BR112013003179A2

BR112013003179A2 - método indústrial de produção de uma preparação de lectina a partir de sementes de feijão e aditivo alimantar para suínos obtidos a partir de sementes de feijão

Info

Publication number: BR112013003179A2
Application number: BR112013003179-4A
Authority: BR
Inventors: Pawel MICHALOWSKI
Original assignee: BIOLEK Sp. z.o.o.
Priority date: 2010-08-12
Filing date: 2010-08-12
Publication date: 2020-08-04
Also published as: US20140050839A1; CN103068263A; WO2012021076A2; WO2012021076A3

Abstract

MÉTODO INDUSTRIAL DE PRODUÇÃO DE UMA PREPARACÃO DE LECTINA A PARTIR DE SEMENTES DE FEIJÃO E ADITIVO ALIMENTAR PARA SUÍNOS OBTIDO A PARTIR DE SEMENTES DE FEIJÃO Um método de produção industrial de uma preparação de lectina a partir de sementes de feijão, em que uma fração da lectina é extraída a partir de sementes de feijão em um sistema de extração que contém ácido acético, um antioxidante, bem como, um ácido orgânico altamente volátil ou seu sal, em uma temperatura reduzida e, substancialmente sem mistura e, subsequentemente, após a concentração, de preferência, nas membranas, a fração PHA resultante é suplementada com um conservante pouco volátil e é seca por spray drying, resultando numa preparação de lectina com uma atividade de lectina não inferior a 128 HU/ 100 mg da preparação, com um nível reduzido de substâncias de estabilidade.

Description

"MÉTODO INDUSTRIAL DE PRODUÇÃO DE UMA PREPARAÇÃO DE LECTINA A PARTIR DE SEMENTES DE FEIJÃO E ADITIVO

ALIMENTAR PARA SUÍNOS OBTIDO A PARTIR DE SEMENTES DE FEIJÃO" "CAMPO DA INVENÇÃO" O objeto da presente invenção é um método de produção de uma preparação de lectina destinada para o uso como aditivo alimentar Ú - - parasuinos. . : "ANTECEDENTES DA INVENÇÃO" EN i | 10 Uma invenção conhecida a partir da descrição do pedido de patente polonês PL 375476 que divulga "Um método de produção de uma preparação de lectina, uma preparação de lectina, bem como, um método de administração de uma preparação de lectina para mamíferos" supôs a utilização de conservantes, a fim de proteger o produto na forma de pó, não indicando a necessidade de utilização de um conservante durante a extração e condensação do extrato e, em particular, durante o período de armazenamento do extrato, bem como, o extrato concentrado, a fim de realizar análises de atividade necessárias, assim como durante o período de intervenção antes do início das fases adicionais de produção. Em certas situações, o relatório descritivo do pedido de patente polonês PL 375476 conhecido e acima mencionado, permitiu a divisão do extrato de uma : atividade biológica definida diretamente no interior de recipientes de dosagem, contornando a fase de secagem. Isto, no entanto, necessitou de métodos padrão de introdução de um conservante antes da divisão, e não afetom o método de extração nem seus resultados. Outros métodos conhecidos de produção de lectina a partir da literatura fazem uso de procedimentos de extração de múltiplas fases, alterações de pH do extrato e filtração múltipla, precipitação do sal, diálise e liofilização, como base de um processo para a produção de um produto sólido. O método acima ooo 2/12 mencionado facilita a produção de preparações de lectina de uma atividade pré-definida limitada pela presença de substâncias de estabilidade nas matérias-primas de extração. Existe, portanto, ainda uma necessidade de proporcionar um método de extração que torne possível produzir um produto com uma atividade aumentada. O objetivo da presente invenção é fornecer um método de produção de produto acabado altamente ativo na forma de pó a partir de sementes de feijão i “para utilizção como um aditivo alimentar para suínos. Inesperadamente, o problema acima mencionado foi resolvido pela presente invenção.

O objeto da presente invenção é um método de produção industrial de uma preparação de lectina a partir de sementes de feijão com base em que as sementes de feijão são quebradas, a polpa do feijão é extraída em um meio ácido, na presença de antioxidantes e um conservante, caracterizado pelo fato em que a extração é realizada a uma baixa temperatura, preferencialmente, de 4ºC a 8ºC, onde apenas na fase inicial da extração são as fases misturadas e, em seguida, o extrato é concentrado, de preferência, nas membranas e um conservante pouco volátil é adicionado, da seguinte maneira, à fração 20 . PHA produzida e, é então seco, de preferência, por pulverização, resultando numa preparação de lectina com um teor de lectina ativo não inferior a 128 HU/100 mg da preparação. Preferencialmente, um método de acordo com a presente invenção é caracterizado pelo fato em = que a extração é realizada utilizando um sistema de extração contendo ácido acético, um antioxidante, bem como, um ácido orgânico de cadeia curta, altamente volátil ou seu sal em uma baixa temperatura. Igualmente, de forma preferencial, um método de acordo com a presente invenção é caracterizado pelo de que as fases sólida e liquida do extrato são misturadas apenas durante a primeira fase da extração,

OO — : ao — são A - 1 e 2 preferencialmente, dentro do período de 60 minutos. Preferencialmente, — um método de acordo com a presente invenção é caracterizado pelo fato da segunda parte do processo de extração ocorrer sem fase de mistura, de preferência, dentro do período de 7 horas.

O segundo objeto da presente invenção é um aditivo alimentar para suínos produzido a partir de sementes de feijão comum, caracterizado pelo fato de que a atividade da lectina não é inferior a 128 HU/100 mg da preparação com um nível reduzido de substâncias de estabilidade. Preferencialmente; um aditivo alimentar de acordo com a presente invenção é caracterizado pelo fato de ser obtido utilizando um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4. =» Inesperadamente, descobriu-se que uma grande redução no tempo de mistura durante a extração, altera na faixa de temperatura (e, assim, uma mudança na dinâmica e características do presente processo), aprimora drasticamente a eficiência e seletividade da extração do PHA (em latim Phytohaemagglutinin) que na verdade, facilita e assegura a produção de um produto com uma maior atividade biológica e menor nível de substâncias de estabilidade em relação aos | métodos de produção de lectinas PHA conhecidos a partir do descrito na literatura. À natureza do novo método de produção de uma preparação de lectina na forma de pó é a de criar um novo sistema de extração, em que as alterações introduzidas no sistema de extração, exclusão da mistura .e a diminuição paralela na temperatura do processo, influenciam significativamente a seletividade do processo de extração, expressada nos termos de uma redução do teor de substância de estabilidade no extrato, com um nível de lectina inalterado €, assim, um nível de atividade inalterado tanto no extrato quanto na preparação de lectina preparada a partir do mesmo, A presente invenção soluciona o problema da eficácia de extração de PHA a partir de sementes de

| 2 4/12 o leguminosas, aqui feijão comum e assegura. uma diminuição do nível de i - | substâncias de estabilidade nas fases individuais de produção da preparação de lectina. O novo método de produção de uma preparação de lectina refere-se particularmente à fase de extração de todas as formas de lectina a partir de sementes de feijão, e facilita a produção de preparações de lectina altamente ativas na forma de pó. Como consequência, a atividade do produto final em pó pode ser aumentada de 128 HU/100 mg a 256 HU/100 mg e, por isso, diminuir significativamente o custo de produção por 1.000 HU. O método descrito leva à produção de um nova e diferente preparação lectina com um teor de massa aumentado de todas as cinco formas de lectinas em relação às substâncias orgânicas restantes contidas e isoladas com o extrato utilizando os métodos da invenção no pedido de patente polonês PL 875476, intitulado "Um método de produção de uma preparação de lectina,y uma preparação de lectina, assim como, um método de ' administração da preparação de lectina para mamíferos", assim como a invenção descrita pelo pedido de patente polonês PL 384.706, intitulado "Um aditivo alimentar de lectina, bem como um método industrial de produção do mesmo", Tanto o produto quanto as fases intermediárias são controladas por meio da determinação da atividade de hemaglutinina (HU), definida como a quantidade de material, expresso em mg/ml, na diluição final causando 50% de aglutinação de uma suspensão de 2%. de eritrócitos, em uma temperatura de 25ºC, de acordo com o método de Pusztai e Watt, 1974, com uma modificação.

Outro método de controle indireto de extração e processos de concentração, particularmente, para fins tecnológicos, é O de determinar a massa seca. Durante os trabalhos sobre o aprimoramento da eficácia de produção de preparações de lectina, bem como, tecnologias para condições variáveis de extração, descobriu-se

2 NS 512 NO Ns inesperadamente que a utilização de regimes tecnológicos de extração, para as alternativas existentes, não só melhoram as condições de extração de PHA a partir de massas de sementes de plantas leguminosas, aqui sementes de feijão, na qual é evidenciado pela atividade da hemaglutinina aumentada do extrato e o pó produzido a partir do mesmo durante os processos seguintes, em relação às determinações de massa seca, confirmando, assim, a redução do teor de substância de estabilidade no extrato e no produto e facílita a produção = de um produto de lectina com uma atividade superior a 128 HU/100 mg A possibilidade de produção da atividade biológica do pó acima de 128 HU/100 mg não só diminui os custos de produção da mesma quantidade de pó, mas também facilita a concepção de novas formulações de produtos de lectina, ExEMPLO 1 ExTRAÇÃO DE PHA A PARTIR DE SEMENTES DE FEIJÃO E PRODUÇÃO DO

PRODUTO FINAL USANDO O MÉTODO DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO

PREPARAÇÃO DE SEMENTES DE FEIJÃO COMUM Sementes de feijão comum foram moídas em um moinho com refrigeração interna e controle da temperatura de moagem. A temperatura do processo de moagem variou de 34ºC a 40ºC. O diâmetro da partícula moida foi definido para grãos com um diâmetro de 1 mm, o que na prática produz 98% de uma fração com diâmetros de grão de 0,98 a 1,02 mm. - :

PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO DA EXTRAÇÃO Uma solução de ácido acético é preparada para a extração utilizando um agitador lento, onde o ácido acético glacial é misturado com água à uma razão de 1,1 gramas de ácido acético em 1.000 ml de solução. Esta solução é suplementada com 0,1 gramas de ácido ascórbico por cada litro de solução, bem como, ácido propiônico a 0,1

DM Ns o o NS <S OS SA é 5 2 eos gramas por litro de solução. A quantidade de solução de extração Pa realizada dependendo da massa de sementes de feijão moida. A razão recomendada é de 10:1.

PROCESSO DE EXTRAÇÃO Para a extração, uma quantidade medida de sementes de feijoeiro é adicionada à solução de extração e a mistura é iniciada. Após minutos, o controle do pH do processo de extração se inicia. O pH recomendado para o processo de extração está na faixa de 5,0 + 0,07. Quaisquer correções possíveis de pH devem ser realizadas após um 10 minimo de 30 minutos de extração, porque depois desse ponto pode-se começar a falar da estabilização do pH do sistema de extrato. Caso uma correção de pH seja necessária, após 20 minutos, o resultado de correção deve ser verificado. A temperatura de extração deve ser de 4ºC a 8ºC. A mistura deve durar uma hora no total, após o que a mistura é postadelado sem se misturar por mais 7 horas.

CENTRIFUGAÇÃO DO EXTRATO A separação dos sólidos ocorre em centrifugas de tambor com alto RPM concebidas para a separação de precipitados de proteinas. O diâmetro do tambor é de 200 mm e a velocidade de rotação é 18,000 RPM. O processo é periódico e o ciclo é determinado pelo volume do tambor.

O resíduo separado da pós-extração e o produto rico em proteina são processados separadamente, a fim de prepará-los para ser utilizado em alimentação animal,

PROCESSO DE EXTRAÇÃO ADICIONAL O extrato clarificado é concentrado por osmose inversa. Os parâmetros iniciais do extrato são: 1,242% de massa seca, atividade de 64 HU/100 ml. A solução concentrada é analisada para a atividade de hemaglutinina e teor de massa seca. Imediatamente antes da secagem

RD MM o oo 7/12 TS "spray drying', o extrato concentrado é suplementado com uma | quantidade calculada, apropriada de maltodextrina e, alternativamente, N-propil p-hidroxibenzoato de sódio ou N-etil p-hidroxibenzoato de sódio. O processo "spray drying' de secagem é realizado em uma temperatura de entrada não superior a 180ºC. O produto é analisado quanto à atividade biológica e uma porção do material é formulada, o qual é analisado de acordo com os requisitos da Comunidade Buropeia - . para aditivos alimentares. O produto resultante é um pó claro (branco a cor de creme), altamente fluido, uma tendência para a aglomeração e Ú ' fácil formação de uma suspensão em água. O pó é totalmente compatível com as máquinas de derramamento mecânico comumente utilizadas. A atividade da hemaglutinina não é inferior a 128 HU/100 mg; o teor de Hg, As, Pb e Cd é inferior às normas da Comunidade Europeia; a pureza microbiológica é compatível e tem uma vida de prateleira de 3 anos a partir da produção. EXEMPLO 2

TESTE DE HEMAGLUTINAÇÃO PARA DETERMINAR A ATIVIDADE DA PREPARAÇÃO

PREPARAÇÃO DE ERITRÓCITOS 1 ml de sangue coletado à partir de um rato Wistar (com 1 gotade heparina) foi diluído em 1:20 em solução salina fisiológica (0,9% de NaCl) e centrifugada (2.000 RPM, 15 minutos, 4ºC). O sobrenadante, foi vertido ao longo da fase intermediária. Os eritrócitos foram ressuspensos em sólução salina fisiológica e lavados conforme mostrado - : acima por 3 vezes. Em seguida, uma solução de eritrócitos 2% foi feita (diluição 1:50).

PREPARO DA PREPARAÇÃO Para a análise, 200 mg da preparação em pó foi tomada e dissolvida em 8 ml de solução salina fisiológica. Concentração final de 25 mg/ml.

>. oo Ba Tomo Uma série de diluições foi preparada: " : O Diluições: 1x; 2x; 4X; 8x; 16x; 32x; 64x; 128x; 256%.

TESTE O ensaio foi realizado simultaneamente em tubos Eppendorfá, bem como, em lâminas de microscópio (não desengorduradas!). A mistura de reação em tubos Eppendorf contérm: 100 ul de ' solução salina fisiológica, 100 ul de eritrócitos 2% e 100 ul da solução examinada (solução adequada). Após agitação vigorosa dos io componentes, 50 ul é coletado a partir de cada uma das amostras analisadas e colocado sobre as lâminas e incubadas à temperatura ambiente durante cerca de 30 minutos a 1 hora (deve ser tomado cuidado para que as gotas não sequem). A parte restante da mistura é incubada em tubos Eppendorfs fechados (não menos do que 1 hora, o alongamento não afeta a leitura). Após a incubação, os conteúdos dos tubos Eppendorf são misturados com uma pipeta, para liberar o precipitado das paredes e, em seguida, 50 ul são coletados e colocados numa lâmina de microscôpio. O teste é realizado na presença de um controle negativo: 200 ul de solução salina fisiológica e 10 ul de eritrócitos 2%. O resultado do teste é lido com um microscópio com ampliação de 250x. Os resultados são escritos usando os sinais: +, £, -, onde ++ significa a presença de eritrócitos hemaglutinados e - é à sua Ú " ausência. Pára simplificar; um pode omitir a incubação em lâminas de " microscópio, à medida que os resultados suficientes são obtidos na incubação em tubos Eppendorf fechados.

DETERMINAÇÃO DAS UNIDADES DE HEMAGLUTININA NA PREPARAÇÃO Uma unidade de hemaglutinina (1 HU) é 1 mg da preparação de lectina, cuja concentração de 1 mg/ml provoca a hemaglutinação de pelo menos, 50% dos eritrócitos em conformidade ooo | 9/12 Tm TT com o procedimento acima mencionado de determinação do grau de " hemaglutinação. A atividade da preparação acima é de 1 HU/mg.

O número de unidades de hemaglutinação (HU) em 1 mg da preparação de lectina examinada é denotado como o inverso da concentração da solução (mostrada em mg/ml!) na diluição seguinte, em que ainda se observa a hemaglutinação de pelo menos 50% de eritrócitos. .

: o Para uma preparação de acordo com a presente invenção, a atividade expressada em unidades de hemaglutinação é dada geralmente calculada por 100 mg de preparação. ExEMPLO 3

EXTRAÇÃO DE PHA A PARTIR DE SEMENTES DE FEIJÃO E DA PRODUÇÃO DO

PRODUTO PRONTO UTILIZANDO O MÉTODO DE ACORDO COM A INVENÇÃO DO PEDIDO DE PATENTE POLONÊS PL 384706

PREPARAÇÃO DE SEMENTES DE FEIJÃO COMUM Sementes de feijão comum foram moidas em um moinho com refrigeração interna e controle de temperatura de moagem. À temperatura do processo de moagem variou de 34ºC a 40ºC. O diâmetro da partícula moída foi definido para os grãos com um diâmetro de 1 mm,oquena prática produz 98% de uma fração com diâmetros de grão de 0,98 a 1,02 mm.

PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO DE EXTRAÇÃO Uma solução de ácido acético ê preparada para a extração utilizando um agitador lento, em que o ácido acético glacial é misturado comáguaa uma razão de 1,1 gramas de ácido acético em 1.000 ml de solução. Esta solução é suplementada com 0,1 gramas de ácido ascórbico por cada litro de solução, bem como, ácido propiônico a 0,1 gramas por litro de solução. A quantidade de solução de extração é o. 10/12 gerada dependendo da massa de sementes de feijão moido. A razão recomendada é de 10:1. Para a extração, uma quantidade medida de sementes de feijoeiro é adicionada à solução de extração e a mistura é iniciada. Após minutos, o controle do pH do processo de extração se inicia. O pH recomendado para o processo de extração está na faixa de 5,0 + 0,07. Quaisquer correções possíveis de pH devem ser realizadas após um : “mínimo de 30 minutos -de extração, porque depois desse ponto pode-se começar a falar da estabilização do pH do sistema de extrato. o 10 processo de extração não exige regimes de temperatura exatos, porque não é significativamente exergônica. A temperatura de extração deve ser de +16ºC a 25ºC. A mistura deve durar quatro horas no total, após o que a mistura é posta de lado sem se misturar por mais de 4 horas.

CENTRIFUGAÇÃO DO EXTRATO A separação dos sólidos ocorre em centrífugas de tambor com alto RPM concebidas para a separação de precipitados de proteinas, O diâmetro do tambor é de 200 mm e a velocidade de rotação é 18.000 RPM. O processo é periódico e o ciclo ê determinado pelo volume do tambor. O resíduo separado da pós-extração e o produto rico em proteina são processados separadamente, a fim de prepará-los para ser utilizado em alimentação animal. SS o — PROCESSO DE EXTRAÇÃO ADICIONAL O extrato clarificado ê concentrado por osmose inversa. Os ' parâmetros iniciais do extrato são: 1,242% de massa seca, atividade de 64 HU/100 ml. A solução concentrada é analisada para a atividade de hemaglutinina e teor de massa seca. Imediatamente antes da secagem "spray drying', o extrato concentrado é suplementado com uma quantidade calculada, apropriada de maltodextrina e, alternativamente, N-propil p-hidroxibenzoato de sódio ou N-etil p-hidroxibenzoato de sódio.

O processo "spray drying' de secagem é realizado em uma temperatura de entrada não superior a +180ºC, O produto é analisado quanto à atividade biológica e uma porção do material é formulada, o qual é analisado de acordo com os requisitos da Comunidade Europeia para aditivos alimentares.

O produto resultante é um pó claro (branco a cor de creme), altamente fluido, uma tendência para a aglomeração e fácil formação de uma suspensão em água, O pó é "totalmente | * compatível com as máquinas de derramamento mecânico comumente | utilizadas.

O produto foi utilizado nos testes em duas fazendas de i | 10 suínos polonesas.

A atividade em pó foi de 128 HU/100 mg.

Os resultados da extração de acordo com os métodos novos e velhos, bem como, a atividade do produto resultante a partir deles, o pó de lectina para a preparação de uma suspensão ex tempore é mostrada na tabela 1 abaixo.

TABELA 1 | Extração de acordo com o invenção do pedido de patente novo método (Exemplo 1) polonês PL 384706 FSNnnNnnr 1 2 3 4 5 Amostra ame e e o 1,242 | 1,242 | 1,241 1,286 1,282 1,279 seca (%) . Atividade PHA " pe do extrato 64 64 HU/100 ml Atividade — do produto final| 256 256 256 128 128 128 HU/100 ml i

A tabela 1 - Atividade PHA do extrato e produto final de acordo com o estado da técnica e à presente invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. MÉTODO INDUSTRIAL DE PRODUÇÃO DE UMA PREPARAÇÃO DE LECTINA A PARTIR DE SEMENTES DE FEIJÃO, onde as sementes de feijão são moidas, a massa de feijão é extraída em um meio ácido, na presença de antioxidantes e um conservante, caracterizado pelo fato da extração ser realizada a uma baixa temperatura, preferencialmente, de 4ºC a 8ºC, onde a fase de mistura é realizada apenas durante a fase inicial da extração e, em seguida, o extrato é concentrado, de preferência, sobre membranas, e dessa forma, uma fração PHA produzida é suplementada com um conservante pouco volátil e é seca, de preferência, por pulverização, resultando em uma preparação de lectina contendo uma atividade de lectina não inferior a 128 HU/100 mg da preparação.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, : caracterizado pelo fato da extração ser realizada utilizando um sistema de extração que contém ácido acético, um antioxidante, bem como um ácido orgânico de cadeia curta, altamente volátil ou seu sal a uma baixa temperatura.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato das fases sólida e líquida ser misturadas no extrato apenas durante a primeira fase de extração, preferencialmente, dentro do período de 60 minutos.

4, MÉTODO, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato da segunda fase do processo de extração ocorrer sema fasede mistura, de preferência, dentro do período de 7 horas. |

5. ADITIVO ALIMENTAR PARA SUÍNOS OBTIDO A | PARTIR DE SEMENTES DE FEIJÃO, caracterizado pelo fato de conter lectinas com uma atividade não inferior a 128 HU/100 mg da preparação com um nível reduzido de substâncias de estabilidade.

6. ADITIVO ALIMENTAR, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de ser obtido utilizando o método de acordo com as reivindicações 1 a 4.