CN108434089A - 使用淀粉的口服疫苗快速溶解剂型 - Google Patents

使用淀粉的口服疫苗快速溶解剂型 Download PDF

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Abstract

使用含有淀粉和任选地至少一种附加的基质形成剂的制剂，制备用于输送疫苗的快速溶解的剂型(FDDF)，其中在需要的患者体内诱发免疫反应，所述附加的基质形成剂优选地是凝胶和甘露醇的组合。

Description

使用淀粉的口服疫苗快速溶解剂型
本申请是申请日为2011年10月11日、申请号为201180059059.2(国际申请号为PCT/US2011/055689)、发明名称为“使用淀粉的口服疫苗快速溶解剂型”的中国专利申请的分案申请。
本申请要求2010年10月8日提交的美国临时申请号61/391238的权利，其全部公开通过援引合并入本文。
技术领域
本发明涉及包含淀粉作为疫苗输送的增强免疫反应的基质形成剂的快速溶解剂型(FDDF)。更具体地，本发明涉及FDDF，其包含淀粉和任选地甘露醇和凝胶作为输送口服疫苗的附加的基质形成剂，以刺激由细菌、病毒如流感病毒、其它微生物或如原生动物或蠕虫的寄生虫引起的感染的免疫。
背景技术
在医学领域已知并容易获得多种口服摄取的剂型。这些中最普遍的是片剂。药物片剂的主要局限包括因难以下咽而引起的不好的患者顺从性和因片剂的无效溶解缺乏活性成分生物利用度。
快速溶解剂型(FDDF)方便使用并常用于解决患者顺从性的问题。有很多FDDF形式，例如包含大量芯吸/崩解剂的“松散的”压缩片剂、包含大量发泡剂的片剂、和冻干的片剂。最常用的，使用快速可溶的凝胶基基质配制冻干的快速溶解剂型，其经设计以在口腔中释放活性成分。这些剂型众所皆知并可用于输送很大范围的药。大部分快速溶解剂型使用凝胶和甘露醇作为载体或基质形成剂。(Seagar,H.,“Drug-Delivery Products和ZydisFast Dissolvingformulationform,”J.Pharm.Pharmaco,第50卷,第375-382页(1998))。
一般优选通过冻干方法生产的FDDF，如剂型。它们具有显著的优势：更快的崩解时间(即，少于5秒，相比松散压缩片剂的1分钟)、更滑的口感(即，没有与压缩片剂中的高度芯吸剂相关的砂砾感)、提高的胃前吸收潜能(从而减少副作用和提高特定药物治疗的功效)、和增多的储存选择。
典型地，使用凝胶为该剂型提供足够的强度以防止从包装中取出时的破损，但一旦置入口中，凝胶允许剂型的即刻分散。水解的哺乳动物凝胶通常是FDDF中所选的基质形成剂，因为其在冷却时快速成胶。也可使用不成胶的鱼凝胶。在加工过程中，优选通过气态介质来冷冻定量的溶液/悬浮液。这样，该溶液/悬浮液快速冷冻，提高了生产效率。
在预防疾病方面重要的疫苗通过激发免疫反应来发挥其作用，免疫反应的作用是通过激发有机体或开始发病过程来防止感染，否则该发病过程在针对其已激发免疫反应的抗原再激发敏感组织时将发生。疫苗也可治疗性地使用以改变对抗原的免疫反应的性质或水平以允许宿主消灭其已经暴露过的病原体。
大部分现有的疫苗通过注射输送，注射是创伤的、不方便的、昂贵的，也可能未能在黏膜组织中诱导适当的免疫原性反应。大部分感染侵袭或开始于黏膜表面。针对这些感染性介质的主动免疫可依赖于成功的黏膜免疫反应诱导。成功的黏膜疫苗可同时保护分泌面即黏膜免疫，并通过诱导循环抗体诱导全身免疫。黏膜疫苗比常规疫苗更易于对患者给药和生产起来较便宜。当然注射输送并没有直接靶向黏膜表面或拥有与口服疫苗相关的优点。
黏膜免疫的诱导由免疫球蛋白(Ig)的出现来证实，其中在黏膜上的黏液中的IgA抗体是特别重要的。IgA在黏膜中发挥多重作用。最显著地，其作用以中和病原体和病原体的组分，防止它们接近和穿透下面的上皮层，这是引起感染的途径。在一个黏膜部位的免疫刺激已知会给予身体里其它部位的黏液膜保护。潜在地，口服疫苗可用于诱导针对口腔的、胃肠的、呼吸系统的、泌尿生殖器的、和眼睛的病原体的免疫。在身体里远离最初抗原刺激点的部位产生免疫的这一能力促生了黏膜普遍免疫系统(common mucosal immunesystem)概念。还有其它迹象表明黏膜免疫系统的刺激会诱导在全身免疫系统内的保护性循环抗体，特别是IgG抗体。最佳的黏膜抗体也应该诱导T淋巴细胞的反应，例如能支援抗体生产的T辅助细胞的产生，和针对特定病原体，局部或全身作用的Th17、Th1、Th2细胞和胞毒T淋巴细胞(CTL)的产生。
口服输送的疫苗可刺激在口和鼻咽区域的鼻关联的淋巴组织、淋巴结、扁桃腺和腺状体，和小肠内的派尔斑中的肠关联的淋巴组织。
加入抗原的疫苗可以是肽、蛋白质、多糖，或细菌、病毒或其它微生物的整体或部份片段或提取物，经常被减弱毒性以去除毒性成分。为了使疫苗产生所需要的保护作用，暴露于抗原必须充分以在接种者中激发免疫反应。在接种过程中的主要问题是确保这些抗原或抗原性化合物以足够的量达到适当的部位以激发所需的免疫反应。在疫苗系统中，当抗原刺激时能提供所需的免疫反应的免疫系统有两方面：全身免疫系统和黏膜免疫系统。
黏膜免疫系统由位于胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道和围绕感觉器官的膜中的诱导性和效应淋巴组织区域组成。诱导性部位一般具有有组织的淋巴结构和检测抗原在黏膜中出现的能力。在淋巴组织局部区域的抗原呈递细胞具有吞并所吸收的抗原和刺激T和B细胞反应的能力，致使浆细胞的产生。这些浆细胞可以局部驻留或在遍及全身的效应器部位分泌抗体，如IgA。分泌的IgA分子抵抗蛋白质水解并通过中和和聚集病原体防止病原体的集落化和入侵。在其它情况下，如果病原体穿透最初屏障，IgA分子激活抗体依赖性T细胞介导的细胞毒性。刺激黏膜组织也会导致产生其它抗体同种型，例如IgG、IgM、和IgE。若病原体设法穿透黏膜，这些其它抗体同种型可在黏膜里局部发挥作用或发挥全身作用，由此提供额外的保护。在黏膜中诱导的T细胞反应也可在黏膜部位或全身性地呈现，其加强了对黏膜表面的保护和针对穿透黏膜的病原体的防御。
形成淋巴组织的细胞的首要功能是防止病原体和毒素的吸收或将吸附在黏膜组织上的这些病原体和毒素失活。通常，黏膜免疫需要相当高的抗原剂量，特别是意在用于口服途径时。这是由于有效的机械和化学屏障的存在和酶和酸对抗原的降解和消化。另外，通过黏膜纤毛的、蠕动的和分泌的过程，有从上呼吸道和消化道到胃部的物质的快速清除。
黏膜经进化以防止诱导针对无害抗原如食物和吸入颗粒的效应免疫反应。因而，在黏膜表面引入的许多抗原诱导的是“耐受性”而不是多产的T和B细胞反应。因此，为了制备有效的疫苗需要克服这些自然过程。
制备口服固体剂型以通过黏膜路径输送疫苗同时保持给药简易性和患者的舒适性一直遇到困难。下咽困难的某些患者是固体口服疫苗的典型不良服药者，其具有所述剂型在口腔中延长的物理停留时间(physical residency)。
可商购的口服疫苗是活的减弱毒性的疫苗(例如脊髓灰质炎、伤寒、轮状病毒)或灭活的疫苗(例如霍乱)，并有效引起适当的黏膜免疫反应，因为它们的感染天然部位是消化道黏膜并且该疫苗单元引发身体的天然免疫防卫机制。但是还没有建立亚单位疫苗(包含微生物的抗原片段)、类毒素疫苗或缀合疫苗的有效且安全的口服疫苗。这些肽基疫苗的口服输送策略因暴露于胃部酸性环境和存在于胃肠道的(GIT)蛋白水解酶而发生降解而很大程度地受到阻碍。而且，抗原一般太大而不能扩散穿过GIT黏膜进入体循环，也未能进行活性迁移进入体循环。因此，常有残存的不足的抗原用以引发全身免疫反应或黏膜免疫反应。另外，GIT内的黏膜反应的前提是通过抗原呈递细胞(APCs)摄取抗原。APCs对可溶的抗原的摄取比对抗原微粒的摄取低效得多。因此，可溶的抗原经常未能获得充足的免疫反应，其事实上会导致对抗原的耐受性。
已应用多种策略以在GIT的苛刻环境中保护抗原和促进黏膜反应。这些包括将抗原包裹于脂质体、免疫刺激复合物(ISCOMs)、蛋白体和微粒中。但是，这些策略仍会需要输送很高剂量的抗原，和黏膜佐剂共给药以引起有效的体液抗体和细胞介导反应。更进一步，当下研究的很多佐剂如霍乱毒素对人体是高度有毒的。不管抗原来源(细菌、病毒、寄生虫等)如何都存在这些问题。
因此，制药领域对有效地输送产生免疫的量的抗原制剂并对抗原吸收的化学和机械屏障有抵抗的改进的口服疫苗剂型存在需求。进一步存在对与注射疫苗一样有效地引发免疫反应，同时易于生产并且能轻松舒适地给药的固体口服剂型的需求。
美国专利申请出版号20080014260公开了一种输送疫苗的口服固体快速分散剂型。但是，该出版公开包含甘露醇和凝胶作为基质形成剂的FDDF。美国专利号6509040教导了一种快速分散剂型的口服给药的药物组合物，其基本无哺乳动物凝胶并包含至少一种基质形成剂和淀粉。这些文献中没有一个教导或建议本发明所获得的益处，具体地是淀粉的免疫加强作用。
本发明是FDDF的新型制剂，其使用淀粉作为增强免疫反应的基质形成剂，并和任选的附加的基质形成剂如甘露醇和凝胶一起，以刺激由细菌、病毒、或其它微生物引起的感染的免疫并获得比现有技术中已知的FDDF制剂更好的免疫反应。本发明中描述的淀粉的免疫增强作用以前并没有在现有技术里公开或建议过。而且所述免疫增强作用可以进一步通过某些附加的基质形成剂或成分加强，这也是以前没有在现有技术里公开或建议过的。这对于现有技术状态是一个显著的进步。
发明内容
本发明涉及快速溶解的口服固体疫苗剂型，其包含：(a)产生免疫的量的抗原制剂；和(b)至少一种增强免疫反应的基质形成剂，其中所述至少一种增强免疫反应的基质形成剂是淀粉。在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗原制剂包含灭活的流感病毒。
在某些优选的实施方式中，淀粉在快速溶解的口服固体疫苗剂型中以约2重量％－约90重量％的量存在和/或选自天然淀粉、改性淀粉及其组合。在本发明的优选的实施方式中，该剂型在放入口腔中后，60秒内，更优选在30秒内，仍然更优选在10秒内，且最优选在5秒内崩解。
本发明的快速溶解的口服固体疫苗剂型优选通过冻干制备。快速溶解的口服固体疫苗剂型可包含附加的基质形成剂，例如甘露醇和/或凝胶。在另外的实施方式中，快速溶解的口服固体疫苗剂型可进一步包含至少一种选自树胶，优选地是黄原胶的附加的基质形成剂，或表面活性剂，优选地是吐温80或泊洛沙姆。快速溶解的口服固体疫苗剂型可包含佐剂和/或粘膜黏合剂。
在本发明优选的实施方式中，免疫反应例如流感特异性抗体反应，是在快速溶解的口服固体疫苗剂型通过放置入口腔给药至患者时诱导的。优选地，放置入口腔是放置在舌之上或之下或在颊或咽区。
本发明也涉及诱导患者中的免疫反应如流感特异性抗体反应的方法，所述方法包括步骤：将快速溶解的口服固体疫苗剂型放置入需要所述免疫反应的人的口腔中，所述快速溶解的口服固体疫苗剂型包含：(a)产生免疫的量的抗原制剂；和(b)至少一种增强免疫反应的基质形成剂，其中所述至少一种增强免疫反应的基质形成剂是淀粉。优选地，放置入口腔是放置在舌之上或之下或在颊或咽区。
附图说明
图1显示了本发明的快速溶解的口服固体疫苗剂型与对比实施例的制剂比较并与未处理的小鼠比较：在14、28和59天的组平均终点效价(EPT)+/-SEM(n＝8每组)。
图2显示了来自使用培养液中的鼠科脾脏巨噬细胞的体外研究的主要组织相容性复合物(MHC)类II的平均荧光强度(MFI)分析结果。
图3显示了来自使用培养液中的鼠科脾脏巨噬细胞的体外研究的CD25MFI分析结果。
图4显示了来自使用培养液中的鼠科脾脏巨噬细胞的体外研究的CD86MFI分析结果。
图5显示了来自使用培养液中的鼠科脾脏巨噬细胞的体外研究的细胞因子性质分析结果。
图6显示了在体内测试中，在免疫和感染小鼠之后体重的改变。
图7显示了在体内测试中，在免疫和感染小鼠之后的临床疾病分数。
图8显示了在体内测试中，感染和免疫小鼠7天之后的存活率。
图9至11显示了对实施例2的制剂的IgG、IgG1、和IgG2a抗体反应。
图12显示了通过鼻洗液分析的黏膜抗体反应。
具体实施方式
本发明通过开发一种输送口服疫苗以借助改进的免疫原性反应来防御针对细菌、病毒、或其它微生物引起的感染的FDDF解决了现有技术中的问题。发明人发现本发明的FDDF使用淀粉作为增强免疫反应的基质形成剂，任选地，与至少一种附加的基质形成剂一起，用以输送疫苗在人体内更好地刺激对感染的免疫。本发明提供当使用含有淀粉的制剂制备FDDF时在免疫反应中获得的令人惊奇的结果，其中淀粉增强提供全身体液抗体和细胞介导反应的免疫反应。因此，其对一些抗原是有效的。
本发明一个新颖和令人惊奇的方面是淀粉基制剂绕开了如上所述的口服输送疫苗抗原的屏障。能够克服口服疫苗输送之后作为产生有效的免疫反应的屏障的天然过程，是源自这里公开的制剂的独特贡献。所述淀粉基快速溶解制剂因其微粒性质促进了在口腔内抗原的摄取(优选地通过舌下的或颊区的给药)，由此避免了GIT的降解机制。这种摄取机制在不需要有效佐剂情况下借助体液抗体和黏膜反应。
所得到的免疫反应性质显示本发明可应用于任意亚单位疫苗、蛋白缀合物和和类毒素疫苗，使其对所有感染性介质有效，即来自病毒、细菌(细菌细胞或病毒颗粒的整个或部份碎片或提取物)、或导致疾病的寄生物的衍生物如原生动物或蠕虫的抗原制剂，或其组合。
第一实施方式涉及快速溶解的口服固体疫苗剂型，其包含：(a)产生免疫的量的抗原制剂；和(b)至少一种增强免疫反应的基质形成剂，其中所述至少一种增强免疫反应的基质形成剂是淀粉。
在本文中，短语“快速溶解”、“快速分散”、和“快速崩解”可交换地使用。为了本发明的目的，“快速溶解”指本发明的固体剂型能够优选地在放进口腔和/或与唾液接触的60秒(或1分钟)内崩解。在更优选的实施方式中，所述剂型在30秒内崩解，在更进一步优选的实施方式中，在10秒之内，和在最优选的实施方式中，在5秒之内。在本文中使用的“口服”和“口服剂型”指通过放置入人或动物口腔给药的药物制剂。“口腔”用在本文中指人或动物的嘴巴和咽喉里的所有空间，包括舌之上或之下(舌下的)或颊或咽区。
在本文中所用的“抗原制剂”是加入可溶的或颗粒性抗原的制剂，所述抗原可以是肽、蛋白、多糖、细菌细胞或病毒颗粒的整个或部份碎片或提取物、或可衍生自会导致疾病的寄生物如原生动物或蠕虫，或其组合。现有技术中任何已知的抗原适合用于本发明中，包括那些可商购的或通过病原体制剂纯化制备的，在无害载体中融合表达的，或由标准化生产合成生产的。生产用于加入FDDF的适当的抗原和抗原制剂的方法在现有技术中是已知的，并且任意已知方法可以用于本发明中。
当以FDDF的形式提供时，所述抗原制剂以足以使其具有免疫原性的量包含在本发明的快速溶解的口服固体疫苗剂型中。“产生免疫的量”定义为适于激发所需的免疫反应的量。对于流感病毒，所述抗原制剂的产生免疫的量优选地是约1μg－约1mg。本领域技术人员能够容易地针对一种特定疾病或感染基于其它因素之外的FDDF将给药的患者的年龄和体重而确定产生免疫的量。
本发明的快速溶解固体口服疫苗剂型可以用于输送预防或减轻宽范围的疾病症状的的疫苗(即通过诱导抗体和T淋巴细胞的产生刺激免疫)。在此意义上，本发明的抗原制剂能含有在针对以下有代表性的但不详尽的疾病目录提供防御方面有用的抗原：流行性感冒、结核、脑膜炎、肝炎、百日咳、脊髓灰质炎、破伤风、白喉、疟疾、霍乱、疱疹、伤寒、HIV、AIDS、麻疹、莱姆病、旅行痢疾、甲型、乙型和丙型肝炎、中耳炎、登革热、狂犬病、副流行性感冒、风疹、黄热病、痢疾、军团病、弓形体病、q热、出血热、阿根廷出血热、骨溃疡、查加斯病、E.coli引起的泌尿道感染、肺炎球菌病、腮腺炎、切昆贡亚热，及其组合。另外，本发明的抗原制剂可含有在针对由以下非详尽的致病微生物目录引起的疾病提供防御方面有用的抗原：弧菌种、沙门氏菌种、鲍特杆菌种、嗜血杆菌种、弓形虫病菌(Toxoplasmosis gondii)、巨细胞病毒、衣原体种、链球菌种、诺沃克病毒,大肠杆菌、幽门螺杆菌、轮状病毒、淋病萘瑟菌、脑膜炎萘瑟菌、腺病毒、爱－巴病毒、日本脑炎病毒、卡氏肺囊虫、单纯疱疹、梭状芽孢杆菌种、呼吸道合胞病毒、克雷白杆种、志贺菌种、铜绿假单胞菌、细小病毒、弯曲杆菌(Camylobacter)种、立克次体种、带状疱疹病毒、耶尔森菌种、罗斯河病毒、J.C.病毒、马红球菌、卡他莫拉菌、伯氏疏螺旋体、溶血性巴斯德菌及其组合。
本发明在兽医学的应用也是可预期的。因此，本发明的抗原制剂可包含针对以下有代表性的兽类疾病目录提供防御方面有用的抗体：球虫病、纽卡斯尔病、地方性动物腺炎、猫白血病、萎缩性鼻炎、丹毒、口蹄疫、猪(swine)病、肺炎和其它疾病情形和影响同伴和农场动物的其它感染，及其组合。
本发明第一实施方式的快速溶解的口服固体疫苗剂型包含至少一种增强免疫反应的基质形成剂，其中所述至少一种增强免疫反应的基质形成剂是淀粉。在本文中所用的淀粉不只是指天然淀粉，还指多种淀粉相关的产品，并且更一般而言，指如在本发明的快速溶解的口服固体疫苗剂型中的淀粉提供相同功能的任意材料。优选地，所述淀粉选自天然淀粉、改性淀粉及其组合。优选地，所述改性的淀粉选自由预凝胶化的淀粉、取代的淀粉、交联的淀粉、降解的淀粉、及其组合。示例性的天然淀粉包括，但不限制于土豆、小麦、玉米(粟米)、木薯(芡粉)、大麦、竹芋、米、sag、高粱、燕麦、小米、及其组合。示例性的改性的淀粉进一步包括、但不限制于从天然淀粉制备但经过物理地、酶学地、化学地或其它处理的淀粉，例如羟烷基淀粉(例如羟丙基淀粉)、羧烷基淀粉(例如羧甲基淀粉)、季铵阳离子淀粉(例如甜菜碱淀粉酯)、淀粉酯类(例如酰化二淀粉磷酸酯、淀粉纳辛烯基琥珀酸酯、乙酰基化二淀粉己二酸酯、硝酸淀粉、淀粉硫酸酯、单淀粉磷酸酯、二淀粉磷酸酯、淀粉carbate等)。示例性的降解的淀粉，经过物理的、热学的、化学的、酶学的或其它处理制备的淀粉，包括但不限制于糊精、麦芽糖糊精、水溶性多糖、葡萄糖、环式糊精、及其组合。
淀粉在随后将冷冻以形成快速溶解的口服固体疫苗剂型的溶液或悬浮液中的量的范围优选地约1重量％－约12重量％，更优选地约2重量％－约10重量％，和最优选地约2重量％－约8重量％。所述抗原溶液或悬浮液可以任意量分配以冷冻和冻干以在干产品中提供最终量。例如，如果将30mg的2％溶液分配和干燥，然后所述干燥的片剂将含有0.6mg淀粉，然而如果将1g相同的溶液分配和干燥，那么干燥的片剂将含有20mg淀粉。这提供了对不同患者群体剂量给药的必要的灵活性。优选地，在快速溶解的口服固体疫苗剂型中的淀粉的量的范围为约2重量％－约90重量％，更优选地约5重量％－约80重量％，和最优选地约7重量％－约75重量％。
不局限于一个理论，据信因为淀粉是由粒状结构的多颗粒组成，这增强了抗原到颗粒表面的进样或摄取，当所述淀粉被吸收入血流中时，所述抗原与其一起被吸收。因而相信淀粉在本发明中除了作为基质形成剂还具有功能性，例如其担当增强免疫反应的基质形成剂。除了改善抗原至人体的输送，据信淀粉通常辅助和改善蛋白和肽在人体中的吸收。
本文中所用的“增强免疫反应的”意指基质形成剂是本发明的快速溶解的口服固体疫苗剂型所达到的免疫反应的类型或程度的原因，至少是部份原因。
在优选的实施方式中，快速溶解的口服固体疫苗剂型还包含至少一种附加的基质形成剂。一种或多种附加的基质形成剂可以在冷冻之前加入溶液或悬浮液中以在生产过程中形成快速溶解的口服固体疫苗剂型。任何常规基质形成剂适合在本发明中用作附加的基质形成剂。适当的附加的基质形成剂包括但不限制于来自于动物或蔬菜蛋白的材料，例如凝胶、糊精和大豆、小麦和亚麻籽蛋白；树胶；多糖；藻酸盐；羧基甲基纤维素；角叉胶；葡聚糖；胶质；合成聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；聚肽/蛋白或多糖复合物例如凝胶-阿拉伯树胶复合物；糖例如甘露醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖和海藻糖；环状糖例如环式糊精；无机盐例如磷酸钠、氯化钠和硅酸铝；和具有2－12个碳原子的氨基酸例如甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸和L-苯丙氨酸、或其组合。至少一种附加的基质形成剂在快速溶解的口服固体疫苗剂型中存在的量的范围优选地为约10重量％－约98重量％，更优选地约20重量％－约95重量％，和最优选地约25重量％－约93重量％。至少一种附加的基质形成剂在随后冷冻以形成快速溶解的口服固体疫苗剂型的溶液或悬浮液中存在的量的范围为优选地约0.01重量％－约45重量％，更优选地约0.01重量％－约33重量％，和最优选地约0.01重量％－约21重量％。
除了形成基质，基质形成剂可辅助保持任何抗原制剂在溶液或悬浮液中的分散。这对于在水中不是充分可溶的因而必须悬浮而不是溶解的抗原制剂的情况是特别有用的。
在优选的实施方式中，所述至少一种附加的基质形成剂是甘露醇。然而在另一优选的实施方式中，所述至少一种附加的基质形成剂是凝胶。在另一优选的实施方式中，所述至少一种附加的基质形成剂包含甘露醇和凝胶，其与淀粉结合作为至少一种增强免疫反应的基质形成剂。
当存在时，甘露醇在快速溶解的口服固体疫苗剂型中的量的范围为优选地约2重量％－约90重量％，更优选地约5重量％－约80重量％，和最优选地约7重量％－约65重量％。当存在时，甘露醇在随后冷冻以形成快速溶解的口服固体疫苗剂型中的溶液或悬浮液中的量的范围为优选地约1重量％－约15重量％，更优选地约2重量％－约10重量％，和最优选地约2重量％－约5重量％。当存在时，凝胶在快速溶解的口服固体疫苗剂型中的量的范围为优选地约2重量％－约85重量％，更优选地约2.5重量％－约65重量％，和最优选地约3重量％－约55重量％。当存在时，凝胶在随后冷冻以形成快速溶解的口服固体疫苗剂型的溶液或悬浮液中的量的范围为优选地约1重量％－约10重量％，更优选地约1重量％－约7重量％，和最优选地约1重量％－约4重量％。
在本发明优选的实施方式中，在快速溶解的口服固体疫苗剂型中，凝胶以约3重量％－约55重量％的量存在；甘露醇以约7重量％－约65重量％的量存在；和淀粉以约7重量％－约75重量％的量存在。在本发明的优选的实施方式中，在随后冷冻以形成快速溶解的口服固体疫苗剂型的溶液或悬浮液中，凝胶以约1重量％－约4重量％的量存在；甘露醇以约2重量％－约5重量％的量存在；和淀粉以约2重量％－约8重量％的量存在。
在另一优选的实施方式中，所述至少一种附加的基质形成剂是树胶，例如但不限制于，金合欢胶、瓜尔树胶、琼脂、黄原胶、胞外多糖、鹿角菜胶、凝胶多糖、魔芋胶、角豆胶、维伦胶、胶黄芪、阿拉伯胶、刺梧桐树胶、印度树胶、果胶、葡聚糖、葡甘露聚糖、和藻酸盐、或其组合物。当存在时，在快速溶解的口服固体疫苗剂型中树胶的量优选地为约0.01重量％－约80重量％范围。当存在时，树胶在随后冷冻以形成快速溶解的口服固体疫苗剂型的溶液或悬浮液中的量优选地为约0.01重量％－约10重量％范围。在更优选的实施方式中，所述至少一种附加的基质形成剂是黄原胶。当存在时，黄原胶在快速溶解的口服固体疫苗剂型中的量优选地为约0.01重量％－约80重量％的范围。当存在时，黄原胶在随后冷冻以形成快速溶解的口服固体疫苗剂型的溶液或悬浮液中的量的范围优选地为约0.01重量％－约10重量％。当将黄原胶加入溶液或悬浮液时，关于IL-6和TNFalpha的免疫增强反应相对于不含有黄原胶的溶液或悬浮液可增加。
在优选的实施方式中，所述至少一种附加的基质形成剂包含甘露醇、凝胶和黄原胶。在本发明更进一步优选的实施方式中，在快速溶解的口服固体疫苗剂型中，凝胶以约3重量％－约55重量％的量存在；甘露醇以约7重量％－约65重量％的量存在；淀粉以约7重量％－约75重量％的量存在；和黄原胶以约0.01重量％－约80重量％的量存在。在本发明优选的实施方式中，在随后冷冻以形成快速溶解的口服固体疫苗剂型的溶液或悬浮液中，凝胶以约1重量％－约4重量％的量存在；甘露醇以约2重量％－约5重量％的量存在；淀粉以约2重量％－约8重量％的量存在；和黄原胶以约0.01重量％－约10重量％的量存在。
在本发明的另一实施方式中，所述快速溶解的口服固体疫苗剂型进一步包含表面活性剂。现有技术已知的任何表面活性剂适合用于本发明中，包括非离子的、阴离子的和阳离子的表面活性剂。可用于本发明的非离子的表面活性剂的例子包括但不限制于聚乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(例如吐温)、聚氧乙烯硬脂酸酯、失水山梨糖醇脂肪酸酯(例如斯潘)、和聚氧乙烯－聚氧丙烯共聚物(例如泊洛沙姆)。可用于本发明的阴离子的表面活性剂的例子包括但不限制于月桂基硫酸钠、丁二酸二辛基磺酸钠、和甘油单油酸盐。可用于本发明的阳离子的表面活性剂的例子包括但不限制于苯扎氯铵、西曲溴铵和西吡氯铵。优选地，表面活性剂选自含有吐温80、泊洛沙姆、及其组合。当存在时，表面活性剂在快速溶解的口服固体疫苗剂型中的量的范围优选地约0.01重量％－约80重量％。当存在时，表面活性剂在随后被冷冻以形成快速溶解的口服固体疫苗剂型的溶液或悬浮液中的量的范围优选地约0.01重量％－约10重量％。当将表面活性剂加入该溶液或悬浮液时，免疫增强反应相对于不含有表面活性剂的溶液或悬浮液可能增强。
在本发明优选的实施方式中，所述至少一种附加的基质形成剂包含甘露醇和凝胶，并且快速溶解的口服固体疫苗剂型进一步包含表面活性剂。在本发明进一步优选的实施方式中，在快速溶解的口服固体疫苗剂型中，凝胶以约3重量％－约55重量％的量存在；甘露醇以约7重量％－约65重量％的量存在；淀粉以约7重量％－约75重量％的量存在；和表面活性剂以约0.01重量％－约80重量％的量存在。在本发明优选的实施方式中，在随后被冷冻以形成快速溶解的口服固体疫苗剂型的溶液或悬浮液中，凝胶以约1重量％－约4重量％的量存在；甘露醇以约2重量％－约5重量％的量存在；淀粉以约2重量％－约8重量％的量存在；和表面活性剂以约0.01重量％－约10重量％的量存在。
本发明的剂型任选地进一步包含佐剂，其在增强对死的或灭活的疫苗的免疫反应中有用，因而产生增强的抗体生产和增强的免疫记忆。为了最有效，免疫反应与提供针对特定疾病的长期保护的记忆反应的产生联合。一旦暴露，免疫系统“记住”所述抗原和启动使该抗原失活的免疫反应。佐剂增强免疫反应的有效性可独立于其所结合的抗原。适合的佐剂包括但不限制于：无毒细菌碎片、霍乱毒素(和其解毒形式及其碎片)、壳聚糖、大肠杆菌的不耐热毒素(和其解毒形式及其碎片)、丙交酯/乙交酯均聚物和共聚物(lactide/glycolide homo.+-).(PLA/GA),聚酸酐、例如trimellitylimido-L-酪氨酸,DEAE-葡聚糖、缀合到膜蛋白抗原的皂角苷(抗原刺激复合物－ISCOMS)、细菌产品例如脂多糖(LPS)和胞壁酰二肽、(MDP)、脂质体、螺形体(cochleates)、类蛋白、细胞因子(白介素、干扰素)、基因工程的活微生物载体、没有感染力的百日咳突变体毒素、neurimidase/半乳糖氧化酶,和衍生自突变种的减毒的细菌和病毒毒素、及其组合。佐剂的适当的量可由本领域技术人员容易地确定。
本发明的剂型促进疫苗输送至靶部位，并且，在一些实施方式中，可设计粘膜黏合(mucoadhesive)系统以保持疫苗在口腔里与目标黏膜淋巴组织接触和增加疫苗成分在这些潜在吸收表面的停留时间。作为口服摄取的产品，一旦服下所述产品，疫苗从中快速释放，高浓度的疫苗因而能很快地输送到所需的靶部位。
一些快速溶解固体剂型是固有地粘膜黏合的。然而可将粘膜黏合剂任选地加入本发明的快速溶解剂型中，其可增加抗原与口腔中黏膜组织接触的停留时间。可用于本发明的适当的粘膜黏合剂包括但不限制于在欧洲专利申请92109080.9中描述的那些，并包括：聚丙烯酸的聚合物如卡波姆和卡波姆衍生物(如聚卡波菲TM、卡巴普TM等)；纤维素衍生物例如羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基纤维素(HPC)和羧甲基纤维素钠(NaCPC)；和天然聚合物例如凝胶、藻酸钠、和果胶。有代表性的粘膜黏合剂(生物黏合剂)聚合物的适当的商业来源包括，但不限制于：卡巴普TM丙烯酸的共聚物(可购自BF GoodrichChemical Co.,Cleveland,Ohio)；羟丙基甲基纤维素(HPMC)(可购自Dow Chemical,Midland,Mich.)；HEC(纤维素羟乙基醚)(可购自Hercules Inc.,Wilmington,Del.)；HPC(KlucelTM)(可购自Dow Chemical Co.,Midland,Mich.)；MaCMC(可购自Hercules,Inc.,Wilmington,Del.)；凝胶(可购自Deamo Chemical Corp.,Elmford,N.Y.)；藻酸钠(可购自Edward Mandell Co.,Inc.,Carmel,N.Y.)；果胶(可购自BDH Chemicals Ltd.,Poole,Dorset,UK)；聚卡波菲TM(可购自BF Goodrich Chemical Co.,Cleveland,Ohio)。本领域技术人员可容易地确定粘膜黏合剂的适当的量。
本发明的快速溶解的口服固体疫苗剂型还可含有其它任选的成分，例如防腐剂、抗氧化剂、粘度强化剂、着色剂、调味剂、pH改性剂、甜味剂、掩味剂(taste-masking agent)及其组合。适当的着色剂包括但不限于红色、黑色和黄色铁氧化物和可购自Ellis&Everard的FD&C染料如FD&C蓝色2号和FD&C红色40号。适当的调味剂包括但不限于薄荷、树莓、欧亚甘草、橘子、柠檬、柚子、焦糖、香草、樱桃和葡萄风味，及其组合。适当的pH改性剂包括但不限于柠檬酸、酒石酸、磷酸、盐酸、马来酸、氢氧化钠、碳酸钠和tris-缓冲液。适当的甜味剂包括但不限于阿司巴坦、蔗糖、三氯蔗糖、乙酰舒泛K和索马甜。适当的掩味剂包括但不限于重碳酸钠和包含环糊精的化合物。本领域技术人员可容易地确定包含在本发明快速溶解的口服固体疫苗剂型中的这些任选的成分的适当的量。
在本发明的某一实施方式中，所述快速溶解的口服固体疫苗剂型可任选包含可生物降解的微球体。所述微球体材料本身可用作佐剂或与其它佐剂结合使用。抗原制剂可吸收或混合到微球体上或进入微球体，从而形成微球体－抗原复合物。因而，一旦组织与微球体－抗原制剂复合物接触，所述抗原制剂可以有效地吸收进入淋巴组织。
可与本发明一起使用的适当的微球体材料包括可生物降解的聚合材料。特别适合的是疏水性材料如聚(乳酸)和聚丙交酯乙交酯共聚物(poly(lactide-co-glycide))和胶乳共聚物。这些聚合材料也赋予对酶和水解消化的抗性直至它们吸收进淋巴组织，其中释放的抗原可发挥其免疫原性作用。优选的聚合材料是增强进入靶组织的吸收的疏水性材料。在优选的实施方式中，所述微球体是藻酸钠或聚丙交酯乙交酯共聚物(PLGA)。
当第一实施方式的快速溶解的口服固体疫苗剂型给药至需要疾病防御的患者(人或动物)口腔时，免疫反应被诱导。免疫反应包括从其中获得剂型中抗原的病原体的特异性抗体的生产、适当的T细胞抗体的产生和一些情况下细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的生产。免疫反应也可包括对特定疾病提供长期保护的记忆反应的产生。
在本发明中，快速溶解的口服固体疫苗剂型的放置优选地在舌上或舌下(舌下的)或在颊或咽区。
本发明的快速溶解的口服固体疫苗剂型可无水地服用和分散在非常小体积的唾液中服用。这增加了含有扁桃体关联的淋巴组织的黏膜组织上的覆盖和增加了在这些组织中抗原的停留时间。已知快速溶解口服固体剂型会快速分散和覆盖口和咽中的黏膜表面，其为黏膜关联的淋巴组织局限处。关于此，可提及参考文献Wilson等的文章，International Journal of Pharmaceutics,40(1997),119-123页，其正文合并入本文中。因此，快速溶解的口服固体剂型改进在口中，特别是舌下，和在咽中的疫苗到易受影响的淋巴组织的靶向。因而，当通过FDDF输送时，与这些组织，例如在颊咽区和舌下区易受影响的淋巴组织的接触的疫苗浓度增大。
生产快速溶解剂型的任何已知方法可依照本发明使用。优选地本发明快速溶解的口服固体疫苗剂型是冻干的。本发明使用的优选的快速溶解剂型在英国专利1548022中有所描述，其涉及包含活性成分网络和可水溶的或可水分散的对活性成分惰性的载体的固体快速溶解固体口服剂型，通过从含有活性成分和溶剂中的载体溶液的组合物中升华溶剂获得该网络。英国专利号1548022没有公开在冻干的FDDF中使用淀粉，但其中的方法可容易地调整以制备出本发明快速溶解的口服固体疫苗剂型。
快速溶解的口服固体疫苗剂型典型地是经配制以在口中快速崩解的白色、圆形片剂。但是，取决于其中使用的材料或添加的着色剂，其颜色可能改变。片剂尺寸一般约5mm－约25mm，并根据其在生产和/或储存中将放入的泡罩腔的尺寸和形状来成形。所述片剂包含高度多孔的网络，其协助崩解，典型地在放入口腔内的60秒内，更优选地在30秒内，仍更优选地在10秒内，和最优选地在5秒内崩解。片剂应是实体结实的以经受住处理和从泡罩包装中取出而不破裂。
在第二实施方式中，快速溶解的口服固体疫苗剂型包含：(a)产生免疫的量的灭活的流感病毒；和(b)至少一种增强免疫反应的基质形成剂，其中所述至少一种增强免疫反应的基质形成剂是淀粉。
任何流感病毒株是适用于本发明的。在流感病毒疫苗生产中，国际组织，例如世界卫生组织，监控引起疾病的病毒株并每年提供需要接种的最重要的病毒株的特定信息。因为在流感病毒表面关键抗原的持续突变，新病毒株不断被监控并生产新疫苗。制备所鉴别的流感病毒株的样品，使得疫苗生产者可用以制备疫苗。病毒通常根据已知的标准方法制备以在疫苗中使用，例如抗原制剂。灭活的流感病毒可以产生免疫的量被包含在本发明的快速溶解的口服固体疫苗剂型中。典型地，所加入的病毒的量由动物中的免疫研究来确立，其中通过测定如血凝抑制试验(HAI)得知的功能性抗体水平达到疫苗管理者同意的所需要的水平。
上文中关于产生免疫的量，淀粉、基质形成剂、表面活性剂、微球体、佐剂、粘膜黏合剂等的细节，在本发明的第二实施方式中和在本发明的第一实施方式中相同。
当第二实施方式的快速溶解的口服固体疫苗剂型给药至需要防御流感病毒的患者(人或动物)口腔中时，诱导了流感特异性抗体反应。通过评估抗体反应的功能能力的HAI或病毒中和测试(VNT)，测量该抗体反应中和病毒感染哺乳动物细胞的能力。抗流感免疫反应的其它需要的方面包括记忆B和T细胞反应的产生和能够杀死病毒感染的细胞的CTL的出现。大多数疫苗现阶段通常只评价其刺激抗体反应的能力。但是，可能通过增强新疫苗产生CTL的能力来获得产生能够赋予交叉－流感株(cross-influenza strain)保护性免疫的疫苗的能力。快速溶解的口服固体疫苗剂型的放置优选地在舌之上或舌之下(舌下的)或在颊或咽区。
本发明的第三实施方式涉及在患者中诱导免疫反应的方法，所述方法包括步骤：将本发明第一实施方式的快速溶解的口服固体疫苗剂型放置入需要所述免疫反应的人的口腔中。优选地，口腔中的放置是放在舌之上或舌之下(舌下的)或在颊或咽区。
在本发明优选的实施方式中，将快速溶解的口服固体疫苗剂型给药以诱导免疫反应，所述免疫反应比阴性对照强和比给药不含有作为增强免疫反应的基质形成剂的淀粉的FDDF强。“阴性对照”在本文指并没有用灭活的病毒处理过的和未被病毒感染的用于实验的动物。
本发明的第四实施方式涉及在患者中诱导流感特异性IgG反应的方法，所述方法包括步骤：将本发明第二实施方式的快速溶解的口服固体疫苗剂型放置入需要所述免疫反应的人口腔。优选地，口腔中的放置是放在舌之上或舌之下(舌下的)或在颊或咽区。
本发明不限制于任何特异性疫苗，而是解决口服输送疫苗的问题。下列实施例将阐明本发明在一些优选的实施方式中的实践。对于本领域技术人员，在权利要求范围内的其它实施方式是显而易见的。
实施例1
制备现有技术中已知的如Seager,H.,“Drug-Delivery Products and Zydis FastDissolving dosing form,”J.Pharm.Pharmacol,第50卷,第375-382页(1998)中所述的FDDF种类，但含有凝胶、甘露醇和淀粉。制成新型基质制剂：结合1.5％(375mg)牛石灰鞣革(Bovine limed hide)凝胶、2.5％(625mg)羟丙基淀粉、3.0％(750mg)甘露醇和25ml水，加热所述混合物至75℃15分钟。在加热时盖上溶液使蒸发最小化。随后将溶液在冷却水浴中冷却至室温，例如20-25℃。将5.5μl流感病毒(A/Panama/2007/99 H3N2)原液加到24.5μl新型基质制剂中，使得各片剂含有1μg流感病毒。在加入流感病毒原液后，基质形成剂在制剂中的最终浓度如下：2.0％淀粉(w/v)、2.4％甘露醇(w/v)和1.2％凝胶(w/v)。然后使用分配30mg每剂的半自动化Hamilton定量给料泵将制剂定量给料到泡罩袋中。然后将定量的制剂通过放置在液氮室内5分钟快速冷冻。随后使用与Edwards RV5泵相连的Edwards Modulyo4K冻干机将冷冻的制剂冻干。首先，运行冻干机15分钟时间段以预冷系统到-45℃。将冷冻的制剂立即转移到冻干机室内的架子上。将盖子置于室上，并开启真空泵以确保排水阀关闭。让冻干机过夜运行以完全地冻干样品。一旦干燥，关闭真空泵和冷凝器并缓慢旋转排水龙头以让空气进入系统中。然后移除填充了的完全冷冻的泡罩包装并放置入箔小袋中并密封在含有干燥剂的玻璃罐中，储存在4℃直至使用。
视觉观察冻干的片剂；没有发现大缺陷。片剂都完整无缺并看起来正常，除了微微凸起。放入37℃的纯化水中，片剂立即在10秒内崩解。
将所得的片剂对小鼠舌下给药，随后在14、28和59天测试血样。进行亚类ELISA以评定在收集自被处理的动物血清样品中的流感特异性IgG1和IgG2a水平。稀释样品，以获得最高浓度1：40。然后在96孔板上用含牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液(PBS/BSA)(1％)进行样品的2倍系列稀释。辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的检测抗体，山羊抗小鼠IgG1和IgG2a(Fc)：HRP缀合物(都来自AbD Serotec)在PBS/BSA中以1：1000稀释。将来自未处理的和未感染的动物的血清作为阴性对照。在如下图1中以“Zydis+流感s.l.(新型基质)”显示结果。
对比实施例1
根据通常已知的片剂的制备来准备FDDF。通过结合200mg凝胶和3.3ml水并加热所述混合物到60℃30分钟来制备片剂。在加热时盖上溶液使蒸发最小化。随后将溶液在冷却水浴中冷却至约25℃。在这之后，边搅拌边加入150mg甘露醇。将流感抗原A/Panama/2007/99 H3N2原液加入使体积变为5ml，从而各片剂含有1μg流感病毒。在加入流感病毒后，基质形成剂的最终浓度为4％凝胶(w/v)和3％甘露醇(w/v)。将制剂在与实施例1一样的条件下加工，即溶解、冷却、冰冻、冻干。冻干的片剂以与实施例1中一样的方式进行检查。检查冻干片剂的表面缺陷；没有发现大缺陷，片剂完整无缺。对片剂进行分散试验(通过将片剂放置在100μl、37℃的纯化水中)，其在少于10秒之内溶解。
根据该方法制备两批片剂。将第一批所得的片剂对小鼠舌下给药，而来自第二批的10片剂溶解在2ml温热至37℃的水中，并每动物200μl胃内(i.g.)给药。随后测试在14、28和59天来自各组的小鼠的血样。进行ELISA亚类以评定在收集自被处理的动物的血清样品中的流感特异性IgG1和IgG2a水平。稀释样品，以获得最高浓度1：40。然后在96孔板上用含牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液(PBS/BSA)(1％)进行样品的2倍系列稀释。HRP缀合的检测抗体，山羊抗小鼠IgG1和IgG2a(Fc)：HRP缀合物(都来自AbD Serotec)在PBS/BSA中以1：1000稀释。来自未处理的和未感染的动物的血清作为阴性对照。在如下图1中分别以“Zydis+流感s.l.”和以“Zydis+流感i.g.,”显示结果。
对比实施例2
根据对比实施例1制备FDDF，除了定量给料到泡罩袋之前，将藻酸钠微胶囊封装的A/Panama/2007/99 H3N2流感病毒加入制剂中使得各片剂包含1μg流感。为了达到该最终量，将3微胶囊封装的流感珠加入每片剂中。随后在与实施例1一样的条件下处理溶液，即溶解、冷却、冰冻、冻干。冻干的片剂以实施例1中一样的方式进行检查。
检查冻干片剂的表面缺陷；没有发现大缺陷。对片剂进行分散试验(通过将片剂放置在100μl、37℃的纯化水中)，其在少于10秒之内溶解。
将所得的片剂对小鼠舌下给药，随后在14和28天测试血样。进行亚类ELISA以评定在收集自被处理的动物的血清样品中的流感特异性IgG1和IgG2a水平。稀释样品，以获得最高浓度1：40。然后在96孔板上用含牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液(PBS/BSA)(1％)进行样品的2倍系列稀释。HRP-缀合的检测抗体，山羊抗小鼠IgG1和IgG2a(Fc)：HRP缀合物(都来自AbDSerotec)在PBS/BSA中以1：1000稀释。将来自未处理的和未感染的动物的血清作为阴性对照。在如下图1中以“Zydis+流感s.l.(藻酸盐珠)”显示结果。
对比实施例3
根据对比实施例1制备FDDF，除了定量给料到泡罩袋之前，将PLGA微胶囊封装的A/Panama/2007/99 H3N2流感病毒加入制剂中使得各片剂包含1μg流感病毒。为了达到该最终量，向20μl的FDDF混合物中加入总共10μl的PLGA珠以达到每片剂10μl微胶囊封装的流感病毒珠的量。随后在与实施例2一样的条件下处理溶液，即溶解、冷却、冰冻、冻干。冻干的片剂以实施例1中一样的方式进行检查。
检查冻干片剂的表面缺陷；在所制备的FDDF上没有发现大缺陷。对片剂进行分散试验(通过将片剂放置在100μl、37℃的纯化水中)，其在少于10秒之内溶解。
将所得的片剂对小鼠舌下给药，随后在14、28和59天测试血样。进行亚类ELISA以评定在收集自被处理的动物的血清样品中的流感特异性IgG1和IgG2a水平。稀释样品，以获得最高浓度1：40。然后96孔板上用含牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液(PBS/BSA)(1％)进行样品的2倍系列稀释。HRP-缀合的检测抗体，山羊抗小鼠IgG1和IgG2a(Fc)：HRP缀合物(都来自AbD Serotec)在PBS/BSA中以1：1000稀释。来自未处理的和未感染的动物的血清作为阴性对照。在如下图1中以“Zydis+流感s.l.(PLGA珠)”显示结果。
实施例2
如上实施例所证实，制剂是舌下输送后刺激对抗原(Ag)的全身抗体反应的有效途径。所得到的免疫反应性质取决于制剂，并包括中和抗体的高反应。这对于中和在体循环中出现的细胞外病毒/细菌毒素和抗原是重要的。实施例1的制剂也能够推动抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)的增殖，其是中和细胞内感染的重要的细胞介导的免疫反应。进行其它的工作以进一步提高制剂所获得的细胞介导反应。
在这些初步研究之后，使用培养液中的鼠科脾脏巨噬细胞和流式细胞计数进行了另外的体外研究以确定它们的活化和分子表达水平，这对介导T细胞活化很重要。对于体外研究，脂多糖(LPS)是已知的这些因子中大多数的有效刺激物，被用作阳性对照。如下表1所示制备制剂以用于使用鼠科脾脏巨噬细胞的体外研究。
*在50℃加工。所有其它制剂均在70℃加工。
如下制备制剂。制备浓度为3.94mg/ml的流感抗原的原液。分别配制如上所列的各制剂的基质浓度。然后结合适当量的流感抗原原液和制剂基质浓度以得到最终体积500μl的最终制剂溶液。从该最终混合的制剂溶液，分配30mg整分试样，冷冻和冻干以得到含有1μg或15μg的流感抗原的片剂。表2总结了该制备。
表2
通过在一定量的水中溶解适当量的各组分制备基质浓缩液。适当量的基质浓缩液，当与所需量的抗原原液结合时，得到基质成分在最终混合的制剂溶液中与上面所列值一致的水平。例如，对制剂1，表3示范了基质浓缩液和在最终制剂中的重量百分比的关系。
表3
从正常成年BALB/c小鼠中分离脾细胞，清洗，然后使用固定在Midi/MACSTM分离器的场中的LS柱通过MACS分离纯化CD11b+巨噬细胞。将巨噬细胞清洗，并在组织培养基中培养。在培养中设置为每测试孔1.8x 105CD11b+细胞。以终浓度100ng/ml加入LPS作为阳性对照。将12制剂的每一个片剂溶解在组织培养基中并在三个重复样品间分配。也制备既不含有LPS也不含有所列制剂之一的未刺激对照。48小时之后，收获培养物并移除上清分析细胞因子。将细胞清洗，并在用抗体着色主要组织相容性复合物(MHC)II类、CD25和CD86后，使用流式细胞计数评估巨噬细胞活化。
测试
A体外测试
对抗原激发的T细胞和抗体反应的性质通过活化状态和因抗原接触由单核细胞/巨噬细胞/树突细胞产生的细胞因子指示。佐剂和输送载体利用这些反应以驱动特定类型的T和B细胞反应。例如这些细胞对IL-12的刺激是与促进Th1免疫反应相关的主要决定因素，Th1免疫反应由补体结合性抗体、噬菌细胞活化和CTL的产生表征。IL-4是Th2反应的主要动力，而IL-6和TGFbeta是黏膜IgA反应的主要动力。
测量作为活化巨噬细胞的水平和类型指示的多种标记物。另外，评估它们生产的作为其可能促进的免疫反应类型指示剂的主要细胞因子。
1、MHCII类
上调II类MHC是增强抗原呈递以驱动对抗原的T细胞反应的必要步骤。上调是激活或增加特定反应的速率或程度的过程。
一旦巨噬细胞通过吞噬作用、内吞作用或大胞饮作用(macropinocytosis)吞入抗原(Ag)，Ag被分解为较小的肽片段。然后这些片段结合至MHC，其移动至细胞表面并“呈递”所述抗原给T细胞。该抗原呈递是驱动免疫反应的必要步骤。因而，增加巨噬细胞上MHCII类的水平的能力是增强的抗原呈递能力的预兆。
图2中的数据显示所有制剂(除了F9)增强了MHCII类的表达，产生了比未刺激的对照显著高水平的平均荧光强度和与阳性对照(LPS)相比良好的水平。
2、CD25
CD25是IL-2的受体的一部分。该分子的上调是对指示提高的活化状态和作为抗原呈递细胞的准备的活化刺激的敏锐反应。
一旦呈递给未接触抗原的T细胞，某些共刺激因素和细胞因子影响T细胞分化和增殖。如图3中所示，所有制剂比未刺激对照展示出更大反应和与阳性对照(LPS)相当的反应。制剂6(含有吐温80)和制剂7(含有泊洛沙姆188)显示出比阳性对照增强的反应。
3、CD86
CD86是影响辅助T细胞和细胞毒性T细胞(对细胞介导免疫是必要的)的共刺激(costimulatory)的因子。CD86提供重要的活化辅助和细胞毒性T细胞反应所需的第二信号。其通常以很低的水平表达在静止抗原呈递细胞上，并且其上调是使得这种细胞有效地与T细胞相互作用以产生免疫反应的重要事件。
如图4中所示，除了在50℃加工的那些(制剂5、10、11、12)和含有卵磷脂的制剂(制剂9)，所有制剂能够刺激增强的CD86表达，提供了与阳性对照相比良好的反应。
4、细胞因子性质
细胞因子性质评价细胞因子反应，其在刺激和影响T细胞反应特性中是关键的。.
数据证明了淀粉基制剂的免疫增强性能和驱动T细胞反应的性能，例如T细胞的刺激和增殖(增加的数目)。
TNFalpha和IL12p40(作为IL-12的量度)的存在在驱动Th1和细胞毒性T细胞反应中是重要的，而IL-4有利于T细胞分化为主要作用是刺激抗体生产的Th2细胞。IL-6与产生Th17反应和促进B细胞的抗体生产均有关，Th17反应与的一方面的促进嗜中性粒细胞活化有关，其在介导某些疾病的防御方面很重要。IL-10具有向下调节(down regulation)其它免疫反应的能力。向下调节是减小反应的活化或活化速率或程度的过程。
如图5中所示，与未刺激的对照相比，所有制剂表现出在反应中显著增加的IL-6、TNFalpha和IL-12p40。含有最低水平的Ag(1μg)和淀粉(2.0％)的制剂1表现出在IL-6和TNFalpha方面的最低反应，虽然IL-12p40的水平与其它制剂的相当或更高。
如在制剂2中，仅增加Ag水平，而保持低水平的淀粉(2％)，导致IL-6和TNFalpha的增加，但IL-12p40反应相对低。
如在制剂3中，增加淀粉水平，保持低水平的抗原，增加了IL-6和TNFalpha，并得到与制剂1相当的IL-12p40反应。这证实了淀粉的免疫增强性质。制剂1至9含羟丙基淀粉，而制剂10含玉米淀粉，制剂11含蜡质玉米淀粉和制剂12含米淀粉。该数据显示淀粉的不同来源能发挥相同的免疫增强作用。
如在制剂4中，增加抗原和淀粉的水平，显示出出乎意料地良好的增强的关于IL-6、TNFalpha和IL-12p40的反应。
制剂8含黄原胶，关于IL-6和TNFalpha，比其它制剂展示出更强的反应。
所有制剂展示出低水平的IL-4。在免疫反应中很早出现IL-4，使其倾向偏离Th1和CTL反应。因而，低水平的IL-4在建立CTL反应方面是有利的。IL-4对于提供针对Th2细胞产生的刺激物是重要的，Th2细胞又对于促进抗体反应是重要的。低水平的IL-4对于该目的是充分的，并且已知其它细胞类型有助于其生产。
所有制剂展示出相对于未刺激的对照较高水平的IL-10。IL-10能向下调节CTL反应和有助于Th2反应。但是阳性对照LPS也展示出高水平的IL-10，而其已知是抗原呈递细胞的有效活化剂。
B、体内测试
1、实施例1和对比实施例1-3的测试
在14、28和59天从小鼠中取得的血样中研究流感特异性IgG在给药五种制剂之一的各动物组和未处理的动物组(阴性对照)中的存在。图1中的图表显示了在使用不同制剂的1、2和3次免疫后，针对流感病毒的抗体水平。所有图表显示组平均终点效价(EPT)+/-SEM(n＝8每组)。
如图1中所示，含有实施例1的新型基质制剂的制剂在14、28和59天展示出比所有对比实施例和未处理的小鼠较高的EPT值。用新型基质片剂加1μg流感处理的组是在14和28天表现出在背景之上的抗体反应的唯一动物。进一步，随着增加的免疫，该反应的终点效价(EPT)从14天到28天到59天增加。
2、实施例2的测试
基于实施例2中所示的使用巨噬细胞培养液的体外研究的结果，为小鼠的体内激发研究选择某些制剂。选择的制剂是：F8(含黄原胶)；F7(含泊洛沙姆188)；F10(含玉米淀粉)；F4(含HP淀粉)；和F12(含米淀粉)。
将五组雌性BALB/c小鼠在0、10和20天用表1所示的测试制剂免疫。在第27天，将动物取血进行血清分析，然后接受用a/Puerto Rico/8/34(PR8)H1N1流感病毒的50μl鼻内(i.n.)激发。对动物的感染症状进行监控7天和根据确认的评分系统进行评分。表4显示了制剂的给药进度表。
表4
小鼠组 制剂 给药频率
1 F8 在0、10和20天，一次
2 F7 在0、10和20天，一次
3 F10 在0、10和20天，一次
4 F4 在0、10和20天，一次
5 F12 在0、10和20天，一次
结果
在激发之后，监控各组小鼠的体重7天。结果呈现在图6中。
H1N1 PR8感染的没有免疫的动物(感染对照)从感染后3天开始很快体重减轻，至第6天达到内政部(HO)同意的终点，体重减轻20％。用含有流感抗原的制剂之一免疫的所有动物显示出减少的体重减轻。特别地，接受制剂8、7和4中的抗原的动物显示出显著减少的体重减轻(分别P<0.001，P<0.01和P<0.05，根据单向ANOVA和Bonferroni’s多重比较测试)。
为了比较疾病的程度，将动物按以下各参数评分为0、0.5或1(分别是无临床症状、轻微临床症状和中等临床症状)，给出的可能最高分为5；
竖毛
驼姿势
不稳定的呼吸
受影响的活动性
流分泌物的眼睛
分数相对感染后天数时间制图并示于图7中。根据体重减轻数据，所有制剂表现得比感染的未免疫对照好。临床症状分数也显示出与只受感染的相比接受制剂8、7和4的组之间的严重性显著的减少，一直到感染后第6天(分别P<0.01和P<0.05)。
由于体重减轻和临床疾病的发作，几只动物达到内政部(HO)人道终点，在第七天之前和在第六天必须终止。图8显示了在用5个制剂之一免疫和用H1N1病毒感染后第7天的存活率。可以看出50％的用制剂10处理的动物、70％的用制剂4处理的动物、和60％的用制剂12处理的动物存活到第7天。只有一只用制剂8处理的动物必须在第6天终止并且接受制剂7的没有必须在第6天终止的。
将来自第27天取的血的血清样品用ELISA分析，使用杀死的流感病毒作为捕捉抗原和任一小鼠IgG、IgG1或IgG2a作为检测抗体。在图9、10和11中显示结果。用每一所选制剂的处理展示了IgG1和IgG2a抗体反应。用制剂8对动物的处理与其它处理组，制剂7、10、4和12相比刺激了显著高的抗H1N1抗体效价，导致高IgG效价(P<0.01)，特别是IgG2a同种型(P<0.001)(当通过单向ANOVA和Benferonni’s多重比较测试比较)。所述数据支持上面报导的临床发现(例如体重、临床症状分数和存活率)，证实所选的制剂能够引起适当的和保护性的免疫反应。
图12显示得自体内激发研究终点的鼻洗液的IgA反应。在此时，终止小鼠和对鼻洗液分析IgA，作为黏膜抗体反应的指示。结果证明所有制剂能够刺激黏膜反应，制剂8和12给出最高平均效价值。
因而，为生产口服疫苗FDDF，含有淀粉作为增强免疫反应的基质形成剂的制剂具有诸多优点。所得FDDF具有出乎意料的技术优势，其对细菌和病毒感染增强免疫反应，这在现有技术中是未知的或未被启示的。
本文公开的优选的实施方式的多种变更、改造和变化对本领域技术人员是显而易见的，并且这些都被预见和预期为在要求保护的发明思想和范围之内。例如，尽管详细描述了具体实施方式，本领域技术人员将理解前述实施方式及其变更可以改变以结合不同类型的替代的、附加的或可选的材料。因此，虽然在本文中描述的只有少数本发明的变种，应理解其额外改造和变化和等同物的实践在以下权利要求所定义的本发明的思想和范围之内。本文引用的所有专利申请、专利和其它出版物其全部内容将合并入本文。

Claims (46)

1.快速溶解的口服固体疫苗剂型，其包含：
(a)产生免疫的量的抗原制剂；
(b)至少一种增强免疫反应的基质形成剂；和
(c)至少一种附加的基质形成剂，
其中所述至少一种增强免疫反应的基质形成剂是在至少约70℃的温度下加工的淀粉，
其中，所述淀粉的量是约5重量％至约80重量％，
其中所述至少一种附加的基质形成剂选自由甘露醇、凝胶、或甘露醇与凝胶的组合组成的组，
其中，当存在时，所述凝胶的量是约2.5重量％至约65重量％，所述甘露醇的量是约5重量％至约80重量％，和
其中所述剂型有助于所述抗原制剂中抗原的口腔摄取。
2.如权利要求1所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中所述淀粉选自天然淀粉、改性淀粉及其组合。
3.如权利要求1所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中所述剂型在放置入口腔之后60秒内崩解。
4.如权利要求3所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中所述剂型放置入口腔30秒内崩解。
5.如权利要求4所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中所述剂型放置入口腔10秒内崩解。
6.如权利要求5所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中所述剂型放置入口腔5秒内崩解。
7.如权利要求1所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其通过冻干制备。
8.如权利要求1所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中所述至少一种附加的基质形成剂是甘露醇。
9.如权利要求1所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中所述至少一种附加的基质形成剂是凝胶。
10.如权利要求1所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中所述至少一种附加的基质形成剂包含凝胶和甘露醇。
11.如权利要求1所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中所述淀粉以约7重量％至约75重量％的量存在。
12.如权利要求1所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中所述凝胶以约3重量％－约55重量％的量存在；所述甘露醇以约7重量％－约65重量％的量存在；和所述淀粉以约7重量％－约75重量％的量存在。
13.如权利要求1所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中所述至少一种附加的基质形成剂进一步包含树胶。
14.如权利要求13所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中所述树胶是黄原胶。
15.如权利要求1所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其进一步包含表面活性剂。
16.如权利要求15所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中所述表面活性剂选自吐温80和泊洛沙姆。
17.如权利要求1所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其进一步包含佐剂。
18.如权利要求1所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其进一步包含粘膜黏合剂。
19.如权利要求1所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中当通过对患者放置入口腔给药时诱导免疫反应。
20.如权利要求19所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中放置入口腔是放置在舌之上或舌之下或在颊或咽区。
21.快速溶解的口服固体疫苗剂型，其包含
(a)产生免疫的量的灭活的流感病毒；
(b)至少一种增强免疫反应的基质形成剂；和
(c)至少一种附加的基质形成剂，
其中所述至少一种增强免疫反应的基质形成剂是在至少约70℃的温度下加工的淀粉，
其中所述淀粉的量是约5重量％至约80重量％，
其中所述至少一种附加的基质形成剂选自由甘露醇、凝胶、或甘露醇与凝胶的组合组成的组，
其中，当存在时，所述凝胶的量是约2.5重量％至约65重量％，所述甘露醇的量是约5重量％至约80重量％，和
其中所述剂型有助于灭活的流感病毒的口腔摄取。
22.如权利要求21所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中所述淀粉选自天然淀粉、改性淀粉及其组合。
23.如权利要求21所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中所述剂型在放置入口腔之后60秒内崩解。
24.如权利要求23所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中所述剂型放置入口腔30秒内崩解。
25.如权利要求24所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中所述剂型放置入口腔10秒内崩解。
26.如权利要求25所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中所述剂型放置入口腔5秒内崩解。
27.如权利要求21所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其通过冻干制备。
28.如权利要求21所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中所述至少一种附加的基质形成剂是甘露醇。
29.如权利要求21所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中所述至少一种附加的基质形成剂是凝胶。
30.如权利要求21所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中所述至少一种附加的基质形成剂包含凝胶和甘露醇。
31.如权利要求30所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中所述淀粉以约7重量％至约75重量％的量存在。
32.如权利要求31所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中所述凝胶以约3重量％－约55重量％的量存在；所述甘露醇以约7重量％－约65重量％的量存在；和所述淀粉以约7重量％－约75重量％的量存在。
33.如权利要求21所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中所述至少一种附加的基质形成剂进一步包含树胶。
34.如权利要求33所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中所述树胶是黄原胶。
35.如权利要求21所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其进一步包含表面活性剂。
36.如权利要求35所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中所述表面活性剂选自吐温80和泊洛沙姆。
37.如权利要求21所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其进一步包含佐剂。
38.如权利要求21所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其进一步包含粘膜黏合剂。
39.如权利要求21所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中当通过放置入口腔给药至患者时诱导流感特异性IgG反应。
40.如权利要求39所述的快速溶解的口服固体疫苗剂型，其中放置入口腔是放置在舌之上或舌之下或在颊或咽区。
41.在患者中诱导免疫反应的方法，所述方法包括以下步骤：
将权利要求1的快速溶解的口服固体疫苗剂型放置于需要所述免疫反应的人的口腔内。
42.根据权利要求41所述的在患者中诱导免疫反应的方法，其中，放置入口腔内是放置在舌之上或舌之下或在颊或咽区。
43.在患者中诱导流感特异性抗体反应的方法，所述方法包括以下步骤：
将权利要求21的快速溶解的口服固体疫苗剂型放置于需要所述流感特异性抗体反应的人的口腔内。
44.根据权利要求43所述的在患者中诱导流感特异性抗体反应的方法，其中，放置入口腔内是放置在舌之上或舌之下或在颊或咽区。
45.根据权利要求43所述的在患者中诱导流感特异性抗体反应的方法，其中，所述流感特异性抗体反应是IgG反应。
46.快速溶解的口服固体疫苗剂型，其包含：
(a)产生免疫的量的抗原制剂；
(b)至少一种增强免疫反应的基质形成剂；和
(c)至少一种附加的基质形成剂，
其中所述至少一种增强免疫反应的基质形成剂是在至少约70-75℃的温度下加工的淀粉，
其中，所述淀粉的量是约5重量％至约80重量％，
其中所述至少一种附加的基质形成剂选自由甘露醇、凝胶、或甘露醇与凝胶的组合组成的组，
其中，当存在时，所述凝胶是哺乳动物凝胶，
其中，当存在时，所述凝胶的量是约2.5重量％至约65重量％，所述甘露醇的量是约5重量％至约80重量％，和
其中所述剂型有助于所述抗原制剂中抗原的口腔摄取。
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