CN103087187B - 一种低血凝活性且高α-葡萄糖苷酶活性的芸豆凝集素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种低血凝活性且高α-葡萄糖苷酶活性的芸豆凝集素的制备方法。具体包括下列步骤：芸豆粗提物的制备；硫酸铵沉淀；亲和层析；离子交换层析；以10-50MPa的压力均质；以5-50kV/cm的电场强度的脉冲电场处理；将处理后的芸豆凝集素取出，经冷冻干燥得到芸豆凝集素粉末。本发明发现经过这种方法处理以后，对比80-120℃热处理20-40min，芸豆凝集素的血凝活性降低同时α-葡萄糖苷酶抑制活性大部分保留，即一方面有效的降低了芸豆的抗营养性，另一方面提高了其有益的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
Description
技术领域
本发明涉及食品生物化学领域，具体属于一种能够有效降低芸豆凝集素的血凝活性同时保持其高α-葡萄糖苷酶抑制活性的新型制备方法。
背景技术
芸豆凝集素 (Phytohemagglutinin,PHA)是芸豆籽粒中的一类非免疫来源的糖蛋白，文献报道其具有双重特性：一方面，由于凝集素是植物在长期进化过程中形成的抵御病虫害和动物消化的成分之一，因此对人体具有一定的抗营养作用，能可逆地结合特异单糖或寡聚糖，促使血红细胞发生凝集或沉淀；另一方面，它还具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，抗HIV病毒和抑制T淋巴细胞的结合等有益的生理活性。近年来的研究表明,α-葡萄糖苷酶与糖尿病、艾滋病、恶性肿瘤等疾病的发生机制有重要关系,是治疗这些疾病的潜在靶点。因此, 对α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究具有重要意义。
糖尿病的发病率逐年上升,而且趋于年轻化,已成为严重威胁人类健康的第三大疾病。抗糖尿病药物的研究受到国内外学者的广泛重视。α-葡萄糖苷酶抑制剂能够可逆性抑制小肠刷状缘的α-葡萄糖苷酶的活性，从而延迟多糖、双糖转化为可吸收的葡萄糖，故降低餐后的血糖高峰,此外还可持续地、较温和地促进胰岛素的分泌。目前临床已通过抑制 α-葡萄糖苷酶的活性来治疗非胰岛素依赖性糖尿病（又称 II 型糖尿病，Noninsulin-dependent diabetes mellitus，NIDDM）的口服降糖药物。拜耳公司先后通过生物合成和对1-deoxynojirimycin结构修饰的方法分别开发了阿卡波糖(acarbose)和米格列醇(miglitol),均为α-葡萄糖苷酶抑制剂类糖尿病治疗药物，但此两类药物常伴有胀气、腹部不适、恶心、呕吐、肠鸣及腹泻等副作用，且机体的药物耐受性也随服药时间逐渐增强。因此，从天然产物中筛选获得更安全、高效的α-葡萄糖苷酶抑制剂，是Ⅱ型糖尿病治疗以及降糖保健食品开发的新研究热点。
然而在传统的芸豆加工工艺中，通过长时间的热处理来破坏凝集素的血凝活性，但导致其α-葡萄糖苷酶抑制活性也随之消失。因此，寻找一种既能有效的降低芸豆凝集素的血凝活性又能有效保持其有益的α-葡萄糖苷酶抑制活性的制备加工方法十分迫切。
发明内容
本发明提供了一种制备低血凝活性高α-葡萄糖苷酶抑制活性的芸豆凝集素的新型制备加工手段，以解决目前加工方法中单纯的采用热处理破坏芸豆凝集素使其抗营养性和有益生理活性同时消失的问题。
一种低血凝活性且高α-葡萄糖苷酶活性的芸豆凝集素的制备方法，其包括下列步骤：
（1）芸豆提取物的制备：将芸豆预先浸泡后与tris缓冲液混合匀浆，0-4℃静置过夜提取，四层纱布过滤后离心，取上清液，得芸豆提取物；
（2）硫酸铵沉淀：向上清液中加入固体(NH4)2SO4至饱和度10%-90%，0-4℃静置过夜，离心取沉淀；将沉淀溶于蒸馏水，0-4℃透析8-12 h，除盐，冷冻干燥得芸豆凝集素粗品；
（3）亲和层析：采用Affi-gel blue柱（20cm*2.5cm），流动相A是10-100 mmol/L tris-HCl，pH 6.8-7.4，流速为0.5-2mL/min，并用流动相A溶解凝集素粗提物；流动相B是在流动相A中加入NaCl至浓度为1-3 mol/L，并用其进行洗脱；用280 nm的紫外光检测，收集各个蛋白峰，放入透析袋0-4℃对水透析12-36 h，冷冻干燥，分别检测其血凝活性，保留活性最高的组分进行下一步分离纯化；
（4）离子交换柱层析：采用Cm-Sepharose柱（20cm*2.5cm），本步骤采用的流动相A是10-100 mmol/L 乙酸-乙酸铵，pH 4.5-5.5，流速为0.5-2mL/min，并用流动相A溶解上一步分离纯化得到的组分；流动相B是在本步骤流动相A中加入NaCl至浓度为0.05-1.2 mol/L，并用其进行洗脱；用280 nm紫外光检测，收集各个蛋白峰，放入透析袋0-4℃对水透析12-36 h，冷冻干燥，分别检测其血凝活性，收集活性最高的组分即为芸豆凝集素；
（5）均质处理：将分离纯化得到的芸豆凝集素样品用水稀释至0.5%-5%蛋白质量浓度进行均质；
（6）低温脉冲电场处理：将均质后的芸豆凝集素样品在脉冲电场中进行处理，用冰袋控制温度在25°C以下；收集处理后的芸豆凝集素溶液，经冷冻干燥得到芸豆凝集素粉末。
进一步优化的，步骤（1）中提取料液比为1:10-20，静置时间为12-24 h，离心条件为6000~8000 g，10-30min。
进一步优化的，在步骤（2）中加入固体(NH4)2SO4至饱和度30%-80%，离心条件为3000~8000 g，10-30min。
进一步优化的，在步骤（3）中所述流动相B是在在流动相A中加入NaCl至NaCl浓度为1-2 mol/L。
进一步优化的，在步骤（4）中所述流动相B是在流动相A中加入NaCl至NaCl浓度为0.05-0.7mol/L。
进一步优化的，在步骤（5）中所述蛋白质量浓度为1%-3%，均质处理压力控制在10MPa-50MPa，
进一步优化的，在步骤（6）中电场强度控制在5-50 kV/cm，流速控制在10-50 mL/min，对应接受脉冲个数为20-60个，样品受到总电脉冲处理时间为1000-4000 μs；通过低温脉冲电场处理改变芸豆提取物中凝集素的结构，从而明显降低凝集素的血凝活性，凝集效价由24降低为21，且具有高α-葡萄糖苷酶酶抑制活性，IC50值为7.8-8.2 mg/mL。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、传统的芸豆粗提物采用热处理或酸碱处理方法后能够使凝集素血凝活性丧失，同时其有益的生理活性也完全消失。相比之下，本发明降低了芸豆凝集素血凝活性且能保持其较高的α-葡萄糖苷酶活性，不仅能够有效的降低芸豆抗营养性，而且还可以提高其有益的生理活性。
2、本发明公开的降低芸豆凝集素血凝活性且有效保留其α-葡萄糖苷酶活性的加工方法，操作简单，产品安全，可规模化生产。
具体实施方式
凝集素血凝活性的测定：
参照孙册等的方法加以改进，用胰蛋白酶溶液处理红细胞，增强红细胞的敏感性。以红细胞发生50%凝集作为判定终点，计算凝集效价。凝集效价以2n（n为血凝板上样品产生凝集现象的最大稀释倍数）表示。
α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定：
将样品用缓冲液稀释到0.01-1mM 一系列浓度梯度，将α-葡萄糖苷酶和底物用相同的缓冲液溶解至一定浓度，在96孔板中进行反应，用酶标仪在405nm波长连续测定0-10min内的吸光值，绘制曲线，计算IC50值。
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的实施不限于此。
实施例1
（1） 芸豆粗提物的制备：将芸豆与Tris缓冲液混合匀浆，料液比为1:15，4℃静置24h，四层纱布过滤后离心（6000g，20min），取上清液，得芸豆提取物；
（2）硫酸铵沉淀：向上清液中加入固体(NH4)2SO4至60%饱和，4℃静置过夜，离心（5000g，30min）取沉淀。将沉淀溶于蒸馏水，4℃透析12h，除盐，冷冻干燥得芸豆凝集素粗品；
（3）亲和层析：采用Affi-gel blue柱（20cm*2.5cm），流动相A是20 mmol/L tris-HCl，pH 7.4，流速为1mL/min，并用流动相A溶解上一步分离纯化得到的组分。流动相B是在流动相A中加入NaCl至1.2 mol/L，并用流动相B进行洗脱。用280 nm的紫外光检测，收集各个蛋白峰，放入透析袋4℃对水透析24 h，冷冻干燥，分别检测其血凝活性，保留活性高的组分进行下一步分离纯化；
（4）离子交换柱层析：采用Cm-sepharose柱（20cm*2.5cm），流动相A是20 mmol/L 乙酸-乙酸铵，pH 5.5，流速为1mL/min，并用流动相A溶解上一步分离纯化得到的组分。流动相B是在本步骤流动相A中加入NaCl至0.2 mol/L，并用其进行洗脱。用280 nm紫外光检测，收集各个蛋白峰，放入透析袋4°C对水透析24 h，冷冻干燥，分别检测其血凝活性，收集活性最高的组分即为芸豆凝集素。
（5）均质处理：将分离纯化得到的芸豆凝集素样品用水稀释至1%的蛋白浓度进行均质，压力控制在20 MPa；
（6）低温脉冲电场处理：将均质后的芸豆凝集素样品在脉冲电场中进行处理，用冰袋控制温度在25°C以下，电场强度控制在15 kV/cm，流速控制在20 mL/min，对应接受脉冲个数为60个，样品受到总电脉冲处理时间为2400 μs。收集处理后的芸豆凝集素溶液，经冷冻干燥得到芸豆凝集素粉末。
实施例2
（1） 芸豆粗提物的制备：芸豆粉碎后与Tris缓冲液混合搅拌8h，料液比为1:15，4℃静置16h，四层纱布过滤后离心（6000g，20min），得芸豆粗提物；
（2） 硫酸铵沉淀：向上清液中加入固体(NH4)2SO4至60%饱和， 4℃静置过夜，离心（5000g，30min）取沉淀。将沉淀溶于蒸馏水，4℃透析12h，除盐，冷冻干燥得芸豆凝集素粗品；
（3）亲和层析：采用Affi-gel blue柱（20cm*2.5cm），流动相A是50 mmol/L tris-HCl，pH 7.2 ，流速为1mL/min，并用流动相A溶解上一步分离纯化得到的组分。流动相B是在在流动相A中加入NaCl至1.4 mol/L，，并用其进行洗脱。用280 nm的紫外光检测，收集各个蛋白峰，放入透析袋4°C对水透析28h，冷冻干燥，分别检测其血凝活性，保留活性最高的组分进行下一步分离纯化；
（4）离子交换柱层析：采用Cm-sepharose柱（20cm*2.5cm），流动相A是20 mmol/L 乙酸-乙酸铵，pH 5.5，流速为1mL/min，并用流动相A溶解上一步分离纯化得到的组分。流动相B是在流动相A中加入NaCl至0.3 mol/L，并用其进行洗脱。用280 nm紫外光检测，收集各个蛋白峰，放入透析袋4°C对水透析28h，冷冻干燥，分别检测其血凝活性，收集活性最高的组分即为芸豆凝集素。
（5）均质处理：将分离纯化得到的芸豆凝集素样品稀释至1%的蛋白浓度进行均质，压力控制在20 MPa；
（6）低温脉冲电场处理：将均质后的芸豆凝集素样品在脉冲电场中进行处理，用冰袋控制温度在25°C以下，电场强度控制在20 kV/cm，流速控制在20 mL/min，对应接受脉冲个数为60个，样品受到总电脉冲处理时间为2400 μs。收集处理后的芸豆凝集素溶液，经冷冻干燥得到芸豆凝集素粉末。
实施例3
（1） 芸豆提取物的制备：将芸豆与Tris缓冲液混合匀浆，料液比为1:15，4℃静置24h，四层纱布过滤后离心（8000g，20min），取上清液，得芸豆提取物；
（2） 硫酸铵沉淀：向上清液中加入固体(NH4)2SO4至65%饱和， 4℃静置过夜，离心（5000g，30min）取沉淀。将沉淀溶于蒸馏水，4℃透析12h，除盐，冷冻干燥得芸豆凝集素粗品；
（3）亲和层析：采用Affi-gel blue柱（20cm*2.5cm），流动相A是20 mmol/L tris-HCl，pH 7.4 ，流速为1mL/min，并用流动相A溶解上一步分离纯化得到的组分。流动相B是在在流动相A中加入NaCl至1.2 mol/L，用流动相B进行洗脱。用280 nm的紫外光检测，收集各个蛋白峰，放入透析袋4°C对水透析24h，冷冻干燥，分别检测其血凝活性，保留活性最高的组分进行下一步分离纯化；
（4）离子交换柱层析：采用Cm-sepharose柱（20cm*2.5cm），流动相A是20 mmol/L 乙酸-乙酸铵，pH 5.5，流速为1mL/min，并用流动相A溶解上一步分离纯化得到的组分。流动相B是在流动相A中加入NaCl至0.2 mol/L，并用其进行洗脱。用280 nm紫外光检测，收集各个蛋白峰，放入透析袋4°C对水透析24h，冷冻干燥，分别检测其血凝活性，收集活性高的组分即为芸豆凝集素。
（5）均质处理：将分离纯化得到的芸豆凝集素样品稀释至1%的蛋白浓度进行均质，压力控制在30 MPa；
（6）低温脉冲电场处理：将均质后的芸豆凝集素样品在脉冲电场中进行处理，用冰袋控制温度在25°C以下，电场强度控制在30 kV/cm，流速控制在30 mL/min，对应接受脉冲个数为40个，样品受到总电脉冲处理时间为1600 μs。收集处理后的芸豆凝集素溶液，经冷冻干燥得到芸豆凝集素粉末。
实施例4
（1） 芸豆提取物的制备：芸豆粉碎后与Tris缓冲液混合搅拌8小时，料液比为1:15，4℃静置16 h，四层纱布过滤后离心（8000g，20min），取上清液，得芸豆提取物；
（2） 硫酸铵沉淀：向上清液中加入固体(NH4)2SO4至65%饱和， 4℃静置过夜，离心（5000g，30min）取沉淀。将沉淀溶于蒸馏水，4℃透析12h，除盐，冷冻干燥得芸豆凝集素粗品；
（3）亲和层析：采用Affi-gel blue柱（20cm*2.5cm），流动相A是50 mmol/L tris-HCl，pH 7.2 ，流速为1mL/min，并用流动相A溶解上一步分离纯化得到的组分。流动相B是在在流动相A中加入NaCl至1.4 mol/L，用流动相B进行洗脱。用280 nm的紫外光检测，收集各个蛋白峰，放入透析袋4°C对水透析28h，冷冻干燥，分别检测其血凝活性，保留活性最高的组分进行下一步分离纯化；
（4）离子交换柱层析：采用Cm-sepharose柱（20cm*2.5cm），流动相A是50 mmol/L 乙酸-乙酸铵，pH 5.4，流速为1mL/min，并用流动相A溶解上一步分离纯化得到的组分。流动相B是在流动相A中加入NaCl至0.2 mol/L，并用其进行洗脱。用280 nm紫外光检测，收集各个蛋白峰，放入透析袋4°C对水透析24h，冷冻干燥，分别检测其血凝活性，收集活性高的组分即为芸豆凝集素。
（5）均质处理：将分离纯化得到的芸豆凝集素样品稀释至1%的蛋白浓度进行均质，压力控制在20 MPa；
（6）低温脉冲电场处理：将均质后的芸豆凝集素样品在脉冲电场中进行处理，用冰袋控制温度在25°C以下，电场强度控制在30 kV/cm，流速控制在20 mL/min，对应接受脉冲个数为60个，样品受到总电脉冲处理时间为2400 μs。收集处理后的芸豆凝集素溶液，经冷冻干燥得到芸豆凝集素粉末。
实施例5
（1）芸豆提取物的制备：将芸豆与生理盐水混合匀浆，料液比为1:15，4℃静置24 h，四层纱布过滤后离心（8000g，20min），取上清液，得芸豆提取物；
（2）硫酸铵沉淀：向上清液中加入固体(NH4)2SO4至70%饱和，4℃静置过夜，离心（8000g，30min）取沉淀。将沉淀溶于蒸馏水，4℃透析12h，除盐，冷冻干燥得芸豆凝集素粗品；
（3）亲和层析：采用Affi-gel blue柱（20cm*2.5cm），流动相A是50 mmol/L tris-HCl，pH 7.2 ，流速为1mL/min，并用流动相A溶解上一步分离纯化得到的组分。流动相B是在在流动相A中加入NaCl至1.4 mol/L，用流动相B进行洗脱。用280 nm的紫外光检测，收集各个蛋白峰，放入透析袋4°C对水透析28h，冷冻干燥，分别检测其血凝活性，保留活性最高的组分进行下一步分离纯化；
（4）离子交换柱层析：采用Cm-sepharose柱（20cm*2.5cm），流动相A是50 mmol/L 乙酸-乙酸铵，pH 5.4，流速为1mL/min，并用流动相A溶解上一步分离纯化得到的组分。流动相B是在流动相A中加入NaCl至0.3 mol/L，并用其进行洗脱。用280 nm紫外光检测，收集各个蛋白峰，放入透析袋4°C对水透析28h，冷冻干燥，分别检测其血凝活性，收集活性高的组分即为芸豆凝集素。
（5）均质处理：将分离纯化得到的芸豆凝集素样品稀释至1%的蛋白浓度进行均质，压力控制在30 MPa；
（6）低温脉冲电场处理：将均质后的芸豆凝集素样品在脉冲电场中进行处理，用冰袋控制温度在25°C以下，电场强度控制在40 kV/cm，循环2次流速控制在30 mL/min，对应接受脉冲个数为40个，样品受到总电脉冲处理时间为1600 μs。收集处理后的芸豆凝集素溶液，经冷冻干燥得到芸豆凝集素粉末。
实施例6
（1）芸豆提取物的制备：芸豆粉碎后与生理盐水混合搅拌8h，料液比为1:15，4℃静置16 h，四层纱布过滤后离心（8000g，20min），取上清液，得芸豆提取物；
（2）硫酸铵沉淀：向上清液中加入固体(NH4)2SO4至70%饱和，4℃静置过夜，离心（8000g，30min）取沉淀。将沉淀溶于蒸馏水，4℃透析12h，除盐，冷冻干燥得芸豆凝集素粗品；
（3）亲和层析：采用Affi-gel blue柱（20cm*2.5cm），流动相A是50 mmol/L tris-HCl，pH 7.2 ，流速为1mL/min，并用流动相A溶解上一步分离纯化得到的组分。流动相B是在在流动相A中加入NaCl至1.4 mol/L，用流动相B进行洗脱。用280 nm的紫外光检测，收集各个蛋白峰，放入透析袋4°C对水透析28h，冷冻干燥，分别检测其血凝活性，保留活性最高的组分进行下一步分离纯化；
（4）离子交换柱层析：采用Cm-sepharose柱（20cm*2.5cm），流动相A是50 mmol/L 乙酸-乙酸铵，pH 5.4，流速为1mL/min，并用流动相A溶解上一步分离纯化得到的组分。流动相B是在流动相A中加入NaCl至0.3 mol/L，并用其进行洗脱。用280 nm紫外光检测，收集各个蛋白峰，放入透析袋4°C对水透析28h，冷冻干燥，分别检测其血凝活性，收集活性高的组分即为芸豆凝集素。
（5）均质处理：将分离纯化得到的芸豆凝集素样品稀释至1%的蛋白浓度进行均质，压力控制在30 MPa；
（6）低温脉冲电场处理：将均质后的芸豆凝集素样品在脉冲电场中进行处理，用冰袋控制温度在25°C以下，电场强度控制在45 kV/cm，流速控制在30 mL/min，对应接受脉冲个数为40个，样品受到总电脉冲处理时间为1600 μs。收集处理后的芸豆凝集素溶液，经冷冻干燥得到芸豆凝集素粉末。
由表1可见，对比未经低温脉冲电场处理的芸豆凝集素样品，采用本发明的加工方法所制备的芸豆凝集素血凝活性均有降低，并且随着电场强度的增大与处理时间的增多，血凝活性降低得越多，表明本发明所采用的加工制备方法能够有效的降低芸豆凝集素的抗营养性。对比100℃热处理30min加工处理的样品，经过电场强度40 kV/cm以上的低温脉冲电场处理均可以使芸豆凝集素的血凝活性基本丧失。
由表2可见，对比未经低温脉冲电场处理的芸豆凝集素样品，采用本发明的加工方法所制备的芸豆凝集素α-葡萄糖苷酶抑制活性均大部分保留，而经100℃热处理的芸豆凝集素样品α-葡萄糖苷酶抑制活性完全消失，表明本发明所采用的加工制备方法能够有效的保持芸豆凝集素的有益生理活性。
表1
| 芸豆凝集素样品 | 凝集效价 | 芸豆凝集素样品 | 凝集效价 |
| 对照1 | 24 | 对照2 | 21 |
| 1 | 23 | 2 | 23 |
| 3 | 22 | 4 | 22 |
| 5 | 21 | 6 | 20 |
注：对照1为未经低温脉冲电场处理的芸豆凝集素样品；样品2为 100℃热处理30min的芸豆凝集素样品。
表2
注：对照1为未经低温脉冲电场处理的芸豆凝集素样品；样品2为 100℃热处理30min的芸豆凝集素样品。
Claims (6)
1.一种低血凝活性且高α-葡萄糖苷酶活性的芸豆凝集素的制备方法，其特征在于包括下列步骤：
（1）芸豆提取物的制备：将芸豆预先浸泡后与tris缓冲液混合匀浆，0-4℃静置过夜提取，四层纱布过滤后离心，取上清液，得芸豆提取物；
（2）硫酸铵沉淀：向上清液中加入固体(NH4)2SO4至饱和度10%-90%，0-4℃静置过夜，离心取沉淀；将沉淀溶于蒸馏水，0-4℃透析8-12 h，除盐，冷冻干燥得芸豆凝集素粗品；
（3）亲和层析：采用Affi-gel blue柱，流动相A是10-100 mmol/L tris-HCl，pH 6.8-7.4，流速为0.5-2mL/min，并用流动相A溶解凝集素粗提物；流动相B是在流动相A中加入NaCl至浓度为1-3 mol/L，并用其进行洗脱；用280 nm的紫外光检测，收集各个蛋白峰，放入透析袋0-4℃对水透析12-36 h，冷冻干燥，分别检测其血凝活性，保留活性最高的组分进行下一步分离纯化；
（4）离子交换柱层析：采用Cm-Sepharose柱，本步骤采用的流动相A是10-100 mmol/L 乙酸-乙酸铵，pH 4.5-5.5，流速为0.5-2mL/min，并用流动相A溶解上一步分离纯化得到的组分；流动相B是在本步骤流动相A中加入NaCl至浓度为0.05-1.2 mol/L，并用其进行洗脱；用280 nm紫外光检测，收集各个蛋白峰，放入透析袋0-4℃对水透析12-36 h，冷冻干燥，分别检测其血凝活性，收集活性最高的组分即为芸豆凝集素；
（5）均质处理：将分离纯化得到的芸豆凝集素样品用水稀释至0.5%-5%蛋白质量浓度进行均质；
（6）低温脉冲电场处理：将均质后的芸豆凝集素样品在脉冲电场中进行处理，用冰袋控制温度在25°C以下；收集处理后的芸豆凝集素溶液，经冷冻干燥得到芸豆凝集素粉末；所述电场强度控制在5-50 kV/cm，流速控制在10-50 mL/min，对应接受脉冲个数为20-60个，样品受到总电脉冲处理时间为1000-4000 μs；通过低温脉冲电场处理改变芸豆提取物中凝集素的结构，从而明显降低凝集素的血凝活性，凝集效价由24降低为21，且具有高α-葡萄糖苷酶酶抑制活性，IC50值为7.8-8.2 mg/mL。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（1）中提取料液比为1:10-20，静置时间为12-24 h，离心条件为6000~8000 g，10-30min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤（2）中加入固体(NH4)2SO4至饱和度30%-80%，离心条件为3000~8000 g，10-30min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤（3）中所述流动相B是在在流动相A中加入NaCl至NaCl浓度为1-2 mol/L。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤（4）中所述流动相B是在流动相A中加入NaCl至NaCl浓度为0.05-0.7mol/L。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤（5）中所述蛋白质量浓度为1%-3%，均质处理压力控制在10MPa-50MPa。
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