadas como a seguir. Umasolução concentrada de antígeno de influenza em uma concentração de 3,94 mg/ml foi preparada. Separadamente, um concentrado de matriz para cada formulação listada acima foi preparado. Uma quantidade apropriada de solução concentrada de antígeno de influenza e um concentrado de formulação de matriz foram então combinadas para dar um volume final de 500 μl da solução da formulação final. A partir dessa solução de formulação misturada, alíquotas de 30 mg foram dispensadas, congeladas e liofilizadas para fornecer comprimidos que contêm 1 μg ou 15 μg de antígeno influenza. A Tabela 2 resume essa preparação.Tabela 2

[0091]O concentrado de matriz foi preparado pela dissolução da quantidade apropriada de cada componente em uma quantidade de água. Uma quantidade apropriada do concentrado de matriz, quando combinado com a quantidade requerida de solução concentrada de antígeno, resultou no nível de componente de matriz na solução da formulação final misturada de acordo com os valores descritos acima. Por exemplo, para a Formulação 1, a Tabela 3 demonstra o relacionamento entre o concentrado de matriz e o percentual em peso da formulação final.Tabela 3

[0092]As células esplênicas foram isoladas de camundongos BALB/C adulto normal, lavadas e depois os macrófagos CD11b+ foram purificados pela separação MACS usando uma coluna de LS mantida dentro de um separador Midi/MACS™. Os macrófagos foram lavados e cultivados em meio de cultura de tecido. Esses foram colocados em cultura a 1,8 x 105 células CD11b+ por poço de teste. LPS foi adicionado em uma concentração final de 100 ng/,l para atuar como um controle positivo. Um comprimido Zydis® para cada uma das 12 formulações foi dissolvido em meio de cultura de tecido e dividido entre três replicatas. Um controle não estimulado também foi preparado não contendo nem LPS nem uma das formulações listadas. Depois de 48 horas, as culturas foram coletadas e os sobrenadantes removidos para análise de citocina. As células foram lavadas e a ativação de macrófago avaliada usando citometria de fluxo seguida pela coloração com anticorpos para o complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe II, CD25 e CD86.

TESTE A.TESTE IN VITRO

[0093]A natureza da resposta de célula T e de anticorpo ao desafio antigênico é ditada elo estado da ativação e as citocinas que são produzidas pelas células monocíticas/macrófagos/dendríticas depois do contato com o antígeno. Adjuvantes e veículos de liberação manipulam essas respostas a fim de direcionar as respostas de célula T e B de tipos particulares. Por exemplo, a estimulação de IL-12 por essas células é um determinante principal associado com a promoção de respostas imunes de Th1, caracterizadas pelos anticorpos que fixam o complemento, ativação de fagócito e produção de CTL. IL-4 é o direcionador principal das respostas de Th2, enquanto que IL-6 junto com TGFbeta são os direcionadores principais de respostas de IgA de mucosa.

[0094]Vários marcadores como uma indicação do nível e do tipo de ativação dos macrófagos foram medidos. Adicionalmente, uma avaliação das citocinas-chave que eles produzem como um indicador dos tipos de reação imune que elas podem promover foi avaliada.

1.MHC Classe II

[0095]A regulação positiva de MHC Classe II é uma etapa essencial na intensificação da apresentação de antígeno a fim de direcionar a resposta de célula T ao antígeno. A regulação positiva é um processo que ativa ou aumenta a taxa ou a extensão daquela resposta particular.

[0096]Uma vez que o macrófago ingira o antígeno (Ag) pela fagocitose, endocitose ou pinocitose, o Ag é quebrado em frações peptídicas menores. Essas frações são então ligadas a MHC, que migra para a superfície da célula e "apresenta" o antígeno às células T. Essa apresentação de antígeno é uma etapa necessária para direcionar a resposta imune. Portanto, a habilidade para aumentar os níveis de MHC classe II em macrófagos é preditiva de uma capacidade de apresentação de antígeno intensificada.

[0097]Os dados da Figura 2 mostram que todas as formulações (exceto F9) intensificam a expressão de MHC classe II, produzindo níveis significativamente maiores de intensidade média de fluorescência do que controles não estimulados e os níveis favoráveis comparados com controles positivos (LPS).

2.CD25

[0098]CD25 é uma parte do receptor de IL-2. A regulação positiva dessa molécula é uma resposta aguda a estímulos de ativação que são indicativos de um estado de ativação elevado e disponibilidade para funcionar como células que apresentam antígeno.

[0099]Uma vez apresentados a células T naives, certos fatores co-estimulatórios e citocinas influenciam a diferenciação e a expansão de célula T. Como mostrado na Figura 3, todas as formulações exibem uma resposta maior do que o controle não estimulado e uma resposta aos controles positivos (LPS). A Formulação 6 (contendo Tween 80) e a Formulação 7 (contendo Poloxâmero 188) mostram uma resposta aumentada acima dos controles positivos.

3.CD86

[00100] CD86 é um fator coestimulatório que influencia ambas as células T auxiliares e células T citotóxicas (necessárias para a imunidade mediada por célula). CD86 fornece um segundo sinal crítico necessário a fim de ativas ambas as respostas de célula T auxiliar e citotóxica. Ele é normalmente expresso em níveis muito baixos sobre as células que apresentam o antígeno em repouso e sua regulação positiva é um evento crítico na capacitação de tais células a interagir produtivamente com as células T a fim de gerar uma resposta imune.

[00101] Como mostrado na Figura 4, todas as formulações, exceto aquelas processadas a 50°C (Formulações 5, 10, 11 e 12) e a formulação que contém lecitina (Formulação 9), foram capazes de estimular a expressão aumentada de CD86, fornecendo uma boa resposta comparada com controles positivos.

4.Perfil de Citocina

[00102] O perfil de citocina avalia a resposta de citocina, que é crítica na estimulação e que afeta a natureza da resposta de célula T.

[00103] Os dados demonstram a capacidade de potencialização imune das formulações baseadas em amido e também a capacidade de direcionar as respostas de célula T, isto é, a estimulação e a expansão (população aumentada de) de células T.

[00104] A presença de TNFalfa e IL12p40 (como uma medida de IL- 12) é importante no direcionamento das respostas de célula Th1 e T citotóxica, enquanto que IL-4 favorece a diferenciação de células T em células Th2, cujo papel primário está na estimulação da produção de anticorpo. IL-6 está envolvido na geração de respostas de Th17 que estão envolvidas na promoção da ativação de neutrófilo, um aspecto que é importante na mediação de proteção em certas doenças e também na promoção da produção de anticorpos pelas células B. IL- 10 tem a habilidade de regular negativamente outras respostas imunes. A regulação negativa é um processo que reduz a ativação ou a taxa ou a extensão de ativação de uma resposta.

[00105] Como mostrado na Figura 5, todas as formulações exibem um aumento significativo na resposta em IL-6, TNF alfa e IL-12p40 comparadas com o controle não estimulado. A Formulação 1, que contém o nível mais baixo de Ag (1 ug) e amido (2,0%), exibiu a menos resposta em termos de IL-6 e TNF alfa, embora os níveis de IL- 12p40 fossem comparáveis ou maiores do que de outras formulações.

[00106] Aumentando apenas o nível de Ag enquanto um nível baixo de amido (2%) é mantido, como na Formulação 2, o resultado é um aumento em IL-6 e TNFalfa, mas a resposta de Il-12p40 é relativamente baixa.

[00107] O aumento do nível de amido com um baixo nível de antígeno, como na Formulação 3, aumenta IL-6 e TNFalfa e produz uma resposta de IL-12p40 comparável a da Formulação 1. Isso demonstra as propriedades de potencialização imune do amido. As formulações 1 a 9 compreendem hidroxi propil amido, enquanto que a Formulação 10 compreende amido de milho, a Formulação 11 compreende amido de milho ceroso e a Formulação 12 compreende amido de arroz. Os dados mostram que as diferentes fontes de amido podem exercer o mesmo efeito de potencialização imune.

[00108] O aumento do nível de antígeno e de amido, como na Formulação 4, mostra uma resposta aperfeiçoada inesperadamente superior com relação a IL-6, TNFalfa e IL-12p40.

[00109]A Formulação 8 inclui goma xantana e exibe respostasmaiores do que as outras formulações com relação a IL-6 e TNFalfa.

[00110]Todas as formulações exibem baixos níveis de IL-4. Apresença de IL-4 muito cedo em respostas imunes predispõe a um retardo das respostas de Th1 e CTL. Portanto, os baixos níveis de IL-4 são favoráveis em termos de estabelecimento de uma resposta de CTL. IL-4 é importante no fornecimento de um estímulo para a geração de células Th2, que são, por sua vez, importantes para a promoção de respostas de anticorpo. Baixos níveis de IL-4 são suficientes para esse propósito e outros tipos de células são conhecidos por contribuir para sua produção.

[00111] Todas as formulações exibem níveis mais elevados de IL- 10 em relação ao controle não estimulado. IL-10 pode regular negativamente a resposta de CTL e favorecer a resposta de Th2. Entretanto, o controle positivo, LPS, também exibe altas níveis de IL- 10 e essa já é conhecida ser um ativador potente de células que apresentam o antígeno.

B.TESTE IN VIVO 1.Teste do Exemplo 1 e Exemplos Comparativos 1-3

[00112] Amostras de sangue retiradas dos camundongos nos dias 14, 28 e 59 foram investigadas quanto a presença de IgG específica para influenza em cada um dos animais dos grupos, que foram tratados com uma das cinco formulações e em um grupo de animais não tratados (controle negativo). Os gráficos na Figura 1 mostram os níveis de anticorpo contra o vírus influenza depois de 1,2 e 3imunizações com diferentes formulações. Todos os gráficos exibem os títulos médios dos pontos de avaliação (EPT) +/- SEM (n=8 por grupo).

[00113] Como mostrado na Figura 1, a formulação Zydis® que possui a nova formulação de matriz do Exemplo 1 exibe valores maiores de EPT nos dias 14, 28 e 59 do que todos os exemplos comparativos e os camundongos não tratados. O grupo tratado com os comprimidos com a nova matriz mais 1 μg de influenza foi o único onde os animais exibiram respostas de anticorpo acima do basal nos dias 14 e 28. Adicionalmente, o título do ponto de avaliação (EPT) dessa resposta aumentou do dia 14 ao dia 28 ao dia 59, com imunizações crescentes.

2.Teste do Exemplo 2

[00114] Com base nos resultados do estudo in vitro mostrado no Exemplo 2 que usa culturas de macrófagos, certas formulações foram selecionadas para um estudo de estimulação in vivo em camundongos. As formulações selecionadas foram: F8 (que contém goma xantana); F7 (que contém poloxâmero 188); F10 (que contém amido de milho); F4 (que contém amido HP); e F12 (que contém amido de arroz).

[00115] Cinco grupos de camundongos fêmeas BALB/c foram imunizados nos dias 0, 10 e 20 com uma formulação de teste como mostrado na Tabela 1. No dia 27, os animais foram sangrados para análise do soro e depois receberam uma inoculação com 50 μl por via intranasal de vírus influenza a/Porto Rico/8/34(PR8)H1N1. Osanimais foram monitorados quanto aos sinais de infecção durante 7 dias e classificados de acordo com um sistema de pontuação validado. A Tabela 4 mostra o esquema de administração das formulações.Tabela 4

Resultados

[00116] O peso corporal de cada grupo de camundongos foi monitorado por 7 dias depois da inoculação. Os resultados são apresentados na Figura 6.

[00117] Os animais infectados com H1N1 PR8 sem imunização (controle infectado) perderam peso rapidamente a partir do dia 3 pós- infecção, alcançando um ponto de avaliação ajustado Home Office (HO) para a perda de peso de 20% no dia 6. Todos os animais imunizados com uma das formulações contendo antígenos influenza mostraram perda de peso reduzida. Em particular, animais que receberam antígeno nas Formulações 8, 7 e 4, mostraram uma perda de peso significativamente reduzida (P<0,001,P<0,01 e P<0,5,respectivamente, de acordo com One Way ANOVA e o Teste de Comparação Múltipla de Bonferroni).

[00118] Para comparar a extensão da doença, os animais foram classificados como 0, 0,5 ou 1 (sem sintomas clínicos, sinais clínicos leves e sinais clínicos moderados, respectivamente) para cada um dos seguintes parâmetros, dando um escore máximo possível de 5: •Pilo-ereção •Postura encurvada •Respiração irregular •Mobilidade afetada •Olhos lacrimejantes

[00119] Os escores foram colocados em gráfico contra o tempo de dias pós-infecção e são mostrados na Figura 7. Como com os dados de perda de peso, todas as formulações atuaram melhor do que o controle infectado não imunizado. Os escores de doença clínica também mostraram redução significativa na severidade entre os grupos que receberam as formulações 8, 7 e 4 comparados apenas com o controle infectado, até o dia seis pós-infecção (P<0,01 e P<0,5, respectivamente).

[00120] Devido a perda de peso e o aparecimento da doença clínica, vários animais alcançaram o ponto de avaliação humano de Home Office (HO) antes do dia 7 e necessitaram de exterminação no dia 6. A Figura 8 mostra a taxa de sobrevivência no dia 7 depois da imunização com uma das 5 formulações e infecção com o vírus H1N1. Pode ser visto que 50% dos animais tratados com a Formulação 10, 70% dos tratados com a Formulação 4 e 60% dos animais tratados com a Formulação 12 sobreviveram ao dia 7. Apenas um animal tratado com a formulação 8 teve que ser exterminado no dia 6 e nenhum que tenha recebido a Formulação 7 teve que ser exterminado no dia 6.

[00121] Amostras de soro derivadas de amostras retiradas no dia 27 foram analisadas por ELISA usando vírus influenza morto como antígeno de captura e IgG, IgG1 ou IgG2a de camundongo como anticorpo de detecção. Os resultados são mostrados nas Figuras 9, 10 e 11. Os tratamentos com cada uma das formulações selecionadas exibiram resposta de anticorpo IgG1 e IgG2a. O tratamento dos animais com a Formulação 8 estimulou títulos significativamente maiores de anticorpo anti-H1N1 comparados com outros grupos de tratamento, as Formulações 7, 10, 4 e 12, resultando em títulos altos de IgG (P<0,01), em particular do isotipo IgG2a (P<0,001) quando comparados por ANOVA com uma variável e o Teste de Comparação Múltipla de Bonferroni). Os dados apoiam os achados clínicos que demonstram que as formulações selecionadas podem desencadear uma resposta imune apropriada e protetora.

[00122] A Figura 12 mostra a resposta de IgA de lavados nasais obtidos no final do estudo de inoculação in vivo. Naquele momento, os camundongos foram exterminados e os lavados nasais analisados quanto a IgA como indicadora de resposta de anticorpo de mucosa. Os resultados demonstraram que todas as formulações foram capazes de estimular uma resposta de mucosa, com as Formulações 8 e 12 dando os valores de título médio mais elevados.

[00123] Portanto, existem numerosas vantagens na formulação que compreende amido como um agente formador de matriz que potencializa a resposta imune para a fabricação de FDDFs de vacinas orais. A FDDF resultante tem uma vantagem técnica inesperada de resposta de imunidade aumentada para infecções bacterianas e virais, o que não era conhecido nem sugerido pela técnica anterior.

[00124] Numerosas alterações, modificações e variações das modalidades preferidas discutidas aqui ficarão aparentes para aqueles versados na técnica e todas elas são antecipadas e contempladas estar dentro do espírito e do escopo da invenção reivindicada. Por exemplo, embora modalidades específicas tenham sido descritas em detalhes, aqueles versados na técnica compreenderão que as modalidades precedentes e variações podem ser modificadas para incorporar vários tipos de materiais substitutos, adicionais ou alternativos. Consequentemente, mesmo que apenas poucas variações da presente invenção tenham sido descritas nesse, deve ser compreendido que a prática de tais modificações e variações adicionais e os seus equivalentes está dentro do espírito e do escopo da invenção como definida nas reivindicações a seguir. Todos os pedidos de patente, patentes e outras publicações citadas aqui estão incorporados pela referencia em sua totalidade.

Claims

1.Composição sólida de vacina oral de dissolução rápida, caracterizada pelo fato de que compreende: (a)uma quantidade imunogênica de uma preparação antigênica; (b)um agente formador de matriz que potencialize uma resposta imune; (c)um agente formador de matriz adicional, em que o agente formador de matriz que potencializa uma resposta imune é um amido processado a uma temperatura de 70°C a 75°C, em que o amido está em uma quantidade de 5% a 80% em peso, em que o pelo menos um agente de formação de matriz adicional é selecionado do grupo que consiste em manitol, gelatina ou uma combinação de manitol e gelatina, em que, quando presente, a gelatina está em uma quantidade de 2,5% a 65% em peso, e o manitol está em uma quantidade de 5% a 80% em peso.

2.Composição sólida de vacina oral de dissolução rápida de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é preparada por liofilização.

3.Composição sólida de vacina oral de dissolução rápida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a gelatina está em uma quantidade de 3% a 55%; o manitol está presente em uma quantidade de 7% a 65%; e o amido está presente em uma quantidade de 7% a 75% em peso.

4.Composição sólida de vacina oral de dissolução rápida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agente formador de matriz compreende ainda goma.

5.Composição sólida de vacina oral de dissolução rápida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um tensoativo.